ＡＳＫ１阻害剤を有効成分とする心不全治療薬およびそのスクリーニング方法
本発明は、心室リモデリングにおける心機能低下や心不全の開始を抑制できる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬、および、そのスクリーニング方法を提供する。本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬であり、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。図１に示すように、ＡＳＫ１タンパク質を排除すれば、例えば、心筋梗塞や圧負荷等の後の心室リモデリングにおいて、心室拡張を減衰できるから、心不全の予防治療が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ＡＳＫ１阻害剤を有効成分とする心不全治療薬およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
心不全とは、心筋の収縮機能障害のために全身性の多彩な自・他覚所見を呈する症候群であって、生命の危険を伴うものである。心不全の患者は、それらの症状のため運動耐容能が低下し、心不全増悪による入院を反復し、最終的には死に至り、その予後は極めて不良である。現在、薬物治療として利尿薬、ジギタリス製剤、βブロッカー、アンギオテンシン転換酵素阻害薬、アンギオテンシン受容体阻害薬等が、心不全発症予防や治療に用いられている。その効果は大規模臨床試験で実証はされているが、その効果は軽微なものであり、重症の慢性心不全においては心移植に頼らざるをえない状態であるため、新しい心不全の治療方法の開発が待たれている。
心不全の原因は未だ十分には解明されていないが、臨床経過としては、例えば、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症等の心臓疾患の後に、心室リモデリング（再構築）が生じ、続いて、心不全が起こることが知られている。前記心室リモデリングとは、心筋の障害や、負荷の変化に応答する左室のジオメトリー、質量、容積、機能の変化のことである。前記リモデリングのプロセスは、順応性であるが、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症等のように、前記障害や負荷が継続的で病的な場合、前記プロセスは順応不良となる。そうすると、肥大した心筋細胞に十分な量の血液が供給されずに虚血に陥り、これが原因で心筋収縮不全などの心筋障害が生じ、心拍出量の低下、臓器循環障害、静脈鬱血、体液貯留などを伴う心不全症候群を来すと考えられる。そして、リモデリング中の左室の拡張の程度は、病気の状態や死亡率についての強力な指標となっている（Ｐａｔｔｅｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｕｄｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．＆Ｋｏｎｓｔａｍ，Ｍ．Ａ．「心不全における心室リモデリングとその予防（Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）」（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１３，１６２−７．参照）。
心筋梗塞後の左室リモデリングを引き起こす基礎となるメカニズムは、ヒト患者においても実験モデルにおいても、筋細胞のアポトーシスの関与が示唆されている（Ｏｌｉｖｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｑｕａｉｎｉ，Ｆ．，Ｓａｌａ，Ｒ．，Ｌａｇｒａｓｔａ，Ｃ．，Ｃｏｒｒａｄｉ，Ｄ．，Ｂｏｎａｃｉｎａ，Ｅ．，Ｇａｍｂｅｒｔ，Ｓ．Ｒ．，Ｃｉｇｏｌａ，Ｅ．＆Ａｎｖｅｒｓａ，Ｐ．「ヒト急性心筋梗塞は、心臓の生存部におけるプログラム筋細胞死と関連する（Ａｃｕｔｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ Ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ）」（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２８，２００５−２０１６．、およびＣｈｅｎｇ，Ｗ．，Ｋａｊｓｔｕｒａ，Ｊ．，Ｎｉｔａｈａｒａ，Ｊ．Ａ．，Ｌｉ，Ｂ．，Ｒｅｉｓｓ，Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ａ．，Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｏｌｉｖｅｔｔｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．「ラットにおけるプログラム筋細胞死は、梗塞後の生存心筋細胞に影響を与える（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ Ｖｉａｂｌｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ａｆｔｅｒ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ）」（１９９６）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２６，３１６−３２７．参照）。また、圧負荷に応答する心肥大の後に生じる心不全においても、心筋細胞のアポトーシスは、代償性肥大と心不全との間の移行における重大なポイントである考えられている（Ｈｉｒｏｔａ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｂｅｔｚ，Ｕ．Ａ．，Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｒｏｓｓ，Ｊ．，Ｊｒ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．＆Ｃｈｉｅｎ，Ｋ．Ｒ．「ｇｐ１３０心筋細胞生存経路の欠損は、生化学的ストレス下における心不全の発症の決定的事象である（Ｌｏｓｓ ｏｆ ａ ｇｐ１３０ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｄｕｒｉｎｇ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｔｒｅｓｓ）」（１９９９）Ｃｅｌｌ ９７，１８９−９８．参照）。
他方、ＡＳＫ１（アポトーシスシグナル制御キナーゼ１；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）タンパク質は、反応性の酵素種に感受性を示すマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）であって、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）や、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼを活性化するものとして同定されたタンパク質である（特開平１０−００００９３号公報およびＩｃｈｉｊｏ，Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｅ．，Ｉｒｉｅ，Ｋ．，Ｄｉｊｉｋｅ，Ｐ．Ｔ．，Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．＆Ｇｏｔｏｈ，Ｙ．「ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ３８シグナル経路を活性化する哺乳類ＭＡＰＫＫＫであるＡＳＫ１によるアポトーシスの誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ＡＳＫ１，ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＰＫＫＫ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＳＡＰＫ／ＪＮＫ ａｎｄ ｐ３８ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ）」（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，９０−９４．参照）。野生型または恒常的に活性型であるＡＳＫ１タンパク質の過剰発現が、様々な細胞でアポトーシスを誘導することや（Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｍ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｋ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ｋａｗａｂａｔａ，Ｍ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．＆Ｉｃｈｉｊｏ，Ｈ．「哺乳類チオレドキシンは、アポトーシスシグナル制御キナーゼ１（ＡＳＫ１）を直接阻害する（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｉｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ（ＡＳＫ）１）」（１９９８）ＥｍｂｏＪ．１７，２５９６−６０６．参照）、酸化ストレスや腫瘍壊死因子が誘導するアポトーシスが、ＡＳＫ−／−細胞で抑制されることが報告されている（Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｚａｗａ，Ａ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ．−ｉ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｍｉｎｏｗａ，Ｏ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，Ｎｏｄａ，Ｔ．＆Ｉｃｈｉｊｏ，Ｈ．「ＡＳＫ１は、ＪＮＫ／ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの持続活性化とアポトーシスに必要である（ＡＳＫ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＪＮＫ／ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」（２００１）ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，２２２−２２８．参照）。しかしながら、心不全とＡＳＫ１との関係については、なんら報告されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、前記リモデリングにおける心機能低下や心不全の開始を抑制できる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬、そのスクリーニング方法、心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法ならびに心不全の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
前記目的を解決するために、本発明者は、臨床的に心不全と最も関連性の高い病因である心筋梗塞後の左室リモデリングと圧負荷後の左室リモデリングを、ＡＳＫ１ノックアウトマウスを利用して再現し、左室リモデリングの分子メカニズムを解明するという着想を得て鋭意研究を重ねた。その結果、ＡＳＫ１タンパク質を心筋細胞から除去しても、基底レベルでは心臓に形態学的および組織学的欠陥が生じないこと、ＡＳＫ１タンパク質除去により、心筋梗塞および圧負荷後の左室リモデリングにおける進行性の収縮機能低下をともなう左室拡張を抑制できること、ＡＳＫ１タンパク質除去により、心筋梗塞および圧負荷後の左室リモデリングにおけるアポトーシスの頻度の進行的な増加を抑制できること、ＡＳＫ１タンパク質の活性化が、心筋細胞においてアポトーシスを誘導すること、および、心筋梗塞や圧負荷後に、心臓でＡＳＫ１タンパク質が活性化すること等を見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬であり、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法であり、本発明の心不全の診断方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性または自己リン酸化能を測定することを含む診断方法である。
【発明の効果】
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の医薬によれば、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害できるから、例えば、心疾患の左室リモデリングにおける進行性の心臓収縮機能低下を抑制できる。したがって、例えば、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症等の心室リモデリングを生じるおそれのある疾患に対して、心不全予防の医薬として使用でき、また、例えば、心不全に対して、心不全治療の医薬として使用できる。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、心不全の予防や治療に効果的な医薬の創薬が可能となる。また、本発明の予防および治療の少なくとも一方の方法によれば、例えば、効果的な心不全の予防や治療が可能となる。また、本発明の診断方法によれば、例えば、効果的な診断と治療方法の選択が可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、本発明の実施例における経胸壁Ｍモード超音波心エコー検査図の一例であり、図１Ｂは、本発明の実施例のおける心エコー検査のパラメーター変化を示すグラフの一例である。
図２は、本発明の実施例における心臓試料切片の写真の一例である。
図３Ａは、本発明の実施例におけるアポトーシス細胞数を示すグラフの一例であり、図３Ｂは、本発明の実施例における三重染色顕微鏡観察の一例である。
図４Ａは、本発明の実施例における細胞生存率を表すグラフの一例であり、図４Ｂは、本発明の実施例におけるＨｏｅｃｈｓｔ染色顕微鏡観察の一例であり、図４Ｃは、本発明の実施例における細胞生存率を表すグラフのその他の例であり、図４Ｄは、本発明の実施例におけるＨｏｅｃｈｓｔ染色顕微鏡観察のその他の例である。
図５Ａは、本発明の実施例におけるＡＳＫ１タンパク質の活性化の測定結果の一例を示す図であり、図５Ｂは、本発明の実施例におけるＪＮＫタンパク質およびｐ３８タンパク質のリン酸化を測定した結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において、ＡＳＫ１タンパク質は、例えば、哺乳類のＡＳＫ１タンパク質であり、好ましくは、ヒトのＡＳＫ１タンパク質であり、より好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース登録番号Ｄ８４４７６のアミノ酸配列もしくは前記アミノ酸配列と実質同一のアミノ酸配列であって、さらに好ましくは、本発明の医薬を適用する患者のＡＳＫ１タンパク質のアミノ酸配列と同一もしくは実質同一のアミノ酸配列からなるＡＳＫ１タンパク質である。前記実質同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列の相同性が約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ配列であって、ＡＳＫ１タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列があげられる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬としては、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬であれば特に制限されないが、例えば、下記（１）〜（８）の形態があげられる。
（１）本発明の一形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、ＡＳＫ１タンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制する化合物を有効成分とする医薬である。
（２）本発明のその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（３）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（４）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（５）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（６）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、ＡＳＫ１タンパク質を活性化する因子を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（７）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、ＡＳＫ１タンパク質が活性化する因子を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（８）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、心室リモデリングにおける進行性の心機能低下を抑制できる化合物を有効成分とする医薬である。
