軟骨魚類から単離されたプロテオグリカンおよびその製造方法
少量摂取で効果を発揮し、かつ効果の作用機序が明確な軟骨抽出物およびその製造方法を提供する。軟骨魚類の軟骨の水抽出物に由来し、主成分が５００ｋＤａ以上の分子量を有する単離されたプロテオグリカン、前記プロテオグリカンを含有する組成物、前記プロテオグリカンを有効成分として含有する医薬組成物、ならびに軟骨魚類由来の軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程、前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程、前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程、および、前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程を含むプロテオグリカンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、軟骨魚類から単離されたプロテオグリカンおよびその製造方法に関する。詳しくは健康の維持、生活の質の向上または医薬として有用なプロテオグリカンおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
癌は人類を悩ます共通の疾患であり、その治療は全地球的な課題となりつつある。我が国においては、主な死亡原因が感染症から生活習慣関連病へと移行する中で、特に癌は日本人の死亡原因の第１位となり、疾病対策上の最重要課題として研究が進められてきた。癌はすべての臓器・組織に発生しうるもので、体質・性別・年齢・地域および生活習慣の違いによって異なる。また癌の種類によって転移や増殖能を主としたすべての性質が異なるため、いまだ決定的な治療法を確立するに至らないのが現状である。
癌細胞の特徴として、血管新生を伴って栄養分を確保し、無秩序に自立性増殖を行い、転移・浸潤により身体の様々な部位に新しい癌組織を生成する。これに加えて、癌性悪液質により宿主を衰弱させ死に至らしめる。現在行われている癌の治療法として切除や抗癌剤投与、免疫療法、温熱療法、放射線照射等が存在するが、癌の種類により効果が異なったり、原発巣部位によっては利用できなかったり、さらに副作用による宿主の衰弱が問題となっている。そこで、固形癌に共通である血管新生や転移・浸潤を阻害する治療法が注目されている（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１，１９９５）。
癌細胞の転移や浸潤、血管新生の際には、細胞を取り巻いている細胞外基質や基底膜を破壊するために、主としてマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を用いることが知られている。それをもとに今日、癌治療の新しいターゲットとして、ＭＭＰを阻害することにより癌の転移・浸潤および血管新生を阻害し、癌の進行を抑制するという方法が用いられており、様々な合成のＭＭＰ阻害剤が開発されている（Ｉｋｉ Ｋ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９９９ Ｊｕｌ；２０（７）：１３２３−９、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ａ．Ｈ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９７）、Ｎａｉｔｏ Ｋ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９４ Ｓｅｐ １；５８（５）：７３０−５）。しかし副作用として骨髄毒性、細胞毒性、関節痛が報告され、実用上問題となっている。
一方、天然物に対する最近の傾向として、漢方や食品中において各種疾患の予防・進行抑制に有効な成分が見出され、その一部は特定保健用食品として厚生労働省より効能の表示が認められている。癌治療においても食品由来の成分は注目を集めており、様々な食品中の成分の癌抑制効果が研究されている。そのうち、軟骨組織には血管形成がなされないことから、軟骨組織中には血管新生阻害活性物質が含まれていると考えられている。事実、腫瘍の周辺に軟骨抽出物を注入した実験において、腫瘍の増殖や血管新生の抑制が見られた（Ｌｅｅ Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３ Ｓｅｐ １６；２２１（４６１６）：１１８５−７）。サメ軟骨の血管新生阻害能のひとつとしてＭＭＰの阻害が挙げられており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＭＰの阻害が見出され（Ｍｏｓｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２３０−２３５，１９９１、Ｇｉｎｇｒａｓ Ｄ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２００１：１９（１−２）：８３−６）、また動物に経口投与した実験においても血管新生の阻害が見られることが報告されている（Ｄａｖｉｓ ＰＦ．ら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ １９９７ Ｓｅｐ；５４（２）：１７８−８２）。これらの知見をもとに、サメは軟骨魚類であり質のよい軟骨が硬骨動物に比べて多く採取できるということから、サメ軟骨パウダーの癌の進行遅延または抑制を期待して癌患者に経口で用いられる代替療法や臨床研究が行なわれている（Ｅｒｎｓｔ Ｅ．、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：２９８ １９９８）。しかし、サメ軟骨の経口摂取によるｉｎ ｖｉｖｏでのサメ軟骨の腫瘍抑制効果の仕組みはほとんど分かっておらず、またサメ軟骨の経口摂取により組織中でサメ軟骨がＭＭＰを阻害しているという知見は得られていない。
サメ軟骨から有効成分を得る方法としては、サメ軟骨を微粉末状にしてそのまま有効成分として用いる方法（特開２００１−４８７９５号公報）またはサメの軟骨を粉砕して水抽出して得られる凍結乾燥物の製造方法が知られている（特表平９−５１２５６３号公報、米国特許第４４７３５５１号明細書）。
【発明の開示】
しかし、前記方法で得られたサメ軟骨由来の成分は、効果を得るために過大な量を摂取しなければならないこと、あるいは他の有効成分と併用することにより抗腫瘍活性や抗炎症活性を発揮することができるものであり、その効果の作用機序は証明されていない。
そこで、本発明の目的は、少量摂取で効果を発揮し、かつ効果の作用機序が明確な軟骨抽出物およびその製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成すべく、軟骨から効率よく有効成分を抽出する条件および有効成分の特性について鋭意研究したところ、下記要件を満たす成分およびその製造方法により所期の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の単離されたプロテオグリカンは、軟骨魚類の軟骨の水抽出物に由来し、主成分が５００ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする。
前記プロテオグリカンは、アルコールに不溶性であることが好ましい。
前記プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン部分がコンドロイチン硫酸Ｃを主成分とすることが好ましい。
前記プロテオグリカンは、マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害活性を有することが好ましい。
前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９の場合、前記阻害活性が０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性の減少を回復させる作用、または０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を少なくとも５％増加させる作用であることが好ましい。
前記プロテオグリカンは、有効量の生体内摂取によりカテプシンＢに対する阻害活性を上昇させる作用を有することが好ましい。
前記プロテオグリカンは、有効量の生体内摂取により血清中のハプトグロビン量を増大させる活性を有することが好ましい。
本発明の組成物は、前記プロテオグリカンを含有することを特徴とする。
前記組成物は、生活の質を向上させるために用いられることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、前記プロテオグリカンを有効成分として含有することを特徴とする。
本発明のプロテオグリカンの製造方法は、軟骨魚類由来の軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程、
前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程、
前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程、および
前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程を含むことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で得られたサメ軟骨水抽出物の組成を示す図である。
図２は、実施例１のゲルろ過ＨＰＬＣで得られたＭＭＰ−９阻害活性画分のアミノ酸組成を示す図である。
図３は、実施例１で得られたサメ軟骨水抽出物のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９阻害活性を示す図である。
図４は、等電点電気泳動による各画分のｐＨとＭＭＰ−９阻害活性との相関を示す図である。
図５は、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５）のチャート図である。
図６は、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５）による各画分のＭＭＰ−９阻害活性を調べた電気泳動の図である。
図７は、セルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す図である。
図８Ａは、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００）のチャート図である。図８Ｂは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００の溶出時間と分子量との関係を示す図である。図８Ｃは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００による各画分のＭＭＰ−９阻害活性を示す図である。
図９は、本発明品とコンドロイチン硫酸Ｃと市販サメ軟骨のＭＭＰ−９阻害活性を比較した図である。サンプル水溶液５μｌを１０μｌの活性型ＭＭＰ−９に加え、３７℃で２４時間反応させたときのＭＭＰ−９の残存活性を示す。
図１０は、実施例１において化学発癌ハムスターの癌抑制効果を示す図である。基礎食または実験食で５０日間飼育したときの腫瘍数を示す。★：ｐ＜０．０５。
図１１は、実施例３において膵臓癌患者の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を示す図である。
図１２は、実施例３において膵臓癌患者の血清中のＩＶ型コラーゲン断片を定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の単離されたプロテオグリカンは、軟骨魚類の軟骨の水抽出物に由来し、主成分が５００ｋＤａ以上の分子量を有するものである。
前記プロテオグリカンの原料となる軟骨魚類は、特に限定されるものではなく板鰓類および全頭類を含むものであり、例えば板鰓類としてはサメ、エイなどがあげられ、全頭類としてはギンザメなどがあげられる。
本発明において原料となる軟骨は、前記軟骨魚類に由来するものであれば特に限定されずに使用することができる。
「主成分」とは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより５００ｋＤａ以上の分子量を有する画分に主要ピークを生じることをいう。
したがって、「５００ｋＤａ以上の分子量」とはゲルろ過クロマトグラフィーにより見積られた分子量をいい、具体的にはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００を用いて測定し、５００ｋＤａないし排除限界１３００ｋＤａまでの分子量である。
本発明のプロテオグリカンは、アルコールに不溶性であることが好ましい。前記アルコールとしてはメタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールが好ましい。
すなわち、本発明のプロテオグリカンは、前記のような高分子化合物であり、アルコールに不溶性であることが好ましい。
ここで、プロテオグリカンとはグリコサミノグリカンとタンパク質との共有結合化合物をいう。前記グリコサミノグリカン部分は、コンドロイチン硫酸Ｃを主成分とすることが好ましい。前記タンパク質部分は、後述する実施例１および図２に記載のようなアミノ酸組成を有することが好ましい。
本発明のプロテオグリカンは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する阻害活性を有することが好ましい。当該プロテオグリカンは、有効量の生体内摂取によりマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する阻害活性を上昇させる作用を有することが好ましい。
