血糖値上昇抑制剤および飲食用組成物
【課題】 食用キノコの１種であるため安全性が高いムラサキシメジの抽出物、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有し、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有して血糖値を低減させる作用に優れる血糖値上昇抑制剤を提供する。
【解決手段】 ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤とする。また、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤とする。
【解決手段】 ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤とする。また、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムラサキシメジからの抽出物、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤および飲食用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満および糖尿病は、過剰カロリーの摂取が主な原因となる。糖尿病には、１型糖尿病（インスリン依存型糖尿病）と２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）との２つのタイプがあるが、その多くは後者のタイプである。
【０００３】
２型糖尿病における高血糖の原因として、食後の急峻な血糖上昇に対応し、瞬時に分泌されるべきインスリンの欠如と、食後高血糖の持続により誘導される内因性インスリンの基礎分泌低下が挙げられる。食後高血糖の是正は、経口血糖降下剤やインスリンを用いても困難なことがあり、消化系における糖類の急速な吸収を防ぐ方法が有望である。
【０００４】
消化系における糖類の吸収としては、糖類のα−１，４結合を切断して単糖に加水分解する小腸中の酵素であるα−グルコシターゼが関与しており、血糖値は、糖類が単糖の形態に分解され血液中へ吸収されることで上昇する。つまり、酵素であるα−グルコシターゼを阻害することにより、食後の血糖値上昇が抑制され、さらにそれに続くインスリン値の上昇も抑制されることになる。
【０００５】
そこで、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有して血糖値を低減させる作用に優れ、かつ安全性が高く長期投与が可能な血糖値上昇抑制剤の開発が望まれている。
【０００６】
ムラサキシメジ（Lepista nuda）は、キシメジ科ムラサキシメジ属に属する食用キノコの１種であり、秋から初冬にかけて広葉樹林の落葉堆積地に群生する腐生菌である。ムラサキシメジは、カサの表面とヒダとが最初は濃い紫色だが、カサが開くにつれて淡くなり、灰白色から淡褐色になる。
【０００７】
このムラサキシメジは、様々な効能があることが知られており、たとえば、特許文献１には、抗疲労作用および持久力増強作用を有することが示されており、特許文献２には、他のキノコ類と併用することで抗菌作用を発現することが示されており、特許文献３には、他のキノコ類と併用することで恒常性バランス補正作用を発現することが示されており、特許文献４，５には、美肌増進作用を発現することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２７７１５８号公報
【特許文献２】特開２００７−１９６１号公報
【特許文献３】特開２００４−３１５５１２号公報
【特許文献４】特開２００５−１５３４８号公報
【特許文献５】特開２００５−２３９６４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、血糖値上昇抑制作用を有する有効成分がムラサキシメジ中、または、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液中に含まれていることについては知られていない。
【００１０】
したがって本発明の目的は、食用キノコの１種であるため安全性が高いムラサキシメジの抽出物、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有し、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有して血糖値上昇を抑制する作用に優れる血糖値上昇抑制剤を提供することであり、該血糖値上昇抑制剤を含む飲食用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤である。
【００１２】
また本発明は、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して得られる水画分であることを特徴とする。
【００１３】
また本発明は、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる０％メタノール画分であることを特徴とする。
【００１４】
また本発明は、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる７５％メタノール画分であることを特徴とする。
【００１５】
また本発明は、抽出物は、下記式（１）で表される化合物を含有することを特徴とする。
【００１６】
【化１】
【００１７】
また本発明は、ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して得られる菌糸体培養物の液体成分である培養ろ液を、有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤である。
【００１８】
また本発明は、前記血糖値上昇抑制剤を含むことを特徴とする飲食用組成物である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する。ムラサキシメジは食用キノコの１種であるので、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤は、食品由来の安全なものである。そして、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００２０】
また本発明によれば、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して得られる水画分である。このような抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇をより効果的に抑制することができる。
【００２１】
また本発明によれば、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる０％メタノール画分である。このような抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇をより効果的に抑制することができる。
【００２２】
また本発明によれば、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる７５％メタノール画分である。このような抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇をより効果的に抑制することができる。
【００２３】
また本発明によれば、抽出物は、前記式（１）で表される化合物を含有する。前記式（１）で表される化合物は、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分であるので、この化合物を含有する抽出物は、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００２４】
また本発明によれば、血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して得られる菌糸体培養物の液体成分である培養ろ液を、有効成分として含有する。ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００２５】
また本発明によれば、本発明の血糖値上昇抑制剤を含む飲食用組成物が提供される。本発明の飲食用組成物は、ムラサキシメジ由来の血糖値上昇抑制作用を有する成分を含有するので、健康食品などとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ムラサキシメジの抽出物を得る手順を示す図である。
【図２】ムラサキシメジのエタノール抽出物を経口投与後の経過時間に対する血糖値の変化を示すグラフである。
【図３】ムラサキシメジの抽出物のＴＬＣによる展開結果を示す図である。
