３，３’−ジインドリルメタン免疫活性化組成物
本発明は、免疫応答活性化組成物および使用方法を提供する。一般的方法は、免疫応答活性剤をそれが必要であると決定された患者に送達する方法であって、（ａ）前記患者に所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭを投与する工程と；および（ｂ）前記患者においてＴ細胞増殖、ＮＯ産生、サイトカイン産生、サイトカイン受容体発現、もしくはサイトカインシグナリングにおける増加などの、結果として生じた免疫応答活性化を検出する工程とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｌｅｏｎａｒｄ Ｆ．Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ、Ｊａｃｑｕｅｓ Ｅ．Ｒｉｂｙ、Ｌｉｎｇ ＸｕｅおよびＧａｒｙ Ｌ．Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ
本研究は、米国立衛生研究所補助金（第ＣＡ６９０５６号）、および米陸軍補助金（第ＲＰ９５０８４４号）による支援を受けた。このため米国連邦政府は、本出願への特許付与に権利を有することができる。
【０００２】
本発明の分野は、３，３’−ジインドリルメタン組成物および免疫活性剤としてのそれらの使用である。
【背景技術】
【０００３】
３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）は、最も一般的にはキャベツ、芽キャベツ、カリフラワーおよびブロッコリーを含むアブラナ属の食用植物中に存在するグルコブラシシンの自己融解分解中に生成される天然産物である。ＤＩＭはさらにまた、植物中のＤＩＭの直前駆体であるインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）の消化後にも産生する（１）。さらに、ＤＩＭは、長時間のインキュベーション期間中にほぼ中性ｐＨ細胞培養条件下でＩ３Ｃから緩徐に産生する。
【０００４】
いくつかの試験の結果は、ＤＩＭが、特に乳腺腫瘍形成に対する前途有望な癌保護活性を示すことを指示している（２〜４）。抗癌治療前の単回投与でのＩ３Ｃの経口挿管法は、ラットにおけるＤＭＢＡ誘導性乳腺腫瘍の発生率および多重度を７０〜８０％減少させた（２，５）。ＤＭＢＡ誘導性乳腺腫瘍形成のプロモーション段階中のＤＩＭの反復経口投与は、齧歯類において９５％という高さで腫瘍増殖を阻害した（６）。本発明者らは、従来型の細胞培養条件下で、エストロゲン受容体状態とは無関係に、ＤＩＭが乳腺腫瘍細胞系の増殖を阻害できることを観察した（７）。ＤＩＭはＧ１細胞周期停止を誘導し、エストロゲン応答性およびエストロゲン非依存性乳癌細胞のどちらにおいてもｐ２１細胞周期阻害剤の遺伝子発現およびプロモーター活性の強力な誘導を発生した。ＤＩＭの抗増殖作用は、ヒト乳癌細胞における細胞周期制御のための標的としてのｐ２１のＳｐ１／Ｓｐ３転写因子活性化を含んでいた（８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、免疫応答の調節における重要な役割とともに抗ウイルス機能および細胞増殖抑制機能を備える１群のサイトカインである。ＩＦＮαおよびＩＦＮβを含むタイプＩのＩＦＮは、ウイルス感染細胞によって産生する。通常はインターフェロンγ（ＩＦＮγ）もしくは「免疫インターフェロン」と呼ばれるタイプＩＩのＩＦＮは、免疫グロブリン産生細胞へのＢ細胞分化を促進する（９）。最近認識されたＩＦＮγの抗腫瘍活性はまだ完全には理解されていないが、非特異的殺腫瘍活性のためのマクロファージのプライミング、腫瘍細胞に対する細胞毒性を増加するための単球、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞の活性化、ならびに腫瘍誘導性血管新生の阻害を含む（１０）。だが癌患者におけるＩＦＮγの可能性のある治療使用は、重篤な副作用のために限定されている（１１）。
【０００６】
関連文献
Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ，Ｕ．，Ｒｉｂｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，ＥＸ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２５：１１１９−２８，２００４．
Ｅｘｏｎ ＪＨ，Ｓｏｕｔｈ ＥＨ，「Ｄｉｅｔａｒｙ ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ａｌｔｅｒｓ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ．」 Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ａ．２０００ Ｆｅｂ ２５；５９（４）：２７１−９．
Ｊ．Ｈ．Ｅｘｏｎ，Ｅ．Ｈ．Ｓｏｕｔｈ，Ｂ．Ａ．Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｋ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｎｄｏｌｅ−３−Ｃａｒｂｉｎｏｌ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｃｒｙｐｔ Ｆｏｃｉ，ａｎｄ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｃｒｙｐｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ」 Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ａ．２００１；６２：５６１−５７３．
任意に置換されたＤＩＭ組成物は、２００３年９月１６日に提出された同時係属出願ＵＳＳＮ １０／６６４，９９１の中に記載されている。
Ａｕｂｏｒｎ ＫＪ，Ｑｉ Ｍ，Ｙａｎ ＸＪ，Ｔｅｉｃｈｂｅｒｇ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｍａｄａｉｏ ＭＰ，Ｃｈｉｏｒａｚｚｉ Ｎ．Ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｓ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ−ｐｒｏｎｅ（ＮＺＢ／ＮＺＷ）Ｆ１ ｍｉｃｅ ｆｅｄ ａ ｄｉｅｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ．Ｊ Ｎｕｔｒ．２００３ Ｎｏｖ；１３３（ｌｌ）：３６１０−３．
Ｋｏｈｕｔ ＭＬ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＲ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｊ，Ｂｒｏｗｎ ＧＡ，Ｖｕｋｏｖｉｃｈ ＭＤ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＤＡ，Ｋｉｎｇ ＤＳ．Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＥＡ）ａｎｄ ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ ｈａｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｄｄｌｅ−ａｇｅｄ ｍｅｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ．２００３ Ｏｃｔ；２２（５）：３６３−７１．
Ｓｔａｎｌｅｙ Ｍ．Ｃｈａｐｔｅｒ １７：Ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ−ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ Ｍｏｎｏｇｒ．２００３（３１）：１１７−２４．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ｗｉａｔｒａｋ ＢＪ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．２００３ Ｄｅｃ；ｌｌ（６）：４３３−４１．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ａｕｂｏｒｎ ＫＪ．Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ．Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．２００２ Ｍａｒ；７（１）：１−９．Ｒｅｖｉｅｗ．
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、免疫応答活性化組成物および使用方法を提供する。一般的方法は、免疫応答活性剤をそれが必要であると決定された患者に送達する方法であって、（ａ）前記患者に所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭを投与する工程と；および（ｂ）前記患者において結果として生じた免疫応答活性化を検出する工程とを含む。
【０００８】
特定の実施形態では、免疫応答活性化は、Ｔ細胞増殖、ＮＯ産生、サイトカイン産生、サイトカイン受容体発現、もしくはサイトカインシグナリングであり、それらの増加として検出される；サイトカインは、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγから選択される；投与する工程は、経口もしくは静脈内投与によって実施される；ならびに患者は、免疫不全状態である、または感染症または腫瘍症に罹患していると判断される。
【０００９】
本方法は、一般に、式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は、個別および独立して、水素、またはハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状もしくは分枝状アルキルもしくはアルコキシ基、アミン、スルホニル、およびニトロ基からなる群から選択される置換基である）を有する、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンを使用する。特定の実施形態では、本化合物は、少なくとも１つの置換基を好ましくはＲ１およびＲ１’以外の位置、またはそれらに加えて含み、直鎖状もしくは分枝状アルキルまたはアルコキシ基は１〜５個の炭素である、および／またはハロゲンは塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択される。特定の実施形態では、インドリルは対称性で置換されており、各インドリルは同様に一置換、二置換、三置換、またはパラ置換されている。
【００１０】
本発明は、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’ジインドリルメタンを、相補的、付加的、および／または相乗的有効性のために、１つまたは複数の他の治療薬、特に様々な免疫応答活性化または抗感染もしくは抗腫瘍形成化合物と結び付けて使用する方法をさらに提供する。これらの方法は、組み合わせ単位製剤、または結合パッケージング内に個別に調薬されて提供される個別組成物であってよい組み合わせ組成物を使用できる。
【００１１】
本発明は、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンと、本方法について記載している説明媒体とを含むキットをさらに提供する。上記の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンは、事前に測定された単位製剤中に存在してよく、さらに追加の治療薬、特に相違する免疫応答活性剤、または抗感染もしくは抗腫瘍形成化合物とともに製剤もしくはパッケージング内に結合されてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下の特定の実施形態および実施例についての説明は、例示するために提供されるもので、限定するためではない。禁忌ではない、または他に特に言及しない限り、これらの説明および本明細書を通して、用語「１つ」は「１つまたは複数」を意味しており、用語「または」は「および／または」を意味している。
【００１３】
一般的方法は、免疫応答活性剤をそれが必要であると決定された宿主に送達する方法であって、（ａ）前記患者に所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）を投与する工程と；および（ｂ）前記患者において結果として生じた免疫応答活性化を検出する工程とを含む。本方法は、接触させる工程の前に、宿主が免疫応答活性剤を必要であることを決定する工程をさらに含むことができる。
【００１４】
本明細書に開示した組成物は、免疫応答活性剤を必要とすると決定された、および特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖、ＮＯ産生、サイトカイン産生、サイトカイン受容体発現、もしくはサイトカインシグナリングの増加を必要とすると決定された宿主に様々な用途を提供するが、特にサイトカインは、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγから選択される。例えば、科学者は、本組成物を細胞培養または実験動物へ免疫応答活性化活性を提供するために使用できる。好ましい宿主はヒト患者であるが、本組成物は、主題免疫応答活性剤を用いて治療可能であることが知られている広範囲の障害に罹患又は素因があると決定された患者に投与できる。例には、ウイルス、細菌および真菌感染症における抗感染療法としての使用が含まれる。
【００１５】
好ましい実施形態では、宿主は、免疫応答増加に伴って改善できる病理の罹患者もしくは素因があると決定されたヒト患者であるが、結果として生じる本発明の免疫応答活性化は病理、特にウイルス、細菌および真菌感染症からなる群から選択される病理もしくは病理の進行の減少として明示される。
【００１６】
本発明者らの方法は、一般に式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は、個別および独立して、水素、またはハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状もしくは分枝状アルキルもしくはアルコキシ基、アミン、スルホニル、およびニトロ基からなる群から選択される置換基である）の構造を有する、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンを使用する。置換基含有化合物は、ＤＩＭ誘導体もしくはＤＩＭアナログと呼ぶことができる。特定の実施形態では、本化合物は、少なくとも１つの置換基を好ましくはＲ１およびＲ１’以外の位置で、またはそれらに加えて含み、直鎖状もしくは分枝状アルキルまたはアルコキシ基は１〜５個の炭素である、および／またはハロゲンは塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択される。
【００１７】
免疫応答活性化活性は、細胞培養中および広範囲の臨床的に重要で妥当性が確認された動物モデルにおいて実施できる、サイトカインおよびサイトカイン受容体アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、ＮＯ産生アッセイなどを含む、以下で記載する様々なアッセイを用いて容易に確認される。
【００１８】
詳細には、本発明者らは、免疫応答活性化活性の高スループットスクリーニングのためのＤＩＭ誘導体のライブラリーを生成するために、反復的コンビナトリアル合成スキームを考案した。典型的な証明では、本発明者らは、以下に要約した５回の合成ラウンドにおいて４５１種のＤＩＭ誘導体構造を生成した。
合成ラウンド２：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−Ｆ、−Ｃｌ、もしくは−Ｂｒ−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド５：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、もしくはペンチル−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド６：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−メトキシ−、エトキシ−、プロピルオキシ−、ブチルオキシ−、もしくはペンチルオキシ−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド９：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−ヒドロキシル、アミノ−、アミノメチル−、スルホ−、もしくはニトロ−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド１２：Ｒ２、４、５、６、７、Ｒ２’、４’、５’、６’、７’デカ−フルオロ（パーフルオロ）−３，３’−ジインドリルメタン
