骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に関連する増殖性疾患の治療および診断のためのＳＡＬＬ４の標的化
本発明は、ジンクフィンガー型転写因子であるＳＡＬＬ４（アイソフォームＳＡＬＬ４Ａ、ＳＡＬＬ４Ｂ、およびＳＡＬＬ４Ｃを含む）の核酸、タンパク質、および抗体を開示する。さらに、ＳＡＬＬ４の構成的発現がモデル動物系の細胞における白血病誘発の可能性を増加させることを実証する方法を開示する。さらに、トランスジェニックマウスにおける選定アイソフォーム（例、ＳＡＬＬ４Ｂ）の構成的発現は、これらの動物が、移植可能な続発性の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）のような兆候および症状を発現することを実証する。また本開示は、白血病幹細胞を含む、胚幹細胞、成体幹細胞、癌幹細胞を識別し精製するための方法と、ＳＡＬＬ４に結合する、および／またはＳＡＬＬ４を調整する物質を識別するための方法と、被検体においてＭＤＳを診断するための方法と、ＭＤＳを示す被検体を治療する方法とを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、概して、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路に関連する因子に関連し、さらに具体的には、ＳＡＬＬタンパク質ファミリーおよびＯＣＴ４を含む、その経路の転写構成要素間の相互作用に関連し、それらはそのような相互作用の標的化により増殖性疾患を診断および治療する方法を含む、胚細胞および癌幹細胞の調整に関する。
【０００２】
本発明は、一部において政府の支援により、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた許可番号第Ｋ０８ＣＡ０９７１８５号に基づいて作成された。当政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来するＥＳ細胞は、自己複製細胞分裂を行いそれらの多分化能を不定の期間維持することが可能である。ＥＳ細胞はまた、体外培養される時に様々な異なる細胞タイプへ分化することも出来る。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路は、正常なヒト幹細胞（ＨＳＣ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）の自己複製に関連している。さらに、転写因子ＯＣＴ４は着床前発生においてＩＣＭの形成のための主要調節因子として同定される。さらには、ＯＣＴ４タンパク質は多様な遺伝子を調整することによって胚性幹（ＥＳ）細胞の多分化能の維持において中心的な役割を行っているようである。
【０００４】
幹細胞の役割は、癌の病因において考えられてきた。腫瘍がそのような癌幹細胞、すなわち、腫瘍の成長の原因となるまれな細胞を含む可能性があるという証拠が増えつつある。これらの無限増殖能を伴うまれな細胞は、従来の治療方法に対応する、癌細胞に見られる抵抗力の原因である可能性がある。幹細胞が、そのような細胞が、例えば造血性細胞等の特定の組織から生じる生体組織で同定されることは既知である。幹細胞自己複製特性は正常な器官形成でしっかりと制御されるため、自己複製の脱制御は発ガンをもたらす可能性がある。
【０００５】
例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、汎血球減少症、多分化機能障害、および骨髄アポトーシスを引き起こす、造血幹細胞（ＨＳＣ）レベルでのゲノム異常の蓄積を特徴とする血液病である。
【０００６】
本疾病による死亡は、汎血球減少症または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）への変換を原因とする。ＡＭＬは、骨髄および末梢血においての未熟骨髄系前駆細胞の蓄積を特徴とする血液癌である。
【０００７】
ＡＭＬ患者からの骨髄サンプルでの遺伝的転座の分析からは、造血にとって重要である転写因子が、白血病誘発において重要な役割を果たすことが明らかである。ＡＭＬの病因は多段階遺伝子変化に関与すると考えられる。ＨＳＣのみが自己複製の能力を有すると考えられるため、それらが多段階性、前白血病遺伝子変化の蓄積および、それらをいわゆる「白血病幹細胞」（ＬＳＣ）へ変換させる最良候補である。
【０００８】
また、下流前駆細胞は自己複製能力を得て、白血病を引き起こす可能性がある。ＬＳＣは特に現在の化学療法レジメンによっては標的化されないが、そのような細胞は薬物耐性および白血病再発の原因であることが発見されている。
【０００９】
ＳＡＬＬ遺伝子ファミリー、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ２、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４は、本来、ショウジョウバエｓｐａｌｔ（ｓａｌ）に対してそれらのＤＮＡ配列相同性に基づいてクローン化された。ショウジョウバエにおいて、ｓｐａｌｔは後頭部および前尾部の断片の発達に必要不可欠であるホメオティック遺伝子である。それは、気管の発生、光受容体の最終分化、および翅脈の配置において重要な役割を果たす。ヒトにおいて、ＳＡＬＬ遺伝子ファミリーは腫瘍形成のみならず正常な発達にも関連する。ＳＡＬＬタンパク質は、全タンパク質に分布されたマルチフィンガー領域を特徴とするＣ２Ｈ２ジンクフィンガー転写因子の群に属する。ショウジョウバエの気管発生の間、ｓｐａｌｔはウィングレスの活性下流標的、Ｗｎｔオーソログである。ＳＡＬＬ１は、コアクチベーターとして機能し、ＳＡＬＬとＷｎｔ／βカテニン経路間の相互作用は両方向性であることを示唆することにより、βカテニンと相互作用することが実証されてきた。
【発明の開示】
【００１０】
発明の開示
本発明は、発達に不可欠なジンクフィンガー型転写因子である、ＳＡＬＬ４、ショウジョウバエｓｐａｌｔへのヒトホモログに関連する。ＳＡＬＬ４およびそのアイソフォーム（ＳＡＬＬ４Ａ、ＳＡＬＬ４Ｂ、およびＳＡＬＬ４Ｃ）は、クローン化され配列決定される。本開示は、ＳＡＬＬ４がヒト原発性ＡＭＬにおいて遮断（ｔｕｒｎ ｏｆｆ）されることが出来なかったことを実証する。さらに、マウスモデルにおいて、ＳＡＬＬ４の構成的発現の白血病誘発可能性が実証される。さらに、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）のような兆候と症状および続発性可移植ＡＭＬを発症するＳＡＬＬ４Ｂ−トランスジェニックマウスを開示する。
【００１１】
髄鞘形成に関連するアポトーシスの増加は、トランスジェニックマウスの骨髄、およびコロニー形成（ＣＦＵ）分析において明らかである。両アイソフォームは、βカテニンに結合することが可能であり、相乗的にＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路を強化することが可能である。これはＳＡＬＬ４の構成的発現がＭＤＳ／ＡＭＬを引き起こすこと、およびそのような発現がＷｎｔ／βカテニン経路に影響を与えることを実証する。関連する態様では、開示されるマウスモデルは、ヒトＭＤＳ／ＡＭＬ変換と白血病幹細胞の病因におけるＷｎｔ／βカテニン経路の役割を調査するプラットフォームを提供する。
【００１２】
一実施形態では、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合される抗体または抗体フラグメントを開示する。
【００１３】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が開示され、該方法は、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体の治療的に有効な量を被検体に投与する段階を含む。
【００１４】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が示され、該方法は、配列番号：１に示される配列、配列番号：３に示される配列、配列番号：５に示される配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、配列番号：５の相補体、およびそれらのフラグメントを有するポリヌクレオチドの組成物を被検体へ投与する段階を含み、前記フラグメントは、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１５】
一実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が開示され、該方法は、配列番号：２、配列番号：４および／または配列番号：６に示される配列を有するポリペプチド組成物を被検体へ投与する段階を含む。
【００１６】
関連する態様では、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００１７】
一実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法が開示され、該方法は、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、その生体サンプルに、ハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１に示される配列、配列番号：３に示される配列、配列番号：５に示される配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、または配列番号：５の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブを接触させる段階と、プローブと生体サンプルのハイブリダイゼーションを検出する段階とを含み、ハイブリダイゼーションの検出はＭＤＳに相関する。
【００１８】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法が開示され、該方法は、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、生体サンプルを配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、サンプルへの抗体の結合を検出する段階とを含み、検出結合はＭＤＳに相関する。
【００１９】
一実施形態では、白血病幹細胞を単離する方法が示され、該方法は、被検体からの細胞のサンプルを採取する段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞をそのアミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞のサンプルから、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞選び出す段階とを含む。
【００２０】
他の実施形態では、ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を有する遺伝子導入動物が示され、動物は配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を発現するように改変される。関連する態様では、動物はその挿入されたＳＡＬＬ４遺伝子を構成的に発現する。
【００２１】
一実施形態では、ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を含む遺伝子導入動物を作成する方法が開示され、該動物は、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を構成的に発現するように改変され、該方法は、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコンストラクトを含む核酸分子を胚細胞へ導入する段階と、コンストラクトの導入の段階から生じる細胞から遺伝子導入動物を作成する段階と、遺伝子導入動物を繁殖してヒトＳＡＬＬ４遺伝子の遺伝子導入動物の同型接合体を得る段階と、遺伝子導入動物由来の組織からヒトＳＡＬＬ４転写物を検出する段階とを含む。
【００２２】
一実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの細胞発現を調整する方法が開示され、該方法は、ポリヌクレオチドへハイブリッドする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはポリヌクレオチドへハイブリッドするアンチセンスＲＮＡ、またはそれらのフラグメントを細胞へ導入する段階を含む。
【００２３】
一実施形態では、内細胞塊（ＩＣＭ）、腫瘍性組織、または腫瘍から単離された細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現するかどうかを判断する段階とを含む、潜在的多能性を有する細胞を同定する方法が開示され、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現の判断は、細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が多分化能を示す。
【００２４】
一形態において、そのＳＡＬＬファミリーメンバーはＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４を含む。関連する態様では、ＳＡＬＬ４はＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである。
【００２５】
他の態様では、薬剤はＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質またはＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である。関連する態様では、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質配列は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４を含む。その他の関連する態様では、核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５；配列番号：２１、および配列番号：２３を含む核酸配列のセンス鎖に相補的である。
【００２６】
一形態において、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、成体幹細胞、または癌幹細胞である。関連する態様では、組織は被検体からの血漿サンプルまたは生検サンプルである。さらに関連する態様では、被検体はヒトである。
【００２７】
一実施形態では、ＯＣＴ４発現に対するＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の影響を調整する薬剤を識別する方法が開示され、該方法は、機能的に連結されたＯＣＴ４プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーターレポーターコンストラクトを含むベクターと、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードする核酸を含むベクターとを細胞へ同時導入する段階、細胞を薬剤に接触させる段階、ならびに薬剤の存在および非存在におけるプロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階を含み、プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階はＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質／ＯＣＴ４相互作用に対する薬剤の影響に相関する。
【００２８】
関連する態様では、プロモーター領域は配列番号：２６に示される核酸配列を含み、発現レポータータンパク質はルシフェラーゼである。
【００２９】
他の実施形態では、被検体の細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現されるかどうかを判断する段階とを含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を診断する方法が開示され、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現の判断は、細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が腫瘍形成または増殖を示す。
【００３０】
一形態において、薬剤は標識化され、判断する段階は、薬剤の位置を画像化する装置に被検体をさらすことによる薬剤の検出を含む。関連する態様では、画像は磁気共鳴、Ｘ線、または放射性核種放出によって作成される。
【００３１】
一実施形態では、ＳＡＬＬ４の発現を抑制する薬剤を含む医薬組成物を被検体へ投与する段階を含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患の治療方法が開示され、ここで被検体の細胞は、自己複製の脱制御を示す。
【００３２】
他の実施形態では、薬剤−細胞相互作用および薬剤の標識化に十分な状態を提供するための１つ以上のＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質と、試薬および緩衝剤を検出するための薬剤と、検出試薬の標識化および薬剤の細胞への接触についての説明書と、構成要素を含む容器とを含む、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキットが開示される。
【００３３】
細胞を、ＳＡＬＬ４に対する抗体に接触させる段階と、抗体に接合された細胞を、流体および細胞の進入および放出のための少なくとも２つの開口部を備える表面境界キャビティへ適用する段階と、細胞および流体がキャビティを通過することを可能にする段階とを含む、増殖性疾患または腫瘍性細胞形成の進行に関連する細胞を検出する方法が開示され、混合流体における抗体結合細胞は光学検出器によって検出され、電圧は流体に加えられ、それによって、その電圧が１つ以上のコレクタにおいて結合細胞を類別する。
【００３４】
本発明の例示的な方法および組成物は、以下にさらに詳しく説明される。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明の組成、方法および培養方法の説明に先立って、本発明は特定の組成、方法、および実験方法に限定されず、そのような組成、方法および状態は変化してもよいことを理解されたい。また本願において使用される専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲でのみで限定されるため、限定することを意図しないということも理解されたい。
【００３６】
本願および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「１つの」および「その」は、その文脈が明記しない限り、複数照応的指示を含む。つまり、例えば、「核酸」の言及は、１つ以上の核酸、および／または本開示などを読む際に、当業者には明らかである、本願に記載の種類の組成物を含む。
【００３７】
別途定めのない限り、本願で使用される全ての技術用語および専門用語は、本発明の属する技術分野において通常の技術を有する者にはよく知られているような意味を有する。本願に説明されるものと類似のまたは同じである全ての方法および物質は、本発明の実施または試験において使用されるが、修正および変更が本開示の趣旨と範囲内に含まれるということが理解されるだろう。本願に記載されるすべての刊行物はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００３８】
ホメオボックスおよびホメオティック遺伝子は正常な発達において重要な役割を果たす。ホックスやパックスのような、一部のホメオボックス遺伝子は腫瘍遺伝子としてまたは腫瘍形成または白血病誘発における腫瘍抑制因子としても機能する。ＳＡＬＬ４、ホメオティック遺伝子および転写因子の重要な役割が、異形接合ＳＡＬＬ４変異がデュアン放射線症候群を引き起こすことにより、ヒトの発達において認められた。関連する態様では、白血病誘発におけるＳＡＬＬ４の発癌性の役割が本願で説明される。
【００３９】
一実施形態では、本開示は２つのＳＡＬＬ４アイソフォーム、ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂを識別する。関連する態様では、本開示は、ＳＡＬＬ４の核酸およびタンパク質の構成的発現に関連する血液悪性腫瘍およびその他の腫瘍等の増殖障害を有する患者を診断および治療するための手段としてのＳＡＬＬ４の核酸およびタンパク質の分析を提供する。関連する態様では、ＳＡＬＬ４は、癌の診断および治療のための悪性幹細胞マーカーをして機能する。
【００４０】
例えば、正常な造血中に、ＳＡＬＬ４アイソフォームはＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣ集団において発現され、正常なヒトの骨髄および末梢血において急速に遮断（ＳＡＬＬ４Ｂ）または下方制御される（ＳＡＬＬ４Ａ）。その一方、ＳＡＬＬ４は検査されたすべてのＡＭＬサンプル（Ｎ＝８１）においては構成的に発現され、ヒト原発性ＡＭＬおよび骨髄性白血病細胞株においては停止することが出来なかった。関連する態様では、体内でのＳＡＬＬ４の構成的発現の白血病誘発可能性がＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスの作製を通じて直接検査された。そのようなトランスジェニックマウスは、ヒトＭＤＳに酷似した、調節不全な造血を示し、移植可能なＡＭＬを示した。これらのＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳのような特性は、協同突然変異を必要とせず、早くて２ヶ月齢で見られる。これらのマウスで見られた無効造血は、ヒトＭＤＳにおいてのように、骨髄において顕著であるアポトーシスの増加に高い確率で続発する、過形成骨髄および奇異性末梢血血球減少（好中球減少および貧血）および形成不全症を特徴とする。学説にとらわれないが、これらのトランスジェニックマウスにおける白血病発達の遅い発現の理由は?８ヶ月の複製ストレスの間の追加的な遺伝子損傷の蓄積であるかもしれない。疾患の後期発症はＳＡＬＬ４導入ゲノム不安定性の結果でもあるかもしれない。
【００４１】
さらに、特定の、再発性の染色体転座は多くの白血病を特徴付け、それらは免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体の遺伝子伝子再配列の正常過程における分解に起因するが、正常な染色体内再配列よりも染色体内転座を引き起こす。染色体転座切断点でのタンパク質への遺伝子からの遺伝子情報の流れは、治療用薬剤が抑制することの出来るいくつかの点を有する。ジンクフィンガー結合タンパク質領域を有効利用する配列特異的結合因子は、異常遺伝子の融合産物の発現を停止させる染色体融合結合を標的化することの出来る遺伝子スイッチとして作用する、デノボ配列特異的結合因子を作り出すために使用されることが出来る。
【００４２】
一実施形態では、ＳＡＬＬ４は、遺伝子融合産物の発現を調節する遺伝子スイッチとして染色体融合結合を標的化する融合タンパク質構成として使用されることが出来る。組み換え融合タンパク質の生成は問う技術分野で既知である（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照）。
【００４３】
一実施形態では、ＳＡＬＬ４のタンパク質および／または核酸は、リンパ腫の亜集団および白血病またはその他のタイプの癌を診断するために検出される。他の実施形態では、ＳＡＬＬ４のタンパク質および核酸の検出は、増殖性疾患を発達させる／得る危険性のあるヒト被検体を含むがそれらに限定されない被検体を識別するために使用されることが出来る。
【００４４】
さらなる実施形態では、ＳＡＬＬ４のタンパク質レベルおよび核酸レベルを変化させる組成を識別する方法が開示される。関連する態様では、ＳＡＬＬ４は、ＳＡＬＬ４の阻害機能が、腫瘍の発達と進行を抑制する、治療標的として機能することが出来る。
【００４５】
他の態様では、白血病誘発へ関与するＳＡＬＬ４の潜在的機序の検査は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方が、ＨＳＣの自己複製を含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路に不可欠な構成要素であるβカテニンと相互作用することを示す。さらに、両方ともが、ショウジョウバエおよびヒトにおけるＳＡＬＬファミリー機能に一致するレポーター遺伝子アッセイでのＷｎｔ／βカテニン経路を活性化することが出来る。さらには、βカテニンの状況と同様に、ＣＭＬにおけるＳＡＬＬ４発現は疾患の様々な段階で変化し、慢性期にないＳＡＬＬ４発現は未熟な芽球の加速期でのみ検出可能になり、芽球期において強く陽性である。
【００４６】
これらの研究に基づいて、作業仮説が開示される（例、図４ｄ参照）。学説にとらわれないが、ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４の構成的発現は、白血病性芽球に自己複製および／または脱分化等の幹細胞特性を得ることが出来るようにさせることが出来、こうして、ＬＳＣになることが出来る。本仮説モデルはβカテニンの場合に見られるものに匹敵するであろう。例えば、正常な骨髄造血において、βカテニンは、自己複製特性を示すＨＳＣにおいてのみ活性化される。ＣＭＬの芽球期において、βカテニンは、ＧＭＰにおいて活性化されることによって機能し、白血病性形質転換をもたらす。
【００４７】
他の態様では、癌遺伝子ＳＡＬＬ４は、正常な造血および白血病誘発において重要な役割を果たす。ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスはＭＤＳのような、移植可能である、続発性のＡＭＬ変換を伴う表現型を示す。ヒトＭＤＳの研究に利用可能な動物モデルは、現在ほとんどない。本願に説明される方法によって作成されたＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスは、モデルヒトＭＤＳおよびそのＡＭＬへの続発性の変換の理解と治療のための適した動物を提供する。ＳＡＬＬ４とＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の相互作用は、白血病誘発におけるＳＡＬＬ４の関与のもっともらしいメカニズムを提供するのみだけでなく、ＣＭＬ芽球化転換におけるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の活性化の理解を提供する。
【００４８】
本願に開示されるように、すべてのヒトＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４アイソフォームの識別とそれらの構成的発現が検査された。ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４発現の直接の影響が生体内で検査された。本開示は、マウスにおけるＳＡＬＬ４の構成的発現が、ＭＤＳのような症状や移植可能なＡＭＬへの変換を誘発するのに十分であることを実証する。本開示は、さらにＳＡＬＬ４はβカテニンを結合しＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路を活性化することが出来ることを実証する。ＳＡＬＬ４およびβカテニンは、ＣＭＬの様々な段階において類似の発現パターンを共有する。
【００４９】
一実施形態では、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＯ４４９５０）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＯ１６５６６）、または配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＯ１６５６７）に示されるアミノ酸配列をコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチドが提供される。関連する態様では、そのような配列は、配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹｌ７２７３８）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１７０６２１）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１７０６２２）、またはそれらの補体に示される核酸配列を含む。もう１つの関連する態様においても、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターが開示され、それらは、ホスト細胞においてポリヌクレオチドの発現を導く調節配列に操作可能に関連する発現ベクターを含むが、それらに限定されるものではない。
【００５０】
他の実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。一形態において、そのようなポリペプチドを投与する段階を含む、個々における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が提供される。他の態様では、そのようなポリペプチドに結合する抗体またはそれらの結合フラグメントも開示される。
【００５１】
開示される方法に使用される抗体は、ＳＡＬＬ４または、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるそれらのアイソフォームを含むポリペプチドを特異的に結合する抗体を含む。一形態においては、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のフラグメントが使用されそのような抗体を生成する。関連する態様では、そのようなフラグメントは配列番号：１３から基本的に構成される。
【００５２】
一実施形態では、潜在的多能性を有する細胞を識別する方法が開示され、該方法は内細胞塊（ＩＣＭ）から単離された細胞、腫瘍性組織からの細胞、または腫瘍からの細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現するかどうかを判断する段階とを含み、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を判断する段階は、細胞における自己複製の誘導に正に相関し、それによって、そのような発現は多分化能を示す。
【００５３】
一形態において、ＳＡＬＬファミリーメンバーはＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４を含む。関連する態様では、ＳＡＬＬ４はＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである。
【００５４】
他の態様では、薬剤はＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質に対するまたはＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である。関連する態様では、そのＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質配列は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４を含む。もう１つの関連する態様において、核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：２１および配列番号：２３を含む核酸配列のセンス鎖に相補的である。
【００５５】
一形態において、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、または胚性癌腫（ＥＣ）細胞、成体幹細胞、癌幹細胞である。関連する態様では、その組織は被検体からの血漿サンプルまたは生検サンプルである。さらなる関連する態様では、被験者はヒトである。
【００５６】
本願に使用される、「潜在的多能性」とは有糸分裂によって自己複製する細胞の能力を意味する。
【００５７】
本願に使用される「正に相関する」とは、認められた現象に肯定的に関連することを意味する。例えば、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ導入は細胞の自己複製力の増大に関連する。
【００５８】
本願に使用される、「新生物」とは、その文法的な変化を含むが、良性または癌性であるかもしれない組織の新しい異常な成長を意味する。
【００５９】
本願に使用される、「基本的に構成される」とは特異的な分子実体（例えば、特異的な配列識別子などを含むがそれらに限定されない）および、特異的な分子実体に関連する特性に物質的には影響しないその他の分子実体を含む。例えば、配列番号：１３を含む融合タンパク質およびアジュバントは、配列番号：２、配列番号：４、および／または配列番号：６に対する免疫原性反応を生成するため、配列番号：１３から基本的に構成される。
【００６０】
抗体は当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，３９１，５８９号で論じられる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント抗体、Ｆ（ａｂ’）フラグメント抗体、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗イディオ抗体などを含む）、および上記すべてのエピトープ結合フラグメントを含むが、それらに限定されるものではない。本願に使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含む分子を示す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の全てのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであることが出来る。
【００６１】
本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド架橋Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）および、ＶＬまたはＶＨ領域のいずれかを含むフラグメントを含む、抗体フラグメントを含むが、それらに限定されるものではない。抗原結合抗体フラグメントは、一本鎖抗体を含むが、可変領域単独または以下のもの、ヒンジ領域、ＣＨｌ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の全体もしくは一部との組合せであることが出来る。また、本発明において、ヒンジ領域、ＣＨｌ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域との可変領域の組合せを含む、抗原結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳類を含むいかなる動物起源であってもよい。一形態において、抗体はヒト抗体、マウス抗体（例えば、マウスおよびラットなど）、ロバ抗体、羊抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、テンジクネズミ抗体、ラクダ抗体、ウマ、または鶏である。さらに、そのような抗体は、動物抗体のヒト化型である（例、米国特許第６，９４９，２４５号などを参照）。本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多特異性である。