【図４】０％メタノール画分を分画するときのＨＰＬＣのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジからの抽出物であり、より詳細には、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する組成物である。ここで、ムラサキシメジは食用キノコの１種であるので、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤は、食品由来の安全なものである。また、本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する組成物である。そして、本発明の血糖値上昇抑制剤は、α−グルコシターゼ阻害活性を有して、血糖値上昇抑制作用を有する組成物である。前記血糖値上昇抑制作用とは、血糖値の上昇を抑制する作用である。
【００２８】
［ムラサキシメジからの抽出物］
本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する組成物である。
【００２９】
本発明で用いられるムラサキシメジの子実体は、天然のものであっても、人工栽培されたものであってもよい。人工栽培の方法としては、たとえば人工栽培用の菌床を作製して、ムラサキシメジの種菌を接種して培養する方法が挙げられる。本実施の形態では、ムラサキシメジの子実体は、奈良県奈良市中町の近畿大学農学部敷地内で１０〜１２月に採取された、かさの大きさ１〜１２ｃｍのものを使用する。
【００３０】
また、本発明で用いられるムラサキシメジの菌糸体は、たとえば、液体培地中で培養する液体培養法によって得ることができる。本実施の形態では、ムラサキシメジの菌糸体は、奈良県奈良市中町の近畿大学農学部敷地内で１０〜１２月に採取された、かさの大きさ１〜１２ｃｍのムラサキシメジから分離したものを使用する。
【００３１】
このようにして得られるムラサキシメジの子実体および菌糸体は、乾燥されずにそのまま抽出に供されてもよく、乾燥されて抽出に供されてもよい。また子実体および菌糸体は、粉末化などの加工が施されてから抽出に供されてもよい。抽出効率の観点からは、抽出に供される子実体および菌糸体は、粉末状であることが好ましい。
【００３２】
次に、本発明の血糖値上昇抑制剤に有効成分として含有されるムラサキシメジの抽出物を得る方法について説明する。図１は、ムラサキシメジの抽出物を得る手順を示す図である。ムラサキシメジの抽出物は、ムラサキシメジを溶媒で第１次抽出した後、得られた抽出液を分配抽出、より詳細には液−液分配抽出することによって得られる。
【００３３】
（Ａ）第１次抽出
ムラサキシメジの第１次抽出に用いられる抽出溶媒としては、水の他に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類などが挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いられてもよく、２種以上が混合されて混合溶媒として用いられてもよい。溶媒を混合して用いる場合には、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよい。
【００３４】
前述の抽出溶媒の中でも、取り扱いが容易であり、しかも優れたα−グルコシターゼ阻害活性を有する抽出物を得ることができることから、水、メタノール、エタノールの少なくともいずれか１種の抽出溶媒を用いることが好ましく、特にエタノールを用いることが好ましい。エタノールは、水と混合されてエタノール水溶液として用いられることが好ましい。エタノール水溶液中におけるエタノールの濃度は、たとえば５０体積％であり、好ましくは３０体積％以上８０体積％以下である。以下、特に断らない限り、エタノール水溶液中におけるエタノールの濃度を示す単位「％」は、「体積％」を意味する。
【００３５】
抽出溶媒の量は、特に制限されないが、ムラサキシメジの乾燥重量に対して、５倍以上５０倍以下の重量であることが好ましい。抽出溶媒の重量がムラサキシメジの乾燥重量の５倍未満であると、操作性が悪く、また５０倍を超えると、作業効率が悪い。また、抽出するときの抽出溶媒の温度は、抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性を失活させない程度に選ばれ、具体的には４℃以上６０℃以下であることが好ましい。
【００３６】
具体的な抽出方法の一例を挙げると、たとえば、ムラサキシメジを、その乾燥重量の５倍以上５０倍以下の重量のエタノール水溶液に浸漬し、４℃以上６０℃以下で３日間以上７日間以下静置することによって、α−グルコシターゼ阻害活性成分を抽出することができる。
【００３７】
本実施の形態では、図１に示すように、まずムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液、たとえば５０％エタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得る。
【００３８】
＜エタノール抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性評価＞
エタノール抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性について、以下の評価１を行って確認した。
【００３９】
（評価１）
ムラサキシメジの子実体、菌糸体を、それぞれ５０％エタノール水溶液に浸漬し、８℃で３日間静置して、浸漬抽出した。抽出に用いた試料および溶媒の量を表１に示す。抽出後、桐山ロートおよび桐山ロート用濾紙を用いて吸引濾過し、残渣に再度５０％エタノール水溶液を加えて１回目と同様にして浸漬抽出した。２回の抽出操作で得られた抽出液を合わせて５０％エタノール抽出液とし、このエタノール抽出液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮して、５０％エタノール抽出物とした。得られたムラサキシメジの子実体、菌糸体の５０％エタノール抽出物について、α−グルコシターゼ阻害活性を、以下のようにして評価した。各エタノール抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性試験における試料溶液の濃度は、１ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌとした。評価結果を表１に示す。
【００４０】
＜α−グルコシターゼ阻害活性評価＞
株式会社シグマ製のラット小腸由来アセトンパウダーの０．１ｇに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）３ｍｌを添加し、超音波ホモジナイザーにて氷上で１０秒間の破砕を２０回行った後、４℃で１５分間遠心分離（１１０００ｒｐｍ）した。その上清を１．２μｇ／ｍｌ／ｍｉｎの基質を分解する酵素量に調製したものを粗酵素液とした。
【００４１】
任意の濃度に調製した試料溶液５０μｌと粗酵素液１００μｌとを１．５ｍｌ容チューブに入れ、３７℃でプレインキュベートし、そこへ基質として１．５ｍＭ ＰＮＰＧ（p-
nitrophenyl-α-D-glucopyranoside）１００μｌを添加し、反応溶液全量を２５０μｌとして３７℃で１５分間インキュベートした。その後、１００℃で５分間加熱処理し、酵素反応を停止させた。反応溶液を４℃で５分間遠心分離（６０００ｒｐｍ）し、その上清をサンプルＳとする。
【００４２】
また同様にして、試料溶液の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を添加したものをコントロールＣ、基質の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を添加したものをサンプルブランクＳＢとした。
【００４３】
サンプルブランクＳＢを測定ブランクとして、サンプルＳおよびコントロールＣについて、吸光光度計を用いて４０５ｎｍ（p-nitrophenolの極大吸収波長）における吸光度を
測定した。測定結果からα−グルコシターゼ阻害活性率を下記式（１）に従い、算出した。α−グルコシターゼ阻害活性率は、その値が大きいほど、α−グルコシターゼ阻害活性が高いことを示す。
【００４４】
α−グルコシターゼ阻害活性率（％）＝｛（Ｃ−Ｓ）／Ｃ｝×１００ …（１）
式（１）において、符号ＣはコントロールＣの吸光度を示し、ＳはサンプルＳの吸光度を示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
表１から、ムラサキシメジの５０％エタノール水溶液による抽出物は、α−グルコシターゼ阻害活性が高く、血糖値上昇抑制作用を発揮することが明らかである。また、ムラサキシメジの抽出物の原料には、ムラサキシメジの子実体および菌糸体のいずれを用いてもよく、両方を用いてもよいが、菌糸体のエタノール抽出物は、子実体のエタノール抽出物に比べて、α−グルコシターゼ阻害活性が高いので、ムラサキシメジの抽出物の原料には、菌糸体を用いることが好ましい。
【００４７】
＜エタノール抽出物の血糖値上昇抑制作用の評価＞
ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物の血糖値上昇抑制作用について、以下の評価２を行って確認した。
【００４８】
（評価２）
