ＣＮＳ疾患の治療のためのＴＧＦ−Ｒシグナリングのインヒビター
本発明は、疾患の予防または治療のための薬学的組成物の調製のためのオリゴヌクレオチドの使用に関し、ここで、神経発生および／または神経再生、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、レーヴィ体痴呆、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳萎縮症、クロイツフェルトヤコブ病、前頭側頭型痴呆、ピック病、エイズ痴呆複合症、血管性痴呆、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、多発性萎縮症、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、卒中、脳外傷および脊髄損傷、色素性網膜炎、黄斑変性、緑内障、蝸牛変性、うつ病、精神分裂病、多発性硬化症、および発育性神経変性のような疾患が有用な効果を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の予防または治療のための薬学的組成物の調製のためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。ここで、神経発生および／または神経再生は、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性萎縮症、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、レーヴィ体痴呆、筋萎縮性側索硬化症およびその他の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳萎縮症、クロイツフェルトヤコブ病およびその他の重症のプリオン疾患、前頭側頭型痴呆、ピック病、エイズ痴呆複合症、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病のような神経変性疾患、血管性痴呆、卒中、脳外傷および脊髄損傷、色素性網膜炎、黄斑変性、緑内障、うつ病および精神分裂病のような脳血管疾患、およびダウン症候群のような発達障害は、有用な効果を有する。
【背景技術】
【０００２】
多くの重篤な神経変性疾患は、現在社会で厳しい社会経済的な影響を有し、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群のような痴呆を伴う発達障害、パーキンソン病、レーヴィ体痴呆、前頭側頭型痴呆、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳萎縮症、クロイツフェルトヤコブ病、エイズ痴呆複合症、血管性痴呆、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、多発性萎縮症、ハンチントン病、卒中、脳外傷、色素性網膜炎、黄斑変性、緑内障、うつ病、精神分裂病、および多発性硬化症のような疾患がある。共通の病態生理学的原因は、遺伝的、後成的、または後天的な欠損が見られ、しばしば細胞破壊片の凝集形成または蓄積が生じ、結局、進行性機能障害を導き、そして最終的に、神経細胞およびグリア細胞の死ならびに構造の崩壊に至ることに見られる。ミクログリア細胞および血管周囲の休眠マクロファージが誘引および活性化されて、細胞破壊片および組織破壊片を取り除こうと試みる。これは、クロイツフェルトヤコブ病では、非常に短い期間に起こり得、または例えば、パーキンソン病または多発性硬化症では、数十年にわたり起こり得る。活性化されたミクログリア細胞／マクロファージ細胞集団は、多くの炎症性サイトカインを細胞外マトリックスに放出して、これらを小静脈またはＣＳＦ腔のいずれかに排出する。不運にも、上述のこれらの疾患の臨床経過に有利な効果を有し得る神経発生および神経再生は（個々の具体的な病態生理学的メカニズムにもかかわらず）、現在のところ未知のメカニズムによって抑制されている。したがって、本発明の根底にある技術的問題は、神経発生および神経再生の抑制を阻害することによって、神経変性疾患または少なくとも該疾患に関連する症状の治療または予防に適切な手段を提供することである。
【０００３】