前記ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、または前記ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、例えば、ＡＳＫ１タンパク質に特異的な抗ＡＳＫ１抗体があげられる。前記抗ＡＳＫ１抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であってもよく、公知の抗体を利用してもよいし、新たに作製しても良い。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の作製方法は、特に制限されず、従来公知の方法を使用できる。また、前記抗ＡＳＫ１抗体は、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖフラグメント等があげられ、これらのフラグメントは、従来公知の種々の修飾がなされてもよい。さらにまた、前記抗ＡＳＫ１抗体は、キメラ抗体であってもよい。
さらに、前記ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、または前記ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、例えば、ＡＳＫ１タンパク質のドミナントネガティブ変異体があげられる。前記ＡＳＫ１ドミナントネガティブ変異体は、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性、自己リン酸化活性、および複合体化の少なくとも一つを阻害できるものであれば、特に制限されず、例えば、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｍ）、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）、ＡＳＫ１ＮＴ、ＡＳＫ−ΔＮ（Ｋ７０９Ｍ）、ＡＳＫ−ΔＮ（Ｋ７０９Ｒ）等があげられる。前記Ｋ７０９ＭおよびＫ７０９Ｒは、ＡＳＫ１タンパク質の７０９番目のリジン（Ｋ）が、それぞれメチオニン（Ｍ）およびアルギニン（Ｒ）に置換したことを表し、前記ＡＳＫ１ＮＴは、ＡＳＫ１タンパク質のＮ末端領域である１〜６４８アミノ酸残基部分からなるタンパク質であり、前記ＡＳＫ−ΔＮは、ＡＳＫ１タンパク質のＣ末端領域である６４９〜１３７５アミノ酸残基からなるタンパク質を表す。
さらにまた、前記ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、または前記ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、例えば、チオレドキシン等があげられる。
前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物としては、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドがあげられる。前記アンチセンスポリヌクレオチドとしては、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡと相補的に対合し、ＡＳＫ１タンパク質の発現を抑制できるものであれば、特に制限されず、例えば、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、およびその誘導体等があげられる。前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列は、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの相補配列と同一または実質的に同一であることが好ましい。本発明において、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列は、例えば、哺乳類のＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列であり、好ましくはヒトのＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列であり、より好ましくはＧｅｎＢａｎｋデータベース登録番号Ｄ８４４７６の配列であり、さらに好ましくは本発明の医薬を適用する患者のＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一または実質同一の配列である。前記実質同一の配列としては、例えば、配列の相同性が約５０％以上の配列であり、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列であって、ＡＳＫ１タンパク質のアミノ酸配列と同一もしくは実質同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列があげられる。
さらに前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物としては、例えば、ＲＮＡ干渉のためのＲＮＡがあげられる。前記ＲＮＡ干渉のためのＲＮＡとしては、例えば、前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一配列の一本鎖、二重鎖、または三重鎖ＲＮＡがあげられ、好ましくは、前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一配列の二重鎖ＲＮＡであって、さらに好ましくは、１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ断片からなる前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一配列の二重鎖ＲＮＡである。
前記ＡＳＫ１タンパク質の活性化因子としては、例えば、Ｄａｘｘ、ＴＲＡＦ２、カルモジュリン依存性リン酸化酵素ＩＩ（Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ；ＣａＭ Ｋｉｎａｓｅ ＩＩ）等があげられ、前記ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子としては、例えば、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ等があげられる。これらの中でも、本発明の医薬の一形態において、有効成分が阻害する前記ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子としては、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＪＮＫが好ましい。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬に有効成分として含まれる化合物には、例えば、低分子無機化合物、低分子有機化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、脂質、糖、これらの誘導体、およびその塩等が含まれる。前記有効成分の化合物が、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよびタンパク質等である場合、これらをコードするヌクレオチド配列を利用できる。したがって、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のさらなる一形態としては、下記（９）の形態があげられる。
（９）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、有効成分である化合物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の発現に必要な調節配列に作動的に連結されているベクターを含む医薬である。
前記ベクターとしては、前記ヌクレオチド配列を、患者の体内、好ましくは心筋細胞内に挿入することが可能なベクターであれば、特に制限されず、例えば、一本鎖、二重鎖、環状またはスーパーコイルのＤＮＡ分子やＲＮＡ分子等を使用できる。具体的には、前記ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等のウイルスベクターや、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ１０８，１９３−２００（１９９１））、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社製）等の非ウイルスベクターがあげられる。前記調節配列とは、患者の細胞内、好ましくは心筋細胞内において、作動的に連結された前記ヌクレオチド配列の発現に必要な塩基配列をであって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを表す。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、例えば、哺乳類に使用でき、好ましくは、ヒトに使用できる。また、本発明の医薬は、心不全、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症、、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症等の疾患に適用できる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の投与経路としては、例えば、経口投与や非経口投与があげられ、前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等があげられる。また、投与形態としては、投与経路に応じて、例えば、経口投与剤、経鼻剤、経皮剤、直腸投与剤（座剤）、舌下剤、経膣剤、注射剤（経静剤、経動剤、皮下、皮内）、点滴剤等があげられる。また、前記経口投与剤としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、乳液、シロップ剤等があげられ、前記経皮剤としては、例えば、ローション等の液剤や、クリームや軟膏等の半固形剤の形態があげられる。本発明の医薬の投与経路および投与形態は、これらに限られることなく、予防および治療の少なくとも一方に際して最も効果的なものを使用することが望ましい。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬が、前記ベクターを含む形態、いわゆる遺伝子治療剤の剤形を取る場合、前記ベクターに応じて、患者の体内、好ましくは心筋細胞内に導入することが好ましい。
前記ベクターが、ウイルスベクターである場合、前記ベクターの投与方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ法やｅｘ ｖｉｖｏ法等があげられる。前記ｉｎ ｖｉｖｏ法では、医薬は、目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与される。例えば、静脈、動脈、冠状動脈、皮下、皮内、心筋内等に投与してもよく、病変と認められる部位そのものに直接局所投与しても良い。他方、前記ベクターが、非ウイルスベクターである場合、前記ベクターの投与方法としては、例えば、内包型リポソームまたは静電気型リポソームによる導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法、レセプター介在性導入法、パーティクル銃で金属粒子の担体とともに導入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等があげられる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法としては、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法であれば特に制限されないが、例えば、下記（１）〜（８）の形態があげられる。
（１）本発明の一形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質が誘導するアポトーシスの抑制を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（２）本発明のその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性の活性阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（３）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（４）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（５）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１遺伝子の転写の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（６）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質の活性化因子の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（７）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質に活性化される因子の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（８）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、心室リモデリングの進行性の心機能低下の抑制を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
前述のスクリーニング方法は、インシリコ、インビトロおよびインビボにおいて従来公知の方法を用いて行うことができる。また、前述の医薬成分を選択する工程で選択された医薬成分は、そのまま、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の有効成分として利用してもよいし、前記医薬成分が、例えば、ポリヌクレオチドやポリペプチド等の場合は、前述のように、前記ポリヌクレオチドやポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子治療剤という形態で利用してもよい。前記薬剤候補化合物としては、例えば、低分子無機化合物、低分子有機化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、脂質、糖、これらの誘導体、およびその塩等が含まれる。
前記アポトーシスの抑制を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、恒常的に活性のあるＡＳＫ１タンパク質（例えば、ＡＳＫ−ΔＮ；Ｎ末端領域のアミノ酸１〜６４８を欠損したＡＳＫ１タンパク質など）を発現する細胞、または前記恒常活性体ＡＳＫ−ΔＮを心臓に発現するトランスゲニックマウスに、薬剤候補化合物を投与し、アポトーシスを抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記キナーゼ活性の活性阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞にＡＳＫ１活性化物質を投与した後、前記細胞から抗ＡＳＫ１抗体を用いて免疫沈降しＡＳＫ１タンパク質を回収して、そのキナーゼ活性を測定することで、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記自己リン酸化の阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞にＡＳＫ１活性化物質を投与した後、前記細胞を試料として抗リン酸化ＡＳＫ１抗体を用いてウエスタンブロットを行うか、または、前記細胞から抗ＡＳＫ１抗体を用いて免疫沈降したＡＳＫ１タンパク質に対して抗リン酸化ＡＳＫ１抗体を用いてウエスタンブロットを行い、ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等があげあれる。
前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞または動物心臓からタンパク質を抽出し、ＡＳＫ１タンパク質の発現を評価することで、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記ＡＳＫ１遺伝子の転写阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞または動物心臓からｍＲＮＡを単離し、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの発現を評価することで、ＡＳＫ１遺伝子の転写を阻害する薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記ＡＳＫ１タンパク質によって活性化される因子の阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、恒常活性体ＡＳＫ−ΔＮを発現する細胞または前記恒常活性体ＡＳＫ−ΔＮを心臓に発現するトランスゲニックマウスに、薬剤候補化合物を投与し、例えば、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、Ｐ３８ ＭＡＰＫ等の活性、好ましくは、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＪＮＫの活性を評価することで、ＡＳＫ１タンパク質によって活性化される因子を阻害する薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。前記活性の評価の方法は、特に制限されず、例えば、前記因子のリン酸化を、抗体などを用いて検出することで行うことができる。