ＭＭＰとしては動物由来のものであれば特に限定されるものではなく、前記動物としては、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、ニワトリ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等の家畜類やヒトなどがあげられる。ＭＭＰの種類としては、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３などの誘導型ＭＭＰ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１４などの恒常型ＭＭＰがあげられるが、腫瘍の血管新生に関与するという観点から、血管を裏打ちしている基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンまたはＶ型コラーゲンを分解するゼラチナーゼ群であるＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９が好ましい。
本発明において「有効量」とは、動物の生体内において、ＭＭＰ阻害活性の上昇作用、カテプシンＢ阻害活性の上昇作用または血清中のハプトグロビン量の増大活性を奏するに足る量をいい、動物の種類や、年齢、性別、体重などの個体差により異なるが、ハムスターにおけるＭＭＰ阻害活性を上昇させるためには、１日当たり１〜５０ｍｇ程度が例示される。ヒトにおけるＭＭＰ阻害活性を上昇させるためには、１日当たり１〜１５ｇ程度が例示される。
前記ＭＭＰがＭＭＰ−９の場合、ＭＭＰ−９の阻害活性の増加は、０．４重量％のプロテオグリカンを添加した餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性の減少を回復させる作用、または０．４重量％のプロテオグリカンを添加した餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を少なくとも５％増加させる作用であることが好ましい。前記ＭＭＰ−９の阻害活性の増加は、より好ましくは２０％以上である。これにより、癌の成長や転移を有効に抑制することができる。
血清中のＭＭＰ−９の阻害能は、本発明者らにより初めて測定することが可能となったものであり、所定量のＶ型コラーゲンとＭＭＰ−９に血清を混合してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングで解析した後デンシトメトリーによりＶ型コラーゲンの量を定量することにより測定することができる。ＭＭＰ−９の活性は、３７℃、２４時間の反応でＶ型コラーゲンを１０％分解する活性を１ｍＵとして定義する。したがって、血清中のＭＭＰ−９の阻害活性は、１ｍＵのＭＭＰ−９の活性を阻害する活性を１ｍＵとして定義することができる。
本発明のプロテオグリカンは、有効量の生体内摂取によりカテプシンＢに対する阻害活性を上昇させる作用を有することが好ましい。カテプシンＢに対する阻害作用を通じて、抗癌作用を発揮することができる。カテプシンＢの種類としては、前記ＭＭＰと同様の動物種由来のものがあげられる。
カテプシンＢの阻害活性は、生体内摂取した動物の血清を用いて、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８１；８０巻、ｐ．５３５−５６１に記載の方法に準じて測定することができる。前記活性は、本発明のプロテオグリカン摂取前の血清と比べて、摂取後の血清において有意に増大していることを指標とする。
また、本発明のプロテオグリカンは、有効量の生体内摂取により血清中のハプトグロビン量を増大させる活性を有することが好ましい。血清中のハプトグロビン量を増大させることによって、前記カテプシンＢに対する阻害作用を通じて抗癌作用を発揮することができる。ハプトグロビンの種類としては、前記ＭＭＰと同様の動物種由来のものがあげられる。
血清中のハプトグロビン量は、生体内摂取した動物の血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、染色してデンシトメーターにより定量する。前記活性は、本発明のプロテオグリカン摂取前の血清と比べて、摂取後の血清において有意に増大していることを指標とする。
本発明は、前記プロテオグリカンを含有する組成物を提供する。本組成物中に含まれるプロテオグリカンの割合は、目的に応じて適宜設定することができるが、通常０．００１〜９９．９重量％である。
本組成物中に含まれる他の成分は、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、組成物が食品の場合、通常の食品の原材料に本発明のプロテオグリカンを一定量混合して食品とすることができる。また、組成物が補助食品（いわゆるサプリメント）の場合、本発明のプロテオグリカンと所望によりデンプンなどの増量剤、ブドウ糖、砂糖、シロップなどの甘味料、香料または水などとを混合して、飲食が容易な形状、例えば錠剤、カプセル、液体とすることができる。前記組成物には、軟骨魚類の軟骨に由来する任意の成分、例えば軟骨粉砕物（ホモジネートを含む）そのもの、軟骨水抽出物由来の他の成分（分子量５００ｋＤａ未満のプロテオグリカン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、ミネラルなど）またはローヤルゼリー、カキエキス、ビタミン類、グルコサミン、キチンキトサン、酵母などの軟骨魚類の軟骨に由来しない成分であって健康によいとされる成分を含有してもよい。
前記組成物は、生体内摂取により特定の機能を発揮するプロテオグリカンを含むことから、健康な状態の維持・向上または不健康な状態（病気に罹患した状態を含む）の改善を含む生活の質を向上させるために用いられることが好ましい。
本発明は、前記プロテオグリカンを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物の対象となる疾患は、血管新生または脈管形成を伴う疾患であり、例えば、癌の成長、癌の転移、慢性関節リウマチなどの関節炎、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬および血管の構成成分を伴う炎症疾患があげられるが、これに限定されるものではない。
本発明の医薬組成物は、前記プロテオグリカンそのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤または注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の含有量、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２０ｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
本発明は、前記プロテオグリカンの製造方法を提供する。当該製造方法は、軟骨魚類由来の軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程、
前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程、
前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程、および
前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程
を含むことを特徴とする。以下、前記工程を含む本発明の製造工程について説明する。
（１）原料およびその前処理
原料となる軟骨は、前記軟骨魚類に由来するものであれば特に限定されずに使用することができる。軟骨の周りに付着している肉、皮などの不要部分は予め取り除いておくことが望ましい。軟骨の部位は特に限定されるものではなく、中骨、ヒレ、頭部軟骨などがあげられる。軟骨は、生軟骨、乾燥軟骨、およびこれらの冷凍品のいずれも使用することができるが、原料の調達しやすさから乾燥軟骨またはその冷凍品が好ましい。軟骨の乾燥は、天日干しまたは６０℃程度の乾燥機を利用することができる。
（２）軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程
下記抽出工程を効率よく行うため、前記軟骨を粉砕する。粉砕方法としては、乾式粉砕または湿式粉砕があげられる。乾式粉砕は、乾燥軟骨またはその冷凍品を用いて行うことができる。湿式粉砕は生軟骨単独でまたは生軟骨もしくは乾燥軟骨に水を添加して行うことができる。粉砕物の粒径の制御の容易さから、乾式粉砕が好ましい。
乾式粉砕に使用する装置としては、冷凍粉砕機、ジェットミルなどがあげられる。
湿式粉砕に使用する装置としては、ホモジナイザ、湿式媒体ミルなどがあげられる。
粉砕物の平均粒径は、０．１〜１００μｍ、好ましくは１〜５０μｍである。０．１μｍ未満にすると生産性が低下する傾向があり、１００μｍを越えると抽出効率が低下する傾向がある。
ここで、平均粒径とは、体積基準分布が中央値（積算分布の５０％に対する粒子径）である粒子と同じ体積の球の直径を指し、レーザー回折法、遠心沈降法などの粒度分布測定装置によって測定することができる。
生産性を高めるためには、軟骨を予め粗粉砕した後、前記粉砕をしてもよい。粗粉砕の方法および装置は特に限定されず、例えばハンマーミルなどの粗粉砕機を使用して行うことができる。粗粉砕は、粉砕物の平均粒径が０．５〜１０ｍｍ程度となるように行えばよい。
（３）前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程
前記粉砕物に水を添加する。添加する水は特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水または蒸留水などがあげられる。水の温度も特に限定されるものではない。また、水のｐＨも特に限定されるものではなく、特にｐＨ調整をすることなく使用することができる。
水の添加量は、通常、粉砕物の重量に対して１〜１０倍の量である。
抽出条件は、粉砕物と水とを撹拌しながら、通常１分〜２４時間程度行う。１分未満では十分な抽出が行われず、２４時間以上では生産性が低下する傾向がある。また、抽出回数は１回でも複数回でもよいが、得られる水相の容量が一定の範囲内になるように、水の添加量と抽出回数を設定すればよい。
（４）前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程
抽出工程終了後、抽出された水溶性成分を含む水相を懸濁抽出液から分離する。分離方法は、通常の固液分離を行えばよい。例えば、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどがあげられる。
（４’）濃縮工程
工程（４）で得られた水相は、必要に応じて濃縮することができる。濃縮方法は、特に制限されないが、加熱濃縮、凍結濃縮、限外ろ過膜による濃縮などがあげられる。濃縮の程度は得られた水相の容量により適宜設定できるが、通常元の容量の７５％以下に濃縮する。
（５）前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程
工程（４）または（４’）で得られた水相にアルコールを添加して、アルコール不溶成分を析出させ、沈殿物を得る。
添加するアルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノールがあげられるが、食品用途にはエタノールが好ましい。アルコールの添加量は、不溶成分の析出が目視できる程度に添加すればよいが、通常水１に対して１〜３倍容量である。析出条件は特に限定されないが、０〜６０℃で１分〜２４時間程度静置すればよい。
（６）沈殿物を回収する工程
工程（５）で得られた沈殿物は、遠心分離、ろ過などにより回収する。回収した沈殿物は、アルコールおよび水分を除去するため、乾燥させることが好ましい。乾燥方法は、風乾または凍結乾燥などがあげられる。
（７）沈殿物を整粒する工程
得られた沈殿物は、保管性や取扱い性をよくするため、さらに水分を除去して粉末化することが望ましい。乾燥水分値は、保管が容易な程度であればよい。さらに、用途に応じて粉砕、造粒などを行ってもよい。
（８）分子量が５００ｋＤａ以上の画分を分取する工程
工程（６）で回収した沈殿物は、実質的に本発明のプロテオグリカンからなるものである。用途によっては、工程（６）の沈殿物をゲルろ過等によりさらに精製することができる。精製方法は、分取用ゲルろ過クロマトグラフ（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００）を用いて５００ｋＤａ以上の画分を分取することにより行うことができる。また、カットオフ値が５００ｋＤａの膜ろ過を濃縮工程で行うことで、工程（８）を代替してもよい。
（９）等電点電気泳動によりｐＩが５．５以下の画分を分取する工程
工程（６）で回収した沈殿物または工程（８）で精製した精製物は、実質的に本発明のプロテオグリカンからなるものである。用途によっては、工程（６）の沈殿物または工程（８）の精製物を等電点電気泳動によりさらに精製することができる。精製方法は、分取用等電点電気泳動装置（例えば、Ｒｏｔｏｆｏｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてｐＩが５．５以下の画分を分取することにより行うことができる。分取する画分は、好ましくはｐＩが５．０以下、より好ましくは２〜３である。
工程（８）または工程（９）により分取した画分は、溶媒を除去した後、工程（７）の整粒工程に供することができる。
このようにして得られた本発明のプロテオグリカンは、単独で、または食品もしくは医薬品の有効成分として利用することができる。本発明のプロテオグリカンは、その有効量を動物の体内に摂取すると、ＭＭＰ阻害活性の上昇作用、カテプシンＢ阻害活性の上昇作用、ハプトグロビンの発現亢進作用を通じて、疾患の予防、治療を含む生活の質の向上（ＱＯＬ）に寄与することができる。
【実施例】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
サメ軟骨由来のプロテオグリカンの単離
（１）サメ軟骨抽出物の調製