【００１９】
ＤＩＭアナログの免疫応答活性化作用は、サイトカインおよびサイトカイン受容体発現についてのセルベース・アッセイを用いて試験される。本発明者らの最初の実証では、ＩＦＮγ、ＩＦＮγ受容体（ＩＦＮＧＲ１）、オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）ファミリーメンバーのタンパク質６９（ｐ６９−ＯＡＳ）、およびＯＡＳと密接に関連するタンパク質であるインターフェロン誘導性タンパク質５６（ｐ５６）の転写活性化を監視するために、処置および未処置ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞のｃＤＮＡ遺伝子発現マイクロアレイスクリーニングを使用し、その後にノーザンブロットおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して結果を確証した。本発明者らは、３日間まで処置されたＭＣＦ−７細胞のコンフルエントな培養由来の培地中でのＩＦＮγのレベルを試験するために感受性サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイもまた使用した。ＤＩＭ誘導体は、本発明者らが実施したレポーターおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいて免疫応答活性化活性を有することが確証されたので、次に以下の実施例ＶＩＩＩおよびＩＸに記載するように全動物サイトカイン産生およびエルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）感染試験においてスクリーニングする。
【００２０】
【表１】
【００２１】
特定の実施形態では、インドリル部分は対称性で置換されており、各部分は同様に一置換、二置換、三置換などされている。他の特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’は塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択されるハロゲンである。それから免疫応答活性化合物が同定されると本明細書に記載した追加のＤＩＭ誘導体には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’はハロゲンである化合物が含まれる。これらには、３，３’−ジインドリルメタン、５，５’−ジクロロ−ジインドリルメタン；５，５’−ジブロモ−ジインドリルメタン；および５，５’−ジフルオロ−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。追加の好ましいそのようなＤＩＭ誘導体には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’は１〜１０個の炭素、最も好ましくは１〜５個の炭素を有するアルキルもしくはアルコキシである化合物が含まれる。これらには、５，５’−ジメチル−ジインドリルメタン、５，５’−ジエチル−ジインドリルメタン、５，５’−ジプロピル−ジインドリルメタン、５，５’−ジブチル−ジインドリルメタン、および５，５’−ジペンチル−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。これらには、さらにまた５，５’−ジメトキシ−ジインドリルメタン、５，５’−ジエトキシ−ジインドリルメタン、５，５’−ジプロピルオキシ−ジインドリルメタン、５，５’−ジブチルオキシ−ジインドリルメタン、および５，５’−ジアミルオキシ−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。
【００２２】
追加の好ましいそのようなＤＩＭ誘導体には、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ１およびＲ１’は１〜１０個の炭素、最も好ましくは１〜５個の炭素を有するアルキルもしくはアルコキシルである化合物が含まれる。そのような有用な誘導体には、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−ジインドリルメタン、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−ジインドリルメタン、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−ジインドリルメタン、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−ジインドリルメタン、およびＮ，Ｎ’−ジペンチル−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。さらにまた別の好ましい実施形態では、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ２およびＲ２’は１〜１０個の炭素、最も好ましくは１〜５個の炭素のアルキルである。そのような化合物には、２，２’−ジメチル−ジインドリルメタン、２，２’−ジエチル−ジインドリルメタン、２，２’−ジプロピル−ジインドリルメタン、２，２’−ジブチル−ジインドリルメタン、および２，２’−ジペンチル−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。また別の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’はニトロである。
【００２３】
置換ＤＩＭアナログは、ホルムアルデヒドと市販で入手できる置換インドールとの縮合によって容易に調製される。前駆体化合物は、置換インドール−３−アルデヒドを形成するために適切な置換インドールのジメチルホルムアルデヒド縮合によって合成できる。適切な置換インドールには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７位で置換基を有するインドールが含まれる。これらには、５−メトキシ、５−クロロ、５−ブロモ、５−フルオロ、５’−メチル、５−ニトロ、ｎ−メチルおよび２−メチルインドールが含まれるがそれらに限定されない。置換インドール−３−アルデヒド生成物は、置換Ｉ３Ｃを得るためにアルデヒド部分を還元させるためにメタノールなどの適切なアルコールおよび固体水素化ホウ素ナトリウムを用いて処理される。置換ＤＩＭは、置換インドール−３−カルビノール生成物を縮合させることによって調製される。これは、例えば、約５．５のｐＨを有するリン酸緩衝液を用いた処理によって達成できる。
【００２４】
本組成物は、医薬担体および／または希釈剤と一緒に投与できる。本発明において有用な医薬担体もしくは希釈剤の例には、適切な水溶性有機担体を含む、すなわちｐＨが約７．０〜７．４の任意の生理的緩衝媒質が含まれる。適切な水溶性有機担体には、コーン油、ジメチルスルホキシド、ゼラチンカプセルなどが含まれるがそれらに限定されない。本発明の免疫応答活性化組成物は、さらにまた、他の物質と組み合わせて、例えば、他の化学療法薬もしくは免役刺激薬もしくは治療薬と結び付けて投与することもできる。これらの方法は、組み合わせ単位製剤、または結合パッケージング内に個別に調薬されて提供される個別組成物であってよい組み合わせ組成物を使用できる。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、主題の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンを、相補的、付加的、および／または相乗的有効性のために、１つまたは複数の他の治療薬、特に様々な免疫応答活性化合物と結び付けて使用する方法を提供する。サイトカインは、そのような組み合わせにおいて有用な、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）などを含む代表的な、周知の免疫応答活性剤を提供する。本方法で共投与するために適合する追加のサイトカインは、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．６ｔｈ ｅｄ．Ｋｕｆｅ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ（Ｃａｎａｄａ）：ＢＣ Ｄｅｃｋｅｒ Ｉｎｃ；ｃ２００３）、およびＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｗｏ Ｖｏｌｕｍｅ Ｓｅｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；４ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｕｌｙ ７，２００３）に記載されている。
【００２６】
本発明の組成物は、経口、静脈内、鼻腔内、直腸内、または治療すべき組織もしくは部位へ有効量の活性物質を送達する任意の手段によって投与できる。適切な用量は、所望のエンドポイントを達成する用量である。様々な障害を治療するためには様々な用量が必要とされることは理解される。物質の有効量は、標的とする病理もしくは病理の進行における有意な減少を引き起こす、または素因を有する宿主における発生を遅延させる、もしくは病理の可能性を減少させる量である。例えば、有効量は感染物質の総数、増殖率、関連病理などを減少させることができる。
【００２７】
投与された免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭは、有益には強化された更新、生物学的利用能、安定性、半減期などを提供するため、または毒性などを低下させるために１つまたは複数の機能的部分と複合化もしくは共投与することができる。しかし、それでも本組成物は、単離形、複合化形、またはプロドラッグ形のいずれであっても、上記の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭを含む。
【００２８】
当業者は、投与経路、化合物の代謝、および例えば分布量、クリアランス、対象者の年齢などの他の薬物動態パラメータを考慮に入れて、経験的に、本発明の物質を投与するために最も有効な用量および時間を確定することができる。
【００２９】
本発明は、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンと、例えば同梱されているなどの本方法を説明もしくは列挙している説明媒体とを含むキットを含む、本方法を実施するために特別に調製されたキットをさらに提供する。上記の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンは、事前に測定された単位製剤中に存在してよく、さらに追加の治療薬、特に相違する免疫応答活性剤、特にサイトカインとともに製剤もしくはパッケージング内に結合されてよい。
【００３０】
本発明は、本方法を実施するために特別に調整されたビジネス方法をさらに提供する。例えば、１つの実施形態では、本ビジネス方法は、主題の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンをベースとする方法もしくは組成物を販売する工程、契約する工程、またはライセンス付与する工程を含む。
【００３１】
本発明を様々な腫瘍性および正常細胞系における感染に対するインビトロおよびインビボ活性によって例示する。インビトロアッセイにおいて使用された試験細胞系は、動物における免疫応答活性化のためのモデルであると明確に認識され、受け入れられている。マウスを使用する実験的インビボアッセイは、ヒトなどであるがヒトに限定されない他の動物におけるインビボ活性を予測できると明確に認識され、受け入れられている。
【００３２】
典型的な実験プロトコル
プロトコルＩ〜ＶＩＩでは、本発明者らは、ＤＩＭがＩＦＮγシグナル伝達経路を活性化することを証明する。ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞はＩＦＮγ ｍＲＮＡを発現し、ＤＩＭ処置に応答して、ＩＦＮγタンパク質をそれらの培養培地中へ分泌した。ＤＩＭ処置は、さらにＩＦＮＧＲ１ならびにＩＦＮγ応答遺伝子であるｐ５６およびｐ６９−ＯＡＳの発現も活性化した。ＤＩＭは、トランスフェクトした細胞中のインターフェロン誘導性受容体構築物のＩＦＮγを用いた相乗性活性化も生じさせた。さらに、ＤＩＭは、ＳＴＡＴ−１のリン酸化も増強し、ＩＦＮγ経路のＤＩＭ活性化のさらなる証拠を提供した。ＤＩＭおよびＩＦＮγは、培養細胞中での付加的抗増殖活性を示した。最後に、ＤＩＭおよびＩＦＮγの併用処置は、ＤＩＭの強力な免疫増強活性と一致して、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現における相乗性増加を生じさせた。
【００３３】
Ｉ．ＤＩＭはＩＦＮγおよび関連遺伝子の転写を活性化する。
ＤＩＭを用いたヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の初期ｃＤＮＡ遺伝子発現マイクロアレイスクリーニング、その後のノーザンブロットおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した結果の確証は、ＩＦＮγ、ＩＦＮγ受容体（ＩＦＮＧＲ１）、オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）ファミリーメンバーのタンパク質６９（ｐ６９−ＯＡＳ）、およびＯＡＳと密接に関連するタンパク質であるインターフェロン誘導性タンパク質５６（ｐ５６）の転写活性化を確証した。ＩＦＮγ、ｐ６９−ＯＡＳおよびｐ５６の発現は６時間の処置後に完全に誘導されたが、最高ＩＦＮＧＲ−１誘導は４８時間の処置後に到達した。ＩＦＮγおよびｐ５６についてのｍＲＮＡのレベルは、４８時間のＤＩＭ処置後にほぼコントロールレベルへ復帰した。ＩＦＮＧＲ１およびｐ６９−ＯＡＳについてのｍＲＮＡレベルは、処置４８時間後に上昇したままであった。ＩＦＮγ、ＩＦＮＧＲ１、ｐ６９−ＯＡＳおよびｐ５６について最高誘導は、各々４．６、３．８、３．２および４．０倍であった。
【００３４】
ＩＩ．ＤＩＭは、ＩＦＮγおよびＩＦＮＧＲ１タンパク質の発現を誘導する。
ＩＦＮγおよびＩＦＮＧＲ１についてのｍＲＮＡのレベルがＤＩＭによってアップレギュレートされた観察所見に続いて、本発明者らは、これらの遺伝子のタンパク質生成物のレベルを試験した。感受性サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、本発明者らは、３日間までＤＩＭを用いて処置されたＭＣＦ−７細胞のコンフルエントな培養由来の培地中でのＩＦＮγのレベルを試験した。これらの試験の結果は、未処置細胞の培地中のＩＦＮγの段階的蓄積およびＤＩＭとともにインキュベートした細胞からのＩＦＮγの分泌のより急速な増加を示した。培養細胞の培地中のＩＦＮγのレベルは１および３日間のインキュベーション後にビヒクル処置コントロール内の実質的に検出不能なレベルから、インドール処置細胞については、各々約５０±１０ｐｇ／ｍＬおよび８０±３０ｐｇ／ｍＬへ増加した。
【００３５】
ウエスタンブロット分析の結果は、ＩＦＮＧＲ１タンパク質のレベルがＤＩＭ処置によって強力にアップレギュレートされることを示した。ＩＦＮＧＲ１タンパク質レベルは、ＤＭＳＯ−処置コントロールと比較して、２４時間後に約７倍増加しており、４８時間後まで維持された。これらの結果は、ｍＲＮＡレベルにおける増加と一致しており、ＤＩＭは転写コントロールを通してＩＦＮＧＲ１発現を調節できることを指示している。
【００３６】
ＩＩＩ．ＤＩＭは内因性ｐ６９−ＯＡＳ遺伝子および関連するレポーター遺伝子構築物のＩＦＮγ誘導性発現を増強する。
次に、本発明者らは、ＤＩＭ単独、およびＩＦＮγとの併用が内因性ｐ６９−ＯＡＳの発現およびトランスフェクトされたＩＦＮγ応答性レポーター遺伝子構築物の発現に及ぼす作用をより詳細に試験した。
【００３７】
ｐ６９−ＯＡＳ転写体のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＤＩＭ（５０μＭ）およびＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍＬ）を用いた個別処置が、コントロールに比較して各々、約３．５倍および５．０倍の誘導を産生することを示したが、他方２種の併用を行なう処置はほぼ１２倍の増加を生じさせた。これらの結果は、内因性ｐ６９−ＯＡＳの誘導性発現にＤＩＭおよびＩＦＮγが及ぼす相乗性相互作用を指示している。
【００３８】
次に、本発明者らは、内因性ｐ６９−ＯＡＳ遺伝子発現に及ぼしたＤＩＭの誘導作用が同時タンパク質合成を必要とするかどうかを決定した。本発明者らの結果は、翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドを用いた共処置がＤＩＭ処置の誘導作用、ならびに内因性ｐ６９−ＯＡＳのＩＦＮγ誘導性発現に及ぼすＤＩＭの増強作用を遮断したことを指示している。
【００３９】