１５時間絶食させた１０〜２０週齢のＳＨＲＳＰラット（脳卒中易発症高血圧自然発症ラット）を用い、１群４匹で２群に分けた。群構成は、ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物が１０％含有されるグルコースの２ｇ／生理食塩水１０ｍｌを１ｍｌ／１００ｇｂ．ｗｔ経口投与した試料投与群と、エタノール抽出物が含有されていないグルコースの２ｇ／生理食塩水１０ｍｌを１ｍｌ／１００ｇｂ．ｗｔ経口投与した対照群とした。
【００４９】
各群のＳＨＲＳＰラットに対して、経口投与前、経口投与後１５、３０、６０、１２０分間経過後に、尾静脈から採血した。採血した血液から遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）により血漿を分離し、分離された血漿サンプル中のグルコース濃度をオキシダーゼ法により測定した。
【００５０】
ここで、前記オキシダーゼ法について説明する。血漿サンプル中のＤ−グルコースは、α−Ｄ−グルコースが３６．５％、β−Ｄ−グルコースが６３．５％の割合で平衡を保っている。このような血漿サンプルに発色液を作用させると、血漿サンプル中のＤ−グルコースでは、発色液中に含まれるムタロターゼによりα−Ｄ−グルコースからβ−Ｄ−グルコースへと速やかに変換される。変換されたβ−Ｄ−グルコースは、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）によって酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、共存するペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により発色液中のフェノールと、４−アミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、赤色の色素を生成する。この赤色の吸光度を測定することによって、血漿サンプル中のグルコース濃度を求めることができる。
【００５１】
評価結果を図２に示す。図２は、ムラサキシメジのエタノール抽出物を経口投与後の経過時間に対する血糖値の変化を示すグラフである。グラフの横軸は経口投与後の経過時間を示し、縦軸は血糖値を示す。なお、グラフ中の血糖値の数値は、各群の４匹のＳＨＲＳＰラットから採血して作製した各血漿サンプルの（平均値±標準誤差）として示した。また、グラフ中の「○」プロットは、試料投与群のＳＨＲＳＰラットから採血して作製した血漿サンプルの血糖値をプロットしたものであり、「△」プロットは、対照群のＳＨＲＳＰラットから採血して作製した血漿サンプルの血糖値をプロットしたものである。
【００５２】
図２から、試料投与群のＳＨＲＳＰラットは、血糖値の上昇が抑制されていることが明らかである。このことから、ムラサキシメジのエタノール抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性が高く、血糖値上昇抑制作用を有する成分が含まれていることがわかる。
【００５３】
（Ｂ）分配抽出
前述の第１次抽出によってムラサキシメジからエタノール抽出物を得た後、濾過、遠心分離などの常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。このようにして得られる抽出液を、濃縮してまたは濃縮せずに、分配抽出する。
【００５４】
分配抽出の溶媒としては、水の他に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールなどのグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素などの極性有機溶媒、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルなどの無極性有機溶媒などが挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いられてもよく、２種以上が混合されて混合溶媒として用いられてもよい。溶媒を混合して用いる場合には、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよい。
【００５５】
本実施の形態では、分配抽出の溶媒としては、水および酢酸エチルを用いる。図１に示すように、エタノール抽出物を減圧下でエタノールがある程度揮発するまで濃縮した後、水および酢酸エチルを加えて液−液分配し、水画分および酢酸エチル画分を得る。
【００５６】
＜エタノール抽出物の画分のα−グルコシターゼ阻害活性評価＞
エタノール抽出物の水画分および酢酸エチル画分のα−グルコシターゼ阻害活性について、以下の評価３を行って確認した。
【００５７】
（評価３）
ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物２７．５ｇに水３００ｍｌおよび酢酸エチル３００ｍｌを加えて液−液分配し、水画分（２７．０ｇ）および酢酸エチル画分（４０７ｍｇ）を得た。得られた水画分および酢酸エチル画分について、前述した評価１と同様にしてα−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表２に示す。なお、表２中の「−」は、α−グルコシターゼ阻害活性を評価していないことを示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
表２に示すように、水画分に高いα−グルコシターゼ阻害活性が認められる。つまり、エタノール抽出物に水および酢酸エチルを加えて液−液分配することによって、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれる抽出物、すなわち水画分に相当する抽出物（１）を得ることができる。このようにして得られた抽出物（１）には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分、つまり血糖値上昇抑制作用を有する成分が含まれている。
【００６０】
本実施の形態では、図１に示すように、高いα−グルコシターゼ阻害活性が認められた水画分（抽出物（１））を、カラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、さらに分画する。
【００６１】
＜カラムクロマトグラフィーにより分画した画分のα−グルコシターゼ阻害活性評価＞
エタノール抽出物の水画分（抽出物（１））をカラムクロマトグラフィーにより分画した画分のα−グルコシターゼ阻害活性について、以下の評価４を行って確認した。
【００６２】
（評価４）
ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物の水画分（抽出物（１））１９．７ｇを、カラム充填剤として逆相吸着樹脂であるＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、水およびメタノールを用いたステップワイズグラジエント法にて、０％メタノール（水）画分（１４．１ｇ）、２５％メタノール画分（５８０ｍｇ）、５０％メタノール画分（１９５ｍｇ）、７５％メタノール画分（８３ｍｇ）、１００％メタノール画分（１２９ｍｇ）に分画した。得られた各画分について、前述した評価１と同様にしてα−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表３に示す。なお、表３中の「−」は、α−グルコシターゼ阻害活性を評価していないことを示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３に示すように、０％メタノール画分および７５％メタノール画分に高いα−グルコシターゼ阻害活性が認められる。つまり、エタノール抽出物の水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて分配することによって、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれる２つの抽出物、すなわち０％メタノール画分に相当する抽出物（２）、および７５％メタノール画分に相当する抽出物（３）を得ることができる。このようにして得られた抽出物（２）および抽出物（３）には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分、つまり血糖値上昇抑制作用を有する成分が含まれている。
【００６５】
［α−グルコシターゼ阻害活性物質の推定］
次に、ムラサキシメジの抽出物に含まれるα−グルコシターゼ阻害活性物質を推定するために行った、評価５〜７について説明する。
【００６６】
（評価５）
展開溶媒をクロロホルム：メタノール：水＝６：４：１として、薄層クロマトグラフィー（略称ＴＬＣ）を用いてムラサキシメジの抽出物を分析したところ、図３に示すようなスポットが確認された。図３は、ムラサキシメジの抽出物のＴＬＣによる展開結果を示す図である。なお、分析に用いたＴＬＣは、ＴＬＣ−Ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０ Ｆ２５４（メルク株式会社製）であり、発色剤として５０％硫酸を用いた。図３では、紙面に向かって左側から順に、ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物の水画分（抽出物（１））、カラムクロマトグラフィーにより分画した０％メタノール画分（抽出物（２））、２５％メタノール画分、５０％メタノール画分、７５％メタノール画分（抽出物（３））、１００％メタノール画分の展開結果を示す。