【００６２】
本発明の抗体は、当技術分野において既知であるすべての適切な方法によって生成されることができる。関心の抗原に対するポリクローナル抗体は当技術分野において既知の様々な過程によって生成されることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、それらに限定されず、様々なホスト動物に投与され、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生成させる。ホスト動物種によって、免疫反応を高めるための様々なアジュバントが使用され、それらは、フロインド（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールならびに、ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）またはコリネバクテリウムパルブムのような潜在的に役立つヒトアジュバントを含むが、それらに限定されない。そのようなアジュバントも当技術分野において既知である。さらに、抗体およびタンパク質を結合する抗体のようなものはファージ提示法によって作られる（例、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｐｅｔｒｅｎｋｏ、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ（１９９７）９７（２）：３９１−４１０などを参照）。
【００６３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、ならびにファージ提示技術、またはそれらの組合せを使用することを含む、当技術分野において既知の様々な技術を使用して、調合されることが出来る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ＣｅＩｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）（参考文献は、参照によって全体が組み入れられる）に教示の方法を含む、ハイブリドーマ技術を用いて生成されることが出来る。本願に使用される「モノクローナル抗体」という用語はハイブリドーマ技術を通じて生成される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」は単一クローンから起因する抗体を示し、全ての真核性、原核生物、またはファージクローンを含み、それが生成される方法を含まない。
【００６４】
一実施形態では、そのような抗体を用いての白血病幹細胞を単離する方法が提供され、該方法は、被検体から細胞のサンプルを得る段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を発現する細胞を、そのアミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を発現する細胞のサンプルから、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞を選び出す段階とを含む。関連する態様では、選別の段階は、蛍光励起細胞選別および／または磁性粒子選別による選別を含む。
【００６５】
他の関連する態様では、マーカーはＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＭＰＯ、および／または非特異的エステラーゼである。さらなる関連態様では、白血病幹細胞はＢ細胞（Ｂ２２０およびＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ５）、巨核球（ＣＤ４１）、および赤血球（Ｔｅｒ１１９）マーカーに対して陰性である。
【００６６】
一実施形態では、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキットが開示され、そのキットは１つ以上のＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質マーカーを検出する薬剤、薬剤細胞相互作用および薬剤の標識化のための十分な状態を提供する試薬および緩衝剤、検出薬剤の標識化と薬剤の細胞への接触のための説明書、および構成要素を含む容器を含む。
【００６７】
該開示の方法により、細胞集団から、配列番号：１３を含むマーカーの発現に陽性である細胞から、そうでない細胞を最初に選別することによって幹細胞を識別する。その後、関心幹細胞を陽性マーカーの細胞から選択し、これは既知の細胞マーカーの発現で細胞を選別することにより実行される。関心幹細胞に関連することで知られるすべてのマーカーを使用することが出来る。
【００６８】
幹細胞が発見される疑いのあるすべての細胞集団は、開示される方法によって選別されることが出来る。一形態において、細胞は非胎児動物の骨髄から得られ、それらはヒト細胞を含むがそれらに限定されるものではない。胎児細胞も使用することができる。
【００６９】
細胞選別は、蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｂａｕｍｇａｒｔｈ ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４３：７７−９７などを参照）および磁性粒子細胞選別（ＭＡＣＳ）による選別を含む、当技術分野において既知の細胞を選別するためのいかなる方法によるものであることが出来る。従来のＭＡＣＳの過程はＭｉｌｔｅｎｙｉら、「Ｈｉｇｈ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＡＣＳ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１１：２３１−２３８（１９９０）によって説明される。ＭＡＣＳによって細胞を選別するには、細胞を磁性粒子で標識化し、その細胞常磁性分離柱から通過させる。分離柱は協力永久磁石で配置され、柱内に磁場を作り出す。磁気的に標識化された細胞は、柱に捕捉され、そうでない細胞は、通過する。その後、捕捉細胞を柱から溶出する。一実施形態では、ＳＡＬＬ４に対して誘導される抗体が胚幹細胞、成体幹細胞および／または癌幹細胞を単離する細胞選別において使用される。他の実施形態では、ＳＡＬＬ４に対して誘導される抗体はフローサイトメトリー分析で使用され、ＳＡＬＬ４を発現する細胞を検出し、そのような細胞は、増殖性疾患の進行または腫瘍性細胞形成に関連する。関連する態様では、ＳＡＬＬ４はＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである。
【００７０】
一実施形態では、生体サンプルにおいて配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの有無を検出する方法が開示され、該方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、生体サンプルに配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５に示される配列、または配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブを接触させる段階と、ハイブリダイゼーションがポリヌクレオチドの存在を示す、プローブとサンプルのハイブリダイゼーションを検出する段階とを含むがそれらに限定されるものではない。
【００７１】
他の実施形態では、生体サンプルに存在する、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法が開示され、該方法は、ポリペプチドに結合する抗体を提供する段階と、生体サンプルを抗体に接触させる段階と、結合がポリペプチドの存在を示す、抗体の生体サンプルへの結合を判断する段階とを含むが、それらに限定されるものではない。
【００７２】
一実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療方法が説明され、該方法は、配列番号：１に示される核酸配列、配列番号：３に示される核酸配列、配列番号：５に示される核酸配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、配列番号：５の相補体、またはそれらのフラグメントを有するポリヌクレオチドを、被検体へ投与する段階を含み、前記フラグメントは、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。関連する態様では、該方法は配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に示されるポリヌクレオチドを投与する段階を含む。一形態において、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００７３】
一実施形態では、ＯＣＴ４発現に対するＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の影響を調節する薬剤を識別する方法が開示され、該方法は、操作可能に連結されたＯＣＴ４プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーターレポーターコンストラクトを含むベクターと、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質コードする核酸を含むベクターとを、細胞に同時導入する段階と、細胞に薬剤を接触させる段階と、薬剤の存在および非存在におけるプロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階とを含み、プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階は、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質／ＯＣＴ４相互作用に対する薬剤の影響に相関する。
【００７４】
関連する態様では、プロモーター領域は、配列番号：２６を含む核酸配列を含むが、それらに限定されず、発現レポータータンパク質はルシフェラーゼである。
【００７５】
他の実施形態では、ＳＡＬＬ４の発現を抑制する薬剤を含む医薬組成物を、被検体へ投与する段階を含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を治療する方法が開示され、被検体の細胞は自己複製の脱制御を示す。
【００７６】
他の実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する物質を識別する方法が提供され、該方法は、ポリペプチドを候補物質に接触させる段階とポリペプチドへの物質の結合を検出する段階とを含む。
【００７７】
一実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能を調節する物質を識別する方法が開示され、該方法は、ポリペプチドを候補物質に接触させる段階とポリペプチドの活性を判断する段階とを含み、その候補物質の存在下での活性における変化は、物質がポリペプチドの機能を調節していることを示す。
【００７８】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法が開示され、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、生体サンプルをハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１に示されるポリヌクレオチド配列、配列番号：３に示されるポリヌクレオチド配列、配列番号：５に示されるポリヌクレオチド配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、または配列番号：５の相補体のうちの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するプローブに接触させる段階と、ハイブリダイゼーションを検出する段階がＭＤＳと相関する、プローブと生体サンプル間のハイブリダイゼーションを検出する段階とを含むが、それらに限定されない。一形態において、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００７９】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法が開示され、該方法は、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、生体サンプルを配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、検出結合がＭＤＳに相関する、サンプルへの抗体の結合を検出する段階とを含むが、それらに限定されない。一形態において、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００８０】
一実施形態では、被検体の細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤へ接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現されるかどうかを判断する段階とを含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を診断する方法が開示され、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現の判断は、細胞においての自己複製の誘発と正に相関し、それによって、そのような発現が腫瘍の形成または増殖を示す。
【００８１】
一形態において、薬剤は標識化され、判断段階は、薬剤の位置を画像化する装置に被検体をさらすことによる検出を含む。関連する態様では、画像は磁気共鳴、またはＸ線、または放射性核種放出によって生成される。
【００８２】
一実施形態では、急性原発性骨髄性白血病細胞に構成的に発現されるジンクフィンガー型転写因子をコードするポリヌクレオチドの細胞発現を調節する方法を含み、該方法は、ポリヌクレオチドへハイブリッドする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはポリヌクレオチドへハイブリッドするアンチセンスＲＮＡ、またはそれらのフラグメントを細胞へ導入する段階を含む。関連する態様では、調節は下方制御である。
【００８３】
一実施形態では、遺伝子導入動物が開示される。一般的な態様において、遺伝子導入動物は、その導入遺伝子の発現を許可する方法で外来遺伝子を導入することにより作成される。遺伝子導入動物の作成の方法は、概して、ＷａｇｎｅｒとＨｏｐｐｅ（参照として本願に取り込まれる米国特許第４，８７３，１９１号）、全体が参照として本願に組み入れられる、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８５）、および全体が参照として本願に組み入れられる「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、（ｅｄｓ．，Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｍｉ ａｎｄ Ｌｏｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））で説明される。
【００８４】
一般的に、遺伝子はマイクロインジェクションによって受精卵へ移入される。微量注入された卵は、ホストの雌へ移植され、その子孫は、導入遺伝子の発現を検査される。遺伝子導入動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、魚類を含むが、それらに限定されない多くの動物からの受精卵から作成されてもよい。
【００８５】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは当技術分野で既知のすべての方法によって作成することが出来る。例えば、マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは細菌プラスミドの配列を除去するのに適した酵素、およびＴＢＥ緩衝剤で１％アガロースゲルで電気泳動させられたＤＮＡのフラグメントで、標準技術を用いて分割することができる。ＤＮＡバンドはエチジウムブロマイドで染色することによって可視化され、発現配列を含むバンドが除去される。除去されたバンドは、その後０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を有する透析袋に置かれる。ＤＮＡは透析袋へ電気溶出され、１：１のフェノール：クロロフォルム溶液で抽出され、２ボリュームのエタノールによって沈殿される。ＤＮＡは１ｍｌの低塩緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）で再び溶かされ、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（商標）カラムで精製される。カラムは、最初に３ｍｌの高塩緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）で感作され、続いて５ｍｌの低塩緩衝液で洗浄される。ＤＮＡ溶液はカラムを３回通過し、ＤＮＡをカラム担体へ結合する。３ｍｌの低塩緩衝液で１回洗浄した後、ＤＮＡは０．４ｍｌの高塩緩衝液で溶出され、２ボリュームのエタノールによって沈殿される。ＤＮＡ濃度は紫外分光光度計において２６０ｎｍでの吸収によって測定される。
【００８６】
本発明はさらに、少なくとも１つの、その有効量で疾患を治療することの出来る組成物と、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の組成物は、記載の通りのその他の治療薬を含むことができ、例えば、従来の個体または液体の賦形剤もしくは希釈剤を採用することにより、製剤処方の技術において既知である技術に従って、望ましい投与のモードへ適した種類の医薬品添加物（例えば、添加剤、結合剤、保存料、安定剤、香料など）に加えて、採用することにより処方されてもよい。
【００８７】
発明の製造品の組成物として採用される医薬組成物は、個体、溶液、乳剤、分散、ミセル、リポソームおよび同様のものなどの形態で使用されることができ、結果の組成物は、腸内または非経口の使用に適した有機または無機のキャリアもしくは添加剤の混合剤で、活性材料としての上記の組成物を１つ以上含む。発明の製造品の組成物として使用されるために採用される組成物は、例えば、通常の非毒性で、薬学的に許容される、タブレット、ペレット、カプセル、坐薬、溶液、乳剤、懸濁液、およびその他の使用に適した形態のためのキャリアと組み合わせられてもよい。使用されるキャリアは、グルコース、ラクト−ス、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および製造調合剤の使用に適したその他のキャリアを個体、半個体、または液体の形態で含む。さらに、補助剤、安定剤、濃厚剤、そして着色剤と香料が使用されてもよい。
【００８８】
発明医薬組成物は、例えば、タブレット、カプセル、顆粒または粉などの形態での経口投与、舌下投与、口腔投与、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、嚢内注射もしくは注入技術などによる非経口投与（例えば、無菌注射剤の水性または非水性の溶液もしくは懸濁液として）、吸入噴霧などによる経鼻投与、クリームまたは軟膏などの形態での局所的投与、または坐薬などの形態での経直腸的投与により、非毒性の、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む投与量ユニット形態ですべての適切な方法によって投与されることが出来る。本組成物は、例えば、短時間作用型または持続放出型に適した形態で投与されることが出来る。短時間作用型または持続放出型は、本組成物を含む適した医薬組成物の使用によって、または、特に持続放出型の場合は、皮下移植または浸透圧ポンプなどの装置を使用することにより、達成されることが出来る。本組成物はリポソームで投与されることも出来る。
【００８９】
霊長類に加えて、ヒトなど、様々なその他の哺乳類が本発明の方法によって治療されることができる。例えば、ウシ、羊、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、テンジクネズミ、ラットまたはその他のウシ亜科の動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物またはネズミ科に属する種を含むが、それらに限定されない哺乳類が治療されることが出来る。しかし、該方法は、鳥類のような（例えば、鶏など）、他の種においても実践されることが出来る。
【００９０】
細胞が調整のため標的化されることが望ましい、上述の方法で治療された被検体はウシ、羊、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、テンジクネズミ、ラットまたはその他のウシ亜科の動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物またはネズミ科に属する種を含むが、それらに限定されない哺乳類であり、好ましくは、ヒトで、男性または女性である。
【００９１】
「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医、医師あるいはその他の臨床医によって探られている組織、システム、動物、またはヒトの生物学的または医学的な反応を引き起こすであろう対象組成物の量を意味する。
【００９２】
本願に使用される、「組成物」という用語は、特定の量で特定の材料を含む製品を、直接的にまたは間接的に、特定の量で特定の材料の組合せから出来るすべての製品と同様に含むことを意図する。「薬学的に許容される」ことを意味するキャリアにおいて、希釈剤または添加剤は処方のその他の材料と適合しなくてはならず、それらの受容体に対して毒性であってはならない。
【００９３】
組成物「の投与」およびまたは組成物「を投与する」という用語は、本発明の組成物を治療が必要な個体に提供することを意味すると理解されるべきである。
【００９４】
本発明の組成物の投与のための医薬組成物は投与量ユニットで小分けに提示されることができ、製薬額の技術において既知であるすべての方法によって調合されることが出来る。すべての方法は、活性材料を１つ以上の副成分を含むキャリアに結合させる段階を含む。一般的に、医薬組成物は、均一に、密接に、活性材料を液体キャリアまたは微紛化された個体キャリアまたはその両方と結合させ、その後、必要に応じて、製品を望ましい形態に成形することによって調合される。医薬組成物において、活性対象組成物は疾患の進行または状態に対して望ましい効果を作り出すのに十分な量で含まれる。
【００９５】
活性成分を含む医薬組成物は、例えば、タブレット、トローチ、ロゼンジ、水性または油性の懸濁液、分散剤もしくは顆粒、乳剤、硬性または軟性のカプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤などとして、経口使用に適した形態であることが出来る。
【００９６】
経口使用を目的とした組成物は、医薬組成物の製造の技術で知られているすべての方法によって調合されることが出来、そのような組成物は、薬学上の優れた、口に合う調合を提供するために、甘味剤、香料剤、着色剤および保存剤からなる群より選択される薬剤を１つ以上含むことができる。タブレットは、タブレットの製造に適した非毒性の、薬学的に許容される添加剤の混合剤で活性材料を含むことが出来る。これらの添加剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ソーダ、ラクト−ス、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような、不活性希釈剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、例えばスターチ、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、そして例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクなどの潤滑剤であることが出来る。タブレットはコーティングされなくてもよく、または胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それにより、より長い期間の持続作用を提供することの出来る既知の技術によってコーティングされても良い。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料が採用されてもよい。また、それらは放出を制御するための浸透圧治療タブレットを形成するようコーティングされてもよい。
【００９７】
経口使用のための処方は、活性材料が例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性個体希釈剤と混合される硬性ゼラチンカプセルとして、または、活性材料が、水もしくは、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、あるいはオリーブ油などの油媒体と混合される軟性ゼラチンカプセルとして示されてもよい。
【００９８】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した添加剤での混合剤で活性物質を含む。そのような添加剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムなどの懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は、例えばレシチンなどの天然フォスファチド、または例えばステアリン酸ポリオキシエチレンなどのアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合物、または例えばへプタデカエチレンオキセタノールなどのエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、またはエチレンオキシドのポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような脂肪酸およびへキシトール由来の部分エステルとの縮合物、または例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキシドの脂肪酸およびへキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物であってもよい。水性懸濁液は、さらに例えばエチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などの１つ以上の保存料、１つ以上の着色剤、１つ以上の香料剤、さらにスクロースまたはサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含んでもよい。
【００９９】
油性懸濁液は活性材料を例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油で懸濁することにより処方されることができる。油性懸濁液は例えば蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの濃厚剤を含んでもよい。上述のような甘味剤、および香料剤が口当たりのいい経口剤を提供するために加えられてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化物質の追加によって保存されてもよい。
【０１００】
水の追加による水性懸濁液の調合に適した分散パウダーおよび顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の保存料との混合剤での活性材料を提供する。適した分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は上述によって例示される。例えば、甘味剤、香料剤および着色剤などの追加の添加剤が存在してもよい。
【０１０１】
シロップおよびエリキシル剤は、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤で処方されることが出来る。そのような処方は、鎮痛薬、保存料および香料剤と着色剤を含むことが出来る。
【０１０２】
医薬組成物は無菌注射剤の水性または油性の懸濁液の形態であることができる。本懸濁液は、既知の技術に従い、上述の適した分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて調合されることができる。無菌注射剤の調合は、例えば１，３−ブタンジオールの溶液として、非毒性の薬学的に許容される希釈剤もしくは溶剤における無菌注射剤の溶液または懸濁液であることができる。許容される賦形剤および溶剤において、水、リンガー溶液および等張食塩水溶液が採用される。さらに、滅菌の固定油は、溶剤または懸濁溶媒として通常に採用される。本目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含む、すべての無菌性の固定油が採用されてもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注入剤の調合において使用される。
【０１０３】
本発明の組成物は、薬剤の直腸投与のための坐薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物はその薬剤を、通常の温度では個体であり直腸温では液体になり、それゆえ直腸で解けて薬剤を放出する、適した非毒性の添加剤と混合することにより調合されることが出来る。そのような物質はココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１０４】
局所使用には、本発明の組成物を含むクリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液などが採用される（本使用の目的のため、局所使用は洗口剤およびうがい薬を含む）。
【０１０５】
本開示に基づく、ＳＡＬＬ４を抑制するポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、例えば、癌などの腫瘍、または細胞周期および／または細胞成長の適切な調節の損失を含む障害、または特異的細胞死が望ましいその他の障害の予防または治療（全体的または部分的）を目的とする個々の治療において遺伝子治療法に使用されることができる。
【０１０６】
ウィルスベクターなどのベクターが、当技術において、核酸を様々な種類の標的細胞に導入するために使用されてきた。一般的に、ベクターは標的細胞にさらされ、トランスフェクションが細胞の十分な部分で行われることができ、望ましいポリペプチドの発現からの有用な治療効果または予防的効果を提供する。トランスフェクションされた核酸は永久に各標的化された腫瘍細胞のゲノムへ組みこまれ、長期持続効果を提供し、または代わりに治療は定期的に繰り返される必要がある場合がある。
【０１０７】
様々なベクター、ウィルスベクターとプラスミドベクターの両方は、米国特許第５，２５２，４７９号およびＷＯ９３／０７２８２に参照される、当技術分野において既知である。具体的には、ＳＶ４０のようなパポバウィルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、またレトロウイルスを含む多くのウィルスが、遺伝子移入ベクターとして使用されてきた。当技術分野における多くの遺伝子治療プロトコルが、無能力のマウスレトロウイルスを使用してきた。
【０１０８】
ウィルスベクターの使用の代わりとして、核酸を細胞へ導入するためのその他の既知の方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム同時沈殿法、マイクロインジェクション法、弾道法、リポソームで媒介される導入法、ＤＮＡ取り込み法などの機械的技術法、および受容体介在ＤＮＡ導入法が挙げられる。
【０１０９】
受容体介在遺伝子導入は、核酸がタンパク質リガンドにポリリシンを介して連結され、標的細胞の界面に存在する受容体に対して特異的であるリガンドを伴う、核酸を特定の細胞へ特異的に標的化するための技術の例である。
【０１１０】
細胞が調整のため標的化される被検体の治療において、適切な投与レベルは、一般的に、単回投与または反復投与で投与される、１日あたりの患者の体重１ｋｇあたりの約０．０１ｍｇから５００ｍｇである。好ましくは、投与レベルは１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは１日当たり約０．５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇである。適した投与レベルは、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから２５０ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇであることができる。この範囲内で投与量は、１日当たり、約０．０５から０．５、０．５から５または５から５０ｍｇ／ｋｇであることができる。経口投与には、組成物は、治療される患者への投与量の症候性調節のため、好ましくは１．０から１０００ミリグラムの活性材料、具体的には、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、および１０００．０ミリグラムの活性材料を含む、タブレットの形態で提供される。組成物は１日あたり１回から４回のレジメンで投与されることができ、好ましくは１日あたり１回または２回である。
【０１１１】
しかしながら、いかなる特定の患者に対する特定の投与レベルならびに投与の回数は変えることができ、採用される特異的組成物の活性、組成物の代謝的安定性および活性の長さ、年齢、体重、通常の健康状態、性別、食事、投与の方法と時間、排せつの割合、薬剤の組合せ、特定の状態の重症度、および治療中のホストなどを含む様々な要因によって変わるということが理解されるだろう。
【０１１２】
以下の実施例は発明を説明することを目的とするが、それを限定するものではない。
【０１１３】
実施例１
方法
分子クローニング
プラスミドコンストラクションおよびＤＮＡシークエンシングが標準の方法に従って実施された。ＳＡＬＬ４アイソフォームのクローニングのため、ＰＣＲプライマーが、ゲノムクローンＲＰ５−１１１２Ｆｌ９（配列番号：２５）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０３４４２０）に基づき、指定された。ＳＡＬＬ４アイソフォームは、ヒトの胎児の腎臓に由来するマラソン−レディｃＤＮＡライブラリ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、サプライヤープロトコルに従いクローン化された。増幅されたＰＣＲ産物はＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へクローン化され、ヌクレオチド配列はＤＮＡシークエンシングにより決定された。ＧＡＬ４−ＳＡＬＬ４Ｂコンストラクトは、ＰＣＲにより、各端部で、制限酵素部位、ＢａｍＨＩを伴う５’プライマーおよび３’プライマーを使用し、生成された：
５’プライマー：
；および３’プライマー：
。
【０１１４】
ＧＡＬ４−ＳＡＬＬ４Ｂコンストラクトは、第１アミノ酸のメチオニンを除く、最小ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域および完全長のＳＡＬＬ４Ｂの９３アミノ酸をコードするものとされる。