上記技術的問題の解決は、請求項で特徴付けられる実施態様の提供によって達成される。タンパク質のＴＧＦ−βファミリー、すなわち特異的な細胞表面レセプターＴＧＦ−ＲＩ、ＴＧＦ−ＲＩＩ、ＴＧＦ−ＲＩＩＩを有するＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は、胚のおよび主に間葉／神経外胚葉の器官発達のいくつかの重大な局面に作用することが知られている。それらは、胚幹細胞をニューロン前駆細胞に分化させ、そして傷ついた成熟ニューロンに対して神経保護的である。さらに、それらは、造血幹細胞分化に重大な影響を有し、増殖および分化も制御することが知られている。本発明に導く実験の過程で、ＴＧＦ−Ｒ（すなわち、ＴＧＦ−ＲＩおよびＴＧＦ−ＲＩＩ）が、神経発生および神経再生の抑制に関連する重要な要因であり、したがって、このＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性を妨害し得る化合物が、神経変性疾患および／または炎症性神経疾患の治療／予防のために有用であることがわかった。
【発明の開示】
【０００４】
要約すると、本発明に導く実験の結果としては、以下の通りである：
１．個々の成分は当然知られているけれども（ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−ＲＩＩ、脳脊髄液コンパートメント、硝子体液、内リンパ液、ニューロン前駆細胞など）、生理学的な調節回路は、前駆細胞／幹細胞による効果的なＣＮＳ再生のレベルを明らかにすることが認識されている。この回路は、心室壁で発現される重要な標的分子ＴＧＦ−ＲＩＩを有し、ＣＮＳ病理学の大部分において消滅した神経再生に原因がある。
２．興味深いことに、調節は、血液、リンパ管、細胞外マトリックスを介してではなく液体コンパートメント（脳脊髄液など）を介して起こり、その液体コンパートメントは、神経細胞およびそれらの前駆細胞または幹細胞に直接接触する。
３．ニューロンの／乏突起神経膠のまたは星状細胞の再生のための生理学的阻害回路は、ＣＮＳ内の損傷を修復する方策のための理想的な標的であるとして発見され、圧倒的に、神経系においてほとんどすべての破壊性の病状に適用され得る。ＴＧＦ−βについてのこれまでの知識から、ＴＧＦ−βの機能を減少させるよりもむしろ増加させようと試みされており（５を参照のこと）、そのためＣＮＳにおいて公知の神経保護または免疫抑制の活性を増強する：ここで、本発明者らは、心室壁でＴＧＦ−ＲＩＩシグナリングをブロックすることによって、幹細胞再生に対するその阻害機能を減少させると仮定する。
４．炎症過程が神経変性に重要な役割を果たし、および比較的大量の臨床前および臨床データがこの考えを支持すると思われると長期間にわたり推測されていたが、主回路は、現在、開示されており、それは、すべての単一の調節副回路、例えば、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２）などを組み合わせる。
５．さらに、自然（Ｎａｔｕｒｅ）に神経保護が設置され、そして神経再生に優先してＣＮＳに免疫特権が与えられることに留意し得る。今のところ、免疫特権が与えられおよび高度に保護されたＣＮＳ（免疫攻撃および神経アポトーシスに対して特異的に保護される）は、ＴＧＦ−βシステムのために重要な部分であり、これが、正確な免疫特権および同一のＴＧＦ−β分子のため神経再生に欠損を有することは示されていない。進化の概念は、非常に精巧なＣＮＳの急激な神経保護およびその最も複雑な機能性を支持して主張するように思われる。この意味で、個々の神経再生は、個人の神経保護よりも進化には重要ではないと思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（調節回路）
生理学的な脳の神経発生により、機能不全のまたは老化している神経細胞、乏突起神経膠細胞または星状細胞が、それぞれの前駆細胞によって継続的に修復／置換される。脳での修復のための神経発生は、ＴＧＦ−β−ＴＧＦ−Ｒ系（特にＴＧＦ−ＲＩＩだけでなく、ＴＧＦ−ＲＩもまた）によって、脳脊髄液を介して調節される。主な組み合わせは、ＴＧＦ−βを産生しそしてＣＳＦ（および硝子体、内リンパ）コンパートメント内へ細胞外腔を介してこれを分泌するミクログリア／マクロファージ系統細胞、および表面構造上に高度に発現されたＴＧＦ−ＲＩＩまたはＴＧＦ−ＲＩ、または同一のレセプターを有する上衣裏層を通じて、ＣＳＦを介して（および硝子体、内リンパへ）、このシグナルを受ける神経前駆細胞／幹細胞である。