これらのスクリーニング方法は、本発明のスクリーニング方法の一例であって、本発明のスクリーニング方法は、これらに限定されない。また、前述のスクリーニング方法において、実験動物、細胞、タンパク質、核酸等の取扱いは、特に制限なく、従来公知の方法にて行うことができる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害することを含む方法であれば、特に制限されないが、例えば、下記（１）〜（６）の形態があげられる。
（１）本発明の一形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、ＡＳＫ１タンパク質が誘導するアポトーシスを抑制することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（２）本発明のその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞においてＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（３）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞においてＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（４）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写翻訳活性を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（５）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、ＡＳＫ１活性化因子およびＡＳＫ１タンパク質に活性化される因子の少なくとも一方を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（６）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬を、薬学上許容される有効量投与することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
これらの予防および治療の少なくとも一方の方法に用いる医薬の投与方法や投与形態は、前述のとおり、予防および治療の少なくとも一方に際して最も効果的なものを選択することができる。
また、本発明の心不全の診断方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性または自己リン酸化能を測定することを含む診断方法である。前記キナーゼ活性や自己リン酸化能を測定することにより、例えば、心不全や心不全のおそれのある心疾患の重症度、質的状態が診断でき、それにより、最適な心不全の予防・治療方法が選択できる。前記心不全のおそれのある心疾患としては、例えば、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症等があげられる。
以下に具体例を用いて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施に際し、以下の手法を用いた。
【実施例】
（ＡＳＫ１ノックアウトマウスと実験モデル）
ＡＳＫ１ノックアウトマウスは、既に報告のあるＣ５７Ｂ１６／Ｊ系統のＦ６世代のものを使用し（Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｋ．ｅｔａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，２２２−２２８．）、その対照野生型マウス（ＷＴマウス）として、年齢が同等であるＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスを使用した（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．社製）。心筋梗塞モデルおよび胸部横行大動脈縮索（ＴＡＣ；ｔｈｏｒａｃｉｃ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ａｏｒｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）モデルのための外科処置は、１０週齢のマウスを使用しておこなった。前記心筋梗塞は、文献に記載のとおりに、左冠動脈の結紮処置により引き起こし（Ｏｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０２，５６−６０．）、また、前記ＴＡＣ処置は、文献に記載のとおりに行った（Ｄａｔｅ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３９，９０７−１２．）。
（心エコー検査）
心エコー検査は、マウスを２．５％のアバーチン（ａｖｅｒｔｉｎ、８μｌ／ｇ）で麻酔し、ｕｌｔｒａ−ｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ（１５−ＭＨｚの線形変換器を備えたＳＯＮＯＳ−５５００、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｃｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実行した。心臓は、胸骨傍短軸方向投影診断図（ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐａｒａｓｔｅｒｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ａｘｉｓ ｖｉｅｗ）で画像化し、心室中央（ｍｉｄｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）のＭモード心エコー図は、乳頭筋のレベルで記録した。心拍、前部および後部壁厚、左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）ならびに左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）を前記Ｍモード画像から得た。
（心カテーテル法による心臓機能のインビボ評価）
心カテーテル法のために、１０週齢のマウスを、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ ５０−１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ ３−６ｍｇ／ｋｇ）との混合物を腹腔内注射して、麻酔した。次に、前記マウスの右頚動脈を分離し、文献に記載のとおり、増幅器（ＴＣＰ−５００，Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｃ．）に接続された１．４ Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｌｌａｒカテーテルとともにカニューレを挿入した（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，０２−０４７４ｆｊｅ．）。前記カテーテルを前記頚動脈に挿入した後、前記カテーテルを大動脈から左室内に進めた。左室圧は、デジタル化し、コンピューターシステムにより処理した。
（組織学的解析）
心臓試料は、心拡張時で停止させ、すぐに３．７％ホルマリンバッファーで固定し、パラフィンに埋め込み、厚み３μｍの切片標本とした。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ；ＨＥ）染色またはマッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を連続切片に対して行った。
（インビトロキナーゼアッセイ）
インビトロにおけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性は、以前に記載されたとおり、免疫複合体キナーゼアッセイにより測定した（Ｉｃｈｉｊｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，９０−４．）。内因性のＡＳＫ１の免疫沈降は、報告のとおり、５００μｇの心筋エキストラクトに対して行った（Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｍｂｏ Ｊ．１７，２５９６−６０６．）。
（アポトーシスの評価）
アポトーシスの評価は、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイにて行った。前記アッセイは、インサイチュ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）アポトーシス検出キット（Ｔａｋａｒａ社製）を使用して、製造業者の取扱説明書に従い、パラフィンに埋め込まれた心臓切片に対して行った。ＴＵＮＥＬ陽性核の数は、×４０対物レンズで切片全体を調べて数えた。いくつかの試料については、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ社製）、ＴＵＮＥＬ、および、抗ａ−サルコメア（横紋筋線維）アクチン抗体を用いた三重染色を行った。
（新生児ラットの心室筋細胞の初代培養とサバイバルアッセイ）
１〜２日齢のウィスターネズミから得たラットの心室筋細胞を、文献のとおりに、調製し、培養した（Ｈｉｒｏｔａｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５，５０９−１５．）。恒常活性体のＡＳＫ１（ＡｄＡＳＫ−ΔＮ）またはβガラクトシダーゼ（ＡｄＬａｃＺ）を発現するアデノウイルスベクターは、以前に記載のとおりである（Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｍｂｏ Ｊ．１７，２５９６−６０６．）。心筋細胞に、前記組換えアデノウイルスベクターを、細胞あたり１００プラーク形成単位の感染多重度で、１時間感染させた。その後、前記細胞を、さらに２４時間または４８時間培養した。０日目の値を１とした相対細胞数は、３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）アッセイに基づいたＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いて、３回測定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８による細胞染色は、細胞を１６０μＭの溶液でインキュベートして行った。
（ＭＡＰＫリン酸化の検定）
ＪＮＫやｐ３８の活性化は、心筋エキストラクトを、抗リン酸化ＪＮＫ坑体または抗リン酸化ｐ３８抗体を用いたウエスタンブロットにより評価した。
実験の結果は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示した。対のデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔで評価した。一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）とボンフェローニの多重比較（ｔｈｅ Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）または反復測定分散分析（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ ＡＮＯＶＡ）を、多重比較（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）に使用した。Ｐ＜０．０５の値は、統計学的に有意であるとみなした。
（ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおける心臓の特徴付け）
ＡＳＫ１のノックアウトマウスの心臓と、対照野生型（ＷＴ）マウスの心臓とを比較した。ＡＳＫ１ノックアウトマウスは、期待されるメンデル遺伝の頻度で産まれ、外見上は、対照ＷＴマウスと見分けがつかなかった。また、体、左室、右室および心房の重さについて、前記ＡＳＫ１ノックアウトマウスと前記対照ＷＴマウスとを比較した。その結果を、下記表１に示す。下記表１のとおり、両者の間に有意な差は認められなかった。前記ＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓は、形態学的傷害の徴候をなんら示さず、前記心臓の組織学的検査においても、筋原線維の混乱や壊死、または心室線維症は認められなかった。さらに、前記ＡＳＫ１ノックアウトマウスの筋細胞の切断面領域は、前記対照ＷＴマウスのそれと差異はなかった（ＡＳＫノックアウトでは、３３８±１２μｍ２であって、対照ＷＴでは、３２８±１２μｍ２であった）。
次に、ＡＳＫ１のノックアウトが、心臓機能に影響するかどうかを判断するために、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓の性能を、１０週齢のマウスにおける心エコー検査と心臓カテーテル法によって評価した。心エコー検査による、左室拡張末期径、左室収縮末期径、左室内径短縮率、拡張期心室中隔壁厚、拡張期左室後壁厚、および、心拍数の評価の結果を下記表１に示す。また、その時の経胸壁Ｍ−モード超音波心エコー検査図の一例を図１Ａの上段に示す。同図において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスは右欄であり、対照ＷＴマウスは左欄である。下記表１および図１Ａに示すように、前記評価項目において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとでは、有意な差は認められなかった。心臓カテーテル法により得られた、左室収縮圧、左室拡張末期圧、左室圧の最大一次導関数、左室圧の最小一次導関数、および心拍に関する血行動態データを下記表１に示す。下記表１に示すように、前記血行動態データにおいても、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとでは、有意な差は認められなかった。以上の知見から、ＡＳＫ１ノックアウトマウスが、正常な心臓の全体構造および機能を有していることが示唆される。
（心筋梗塞およびＴＡＣ後の心臓機能と心室の解剖学的構造）
ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスの左冠動脈を結紮処置し、心筋梗塞を引き起こさせた。心筋梗塞において、リモデリングは、まず、筋細胞の側面と側面のズレ（ｓｉｄｅ−ｓｉｄｅ ｓｌｉｐｐａｇｅ）に伴って生じ、その結果、梗塞が拡大し、そして、容積負荷と神経液性シグナルに応答して、梗塞領域から離れた非梗塞領域の心筋が肥大する。初期には、このことは、壁のストレスを減少するのに役立つが、最終的には、左室が拡張し、左室壁が薄くなり、収縮作用が低下する。前記外科的処置後の早期手術死亡率（２４時間以内）は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスでともにゼロであり、７日以内の死亡率も両者の間に有意な差は認められなかった（ＡＳＫ１ノックアウトマウスが２０％であり、対照ＷＴマウスが１８％であった）。死亡したマウスの全ての例において、心臓の周囲または胸腔を満たす過度の出血があり、左室の破裂が死亡原因であることが認められた。なお、前記外科的処置の１週間後から四週間後までの期間は、マウスは死亡しなかった。心筋梗塞後の左室リモデリングにおける、ＡＳＫ１ノックアウトのインビボにおける生理学的影響を評価した。前記評価のために、心エコー検査法を、前記外科的処置前、前記処置の２週間後、および前記処置の４週間後に、連続的に行った。その結果を下記表２に示し、そのときの経胸壁Ｍ−モード超音波心エコー検査図の一例を図１Ａ中段に示す。同図において、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ−／−）は右欄であり、対照ＷＴマウスは左欄である。また、前記処置４週間後の左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）および左室内径短縮率（ＦＳ）を比較した一例を図１Ｂ上段に示す。同図および下記表２に示すとおり、処置後の左室拡張末期径および収縮末期径は、ともに増加したが、その増加の程度は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ−／−）よりも対照ＷＴマウスが有意に大きかった。また、左室内径短縮率は、ともに減少したが、その減少の程度は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスよりも対照ＷＴマウスが有意に大きかった。偽処置の（左冠動脈を結紮していない）ＡＳＫ１ノックアウトおよび対照ＷＴマウスでは、左室拡張末期径、収縮末期径、および、左室内径短縮率のいずれについても、著しい変化は認められなかった。左冠動脈結紮の４週間後の対照ＷＴマウスの肺重量および肺と体の重量比（肺／体比）は、対照ＷＴマウスがＡＳＫ１ノックアウトマウスよりも有意に大きかった（肺重量は、ＡＳＫ１ノックアウトが、１５３．３±３．３ｍｇであり、対照ＷＴが、２０４．５±１５．３ｍｇであった。また、肺／体比は、ＡＳＫ１ノックアウトが、５．６３±０．２４ｘ１０−３であり、対照ＷＴが、７．６５±０．５３ｘ１０−３であった）。
