遺伝子操作によるデキストランスクラーゼＤＳＲ−Ｓの新規変異体の構築
本発明は、酵素活性および／またはα−１，６結合の合成における特異性を保持しながらトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを生成するための組換えプロセスに関する。より正確には、本発明は、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼの核酸配列、該核酸配列を含むベクターならびにトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼをコードする配列によって形質転換された宿主細胞に関する。さらなる態様では、本発明は、酵素活性を保持、および／またはα−１，６結合の合成において特異性を保持するが、同じ条件下で未変性酵素により得られるデキストラン、ならびにモル質量およびデキストランが制御されたイソマルト−オリゴ糖の特性と比較して、レオロジー特性が改変された高モル質量のデキストランをサッカロースから生成できる、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを組換え方式で生成する方法に関する。本発明のデキストランおよびＩＭＯは、すなわちテクスチャー剤またはプレバイオティクスとして使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を保持しながら、および／またはα−１，６結合の合成に対する特異性を保存しながらトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを生成するための組換えプロセスに関する。より正確には、本発明は、トランケートまたは突然変異したデキストランスクラーゼの核酸配列、該核酸配列を含むベクターおよびトランケートまたは突然変異したデキストランスクラーゼをコードする配列によって形質転換された宿主細胞に関する。さらなる態様では、本発明は、最終生成物で酵素活性を保持する、および／またはα−１，６結合の合成に対する特異性を保持するトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを組換え方式で生成する方法、ならびにモル質量が制御された単一工程でのデキストランまたはイソマルト−オリゴ糖および特に未変性酵素で得られたデキストランの特性と比較してレオロジー特性が改変されたデキストランを生成する方法に関する。
【０００２】
発明の分野
デキストランは、主要鎖ならびにα−１，２、α−１，３および／またはα−１，４分岐において５０％以上がα−１，６結合を有する隣接グリコシル単位を含む多様な構造のα−Ｄ−グルカンである［１］。このようなデキストランをスクロースから生成する酵素はデキストランスクラーゼと称し、グリコシド加水分解酵素ファミリー７０に属する［２］。反応中、スクロース由来フルクトースが放出し、他の場所でアップグレードする可能性がある。デキストランスクラーゼはロイコノストック（Leuconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属およびラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸菌により生成される［１］。
【０００３】
ロイコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来のデキストランスクラーゼ（ＤＳＲ−Ｓ）は、１，５２７個のアミノ酸を含む［３］。この酵素は、９５％を超えるα−１，６結合によりグルコースホモポリマーの合成を触媒する。デキストランの生成は、好適なアクセプターを反応混合物に添加することにより、オリゴ糖またはグリコシル化抱合体の生成に再度方向づけられるかもしれない［４］。
【０００４】
デキストランおよびデキストラン誘導体に対する工業的応用は、特に特定のサイズを有するデキストランでは増加の一途にある。７０，０００〜１００，０００Daの範囲のサイズを有するデキストランは、例えば、血漿代用薬として使用される［５、３１］。さらに、４０，０００Daのデキストランを使用し、血液粘度を低下させ、赤血球凝集を阻害することでほぼ確実に血流を改善することができる［６、８］。硫酸化後、約１０，０００ダルトンのより小さいデキストランは、例えば鉄のトランスポーター［７］または抗凝固薬［８］として使用する。これらの化合物は抗ウイルス特性を有する可能性がある［９、１０］。
【０００５】
さらに、架橋したデキストラン誘導体は分子分離の分野で長い間使用されており；商標名Sephadex（登録商標）としてクロマトグラフィー担体は１９６１年から販売されている［６］。
【０００６】
さらに、欧州連合は近年、デキストランが９５％を超えるα−１，６結合を含み、２×１０６Daを超えるモル質量を有する場合、ベーカリー製品の食品成分としての使用を承認している［１５］。
【０００７】
デキストランスクラーゼはアクセプター反応を介してイソマルト−オリゴ糖（ＩＭＯ）を生成してもよい。グルカンスクラーゼにより行われるアクセプター反応は、スクロース由来のグリコシル残基を、反応培地に添加した他の分子へと移行させることからなる。特に、イソマルト−オリゴ糖の需要が年間約１５，０００トンである日本で商業的関心が高まっている［１１］。このような小さいＩＭＯ（ＤＰ２〜６）はベーカリー製品、飲料では日本酒、調味料、製菓に、また抗齲蝕原性甘味料として使用する。該ＩＭＯは腸内および／または膣内細菌叢に関して有用なプレバイオティクス特性を有することも示されている［１２、１３］。これらの特性はＩＭＯのサイズにより可変であるらしく、高い重合度が有利に働く［１４］。
【０００８】
デキストランの唯一の商業的供給源および通常の源はＬ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆをスクロースとともに培養することからなり、約１０８Daの高モル質量ポリマーが形成される。１０，０００〜１００，０００Daのより小さいデキストランの直接的合成は現在では不可能である。現在、デキストランは、高モル質量未変性ポリマーを酸加水分解し、その後有機溶媒を使用して分画することにより、慣用的に生成する。しかしこの第２工程は収率が低いことで名高い［１９］。
【０００９】
商業的観点から、ＤＰが２〜６であるＩＭＯは、デキストランスクラーゼＤＳＲ−Ｓおよびグルコースとのアクセプター反応によっては、その低い反応収率のために生成されないが、デンプン加水分解物およびα−アミラーゼとグルコシダーゼとの混合物からは生成される［１１］。
【００１０】
Monchoisら［１６］は、ロイコノストック・メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆのデキストランスクラーゼからのカルボキシ末端の欠失を記述しており、Ｃ末端ドメインの役割は活性部位をこえてデキストランおよびオリゴ糖の移行を促進することであると結論づけている。
【００１１】
米国特許ＵＳ−Ａ−５，２２９，２７７は、均一にモル質量が低いデキストランポリマーを生成するプロセスを記述しており、このプロセスはロイコノストック・メゼンテロイデスと、デキストランのα−１，６結合の加水分解のための特定の酵素デキストラナーゼの活性を有する酵母であるリポマイセス・スターケイ（Lypomyces starkeyi）ＡＴＣＣ７４０５４の突然変異微生物とを使用している。該方法は特定の培養条件、ならびにデキストラナーゼ活性がデキストランのモル質量を減少させるように正確に調節された持続時間および温度を必要とする。該方法で生成されたデキストランポリマーのモル質量は４０，０００〜１５０，０００Daの範囲にある。
【００１２】
前記で、酸加水分解も分画も特に必要としない収率が良好である迅速な方法を使用してモル質量が約１０，０００〜１００，０００Daであるデキストランの生成が必要であることが示されている。
【００１３】
本発明は、酵素活性を保持しつつ、および／またはα−１，６結合の合成に対する特異性を保存しつつもトランケートおよび／または突然変異した、組換え方式で生成したデキストランスクラーゼ、あるいはモル質量を制御したデキストランを生成するデキストランスクラーゼのトランケート変異体に関する。より正確には、それらは未変性ＤＳＲ−Ｓの結合特異性を保存し、および／またはα−１，６結合を合成する特異性を保存し、スクロースを出発物質として、興味深いテクスチャー特性を有する高モル質量デキストランおよび／またはモル質量を制御したデキストランとＩＭＯを生成する。
【００１４】
本発明はまた、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼの核酸配列、ベクターおよび前記ベクターによって形質転換された宿主細胞、ならびにトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼのアミノ酸配列を提供することにも関する。
【００１５】
特に、実施例から明らかになるように、ある種のデキストランスクラーゼは興味深いテクスチャー特性、すなわち未変性酵素により生成したポリマーの特性よりも実質的に優れている特性を有するポリマーを生成し；他の種はモル質量が制御されたデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖を生成する。イソマルトースは少なくとも１つのトランケートおよび突然変異したデキストランスクラーゼにより生成される。
【００１６】
本発明のさらなる態様は以下の記述および実施例または好ましい実施から明らかになる。
【００１７】
発明の要旨
第一の態様では、本発明は、図１に記載のヌクレオチド配列（配列番号１）、図２に記載のヌクレオチド配列（配列番号２）、図３に記載のヌクレオチド配列（配列番号３）、図４に記載のヌクレオチド配列（配列番号４）、図５に記載のヌクレオチド配列（配列番号５）、配列番号１、２、３、４もしくは５を有する配列の１つとの相補的配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、２、３、４もしくは５を含む配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性を保持している配列から本質的になる、またはそれからなるヌクレオチド配列に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント（配列番号１７）、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント（配列番号１８）、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント（配列番号１９）、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント（配列番号２０）および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント（配列番号２１）から選択されたヌクレオチド配列から本質的になる、あるいはそれからなるデキストランスクラーゼのヌクレオチド配列に関する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号２の位置３７３〜位置４００５のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号３の位置３７３〜位置３４０８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号４の位置３７３〜位置３０１８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、および配列番号５の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、あるいはそれからなるヌクレオチド配列に関する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の位置３７３〜位置３４０８にある配列のフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメントから選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ただしその配列はデキストランスクラーゼ酵素活性を保持し、それとハイブリダイズする該ヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドを有し、フラグメントの全長にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列に関する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、配列番号６〜１０もしくは２２〜２６のいずれか１つの連続的アミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００２２】
一層さらなる態様では、本発明は、ベクター、例えばプラスミド、ならびに前記ベクターによって形質転換され、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼ、特に実施例の変異体由来の核酸の該配列を含む宿主細胞に関する。
【００２３】
本発明の一層さらなる態様では、本発明は、配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択される前記トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に関する。
【００２４】
さらに本発明は、特に、配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択される本明細書に記載の配列の１つから本質的になる、あるいはそれからなるトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼに関する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、デキストランスクラーゼを発現させる条件下でトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを含む宿主細胞を培養し、培地から該デキストランスクラーゼを単離することによる突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼの調製に関する。
【００２６】
本発明はまた、本発明の突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼとスクロース、場合によりアクセプターとを反応させて、モル質量が制御されたデキストランおよび／またはイソマルト−オリゴ糖（ＩＭＯ）を生成し、イソマルトースを含む、モル質量が制御された該デキストランまたはＩＭＯを得る方法に関する。
【００２７】
本質的にスクロース由来のＩＭＯを直接的に生成する方法はまた、本発明の態様を構成する。本明細書で使用する用語「本質的に」は、アクセプターが必ずしも反応に使用される必要がないことを意味している。
【００２８】
本発明の高モル質量デキストランは、未変性酵素、特に非ニュートン性、繊維性の特性および／またはゲル化特性により合成されたデキストランの特性と比較してレオロジー特性が改変されている。
【００２９】
最終的に、本発明は前記デキストランスクラーゼを使用して得られるデキストラン含有組成物、ならびに３４２〜１０９Daの範囲でモル質量を制御したデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖を生成するための該デキストランスクラーゼの使用に関する。より正確には、本発明は（ｉ）イソマルトース（３４２Da）、（ｉｉ）３４２〜５，０００Daのイソマルト−オリゴ糖、（ｉｉｉ）１，３００〜５２，０００Da、より正確には５，０００〜２２，０００Da、中間がおよそ１０，０００Daであるようにサイズが制御されたデキストラン、（ｉｖ）７，０００〜１．７×１０５Da、より正確には２２，０００〜７０，０００Da、中間がおよそ４０，０００Daであるようにサイズが制御されたデキストランを生成する。
【００３０】
好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書で使用した用語「デキストランスクラーゼ酵素活性を有する酵素」は、α−１，６結合で結合し、３４２〜１０９Daの範囲のサイズであるグリコシル単位を、５０％を越えて含むオリゴシドおよびポリオシドへと、より詳しくは、α−１，６結合が９５％を超えるデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖へとスクロースを変換することを触媒する酵素を意味する。この変換はマルトース、グルコース、イソマルトースまたはフルクトースまたはイソマルト−オリゴ糖などの外部アクセプターの存在下または非存在で行ってもよい。マルトース、イソマルトースおよびグルコースは本発明の好ましいアクセプターである。本発明のデキストランスクラーゼの酵素活性は実施例で記述したとおりに測定してよい。
【００３１】
本明細書に使用する用語「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は同義であり、単鎖または二重鎖の形態の２種以上のヌクレオチドを有するＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列を含むがこれらに限定されない。本発明のポリヌクレオチド配列は、限定されないが任意の組換え合成法および任意のエクスビボ産生法、かつそれらの方法の組み合わせなどの任意の公知の方法で調製してよい。
【００３２】
本明細書で使用する用語「トランケートされた」はアミノ酸配列または核酸配列のＮまたはＣ末端の少なくとも１つを短くしたことを意味する。短縮は制限酵素、タンパク質分解酵素を使用して、またはヌクレオチド配列の特異的増幅、特にＰＣＲなど合成的に行ってよい。
【００３３】
本明細書で使用する用語「精製デキストランスクラーゼ」は、その調製においてデキストランスクラーゼ活性形態を１つしか持たず、タンパク質純度は少なくとも７０％または８５％または９５％であるデキストランスクラーゼを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する用語「興味深い独自のテクスチャー特性」は、同じ条件下で未変性酵素により合成したデキストランと比較して、例えば非ニュートン性挙動、特にゲルまたは繊維型挙動を示す本発明のデキストランのレオロジー特性を意味する。「ゲル型ポリマー」は本明細書では、エネルギー保持（Ｇ’）およびエネルギー散逸（Ｇ”）率を検出する力学的モードのレオロジー測定で特徴づけする。ゲルでは、研究した周波数全域にわたってＧ’はＧ”より高く、このことは実施例５で明らかになる。繊維性特性は裸眼で同定可能である。実施例５でもわかるように、剪断応力の第２系列を付与した後に、本発明の繊維性デキストランは溶液型挙動からゲル型挙動へと変化する。
【００３５】
本明細書で使用する以下の略称は以下の意味を有する：ＤＳＲ−ＳはＬ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来のデキストランスクラーゼ；ＤＰは重合度；ＨＭＷは「高モル質量」、ＩＭＷは「中間モル質量」、ＩＭＷポリマーは、濃度が低いことからＨＰＳＥＣによる分離が困難である、サイズが１，０００〜１０７Daの範囲の高度多分散ポリマーである。ＬＭＷポリマー（低モル質量）は、本発明にしたがって、７５０〜７０，０００Daで中間がおよそ１０，０００Da、または２，０００〜１．７×１０５Daで中間がおよそ４０，０００Daの範囲で、はるかに高度かつ容易に検出される集団である。
【００３６】
本明細書で使用する用語「１０，０００Daデキストラン」は、サイズが１，３００〜５２，０００Daの範囲にあり、より正確には５，０００〜２２，０００Daであり、中間が約１０，０００Daのピーク最高値であるデキストランの集団を意味する。特徴づけの際、ゲル透過で得られた溶出ピークの塩基は１，３００〜５２,０００Daの範囲であり、溶出ピークの半分の高さで推定したモル質量の範囲は５，０００〜２２,０００Daの範囲であり、ピークは中間にあり、そのピーク高はおよその質量で１０,０００Daであった。モル質量がピークの半分の高さで表された場合、デキストラン集団のうち少なくとも５０％が指示範囲内に収まっていた。
【００３７】
本明細書で使用する用語「４０，０００Daデキストラン」は、サイズが７，０００〜１．７×１０５Daの範囲にあり、より正確には２２，０００〜７０，０００Daであり、中間が約４０，０００Daのピーク最高値であるデキストランの集団を意味する。特徴づけの際、ゲル透過で得られた溶出ピークの塩基は７，０００〜１．７×１０５Daの範囲であり、溶出ピークの半分の高さで推定したモル質量の範囲は２２，０００〜７０,０００Daの範囲であり、ピークは中間にあり、約４０,０００Daの質量であった。モル質量がピークの半分の高さで表された場合、デキストラン集団のうち少なくとも５０％が指示範囲内に収まっていた。
【００３８】
ＩＭＯはイソマルト−オリゴ糖を意味する。
【００３９】
本明細書で使用し、核酸またはアミノ酸に関連して使用する場合の用語「本質的に〜からなる」は、他の主要でない成分または分子がアミノ酸配列または核酸配列とともに存在する可能性があることを意味する。核酸配列は配列識別番号で示されたものと全く同じ長さであるが、ＮおよびＣ末端で３〜１２個分のヌクレオチドが過剰にある場合がある。同様に、アミノ酸配列は配列識別番号で示されたものと全く同じ長さであるが、ＮまたはＣ末端で１〜４個分のアミノ酸が過剰に付加されている場合がある。これらの過剰なアミノ酸は酵素活性に全く影響を及ぼさない。
【００４０】
より具体的には、本発明はトランケートしたデキストランスクラーゼもしくは突然変異したデキストランスクラーゼをコードする核酸、その配列のすべてもしくは一部と相補的な配列、またはデキストランスクラーゼ酵素活性が保持されるのであれば上記の配列の１つと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列に関する。当然のことながら、それにハイブリダイズするヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドを有し、フラグメントの全長にわたってハイブリダイズする。
【００４１】
本明細書で使用する用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning Manual, 3rd edition (2001)に記述する条件を意味し、すなわち、以下の条件を一例として挙げる：ハイブリダイゼーションバッファー：２×ＳＳＣ、１０×デンハルト溶液（Ficoll 400&PEG&BSA、割合１：１：１）、０．１％のＳＤＳ、５mMのＥＤＴＡ、５０mMのＮａ２ＨＰＯ４、２５０μg/mlのニシン精子ＤＮＡ、５０μg/mlのｔ−ＲＮＡまたは０．２５MのｐＨ７．２のリン酸ナトリウムバッファー、１mMのＥＤＴＡ、７％のＳＤＳ；
ハイブリダイゼーション温度：６０℃；
洗浄バッファー：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；
洗浄温度：６０℃。
【００４２】
ストリンジェントな条件下で本発明の核酸とハイブリダイズする核酸分子は、原則として細菌、グラム陽性細菌、および本発明の１つの態様ではロイコノストック属、ストレプトコッカス属またはラクトバチルス属などの任意の微生物由来のデキストランスクラーゼをコードする可能性がある。
【００４３】
本発明は、配列番号１〜配列番号５および配列番号１７〜２１の配列と少なくとも７０％または８０％または９０％の配列同一性を有するデキストランスクラーゼタンパク質をコードする核酸であって、但し、該配列によってコードされるタンパク質がデキストランスクラーゼ酵素活性を有する核酸に関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、配列番号６〜１０または２２〜２６のいずれか１つの連続的なアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００４５】
本発明のさらなる態様では、本発明の配列に相補的な配列、またはストリンジェントな条件下で該配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性が維持されている配列、も本発明に包含される。
【００４６】
基本的なヌクレオチド配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５）からの誘導であり、ここでは該配列は、配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるヌクレオチドのフラグメントから選択され、該配列に相補的な配列、またはストリンジェントな条件下で該配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性が維持されている配列は、欠失、置換、挿入または組換えにより、例えば；当技術分野で周知であり、例えば前記Sambrookらが記述している前記工程および形質転換により生成してよい。
【００４７】
本明細書において当然のことながら、上述の配列のいずれかに任意に欠失、置換、挿入または組換えが起こっても、配列によってコードされたタンパク質はそのデキストランスクラーゼ酵素活性を維持しなければならない。したがって１〜１３２、好ましくは２〜６０個のヌクレオチド、より好ましくは１５〜３６個のヌクレオチド、さらにより好ましくは１２〜２７個のヌクレオチドを、例えば欠失、置換、挿入または組換えによって修飾してもよい。本発明によると、ヌクレオチドの９０％、好ましくは９５％が変化しないままで存在する。
【００４８】
デキストランスクラーゼ酵素活性は本出願の方法の項および実施例に記述したとおり、測定することが可能である。
【００４９】
プローブまたはプライマーとして使用してよいオリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１〜配列番号５であり、あるいは配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるヌクレオチドのフラグメント、から選択されたヌクレオチド配列である。
【００５０】
プローブおよびプライマーの長さはその用途により可変である。一般に、それらは少なくとも２５個のヌクレオチドを必ず有しており、記述したデキストランスクラーゼ配列のすべて、３，８６９個のヌクレオチドなどを含んでいる場合がある。長さは例えば２５〜１５０個のヌクレオチド、２５〜８００個のヌクレオチドまたは２５〜３０００個のヌクレオチドの範囲でも可変である。
【００５１】
プライマーの長さは概して１８〜２５個のヌクレオチドであるが、想定した用途によってはさらに長くなる可能性もある。本発明に使用可能なプライマーの例としては以下が挙げられる：
【表１】
【００５２】
ヌクレオチドの５’および３’末端位置にあるプライマーはデキストランスクラーゼ（配列番号１１〜１５）および突然変異配列の５’および３’部位（配列番号１６）をコードすることは留意されたい。しかし当業者はこれらの配列をそれぞれ使用し、連続的なヌクレオチドを用いてプライマーまたはプローブを生成することができる。さらに、プローブとして使用されるこれらのヌクレオチド配列は、特に放射活性、酵素標識、蛍光標識によりタグ化してよい。
【００５３】
原核または真核細胞を遺伝子操作するために、本出願の核酸または本出願の核酸の一部をヌクレオチド配列の組換えにより配列の突然変異または修飾を可能にするプラスミドに導入してよい。これらの技術を使用する標準法は当業者に公知であり、特に、上述のSambrookらに報告されている。またＤＮＡフラグメントは互いにアダプターまたは連結部位により結合可能で、好適な制限酵素を使用して特定のＤＮＡ配列を除去することが可能である。突然変異誘発、プライマー復元後の制限法または結紮法などの方法を使用し、適切な挿入、欠失、または必要なもしくは所望の置換により目的の配列を得ることが可能である。
【００５４】
さらに、核酸をコードする明確なタグを本発明の核酸配列のＮまたはＣ末端に付着させてよい。それらはポリＨｉｓ、ｃ−ｍｙｃエピトープもしくはＨＡタグなどのペプチド、または細菌性ＧＳＴ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質等の小さいタンパク質であってよい。