多くのＣＮＳ病理では、神経発生は、重度に障害されまたは機能不全になる。神経発生の調節は、通常、任意の特定の疾患の病理の状況において起こるＣＮＳのミクログリア細胞／マクロファージの活性化によって調節、通常は抑制される。このルート（ＣＳＦから副脳室領域／その他の神経性の領域へ）によって活性化されたミクログリア細胞／マクロファージは、神経変性性、急性および慢性、炎症性、低酸素性、アテローム性動脈硬化性または加齢性の脳の柔組織の再生を抑制する。ニューロンの分化が影響されるだけではなく、乏突起神経膠細胞および星状細胞系も影響される。ニューロンの／乏突起神経膠の／星状細胞の再生を改善するために、この回路を妨害するすべての分子は、治療として請求されている。この回路を使用するＣＮＳ病理の診断、予防処置、予防、または予後のための方法はまた、治療処置の効果をモニタリングするために、考えられるところでは非常に重要である。
【０００６】
上記の疾患では、ミクログリア細胞、および潜在的には血管周囲の休眠マクロファージは、タンパク質凝集体、細胞破壊片、炎症、アテローム性動脈硬化における炎症性応答、または急性の外傷／低酸素性に関連する細胞死から誘引される。これは、急性、亜急性、または慢性の過程であり得る。活性化過程の間、活性化されたミクログリア細胞集団（血管壁由来またはその他の由来のマクロファージを含む）は、大量の炎症性サイトカインを細胞外マトリックスに放出し、小静脈または直接的にＣＳＦ腔のいずれかに流出する。これらのサイトカインは、ＣＳＦコンパートメントに達し、直ちにすべての場所で利用され、そしてＣＳＦによっていくらかの範囲まで取り囲まれる。これらのサイトカインの中では、ＴＧＦ−βである。神経炎症が神経発生を阻害すること、およびインドメタシン（一般的な非ステロイド系の抗炎症薬）での炎症の阻害が、内毒素で誘導された炎症後に神経発生を回復し、そして頭蓋照射後に神経発生が増加することが示された（Monje, M. L., H. Todaら、(2003).「Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis.」Science 302 (5651):1760-1765）。
【０００７】
しかし、従来技術は、ＴＧＦ−βを、損傷後あるいは病理学的状態下で神経発生および神経修復をダウンレギュレートする主なレギュレーターとして開示していない。対照的に、従来技術は、ＴＧＦ−βを、損傷したニューロンまたは障害のあるニューロンの細胞死を妨げる神経保護剤として考え、ＣＮＳ疾患状態でＴＧＦ−βをアップレギュレートしようと試みた。
【０００８】
Zhangら（Zhang, J. M., R. Hoffmannら、(1997).「Mitogenic and antiproliferative signals for neural crest cells and the neurogenic action of TGF-beta1.」Dev. Dyn. 208(3):375-386.）は、ＴＧＦ−βがウズラの神経冠細胞の発生に効果を有することを示す。ここで、ＴＧＦ−βは、多分化能性神経冠細胞（および／またはそれらの直接の誘導体）および単分化能メラニン形成細胞の両方の増殖を阻害し、コロニーの大きさを減少させる。さらに、本発明とは対照的に、神経発生は、ＴＧＦ−βの存在下で顕著に増加した。アドレナリン細胞および感覚ニューロン前駆体の両方のコロニーあたりの数は、ＴＧＦ−β処理された神経芽細胞陽性コロニーで増加した。
【０００９】
ＴＧＦ−βは、細胞の成長および分化、器官発生、マトリックス形成、傷の修復、および免疫機能において重要な役割を有する。ＴＧＦ−βは、多くの細胞タイプに対して強力な成長阻害物質であるけれども、線維芽細胞および骨芽細胞の増殖を刺激する。これはまた、線維芽細胞および骨芽細胞による細胞外マトリックス産生の強力な刺激物質でもあり、マトリックス分解を阻害し、そしてマトリックス相互作用のためにレセプターをアップレギュレートする。ＴＧＦ−β１は、肝臓線維症の病因における主要な要因として、ならびに免疫系および腎臓におけるシクロスポリンＡの有益および有害な両方の効果の重要なメディエータの少なくとも１つとして関与している。さらに、ヒトおよび実験モデルにおける、種々の慢性の進行性線維症の腎臓疾患は、ＴＧＦ−β系の刺激に関連することが示されている。