【００６７】
図３に示すように、特に０％メタノール画分（抽出物（２））には、α−グルコシターゼ阻害活性物質に由来すると思われる黒く発色したスポットが確認された。
【００６８】
（評価６）
次に、高速液体クロマトグラフィー（略称ＨＰＬＣ）によって０％メタノール画分である抽出物（２）を分析したところ、図４に示すようなチャートが得られた。図４は、０％メタノール画分を分画するときのＨＰＬＣのチャートである。なお、分析に用いたＨＰＬＣは、Ｃｌａｓｓ ＡＶ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（株式会社島津製作所製）である。また、ＨＰＬＣによる分析は、表４に示す条件で行った。
【００６９】
【表４】
【００７０】
図４に示すように、抽出物（２）である０％メタノール画分には、α−グルコシターゼ阻害活性物質に由来すると思われる３つのピーク１，２，３が確認された。３つのピーク１，２，３に対応する保持時間に基づいて、複数の画分に分画することによって、各ピークに由来する化合物を分取することができる。
【００７１】
（評価７）
高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含有されるムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、１００℃で１時間加熱処理し、α−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表５に示す。なお、表５には、加熱処理を施していないエタノール抽出物の評価結果も比較のために示している。
【００７２】
【表５】
【００７３】
表５に示すように、ムラサキシメジのエタノール抽出物に含まれるα−グルコシターゼ阻害活性物質は、加熱処理によって阻害活性が低下することがなく、加熱処理によって変成することはない。
【００７４】
α−グルコシターゼ阻害活性物質は、水画分に含まれていることから、水溶性の蛋白質、糖類、β−グルカン系の化合物であると考えられる。
【００７５】
［α−グルコシターゼ阻害活性物質の同定］
高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する、カラムクロマトグラフィーにより分画した０％メタノール画分である抽出物（２）について、ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その抽出物（２）のスペクトルデータを表６に示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】
得られたスペクトルデータと、（Phytochemistry,65,91-97,2004）に記載されるスペクトルデータとを比較することにより、抽出物（２）を、下記式（１）に示す化学構造を有する化合物（Ethyl-β-D-glucoside）と同定した。
【００７８】
【化２】
【００７９】
したがって、式（１）に示す化学構造を有する化合物を含有する抽出物（２）は、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００８０】
［ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液］
本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する組成物とすることもできる。
【００８１】
ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液は、次のようにして作製することができる。まず、ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して、液体中に菌糸体が浮遊した状態の菌糸体培養物を得る。そして、菌糸体培養物を遠心分離し、上清部分を採取する。このようにして得られた上清部分、すなわち、菌糸体培養物の液体成分が、培養ろ液である。
【００８２】
なお、液体培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖、デキストリン、グリセロールなどが挙げられる。窒素源としては、無機および有機のいずれの窒素源を用いてもよいが、菌糸体の生育速度の観点からは、有機窒素源を用いる方が好ましい。また、液体培地には、微量元素およびビタミンなどの生育因子を添加してもよい。また、液体培地には、菌糸体を均一に生育させる不溶成分を添加してもよい。
【００８３】
ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液について、前述した評価１と同様にしてα−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表７に示す。なお、表７には、菌糸体の５０％エタノール抽出物の評価結果も比較のために示している。また、培養ろ液の評価に際しては、濃縮処理を施すことなく、培養ろ液をそのまま使用したため、表７中には処理濃度は表記していない。
【００８４】
【表７】
【００８５】
表７から明らかなように、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれている。そのため、この培養ろ液を有効成分として含有する組成物は、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００８６】
［血糖値上昇抑制剤］
本発明の血糖値上昇抑制剤は、前述のようにして得られる、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分を含むムラサキシメジからの抽出物（１），（２），（３）、またはムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を、有効成分として含有する。血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの抽出物、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液の単独からなるように構成してもよいし、栄養補強剤として各種ビタミン類などを添加して構成してもよい。また、血糖値上昇抑制剤の剤形は特に制限されず、たとえば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、液状剤などが挙げられる。
【００８７】
［飲食用組成物］
本発明の飲食用組成物は、前述の血糖値上昇抑制剤を含む。飲食用組成物は、本発明の血糖値上昇抑制剤を飲食物材料に混合して得られる。
【００８８】
前記飲食物材料としては、チューインガム、チョコレート、ゼリー、ビスケットなどの菓子類、アイスクリーム、氷菓などの冷菓類、茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料、うどん、中華麺などの麺類、かまぼこ、ちくわなどの練り製品、ドレッシング、ソースなどの調味料、マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類などを挙げることができる。
【００８９】
本発明の飲食用組成物は、ムラサキシメジ由来の血糖値上昇抑制作用を有する成分を含有するので、健康食品などとして有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムラサキシメジからの抽出物、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤および飲食用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満および糖尿病は、過剰カロリーの摂取が主な原因となる。糖尿病には、１型糖尿病（インスリン依存型糖尿病）と２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）との２つのタイプがあるが、その多くは後者のタイプである。
【０００３】
２型糖尿病における高血糖の原因として、食後の急峻な血糖上昇に対応し、瞬時に分泌されるべきインスリンの欠如と、食後高血糖の持続により誘導される内因性インスリンの基礎分泌低下が挙げられる。食後高血糖の是正は、経口血糖降下剤やインスリンを用いても困難なことがあり、消化系における糖類の急速な吸収を防ぐ方法が有望である。
【０００４】
消化系における糖類の吸収としては、糖類のα−１，４結合を切断して単糖に加水分解する小腸中の酵素であるα−グルコシターゼが関与しており、血糖値は、糖類が単糖の形態に分解され血液中へ吸収されることで上昇する。つまり、酵素であるα−グルコシターゼを阻害することにより、食後の血糖値上昇が抑制され、さらにそれに続くインスリン値の上昇も抑制されることになる。
【０００５】