次に、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスの胸部横行大動脈を緊縛（ＴＡＣ）処置し、圧負荷を生じさせた。圧負荷に応答して、心臓は、順応性の生理的応答を活性化し、心臓肥大という形をとり、壁のストレスを減少させる。ＴＡＣ処置したマウスにおいても、１週間後の時点では、心不全の兆候を示すことなく、機能亢進肥大を示すことが知られている。しかしながら、長期に渡るまたは過度の機械的ストレスへの暴露は、心室や心房の拡張および心機能異常という結果を招く。ＴＡＣ処置による圧負荷後の左室リモデリングにおける、ＡＳＫ１ノックアウトのインビボにおける生理学的影響を評価した。前記評価のために、心エコー検査法を、前記外科的処置前、前記処置の２週間後、および前記処置の４週間後に、連続的に行った。その結果を下記表３に示し、そのときの経胸壁Ｍ−モード超音波心エコー検査図の一例を図１Ａ下段に示す。同図において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスは右欄であり、対照ＷＴマウスは左欄である。また、前記処置４週間後の左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）および左室内径短縮率（ＦＳ）を比較した一例を図１Ｂ下段に示す。同図および下記表３に示すとおり、ＴＡＣ処置１週間後、心臓重量および心臓と体の重量比（心／体重量比）は、ＡＳＫ１ノックアウトおよび対照ＷＴマウスで、ともに同程度増加した。その時点での筋細胞の切断面領域についても、差異は認められなかった（ＡＳＫ１ノックアウトが、４４３±１８μｍ２であり、対照ＷＴが、４４５±１５μｍ２であった）。また、前記処置４週間後では、対照ＷＴマウスの左室拡張末期径が、ＡＳＫ１ノックアウトマウスや偽処置（ＴＡＣ処置をしていない）マウスに比べて著しく増加した。左室内径短縮率も、ＡＳＫ１ノックアウトマウスや偽処置マウスに比べて対照ＷＴマウスにおいて著しく減少した。ＴＡＣ処置４週間後の肺重量および肺／体重量比は、対照ＷＴマウスで著しく増加したが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスでは、増加しなかった。
（組織学的検査）
前記冠動脈結紮処置の４週間後のＡＳＫ１ノックアウトマウスおよび対照ＷＴマウスの心臓について組織学的検査を行った。その結果の一例を図２の中、上段に示す。同図において、右欄がＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓であり、左欄が対照ＷＴマウスの心臓である。また、各欄において、左側が、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色した切片であり、右側が、マッソントリクローム染色した切片であり、バーは、５ｍｍを示す。同図が示すように、前記処置の４週間後の対照ＷＴマウスの心臓は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスのそれと比較して明らかに大きかった。また、同図からは、対照ＷＴマウスでは、虚血性障害から遠隔の領域の一部が線維性の組織に取って代わられたが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスでは、前記遠隔領域は無傷であることが読み取れた。対照ＷＴマウスの心臓の左室の残存部分において、筋肉間および血管周囲に線維形成が認められたが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの前記遠隔領域においても、わずかであるが、我々は、血管周囲の線維形成を観察した。
次に、前記ＴＡＣ処理の４週間後のＡＳＫ１ノックアウトマウスおよび対照ＷＴマウスの心臓について組織学的検査を行った。その結果の一例を図２の下段に示す。同図において、右欄がＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓であり、左欄が対照ＷＴマウスの心臓である。また、各欄において、左側が、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色した切片であり、右側が、マッソントリクローム染色した切片である。同図が示すように、前記処置の４週間後の対照ＷＴマウスの心臓の拡張は明らかだったが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいては、心室や心房の拡張が起こらなかった。また、前記両マウスにおいては、血管周囲の線維形成と同様に、筋肉間の線維形成が、分散して観察され、その線維形成の程度は、前記両マウスの心臓で同様であった。
（機械的ストレス）
心筋リモデリングの主要な刺激は、機械的な過負荷であるため、冠動脈結紮またはＴＡＣ処置後における対照ＷＴおよびＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓にかかる機械的ストレスの程度を評価した。
心筋梗塞モデルでは、残存する心筋に課せられる機械的負荷は、二重積（ｄｏｕｂｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）として推定される。ＬＶ収縮圧も心拍も、冠動脈結紮後１週間では、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとで有意な差は認められなかった（収縮期圧は、ＡＳＫ１ノックアウトが、１１０．２±６．０ｍｍＨｇであって、対照ＷＴが、１０８．２±２．８ｍｍＨｇであった。心拍は、ＡＳＫ１ノックアウトが、５８２±１０／ｍｉｎであって、対照ＷＴが、５５９±２４／ｍｉｎであった）。さらに、梗塞のサイズは、冠動脈結紮直後に調べた両方のマウスにおいて同様であり、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの平均は、５１．３±５．７％であり、対照ＷＴの平均が、４９．１±４．９％であった。したがって、ＡＳＫ１除去による表現型は、側副血行の発達と関係する可能性が低いことが示唆された。
ＴＡＣ処置により産生される機械的ストレスは、ＴＡＣから７日後、狭窄を横切る圧力の傾斜をインビボで測定することで推定できる。その測定の結果、ＴＡＣ処置は２つの頚動脈間の圧力傾斜を著しく増加させたが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとで有意な差は認められなかった（ＡＳＫ１ノックアウトが、５５．５±５．７ｍｍＨｇであり、対照ＷＴが、５７．３±４．６ｍｍＨｇであった）。
（左室リモデリングにおけるアポトーシス）
左室リモデリング中に心筋細胞で増加するアポトーシスに対するＡＳＫ１除去の効果を評価した。冠動脈結紮またはＴＡＣ処置後にアポトーシスが誘導された心筋細胞の数えるために、ＴＵＮＥＬアッセイを利用した。ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとで比較した結果の一例を図３に示す。図３Ａのグラフは、冠動脈結紮処置から１週または４週後の境界領域および遠隔領域（左２パネル）、ならびにＴＡＣ処理から１週または４週後の心筋（右パネル）におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の相対数の一例を示す。同図に示すように、冠動脈結紮処置では、１週間および４週間後で、梗塞の境界領域においても、虚血障害の領域から遠隔の心筋においても、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数、すなわち、アポトーシス細胞の数は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいてよりも、対照ＷＴマウスにおいて著しく増加した。また、ＴＡＣ処置後のＴＵＮＥＬ陽性細胞は、左室壁に偏在しており、その数は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスよりも、対照ＷＴマウスにおいて著しく増加した。
前記ＴＵＮＥＬ陽性細胞が心筋細胞であることは、三重染色により確認した。その結果の一例を図３Ｂに示す。同図に示すとおり、ＴＵＮＥＬ染色は緑色に見え、抗ａ−サルコメア抗体およびヨウ化プロピジウム染色は赤色に見える。したがって両図を重ねた場合に黄色に見えれば心筋細胞であると確認できる。
（ＡＳＫ１タンパク質の活性化によるアポトーシスの誘導）
ＡＳＫ１タンパク質が、心筋細胞においてアポトーシスを誘導できることを確認するために、新生児の心筋細胞を分離し、恒常的に活性な変異型のＡＳＫ１タンパク質（ＡｄＡＳＫ（ΔＮ））またはβガラクトシダーゼ（ＡｄＬａｃＺ）を発現するアデノウイルスを、細胞あたりのプラーク形成単位が１００の感染多重度で感染させた。その結果を図４に示す。図４Ａは、前記ウイルスを感染させた０日目の生存数に対するパーセントで表した細胞生存率のグラフである。図４Ａに示すとおり、活性変異型のＡＳＫ１タンパク質の過剰発現は、生存細胞数の減少を引き起こした。一方、βガラクトシダーゼを発現させても、生存細胞数の減少は見られなかった。図４Ｂは、前記ウイルス感染４８時間後の細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染色した顕微鏡写真である。図４Ｂに示すとおり、活性変異型のＡＳＫ１タンパク質の過剰発現させてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色すると、様々な程度の凝縮核クロマチンや、断片化した核が観察された。一方、βガラクトシダーゼを発現させても、そのようなことは観察されなかった。また、前記感染多重度を１０にして前記変異型ＡＳＫ１タンパク質を発現させると、心筋細胞は肥大した。
（Ｈ２Ｏ２が誘導するアポトーシスにおけるＡＳＫ１の必要性）
次に、Ｈ２Ｏ２が誘導するアポトーシスにおけるＡＳＫ１の必要性を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ−／−）および対照ＷＴマウスの新生児の心筋細胞を用いて確かめた。前記心筋細胞を、様々な濃度のＨ２Ｏ２とともに２４時間培養し、ＭＭＴアッセイにより生存細胞数を測定し、前記心筋細胞の生存率（％）を求めた。その結果を図４Ｃに示す。図４Ｃに示すとおり、Ｈ２Ｏ２に対する耐性は、ＡＳＫ−／−の心筋細胞のほうが、ＷＴの心筋細胞よりも優れていた。また、前記心筋細胞を１０μＭのＨ２Ｏ２で２４時間処理した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色して顕微鏡観察した写真を図４Ｄに示す。図４Ｄに示すとおり、観察された核の形態から、Ｈ２Ｏ２によりアポトーシスが誘導されたことが確認された。
（冠動脈結紮処置およびＴＡＣ処置後におけるＡＳＫ１タンパク質の活性化）
リモデリング中におけるＡＳＫ１タンパク質の活性を確認した。冠動脈結紮処置後またはＴＡＣ処置後の心臓について、ＡＳＫ１タンパク質の活性を測定した。その結果を図５Ａに示す。図５Ａは、Ｈｉｓ−ＭＫＫ６を基質に使用した免疫複合体アッセイの測定結果であって、上段のパネルが、冠動脈結紮処置の２日および１週間後のＡＳＫ１タンパク質の活性化を示し、下段のパネルが、ＴＡＣ処置の２日および１週間後のＡＳＫ１タンパク質の活性化を示す。前記上段パネルでは、心筋ホモジネートは、処置および未処置のＡＳＫ１ノックアウトマウス、ならびに、未処置、偽処置および処置の２日および１週間後のＷＴマウスより抽出した心筋ホモジネートを使用した。前記下段パネルでは、心筋ホモジネートは、処置の２日および１週間後のＡＳＫ１ノックアウトマウス、ならびに、偽処置および処置の２日および１週間後のＷＴマウスより抽出した心筋ホモジネートを使用した。図５Ａに示すとおり、ＷＴマウスの心臓において、冠動脈結紮処置後およびＴＡＣ処置後にＡＳＫ１タンパク質が著しく活性化されることが確認された。しかしながら、ＡＳＫ１ノックアウトマウスでは、有意なＡＳＫ１の活性化が認められなかった。
また、リモデリング中、ＡＳＫ１タンパク質の下流に存在するＪＮＫやｐ３８の活性を評価するため、各々のリン酸化状態をウエスタンブロット法を用いて測定した。その結果を図５Ｂに示す。図５Ｂは、冠動脈結紮処置後（左側）またはＴＡＣ処置後（右側）の、ＡＳＫ１ノックアウトマウスおよびＷＴマウスの心臓細胞のＪＮＫおよびｐ３８に対するのウエスタンブロットの結果の一例を示す図である。同図に示すとおり、ＷＴマウスの心臓において、冠動脈結紮処置後およびＴＡＣ処置後に、ＪＮＫやｐ３８の活性化が認められた。一方、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓では、ｐ３８の活性化は、ＷＴマウスと同程度に観察されたが、ＪＮＫ活性化は、有意に抑制されていた。従って、リモデリングにおいては、ＪＮＫが、ＡＳＫ１の下流因子として重要な働きを果たしていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
慢性心不全は、先進国では主要な死亡原因の一つである。また、急性冠動脈疾患が、ＣＣＵ（冠動脈疾患集中治療）や冠動脈形成術の発展によって克服されてきていることが、心筋梗塞後の心不全発症を増加させている。さらに、心不全患者は、高血圧症群にも多い。本発明は、例えば、このように非常に大きな需要が見込まれる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の分野や心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法の分野で有用である。
【図２】
【技術分野】
本発明は、ＡＳＫ１阻害剤を有効成分とする心不全治療薬およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
心不全とは、心筋の収縮機能障害のために全身性の多彩な自・他覚所見を呈する症候群であって、生命の危険を伴うものである。心不全の患者は、それらの症状のため運動耐容能が低下し、心不全増悪による入院を反復し、最終的には死に至り、その予後は極めて不良である。現在、薬物治療として利尿薬、ジギタリス製剤、βブロッカー、アンギオテンシン転換酵素阻害薬、アンギオテンシン受容体阻害薬等が、心不全発症予防や治療に用いられている。その効果は大規模臨床試験で実証はされているが、その効果は軽微なものであり、重症の慢性心不全においては心移植に頼らざるをえない状態であるため、新しい心不全の治療方法の開発が待たれている。
心不全の原因は未だ十分には解明されていないが、臨床経過としては、例えば、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症等の心臓疾患の後に、心室リモデリング（再構築）が生じ、続いて、心不全が起こることが知られている。前記心室リモデリングとは、心筋の障害や、負荷の変化に応答する左室のジオメトリー、質量、容積、機能の変化のことである。前記リモデリングのプロセスは、順応性であるが、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症等のように、前記障害や負荷が継続的で病的な場合、前記プロセスは順応不良となる。そうすると、肥大した心筋細胞に十分な量の血液が供給されずに虚血に陥り、これが原因で心筋収縮不全などの心筋障害が生じ、心拍出量の低下、臓器循環障害、静脈鬱血、体液貯留などを伴う心不全症候群を来すと考えられる。そして、リモデリング中の左室の拡張の程度は、病気の状態や死亡率についての強力な指標となっている（Ｐａｔｔｅｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｕｄｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．＆Ｋｏｎｓｔａｍ，Ｍ．Ａ．「心不全における心室リモデリングとその予防（Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）」（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１３，１６２−７．参照）。
心筋梗塞後の左室リモデリングを引き起こす基礎となるメカニズムは、ヒト患者においても実験モデルにおいても、筋細胞のアポトーシスの関与が示唆されている（Ｏｌｉｖｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｑｕａｉｎｉ，Ｆ．，Ｓａｌａ，Ｒ．，Ｌａｇｒａｓｔａ，Ｃ．，Ｃｏｒｒａｄｉ，Ｄ．，Ｂｏｎａｃｉｎａ，Ｅ．，Ｇａｍｂｅｒｔ，Ｓ．Ｒ．，Ｃｉｇｏｌａ，Ｅ．＆Ａｎｖｅｒｓａ，Ｐ．「ヒト急性心筋梗塞は、心臓の生存部におけるプログラム筋細胞死と関連する（Ａｃｕｔｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ Ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ）」（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２８，２００５−２０１６．、およびＣｈｅｎｇ，Ｗ．，Ｋａｊｓｔｕｒａ，Ｊ．，Ｎｉｔａｈａｒａ，Ｊ．Ａ．，Ｌｉ，Ｂ．，Ｒｅｉｓｓ，Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ａ．，Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｏｌｉｖｅｔｔｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．「ラットにおけるプログラム筋細胞死は、梗塞後の生存心筋細胞に影響を与える（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ Ｖｉａｂｌｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ａｆｔｅｒ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ）」（１９９６）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２６，３１６−３２７．参照）。また、圧負荷に応答する心肥大の後に生じる心不全においても、心筋細胞のアポトーシスは、代償性肥大と心不全との間の移行における重大なポイントである考えられている（Ｈｉｒｏｔａ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｂｅｔｚ，Ｕ．Ａ．，Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｒｏｓｓ，Ｊ．，Ｊｒ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．＆Ｃｈｉｅｎ，Ｋ．Ｒ．「ｇｐ１３０心筋細胞生存経路の欠損は、生化学的ストレス下における心不全の発症の決定的事象である（Ｌｏｓｓ ｏｆ ａ ｇｐ１３０ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｄｕｒｉｎｇ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｔｒｅｓｓ）」（１９９９）Ｃｅｌｌ ９７，１８９−９８．参照）。