ＤＩＭの誘導作用が転写レベルにあるかどうかを試験するためのまた別の実験では、２種のルシフェラーゼレポーター構築物であるＯＡＳ−Ｌｕｃ（１２）および４ＧＡＳ−Ｌｕｃ（１３）の活性にＤＩＭが及ぼす作用を試験した。ＯＡＳ−Ｌｕｃは、ｐ６９−ＯＡＳのプロモーターおよび５’−フランキング領域（−９７２）を含有し、ＧＡＳ−ＬｕｃはコンセンサスＧＡＳエレメントの４つの繰り返しを含有する。これらのレポーター構築物を用いて一過性でトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞は、２４時間にわたり、ＩＦＮγ、ＤＩＭ、もしくは両方の組み合わせで処置した。ＤＩＭ処置はＯＡＳ−Ｌｕｃレポーターの発現を最高約２．３倍へ誘導したが、本発明者らは、３倍を超える対応する内因性遺伝子の誘導についてそのレベルよりいくらか低い誘導レベルを観察した。ＩＦＮγはこのレポーターの転写活性を、約５．０倍の内因性遺伝子の応答より低い最高約１．８倍へ濃度依存方法で誘導した。内因性遺伝子発現に誘導因子の併用処置の最大作用とは顕著に対照的に（ビヒクル処置細胞と比較してほぼ１２倍の増加）、レポーター遺伝子構築物はコントロールに比較して３倍未満の増加で応答した。これらの結果は、レポーターおよび内因性遺伝子がＤＩＭ単独による処置へ同様に応答したが、レポーターはＩＦＮγに対する内因性遺伝子より低応答性であったことを示している。
【００４０】
最後に、４ＧＡＳ−Ｌｕｃレポーターを用いてトランスフェクトされた細胞を用いた試験は、ｐ６９−ＯＡＳ遺伝子の応答に類似するが、２種の誘導因子を用いた共処置へ一致する相乗性応答が付随したＩＦＮγに対するより強固な応答であるＤＩＭの誘導作用を示した。そこで、ＤＩＭ（５０μＭ）単独による処置は、さらにこのレポーターの活性の２〜３倍の増加を生じさせた。しかしＩＦＮγ処置は、ビヒクル処置コントロールに比較してほぼ４０倍の誘導へレポーター活性における堅固な濃度依存性増加を生じさせた。ＤＩＭおよびＩＦＮγを用いた共処置は、試験した全ＩＦＮ−γ濃度で４ＧＡＳ−Ｌｕｃレポーターのほぼ２倍の相乗性活性化を生じさせ、約７５倍の最高誘導に到達した。
【００４１】
これらをまとめると、これらの結果は、ＤＩＭ単独がＩＦＮγへ差別的に応答する内因性活性化およびトランスフェクトされたレポーター遺伝子の類似レベルを生じさせることを示した。これらの結果は、ＤＩＭの誘導作用は短命の転写因子によって媒介され、中間体調節タンパク質の新規合成を必要とすることをさらに示している。
【００４２】
ＩＶ．ＤＩＭがＩＦＮγ媒介性シグナル伝達に及ぼす相乗作用。
ＤＩＭによる転写活性化においてＧＡＳエレメント活性化が果たす役割を確証するために、本発明者らは、このインドールがＧＡＳシグナリング経路において下流イベントに及ぼす作用について試験した。このために、ＤＩＭがシグナル伝達のリン酸化および転写因子の活性化因子１（ＳＴＡＴ１）に及ぼす作用、ならびに活性化ＳＴＡＴ１ダイマーの同族ＧＡＳ応答性エレメントへの結合について試験した。Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ（ＪＡＫ）によるＳＴＡＴ１のリン酸化は、ＩＦＮＧＲ１への結合に続くＩＦＮγシグナリングにおける第１工程である。これらの試験のために、細胞は、６もしくは２４時間にわたりＤＩＭで前処置し、その後に１５分間にわたりＩＦＮγへ曝露させた。ＤＩＭ処置細胞の細胞溶解液中のＳＴＡＴ１リン酸化レベルは、ＩＦＮγ処置は受けたが、ＤＩＭ処置を受けていなかったコントロールと比較した。リン酸化は、Ｔｙｒ−７０１残基上でリン酸化されたＳＴＡＴ１に対して特異的な抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって測定した。本発明者らの結果は、６もしくは２４時間にわたるＤＩＭ単独の処置はＳＴＡＴ１リン酸化を誘導しなかったが、ＤＩＭを用いた前処置はＩＦＮγによって誘導されたＳＴＡＴ１リン酸化を増加させたことを示している。不活性（全）ＳＴＡＴ１のレベルに影響を及ぼした処置はなかった。
【００４３】
電気泳動ゲル泳動度シフトアッセイを使用して、リン酸化ＳＴＡＴ１がＧＡＳエレメントに結合できたダイマーへ効果的に活性化したことを検証した。ＧＡＳ配列を含有する３２Ｐ標識ＤＮＡプローブは、指示したように様々な回数にわたりＤＩＭを用いて前処置した細胞由来の核抽出物、およびＩＦＮγとともに３０分間にわたりインキュベートした。ＩＦＮγ処置は、ＤＩＭ前処置の期間に伴って強度が増加するバンドシフトを生じさせた。ＩＦＮγの不在下でのＤＩＭ処置は、任意の時点にシフトしたバンドを生じさせなかった。サンプルをＳＴＡＴ１に対して特異的な抗体とともにインキュベートした場合はバンドがスーパーシフトされ、これは標識されたＧＡＳプローブヘのタンパク質結合の同一性を確証した。
【００４４】
これらをまとめると、これらの結果は、ＤＩＭがＩＦＮγ誘導性ＳＴＡＴ１活性化、二量体化およびＤＮＡ中のＧＡＳエレメントへの結合を増強できることを示している。これらの結果は、ＤＩＭがＩＦＮγ活性に及ぼす相乗作用がＩＦＮγシグナリングにおける数種のレベルで明白であり、これらのアッセイ条件下でＤＩＭの最も有意な作用である可能性を示している。
【００４５】
Ｖ．ＤＩＭおよびＩＦＮγが増殖および細胞周期に及ぼす作用。
ＤＩＭおよびＩＦＮγが遺伝子発現に及ぼす相乗作用の機能的結果を増殖率のレベルで試験した。４日間の処置期間にわたりＤＩＭ、ＩＦＮγ、もしくは両方の物質を用いた処置による細胞増殖を測定し、ＤＭＳＯコントロールと比較した。熱処理血清を用いると、ＩＦＮγ単独は、コントロールと比較して７０％まで細胞増殖を大きく減少させた。ＤＩＭ処置は、６０％まで増殖を大きく減少させた。最高濃度のＩＦＮγを除いて、ＤＩＭおよびＩＦＮγの併用処置は、ＤＩＭ単独の処置に比較して細胞増殖抑制活性のほぼ付加的な増加を生じさせた。これらの作用には、アポトーシスに特徴的な形態学的変化が付随した。本発明者らは、ＩＦＮγが未処理血清中で増殖させた細胞の増殖に及ぼす有意な作用を観察しなかった。
【００４６】
フローサイトメトリーを使用してＤＩＭおよびＩＦＮγが細胞周期に及ぼす作用を決定した。本発明者らのデータは、３日間までの相違する間隔での細胞周期のＧ１期における細胞集団の比率を示した。コントロール群では、約５０％の細胞がＧ１期にあった。ＩＦＮγ単独による処置は、３日後には、ＤＭＳＯコントロールを１０％まで超えるＧ１期遮断細胞の小さな前進性増加を引き起こした。ＤＩＭは、ＤＭＳＯコントロールに比較して経時的に３０％まで増加したより即時的な作用を有していた。ＤＩＭおよびＩＦＮγの併用は、３日後に、増殖の不在と相関している、Ｇ１静止期において９０％を超える細胞を導く付加作用を有していた。これらをまとめると、これらの結果はＤＩＭおよびＩＦＮγについての別個の細胞増殖抑制機序と一致している。
【００４７】
ＶＩ．ＤＩＭは、ＭＨＣ−Ｉ複合体のＩＦＮγ誘導性発現を増強する。
ＭＨＣ−Ｉ複合体の誘導性発現は、ＩＦＮγ媒介性シグナル伝達の明確に確立された重要な下流標的である。ＤＩＭがＩＦＮγシグナリングの有意な代謝産物に及ぼす可能性がある相乗作用をさらに試験するために、本発明者らは、ＤＩＭとの共処置がＭＣＦ−７細胞中でのＭＨＣ−Ｉ複合体のＩＦＮγ誘導性発現に及ぼす作用について試験した。
【００４８】
細胞表面ＭＨＣ−Ｉ発現についてのフローサイトメトリー分析は、ＦＩＴＣコンジュゲート化ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いて実施した。初期コントロール実験では、培養ＭＣＦ−７細胞を４８時間にわたり３０μＭのＤＩＭにより、次にさらに１６時間にわたり１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて、または用いずに前処置した。陰性コントロール抗体であるＦＩＴＣコンジュゲート化マウスＩｇＧ２ｂを用いた分析は、有意に誘導されたシグナルを示さなかった。細胞をある範囲のＩＦＮγ濃度で処置して抗ＭＨＣ−Ｉ抗体を用いて分析したその後の実験では、ＩＦＮγ誘導性ＭＨＣ−Ｉ発現の指標である強力なシグナルは０．１ｎｇ／ｍＬで検出可能であり、１０ｎｇ／ｍＬでプラトーにあると思われた。ビヒクルコントロール単独で処置した細胞中では、ＭＨＣ−Ｉ発現は、９９％を超える細胞中では検出されなかった。
【００４９】
４８時間にわたる３０μＭのＤＩＭによる前処置、次に０．１ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγによる処置は、８．１１％から４０．９８％へのＭＨＣ−Ｉ陽性細胞のパーセンテージにおけるさらなる増加を生じさせたが、ＭＨＣ−Ｉ発現／細胞（ＭＦＶ）に有意な作用を及ぼさなかった。ＭＨＣ−Ｉを発現した約９５％である１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて処置された細胞のＤＩＭへの曝露は、７６．０４から１３１．４１へのＭＦＶにおける強力な時間依存性増加を生じさせた。ＤＩＭ処置単独は、ＭＨＣ−Ｉ複合体の発現に有意な作用を及ぼさなかった。予想通りに、処置前の培地中へのＩＦＮγ遮断抗体の添加はＭＨＣ−Ｉ発現にＩＦＮγおよびＤＩＭの共処置が及ぼす誘導作用を無効にし、観察された作用についてのサイトカインの要件を確証した。
【００５０】
類似のまた別の実験では、本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞中でのＭＨＣ−ＩＩ発現にＤＩＭもしくはＩＦＮγが及ぼす作用を観察しなかった。これらの結果は、ＤＩＭ単独はＭＨＣ−Ｉの発現にほとんど、もしくは全く作用を生じさせないが、このインドールは、このタンパク質複合体を発現する細胞の比率、ならびにＩＦＮγに応答して細胞１個あたりＭＨＣ−Ｉの最高レベルを強力に増強することを示している。
【００５１】
ＶＩＩ．ＤＩＭは、ＭＨＣ−Ｉ構成成分およびトランスポーターのＩＦＮγ誘導性転写を増強する。
細胞表面上のＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体のレベルはＤＩＭによる前処置によって増強できるので、本発明者らは、複合体およびそのトランスポーターについての対応する遺伝子の発現もまた増加するかどうかを試験した。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびβ−マイクロチューブリンを含むヒトＭＨＣ−Ｉの４種の主要構成成分、ならびに２つの重要な関連トランスポーターであるＴＡＰ１およびＴＡＰ２の発現について試験した。本発明者らの結果は、全６つの遺伝子の発現レベルは、ビヒクル処置ＭＣＦ−７細胞と比較して、ＤＩＭによって有意に増強されなかったことを示している。予測通りに、これらの遺伝子の発現は、ＩＦＮγを用いた処置によって２〜８倍増加した。これらの結果は、さらに、ＤＩＭによる細胞の前処置が、ＩＦＮγ自体によって誘導されたレベルに比して少なくとも２倍以上、または背景レベルを超えて４〜１６倍へこれらの遺伝子のｍＲＮＡレベルをさらに増加させたことを示している。
【００５２】
これらの結果は、ＤＩＭがＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体および関連ｍＲＮＡのＩＦＮγ誘導性発現のレベルを相乗的に増強できることを示している。ＭＨＣ−Ｉタンパク質／細胞および関連ｍＲＮＡ両方のレベルにおけるＤＩＭによる大まかに２倍の増強は、ＤＩＭによるＭＨＣ−Ｉ発現が遺伝子転写のレベルで調節されることを示している。
【００５３】
プロトコルＩ〜ＶＩＩの結果は、ＤＩＭが、ＩＦＮγの発現を誘導でき、このサイトカインへの外因性曝露への細胞の応答に影響を及ぼすことのできる免疫調節因子であることを指示している。これらの結果は、ＤＩＭが、１）ＩＦＮγ、ＩＦＮγ受容体、および２種のＩＦＮγ誘導性遺伝子の発現を誘導する、２）ＩＦＮγ誘導性レポーター遺伝子構築物の発現を誘導する、３）ＳＴＡＴ−１シグナル伝達経路のＩＦＮγ媒介生活性化を相乗的に増強する、４）培養細胞中でのＩＦＮγの細胞増殖抑制作用を付加的に増強する、および５）ＩＦＮγ誘導性ＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体および関連ｍＲＮＡの発現を相乗的に増強することができることを示している。我々の知る限り、これは腫瘍細胞によるＩＦＮγの産生についての最初の報告である。ＤＩＭによる処置後には、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ技術を用いて分泌されたＩＦＮγについて強力なシグナルを観察した。
【００５４】
免疫細胞中でのＩＦＮ−γ発現の活性化は、シグナリングプロセスの複雑な相互作用によって媒介される。先天性もしくは後天性免疫を促進するリンパ球しかＩＦＮγを産生しないことは知られている。これらの細胞中でのＩＦＮγ産生は、通常は分泌されたサイトカインによって制御されるが、そのうちで最も広汎に試験されたものはインターロイキン（ＩＬ）−１２である（１４）。免疫細胞のＩＬ−１２への曝露は、ＪａｎｕｓキナーゼであるＪＡＫ２およびＴｙｋ２の活性化を生じさせ、これらは順にＩＬ−１２受容体をリン酸化し、転写因子ＳＴＡＴ４のためのドッキング部位を提供する。レポーター結合ＳＴＡＴ４は、ＪＡＫによってリン酸化され、ＳＴＡＴ４二量体化、核への転位、および遺伝子発現の調節を促進する。ＳＴＡＴ４は、ＩＦＮγ遺伝子調節へ直接的に寄与できるが、それは潜在的ＳＴＡＴ４結合部位がＩＦＮγ遺伝子の第１イントロンおよびプロモーター内に存在するからである（１５）。本発明者らの試験は、腫瘍細胞中でのＩＦＮγ発現のＤＩＭ誘導は、他の誘導されたサイトカインの仲介を含んでいない遺伝子活性化への直接的作用によって進行することを示している。転写内の増加はタンパク質合成のためには一般的に短すぎる期間であるたった６時間以内で発生する；さらに、ＭＣＦ−７細胞は、ＩＬ−１２などのＩＦＮγ活性化サイトカインを産生することは知られていない。
【００５５】
ＩＦＮγによって調節されるシグナリングカスケードは、相当詳細に試験されている。標的細胞の膜上でのＩＦＮγの高度に特異的なＩＦＮγ受容体（ＩＦＮＧＲ１）への結合は、通常は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２ならびにＳＴＡＴ１を含むリン酸化カスケードを活性化する。リン酸化ＳＴＡＴ１は、ホモ二量体化し、核へ転位し、ＩＦＮγ誘導性遺伝子のプロモーター内のＩＦＮγ活性化配列（ＧＡＳ）へ結合し、さらに転写を活性化する。そのような遺伝子の１つであるｐ６９−ＯＡＳの活性化は、順に感染細胞中でのウイルスＲＮＡの複製の防止において重要な役割を果たしている。さらに、ｐ６９−ＯＡＳは、近年細胞増殖の阻害因子であり、Ｂｃｌ−２に関連する前アポトーシスタンパク質であると同定されている（１７）。本発明者らの結果は、ＩＦＮγは乳腺腫瘍細胞中でのＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化できることを確証しており、このＩＦＮγの活性（すなわち、ＳＴＡＴ１リン酸化、ＳＴＡＴ１二量体化およびＧＡＳへの結合、ならびにＧＡＳ調節転写の活性化）はＤＩＭによる処置によって相乗的に増強されることを示している。これらの結果は、ＤＩＭがＩＦＮＧＲ１活性化の即時下流イベントに及ぼす作用が単独では限定されているが、インドールは付加されたＩＦＮγの作用を強力に増強することを示している。
【００５６】
ＤＩＭがＩＦＮγシグナリングに及ぼす作用は、これらの他の物質の作用から明白に識別可能である。一連の試験では、乳癌細胞中でのレチノイン酸（ＲＡ）およびＩＦＮγの相乗作用について記載された。最初に、相乗性抗増殖作用は、ＩＦＮγおよびＲＡを用いた細胞の連続的処置後に観察された。作用は、ＲＡ細胞増殖抑制活性のＩＦＮγ媒介性増強の結果として生じると思われた。ＩＦＮγは、レチノイン酸−γ（ＲＡＲγ）レベルの発現の増加および細胞ＲＡ結合タンパク質（ＣＲＡＢＰ）の発現減少によってＲＡ細胞増殖抑制潜在力を増加させることが証明された（１８）。引き続いて、ＲＡがＩＦＮγシグナリングに及ぼす作用についても乳腺腫瘍細胞中でも試験した。結果は、ＳＴＡＴ１発現のＲＡ媒介性増強を含んでいた機序によってＭＣＦ−７細胞中での遺伝子転写へのＩＦＮγが及ぼす作用を相乗的に増強できることを示した（１９）。また別の一連の試験では、乳癌細胞のＩＦＮおよびエストロゲンアンタゴニスト、タモキシフェンによる併用処置の作用を試験した。これらの物質を用いた共処置は、転写因子ＩＳＧＦ−３およびＧＡＦを含む所定のＩＦＮ刺激遺伝子の発現の増強を引き起こした（２０）。しかし、タモキシフェン単独では、これらの転写因子の発現に作用を生じさせなかった。そこで、ＤＩＭによる本発明者らの結果は、ＩＦＮγ作用への報告されたＲＡおよびタモキシフェンの作用からの有意差を示している。本発明者らは、ＤＩＭおよびＩＦＮγがＭＣＦ−７細胞増殖に及ぼす付加的阻害作用を観察したが、ＲＡを用いた作用は相乗性であった。同様にＲＡとは対照的に、ＤＩＭはＩＦＮγシグナル伝達を相乗的に増強したが、このインドールは、ＩＦＮγ処置の不在下ではＳＴＡＴ１発現を増加させなかった。最後に、単独でのＤＩＭ処置は、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮγおよびＯＡＳ関連遺伝子の発現を明白に誘導したが、これはＲＡもしくはタモキシフェンについては報告されなかった作用である。
【００５７】