【０１１５】
異なる組織における選択的スプライシングパターンの決定
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲが使用され、成人組織におけるＳＡＬＬ４のｍＲＮＡ発現パターンを評価した。８つの正常化第１ストランドｃＤＮＡ調合液のパネルは、異なる成人組織から由来し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入された。ＰＣＲ増幅が、５μｌのｃＤＮＡ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を含む５０−μｌ反応体積で実施された。９４℃で１０分間の初期変性の後、増幅が３０サイクルで以下の条件の下実施された：９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長。続いて最後のサイクルは、７２℃での最終の７分間の伸長であった。
【０１１６】
グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの増幅は鋳型濃度ローディングの対照に使用された。ＳＡＬＬ４アイソフォームに対して特異的に選択されたプライマーのペアは以下である。
【０１１７】
１）ＳＡＬＬ４Ａプライマー（センスプライマー：
；アンチセンスプライマー：
）。
【０１１８】
２）ＳＡＬＬ４Ｂプライマー（センスプライマー：
；アンチセンスプライマー：
）。
【０１１９】
ＰＣＲ産物は電気泳動的に１％アガロースゲルで分離された。ＤＮＡシークエンシングはまた増幅産物を確認するために使用された。
【０１２０】
抗体生成
ヒトＳＡＬＬ４のペプチドＭＳＲＲＫＱＡＫＰＱＨＩＮ（配列番号：１３）は、その潜在的抗原性（アミノ酸１〜１３）に対して選ばれ、抗ペプチド抗体を生成するために使用された。本領域はマウスＳＡＬＬ４の領域とも同一であり、生成された抗体がマウスＳＡＬＬ４と交差反応することを可能にする。ＳＡＬＬ４抗ペプチド抗体はウサギにおいて、Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）との協力において作成された。
【０１２１】
ゲル電気泳動ならびにウエスタンブロット分析
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が、ラエムリ法に従いＳＤＳ１０％ｗ／ｖポリアクリルアミドスラブゲルにおいて実施され、タンパク質はその後、ニトロセルロース膜へ移された。ＳＡＬＬ４抗ペプチド抗体（１：１００）を伴うウサギ免疫血清の免疫ブロット法は、説明されるように、電気化学発光検出システムで製造会社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって実施された。
【０１２２】
白血病と正常組織
白血病サンプルと正常なサンプルは、パラフィンブロックまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）での凍結のいずれかで、テキサス州立大学ＭＤのファイルから採取された。Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、およびＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９９８から２００４年の間、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄプロトコル認可。すべての腫瘍の診断は、造血形新生物のＦＡＢ分類に従い、形態学的および免疫表現型的基準に基づく。ＣＤ３４＋新鮮細胞がＣａｍｂｒｅｘから購入された。
【０１２３】
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ５’ヌクレアーゼ分析が（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）これらの研究で使用された。正常骨髄および末梢血からの精製ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣからの全ＲＮＡ、１５ＡＭＬサンプル、および３つの白血病細胞系がＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔで単離され、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）で消化された。ＲＮＡ（１μｇ）が２０μＬでＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素およびポリ（ｄＴ）１２〜１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写された。８０μＬの水および混合液を追加した後、５−μＬのアリコートが各ＴａｑＭａｎ反応に使用された。ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアバーション１．５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用するように設定されている。ＳＡＬＬ４およびＧＡＰＤＨのリアルタイムＰＣＲがＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行された。ＰＣＲ反応混合液は３．５ｍＭのＭｇＣｌ２；各０．２ｍＭのデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）；０．４ｍＭのデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）；０．５μＭフォワードプライマー；０．５μＭリバースプライマー；０．１μＭ ＴａｑＭａｎプローブ；０．２５ＵウラシルＤＮＡグリコシラーゼ；および０．６２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼを、１×ＴａｑＭａｎＰＣＲ緩衝液に含んだ。ｃＤＮＡ（５μＬ）がＰＣＲ混合液に加えられ、ＰＣＲ反応の最終体積は２５μＬであった。すべてのサンプルは二重で実行された。ＧＡＰＤＨは内因性対照として使用された。熱循環の状態は５０℃で２分間、９５℃で１０分間であり、および９５℃で０．３０分間、そして６０℃で１分間の４５サイクルであった。データはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアバージョン１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析された。結果はサイクル閾値（Ｃｔ）の値である。ソフトウェアは、基準蛍光信号に基づき閾値ラインを測定し、閾値に合うデータポイントはＣｔ値として与えられる。Ｃｔ値は鋳型の複製の最初の数に反比例する。すべての測定はニ重して実施された。ＴａｑＭａｎ配列は以下を含む。
【０１２４】
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：
およびリバースプライマー：
、ＴａｑＭａｎプローブ：
、およびＳＡＬＬ４フォワードプライマー：
およびリバースプライマー：
。
【０１２５】
組織配列の設計および構成
白血病標本からの３部腫瘍核を含んだ組織配列を切断した（厚さ５μｍ）。手動組織配列器（Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使用して、組織配列を構成した。
【０１２６】
免疫組織化学
免疫組織化学的染色を標準技術によって実施した。手短に言えば、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した厚さ４μｍの組織切片を脱パラフィン化して水和した。加熱誘導（ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ）エピトープをトリス緩衝液（ｐＨ９．９；Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）および高速マイクロ波ヒストプロセッサで回収した。１００度での１０分間のインキュベーションの後、スライドを水道の流水で５分間、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）で５分間洗浄した。そして組織切片は、室温の加湿室内で５時間、抗ＳＡＬＬ４抗体（１：２００）によりインキュベートした。ＰＢＳによる３回の洗浄後、組織切片は室温で３０分間、抗マウス免疫グロブリンＧおよびペルオキシダーゼによりインキュベートした。
【０１２７】
ＰＢＳによる３回の洗浄後、組織切片は着色のために３，３’−ジアノベンジジン／Ｈ２Ｏ２（Ｄａｋｏ）によりインキュベートし、ヘマトキシリンを使用して切片を対比染色した。腫瘍性細胞は、明確な核染色を示した時にＳＡＬＬ４に対して陽性であると考えられた。
【０１２８】
トランスジェニックマウスの生成
コーディング領域全体に対応するＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡは、ｐＣＥＰ４ベクター（ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ；ｎｏｗ Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にサブクローン化し、遺伝子導入実験のためのＣＭＶ／ＳＡＬＬ４Ｂコンストラクトを作成した。ＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡ内を切り取らないＳａｌＩによる後の消化は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＬＬ４ ｃＤＮＡコーディング領域、ＳＶ４０イントロン、および追加ベクター配列のないポリアデニル化信号のみを含む線形断片を放出した。
【０１２９】
トランスジェニックマウスは、エール大学のトランスジェニックマウス施設で、前核注入を介して生成した。ＳＡＬＬ４Ｂ初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスの識別および導入遺伝子の伝達はＰＣＲ分析によって判定した。遺伝子型に使用されるＰＣＲプライマーは、ＣＭＶプロモーター（センスプライマー：
への５’ＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡの注入に及び、アンチセンスプライマーは
）である。
【０１３０】
血液学的分析
自動差異を伴う全血球計算値は、Ｍａｓｃｏｔ Ｈｅｍａｖｅｔ細胞カウンタ（ＣＤＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＣＴ）により判定した。前駆細胞検定に対して、１．５×１０４骨髄細胞を、組み換えマウスインターロイキン−３（ＩＬ−３）（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびエリスロポエチン（３Ｕ／ｍｌ）（Ｍ３４３４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａ）で補充された二つ組の１．２５ｍｌメチルセルロース培養に載せた。コロニーは７から１４日の間に記録した（ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、およびＢＦＵ−Ｅ）。末梢血、骨髄塗抹標本、およびプールＣＦＵ細胞からのサイトスピンは、ライトギムザ染色で染色した。
【０１３１】
フローサイトメトリー分析
細胞は、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）またはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に対して、直接共役抗体により染色した。１万個の散在ゲート赤血球は、ＦＡＣＳｃａｎ上で獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で分析した。
【０１３２】
統計分析
通常の両側分布および不等分散を想定して、スチューデントｔ−検定を全ての統計分析に使用した。
【０１３３】
細胞培養
ＨＥＫ−２９３細胞（ヒト胚腎臓由来）および細胞系ＫＧ．１、Ｋａｓｕｍｉ−１、およびＴＨＰ−１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）より購入した。細胞は、５％二酸化炭素および１０％胎児血清を伴う加湿環境内で３７℃に維持した。
【０１３４】
トランスフェクション
トランスフェクションは、メーカーの指示に従って、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により実施した。細胞は、〜１×１０５細胞／ウェルまでの濃度で２４ウェルプレートに載せた。細胞は、トランスフェクションの２４時間後に収穫した。一時的トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で調製した。
【０１３５】
β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ検定
細胞は、トランスフェクションの２４時間後に、１００μｌのルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉ）で抽出した。１０μｌの細胞抽出物により実施したβガラクトシダーゼ検定は、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびメーカー提供の標準検定プロトコル（炭酸ソーダの代わりに、停止緩衝液として１Ｍトリス基剤を使用したことを除く）を使用した。ルシフェラーゼ検定（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対しては、５μｌの抽出物をメーカーの指示に従って使用した。バックグラウンドの減算後、ルシフェラーゼ活性（任意の単位）を、各サンプルに対してβ−ガラクトシダーゼ活性（任意の単位）に対して正常化した。
【０１３６】
プロモーターレポーター検定
一般的に、ＯＣＴ４プロモーター（配列番号：２６）を含む０．２５〜０．３μｇのＯＣＴ４−Ｌｕｃコンストラクト（ＰＭＯｃｔ４）、またはＳＡＬＬファミリータンパク質（つまり、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、ＳＡＬＬ４Ａ、またはＳＡＬＬ４Ｂ）プロモーター（つまり、それぞれ配列番号：２７、配列番号：２８、および配列番号：２９であり、ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂはプロモーターを共有する）を含むＳＡＬＬ−Ｌｕｃコンストラクトは、０．１μｇから０．１２μｇのレニラプラスミドおよび／または、ＨＥＫ−２９３またはＣＯＳ−７細胞中でＳＡＬＬファミリータンパク質またはＯＣＴ４タンパク質を発現する様々な量（０〜１．０μｇ）のプラスミドに同時導入される。典型的に、ｐｃＤＮＡ３ベクターは対照として使用した。そしてトランスフェクト細胞は、トランスフェクション後の２４時間のルシフェラーゼ活性について監視した。
【０１３７】
結果
ヒトＳＡＬＬ４の２つの選択的スプライシングアイソフォームの分子クローニング
ＳＡＬＬ４の２つの全長転写物は、ヒト胎児腎臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして使用し、５’および３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（５’および３’ｃＤＮＡ端ポリメラーゼ連鎖反応の高速増幅）によって単離した。
【０１３８】
単離されたより大きいｃＤＮＡ断片の配列分析は、強いコンセンサスインターフェロン配列から始まり、１，０５３のアミノ酸をコードすることが予期された、ＳＡＬＬ４Ａと指定される単一の大型オープンリーディングフレームを明らかにした。ＳＡＬＬ４Ｂに指定されるＳＡＬＬ４の他のスプライシング変異体は、全長ＳＡＬＬ４Ａのアミノ酸３８５〜８２０に対応する領域が欠けていた（図１ａ）。ＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡによってコードされる推定タンパク質は、６１７のアミノ酸から成ることが予期された。
【０１３９】
これら２つの明白なスプライシング変異体が人工物に起因するかもしれないという可能性を除外するため、ヒトゲノムの対応配列を伴う両方の変異型ｍＲＮＡ配列を比較した。ＳＡＬＬ４Ａは全エクソン（１〜４）を含んだが（図１ａ）、ＳＡＬＬ４Ｂはエクソン２の３’大部分が欠けていた。両方のエクソン−イントロンスプライス部位は、Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ規則を満たした。両方のスプライシング変異体には同じ翻訳リーディングフレームがあったが、ＳＡＬＬ４Ｂ ｍＲＮＡは内部欠損のあるタンパク質をコードした。ＳＡＬＬ４Ａは８つのジンクフィンガー領域を含んだ一方で、ＳＡＬＬ４Ｂには３つのジンクフィンガー領域があった。
【０１４０】
ヒト組織におけるＳＡＬＬ４アイソフォームの発現パターン
ＳＡＬＬ４の選択的スプライシングパターンは、種々のヒト組織における逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって描かれた。遍在ＧＡＰＤＨ遺伝子ｃＤＮＡの断片は、対照として増幅した（図１ｂ）。より長いスプライス変異体を表す３１５−ｂｐ断片であるＳＡＬＬ４Ａは、一部組織中で増幅し、様々な発現レベルを達成した。ＳＡＬＬ４Ｂ変異体は、発現の様々なレベルにおいてあらゆる組織中に存在した。造血組織におけるＳＡＬＬ４発現についての詳細な研究は、次の結果で説明される。
【０１４１】
ＳＡＬＬ４抗体の生成ならびにＳＡＬＬ４タンパク質産物の識別
ＳＡＬＬ４遺伝子産物を識別し、ＳＡＬＬ４変異体の存在を確認するため、ＳＡＬＬ４の合成ペプチド（アミノ酸１〜１３）に対するポリクローナル抗体を開発した。両方のＳＡＬＬ４変異体に共通であるため、本領域を選んだ。アフィニティ精製したＳＡＬＬ４ペプチド抗体は、ヒト腎臓全溶解液中の２つの内因性タンパク質を特異的に認識した。２つのタンパク質は約１６５ｋＤａと９５ｋＤａであり、それぞれＣｏｓ−７細胞において過剰発現されたＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの分子量と同一であった（図１ｃ）。本抗体によるウエスタンブロット法は、ＳＡＬＬ４アイソフォームにはｍＲＮＡレベルで認められるものと同様であった異なる組織分布があったことを確認した（図１ｂ−Ｂ）。
【０１４２】
ヒト原発性ＡＭＬおよび骨髄性白血病細胞株におけるＳＡＬＬ４の非遮断
ＳＡＬＬ４が位置する染色体領域２０ｑ１３は、腫瘍に頻繁に関与するため、ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４のｍＲＮＡ発現を調べた。ＳＡＬＬ４の発現は、ＡＭＬサンプル由来の骨髄細胞（Ｎ＝１５）、骨髄性白血病細胞株（Ｎ＝３）においてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量的に調査し、精製ＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞プール（Ｃａｍｂｒｅｘより購入したＨＳＣ／ＨＰＣ）からの非腫瘍性造血性細胞、正常骨髄（Ｎ＝３）、および正常末梢血（Ｎ＝３）と比較した。アイソフォーム特異的プライマー（図２ａ参照）を使用すると、ＳＡＬＬ４Ｂおよび／またはＳＡＬＬ４Ａのいずれかまたは両方は、ＡＭＬサンプルまたは骨髄性白血病細胞株中で遮断（ＳＡＬＬ４Ｂ）または下方制御（ＳＡＬＬ４Ａ）されなかった。データは、ＧＡＰＤＨの内因性発現に対して正常化し、精製ＣＤ３４＋細胞中のＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ発現のレベルに対して調整した。正常骨髄におけるＳＡＬＬ４Ｂ完全欠損とは対照的に、原発性ＡＭＬにおけるその発現は、１５のＡＭＬサンプル中１３で、かつ３つ全ての骨髄性白血病細胞株で遮断されなかった。原発性ＡＭＬサンプルにおけるＳＡＬＬ４Ａの中央正常化レベルは正常骨髄よりも４０倍高かった。骨髄性白血病細胞株ＫＧ．１、Ｋａｓｕｍｉ−１およびＴＨＰ−１におけるＳＡＬＬ４Ａ発現は、正常骨髄よりもそれぞれ、８倍、２５倍、および２４０倍高かった。興味深いことに、ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂ発現レベルは両方とも、正常骨髄と比べて、ＡＭＬサンプルの６０％および３つ全ての細胞株において増加した。ＡＭＬサンプルの残りの４０％では、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂのいずれかが下方制御しなかった。
【０１４３】
ヒト原発性ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４タンパク質の構成的発現
認められた異常ＳＡＬＬ４発現がタンパク質レベルでも存在するかどうかを調査するため、ＡＭＬクラスＭ１からＭ５（ＦＡＢ分類）に及ぶ８１のＡＭＬサンプルを調べた：Ｍｌ（Ｎ＝２０）、Ｍ２（Ｎ＝２７）、Ｍ３（Ｎ＝８）、Ｍ４（Ｎ＝１６）、Ｍ５（Ｎ＝３）、およびＡＭＬ非特定（Ｎ＝７）で、正常骨髄、胸腺および脾臓の一部のサンプル、ならびに正常ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣであった。
【０１４４】
正常骨髄、脾臓および胸腺は、検出可能なＳＡＬＬ４タンパク質発現を示さず、正常ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣは、陽性であるがより弱いＳＡＬＬ４タンパク質染色を呈したが、より強いＳＡＬＬ４発現が白血病細胞の核において検出された（図２ｂ−Ｆ）。全８１ＡＭＬサンプルは異常ＳＡＬＬ４発現を示し、最も強い染色はＡＭＬ−Ｍ１および−Ｍ２で見られた。これらの所見は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって実証されたＳＡＬＬ４のｍＲＮＡ発現レベルと一致した（図２ａ）。データは、ＳＡＬＬ４がＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣにおいて存在し、成熟顆粒球およびリンパ球において下方制御されたことを示唆した。結果として、白血病におけるＳＡＬＬ４の構成的発現は、白血病性芽球が通常ＨＳＣで見られる特性を鑑別および／または獲得することを防いだのかもしれない。
【０１４５】
全長ヒトＳＡＬＬ４Ｂを構成的に発現するトランスジェニックマウスの生成
ＳＡＬＬ４の構成的発現がＡＭＬを誘発するのに十分であるかを直接的に試験するため、ＳＡＬＬ４トランスジェニックマウスモデルを生成した。ＣＭＶプロモーターはヒトＳＡＬＬ４Ｂの６１７のアミノ酸をコードするｃＤＮＡに融合し（図３ａ−Ａ）それは以前に調べたあらゆる組織中で発現されたため選ばれた（図１ｂ−Ｂ）。ＣＭＶプロモーターは、ほとんどのネズミ臓器においてヒト遺伝子を異所的に発現させるために以前に使用した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行い、トランスジェニックマウスにおける野生型（ＷＴ）全長ＳＡＬＬ４Ｂの過剰発現を調べた。
【０１４６】
ＳＡＬＬ４Ｂ転写物は、脳、腎臓、肝臓、脾臓、末梢血、リンパ節、および骨髄を含む、トランスジェニックマウスからの種々の組織において検出された（図３ａ−Ｂ）。生後３週間の異常歩行および関連水頭症が、複数系統からのトランスジェニックマウスの２０％において認められ、６０％に多嚢胞腎臓を認めた。これらの所見は、ＳＡＬＬ４Ｂが神経および腎臓発生において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１４７】
ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳ様症状およびＡＭＬ
６つ全ての系統からの１４匹のトランスジェニックマウスのコホートにおける血液学的異常の監視は、６〜８月齢で全マウスに明白なＭＤＳ様特徴があったことを明らかにした。過分葉好中球および偽ペルゲル・フェット様細胞を含む、増加した数の未熟芽球および多くの異型および異形成白血球が、末梢血塗抹標本上で見られた（図３ｂ）。有核赤血球および巨大血小板、ならびに二核赤血球前駆細胞および低分葉巨核球などの赤血球および巨核球異形成の特徴も存在した。
【０１４８】
これら１４匹のマウスのうち６匹（４３％）が最終的に急性白血病に達した（表１）。
【０１４９】
（表１）ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳ様／ＡＭＬの概要
【０１５０】
肺、腎臓、肝臓、脾臓、およびリンパ節を含む、多くの臓器の白血病の浸潤は、疾患の悪性度を強調した（図３ｃ）。白血病芽細胞は、ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＭＰＯ、および非特異的エステラーゼが陽性であったため、元来は骨髄性と考えられ、Ｂ細胞（Ｂ２２０およびＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ５）、巨核球（ＣＤ４１）、および赤血球（Ｔｅｒ１１９）マーカーで陰性であった（図３ｄ）。
【０１５１】
ＳＡＬＬ４Ｂ誘発性ＡＭＬは移植可能であった
発症が約６週間である侵攻性致命的ＡＭＬは、皮下注射によるＳＡＬＬ４Ｂ誘発性ＡＭＬ細胞の連続移植後に、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに発生させた。移植疾患は、多臓器への播種によって特徴付けられ、顕著な脾腫および肝腫脹を伴った（図３ｅ）。
【０１５２】
ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおける無効造血および過剰アポトーシス
若年ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウス（２〜６月齢）における血液学的異常の調査は、それらの末梢血が最低限の骨髄異形成特徴だが、統計学的有意な白血球減少および好中球減少、ならびに軽度の貧血を示したことを明らかにした（表２）。
【０１５３】
（表２）ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスおよび野生型対照からのＣＢＣ
【０１５４】
これらのトランスジェニックマウスにおける血球減少の原因が産出の問題に関連したかどうかを判定するため、それらの骨髄を検討した。骨髄サンプルは、ＷＴ対照と比較して、細胞充実度の増加および骨髄性細胞集団の増加を示した（図３ｆ）（ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＧｒ−１／Ｍａｃ−１二重陽性集団：６７±１６％、Ｎ＝１０に対して、ＷＴ：５５．３±４％、Ｎ＝１１；Ｐ＝０．０４８）。
【０１５５】
過剰アポトーシスがヒトＭＤＳにおける無効造血で中心的役割を果たすため、インビボおよびインビトロのＳＡＬＬ４トランスジェニックマウスにおけるアポトーシスを次に調べた。アポトーシスの増加が、一次骨髄（トランスジェニックマウスにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性、ＰＩ陰性集団：４．４±２．４％、Ｎ＝１０に対して、ＷＴ：１．８６±１．５５％、Ｎ＝７；Ｐ＝０．０３）および７日ＣＦＵ（トランスジェニックマウスにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性、ＰＩ陰性集団：２０．１±６％、Ｎ＝１０に対して、ＷＴ：１０．９±４％、Ｎ＝７；Ｐ＝０．００２）上の両方でＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおいて認められた（図３ｆおよびｇ）。これらの所見は、骨髄中の脊髄性細胞集団の増加にもかかわらず、これらのトランスジェニックマウスには、その骨髄中の進行中の無効骨髄造血に続発する、末梢血中の統計学的有意な低い好中球数があるという事実を説明することができる。未熟細胞の集団の増加も、一次骨髄（ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおけるｃ−ｋｉｔ陽性集団：１０．２±１．３％、Ｎ＝１４に対して、ＷＴ：６．５±２．５％、Ｎ＝１０；Ｐ＝０．００８）（図３ｆ）および７日ＣＦＵ（ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＣＤ３４陽性集団：１１±２．２％、Ｎ＝８に対して、ＷＴ：６．３±２．４％、Ｎ＝７；Ｐ＝０．００２）上の両方でＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおいて注目された（図３ｇ）。同様数の総コロニーがＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウス（平均＝５１、Ｎ＝１０）およびＷＴ対照（平均＝４０、Ｎ＝６）において認められた。しかし、ヒトＭＤＳ患者およびその他のＭＤＳマウスモデルで報告されているように、増加した脊髄性細胞および減少した赤血球コロニー集団（図３ｈ）が、ＷＴ対照と比較してＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスＣＦＵにおいて見られた。これらの結果は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおける欠陥は、造血分化に影響する幹細胞／前駆細胞レベルにあることを示唆する。
【０１５６】
インビトロでのβ−カテニンへのＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの結合
ＳＡＬＬ４が白血病誘発において影響を及ぼす場合のある潜在的シグナル伝達経路を次に探索した。ショウジョウバエにおいて、ｓｐａｌｔ（ｓａｌ）は、Ｗｎｔシグナル伝達の下流ターゲットである。ＳＡＬＬ遺伝子ファミリーのもう１つのメンバーであるＡＬＬ１は、β−カテニンと相互作用することが可能である。本相互作用に対する高親和性部位は、Ｃ末端二重ジンクフィンガー領域に位置する。ＳＡＬＬ１の本領域は、ＳＡＬＬ４のもとのほぼまさに同一であることが分かった。本所見は、ＳＡＬＬ４もβ−１２カテニンに結合できたかどうかの調査を促進した。血球凝集素（ＨＡ）に付いたＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの発現コンストラクトが生成された。図４ａに示されるように、内因性β−カテニンは、ＨＡ単独ではなく、ＨＡ−ＳＡＬＬ４ＡおよびＨＡ−ＳＡＬＬ４Ｂによってプルダウンされた。
【０１５７】
ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂ両方によるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化
β−カテニンとのＳＡＬＬ４アイソフォームの相互作用の機能的効果を調査するため、例示的なＷｎｔシグナル伝達経路を活性化するＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの潜在能力を判定するためのＷｎｔ応答要素の複数の複写を含むルシフェラーゼレポーター（ＴＯＰｆｌａｓｈ；Ｕｐｓｔａｔｅ ＵＳＡ）を使用した。本レポーターコンストラクトは、種々の細胞系においてＷｎｔ１によって能率的に刺激されることが示されている。ＴＯＰｆｌａｓｈレポータープラスミドは、ＷｎｔおよびそのＷｎｔ／β−カテニンシグナル経路の両方が存在したＨＥＫ−２９３細胞系に一過性に遺伝子導入した。ＴＯＰｆｌａｓｈレポータープラスミドは、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂにも同時導入した。ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの両方によるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の有意な活性化は、ルシフェラーゼ活性の増加によって示された（図４ｂ）。
【０１５８】
ＣＭＬの異なる段階におけるβ−カテニンおよびＳＡＬＬ４の同様な発現パターン
調節不全なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、ＬＳＣの発生に関与することが知られている。β−カテニンのＬＳＣ自己複製への関与の最もよい証拠は、ＣＭＬ芽球化現象の研究によってもたらされる。Ｗｎｔシグナル伝達は慢性期ではなく、ＣＭＬの芽球期に活性化され、その時にβ−カテニンの活性化などの調節不全なＷｎｔシグナル伝達は、ＣＭＬのＧＭＰにで自己複製の特性を与えて芽球化転換に繋がった可能性があるという結論が下されたことが実証されている。
【０１５９】
ＳＡＬＬ４とβ−カテニンとの間の潜在的な相互作用、およびショウジョウバエにおけるＷｎｔシグナル伝達の下流ターゲットとしてのｓｐａｌｔの位置を所与として、異なる段階でのＣＭＬにおけるＳＡＬＬ４タンパク質発現を調べた。ＳＡＬＬ４発現は、芽球期ＣＭＬに存在したが（Ｎ＝１２，７５％）、慢性期には存在しなかった（Ｎ＝１１，１００％）（図４ｃ）。芽球が増加する加速期（Ｎ＝６，１０％）では、ＳＡＬＬ４を発現する未熟芽球が、好中球などの非染色性成熟骨髄性細胞のバックグラウンド上に認められた。
【０１６０】
ＯＣＴ４プロモーターに対するＳＡＬＬ４の効果
ＯＣＴ４に対するＳＡＬＬ４の効果を識別するため、細胞、ＯＣＴ４−Ｌｕｃコンストラクトをレニラプラスミドおよび増加する濃度のＳＡＬＬ４Ｂに同時導入した（図５）。図が示すように、増加するＳＡＬＬ４Ｂは、ＯＣＴ４プロモーター活性を８倍以上増加させた。
【０１６１】
ＯＣＴ４がＳＡＬＬ遺伝子メンバープロモーターの活性を刺激するかどうかを判定するため、プロモーターコンストラクト（ｐＳＡＬＬ１、ｐＳＡＬＬ３、およびｐＳＡＬＬ４）をＨＥＫ−２９３細胞中のＯＣＴ４に同時導入した。データ（図６）に図示されるように、２４時間のトランスフェクション後の後に、ＯＣＴ４の過剰発現は、ｐｃＤＮＡ３ベクター対照と比較すると、ＳＡＬＬ遺伝子メンバーＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４のプロモーター活性を際立って刺激した。また、この活性化は少量の過剰ＳＡＬＬ４の存在により完全に阻止された（図１０）。
【０１６２】
ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質によるＳＡＬＬプロモーターの自己調整があったかどうかを判定するため、ＳＡＬＬ４−Ｌｕｃはレニラレポーターに同時導入し、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ発現プラスミドのいずれかがＨＥＫ−２９３およびＣＯＳ−７細胞である（図７）。図に示されるように、ＳＡＬＬ４（ＡおよびＢアイソフォームの両方）は、異なる細胞系においてそれ自身のプロモーター活性を抑制する。さらに、本自己抑制は用量依存性である（図８参照）。ＳＡＬＬ４プロモーターとのＳＡＬＬ４の比率が６：１に達した時、プロモーター活性は、基礎レベルと比較して約３．５倍低下した。本データは、ＳＡＬＬ４が自己抑制機能を持つことを示す。このことは全てのＳＡＬＬメンバーに該当するわけではなく、例えば、ＳＡＬＬ１はそのプロモーターの自己抑制を明示しない（図１２）。
【０１６３】
データは、ＳＡＬＬ１およびＳＡＬＬ３プロモーターが外から加えられたＳＡＬＬ４によって際立って活性されたことも示し（図９参照）、ＳＡＬＬ４が胚幹細胞機能を伴うＳＡＬＬ遺伝子ファミリーの他のメンバーを調整することができることを示す。