【００１０】
ＴＧＦ−β１は、Ｇ１およびＧ２サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリンを、キナーゼ活性およびタンパク質の量の両方でダウンレギュレートする。ＴＧＦ−β１はまた、ヒト骨髄性白血病細胞中の多数のセリンおよびスレオニン残基に対する網膜芽腫サプレッサー遺伝子ｐＲｂの産生物のリン酸化を阻害する。十分にリン酸化されていないｐＲｂは、Ｇ１相で転写因子Ｅ２Ｆ−４に関連するが、リン酸化されたｐＲｂは、主にＥ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−３と結合する。ＴＧＦ−β１は、ｐ１３０（ｐＲｂファミリーメンバー）／Ｅ２Ｆ−４複合体形成をアップレギュレートし、そしてｐ１０７（ｐＲｂファミリーメンバー）／Ｅ２Ｆ−４複合体形成をダウンレギュレートしてＥ２Ｆ−４レベルを一定に保持するので、これらの結果は、細胞が細胞周期を逸脱しＧ１中に引き止められると、ＴＧＦ−β１の作用によって、Ｅ２Ｆ−４がｐ１０７からｐＲｂおよびｐ１３０に転換されることを示唆する。「ｃｄｋインヒビター」ｐ２７は、ＴＧＦ−β１に媒介された細胞周期制御の正および負の両方のレギュレーターである。ＴＧＦ−β１は、正常な原始造血幹細胞の選択されたインヒビターであることが報告されているが、ＴＧＦ−βは、原始およびより分化した骨髄性白血病細胞株の両方ともを阻害する。ＴＧＦ−β１の神経保護活性、神経発達におけるその役割、および免疫応答を調節するその役割に多くの関心が寄せられる。ＴＧＦ−β１は、インビトロおよびインビボでの神経保護することが多くの研究で示されている。アゴニスト研究は、ＴＧＦ−β１が中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の後の神経細胞死および梗塞の大きさを減少させることを示すが、逆に、アンタゴニスト研究は、ＭＣＡＯ後に神経細胞死および梗塞の大きさを増加させることを示しており、これはＴＧＦ−β１が、大脳虚血において神経保護の役割を有することを示唆している。マウスにおけるインビボでのＴＧＦ−β１のアデノウイルスに媒介された過剰発現についての最近の研究は、さらに、大脳虚血においてＴＧＦ−β１が神経保護の役割に関連し、これは、神経細胞死、梗塞の大きさ、および神経学的結果の減少によって明らかである。さらに、多くのインビトロでの研究は、ラット、マウス、ニワトリ、およびヒトを含む様々な種由来のニューロンにおけるＴＧＦ−β１の神経保護の能力を示している。非常に興味深いことに、ＴＧＦ−β１は、広範な死誘導薬剤／損傷（低酸素性／虚血、グルタミン酸興奮毒性、β−アミロイド、酸化的損傷、およびヒト免疫不全ウイルスを含む）に対して保護することが示された。ＴＧＦ−β１の神経保護効果は、ミトコンドリア膜ポテンシャルを維持する能力、Ｃａ２＋ホメオスタシスを安定化する能力、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ１の発現を増加させる能力、カスパーゼ３活性化を阻害する能力、およびプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１を誘導する能力に関連している。胚幹細胞の研究は、ＴＧＦ−β関連シグナリングによって負に調節される神経系統の詳細の構成要素として原始神経幹細胞を示している。もう１つのＴＧＦファミリーのメンバーであるＴＧＦ−αの内因性の発現は、成体の神経発生を正に調節することを示している。ＴＧＦ−αは、上衣下に存在する祖先細胞の十分な増殖および嗅球に移動する神経前駆体の十分な産生のために必要である。ＴＧＦ−αノックアウトマウスでは、これらの祖先細胞の増殖もまた、おそらく細胞周期の延長のため、加齢とともに減少する。老化現象または内因性ＴＧＦ−αの不在は、インビトロで上皮増殖因子の存在下において、単離される神経幹細胞の数に影響を与えない。
【００１１】
ヒトにおける免疫修飾のためのＴＧＦ−βの使用は、その毒性（マトリックス産生の過度の刺激を含む）、腎毒性、およびその他の有害な影響によって厳しく制限される。ＴＧＦ−βは、腫瘍形成の可能性を有し、そして糸球体症、肺線維症、硬皮症、および慢性的な移植片対宿主病に関与している。さらに、ＴＧＦ−βは、極めて強力な免疫抑制性のサイトカインであるが、証拠のいくつかの系統は、疾患に関連するかまたはトランスジェニック動物モデルにおけるかの両方のＴＧＦ−β発現の慢性的な刺激が、自己免疫炎症に逆説的に導き得るかまたは増強し得ることを示す。