ＤＩＭがＭＨＣ−ＩのＩＦＮγ誘導性発現に及ぼす相乗作用は相当に重要であるが、それはこの複合体が腫瘍免疫学的監視において重要な役割を果たすからである。ＭＨＣ−Ｉ分子は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）へ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を提示するために必要とされる。ＭＨＣ抗原の減少した発現は、腫瘍細胞を免疫学的監視から保護できる（２１，２２）。したがって、ＭＨＣ−Ｉの消失もしくはダウンレギュレーションは、乳房腫瘍形成における頻回な事象であることが示されている。実際に、誘導発癌性のマウスモデルを用いた数件の試験は、腫瘍の腫瘍形成および転移能力を増加させる際にＭＨＣ−Ｉ抗原のダウンレギュレーションが果たす役割を確証した（２３）。これとは逆に、誘導されたＭＨＣ−Ｉ発現はＩＦＮγ（２４）ならびにヌクレオチドアナログ、５−アザシチジンシトシンアルビノシド、５−フルオロウラシル、レチノイド、ビタミンＤ３、ならびに植物アルカノイド、ビンクリスチンを含む所定の小分子癌治療薬（２５，２６）の抗腫瘍特性において重要である。
【００５８】
ＤＩＭを用いた本発明者らの試験結果とＩ３Ｃを用いた本発明者らの試験結果（２７）の比較は、ＤＩＭおよびそのインビボ前駆物質がＩＦＮγシグナリングに及ぼす作用における活性の明確な相違を示している。ＤＩＭを用いた本発明者らの今回の結果に類似して、本発明者らは以前の研究において、Ｉ３Ｃが、ＩＦＮＧＲ１の発現およびＳＴＡＴ１シグナリングの相乗性活性化における強力かつ迅速な増加を含む機序によってＭＣＦ−７細胞中でのＩＦＮγシグナリングに作用を及ぼせることを示した。ＤＩＭおよびＩ３Ｃの類似の作用は、細胞増殖および細胞周期についてもまた観察された。しかしＤＩＭを用いた今回の結果とは対照的に、本発明者らは、以前の試験ではＩ３ＣによるＩＦＮγ刺激遺伝子（ｐ５６およびｐ６９−ＯＡＳ）の発現増加を観察しなかった。ＩＦＮＧＲ１タンパク質誘導の最高レベルはＩ３ＣおよびＤＩＭについて類似、すなわち約７倍であったが、レポーター発現の動態は、２種の処置後に有意に相違していた。そこで、強力レベルの誘導（約５倍）はＤＩＭへのたった６時間の曝露後に所見され、最高誘導はこのジインドールを用いた２４時間の処置によって達成された。対照的に、レポーター発現はＩ３Ｃを用いた２４時間の処置後には約３倍しか増加せず、最高誘導には約４８時間の曝露後にのみ達すると思われた。これらの結果は、Ｉ３ＣがＩＦＮＧＲ１発現に及ぼす作用が、細胞とのインキュベーション中にＤＩＭへの緩徐な転換によって媒介されるという仮説と一致している。実際に、本発明者らは以前に、ＤＩＭが、Ｉ３Ｃで処置されたＭＣＦ−７培養細胞の核内に蓄積することを示している（２８）。
【００５９】
本発明者らの結果は、再発性呼吸性乳頭腫症（ＲＲＰ）の制御におけるインドール処置の臨床的有効性を説明している。Ｉ３ＣおよびＤＩＭは、それらの有効性および低レベルの毒性のために、この障害のための一般的な補助療法になっている（２９，３０）。ＲＲＰは、所定タイプのヒトヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされ（３１，３２）、この疾患の特質は、外科的切除後に乳頭腫が再発する傾向である（３３−３４）。１つの報告書は、再発率を緩徐化することによって多数の患者（５５．４％）がＩ３Ｃ／ＤＩＭの処置に応答すること、そしてこの疾患の再発が患者の１９％において完全に阻害されることを指示した（３０）。ＲＲＰの制御において以前に示唆されたＩ３Ｃ／ＤＩＭの作用様式には、より良好なエストロゲン代謝産物平衡の誘導（３５）、細胞増殖の阻害（３６）、およびアポトーシスの誘導（３７）が含まれる。本発明者らの結果は、Ｉ３Ｃ／ＤＩＭは免疫増強のまた別の機序によって機能できることを示している。この活性は、再発性乳頭腫の予防においてだけではなく、乳頭腫症の治療および広範囲の腫瘍タイプの悪性転換の予防においても有用である。
【００６０】
本発明者らは、生理学的に重要な濃度でＤＩＭの免疫応答活性化活性を観察した。２００ｇのブロッコリーを毎日摂取する平均体重のヒトは、約１２ｍｇのＤＩＭを入手する。ＤＩＭの吸収が最大である場合は、ＤＩＭの血中濃度はおよそ１０μＭに達する。このため、食用アブラナ科野菜からのＤＩＭのインビボ濃度はインビトロでのＤＩＭの有効レベルを表している。
【００６１】
ＶＩＩＩ．３，３’−ジインドリルメタンおよび置換３，３’−ジインドリルメタンは、サイトカインの血清中レベルにおける時間依存性増加を刺激する。
本試験では、本発明者らは、インビボおよびインビトロでのサイトカインの産生、Ｔ細胞増殖、およびＮＯ産生を含む、ＤＩＭが免疫応答活性化に及ぼす作用を試験した。
【００６２】
本発明者らは、最初に未置換ＤＩＭがＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγの産生に及ぼす作用について調査した。１群３匹のマウス群に、３０μｇ／ｋｇの未置換ＤＩＭを経口投与し、薬物抗原投与の１、３、５、８、および２４時間後に致死させた。血清を採取し、プールし、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果は、ＤＩＭがサイトカインの血清中レベルにおける時間依存性増加を刺激したことを示している。ＤＩＭは、Ｇ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの循環中レベルの増加を生じさせ、３時間後の時点が最高であった。ＩＬ−６は５時間後にもピーク値で誘導された。ＤＩＭはＩＬ−１２も刺激し、少なくとも２４時間にわたり増加したレベルが維持されたので、動態はわずかに相違していた。類似の実験では、本発明者らは、ＤＩＭが静脈内投与されたマウスにおいて、ＩＦＮγ産生の上昇を含む上昇したサイトカイン産生を見いだした。
【００６３】
本発明者らは、表１（上記）に示した１パネルの典型的な置換ＤＩＭ化合物が、インビボおよびインビトロでのサイトカインの産生、Ｔ細胞増殖、およびＮＯ産生を含む、免疫応答活性化に及ぼす作用を試験するためのその後の平行試験を設計した。これらの実験は、サイトカインの血清中レベルにおける類似の時間依存性増加を示している。
【００６４】
ＩＸ．３，３’−ジインドリルメタンおよび置換３，３’−ジインドリルメタンの投与はＢＡＬＢ／ｃマウスをＹ．エンテロコリチカ感染に対して耐性にする。
エルシニア・エンテロコリチカは、ヒトおよび齧歯類において腸炎および全腸炎を引き起こす、グラム陰性の、主として細胞外に位置する病原体である。さらに、脾臓および肝臓内での膿瘍および肉芽腫病変を含む全身性感染は、特に免疫不全性の個体において発生する。細胞内病原体による感染症におけると同様に、一次エルシニア感染を浄化するためには、活性化マクロファージと協調してＴ細胞、特にＣＤ４＋Ｔｈ１細胞が必要とされる。エルシニアに対する保護的宿主応答は、様々な前炎症性サイトカインによって媒介される。ＴＮＦα、ＩＦＮγ、もしくはＩＬ−１２の中和は、この病原体に対する耐性を阻害する。以前の試験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＹ．エンテロコリチカに対して耐性であるが、ＢＡＬＢ／ｃマウスは易感染性である。ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、もしくは抗ＩＬ−４抗体の投与はＢＡＬＢ／ｃマウスをエルシニアに対して耐性にさせた。上記で報告したように、本発明者らは、ＤＩＭが、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２を含む免疫応答活性化サイトカインの数増加に作用を及ぼせることを見いだした。ここで本発明者らは、ＤＩＭがＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるエルシニア感染の重症度を減少させられることを示している。
【００６５】
雌性６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社から購入し、特異的病原体無含有条件（陽圧キャビネット）下で維持する。
【００６６】
マウスには３０μｇ／ｋｇ／日のＤＩＭまたは２４種の置換ＤＩＭ化合物（表１、上記）のうちの１つを感染１日前から開始して経口投与する。
【００６７】
０．１ｍＬの無菌リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中に懸濁させた、新しく解凍した、プラスミドを含むＹ．エンテロコリチカＷＡ−３１４血清型Ｏ：８生物体を以前に記載したように静脈内および経口感染のために使用する（Ａｕｔｅｎｒｉｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２５９０−２５９９）。投与される実際細菌数は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天上の摂種菌の連続希釈物を平板培養し、２６℃で３６時間のインキュベーション時間後にＣＦＵを計数することによって決定する。動態試験のために、１群５匹のマウスは５×１０３の細菌を用いる感染後（ｐ．ｉ．）第１、３、および７日に二酸化炭素窒息によって致死させる。脾臓を無菌的に切除し、０．１％のウシ血清アルブミンを含有する５ｍＬのＰＢＳを用いることによって単細胞懸濁液を調製する。これらの調製物の連続希釈液０．１ｍＬを２つずつＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天上で平板培養する。検出可能なＣＦＵの限度は２５（ｌｏｇ１０２５＝１．４）である。
【００６８】
単一エンドポイント試験では、２×１０３のＹ．エンテロコリチカを用いた感染７日後の処置ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓中の細菌数は未処置コントロールと比較した有意な減少を示している。これと一致して、動態試験は、未処置コントロールマウスと比較して２５の処置群の各々において脾臓中細菌数における時間依存性減少を示している。
【００６９】
参考文献
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２７．Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ，Ｕ．，Ｒｉｂｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２５：１１１９−２８．２００４．
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３６．Ｃｏｖｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｈｓｉｅｈ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｒａｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈａｌｌｄｅｎ，Ｇ．，Ｋｉｍ，Ｇ．Ｓ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ−６ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｇ１ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：３８３８−４７，１９９８．
３７．Ｈｏｎｇ，Ｃ，Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ３，３’−ｄｉｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈａｎｅ（ＤＩＭ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６３：１０８５−９７，２００２．
【００７０】
上記の特定の実施形態および実施例についての説明は、限定するためではなく例示するために提供されている。本明細書で言及した全刊行物および特許出願ならびにその中に言及された全参考文献は、個別刊行物または特許出願または参考文献が各々特別かつ個別に参照して組み込まれると指示されたかのように組み込まれる。上記の本発明は明確に理解するために例示および実施例によってある程度詳細に記載してきたが、当業者には、添付の請求項の精神もしくは範囲から逸脱せずに本発明の教示に照らして所定の変化および修飾を加えられることは容易に明白である。
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｌｅｏｎａｒｄ Ｆ．Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ、Ｊａｃｑｕｅｓ Ｅ．Ｒｉｂｙ、Ｌｉｎｇ ＸｕｅおよびＧａｒｙ Ｌ．Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ
本研究は、米国立衛生研究所補助金（第ＣＡ６９０５６号）、および米陸軍補助金（第ＲＰ９５０８４４号）による支援を受けた。このため米国連邦政府は、本出願への特許付与に権利を有することができる。
【０００２】
本発明の分野は、３，３’−ジインドリルメタン組成物および免疫活性剤としてのそれらの使用である。
【背景技術】
【０００３】
３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）は、最も一般的にはキャベツ、芽キャベツ、カリフラワーおよびブロッコリーを含むアブラナ属の食用植物中に存在するグルコブラシシンの自己融解分解中に生成される天然産物である。ＤＩＭはさらにまた、植物中のＤＩＭの直前駆体であるインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）の消化後にも産生する（１）。さらに、ＤＩＭは、長時間のインキュベーション期間中にほぼ中性ｐＨ細胞培養条件下でＩ３Ｃから緩徐に産生する。
【０００４】
いくつかの試験の結果は、ＤＩＭが、特に乳腺腫瘍形成に対する前途有望な癌保護活性を示すことを指示している（２〜４）。抗癌治療前の単回投与でのＩ３Ｃの経口挿管法は、ラットにおけるＤＭＢＡ誘導性乳腺腫瘍の発生率および多重度を７０〜８０％減少させた（２，５）。ＤＭＢＡ誘導性乳腺腫瘍形成のプロモーション段階中のＤＩＭの反復経口投与は、齧歯類において９５％という高さで腫瘍増殖を阻害した（６）。本発明者らは、従来型の細胞培養条件下で、エストロゲン受容体状態とは無関係に、ＤＩＭが乳腺腫瘍細胞系の増殖を阻害できることを観察した（７）。ＤＩＭはＧ１細胞周期停止を誘導し、エストロゲン応答性およびエストロゲン非依存性乳癌細胞のどちらにおいてもｐ２１細胞周期阻害剤の遺伝子発現およびプロモーター活性の強力な誘導を発生した。ＤＩＭの抗増殖作用は、ヒト乳癌細胞における細胞周期制御のための標的としてのｐ２１のＳｐ１／Ｓｐ３転写因子活性化を含んでいた（８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、免疫応答の調節における重要な役割とともに抗ウイルス機能および細胞増殖抑制機能を備える１群のサイトカインである。ＩＦＮαおよびＩＦＮβを含むタイプＩのＩＦＮは、ウイルス感染細胞によって産生する。通常はインターフェロンγ（ＩＦＮγ）もしくは「免疫インターフェロン」と呼ばれるタイプＩＩのＩＦＮは、免疫グロブリン産生細胞へのＢ細胞分化を促進する（９）。最近認識されたＩＦＮγの抗腫瘍活性はまだ完全には理解されていないが、非特異的殺腫瘍活性のためのマクロファージのプライミング、腫瘍細胞に対する細胞毒性を増加するための単球、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞の活性化、ならびに腫瘍誘導性血管新生の阻害を含む（１０）。だが癌患者におけるＩＦＮγの可能性のある治療使用は、重篤な副作用のために限定されている（１１）。
【０００６】
関連文献
Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ，Ｕ．，Ｒｉｂｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，ＥＸ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２５：１１１９−２８，２００４．
Ｅｘｏｎ ＪＨ，Ｓｏｕｔｈ ＥＨ，「Ｄｉｅｔａｒｙ ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ａｌｔｅｒｓ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ．」 Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ａ．２０００ Ｆｅｂ ２５；５９（４）：２７１−９．