【００５５】
他のタンパク質タグをコードする特定の核酸はＨｉｓ−タグ、Ｔ７タグ、Ｓ−タグ、「フラッグ」ペプチド、ｔｒｐＥ、アビジン／ストレプトアビジン、ブドウ球菌ＡまたはＧタンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、セルロース結合ドメイン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン等であり、本発明で使用してもよい。
【００５６】
本発明の一態様にしたがって、チオレドキシンをコードする核酸をＮ末端核酸配列に融合させる。６×Ｈｉｓタグをコードする核酸を核酸配列の３’末端に融合させる。
【００５７】
本発明の核酸は、（１）プロモーターや増幅因子などの遺伝子発現調節子、（２）ｍＲＮＡに転写され、対応するタンパク質に翻訳されるコード配列または構造配列、および（３）適切な開始および終止シグナル、を含む転写単位に連結してよい。
【００５８】
多数の好適な発現制御配列が当技術分野で公知である。組換えタンパク質を発現する一般法も公知であり、R Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)の文書が例として挙げられる［１７］。
【００５９】
本発明のベクターに使用可能なプロモーター領域には、ｌａｃＬ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ｔｒｅおよびａｒａが挙げられる。
【００６０】
本発明はまた、ベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、ならびに遺伝子工学分野で公知であり、本発明の一態様では本出願の核酸配列を含み、プラスミドであり、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ、ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡから選択された、他のベクターに関する。
【００６１】
本発明の核酸は原核または真核細胞で発現させてよい。引用される可能性のある該細胞の非限定的例として、ＶＥＲＯ細胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ３などのＨＥＬＡ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１などのＣＨＯ細胞系、ＣＯＳ−７などのＣＯＳ細胞およびＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲ細胞：１６５０、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ６３６１、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、２９３細胞などの３Ｔ３、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ １７１１などのＳｆ９細胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ７０などのＣｖ１細胞ならびにＡＴＣＣ Ｔｉｂ１５２などのＪＲＫＡＴ細胞が挙げられる。
【００６２】
本出願で使用可能な非限定的細胞には、大腸菌（Eschierichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）またはシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属およびブドウ球菌（Staphylococcus）属の株などの原核宿主細胞の株、もしくは寄生生物アピコンプレクサ（Apicomplexan）（マラリア原虫（Plasmodia）、トキソプラズマ（Toxoplasma）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidia））、リーシュマニア（Leishmania）またはトリパノソーマ（Trypanosoma）などの真核宿主細胞の株が挙げられる。
【００６３】
他の適切な細胞を本発明に使用してもよく、特にサッカロマイセス（Saccharomyces）、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母細胞および真核細胞（植物細胞、ＣＨＯ細胞等）が挙げられる。
【００６４】
さらなる態様では、本発明の核酸を発現するのに使用する細胞は大腸菌および、例えばＪＭ１０９、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＴＯＰ１０またはＰｉｒ１から選択される株である。サッカロマイセス・セレビシエのＩＮＶｓｃ株を使用してもよい。
【００６５】
本発明は、上述の核酸配列または上述のベクターで形質転換した宿主細胞、および形質転換細胞由来であり本明細書に記載のベクターまたは核酸配列を含む細胞に関する。
【００６６】
引用してもよいこのような宿主細胞の例として、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼが生成される可能性がある大腸菌が挙げられる。このような宿主細胞の調製は当技術分野で公知である。
【００６７】
本発明の核酸分子によってコードされる、タンパク質および該タンパク質と突然変異タンパク質の生物活性的フラグメント、ならびにこれらの調製法も本発明の範囲内にある。
【００６８】
よって本発明は突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼの調製法であって、以下の工程：
（ａ）上述の核酸配列または上述のベクターにより、デキストランスクラーゼの発現を可能にする条件下で形質転換した宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）培地から該デキストランスクラーゼを単離する工程
を含む方法に関する。
【００６９】
より具体的には、核酸配列は、配列番号１の位置３７３〜位置４２６９、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の前駆体３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、該配列の相補的配列、およびストリンジェントな条件下で該配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性が保持されている配列、から選択してよい。
【００７０】
単離後に本発明のデキストランスクラーゼを精製してもよい。この点において、通常の精製法を使用してよく、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性交換型クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相ＨＰＬＣ、相偏析等が挙げられる。本発明の一態様では、本発明の突然変異またはトランケートしたデキストランスクラーゼは、チオレドキシンおよび６×Ｈｉｓタグの存在を考慮して、ニッケルを充填した樹脂を使用して精製してよい。
【００７１】
本発明の別の態様は、配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント、から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそれからなるデキストランスクラーゼタンパク質に関する。
【００７２】
上記で説明した配列番号１〜配列番号５のヌクレオチド配列または該配列のフラグメントの１つによってコードされたタンパク質は、本発明の別の実施態様である。
【００７３】
相同アミノ酸配列、すなわち上記で定義した配列との類似度が酵素活性を維持するに十分である配列もまた、本願の対象に含まれる。よって、BlastおよびFastaプログラムを使用して類似性を調査してもよい。酵素活性を維持しながらデキストランスクラーゼのＮおよびＣ末端をトランケートできることが本明細書で明らかになったことから、単一完全配列のみならずトランケート配列に対しても配列類似性を考えることはできない。よって本発明は、完全配列と８０％、９０％または９８％の配列類似性がある任意の配列、ならびにトランケート配列の１つと８０％、９０％または９８％の配列類似性がある配列であって、ただし酵素活性が維持されている配列に関する。
【００７４】
より具体的には、本発明は、配列番号６〜１０と、９０％、９５％または９８％オーダーの類似度を有する配列、または配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸のフラグメントから選択されるアミノ酸配列に関しており、但しこれらのタンパク質は該デキストランスクラーゼの酵素活性を有している。明らかに、上記で定義した特異的同一性を有するアミノ酸配列は大多数が保存的にアミノ酸置換されている。
【００７５】
保存的アミノ酸置換は同じ種類のアミノ酸置換を含む。これらの種類は例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒなどの非荷電極性側鎖を有するアミノ酸；Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇなどの塩基性側鎖を含むアミノ酸；ＧｌｕまたはＡｓｐなどの酸性側鎖を含むアミノ酸、およびＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＣｙｓまたはＴｒｐなどの非極性側鎖を含むアミノ酸を含む。
【００７６】
さらに、アミノ酸が置換されたデキストランスクラーゼの酵素活性に関し、これは実施例に示したとおりに試験することが可能であるが、活性もＨＰＬＣ分析により、あるいはアミノ酸変化がタンパク質機能に影響を与える方式について通常通りに予測して、評価することが可能である。
【００７７】
さらなる態様では、アミノ酸配列を本明細書に示していることから、タンパク質はR B Merrifieldの方法、1963［２０］を使用して合成してよい。この理由で、合成したデキストランスクラーゼタンパク質は本発明の別の態様を構成する。
【００７８】
本発明はまた、位置６６３、６６４および６６５にあるセリン、グルタミン酸およびバリンがそれぞれチロシン、アスパラギン酸およびアラニンへと改変されたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの突然変異体ＳＥＶ６６３ＹＤＡという突然変異デキストランスクラーゼに関する。
【００７９】
グルコースなどのアクセプターを反応培地に添加した場合に得られるものと同等の収率で、基質としてのみスクロースを使用して、スクロースからイソマルトースを合成するためにこの突然変異体を使用してよい。
【００８０】
この理由で、本発明はスクロースから直接イソマルトースを生成する方法で、配列番号１０を有する突然変異体デキストランスクラーゼとスクロースとを反応させ、イソマルトースを生成する工程を含む該方法に関する。
【００８１】
前述したタンパク質タグを含む融合タンパク質はまた本発明の一部を形成する。この点では、本発明の突然変異および／またはトランケートしたタンパク質は少なくとも１つのタンパク質タグと融合してよい。
【００８２】
本発明のトランケートしたデキストランスクラーゼを使用してＬ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆの未変性ＤＳＲ−Ｓにより合成したデキストランと比較してレオロジー特性が改変された、高モル質量（約１０６〜１０８Da）デキストランの調製は本発明の別の態様である。
【００８３】
より具体的には、デキストランスクラーゼを分泌する微生物または細胞内方式でデキストランスクラーゼを生成する微生物の細胞抽出物はスクロース含有培地で培養し、または使用してよく、結果としてイソマルトース（３４２Da）、（ｉｉ）３４２〜５，０００Daのイソマルト−オリゴ糖、（ｉｉｉ）サイズが１，３００〜５，２００Daに制御され、中間がおよそ１０，０００Daであるデキストラン、（ｉｖ）サイズが７，０００〜１．７×１０５Daに制御され、中間がおよそ４０，０００Daであるデキストラン、および（ｖ）２×１０６Da〜１０９Daの高モル質量であるデキストランが合成される。これらの化合物は、限外ろ過、ナノろ過、アルコール沈殿、液体クロマトグラフィー等の従来法による培地から単離してよい。
【００８４】
あるいは、本発明に記載のトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを精製し、モル質量を制御したデキストランの生成法に使用してよい。
【００８５】
よって、本発明は、モル質量を制御したデキストランおよび／またはイソマルト−オリゴ糖を生成する方法に関するものであり、この方法は、上記で定義した配列番号６〜配列番号１０のヌクレオチド配列より選択した配列から本質的になる、あるいはそれからなる突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼを少なくともスクロース、および場合によりアクセプターと反応させる工程を含む。
【００８６】
本発明はまた、イソマルトースの生成法、本質的に配列番号１０の配列を有する突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼをスクロースと反応させる工程を含む方法に関する。本発明はまた、興味深いテクスチャー特性を有するデキストランの生成法、突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼを配列番号６の配列と反応させる工程を含む方法に関する。
【００８７】
本発明は本明細書に記述した方法で得られる可能性のある本出願で定義した特徴を有するデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖に関する。これらの特徴的な特性には、高モル質量デキストランが非ニュートン性挙動、およびゲル特性または繊維特性の性質を有し、剪断応力の第２系列を付与した後に溶液型挙動からゲル型挙動に変化するという特性を有するという事実が含まれる。
【００８８】
実施例で明らかになるように、好都合にも異なるレオロジー特性は、酵素が精製してあるか否かによって得られる可能性がある。
【００８９】
本発明の酵素的に生成したデキストランは、医薬産業における補助剤として、血漿代用薬、布地または塗料の添加剤として、化粧品に、肥料産業に、ならびにテクスチャー剤として、例えばアラビアゴムまたはゲル化剤の代用物として使用してよい。本発明はまた、本発明のデキストランおよびＩＭＯを含む組成物に関する。
【００９０】
本出願のデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖の１つの重要な用途はプレバイオティクスとしての使用である。これらの生成物は完全には代謝されず、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）および乳酸桿菌（Lactobacilli）などの適切な細菌種により結腸内で選択的に発酵する。
【００９１】
オリゴ糖は、ヒトもしくは動物の食料用に、医薬産業で、化粧品産業で、または甘味料、安定剤もしくは充填剤として従来から使用されてきた［２１］。この１５年間、特定の非消化分子のプレバイオティクス特性に対して活性の新たな分野が開発されている［２３］。プレバイオティクスとしてオリゴ糖は、消化酵素による攻撃に耐性を有し、腸内のビフィドバクテリウム属および乳酸桿菌を主として「健康に良い」細菌の増殖を促進するという能力に関して興味深い。この考えは、急速に人気を博している市販のプレバイオティクス製品が出現したことにより刺激された。フルクト−オリゴ糖、ラクチュロース、ガラクト−オリゴ糖、キシロ−オリゴ糖、大豆抽出オリゴ糖、または生物学的プロセスにより、もしくは植物からの抽出により通常得られるイソマルト−オリゴ糖などのオリゴマーも有望である。現在この分野の研究は、第２世代プレバイオティクスと称する新規のオリゴ糖構造を生成することを中心に行われており、これは新規の物理化学的特性および、より特異的な生物活性を有するはずである［１８］。
【００９２】
さらなる態様では、本発明は、本発明のデキストランスクラーゼから得たデキストランを含む組成物および医薬的に許容され得るビヒクルまたは食品品質ビヒクルに関する。
【００９３】
許容され得るビヒクルは、例えばアジュバント、塩等から選択してよく、アジュバントはムラミルペプチド、ミョウバン、モンタニド等から選択してよい。突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼは、精製タンパク質、組換え法で生成したタンパク質または合成的に生成したタンパク質であってよい。
【００９４】
デキストランおよび／またはＩＭＯの生成法に関し、使用の際の好ましいアクセプターはグルコース、イソマルトース、マルトースおよびイソマルト−オリゴ糖である。
【００９５】
モル質量を制御したイソマルト−オリゴ糖を生成する方法には、本質的に配列番号７、８、９または１０の配列からなる突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼをスクロースと反応させる工程が含まれることが好ましい。よって重合度は２〜６０グルコシル単位（ＤＰ２〜ＤＰ６０）の範囲で変化する。
【００９６】
生成反応は４℃〜８０℃、好ましくは４℃〜４０℃の範囲の温度で起こる。
【００９７】
配列が配列番号７、配列番号８または配列番号９である場合、温度は４℃〜１５℃、好ましくは８℃〜１２℃であることが好ましく、サイズを制御してデキストランを生成するため、温度は１０℃オーダーであることがより好ましい。さらに、この配列のために、温度は約８℃〜約２５℃の範囲であることが好ましく、ＩＭＯを合成するためには２０℃オーダーであることがより好ましい。
【００９８】
さらに、配列が配列番号６または配列番号１０である場合、温度は１５℃〜４５℃、好ましくは１７℃〜３０℃であることが好ましく、２０℃〜２５℃オーダーであることがより好ましい。
【００９９】
さらに、スクロース濃度は１０〜６００g/l、好ましくは７５〜４００g/l、より好ましくは９０〜２８０g/lである。
【０１００】
配列が配列番号７、配列番号８または配列番号９である場合、培地におけるスクロースの濃度は２５０g/lオーダーが好ましい。
【０１０１】
さらに、配列が配列番号６または配列番号１０である場合、スクロースの濃度は１００g/lオーダーでよい。
【０１０２】
さらに必要に応じて、スクロース／アクセプター重量比はおよそ０．５〜１２、好ましくは１〜４、より好ましくは約２オーダーでよい。
【０１０３】
本発明の方法では、デキストランスクラーゼは遊離形態であるか、あるいは支持体に固定している。前記固定は、例えば吸着、封入または共有結合によって行われる可能性がある。
【０１０４】
最終的に、本方法を実行するため、ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜７．０、より好ましくは４．５〜６．０、さらにより好ましくは約５．２の範囲である。
【０１０５】
本発明の他の態様は以下の実施例の研究から明らかになる可能性がある。
【０１０６】
実施例１：変異体の構築
Ｌ−アラビノースプロモーターの制御下でトランケートおよび／または突然変異したｄｓｒＳ遺伝子をクローン化および発現するために、pBad/TOPO Thiofusionベクター（Invitrogen）を使用した。それにより遺伝子はC末端で６×Ｈｉｓタグに、およびN末端でチオレドキシンタグに融合する。
【０１０７】
マトリックスとして使用するため、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来ゲノムＤＮＡを「Blood and Cell culture DNA maxi」キット（Qiagen）を使用して抽出した。株はNCAUR collection, Peoria, IL, USAから入手する。
【０１０８】
トランケートおよび／または突然変異したｄｓｒＳ遺伝子を発現するために、One Shot TOP10細胞（Invitrogen）を使用した。制限酵素をNew England Biolabsから購入し、メーカーの取扱説明書にしたがって使用した。ＤＮＡをQiagenの「QIAquick」（ＰＣＲおよびゲル抽出による精製）および「QIAprep」（プラスミド精製）キットを用いて精製した。
【０１０９】
Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来ゲノムＤＮＡからＤＳＲ−Ｓ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、変異体を「Expand High fidelity」ポリメラーゼ（Roche）および以下のプライマー（５’→３’方向）を使用して構築した：
１ ｐＢａｄおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌプライマー：
【表２】
およびＰＢａｄ Δ４Ｎ：
【表３】
を使用してＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎを構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｔ１５２〜Ｓ１４５０が含まれていた。
２ ｐＢａｄおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌプライマー：
【表４】
およびＰＢａｄ Δ３：
【表５】
を使用してＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌΔ３を構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｔ１５２〜Ｇ１３６２が含まれていた。
３ ＰＢａｄおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌプライマー：
【表６】
およびＰＢａｄ Ｃｏｒｅ：
【表７】
を使用してＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅを構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｔ１５２〜Ｇ１１６２が含まれていた。
４ ＰＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｃａｔプライマー：
【表８】
およびＰＢａｄ Ｃｏｒｅ：
【表９】
を使用してＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡを構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｇ２８２〜Ｇ１１６２が含まれていた。
５ 「mega primer」技術［３３、２１］およびＤＮＡポリメラーゼPfu（Strategene）を使用する定方向突然変異誘発により、突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡを構築した。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４ＮプラスミドマトリックスおよびＳＥＶ６６３ＹＤＡプライマーペア：
【表１０】
およびＢｓｔＢＩ制限部位（下線部）を含むｒｅｖ：
【表１１】
を使用して第一のＰＣＲ反応を行った。その後、ＳｐｅＩ制限部位を含むｆｏｒｗプライマー：
【表１２】
による第二のＰＣＲにおいて、逆メガプライマーとしてＰＣＲ産物を使用した。その後，メーカーの条件（New England Biolabs）にしたがって第二ＰＣＲ産物を２つの制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素であらかじめ消化したｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎベクターへクローン化した。陽性クローン（この場合、ＳａｃＩ部位）を選択するために、単一制限部位を導入するようにＳＥＶ６６３ＹＤＡプライマーを設計した。
【０１１０】
変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの各々の一次構造は図６で図式的に示す。
【０１１１】
実施例２：大腸菌における変異体の生成
ＤＳＲ−Ｓはアルカリ性ｐＨ条件下では不安定であることが知られており［３］、１００mNのＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨを６．４に緩衝した２×ＹＴ培地で、バッフル付エルレンマイヤーフラスコ中で培養を行った。
【０１１２】
培地２×ＹＴの組成物：
バクトトリプトン １６g/l
酵母エキス １０g/l
ＮａＣｌ ５g/l
Ｔｒｉｓ １２．１g/l
【０１１３】
ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４ＮおよびｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡプラスミドを有する大腸菌ＴＯＰ１０細胞を２３℃で培養した。細胞が増殖し、ＯＤ６００nmが０．２で誘導因子が０．００２％（w/v）になったときにＬアラビノース誘導を行った。細胞溶解段階の開始に先だって細胞増殖がプラトー（ＯＤ６００nmは約３〜３．５）に到達したときに培養を停止した。
【０１１４】
ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ＣｏｒｅΔＡプラスミドを有する大腸菌ＴＯＰ１０細胞の温度を１６℃にした。ＯＤ６００nmが０．２になり、ＬアラビノースがＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の場合０．００５％（w/v）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの場合０．０２％（w/v）になったときに誘導を行った。細胞溶解段階の開始に先だって細胞増殖がプラトー（ＯＤ６００nmは約２．５）に到達したときに培養を停止した。
【０１１５】
培養後、細胞を遠心分離（８，０００×g、１０分、４℃）で回収し、再懸濁し、酢酸ナトリウムバッファー５０mM、ｐＨ５．２中でＯＤ６００nmが８０になるように濃縮し、０．０５g/lの１mMＣａＣｌ２およびフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を添加した。超音波処理で細胞を破壊した。その後、再度標本を１回遠心分離（２０，０００×g、３０分、４℃）し、細胞砕片を排除し、超音波処理の上清のみを回収した。
【０１１６】
SumnerおよびHowell, 1935［２２］のジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により、抽出物の酵素活性を測定した。酵素ユニットは、所与の温度（場合により４℃〜４０℃、より正確には２０℃または３０℃）で、０．０５g/lのＣａＣｌ２および１００g/lのスクロースを含む酢酸ナトリウムバッファー（５０mM）、ｐＨ５．２中で、１分間当たり１μモルのフルクトースの形成を触媒する酵素の量として定義する。
【０１１７】
実施例３：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ変異体の精製
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの様々な酵素型を、大腸菌ＴＯＰ１０の培養中に生成した：大多数の完全型およびＣ末端における様々な分解型（図７）。これらの分解の原因は不明である。実施例２での生成量は、超音波処理の上清中で約５５００U/l培養物に達した（３０℃でアッセイした活性）。
【０１１８】
抽出物中の活性酵素型の数を測定するため、未変性条件または変性条件下で電気泳動ゲルを作成した。ゲル復元後に、１００g/lのスクロースを補足した５０mMの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．２中で一晩、２５℃でインキュベートした。次いで活性酵素型はゲル内で移行する先の領域でポリマーを合成した。活性デキストランスクラーゼに合成されたポリマーを特異的に着色する試薬（シッフ試薬）を、過ヨウ素酸ポリマーの一次アルコール機能が酸化した後に使用し、ゲルをこの試薬で染色した。このタイプのゲルはザイモグラムと称する。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎまたはその突然変異体ＳＥＶ６６３ＹＤＡの場合、２つの高モル質量型のみ活性であることが分かった（結果は示されていない）。しかし完全型のみがチオレドキシンタグも６×Ｈｉｓタグも有していた。