【０１６４】
ＳＡＬＬ４プロモーターに対するＯＣＴ４の刺激はＳＡＬＬ４によって完全に阻止することが可能であるため（図１０）、ＳＡＬＬ４を調べて、その他のＳＡＬＬメンバープロモーターに対するＯＣＴ４の活性化を抑えるかどうかを判定した。図１１に示されるように、ＳＡＬＬ４は、その他のＳＡＬＬメンバープロモーターのＯＣＴ４活性化も阻止した。
【０１６５】
成体幹細胞および胚性癌腫におけるＳＡＬＬ４
幹細胞とその分化子孫との間で区別することが可能であるマーカーの欠如のため、組織幹細胞集団の特徴は困難なままである。多くの組織にとって、分子マーカーの一団は、幹細胞コンパートメントを画定するように開発されている。
【０１６６】
本データは、ＳＡＬＬ４が多分化能および自己複製における胚幹細胞の主要調節因子であることを示す。例えば、胚性癌腫は、初期胚幹細胞の表現型を示し、潜在的多能性を持つ。したがって、免疫組織化学による、この種類の腫瘍におけるＳＡＬＬ４タンパク質の発現を調べた。免疫組織化学データは、胚性癌腫の全腫瘍細胞が核染色を示したが、全ての非腫瘍細胞が陰性だったことを決定的に示した。これらの結果は、ＳＡＬＬ４は、正常および悪性胚生殖細胞および胚幹細胞に対する特異的マーカーとして使用することが可能であることを示唆する。
【０１６７】
ＳＡＬＬ４がきわめて初期の胚幹細胞において発現され、胚性癌腫がこれらの細胞の変換より生じることが報告されていることを考えると、免疫組織化学は、ａ）正常乳腺小葉中のＳＡＬＬ４陽性細胞が上皮の２％未満を占め、ｂ）乳癌サンプルにおいて、細胞の集団または散在性細胞におけるＳＡＬＬ４タンパク質発現が認められたことも示す。さらに、ＳＡＬＬ４タンパク質は、正常乳房上皮細胞および乳癌細胞の核において発現された。また、この多能性の遺伝子発現は、前立腺および肺などのその他の正常成人組織、およびＳＡＬＬ４抗体を伴うこれらの組織から生じる癌腫において認められた。気管支上皮および前立腺房、およびそれらの間質細胞における少数のＳＡＬＬ４発現細胞の存在、ならびにＳＡＬＬ４が胸の小葉性上皮細胞と同様の頻度で、正常前立腺および肺において発現したという所見が認められた。また、前立腺癌における散在性腫瘍細胞は、ＳＡＬＬ４抗体による免疫組織化学研究によってＳＡＬＬ４タンパク質を発現した。
【０１６８】
結論として、本実施例は、（１）抗ＳＡＬＬ４抗体による免疫染色は、胚性癌腫の識別において有用な診断ツールである、（２）ＳＡＬＬ４の発現は、一部のヒト幹細胞および癌細胞において見られる、（３）ヒト組織中のＳＡＬＬ４発現細胞の識別は、幹細胞、その前癌状態クローン、および悪性Ｔ細胞を識別するために使用することが可能である、（４）ＳＡＬＬ４は、胚幹細胞、成体幹細胞および癌幹細胞に対する理想的なマーカーを代表する、ということを解明する。
【０１６９】
参考文献
【０１７０】
本発明は上記の実施例を参照して説明したが、本発明の精神および範囲内に変更および変化が包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求項の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１（ａ〜ｃ）は、３つのＳＡＬＬ４アイソフォーム（ＳＡＬＬ４Ａ、配列番号：ｌ［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹｌ７２７３８］、ＳＡＬＬ４Ｂ、配列番号：３［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ１７０６２１］、およびＳＡＬＬ４Ｃ、配列番号：５［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ１７０６２２］）の領域を示す。選択的スプライシングはＳＡＬＬ４ｍＲＮＡの２つの異形を生成する。図１（ａ）ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂはタンパク質の長さおよび特性ｓａｌ様ジンクフィンガー領域の異なる数の存在において異なる。ＳＡＬＬ４Ａ（１，０６７アミノ酸をコード）は、８つのジンクフィンガー領域を含み、一方ＳＡＬＬ４Ｂ（６２３アミノ酸をコード）は、３つのジンクフィンガー領域を有する。ＳＡＬＬ４Ｃは２７６アミノ酸を含み、アミノ酸４３から８２０の完全長ＳＡＬＬ４Ａに一致する領域を欠く。両方の変異体は１、３、および４のエクソンを有し、ＳＡＬＬ４Ａは１から４のすべてのエクソンを含む。しかしながら、ＳＡＬＬ４Ｂは、エクソン２の大きな３’の部分の欠失に繋がる選択的スプライス受容部を使用する。図１（ｂ）は、異なる組織におけるＳＡＬＬ４の変異のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＳＡＬＬ４の４つのエクソンとそれらの潜在性コーディング構造が、ＳＡＬＬ４転写物（Ａ）のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーを示す矢印で示さる。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）によるＳＡＬＬ４転写物の組織依存的な発現。プライマーＡ１（エクソン２）およびＢ１（エクソン４）を伴う、ＳＡＬＬ４Ａに対して特異的な３１５−ｂｐ期待産物はｃＤＮＡの様々な組織で増幅される。プライマーＤ１（エクソン４）およびＣ１（エクソン１）は、ＳＡＬＬ４Ｂの１，８５１−ｂｐ期待産物を増幅するために使用された。同等の量のｃＤＮＡがＧＡＰＤＨによって測定された。図１（ｃ）は、ＳＡＬＬ４ペプチド抗体によって識別されたＳＡＬＬ４タンパク質産物、ＳＡＬＬ４Ａ、およびＳＡＬＬ４Ｂを示す。Ｈｉｓ−ＳＡＬＬ４Ｂ（レーン１）、Ｈｉｓ−ＳＡＬＬ４Ａ（レーン２）、または対照ベクター（レーン８）を一時的に発現するＣｏｓ−７細胞からの溶解液、または異なるヒト組織からの溶解液は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分解され、ニトロセルロース膜へ移され、Ｎ末端ＳＡＬＬ４ペプチド抗体で検査された。
【図２】図２（ａ〜ｂ）は、ヒト原発性ＡＭＬおよび骨髄性白血病細胞株におけるＳＡＬＬ４の発現を示す。図２（ａ）は、ＳＡＬＬ４がＡＭＬにおいて遮断されないことを実証する。ＧＡＰＤＨに正規化されたＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４ＢのリアルタイムＰＣＲ定量化は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方が精製ＣＤ３４＋細胞において発現されたが、ＳＡＬＬ４Ａは急速に下方制御され、ＳＡＬＬ４Ｂは正常な骨髄（Ｎ＝３）細胞および正常な末梢血（Ｎ＝３）細胞で遮断されたことを示した。その一方、１５の原発性ＡＭＬサンプルおよび３つの骨髄性白血病細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−１、ＴＨＰ−１、およびＫＧ．１）において、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ、あるいはその両方の発現は、下方制御されることが出来なかった。その結果は、精製ＣＤ３４＋細胞におけるＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂの発現に対し調整された。図２（ｂ）は、免疫組織化学的染色によって示されるように、ヒトＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ１−Ｍ５、Ｎ＝８１）におけるＳＡＬＬ４タンパク質の構成的発現を示す。正常骨髄（Ａ）、正常脾臓（Ｂ）、または正常胸腺（Ｃ）においてＳＡＬＬ４発現は検出されなかった。すべての細胞核が青く染色された。ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣの核はＳＡＬＬ４発現（Ｄ）を示す茶色い染色を示し、急性骨髄性白血病芽球はマイクロアレイ白血病組織サンプルと同様の染色（Ｅ、低力［×４］）を示した。それぞれの丸は１つの白血病サンプルを表す。（Ｆ）１つの白血病サンプルの高倍率（×１００）の図がパートＦに示される。赤い矢印は陽性の核染色を示す。
【図３】図３（ａ〜ｈ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスがＭＤＳのような／ＡＭＬ表現型を有することを示す。図３（ａ）は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスの生成を表し、ＣＭＶ／ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックコンストラクトおよびトランスジェニック系統のＰＣＲ分析５０７を表す。（Ａ）トランスジェニックコンストラクトの系統図。約１．８−ｋｂのＳＡＬＬ４ＢのｃＤＮＡがｐＣＥＰ４ベクターへサブクローン化され、ＣＭＶ／ＳＡＬＬ４コンストラクトはＳａｌＩでの消化によって励起された。（Ｂ）トランスジェニックマウスにおけるＳＡＬＬ４Ｂの組織分布。ＲＴ−ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーの位置は、パートＡの矢印によって示される。Ｃ末端でヒトＳＡＬＬ４Ｂに対して特異的なプライマーは５’プライマーとして使用され、様々な組織のＲＴ−ＰＣＲのためのＳＶ４０−非コード配列特異的プライマーと組み合わされる。図３（ｂ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳのような変化を実証する。正常で、年齢の一致する同じＷＴ同腹子からの末梢血のギムザ染色は、好中球正常（Ａ）、および正常赤血球と血小板（Ｂ、黒矢印）を示した。トランスジェニックマウスにおいて、好中球は過分葉であり（Ｅ）、偽ペルゲルフェット様異常白細胞が表れ、（Ｆ−Ｈ）、未熟細胞（Ｉ−Ｋ）の数の増加を伴う。有核赤細胞（Ｌ、赤矢印）、巨大血小板（Ｍ、赤矢印）、および多染性（Ｎ）もトランスジェニックマウスにおいて認められる。二核異形成赤血球（Ｏ、赤矢印）および次小葉中核を伴う異形成巨核球（Ｐ、赤矢印）がトランスジェニックマウス骨髄からのサイトスピンで発見された。ＷＴ対照動物からの赤血球前駆細胞（Ｃ）および巨核球（Ｄ）が比較のために示される。図３（ｃ）は、ＡＭＬがＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスで見られることを示す。芽球は末梢血（Ａ、×６００）、骨髄生検標本（Ｂ、×１００；Ｃ、×４００）、骨髄標本（Ｄ、×６００）、肝臓（Ｅ、×１００）、リンパ節（Ｆ、×４００）、および脾臓（ＧとＨ、総体図；Ｉ、×１００；差し込み図×４００）で見られた。図３（ｄ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＡＭＬのフローサイメトリ分析を示す。ＡＭＬ細胞はＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、およびＭａｃ−１に対して陽性であり、Ｂ２２０、ＣＤ３、およびＴｅｒ１１９に対して陰性であった。図３（ｅ）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのＳＡＬＬ４Ｂ導入ＡＭＬの連続移植を実証する。白血病移植の６週間後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて白血病浸潤により引き起こされる、脾腫（３ｅ−Ａ黒矢印、３ｅ−Ｃ）、肝腫大（３ｅ−Ａ二重黒矢印、３ｅ−Ｄ）、リンパ節増大（３ｅ−Ｂ黒矢印、３ｅ−Ｅ）および弱い腎臓（３ｅ−Ｂ二重黒矢印、３ｅ−Ｆ）に関する総体図（Ａ＆Ｂ）および組織学（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、×２００）。図３（ｆ）は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスと対照マウスの骨髄の比較を示す。ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスの骨髄は、対照ＷＴマウスに比べ、増加した細胞質、骨髄集団（Ｇｒ−１／Ｍａｃ−１二重陽性）、未熟集団（ｃ−ｋｉｔ陽性）、およびアポトーシス（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）を示した。図３（ｇ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスからのＣＦＵにおいて未熟細胞およびアポトーシスの増加があることを示す。培養の７日目に、対照ＣＦＵにおいてよりも、より多くの数の未熟細胞（Ｂ、Ｃ、およびＤ、赤矢印）とアポトーシスを起こした細胞（Ｂ、Ｃ、およびＤ、二重赤矢印）がトランスジェニックマウスＣＦＵにおいて、認められた（Ａ）。形態学的観察に一致し、アポトーシス（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性、Ｅ）およびより多くのＣＤ３４＋未熟細胞の増加があった（Ｆ）。図３（ｈ）は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスと対照マウスの骨髄ＣＦＵの比較を示す。ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスと対照マウスのＣＦＵ分析において発見された異なる種類のコロニーの割合（Ａ）。ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスからのＣＦＵは、対照マウスに比べ、統計的に、ＣＦＵ−ＧＭでの顕著な増大（Ｂ）（トランスジェニック：５３．６±１０．３、Ｎ＝１３ｖｓ．ＷＴ：３８．１±３．１、Ｎ＝８；Ｐ＝０．００２）を示し、ＢＦＵ−Ｅでの減少（トランスジェニック：７．８±３．８、Ｎ＝１３ｖｓ．ＷＴ：１４．１±２．７、Ｎ＝８；Ｐ＝０．００１）を示した。
【図４】図４（ａ〜ｄ）は、ＳＡＬＬ４とＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の相互作用を実証する。図４（ａ）は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方がβカテニンと相互作用することを示す。Ｃｏｓ−７細胞から作られた核抽出物（溶解液）は、一時的にＨＡ−ＳＡＬＬ４ＡまたはＨＡ−ＳＡＬＬ４Ｂでトランスフェクトされた。（Ａ）抗ＨＡ抗体ＳＡＬＬ４Ａ（１６５ｋＤａ）とＳＡＬＬ４Ｂ（９５ｋＤａ）の両方を認識した。（Ｂ）βカテニンは溶解液で検出された。（Ｃ）免疫沈降がＨＡ親和性樹脂を使用して実施され、抗βカテニン抗体で検出された。βカテニンはすぐにＨＡ−ＳＡＬＬ４ＡとＨＡ−ＳＡＬＬ４Ｂプルダウンの両方で検出された。図４（ｂ）は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方によるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の活性を示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は１．０μｇのＳＡＬＬ４ＡプラスミドまたはＳＡＬＬ４Ｂプラスミドのいずれか、およびトップフラッシュレポータープラスミドでトランスフェクトされた（Ｕｐｓｔａｔｅ ＵＳＡ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）。Ｗｎｔ１またはｍｏｃｋでの２４時間の刺激後、ルシフェラーゼ活性が測定された。図４（ｃ）は、免疫組織化学的染色によって実証されるように芽球期（Ｎ＝１２）でＳＡＬＬ４タンパク質発現が存在するが、ＣＭＬの慢性期（Ｎ＝１１）では存在しないことを実証する。（Ａ）は、異なる段階でのＣＭＬ採取の組織配列の低倍率図を示す。ＳＡＬＬ４発現は、すべての細胞の核は青いままで（Ｂ、×４；Ｄ、×４００）、慢性期ＣＭＬ（Ｂ）において見られなかった。ＳＡＬＬ４発現は、しかしながら、ＳＡＬＬ４の茶色い核染色（Ｃ、×４；Ｅ、×４００）で示されるように、急性転化期ＣＭＬで現れた。芽球数は増加するがまだ１５％未満である、ＣＭＬ加速期（Ｎ＝６）において、未熟芽球のみが認められ、ＳＡＬＬ４発現に対し陽性に染色し（Ｆ、赤矢印）、成熟好中球は染色しなかった（Ｆ、黒矢印、×６００）。図４（ｄ）は、作業仮説を示す。ＳＡＬＬ４はヒト幹細胞／前駆細胞に発現するが、正常な造血中、成熟造血性細胞においては発現しない。ＳＡＬＬ４アイソフォームの構成的発現（ＳＡＬＬ４の非遮断）は、幹細胞プールの異常拡大で、白血病性形質転換（＋、ＳＡＬＬ４発現有り；−、ＳＡＬＬ４発現無し）を引き起こす、分化の阻害および構成的再生をもたらす。
【図５】図５は、ＳＡＬＬ４ＢのＯＣＴ４プロモーターへの用量依存効果を示す。０．３μｇのＯＣＴ４−Ｌｕｃコンストラクト（ＰＭＯｃｔ４）を、０．１μｇのレニラプラスミドと同時導入し、ＳＡＬＬ４ＢまたはｐｃＤＮＡ３ベクター対照の量を増加した（０〜１．０μｇ）。
【図６】図６はＯＣＴ４のＳＡＬＬ遺伝子ファミリーメンバープロモーターへの効果を実証する。各（０．３μｇ）ＳＡＬＬ−Ｌｕｃプロモーターコンストラクト（すなわち、ｐＳＡＬＬ１、ｐＳＡＬＬ３、およびｐＳＡＬＬ４）は、０．９μｇのＯＣＴ４またはｐｃＤＮＡ３ベクター対照を、ＨＥＫ−２９３細胞において同時導入された。２４時間のトランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性を各群で評価した。
【図７】図７はＳＡＬＬ４アイソフォームＡおよびＢのＳＡＬＬ４プロモーター活性への効果を示す。０．３μｇのＳＡＬＬ４−Ｌｕｃが、０．１μｇの異なるＴ細胞系統においてプラスミドを発現する（ＨＥＫ−２９３またはＣＯＳ−７）ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂと同時導入され、ｐｃＤＮＡ３ベクターは対照として使用された。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して正常化された。その値は、３つの実験の±ｓ．ｅ．平均値を表す。
【図８】図８はＳＡＬＬ４プロモーター活性へのＳＡＬＬ４Ａの用量依存効果を実証する。ＨＥＫ−２９３細胞において、０．３μｇのＳＡＬＬ４−Ｌｕｃを、０．１μｇのレニラプラスミドと同時導入し、ＳＡＬＬ４Ａコンストラクトおよび対照ｐｃＤＮＡ３ベクターの割合を増加した。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して正常化された。
【図９】図９は、ＳＡＬＬ４のＳＡＬＬ１およびＳＡＬＬ３プロモーター活性への効果を示す。各（０．３μｇ）ＳＡＬＬ−Ｌｕｃプロモーターコンストラクトは、ＨＥＫ−２９３細胞に、一過的に０．９μｇのＳＡＬＬ４ＡプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）と同時導入された。
【図１０】図１０は、過剰ＳＡＬＬ４Ａの存在下の、ＯＣＴ４のＳＡＬＬ４プロモーターへの効果を示す。０．２５μｇのＳＡＬＬ４−Ｌｕｃコンストラクト（ｐＳＡＬＬ４）を、ＨＥＫ−２９３細胞に、一時的に同量（０．５μｇ）のＳＡＬＬ４ＡおよびＯＣＴ４プラスミドと同時導入した。ｐｃＤＮＡ３は対照として使用された。
【図１１】図１１は、ＳＡＬＬ４の存在下での他のＳＡＬＬメンバープロモーターに対するＯＣＴ４の効果を示す。２４ウェルプレートに播種されたＨＥＫ−２９３細胞を、一過性に異なるＳＡＬＬメンバーレポーター（ｐＳＡＬＬ１またはｐＳＡＬＬ３）ならびにＯＣＴ４プラスミドおよび／またはＳＡＬＬ４Ａコンストラクトと同時導入した。ｐｃＤＮＡ３は対照として使用された。
【図１２】図１２は、その他のＳＡＬＬタンパク質ファミリーメンバーについてのプロモーター活性に対する自己プロモーター相互作用の効果を示す。ＨＥＫ−２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、これまでにＳＡＬＬ１プロモーターを活性化させることが認められた、様々な量のＳＡＬＬ１プラスミド（０．４５および０．９μｇ）ＳＩＸ１を伴う、０．３μｇのＳＡＬＬ１−Ｌｕｃレポーターコンストラクトを、一時的に導入または同時導入し、陽性対照として使用した。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して正常化された。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、概して、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路に関連する因子に関連し、さらに具体的には、ＳＡＬＬタンパク質ファミリーおよびＯＣＴ４を含む、その経路の転写構成要素間の相互作用に関連し、それらはそのような相互作用の標的化により増殖性疾患を診断および治療する方法を含む、胚細胞および癌幹細胞の調整に関する。
【０００２】
本発明は、一部において政府の支援により、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた許可番号第Ｋ０８ＣＡ０９７１８５号に基づいて作成された。当政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来するＥＳ細胞は、自己複製細胞分裂を行いそれらの多分化能を不定の期間維持することが可能である。ＥＳ細胞はまた、体外培養される時に様々な異なる細胞タイプへ分化することも出来る。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路は、正常なヒト幹細胞（ＨＳＣ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）の自己複製に関連している。さらに、転写因子ＯＣＴ４は着床前発生においてＩＣＭの形成のための主要調節因子として同定される。さらには、ＯＣＴ４タンパク質は多様な遺伝子を調整することによって胚性幹（ＥＳ）細胞の多分化能の維持において中心的な役割を行っているようである。
【０００４】
幹細胞の役割は、癌の病因において考えられてきた。腫瘍がそのような癌幹細胞、すなわち、腫瘍の成長の原因となるまれな細胞を含む可能性があるという証拠が増えつつある。これらの無限増殖能を伴うまれな細胞は、従来の治療方法に対応する、癌細胞に見られる抵抗力の原因である可能性がある。幹細胞が、そのような細胞が、例えば造血性細胞等の特定の組織から生じる生体組織で同定されることは既知である。幹細胞自己複製特性は正常な器官形成でしっかりと制御されるため、自己複製の脱制御は発ガンをもたらす可能性がある。
【０００５】
例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、汎血球減少症、多分化機能障害、および骨髄アポトーシスを引き起こす、造血幹細胞（ＨＳＣ）レベルでのゲノム異常の蓄積を特徴とする血液病である。
【０００６】
本疾病による死亡は、汎血球減少症または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）への変換を原因とする。ＡＭＬは、骨髄および末梢血においての未熟骨髄系前駆細胞の蓄積を特徴とする血液癌である。
【０００７】
ＡＭＬ患者からの骨髄サンプルでの遺伝的転座の分析からは、造血にとって重要である転写因子が、白血病誘発において重要な役割を果たすことが明らかである。ＡＭＬの病因は多段階遺伝子変化に関与すると考えられる。ＨＳＣのみが自己複製の能力を有すると考えられるため、それらが多段階性、前白血病遺伝子変化の蓄積および、それらをいわゆる「白血病幹細胞」（ＬＳＣ）へ変換させる最良候補である。
【０００８】
また、下流前駆細胞は自己複製能力を得て、白血病を引き起こす可能性がある。ＬＳＣは特に現在の化学療法レジメンによっては標的化されないが、そのような細胞は薬物耐性および白血病再発の原因であることが発見されている。
【０００９】
ＳＡＬＬ遺伝子ファミリー、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ２、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４は、本来、ショウジョウバエｓｐａｌｔ（ｓａｌ）に対してそれらのＤＮＡ配列相同性に基づいてクローン化された。ショウジョウバエにおいて、ｓｐａｌｔは後頭部および前尾部の断片の発達に必要不可欠であるホメオティック遺伝子である。それは、気管の発生、光受容体の最終分化、および翅脈の配置において重要な役割を果たす。ヒトにおいて、ＳＡＬＬ遺伝子ファミリーは腫瘍形成のみならず正常な発達にも関連する。ＳＡＬＬタンパク質は、全タンパク質に分布されたマルチフィンガー領域を特徴とするＣ２Ｈ２ジンクフィンガー転写因子の群に属する。ショウジョウバエの気管発生の間、ｓｐａｌｔはウィングレスの活性下流標的、Ｗｎｔオーソログである。ＳＡＬＬ１は、コアクチベーターとして機能し、ＳＡＬＬとＷｎｔ／βカテニン経路間の相互作用は両方向性であることを示唆することにより、βカテニンと相互作用することが実証されてきた。
【発明の開示】
【００１０】
発明の開示
本発明は、発達に不可欠なジンクフィンガー型転写因子である、ＳＡＬＬ４、ショウジョウバエｓｐａｌｔへのヒトホモログに関連する。ＳＡＬＬ４およびそのアイソフォーム（ＳＡＬＬ４Ａ、ＳＡＬＬ４Ｂ、およびＳＡＬＬ４Ｃ）は、クローン化され配列決定される。本開示は、ＳＡＬＬ４がヒト原発性ＡＭＬにおいて遮断（ｔｕｒｎ ｏｆｆ）されることが出来なかったことを実証する。さらに、マウスモデルにおいて、ＳＡＬＬ４の構成的発現の白血病誘発可能性が実証される。さらに、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）のような兆候と症状および続発性可移植ＡＭＬを発症するＳＡＬＬ４Ｂ−トランスジェニックマウスを開示する。
【００１１】
髄鞘形成に関連するアポトーシスの増加は、トランスジェニックマウスの骨髄、およびコロニー形成（ＣＦＵ）分析において明らかである。両アイソフォームは、βカテニンに結合することが可能であり、相乗的にＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路を強化することが可能である。これはＳＡＬＬ４の構成的発現がＭＤＳ／ＡＭＬを引き起こすこと、およびそのような発現がＷｎｔ／βカテニン経路に影響を与えることを実証する。関連する態様では、開示されるマウスモデルは、ヒトＭＤＳ／ＡＭＬ変換と白血病幹細胞の病因におけるＷｎｔ／βカテニン経路の役割を調査するプラットフォームを提供する。
【００１２】
一実施形態では、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合される抗体または抗体フラグメントを開示する。
【００１３】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が開示され、該方法は、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体の治療的に有効な量を被検体に投与する段階を含む。
【００１４】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が示され、該方法は、配列番号：１に示される配列、配列番号：３に示される配列、配列番号：５に示される配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、配列番号：５の相補体、およびそれらのフラグメントを有するポリヌクレオチドの組成物を被検体へ投与する段階を含み、前記フラグメントは、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１５】
一実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が開示され、該方法は、配列番号：２、配列番号：４および／または配列番号：６に示される配列を有するポリペプチド組成物を被検体へ投与する段階を含む。
【００１６】
関連する態様では、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００１７】
一実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法が開示され、該方法は、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、その生体サンプルに、ハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１に示される配列、配列番号：３に示される配列、配列番号：５に示される配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、または配列番号：５の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブを接触させる段階と、プローブと生体サンプルのハイブリダイゼーションを検出する段階とを含み、ハイブリダイゼーションの検出はＭＤＳに相関する。
【００１８】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法が開示され、該方法は、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、生体サンプルを配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、サンプルへの抗体の結合を検出する段階とを含み、検出結合はＭＤＳに相関する。
【００１９】
一実施形態では、白血病幹細胞を単離する方法が示され、該方法は、被検体からの細胞のサンプルを採取する段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞をそのアミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞のサンプルから、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞選び出す段階とを含む。
【００２０】
他の実施形態では、ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を有する遺伝子導入動物が示され、動物は配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を発現するように改変される。関連する態様では、動物はその挿入されたＳＡＬＬ４遺伝子を構成的に発現する。
【００２１】
一実施形態では、ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を含む遺伝子導入動物を作成する方法が開示され、該動物は、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を構成的に発現するように改変され、該方法は、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコンストラクトを含む核酸分子を胚細胞へ導入する段階と、コンストラクトの導入の段階から生じる細胞から遺伝子導入動物を作成する段階と、遺伝子導入動物を繁殖してヒトＳＡＬＬ４遺伝子の遺伝子導入動物の同型接合体を得る段階と、遺伝子導入動物由来の組織からヒトＳＡＬＬ４転写物を検出する段階とを含む。
【００２２】
一実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの細胞発現を調整する方法が開示され、該方法は、ポリヌクレオチドへハイブリッドする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはポリヌクレオチドへハイブリッドするアンチセンスＲＮＡ、またはそれらのフラグメントを細胞へ導入する段階を含む。
【００２３】
一実施形態では、内細胞塊（ＩＣＭ）、腫瘍性組織、または腫瘍から単離された細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現するかどうかを判断する段階とを含む、潜在的多能性を有する細胞を同定する方法が開示され、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現の判断は、細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が多分化能を示す。
【００２４】
一形態において、そのＳＡＬＬファミリーメンバーはＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４を含む。関連する態様では、ＳＡＬＬ４はＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである。
【００２５】
他の態様では、薬剤はＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質またはＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である。関連する態様では、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質配列は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４を含む。その他の関連する態様では、核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５；配列番号：２１、および配列番号：２３を含む核酸配列のセンス鎖に相補的である。
【００２６】
一形態において、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、成体幹細胞、または癌幹細胞である。関連する態様では、組織は被検体からの血漿サンプルまたは生検サンプルである。さらに関連する態様では、被検体はヒトである。
【００２７】
一実施形態では、ＯＣＴ４発現に対するＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の影響を調整する薬剤を識別する方法が開示され、該方法は、機能的に連結されたＯＣＴ４プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーターレポーターコンストラクトを含むベクターと、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードする核酸を含むベクターとを細胞へ同時導入する段階、細胞を薬剤に接触させる段階、ならびに薬剤の存在および非存在におけるプロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階を含み、プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階はＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質／ＯＣＴ４相互作用に対する薬剤の影響に相関する。
【００２８】
関連する態様では、プロモーター領域は配列番号：２６に示される核酸配列を含み、発現レポータータンパク質はルシフェラーゼである。
【００２９】
他の実施形態では、被検体の細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現されるかどうかを判断する段階とを含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を診断する方法が開示され、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現の判断は、細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が腫瘍形成または増殖を示す。
【００３０】