Ｊ．Ｈ．Ｅｘｏｎ，Ｅ．Ｈ．Ｓｏｕｔｈ，Ｂ．Ａ．Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｋ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｎｄｏｌｅ−３−Ｃａｒｂｉｎｏｌ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｃｒｙｐｔ Ｆｏｃｉ，ａｎｄ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｃｒｙｐｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ」 Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ａ．２００１；６２：５６１−５７３．
任意に置換されたＤＩＭ組成物は、２００３年９月１６日に提出された同時係属出願ＵＳＳＮ １０／６６４，９９１の中に記載されている。
Ａｕｂｏｒｎ ＫＪ，Ｑｉ Ｍ，Ｙａｎ ＸＪ，Ｔｅｉｃｈｂｅｒｇ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｍａｄａｉｏ ＭＰ，Ｃｈｉｏｒａｚｚｉ Ｎ．Ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｓ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ−ｐｒｏｎｅ（ＮＺＢ／ＮＺＷ）Ｆ１ ｍｉｃｅ ｆｅｄ ａ ｄｉｅｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ．Ｊ Ｎｕｔｒ．２００３ Ｎｏｖ；１３３（ｌｌ）：３６１０−３．
Ｋｏｈｕｔ ＭＬ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＲ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｊ，Ｂｒｏｗｎ ＧＡ，Ｖｕｋｏｖｉｃｈ ＭＤ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＤＡ，Ｋｉｎｇ ＤＳ．Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＥＡ）ａｎｄ ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ ｈａｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｄｄｌｅ−ａｇｅｄ ｍｅｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ．２００３ Ｏｃｔ；２２（５）：３６３−７１．
Ｓｔａｎｌｅｙ Ｍ．Ｃｈａｐｔｅｒ １７：Ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ−ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ Ｍｏｎｏｇｒ．２００３（３１）：１１７−２４．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ｗｉａｔｒａｋ ＢＪ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．２００３ Ｄｅｃ；ｌｌ（６）：４３３−４１．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ａｕｂｏｒｎ ＫＪ．Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ．Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．２００２ Ｍａｒ；７（１）：１−９．Ｒｅｖｉｅｗ．
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、免疫応答活性化組成物および使用方法を提供する。一般的方法は、免疫応答活性剤をそれが必要であると決定された患者に送達する方法であって、（ａ）前記患者に所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭを投与する工程と；および（ｂ）前記患者において結果として生じた免疫応答活性化を検出する工程とを含む。
【０００８】
特定の実施形態では、免疫応答活性化は、Ｔ細胞増殖、ＮＯ産生、サイトカイン産生、サイトカイン受容体発現、もしくはサイトカインシグナリングであり、それらの増加として検出される；サイトカインは、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγから選択される；投与する工程は、経口もしくは静脈内投与によって実施される；ならびに患者は、免疫不全状態である、または感染症または腫瘍症に罹患していると判断される。
【０００９】
本方法は、一般に、式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は、個別および独立して、水素、またはハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状もしくは分枝状アルキルもしくはアルコキシ基、アミン、スルホニル、およびニトロ基からなる群から選択される置換基である）を有する、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンを使用する。特定の実施形態では、本化合物は、少なくとも１つの置換基を好ましくはＲ１およびＲ１’以外の位置、またはそれらに加えて含み、直鎖状もしくは分枝状アルキルまたはアルコキシ基は１〜５個の炭素である、および／またはハロゲンは塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択される。特定の実施形態では、インドリルは対称性で置換されており、各インドリルは同様に一置換、二置換、三置換、またはパラ置換されている。
【００１０】
本発明は、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’ジインドリルメタンを、相補的、付加的、および／または相乗的有効性のために、１つまたは複数の他の治療薬、特に様々な免疫応答活性化または抗感染もしくは抗腫瘍形成化合物と結び付けて使用する方法をさらに提供する。これらの方法は、組み合わせ単位製剤、または結合パッケージング内に個別に調薬されて提供される個別組成物であってよい組み合わせ組成物を使用できる。
【００１１】
本発明は、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンと、本方法について記載している説明媒体とを含むキットをさらに提供する。上記の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンは、事前に測定された単位製剤中に存在してよく、さらに追加の治療薬、特に相違する免疫応答活性剤、または抗感染もしくは抗腫瘍形成化合物とともに製剤もしくはパッケージング内に結合されてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下の特定の実施形態および実施例についての説明は、例示するために提供されるもので、限定するためではない。禁忌ではない、または他に特に言及しない限り、これらの説明および本明細書を通して、用語「１つ」は「１つまたは複数」を意味しており、用語「または」は「および／または」を意味している。
【００１３】
一般的方法は、免疫応答活性剤をそれが必要であると決定された宿主に送達する方法であって、（ａ）前記患者に所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）を投与する工程と；および（ｂ）前記患者において結果として生じた免疫応答活性化を検出する工程とを含む。本方法は、接触させる工程の前に、宿主が免疫応答活性剤を必要であることを決定する工程をさらに含むことができる。
【００１４】
本明細書に開示した組成物は、免疫応答活性剤を必要とすると決定された、および特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖、ＮＯ産生、サイトカイン産生、サイトカイン受容体発現、もしくはサイトカインシグナリングの増加を必要とすると決定された宿主に様々な用途を提供するが、特にサイトカインは、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγから選択される。例えば、科学者は、本組成物を細胞培養または実験動物へ免疫応答活性化活性を提供するために使用できる。好ましい宿主はヒト患者であるが、本組成物は、主題免疫応答活性剤を用いて治療可能であることが知られている広範囲の障害に罹患又は素因があると決定された患者に投与できる。例には、ウイルス、細菌および真菌感染症における抗感染療法としての使用が含まれる。
【００１５】
好ましい実施形態では、宿主は、免疫応答増加に伴って改善できる病理の罹患者もしくは素因があると決定されたヒト患者であるが、結果として生じる本発明の免疫応答活性化は病理、特にウイルス、細菌および真菌感染症からなる群から選択される病理もしくは病理の進行の減少として明示される。
【００１６】
本発明者らの方法は、一般に式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は、個別および独立して、水素、またはハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状もしくは分枝状アルキルもしくはアルコキシ基、アミン、スルホニル、およびニトロ基からなる群から選択される置換基である）の構造を有する、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンを使用する。置換基含有化合物は、ＤＩＭ誘導体もしくはＤＩＭアナログと呼ぶことができる。特定の実施形態では、本化合物は、少なくとも１つの置換基を好ましくはＲ１およびＲ１’以外の位置で、またはそれらに加えて含み、直鎖状もしくは分枝状アルキルまたはアルコキシ基は１〜５個の炭素である、および／またはハロゲンは塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択される。
【００１７】
免疫応答活性化活性は、細胞培養中および広範囲の臨床的に重要で妥当性が確認された動物モデルにおいて実施できる、サイトカインおよびサイトカイン受容体アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、ＮＯ産生アッセイなどを含む、以下で記載する様々なアッセイを用いて容易に確認される。
【００１８】
詳細には、本発明者らは、免疫応答活性化活性の高スループットスクリーニングのためのＤＩＭ誘導体のライブラリーを生成するために、反復的コンビナトリアル合成スキームを考案した。典型的な証明では、本発明者らは、以下に要約した５回の合成ラウンドにおいて４５１種のＤＩＭ誘導体構造を生成した。
合成ラウンド２：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−Ｆ、−Ｃｌ、もしくは−Ｂｒ−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド５：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、もしくはペンチル−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド６：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−メトキシ−、エトキシ−、プロピルオキシ−、ブチルオキシ−、もしくはペンチルオキシ−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド９：Ｒ２、４、５、６もしくは７、Ｒ２’、４’、５’、６’もしくは７’ジ−ヒドロキシル、アミノ−、アミノメチル−、スルホ−、もしくはニトロ−３，３’−ジインドリルメタン
合成ラウンド１２：Ｒ２、４、５、６、７、Ｒ２’、４’、５’、６’、７’デカ−フルオロ（パーフルオロ）−３，３’−ジインドリルメタン
【００１９】
ＤＩＭアナログの免疫応答活性化作用は、サイトカインおよびサイトカイン受容体発現についてのセルベース・アッセイを用いて試験される。本発明者らの最初の実証では、ＩＦＮγ、ＩＦＮγ受容体（ＩＦＮＧＲ１）、オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）ファミリーメンバーのタンパク質６９（ｐ６９−ＯＡＳ）、およびＯＡＳと密接に関連するタンパク質であるインターフェロン誘導性タンパク質５６（ｐ５６）の転写活性化を監視するために、処置および未処置ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞のｃＤＮＡ遺伝子発現マイクロアレイスクリーニングを使用し、その後にノーザンブロットおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して結果を確証した。本発明者らは、３日間まで処置されたＭＣＦ−７細胞のコンフルエントな培養由来の培地中でのＩＦＮγのレベルを試験するために感受性サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイもまた使用した。ＤＩＭ誘導体は、本発明者らが実施したレポーターおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいて免疫応答活性化活性を有することが確証されたので、次に以下の実施例ＶＩＩＩおよびＩＸに記載するように全動物サイトカイン産生およびエルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）感染試験においてスクリーニングする。
【００２０】
【表１】
【００２１】
特定の実施形態では、インドリル部分は対称性で置換されており、各部分は同様に一置換、二置換、三置換などされている。他の特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’は塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択されるハロゲンである。それから免疫応答活性化合物が同定されると本明細書に記載した追加のＤＩＭ誘導体には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’はハロゲンである化合物が含まれる。これらには、３，３’−ジインドリルメタン、５，５’−ジクロロ−ジインドリルメタン；５，５’−ジブロモ−ジインドリルメタン；および５，５’−ジフルオロ−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。追加の好ましいそのようなＤＩＭ誘導体には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’は１〜１０個の炭素、最も好ましくは１〜５個の炭素を有するアルキルもしくはアルコキシである化合物が含まれる。これらには、５，５’−ジメチル−ジインドリルメタン、５，５’−ジエチル−ジインドリルメタン、５，５’−ジプロピル−ジインドリルメタン、５，５’−ジブチル−ジインドリルメタン、および５，５’−ジペンチル−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。これらには、さらにまた５，５’−ジメトキシ−ジインドリルメタン、５，５’−ジエトキシ−ジインドリルメタン、５，５’−ジプロピルオキシ−ジインドリルメタン、５，５’−ジブチルオキシ−ジインドリルメタン、および５，５’−ジアミルオキシ−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。
【００２２】
追加の好ましいそのようなＤＩＭ誘導体には、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ１およびＲ１’は１〜１０個の炭素、最も好ましくは１〜５個の炭素を有するアルキルもしくはアルコキシルである化合物が含まれる。そのような有用な誘導体には、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−ジインドリルメタン、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−ジインドリルメタン、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−ジインドリルメタン、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−ジインドリルメタン、およびＮ，Ｎ’−ジペンチル−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。さらにまた別の好ましい実施形態では、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ２およびＲ２’は１〜１０個の炭素、最も好ましくは１〜５個の炭素のアルキルである。そのような化合物には、２，２’−ジメチル−ジインドリルメタン、２，２’−ジエチル−ジインドリルメタン、２，２’−ジプロピル−ジインドリルメタン、２，２’−ジブチル−ジインドリルメタン、および２，２’−ジペンチル−ジインドリルメタンが含まれるが、それらに限定されない。また別の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’は水素であり、Ｒ５およびＲ５’はニトロである。