【０１１９】
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの完全型においてのみ存在する６×Ｈｉｓタグを利用し、ニッケル樹脂（Probond Ni-NTA, Invitrogen）での親和性クロマトグラフィーにより酵素を精製した。
【０１２０】
精製を４℃で行った。すべてのバッファーには、５０mM濃度の酢酸ナトリウム、４００mMのＮａＣｌ、異なる濃度のイミダゾールが含まれており、ｐＨは７．５に調整した。樹脂を、４０mM濃度のイミダゾールを含む８容量のバッファーで平衡化した。２０mMのイミダゾールを補足した７容量の酵素抽出物で固定を２時間行い、ｐＨを７．５に調整した。次いで、樹脂を４０容量の４０mMイミダゾールバッファーで、８容量の６０mMで、そして４容量の１００mMで洗浄した。最後に、２５０mM濃度のイミダゾールを含む７容量のバッファーでタンパク質を溶出した。
【０１２１】
溶出した融合タンパク質を含有する画分を混合し、５０mM濃度の酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および０．０５g/lのＣａＣｌ２を含有するバッファーに対して４℃で一晩透析した。スタンダードとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用し、マイクロブラッドフォード法（Biorad Laboratories）でタンパク質濃度を測定した。
【０１２２】
操作の最後に標本の純度を約９０％と推定した（図８）。精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎタンパク質は非常に強い凝集傾向を示し、白色沈殿が形成され、操作の最後に得られる収率が制限された（表１）。しかし標本の特異的活性は５８４U/mgのタンパク質と推定され、これは最良と称されている組換えデキストランスクラーゼの特異的活性に相当する。比較により、（Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆに発現された）未変性ＤＳＲ−Ｓの特異的活性は約１７０U/mgと推定した［２４］。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
実施例４：ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
構築物を配列決定し、対応する配列を図１〜５に示す。
【０１２５】
実施例５：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎによるデキストランの合成、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来ＤＳＲ−Ｓとの比較
Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓ、完全組換えＤＳＲ−Ｓ（超音波処理の上清）およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（超音波処理の上清および精製した酵素）からデキストランを合成した。
【０１２６】
合成条件および生成物の分析
実施例１に記述した変異体と同様の原理で、全遺伝子の増幅に適したプライマーを用いて完全組換えＤＳＲ−Ｓを構築した。ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓプラスミドを有する大腸菌ＴＯＰ１０細胞を、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ用のプロトコール（実施例２）を使用して培養した。上清には３つの酵素型が含まれ、このうち２つは高活性のモル質量を有していた。
【０１２７】
サイズが最も大きい型は全体的にＤＳＲ−Ｓを含み；２つの他の型はそのＮ末端位置で分解した（データなし）。
【０１２８】
各酵素標本の活性を３０℃で測定した。
【０１２９】
０．０５g/lのＣａＣｌ２を含む５０mMの酢酸ナトリウムバッファー中の１００g/lスクロース溶液と、１単位/mlの酵素とを出発物質として、デキストランを２５℃で合成した。スクロース消耗が進行していることがＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりモニターされ（以下参照）、完全に消費された後、９５℃で５分間加熱して（前述のデキストランスクラーゼの完全な変性）、反応を停止した。
【０１３０】
単糖、二糖およびオリゴ糖に関してはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルスアンペロメトリック検出法を用いた高性能陰イオン交換クロマトグラフィー）により、また多糖に関してはＨＰＳＥＣ（高性能サイズ排除クロマトグラフィー）により、生成物を分析した。
【０１３１】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ系には、Dionex「Carbopack PA100」４ｘ２５０mmカラムが装備されていた。１５０mMの水酸化ナトリウム溶液中での６〜３００mM酢酸ナトリウムの２８分間の勾配を、流速１ml/分で適用した。金電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ ｐＨ参照電極を有するDionex ED40モジュールを使用してアンペロメトリーにより検出を行った。
【０１３２】
溶媒として０．４５Mの硝酸ナトリウム＋１％（v/v）のエチレングリコールを使用して、０．３ml/分で、Shodex OH-Pack SB-805およびSB-802.5カラムの２つを連続的に使用し、ＨＰＳＥＣ系を構成した。カラムおよびプレカラムを７０℃に維持し、注入に先だって試料を０．４５μmフィルター（Sartorius）でろ過した。検出は屈折率タイプであり、光拡散検出器（Wyatt）と組み合わせてデキストラン質量を測定した。
【０１３３】
グルコース、フルクトースおよびロイクロース（スクロース異性体）の重量濃度をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析で測定した。グリコシル残基のパーセンテージを、グルコースおよびロイクロースに組み込まれたスクロースから以下の式を使用して計算した：
％Ｇグルコース＝［グルコースｔｆ］／（［スクロースｔ０］ｘ（１８０／３４２））
および
％Ｇロイクロース＝［ロイクロースｔｆ］／［スクロースｔ０］
式中、［グルコースｔｆ］および［ロイクロースｔｆ］は反応の最後のグルコースおよびロイクロースの終濃度であり、［スクロースｔ０］は開始基質の濃度（g/l）である。
【０１３４】
ＨＭＷポリマーに組み込まれたグリコシル残基のパーセンテージをＨＰＳＥＣ分析により以下の式を使用して判定した：
％Ｇデキストラン＝表面面積デキストラン−ｔｆ／（表面面積スクロース−ｔ０／（１６２／３４２））
式中、表面面積デキストラン−ｔｆは反応の最後にＨＰＳＥＣクロマトグラムを使用して測定したデキストランのピークの表面面積であり、表面面積スクロース−ｔ０は開始基質のピークの表面面積である。所与の濃度では、屈折率測定法で求められた表面は糖の別なく同一である。
【０１３５】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤまたはＨＰＳＥＣで濃度が直接に定量化できないＩＭＷポリマーまたはオリゴ糖に組み込まれたグリコシル単位の割合を以下の式を使用して判定した：
％ＧＩＭＷ＝１００−％Ｇグルコース−ｔｆ−％Ｇロイクロース−ｔｆ−％Ｇデキストラン−ｔｆ
【０１３６】
ＨＰＳＥＣにより得られた４種のデキストランの溶出プロファイルを図９に示す。異なる集団を区別することが可能である：３８分時点での第一溶出ピークは高モル質量ポリマー（ＨＭＷ）に相当し、７５分時点での第二ピークは、重合度（ＤＰ）が７未満で、系により分離されず、または非常に低い濃度であるフルクトース、グルコース、ロイクロース（５−Ｏ−α−Ｄグルコシルフルクトース）および他のオリゴ糖に相当する。これら２種の主要なピーク間では、ベースラインの摂動で示されたとおり、中間サイズの生成物（ＩＭＷデキストラン）も存在した。１０００〜１０７Da間でサイズが変化するこれらの化合物は高度に多分散しており、非常に低い濃度であり、このことはクロマトグラムでの強度が低いことを示している。しかしＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりそれらの存在を確認した（結果は示されていない）。
【０１３７】
スクロース由来であり異なる生成物に組み込まれたグルコシル単位の相対量を以下の表２に一覧にする。ＨＭＷデキストランの合成収率は、各標本でのグルコシル単位の約６０％である。水（グルコース）またはフルクトース（ロイクロース）へのグルコシル単位の移行は８％未満であり、一方、中間サイズのデキストラン（ＩＭＷ）の合成物は移行したグルコシル単位の２５％〜３２％を占めていた。ＤＳＲ−Ｓの組換え型すべては、中間サイズデキストランをより多く合成する傾向にあった。またＨＰＳＥＣの分析により、組換え酵素が１つの集団だけを合成することと対照的に未変性酵素は２つの異なるデキストラン集団を合成することが明らかになった。ＨＭＷデキストランのモル質量を光拡散により測定し、すべての試料で１０７g/モルを超えると推定した（使用したカラムの排除限界）。
【０１３８】
【表１４】
【０１３９】
形成されたデキストランの構造
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎにより（精製またはその他の方法で）生成されたデキストランの構造を、完全組換えＤＳＲ−Ｓおよび未変性ＤＳＲ−Ｓから合成したデキストランの構造と比較した。これらの構造は、８５℃で３００．１３MHzの周波数捕捉で、Brucker AC300を使用し、核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）により判定した。捕捉時間は３秒で３２〜６４周期であった。１容量の無水エタノールで３回沈殿させて共生成したフルクトースからデキストランを最初に分離し、遠心分離により回収し、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥させた。試料を６mg/mlの濃度になるまでＤ２Ｏに溶解した。
【０１４０】
ＮＭＲスペクトルを図１０に示す。α−１，６結合のみ検出した。精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成されたデキストランで炭素１３のＮＭＲ分析も行った。得られたスペクトルは、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆおよび完全ＤＳＲ−Ｓ由来デキストランに関する刊行物［３］と一致した。
【０１４１】
これらのポリマーも、ケトミウム・グラシル（Chaetomium gracile）由来エンドデキストラナーゼにより、１６時間３７℃で、合成培地１ml当たり３酵素ユニットで消化した。消化生成物をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで分析した（図１１）。得られた消化プロファイルは、分析した４種のデキストランと一致し、そのすべてが少なくとも９５％のα−１，６結合を有していることが確認された。
【０１４２】
したがってＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ変異体を構築するＤＳＲ−ＳのＮおよびＣ末端位置で欠失が生じても、ＤＳＲ−Ｓの最初の活性、またはＨＭＷデキストラン合成物に組み込まれたスクロース由来グルコシル単位の割合、多糖のサイズまたは構造にはさほど影響が及ぶことはない。
【０１４３】
形成されたデキストランのレオロジー挙動
角度が３．５９度の４cm径の円錐体を備え、速度が０．０１〜１００s-1の範囲にあるコーンプレート装置（AR 1000, TA Instruments）を使用して４種のデキストランのレオロジー挙動を分析した。測定を２５℃で行った。０〜１０Pa間で、直線ドメイン内で力学実験を行ったところ、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓに合成されたデキストラン（対照）では変形は８％であり、完全組換えＤＳＲ−Ｓに合成されたデキストランでは３％であり、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの非精製抽出物に合成されたデキストランでは５％であり、精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎにより合成されたデキストランでは０．４％であった。複素剛性モジュールを以下の関係で定義する：
Ｇ＊（ω）＝Ｇ’（ω）＋ｉＧ”（ω）。
【０１４４】
試料が主に弾性で高度に構造化されている場合、エネルギー保存モジュールＧ’（ω）はより大きい。喪失モジールＧ”（ω）は、変形している間に散逸したエネルギーを表している。主として粘性のある試料のＧ”（ω）は高い。
【０１４５】
これらのレオロジー分析により、全く独自の結果が得られた（図１２）。文献に記述されているとおり、未変性ＤＳＲ−Ｓはニュートン性挙動を有するデキストランを合成した［２５］。
【０１４６】
完全組換えＤＳＲ−Ｓ抽出物および非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ抽出物は同一の挙動を有する粘性溶液を生成した（粘度は未変性酵素により生成したデキストランのものより約１０倍高い）。裸眼で観察する場合、それらはかなり明確な繊維性挙動も示した。さらに、新たに剪断応力を付与した後、前記ポリマーの挙動は溶液タイプからゲルタイプへと変化した。ゲルタイプはこのタイプの生体高分子で同定された新規の特性である。対照として、未変性酵素により生成したデキストランは線維性ではなく、その挙動は応力の第２系列を付与した後に完全に可逆的であった（図１２Ａ）。
【０１４７】
精製酵素は、１０℃〜７０℃の濃度範囲にわたってその性質を維持しながら、高度に構造化されたゲル（図１２Ｂ、モジュールＧ’はＧ”よりかなり高い）の特性を有するポリマーを直接合成した（結果は示していない）。この挙動は未変性酵素のものとは完全に異なっている。
【０１４８】
精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの標本のみが、抽出物中に活性デキストランスクラーゼを１種だけ含有していた。未変性ＤＳＲ−Ｓはタンパク質溶解分解の問題を抱えやすいことが公知であり［２６］、開発した精製技術ではその問題を解決できない［２７、２８、２９］。試験に使用した完全組換えＤＳＲ−Ｓには、精製前のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ標本のような、少なくとも２つの活性酵素型が含まれていた。しかし、未変性ＤＳＲ−Ｓ、完全組換えＤＳＲ−ＳおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの分解型は完全に異なっている。培地中のこれらの異なる活性酵素型間の共同作用はデキストラン鎖への改変の起源となり、挙動に差異を引き起こすということが現在推測されている。
【０１４９】
実施例６：スクロースからのイソマルトースの合成
高モル質量デキストランが喪失するまでスクロースからイソマルトースだけを合成する突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌΔ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡの能力を検討した。
【０１５０】
実施例３でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎについて記述された手技を使用して親和性クロマトグラフィーにより突然変異体を精製した。
【０１５１】
活性を３０℃でアッセイした。
【０１５２】
わずか９U/mgの特異性活性により、ＳＥＶ６６３ＹＤＡ突然変異体はＤＳＲ−Ｓの活性に重大な影響を及ぼす（最初のスクロース消費割合の９８％が喪失）。しかしその特異的活性は、その潜在的な用途のために広く研究されているＮ．ポリサッカレア（N. polysaccharea）［３２］由来の組換えアミロスクラーゼのものと同等である。
【０１５３】
特徴づけを行い、この突然変異体ＤＳＲ−Ｓによりイソマルトース生成が実行可能になること、一方、野生型酵素により高モル質量デキストランのみが生成されることが明らかになった。５０mM濃度の酢酸ナトリウムｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２、１U/mlの精製酵素を含むバッファー中、単に基質としてのスクロースを１００g/l使用して、あるいは１００g/lのスクロースおよび５０g/lのグルコースを出発物質とするアクセプター反応により、２５℃で合成を行った。スクロースの消耗をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析でモニターし（分析条件は実施例４を参照）、完全に消費した後に反応を中断した。
【０１５４】
このようにして、イソマルトース生成量は、単に基質としてのスクロースを使用した場合、収率４７％に達し（表３および図１３）、これはアクセプター反応で得られたものと同等の収率であった。したがって外因性アクセプターの添加は必要ではなかった。ＤＰが７未満であり、既知の構造の他のオリゴ糖の存在とともに、イソマルトトリオース、マルトースまたはニゲロース（系では分離されない）の軌跡も確認した（図１３）。
【０１５５】
【表１５】
【０１５６】
したがって本実施例では、イソマルトース生成量は４７％の収率に到達した。現在、これはスクロースからイソマルトースを合成する単一の酵素が関与する最初の方法であり；先行の研究はすべてα−アミラーゼおよびグリコシダーゼの混合物によるデンプンの分解［１１］に、またはデキストランスクラーゼおよびデキストラナーゼの連結作用［３０］に関連している。さらに、スクロースは安価で入手範囲の広い基質であり、合成の際に放出されたフルクトースは、個別に利用可能な価値を有する共生成物を構成する。
【０１５７】
実施例７：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３によるデキストランの合成
大腸菌ＴＯＰ１０の培養中にＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の異なる酵素型が生成された。しかし、完全型は非常に多数を占めており、得られたザイモグラム（実施例３を参照）から完全型のみが活性であることが分かった。
【０１５８】
この変異体に最適な活性温度は２０℃であった。よってこの温度で活性アッセイを行った。実施例２にしたがってＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の生成量は約３２０U/l培養液となった。
【０１５９】
５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２、１００g/lのスクロースおよび１U/mlの非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３抽出物を含むバッファー中で２０℃でデキストランを合成した。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３抽出物は、実施例３のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎについて記述したプロトコールを使用して、ニッケル樹脂での親和性クロマトグラフィーにより精製できた。しかし超音波処理の上清にはデキストランスクラーゼの単一酵素型のみが含まれ、大腸菌はスクロースを消費できる別の酵素を生成しなかったことから、変異体の精製はその特性の厳密な特徴づけのための必須条件にはならなかった。比較として、（非精製）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎと同じ条件下でデキストランを合成した。スクロースの消失をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析でモニターし、完全枯渇した後、反応を停止した（５分、９５℃）。
【０１６０】
合成産物を、実施例４に記述した条件で、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＨＰＳＥＣにより分析し、定量した。ＨＰＳＥＣ分析では、サイズが２×１０６、５０３×１０３、７０，０００、１０，０００Daである市販のデキストラン、マルトヘプタオースおよびグルコース（Sigma）を使用してデキストランのサイズを推定した。
【０１６１】
図１３で分かるように、２０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３変異体は２つのポリマー集団；約３９％のスクロース由来グルコシル残基である、サイズが２×１０６DaのＨＭＷデキストランの主要集団（表４）、および１，３００〜５２，０００Daで、中間がおよそ１０，０００Daの最高ピーク値である第二集団（約２５％グルコシル残基）を合成した。ＨＰＳＥＣクロマトグラムに鮮明に見えるデキストランの第二集団を、ＤＳＲ−Ｓ変異体について観察したことはこれが初めてである。
【０１６２】
生成物のプロファイルに対する温度の影響
温度１０℃で、５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２、および１U/mlの酵素を含むバッファーをまた使用し、デキストランをまた合成した（２０℃での活性アッセイ）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりスクロース枯渇をモニターし、完全に消費された後に反応を停止した（５分、９５℃）。
【０１６３】
図１４で分かるように、１０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３変異体は、２０℃で生成されたものと全く異なるデキストラン集団を合成した。その温度で形成された主要なポリマー（約４４％）のモル質量は７，０００〜１．７×１０５Daであり、中間がおよそ４０，０００Daのピークにあった。
【０１６４】
【表１６】
【０１６５】
スクロース濃度の影響
２０℃および１０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３（１U/ml）により行ったデキストラン合成に関し、４段階に濃度を増加させた（１００、１５０、２００および２５０g/l）スクロースを試験した。スクロースの全体消費をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりモニターし、完全に消費された（４８時間未満）後に合成を停止した。
【０１６６】
２つの温度では、基質の初期の濃度上昇は低モル質量デキストランの合成を促進した。よって２０℃で、１０，０００Daデキストランの合成は、初期スクロースが１００g/lから２５０g/lへ変化するにつれて、収率は２５％から４８％へと変化した。１０℃で２５０g/lから始めると、ＨＭＷデキストラン合成は完全に停止し、中間がおよそ４０，０００Daにあるモル質量の主要集団でのデキストランの合成では、首尾よく収率が６９％に達した。
【０１６７】
１０℃および２０℃で、スクロース１００〜２５０g/lから始めてＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３により合成されたデキストランすべてでは、エンドデキストラナーゼ消化プロファイル（実施例５を参照）により、ＤＳＲ−Ｓの結合特異性は変化しないことが確認された（ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎと同様の、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤに検出されたオリゴ糖プロファイル、すなわち少なくとも９５％のα−１，６結合）。
【０１６８】
実施例８：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡによるデキストランの合成
実施例２で記述した条件下での大腸菌ＴＯＰによる発現の際、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ変異体もやや分解された。しかし、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３変異体の場合のように、ザイモグラムによると大多数の完全型のみが活性であった（結果は示されていない）。
【０１６９】
これらの変異体に最適な活性温度も２０℃であった。このようにして生成量はＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの培養物中、それぞれ３８および１８０U/Lに達した。
【０１７０】
５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２および１U/mlの酵素抽出物（非精製）を含むバッファー中で１００〜２５０g/lのスクロースを使用して２０℃および１０℃でデキストラン合成を行った。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりスクロース消費をモニターし、完全に枯渇した（４８時間未満）後に合成を停止した（５分、９５℃）。生成物をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＨＰＳＥＣで分析し、その濃度を実施例５で記述したとおりに定量した。
【０１７１】
２つの変異体により２０℃で合成した生成物のプロファイルを図１５に示す（ＨＰＳＥＣクロマトグラム）。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４ＮおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３と対照的に、これらの変異体では、形成されたデキストランの主要集団のモル質量は１０，０００Daに近く、ピークが１，３００〜５２，０００間（５，０００〜２２，０００間の半分の高さ）にある塩基を有していたことが明確に分かる。ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ変異体では、ＨＭＷデキストランの合成は完全に停止した（表５）。温度を１０℃まで低下させると、サイズを大幅に変更せずにデキストランの収率は１０，０００Daまで増加することが可能となり、これはＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の場合と同様であった（表５）。ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ変異体によるデキストラン合成はこのようにして収率７５％に達した。初期のスクロース濃度を２５０g/lにすると、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ変異体と同等の収率が得られた（結果は示されていない）。
【０１７２】
【表１７】
【０１７３】
異なる変異体により２０℃で１００g/lのスクロースから合成したデキストランのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により、特にＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡに関し、ＤＰが２〜約６０であるイソマルト−オリゴ糖を含む生成物の多分散性が非常に高いことが分かった（図１６）。
【０１７４】