一形態において、薬剤は標識化され、判断する段階は、薬剤の位置を画像化する装置に被検体をさらすことによる薬剤の検出を含む。関連する態様では、画像は磁気共鳴、Ｘ線、または放射性核種放出によって作成される。
【００３１】
一実施形態では、ＳＡＬＬ４の発現を抑制する薬剤を含む医薬組成物を被検体へ投与する段階を含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患の治療方法が開示され、ここで被検体の細胞は、自己複製の脱制御を示す。
【００３２】
他の実施形態では、薬剤−細胞相互作用および薬剤の標識化に十分な状態を提供するための１つ以上のＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質と、試薬および緩衝剤を検出するための薬剤と、検出試薬の標識化および薬剤の細胞への接触についての説明書と、構成要素を含む容器とを含む、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキットが開示される。
【００３３】
細胞を、ＳＡＬＬ４に対する抗体に接触させる段階と、抗体に接合された細胞を、流体および細胞の進入および放出のための少なくとも２つの開口部を備える表面境界キャビティへ適用する段階と、細胞および流体がキャビティを通過することを可能にする段階とを含む、増殖性疾患または腫瘍性細胞形成の進行に関連する細胞を検出する方法が開示され、混合流体における抗体結合細胞は光学検出器によって検出され、電圧は流体に加えられ、それによって、その電圧が１つ以上のコレクタにおいて結合細胞を類別する。
【００３４】
本発明の例示的な方法および組成物は、以下にさらに詳しく説明される。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明の組成、方法および培養方法の説明に先立って、本発明は特定の組成、方法、および実験方法に限定されず、そのような組成、方法および状態は変化してもよいことを理解されたい。また本願において使用される専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲でのみで限定されるため、限定することを意図しないということも理解されたい。
【００３６】
本願および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「１つの」および「その」は、その文脈が明記しない限り、複数照応的指示を含む。つまり、例えば、「核酸」の言及は、１つ以上の核酸、および／または本開示などを読む際に、当業者には明らかである、本願に記載の種類の組成物を含む。
【００３７】
別途定めのない限り、本願で使用される全ての技術用語および専門用語は、本発明の属する技術分野において通常の技術を有する者にはよく知られているような意味を有する。本願に説明されるものと類似のまたは同じである全ての方法および物質は、本発明の実施または試験において使用されるが、修正および変更が本開示の趣旨と範囲内に含まれるということが理解されるだろう。本願に記載されるすべての刊行物はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００３８】
ホメオボックスおよびホメオティック遺伝子は正常な発達において重要な役割を果たす。ホックスやパックスのような、一部のホメオボックス遺伝子は腫瘍遺伝子としてまたは腫瘍形成または白血病誘発における腫瘍抑制因子としても機能する。ＳＡＬＬ４、ホメオティック遺伝子および転写因子の重要な役割が、異形接合ＳＡＬＬ４変異がデュアン放射線症候群を引き起こすことにより、ヒトの発達において認められた。関連する態様では、白血病誘発におけるＳＡＬＬ４の発癌性の役割が本願で説明される。
【００３９】
一実施形態では、本開示は２つのＳＡＬＬ４アイソフォーム、ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂを識別する。関連する態様では、本開示は、ＳＡＬＬ４の核酸およびタンパク質の構成的発現に関連する血液悪性腫瘍およびその他の腫瘍等の増殖障害を有する患者を診断および治療するための手段としてのＳＡＬＬ４の核酸およびタンパク質の分析を提供する。関連する態様では、ＳＡＬＬ４は、癌の診断および治療のための悪性幹細胞マーカーをして機能する。
【００４０】
例えば、正常な造血中に、ＳＡＬＬ４アイソフォームはＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣ集団において発現され、正常なヒトの骨髄および末梢血において急速に遮断（ＳＡＬＬ４Ｂ）または下方制御される（ＳＡＬＬ４Ａ）。その一方、ＳＡＬＬ４は検査されたすべてのＡＭＬサンプル（Ｎ＝８１）においては構成的に発現され、ヒト原発性ＡＭＬおよび骨髄性白血病細胞株においては停止することが出来なかった。関連する態様では、体内でのＳＡＬＬ４の構成的発現の白血病誘発可能性がＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスの作製を通じて直接検査された。そのようなトランスジェニックマウスは、ヒトＭＤＳに酷似した、調節不全な造血を示し、移植可能なＡＭＬを示した。これらのＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳのような特性は、協同突然変異を必要とせず、早くて２ヶ月齢で見られる。これらのマウスで見られた無効造血は、ヒトＭＤＳにおいてのように、骨髄において顕著であるアポトーシスの増加に高い確率で続発する、過形成骨髄および奇異性末梢血血球減少（好中球減少および貧血）および形成不全症を特徴とする。学説にとらわれないが、これらのトランスジェニックマウスにおける白血病発達の遅い発現の理由は?８ヶ月の複製ストレスの間の追加的な遺伝子損傷の蓄積であるかもしれない。疾患の後期発症はＳＡＬＬ４導入ゲノム不安定性の結果でもあるかもしれない。
【００４１】
さらに、特定の、再発性の染色体転座は多くの白血病を特徴付け、それらは免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体の遺伝子伝子再配列の正常過程における分解に起因するが、正常な染色体内再配列よりも染色体内転座を引き起こす。染色体転座切断点でのタンパク質への遺伝子からの遺伝子情報の流れは、治療用薬剤が抑制することの出来るいくつかの点を有する。ジンクフィンガー結合タンパク質領域を有効利用する配列特異的結合因子は、異常遺伝子の融合産物の発現を停止させる染色体融合結合を標的化することの出来る遺伝子スイッチとして作用する、デノボ配列特異的結合因子を作り出すために使用されることが出来る。
【００４２】
一実施形態では、ＳＡＬＬ４は、遺伝子融合産物の発現を調節する遺伝子スイッチとして染色体融合結合を標的化する融合タンパク質構成として使用されることが出来る。組み換え融合タンパク質の生成は問う技術分野で既知である（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照）。
【００４３】
一実施形態では、ＳＡＬＬ４のタンパク質および／または核酸は、リンパ腫の亜集団および白血病またはその他のタイプの癌を診断するために検出される。他の実施形態では、ＳＡＬＬ４のタンパク質および核酸の検出は、増殖性疾患を発達させる／得る危険性のあるヒト被検体を含むがそれらに限定されない被検体を識別するために使用されることが出来る。
【００４４】
さらなる実施形態では、ＳＡＬＬ４のタンパク質レベルおよび核酸レベルを変化させる組成を識別する方法が開示される。関連する態様では、ＳＡＬＬ４は、ＳＡＬＬ４の阻害機能が、腫瘍の発達と進行を抑制する、治療標的として機能することが出来る。
【００４５】
他の態様では、白血病誘発へ関与するＳＡＬＬ４の潜在的機序の検査は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方が、ＨＳＣの自己複製を含む、Ｗｎｔシグナル伝達経路に不可欠な構成要素であるβカテニンと相互作用することを示す。さらに、両方ともが、ショウジョウバエおよびヒトにおけるＳＡＬＬファミリー機能に一致するレポーター遺伝子アッセイでのＷｎｔ／βカテニン経路を活性化することが出来る。さらには、βカテニンの状況と同様に、ＣＭＬにおけるＳＡＬＬ４発現は疾患の様々な段階で変化し、慢性期にないＳＡＬＬ４発現は未熟な芽球の加速期でのみ検出可能になり、芽球期において強く陽性である。
【００４６】
これらの研究に基づいて、作業仮説が開示される（例、図４ｄ参照）。学説にとらわれないが、ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４の構成的発現は、白血病性芽球に自己複製および／または脱分化等の幹細胞特性を得ることが出来るようにさせることが出来、こうして、ＬＳＣになることが出来る。本仮説モデルはβカテニンの場合に見られるものに匹敵するであろう。例えば、正常な骨髄造血において、βカテニンは、自己複製特性を示すＨＳＣにおいてのみ活性化される。ＣＭＬの芽球期において、βカテニンは、ＧＭＰにおいて活性化されることによって機能し、白血病性形質転換をもたらす。
【００４７】
他の態様では、癌遺伝子ＳＡＬＬ４は、正常な造血および白血病誘発において重要な役割を果たす。ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスはＭＤＳのような、移植可能である、続発性のＡＭＬ変換を伴う表現型を示す。ヒトＭＤＳの研究に利用可能な動物モデルは、現在ほとんどない。本願に説明される方法によって作成されたＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスは、モデルヒトＭＤＳおよびそのＡＭＬへの続発性の変換の理解と治療のための適した動物を提供する。ＳＡＬＬ４とＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の相互作用は、白血病誘発におけるＳＡＬＬ４の関与のもっともらしいメカニズムを提供するのみだけでなく、ＣＭＬ芽球化転換におけるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の活性化の理解を提供する。
【００４８】
本願に開示されるように、すべてのヒトＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４アイソフォームの識別とそれらの構成的発現が検査された。ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４発現の直接の影響が生体内で検査された。本開示は、マウスにおけるＳＡＬＬ４の構成的発現が、ＭＤＳのような症状や移植可能なＡＭＬへの変換を誘発するのに十分であることを実証する。本開示は、さらにＳＡＬＬ４はβカテニンを結合しＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路を活性化することが出来ることを実証する。ＳＡＬＬ４およびβカテニンは、ＣＭＬの様々な段階において類似の発現パターンを共有する。
【００４９】
一実施形態では、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＯ４４９５０）、配列番号：４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＯ１６５６６）、または配列番号：６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＯ１６５６７）に示されるアミノ酸配列をコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチドが提供される。関連する態様では、そのような配列は、配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹｌ７２７３８）、配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１７０６２１）、配列番号：５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１７０６２２）、またはそれらの補体に示される核酸配列を含む。もう１つの関連する態様においても、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターが開示され、それらは、ホスト細胞においてポリヌクレオチドの発現を導く調節配列に操作可能に関連する発現ベクターを含むが、それらに限定されるものではない。
【００５０】
他の実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。一形態において、そのようなポリペプチドを投与する段階を含む、個々における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療の方法が提供される。他の態様では、そのようなポリペプチドに結合する抗体またはそれらの結合フラグメントも開示される。
【００５１】
開示される方法に使用される抗体は、ＳＡＬＬ４または、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるそれらのアイソフォームを含むポリペプチドを特異的に結合する抗体を含む。一形態においては、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のフラグメントが使用されそのような抗体を生成する。関連する態様では、そのようなフラグメントは配列番号：１３から基本的に構成される。
【００５２】
一実施形態では、潜在的多能性を有する細胞を識別する方法が開示され、該方法は内細胞塊（ＩＣＭ）から単離された細胞、腫瘍性組織からの細胞、または腫瘍からの細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現するかどうかを判断する段階とを含み、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を判断する段階は、細胞における自己複製の誘導に正に相関し、それによって、そのような発現は多分化能を示す。
【００５３】
一形態において、ＳＡＬＬファミリーメンバーはＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４を含む。関連する態様では、ＳＡＬＬ４はＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである。
【００５４】
他の態様では、薬剤はＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質に対するまたはＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である。関連する態様では、そのＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質配列は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４を含む。もう１つの関連する態様において、核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：２１および配列番号：２３を含む核酸配列のセンス鎖に相補的である。
【００５５】
一形態において、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、または胚性癌腫（ＥＣ）細胞、成体幹細胞、癌幹細胞である。関連する態様では、その組織は被検体からの血漿サンプルまたは生検サンプルである。さらなる関連する態様では、被験者はヒトである。
【００５６】
本願に使用される、「潜在的多能性」とは有糸分裂によって自己複製する細胞の能力を意味する。
【００５７】
本願に使用される「正に相関する」とは、認められた現象に肯定的に関連することを意味する。例えば、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ導入は細胞の自己複製力の増大に関連する。
【００５８】
本願に使用される、「新生物」とは、その文法的な変化を含むが、良性または癌性であるかもしれない組織の新しい異常な成長を意味する。
【００５９】
本願に使用される、「基本的に構成される」とは特異的な分子実体（例えば、特異的な配列識別子などを含むがそれらに限定されない）および、特異的な分子実体に関連する特性に物質的には影響しないその他の分子実体を含む。例えば、配列番号：１３を含む融合タンパク質およびアジュバントは、配列番号：２、配列番号：４、および／または配列番号：６に対する免疫原性反応を生成するため、配列番号：１３から基本的に構成される。
【００６０】
抗体は当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，３９１，５８９号で論じられる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント抗体、Ｆ（ａｂ’）フラグメント抗体、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗イディオ抗体などを含む）、および上記すべてのエピトープ結合フラグメントを含むが、それらに限定されるものではない。本願に使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含む分子を示す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の全てのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであることが出来る。
【００６１】
本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド架橋Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）および、ＶＬまたはＶＨ領域のいずれかを含むフラグメントを含む、抗体フラグメントを含むが、それらに限定されるものではない。抗原結合抗体フラグメントは、一本鎖抗体を含むが、可変領域単独または以下のもの、ヒンジ領域、ＣＨｌ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の全体もしくは一部との組合せであることが出来る。また、本発明において、ヒンジ領域、ＣＨｌ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域との可変領域の組合せを含む、抗原結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳類を含むいかなる動物起源であってもよい。一形態において、抗体はヒト抗体、マウス抗体（例えば、マウスおよびラットなど）、ロバ抗体、羊抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、テンジクネズミ抗体、ラクダ抗体、ウマ、または鶏である。さらに、そのような抗体は、動物抗体のヒト化型である（例、米国特許第６，９４９，２４５号などを参照）。本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多特異性である。
【００６２】
本発明の抗体は、当技術分野において既知であるすべての適切な方法によって生成されることができる。関心の抗原に対するポリクローナル抗体は当技術分野において既知の様々な過程によって生成されることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、それらに限定されず、様々なホスト動物に投与され、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生成させる。ホスト動物種によって、免疫反応を高めるための様々なアジュバントが使用され、それらは、フロインド（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールならびに、ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）またはコリネバクテリウムパルブムのような潜在的に役立つヒトアジュバントを含むが、それらに限定されない。そのようなアジュバントも当技術分野において既知である。さらに、抗体およびタンパク質を結合する抗体のようなものはファージ提示法によって作られる（例、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｐｅｔｒｅｎｋｏ、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ（１９９７）９７（２）：３９１−４１０などを参照）。
【００６３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、ならびにファージ提示技術、またはそれらの組合せを使用することを含む、当技術分野において既知の様々な技術を使用して、調合されることが出来る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ＣｅＩｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）（参考文献は、参照によって全体が組み入れられる）に教示の方法を含む、ハイブリドーマ技術を用いて生成されることが出来る。本願に使用される「モノクローナル抗体」という用語はハイブリドーマ技術を通じて生成される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」は単一クローンから起因する抗体を示し、全ての真核性、原核生物、またはファージクローンを含み、それが生成される方法を含まない。
【００６４】
一実施形態では、そのような抗体を用いての白血病幹細胞を単離する方法が提供され、該方法は、被検体から細胞のサンプルを得る段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を発現する細胞を、そのアミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を発現する細胞のサンプルから、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞を選び出す段階とを含む。関連する態様では、選別の段階は、蛍光励起細胞選別および／または磁性粒子選別による選別を含む。
【００６５】
他の関連する態様では、マーカーはＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＭＰＯ、および／または非特異的エステラーゼである。さらなる関連態様では、白血病幹細胞はＢ細胞（Ｂ２２０およびＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ５）、巨核球（ＣＤ４１）、および赤血球（Ｔｅｒ１１９）マーカーに対して陰性である。
【００６６】
一実施形態では、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキットが開示され、そのキットは１つ以上のＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質マーカーを検出する薬剤、薬剤細胞相互作用および薬剤の標識化のための十分な状態を提供する試薬および緩衝剤、検出薬剤の標識化と薬剤の細胞への接触のための説明書、および構成要素を含む容器を含む。
【００６７】
該開示の方法により、細胞集団から、配列番号：１３を含むマーカーの発現に陽性である細胞から、そうでない細胞を最初に選別することによって幹細胞を識別する。その後、関心幹細胞を陽性マーカーの細胞から選択し、これは既知の細胞マーカーの発現で細胞を選別することにより実行される。関心幹細胞に関連することで知られるすべてのマーカーを使用することが出来る。
【００６８】
幹細胞が発見される疑いのあるすべての細胞集団は、開示される方法によって選別されることが出来る。一形態において、細胞は非胎児動物の骨髄から得られ、それらはヒト細胞を含むがそれらに限定されるものではない。胎児細胞も使用することができる。
【００６９】
細胞選別は、蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｂａｕｍｇａｒｔｈ ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４３：７７−９７などを参照）および磁性粒子細胞選別（ＭＡＣＳ）による選別を含む、当技術分野において既知の細胞を選別するためのいかなる方法によるものであることが出来る。従来のＭＡＣＳの過程はＭｉｌｔｅｎｙｉら、「Ｈｉｇｈ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＡＣＳ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１１：２３１−２３８（１９９０）によって説明される。ＭＡＣＳによって細胞を選別するには、細胞を磁性粒子で標識化し、その細胞常磁性分離柱から通過させる。分離柱は協力永久磁石で配置され、柱内に磁場を作り出す。磁気的に標識化された細胞は、柱に捕捉され、そうでない細胞は、通過する。その後、捕捉細胞を柱から溶出する。一実施形態では、ＳＡＬＬ４に対して誘導される抗体が胚幹細胞、成体幹細胞および／または癌幹細胞を単離する細胞選別において使用される。他の実施形態では、ＳＡＬＬ４に対して誘導される抗体はフローサイトメトリー分析で使用され、ＳＡＬＬ４を発現する細胞を検出し、そのような細胞は、増殖性疾患の進行または腫瘍性細胞形成に関連する。関連する態様では、ＳＡＬＬ４はＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである。
【００７０】
一実施形態では、生体サンプルにおいて配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの有無を検出する方法が開示され、該方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、生体サンプルに配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５に示される配列、または配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブを接触させる段階と、ハイブリダイゼーションがポリヌクレオチドの存在を示す、プローブとサンプルのハイブリダイゼーションを検出する段階とを含むがそれらに限定されるものではない。
【００７１】
他の実施形態では、生体サンプルに存在する、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法が開示され、該方法は、ポリペプチドに結合する抗体を提供する段階と、生体サンプルを抗体に接触させる段階と、結合がポリペプチドの存在を示す、抗体の生体サンプルへの結合を判断する段階とを含むが、それらに限定されるものではない。
【００７２】
一実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療方法が説明され、該方法は、配列番号：１に示される核酸配列、配列番号：３に示される核酸配列、配列番号：５に示される核酸配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、配列番号：５の相補体、またはそれらのフラグメントを有するポリヌクレオチドを、被検体へ投与する段階を含み、前記フラグメントは、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。関連する態様では、該方法は配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５に示されるポリヌクレオチドを投与する段階を含む。一形態において、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００７３】
一実施形態では、ＯＣＴ４発現に対するＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の影響を調節する薬剤を識別する方法が開示され、該方法は、操作可能に連結されたＯＣＴ４プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーターレポーターコンストラクトを含むベクターと、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質コードする核酸を含むベクターとを、細胞に同時導入する段階と、細胞に薬剤を接触させる段階と、薬剤の存在および非存在におけるプロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階とを含み、プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階は、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質／ＯＣＴ４相互作用に対する薬剤の影響に相関する。
【００７４】
関連する態様では、プロモーター領域は、配列番号：２６を含む核酸配列を含むが、それらに限定されず、発現レポータータンパク質はルシフェラーゼである。
【００７５】
他の実施形態では、ＳＡＬＬ４の発現を抑制する薬剤を含む医薬組成物を、被検体へ投与する段階を含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を治療する方法が開示され、被検体の細胞は自己複製の脱制御を示す。
【００７６】
他の実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する物質を識別する方法が提供され、該方法は、ポリペプチドを候補物質に接触させる段階とポリペプチドへの物質の結合を検出する段階とを含む。
【００７７】
一実施形態では、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能を調節する物質を識別する方法が開示され、該方法は、ポリペプチドを候補物質に接触させる段階とポリペプチドの活性を判断する段階とを含み、その候補物質の存在下での活性における変化は、物質がポリペプチドの機能を調節していることを示す。
【００７８】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法が開示され、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、生体サンプルをハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１に示されるポリヌクレオチド配列、配列番号：３に示されるポリヌクレオチド配列、配列番号：５に示されるポリヌクレオチド配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、または配列番号：５の相補体のうちの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するプローブに接触させる段階と、ハイブリダイゼーションを検出する段階がＭＤＳと相関する、プローブと生体サンプル間のハイブリダイゼーションを検出する段階とを含むが、それらに限定されない。一形態において、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００７９】
他の実施形態では、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法が開示され、該方法は、被検体からの生体サンプルを提供する段階と、生体サンプルを配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、検出結合がＭＤＳに相関する、サンプルへの抗体の結合を検出する段階とを含むが、それらに限定されない。一形態において、ＭＤＳは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００８０】
一実施形態では、被検体の細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤へ接触させる段階と、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、細胞において発現されるかどうかを判断する段階とを含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を診断する方法が開示され、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現の判断は、細胞においての自己複製の誘発と正に相関し、それによって、そのような発現が腫瘍の形成または増殖を示す。
【００８１】
一形態において、薬剤は標識化され、判断段階は、薬剤の位置を画像化する装置に被検体をさらすことによる検出を含む。関連する態様では、画像は磁気共鳴、またはＸ線、または放射性核種放出によって生成される。
【００８２】
一実施形態では、急性原発性骨髄性白血病細胞に構成的に発現されるジンクフィンガー型転写因子をコードするポリヌクレオチドの細胞発現を調節する方法を含み、該方法は、ポリヌクレオチドへハイブリッドする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはポリヌクレオチドへハイブリッドするアンチセンスＲＮＡ、またはそれらのフラグメントを細胞へ導入する段階を含む。関連する態様では、調節は下方制御である。
【００８３】
一実施形態では、遺伝子導入動物が開示される。一般的な態様において、遺伝子導入動物は、その導入遺伝子の発現を許可する方法で外来遺伝子を導入することにより作成される。遺伝子導入動物の作成の方法は、概して、ＷａｇｎｅｒとＨｏｐｐｅ（参照として本願に取り込まれる米国特許第４，８７３，１９１号）、全体が参照として本願に組み入れられる、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８５）、および全体が参照として本願に組み入れられる「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、（ｅｄｓ．，Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｍｉ ａｎｄ Ｌｏｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））で説明される。
【００８４】
一般的に、遺伝子はマイクロインジェクションによって受精卵へ移入される。微量注入された卵は、ホストの雌へ移植され、その子孫は、導入遺伝子の発現を検査される。遺伝子導入動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、魚類を含むが、それらに限定されない多くの動物からの受精卵から作成されてもよい。