【００２３】
置換ＤＩＭアナログは、ホルムアルデヒドと市販で入手できる置換インドールとの縮合によって容易に調製される。前駆体化合物は、置換インドール−３−アルデヒドを形成するために適切な置換インドールのジメチルホルムアルデヒド縮合によって合成できる。適切な置換インドールには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７位で置換基を有するインドールが含まれる。これらには、５−メトキシ、５−クロロ、５−ブロモ、５−フルオロ、５’−メチル、５−ニトロ、ｎ−メチルおよび２−メチルインドールが含まれるがそれらに限定されない。置換インドール−３−アルデヒド生成物は、置換Ｉ３Ｃを得るためにアルデヒド部分を還元させるためにメタノールなどの適切なアルコールおよび固体水素化ホウ素ナトリウムを用いて処理される。置換ＤＩＭは、置換インドール−３−カルビノール生成物を縮合させることによって調製される。これは、例えば、約５．５のｐＨを有するリン酸緩衝液を用いた処理によって達成できる。
【００２４】
本組成物は、医薬担体および／または希釈剤と一緒に投与できる。本発明において有用な医薬担体もしくは希釈剤の例には、適切な水溶性有機担体を含む、すなわちｐＨが約７．０〜７．４の任意の生理的緩衝媒質が含まれる。適切な水溶性有機担体には、コーン油、ジメチルスルホキシド、ゼラチンカプセルなどが含まれるがそれらに限定されない。本発明の免疫応答活性化組成物は、さらにまた、他の物質と組み合わせて、例えば、他の化学療法薬もしくは免役刺激薬もしくは治療薬と結び付けて投与することもできる。これらの方法は、組み合わせ単位製剤、または結合パッケージング内に個別に調薬されて提供される個別組成物であってよい組み合わせ組成物を使用できる。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、主題の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンを、相補的、付加的、および／または相乗的有効性のために、１つまたは複数の他の治療薬、特に様々な免疫応答活性化合物と結び付けて使用する方法を提供する。サイトカインは、そのような組み合わせにおいて有用な、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）などを含む代表的な、周知の免疫応答活性剤を提供する。本方法で共投与するために適合する追加のサイトカインは、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．６ｔｈ ｅｄ．Ｋｕｆｅ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ（Ｃａｎａｄａ）：ＢＣ Ｄｅｃｋｅｒ Ｉｎｃ；ｃ２００３）、およびＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｗｏ Ｖｏｌｕｍｅ Ｓｅｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；４ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｕｌｙ ７，２００３）に記載されている。
【００２６】
本発明の組成物は、経口、静脈内、鼻腔内、直腸内、または治療すべき組織もしくは部位へ有効量の活性物質を送達する任意の手段によって投与できる。適切な用量は、所望のエンドポイントを達成する用量である。様々な障害を治療するためには様々な用量が必要とされることは理解される。物質の有効量は、標的とする病理もしくは病理の進行における有意な減少を引き起こす、または素因を有する宿主における発生を遅延させる、もしくは病理の可能性を減少させる量である。例えば、有効量は感染物質の総数、増殖率、関連病理などを減少させることができる。
【００２７】
投与された免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭは、有益には強化された更新、生物学的利用能、安定性、半減期などを提供するため、または毒性などを低下させるために１つまたは複数の機能的部分と複合化もしくは共投与することができる。しかし、それでも本組成物は、単離形、複合化形、またはプロドラッグ形のいずれであっても、上記の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭを含む。
【００２８】
当業者は、投与経路、化合物の代謝、および例えば分布量、クリアランス、対象者の年齢などの他の薬物動態パラメータを考慮に入れて、経験的に、本発明の物質を投与するために最も有効な用量および時間を確定することができる。
【００２９】
本発明は、免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンと、例えば同梱されているなどの本方法を説明もしくは列挙している説明媒体とを含むキットを含む、本方法を実施するために特別に調製されたキットをさらに提供する。上記の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンは、事前に測定された単位製剤中に存在してよく、さらに追加の治療薬、特に相違する免疫応答活性剤、特にサイトカインとともに製剤もしくはパッケージング内に結合されてよい。
【００３０】
本発明は、本方法を実施するために特別に調整されたビジネス方法をさらに提供する。例えば、１つの実施形態では、本ビジネス方法は、主題の免疫応答を活性化する、任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンをベースとする方法もしくは組成物を販売する工程、契約する工程、またはライセンス付与する工程を含む。
【００３１】
本発明を様々な腫瘍性および正常細胞系における感染に対するインビトロおよびインビボ活性によって例示する。インビトロアッセイにおいて使用された試験細胞系は、動物における免疫応答活性化のためのモデルであると明確に認識され、受け入れられている。マウスを使用する実験的インビボアッセイは、ヒトなどであるがヒトに限定されない他の動物におけるインビボ活性を予測できると明確に認識され、受け入れられている。
【００３２】
典型的な実験プロトコル
プロトコルＩ〜ＶＩＩでは、本発明者らは、ＤＩＭがＩＦＮγシグナル伝達経路を活性化することを証明する。ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞はＩＦＮγ ｍＲＮＡを発現し、ＤＩＭ処置に応答して、ＩＦＮγタンパク質をそれらの培養培地中へ分泌した。ＤＩＭ処置は、さらにＩＦＮＧＲ１ならびにＩＦＮγ応答遺伝子であるｐ５６およびｐ６９−ＯＡＳの発現も活性化した。ＤＩＭは、トランスフェクトした細胞中のインターフェロン誘導性受容体構築物のＩＦＮγを用いた相乗性活性化も生じさせた。さらに、ＤＩＭは、ＳＴＡＴ−１のリン酸化も増強し、ＩＦＮγ経路のＤＩＭ活性化のさらなる証拠を提供した。ＤＩＭおよびＩＦＮγは、培養細胞中での付加的抗増殖活性を示した。最後に、ＤＩＭおよびＩＦＮγの併用処置は、ＤＩＭの強力な免疫増強活性と一致して、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現における相乗性増加を生じさせた。
【００３３】
Ｉ．ＤＩＭはＩＦＮγおよび関連遺伝子の転写を活性化する。
ＤＩＭを用いたヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の初期ｃＤＮＡ遺伝子発現マイクロアレイスクリーニング、その後のノーザンブロットおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した結果の確証は、ＩＦＮγ、ＩＦＮγ受容体（ＩＦＮＧＲ１）、オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）ファミリーメンバーのタンパク質６９（ｐ６９−ＯＡＳ）、およびＯＡＳと密接に関連するタンパク質であるインターフェロン誘導性タンパク質５６（ｐ５６）の転写活性化を確証した。ＩＦＮγ、ｐ６９−ＯＡＳおよびｐ５６の発現は６時間の処置後に完全に誘導されたが、最高ＩＦＮＧＲ−１誘導は４８時間の処置後に到達した。ＩＦＮγおよびｐ５６についてのｍＲＮＡのレベルは、４８時間のＤＩＭ処置後にほぼコントロールレベルへ復帰した。ＩＦＮＧＲ１およびｐ６９−ＯＡＳについてのｍＲＮＡレベルは、処置４８時間後に上昇したままであった。ＩＦＮγ、ＩＦＮＧＲ１、ｐ６９−ＯＡＳおよびｐ５６について最高誘導は、各々４．６、３．８、３．２および４．０倍であった。
【００３４】
ＩＩ．ＤＩＭは、ＩＦＮγおよびＩＦＮＧＲ１タンパク質の発現を誘導する。
ＩＦＮγおよびＩＦＮＧＲ１についてのｍＲＮＡのレベルがＤＩＭによってアップレギュレートされた観察所見に続いて、本発明者らは、これらの遺伝子のタンパク質生成物のレベルを試験した。感受性サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、本発明者らは、３日間までＤＩＭを用いて処置されたＭＣＦ−７細胞のコンフルエントな培養由来の培地中でのＩＦＮγのレベルを試験した。これらの試験の結果は、未処置細胞の培地中のＩＦＮγの段階的蓄積およびＤＩＭとともにインキュベートした細胞からのＩＦＮγの分泌のより急速な増加を示した。培養細胞の培地中のＩＦＮγのレベルは１および３日間のインキュベーション後にビヒクル処置コントロール内の実質的に検出不能なレベルから、インドール処置細胞については、各々約５０±１０ｐｇ／ｍＬおよび８０±３０ｐｇ／ｍＬへ増加した。
【００３５】
ウエスタンブロット分析の結果は、ＩＦＮＧＲ１タンパク質のレベルがＤＩＭ処置によって強力にアップレギュレートされることを示した。ＩＦＮＧＲ１タンパク質レベルは、ＤＭＳＯ−処置コントロールと比較して、２４時間後に約７倍増加しており、４８時間後まで維持された。これらの結果は、ｍＲＮＡレベルにおける増加と一致しており、ＤＩＭは転写コントロールを通してＩＦＮＧＲ１発現を調節できることを指示している。
【００３６】
ＩＩＩ．ＤＩＭは内因性ｐ６９−ＯＡＳ遺伝子および関連するレポーター遺伝子構築物のＩＦＮγ誘導性発現を増強する。
次に、本発明者らは、ＤＩＭ単独、およびＩＦＮγとの併用が内因性ｐ６９−ＯＡＳの発現およびトランスフェクトされたＩＦＮγ応答性レポーター遺伝子構築物の発現に及ぼす作用をより詳細に試験した。
【００３７】
ｐ６９−ＯＡＳ転写体のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＤＩＭ（５０μＭ）およびＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍＬ）を用いた個別処置が、コントロールに比較して各々、約３．５倍および５．０倍の誘導を産生することを示したが、他方２種の併用を行なう処置はほぼ１２倍の増加を生じさせた。これらの結果は、内因性ｐ６９−ＯＡＳの誘導性発現にＤＩＭおよびＩＦＮγが及ぼす相乗性相互作用を指示している。
【００３８】
次に、本発明者らは、内因性ｐ６９−ＯＡＳ遺伝子発現に及ぼしたＤＩＭの誘導作用が同時タンパク質合成を必要とするかどうかを決定した。本発明者らの結果は、翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドを用いた共処置がＤＩＭ処置の誘導作用、ならびに内因性ｐ６９−ＯＡＳのＩＦＮγ誘導性発現に及ぼすＤＩＭの増強作用を遮断したことを指示している。
【００３９】
ＤＩＭの誘導作用が転写レベルにあるかどうかを試験するためのまた別の実験では、２種のルシフェラーゼレポーター構築物であるＯＡＳ−Ｌｕｃ（１２）および４ＧＡＳ−Ｌｕｃ（１３）の活性にＤＩＭが及ぼす作用を試験した。ＯＡＳ−Ｌｕｃは、ｐ６９−ＯＡＳのプロモーターおよび５’−フランキング領域（−９７２）を含有し、ＧＡＳ−ＬｕｃはコンセンサスＧＡＳエレメントの４つの繰り返しを含有する。これらのレポーター構築物を用いて一過性でトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞は、２４時間にわたり、ＩＦＮγ、ＤＩＭ、もしくは両方の組み合わせで処置した。ＤＩＭ処置はＯＡＳ−Ｌｕｃレポーターの発現を最高約２．３倍へ誘導したが、本発明者らは、３倍を超える対応する内因性遺伝子の誘導についてそのレベルよりいくらか低い誘導レベルを観察した。ＩＦＮγはこのレポーターの転写活性を、約５．０倍の内因性遺伝子の応答より低い最高約１．８倍へ濃度依存方法で誘導した。内因性遺伝子発現に誘導因子の併用処置の最大作用とは顕著に対照的に（ビヒクル処置細胞と比較してほぼ１２倍の増加）、レポーター遺伝子構築物はコントロールに比較して３倍未満の増加で応答した。これらの結果は、レポーターおよび内因性遺伝子がＤＩＭ単独による処置へ同様に応答したが、レポーターはＩＦＮγに対する内因性遺伝子より低応答性であったことを示している。
【００４０】
最後に、４ＧＡＳ−Ｌｕｃレポーターを用いてトランスフェクトされた細胞を用いた試験は、ｐ６９−ＯＡＳ遺伝子の応答に類似するが、２種の誘導因子を用いた共処置へ一致する相乗性応答が付随したＩＦＮγに対するより強固な応答であるＤＩＭの誘導作用を示した。そこで、ＤＩＭ（５０μＭ）単独による処置は、さらにこのレポーターの活性の２〜３倍の増加を生じさせた。しかしＩＦＮγ処置は、ビヒクル処置コントロールに比較してほぼ４０倍の誘導へレポーター活性における堅固な濃度依存性増加を生じさせた。ＤＩＭおよびＩＦＮγを用いた共処置は、試験した全ＩＦＮ−γ濃度で４ＧＡＳ−Ｌｕｃレポーターのほぼ２倍の相乗性活性化を生じさせ、約７５倍の最高誘導に到達した。
【００４１】
これらをまとめると、これらの結果は、ＤＩＭ単独がＩＦＮγへ差別的に応答する内因性活性化およびトランスフェクトされたレポーター遺伝子の類似レベルを生じさせることを示した。これらの結果は、ＤＩＭの誘導作用は短命の転写因子によって媒介され、中間体調節タンパク質の新規合成を必要とすることをさらに示している。
【００４２】
ＩＶ．ＤＩＭがＩＦＮγ媒介性シグナル伝達に及ぼす相乗作用。
ＤＩＭによる転写活性化においてＧＡＳエレメント活性化が果たす役割を確証するために、本発明者らは、このインドールがＧＡＳシグナリング経路において下流イベントに及ぼす作用について試験した。このために、ＤＩＭがシグナル伝達のリン酸化および転写因子の活性化因子１（ＳＴＡＴ１）に及ぼす作用、ならびに活性化ＳＴＡＴ１ダイマーの同族ＧＡＳ応答性エレメントへの結合について試験した。Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ（ＪＡＫ）によるＳＴＡＴ１のリン酸化は、ＩＦＮＧＲ１への結合に続くＩＦＮγシグナリングにおける第１工程である。これらの試験のために、細胞は、６もしくは２４時間にわたりＤＩＭで前処置し、その後に１５分間にわたりＩＦＮγへ曝露させた。ＤＩＭ処置細胞の細胞溶解液中のＳＴＡＴ１リン酸化レベルは、ＩＦＮγ処置は受けたが、ＤＩＭ処置を受けていなかったコントロールと比較した。リン酸化は、Ｔｙｒ−７０１残基上でリン酸化されたＳＴＡＴ１に対して特異的な抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって測定した。本発明者らの結果は、６もしくは２４時間にわたるＤＩＭ単独の処置はＳＴＡＴ１リン酸化を誘導しなかったが、ＤＩＭを用いた前処置はＩＦＮγによって誘導されたＳＴＡＴ１リン酸化を増加させたことを示している。不活性（全）ＳＴＡＴ１のレベルに影響を及ぼした処置はなかった。
【００４３】
電気泳動ゲル泳動度シフトアッセイを使用して、リン酸化ＳＴＡＴ１がＧＡＳエレメントに結合できたダイマーへ効果的に活性化したことを検証した。ＧＡＳ配列を含有する３２Ｐ標識ＤＮＡプローブは、指示したように様々な回数にわたりＤＩＭを用いて前処置した細胞由来の核抽出物、およびＩＦＮγとともに３０分間にわたりインキュベートした。ＩＦＮγ処置は、ＤＩＭ前処置の期間に伴って強度が増加するバンドシフトを生じさせた。ＩＦＮγの不在下でのＤＩＭ処置は、任意の時点にシフトしたバンドを生じさせなかった。サンプルをＳＴＡＴ１に対して特異的な抗体とともにインキュベートした場合はバンドがスーパーシフトされ、これは標識されたＧＡＳプローブヘのタンパク質結合の同一性を確証した。
【００４４】
これらをまとめると、これらの結果は、ＤＩＭがＩＦＮγ誘導性ＳＴＡＴ１活性化、二量体化およびＤＮＡ中のＧＡＳエレメントへの結合を増強できることを示している。これらの結果は、ＤＩＭがＩＦＮγ活性に及ぼす相乗作用がＩＦＮγシグナリングにおける数種のレベルで明白であり、これらのアッセイ条件下でＤＩＭの最も有意な作用である可能性を示している。
【００４５】
Ｖ．ＤＩＭおよびＩＦＮγが増殖および細胞周期に及ぼす作用。