１０℃および２０℃で、スクロース１００〜２５０g/lを使用しＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡにより合成されたデキストランすべてについて、実施したエンドデキストラナーゼ消化プロファイル（実施例５を参照）により、ＤＳＲ−Ｓの結合特異性は変化しないことが確認された（ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎと比較して同等の、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤに検出されたオリゴ糖プロファイル、よってα−１，６結合は少なくとも９５％）。
【０１７５】
実施例９：グルコースとのアクセプター反応
５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２を含むバッファー中、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの抽出物１U/mlでアクセプター反応を、２０℃、スクロース／グルコース比２（スクロース１００g/l、グルコース５０g/l）で行った。スクロースの全消費をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤでモニターし、完全に枯渇した後に反応を停止した。変異体すべてはＤＰが２〜約３０のイソマルト−オリゴ糖（ＩＭＯ）を合成し、高ＤＰのポリマーの合成は喪失した。
【０１７６】
しかし、得られた収率はＡ単位のトランケートされた変異体ではより高かった。したがって、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの場合の４７％と対照的に、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の場合ではＩＭＯ生成量は５２％に、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡでは５８％に達した。オリゴ糖分布も改変した（図１７）。
【０１７７】
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３では、ＤＰが２〜１５であるＩＭＯの割合はＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成された生成物の割合より低かった。ＤＰが１５を超えるＩＭＯでは状態は後退した。
【０１７８】
同様に、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ突然変異体は、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎまたは未変性ＤＳＲ−Ｓ（基本的に２〜１５のＤＰ）より、高ＤＰでＩＭＯ合成に対して良好に作用することが分かった：ＤＰが１２〜２７のＩＭＯの生成量は（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで得られた表面積の割合によると）これらの２種の変異体により２〜５倍高まった。
【０１７９】
【表１８】
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図１は、配列の５’末端位置にチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎデキストランスクラーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、かつタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図２】図２は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図３】図３は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図４】図４は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図５】図５は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有する突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図６】図６は、ＤＳＲ−Ｓのトランケートした変異体およびその相対的活性を表した図表である。ＤＳＲ−Ｓの４つの異なるドメイン（ｉ）〜（ｉｖ）は以下に対応する：（ｉ）シグナルペプチド、（ｉｉ）可変領域；（ｉｉｉ）触媒ドメインおよび（ｉｖ）Ｃ末端ドメインならびにMonchoisら、1998［１６］にしたがって位置する反復単位Ａ，ＣおよびＮ（網掛けの四角部分）。
【図７Ａ】図７は、大腸菌ＴＯＰ１０により生成したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに関して２３℃で行われた抗チオレドキシン（Ａ）および抗６×Ｈｉｓ（Ｂ）のウエスタンブロットを示す図である。
【図７Ｂ】図７は、大腸菌ＴＯＰ１０により生成したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに関して２３℃で行われた抗チオレドキシン（Ａ）および抗６×Ｈｉｓ（Ｂ）のウエスタンブロットを示す図である。
【図８】図８は、ニッケル樹脂（Probond, Invitrogen）での親和性精製中のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ抽出物に関してコロイダルブルーでタンパク質を染色した後の電気泳動ゲルを示す図である。トラック１は、培養の終りに大腸菌ＴＯＰ１０を超音波処理して得た上清である；トラック２は、樹脂上にタグ化６×Ｈｉｓタンパク質を結合させた後に得た溶出物であり、トラック３は溶出画分であり、そしてトラック４は凝集物を排除した後の溶出画分である。
【図９】図９は、ａ）Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓ、ｂ）完全組換えＤＳＲ−Ｓ、ｃ）精製前のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、およびｄ）精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎを調製することで生成したデキストランのＨＰＳＥＣにより得た溶出プロファイルを示す図である。ピーク１は高モル質量ポリマー（ＨＭＷ）であり、ピーク２はＤＰが７未満の、系により分離していないフルクトース、グルコースおよびオリゴ糖である。これら２つのピーク間では、ベースラインの摂動は濃度が非常に低い中間サイズ（１０３〜１０７Da）のデキストランの存在を反映している。
【図１０】図１０は、Ａ）Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓ、Ｂ）完全組換えＤＳＲ−Ｓ、Ｃ）精製前のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、およびＤ）精製後のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎにより合成したデキストランに関するプロトンＮＭＲで得たスペクトルを示す図である。スペクトルＥ）は精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成されたデキストランの炭素１３スペクトルである。
【図１１】図１１は、未変性ＤＳＲ−Ｓ、完全組換えＤＳＲ−Ｓおよび精製前後のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成された４種のデキストランのエンドデキストラナーゼ（ダーゼ）を使用している消化産物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムを示す図である。
【図１２Ａ】図１２は、剪断前（１）および後（２）の未変性ＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（３）および後（４）の完全組換えＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（６）および（７）のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（５）に合成された４種のデキストランのレオロジー挙動を示す図である。ここで、Ａ）は粘性流動の測定値であり、Ｂ）は非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（○および●；溶液型挙動、Ｇ’＜Ｇ”；５％変形）および精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（□および■；ゲル型挙動、Ｇ’＞Ｇ”；０．４％変形）により合成されたデキストランについて保存Ｇ’率およびエネルギー散逸Ｇ”率を測定する前の、力学的モード粘度測定値（０〜１０Paの振動）である。
【図１２Ｂ】図１２は、剪断前（１）および後（２）の未変性ＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（３）および後（４）の完全組換えＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（６）および（７）のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（５）に合成された４種のデキストランのレオロジー挙動を示す図である。ここで、Ａ）は粘性流動の測定値であり、Ｂ）は非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（○および●；溶液型挙動、Ｇ’＜Ｇ”；５％変形）および精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（□および■；ゲル型挙動、Ｇ’＞Ｇ”；０．４％変形）により合成されたデキストランについて保存Ｇ’率およびエネルギー散逸Ｇ”率を測定する前の、力学的モード粘度測定値（０〜１０Paの振動）である。
【図１３】図１３は、スクロース単独を１００g/l含有する突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌΔ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡ（Ａ）により、あるいはスクロース１００g/lおよびグルコース５０g/lによるアクセプター反応（Ｂ）により合成される生成物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムを示す図である。記号Ｇはグルコースを意味し、Ｆはフルクトース、Ｉ２はイソマルトース、Ｉ３はイソマルトトリオース、Ｎ／Ｍはニゲロースまたはマルトース（ＨＰＡＥＣパッド装置によって分離されていない）を意味し、記号「？」は構造が未知である生成物を表している。
【図１４】図１４は、２０℃および１０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３により合成したデキストランのＨＰＳＥＣクロマトグラムを示す図である。矢印は、対照の役割である２×１０６Da、７０，０００および１０，０００Daの市販のデキストランの保持時間である。
【図１５】図１５は、１００g/lのスクロースおよび１U/mlの（１）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、（２）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、（３）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅおよび（４）ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡにより２０℃で合成したデキストランのＨＰＳＥＣクロマトグラム、ならびに１０，０００Daの市販デキストラン（Sigma）の溶出プロファイル（５）を示す図である。
【図１６】図１６は、１００g/lのスクロースおよび１U/mlのＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎで（１）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３で（２）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅで（３）、およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ ΔＡで（４）、２０℃で合成したデキストランのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す図である。
【図１７Ａ】図１７は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイル（Ａ）、ならびに変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（１）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３（２）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ（３）およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ ΔＡ（４）と２０℃でアクセプター反応させることで生成されたＩＭＯの分布（Ｂ）を示す図である。Ｇ：グルコース；Ｆ：フルクトース；Ｌ：ロイクロース；Ｔ：トレハルロース；Ｉ２〜Ｉ２０：ＤＰ２〜ＤＰ２０のイソマルト−オリゴ糖。図Ｂの挿入図は、ＩＭＯのＤＰが１５〜２７に拡張したことを示す。
【図１７Ｂ】図１７は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイル（Ａ）、ならびに変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（１）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３（２）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ（３）およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ ΔＡ（４）と２０℃でアクセプター反応させることで生成されたＩＭＯの分布（Ｂ）を示す図である。Ｇ：グルコース；Ｆ：フルクトース；Ｌ：ロイクロース；Ｔ：トレハルロース；Ｉ２〜Ｉ２０：ＤＰ２〜ＤＰ２０のイソマルト−オリゴ糖。図Ｂの挿入図は、ＩＭＯのＤＰが１５〜２７に拡張したことを示す。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を保持しながら、および／またはα−１，６結合の合成に対する特異性を保存しながらトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを生成するための組換えプロセスに関する。より正確には、本発明は、トランケートまたは突然変異したデキストランスクラーゼの核酸配列、該核酸配列を含むベクターおよびトランケートまたは突然変異したデキストランスクラーゼをコードする配列によって形質転換された宿主細胞に関する。さらなる態様では、本発明は、最終生成物で酵素活性を保持する、および／またはα−１，６結合の合成に対する特異性を保持するトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを組換え方式で生成する方法、ならびにモル質量が制御された単一工程でのデキストランまたはイソマルト−オリゴ糖および特に未変性酵素で得られたデキストランの特性と比較してレオロジー特性が改変されたデキストランを生成する方法に関する。
【０００２】
発明の分野
デキストランは、主要鎖ならびにα−１，２、α−１，３および／またはα−１，４分岐において５０％以上がα−１，６結合を有する隣接グリコシル単位を含む多様な構造のα−Ｄ−グルカンである［１］。このようなデキストランをスクロースから生成する酵素はデキストランスクラーゼと称し、グリコシド加水分解酵素ファミリー７０に属する［２］。反応中、スクロース由来フルクトースが放出し、他の場所でアップグレードする可能性がある。デキストランスクラーゼはロイコノストック（Leuconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属およびラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸菌により生成される［１］。
【０００３】
ロイコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来のデキストランスクラーゼ（ＤＳＲ−Ｓ）は、１，５２７個のアミノ酸を含む［３］。この酵素は、９５％を超えるα−１，６結合によりグルコースホモポリマーの合成を触媒する。デキストランの生成は、好適なアクセプターを反応混合物に添加することにより、オリゴ糖またはグリコシル化抱合体の生成に再度方向づけられるかもしれない［４］。
【０００４】
デキストランおよびデキストラン誘導体に対する工業的応用は、特に特定のサイズを有するデキストランでは増加の一途にある。７０，０００〜１００，０００Daの範囲のサイズを有するデキストランは、例えば、血漿代用薬として使用される［５、３１］。さらに、４０，０００Daのデキストランを使用し、血液粘度を低下させ、赤血球凝集を阻害することでほぼ確実に血流を改善することができる［６、８］。硫酸化後、約１０，０００ダルトンのより小さいデキストランは、例えば鉄のトランスポーター［７］または抗凝固薬［８］として使用する。これらの化合物は抗ウイルス特性を有する可能性がある［９、１０］。
【０００５】
さらに、架橋したデキストラン誘導体は分子分離の分野で長い間使用されており；商標名Sephadex（登録商標）としてクロマトグラフィー担体は１９６１年から販売されている［６］。
【０００６】
さらに、欧州連合は近年、デキストランが９５％を超えるα−１，６結合を含み、２×１０６Daを超えるモル質量を有する場合、ベーカリー製品の食品成分としての使用を承認している［１５］。
【０００７】
デキストランスクラーゼはアクセプター反応を介してイソマルト−オリゴ糖（ＩＭＯ）を生成してもよい。グルカンスクラーゼにより行われるアクセプター反応は、スクロース由来のグリコシル残基を、反応培地に添加した他の分子へと移行させることからなる。特に、イソマルト−オリゴ糖の需要が年間約１５，０００トンである日本で商業的関心が高まっている［１１］。このような小さいＩＭＯ（ＤＰ２〜６）はベーカリー製品、飲料では日本酒、調味料、製菓に、また抗齲蝕原性甘味料として使用する。該ＩＭＯは腸内および／または膣内細菌叢に関して有用なプレバイオティクス特性を有することも示されている［１２、１３］。これらの特性はＩＭＯのサイズにより可変であるらしく、高い重合度が有利に働く［１４］。
【０００８】
デキストランの唯一の商業的供給源および通常の源はＬ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆをスクロースとともに培養することからなり、約１０８Daの高モル質量ポリマーが形成される。１０，０００〜１００，０００Daのより小さいデキストランの直接的合成は現在では不可能である。現在、デキストランは、高モル質量未変性ポリマーを酸加水分解し、その後有機溶媒を使用して分画することにより、慣用的に生成する。しかしこの第２工程は収率が低いことで名高い［１９］。
【０００９】
商業的観点から、ＤＰが２〜６であるＩＭＯは、デキストランスクラーゼＤＳＲ−Ｓおよびグルコースとのアクセプター反応によっては、その低い反応収率のために生成されないが、デンプン加水分解物およびα−アミラーゼとグルコシダーゼとの混合物からは生成される［１１］。
【００１０】
Monchoisら［１６］は、ロイコノストック・メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆのデキストランスクラーゼからのカルボキシ末端の欠失を記述しており、Ｃ末端ドメインの役割は活性部位をこえてデキストランおよびオリゴ糖の移行を促進することであると結論づけている。
【００１１】
米国特許ＵＳ−Ａ−５，２２９，２７７は、均一にモル質量が低いデキストランポリマーを生成するプロセスを記述しており、このプロセスはロイコノストック・メゼンテロイデスと、デキストランのα−１，６結合の加水分解のための特定の酵素デキストラナーゼの活性を有する酵母であるリポマイセス・スターケイ（Lypomyces starkeyi）ＡＴＣＣ７４０５４の突然変異微生物とを使用している。該方法は特定の培養条件、ならびにデキストラナーゼ活性がデキストランのモル質量を減少させるように正確に調節された持続時間および温度を必要とする。該方法で生成されたデキストランポリマーのモル質量は４０，０００〜１５０，０００Daの範囲にある。
【００１２】
前記で、酸加水分解も分画も特に必要としない収率が良好である迅速な方法を使用してモル質量が約１０，０００〜１００，０００Daであるデキストランの生成が必要であることが示されている。
【００１３】
本発明は、酵素活性を保持しつつ、および／またはα−１，６結合の合成に対する特異性を保存しつつもトランケートおよび／または突然変異した、組換え方式で生成したデキストランスクラーゼ、あるいはモル質量を制御したデキストランを生成するデキストランスクラーゼのトランケート変異体に関する。より正確には、それらは未変性ＤＳＲ−Ｓの結合特異性を保存し、および／またはα−１，６結合を合成する特異性を保存し、スクロースを出発物質として、興味深いテクスチャー特性を有する高モル質量デキストランおよび／またはモル質量を制御したデキストランとＩＭＯを生成する。
【００１４】
本発明はまた、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼの核酸配列、ベクターおよび前記ベクターによって形質転換された宿主細胞、ならびにトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼのアミノ酸配列を提供することにも関する。
【００１５】
特に、実施例から明らかになるように、ある種のデキストランスクラーゼは興味深いテクスチャー特性、すなわち未変性酵素により生成したポリマーの特性よりも実質的に優れている特性を有するポリマーを生成し；他の種はモル質量が制御されたデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖を生成する。イソマルトースは少なくとも１つのトランケートおよび突然変異したデキストランスクラーゼにより生成される。
【００１６】
本発明のさらなる態様は以下の記述および実施例または好ましい実施から明らかになる。
【００１７】
発明の要旨
第一の態様では、本発明は、図１に記載のヌクレオチド配列（配列番号１）、図２に記載のヌクレオチド配列（配列番号２）、図３に記載のヌクレオチド配列（配列番号３）、図４に記載のヌクレオチド配列（配列番号４）、図５に記載のヌクレオチド配列（配列番号５）、配列番号１、２、３、４もしくは５を有する配列の１つとの相補的配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、２、３、４もしくは５を含む配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性を保持している配列から本質的になる、またはそれからなるヌクレオチド配列に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント（配列番号１７）、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント（配列番号１８）、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント（配列番号１９）、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント（配列番号２０）および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント（配列番号２１）から選択されたヌクレオチド配列から本質的になる、あるいはそれからなるデキストランスクラーゼのヌクレオチド配列に関する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号２の位置３７３〜位置４００５のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号３の位置３７３〜位置３４０８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号４の位置３７３〜位置３０１８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、および配列番号５の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、あるいはそれからなるヌクレオチド配列に関する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の位置３７３〜位置３４０８にある配列のフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメントから選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ただしその配列はデキストランスクラーゼ酵素活性を保持し、それとハイブリダイズする該ヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドを有し、フラグメントの全長にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列に関する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、配列番号６〜１０もしくは２２〜２６のいずれか１つの連続的アミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００２２】
一層さらなる態様では、本発明は、ベクター、例えばプラスミド、ならびに前記ベクターによって形質転換され、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼ、特に実施例の変異体由来の核酸の該配列を含む宿主細胞に関する。
【００２３】
本発明の一層さらなる態様では、本発明は、配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択される前記トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に関する。
【００２４】
さらに本発明は、特に、配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択される本明細書に記載の配列の１つから本質的になる、あるいはそれからなるトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼに関する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、デキストランスクラーゼを発現させる条件下でトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを含む宿主細胞を培養し、培地から該デキストランスクラーゼを単離することによる突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼの調製に関する。
【００２６】
本発明はまた、本発明の突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼとスクロース、場合によりアクセプターとを反応させて、モル質量が制御されたデキストランおよび／またはイソマルト−オリゴ糖（ＩＭＯ）を生成し、イソマルトースを含む、モル質量が制御された該デキストランまたはＩＭＯを得る方法に関する。
【００２７】
本質的にスクロース由来のＩＭＯを直接的に生成する方法はまた、本発明の態様を構成する。本明細書で使用する用語「本質的に」は、アクセプターが必ずしも反応に使用される必要がないことを意味している。
【００２８】