天日干しして乾燥させたサメ軟骨（ヨシキリサメの軟骨）を、粗粉砕機（ホソカワミクロン（株）製、ＦＭ−１）で平均粒径が５ｍｍ程度まで粗粉砕した。得られた粗粉砕物を、冷凍粉砕機（ホソカワミクロン（株）製、ＬＸ−１）で液体窒素とともに粉砕し、平均粒径２５μｍの微粉末を得た。平均粒径は、マイクロトラック９３２０ＨＲＡ（リーズ・アンド・ノースラップ社製）を用いて測定した。得られた微粉末３ｋｇに対して蒸留水１５ｋｇを加え、室温で２０分間撹拌した後、遠心分離（５分、３０００ｒｐｍ）して上清を得た。残った残渣にさらに１０ｋｇの蒸留水を加え、室温で２０分間撹拌した後、前記と同様に遠心分離して上清を得た。以上の上清を合わせて、限外ろ過膜（分画分子量６ｋＤａ、ＳＩＰ−１０５３、ＩＤ１．４ｍｍ、旭化成製）により約６５％の容量になるまで濃縮した。得られた濃縮液に３倍容量のエタノールを加えて室温で２時間静置し、沈殿物を析出させた。析出した沈殿物を遠心分離（５分、３０００ｒｐｍ）により回収し、４０℃で乾燥させた。乾燥したサメ軟骨抽出物を、コーヒーミルで粉砕し、以下の実験に用いた。
（２）水分量測定
常圧加熱乾燥法により水分含量を算出した。十分に乾燥させたるつぼの風袋を測り、そこに前記（１）で得た試料１ｇを正確に計り取った。１２０℃の試料乾燥機で１時間乾燥させ、放冷した後、秤量した。これを重量が一定となるまで繰り返し、その後重量の減少量から各試料中の水分含量を算出した（図１）。
（３）灰分量測定
るつぼの風袋を測り、そこに前記（１）で得た試料を０．２ｇ計り取った。るつぼをバーナーで焼き、煙が出なくなったら火を止め、デシケーターに入れて５００℃に設定しておいた電気炉内に置いた。２４時間放置後、放冷し、秤量し、重量変化から灰分量を算出した（図１）。
（４）アミノ酸分析
前記（１）で得た試料の水溶液（２００μｇ／ｍｌ）１００μｌとスタンダード３０μｌ（アミノ酸混合標準溶液Ｈ型を１０μｌ、２．５μｍｏｌ／ｍｌ Ｈｙｐを１０μｌ、２．５μｍｏｌ／ｍｌ Ｈｙｌを１０μｌ）を、各々別の洗浄済小試験管（６ｍｍ×５ｃｍ）に加え、遠心真空乾固した。その後、ミニナートバルブを備えた１５ｍｌリアクティブバイアルに入れ、３００μｌの６Ｎ ＨＣｌとともに減圧下（０．１−０．２Ｔｏｒｒ）で、１５０℃１時間加水分解した。次に、ＨＣｌを除去するために真空乾固した。
メタノール：トリエチルアミン：蒸留水＝７：２：１に調製した混合液を１０μｌずつ加えて真空乾固した。ついで、メタノール：トリエチルアミン：蒸留水：フェニルイソチアネート＝７：１：１：１からなる誘導化液を２０μｌずつ加え、２０分間室温で誘導化した後、真空乾固した。そこで、１０％アセトニトリルを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｗａｔｅｒｓ社製、Ｐｉｃｏ−Ｔａｇサンプル希釈液）を、スタンダードには５００μｌ、試料には２００μｌ添加した。ついで、試験管をパラフィルムで密封して超音波でフェニルイソチアネートの結晶を破壊し、０．４５μｍのフィルターでろ過後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３分）し、上清（スタンダードは１０μｌ、試料は２０μｌ）を逆相ＨＰＬＣで分析した。カラムはＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒ １００ＰＲ−１８（ｅ）（Ｍｅｒｃｋ社製）を、溶離液はＡ液：５％アセトニトリルを含む１５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｂ液：６０％アセトニトリルを使用した。グラジエント構成は、溶離液Ｂを０−２分：０％、２−２０分：１０−４７．５％、２０−２５分：４７．５−１００％、２５−３７分：１００％、３７−５０分：０％とし、検出は２５４ｎｍ、流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。結果を図１に示す。
（５）カルバゾール硫酸法によるコンドロイチン硫酸量の測定
前記（１）で得た試料の水溶液（２００μｇ／ｍｌ）０．２５ｍｌを試験管にとり、氷水で冷却撹拌しながら１．５ｍｌの硫酸溶液（四ホウ酸ナトリウム１０水和物０．９５ｇを１００ｍｌの濃硫酸に溶かす）を滴下し、０．０５ｍｌの０．１２５％カルバゾール溶液（１２．５ｍｇのカルバゾールを１０ｍｌのエタノールに溶かす）を加え、十分に混合した後、ガラス球でふたをし、沸騰水中で２０分間加熱した。室温で冷却後、５３０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ ＤＵ６４０，ＢＥＣＫＭＡＮ社製）で測定した（Ｔ．Ｂｉｔｔｅｒ，Ｈ．Ｍ．Ｍｕｉｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４，３３０，１９６２）。スタンダードにはコンドロイチン硫酸Ｃ（２０、４０、１００、２００μｇ／ｍｌ）を用い、同様の操作を行った。
［結果］
前記（１）で得られたサメ軟骨水抽出物は、図１に示すように、タンパク質とコンドロイチン硫酸を主成分（それぞれ３０．８％と４４．２％）とし、水分が５．８％と灰分が１９．２％の組成であった。また、サメ軟骨抽出物に含まれるタンパク質のアミノ酸組成は、Ｇｌｙを多く含み、コラーゲン特有のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を含んでいた。この組成は、サメ軟骨ＩＩ型コラーゲンの組成とほぼ一致した。ＩＩ型コラーゲンとともに、Ｓｅｒなどが多いことから、プロテオグリカンのタンパク成分を含むことが示唆された。
次に、後述のゲルろ過で精製して得られたＭＭＰ−９阻害活性の画分を、前記（４）と同様の方法でアミノ酸分析を行った。結果を図２に示す。図２より、ヒドロキシプロリンをほとんど含まないため、前記画分は、そのタンパク成分が主としてプロテオグリカンに由来することが示唆された。
（６）サメ軟骨水抽出物のＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９阻害活性
０．６ｍｌマイクロチューブに４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｂｒｉｊ３５（ＩＣＩ社製）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８６）１０μｌ、０．１％Ｖ型コラーゲン（牛胎盤由来ペプシン分解、株式会社ヤガイ製）溶液１０μｌ、前記（１）で得られた試料（０．０１〜２．０％水溶液に調製）５μｌ、ＭＭＰ−２溶液またはＭＭＰ−９溶液１０μｌを加え、３７℃で２４時間酵素反応させた。なおネガティブコントロール（ＮＣ）として試料とＭＭＰ−９を除いたもの、ポジティブコントロール（ＰＣ）として試料を除いたものを用い、代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を同じ量になるように加えた。反応後、０．５Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸（ｐＨ７．５）を２０μｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウムおよび０．１％ブロモフェノールブルーをそれぞれ５μｌ加え、熱湯で加熱した。そのうち１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いでウエスタンブロット法によりＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＯＤイムノステインセット（和光純薬工業株式会社製）によりＶ型コラーゲンとその分解産物のバンドを分離・同定した。各バンド濃度はデンシトメータで測定し、Ｖ型コラーゲンのα１、α２鎖に対する分解産物のバンド鎖（α１’、α２’鎖）の存在比（ＩｎｔＯＤ％：Ｓ’）を求めた。分解阻害率はポジティブコントロール（ＰＣ）分解産物の存在比（ＰＣ’）を１００としたときの比を１００から引くことで阻害率を求めた（図３）。
図３より、前記（１）で得られたサメ軟骨抽出物は、濃度依存的にＭＭＰ−２活性およびＭＭＰ−９活性を阻害し、２％の濃度では約９０％阻害することがわかる。
（７）等電点電気泳動による分画
前記（１）で得られたサメ軟骨抽出物０．５ｇを５０ｍｌの蒸留水に溶解し、等電点電気泳動装置Ｒｏｔｏｆｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で、１２Ｗ、１２０分間泳動した。各フラクションについてｐＨを測定し、ＭＭＰ−９阻害活性を前記（６）と同様の方法により調べた（図４）。
図４より、ＭＭＰ−９阻害活性は等電点が酸性の画分で高く、特にｐＨ２．０〜３．０の画分でＭＭＰ−９阻害活性が高かった。
（８）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５ゲルろ過ＨＰＬＣによる分画
前記（７）の等電点電気泳動でＭＭＰ−９阻害活性が高かった画分を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）し、その上清を０．４５μｍのフィルターによりろ過後、２００μｌをゲルろ過ＨＰＬＣにより分画した。分離条件は、溶離液に２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８６）を用い、カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、波長２３０ｎｍで検出した（図５）。ピークの生じる直前の１０分から１分ずつＦＲＡＣＴＩＯＮ ＣＯＲＥＣＴＯＲＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で分取し、ＭＭＰ−９阻害活性を前記（６）と同様の方法により調べた（図６）。
図５および図６より、ＭＭＰ−９阻害活性は、分子量１００ｋＤａ以上の高分子画分（図中、※で示す）に存在することがわかる。
（９）セルロースアセテート膜電気泳動
ＭＭＰ−９阻害活性画分に３０倍容量の０．５Ｎ ＮａＯＨを添加し、４℃で２４時間反応させた。その後、１Ｎ ＨＣｌで中和し、４．５ｍｌのプロナーゼ緩衝液を加え熱変性（１００℃、１０分）させた。５０℃まで冷却後チモールを加えた。その後、５０℃で４８時間反応させた。除タンパクのため、４．５ｍｌの３０％トリクロロ酢酸溶液を加え、４℃で１時間反応させた。前記溶液を遠心分離（８０００×ｇ、１５分）し、その上清を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。この乾燥物について、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動を行った。電気泳動用緩衝液として、０．１Ｍピリジン、０．４７Ｍギ酸を含むピリジン−ギ酸緩衝液を使用した。マーカーとして、コンドロイチン硫酸Ｃ、デルマタン硫酸およびヒアルロン酸を用いた（図７）。
図７より、ＭＭＰ−９阻害活性を有する高分子画分は、プロナーゼ処理前は、ブロードなバンドとして検出されたが、プロナーゼ処理によりコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）と同じ位置に検出された。したがって、ＭＭＰ−９阻害活性を有する酸性で親水性の高分子画分は、コンドロイチン硫酸Ｃを含み、かつ、タンパク質と結合していることが示された。
（１０）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ゲルろ過ＨＰＬＣによる分画
前記（１）で得られたサメ軟骨抽出物を蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）し、その上清を０．４５μｍのフィルターによりろ過後、２００μｌをゲルろ過ＨＰＬＣにより分画した。分離条件は、溶離液に２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８６）を用い、カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、波長２３０ｎｍで検出した（図８）。１分ずつＦＲＡＣＴＩＯＮ ＣＯＬＬＥＣＴＯＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で分取し、ＭＭＰ−９阻害活性を前記（６）と同様の方法により調べた。
図８より、ＭＭＰ−９阻害活性は、分子量５００ｋＤａ以上の高分子画分に存在することがわかる。
比較例１
実施例１（８）で得られた酸性で親水性の高分子画分（本発明品）、コンドロイチン硫酸Ｃおよび市販のサメ軟骨を、実施例１（６）に記載の方法によりＭＭＰ−９阻害活性を調べた。その結果を図９に示す。
図９より、コンドロイチン硫酸Ｃおよび市販のサメ軟骨は、ＭＭＰ−９阻害活性をほとんど有していないことがわかった。本発明品と市販のサメ軟骨の成分を比較するため、それぞれのコンドロイチン硫酸量とアミノ酸量を調べた。その結果、コンドロイチン硫酸量は有意な差がなかったが、アミノ酸量は本発明品が圧倒的に多かった。コンドロイチン硫酸Ｃ単独ではＭＭＰ−９阻害活性がほとんど存在しなかったことから、ＭＭＰ−９阻害活性は糖鎖よりもタンパク部分に存在することが示唆される。
【実施例２】
担癌ハムスターに対するサメ軟骨抽出物摂取の効果
（１）実験食の調製
基礎食として日本クレア株式会社より購入したＣＥ−２粉末を用い、実験食として基礎食に実施例１（１）で調製したサメ軟骨抽出物を０．２重量％または０．４重量％添加したもの（以下、単に重量％を％と略す場合がある）を用いた。前記基礎食および実験食は、下記ハムスターに自由に摂食させた。水も自由摂取とした。実験食を摂取させた各ハムスターの体重と餌の摂取量を調べた。同じ群間において目立った体重差および餌の摂取量に差は見られなかった。
（２）実験動物
シリアンゴールデンハムスター（６週齢）を日本ＳＬＣ株式会社より購入した。ハムスターは室温２４±１℃、湿度６０±５％に調節した１２時間明暗サイクルの飼育室で４〜５匹づつプラスチックケージに入れて飼育した。環境順応のため、動物搬入より非験飼育を一週間行なった。なお、動物実験は奈良県立医科大動物実験施設において、同施設の動物実験倫理規定を遵守して行なった。
（３）Ｎ−ニトロソビス（２−オキソプロピル）アミン（ＢＯＰ）による膵管癌誘発ハムスター
全動物に体重１ｋｇあたり５０ｍｇのＢＯＰを皮下投与し、短期膵癌発生系（Ｍｉｚｕｍｏｔｏ Ｋ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５４６−５７，１９８８）に従い、コリン欠乏食投与、体重１ｋｇあたり５００ｍｇのエチオニン腹腔内投与、体重１ｋｇあたり８００ｍｇのメチオニン腹腔内および体重１ｋｇあたり２０ｍｇのＢＯＰ皮下投与なる一連の操作を２回繰り返し、膵管癌誘発ハムスターを作出した。実験開始から５０日目から１００日目まで、上記の実験食を投与した（村田奈保：ハムスター膵管癌発生に対するウシおよびサメ軟骨水抽出物の影響 奈良医学雑誌５３（５、６）２４１−５２ ２００２）。