ＤＩＭおよびＩＦＮγが遺伝子発現に及ぼす相乗作用の機能的結果を増殖率のレベルで試験した。４日間の処置期間にわたりＤＩＭ、ＩＦＮγ、もしくは両方の物質を用いた処置による細胞増殖を測定し、ＤＭＳＯコントロールと比較した。熱処理血清を用いると、ＩＦＮγ単独は、コントロールと比較して７０％まで細胞増殖を大きく減少させた。ＤＩＭ処置は、６０％まで増殖を大きく減少させた。最高濃度のＩＦＮγを除いて、ＤＩＭおよびＩＦＮγの併用処置は、ＤＩＭ単独の処置に比較して細胞増殖抑制活性のほぼ付加的な増加を生じさせた。これらの作用には、アポトーシスに特徴的な形態学的変化が付随した。本発明者らは、ＩＦＮγが未処理血清中で増殖させた細胞の増殖に及ぼす有意な作用を観察しなかった。
【００４６】
フローサイトメトリーを使用してＤＩＭおよびＩＦＮγが細胞周期に及ぼす作用を決定した。本発明者らのデータは、３日間までの相違する間隔での細胞周期のＧ１期における細胞集団の比率を示した。コントロール群では、約５０％の細胞がＧ１期にあった。ＩＦＮγ単独による処置は、３日後には、ＤＭＳＯコントロールを１０％まで超えるＧ１期遮断細胞の小さな前進性増加を引き起こした。ＤＩＭは、ＤＭＳＯコントロールに比較して経時的に３０％まで増加したより即時的な作用を有していた。ＤＩＭおよびＩＦＮγの併用は、３日後に、増殖の不在と相関している、Ｇ１静止期において９０％を超える細胞を導く付加作用を有していた。これらをまとめると、これらの結果はＤＩＭおよびＩＦＮγについての別個の細胞増殖抑制機序と一致している。
【００４７】
ＶＩ．ＤＩＭは、ＭＨＣ−Ｉ複合体のＩＦＮγ誘導性発現を増強する。
ＭＨＣ−Ｉ複合体の誘導性発現は、ＩＦＮγ媒介性シグナル伝達の明確に確立された重要な下流標的である。ＤＩＭがＩＦＮγシグナリングの有意な代謝産物に及ぼす可能性がある相乗作用をさらに試験するために、本発明者らは、ＤＩＭとの共処置がＭＣＦ−７細胞中でのＭＨＣ−Ｉ複合体のＩＦＮγ誘導性発現に及ぼす作用について試験した。
【００４８】
細胞表面ＭＨＣ−Ｉ発現についてのフローサイトメトリー分析は、ＦＩＴＣコンジュゲート化ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いて実施した。初期コントロール実験では、培養ＭＣＦ−７細胞を４８時間にわたり３０μＭのＤＩＭにより、次にさらに１６時間にわたり１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて、または用いずに前処置した。陰性コントロール抗体であるＦＩＴＣコンジュゲート化マウスＩｇＧ２ｂを用いた分析は、有意に誘導されたシグナルを示さなかった。細胞をある範囲のＩＦＮγ濃度で処置して抗ＭＨＣ−Ｉ抗体を用いて分析したその後の実験では、ＩＦＮγ誘導性ＭＨＣ−Ｉ発現の指標である強力なシグナルは０．１ｎｇ／ｍＬで検出可能であり、１０ｎｇ／ｍＬでプラトーにあると思われた。ビヒクルコントロール単独で処置した細胞中では、ＭＨＣ−Ｉ発現は、９９％を超える細胞中では検出されなかった。
【００４９】
４８時間にわたる３０μＭのＤＩＭによる前処置、次に０．１ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγによる処置は、８．１１％から４０．９８％へのＭＨＣ−Ｉ陽性細胞のパーセンテージにおけるさらなる増加を生じさせたが、ＭＨＣ−Ｉ発現／細胞（ＭＦＶ）に有意な作用を及ぼさなかった。ＭＨＣ−Ｉを発現した約９５％である１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて処置された細胞のＤＩＭへの曝露は、７６．０４から１３１．４１へのＭＦＶにおける強力な時間依存性増加を生じさせた。ＤＩＭ処置単独は、ＭＨＣ−Ｉ複合体の発現に有意な作用を及ぼさなかった。予想通りに、処置前の培地中へのＩＦＮγ遮断抗体の添加はＭＨＣ−Ｉ発現にＩＦＮγおよびＤＩＭの共処置が及ぼす誘導作用を無効にし、観察された作用についてのサイトカインの要件を確証した。
【００５０】
類似のまた別の実験では、本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞中でのＭＨＣ−ＩＩ発現にＤＩＭもしくはＩＦＮγが及ぼす作用を観察しなかった。これらの結果は、ＤＩＭ単独はＭＨＣ−Ｉの発現にほとんど、もしくは全く作用を生じさせないが、このインドールは、このタンパク質複合体を発現する細胞の比率、ならびにＩＦＮγに応答して細胞１個あたりＭＨＣ−Ｉの最高レベルを強力に増強することを示している。
【００５１】
ＶＩＩ．ＤＩＭは、ＭＨＣ−Ｉ構成成分およびトランスポーターのＩＦＮγ誘導性転写を増強する。
細胞表面上のＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体のレベルはＤＩＭによる前処置によって増強できるので、本発明者らは、複合体およびそのトランスポーターについての対応する遺伝子の発現もまた増加するかどうかを試験した。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびβ−マイクロチューブリンを含むヒトＭＨＣ−Ｉの４種の主要構成成分、ならびに２つの重要な関連トランスポーターであるＴＡＰ１およびＴＡＰ２の発現について試験した。本発明者らの結果は、全６つの遺伝子の発現レベルは、ビヒクル処置ＭＣＦ−７細胞と比較して、ＤＩＭによって有意に増強されなかったことを示している。予測通りに、これらの遺伝子の発現は、ＩＦＮγを用いた処置によって２〜８倍増加した。これらの結果は、さらに、ＤＩＭによる細胞の前処置が、ＩＦＮγ自体によって誘導されたレベルに比して少なくとも２倍以上、または背景レベルを超えて４〜１６倍へこれらの遺伝子のｍＲＮＡレベルをさらに増加させたことを示している。
【００５２】
これらの結果は、ＤＩＭがＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体および関連ｍＲＮＡのＩＦＮγ誘導性発現のレベルを相乗的に増強できることを示している。ＭＨＣ−Ｉタンパク質／細胞および関連ｍＲＮＡ両方のレベルにおけるＤＩＭによる大まかに２倍の増強は、ＤＩＭによるＭＨＣ−Ｉ発現が遺伝子転写のレベルで調節されることを示している。
【００５３】
プロトコルＩ〜ＶＩＩの結果は、ＤＩＭが、ＩＦＮγの発現を誘導でき、このサイトカインへの外因性曝露への細胞の応答に影響を及ぼすことのできる免疫調節因子であることを指示している。これらの結果は、ＤＩＭが、１）ＩＦＮγ、ＩＦＮγ受容体、および２種のＩＦＮγ誘導性遺伝子の発現を誘導する、２）ＩＦＮγ誘導性レポーター遺伝子構築物の発現を誘導する、３）ＳＴＡＴ−１シグナル伝達経路のＩＦＮγ媒介生活性化を相乗的に増強する、４）培養細胞中でのＩＦＮγの細胞増殖抑制作用を付加的に増強する、および５）ＩＦＮγ誘導性ＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体および関連ｍＲＮＡの発現を相乗的に増強することができることを示している。我々の知る限り、これは腫瘍細胞によるＩＦＮγの産生についての最初の報告である。ＤＩＭによる処置後には、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ技術を用いて分泌されたＩＦＮγについて強力なシグナルを観察した。
【００５４】
免疫細胞中でのＩＦＮ−γ発現の活性化は、シグナリングプロセスの複雑な相互作用によって媒介される。先天性もしくは後天性免疫を促進するリンパ球しかＩＦＮγを産生しないことは知られている。これらの細胞中でのＩＦＮγ産生は、通常は分泌されたサイトカインによって制御されるが、そのうちで最も広汎に試験されたものはインターロイキン（ＩＬ）−１２である（１４）。免疫細胞のＩＬ−１２への曝露は、ＪａｎｕｓキナーゼであるＪＡＫ２およびＴｙｋ２の活性化を生じさせ、これらは順にＩＬ−１２受容体をリン酸化し、転写因子ＳＴＡＴ４のためのドッキング部位を提供する。レポーター結合ＳＴＡＴ４は、ＪＡＫによってリン酸化され、ＳＴＡＴ４二量体化、核への転位、および遺伝子発現の調節を促進する。ＳＴＡＴ４は、ＩＦＮγ遺伝子調節へ直接的に寄与できるが、それは潜在的ＳＴＡＴ４結合部位がＩＦＮγ遺伝子の第１イントロンおよびプロモーター内に存在するからである（１５）。本発明者らの試験は、腫瘍細胞中でのＩＦＮγ発現のＤＩＭ誘導は、他の誘導されたサイトカインの仲介を含んでいない遺伝子活性化への直接的作用によって進行することを示している。転写内の増加はタンパク質合成のためには一般的に短すぎる期間であるたった６時間以内で発生する；さらに、ＭＣＦ−７細胞は、ＩＬ−１２などのＩＦＮγ活性化サイトカインを産生することは知られていない。
【００５５】
ＩＦＮγによって調節されるシグナリングカスケードは、相当詳細に試験されている。標的細胞の膜上でのＩＦＮγの高度に特異的なＩＦＮγ受容体（ＩＦＮＧＲ１）への結合は、通常は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２ならびにＳＴＡＴ１を含むリン酸化カスケードを活性化する。リン酸化ＳＴＡＴ１は、ホモ二量体化し、核へ転位し、ＩＦＮγ誘導性遺伝子のプロモーター内のＩＦＮγ活性化配列（ＧＡＳ）へ結合し、さらに転写を活性化する。そのような遺伝子の１つであるｐ６９−ＯＡＳの活性化は、順に感染細胞中でのウイルスＲＮＡの複製の防止において重要な役割を果たしている。さらに、ｐ６９−ＯＡＳは、近年細胞増殖の阻害因子であり、Ｂｃｌ−２に関連する前アポトーシスタンパク質であると同定されている（１７）。本発明者らの結果は、ＩＦＮγは乳腺腫瘍細胞中でのＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化できることを確証しており、このＩＦＮγの活性（すなわち、ＳＴＡＴ１リン酸化、ＳＴＡＴ１二量体化およびＧＡＳへの結合、ならびにＧＡＳ調節転写の活性化）はＤＩＭによる処置によって相乗的に増強されることを示している。これらの結果は、ＤＩＭがＩＦＮＧＲ１活性化の即時下流イベントに及ぼす作用が単独では限定されているが、インドールは付加されたＩＦＮγの作用を強力に増強することを示している。
【００５６】
ＤＩＭがＩＦＮγシグナリングに及ぼす作用は、これらの他の物質の作用から明白に識別可能である。一連の試験では、乳癌細胞中でのレチノイン酸（ＲＡ）およびＩＦＮγの相乗作用について記載された。最初に、相乗性抗増殖作用は、ＩＦＮγおよびＲＡを用いた細胞の連続的処置後に観察された。作用は、ＲＡ細胞増殖抑制活性のＩＦＮγ媒介性増強の結果として生じると思われた。ＩＦＮγは、レチノイン酸−γ（ＲＡＲγ）レベルの発現の増加および細胞ＲＡ結合タンパク質（ＣＲＡＢＰ）の発現減少によってＲＡ細胞増殖抑制潜在力を増加させることが証明された（１８）。引き続いて、ＲＡがＩＦＮγシグナリングに及ぼす作用についても乳腺腫瘍細胞中でも試験した。結果は、ＳＴＡＴ１発現のＲＡ媒介性増強を含んでいた機序によってＭＣＦ−７細胞中での遺伝子転写へのＩＦＮγが及ぼす作用を相乗的に増強できることを示した（１９）。また別の一連の試験では、乳癌細胞のＩＦＮおよびエストロゲンアンタゴニスト、タモキシフェンによる併用処置の作用を試験した。これらの物質を用いた共処置は、転写因子ＩＳＧＦ−３およびＧＡＦを含む所定のＩＦＮ刺激遺伝子の発現の増強を引き起こした（２０）。しかし、タモキシフェン単独では、これらの転写因子の発現に作用を生じさせなかった。そこで、ＤＩＭによる本発明者らの結果は、ＩＦＮγ作用への報告されたＲＡおよびタモキシフェンの作用からの有意差を示している。本発明者らは、ＤＩＭおよびＩＦＮγがＭＣＦ−７細胞増殖に及ぼす付加的阻害作用を観察したが、ＲＡを用いた作用は相乗性であった。同様にＲＡとは対照的に、ＤＩＭはＩＦＮγシグナル伝達を相乗的に増強したが、このインドールは、ＩＦＮγ処置の不在下ではＳＴＡＴ１発現を増加させなかった。最後に、単独でのＤＩＭ処置は、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮγおよびＯＡＳ関連遺伝子の発現を明白に誘導したが、これはＲＡもしくはタモキシフェンについては報告されなかった作用である。
【００５７】
ＤＩＭがＭＨＣ−ＩのＩＦＮγ誘導性発現に及ぼす相乗作用は相当に重要であるが、それはこの複合体が腫瘍免疫学的監視において重要な役割を果たすからである。ＭＨＣ−Ｉ分子は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）へ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を提示するために必要とされる。ＭＨＣ抗原の減少した発現は、腫瘍細胞を免疫学的監視から保護できる（２１，２２）。したがって、ＭＨＣ−Ｉの消失もしくはダウンレギュレーションは、乳房腫瘍形成における頻回な事象であることが示されている。実際に、誘導発癌性のマウスモデルを用いた数件の試験は、腫瘍の腫瘍形成および転移能力を増加させる際にＭＨＣ−Ｉ抗原のダウンレギュレーションが果たす役割を確証した（２３）。これとは逆に、誘導されたＭＨＣ−Ｉ発現はＩＦＮγ（２４）ならびにヌクレオチドアナログ、５−アザシチジンシトシンアルビノシド、５−フルオロウラシル、レチノイド、ビタミンＤ３、ならびに植物アルカノイド、ビンクリスチンを含む所定の小分子癌治療薬（２５，２６）の抗腫瘍特性において重要である。
【００５８】
ＤＩＭを用いた本発明者らの試験結果とＩ３Ｃを用いた本発明者らの試験結果（２７）の比較は、ＤＩＭおよびそのインビボ前駆物質がＩＦＮγシグナリングに及ぼす作用における活性の明確な相違を示している。ＤＩＭを用いた本発明者らの今回の結果に類似して、本発明者らは以前の研究において、Ｉ３Ｃが、ＩＦＮＧＲ１の発現およびＳＴＡＴ１シグナリングの相乗性活性化における強力かつ迅速な増加を含む機序によってＭＣＦ−７細胞中でのＩＦＮγシグナリングに作用を及ぼせることを示した。ＤＩＭおよびＩ３Ｃの類似の作用は、細胞増殖および細胞周期についてもまた観察された。しかしＤＩＭを用いた今回の結果とは対照的に、本発明者らは、以前の試験ではＩ３ＣによるＩＦＮγ刺激遺伝子（ｐ５６およびｐ６９−ＯＡＳ）の発現増加を観察しなかった。ＩＦＮＧＲ１タンパク質誘導の最高レベルはＩ３ＣおよびＤＩＭについて類似、すなわち約７倍であったが、レポーター発現の動態は、２種の処置後に有意に相違していた。そこで、強力レベルの誘導（約５倍）はＤＩＭへのたった６時間の曝露後に所見され、最高誘導はこのジインドールを用いた２４時間の処置によって達成された。対照的に、レポーター発現はＩ３Ｃを用いた２４時間の処置後には約３倍しか増加せず、最高誘導には約４８時間の曝露後にのみ達すると思われた。これらの結果は、Ｉ３ＣがＩＦＮＧＲ１発現に及ぼす作用が、細胞とのインキュベーション中にＤＩＭへの緩徐な転換によって媒介されるという仮説と一致している。実際に、本発明者らは以前に、ＤＩＭが、Ｉ３Ｃで処置されたＭＣＦ−７培養細胞の核内に蓄積することを示している（２８）。
【００５９】
本発明者らの結果は、再発性呼吸性乳頭腫症（ＲＲＰ）の制御におけるインドール処置の臨床的有効性を説明している。Ｉ３ＣおよびＤＩＭは、それらの有効性および低レベルの毒性のために、この障害のための一般的な補助療法になっている（２９，３０）。ＲＲＰは、所定タイプのヒトヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされ（３１，３２）、この疾患の特質は、外科的切除後に乳頭腫が再発する傾向である（３３−３４）。１つの報告書は、再発率を緩徐化することによって多数の患者（５５．４％）がＩ３Ｃ／ＤＩＭの処置に応答すること、そしてこの疾患の再発が患者の１９％において完全に阻害されることを指示した（３０）。ＲＲＰの制御において以前に示唆されたＩ３Ｃ／ＤＩＭの作用様式には、より良好なエストロゲン代謝産物平衡の誘導（３５）、細胞増殖の阻害（３６）、およびアポトーシスの誘導（３７）が含まれる。本発明者らの結果は、Ｉ３Ｃ／ＤＩＭは免疫増強のまた別の機序によって機能できることを示している。この活性は、再発性乳頭腫の予防においてだけではなく、乳頭腫症の治療および広範囲の腫瘍タイプの悪性転換の予防においても有用である。
【００６０】
本発明者らは、生理学的に重要な濃度でＤＩＭの免疫応答活性化活性を観察した。２００ｇのブロッコリーを毎日摂取する平均体重のヒトは、約１２ｍｇのＤＩＭを入手する。ＤＩＭの吸収が最大である場合は、ＤＩＭの血中濃度はおよそ１０μＭに達する。このため、食用アブラナ科野菜からのＤＩＭのインビボ濃度はインビトロでのＤＩＭの有効レベルを表している。
【００６１】
ＶＩＩＩ．３，３’−ジインドリルメタンおよび置換３，３’−ジインドリルメタンは、サイトカインの血清中レベルにおける時間依存性増加を刺激する。
本試験では、本発明者らは、インビボおよびインビトロでのサイトカインの産生、Ｔ細胞増殖、およびＮＯ産生を含む、ＤＩＭが免疫応答活性化に及ぼす作用を試験した。
【００６２】
本発明者らは、最初に未置換ＤＩＭがＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγの産生に及ぼす作用について調査した。１群３匹のマウス群に、３０μｇ／ｋｇの未置換ＤＩＭを経口投与し、薬物抗原投与の１、３、５、８、および２４時間後に致死させた。血清を採取し、プールし、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果は、ＤＩＭがサイトカインの血清中レベルにおける時間依存性増加を刺激したことを示している。ＤＩＭは、Ｇ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの循環中レベルの増加を生じさせ、３時間後の時点が最高であった。ＩＬ−６は５時間後にもピーク値で誘導された。ＤＩＭはＩＬ−１２も刺激し、少なくとも２４時間にわたり増加したレベルが維持されたので、動態はわずかに相違していた。類似の実験では、本発明者らは、ＤＩＭが静脈内投与されたマウスにおいて、ＩＦＮγ産生の上昇を含む上昇したサイトカイン産生を見いだした。