本発明の高モル質量デキストランは、未変性酵素、特に非ニュートン性、繊維性の特性および／またはゲル化特性により合成されたデキストランの特性と比較してレオロジー特性が改変されている。
【００２９】
最終的に、本発明は前記デキストランスクラーゼを使用して得られるデキストラン含有組成物、ならびに３４２〜１０９Daの範囲でモル質量を制御したデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖を生成するための該デキストランスクラーゼの使用に関する。より正確には、本発明は（ｉ）イソマルトース（３４２Da）、（ｉｉ）３４２〜５，０００Daのイソマルト−オリゴ糖、（ｉｉｉ）１，３００〜５２，０００Da、より正確には５，０００〜２２，０００Da、中間がおよそ１０，０００Daであるようにサイズが制御されたデキストラン、（ｉｖ）７，０００〜１．７×１０５Da、より正確には２２，０００〜７０，０００Da、中間がおよそ４０，０００Daであるようにサイズが制御されたデキストランを生成する。
【００３０】
好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書で使用した用語「デキストランスクラーゼ酵素活性を有する酵素」は、α−１，６結合で結合し、３４２〜１０９Daの範囲のサイズであるグリコシル単位を、５０％を越えて含むオリゴシドおよびポリオシドへと、より詳しくは、α−１，６結合が９５％を超えるデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖へとスクロースを変換することを触媒する酵素を意味する。この変換はマルトース、グルコース、イソマルトースまたはフルクトースまたはイソマルト−オリゴ糖などの外部アクセプターの存在下または非存在で行ってもよい。マルトース、イソマルトースおよびグルコースは本発明の好ましいアクセプターである。本発明のデキストランスクラーゼの酵素活性は実施例で記述したとおりに測定してよい。
【００３１】
本明細書に使用する用語「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は同義であり、単鎖または二重鎖の形態の２種以上のヌクレオチドを有するＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列を含むがこれらに限定されない。本発明のポリヌクレオチド配列は、限定されないが任意の組換え合成法および任意のエクスビボ産生法、かつそれらの方法の組み合わせなどの任意の公知の方法で調製してよい。
【００３２】
本明細書で使用する用語「トランケートされた」はアミノ酸配列または核酸配列のＮまたはＣ末端の少なくとも１つを短くしたことを意味する。短縮は制限酵素、タンパク質分解酵素を使用して、またはヌクレオチド配列の特異的増幅、特にＰＣＲなど合成的に行ってよい。
【００３３】
本明細書で使用する用語「精製デキストランスクラーゼ」は、その調製においてデキストランスクラーゼ活性形態を１つしか持たず、タンパク質純度は少なくとも７０％または８５％または９５％であるデキストランスクラーゼを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する用語「興味深い独自のテクスチャー特性」は、同じ条件下で未変性酵素により合成したデキストランと比較して、例えば非ニュートン性挙動、特にゲルまたは繊維型挙動を示す本発明のデキストランのレオロジー特性を意味する。「ゲル型ポリマー」は本明細書では、エネルギー保持（Ｇ’）およびエネルギー散逸（Ｇ”）率を検出する力学的モードのレオロジー測定で特徴づけする。ゲルでは、研究した周波数全域にわたってＧ’はＧ”より高く、このことは実施例５で明らかになる。繊維性特性は裸眼で同定可能である。実施例５でもわかるように、剪断応力の第２系列を付与した後に、本発明の繊維性デキストランは溶液型挙動からゲル型挙動へと変化する。
【００３５】
本明細書で使用する以下の略称は以下の意味を有する：ＤＳＲ−ＳはＬ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来のデキストランスクラーゼ；ＤＰは重合度；ＨＭＷは「高モル質量」、ＩＭＷは「中間モル質量」、ＩＭＷポリマーは、濃度が低いことからＨＰＳＥＣによる分離が困難である、サイズが１，０００〜１０７Daの範囲の高度多分散ポリマーである。ＬＭＷポリマー（低モル質量）は、本発明にしたがって、７５０〜７０，０００Daで中間がおよそ１０，０００Da、または２，０００〜１．７×１０５Daで中間がおよそ４０，０００Daの範囲で、はるかに高度かつ容易に検出される集団である。
【００３６】
本明細書で使用する用語「１０，０００Daデキストラン」は、サイズが１，３００〜５２，０００Daの範囲にあり、より正確には５，０００〜２２，０００Daであり、中間が約１０，０００Daのピーク最高値であるデキストランの集団を意味する。特徴づけの際、ゲル透過で得られた溶出ピークの塩基は１，３００〜５２,０００Daの範囲であり、溶出ピークの半分の高さで推定したモル質量の範囲は５，０００〜２２,０００Daの範囲であり、ピークは中間にあり、そのピーク高はおよその質量で１０,０００Daであった。モル質量がピークの半分の高さで表された場合、デキストラン集団のうち少なくとも５０％が指示範囲内に収まっていた。
【００３７】
本明細書で使用する用語「４０，０００Daデキストラン」は、サイズが７，０００〜１．７×１０５Daの範囲にあり、より正確には２２，０００〜７０，０００Daであり、中間が約４０，０００Daのピーク最高値であるデキストランの集団を意味する。特徴づけの際、ゲル透過で得られた溶出ピークの塩基は７，０００〜１．７×１０５Daの範囲であり、溶出ピークの半分の高さで推定したモル質量の範囲は２２，０００〜７０,０００Daの範囲であり、ピークは中間にあり、約４０,０００Daの質量であった。モル質量がピークの半分の高さで表された場合、デキストラン集団のうち少なくとも５０％が指示範囲内に収まっていた。
【００３８】
ＩＭＯはイソマルト−オリゴ糖を意味する。
【００３９】
本明細書で使用し、核酸またはアミノ酸に関連して使用する場合の用語「本質的に〜からなる」は、他の主要でない成分または分子がアミノ酸配列または核酸配列とともに存在する可能性があることを意味する。核酸配列は配列識別番号で示されたものと全く同じ長さであるが、ＮおよびＣ末端で３〜１２個分のヌクレオチドが過剰にある場合がある。同様に、アミノ酸配列は配列識別番号で示されたものと全く同じ長さであるが、ＮまたはＣ末端で１〜４個分のアミノ酸が過剰に付加されている場合がある。これらの過剰なアミノ酸は酵素活性に全く影響を及ぼさない。
【００４０】
より具体的には、本発明はトランケートしたデキストランスクラーゼもしくは突然変異したデキストランスクラーゼをコードする核酸、その配列のすべてもしくは一部と相補的な配列、またはデキストランスクラーゼ酵素活性が保持されるのであれば上記の配列の１つと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列に関する。当然のことながら、それにハイブリダイズするヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドを有し、フラグメントの全長にわたってハイブリダイズする。
【００４１】
本明細書で使用する用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning Manual, 3rd edition (2001)に記述する条件を意味し、すなわち、以下の条件を一例として挙げる：ハイブリダイゼーションバッファー：２×ＳＳＣ、１０×デンハルト溶液（Ficoll 400&PEG&BSA、割合１：１：１）、０．１％のＳＤＳ、５mMのＥＤＴＡ、５０mMのＮａ２ＨＰＯ４、２５０μg/mlのニシン精子ＤＮＡ、５０μg/mlのｔ−ＲＮＡまたは０．２５MのｐＨ７．２のリン酸ナトリウムバッファー、１mMのＥＤＴＡ、７％のＳＤＳ；
ハイブリダイゼーション温度：６０℃；
洗浄バッファー：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；
洗浄温度：６０℃。
【００４２】
ストリンジェントな条件下で本発明の核酸とハイブリダイズする核酸分子は、原則として細菌、グラム陽性細菌、および本発明の１つの態様ではロイコノストック属、ストレプトコッカス属またはラクトバチルス属などの任意の微生物由来のデキストランスクラーゼをコードする可能性がある。
【００４３】
本発明は、配列番号１〜配列番号５および配列番号１７〜２１の配列と少なくとも７０％または８０％または９０％の配列同一性を有するデキストランスクラーゼタンパク質をコードする核酸であって、但し、該配列によってコードされるタンパク質がデキストランスクラーゼ酵素活性を有する核酸に関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、配列番号６〜１０または２２〜２６のいずれか１つの連続的なアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００４５】
本発明のさらなる態様では、本発明の配列に相補的な配列、またはストリンジェントな条件下で該配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性が維持されている配列、も本発明に包含される。
【００４６】
基本的なヌクレオチド配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５）からの誘導であり、ここでは該配列は、配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるヌクレオチドのフラグメントから選択され、該配列に相補的な配列、またはストリンジェントな条件下で該配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性が維持されている配列は、欠失、置換、挿入または組換えにより、例えば；当技術分野で周知であり、例えば前記Sambrookらが記述している前記工程および形質転換により生成してよい。
【００４７】
本明細書において当然のことながら、上述の配列のいずれかに任意に欠失、置換、挿入または組換えが起こっても、配列によってコードされたタンパク質はそのデキストランスクラーゼ酵素活性を維持しなければならない。したがって１〜１３２、好ましくは２〜６０個のヌクレオチド、より好ましくは１５〜３６個のヌクレオチド、さらにより好ましくは１２〜２７個のヌクレオチドを、例えば欠失、置換、挿入または組換えによって修飾してもよい。本発明によると、ヌクレオチドの９０％、好ましくは９５％が変化しないままで存在する。
【００４８】
デキストランスクラーゼ酵素活性は本出願の方法の項および実施例に記述したとおり、測定することが可能である。
【００４９】
プローブまたはプライマーとして使用してよいオリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１〜配列番号５であり、あるいは配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるヌクレオチドのフラグメント、から選択されたヌクレオチド配列である。
【００５０】
プローブおよびプライマーの長さはその用途により可変である。一般に、それらは少なくとも２５個のヌクレオチドを必ず有しており、記述したデキストランスクラーゼ配列のすべて、３，８６９個のヌクレオチドなどを含んでいる場合がある。長さは例えば２５〜１５０個のヌクレオチド、２５〜８００個のヌクレオチドまたは２５〜３０００個のヌクレオチドの範囲でも可変である。
【００５１】
プライマーの長さは概して１８〜２５個のヌクレオチドであるが、想定した用途によってはさらに長くなる可能性もある。本発明に使用可能なプライマーの例としては以下が挙げられる：
【表１】
【００５２】
ヌクレオチドの５’および３’末端位置にあるプライマーはデキストランスクラーゼ（配列番号１１〜１５）および突然変異配列の５’および３’部位（配列番号１６）をコードすることは留意されたい。しかし当業者はこれらの配列をそれぞれ使用し、連続的なヌクレオチドを用いてプライマーまたはプローブを生成することができる。さらに、プローブとして使用されるこれらのヌクレオチド配列は、特に放射活性、酵素標識、蛍光標識によりタグ化してよい。
【００５３】
原核または真核細胞を遺伝子操作するために、本出願の核酸または本出願の核酸の一部をヌクレオチド配列の組換えにより配列の突然変異または修飾を可能にするプラスミドに導入してよい。これらの技術を使用する標準法は当業者に公知であり、特に、上述のSambrookらに報告されている。またＤＮＡフラグメントは互いにアダプターまたは連結部位により結合可能で、好適な制限酵素を使用して特定のＤＮＡ配列を除去することが可能である。突然変異誘発、プライマー復元後の制限法または結紮法などの方法を使用し、適切な挿入、欠失、または必要なもしくは所望の置換により目的の配列を得ることが可能である。
【００５４】
さらに、核酸をコードする明確なタグを本発明の核酸配列のＮまたはＣ末端に付着させてよい。それらはポリＨｉｓ、ｃ−ｍｙｃエピトープもしくはＨＡタグなどのペプチド、または細菌性ＧＳＴ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質等の小さいタンパク質であってよい。
【００５５】
他のタンパク質タグをコードする特定の核酸はＨｉｓ−タグ、Ｔ７タグ、Ｓ−タグ、「フラッグ」ペプチド、ｔｒｐＥ、アビジン／ストレプトアビジン、ブドウ球菌ＡまたはＧタンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、セルロース結合ドメイン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン等であり、本発明で使用してもよい。
【００５６】
本発明の一態様にしたがって、チオレドキシンをコードする核酸をＮ末端核酸配列に融合させる。６×Ｈｉｓタグをコードする核酸を核酸配列の３’末端に融合させる。
【００５７】
本発明の核酸は、（１）プロモーターや増幅因子などの遺伝子発現調節子、（２）ｍＲＮＡに転写され、対応するタンパク質に翻訳されるコード配列または構造配列、および（３）適切な開始および終止シグナル、を含む転写単位に連結してよい。
【００５８】
多数の好適な発現制御配列が当技術分野で公知である。組換えタンパク質を発現する一般法も公知であり、R Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)の文書が例として挙げられる［１７］。
【００５９】
本発明のベクターに使用可能なプロモーター領域には、ｌａｃＬ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ｔｒｅおよびａｒａが挙げられる。
【００６０】
本発明はまた、ベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、ならびに遺伝子工学分野で公知であり、本発明の一態様では本出願の核酸配列を含み、プラスミドであり、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ、ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡから選択された、他のベクターに関する。
【００６１】
本発明の核酸は原核または真核細胞で発現させてよい。引用される可能性のある該細胞の非限定的例として、ＶＥＲＯ細胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ３などのＨＥＬＡ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１などのＣＨＯ細胞系、ＣＯＳ−７などのＣＯＳ細胞およびＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲ細胞：１６５０、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ６３６１、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、２９３細胞などの３Ｔ３、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ １７１１などのＳｆ９細胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ７０などのＣｖ１細胞ならびにＡＴＣＣ Ｔｉｂ１５２などのＪＲＫＡＴ細胞が挙げられる。
【００６２】
本出願で使用可能な非限定的細胞には、大腸菌（Eschierichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）またはシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属およびブドウ球菌（Staphylococcus）属の株などの原核宿主細胞の株、もしくは寄生生物アピコンプレクサ（Apicomplexan）（マラリア原虫（Plasmodia）、トキソプラズマ（Toxoplasma）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidia））、リーシュマニア（Leishmania）またはトリパノソーマ（Trypanosoma）などの真核宿主細胞の株が挙げられる。
【００６３】
他の適切な細胞を本発明に使用してもよく、特にサッカロマイセス（Saccharomyces）、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母細胞および真核細胞（植物細胞、ＣＨＯ細胞等）が挙げられる。
【００６４】
さらなる態様では、本発明の核酸を発現するのに使用する細胞は大腸菌および、例えばＪＭ１０９、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＴＯＰ１０またはＰｉｒ１から選択される株である。サッカロマイセス・セレビシエのＩＮＶｓｃ株を使用してもよい。
【００６５】
本発明は、上述の核酸配列または上述のベクターで形質転換した宿主細胞、および形質転換細胞由来であり本明細書に記載のベクターまたは核酸配列を含む細胞に関する。
【００６６】
引用してもよいこのような宿主細胞の例として、トランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼが生成される可能性がある大腸菌が挙げられる。このような宿主細胞の調製は当技術分野で公知である。
【００６７】
本発明の核酸分子によってコードされる、タンパク質および該タンパク質と突然変異タンパク質の生物活性的フラグメント、ならびにこれらの調製法も本発明の範囲内にある。
【００６８】
よって本発明は突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼの調製法であって、以下の工程：
（ａ）上述の核酸配列または上述のベクターにより、デキストランスクラーゼの発現を可能にする条件下で形質転換した宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）培地から該デキストランスクラーゼを単離する工程
を含む方法に関する。
【００６９】
より具体的には、核酸配列は、配列番号１の位置３７３〜位置４２６９、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の前駆体３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、該配列の相補的配列、およびストリンジェントな条件下で該配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性が保持されている配列、から選択してよい。
【００７０】
単離後に本発明のデキストランスクラーゼを精製してもよい。この点において、通常の精製法を使用してよく、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性交換型クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相ＨＰＬＣ、相偏析等が挙げられる。本発明の一態様では、本発明の突然変異またはトランケートしたデキストランスクラーゼは、チオレドキシンおよび６×Ｈｉｓタグの存在を考慮して、ニッケルを充填した樹脂を使用して精製してよい。
【００７１】
本発明の別の態様は、配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント、から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、あるいはそれからなるデキストランスクラーゼタンパク質に関する。
【００７２】
上記で説明した配列番号１〜配列番号５のヌクレオチド配列または該配列のフラグメントの１つによってコードされたタンパク質は、本発明の別の実施態様である。
【００７３】
相同アミノ酸配列、すなわち上記で定義した配列との類似度が酵素活性を維持するに十分である配列もまた、本願の対象に含まれる。よって、BlastおよびFastaプログラムを使用して類似性を調査してもよい。酵素活性を維持しながらデキストランスクラーゼのＮおよびＣ末端をトランケートできることが本明細書で明らかになったことから、単一完全配列のみならずトランケート配列に対しても配列類似性を考えることはできない。よって本発明は、完全配列と８０％、９０％または９８％の配列類似性がある任意の配列、ならびにトランケート配列の１つと８０％、９０％または９８％の配列類似性がある配列であって、ただし酵素活性が維持されている配列に関する。
【００７４】
より具体的には、本発明は、配列番号６〜１０と、９０％、９５％または９８％オーダーの類似度を有する配列、または配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸のフラグメントから選択されるアミノ酸配列に関しており、但しこれらのタンパク質は該デキストランスクラーゼの酵素活性を有している。明らかに、上記で定義した特異的同一性を有するアミノ酸配列は大多数が保存的にアミノ酸置換されている。
【００７５】
保存的アミノ酸置換は同じ種類のアミノ酸置換を含む。これらの種類は例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒなどの非荷電極性側鎖を有するアミノ酸；Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇなどの塩基性側鎖を含むアミノ酸；ＧｌｕまたはＡｓｐなどの酸性側鎖を含むアミノ酸、およびＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＣｙｓまたはＴｒｐなどの非極性側鎖を含むアミノ酸を含む。
【００７６】
さらに、アミノ酸が置換されたデキストランスクラーゼの酵素活性に関し、これは実施例に示したとおりに試験することが可能であるが、活性もＨＰＬＣ分析により、あるいはアミノ酸変化がタンパク質機能に影響を与える方式について通常通りに予測して、評価することが可能である。
【００７７】
さらなる態様では、アミノ酸配列を本明細書に示していることから、タンパク質はR B Merrifieldの方法、1963［２０］を使用して合成してよい。この理由で、合成したデキストランスクラーゼタンパク質は本発明の別の態様を構成する。
【００７８】
本発明はまた、位置６６３、６６４および６６５にあるセリン、グルタミン酸およびバリンがそれぞれチロシン、アスパラギン酸およびアラニンへと改変されたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの突然変異体ＳＥＶ６６３ＹＤＡという突然変異デキストランスクラーゼに関する。
【００７９】
グルコースなどのアクセプターを反応培地に添加した場合に得られるものと同等の収率で、基質としてのみスクロースを使用して、スクロースからイソマルトースを合成するためにこの突然変異体を使用してよい。
【００８０】
この理由で、本発明はスクロースから直接イソマルトースを生成する方法で、配列番号１０を有する突然変異体デキストランスクラーゼとスクロースとを反応させ、イソマルトースを生成する工程を含む該方法に関する。
【００８１】
前述したタンパク質タグを含む融合タンパク質はまた本発明の一部を形成する。この点では、本発明の突然変異および／またはトランケートしたタンパク質は少なくとも１つのタンパク質タグと融合してよい。
【００８２】
本発明のトランケートしたデキストランスクラーゼを使用してＬ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆの未変性ＤＳＲ−Ｓにより合成したデキストランと比較してレオロジー特性が改変された、高モル質量（約１０６〜１０８Da）デキストランの調製は本発明の別の態様である。
【００８３】
より具体的には、デキストランスクラーゼを分泌する微生物または細胞内方式でデキストランスクラーゼを生成する微生物の細胞抽出物はスクロース含有培地で培養し、または使用してよく、結果としてイソマルトース（３４２Da）、（ｉｉ）３４２〜５，０００Daのイソマルト−オリゴ糖、（ｉｉｉ）サイズが１，３００〜５，２００Daに制御され、中間がおよそ１０，０００Daであるデキストラン、（ｉｖ）サイズが７，０００〜１．７×１０５Daに制御され、中間がおよそ４０，０００Daであるデキストラン、および（ｖ）２×１０６Da〜１０９Daの高モル質量であるデキストランが合成される。これらの化合物は、限外ろ過、ナノろ過、アルコール沈殿、液体クロマトグラフィー等の従来法による培地から単離してよい。
【００８４】
あるいは、本発明に記載のトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを精製し、モル質量を制御したデキストランの生成法に使用してよい。
【００８５】
よって、本発明は、モル質量を制御したデキストランおよび／またはイソマルト−オリゴ糖を生成する方法に関するものであり、この方法は、上記で定義した配列番号６〜配列番号１０のヌクレオチド配列より選択した配列から本質的になる、あるいはそれからなる突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼを少なくともスクロース、および場合によりアクセプターと反応させる工程を含む。
【００８６】
本発明はまた、イソマルトースの生成法、本質的に配列番号１０の配列を有する突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼをスクロースと反応させる工程を含む方法に関する。本発明はまた、興味深いテクスチャー特性を有するデキストランの生成法、突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼを配列番号６の配列と反応させる工程を含む方法に関する。
【００８７】
本発明は本明細書に記述した方法で得られる可能性のある本出願で定義した特徴を有するデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖に関する。これらの特徴的な特性には、高モル質量デキストランが非ニュートン性挙動、およびゲル特性または繊維特性の性質を有し、剪断応力の第２系列を付与した後に溶液型挙動からゲル型挙動に変化するという特性を有するという事実が含まれる。
【００８８】
実施例で明らかになるように、好都合にも異なるレオロジー特性は、酵素が精製してあるか否かによって得られる可能性がある。
【００８９】
本発明の酵素的に生成したデキストランは、医薬産業における補助剤として、血漿代用薬、布地または塗料の添加剤として、化粧品に、肥料産業に、ならびにテクスチャー剤として、例えばアラビアゴムまたはゲル化剤の代用物として使用してよい。本発明はまた、本発明のデキストランおよびＩＭＯを含む組成物に関する。
【００９０】
本出願のデキストランおよびイソマルト−オリゴ糖の１つの重要な用途はプレバイオティクスとしての使用である。これらの生成物は完全には代謝されず、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）および乳酸桿菌（Lactobacilli）などの適切な細菌種により結腸内で選択的に発酵する。
【００９１】