他方、ＡＳＫ１（アポトーシスシグナル制御キナーゼ１；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）タンパク質は、反応性の酵素種に感受性を示すマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）であって、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）や、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼを活性化するものとして同定されたタンパク質である（特開平１０−００００９３号公報およびＩｃｈｉｊｏ，Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｅ．，Ｉｒｉｅ，Ｋ．，Ｄｉｊｉｋｅ，Ｐ．Ｔ．，Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．＆Ｇｏｔｏｈ，Ｙ．「ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ３８シグナル経路を活性化する哺乳類ＭＡＰＫＫＫであるＡＳＫ１によるアポトーシスの誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ＡＳＫ１，ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＰＫＫＫ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＳＡＰＫ／ＪＮＫ ａｎｄ ｐ３８ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ）」（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，９０−９４．参照）。野生型または恒常的に活性型であるＡＳＫ１タンパク質の過剰発現が、様々な細胞でアポトーシスを誘導することや（Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｍ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｋ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ｋａｗａｂａｔａ，Ｍ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．＆Ｉｃｈｉｊｏ，Ｈ．「哺乳類チオレドキシンは、アポトーシスシグナル制御キナーゼ１（ＡＳＫ１）を直接阻害する（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｉｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ（ＡＳＫ）１）」（１９９８）ＥｍｂｏＪ．１７，２５９６−６０６．参照）、酸化ストレスや腫瘍壊死因子が誘導するアポトーシスが、ＡＳＫ−／−細胞で抑制されることが報告されている（Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｚａｗａ，Ａ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ．−ｉ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｍｉｎｏｗａ，Ｏ．，Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，Ｎｏｄａ，Ｔ．＆Ｉｃｈｉｊｏ，Ｈ．「ＡＳＫ１は、ＪＮＫ／ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの持続活性化とアポトーシスに必要である（ＡＳＫ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＪＮＫ／ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」（２００１）ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，２２２−２２８．参照）。しかしながら、心不全とＡＳＫ１との関係については、なんら報告されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、前記リモデリングにおける心機能低下や心不全の開始を抑制できる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬、そのスクリーニング方法、心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法ならびに心不全の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
前記目的を解決するために、本発明者は、臨床的に心不全と最も関連性の高い病因である心筋梗塞後の左室リモデリングと圧負荷後の左室リモデリングを、ＡＳＫ１ノックアウトマウスを利用して再現し、左室リモデリングの分子メカニズムを解明するという着想を得て鋭意研究を重ねた。その結果、ＡＳＫ１タンパク質を心筋細胞から除去しても、基底レベルでは心臓に形態学的および組織学的欠陥が生じないこと、ＡＳＫ１タンパク質除去により、心筋梗塞および圧負荷後の左室リモデリングにおける進行性の収縮機能低下をともなう左室拡張を抑制できること、ＡＳＫ１タンパク質除去により、心筋梗塞および圧負荷後の左室リモデリングにおけるアポトーシスの頻度の進行的な増加を抑制できること、ＡＳＫ１タンパク質の活性化が、心筋細胞においてアポトーシスを誘導すること、および、心筋梗塞や圧負荷後に、心臓でＡＳＫ１タンパク質が活性化すること等を見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬であり、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法であり、本発明の心不全の診断方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性または自己リン酸化能を測定することを含む診断方法である。
【発明の効果】
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の医薬によれば、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害できるから、例えば、心疾患の左室リモデリングにおける進行性の心臓収縮機能低下を抑制できる。したがって、例えば、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症等の心室リモデリングを生じるおそれのある疾患に対して、心不全予防の医薬として使用でき、また、例えば、心不全に対して、心不全治療の医薬として使用できる。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、心不全の予防や治療に効果的な医薬の創薬が可能となる。また、本発明の予防および治療の少なくとも一方の方法によれば、例えば、効果的な心不全の予防や治療が可能となる。また、本発明の診断方法によれば、例えば、効果的な診断と治療方法の選択が可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、本発明の実施例における経胸壁Ｍモード超音波心エコー検査図の一例であり、図１Ｂは、本発明の実施例のおける心エコー検査のパラメーター変化を示すグラフの一例である。
図２は、本発明の実施例における心臓試料切片の写真の一例である。
図３Ａは、本発明の実施例におけるアポトーシス細胞数を示すグラフの一例であり、図３Ｂは、本発明の実施例における三重染色顕微鏡観察の一例である。
図４Ａは、本発明の実施例における細胞生存率を表すグラフの一例であり、図４Ｂは、本発明の実施例におけるＨｏｅｃｈｓｔ染色顕微鏡観察の一例であり、図４Ｃは、本発明の実施例における細胞生存率を表すグラフのその他の例であり、図４Ｄは、本発明の実施例におけるＨｏｅｃｈｓｔ染色顕微鏡観察のその他の例である。
図５Ａは、本発明の実施例におけるＡＳＫ１タンパク質の活性化の測定結果の一例を示す図であり、図５Ｂは、本発明の実施例におけるＪＮＫタンパク質およびｐ３８タンパク質のリン酸化を測定した結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において、ＡＳＫ１タンパク質は、例えば、哺乳類のＡＳＫ１タンパク質であり、好ましくは、ヒトのＡＳＫ１タンパク質であり、より好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース登録番号Ｄ８４４７６のアミノ酸配列もしくは前記アミノ酸配列と実質同一のアミノ酸配列であって、さらに好ましくは、本発明の医薬を適用する患者のＡＳＫ１タンパク質のアミノ酸配列と同一もしくは実質同一のアミノ酸配列からなるＡＳＫ１タンパク質である。前記実質同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列の相同性が約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ配列であって、ＡＳＫ１タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列があげられる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬としては、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬であれば特に制限されないが、例えば、下記（１）〜（８）の形態があげられる。
（１）本発明の一形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、ＡＳＫ１タンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制する化合物を有効成分とする医薬である。
（２）本発明のその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（３）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（４）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（５）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（６）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、ＡＳＫ１タンパク質を活性化する因子を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（７）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、ＡＳＫ１タンパク質が活性化する因子を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
（８）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、心室リモデリングにおける進行性の心機能低下を抑制できる化合物を有効成分とする医薬である。
前記ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、または前記ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、例えば、ＡＳＫ１タンパク質に特異的な抗ＡＳＫ１抗体があげられる。前記抗ＡＳＫ１抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であってもよく、公知の抗体を利用してもよいし、新たに作製しても良い。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の作製方法は、特に制限されず、従来公知の方法を使用できる。また、前記抗ＡＳＫ１抗体は、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖフラグメント等があげられ、これらのフラグメントは、従来公知の種々の修飾がなされてもよい。さらにまた、前記抗ＡＳＫ１抗体は、キメラ抗体であってもよい。
さらに、前記ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、または前記ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、例えば、ＡＳＫ１タンパク質のドミナントネガティブ変異体があげられる。前記ＡＳＫ１ドミナントネガティブ変異体は、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性、自己リン酸化活性、および複合体化の少なくとも一つを阻害できるものであれば、特に制限されず、例えば、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｍ）、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）、ＡＳＫ１ＮＴ、ＡＳＫ−ΔＮ（Ｋ７０９Ｍ）、ＡＳＫ−ΔＮ（Ｋ７０９Ｒ）等があげられる。前記Ｋ７０９ＭおよびＫ７０９Ｒは、ＡＳＫ１タンパク質の７０９番目のリジン（Ｋ）が、それぞれメチオニン（Ｍ）およびアルギニン（Ｒ）に置換したことを表し、前記ＡＳＫ１ＮＴは、ＡＳＫ１タンパク質のＮ末端領域である１〜６４８アミノ酸残基部分からなるタンパク質であり、前記ＡＳＫ−ΔＮは、ＡＳＫ１タンパク質のＣ末端領域である６４９〜１３７５アミノ酸残基からなるタンパク質を表す。
さらにまた、前記ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、または前記ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、例えば、チオレドキシン等があげられる。
前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物としては、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドがあげられる。前記アンチセンスポリヌクレオチドとしては、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡと相補的に対合し、ＡＳＫ１タンパク質の発現を抑制できるものであれば、特に制限されず、例えば、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、およびその誘導体等があげられる。前記アンチセンスポリヌクレオチドの配列は、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの相補配列と同一または実質的に同一であることが好ましい。本発明において、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列は、例えば、哺乳類のＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列であり、好ましくはヒトのＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列であり、より好ましくはＧｅｎＢａｎｋデータベース登録番号Ｄ８４４７６の配列であり、さらに好ましくは本発明の医薬を適用する患者のＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一または実質同一の配列である。前記実質同一の配列としては、例えば、配列の相同性が約５０％以上の配列であり、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列であって、ＡＳＫ１タンパク質のアミノ酸配列と同一もしくは実質同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列があげられる。
さらに前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物としては、例えば、ＲＮＡ干渉のためのＲＮＡがあげられる。前記ＲＮＡ干渉のためのＲＮＡとしては、例えば、前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一配列の一本鎖、二重鎖、または三重鎖ＲＮＡがあげられ、好ましくは、前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一配列の二重鎖ＲＮＡであって、さらに好ましくは、１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ断片からなる前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡ配列と同一配列の二重鎖ＲＮＡである。