【００１２】
Ｔ細胞免疫応答の負のレギュレーターとしてＴＧＦ−βの強力な抗炎症特性は、種々のＣＮＳ病理の病態生理学において重要な役割を果たすという証拠が増加している。したがって、このサイトカインは、損傷に関連するペプチドおよび治療介入のための可能性のある標的とみなされる。神経炎症およびミクログリア病理は、多くの神経学的疾患と関連する。ここで、最も古典的な疾患は、明らかに多発性硬化症のような神経免疫学的疾患である。しかし、これはまた、例えば、アルツハイマー病、レーヴィ体痴呆、エイズ痴呆複合症、血管性痴呆のような記憶喪失を顕著に特徴とする、または例えば、ピック病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、およびクロイツフェルトヤコブ病のような記憶喪失をあまり顕著に特徴としない認知の疾患も含む。さらに、炎症プログラムは、卒中、脳外傷、および脊髄損傷のような急性の傷害の後、活性化される。クロイツフェルトヤコブ病の異なる動物モデルでは、ミクログリアの活性化およびＴＧＦ−β１のアップレギュレーションが報告されている（Baker, C. A., Z. Y. Luら、(1999).「Microglial activation varies in different models of Creutzfeldt-Jakob disease.」J Virol 73(6):5089-5097）。
【００１３】
数百もの異なる神経変性疾患の中で、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症を含む一握りにしか注意が向けられていない。同様の神経変性の過程が、脳の異なる領域に影響を与え得、所定の疾患を徴候の観点から非常に異なるように見せているということを述べる価値がある。中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性疾患は、大脳皮質の疾患（アルツハイマー病）、大脳基底核の疾患（パーキンソン病）、脳幹および小脳の疾患、または脊髄の疾患（筋萎縮性側索硬化症）に分類され得る。
【００１４】
例えば、神経変性および神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（Multisystem Atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性髄膜脳炎、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、急性虚血／低酸素性障害、ＣＮＳ外傷、頭部外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病、白質病変、網膜変性、蝸牛変性、黄斑変性、迷路性難聴、ＡＩＤＳ関連痴呆、色素性網膜炎、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）がある。
【００１５】
（ＴＧＦ−β１のレベルへの影響）
（ＴＧＦ−β１のアップレギュレーションおよびその効果）
多くの研究は、神経保護または免疫調節の目的のためにＴＧＦ−β１のレベルを増加させようと試みた。アゴニスト研究は、ＴＧＦ−β１が中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の後の神経細胞死および梗塞の大きさを減少させることを示すが、逆に、アンタゴニスト研究は、ＭＣＡＯ後に神経細胞死および梗塞の大きさを増加させることを示しており、これはＴＧＦ−β１が、大脳虚血において神経保護の役割を有することを示唆している。マウスにおけるインビボでのＴＧＦ−β１のアデノウイルスに媒介された過剰発現についての最近の研究は、さらに、大脳虚血においてＴＧＦ−β１が神経保護の役割に関連し、これは、神経細胞死、梗塞の大きさ、および神経学的結果の減少によって明らかである。さらに、多くのインビトロでの研究は、ラット、マウス、ニワトリ、およびヒトを含む様々な種由来のニューロンにおけるＴＧＦ−β１の神経保護の能力を示している。非常に興味深いことには、ＴＧＦ−β１は、広範な死誘導薬剤／損傷（低酸素性／虚血、グルタミン酸興奮毒性、β−アミロイド、酸化的損傷、およびヒト免疫不全ウイルスを含む）に対して保護することが示された。ＴＧＦ−β１の神経保護効果は、ミトコンドリア膜ポテンシャルを維持する能力、Ｃａ２＋ホメオスタシスを安定化する能力、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ１の発現を増加させる能力、カスパーゼ３活性化を阻害する能力、およびプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１を誘導する能力に関連している。