オリゴ糖は、ヒトもしくは動物の食料用に、医薬産業で、化粧品産業で、または甘味料、安定剤もしくは充填剤として従来から使用されてきた［２１］。この１５年間、特定の非消化分子のプレバイオティクス特性に対して活性の新たな分野が開発されている［２３］。プレバイオティクスとしてオリゴ糖は、消化酵素による攻撃に耐性を有し、腸内のビフィドバクテリウム属および乳酸桿菌を主として「健康に良い」細菌の増殖を促進するという能力に関して興味深い。この考えは、急速に人気を博している市販のプレバイオティクス製品が出現したことにより刺激された。フルクト−オリゴ糖、ラクチュロース、ガラクト−オリゴ糖、キシロ−オリゴ糖、大豆抽出オリゴ糖、または生物学的プロセスにより、もしくは植物からの抽出により通常得られるイソマルト−オリゴ糖などのオリゴマーも有望である。現在この分野の研究は、第２世代プレバイオティクスと称する新規のオリゴ糖構造を生成することを中心に行われており、これは新規の物理化学的特性および、より特異的な生物活性を有するはずである［１８］。
【００９２】
さらなる態様では、本発明は、本発明のデキストランスクラーゼから得たデキストランを含む組成物および医薬的に許容され得るビヒクルまたは食品品質ビヒクルに関する。
【００９３】
許容され得るビヒクルは、例えばアジュバント、塩等から選択してよく、アジュバントはムラミルペプチド、ミョウバン、モンタニド等から選択してよい。突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼは、精製タンパク質、組換え法で生成したタンパク質または合成的に生成したタンパク質であってよい。
【００９４】
デキストランおよび／またはＩＭＯの生成法に関し、使用の際の好ましいアクセプターはグルコース、イソマルトース、マルトースおよびイソマルト−オリゴ糖である。
【００９５】
モル質量を制御したイソマルト−オリゴ糖を生成する方法には、本質的に配列番号７、８、９または１０の配列からなる突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼをスクロースと反応させる工程が含まれることが好ましい。よって重合度は２〜６０グルコシル単位（ＤＰ２〜ＤＰ６０）の範囲で変化する。
【００９６】
生成反応は４℃〜８０℃、好ましくは４℃〜４０℃の範囲の温度で起こる。
【００９７】
配列が配列番号７、配列番号８または配列番号９である場合、温度は４℃〜１５℃、好ましくは８℃〜１２℃であることが好ましく、サイズを制御してデキストランを生成するため、温度は１０℃オーダーであることがより好ましい。さらに、この配列のために、温度は約８℃〜約２５℃の範囲であることが好ましく、ＩＭＯを合成するためには２０℃オーダーであることがより好ましい。
【００９８】
さらに、配列が配列番号６または配列番号１０である場合、温度は１５℃〜４５℃、好ましくは１７℃〜３０℃であることが好ましく、２０℃〜２５℃オーダーであることがより好ましい。
【００９９】
さらに、スクロース濃度は１０〜６００g/l、好ましくは７５〜４００g/l、より好ましくは９０〜２８０g/lである。
【０１００】
配列が配列番号７、配列番号８または配列番号９である場合、培地におけるスクロースの濃度は２５０g/lオーダーが好ましい。
【０１０１】
さらに、配列が配列番号６または配列番号１０である場合、スクロースの濃度は１００g/lオーダーでよい。
【０１０２】
さらに必要に応じて、スクロース／アクセプター重量比はおよそ０．５〜１２、好ましくは１〜４、より好ましくは約２オーダーでよい。
【０１０３】
本発明の方法では、デキストランスクラーゼは遊離形態であるか、あるいは支持体に固定している。前記固定は、例えば吸着、封入または共有結合によって行われる可能性がある。
【０１０４】
最終的に、本方法を実行するため、ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜７．０、より好ましくは４．５〜６．０、さらにより好ましくは約５．２の範囲である。
【０１０５】
本発明の他の態様は以下の実施例の研究から明らかになる可能性がある。
【０１０６】
実施例１：変異体の構築
Ｌ−アラビノースプロモーターの制御下でトランケートおよび／または突然変異したｄｓｒＳ遺伝子をクローン化および発現するために、pBad/TOPO Thiofusionベクター（Invitrogen）を使用した。それにより遺伝子はC末端で６×Ｈｉｓタグに、およびN末端でチオレドキシンタグに融合する。
【０１０７】
マトリックスとして使用するため、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来ゲノムＤＮＡを「Blood and Cell culture DNA maxi」キット（Qiagen）を使用して抽出した。株はNCAUR collection, Peoria, IL, USAから入手する。
【０１０８】
トランケートおよび／または突然変異したｄｓｒＳ遺伝子を発現するために、One Shot TOP10細胞（Invitrogen）を使用した。制限酵素をNew England Biolabsから購入し、メーカーの取扱説明書にしたがって使用した。ＤＮＡをQiagenの「QIAquick」（ＰＣＲおよびゲル抽出による精製）および「QIAprep」（プラスミド精製）キットを用いて精製した。
【０１０９】
Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来ゲノムＤＮＡからＤＳＲ−Ｓ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、変異体を「Expand High fidelity」ポリメラーゼ（Roche）および以下のプライマー（５’→３’方向）を使用して構築した：
１ ｐＢａｄおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌプライマー：
【表２】
およびＰＢａｄ Δ４Ｎ：
【表３】
を使用してＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎを構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｔ１５２〜Ｓ１４５０が含まれていた。
２ ｐＢａｄおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌプライマー：
【表４】
およびＰＢａｄ Δ３：
【表５】
を使用してＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌΔ３を構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｔ１５２〜Ｇ１３６２が含まれていた。
３ ＰＢａｄおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌプライマー：
【表６】
およびＰＢａｄ Ｃｏｒｅ：
【表７】
を使用してＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅを構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｔ１５２〜Ｇ１１６２が含まれていた。
４ ＰＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｃａｔプライマー：
【表８】
およびＰＢａｄ Ｃｏｒｅ：
【表９】
を使用してＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡを構築した。それにはＤＳＲ−Ｓのアミノ酸Ｇ２８２〜Ｇ１１６２が含まれていた。
５ 「mega primer」技術［３３、２１］およびＤＮＡポリメラーゼPfu（Strategene）を使用する定方向突然変異誘発により、突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡを構築した。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４ＮプラスミドマトリックスおよびＳＥＶ６６３ＹＤＡプライマーペア：
【表１０】
およびＢｓｔＢＩ制限部位（下線部）を含むｒｅｖ：
【表１１】
を使用して第一のＰＣＲ反応を行った。その後、ＳｐｅＩ制限部位を含むｆｏｒｗプライマー：
【表１２】
による第二のＰＣＲにおいて、逆メガプライマーとしてＰＣＲ産物を使用した。その後，メーカーの条件（New England Biolabs）にしたがって第二ＰＣＲ産物を２つの制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素であらかじめ消化したｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎベクターへクローン化した。陽性クローン（この場合、ＳａｃＩ部位）を選択するために、単一制限部位を導入するようにＳＥＶ６６３ＹＤＡプライマーを設計した。
【０１１０】
変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの各々の一次構造は図６で図式的に示す。
【０１１１】
実施例２：大腸菌における変異体の生成
ＤＳＲ−Ｓはアルカリ性ｐＨ条件下では不安定であることが知られており［３］、１００mNのＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨを６．４に緩衝した２×ＹＴ培地で、バッフル付エルレンマイヤーフラスコ中で培養を行った。
【０１１２】
培地２×ＹＴの組成物：
バクトトリプトン １６g/l
酵母エキス １０g/l
ＮａＣｌ ５g/l
Ｔｒｉｓ １２．１g/l
【０１１３】
ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４ＮおよびｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡプラスミドを有する大腸菌ＴＯＰ１０細胞を２３℃で培養した。細胞が増殖し、ＯＤ６００nmが０．２で誘導因子が０．００２％（w/v）になったときにＬアラビノース誘導を行った。細胞溶解段階の開始に先だって細胞増殖がプラトー（ＯＤ６００nmは約３〜３．５）に到達したときに培養を停止した。
【０１１４】
ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓ ＣｏｒｅΔＡプラスミドを有する大腸菌ＴＯＰ１０細胞の温度を１６℃にした。ＯＤ６００nmが０．２になり、ＬアラビノースがＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の場合０．００５％（w/v）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの場合０．０２％（w/v）になったときに誘導を行った。細胞溶解段階の開始に先だって細胞増殖がプラトー（ＯＤ６００nmは約２．５）に到達したときに培養を停止した。
【０１１５】
培養後、細胞を遠心分離（８，０００×g、１０分、４℃）で回収し、再懸濁し、酢酸ナトリウムバッファー５０mM、ｐＨ５．２中でＯＤ６００nmが８０になるように濃縮し、０．０５g/lの１mMＣａＣｌ２およびフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を添加した。超音波処理で細胞を破壊した。その後、再度標本を１回遠心分離（２０，０００×g、３０分、４℃）し、細胞砕片を排除し、超音波処理の上清のみを回収した。
【０１１６】
SumnerおよびHowell, 1935［２２］のジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により、抽出物の酵素活性を測定した。酵素ユニットは、所与の温度（場合により４℃〜４０℃、より正確には２０℃または３０℃）で、０．０５g/lのＣａＣｌ２および１００g/lのスクロースを含む酢酸ナトリウムバッファー（５０mM）、ｐＨ５．２中で、１分間当たり１μモルのフルクトースの形成を触媒する酵素の量として定義する。
【０１１７】
実施例３：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ変異体の精製
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの様々な酵素型を、大腸菌ＴＯＰ１０の培養中に生成した：大多数の完全型およびＣ末端における様々な分解型（図７）。これらの分解の原因は不明である。実施例２での生成量は、超音波処理の上清中で約５５００U/l培養物に達した（３０℃でアッセイした活性）。
【０１１８】
抽出物中の活性酵素型の数を測定するため、未変性条件または変性条件下で電気泳動ゲルを作成した。ゲル復元後に、１００g/lのスクロースを補足した５０mMの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．２中で一晩、２５℃でインキュベートした。次いで活性酵素型はゲル内で移行する先の領域でポリマーを合成した。活性デキストランスクラーゼに合成されたポリマーを特異的に着色する試薬（シッフ試薬）を、過ヨウ素酸ポリマーの一次アルコール機能が酸化した後に使用し、ゲルをこの試薬で染色した。このタイプのゲルはザイモグラムと称する。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎまたはその突然変異体ＳＥＶ６６３ＹＤＡの場合、２つの高モル質量型のみ活性であることが分かった（結果は示されていない）。しかし完全型のみがチオレドキシンタグも６×Ｈｉｓタグも有していた。
【０１１９】
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの完全型においてのみ存在する６×Ｈｉｓタグを利用し、ニッケル樹脂（Probond Ni-NTA, Invitrogen）での親和性クロマトグラフィーにより酵素を精製した。
【０１２０】
精製を４℃で行った。すべてのバッファーには、５０mM濃度の酢酸ナトリウム、４００mMのＮａＣｌ、異なる濃度のイミダゾールが含まれており、ｐＨは７．５に調整した。樹脂を、４０mM濃度のイミダゾールを含む８容量のバッファーで平衡化した。２０mMのイミダゾールを補足した７容量の酵素抽出物で固定を２時間行い、ｐＨを７．５に調整した。次いで、樹脂を４０容量の４０mMイミダゾールバッファーで、８容量の６０mMで、そして４容量の１００mMで洗浄した。最後に、２５０mM濃度のイミダゾールを含む７容量のバッファーでタンパク質を溶出した。
【０１２１】
溶出した融合タンパク質を含有する画分を混合し、５０mM濃度の酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および０．０５g/lのＣａＣｌ２を含有するバッファーに対して４℃で一晩透析した。スタンダードとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用し、マイクロブラッドフォード法（Biorad Laboratories）でタンパク質濃度を測定した。
【０１２２】
操作の最後に標本の純度を約９０％と推定した（図８）。精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎタンパク質は非常に強い凝集傾向を示し、白色沈殿が形成され、操作の最後に得られる収率が制限された（表１）。しかし標本の特異的活性は５８４U/mgのタンパク質と推定され、これは最良と称されている組換えデキストランスクラーゼの特異的活性に相当する。比較により、（Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆに発現された）未変性ＤＳＲ−Ｓの特異的活性は約１７０U/mgと推定した［２４］。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
実施例４：ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
構築物を配列決定し、対応する配列を図１〜５に示す。
【０１２５】
実施例５：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎによるデキストランの合成、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来ＤＳＲ−Ｓとの比較
Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓ、完全組換えＤＳＲ−Ｓ（超音波処理の上清）およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（超音波処理の上清および精製した酵素）からデキストランを合成した。
【０１２６】
合成条件および生成物の分析
実施例１に記述した変異体と同様の原理で、全遺伝子の増幅に適したプライマーを用いて完全組換えＤＳＲ−Ｓを構築した。ｐＢａｄ ＤＳＲ−Ｓプラスミドを有する大腸菌ＴＯＰ１０細胞を、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ用のプロトコール（実施例２）を使用して培養した。上清には３つの酵素型が含まれ、このうち２つは高活性のモル質量を有していた。
【０１２７】
サイズが最も大きい型は全体的にＤＳＲ−Ｓを含み；２つの他の型はそのＮ末端位置で分解した（データなし）。
【０１２８】
各酵素標本の活性を３０℃で測定した。
【０１２９】
０．０５g/lのＣａＣｌ２を含む５０mMの酢酸ナトリウムバッファー中の１００g/lスクロース溶液と、１単位/mlの酵素とを出発物質として、デキストランを２５℃で合成した。スクロース消耗が進行していることがＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりモニターされ（以下参照）、完全に消費された後、９５℃で５分間加熱して（前述のデキストランスクラーゼの完全な変性）、反応を停止した。
【０１３０】
単糖、二糖およびオリゴ糖に関してはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルスアンペロメトリック検出法を用いた高性能陰イオン交換クロマトグラフィー）により、また多糖に関してはＨＰＳＥＣ（高性能サイズ排除クロマトグラフィー）により、生成物を分析した。
【０１３１】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ系には、Dionex「Carbopack PA100」４ｘ２５０mmカラムが装備されていた。１５０mMの水酸化ナトリウム溶液中での６〜３００mM酢酸ナトリウムの２８分間の勾配を、流速１ml/分で適用した。金電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ ｐＨ参照電極を有するDionex ED40モジュールを使用してアンペロメトリーにより検出を行った。
【０１３２】
溶媒として０．４５Mの硝酸ナトリウム＋１％（v/v）のエチレングリコールを使用して、０．３ml/分で、Shodex OH-Pack SB-805およびSB-802.5カラムの２つを連続的に使用し、ＨＰＳＥＣ系を構成した。カラムおよびプレカラムを７０℃に維持し、注入に先だって試料を０．４５μmフィルター（Sartorius）でろ過した。検出は屈折率タイプであり、光拡散検出器（Wyatt）と組み合わせてデキストラン質量を測定した。
【０１３３】
グルコース、フルクトースおよびロイクロース（スクロース異性体）の重量濃度をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析で測定した。グリコシル残基のパーセンテージを、グルコースおよびロイクロースに組み込まれたスクロースから以下の式を使用して計算した：
％Ｇグルコース＝［グルコースｔｆ］／（［スクロースｔ０］ｘ（１８０／３４２））
および
％Ｇロイクロース＝［ロイクロースｔｆ］／［スクロースｔ０］
式中、［グルコースｔｆ］および［ロイクロースｔｆ］は反応の最後のグルコースおよびロイクロースの終濃度であり、［スクロースｔ０］は開始基質の濃度（g/l）である。
【０１３４】
ＨＭＷポリマーに組み込まれたグリコシル残基のパーセンテージをＨＰＳＥＣ分析により以下の式を使用して判定した：
％Ｇデキストラン＝表面面積デキストラン−ｔｆ／（表面面積スクロース−ｔ０／（１６２／３４２））
式中、表面面積デキストラン−ｔｆは反応の最後にＨＰＳＥＣクロマトグラムを使用して測定したデキストランのピークの表面面積であり、表面面積スクロース−ｔ０は開始基質のピークの表面面積である。所与の濃度では、屈折率測定法で求められた表面は糖の別なく同一である。
【０１３５】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤまたはＨＰＳＥＣで濃度が直接に定量化できないＩＭＷポリマーまたはオリゴ糖に組み込まれたグリコシル単位の割合を以下の式を使用して判定した：
％ＧＩＭＷ＝１００−％Ｇグルコース−ｔｆ−％Ｇロイクロース−ｔｆ−％Ｇデキストラン−ｔｆ
【０１３６】
ＨＰＳＥＣにより得られた４種のデキストランの溶出プロファイルを図９に示す。異なる集団を区別することが可能である：３８分時点での第一溶出ピークは高モル質量ポリマー（ＨＭＷ）に相当し、７５分時点での第二ピークは、重合度（ＤＰ）が７未満で、系により分離されず、または非常に低い濃度であるフルクトース、グルコース、ロイクロース（５−Ｏ−α−Ｄグルコシルフルクトース）および他のオリゴ糖に相当する。これら２種の主要なピーク間では、ベースラインの摂動で示されたとおり、中間サイズの生成物（ＩＭＷデキストラン）も存在した。１０００〜１０７Da間でサイズが変化するこれらの化合物は高度に多分散しており、非常に低い濃度であり、このことはクロマトグラムでの強度が低いことを示している。しかしＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりそれらの存在を確認した（結果は示されていない）。
【０１３７】
スクロース由来であり異なる生成物に組み込まれたグルコシル単位の相対量を以下の表２に一覧にする。ＨＭＷデキストランの合成収率は、各標本でのグルコシル単位の約６０％である。水（グルコース）またはフルクトース（ロイクロース）へのグルコシル単位の移行は８％未満であり、一方、中間サイズのデキストラン（ＩＭＷ）の合成物は移行したグルコシル単位の２５％〜３２％を占めていた。ＤＳＲ−Ｓの組換え型すべては、中間サイズデキストランをより多く合成する傾向にあった。またＨＰＳＥＣの分析により、組換え酵素が１つの集団だけを合成することと対照的に未変性酵素は２つの異なるデキストラン集団を合成することが明らかになった。ＨＭＷデキストランのモル質量を光拡散により測定し、すべての試料で１０７g/モルを超えると推定した（使用したカラムの排除限界）。
【０１３８】
【表１４】
【０１３９】
形成されたデキストランの構造
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎにより（精製またはその他の方法で）生成されたデキストランの構造を、完全組換えＤＳＲ−Ｓおよび未変性ＤＳＲ−Ｓから合成したデキストランの構造と比較した。これらの構造は、８５℃で３００．１３MHzの周波数捕捉で、Brucker AC300を使用し、核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）により判定した。捕捉時間は３秒で３２〜６４周期であった。１容量の無水エタノールで３回沈殿させて共生成したフルクトースからデキストランを最初に分離し、遠心分離により回収し、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥させた。試料を６mg/mlの濃度になるまでＤ２Ｏに溶解した。
【０１４０】
ＮＭＲスペクトルを図１０に示す。α−１，６結合のみ検出した。精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成されたデキストランで炭素１３のＮＭＲ分析も行った。得られたスペクトルは、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆおよび完全ＤＳＲ−Ｓ由来デキストランに関する刊行物［３］と一致した。
【０１４１】
これらのポリマーも、ケトミウム・グラシル（Chaetomium gracile）由来エンドデキストラナーゼにより、１６時間３７℃で、合成培地１ml当たり３酵素ユニットで消化した。消化生成物をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで分析した（図１１）。得られた消化プロファイルは、分析した４種のデキストランと一致し、そのすべてが少なくとも９５％のα−１，６結合を有していることが確認された。
【０１４２】
したがってＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ変異体を構築するＤＳＲ−ＳのＮおよびＣ末端位置で欠失が生じても、ＤＳＲ−Ｓの最初の活性、またはＨＭＷデキストラン合成物に組み込まれたスクロース由来グルコシル単位の割合、多糖のサイズまたは構造にはさほど影響が及ぶことはない。
【０１４３】
形成されたデキストランのレオロジー挙動
角度が３．５９度の４cm径の円錐体を備え、速度が０．０１〜１００s-1の範囲にあるコーンプレート装置（AR 1000, TA Instruments）を使用して４種のデキストランのレオロジー挙動を分析した。測定を２５℃で行った。０〜１０Pa間で、直線ドメイン内で力学実験を行ったところ、Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓに合成されたデキストラン（対照）では変形は８％であり、完全組換えＤＳＲ−Ｓに合成されたデキストランでは３％であり、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの非精製抽出物に合成されたデキストランでは５％であり、精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎにより合成されたデキストランでは０．４％であった。複素剛性モジュールを以下の関係で定義する：
Ｇ＊（ω）＝Ｇ’（ω）＋ｉＧ”（ω）。
【０１４４】
試料が主に弾性で高度に構造化されている場合、エネルギー保存モジュールＧ’（ω）はより大きい。喪失モジールＧ”（ω）は、変形している間に散逸したエネルギーを表している。主として粘性のある試料のＧ”（ω）は高い。
【０１４５】
これらのレオロジー分析により、全く独自の結果が得られた（図１２）。文献に記述されているとおり、未変性ＤＳＲ−Ｓはニュートン性挙動を有するデキストランを合成した［２５］。
【０１４６】
完全組換えＤＳＲ−Ｓ抽出物および非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ抽出物は同一の挙動を有する粘性溶液を生成した（粘度は未変性酵素により生成したデキストランのものより約１０倍高い）。裸眼で観察する場合、それらはかなり明確な繊維性挙動も示した。さらに、新たに剪断応力を付与した後、前記ポリマーの挙動は溶液タイプからゲルタイプへと変化した。ゲルタイプはこのタイプの生体高分子で同定された新規の特性である。対照として、未変性酵素により生成したデキストランは線維性ではなく、その挙動は応力の第２系列を付与した後に完全に可逆的であった（図１２Ａ）。
【０１４７】
精製酵素は、１０℃〜７０℃の濃度範囲にわたってその性質を維持しながら、高度に構造化されたゲル（図１２Ｂ、モジュールＧ’はＧ”よりかなり高い）の特性を有するポリマーを直接合成した（結果は示していない）。この挙動は未変性酵素のものとは完全に異なっている。
【０１４８】
精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの標本のみが、抽出物中に活性デキストランスクラーゼを１種だけ含有していた。未変性ＤＳＲ−Ｓはタンパク質溶解分解の問題を抱えやすいことが公知であり［２６］、開発した精製技術ではその問題を解決できない［２７、２８、２９］。試験に使用した完全組換えＤＳＲ−Ｓには、精製前のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ標本のような、少なくとも２つの活性酵素型が含まれていた。しかし、未変性ＤＳＲ−Ｓ、完全組換えＤＳＲ−ＳおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの分解型は完全に異なっている。培地中のこれらの異なる活性酵素型間の共同作用はデキストラン鎖への改変の起源となり、挙動に差異を引き起こすということが現在推測されている。