そこで、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有して血糖値を低減させる作用に優れ、かつ安全性が高く長期投与が可能な血糖値上昇抑制剤の開発が望まれている。
【０００６】
ムラサキシメジ（Lepista nuda）は、キシメジ科ムラサキシメジ属に属する食用キノコの１種であり、秋から初冬にかけて広葉樹林の落葉堆積地に群生する腐生菌である。ムラサキシメジは、カサの表面とヒダとが最初は濃い紫色だが、カサが開くにつれて淡くなり、灰白色から淡褐色になる。
【０００７】
このムラサキシメジは、様々な効能があることが知られており、たとえば、特許文献１には、抗疲労作用および持久力増強作用を有することが示されており、特許文献２には、他のキノコ類と併用することで抗菌作用を発現することが示されており、特許文献３には、他のキノコ類と併用することで恒常性バランス補正作用を発現することが示されており、特許文献４，５には、美肌増進作用を発現することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２７７１５８号公報
【特許文献２】特開２００７−１９６１号公報
【特許文献３】特開２００４−３１５５１２号公報
【特許文献４】特開２００５−１５３４８号公報
【特許文献５】特開２００５−２３９６４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、血糖値上昇抑制作用を有する有効成分がムラサキシメジ中、または、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液中に含まれていることについては知られていない。
【００１０】
したがって本発明の目的は、食用キノコの１種であるため安全性が高いムラサキシメジの抽出物、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有し、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有して血糖値上昇を抑制する作用に優れる血糖値上昇抑制剤を提供することであり、該血糖値上昇抑制剤を含む飲食用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤である。
【００１２】
また本発明は、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して得られる水画分であることを特徴とする。
【００１３】
また本発明は、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる０％メタノール画分であることを特徴とする。
【００１４】
また本発明は、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる７５％メタノール画分であることを特徴とする。
【００１５】
また本発明は、抽出物は、下記式（１）で表される化合物を含有することを特徴とする。
【００１６】
【化１】
【００１７】
また本発明は、ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して得られる菌糸体培養物の液体成分である培養ろ液を、有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤である。
【００１８】
また本発明は、前記血糖値上昇抑制剤を含むことを特徴とする飲食用組成物である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する。ムラサキシメジは食用キノコの１種であるので、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤は、食品由来の安全なものである。そして、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００２０】
また本発明によれば、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して得られる水画分である。このような抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇をより効果的に抑制することができる。
【００２１】
また本発明によれば、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる０％メタノール画分である。このような抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇をより効果的に抑制することができる。
【００２２】
また本発明によれば、抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる７５％メタノール画分である。このような抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇をより効果的に抑制することができる。
【００２３】
また本発明によれば、抽出物は、前記式（１）で表される化合物を含有する。前記式（１）で表される化合物は、α−グルコシターゼ阻害活性を有する成分であるので、この化合物を含有する抽出物は、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００２４】
また本発明によれば、血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して得られる菌糸体培養物の液体成分である培養ろ液を、有効成分として含有する。ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれているので、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００２５】
また本発明によれば、本発明の血糖値上昇抑制剤を含む飲食用組成物が提供される。本発明の飲食用組成物は、ムラサキシメジ由来の血糖値上昇抑制作用を有する成分を含有するので、健康食品などとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ムラサキシメジの抽出物を得る手順を示す図である。
【図２】ムラサキシメジのエタノール抽出物を経口投与後の経過時間に対する血糖値の変化を示すグラフである。
【図３】ムラサキシメジの抽出物のＴＬＣによる展開結果を示す図である。
【図４】０％メタノール画分を分画するときのＨＰＬＣのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジからの抽出物であり、より詳細には、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する組成物である。ここで、ムラサキシメジは食用キノコの１種であるので、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤は、食品由来の安全なものである。また、本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する組成物である。そして、本発明の血糖値上昇抑制剤は、α−グルコシターゼ阻害活性を有して、血糖値上昇抑制作用を有する組成物である。前記血糖値上昇抑制作用とは、血糖値の上昇を抑制する作用である。
【００２８】
［ムラサキシメジからの抽出物］
本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有する組成物である。
【００２９】
本発明で用いられるムラサキシメジの子実体は、天然のものであっても、人工栽培されたものであってもよい。人工栽培の方法としては、たとえば人工栽培用の菌床を作製して、ムラサキシメジの種菌を接種して培養する方法が挙げられる。本実施の形態では、ムラサキシメジの子実体は、奈良県奈良市中町の近畿大学農学部敷地内で１０〜１２月に採取された、かさの大きさ１〜１２ｃｍのものを使用する。
【００３０】
また、本発明で用いられるムラサキシメジの菌糸体は、たとえば、液体培地中で培養する液体培養法によって得ることができる。本実施の形態では、ムラサキシメジの菌糸体は、奈良県奈良市中町の近畿大学農学部敷地内で１０〜１２月に採取された、かさの大きさ１〜１２ｃｍのムラサキシメジから分離したものを使用する。
【００３１】
このようにして得られるムラサキシメジの子実体および菌糸体は、乾燥されずにそのまま抽出に供されてもよく、乾燥されて抽出に供されてもよい。また子実体および菌糸体は、粉末化などの加工が施されてから抽出に供されてもよい。抽出効率の観点からは、抽出に供される子実体および菌糸体は、粉末状であることが好ましい。
【００３２】
次に、本発明の血糖値上昇抑制剤に有効成分として含有されるムラサキシメジの抽出物を得る方法について説明する。図１は、ムラサキシメジの抽出物を得る手順を示す図である。ムラサキシメジの抽出物は、ムラサキシメジを溶媒で第１次抽出した後、得られた抽出液を分配抽出、より詳細には液−液分配抽出することによって得られる。
【００３３】
（Ａ）第１次抽出