実験期間中の体重に各群間で差は見られず、最終体重、膵および肝の重量および餌の摂取量にも有意差は見られなかった。被験物質開始直後に０．４％サメ軟骨食群が１匹死亡したことを除いて実験期間中に動物の死亡は見られなかった。また、毛づやなどの動物の一般状態は、０．４％群では他の群と比較して良好であった。
図１０に実験食を５０日間摂取させ、１００日目に生存していた全動物を屠殺剖検したときの膵癌病変と膵管癌の数を示す。動物一匹あたりの膵管上皮過形成および異型性過形成の発生数は０．２％、０．４％群で減少傾向が見られたが、基礎食群と比較して有意な差は見られなかった。膵管癌の発生数は基礎食群で３．１±２．０個、０．２％群で２．６±２．１個、０．４％群で１．４±０．９個であり、サメ軟骨抽出物の用量に相関して減少する傾向が見られた。０．４％群は基礎食（０％）群に比べ、膵管癌の発生数が優位に減少していた（図中★はＰ＜０．０５である）。
（４）膵癌組織移植ハムスター
ハムスターの後背部左右２箇所にＮ−ニトロソビス（２−ヒドロキシプロピル）アミン（ＢＨＰ）誘発膵癌組織を継代移植したものを細分化し、金属製トロッカーを用いて移植した。実験食投与に際して、移植癌の生着抑制効果ではなく、腫瘍の増大抑制効果を見るために一週間の癌生着猶予期間を設けた。その後３週間、実験食を投与した。腫瘍増大を観察する計算方法として、楕円形と近似するとして計測した長径および短径から、４／３×π×（長径／２）×（短径／２）２で体積を求めて比較を行なった。一部のハムスターは、非担癌ハムスターとして実験食投与を行なった。
その結果、癌生着後３週間経過すると、実験食群は、基礎食群に比べて腫瘍の成長が阻害されていた。
（５）血清と組織採取
実験期間終了後、エーテル麻酔のもとハムスターの腹部大動脈より全血を採取し、常温放置により分離した上清を遠心分離（２０分、３０００ｒｐｍ）して血清を得た。腫瘍および非腫瘍組織も必要に応じて採取し、−８０℃で凍結保存した。組織からのＭＭＰ抽出法として、組織１０ｍｇに対して１％ Ｔｗｅｅｎおよび３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を５００μｌ加え、マイクロチューブ内でホモジェネートし、氷中で１５分間インキュベーションした。その後３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上清を組織抽出液とした。実験は、すべて滅菌操作により行なった。
（６）サメ軟骨抽出物を摂取した非担癌または担癌ハムスター血清のＭＭＰ−９阻害活性測定
４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｂｒｉｊ３５を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８６）と、この２倍希釈の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を作成し、この５０ｍＭ緩衝液を用いて血清を適当な濃度に希釈（５〜２０倍）してＭＭＰ阻害活性測定に供した。
０．６ｍｌマイクロチューブに４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２ ０．１％Ｂｒｉｊ３５を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８６）１０μｌ、０．１％Ｖ型コラーゲン（牛胎盤由来ペプシン分解 株式会社ヤガイ製）溶液１０μｌ、血清サンプル５μｌ、ＭＭＰ−９溶液１０μｌを加え、３７℃で２４時間酵素反応させた。なおネガティブコントロール（ＮＣ）として血清、ＭＭＰ−９を除いたもの、ポジティブコントロール（ＰＣ）として血清を除いたものを用い、代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を同じ量になるように加えた。反応後、０．５Ｍ エチレンジアミンテトラ酢酸（ｐＨ７．５）を２０μｌ、１０％ＳＤＳおよび０．１％ＢＰＢをそれぞれ５μｌ加え、熱湯で加熱した。そのうち１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後ウエスタンブロット法によりＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＯＤイムノステインセット（和光純薬工業株式会社製）によりＶ型コラーゲンとその分解産物のバンドを分離・同定した。各バンド濃度はデンシトメータで測定し、Ｖ型コラーゲンのα１、α２鎖に対する分解産物のバンド鎖の存在比（ＩｎｔＯＤ％：Ｓ’）を求めた。分解阻害率はポジティブコントロール（ＰＣ）分解産物の存在比（ＰＣ’）を１００としたときの比を１００から引くことで阻害率を求め、さらに希釈倍率（Ｄ’）とアプライ量（Ａ’）から血清１ｍｌ中の阻害活性として表した。
［結果］
実験食（０．４％）または基礎食を非担癌ハムスターに２週間摂取させたときの血清におけるＭＭＰ−９のＶ型コラーゲン分解阻害活性（Ｕ／ｍｌ）は、実験食群では４．９５±０．０６、基礎食群では４．１３±０．５９であった。サメ軟骨抽出物を摂取することにより、ＭＭＰ−９に対する阻害活性が増加する傾向が見られた。
実験食（０．４％）または基礎食を担癌ハムスターに３週間摂取させたときの血清におけるＭＭＰ−９のＶ型コラーゲン分解阻害活性（Ｕ／ｍｌ）は、実験食群では４．１±０．３、基礎食群では３．２±０．７であった。
これらのことから、ハムスターにおいて、発癌によりＭＭＰ−９阻害活性は４．１Ｕ／ｍｌから３．２Ｕ／ｍｌに約２０％低下するが、サメ軟骨抽出物を摂取することにより非担癌ハムスター並みに有意に回復したことがわかる。また、健康な非担癌ハムスターにおいても、サメ軟骨抽出物を摂取することによりＭＭＰ−９阻害活性が約２０％増加することが認められた。
【実施例３】
ハムスター血清中のハプトグロビン量
非担癌ハムスターにサメ軟骨抽出物を二週間摂取したときの血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してＣＢＢ染色した。その結果、約８０ｋＤａのバンドが、基礎食群と比べて実験食群で増加していた。前記８０ｋＤａのバンドを切り出し、構造解析（プロテインシークエンサー：ＰＰＳＱ ２１、島津製作所製）したところ、ハムスター内因性のハプトグロビン（α鎖：ＶＤＬＳＮＤＡＭＤＴＡＤＤＳ（配列番号：１）、β鎖：ＩＩＧＧＳＬＤＡＫＧＳＦＰＷ（配列番号：２））であることがわかった。
ハプトグロビンは溶血により生じた酸化ヘモグロビンを結合して酸化的血管障害毒性を中和するなどの働きを持っており、溶血をはじめ、最近では癌の悪性度など多くの疾患の指標タンパクとなっている（Ｐａｔｈｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ．１９９８；４（４）：２７１−６、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９１ Ａｕｇ；６４（２）：３８６−９０）。また癌の転移・浸潤への関連が示唆されているカテプシンＢ（Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ｊ（Ｅｎｇｌ）．１９９８ Ｓｅｐ；１１１（９）：７８４−８、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９９ Ｊｕｌ ２３；４５５（３）：２８６−９０）に対する阻害活性能（Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２ Ｊｕｎ；６０（６）：６３１−７）や、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体が癌細胞のアポトーシスを誘導（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５ Ｏｃｔ；５５（６）：５２９−３５）することが報告されている。現段階でハプトグロビンに対する解釈は難しいが、解釈のひとつとしてサメ軟骨抽出物摂取により血清中ハプトグロビンの増加がみられ、肝機能が良好に保たれていた可能性がうかがえる。
【実施例４】
癌患者に対するサメ軟骨抽出物摂取の効果
膵臓癌を患った男性ボランティア（５０代）に対し、実施例１（１）で調製したサメ軟骨抽出物を毎日２ｇ、４ヶ月に渡り経口摂取させ、摂取前および摂取後の血清を分析した。この患者への他の抗癌剤投与は、副作用の影響が多大であったため、行っていない。
（１）サメ軟骨抽出物を摂取した担癌ヒト血清のＭＭＰ−９阻害活性測定
当該患者の血清を２０倍に希釈し、実施例２（６）と同じ手法でＭＭＰ−９の阻害活性を測定した。その結果を図１１に示す。
ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＝Ｖ型コラーゲン基質溶液のみの陰性対照）とＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＝Ｖ型コラーゲン基質溶液にＭＭＰ−９を加えインキュベーションした陽性対照）を比較すると、ＰＣにはＭＭＰ−９により分解された低分子量のＶ型コラーゲンがみとめられる。（図中矢印にて示す）
Ｂｅｆｏｒｅ（サメ軟骨抽出物摂取前の患者の血清）にはＰＣと同様の分解産物がみとめられるが、Ａｆｔｅｒ（同４ヶ月摂取後）では、明らかに分解物が減少しており、サメ軟骨抽出物を摂取することにより、癌患者においてもＭＭＰ−９に対する阻害活性が増加することが確認された。
（２）ＥＬＩＳＡ法による膵臓癌患者のＩＶ型コラーゲン分解物量の測定
癌患者においてＭＭＰ−９、２の活性が高ければ、ＩＶ型コラーゲンが分解され、その断片が血清中に増えることとなる。そこで、ＥＬＩＳＡ法測定キットであるバナッセイＩＶ−Ｃ（第一ファインケミカル株式会社製）を用い、血清中のＩＶ型コラーゲンの断片量を測定することで、ＭＭＰ−９の活性を評価した。
サメ軟骨抽出物摂取前および摂取後の患者の血清と、対照として健常者３名の血清を採取した。２０倍に希釈した血清５０μＬと酵素標識抗体液３００μＬとを加えた試験管に、抗体結合ビーズを投入し、混和後１時間静置した。静置後、洗浄液を試験管に加え反応液をアスピレータで吸引除去する工程を４回繰り返した。残ったビーズに発色液３００μＬを加え、さらに基質液１００μＬを加え、混和した後、３０分間静置した。静置後、停止液を１ｍＬ加え、水を対照として波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。予め用意した検量線にもとづき、吸光度から血清中のＩＶ型コラーゲン断片量を求めた。結果を図１２に示す。（「正常人」は健常者３名の平均値）
正常人に比べ、サメ軟骨抽出物の摂取前の膵臓癌患者の血清ＩＶ型コラーゲン量はかなり高い値となっている。そのため、ＩＶ型コラーゲンが分解を受け、癌の転移浸潤、増殖が生じていることが推測できる。これがサメ軟骨抽出物の摂取後は着実に減少している。このことからも、サメ軟骨抽出物の摂取がＭＭＰの活性を抑制する効果があることがうかがえる。
【産業上の利用可能性】
以前の報告にあるＭＭＰ合成阻害剤のＯＰＢ−３２０６における膵発癌抑制実験（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．１９９９ Ｊｕｌ；２０（７）：１３２３−９）と比較すると、本発明のプロテオグリカンの膵発癌抑制実験は合成阻害剤に匹敵する癌抑制効果を示している。そのうえ、被験動物の体重減少や運動能低下等のＭＭＰ合成阻害剤特有の目立った副作用は見られないことから、サメ軟骨由来の本発明品は、天然物由来の癌進行抑制物質として期待できる。また、本発明のプロテオグリカンの製造方法は、このような特性を有し、作用機序の明確なプロテオグリカンを容易に製造することができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【技術分野】
本発明は、軟骨魚類から単離されたプロテオグリカンおよびその製造方法に関する。詳しくは健康の維持、生活の質の向上または医薬として有用なプロテオグリカンおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
癌は人類を悩ます共通の疾患であり、その治療は全地球的な課題となりつつある。我が国においては、主な死亡原因が感染症から生活習慣関連病へと移行する中で、特に癌は日本人の死亡原因の第１位となり、疾病対策上の最重要課題として研究が進められてきた。癌はすべての臓器・組織に発生しうるもので、体質・性別・年齢・地域および生活習慣の違いによって異なる。また癌の種類によって転移や増殖能を主としたすべての性質が異なるため、いまだ決定的な治療法を確立するに至らないのが現状である。
癌細胞の特徴として、血管新生を伴って栄養分を確保し、無秩序に自立性増殖を行い、転移・浸潤により身体の様々な部位に新しい癌組織を生成する。これに加えて、癌性悪液質により宿主を衰弱させ死に至らしめる。現在行われている癌の治療法として切除や抗癌剤投与、免疫療法、温熱療法、放射線照射等が存在するが、癌の種類により効果が異なったり、原発巣部位によっては利用できなかったり、さらに副作用による宿主の衰弱が問題となっている。そこで、固形癌に共通である血管新生や転移・浸潤を阻害する治療法が注目されている（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１，１９９５）。
癌細胞の転移や浸潤、血管新生の際には、細胞を取り巻いている細胞外基質や基底膜を破壊するために、主としてマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を用いることが知られている。それをもとに今日、癌治療の新しいターゲットとして、ＭＭＰを阻害することにより癌の転移・浸潤および血管新生を阻害し、癌の進行を抑制するという方法が用いられており、様々な合成のＭＭＰ阻害剤が開発されている（Ｉｋｉ Ｋ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９９９ Ｊｕｌ；２０（７）：１３２３−９、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ａ．Ｈ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９７）、Ｎａｉｔｏ Ｋ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９４ Ｓｅｐ １；５８（５）：７３０−５）。しかし副作用として骨髄毒性、細胞毒性、関節痛が報告され、実用上問題となっている。