【０１４９】
実施例６：スクロースからのイソマルトースの合成
高モル質量デキストランが喪失するまでスクロースからイソマルトースだけを合成する突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌΔ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡの能力を検討した。
【０１５０】
実施例３でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎについて記述された手技を使用して親和性クロマトグラフィーにより突然変異体を精製した。
【０１５１】
活性を３０℃でアッセイした。
【０１５２】
わずか９U/mgの特異性活性により、ＳＥＶ６６３ＹＤＡ突然変異体はＤＳＲ−Ｓの活性に重大な影響を及ぼす（最初のスクロース消費割合の９８％が喪失）。しかしその特異的活性は、その潜在的な用途のために広く研究されているＮ．ポリサッカレア（N. polysaccharea）［３２］由来の組換えアミロスクラーゼのものと同等である。
【０１５３】
特徴づけを行い、この突然変異体ＤＳＲ−Ｓによりイソマルトース生成が実行可能になること、一方、野生型酵素により高モル質量デキストランのみが生成されることが明らかになった。５０mM濃度の酢酸ナトリウムｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２、１U/mlの精製酵素を含むバッファー中、単に基質としてのスクロースを１００g/l使用して、あるいは１００g/lのスクロースおよび５０g/lのグルコースを出発物質とするアクセプター反応により、２５℃で合成を行った。スクロースの消耗をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析でモニターし（分析条件は実施例４を参照）、完全に消費した後に反応を中断した。
【０１５４】
このようにして、イソマルトース生成量は、単に基質としてのスクロースを使用した場合、収率４７％に達し（表３および図１３）、これはアクセプター反応で得られたものと同等の収率であった。したがって外因性アクセプターの添加は必要ではなかった。ＤＰが７未満であり、既知の構造の他のオリゴ糖の存在とともに、イソマルトトリオース、マルトースまたはニゲロース（系では分離されない）の軌跡も確認した（図１３）。
【０１５５】
【表１５】
【０１５６】
したがって本実施例では、イソマルトース生成量は４７％の収率に到達した。現在、これはスクロースからイソマルトースを合成する単一の酵素が関与する最初の方法であり；先行の研究はすべてα−アミラーゼおよびグリコシダーゼの混合物によるデンプンの分解［１１］に、またはデキストランスクラーゼおよびデキストラナーゼの連結作用［３０］に関連している。さらに、スクロースは安価で入手範囲の広い基質であり、合成の際に放出されたフルクトースは、個別に利用可能な価値を有する共生成物を構成する。
【０１５７】
実施例７：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３によるデキストランの合成
大腸菌ＴＯＰ１０の培養中にＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の異なる酵素型が生成された。しかし、完全型は非常に多数を占めており、得られたザイモグラム（実施例３を参照）から完全型のみが活性であることが分かった。
【０１５８】
この変異体に最適な活性温度は２０℃であった。よってこの温度で活性アッセイを行った。実施例２にしたがってＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の生成量は約３２０U/l培養液となった。
【０１５９】
５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２、１００g/lのスクロースおよび１U/mlの非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３抽出物を含むバッファー中で２０℃でデキストランを合成した。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３抽出物は、実施例３のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎについて記述したプロトコールを使用して、ニッケル樹脂での親和性クロマトグラフィーにより精製できた。しかし超音波処理の上清にはデキストランスクラーゼの単一酵素型のみが含まれ、大腸菌はスクロースを消費できる別の酵素を生成しなかったことから、変異体の精製はその特性の厳密な特徴づけのための必須条件にはならなかった。比較として、（非精製）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎと同じ条件下でデキストランを合成した。スクロースの消失をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析でモニターし、完全枯渇した後、反応を停止した（５分、９５℃）。
【０１６０】
合成産物を、実施例４に記述した条件で、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＨＰＳＥＣにより分析し、定量した。ＨＰＳＥＣ分析では、サイズが２×１０６、５０３×１０３、７０，０００、１０，０００Daである市販のデキストラン、マルトヘプタオースおよびグルコース（Sigma）を使用してデキストランのサイズを推定した。
【０１６１】
図１３で分かるように、２０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３変異体は２つのポリマー集団；約３９％のスクロース由来グルコシル残基である、サイズが２×１０６DaのＨＭＷデキストランの主要集団（表４）、および１，３００〜５２，０００Daで、中間がおよそ１０，０００Daの最高ピーク値である第二集団（約２５％グルコシル残基）を合成した。ＨＰＳＥＣクロマトグラムに鮮明に見えるデキストランの第二集団を、ＤＳＲ−Ｓ変異体について観察したことはこれが初めてである。
【０１６２】
生成物のプロファイルに対する温度の影響
温度１０℃で、５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２、および１U/mlの酵素を含むバッファーをまた使用し、デキストランをまた合成した（２０℃での活性アッセイ）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりスクロース枯渇をモニターし、完全に消費された後に反応を停止した（５分、９５℃）。
【０１６３】
図１４で分かるように、１０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３変異体は、２０℃で生成されたものと全く異なるデキストラン集団を合成した。その温度で形成された主要なポリマー（約４４％）のモル質量は７，０００〜１．７×１０５Daであり、中間がおよそ４０，０００Daのピークにあった。
【０１６４】
【表１６】
【０１６５】
スクロース濃度の影響
２０℃および１０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３（１U/ml）により行ったデキストラン合成に関し、４段階に濃度を増加させた（１００、１５０、２００および２５０g/l）スクロースを試験した。スクロースの全体消費をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりモニターし、完全に消費された（４８時間未満）後に合成を停止した。
【０１６６】
２つの温度では、基質の初期の濃度上昇は低モル質量デキストランの合成を促進した。よって２０℃で、１０，０００Daデキストランの合成は、初期スクロースが１００g/lから２５０g/lへ変化するにつれて、収率は２５％から４８％へと変化した。１０℃で２５０g/lから始めると、ＨＭＷデキストラン合成は完全に停止し、中間がおよそ４０，０００Daにあるモル質量の主要集団でのデキストランの合成では、首尾よく収率が６９％に達した。
【０１６７】
１０℃および２０℃で、スクロース１００〜２５０g/lから始めてＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３により合成されたデキストランすべてでは、エンドデキストラナーゼ消化プロファイル（実施例５を参照）により、ＤＳＲ−Ｓの結合特異性は変化しないことが確認された（ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎと同様の、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤに検出されたオリゴ糖プロファイル、すなわち少なくとも９５％のα−１，６結合）。
【０１６８】
実施例８：ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡによるデキストランの合成
実施例２で記述した条件下での大腸菌ＴＯＰによる発現の際、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ変異体もやや分解された。しかし、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３変異体の場合のように、ザイモグラムによると大多数の完全型のみが活性であった（結果は示されていない）。
【０１６９】
これらの変異体に最適な活性温度も２０℃であった。このようにして生成量はＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの培養物中、それぞれ３８および１８０U/Lに達した。
【０１７０】
５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２および１U/mlの酵素抽出物（非精製）を含むバッファー中で１００〜２５０g/lのスクロースを使用して２０℃および１０℃でデキストラン合成を行った。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりスクロース消費をモニターし、完全に枯渇した（４８時間未満）後に合成を停止した（５分、９５℃）。生成物をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＨＰＳＥＣで分析し、その濃度を実施例５で記述したとおりに定量した。
【０１７１】
２つの変異体により２０℃で合成した生成物のプロファイルを図１５に示す（ＨＰＳＥＣクロマトグラム）。ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４ＮおよびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３と対照的に、これらの変異体では、形成されたデキストランの主要集団のモル質量は１０，０００Daに近く、ピークが１，３００〜５２，０００間（５，０００〜２２，０００間の半分の高さ）にある塩基を有していたことが明確に分かる。ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ変異体では、ＨＭＷデキストランの合成は完全に停止した（表５）。温度を１０℃まで低下させると、サイズを大幅に変更せずにデキストランの収率は１０，０００Daまで増加することが可能となり、これはＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の場合と同様であった（表５）。ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ変異体によるデキストラン合成はこのようにして収率７５％に達した。初期のスクロース濃度を２５０g/lにすると、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ変異体と同等の収率が得られた（結果は示されていない）。
【０１７２】
【表１７】
【０１７３】
異なる変異体により２０℃で１００g/lのスクロースから合成したデキストランのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により、特にＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡに関し、ＤＰが２〜約６０であるイソマルト−オリゴ糖を含む生成物の多分散性が非常に高いことが分かった（図１６）。
【０１７４】
１０℃および２０℃で、スクロース１００〜２５０g/lを使用しＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡにより合成されたデキストランすべてについて、実施したエンドデキストラナーゼ消化プロファイル（実施例５を参照）により、ＤＳＲ−Ｓの結合特異性は変化しないことが確認された（ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎと比較して同等の、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤに検出されたオリゴ糖プロファイル、よってα−１，６結合は少なくとも９５％）。
【０１７５】
実施例９：グルコースとのアクセプター反応
５０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、０．０５g/lのＣａＣｌ２を含むバッファー中、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡの抽出物１U/mlでアクセプター反応を、２０℃、スクロース／グルコース比２（スクロース１００g/l、グルコース５０g/l）で行った。スクロースの全消費をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤでモニターし、完全に枯渇した後に反応を停止した。変異体すべてはＤＰが２〜約３０のイソマルト−オリゴ糖（ＩＭＯ）を合成し、高ＤＰのポリマーの合成は喪失した。
【０１７６】
しかし、得られた収率はＡ単位のトランケートされた変異体ではより高かった。したがって、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎの場合の４７％と対照的に、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３の場合ではＩＭＯ生成量は５２％に、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡでは５８％に達した。オリゴ糖分布も改変した（図１７）。
【０１７７】
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３では、ＤＰが２〜１５であるＩＭＯの割合はＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成された生成物の割合より低かった。ＤＰが１５を超えるＩＭＯでは状態は後退した。
【０１７８】
同様に、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ ＣｏｒｅおよびＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡ突然変異体は、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎまたは未変性ＤＳＲ−Ｓ（基本的に２〜１５のＤＰ）より、高ＤＰでＩＭＯ合成に対して良好に作用することが分かった：ＤＰが１２〜２７のＩＭＯの生成量は（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで得られた表面積の割合によると）これらの２種の変異体により２〜５倍高まった。
【０１７９】
【表１８】
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図１は、配列の５’末端位置にチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎデキストランスクラーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、かつタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図２】図２は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図３】図３は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図４】図４は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有するトランケートしたＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図５】図５は、配列の５’末端位置にあるチオレドキシンタグおよび配列の３’末端位置にある６個のヒスチジンタグを有する突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにタンパク質タグとデキストランスクラーゼをコードする配列との間にあるスペーサーアームを示す図である。
【図６】図６は、ＤＳＲ−Ｓのトランケートした変異体およびその相対的活性を表した図表である。ＤＳＲ−Ｓの４つの異なるドメイン（ｉ）〜（ｉｖ）は以下に対応する：（ｉ）シグナルペプチド、（ｉｉ）可変領域；（ｉｉｉ）触媒ドメインおよび（ｉｖ）Ｃ末端ドメインならびにMonchoisら、1998［１６］にしたがって位置する反復単位Ａ，ＣおよびＮ（網掛けの四角部分）。
【図７Ａ】図７は、大腸菌ＴＯＰ１０により生成したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに関して２３℃で行われた抗チオレドキシン（Ａ）および抗６×Ｈｉｓ（Ｂ）のウエスタンブロットを示す図である。
【図７Ｂ】図７は、大腸菌ＴＯＰ１０により生成したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに関して２３℃で行われた抗チオレドキシン（Ａ）および抗６×Ｈｉｓ（Ｂ）のウエスタンブロットを示す図である。
【図８】図８は、ニッケル樹脂（Probond, Invitrogen）での親和性精製中のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ抽出物に関してコロイダルブルーでタンパク質を染色した後の電気泳動ゲルを示す図である。トラック１は、培養の終りに大腸菌ＴＯＰ１０を超音波処理して得た上清である；トラック２は、樹脂上にタグ化６×Ｈｉｓタンパク質を結合させた後に得た溶出物であり、トラック３は溶出画分であり、そしてトラック４は凝集物を排除した後の溶出画分である。
【図９】図９は、ａ）Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓ、ｂ）完全組換えＤＳＲ−Ｓ、ｃ）精製前のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、およびｄ）精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎを調製することで生成したデキストランのＨＰＳＥＣにより得た溶出プロファイルを示す図である。ピーク１は高モル質量ポリマー（ＨＭＷ）であり、ピーク２はＤＰが７未満の、系により分離していないフルクトース、グルコースおよびオリゴ糖である。これら２つのピーク間では、ベースラインの摂動は濃度が非常に低い中間サイズ（１０３〜１０７Da）のデキストランの存在を反映している。
【図１０】図１０は、Ａ）Ｌ．メゼンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ由来未変性ＤＳＲ−Ｓ、Ｂ）完全組換えＤＳＲ−Ｓ、Ｃ）精製前のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、およびＤ）精製後のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎにより合成したデキストランに関するプロトンＮＭＲで得たスペクトルを示す図である。スペクトルＥ）は精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成されたデキストランの炭素１３スペクトルである。
【図１１】図１１は、未変性ＤＳＲ−Ｓ、完全組換えＤＳＲ−Ｓおよび精製前後のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎに合成された４種のデキストランのエンドデキストラナーゼ（ダーゼ）を使用している消化産物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムを示す図である。
【図１２Ａ】図１２は、剪断前（１）および後（２）の未変性ＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（３）および後（４）の完全組換えＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（６）および（７）のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（５）に合成された４種のデキストランのレオロジー挙動を示す図である。ここで、Ａ）は粘性流動の測定値であり、Ｂ）は非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（○および●；溶液型挙動、Ｇ’＜Ｇ”；５％変形）および精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（□および■；ゲル型挙動、Ｇ’＞Ｇ”；０．４％変形）により合成されたデキストランについて保存Ｇ’率およびエネルギー散逸Ｇ”率を測定する前の、力学的モード粘度測定値（０〜１０Paの振動）である。
【図１２Ｂ】図１２は、剪断前（１）および後（２）の未変性ＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（３）および後（４）の完全組換えＤＳＲ−Ｓ、剪断応力の第２系列を付与する前（６）および（７）のＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、精製したＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（５）に合成された４種のデキストランのレオロジー挙動を示す図である。ここで、Ａ）は粘性流動の測定値であり、Ｂ）は非精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（○および●；溶液型挙動、Ｇ’＜Ｇ”；５％変形）および精製ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ調製物（□および■；ゲル型挙動、Ｇ’＞Ｇ”；０．４％変形）により合成されたデキストランについて保存Ｇ’率およびエネルギー散逸Ｇ”率を測定する前の、力学的モード粘度測定値（０〜１０Paの振動）である。
【図１３】図１３は、スクロース単独を１００g/l含有する突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌΔ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡ（Ａ）により、あるいはスクロース１００g/lおよびグルコース５０g/lによるアクセプター反応（Ｂ）により合成される生成物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムを示す図である。記号Ｇはグルコースを意味し、Ｆはフルクトース、Ｉ２はイソマルトース、Ｉ３はイソマルトトリオース、Ｎ／Ｍはニゲロースまたはマルトース（ＨＰＡＥＣパッド装置によって分離されていない）を意味し、記号「？」は構造が未知である生成物を表している。
【図１４】図１４は、２０℃および１０℃でＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３により合成したデキストランのＨＰＳＥＣクロマトグラムを示す図である。矢印は、対照の役割である２×１０６Da、７０，０００および１０，０００Daの市販のデキストランの保持時間である。
【図１５】図１５は、１００g/lのスクロースおよび１U/mlの（１）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、（２）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、（３）ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅおよび（４）ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡにより２０℃で合成したデキストランのＨＰＳＥＣクロマトグラム、ならびに１０，０００Daの市販デキストラン（Sigma）の溶出プロファイル（５）を示す図である。
【図１６】図１６は、１００g/lのスクロースおよび１U/mlのＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎで（１）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３で（２）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅで（３）、およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ ΔＡで（４）、２０℃で合成したデキストランのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す図である。
【図１７Ａ】図１７は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイル（Ａ）、ならびに変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（１）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３（２）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ（３）およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ ΔＡ（４）と２０℃でアクセプター反応させることで生成されたＩＭＯの分布（Ｂ）を示す図である。Ｇ：グルコース；Ｆ：フルクトース；Ｌ：ロイクロース；Ｔ：トレハルロース；Ｉ２〜Ｉ２０：ＤＰ２〜ＤＰ２０のイソマルト−オリゴ糖。図Ｂの挿入図は、ＩＭＯのＤＰが１５〜２７に拡張したことを示す。