前記ＡＳＫ１タンパク質の活性化因子としては、例えば、Ｄａｘｘ、ＴＲＡＦ２、カルモジュリン依存性リン酸化酵素ＩＩ（Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ；ＣａＭ Ｋｉｎａｓｅ ＩＩ）等があげられ、前記ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子としては、例えば、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ等があげられる。これらの中でも、本発明の医薬の一形態において、有効成分が阻害する前記ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子としては、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＪＮＫが好ましい。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬に有効成分として含まれる化合物には、例えば、低分子無機化合物、低分子有機化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、脂質、糖、これらの誘導体、およびその塩等が含まれる。前記有効成分の化合物が、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよびタンパク質等である場合、これらをコードするヌクレオチド配列を利用できる。したがって、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のさらなる一形態としては、下記（９）の形態があげられる。
（９）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、有効成分である化合物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の発現に必要な調節配列に作動的に連結されているベクターを含む医薬である。
前記ベクターとしては、前記ヌクレオチド配列を、患者の体内、好ましくは心筋細胞内に挿入することが可能なベクターであれば、特に制限されず、例えば、一本鎖、二重鎖、環状またはスーパーコイルのＤＮＡ分子やＲＮＡ分子等を使用できる。具体的には、前記ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等のウイルスベクターや、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ１０８，１９３−２００（１９９１））、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社製）等の非ウイルスベクターがあげられる。前記調節配列とは、患者の細胞内、好ましくは心筋細胞内において、作動的に連結された前記ヌクレオチド配列の発現に必要な塩基配列をであって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを表す。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、例えば、哺乳類に使用でき、好ましくは、ヒトに使用できる。また、本発明の医薬は、心不全、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症、、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症等の疾患に適用できる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の投与経路としては、例えば、経口投与や非経口投与があげられ、前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等があげられる。また、投与形態としては、投与経路に応じて、例えば、経口投与剤、経鼻剤、経皮剤、直腸投与剤（座剤）、舌下剤、経膣剤、注射剤（経静剤、経動剤、皮下、皮内）、点滴剤等があげられる。また、前記経口投与剤としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、乳液、シロップ剤等があげられ、前記経皮剤としては、例えば、ローション等の液剤や、クリームや軟膏等の半固形剤の形態があげられる。本発明の医薬の投与経路および投与形態は、これらに限られることなく、予防および治療の少なくとも一方に際して最も効果的なものを使用することが望ましい。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬が、前記ベクターを含む形態、いわゆる遺伝子治療剤の剤形を取る場合、前記ベクターに応じて、患者の体内、好ましくは心筋細胞内に導入することが好ましい。
前記ベクターが、ウイルスベクターである場合、前記ベクターの投与方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ法やｅｘ ｖｉｖｏ法等があげられる。前記ｉｎ ｖｉｖｏ法では、医薬は、目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与される。例えば、静脈、動脈、冠状動脈、皮下、皮内、心筋内等に投与してもよく、病変と認められる部位そのものに直接局所投与しても良い。他方、前記ベクターが、非ウイルスベクターである場合、前記ベクターの投与方法としては、例えば、内包型リポソームまたは静電気型リポソームによる導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法、レセプター介在性導入法、パーティクル銃で金属粒子の担体とともに導入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等があげられる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法としては、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法であれば特に制限されないが、例えば、下記（１）〜（８）の形態があげられる。
（１）本発明の一形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質が誘導するアポトーシスの抑制を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（２）本発明のその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性の活性阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（３）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（４）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（５）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１遺伝子の転写の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（６）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質の活性化因子の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（７）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ＡＳＫ１タンパク質に活性化される因子の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
（８）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、心室リモデリングの進行性の心機能低下の抑制を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
前述のスクリーニング方法は、インシリコ、インビトロおよびインビボにおいて従来公知の方法を用いて行うことができる。また、前述の医薬成分を選択する工程で選択された医薬成分は、そのまま、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の有効成分として利用してもよいし、前記医薬成分が、例えば、ポリヌクレオチドやポリペプチド等の場合は、前述のように、前記ポリヌクレオチドやポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子治療剤という形態で利用してもよい。前記薬剤候補化合物としては、例えば、低分子無機化合物、低分子有機化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、脂質、糖、これらの誘導体、およびその塩等が含まれる。
前記アポトーシスの抑制を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、恒常的に活性のあるＡＳＫ１タンパク質（例えば、ＡＳＫ−ΔＮ；Ｎ末端領域のアミノ酸１〜６４８を欠損したＡＳＫ１タンパク質など）を発現する細胞、または前記恒常活性体ＡＳＫ−ΔＮを心臓に発現するトランスゲニックマウスに、薬剤候補化合物を投与し、アポトーシスを抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記キナーゼ活性の活性阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞にＡＳＫ１活性化物質を投与した後、前記細胞から抗ＡＳＫ１抗体を用いて免疫沈降しＡＳＫ１タンパク質を回収して、そのキナーゼ活性を測定することで、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記自己リン酸化の阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞にＡＳＫ１活性化物質を投与した後、前記細胞を試料として抗リン酸化ＡＳＫ１抗体を用いてウエスタンブロットを行うか、または、前記細胞から抗ＡＳＫ１抗体を用いて免疫沈降したＡＳＫ１タンパク質に対して抗リン酸化ＡＳＫ１抗体を用いてウエスタンブロットを行い、ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等があげあれる。
前記ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞または動物心臓からタンパク質を抽出し、ＡＳＫ１タンパク質の発現を評価することで、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記ＡＳＫ１遺伝子の転写阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞または動物心臓からｍＲＮＡを単離し、ＡＳＫ１ ｍＲＮＡの発現を評価することで、ＡＳＫ１遺伝子の転写を阻害する薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記ＡＳＫ１タンパク質によって活性化される因子の阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体的には、例えば、恒常活性体ＡＳＫ−ΔＮを発現する細胞または前記恒常活性体ＡＳＫ−ΔＮを心臓に発現するトランスゲニックマウスに、薬剤候補化合物を投与し、例えば、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、Ｐ３８ ＭＡＰＫ等の活性、好ましくは、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＪＮＫの活性を評価することで、ＡＳＫ１タンパク質によって活性化される因子を阻害する薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。前記活性の評価の方法は、特に制限されず、例えば、前記因子のリン酸化を、抗体などを用いて検出することで行うことができる。
これらのスクリーニング方法は、本発明のスクリーニング方法の一例であって、本発明のスクリーニング方法は、これらに限定されない。また、前述のスクリーニング方法において、実験動物、細胞、タンパク質、核酸等の取扱いは、特に制限なく、従来公知の方法にて行うことができる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害することを含む方法であれば、特に制限されないが、例えば、下記（１）〜（６）の形態があげられる。
（１）本発明の一形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、ＡＳＫ１タンパク質が誘導するアポトーシスを抑制することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（２）本発明のその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞においてＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（３）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞においてＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（４）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写翻訳活性を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（５）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、ＡＳＫ１活性化因子およびＡＳＫ１タンパク質に活性化される因子の少なくとも一方を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
（６）本発明のさらにその他の形態として、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬を、薬学上許容される有効量投与することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
これらの予防および治療の少なくとも一方の方法に用いる医薬の投与方法や投与形態は、前述のとおり、予防および治療の少なくとも一方に際して最も効果的なものを選択することができる。
また、本発明の心不全の診断方法は、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性または自己リン酸化能を測定することを含む診断方法である。前記キナーゼ活性や自己リン酸化能を測定することにより、例えば、心不全や心不全のおそれのある心疾患の重症度、質的状態が診断でき、それにより、最適な心不全の予防・治療方法が選択できる。前記心不全のおそれのある心疾患としては、例えば、心筋梗塞、高血圧症、心臓弁膜症、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症等があげられる。
以下に具体例を用いて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施に際し、以下の手法を用いた。
【実施例】
（ＡＳＫ１ノックアウトマウスと実験モデル）
ＡＳＫ１ノックアウトマウスは、既に報告のあるＣ５７Ｂ１６／Ｊ系統のＦ６世代のものを使用し（Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｋ．ｅｔａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，２２２−２２８．）、その対照野生型マウス（ＷＴマウス）として、年齢が同等であるＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスを使用した（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．社製）。心筋梗塞モデルおよび胸部横行大動脈縮索（ＴＡＣ；ｔｈｏｒａｃｉｃ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ａｏｒｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）モデルのための外科処置は、１０週齢のマウスを使用しておこなった。前記心筋梗塞は、文献に記載のとおりに、左冠動脈の結紮処置により引き起こし（Ｏｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０２，５６−６０．）、また、前記ＴＡＣ処置は、文献に記載のとおりに行った（Ｄａｔｅ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３９，９０７−１２．）。
（心エコー検査）
心エコー検査は、マウスを２．５％のアバーチン（ａｖｅｒｔｉｎ、８μｌ／ｇ）で麻酔し、ｕｌｔｒａ−ｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ（１５−ＭＨｚの線形変換器を備えたＳＯＮＯＳ−５５００、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｃｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実行した。心臓は、胸骨傍短軸方向投影診断図（ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐａｒａｓｔｅｒｎａｌ ｓｈｏｒｔ−ａｘｉｓ ｖｉｅｗ）で画像化し、心室中央（ｍｉｄｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）のＭモード心エコー図は、乳頭筋のレベルで記録した。心拍、前部および後部壁厚、左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）ならびに左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）を前記Ｍモード画像から得た。