【００８５】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは当技術分野で既知のすべての方法によって作成することが出来る。例えば、マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは細菌プラスミドの配列を除去するのに適した酵素、およびＴＢＥ緩衝剤で１％アガロースゲルで電気泳動させられたＤＮＡのフラグメントで、標準技術を用いて分割することができる。ＤＮＡバンドはエチジウムブロマイドで染色することによって可視化され、発現配列を含むバンドが除去される。除去されたバンドは、その後０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を有する透析袋に置かれる。ＤＮＡは透析袋へ電気溶出され、１：１のフェノール：クロロフォルム溶液で抽出され、２ボリュームのエタノールによって沈殿される。ＤＮＡは１ｍｌの低塩緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）で再び溶かされ、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（商標）カラムで精製される。カラムは、最初に３ｍｌの高塩緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）で感作され、続いて５ｍｌの低塩緩衝液で洗浄される。ＤＮＡ溶液はカラムを３回通過し、ＤＮＡをカラム担体へ結合する。３ｍｌの低塩緩衝液で１回洗浄した後、ＤＮＡは０．４ｍｌの高塩緩衝液で溶出され、２ボリュームのエタノールによって沈殿される。ＤＮＡ濃度は紫外分光光度計において２６０ｎｍでの吸収によって測定される。
【００８６】
本発明はさらに、少なくとも１つの、その有効量で疾患を治療することの出来る組成物と、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の組成物は、記載の通りのその他の治療薬を含むことができ、例えば、従来の個体または液体の賦形剤もしくは希釈剤を採用することにより、製剤処方の技術において既知である技術に従って、望ましい投与のモードへ適した種類の医薬品添加物（例えば、添加剤、結合剤、保存料、安定剤、香料など）に加えて、採用することにより処方されてもよい。
【００８７】
発明の製造品の組成物として採用される医薬組成物は、個体、溶液、乳剤、分散、ミセル、リポソームおよび同様のものなどの形態で使用されることができ、結果の組成物は、腸内または非経口の使用に適した有機または無機のキャリアもしくは添加剤の混合剤で、活性材料としての上記の組成物を１つ以上含む。発明の製造品の組成物として使用されるために採用される組成物は、例えば、通常の非毒性で、薬学的に許容される、タブレット、ペレット、カプセル、坐薬、溶液、乳剤、懸濁液、およびその他の使用に適した形態のためのキャリアと組み合わせられてもよい。使用されるキャリアは、グルコース、ラクト−ス、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および製造調合剤の使用に適したその他のキャリアを個体、半個体、または液体の形態で含む。さらに、補助剤、安定剤、濃厚剤、そして着色剤と香料が使用されてもよい。
【００８８】
発明医薬組成物は、例えば、タブレット、カプセル、顆粒または粉などの形態での経口投与、舌下投与、口腔投与、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、嚢内注射もしくは注入技術などによる非経口投与（例えば、無菌注射剤の水性または非水性の溶液もしくは懸濁液として）、吸入噴霧などによる経鼻投与、クリームまたは軟膏などの形態での局所的投与、または坐薬などの形態での経直腸的投与により、非毒性の、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む投与量ユニット形態ですべての適切な方法によって投与されることが出来る。本組成物は、例えば、短時間作用型または持続放出型に適した形態で投与されることが出来る。短時間作用型または持続放出型は、本組成物を含む適した医薬組成物の使用によって、または、特に持続放出型の場合は、皮下移植または浸透圧ポンプなどの装置を使用することにより、達成されることが出来る。本組成物はリポソームで投与されることも出来る。
【００８９】
霊長類に加えて、ヒトなど、様々なその他の哺乳類が本発明の方法によって治療されることができる。例えば、ウシ、羊、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、テンジクネズミ、ラットまたはその他のウシ亜科の動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物またはネズミ科に属する種を含むが、それらに限定されない哺乳類が治療されることが出来る。しかし、該方法は、鳥類のような（例えば、鶏など）、他の種においても実践されることが出来る。
【００９０】
細胞が調整のため標的化されることが望ましい、上述の方法で治療された被検体はウシ、羊、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、テンジクネズミ、ラットまたはその他のウシ亜科の動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物またはネズミ科に属する種を含むが、それらに限定されない哺乳類であり、好ましくは、ヒトで、男性または女性である。
【００９１】
「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医、医師あるいはその他の臨床医によって探られている組織、システム、動物、またはヒトの生物学的または医学的な反応を引き起こすであろう対象組成物の量を意味する。
【００９２】
本願に使用される、「組成物」という用語は、特定の量で特定の材料を含む製品を、直接的にまたは間接的に、特定の量で特定の材料の組合せから出来るすべての製品と同様に含むことを意図する。「薬学的に許容される」ことを意味するキャリアにおいて、希釈剤または添加剤は処方のその他の材料と適合しなくてはならず、それらの受容体に対して毒性であってはならない。
【００９３】
組成物「の投与」およびまたは組成物「を投与する」という用語は、本発明の組成物を治療が必要な個体に提供することを意味すると理解されるべきである。
【００９４】
本発明の組成物の投与のための医薬組成物は投与量ユニットで小分けに提示されることができ、製薬額の技術において既知であるすべての方法によって調合されることが出来る。すべての方法は、活性材料を１つ以上の副成分を含むキャリアに結合させる段階を含む。一般的に、医薬組成物は、均一に、密接に、活性材料を液体キャリアまたは微紛化された個体キャリアまたはその両方と結合させ、その後、必要に応じて、製品を望ましい形態に成形することによって調合される。医薬組成物において、活性対象組成物は疾患の進行または状態に対して望ましい効果を作り出すのに十分な量で含まれる。
【００９５】
活性成分を含む医薬組成物は、例えば、タブレット、トローチ、ロゼンジ、水性または油性の懸濁液、分散剤もしくは顆粒、乳剤、硬性または軟性のカプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤などとして、経口使用に適した形態であることが出来る。
【００９６】
経口使用を目的とした組成物は、医薬組成物の製造の技術で知られているすべての方法によって調合されることが出来、そのような組成物は、薬学上の優れた、口に合う調合を提供するために、甘味剤、香料剤、着色剤および保存剤からなる群より選択される薬剤を１つ以上含むことができる。タブレットは、タブレットの製造に適した非毒性の、薬学的に許容される添加剤の混合剤で活性材料を含むことが出来る。これらの添加剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ソーダ、ラクト−ス、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような、不活性希釈剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、例えばスターチ、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、そして例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクなどの潤滑剤であることが出来る。タブレットはコーティングされなくてもよく、または胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それにより、より長い期間の持続作用を提供することの出来る既知の技術によってコーティングされても良い。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料が採用されてもよい。また、それらは放出を制御するための浸透圧治療タブレットを形成するようコーティングされてもよい。
【００９７】
経口使用のための処方は、活性材料が例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性個体希釈剤と混合される硬性ゼラチンカプセルとして、または、活性材料が、水もしくは、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、あるいはオリーブ油などの油媒体と混合される軟性ゼラチンカプセルとして示されてもよい。
【００９８】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した添加剤での混合剤で活性物質を含む。そのような添加剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムなどの懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は、例えばレシチンなどの天然フォスファチド、または例えばステアリン酸ポリオキシエチレンなどのアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合物、または例えばへプタデカエチレンオキセタノールなどのエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、またはエチレンオキシドのポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような脂肪酸およびへキシトール由来の部分エステルとの縮合物、または例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキシドの脂肪酸およびへキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物であってもよい。水性懸濁液は、さらに例えばエチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などの１つ以上の保存料、１つ以上の着色剤、１つ以上の香料剤、さらにスクロースまたはサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含んでもよい。
【００９９】
油性懸濁液は活性材料を例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油で懸濁することにより処方されることができる。油性懸濁液は例えば蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの濃厚剤を含んでもよい。上述のような甘味剤、および香料剤が口当たりのいい経口剤を提供するために加えられてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化物質の追加によって保存されてもよい。
【０１００】
水の追加による水性懸濁液の調合に適した分散パウダーおよび顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の保存料との混合剤での活性材料を提供する。適した分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は上述によって例示される。例えば、甘味剤、香料剤および着色剤などの追加の添加剤が存在してもよい。
【０１０１】
シロップおよびエリキシル剤は、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤で処方されることが出来る。そのような処方は、鎮痛薬、保存料および香料剤と着色剤を含むことが出来る。
【０１０２】
医薬組成物は無菌注射剤の水性または油性の懸濁液の形態であることができる。本懸濁液は、既知の技術に従い、上述の適した分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて調合されることができる。無菌注射剤の調合は、例えば１，３−ブタンジオールの溶液として、非毒性の薬学的に許容される希釈剤もしくは溶剤における無菌注射剤の溶液または懸濁液であることができる。許容される賦形剤および溶剤において、水、リンガー溶液および等張食塩水溶液が採用される。さらに、滅菌の固定油は、溶剤または懸濁溶媒として通常に採用される。本目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含む、すべての無菌性の固定油が採用されてもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注入剤の調合において使用される。
【０１０３】
本発明の組成物は、薬剤の直腸投与のための坐薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物はその薬剤を、通常の温度では個体であり直腸温では液体になり、それゆえ直腸で解けて薬剤を放出する、適した非毒性の添加剤と混合することにより調合されることが出来る。そのような物質はココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１０４】
局所使用には、本発明の組成物を含むクリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液などが採用される（本使用の目的のため、局所使用は洗口剤およびうがい薬を含む）。
【０１０５】
本開示に基づく、ＳＡＬＬ４を抑制するポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、例えば、癌などの腫瘍、または細胞周期および／または細胞成長の適切な調節の損失を含む障害、または特異的細胞死が望ましいその他の障害の予防または治療（全体的または部分的）を目的とする個々の治療において遺伝子治療法に使用されることができる。
【０１０６】
ウィルスベクターなどのベクターが、当技術において、核酸を様々な種類の標的細胞に導入するために使用されてきた。一般的に、ベクターは標的細胞にさらされ、トランスフェクションが細胞の十分な部分で行われることができ、望ましいポリペプチドの発現からの有用な治療効果または予防的効果を提供する。トランスフェクションされた核酸は永久に各標的化された腫瘍細胞のゲノムへ組みこまれ、長期持続効果を提供し、または代わりに治療は定期的に繰り返される必要がある場合がある。
【０１０７】
様々なベクター、ウィルスベクターとプラスミドベクターの両方は、米国特許第５，２５２，４７９号およびＷＯ９３／０７２８２に参照される、当技術分野において既知である。具体的には、ＳＶ４０のようなパポバウィルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、またレトロウイルスを含む多くのウィルスが、遺伝子移入ベクターとして使用されてきた。当技術分野における多くの遺伝子治療プロトコルが、無能力のマウスレトロウイルスを使用してきた。
【０１０８】
ウィルスベクターの使用の代わりとして、核酸を細胞へ導入するためのその他の既知の方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム同時沈殿法、マイクロインジェクション法、弾道法、リポソームで媒介される導入法、ＤＮＡ取り込み法などの機械的技術法、および受容体介在ＤＮＡ導入法が挙げられる。
【０１０９】
受容体介在遺伝子導入は、核酸がタンパク質リガンドにポリリシンを介して連結され、標的細胞の界面に存在する受容体に対して特異的であるリガンドを伴う、核酸を特定の細胞へ特異的に標的化するための技術の例である。
【０１１０】
細胞が調整のため標的化される被検体の治療において、適切な投与レベルは、一般的に、単回投与または反復投与で投与される、１日あたりの患者の体重１ｋｇあたりの約０．０１ｍｇから５００ｍｇである。好ましくは、投与レベルは１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは１日当たり約０．５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇである。適した投与レベルは、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから２５０ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇであることができる。この範囲内で投与量は、１日当たり、約０．０５から０．５、０．５から５または５から５０ｍｇ／ｋｇであることができる。経口投与には、組成物は、治療される患者への投与量の症候性調節のため、好ましくは１．０から１０００ミリグラムの活性材料、具体的には、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、および１０００．０ミリグラムの活性材料を含む、タブレットの形態で提供される。組成物は１日あたり１回から４回のレジメンで投与されることができ、好ましくは１日あたり１回または２回である。
【０１１１】
しかしながら、いかなる特定の患者に対する特定の投与レベルならびに投与の回数は変えることができ、採用される特異的組成物の活性、組成物の代謝的安定性および活性の長さ、年齢、体重、通常の健康状態、性別、食事、投与の方法と時間、排せつの割合、薬剤の組合せ、特定の状態の重症度、および治療中のホストなどを含む様々な要因によって変わるということが理解されるだろう。
【０１１２】
以下の実施例は発明を説明することを目的とするが、それを限定するものではない。
【０１１３】
実施例１
方法
分子クローニング
プラスミドコンストラクションおよびＤＮＡシークエンシングが標準の方法に従って実施された。ＳＡＬＬ４アイソフォームのクローニングのため、ＰＣＲプライマーが、ゲノムクローンＲＰ５−１１１２Ｆｌ９（配列番号：２５）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０３４４２０）に基づき、指定された。ＳＡＬＬ４アイソフォームは、ヒトの胎児の腎臓に由来するマラソン−レディｃＤＮＡライブラリ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、サプライヤープロトコルに従いクローン化された。増幅されたＰＣＲ産物はＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へクローン化され、ヌクレオチド配列はＤＮＡシークエンシングにより決定された。ＧＡＬ４−ＳＡＬＬ４Ｂコンストラクトは、ＰＣＲにより、各端部で、制限酵素部位、ＢａｍＨＩを伴う５’プライマーおよび３’プライマーを使用し、生成された：
５’プライマー：
；および３’プライマー：
。
【０１１４】
ＧＡＬ４−ＳＡＬＬ４Ｂコンストラクトは、第１アミノ酸のメチオニンを除く、最小ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域および完全長のＳＡＬＬ４Ｂの９３アミノ酸をコードするものとされる。
【０１１５】
異なる組織における選択的スプライシングパターンの決定
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲが使用され、成人組織におけるＳＡＬＬ４のｍＲＮＡ発現パターンを評価した。８つの正常化第１ストランドｃＤＮＡ調合液のパネルは、異なる成人組織から由来し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入された。ＰＣＲ増幅が、５μｌのｃＤＮＡ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を含む５０−μｌ反応体積で実施された。９４℃で１０分間の初期変性の後、増幅が３０サイクルで以下の条件の下実施された：９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長。続いて最後のサイクルは、７２℃での最終の７分間の伸長であった。
【０１１６】
グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの増幅は鋳型濃度ローディングの対照に使用された。ＳＡＬＬ４アイソフォームに対して特異的に選択されたプライマーのペアは以下である。
【０１１７】
１）ＳＡＬＬ４Ａプライマー（センスプライマー：
；アンチセンスプライマー：
）。
【０１１８】
２）ＳＡＬＬ４Ｂプライマー（センスプライマー：
；アンチセンスプライマー：
）。
【０１１９】
ＰＣＲ産物は電気泳動的に１％アガロースゲルで分離された。ＤＮＡシークエンシングはまた増幅産物を確認するために使用された。
【０１２０】
抗体生成
ヒトＳＡＬＬ４のペプチドＭＳＲＲＫＱＡＫＰＱＨＩＮ（配列番号：１３）は、その潜在的抗原性（アミノ酸１〜１３）に対して選ばれ、抗ペプチド抗体を生成するために使用された。本領域はマウスＳＡＬＬ４の領域とも同一であり、生成された抗体がマウスＳＡＬＬ４と交差反応することを可能にする。ＳＡＬＬ４抗ペプチド抗体はウサギにおいて、Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）との協力において作成された。
【０１２１】
ゲル電気泳動ならびにウエスタンブロット分析
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が、ラエムリ法に従いＳＤＳ１０％ｗ／ｖポリアクリルアミドスラブゲルにおいて実施され、タンパク質はその後、ニトロセルロース膜へ移された。ＳＡＬＬ４抗ペプチド抗体（１：１００）を伴うウサギ免疫血清の免疫ブロット法は、説明されるように、電気化学発光検出システムで製造会社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって実施された。
【０１２２】
白血病と正常組織
白血病サンプルと正常なサンプルは、パラフィンブロックまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）での凍結のいずれかで、テキサス州立大学ＭＤのファイルから採取された。Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、およびＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９９８から２００４年の間、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄプロトコル認可。すべての腫瘍の診断は、造血形新生物のＦＡＢ分類に従い、形態学的および免疫表現型的基準に基づく。ＣＤ３４＋新鮮細胞がＣａｍｂｒｅｘから購入された。
【０１２３】
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ５’ヌクレアーゼ分析が（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）これらの研究で使用された。正常骨髄および末梢血からの精製ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣからの全ＲＮＡ、１５ＡＭＬサンプル、および３つの白血病細胞系がＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔで単離され、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）で消化された。ＲＮＡ（１μｇ）が２０μＬでＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素およびポリ（ｄＴ）１２〜１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写された。８０μＬの水および混合液を追加した後、５−μＬのアリコートが各ＴａｑＭａｎ反応に使用された。ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアバーション１．５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用するように設定されている。ＳＡＬＬ４およびＧＡＰＤＨのリアルタイムＰＣＲがＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行された。ＰＣＲ反応混合液は３．５ｍＭのＭｇＣｌ２；各０．２ｍＭのデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）；０．４ｍＭのデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）；０．５μＭフォワードプライマー；０．５μＭリバースプライマー；０．１μＭ ＴａｑＭａｎプローブ；０．２５ＵウラシルＤＮＡグリコシラーゼ；および０．６２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼを、１×ＴａｑＭａｎＰＣＲ緩衝液に含んだ。ｃＤＮＡ（５μＬ）がＰＣＲ混合液に加えられ、ＰＣＲ反応の最終体積は２５μＬであった。すべてのサンプルは二重で実行された。ＧＡＰＤＨは内因性対照として使用された。熱循環の状態は５０℃で２分間、９５℃で１０分間であり、および９５℃で０．３０分間、そして６０℃で１分間の４５サイクルであった。データはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアバージョン１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析された。結果はサイクル閾値（Ｃｔ）の値である。ソフトウェアは、基準蛍光信号に基づき閾値ラインを測定し、閾値に合うデータポイントはＣｔ値として与えられる。Ｃｔ値は鋳型の複製の最初の数に反比例する。すべての測定はニ重して実施された。ＴａｑＭａｎ配列は以下を含む。
【０１２４】
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：
およびリバースプライマー：
、ＴａｑＭａｎプローブ：
、およびＳＡＬＬ４フォワードプライマー：
およびリバースプライマー：
。
【０１２５】
組織配列の設計および構成
白血病標本からの３部腫瘍核を含んだ組織配列を切断した（厚さ５μｍ）。手動組織配列器（Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使用して、組織配列を構成した。
【０１２６】
免疫組織化学
免疫組織化学的染色を標準技術によって実施した。手短に言えば、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した厚さ４μｍの組織切片を脱パラフィン化して水和した。加熱誘導（ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ）エピトープをトリス緩衝液（ｐＨ９．９；Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）および高速マイクロ波ヒストプロセッサで回収した。１００度での１０分間のインキュベーションの後、スライドを水道の流水で５分間、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）で５分間洗浄した。そして組織切片は、室温の加湿室内で５時間、抗ＳＡＬＬ４抗体（１：２００）によりインキュベートした。ＰＢＳによる３回の洗浄後、組織切片は室温で３０分間、抗マウス免疫グロブリンＧおよびペルオキシダーゼによりインキュベートした。
【０１２７】
ＰＢＳによる３回の洗浄後、組織切片は着色のために３，３’−ジアノベンジジン／Ｈ２Ｏ２（Ｄａｋｏ）によりインキュベートし、ヘマトキシリンを使用して切片を対比染色した。腫瘍性細胞は、明確な核染色を示した時にＳＡＬＬ４に対して陽性であると考えられた。
【０１２８】
トランスジェニックマウスの生成
コーディング領域全体に対応するＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡは、ｐＣＥＰ４ベクター（ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ；ｎｏｗ Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にサブクローン化し、遺伝子導入実験のためのＣＭＶ／ＳＡＬＬ４Ｂコンストラクトを作成した。ＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡ内を切り取らないＳａｌＩによる後の消化は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＬＬ４ ｃＤＮＡコーディング領域、ＳＶ４０イントロン、および追加ベクター配列のないポリアデニル化信号のみを含む線形断片を放出した。
【０１２９】
トランスジェニックマウスは、エール大学のトランスジェニックマウス施設で、前核注入を介して生成した。ＳＡＬＬ４Ｂ初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスの識別および導入遺伝子の伝達はＰＣＲ分析によって判定した。遺伝子型に使用されるＰＣＲプライマーは、ＣＭＶプロモーター（センスプライマー：
への５’ＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡの注入に及び、アンチセンスプライマーは
）である。
【０１３０】
血液学的分析
自動差異を伴う全血球計算値は、Ｍａｓｃｏｔ Ｈｅｍａｖｅｔ細胞カウンタ（ＣＤＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＣＴ）により判定した。前駆細胞検定に対して、１．５×１０４骨髄細胞を、組み換えマウスインターロイキン−３（ＩＬ−３）（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびエリスロポエチン（３Ｕ／ｍｌ）（Ｍ３４３４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａ）で補充された二つ組の１．２５ｍｌメチルセルロース培養に載せた。コロニーは７から１４日の間に記録した（ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、およびＢＦＵ−Ｅ）。末梢血、骨髄塗抹標本、およびプールＣＦＵ細胞からのサイトスピンは、ライトギムザ染色で染色した。
【０１３１】
フローサイトメトリー分析
細胞は、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）またはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に対して、直接共役抗体により染色した。１万個の散在ゲート赤血球は、ＦＡＣＳｃａｎ上で獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で分析した。
【０１３２】
統計分析
通常の両側分布および不等分散を想定して、スチューデントｔ−検定を全ての統計分析に使用した。
【０１３３】
細胞培養
ＨＥＫ−２９３細胞（ヒト胚腎臓由来）および細胞系ＫＧ．１、Ｋａｓｕｍｉ−１、およびＴＨＰ−１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）より購入した。細胞は、５％二酸化炭素および１０％胎児血清を伴う加湿環境内で３７℃に維持した。
【０１３４】
トランスフェクション
トランスフェクションは、メーカーの指示に従って、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により実施した。細胞は、〜１×１０５細胞／ウェルまでの濃度で２４ウェルプレートに載せた。細胞は、トランスフェクションの２４時間後に収穫した。一時的トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で調製した。
【０１３５】
β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ検定
細胞は、トランスフェクションの２４時間後に、１００μｌのルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉ）で抽出した。１０μｌの細胞抽出物により実施したβガラクトシダーゼ検定は、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびメーカー提供の標準検定プロトコル（炭酸ソーダの代わりに、停止緩衝液として１Ｍトリス基剤を使用したことを除く）を使用した。ルシフェラーゼ検定（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対しては、５μｌの抽出物をメーカーの指示に従って使用した。バックグラウンドの減算後、ルシフェラーゼ活性（任意の単位）を、各サンプルに対してβ−ガラクトシダーゼ活性（任意の単位）に対して正常化した。
【０１３６】
プロモーターレポーター検定
一般的に、ＯＣＴ４プロモーター（配列番号：２６）を含む０．２５〜０．３μｇのＯＣＴ４−Ｌｕｃコンストラクト（ＰＭＯｃｔ４）、またはＳＡＬＬファミリータンパク質（つまり、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、ＳＡＬＬ４Ａ、またはＳＡＬＬ４Ｂ）プロモーター（つまり、それぞれ配列番号：２７、配列番号：２８、および配列番号：２９であり、ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂはプロモーターを共有する）を含むＳＡＬＬ−Ｌｕｃコンストラクトは、０．１μｇから０．１２μｇのレニラプラスミドおよび／または、ＨＥＫ−２９３またはＣＯＳ−７細胞中でＳＡＬＬファミリータンパク質またはＯＣＴ４タンパク質を発現する様々な量（０〜１．０μｇ）のプラスミドに同時導入される。典型的に、ｐｃＤＮＡ３ベクターは対照として使用した。そしてトランスフェクト細胞は、トランスフェクション後の２４時間のルシフェラーゼ活性について監視した。
【０１３７】
結果
ヒトＳＡＬＬ４の２つの選択的スプライシングアイソフォームの分子クローニング
ＳＡＬＬ４の２つの全長転写物は、ヒト胎児腎臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして使用し、５’および３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（５’および３’ｃＤＮＡ端ポリメラーゼ連鎖反応の高速増幅）によって単離した。
【０１３８】
単離されたより大きいｃＤＮＡ断片の配列分析は、強いコンセンサスインターフェロン配列から始まり、１，０５３のアミノ酸をコードすることが予期された、ＳＡＬＬ４Ａと指定される単一の大型オープンリーディングフレームを明らかにした。ＳＡＬＬ４Ｂに指定されるＳＡＬＬ４の他のスプライシング変異体は、全長ＳＡＬＬ４Ａのアミノ酸３８５〜８２０に対応する領域が欠けていた（図１ａ）。ＳＡＬＬ４Ｂ ｃＤＮＡによってコードされる推定タンパク質は、６１７のアミノ酸から成ることが予期された。
【０１３９】