【図１７Ｂ】図１７は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイル（Ａ）、ならびに変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ（１）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３（２）、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ（３）およびＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ ΔＡ（４）と２０℃でアクセプター反応させることで生成されたＩＭＯの分布（Ｂ）を示す図である。Ｇ：グルコース；Ｆ：フルクトース；Ｌ：ロイクロース；Ｔ：トレハルロース；Ｉ２〜Ｉ２０：ＤＰ２〜ＤＰ２０のイソマルト−オリゴ糖。図Ｂの挿入図は、ＩＭＯのＤＰが１５〜２７に拡張したことを示す。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１に記載のヌクレオチド配列（配列番号１）、図２に記載のヌクレオチド配列（配列番号２）、図３に記載のヌクレオチド配列（配列番号３）、図４に記載のヌクレオチド配列（配列番号４）、図５に記載のヌクレオチド配列（配列番号５）、配列番号１、２、３、４もしくは５を有する配列の１つとの相補的配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、２、３、４もしくは５を有する配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性を保持する配列から本質的になるヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント（配列番号１７）、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント（配列番号１８）、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント（配列番号１９）、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント（配列番号２０）および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメント（配列番号２１）から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項１記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号１の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号２の位置３７３〜位置４００５のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号３の位置３７３〜位置３４０８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号４の位置３７３〜位置３０１８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、および配列番号５の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項１または請求項２記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
該ヌクレオチド配列が、配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメントから選択されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性を保持する請求項１または２記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項で定義したヌクレオチド配列のいずれか１つと、少なくとも７０％一致することを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項で定義したヌクレオチド配列のいずれか１つと、少なくとも８０％、好ましくは９０％一致することを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項１〜６の一項に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項８】
プラスミドである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ、ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡおよび突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡから選択されたデキストランスクラーゼ酵素の変異体である、酵素をコードする核酸の配列を含む、請求項７または請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７〜９の一項に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号１〜配列番号５のヌクレオチド配列または請求項１〜６の一項に記載の前記配列のフラグメントの１つによってコードされるタンパク質。
【請求項１２】
配列番号６〜配列番号１０から選択される配列の１つから本質的になるトランケートおよび／または突然変異デキストランスクラーゼであって、ただし酵素活性を保持するデキストランスクラーゼ。
【請求項１３】
配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項１２記載のデキストランスクラーゼ。
【請求項１４】
配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列のタンパク質タグを、Ｎ末端および／またはＣ末端位置で含む、融合タンパク質。
【請求項１５】
該タンパク質タグがＮ末端に位置するチオレドキシンである、請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
該タンパク質タグがＣ末端に位置する６×Ｈｉｓタグである、請求項１４または請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼの調製法であって、以下の工程：
（ａ）デキストランスクラーゼの発現を可能にする条件下で請求項１０記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）培地から前記デキストランスクラーゼを単離する工程
を含む方法。
【請求項１８】
該単離したデキストランスクラーゼを精製する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
モル質量を制御したデキストランおよび／またはイソマルト−オリゴ糖を生成する方法であって、請求項１２または請求項１３の配列番号６〜配列番号１０のヌクレオチド配列から選択される配列から本質的になるトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを、少なくともスクロース、および場合により少なくとも１つのアクセプターと反応させる工程を含む方法。
【請求項２０】
グルコース、マルトース、イソマルトース、フルクトース、イソマルト−オリゴ糖およびこれらの混合物、好ましくはマルトース、イソマルトースおよび／またはグルコースから選択される少なくとも１つのアクセプターの存在下で該反応が起こる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
イソマルトース生成のための請求項１９記載の方法であって、配列番号１０の配列から本質的になるデキストランスクラーゼをスクロースと本質的に反応させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
４℃〜８０℃、好ましくは４℃〜４０℃の範囲の温度で該反応が起こることを特徴とする、請求項１９、２０または２１の一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列が配列番号７、配列番号８または配列番号９であり、該温度が４℃〜１５℃、好ましくは８℃〜１２℃の範囲であることを特徴とする、請求項１９または請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
該温度が１０℃オーダーであることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記配列が配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０であり、該温度が１５℃〜４５℃、好ましくは１７℃〜３０℃の範囲であることを特徴とする、請求項１９〜２４の一項に記載の方法。
【請求項２６】
該温度が２０℃〜２５℃オーダーであることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該スクロース濃度が１０〜６００g/l、好ましくは７５〜４００g/l、より好ましくは９０〜２８０g/lの範囲にあることを特徴とする、請求項２０〜２６の一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記配列が配列番号７または配列番号８または配列番号９であり、該スクロース濃度が２５０g/lオーダーであることを特徴とする、請求項１９、２０および２２〜２７の一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記配列が配列番号６または配列番号１０であり、該スクロース濃度が１００g/lオーダーであることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
該デキストランスクラーゼが遊離形態であるか、あるいは吸着、封入または共有結合により支持体に固定されていることを特徴とする、請求項１９〜２９の一項に記載の方法。
【請求項３１】
ｐＨが３．０〜１０．０、好ましくは４．５〜６．０の範囲にあり、より好ましくは約５．２であることを特徴とする、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
非ニュートン性挙動を有する、請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得ることができるデキストラン。
【請求項３３】
請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法により得ることができるイソマルト−オリゴ糖。
【請求項３４】
請求項１２もしくは請求項１３記載のデキストランスクラーゼの介在により得られる、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られる、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られるデキストランまたはＩＭＯ、または請求項３２記載のデキストラン、または請求項３３記載のイソマルト−オリゴ糖を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項１２もしくは請求項１３記載のデキストランスクラーゼの介在により得られる、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られる、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られるデキストランまたはＩＭＯ、または請求項３２記載のデキストラン、または請求項３３記載のイソマルト−オリゴ糖、および医薬的にもしくは栄養学的に許容され得るビヒクルを含む、医薬組成物または食品組成物。
【請求項３６】
請求項１２もしくは請求項１３に記載のデキストランスクラーゼの介在により得られる、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られる、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られる、少なくとも１つのデキストランを含むことを特徴とする、テクスチャー組成物。
【請求項３７】
（ｉ）イソマルトース（３４２Da）、（ｉｉ）３４２〜５０００Daのイソマルト−オリゴ糖、（ｉｉｉ）サイズが１３００〜５２０００Daに制御され、中間がおよそ１０００００Daであるデキストラン、（ｉｖ）サイズが７０００〜１．７×１０５Daに制御され、中間がおよそ４００００Daであるデキストラン、および（ｖ）２×１０６Daの高モル質量であるデキストラン、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られるデキストランもしくはＩＭＯを製造する方法における、請求項１２もしくは請求項１３記載の、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られるデキストランスクラーゼの使用。
【請求項３８】
テクスチャー剤としての、請求項３２記載のデキストランの使用。
【請求項３９】
プレバイオティクスとしての請求項３２または請求項３３記載のデキストランまたはＩＭＯ、特にサイズが１３００〜５２０００Daに制御され、中間がおよそ１００００Daであるデキストランの使用。
【請求項４０】
配列番号６〜１０または２２〜２６のいずれか１つの連続的アミノ酸配列から本質的になるタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１】
図１に記載のヌクレオチド配列（配列番号１）、図２に記載のヌクレオチド配列（配列番号２）、図３に記載のヌクレオチド配列（配列番号３）、図４に記載のヌクレオチド配列（配列番号４）、図５に記載のヌクレオチド配列（配列番号５）、配列番号１、２、３、４もしくは５を有する配列の１つとの相補的配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、２、３、４もしくは５を有する配列とハイブリダイズする配列であって、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性を保持する配列から本質的になるヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント（配列番号１７）、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント（配列番号１８）、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント（配列番号１９）、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント（配列番号２０）および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメント（配列番号２１）から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項１記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号１の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号２の位置３７３〜位置４００５のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号３の位置３７３〜位置３４０８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、配列番号４の位置３７３〜位置３０１８のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列、および配列番号５の位置３７３〜位置４２６９のヌクレオチドにあるフラグメントの相補的ヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項１または請求項２記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
該ヌクレオチド配列が、配列番号１の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメント、配列番号２の配列の位置３７３〜位置４００５にあるフラグメント、配列番号３の配列の位置３７３〜位置３４０８にあるフラグメント、配列番号４の配列の位置３７３〜位置３０１８にあるフラグメント、および配列番号５の配列の位置３７３〜位置４２６９にあるフラグメントから選択されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ただしデキストランスクラーゼ酵素活性を保持する請求項１または２記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項で定義したヌクレオチド配列のいずれか１つと、少なくとも７０％一致することを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項で定義したヌクレオチド配列のいずれか１つと、少なくとも８０％、好ましくは９０％一致することを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項１〜６の一項に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項８】
プラスミドである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ３、ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Ｃｏｒｅ、ＤＳＲ−Ｓ Ｃｏｒｅ ΔＡおよび突然変異体ＤＳＲ−Ｓ ｖａｒｄｅｌ Δ４Ｎ ＳＥＶ６６３ＹＤＡから選択されたデキストランスクラーゼ酵素の変異体である、酵素をコードする核酸の配列を含む、請求項７または請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７〜９の一項に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号１〜配列番号５のヌクレオチド配列または請求項１〜６の一項に記載の前記配列のフラグメントの１つによってコードされるタンパク質。
【請求項１２】
配列番号６〜配列番号１０から選択される配列の１つから本質的になるトランケートおよび／または突然変異デキストランスクラーゼであって、ただし酵素活性を保持するデキストランスクラーゼ。
【請求項１３】
配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項１２記載のデキストランスクラーゼ。
【請求項１４】
配列番号６の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２２）、配列番号７の位置１２５のアミノ酸〜位置１３３５のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２３）、配列番号８の位置１２５のアミノ酸〜位置１１３６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２４）、配列番号９の位置１２５のアミノ酸〜位置１００６のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２５）、および配列番号１０の位置１２５のアミノ酸〜位置１４２３のアミノ酸にあるフラグメント（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列のタンパク質タグを、Ｎ末端および／またはＣ末端位置で含む、融合タンパク質。
【請求項１５】
該タンパク質タグがＮ末端に位置するチオレドキシンである、請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
該タンパク質タグがＣ末端に位置する６×Ｈｉｓタグである、請求項１４または請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
突然変異および／またはトランケートしたデキストランスクラーゼの調製法であって、以下の工程：
（ａ）デキストランスクラーゼの発現を可能にする条件下で請求項１０記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）培地から前記デキストランスクラーゼを単離する工程
を含む方法。
【請求項１８】
該単離したデキストランスクラーゼを精製する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
モル質量を制御したデキストランおよび／またはイソマルト−オリゴ糖を生成する方法であって、請求項１２または請求項１３の配列番号６〜配列番号１０のヌクレオチド配列から選択される配列から本質的になるトランケートおよび／または突然変異したデキストランスクラーゼを、少なくともスクロース、および場合により少なくとも１つのアクセプターと反応させる工程を含む方法。
【請求項２０】
グルコース、マルトース、イソマルトース、フルクトース、イソマルト−オリゴ糖およびこれらの混合物、好ましくはマルトース、イソマルトースおよび／またはグルコースから選択される少なくとも１つのアクセプターの存在下で該反応が起こる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
イソマルトース生成のための請求項１９記載の方法であって、配列番号１０の配列から本質的になるデキストランスクラーゼをスクロースと本質的に反応させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
４℃〜８０℃、好ましくは４℃〜４０℃の範囲の温度で該反応が起こることを特徴とする、請求項１９、２０または２１の一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列が配列番号７、配列番号８または配列番号９であり、該温度が４℃〜１５℃、好ましくは８℃〜１２℃の範囲であることを特徴とする、請求項１９または請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
該温度が１０℃オーダーであることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記配列が配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０であり、該温度が１５℃〜４５℃、好ましくは１７℃〜３０℃の範囲であることを特徴とする、請求項１９〜２４の一項に記載の方法。
【請求項２６】
該温度が２０℃〜２５℃オーダーであることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該スクロース濃度が１０〜６００g/l、好ましくは７５〜４００g/l、より好ましくは９０〜２８０g/lの範囲にあることを特徴とする、請求項２０〜２６の一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記配列が配列番号７または配列番号８または配列番号９であり、該スクロース濃度が２５０g/lオーダーであることを特徴とする、請求項１９、２０および２２〜２７の一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記配列が配列番号６または配列番号１０であり、該スクロース濃度が１００g/lオーダーであることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
該デキストランスクラーゼが遊離形態であるか、あるいは吸着、封入または共有結合により支持体に固定されていることを特徴とする、請求項１９〜２９の一項に記載の方法。
【請求項３１】
ｐＨが３．０〜１０．０、好ましくは４．５〜６．０の範囲にあり、より好ましくは約５．２であることを特徴とする、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
非ニュートン性挙動を有する、請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得ることができるデキストラン。
【請求項３３】
請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法により得ることができるイソマルト−オリゴ糖。
【請求項３４】
請求項１２もしくは請求項１３記載のデキストランスクラーゼの介在により得られる、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られる、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られるデキストランまたはＩＭＯ、または請求項３２記載のデキストラン、または請求項３３記載のイソマルト−オリゴ糖を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項１２もしくは請求項１３記載のデキストランスクラーゼの介在により得られる、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られる、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られるデキストランまたはＩＭＯ、または請求項３２記載のデキストラン、または請求項３３記載のイソマルト−オリゴ糖、および医薬的にもしくは栄養学的に許容され得るビヒクルを含む、医薬組成物または食品組成物。
【請求項３６】
請求項１２もしくは請求項１３に記載のデキストランスクラーゼの介在により得られる、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られる、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られる、少なくとも１つのデキストランを含むことを特徴とする、テクスチャー組成物。
【請求項３７】
（ｉ）イソマルトース（３４２Da）、（ｉｉ）３４２〜５０００Daのイソマルト−オリゴ糖、（ｉｉｉ）サイズが１３００〜５２０００Daに制御され、中間がおよそ１０００００Daであるデキストラン、（ｉｖ）サイズが７０００〜１．７×１０５Daに制御され、中間がおよそ４００００Daであるデキストラン、および（ｖ）２×１０６Daの高モル質量であるデキストラン、または請求項１９〜３１の一項に記載の方法により得られるデキストランもしくはＩＭＯを製造する方法における、請求項１２もしくは請求項１３記載の、または請求項１７もしくは請求項１８の方法により得られるデキストランスクラーゼの使用。
【請求項３８】
テクスチャー剤としての、請求項３２記載のデキストランの使用。
【請求項３９】
プレバイオティクスとしての請求項３２または請求項３３記載のデキストランまたはＩＭＯ、特にサイズが１３００〜５２０００Daに制御され、中間がおよそ１００００Daであるデキストランの使用。
【請求項４０】
配列番号６〜１０または２２〜２６のいずれか１つの連続的アミノ酸配列から本質的になるタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５２５７４５（Ｐ２００９−５２５７４５Ａ）
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５３８５５（Ｐ２００８−５５３８５５）
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００９５１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９１１７８
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０１４５５３０１）インスティチュート・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシェ・アグロノミック (2)
【出願人】（５０８２４２０６７）アンスティテュ・ナショナル・デ・シヤンス・アプリケ・ドゥ・トゥールーズ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＡＰＰＬＩＱＵＥＥＳ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００９５１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９１１７８
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０１４５５３０１）インスティチュート・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシェ・アグロノミック (2)
【出願人】（５０８２４２０６７）アンスティテュ・ナショナル・デ・シヤンス・アプリケ・ドゥ・トゥールーズ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＡＰＰＬＩＱＵＥＥＳ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ
【Ｆターム（参考）】
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