ムラサキシメジの第１次抽出に用いられる抽出溶媒としては、水の他に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類などが挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いられてもよく、２種以上が混合されて混合溶媒として用いられてもよい。溶媒を混合して用いる場合には、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよい。
【００３４】
前述の抽出溶媒の中でも、取り扱いが容易であり、しかも優れたα−グルコシターゼ阻害活性を有する抽出物を得ることができることから、水、メタノール、エタノールの少なくともいずれか１種の抽出溶媒を用いることが好ましく、特にエタノールを用いることが好ましい。エタノールは、水と混合されてエタノール水溶液として用いられることが好ましい。エタノール水溶液中におけるエタノールの濃度は、たとえば５０体積％であり、好ましくは３０体積％以上８０体積％以下である。以下、特に断らない限り、エタノール水溶液中におけるエタノールの濃度を示す単位「％」は、「体積％」を意味する。
【００３５】
抽出溶媒の量は、特に制限されないが、ムラサキシメジの乾燥重量に対して、５倍以上５０倍以下の重量であることが好ましい。抽出溶媒の重量がムラサキシメジの乾燥重量の５倍未満であると、操作性が悪く、また５０倍を超えると、作業効率が悪い。また、抽出するときの抽出溶媒の温度は、抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性を失活させない程度に選ばれ、具体的には４℃以上６０℃以下であることが好ましい。
【００３６】
具体的な抽出方法の一例を挙げると、たとえば、ムラサキシメジを、その乾燥重量の５倍以上５０倍以下の重量のエタノール水溶液に浸漬し、４℃以上６０℃以下で３日間以上７日間以下静置することによって、α−グルコシターゼ阻害活性成分を抽出することができる。
【００３７】
本実施の形態では、図１に示すように、まずムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液、たとえば５０％エタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得る。
【００３８】
＜エタノール抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性評価＞
エタノール抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性について、以下の評価１を行って確認した。
【００３９】
（評価１）
ムラサキシメジの子実体、菌糸体を、それぞれ５０％エタノール水溶液に浸漬し、８℃で３日間静置して、浸漬抽出した。抽出に用いた試料および溶媒の量を表１に示す。抽出後、桐山ロートおよび桐山ロート用濾紙を用いて吸引濾過し、残渣に再度５０％エタノール水溶液を加えて１回目と同様にして浸漬抽出した。２回の抽出操作で得られた抽出液を合わせて５０％エタノール抽出液とし、このエタノール抽出液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮して、５０％エタノール抽出物とした。得られたムラサキシメジの子実体、菌糸体の５０％エタノール抽出物について、α−グルコシターゼ阻害活性を、以下のようにして評価した。各エタノール抽出物のα−グルコシターゼ阻害活性試験における試料溶液の濃度は、１ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌとした。評価結果を表１に示す。
【００４０】
＜α−グルコシターゼ阻害活性評価＞
株式会社シグマ製のラット小腸由来アセトンパウダーの０．１ｇに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）３ｍｌを添加し、超音波ホモジナイザーにて氷上で１０秒間の破砕を２０回行った後、４℃で１５分間遠心分離（１１０００ｒｐｍ）した。その上清を１．２μｇ／ｍｌ／ｍｉｎの基質を分解する酵素量に調製したものを粗酵素液とした。
【００４１】
任意の濃度に調製した試料溶液５０μｌと粗酵素液１００μｌとを１．５ｍｌ容チューブに入れ、３７℃でプレインキュベートし、そこへ基質として１．５ｍＭ ＰＮＰＧ（p-
nitrophenyl-α-D-glucopyranoside）１００μｌを添加し、反応溶液全量を２５０μｌとして３７℃で１５分間インキュベートした。その後、１００℃で５分間加熱処理し、酵素反応を停止させた。反応溶液を４℃で５分間遠心分離（６０００ｒｐｍ）し、その上清をサンプルＳとする。
【００４２】
また同様にして、試料溶液の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を添加したものをコントロールＣ、基質の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を添加したものをサンプルブランクＳＢとした。
【００４３】
サンプルブランクＳＢを測定ブランクとして、サンプルＳおよびコントロールＣについて、吸光光度計を用いて４０５ｎｍ（p-nitrophenolの極大吸収波長）における吸光度を
測定した。測定結果からα−グルコシターゼ阻害活性率を下記式（１）に従い、算出した。α−グルコシターゼ阻害活性率は、その値が大きいほど、α−グルコシターゼ阻害活性が高いことを示す。
【００４４】
α−グルコシターゼ阻害活性率（％）＝｛（Ｃ−Ｓ）／Ｃ｝×１００ …（１）
式（１）において、符号ＣはコントロールＣの吸光度を示し、ＳはサンプルＳの吸光度を示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
表１から、ムラサキシメジの５０％エタノール水溶液による抽出物は、α−グルコシターゼ阻害活性が高く、血糖値上昇抑制作用を発揮することが明らかである。また、ムラサキシメジの抽出物の原料には、ムラサキシメジの子実体および菌糸体のいずれを用いてもよく、両方を用いてもよいが、菌糸体のエタノール抽出物は、子実体のエタノール抽出物に比べて、α−グルコシターゼ阻害活性が高いので、ムラサキシメジの抽出物の原料には、菌糸体を用いることが好ましい。
【００４７】
＜エタノール抽出物の血糖値上昇抑制作用の評価＞
ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物の血糖値上昇抑制作用について、以下の評価２を行って確認した。
【００４８】
（評価２）
１５時間絶食させた１０〜２０週齢のＳＨＲＳＰラット（脳卒中易発症高血圧自然発症ラット）を用い、１群４匹で２群に分けた。群構成は、ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物が１０％含有されるグルコースの２ｇ／生理食塩水１０ｍｌを１ｍｌ／１００ｇｂ．ｗｔ経口投与した試料投与群と、エタノール抽出物が含有されていないグルコースの２ｇ／生理食塩水１０ｍｌを１ｍｌ／１００ｇｂ．ｗｔ経口投与した対照群とした。
【００４９】
各群のＳＨＲＳＰラットに対して、経口投与前、経口投与後１５、３０、６０、１２０分間経過後に、尾静脈から採血した。採血した血液から遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）により血漿を分離し、分離された血漿サンプル中のグルコース濃度をオキシダーゼ法により測定した。
【００５０】
ここで、前記オキシダーゼ法について説明する。血漿サンプル中のＤ−グルコースは、α−Ｄ−グルコースが３６．５％、β−Ｄ−グルコースが６３．５％の割合で平衡を保っている。このような血漿サンプルに発色液を作用させると、血漿サンプル中のＤ−グルコースでは、発色液中に含まれるムタロターゼによりα−Ｄ−グルコースからβ−Ｄ−グルコースへと速やかに変換される。変換されたβ−Ｄ−グルコースは、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）によって酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、共存するペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により発色液中のフェノールと、４−アミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、赤色の色素を生成する。この赤色の吸光度を測定することによって、血漿サンプル中のグルコース濃度を求めることができる。
【００５１】
評価結果を図２に示す。図２は、ムラサキシメジのエタノール抽出物を経口投与後の経過時間に対する血糖値の変化を示すグラフである。グラフの横軸は経口投与後の経過時間を示し、縦軸は血糖値を示す。なお、グラフ中の血糖値の数値は、各群の４匹のＳＨＲＳＰラットから採血して作製した各血漿サンプルの（平均値±標準誤差）として示した。また、グラフ中の「○」プロットは、試料投与群のＳＨＲＳＰラットから採血して作製した血漿サンプルの血糖値をプロットしたものであり、「△」プロットは、対照群のＳＨＲＳＰラットから採血して作製した血漿サンプルの血糖値をプロットしたものである。