一方、天然物に対する最近の傾向として、漢方や食品中において各種疾患の予防・進行抑制に有効な成分が見出され、その一部は特定保健用食品として厚生労働省より効能の表示が認められている。癌治療においても食品由来の成分は注目を集めており、様々な食品中の成分の癌抑制効果が研究されている。そのうち、軟骨組織には血管形成がなされないことから、軟骨組織中には血管新生阻害活性物質が含まれていると考えられている。事実、腫瘍の周辺に軟骨抽出物を注入した実験において、腫瘍の増殖や血管新生の抑制が見られた（Ｌｅｅ Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３ Ｓｅｐ １６；２２１（４６１６）：１１８５−７）。サメ軟骨の血管新生阻害能のひとつとしてＭＭＰの阻害が挙げられており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＭＰの阻害が見出され（Ｍｏｓｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２３０−２３５，１９９１、Ｇｉｎｇｒａｓ Ｄ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２００１：１９（１−２）：８３−６）、また動物に経口投与した実験においても血管新生の阻害が見られることが報告されている（Ｄａｖｉｓ ＰＦ．ら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ １９９７ Ｓｅｐ；５４（２）：１７８−８２）。これらの知見をもとに、サメは軟骨魚類であり質のよい軟骨が硬骨動物に比べて多く採取できるということから、サメ軟骨パウダーの癌の進行遅延または抑制を期待して癌患者に経口で用いられる代替療法や臨床研究が行なわれている（Ｅｒｎｓｔ Ｅ．、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：２９８ １９９８）。しかし、サメ軟骨の経口摂取によるｉｎ ｖｉｖｏでのサメ軟骨の腫瘍抑制効果の仕組みはほとんど分かっておらず、またサメ軟骨の経口摂取により組織中でサメ軟骨がＭＭＰを阻害しているという知見は得られていない。
サメ軟骨から有効成分を得る方法としては、サメ軟骨を微粉末状にしてそのまま有効成分として用いる方法（特開２００１−４８７９５号公報）またはサメの軟骨を粉砕して水抽出して得られる凍結乾燥物の製造方法が知られている（特表平９−５１２５６３号公報、米国特許第４４７３５５１号明細書）。
【発明の開示】
しかし、前記方法で得られたサメ軟骨由来の成分は、効果を得るために過大な量を摂取しなければならないこと、あるいは他の有効成分と併用することにより抗腫瘍活性や抗炎症活性を発揮することができるものであり、その効果の作用機序は証明されていない。
そこで、本発明の目的は、少量摂取で効果を発揮し、かつ効果の作用機序が明確な軟骨抽出物およびその製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成すべく、軟骨から効率よく有効成分を抽出する条件および有効成分の特性について鋭意研究したところ、下記要件を満たす成分およびその製造方法により所期の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の単離されたプロテオグリカンは、軟骨魚類の軟骨の水抽出物に由来し、主成分が５００ｋＤａ以上の分子量を有することを特徴とする。
前記プロテオグリカンは、アルコールに不溶性であることが好ましい。
前記プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン部分がコンドロイチン硫酸Ｃを主成分とすることが好ましい。
前記プロテオグリカンは、マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害活性を有することが好ましい。
前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９の場合、前記阻害活性が０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性の減少を回復させる作用、または０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を少なくとも５％増加させる作用であることが好ましい。
前記プロテオグリカンは、有効量の生体内摂取によりカテプシンＢに対する阻害活性を上昇させる作用を有することが好ましい。
前記プロテオグリカンは、有効量の生体内摂取により血清中のハプトグロビン量を増大させる活性を有することが好ましい。
本発明の組成物は、前記プロテオグリカンを含有することを特徴とする。
前記組成物は、生活の質を向上させるために用いられることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、前記プロテオグリカンを有効成分として含有することを特徴とする。
本発明のプロテオグリカンの製造方法は、軟骨魚類由来の軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程、
前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程、
前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程、および
前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程を含むことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で得られたサメ軟骨水抽出物の組成を示す図である。
図２は、実施例１のゲルろ過ＨＰＬＣで得られたＭＭＰ−９阻害活性画分のアミノ酸組成を示す図である。
図３は、実施例１で得られたサメ軟骨水抽出物のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９阻害活性を示す図である。
図４は、等電点電気泳動による各画分のｐＨとＭＭＰ−９阻害活性との相関を示す図である。
図５は、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５）のチャート図である。
図６は、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５）による各画分のＭＭＰ−９阻害活性を調べた電気泳動の図である。
図７は、セルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す図である。
図８Ａは、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００）のチャート図である。図８Ｂは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００の溶出時間と分子量との関係を示す図である。図８Ｃは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００による各画分のＭＭＰ−９阻害活性を示す図である。
図９は、本発明品とコンドロイチン硫酸Ｃと市販サメ軟骨のＭＭＰ−９阻害活性を比較した図である。サンプル水溶液５μｌを１０μｌの活性型ＭＭＰ−９に加え、３７℃で２４時間反応させたときのＭＭＰ−９の残存活性を示す。
図１０は、実施例１において化学発癌ハムスターの癌抑制効果を示す図である。基礎食または実験食で５０日間飼育したときの腫瘍数を示す。★：ｐ＜０．０５。
図１１は、実施例３において膵臓癌患者の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を示す図である。
図１２は、実施例３において膵臓癌患者の血清中のＩＶ型コラーゲン断片を定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の単離されたプロテオグリカンは、軟骨魚類の軟骨の水抽出物に由来し、主成分が５００ｋＤａ以上の分子量を有するものである。
前記プロテオグリカンの原料となる軟骨魚類は、特に限定されるものではなく板鰓類および全頭類を含むものであり、例えば板鰓類としてはサメ、エイなどがあげられ、全頭類としてはギンザメなどがあげられる。
本発明において原料となる軟骨は、前記軟骨魚類に由来するものであれば特に限定されずに使用することができる。
「主成分」とは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより５００ｋＤａ以上の分子量を有する画分に主要ピークを生じることをいう。
したがって、「５００ｋＤａ以上の分子量」とはゲルろ過クロマトグラフィーにより見積られた分子量をいい、具体的にはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００を用いて測定し、５００ｋＤａないし排除限界１３００ｋＤａまでの分子量である。
本発明のプロテオグリカンは、アルコールに不溶性であることが好ましい。前記アルコールとしてはメタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールが好ましい。
すなわち、本発明のプロテオグリカンは、前記のような高分子化合物であり、アルコールに不溶性であることが好ましい。
ここで、プロテオグリカンとはグリコサミノグリカンとタンパク質との共有結合化合物をいう。前記グリコサミノグリカン部分は、コンドロイチン硫酸Ｃを主成分とすることが好ましい。前記タンパク質部分は、後述する実施例１および図２に記載のようなアミノ酸組成を有することが好ましい。
本発明のプロテオグリカンは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する阻害活性を有することが好ましい。当該プロテオグリカンは、有効量の生体内摂取によりマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する阻害活性を上昇させる作用を有することが好ましい。
ＭＭＰとしては動物由来のものであれば特に限定されるものではなく、前記動物としては、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、ニワトリ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等の家畜類やヒトなどがあげられる。ＭＭＰの種類としては、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３などの誘導型ＭＭＰ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１４などの恒常型ＭＭＰがあげられるが、腫瘍の血管新生に関与するという観点から、血管を裏打ちしている基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンまたはＶ型コラーゲンを分解するゼラチナーゼ群であるＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９が好ましい。
本発明において「有効量」とは、動物の生体内において、ＭＭＰ阻害活性の上昇作用、カテプシンＢ阻害活性の上昇作用または血清中のハプトグロビン量の増大活性を奏するに足る量をいい、動物の種類や、年齢、性別、体重などの個体差により異なるが、ハムスターにおけるＭＭＰ阻害活性を上昇させるためには、１日当たり１〜５０ｍｇ程度が例示される。ヒトにおけるＭＭＰ阻害活性を上昇させるためには、１日当たり１〜１５ｇ程度が例示される。
前記ＭＭＰがＭＭＰ−９の場合、ＭＭＰ−９の阻害活性の増加は、０．４重量％のプロテオグリカンを添加した餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性の減少を回復させる作用、または０．４重量％のプロテオグリカンを添加した餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を少なくとも５％増加させる作用であることが好ましい。前記ＭＭＰ−９の阻害活性の増加は、より好ましくは２０％以上である。これにより、癌の成長や転移を有効に抑制することができる。
血清中のＭＭＰ−９の阻害能は、本発明者らにより初めて測定することが可能となったものであり、所定量のＶ型コラーゲンとＭＭＰ−９に血清を混合してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングで解析した後デンシトメトリーによりＶ型コラーゲンの量を定量することにより測定することができる。ＭＭＰ−９の活性は、３７℃、２４時間の反応でＶ型コラーゲンを１０％分解する活性を１ｍＵとして定義する。したがって、血清中のＭＭＰ−９の阻害活性は、１ｍＵのＭＭＰ−９の活性を阻害する活性を１ｍＵとして定義することができる。
本発明のプロテオグリカンは、有効量の生体内摂取によりカテプシンＢに対する阻害活性を上昇させる作用を有することが好ましい。カテプシンＢに対する阻害作用を通じて、抗癌作用を発揮することができる。カテプシンＢの種類としては、前記ＭＭＰと同様の動物種由来のものがあげられる。
カテプシンＢの阻害活性は、生体内摂取した動物の血清を用いて、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８１；８０巻、ｐ．５３５−５６１に記載の方法に準じて測定することができる。前記活性は、本発明のプロテオグリカン摂取前の血清と比べて、摂取後の血清において有意に増大していることを指標とする。