これら２つの明白なスプライシング変異体が人工物に起因するかもしれないという可能性を除外するため、ヒトゲノムの対応配列を伴う両方の変異型ｍＲＮＡ配列を比較した。ＳＡＬＬ４Ａは全エクソン（１〜４）を含んだが（図１ａ）、ＳＡＬＬ４Ｂはエクソン２の３’大部分が欠けていた。両方のエクソン−イントロンスプライス部位は、Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ規則を満たした。両方のスプライシング変異体には同じ翻訳リーディングフレームがあったが、ＳＡＬＬ４Ｂ ｍＲＮＡは内部欠損のあるタンパク質をコードした。ＳＡＬＬ４Ａは８つのジンクフィンガー領域を含んだ一方で、ＳＡＬＬ４Ｂには３つのジンクフィンガー領域があった。
【０１４０】
ヒト組織におけるＳＡＬＬ４アイソフォームの発現パターン
ＳＡＬＬ４の選択的スプライシングパターンは、種々のヒト組織における逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって描かれた。遍在ＧＡＰＤＨ遺伝子ｃＤＮＡの断片は、対照として増幅した（図１ｂ）。より長いスプライス変異体を表す３１５−ｂｐ断片であるＳＡＬＬ４Ａは、一部組織中で増幅し、様々な発現レベルを達成した。ＳＡＬＬ４Ｂ変異体は、発現の様々なレベルにおいてあらゆる組織中に存在した。造血組織におけるＳＡＬＬ４発現についての詳細な研究は、次の結果で説明される。
【０１４１】
ＳＡＬＬ４抗体の生成ならびにＳＡＬＬ４タンパク質産物の識別
ＳＡＬＬ４遺伝子産物を識別し、ＳＡＬＬ４変異体の存在を確認するため、ＳＡＬＬ４の合成ペプチド（アミノ酸１〜１３）に対するポリクローナル抗体を開発した。両方のＳＡＬＬ４変異体に共通であるため、本領域を選んだ。アフィニティ精製したＳＡＬＬ４ペプチド抗体は、ヒト腎臓全溶解液中の２つの内因性タンパク質を特異的に認識した。２つのタンパク質は約１６５ｋＤａと９５ｋＤａであり、それぞれＣｏｓ−７細胞において過剰発現されたＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの分子量と同一であった（図１ｃ）。本抗体によるウエスタンブロット法は、ＳＡＬＬ４アイソフォームにはｍＲＮＡレベルで認められるものと同様であった異なる組織分布があったことを確認した（図１ｂ−Ｂ）。
【０１４２】
ヒト原発性ＡＭＬおよび骨髄性白血病細胞株におけるＳＡＬＬ４の非遮断
ＳＡＬＬ４が位置する染色体領域２０ｑ１３は、腫瘍に頻繁に関与するため、ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４のｍＲＮＡ発現を調べた。ＳＡＬＬ４の発現は、ＡＭＬサンプル由来の骨髄細胞（Ｎ＝１５）、骨髄性白血病細胞株（Ｎ＝３）においてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量的に調査し、精製ＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞プール（Ｃａｍｂｒｅｘより購入したＨＳＣ／ＨＰＣ）からの非腫瘍性造血性細胞、正常骨髄（Ｎ＝３）、および正常末梢血（Ｎ＝３）と比較した。アイソフォーム特異的プライマー（図２ａ参照）を使用すると、ＳＡＬＬ４Ｂおよび／またはＳＡＬＬ４Ａのいずれかまたは両方は、ＡＭＬサンプルまたは骨髄性白血病細胞株中で遮断（ＳＡＬＬ４Ｂ）または下方制御（ＳＡＬＬ４Ａ）されなかった。データは、ＧＡＰＤＨの内因性発現に対して正常化し、精製ＣＤ３４＋細胞中のＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ発現のレベルに対して調整した。正常骨髄におけるＳＡＬＬ４Ｂ完全欠損とは対照的に、原発性ＡＭＬにおけるその発現は、１５のＡＭＬサンプル中１３で、かつ３つ全ての骨髄性白血病細胞株で遮断されなかった。原発性ＡＭＬサンプルにおけるＳＡＬＬ４Ａの中央正常化レベルは正常骨髄よりも４０倍高かった。骨髄性白血病細胞株ＫＧ．１、Ｋａｓｕｍｉ−１およびＴＨＰ−１におけるＳＡＬＬ４Ａ発現は、正常骨髄よりもそれぞれ、８倍、２５倍、および２４０倍高かった。興味深いことに、ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂ発現レベルは両方とも、正常骨髄と比べて、ＡＭＬサンプルの６０％および３つ全ての細胞株において増加した。ＡＭＬサンプルの残りの４０％では、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂのいずれかが下方制御しなかった。
【０１４３】
ヒト原発性ＡＭＬにおけるＳＡＬＬ４タンパク質の構成的発現
認められた異常ＳＡＬＬ４発現がタンパク質レベルでも存在するかどうかを調査するため、ＡＭＬクラスＭ１からＭ５（ＦＡＢ分類）に及ぶ８１のＡＭＬサンプルを調べた：Ｍｌ（Ｎ＝２０）、Ｍ２（Ｎ＝２７）、Ｍ３（Ｎ＝８）、Ｍ４（Ｎ＝１６）、Ｍ５（Ｎ＝３）、およびＡＭＬ非特定（Ｎ＝７）で、正常骨髄、胸腺および脾臓の一部のサンプル、ならびに正常ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣであった。
【０１４４】
正常骨髄、脾臓および胸腺は、検出可能なＳＡＬＬ４タンパク質発現を示さず、正常ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣは、陽性であるがより弱いＳＡＬＬ４タンパク質染色を呈したが、より強いＳＡＬＬ４発現が白血病細胞の核において検出された（図２ｂ−Ｆ）。全８１ＡＭＬサンプルは異常ＳＡＬＬ４発現を示し、最も強い染色はＡＭＬ−Ｍ１および−Ｍ２で見られた。これらの所見は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって実証されたＳＡＬＬ４のｍＲＮＡ発現レベルと一致した（図２ａ）。データは、ＳＡＬＬ４がＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣにおいて存在し、成熟顆粒球およびリンパ球において下方制御されたことを示唆した。結果として、白血病におけるＳＡＬＬ４の構成的発現は、白血病性芽球が通常ＨＳＣで見られる特性を鑑別および／または獲得することを防いだのかもしれない。
【０１４５】
全長ヒトＳＡＬＬ４Ｂを構成的に発現するトランスジェニックマウスの生成
ＳＡＬＬ４の構成的発現がＡＭＬを誘発するのに十分であるかを直接的に試験するため、ＳＡＬＬ４トランスジェニックマウスモデルを生成した。ＣＭＶプロモーターはヒトＳＡＬＬ４Ｂの６１７のアミノ酸をコードするｃＤＮＡに融合し（図３ａ−Ａ）それは以前に調べたあらゆる組織中で発現されたため選ばれた（図１ｂ−Ｂ）。ＣＭＶプロモーターは、ほとんどのネズミ臓器においてヒト遺伝子を異所的に発現させるために以前に使用した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行い、トランスジェニックマウスにおける野生型（ＷＴ）全長ＳＡＬＬ４Ｂの過剰発現を調べた。
【０１４６】
ＳＡＬＬ４Ｂ転写物は、脳、腎臓、肝臓、脾臓、末梢血、リンパ節、および骨髄を含む、トランスジェニックマウスからの種々の組織において検出された（図３ａ−Ｂ）。生後３週間の異常歩行および関連水頭症が、複数系統からのトランスジェニックマウスの２０％において認められ、６０％に多嚢胞腎臓を認めた。これらの所見は、ＳＡＬＬ４Ｂが神経および腎臓発生において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１４７】
ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳ様症状およびＡＭＬ
６つ全ての系統からの１４匹のトランスジェニックマウスのコホートにおける血液学的異常の監視は、６〜８月齢で全マウスに明白なＭＤＳ様特徴があったことを明らかにした。過分葉好中球および偽ペルゲル・フェット様細胞を含む、増加した数の未熟芽球および多くの異型および異形成白血球が、末梢血塗抹標本上で見られた（図３ｂ）。有核赤血球および巨大血小板、ならびに二核赤血球前駆細胞および低分葉巨核球などの赤血球および巨核球異形成の特徴も存在した。
【０１４８】
これら１４匹のマウスのうち６匹（４３％）が最終的に急性白血病に達した（表１）。
【０１４９】
（表１）ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳ様／ＡＭＬの概要
【０１５０】
肺、腎臓、肝臓、脾臓、およびリンパ節を含む、多くの臓器の白血病の浸潤は、疾患の悪性度を強調した（図３ｃ）。白血病芽細胞は、ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＭＰＯ、および非特異的エステラーゼが陽性であったため、元来は骨髄性と考えられ、Ｂ細胞（Ｂ２２０およびＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ５）、巨核球（ＣＤ４１）、および赤血球（Ｔｅｒ１１９）マーカーで陰性であった（図３ｄ）。
【０１５１】
ＳＡＬＬ４Ｂ誘発性ＡＭＬは移植可能であった
発症が約６週間である侵攻性致命的ＡＭＬは、皮下注射によるＳＡＬＬ４Ｂ誘発性ＡＭＬ細胞の連続移植後に、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに発生させた。移植疾患は、多臓器への播種によって特徴付けられ、顕著な脾腫および肝腫脹を伴った（図３ｅ）。
【０１５２】
ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおける無効造血および過剰アポトーシス
若年ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウス（２〜６月齢）における血液学的異常の調査は、それらの末梢血が最低限の骨髄異形成特徴だが、統計学的有意な白血球減少および好中球減少、ならびに軽度の貧血を示したことを明らかにした（表２）。
【０１５３】
（表２）ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスおよび野生型対照からのＣＢＣ
【０１５４】
これらのトランスジェニックマウスにおける血球減少の原因が産出の問題に関連したかどうかを判定するため、それらの骨髄を検討した。骨髄サンプルは、ＷＴ対照と比較して、細胞充実度の増加および骨髄性細胞集団の増加を示した（図３ｆ）（ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＧｒ−１／Ｍａｃ−１二重陽性集団：６７±１６％、Ｎ＝１０に対して、ＷＴ：５５．３±４％、Ｎ＝１１；Ｐ＝０．０４８）。
【０１５５】
過剰アポトーシスがヒトＭＤＳにおける無効造血で中心的役割を果たすため、インビボおよびインビトロのＳＡＬＬ４トランスジェニックマウスにおけるアポトーシスを次に調べた。アポトーシスの増加が、一次骨髄（トランスジェニックマウスにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性、ＰＩ陰性集団：４．４±２．４％、Ｎ＝１０に対して、ＷＴ：１．８６±１．５５％、Ｎ＝７；Ｐ＝０．０３）および７日ＣＦＵ（トランスジェニックマウスにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性、ＰＩ陰性集団：２０．１±６％、Ｎ＝１０に対して、ＷＴ：１０．９±４％、Ｎ＝７；Ｐ＝０．００２）上の両方でＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおいて認められた（図３ｆおよびｇ）。これらの所見は、骨髄中の脊髄性細胞集団の増加にもかかわらず、これらのトランスジェニックマウスには、その骨髄中の進行中の無効骨髄造血に続発する、末梢血中の統計学的有意な低い好中球数があるという事実を説明することができる。未熟細胞の集団の増加も、一次骨髄（ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおけるｃ−ｋｉｔ陽性集団：１０．２±１．３％、Ｎ＝１４に対して、ＷＴ：６．５±２．５％、Ｎ＝１０；Ｐ＝０．００８）（図３ｆ）および７日ＣＦＵ（ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＣＤ３４陽性集団：１１±２．２％、Ｎ＝８に対して、ＷＴ：６．３±２．４％、Ｎ＝７；Ｐ＝０．００２）上の両方でＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおいて注目された（図３ｇ）。同様数の総コロニーがＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウス（平均＝５１、Ｎ＝１０）およびＷＴ対照（平均＝４０、Ｎ＝６）において認められた。しかし、ヒトＭＤＳ患者およびその他のＭＤＳマウスモデルで報告されているように、増加した脊髄性細胞および減少した赤血球コロニー集団（図３ｈ）が、ＷＴ対照と比較してＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスＣＦＵにおいて見られた。これらの結果は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスにおける欠陥は、造血分化に影響する幹細胞／前駆細胞レベルにあることを示唆する。
【０１５６】
インビトロでのβ−カテニンへのＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの結合
ＳＡＬＬ４が白血病誘発において影響を及ぼす場合のある潜在的シグナル伝達経路を次に探索した。ショウジョウバエにおいて、ｓｐａｌｔ（ｓａｌ）は、Ｗｎｔシグナル伝達の下流ターゲットである。ＳＡＬＬ遺伝子ファミリーのもう１つのメンバーであるＡＬＬ１は、β−カテニンと相互作用することが可能である。本相互作用に対する高親和性部位は、Ｃ末端二重ジンクフィンガー領域に位置する。ＳＡＬＬ１の本領域は、ＳＡＬＬ４のもとのほぼまさに同一であることが分かった。本所見は、ＳＡＬＬ４もβ−１２カテニンに結合できたかどうかの調査を促進した。血球凝集素（ＨＡ）に付いたＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの発現コンストラクトが生成された。図４ａに示されるように、内因性β−カテニンは、ＨＡ単独ではなく、ＨＡ−ＳＡＬＬ４ＡおよびＨＡ−ＳＡＬＬ４Ｂによってプルダウンされた。
【０１５７】
ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂ両方によるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化
β−カテニンとのＳＡＬＬ４アイソフォームの相互作用の機能的効果を調査するため、例示的なＷｎｔシグナル伝達経路を活性化するＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの潜在能力を判定するためのＷｎｔ応答要素の複数の複写を含むルシフェラーゼレポーター（ＴＯＰｆｌａｓｈ；Ｕｐｓｔａｔｅ ＵＳＡ）を使用した。本レポーターコンストラクトは、種々の細胞系においてＷｎｔ１によって能率的に刺激されることが示されている。ＴＯＰｆｌａｓｈレポータープラスミドは、ＷｎｔおよびそのＷｎｔ／β−カテニンシグナル経路の両方が存在したＨＥＫ−２９３細胞系に一過性に遺伝子導入した。ＴＯＰｆｌａｓｈレポータープラスミドは、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂにも同時導入した。ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂの両方によるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の有意な活性化は、ルシフェラーゼ活性の増加によって示された（図４ｂ）。
【０１５８】
ＣＭＬの異なる段階におけるβ−カテニンおよびＳＡＬＬ４の同様な発現パターン
調節不全なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、ＬＳＣの発生に関与することが知られている。β−カテニンのＬＳＣ自己複製への関与の最もよい証拠は、ＣＭＬ芽球化現象の研究によってもたらされる。Ｗｎｔシグナル伝達は慢性期ではなく、ＣＭＬの芽球期に活性化され、その時にβ−カテニンの活性化などの調節不全なＷｎｔシグナル伝達は、ＣＭＬのＧＭＰにで自己複製の特性を与えて芽球化転換に繋がった可能性があるという結論が下されたことが実証されている。
【０１５９】
ＳＡＬＬ４とβ−カテニンとの間の潜在的な相互作用、およびショウジョウバエにおけるＷｎｔシグナル伝達の下流ターゲットとしてのｓｐａｌｔの位置を所与として、異なる段階でのＣＭＬにおけるＳＡＬＬ４タンパク質発現を調べた。ＳＡＬＬ４発現は、芽球期ＣＭＬに存在したが（Ｎ＝１２，７５％）、慢性期には存在しなかった（Ｎ＝１１，１００％）（図４ｃ）。芽球が増加する加速期（Ｎ＝６，１０％）では、ＳＡＬＬ４を発現する未熟芽球が、好中球などの非染色性成熟骨髄性細胞のバックグラウンド上に認められた。
【０１６０】
ＯＣＴ４プロモーターに対するＳＡＬＬ４の効果
ＯＣＴ４に対するＳＡＬＬ４の効果を識別するため、細胞、ＯＣＴ４−Ｌｕｃコンストラクトをレニラプラスミドおよび増加する濃度のＳＡＬＬ４Ｂに同時導入した（図５）。図が示すように、増加するＳＡＬＬ４Ｂは、ＯＣＴ４プロモーター活性を８倍以上増加させた。
【０１６１】
ＯＣＴ４がＳＡＬＬ遺伝子メンバープロモーターの活性を刺激するかどうかを判定するため、プロモーターコンストラクト（ｐＳＡＬＬ１、ｐＳＡＬＬ３、およびｐＳＡＬＬ４）をＨＥＫ−２９３細胞中のＯＣＴ４に同時導入した。データ（図６）に図示されるように、２４時間のトランスフェクション後の後に、ＯＣＴ４の過剰発現は、ｐｃＤＮＡ３ベクター対照と比較すると、ＳＡＬＬ遺伝子メンバーＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４のプロモーター活性を際立って刺激した。また、この活性化は少量の過剰ＳＡＬＬ４の存在により完全に阻止された（図１０）。
【０１６２】
ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質によるＳＡＬＬプロモーターの自己調整があったかどうかを判定するため、ＳＡＬＬ４−Ｌｕｃはレニラレポーターに同時導入し、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ発現プラスミドのいずれかがＨＥＫ−２９３およびＣＯＳ−７細胞である（図７）。図に示されるように、ＳＡＬＬ４（ＡおよびＢアイソフォームの両方）は、異なる細胞系においてそれ自身のプロモーター活性を抑制する。さらに、本自己抑制は用量依存性である（図８参照）。ＳＡＬＬ４プロモーターとのＳＡＬＬ４の比率が６：１に達した時、プロモーター活性は、基礎レベルと比較して約３．５倍低下した。本データは、ＳＡＬＬ４が自己抑制機能を持つことを示す。このことは全てのＳＡＬＬメンバーに該当するわけではなく、例えば、ＳＡＬＬ１はそのプロモーターの自己抑制を明示しない（図１２）。
【０１６３】
データは、ＳＡＬＬ１およびＳＡＬＬ３プロモーターが外から加えられたＳＡＬＬ４によって際立って活性されたことも示し（図９参照）、ＳＡＬＬ４が胚幹細胞機能を伴うＳＡＬＬ遺伝子ファミリーの他のメンバーを調整することができることを示す。
【０１６４】
ＳＡＬＬ４プロモーターに対するＯＣＴ４の刺激はＳＡＬＬ４によって完全に阻止することが可能であるため（図１０）、ＳＡＬＬ４を調べて、その他のＳＡＬＬメンバープロモーターに対するＯＣＴ４の活性化を抑えるかどうかを判定した。図１１に示されるように、ＳＡＬＬ４は、その他のＳＡＬＬメンバープロモーターのＯＣＴ４活性化も阻止した。
【０１６５】
成体幹細胞および胚性癌腫におけるＳＡＬＬ４
幹細胞とその分化子孫との間で区別することが可能であるマーカーの欠如のため、組織幹細胞集団の特徴は困難なままである。多くの組織にとって、分子マーカーの一団は、幹細胞コンパートメントを画定するように開発されている。
【０１６６】
本データは、ＳＡＬＬ４が多分化能および自己複製における胚幹細胞の主要調節因子であることを示す。例えば、胚性癌腫は、初期胚幹細胞の表現型を示し、潜在的多能性を持つ。したがって、免疫組織化学による、この種類の腫瘍におけるＳＡＬＬ４タンパク質の発現を調べた。免疫組織化学データは、胚性癌腫の全腫瘍細胞が核染色を示したが、全ての非腫瘍細胞が陰性だったことを決定的に示した。これらの結果は、ＳＡＬＬ４は、正常および悪性胚生殖細胞および胚幹細胞に対する特異的マーカーとして使用することが可能であることを示唆する。
【０１６７】
ＳＡＬＬ４がきわめて初期の胚幹細胞において発現され、胚性癌腫がこれらの細胞の変換より生じることが報告されていることを考えると、免疫組織化学は、ａ）正常乳腺小葉中のＳＡＬＬ４陽性細胞が上皮の２％未満を占め、ｂ）乳癌サンプルにおいて、細胞の集団または散在性細胞におけるＳＡＬＬ４タンパク質発現が認められたことも示す。さらに、ＳＡＬＬ４タンパク質は、正常乳房上皮細胞および乳癌細胞の核において発現された。また、この多能性の遺伝子発現は、前立腺および肺などのその他の正常成人組織、およびＳＡＬＬ４抗体を伴うこれらの組織から生じる癌腫において認められた。気管支上皮および前立腺房、およびそれらの間質細胞における少数のＳＡＬＬ４発現細胞の存在、ならびにＳＡＬＬ４が胸の小葉性上皮細胞と同様の頻度で、正常前立腺および肺において発現したという所見が認められた。また、前立腺癌における散在性腫瘍細胞は、ＳＡＬＬ４抗体による免疫組織化学研究によってＳＡＬＬ４タンパク質を発現した。
【０１６８】
結論として、本実施例は、（１）抗ＳＡＬＬ４抗体による免疫染色は、胚性癌腫の識別において有用な診断ツールである、（２）ＳＡＬＬ４の発現は、一部のヒト幹細胞および癌細胞において見られる、（３）ヒト組織中のＳＡＬＬ４発現細胞の識別は、幹細胞、その前癌状態クローン、および悪性Ｔ細胞を識別するために使用することが可能である、（４）ＳＡＬＬ４は、胚幹細胞、成体幹細胞および癌幹細胞に対する理想的なマーカーを代表する、ということを解明する。
【０１６９】
参考文献
【０１７０】
本発明は上記の実施例を参照して説明したが、本発明の精神および範囲内に変更および変化が包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求項の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１（ａ〜ｃ）は、３つのＳＡＬＬ４アイソフォーム（ＳＡＬＬ４Ａ、配列番号：ｌ［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹｌ７２７３８］、ＳＡＬＬ４Ｂ、配列番号：３［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ１７０６２１］、およびＳＡＬＬ４Ｃ、配列番号：５［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ１７０６２２］）の領域を示す。選択的スプライシングはＳＡＬＬ４ｍＲＮＡの２つの異形を生成する。図１（ａ）ＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４Ｂはタンパク質の長さおよび特性ｓａｌ様ジンクフィンガー領域の異なる数の存在において異なる。ＳＡＬＬ４Ａ（１，０６７アミノ酸をコード）は、８つのジンクフィンガー領域を含み、一方ＳＡＬＬ４Ｂ（６２３アミノ酸をコード）は、３つのジンクフィンガー領域を有する。ＳＡＬＬ４Ｃは２７６アミノ酸を含み、アミノ酸４３から８２０の完全長ＳＡＬＬ４Ａに一致する領域を欠く。両方の変異体は１、３、および４のエクソンを有し、ＳＡＬＬ４Ａは１から４のすべてのエクソンを含む。しかしながら、ＳＡＬＬ４Ｂは、エクソン２の大きな３’の部分の欠失に繋がる選択的スプライス受容部を使用する。図１（ｂ）は、異なる組織におけるＳＡＬＬ４の変異のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＳＡＬＬ４の４つのエクソンとそれらの潜在性コーディング構造が、ＳＡＬＬ４転写物（Ａ）のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーを示す矢印で示さる。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）によるＳＡＬＬ４転写物の組織依存的な発現。プライマーＡ１（エクソン２）およびＢ１（エクソン４）を伴う、ＳＡＬＬ４Ａに対して特異的な３１５−ｂｐ期待産物はｃＤＮＡの様々な組織で増幅される。プライマーＤ１（エクソン４）およびＣ１（エクソン１）は、ＳＡＬＬ４Ｂの１，８５１−ｂｐ期待産物を増幅するために使用された。同等の量のｃＤＮＡがＧＡＰＤＨによって測定された。図１（ｃ）は、ＳＡＬＬ４ペプチド抗体によって識別されたＳＡＬＬ４タンパク質産物、ＳＡＬＬ４Ａ、およびＳＡＬＬ４Ｂを示す。Ｈｉｓ−ＳＡＬＬ４Ｂ（レーン１）、Ｈｉｓ−ＳＡＬＬ４Ａ（レーン２）、または対照ベクター（レーン８）を一時的に発現するＣｏｓ−７細胞からの溶解液、または異なるヒト組織からの溶解液は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分解され、ニトロセルロース膜へ移され、Ｎ末端ＳＡＬＬ４ペプチド抗体で検査された。
【図２】図２（ａ〜ｂ）は、ヒト原発性ＡＭＬおよび骨髄性白血病細胞株におけるＳＡＬＬ４の発現を示す。図２（ａ）は、ＳＡＬＬ４がＡＭＬにおいて遮断されないことを実証する。ＧＡＰＤＨに正規化されたＳＡＬＬ４ＡおよびＳＡＬＬ４ＢのリアルタイムＰＣＲ定量化は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方が精製ＣＤ３４＋細胞において発現されたが、ＳＡＬＬ４Ａは急速に下方制御され、ＳＡＬＬ４Ｂは正常な骨髄（Ｎ＝３）細胞および正常な末梢血（Ｎ＝３）細胞で遮断されたことを示した。その一方、１５の原発性ＡＭＬサンプルおよび３つの骨髄性白血病細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−１、ＴＨＰ−１、およびＫＧ．１）において、ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂ、あるいはその両方の発現は、下方制御されることが出来なかった。その結果は、精製ＣＤ３４＋細胞におけるＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂの発現に対し調整された。図２（ｂ）は、免疫組織化学的染色によって示されるように、ヒトＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ１−Ｍ５、Ｎ＝８１）におけるＳＡＬＬ４タンパク質の構成的発現を示す。正常骨髄（Ａ）、正常脾臓（Ｂ）、または正常胸腺（Ｃ）においてＳＡＬＬ４発現は検出されなかった。すべての細胞核が青く染色された。ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣの核はＳＡＬＬ４発現（Ｄ）を示す茶色い染色を示し、急性骨髄性白血病芽球はマイクロアレイ白血病組織サンプルと同様の染色（Ｅ、低力［×４］）を示した。それぞれの丸は１つの白血病サンプルを表す。（Ｆ）１つの白血病サンプルの高倍率（×１００）の図がパートＦに示される。赤い矢印は陽性の核染色を示す。
【図３】図３（ａ〜ｈ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスがＭＤＳのような／ＡＭＬ表現型を有することを示す。図３（ａ）は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスの生成を表し、ＣＭＶ／ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックコンストラクトおよびトランスジェニック系統のＰＣＲ分析５０７を表す。（Ａ）トランスジェニックコンストラクトの系統図。約１．８−ｋｂのＳＡＬＬ４ＢのｃＤＮＡがｐＣＥＰ４ベクターへサブクローン化され、ＣＭＶ／ＳＡＬＬ４コンストラクトはＳａｌＩでの消化によって励起された。（Ｂ）トランスジェニックマウスにおけるＳＡＬＬ４Ｂの組織分布。ＲＴ−ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーの位置は、パートＡの矢印によって示される。Ｃ末端でヒトＳＡＬＬ４Ｂに対して特異的なプライマーは５’プライマーとして使用され、様々な組織のＲＴ−ＰＣＲのためのＳＶ４０−非コード配列特異的プライマーと組み合わされる。図３（ｂ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＤＳのような変化を実証する。正常で、年齢の一致する同じＷＴ同腹子からの末梢血のギムザ染色は、好中球正常（Ａ）、および正常赤血球と血小板（Ｂ、黒矢印）を示した。トランスジェニックマウスにおいて、好中球は過分葉であり（Ｅ）、偽ペルゲルフェット様異常白細胞が表れ、（Ｆ−Ｈ）、未熟細胞（Ｉ−Ｋ）の数の増加を伴う。有核赤細胞（Ｌ、赤矢印）、巨大血小板（Ｍ、赤矢印）、および多染性（Ｎ）もトランスジェニックマウスにおいて認められる。二核異形成赤血球（Ｏ、赤矢印）および次小葉中核を伴う異形成巨核球（Ｐ、赤矢印）がトランスジェニックマウス骨髄からのサイトスピンで発見された。ＷＴ対照動物からの赤血球前駆細胞（Ｃ）および巨核球（Ｄ）が比較のために示される。図３（ｃ）は、ＡＭＬがＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスで見られることを示す。芽球は末梢血（Ａ、×６００）、骨髄生検標本（Ｂ、×１００；Ｃ、×４００）、骨髄標本（Ｄ、×６００）、肝臓（Ｅ、×１００）、リンパ節（Ｆ、×４００）、および脾臓（ＧとＨ、総体図；Ｉ、×１００；差し込み図×４００）で見られた。図３（ｄ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスにおけるＡＭＬのフローサイメトリ分析を示す。ＡＭＬ細胞はＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、およびＭａｃ−１に対して陽性であり、Ｂ２２０、ＣＤ３、およびＴｅｒ１１９に対して陰性であった。図３（ｅ）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのＳＡＬＬ４Ｂ導入ＡＭＬの連続移植を実証する。白血病移植の６週間後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて白血病浸潤により引き起こされる、脾腫（３ｅ−Ａ黒矢印、３ｅ−Ｃ）、肝腫大（３ｅ−Ａ二重黒矢印、３ｅ−Ｄ）、リンパ節増大（３ｅ−Ｂ黒矢印、３ｅ−Ｅ）および弱い腎臓（３ｅ−Ｂ二重黒矢印、３ｅ−Ｆ）に関する総体図（Ａ＆Ｂ）および組織学（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、×２００）。図３（ｆ）は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスと対照マウスの骨髄の比較を示す。ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスの骨髄は、対照ＷＴマウスに比べ、増加した細胞質、骨髄集団（Ｇｒ−１／Ｍａｃ−１二重陽性）、未熟集団（ｃ−ｋｉｔ陽性）、およびアポトーシス（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）を示した。図３（ｇ）は、ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスからのＣＦＵにおいて未熟細胞およびアポトーシスの増加があることを示す。培養の７日目に、対照ＣＦＵにおいてよりも、より多くの数の未熟細胞（Ｂ、Ｃ、およびＤ、赤矢印）とアポトーシスを起こした細胞（Ｂ、Ｃ、およびＤ、二重赤矢印）がトランスジェニックマウスＣＦＵにおいて、認められた（Ａ）。形態学的観察に一致し、アポトーシス（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性、Ｅ）およびより多くのＣＤ３４＋未熟細胞の増加があった（Ｆ）。図３（ｈ）は、ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスと対照マウスの骨髄ＣＦＵの比較を示す。ＳＡＬＬ４Ｂトランスジェニックマウスと対照マウスのＣＦＵ分析において発見された異なる種類のコロニーの割合（Ａ）。ＳＡＬＬ４ＢトランスジェニックマウスからのＣＦＵは、対照マウスに比べ、統計的に、ＣＦＵ−ＧＭでの顕著な増大（Ｂ）（トランスジェニック：５３．６±１０．３、Ｎ＝１３ｖｓ．ＷＴ：３８．１±３．１、Ｎ＝８；Ｐ＝０．００２）を示し、ＢＦＵ−Ｅでの減少（トランスジェニック：７．８±３．８、Ｎ＝１３ｖｓ．ＷＴ：１４．１±２．７、Ｎ＝８；Ｐ＝０．００１）を示した。
【図４】図４（ａ〜ｄ）は、ＳＡＬＬ４とＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の相互作用を実証する。図４（ａ）は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方がβカテニンと相互作用することを示す。Ｃｏｓ−７細胞から作られた核抽出物（溶解液）は、一時的にＨＡ−ＳＡＬＬ４ＡまたはＨＡ−ＳＡＬＬ４Ｂでトランスフェクトされた。（Ａ）抗ＨＡ抗体ＳＡＬＬ４Ａ（１６５ｋＤａ）とＳＡＬＬ４Ｂ（９５ｋＤａ）の両方を認識した。（Ｂ）βカテニンは溶解液で検出された。（Ｃ）免疫沈降がＨＡ親和性樹脂を使用して実施され、抗βカテニン抗体で検出された。βカテニンはすぐにＨＡ−ＳＡＬＬ４ＡとＨＡ−ＳＡＬＬ４Ｂプルダウンの両方で検出された。図４（ｂ）は、ＳＡＬＬ４ＡとＳＡＬＬ４Ｂの両方によるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の活性を示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は１．０μｇのＳＡＬＬ４ＡプラスミドまたはＳＡＬＬ４Ｂプラスミドのいずれか、およびトップフラッシュレポータープラスミドでトランスフェクトされた（Ｕｐｓｔａｔｅ ＵＳＡ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）。Ｗｎｔ１またはｍｏｃｋでの２４時間の刺激後、ルシフェラーゼ活性が測定された。図４（ｃ）は、免疫組織化学的染色によって実証されるように芽球期（Ｎ＝１２）でＳＡＬＬ４タンパク質発現が存在するが、ＣＭＬの慢性期（Ｎ＝１１）では存在しないことを実証する。（Ａ）は、異なる段階でのＣＭＬ採取の組織配列の低倍率図を示す。ＳＡＬＬ４発現は、すべての細胞の核は青いままで（Ｂ、×４；Ｄ、×４００）、慢性期ＣＭＬ（Ｂ）において見られなかった。ＳＡＬＬ４発現は、しかしながら、ＳＡＬＬ４の茶色い核染色（Ｃ、×４；Ｅ、×４００）で示されるように、急性転化期ＣＭＬで現れた。芽球数は増加するがまだ１５％未満である、ＣＭＬ加速期（Ｎ＝６）において、未熟芽球のみが認められ、ＳＡＬＬ４発現に対し陽性に染色し（Ｆ、赤矢印）、成熟好中球は染色しなかった（Ｆ、黒矢印、×６００）。図４（ｄ）は、作業仮説を示す。ＳＡＬＬ４はヒト幹細胞／前駆細胞に発現するが、正常な造血中、成熟造血性細胞においては発現しない。ＳＡＬＬ４アイソフォームの構成的発現（ＳＡＬＬ４の非遮断）は、幹細胞プールの異常拡大で、白血病性形質転換（＋、ＳＡＬＬ４発現有り；−、ＳＡＬＬ４発現無し）を引き起こす、分化の阻害および構成的再生をもたらす。
【図５】図５は、ＳＡＬＬ４ＢのＯＣＴ４プロモーターへの用量依存効果を示す。０．３μｇのＯＣＴ４−Ｌｕｃコンストラクト（ＰＭＯｃｔ４）を、０．１μｇのレニラプラスミドと同時導入し、ＳＡＬＬ４ＢまたはｐｃＤＮＡ３ベクター対照の量を増加した（０〜１．０μｇ）。
【図６】図６はＯＣＴ４のＳＡＬＬ遺伝子ファミリーメンバープロモーターへの効果を実証する。各（０．３μｇ）ＳＡＬＬ−Ｌｕｃプロモーターコンストラクト（すなわち、ｐＳＡＬＬ１、ｐＳＡＬＬ３、およびｐＳＡＬＬ４）は、０．９μｇのＯＣＴ４またはｐｃＤＮＡ３ベクター対照を、ＨＥＫ−２９３細胞において同時導入された。２４時間のトランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性を各群で評価した。