【００５２】
図２から、試料投与群のＳＨＲＳＰラットは、血糖値の上昇が抑制されていることが明らかである。このことから、ムラサキシメジのエタノール抽出物には、α−グルコシターゼ阻害活性が高く、血糖値上昇抑制作用を有する成分が含まれていることがわかる。
【００５３】
（Ｂ）分配抽出
前述の第１次抽出によってムラサキシメジからエタノール抽出物を得た後、濾過、遠心分離などの常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。このようにして得られる抽出液を、濃縮してまたは濃縮せずに、分配抽出する。
【００５４】
分配抽出の溶媒としては、水の他に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールなどのグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素などの極性有機溶媒、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルなどの無極性有機溶媒などが挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いられてもよく、２種以上が混合されて混合溶媒として用いられてもよい。溶媒を混合して用いる場合には、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよい。
【００５５】
本実施の形態では、分配抽出の溶媒としては、水および酢酸エチルを用いる。図１に示すように、エタノール抽出物を減圧下でエタノールがある程度揮発するまで濃縮した後、水および酢酸エチルを加えて液−液分配し、水画分および酢酸エチル画分を得る。
【００５６】
＜エタノール抽出物の画分のα−グルコシターゼ阻害活性評価＞
エタノール抽出物の水画分および酢酸エチル画分のα−グルコシターゼ阻害活性について、以下の評価３を行って確認した。
【００５７】
（評価３）
ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物２７．５ｇに水３００ｍｌおよび酢酸エチル３００ｍｌを加えて液−液分配し、水画分（２７．０ｇ）および酢酸エチル画分（４０７ｍｇ）を得た。得られた水画分および酢酸エチル画分について、前述した評価１と同様にしてα−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表２に示す。なお、表２中の「−」は、α−グルコシターゼ阻害活性を評価していないことを示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
表２に示すように、水画分に高いα−グルコシターゼ阻害活性が認められる。つまり、エタノール抽出物に水および酢酸エチルを加えて液−液分配することによって、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれる抽出物、すなわち水画分に相当する抽出物（１）を得ることができる。このようにして得られた抽出物（１）には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分、つまり血糖値上昇抑制作用を有する成分が含まれている。
【００６０】
本実施の形態では、図１に示すように、高いα−グルコシターゼ阻害活性が認められた水画分（抽出物（１））を、カラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、さらに分画する。
【００６１】
＜カラムクロマトグラフィーにより分画した画分のα−グルコシターゼ阻害活性評価＞
エタノール抽出物の水画分（抽出物（１））をカラムクロマトグラフィーにより分画した画分のα−グルコシターゼ阻害活性について、以下の評価４を行って確認した。
【００６２】
（評価４）
ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物の水画分（抽出物（１））１９．７ｇを、カラム充填剤として逆相吸着樹脂であるＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、水およびメタノールを用いたステップワイズグラジエント法にて、０％メタノール（水）画分（１４．１ｇ）、２５％メタノール画分（５８０ｍｇ）、５０％メタノール画分（１９５ｍｇ）、７５％メタノール画分（８３ｍｇ）、１００％メタノール画分（１２９ｍｇ）に分画した。得られた各画分について、前述した評価１と同様にしてα−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表３に示す。なお、表３中の「−」は、α−グルコシターゼ阻害活性を評価していないことを示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３に示すように、０％メタノール画分および７５％メタノール画分に高いα−グルコシターゼ阻害活性が認められる。つまり、エタノール抽出物の水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて分配することによって、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれる２つの抽出物、すなわち０％メタノール画分に相当する抽出物（２）、および７５％メタノール画分に相当する抽出物（３）を得ることができる。このようにして得られた抽出物（２）および抽出物（３）には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分、つまり血糖値上昇抑制作用を有する成分が含まれている。
【００６５】
［α−グルコシターゼ阻害活性物質の推定］
次に、ムラサキシメジの抽出物に含まれるα−グルコシターゼ阻害活性物質を推定するために行った、評価５〜７について説明する。
【００６６】
（評価５）
展開溶媒をクロロホルム：メタノール：水＝６：４：１として、薄層クロマトグラフィー（略称ＴＬＣ）を用いてムラサキシメジの抽出物を分析したところ、図３に示すようなスポットが確認された。図３は、ムラサキシメジの抽出物のＴＬＣによる展開結果を示す図である。なお、分析に用いたＴＬＣは、ＴＬＣ−Ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０ Ｆ２５４（メルク株式会社製）であり、発色剤として５０％硫酸を用いた。図３では、紙面に向かって左側から順に、ムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物の水画分（抽出物（１））、カラムクロマトグラフィーにより分画した０％メタノール画分（抽出物（２））、２５％メタノール画分、５０％メタノール画分、７５％メタノール画分（抽出物（３））、１００％メタノール画分の展開結果を示す。
【００６７】
図３に示すように、特に０％メタノール画分（抽出物（２））には、α−グルコシターゼ阻害活性物質に由来すると思われる黒く発色したスポットが確認された。
【００６８】
（評価６）
次に、高速液体クロマトグラフィー（略称ＨＰＬＣ）によって０％メタノール画分である抽出物（２）を分析したところ、図４に示すようなチャートが得られた。図４は、０％メタノール画分を分画するときのＨＰＬＣのチャートである。なお、分析に用いたＨＰＬＣは、Ｃｌａｓｓ ＡＶ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（株式会社島津製作所製）である。また、ＨＰＬＣによる分析は、表４に示す条件で行った。
【００６９】
【表４】
【００７０】
図４に示すように、抽出物（２）である０％メタノール画分には、α−グルコシターゼ阻害活性物質に由来すると思われる３つのピーク１，２，３が確認された。３つのピーク１，２，３に対応する保持時間に基づいて、複数の画分に分画することによって、各ピークに由来する化合物を分取することができる。
【００７１】
（評価７）
高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含有されるムラサキシメジ菌糸体の５０％エタノール抽出物を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、１００℃で１時間加熱処理し、α−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表５に示す。なお、表５には、加熱処理を施していないエタノール抽出物の評価結果も比較のために示している。
【００７２】
【表５】
【００７３】
表５に示すように、ムラサキシメジのエタノール抽出物に含まれるα−グルコシターゼ阻害活性物質は、加熱処理によって阻害活性が低下することがなく、加熱処理によって変成することはない。
【００７４】
α−グルコシターゼ阻害活性物質は、水画分に含まれていることから、水溶性の蛋白質、糖類、β−グルカン系の化合物であると考えられる。
【００７５】
［α−グルコシターゼ阻害活性物質の同定］