（心カテーテル法による心臓機能のインビボ評価）
心カテーテル法のために、１０週齢のマウスを、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ ５０−１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ ３−６ｍｇ／ｋｇ）との混合物を腹腔内注射して、麻酔した。次に、前記マウスの右頚動脈を分離し、文献に記載のとおり、増幅器（ＴＣＰ−５００，Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｃ．）に接続された１．４ Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｌｌａｒカテーテルとともにカニューレを挿入した（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，０２−０４７４ｆｊｅ．）。前記カテーテルを前記頚動脈に挿入した後、前記カテーテルを大動脈から左室内に進めた。左室圧は、デジタル化し、コンピューターシステムにより処理した。
（組織学的解析）
心臓試料は、心拡張時で停止させ、すぐに３．７％ホルマリンバッファーで固定し、パラフィンに埋め込み、厚み３μｍの切片標本とした。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ；ＨＥ）染色またはマッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を連続切片に対して行った。
（インビトロキナーゼアッセイ）
インビトロにおけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性は、以前に記載されたとおり、免疫複合体キナーゼアッセイにより測定した（Ｉｃｈｉｊｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，９０−４．）。内因性のＡＳＫ１の免疫沈降は、報告のとおり、５００μｇの心筋エキストラクトに対して行った（Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｍｂｏ Ｊ．１７，２５９６−６０６．）。
（アポトーシスの評価）
アポトーシスの評価は、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイにて行った。前記アッセイは、インサイチュ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）アポトーシス検出キット（Ｔａｋａｒａ社製）を使用して、製造業者の取扱説明書に従い、パラフィンに埋め込まれた心臓切片に対して行った。ＴＵＮＥＬ陽性核の数は、×４０対物レンズで切片全体を調べて数えた。いくつかの試料については、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ社製）、ＴＵＮＥＬ、および、抗ａ−サルコメア（横紋筋線維）アクチン抗体を用いた三重染色を行った。
（新生児ラットの心室筋細胞の初代培養とサバイバルアッセイ）
１〜２日齢のウィスターネズミから得たラットの心室筋細胞を、文献のとおりに、調製し、培養した（Ｈｉｒｏｔａｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５，５０９−１５．）。恒常活性体のＡＳＫ１（ＡｄＡＳＫ−ΔＮ）またはβガラクトシダーゼ（ＡｄＬａｃＺ）を発現するアデノウイルスベクターは、以前に記載のとおりである（Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｍｂｏ Ｊ．１７，２５９６−６０６．）。心筋細胞に、前記組換えアデノウイルスベクターを、細胞あたり１００プラーク形成単位の感染多重度で、１時間感染させた。その後、前記細胞を、さらに２４時間または４８時間培養した。０日目の値を１とした相対細胞数は、３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）アッセイに基づいたＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いて、３回測定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８による細胞染色は、細胞を１６０μＭの溶液でインキュベートして行った。
（ＭＡＰＫリン酸化の検定）
ＪＮＫやｐ３８の活性化は、心筋エキストラクトを、抗リン酸化ＪＮＫ坑体または抗リン酸化ｐ３８抗体を用いたウエスタンブロットにより評価した。
実験の結果は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示した。対のデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔで評価した。一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）とボンフェローニの多重比較（ｔｈｅ Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）または反復測定分散分析（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ ＡＮＯＶＡ）を、多重比較（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）に使用した。Ｐ＜０．０５の値は、統計学的に有意であるとみなした。
（ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおける心臓の特徴付け）
ＡＳＫ１のノックアウトマウスの心臓と、対照野生型（ＷＴ）マウスの心臓とを比較した。ＡＳＫ１ノックアウトマウスは、期待されるメンデル遺伝の頻度で産まれ、外見上は、対照ＷＴマウスと見分けがつかなかった。また、体、左室、右室および心房の重さについて、前記ＡＳＫ１ノックアウトマウスと前記対照ＷＴマウスとを比較した。その結果を、下記表１に示す。下記表１のとおり、両者の間に有意な差は認められなかった。前記ＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓は、形態学的傷害の徴候をなんら示さず、前記心臓の組織学的検査においても、筋原線維の混乱や壊死、または心室線維症は認められなかった。さらに、前記ＡＳＫ１ノックアウトマウスの筋細胞の切断面領域は、前記対照ＷＴマウスのそれと差異はなかった（ＡＳＫノックアウトでは、３３８±１２μｍ２であって、対照ＷＴでは、３２８±１２μｍ２であった）。
次に、ＡＳＫ１のノックアウトが、心臓機能に影響するかどうかを判断するために、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓の性能を、１０週齢のマウスにおける心エコー検査と心臓カテーテル法によって評価した。心エコー検査による、左室拡張末期径、左室収縮末期径、左室内径短縮率、拡張期心室中隔壁厚、拡張期左室後壁厚、および、心拍数の評価の結果を下記表１に示す。また、その時の経胸壁Ｍ−モード超音波心エコー検査図の一例を図１Ａの上段に示す。同図において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスは右欄であり、対照ＷＴマウスは左欄である。下記表１および図１Ａに示すように、前記評価項目において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとでは、有意な差は認められなかった。心臓カテーテル法により得られた、左室収縮圧、左室拡張末期圧、左室圧の最大一次導関数、左室圧の最小一次導関数、および心拍に関する血行動態データを下記表１に示す。下記表１に示すように、前記血行動態データにおいても、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとでは、有意な差は認められなかった。以上の知見から、ＡＳＫ１ノックアウトマウスが、正常な心臓の全体構造および機能を有していることが示唆される。
（心筋梗塞およびＴＡＣ後の心臓機能と心室の解剖学的構造）
ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスの左冠動脈を結紮処置し、心筋梗塞を引き起こさせた。心筋梗塞において、リモデリングは、まず、筋細胞の側面と側面のズレ（ｓｉｄｅ−ｓｉｄｅ ｓｌｉｐｐａｇｅ）に伴って生じ、その結果、梗塞が拡大し、そして、容積負荷と神経液性シグナルに応答して、梗塞領域から離れた非梗塞領域の心筋が肥大する。初期には、このことは、壁のストレスを減少するのに役立つが、最終的には、左室が拡張し、左室壁が薄くなり、収縮作用が低下する。前記外科的処置後の早期手術死亡率（２４時間以内）は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスでともにゼロであり、７日以内の死亡率も両者の間に有意な差は認められなかった（ＡＳＫ１ノックアウトマウスが２０％であり、対照ＷＴマウスが１８％であった）。死亡したマウスの全ての例において、心臓の周囲または胸腔を満たす過度の出血があり、左室の破裂が死亡原因であることが認められた。なお、前記外科的処置の１週間後から四週間後までの期間は、マウスは死亡しなかった。心筋梗塞後の左室リモデリングにおける、ＡＳＫ１ノックアウトのインビボにおける生理学的影響を評価した。前記評価のために、心エコー検査法を、前記外科的処置前、前記処置の２週間後、および前記処置の４週間後に、連続的に行った。その結果を下記表２に示し、そのときの経胸壁Ｍ−モード超音波心エコー検査図の一例を図１Ａ中段に示す。同図において、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ−／−）は右欄であり、対照ＷＴマウスは左欄である。また、前記処置４週間後の左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）および左室内径短縮率（ＦＳ）を比較した一例を図１Ｂ上段に示す。同図および下記表２に示すとおり、処置後の左室拡張末期径および収縮末期径は、ともに増加したが、その増加の程度は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ−／−）よりも対照ＷＴマウスが有意に大きかった。また、左室内径短縮率は、ともに減少したが、その減少の程度は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスよりも対照ＷＴマウスが有意に大きかった。偽処置の（左冠動脈を結紮していない）ＡＳＫ１ノックアウトおよび対照ＷＴマウスでは、左室拡張末期径、収縮末期径、および、左室内径短縮率のいずれについても、著しい変化は認められなかった。左冠動脈結紮の４週間後の対照ＷＴマウスの肺重量および肺と体の重量比（肺／体比）は、対照ＷＴマウスがＡＳＫ１ノックアウトマウスよりも有意に大きかった（肺重量は、ＡＳＫ１ノックアウトが、１５３．３±３．３ｍｇであり、対照ＷＴが、２０４．５±１５．３ｍｇであった。また、肺／体比は、ＡＳＫ１ノックアウトが、５．６３±０．２４ｘ１０−３であり、対照ＷＴが、７．６５±０．５３ｘ１０−３であった）。
次に、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスの胸部横行大動脈を緊縛（ＴＡＣ）処置し、圧負荷を生じさせた。圧負荷に応答して、心臓は、順応性の生理的応答を活性化し、心臓肥大という形をとり、壁のストレスを減少させる。ＴＡＣ処置したマウスにおいても、１週間後の時点では、心不全の兆候を示すことなく、機能亢進肥大を示すことが知られている。しかしながら、長期に渡るまたは過度の機械的ストレスへの暴露は、心室や心房の拡張および心機能異常という結果を招く。ＴＡＣ処置による圧負荷後の左室リモデリングにおける、ＡＳＫ１ノックアウトのインビボにおける生理学的影響を評価した。前記評価のために、心エコー検査法を、前記外科的処置前、前記処置の２週間後、および前記処置の４週間後に、連続的に行った。その結果を下記表３に示し、そのときの経胸壁Ｍ−モード超音波心エコー検査図の一例を図１Ａ下段に示す。同図において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスは右欄であり、対照ＷＴマウスは左欄である。また、前記処置４週間後の左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）および左室内径短縮率（ＦＳ）を比較した一例を図１Ｂ下段に示す。同図および下記表３に示すとおり、ＴＡＣ処置１週間後、心臓重量および心臓と体の重量比（心／体重量比）は、ＡＳＫ１ノックアウトおよび対照ＷＴマウスで、ともに同程度増加した。その時点での筋細胞の切断面領域についても、差異は認められなかった（ＡＳＫ１ノックアウトが、４４３±１８μｍ２であり、対照ＷＴが、４４５±１５μｍ２であった）。また、前記処置４週間後では、対照ＷＴマウスの左室拡張末期径が、ＡＳＫ１ノックアウトマウスや偽処置（ＴＡＣ処置をしていない）マウスに比べて著しく増加した。左室内径短縮率も、ＡＳＫ１ノックアウトマウスや偽処置マウスに比べて対照ＷＴマウスにおいて著しく減少した。ＴＡＣ処置４週間後の肺重量および肺／体重量比は、対照ＷＴマウスで著しく増加したが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスでは、増加しなかった。
（組織学的検査）
前記冠動脈結紮処置の４週間後のＡＳＫ１ノックアウトマウスおよび対照ＷＴマウスの心臓について組織学的検査を行った。その結果の一例を図２の中、上段に示す。同図において、右欄がＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓であり、左欄が対照ＷＴマウスの心臓である。また、各欄において、左側が、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色した切片であり、右側が、マッソントリクローム染色した切片であり、バーは、５ｍｍを示す。同図が示すように、前記処置の４週間後の対照ＷＴマウスの心臓は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスのそれと比較して明らかに大きかった。また、同図からは、対照ＷＴマウスでは、虚血性障害から遠隔の領域の一部が線維性の組織に取って代わられたが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスでは、前記遠隔領域は無傷であることが読み取れた。対照ＷＴマウスの心臓の左室の残存部分において、筋肉間および血管周囲に線維形成が認められたが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの前記遠隔領域においても、わずかであるが、我々は、血管周囲の線維形成を観察した。
次に、前記ＴＡＣ処理の４週間後のＡＳＫ１ノックアウトマウスおよび対照ＷＴマウスの心臓について組織学的検査を行った。その結果の一例を図２の下段に示す。同図において、右欄がＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓であり、左欄が対照ＷＴマウスの心臓である。また、各欄において、左側が、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色した切片であり、右側が、マッソントリクローム染色した切片である。同図が示すように、前記処置の４週間後の対照ＷＴマウスの心臓の拡張は明らかだったが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいては、心室や心房の拡張が起こらなかった。また、前記両マウスにおいては、血管周囲の線維形成と同様に、筋肉間の線維形成が、分散して観察され、その線維形成の程度は、前記両マウスの心臓で同様であった。
（機械的ストレス）
心筋リモデリングの主要な刺激は、機械的な過負荷であるため、冠動脈結紮またはＴＡＣ処置後における対照ＷＴおよびＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓にかかる機械的ストレスの程度を評価した。
心筋梗塞モデルでは、残存する心筋に課せられる機械的負荷は、二重積（ｄｏｕｂｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）として推定される。ＬＶ収縮圧も心拍も、冠動脈結紮後１週間では、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとで有意な差は認められなかった（収縮期圧は、ＡＳＫ１ノックアウトが、１１０．２±６．０ｍｍＨｇであって、対照ＷＴが、１０８．２±２．８ｍｍＨｇであった。心拍は、ＡＳＫ１ノックアウトが、５８２±１０／ｍｉｎであって、対照ＷＴが、５５９±２４／ｍｉｎであった）。さらに、梗塞のサイズは、冠動脈結紮直後に調べた両方のマウスにおいて同様であり、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの平均は、５１．３±５．７％であり、対照ＷＴの平均が、４９．１±４．９％であった。したがって、ＡＳＫ１除去による表現型は、側副血行の発達と関係する可能性が低いことが示唆された。