【図７】図７はＳＡＬＬ４アイソフォームＡおよびＢのＳＡＬＬ４プロモーター活性への効果を示す。０．３μｇのＳＡＬＬ４−Ｌｕｃが、０．１μｇの異なるＴ細胞系統においてプラスミドを発現する（ＨＥＫ−２９３またはＣＯＳ−７）ＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂと同時導入され、ｐｃＤＮＡ３ベクターは対照として使用された。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して正常化された。その値は、３つの実験の±ｓ．ｅ．平均値を表す。
【図８】図８はＳＡＬＬ４プロモーター活性へのＳＡＬＬ４Ａの用量依存効果を実証する。ＨＥＫ−２９３細胞において、０．３μｇのＳＡＬＬ４−Ｌｕｃを、０．１μｇのレニラプラスミドと同時導入し、ＳＡＬＬ４Ａコンストラクトおよび対照ｐｃＤＮＡ３ベクターの割合を増加した。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して正常化された。
【図９】図９は、ＳＡＬＬ４のＳＡＬＬ１およびＳＡＬＬ３プロモーター活性への効果を示す。各（０．３μｇ）ＳＡＬＬ−Ｌｕｃプロモーターコンストラクトは、ＨＥＫ−２９３細胞に、一過的に０．９μｇのＳＡＬＬ４ＡプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）と同時導入された。
【図１０】図１０は、過剰ＳＡＬＬ４Ａの存在下の、ＯＣＴ４のＳＡＬＬ４プロモーターへの効果を示す。０．２５μｇのＳＡＬＬ４−Ｌｕｃコンストラクト（ｐＳＡＬＬ４）を、ＨＥＫ−２９３細胞に、一時的に同量（０．５μｇ）のＳＡＬＬ４ＡおよびＯＣＴ４プラスミドと同時導入した。ｐｃＤＮＡ３は対照として使用された。
【図１１】図１１は、ＳＡＬＬ４の存在下での他のＳＡＬＬメンバープロモーターに対するＯＣＴ４の効果を示す。２４ウェルプレートに播種されたＨＥＫ−２９３細胞を、一過性に異なるＳＡＬＬメンバーレポーター（ｐＳＡＬＬ１またはｐＳＡＬＬ３）ならびにＯＣＴ４プラスミドおよび／またはＳＡＬＬ４Ａコンストラクトと同時導入した。ｐｃＤＮＡ３は対照として使用された。
【図１２】図１２は、その他のＳＡＬＬタンパク質ファミリーメンバーについてのプロモーター活性に対する自己プロモーター相互作用の効果を示す。ＨＥＫ−２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、これまでにＳＡＬＬ１プロモーターを活性化させることが認められた、様々な量のＳＡＬＬ１プラスミド（０．４５および０．９μｇ）ＳＩＸ１を伴う、０．３μｇのＳＡＬＬ１−Ｌｕｃレポーターコンストラクトを、一時的に導入または同時導入し、陽性対照として使用した。ルシフェラーゼ活性は、レニラレポーター活性に対して正常化された。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１３に示されるアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
請求項１記載の抗体の治療的有効量を被検体に投与する段階を含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法。
【請求項３】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、配列番号：５の相補体、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む組成物を被検体に投与する段階を含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法であって、前記フラグメントが、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、方法。
【請求項５】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群より選択されるポリペプチドを含む組成物を被検体に投与する段階を含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法。
【請求項７】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
（ａ）被検体からの生体サンプルを提供する段階と、
（ｂ）前記生体サンプルをハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１に示される配列、配列番号：３に示される配列、配列番号：５に示される配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、または配列番号：５の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブに接触させる段階と、
（ｃ）前記プローブと前記生体サンプルとの間のハイブリダイゼーションを検出する段階とを含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法であって、
ハイブリダイゼーションの検出がＭＤＳと相関する、方法。
【請求項９】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）被検体からの生体サンプルを提供する段階と、
（ｂ）生体サンプルを、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、
（ｃ）前記サンプルへの前記抗体の前記結合を検出する段階とを含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法であって、
結合の検出がＭＤＳに相関する、方法。
【請求項１１】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
被検体からの細胞のサンプルを採取する段階と、
配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を、前記アミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、
配列番号：１３に示される前記アミノ酸配列を含む前記ポリペプチドを発現する細胞の前記サンプルから、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞を選択する段階とを含む、白血病幹細胞を単離するための方法。
【請求項１３】
前記選別する段階が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選別する段階を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記選別する段階が、磁性粒子選別（ＭＡＣＳ）によって選別する段階を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーがＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＭＰＯ、および／または非特異的エステラーゼである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記白血病幹細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、巨核球、および赤血球マーカーに対して陰性である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を含む遺伝子導入動物であって、前記動物が、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を発現するように改変される、遺伝子導入動物。
【請求項１８】
前記動物が、前記挿入されたＳＡＬＬ４遺伝子を構成的に発現する、請求項１７記載の遺伝子導入動物。
【請求項１９】
前記ＳＡＬＬ４遺伝子が、配列番号：４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む、請求項１８記載の遺伝子導入動物。
【請求項２０】
ａ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコンストラクトを含む核酸分子を胚細胞に導入する段階と、
ｂ）段階ａ）から生じる前記細胞から遺伝子導入動物を作製する段階と、
ｃ）前記遺伝子導入動物を繁殖させて前記ヒトＳＡＬＬ４遺伝子のための遺伝子導入動物同型接合体を得る段階と、
ｄ）前記遺伝子導入動物由来の組織からヒトＳＡＬＬ４転写物を検出する段階とを含む、ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を含む遺伝子導入動物を作成する方法であって、
前記動物が、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を構成的に発現するように改変される、方法。
【請求項２１】
前記ヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコンストラクトが、配列番号：４に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ａ）内細胞塊（ＩＣＭ）、腫瘍性組織、または腫瘍から単離された細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、
ｂ）ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が段階（ａ）の細胞で発現されるかどうかを判断する段階とを含む、潜在的多能性を有する細胞を識別する方法であって、
前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の前記発現を判断する段階が、前記細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が多分化能を示す、方法。
【請求項２３】
前記ＳＡＬＬファミリーメンバーが、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＡＬＬファミリーメンバーがＳＡＬＬ４である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＳＡＬＬ４がＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質に対するまたは前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４からなる群より選択されるＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質配列をコードする核酸に相補的である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５；配列番号：２１、および配列番号：２３からなる群より選択される核酸配列のセンス鎖に相補的である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、成体幹細胞、または癌幹細胞である、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記組織が、被検体からの血漿サンプルまたは生検サンプルである、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
前記被検体が哺乳動物である、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
前記被検体がヒトである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ａ）細胞に
ｉ）機能的に連結されたＯＣＴ４プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーターレポーターコンストラクトを含むベクター、および
ｉｉ）ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードする核酸を含むベクター
を同時導入する段階と、
ｂ）段階（ａ）の細胞に薬剤を接触させる段階と、
ｃ）段階（ｂ）で、前記薬剤の存在および非存在における前記プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階とを含む、ＯＣＴ４発現に対するＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の影響を調整する薬剤を識別する方法であって、
前記プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階が、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質／ＯＣＴ４相互作用に対する前記薬剤の影響と相関する、方法。
【請求項３４】
前記プロモーター領域が、配列番号：２６に示される核酸配列を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
段階（ａ）（ｉｉ）の前記核酸が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４からなる群より選択されるタンパク質配列をコードする、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記発現レポータータンパク質がルシフェラーゼである、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
ａ）被検体の細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、
ｂ）ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が段階（ａ）の細胞で発現されるかどうかを判断する段階とを含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を診断する方法であって、
前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を判断する段階が、前記細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が腫瘍形成または増殖を示す、方法。
【請求項３８】
前記薬剤が標識されている、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
判断する段階が、前記薬剤の検出を含み、前記薬剤の位置を画像化する装置に前記被検体をさらすことによって行われる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記画像が、磁気共鳴、Ｘ線、または放射性核種放出によって生成される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ＳＡＬＬ４の発現を抑制する薬剤を含む医薬組成物を被検体に投与する段階を含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を治療する方法であって、被検体の細胞が自己複製の脱制御を示す、方法。
【請求項４２】
前記薬剤が核酸である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記薬剤がＳＡＬＬ４に対する抗体である、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
ａ）１つ以上のＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質を検出するための薬剤と、
ｂ）薬剤−細胞相互作用および前記薬剤の標識化に十分な状態を提供する試薬および緩衝剤と、
ｃ）前記検出試薬の標識化および前記薬剤の前記細胞への接触についての説明書と、
ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記構成要素を含む容器とを含む、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキット。
【請求項４５】
前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４からなる群より選択される、請求項４４記載のキット。
【請求項４６】
前記薬剤が、前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質に対するまたは前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である、請求項４４記載のキット。
【請求項４７】
ａ）細胞を、ＳＡＬＬ４に対する抗体に接触させる段階と、
ｂ）前記抗体に結合した細胞を、流体および細胞の進入および放出ための少なくとも２つの開口部を備える表面境界キャビティに適用する段階と、
ｃ）細胞および流体が前記キャビティを通過することを可能にする段階とを含む、細胞を単離する方法であって、
混合流体中の抗体結合細胞が、光学検出器または磁気検出器によって検出され、電圧または磁束が前記流体に加えられ、それによって、前記電圧または磁束が、１つ以上のコレクタまたは前記キャビティ内で前記結合細胞を類別する、方法。
【請求項４８】
前記方法が蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が磁性粒子細胞選別（ＭＡＣＳ）である、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が胚幹細胞、成体幹細胞、または癌幹細胞である、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
ＳＡＬＬ４がＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである、請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
ａ）細胞を、ＳＡＬＬ４に対する抗体に接触させる段階と、
ｂ）前記抗体に結合した細胞を、流体および細胞の進入および放出のための少なくとも２つの開口部を備える表面境界キャビティに適用する段階と、
ｃ）細胞および流体が前記キャビティを通過することを可能にする段階とを含む、増殖性疾患または腫瘍性細胞形成の進行に関連する細胞を検出する方法であって、
混合流体中の抗体結合細胞が、光学検出器によって検出され、電圧が前記流体に加えられ、それによって、前記電圧が、１つ以上のコレクタにおいて前記結合細胞を類別する、方法。
【請求項１】
配列番号：１３に示されるアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
請求項１記載の抗体の治療的有効量を被検体に投与する段階を含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法。
【請求項３】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、配列番号：５の相補体、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む組成物を被検体に投与する段階を含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法であって、前記フラグメントが、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、方法。
【請求項５】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群より選択されるポリペプチドを含む組成物を被検体に投与する段階を含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法。
【請求項７】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
（ａ）被検体からの生体サンプルを提供する段階と、
（ｂ）前記生体サンプルをハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１に示される配列、配列番号：３に示される配列、配列番号：５に示される配列、配列番号：１の相補体、配列番号：３の相補体、または配列番号：５の相補体を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブに接触させる段階と、
（ｃ）前記プローブと前記生体サンプルとの間のハイブリダイゼーションを検出する段階とを含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法であって、
ハイブリダイゼーションの検出がＭＤＳと相関する、方法。
【請求項９】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）被検体からの生体サンプルを提供する段階と、
（ｂ）生体サンプルを、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体に接触させる段階と、
（ｃ）前記サンプルへの前記抗体の前記結合を検出する段階とを含む、被検体における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法であって、
結合の検出がＭＤＳに相関する、方法。
【請求項１１】
前記ＭＤＳが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
被検体からの細胞のサンプルを採取する段階と、
配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を、前記アミノ酸配列を発現しない細胞から選別する段階と、
配列番号：１３に示される前記アミノ酸配列を含む前記ポリペプチドを発現する細胞の前記サンプルから、骨髄表面マーカーによって白血病幹細胞を選択する段階とを含む、白血病幹細胞を単離するための方法。
【請求項１３】
前記選別する段階が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選別する段階を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記選別する段階が、磁性粒子選別（ＭＡＣＳ）によって選別する段階を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーがＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＭＰＯ、および／または非特異的エステラーゼである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記白血病幹細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、巨核球、および赤血球マーカーに対して陰性である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を含む遺伝子導入動物であって、前記動物が、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を発現するように改変される、遺伝子導入動物。
【請求項１８】
前記動物が、前記挿入されたＳＡＬＬ４遺伝子を構成的に発現する、請求項１７記載の遺伝子導入動物。
【請求項１９】
前記ＳＡＬＬ４遺伝子が、配列番号：４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む、請求項１８記載の遺伝子導入動物。
【請求項２０】
ａ）配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコンストラクトを含む核酸分子を胚細胞に導入する段階と、
ｂ）段階ａ）から生じる前記細胞から遺伝子導入動物を作製する段階と、
ｃ）前記遺伝子導入動物を繁殖させて前記ヒトＳＡＬＬ４遺伝子のための遺伝子導入動物同型接合体を得る段階と、
ｄ）前記遺伝子導入動物由来の組織からヒトＳＡＬＬ４転写物を検出する段階とを含む、ヒトＳＡＬＬ４遺伝子を含む遺伝子導入動物を作成する方法であって、
前記動物が、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むヒトＳＡＬＬ４遺伝子の配列を構成的に発現するように改変される、方法。
【請求項２１】
前記ヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコンストラクトが、配列番号：４に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ａ）内細胞塊（ＩＣＭ）、腫瘍性組織、または腫瘍から単離された細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、
ｂ）ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が段階（ａ）の細胞で発現されるかどうかを判断する段階とを含む、潜在的多能性を有する細胞を識別する方法であって、
前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の前記発現を判断する段階が、前記細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が多分化能を示す、方法。
【請求項２３】
前記ＳＡＬＬファミリーメンバーが、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＡＬＬファミリーメンバーがＳＡＬＬ４である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＳＡＬＬ４がＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質に対するまたは前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４からなる群より選択されるＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質配列をコードする核酸に相補的である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５；配列番号：２１、および配列番号：２３からなる群より選択される核酸配列のセンス鎖に相補的である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、成体幹細胞、または癌幹細胞である、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記組織が、被検体からの血漿サンプルまたは生検サンプルである、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
前記被検体が哺乳動物である、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
前記被検体がヒトである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ａ）細胞に
ｉ）機能的に連結されたＯＣＴ４プロモーターと遺伝子発現レポータータンパク質をコードする核酸とを含むプロモーターレポーターコンストラクトを含むベクター、および
ｉｉ）ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードする核酸を含むベクター
を同時導入する段階と、
ｂ）段階（ａ）の細胞に薬剤を接触させる段階と、
ｃ）段階（ｂ）で、前記薬剤の存在および非存在における前記プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階とを含む、ＯＣＴ４発現に対するＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の影響を調整する薬剤を識別する方法であって、
前記プロモーターレポーターコンストラクトの活性を判断する段階が、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質／ＯＣＴ４相互作用に対する前記薬剤の影響と相関する、方法。
【請求項３４】
前記プロモーター領域が、配列番号：２６に示される核酸配列を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
段階（ａ）（ｉｉ）の前記核酸が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：２２、および配列番号：２４からなる群より選択されるタンパク質配列をコードする、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記発現レポータータンパク質がルシフェラーゼである、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
ａ）被検体の細胞を、ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を検出する薬剤に接触させる段階と、
ｂ）ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が段階（ａ）の細胞で発現されるかどうかを判断する段階とを含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を診断する方法であって、
前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質の発現を判断する段階が、前記細胞における自己複製の誘発に正に相関し、それによって、そのような発現が腫瘍形成または増殖を示す、方法。
【請求項３８】
前記薬剤が標識されている、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
判断する段階が、前記薬剤の検出を含み、前記薬剤の位置を画像化する装置に前記被検体をさらすことによって行われる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記画像が、磁気共鳴、Ｘ線、または放射性核種放出によって生成される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ＳＡＬＬ４の発現を抑制する薬剤を含む医薬組成物を被検体に投与する段階を含む、腫瘍性疾患または増殖性疾患を治療する方法であって、被検体の細胞が自己複製の脱制御を示す、方法。
【請求項４２】
前記薬剤が核酸である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記薬剤がＳＡＬＬ４に対する抗体である、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
ａ）１つ以上のＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質を検出するための薬剤と、
ｂ）薬剤−細胞相互作用および前記薬剤の標識化に十分な状態を提供する試薬および緩衝剤と、
ｃ）前記検出試薬の標識化および前記薬剤の前記細胞への接触についての説明書と、
ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記構成要素を含む容器とを含む、潜在的多能性を有する細胞を識別するためのキット。
【請求項４５】
前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質が、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ３、およびＳＡＬＬ４からなる群より選択される、請求項４４記載のキット。
【請求項４６】
前記薬剤が、前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質に対するまたは前記ＳＡＬＬファミリーメンバータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸に対する抗体である、請求項４４記載のキット。
【請求項４７】
ａ）細胞を、ＳＡＬＬ４に対する抗体に接触させる段階と、
ｂ）前記抗体に結合した細胞を、流体および細胞の進入および放出ための少なくとも２つの開口部を備える表面境界キャビティに適用する段階と、
ｃ）細胞および流体が前記キャビティを通過することを可能にする段階とを含む、細胞を単離する方法であって、
混合流体中の抗体結合細胞が、光学検出器または磁気検出器によって検出され、電圧または磁束が前記流体に加えられ、それによって、前記電圧または磁束が、１つ以上のコレクタまたは前記キャビティ内で前記結合細胞を類別する、方法。
【請求項４８】
前記方法が蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が磁性粒子細胞選別（ＭＡＣＳ）である、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が胚幹細胞、成体幹細胞、または癌幹細胞である、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
ＳＡＬＬ４がＳＡＬＬ４ＡまたはＳＡＬＬ４Ｂである、請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
ａ）細胞を、ＳＡＬＬ４に対する抗体に接触させる段階と、
ｂ）前記抗体に結合した細胞を、流体および細胞の進入および放出のための少なくとも２つの開口部を備える表面境界キャビティに適用する段階と、
ｃ）細胞および流体が前記キャビティを通過することを可能にする段階とを含む、増殖性疾患または腫瘍性細胞形成の進行に関連する細胞を検出する方法であって、
混合流体中の抗体結合細胞が、光学検出器によって検出され、電圧が前記流体に加えられ、それによって、前記電圧が、１つ以上のコレクタにおいて前記結合細胞を類別する、方法。
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５１７４７９（Ｐ２００９−５１７４７９Ａ）
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３４１７（Ｐ２００８−５４３４１７）
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５６７２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４６９６
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０８１５８８９４）ネバダ キャンサー インスティテュート (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５６７２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４６９６
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０８１５８８９４）ネバダ キャンサー インスティテュート (2)
【Ｆターム（参考）】
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