【００１６】
ヒトにおける免疫修飾のためのＴＧＦ−βの使用は、その毒性（マトリックス産生の過度の刺激を含む）、腎毒性、およびその他の有害な影響によって厳しく制限される。ＴＧＦ−βは、腫瘍形成の可能性を有し、そして糸球体症、肺線維症、硬皮症、および慢性的な移植片対宿主病に関与している。さらに、ＴＧＦ−βは、極めて強力な免疫抑制性のサイトカインであるが、証拠のいくつかの系統は、疾患に関連するかまたはトランスジェニック動物モデルにおけるかの両方のＴＧＦ−β発現の慢性的な刺激が、自己免疫炎症に逆説的に導き得るかまたは増強し得ることを示す。
【００１７】
本発明者らの主な所見は、上記ＣＮＳにおける保護効果について記載されている同一のＴＧＦ−βが、生理学およびほとんどすべてのＣＮＳの病理学においてＣＮＳ幹細胞修復の主な負の調節分子であることである。ミクログリア細胞によって（疾患に対する応答において低い生理学的なレベルまたは高いレベルのいずれかで）産生されるＴＧＦ−βは、細胞間マトリックスを介してＣＳＦ中へ漏出する。そこで、上衣下の祖先を含む細胞層領域または潜在的なその他のＣＮＳ幹細胞再生の領域で、ＣＮＳの前駆細胞集団／幹細胞集団において非常に調節および発現されるＴＧＦ−ＲＩＩおよびＴＧＦ−ＲＩと、自由におよび直接的に相互作用し得る。この所見は、負の調節からなり、逆に、高いＣＳＦ−ＴＧＦ−βレベルの場合に低い幹細胞再生を生じる。普通でなく意外なことに、ＴＧＦ−ＲＩＩの極端に高い発現レベルおよび活性は、本発明者らのＳＶＺまたは海馬の実験では、前駆細胞／幹細胞増殖の部位にある。例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）のような緩衝液を介したシグナルの伝達もまた、普通ではない。したがって、完全な調節回路であり、そこでは、生理学的および病理学的な調節が非常に類似しているが、強度によってのみ変化する（すなわち、ＣＳＦ中のＴＧＦ−βのレベル、および標的細胞でのＴＧＦ−Ｒ発現のレベル）。個々の疾患の病理学的表現型は、遺伝学的な欠損（例えば、シヌクレイノパチー、スーパーオキサイドジスムターゼ変異、トリヌクレオチド反復疾患）または外傷、低酸素性、血管疾患または炎症、またはＣＮＳの老化のような多様な変化によって特徴付けられる。しかし、疾患病理学の執行者は、常にミクログリア細胞／マクロファージ集団が産生したＴＧＦ−βである。一方では、それは、神経保護および免疫抑制であり、潜在的に疾患病理学によって与えられる柔組織への急性炎症性損傷および神経損失を減少させることを助ける。間接的には、ヤヌス頭のように、同一の分子は、前駆細胞または幹細胞レベルで、ＴＧＦ−β−ＴＧＦ−Ｒループを妨げることによって、自身の幹細胞／前駆細胞によるＣＮＳの損傷修復を妨げ、それによって幹細胞の増殖を顕著に抑制する。この場合、幹細胞としては、ＣＮＳ内からの前駆細胞に由来する細胞のみが見られるだけではなく、おそらく、それらの幹細胞／前駆細胞もまた、骨髄のそれぞれの血管からＣＮＳ柔組織に浸入しようと試みる。これはまた、柔組織中のＴＧＦ−βレベルが単に減少することによって、ＣＮＳにおける神経保護／免疫抑制効果が、炎症および／または直接的な神経のアポトーシスによる重篤な急性損傷を導くことを廃止することを意味する。
【００１８】