また、本発明のプロテオグリカンは、有効量の生体内摂取により血清中のハプトグロビン量を増大させる活性を有することが好ましい。血清中のハプトグロビン量を増大させることによって、前記カテプシンＢに対する阻害作用を通じて抗癌作用を発揮することができる。ハプトグロビンの種類としては、前記ＭＭＰと同様の動物種由来のものがあげられる。
血清中のハプトグロビン量は、生体内摂取した動物の血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、染色してデンシトメーターにより定量する。前記活性は、本発明のプロテオグリカン摂取前の血清と比べて、摂取後の血清において有意に増大していることを指標とする。
本発明は、前記プロテオグリカンを含有する組成物を提供する。本組成物中に含まれるプロテオグリカンの割合は、目的に応じて適宜設定することができるが、通常０．００１〜９９．９重量％である。
本組成物中に含まれる他の成分は、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、組成物が食品の場合、通常の食品の原材料に本発明のプロテオグリカンを一定量混合して食品とすることができる。また、組成物が補助食品（いわゆるサプリメント）の場合、本発明のプロテオグリカンと所望によりデンプンなどの増量剤、ブドウ糖、砂糖、シロップなどの甘味料、香料または水などとを混合して、飲食が容易な形状、例えば錠剤、カプセル、液体とすることができる。前記組成物には、軟骨魚類の軟骨に由来する任意の成分、例えば軟骨粉砕物（ホモジネートを含む）そのもの、軟骨水抽出物由来の他の成分（分子量５００ｋＤａ未満のプロテオグリカン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、ミネラルなど）またはローヤルゼリー、カキエキス、ビタミン類、グルコサミン、キチンキトサン、酵母などの軟骨魚類の軟骨に由来しない成分であって健康によいとされる成分を含有してもよい。
前記組成物は、生体内摂取により特定の機能を発揮するプロテオグリカンを含むことから、健康な状態の維持・向上または不健康な状態（病気に罹患した状態を含む）の改善を含む生活の質を向上させるために用いられることが好ましい。
本発明は、前記プロテオグリカンを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物の対象となる疾患は、血管新生または脈管形成を伴う疾患であり、例えば、癌の成長、癌の転移、慢性関節リウマチなどの関節炎、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬および血管の構成成分を伴う炎症疾患があげられるが、これに限定されるものではない。
本発明の医薬組成物は、前記プロテオグリカンそのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤または注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の含有量、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２０ｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
本発明は、前記プロテオグリカンの製造方法を提供する。当該製造方法は、軟骨魚類由来の軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程、
前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程、
前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程、および
前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程
を含むことを特徴とする。以下、前記工程を含む本発明の製造工程について説明する。
（１）原料およびその前処理
原料となる軟骨は、前記軟骨魚類に由来するものであれば特に限定されずに使用することができる。軟骨の周りに付着している肉、皮などの不要部分は予め取り除いておくことが望ましい。軟骨の部位は特に限定されるものではなく、中骨、ヒレ、頭部軟骨などがあげられる。軟骨は、生軟骨、乾燥軟骨、およびこれらの冷凍品のいずれも使用することができるが、原料の調達しやすさから乾燥軟骨またはその冷凍品が好ましい。軟骨の乾燥は、天日干しまたは６０℃程度の乾燥機を利用することができる。
（２）軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程
下記抽出工程を効率よく行うため、前記軟骨を粉砕する。粉砕方法としては、乾式粉砕または湿式粉砕があげられる。乾式粉砕は、乾燥軟骨またはその冷凍品を用いて行うことができる。湿式粉砕は生軟骨単独でまたは生軟骨もしくは乾燥軟骨に水を添加して行うことができる。粉砕物の粒径の制御の容易さから、乾式粉砕が好ましい。
乾式粉砕に使用する装置としては、冷凍粉砕機、ジェットミルなどがあげられる。
湿式粉砕に使用する装置としては、ホモジナイザ、湿式媒体ミルなどがあげられる。
粉砕物の平均粒径は、０．１〜１００μｍ、好ましくは１〜５０μｍである。０．１μｍ未満にすると生産性が低下する傾向があり、１００μｍを越えると抽出効率が低下する傾向がある。
ここで、平均粒径とは、体積基準分布が中央値（積算分布の５０％に対する粒子径）である粒子と同じ体積の球の直径を指し、レーザー回折法、遠心沈降法などの粒度分布測定装置によって測定することができる。
生産性を高めるためには、軟骨を予め粗粉砕した後、前記粉砕をしてもよい。粗粉砕の方法および装置は特に限定されず、例えばハンマーミルなどの粗粉砕機を使用して行うことができる。粗粉砕は、粉砕物の平均粒径が０．５〜１０ｍｍ程度となるように行えばよい。
（３）前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程
前記粉砕物に水を添加する。添加する水は特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水または蒸留水などがあげられる。水の温度も特に限定されるものではない。また、水のｐＨも特に限定されるものではなく、特にｐＨ調整をすることなく使用することができる。
水の添加量は、通常、粉砕物の重量に対して１〜１０倍の量である。
抽出条件は、粉砕物と水とを撹拌しながら、通常１分〜２４時間程度行う。１分未満では十分な抽出が行われず、２４時間以上では生産性が低下する傾向がある。また、抽出回数は１回でも複数回でもよいが、得られる水相の容量が一定の範囲内になるように、水の添加量と抽出回数を設定すればよい。
（４）前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程
抽出工程終了後、抽出された水溶性成分を含む水相を懸濁抽出液から分離する。分離方法は、通常の固液分離を行えばよい。例えば、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどがあげられる。
（４’）濃縮工程
工程（４）で得られた水相は、必要に応じて濃縮することができる。濃縮方法は、特に制限されないが、加熱濃縮、凍結濃縮、限外ろ過膜による濃縮などがあげられる。濃縮の程度は得られた水相の容量により適宜設定できるが、通常元の容量の７５％以下に濃縮する。
（５）前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程
工程（４）または（４’）で得られた水相にアルコールを添加して、アルコール不溶成分を析出させ、沈殿物を得る。
添加するアルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノールがあげられるが、食品用途にはエタノールが好ましい。アルコールの添加量は、不溶成分の析出が目視できる程度に添加すればよいが、通常水１に対して１〜３倍容量である。析出条件は特に限定されないが、０〜６０℃で１分〜２４時間程度静置すればよい。
（６）沈殿物を回収する工程
工程（５）で得られた沈殿物は、遠心分離、ろ過などにより回収する。回収した沈殿物は、アルコールおよび水分を除去するため、乾燥させることが好ましい。乾燥方法は、風乾または凍結乾燥などがあげられる。
（７）沈殿物を整粒する工程
得られた沈殿物は、保管性や取扱い性をよくするため、さらに水分を除去して粉末化することが望ましい。乾燥水分値は、保管が容易な程度であればよい。さらに、用途に応じて粉砕、造粒などを行ってもよい。
（８）分子量が５００ｋＤａ以上の画分を分取する工程
工程（６）で回収した沈殿物は、実質的に本発明のプロテオグリカンからなるものである。用途によっては、工程（６）の沈殿物をゲルろ過等によりさらに精製することができる。精製方法は、分取用ゲルろ過クロマトグラフ（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００）を用いて５００ｋＤａ以上の画分を分取することにより行うことができる。また、カットオフ値が５００ｋＤａの膜ろ過を濃縮工程で行うことで、工程（８）を代替してもよい。
（９）等電点電気泳動によりｐＩが５．５以下の画分を分取する工程
工程（６）で回収した沈殿物または工程（８）で精製した精製物は、実質的に本発明のプロテオグリカンからなるものである。用途によっては、工程（６）の沈殿物または工程（８）の精製物を等電点電気泳動によりさらに精製することができる。精製方法は、分取用等電点電気泳動装置（例えば、Ｒｏｔｏｆｏｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてｐＩが５．５以下の画分を分取することにより行うことができる。分取する画分は、好ましくはｐＩが５．０以下、より好ましくは２〜３である。
工程（８）または工程（９）により分取した画分は、溶媒を除去した後、工程（７）の整粒工程に供することができる。
このようにして得られた本発明のプロテオグリカンは、単独で、または食品もしくは医薬品の有効成分として利用することができる。本発明のプロテオグリカンは、その有効量を動物の体内に摂取すると、ＭＭＰ阻害活性の上昇作用、カテプシンＢ阻害活性の上昇作用、ハプトグロビンの発現亢進作用を通じて、疾患の予防、治療を含む生活の質の向上（ＱＯＬ）に寄与することができる。
【実施例】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
サメ軟骨由来のプロテオグリカンの単離
（１）サメ軟骨抽出物の調製
天日干しして乾燥させたサメ軟骨（ヨシキリサメの軟骨）を、粗粉砕機（ホソカワミクロン（株）製、ＦＭ−１）で平均粒径が５ｍｍ程度まで粗粉砕した。得られた粗粉砕物を、冷凍粉砕機（ホソカワミクロン（株）製、ＬＸ−１）で液体窒素とともに粉砕し、平均粒径２５μｍの微粉末を得た。平均粒径は、マイクロトラック９３２０ＨＲＡ（リーズ・アンド・ノースラップ社製）を用いて測定した。得られた微粉末３ｋｇに対して蒸留水１５ｋｇを加え、室温で２０分間撹拌した後、遠心分離（５分、３０００ｒｐｍ）して上清を得た。残った残渣にさらに１０ｋｇの蒸留水を加え、室温で２０分間撹拌した後、前記と同様に遠心分離して上清を得た。以上の上清を合わせて、限外ろ過膜（分画分子量６ｋＤａ、ＳＩＰ−１０５３、ＩＤ１．４ｍｍ、旭化成製）により約６５％の容量になるまで濃縮した。得られた濃縮液に３倍容量のエタノールを加えて室温で２時間静置し、沈殿物を析出させた。析出した沈殿物を遠心分離（５分、３０００ｒｐｍ）により回収し、４０℃で乾燥させた。乾燥したサメ軟骨抽出物を、コーヒーミルで粉砕し、以下の実験に用いた。
（２）水分量測定
常圧加熱乾燥法により水分含量を算出した。十分に乾燥させたるつぼの風袋を測り、そこに前記（１）で得た試料１ｇを正確に計り取った。１２０℃の試料乾燥機で１時間乾燥させ、放冷した後、秤量した。これを重量が一定となるまで繰り返し、その後重量の減少量から各試料中の水分含量を算出した（図１）。
（３）灰分量測定
るつぼの風袋を測り、そこに前記（１）で得た試料を０．２ｇ計り取った。るつぼをバーナーで焼き、煙が出なくなったら火を止め、デシケーターに入れて５００℃に設定しておいた電気炉内に置いた。２４時間放置後、放冷し、秤量し、重量変化から灰分量を算出した（図１）。
（４）アミノ酸分析
前記（１）で得た試料の水溶液（２００μｇ／ｍｌ）１００μｌとスタンダード３０μｌ（アミノ酸混合標準溶液Ｈ型を１０μｌ、２．５μｍｏｌ／ｍｌ Ｈｙｐを１０μｌ、２．５μｍｏｌ／ｍｌ Ｈｙｌを１０μｌ）を、各々別の洗浄済小試験管（６ｍｍ×５ｃｍ）に加え、遠心真空乾固した。その後、ミニナートバルブを備えた１５ｍｌリアクティブバイアルに入れ、３００μｌの６Ｎ ＨＣｌとともに減圧下（０．１−０．２Ｔｏｒｒ）で、１５０℃１時間加水分解した。次に、ＨＣｌを除去するために真空乾固した。
メタノール：トリエチルアミン：蒸留水＝７：２：１に調製した混合液を１０μｌずつ加えて真空乾固した。ついで、メタノール：トリエチルアミン：蒸留水：フェニルイソチアネート＝７：１：１：１からなる誘導化液を２０μｌずつ加え、２０分間室温で誘導化した後、真空乾固した。そこで、１０％アセトニトリルを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｗａｔｅｒｓ社製、Ｐｉｃｏ−Ｔａｇサンプル希釈液）を、スタンダードには５００μｌ、試料には２００μｌ添加した。ついで、試験管をパラフィルムで密封して超音波でフェニルイソチアネートの結晶を破壊し、０．４５μｍのフィルターでろ過後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３分）し、上清（スタンダードは１０μｌ、試料は２０μｌ）を逆相ＨＰＬＣで分析した。カラムはＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒ １００ＰＲ−１８（ｅ）（Ｍｅｒｃｋ社製）を、溶離液はＡ液：５％アセトニトリルを含む１５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｂ液：６０％アセトニトリルを使用した。グラジエント構成は、溶離液Ｂを０−２分：０％、２−２０分：１０−４７．５％、２０−２５分：４７．５−１００％、２５−３７分：１００％、３７−５０分：０％とし、検出は２５４ｎｍ、流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。結果を図１に示す。