【００６３】
本発明者らは、表１（上記）に示した１パネルの典型的な置換ＤＩＭ化合物が、インビボおよびインビトロでのサイトカインの産生、Ｔ細胞増殖、およびＮＯ産生を含む、免疫応答活性化に及ぼす作用を試験するためのその後の平行試験を設計した。これらの実験は、サイトカインの血清中レベルにおける類似の時間依存性増加を示している。
【００６４】
ＩＸ．３，３’−ジインドリルメタンおよび置換３，３’−ジインドリルメタンの投与はＢＡＬＢ／ｃマウスをＹ．エンテロコリチカ感染に対して耐性にする。
エルシニア・エンテロコリチカは、ヒトおよび齧歯類において腸炎および全腸炎を引き起こす、グラム陰性の、主として細胞外に位置する病原体である。さらに、脾臓および肝臓内での膿瘍および肉芽腫病変を含む全身性感染は、特に免疫不全性の個体において発生する。細胞内病原体による感染症におけると同様に、一次エルシニア感染を浄化するためには、活性化マクロファージと協調してＴ細胞、特にＣＤ４＋Ｔｈ１細胞が必要とされる。エルシニアに対する保護的宿主応答は、様々な前炎症性サイトカインによって媒介される。ＴＮＦα、ＩＦＮγ、もしくはＩＬ−１２の中和は、この病原体に対する耐性を阻害する。以前の試験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＹ．エンテロコリチカに対して耐性であるが、ＢＡＬＢ／ｃマウスは易感染性である。ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、もしくは抗ＩＬ−４抗体の投与はＢＡＬＢ／ｃマウスをエルシニアに対して耐性にさせた。上記で報告したように、本発明者らは、ＤＩＭが、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２を含む免疫応答活性化サイトカインの数増加に作用を及ぼせることを見いだした。ここで本発明者らは、ＤＩＭがＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるエルシニア感染の重症度を減少させられることを示している。
【００６５】
雌性６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社から購入し、特異的病原体無含有条件（陽圧キャビネット）下で維持する。
【００６６】
マウスには３０μｇ／ｋｇ／日のＤＩＭまたは２４種の置換ＤＩＭ化合物（表１、上記）のうちの１つを感染１日前から開始して経口投与する。
【００６７】
０．１ｍＬの無菌リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中に懸濁させた、新しく解凍した、プラスミドを含むＹ．エンテロコリチカＷＡ−３１４血清型Ｏ：８生物体を以前に記載したように静脈内および経口感染のために使用する（Ａｕｔｅｎｒｉｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２５９０−２５９９）。投与される実際細菌数は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天上の摂種菌の連続希釈物を平板培養し、２６℃で３６時間のインキュベーション時間後にＣＦＵを計数することによって決定する。動態試験のために、１群５匹のマウスは５×１０３の細菌を用いる感染後（ｐ．ｉ．）第１、３、および７日に二酸化炭素窒息によって致死させる。脾臓を無菌的に切除し、０．１％のウシ血清アルブミンを含有する５ｍＬのＰＢＳを用いることによって単細胞懸濁液を調製する。これらの調製物の連続希釈液０．１ｍＬを２つずつＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天上で平板培養する。検出可能なＣＦＵの限度は２５（ｌｏｇ１０２５＝１．４）である。
【００６８】
単一エンドポイント試験では、２×１０３のＹ．エンテロコリチカを用いた感染７日後の処置ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓中の細菌数は未処置コントロールと比較した有意な減少を示している。これと一致して、動態試験は、未処置コントロールマウスと比較して２５の処置群の各々において脾臓中細菌数における時間依存性減少を示している。
【００６９】
参考文献
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２７．Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ，Ｕ．，Ｒｉｂｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２５：１１１９−２８．２００４．
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３４．Ｋａｓｈｉｍａ，Ｈ．Ｋ．，Ｍｏｕｎｔｓ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｋ．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．，２３：６９９−７０６，１９９６．
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３６．Ｃｏｖｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｈｓｉｅｈ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｒａｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈａｌｌｄｅｎ，Ｇ．，Ｋｉｍ，Ｇ．Ｓ．，Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｃａｒｂｉｎｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ−６ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｇ１ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：３８３８−４７，１９９８．
３７．Ｈｏｎｇ，Ｃ，Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ Ｂｊｅｌｄａｎｅｓ，Ｌ．Ｆ．Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ３，３’−ｄｉｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈａｎｅ（ＤＩＭ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６３：１０８５−９７，２００２．
【００７０】
上記の特定の実施形態および実施例についての説明は、限定するためではなく例示するために提供されている。本明細書で言及した全刊行物および特許出願ならびにその中に言及された全参考文献は、個別刊行物または特許出願または参考文献が各々特別かつ個別に参照して組み込まれると指示されたかのように組み込まれる。上記の本発明は明確に理解するために例示および実施例によってある程度詳細に記載してきたが、当業者には、添付の請求項の精神もしくは範囲から逸脱せずに本発明の教示に照らして所定の変化および修飾を加えられることは容易に明白である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答活性剤をそれが必要であると判断された患者に送達する方法であって、
前記患者に所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭを投与する工程と；および
前記患者において結果として生じた免疫応答活性化を検出する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記免疫応答活性化が、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、サイトカイン受容体発現、もしくはサイトカインシグナリングの増加であり、それらの増加として検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与する工程が、経口または静脈内投与によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、免疫不全である、または感染症もしくは腫瘍症に罹患していると判断される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、接触させる工程の前に、前記宿主が免疫応答活性剤を必要であることを決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンが、式：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が、個別に独立して、水素、またはハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状又は分枝状のアルキル又はアルコキシ基、およびニトロ基からなる群から選択される置換基である）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が、ハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状もしくは分枝状アルキルもしくはアルコキシ基、およびニトロ基からなる群から選択される置換基を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記直鎖状又は分枝状のアルキル又はアルコキシ基は、炭素が１〜５個である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハロゲンが、塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ５およびＲ５’がハロゲンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ１およびＲ１’が１〜１０個の炭素を有するアルキル又はアルコキシルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ２およびＲ２’が１〜１０個の炭素のアルキルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ５およびＲ５’がニトロである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンが、３，３’−ジインドリルメタンである、請求項１、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１６】
前記任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンが、パーフルオロ−３，３’−ジインドリルメタンである、請求項１、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１７】
所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭ、およびサイトカインを含む医薬組成物。
【請求項１８】
所定量の免疫応答を活性化する任意で置換されたＤＩＭと、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）からなる群から選択されるサイトカインと、を含む医薬組成物。
【請求項１】
免疫応答活性剤をそれが必要であると判断された患者に送達する方法であって、
前記患者に所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭを投与する工程と；および
前記患者において結果として生じた免疫応答活性化を検出する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記免疫応答活性化が、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、サイトカイン受容体発現、もしくはサイトカインシグナリングの増加であり、それらの増加として検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与する工程が、経口または静脈内投与によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、免疫不全である、または感染症もしくは腫瘍症に罹患していると判断される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、接触させる工程の前に、前記宿主が免疫応答活性剤を必要であることを決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンが、式：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が、個別に独立して、水素、またはハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状又は分枝状のアルキル又はアルコキシ基、およびニトロ基からなる群から選択される置換基である）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が、ハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素からなる直鎖状もしくは分枝状アルキルもしくはアルコキシ基、およびニトロ基からなる群から選択される置換基を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記直鎖状又は分枝状のアルキル又はアルコキシ基は、炭素が１〜５個である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハロゲンが、塩素、ホウ素およびフッ素からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ５およびＲ５’がハロゲンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ１およびＲ１’が１〜１０個の炭素を有するアルキル又はアルコキシルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ２およびＲ２’が１〜１０個の炭素のアルキルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ４’、Ｒ６’、およびＲ７’が水素であり、Ｒ５およびＲ５’がニトロである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンが、３，３’−ジインドリルメタンである、請求項１、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１６】
前記任意で置換された３，３’−ジインドリルメタンが、パーフルオロ−３，３’−ジインドリルメタンである、請求項１、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１７】
所定量の免疫応答を活性化する、任意で置換されたＤＩＭ、およびサイトカインを含む医薬組成物。
【請求項１８】
所定量の免疫応答を活性化する任意で置換されたＤＩＭと、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）からなる群から選択されるサイトカインと、を含む医薬組成物。
【公表番号】特表２００８−５１９０５１（Ｐ２００８−５１９０５１Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０１１５（Ｐ２００７−５４０１１５）
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６８７１３
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０２０４５６９９）リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６８７１３
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０２０４５６９９）リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (3)
【Ｆターム（参考）】
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