ＴＡＣ処置により産生される機械的ストレスは、ＴＡＣから７日後、狭窄を横切る圧力の傾斜をインビボで測定することで推定できる。その測定の結果、ＴＡＣ処置は２つの頚動脈間の圧力傾斜を著しく増加させたが、ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとで有意な差は認められなかった（ＡＳＫ１ノックアウトが、５５．５±５．７ｍｍＨｇであり、対照ＷＴが、５７．３±４．６ｍｍＨｇであった）。
（左室リモデリングにおけるアポトーシス）
左室リモデリング中に心筋細胞で増加するアポトーシスに対するＡＳＫ１除去の効果を評価した。冠動脈結紮またはＴＡＣ処置後にアポトーシスが誘導された心筋細胞の数えるために、ＴＵＮＥＬアッセイを利用した。ＡＳＫ１ノックアウトマウスと対照ＷＴマウスとで比較した結果の一例を図３に示す。図３Ａのグラフは、冠動脈結紮処置から１週または４週後の境界領域および遠隔領域（左２パネル）、ならびにＴＡＣ処理から１週または４週後の心筋（右パネル）におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の相対数の一例を示す。同図に示すように、冠動脈結紮処置では、１週間および４週間後で、梗塞の境界領域においても、虚血障害の領域から遠隔の心筋においても、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数、すなわち、アポトーシス細胞の数は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいてよりも、対照ＷＴマウスにおいて著しく増加した。また、ＴＡＣ処置後のＴＵＮＥＬ陽性細胞は、左室壁に偏在しており、その数は、ＡＳＫ１ノックアウトマウスよりも、対照ＷＴマウスにおいて著しく増加した。
前記ＴＵＮＥＬ陽性細胞が心筋細胞であることは、三重染色により確認した。その結果の一例を図３Ｂに示す。同図に示すとおり、ＴＵＮＥＬ染色は緑色に見え、抗ａ−サルコメア抗体およびヨウ化プロピジウム染色は赤色に見える。したがって両図を重ねた場合に黄色に見えれば心筋細胞であると確認できる。
（ＡＳＫ１タンパク質の活性化によるアポトーシスの誘導）
ＡＳＫ１タンパク質が、心筋細胞においてアポトーシスを誘導できることを確認するために、新生児の心筋細胞を分離し、恒常的に活性な変異型のＡＳＫ１タンパク質（ＡｄＡＳＫ（ΔＮ））またはβガラクトシダーゼ（ＡｄＬａｃＺ）を発現するアデノウイルスを、細胞あたりのプラーク形成単位が１００の感染多重度で感染させた。その結果を図４に示す。図４Ａは、前記ウイルスを感染させた０日目の生存数に対するパーセントで表した細胞生存率のグラフである。図４Ａに示すとおり、活性変異型のＡＳＫ１タンパク質の過剰発現は、生存細胞数の減少を引き起こした。一方、βガラクトシダーゼを発現させても、生存細胞数の減少は見られなかった。図４Ｂは、前記ウイルス感染４８時間後の細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染色した顕微鏡写真である。図４Ｂに示すとおり、活性変異型のＡＳＫ１タンパク質の過剰発現させてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色すると、様々な程度の凝縮核クロマチンや、断片化した核が観察された。一方、βガラクトシダーゼを発現させても、そのようなことは観察されなかった。また、前記感染多重度を１０にして前記変異型ＡＳＫ１タンパク質を発現させると、心筋細胞は肥大した。
（Ｈ２Ｏ２が誘導するアポトーシスにおけるＡＳＫ１の必要性）
次に、Ｈ２Ｏ２が誘導するアポトーシスにおけるＡＳＫ１の必要性を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ−／−）および対照ＷＴマウスの新生児の心筋細胞を用いて確かめた。前記心筋細胞を、様々な濃度のＨ２Ｏ２とともに２４時間培養し、ＭＭＴアッセイにより生存細胞数を測定し、前記心筋細胞の生存率（％）を求めた。その結果を図４Ｃに示す。図４Ｃに示すとおり、Ｈ２Ｏ２に対する耐性は、ＡＳＫ−／−の心筋細胞のほうが、ＷＴの心筋細胞よりも優れていた。また、前記心筋細胞を１０μＭのＨ２Ｏ２で２４時間処理した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色して顕微鏡観察した写真を図４Ｄに示す。図４Ｄに示すとおり、観察された核の形態から、Ｈ２Ｏ２によりアポトーシスが誘導されたことが確認された。
（冠動脈結紮処置およびＴＡＣ処置後におけるＡＳＫ１タンパク質の活性化）
リモデリング中におけるＡＳＫ１タンパク質の活性を確認した。冠動脈結紮処置後またはＴＡＣ処置後の心臓について、ＡＳＫ１タンパク質の活性を測定した。その結果を図５Ａに示す。図５Ａは、Ｈｉｓ−ＭＫＫ６を基質に使用した免疫複合体アッセイの測定結果であって、上段のパネルが、冠動脈結紮処置の２日および１週間後のＡＳＫ１タンパク質の活性化を示し、下段のパネルが、ＴＡＣ処置の２日および１週間後のＡＳＫ１タンパク質の活性化を示す。前記上段パネルでは、心筋ホモジネートは、処置および未処置のＡＳＫ１ノックアウトマウス、ならびに、未処置、偽処置および処置の２日および１週間後のＷＴマウスより抽出した心筋ホモジネートを使用した。前記下段パネルでは、心筋ホモジネートは、処置の２日および１週間後のＡＳＫ１ノックアウトマウス、ならびに、偽処置および処置の２日および１週間後のＷＴマウスより抽出した心筋ホモジネートを使用した。図５Ａに示すとおり、ＷＴマウスの心臓において、冠動脈結紮処置後およびＴＡＣ処置後にＡＳＫ１タンパク質が著しく活性化されることが確認された。しかしながら、ＡＳＫ１ノックアウトマウスでは、有意なＡＳＫ１の活性化が認められなかった。
また、リモデリング中、ＡＳＫ１タンパク質の下流に存在するＪＮＫやｐ３８の活性を評価するため、各々のリン酸化状態をウエスタンブロット法を用いて測定した。その結果を図５Ｂに示す。図５Ｂは、冠動脈結紮処置後（左側）またはＴＡＣ処置後（右側）の、ＡＳＫ１ノックアウトマウスおよびＷＴマウスの心臓細胞のＪＮＫおよびｐ３８に対するのウエスタンブロットの結果の一例を示す図である。同図に示すとおり、ＷＴマウスの心臓において、冠動脈結紮処置後およびＴＡＣ処置後に、ＪＮＫやｐ３８の活性化が認められた。一方、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの心臓では、ｐ３８の活性化は、ＷＴマウスと同程度に観察されたが、ＪＮＫ活性化は、有意に抑制されていた。従って、リモデリングにおいては、ＪＮＫが、ＡＳＫ１の下流因子として重要な働きを果たしていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
慢性心不全は、先進国では主要な死亡原因の一つである。また、急性冠動脈疾患が、ＣＣＵ（冠動脈疾患集中治療）や冠動脈形成術の発展によって克服されてきていることが、心筋梗塞後の心不全発症を増加させている。さらに、心不全患者は、高血圧症群にも多い。本発明は、例えば、このように非常に大きな需要が見込まれる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の分野や心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法の分野で有用である。
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬。
【請求項２】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、ＡＳＫ１タンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制する化合物を有効成分とする医薬。
【請求項３】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、Ｄａｘｘ、ＴＲＡＦ２、カルモジュリン依存性リン酸化酵素ＩＩ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群から選択される少なくとも１つを阻害する化合物を有効成分とする医薬。
【請求項４】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、心筋細胞におけるＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物、および心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写を阻害する化合物からなる群から選択される少なくとも一種類以上の化合物を有効成分とする医薬。
【請求項５】
前記心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物が、ＡＳＫ１タンパク質のドミナントネガティブ変異体、抗ＡＳＫ１抗体、チオレドキシンからなる群から選択されるの少なくとも一種類である請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記心筋細胞におけるＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物が、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉のためのＲＮＡから選択される少なくとも一種類である請求項４に記載の医薬。
【請求項７】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項８】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質が誘導するアポトーシスの抑制を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性に対する活性阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１０】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１１】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１遺伝子の転写翻訳の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１２】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質を活性化する因子の活性阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記ＡＳＫ１タンパク質を活性化する因子が、Ｄａｘｘ、ＴＲＡＦ２およびカルモジュリン依存性リン酸化酵素ＩＩからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子が、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項１７】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、ＡＳＫ１タンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項１８】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化、および心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写翻訳の少なくとも一つを阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項１９】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、請求項１から６のいずれかに記載の予防および治療の少なくとも一方のための医薬を、薬学上許容される有効量投与すること含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項２０】
心不全の診断方法であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性または自己リン酸化能を測定する工程を含む診断方法。
【請求項１】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬。
【請求項２】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、ＡＳＫ１タンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制する化合物を有効成分とする医薬。
【請求項３】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、Ｄａｘｘ、ＴＲＡＦ２、カルモジュリン依存性リン酸化酵素ＩＩ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群から選択される少なくとも１つを阻害する化合物を有効成分とする医薬。
【請求項４】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、心筋細胞におけるＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物、および心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写を阻害する化合物からなる群から選択される少なくとも一種類以上の化合物を有効成分とする医薬。
【請求項５】
前記心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物が、ＡＳＫ１タンパク質のドミナントネガティブ変異体、抗ＡＳＫ１抗体、チオレドキシンからなる群から選択されるの少なくとも一種類である請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記心筋細胞におけるＡＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する化合物が、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉のためのＲＮＡから選択される少なくとも一種類である請求項４に記載の医薬。
【請求項７】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項８】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質が誘導するアポトーシスの抑制を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性に対する活性阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１０】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１１】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１遺伝子の転写翻訳の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１２】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質を活性化する因子の活性阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記ＡＳＫ１タンパク質を活性化する因子が、Ｄａｘｘ、ＴＲＡＦ２およびカルモジュリン依存性リン酸化酵素ＩＩからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法であって、ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記ＡＳＫ１タンパク質により活性化される因子が、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の機能発現を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項１７】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、ＡＳＫ１タンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項１８】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質の自己リン酸化、および心筋細胞におけるＡＳＫ１遺伝子の転写翻訳の少なくとも一つを阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項１９】
心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、請求項１から６のいずれかに記載の予防および治療の少なくとも一方のための医薬を、薬学上許容される有効量投与すること含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
【請求項２０】
心不全の診断方法であって、心筋細胞におけるＡＳＫ１タンパク質のキナーゼ活性または自己リン酸化能を測定する工程を含む診断方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００９４７０
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２１２３（Ｐ２００５−５１２１２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１１２４
【国際出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１１２４
【国際出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]