（５）カルバゾール硫酸法によるコンドロイチン硫酸量の測定
前記（１）で得た試料の水溶液（２００μｇ／ｍｌ）０．２５ｍｌを試験管にとり、氷水で冷却撹拌しながら１．５ｍｌの硫酸溶液（四ホウ酸ナトリウム１０水和物０．９５ｇを１００ｍｌの濃硫酸に溶かす）を滴下し、０．０５ｍｌの０．１２５％カルバゾール溶液（１２．５ｍｇのカルバゾールを１０ｍｌのエタノールに溶かす）を加え、十分に混合した後、ガラス球でふたをし、沸騰水中で２０分間加熱した。室温で冷却後、５３０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ ＤＵ６４０，ＢＥＣＫＭＡＮ社製）で測定した（Ｔ．Ｂｉｔｔｅｒ，Ｈ．Ｍ．Ｍｕｉｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４，３３０，１９６２）。スタンダードにはコンドロイチン硫酸Ｃ（２０、４０、１００、２００μｇ／ｍｌ）を用い、同様の操作を行った。
［結果］
前記（１）で得られたサメ軟骨水抽出物は、図１に示すように、タンパク質とコンドロイチン硫酸を主成分（それぞれ３０．８％と４４．２％）とし、水分が５．８％と灰分が１９．２％の組成であった。また、サメ軟骨抽出物に含まれるタンパク質のアミノ酸組成は、Ｇｌｙを多く含み、コラーゲン特有のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を含んでいた。この組成は、サメ軟骨ＩＩ型コラーゲンの組成とほぼ一致した。ＩＩ型コラーゲンとともに、Ｓｅｒなどが多いことから、プロテオグリカンのタンパク成分を含むことが示唆された。
次に、後述のゲルろ過で精製して得られたＭＭＰ−９阻害活性の画分を、前記（４）と同様の方法でアミノ酸分析を行った。結果を図２に示す。図２より、ヒドロキシプロリンをほとんど含まないため、前記画分は、そのタンパク成分が主としてプロテオグリカンに由来することが示唆された。
（６）サメ軟骨水抽出物のＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９阻害活性
０．６ｍｌマイクロチューブに４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｂｒｉｊ３５（ＩＣＩ社製）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８６）１０μｌ、０．１％Ｖ型コラーゲン（牛胎盤由来ペプシン分解、株式会社ヤガイ製）溶液１０μｌ、前記（１）で得られた試料（０．０１〜２．０％水溶液に調製）５μｌ、ＭＭＰ−２溶液またはＭＭＰ−９溶液１０μｌを加え、３７℃で２４時間酵素反応させた。なおネガティブコントロール（ＮＣ）として試料とＭＭＰ−９を除いたもの、ポジティブコントロール（ＰＣ）として試料を除いたものを用い、代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を同じ量になるように加えた。反応後、０．５Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸（ｐＨ７．５）を２０μｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウムおよび０．１％ブロモフェノールブルーをそれぞれ５μｌ加え、熱湯で加熱した。そのうち１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いでウエスタンブロット法によりＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＯＤイムノステインセット（和光純薬工業株式会社製）によりＶ型コラーゲンとその分解産物のバンドを分離・同定した。各バンド濃度はデンシトメータで測定し、Ｖ型コラーゲンのα１、α２鎖に対する分解産物のバンド鎖（α１’、α２’鎖）の存在比（ＩｎｔＯＤ％：Ｓ’）を求めた。分解阻害率はポジティブコントロール（ＰＣ）分解産物の存在比（ＰＣ’）を１００としたときの比を１００から引くことで阻害率を求めた（図３）。
図３より、前記（１）で得られたサメ軟骨抽出物は、濃度依存的にＭＭＰ−２活性およびＭＭＰ−９活性を阻害し、２％の濃度では約９０％阻害することがわかる。
（７）等電点電気泳動による分画
前記（１）で得られたサメ軟骨抽出物０．５ｇを５０ｍｌの蒸留水に溶解し、等電点電気泳動装置Ｒｏｔｏｆｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で、１２Ｗ、１２０分間泳動した。各フラクションについてｐＨを測定し、ＭＭＰ−９阻害活性を前記（６）と同様の方法により調べた（図４）。
図４より、ＭＭＰ−９阻害活性は等電点が酸性の画分で高く、特にｐＨ２．０〜３．０の画分でＭＭＰ−９阻害活性が高かった。
（８）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５ゲルろ過ＨＰＬＣによる分画
前記（７）の等電点電気泳動でＭＭＰ−９阻害活性が高かった画分を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）し、その上清を０．４５μｍのフィルターによりろ過後、２００μｌをゲルろ過ＨＰＬＣにより分画した。分離条件は、溶離液に２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８６）を用い、カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、波長２３０ｎｍで検出した（図５）。ピークの生じる直前の１０分から１分ずつＦＲＡＣＴＩＯＮ ＣＯＲＥＣＴＯＲＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で分取し、ＭＭＰ−９阻害活性を前記（６）と同様の方法により調べた（図６）。
図５および図６より、ＭＭＰ−９阻害活性は、分子量１００ｋＤａ以上の高分子画分（図中、※で示す）に存在することがわかる。
（９）セルロースアセテート膜電気泳動
ＭＭＰ−９阻害活性画分に３０倍容量の０．５Ｎ ＮａＯＨを添加し、４℃で２４時間反応させた。その後、１Ｎ ＨＣｌで中和し、４．５ｍｌのプロナーゼ緩衝液を加え熱変性（１００℃、１０分）させた。５０℃まで冷却後チモールを加えた。その後、５０℃で４８時間反応させた。除タンパクのため、４．５ｍｌの３０％トリクロロ酢酸溶液を加え、４℃で１時間反応させた。前記溶液を遠心分離（８０００×ｇ、１５分）し、その上清を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。この乾燥物について、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動を行った。電気泳動用緩衝液として、０．１Ｍピリジン、０．４７Ｍギ酸を含むピリジン−ギ酸緩衝液を使用した。マーカーとして、コンドロイチン硫酸Ｃ、デルマタン硫酸およびヒアルロン酸を用いた（図７）。
図７より、ＭＭＰ−９阻害活性を有する高分子画分は、プロナーゼ処理前は、ブロードなバンドとして検出されたが、プロナーゼ処理によりコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）と同じ位置に検出された。したがって、ＭＭＰ−９阻害活性を有する酸性で親水性の高分子画分は、コンドロイチン硫酸Ｃを含み、かつ、タンパク質と結合していることが示された。
（１０）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ゲルろ過ＨＰＬＣによる分画
前記（１）で得られたサメ軟骨抽出物を蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）し、その上清を０．４５μｍのフィルターによりろ過後、２００μｌをゲルろ過ＨＰＬＣにより分画した。分離条件は、溶離液に２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８６）を用い、カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、波長２３０ｎｍで検出した（図８）。１分ずつＦＲＡＣＴＩＯＮ ＣＯＬＬＥＣＴＯＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で分取し、ＭＭＰ−９阻害活性を前記（６）と同様の方法により調べた。
図８より、ＭＭＰ−９阻害活性は、分子量５００ｋＤａ以上の高分子画分に存在することがわかる。
比較例１
実施例１（８）で得られた酸性で親水性の高分子画分（本発明品）、コンドロイチン硫酸Ｃおよび市販のサメ軟骨を、実施例１（６）に記載の方法によりＭＭＰ−９阻害活性を調べた。その結果を図９に示す。
図９より、コンドロイチン硫酸Ｃおよび市販のサメ軟骨は、ＭＭＰ−９阻害活性をほとんど有していないことがわかった。本発明品と市販のサメ軟骨の成分を比較するため、それぞれのコンドロイチン硫酸量とアミノ酸量を調べた。その結果、コンドロイチン硫酸量は有意な差がなかったが、アミノ酸量は本発明品が圧倒的に多かった。コンドロイチン硫酸Ｃ単独ではＭＭＰ−９阻害活性がほとんど存在しなかったことから、ＭＭＰ−９阻害活性は糖鎖よりもタンパク部分に存在することが示唆される。
【実施例２】
担癌ハムスターに対するサメ軟骨抽出物摂取の効果
（１）実験食の調製
基礎食として日本クレア株式会社より購入したＣＥ−２粉末を用い、実験食として基礎食に実施例１（１）で調製したサメ軟骨抽出物を０．２重量％または０．４重量％添加したもの（以下、単に重量％を％と略す場合がある）を用いた。前記基礎食および実験食は、下記ハムスターに自由に摂食させた。水も自由摂取とした。実験食を摂取させた各ハムスターの体重と餌の摂取量を調べた。同じ群間において目立った体重差および餌の摂取量に差は見られなかった。
（２）実験動物
シリアンゴールデンハムスター（６週齢）を日本ＳＬＣ株式会社より購入した。ハムスターは室温２４±１℃、湿度６０±５％に調節した１２時間明暗サイクルの飼育室で４〜５匹づつプラスチックケージに入れて飼育した。環境順応のため、動物搬入より非験飼育を一週間行なった。なお、動物実験は奈良県立医科大動物実験施設において、同施設の動物実験倫理規定を遵守して行なった。
（３）Ｎ−ニトロソビス（２−オキソプロピル）アミン（ＢＯＰ）による膵管癌誘発ハムスター
全動物に体重１ｋｇあたり５０ｍｇのＢＯＰを皮下投与し、短期膵癌発生系（Ｍｉｚｕｍｏｔｏ Ｋ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５４６−５７，１９８８）に従い、コリン欠乏食投与、体重１ｋｇあたり５００ｍｇのエチオニン腹腔内投与、体重１ｋｇあたり８００ｍｇのメチオニン腹腔内および体重１ｋｇあたり２０ｍｇのＢＯＰ皮下投与なる一連の操作を２回繰り返し、膵管癌誘発ハムスターを作出した。実験開始から５０日目から１００日目まで、上記の実験食を投与した（村田奈保：ハムスター膵管癌発生に対するウシおよびサメ軟骨水抽出物の影響 奈良医学雑誌５３（５、６）２４１−５２ ２００２）。
実験期間中の体重に各群間で差は見られず、最終体重、膵および肝の重量および餌の摂取量にも有意差は見られなかった。被験物質開始直後に０．４％サメ軟骨食群が１匹死亡したことを除いて実験期間中に動物の死亡は見られなかった。また、毛づやなどの動物の一般状態は、０．４％群では他の群と比較して良好であった。
図１０に実験食を５０日間摂取させ、１００日目に生存していた全動物を屠殺剖検したときの膵癌病変と膵管癌の数を示す。動物一匹あたりの膵管上皮過形成および異型性過形成の発生数は０．２％、０．４％群で減少傾向が見られたが、基礎食群と比較して有意な差は見られなかった。膵管癌の発生数は基礎食群で３．１±２．０個、０．２％群で２．６±２．１個、０．４％群で１．４±０．９個であり、サメ軟骨抽出物の用量に相関して減少する傾向が見られた。０．４％群は基礎食（０％）群に比べ、膵管癌の発生数が優位に減少していた（図中★はＰ＜０．０５である）。
（４）膵癌組織移植ハムスター
ハムスターの後背部左右２箇所にＮ−ニトロソビス（２−ヒドロキシプロピル）アミン（ＢＨＰ）誘発膵癌組織を継代移植したものを細分化し、金属製トロッカーを用いて移植した。実験食投与に際して、移植癌の生着抑制効果ではなく、腫瘍の増大抑制効果を見るために一週間の癌生着猶予期間を設けた。その後３週間、実験食を投与した。腫瘍増大を観察する計算方法として、楕円形と近似するとして計測した長径および短径から、４／３×π×（長径／２）×（短径／２）２で体積を求めて比較を行なった。一部のハムスターは、非担癌ハムスターとして実験食投与を行なった。
その結果、癌生着後３週間経過すると、実験食群は、基礎食群に比べて腫瘍の成長が阻害されていた。
（５）血清と組織採取
実験期間終了後、エーテル麻酔のもとハムスターの腹部大動脈より全血を採取し、常温放置により分離した上清を遠心分離（２０分、３０００ｒｐｍ）して血清を得た。腫瘍および非腫瘍組織も必要に応じて採取し、−８０℃で凍結保存した。組織からのＭＭＰ抽出法として、組織１０ｍｇに対して１％ Ｔｗｅｅｎおよび３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を５００μｌ加え、マイクロチューブ内でホモジェネートし、氷中で１５分間インキュベーションした。その後３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上清を組織抽出液とした。実験は、すべて滅菌操作により行なった。
（６）サメ軟骨抽出物を摂取した非担癌または担癌ハムスター血清のＭＭＰ−９阻害活性測定
４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｂｒｉｊ３５を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８６）と、この２倍希釈の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を作成し、この５０ｍＭ緩衝液を用いて血清を適当な濃度に希釈（５〜２０倍）してＭＭＰ阻害活性測定に供した。