高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する、カラムクロマトグラフィーにより分画した０％メタノール画分である抽出物（２）について、ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その抽出物（２）のスペクトルデータを表６に示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】
得られたスペクトルデータと、（Phytochemistry,65,91-97,2004）に記載されるスペクトルデータとを比較することにより、抽出物（２）を、下記式（１）に示す化学構造を有する化合物（Ethyl-β-D-glucoside）と同定した。
【００７８】
【化２】
【００７９】
したがって、式（１）に示す化学構造を有する化合物を含有する抽出物（２）は、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００８０】
［ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液］
本発明の血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を有効成分として含有する組成物とすることもできる。
【００８１】
ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液は、次のようにして作製することができる。まず、ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して、液体中に菌糸体が浮遊した状態の菌糸体培養物を得る。そして、菌糸体培養物を遠心分離し、上清部分を採取する。このようにして得られた上清部分、すなわち、菌糸体培養物の液体成分が、培養ろ液である。
【００８２】
なお、液体培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖、デキストリン、グリセロールなどが挙げられる。窒素源としては、無機および有機のいずれの窒素源を用いてもよいが、菌糸体の生育速度の観点からは、有機窒素源を用いる方が好ましい。また、液体培地には、微量元素およびビタミンなどの生育因子を添加してもよい。また、液体培地には、菌糸体を均一に生育させる不溶成分を添加してもよい。
【００８３】
ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液について、前述した評価１と同様にしてα−グルコシターゼ阻害活性を評価した。評価結果を表７に示す。なお、表７には、菌糸体の５０％エタノール抽出物の評価結果も比較のために示している。また、培養ろ液の評価に際しては、濃縮処理を施すことなく、培養ろ液をそのまま使用したため、表７中には処理濃度は表記していない。
【００８４】
【表７】
【００８５】
表７から明らかなように、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液には、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分が含まれている。そのため、この培養ろ液を有効成分として含有する組成物は、血糖値上昇を効果的に抑制することができる。
【００８６】
［血糖値上昇抑制剤］
本発明の血糖値上昇抑制剤は、前述のようにして得られる、高いα−グルコシターゼ阻害活性を有する成分を含むムラサキシメジからの抽出物（１），（２），（３）、またはムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液を、有効成分として含有する。血糖値上昇抑制剤は、ムラサキシメジの抽出物、ムラサキシメジの菌糸体培養物の培養ろ液の単独からなるように構成してもよいし、栄養補強剤として各種ビタミン類などを添加して構成してもよい。また、血糖値上昇抑制剤の剤形は特に制限されず、たとえば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、液状剤などが挙げられる。
【００８７】
［飲食用組成物］
本発明の飲食用組成物は、前述の血糖値上昇抑制剤を含む。飲食用組成物は、本発明の血糖値上昇抑制剤を飲食物材料に混合して得られる。
【００８８】
前記飲食物材料としては、チューインガム、チョコレート、ゼリー、ビスケットなどの菓子類、アイスクリーム、氷菓などの冷菓類、茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料、うどん、中華麺などの麺類、かまぼこ、ちくわなどの練り製品、ドレッシング、ソースなどの調味料、マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類などを挙げることができる。
【００８９】
本発明の飲食用組成物は、ムラサキシメジ由来の血糖値上昇抑制作用を有する成分を含有するので、健康食品などとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤。
【請求項２】
抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して得られる水画分であることを特徴とする請求項１に記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項３】
抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる０％メタノール画分であることを特徴とする請求項１に記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項４】
抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる７５％メタノール画分であることを特徴とする請求項１に記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項５】
抽出物は、下記式（１）で表される化合物を含有することを特徴とする請求項３に記載の血糖値上昇抑制剤。
【化３】
【請求項６】
ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して得られる菌糸体培養物の液体成分である培養ろ液を、有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の血糖値上昇抑制剤を含むことを特徴とする飲食用組成物。
【請求項１】
ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤。
【請求項２】
抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して得られる水画分であることを特徴とする請求項１に記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項３】
抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる０％メタノール画分であることを特徴とする請求項１に記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項４】
抽出物は、ムラサキシメジの菌糸体および子実体の少なくともいずれか一方をエタノール水溶液で抽出してエタノール抽出物を得て、このエタノール抽出物を水および酢酸エチルで分配して水画分を得て、この水画分をカラムクロマトグラフィーに供して水およびメタノールを用いて、ステップワイズグラジエント法にて分配して得られる７５％メタノール画分であることを特徴とする請求項１に記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項５】
抽出物は、下記式（１）で表される化合物を含有することを特徴とする請求項３に記載の血糖値上昇抑制剤。
【化３】
【請求項６】
ムラサキシメジの菌糸体を液体培地中で培養して得られる菌糸体培養物の液体成分である培養ろ液を、有効成分として含有することを特徴とする血糖値上昇抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の血糖値上昇抑制剤を含むことを特徴とする飲食用組成物。
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図２】
【図４】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１９５７６７（Ｐ２０１０−１９５７６７Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４２８６３（Ｐ２００９−２４２８６３）
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【出願人】（３９５００５４２４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【出願人】（３９５００５４２４）
【Ｆターム（参考）】
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