０．６ｍｌマイクロチューブに４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２ ０．１％Ｂｒｉｊ３５を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８６）１０μｌ、０．１％Ｖ型コラーゲン（牛胎盤由来ペプシン分解 株式会社ヤガイ製）溶液１０μｌ、血清サンプル５μｌ、ＭＭＰ−９溶液１０μｌを加え、３７℃で２４時間酵素反応させた。なおネガティブコントロール（ＮＣ）として血清、ＭＭＰ−９を除いたもの、ポジティブコントロール（ＰＣ）として血清を除いたものを用い、代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を同じ量になるように加えた。反応後、０．５Ｍ エチレンジアミンテトラ酢酸（ｐＨ７．５）を２０μｌ、１０％ＳＤＳおよび０．１％ＢＰＢをそれぞれ５μｌ加え、熱湯で加熱した。そのうち１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後ウエスタンブロット法によりＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＯＤイムノステインセット（和光純薬工業株式会社製）によりＶ型コラーゲンとその分解産物のバンドを分離・同定した。各バンド濃度はデンシトメータで測定し、Ｖ型コラーゲンのα１、α２鎖に対する分解産物のバンド鎖の存在比（ＩｎｔＯＤ％：Ｓ’）を求めた。分解阻害率はポジティブコントロール（ＰＣ）分解産物の存在比（ＰＣ’）を１００としたときの比を１００から引くことで阻害率を求め、さらに希釈倍率（Ｄ’）とアプライ量（Ａ’）から血清１ｍｌ中の阻害活性として表した。
［結果］
実験食（０．４％）または基礎食を非担癌ハムスターに２週間摂取させたときの血清におけるＭＭＰ−９のＶ型コラーゲン分解阻害活性（Ｕ／ｍｌ）は、実験食群では４．９５±０．０６、基礎食群では４．１３±０．５９であった。サメ軟骨抽出物を摂取することにより、ＭＭＰ−９に対する阻害活性が増加する傾向が見られた。
実験食（０．４％）または基礎食を担癌ハムスターに３週間摂取させたときの血清におけるＭＭＰ−９のＶ型コラーゲン分解阻害活性（Ｕ／ｍｌ）は、実験食群では４．１±０．３、基礎食群では３．２±０．７であった。
これらのことから、ハムスターにおいて、発癌によりＭＭＰ−９阻害活性は４．１Ｕ／ｍｌから３．２Ｕ／ｍｌに約２０％低下するが、サメ軟骨抽出物を摂取することにより非担癌ハムスター並みに有意に回復したことがわかる。また、健康な非担癌ハムスターにおいても、サメ軟骨抽出物を摂取することによりＭＭＰ−９阻害活性が約２０％増加することが認められた。
【実施例３】
ハムスター血清中のハプトグロビン量
非担癌ハムスターにサメ軟骨抽出物を二週間摂取したときの血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してＣＢＢ染色した。その結果、約８０ｋＤａのバンドが、基礎食群と比べて実験食群で増加していた。前記８０ｋＤａのバンドを切り出し、構造解析（プロテインシークエンサー：ＰＰＳＱ ２１、島津製作所製）したところ、ハムスター内因性のハプトグロビン（α鎖：ＶＤＬＳＮＤＡＭＤＴＡＤＤＳ（配列番号：１）、β鎖：ＩＩＧＧＳＬＤＡＫＧＳＦＰＷ（配列番号：２））であることがわかった。
ハプトグロビンは溶血により生じた酸化ヘモグロビンを結合して酸化的血管障害毒性を中和するなどの働きを持っており、溶血をはじめ、最近では癌の悪性度など多くの疾患の指標タンパクとなっている（Ｐａｔｈｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ．１９９８；４（４）：２７１−６、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９１ Ａｕｇ；６４（２）：３８６−９０）。また癌の転移・浸潤への関連が示唆されているカテプシンＢ（Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ｊ（Ｅｎｇｌ）．１９９８ Ｓｅｐ；１１１（９）：７８４−８、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９９ Ｊｕｌ ２３；４５５（３）：２８６−９０）に対する阻害活性能（Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２ Ｊｕｎ；６０（６）：６３１−７）や、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体が癌細胞のアポトーシスを誘導（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５ Ｏｃｔ；５５（６）：５２９−３５）することが報告されている。現段階でハプトグロビンに対する解釈は難しいが、解釈のひとつとしてサメ軟骨抽出物摂取により血清中ハプトグロビンの増加がみられ、肝機能が良好に保たれていた可能性がうかがえる。
【実施例４】
癌患者に対するサメ軟骨抽出物摂取の効果
膵臓癌を患った男性ボランティア（５０代）に対し、実施例１（１）で調製したサメ軟骨抽出物を毎日２ｇ、４ヶ月に渡り経口摂取させ、摂取前および摂取後の血清を分析した。この患者への他の抗癌剤投与は、副作用の影響が多大であったため、行っていない。
（１）サメ軟骨抽出物を摂取した担癌ヒト血清のＭＭＰ−９阻害活性測定
当該患者の血清を２０倍に希釈し、実施例２（６）と同じ手法でＭＭＰ−９の阻害活性を測定した。その結果を図１１に示す。
ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＝Ｖ型コラーゲン基質溶液のみの陰性対照）とＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＝Ｖ型コラーゲン基質溶液にＭＭＰ−９を加えインキュベーションした陽性対照）を比較すると、ＰＣにはＭＭＰ−９により分解された低分子量のＶ型コラーゲンがみとめられる。（図中矢印にて示す）
Ｂｅｆｏｒｅ（サメ軟骨抽出物摂取前の患者の血清）にはＰＣと同様の分解産物がみとめられるが、Ａｆｔｅｒ（同４ヶ月摂取後）では、明らかに分解物が減少しており、サメ軟骨抽出物を摂取することにより、癌患者においてもＭＭＰ−９に対する阻害活性が増加することが確認された。
（２）ＥＬＩＳＡ法による膵臓癌患者のＩＶ型コラーゲン分解物量の測定
癌患者においてＭＭＰ−９、２の活性が高ければ、ＩＶ型コラーゲンが分解され、その断片が血清中に増えることとなる。そこで、ＥＬＩＳＡ法測定キットであるバナッセイＩＶ−Ｃ（第一ファインケミカル株式会社製）を用い、血清中のＩＶ型コラーゲンの断片量を測定することで、ＭＭＰ−９の活性を評価した。
サメ軟骨抽出物摂取前および摂取後の患者の血清と、対照として健常者３名の血清を採取した。２０倍に希釈した血清５０μＬと酵素標識抗体液３００μＬとを加えた試験管に、抗体結合ビーズを投入し、混和後１時間静置した。静置後、洗浄液を試験管に加え反応液をアスピレータで吸引除去する工程を４回繰り返した。残ったビーズに発色液３００μＬを加え、さらに基質液１００μＬを加え、混和した後、３０分間静置した。静置後、停止液を１ｍＬ加え、水を対照として波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。予め用意した検量線にもとづき、吸光度から血清中のＩＶ型コラーゲン断片量を求めた。結果を図１２に示す。（「正常人」は健常者３名の平均値）
正常人に比べ、サメ軟骨抽出物の摂取前の膵臓癌患者の血清ＩＶ型コラーゲン量はかなり高い値となっている。そのため、ＩＶ型コラーゲンが分解を受け、癌の転移浸潤、増殖が生じていることが推測できる。これがサメ軟骨抽出物の摂取後は着実に減少している。このことからも、サメ軟骨抽出物の摂取がＭＭＰの活性を抑制する効果があることがうかがえる。
【産業上の利用可能性】
以前の報告にあるＭＭＰ合成阻害剤のＯＰＢ−３２０６における膵発癌抑制実験（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．１９９９ Ｊｕｌ；２０（７）：１３２３−９）と比較すると、本発明のプロテオグリカンの膵発癌抑制実験は合成阻害剤に匹敵する癌抑制効果を示している。そのうえ、被験動物の体重減少や運動能低下等のＭＭＰ合成阻害剤特有の目立った副作用は見られないことから、サメ軟骨由来の本発明品は、天然物由来の癌進行抑制物質として期待できる。また、本発明のプロテオグリカンの製造方法は、このような特性を有し、作用機序の明確なプロテオグリカンを容易に製造することができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨魚類の軟骨の水抽出物に由来し、主成分が５００ｋＤａ以上の分子量を有する単離されたプロテオグリカン。
【請求項２】
アルコールに不溶性である請求項１に記載のプロテオグリカン。
【請求項３】
グリコサミノグリカン部分がコンドロイチン硫酸Ｃを主成分とする請求項１または２に記載のプロテオグリカン。
【請求項４】
マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害活性を有する請求項１〜３いずれかに記載のプロテオグリカン。
【請求項５】
前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９であり、前記阻害活性が０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性の減少を回復させる作用、または０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を少なくとも５％増加させる作用である請求項４に記載のプロテオグリカン。
【請求項６】
有効量の生体内摂取によりカテプシンＢに対する阻害活性を上昇させる作用を有する請求項１〜５いずれかに記載のプロテオグリカン。
【請求項７】
有効量の生体内摂取により血清中のハプトグロビン量を増大させる活性を有する請求項１〜６いずれかに記載のプロテオグリカン。
【請求項８】
請求項１〜７いずれかに記載のプロテオグリカンを含有する組成物。
【請求項９】
生活の質を向上させるために用いられる請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７いずれかに記載のプロテオグリカンを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１１】
軟骨魚類由来の軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程、
前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程、
前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程、および
前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程
を含む請求項１〜７いずれかに記載のプロテオグリカンの製造方法。
【請求項１】
軟骨魚類の軟骨の水抽出物に由来し、主成分が５００ｋＤａ以上の分子量を有する単離されたプロテオグリカン。
【請求項２】
アルコールに不溶性である請求項１に記載のプロテオグリカン。
【請求項３】
グリコサミノグリカン部分がコンドロイチン硫酸Ｃを主成分とする請求項１または２に記載のプロテオグリカン。
【請求項４】
マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害活性を有する請求項１〜３いずれかに記載のプロテオグリカン。
【請求項５】
前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９であり、前記阻害活性が０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性の減少を回復させる作用、または０．４重量％添加餌料を摂取した担癌動物の血清中のＭＭＰ−９阻害活性を少なくとも５％増加させる作用である請求項４に記載のプロテオグリカン。
【請求項６】
有効量の生体内摂取によりカテプシンＢに対する阻害活性を上昇させる作用を有する請求項１〜５いずれかに記載のプロテオグリカン。
【請求項７】
有効量の生体内摂取により血清中のハプトグロビン量を増大させる活性を有する請求項１〜６いずれかに記載のプロテオグリカン。
【請求項８】
請求項１〜７いずれかに記載のプロテオグリカンを含有する組成物。
【請求項９】
生活の質を向上させるために用いられる請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７いずれかに記載のプロテオグリカンを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１１】
軟骨魚類由来の軟骨を平均粒径が１００μｍ以下の粉砕物に粉砕する工程、
前記粉砕物に水を添加し、水溶性成分を抽出する工程、
前記抽出された水溶性成分を含む水相を分離する工程、および
前記水相にアルコールを添加して沈殿物を得る工程
を含む請求項１〜７いずれかに記載のプロテオグリカンの製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３２５７
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３６７９（Ｐ２００５−５０３６７９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３４３２
【国際出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【出願人】（０００１１３３５５）ホソカワミクロン株式会社 (43)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３４３２
【国際出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【出願人】（０００１１３３５５）ホソカワミクロン株式会社 (43)
【Ｆターム（参考）】
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