したがって、ＴＧＦ−Ｒレベルでの局所的な介入は、修復のための安定な介入への唯一の魅力的な経路であるように思われ、脳へのＴＧＦ−βの有用な効果を危険にさらさない。したがって、本発明は、ＴＧＦ−Ｒを発現する前駆細胞／幹細胞プールにおけるＴＧＦ−β１の生物学的活性を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。このオリゴヌクレオチドまたはこのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む薬学的組成物は、疾患の診断／予防処置／予防または治療に有用であり、ここで、神経発生または神経再生に、有用な効果を有する。それらはまた、治療的予防（例えば、卒中または頭部損傷の後）において、これ以下に記載されるメカニズムが効果的である前に、本発明者らの実験に示されるように、有用である。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「妨害する」は、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性またはその発現を調節すること、好ましくは減少させることまたは消失させることを意味する。生物学的活性の調節は、直接的相互作用、すなわち、ＴＧＦ−Ｒ、好ましくはＴＧＦ−ＲＩＩへの化合物の結合によって、あるいは間接的な相互作用、例えば、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性に関連する化合物との相互作用によって、引き起こされ得る。局所的または全身的な移植のすべてのタイプ（例えば、エクスビボ増殖、同種異系細胞）を含む、ＣＮＳでの神経再生を改善する目的または神経／造血幹細胞もしくは前駆細胞を増加させる目的で、この調節回路を妨害するためのＴＧＦ−βＲＩ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、またはそのシグナル伝達をターゲティングする薬剤として作用する適切な化合物を、以下に列挙する。
【００２０】
（ａ）プラスミド、ベクターまたは天然の／合成の／突然変異したウイルス、種々の改変型のオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ、ＬＮＡ、２’Ｆ−ＡＮＡ、タンパク質−ヌクレオチド複合体、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたはマイクロｍｉＲＮＡ、メチルメトキシ、ホスホロアミデート、ＰＮＡ、モルホリノ、ホスホラミデート、シクロヘキセン（ＣｅＮＡ）、ギャップマー（gap-mere）、リボザイム、アプタマー、ＣｐＧオリゴ、ＤＮＡザイム、リボスイッチ、または脂質もしくは脂質含有分子）、
（ｂ）リンカーのすべてのタイプを含むペプチド、ペプチド複合体、
（ｃ）低分子、ラフト（raft）またはカベオリ（caveoli）改変剤、
（ｄ）ゴルジ体の改変剤、
（ｅ）抗体およびそれらの誘導体、特にキメラ、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント、または
（ｆ）キャリア、リポソーム、ナノ粒子、複合体、または上述の構成物を含む任意のその他の送達システム
が、上述の回路を標的とするために用いられ得、そのため神経再生が回復または改善される。
【００２１】
しかし、上述の薬剤の中で、アンチセンスオリゴヌクレオチドが最も好ましい。なぜなら、それらは、非常に早い段階でＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの形成を妨害するからである。これらの分子の主な利点は、それらの極端に良好な全身的および局所的な耐性と組み合わせた、極端に高い標的特異性にある。それらは、柔組織またはＣＳＦ腔のいずれかへのＣＮＳへの局所的な適用に、非常によく適している。さらに、それらは非常に安定であり、したがって、移植されたポンプシステムから容易に適用され得る。その費用効果もまた注目すべきである。
【００２２】
したがって、本発明の好ましい実施態様では、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードしている遺伝子の発現を妨害するために有用な化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成は、アンチセンス相互作用のためのＴＧＦ−Ｒ遺伝子またはＴＧＦ−ＲＩＩ遺伝子内の部位の決定を含み、そのため所望の効果（例えば、タンパク質の発現の阻害）が生じる。好ましい遺伝子内の部位は、（ａ）遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または翻訳終止コドンを含む領域または（ｂ）「ループ」または「バルジ」であり、すなわち二次構造の部分ではないｍＲＮＡの領域である。一旦、１またはそれ以上の標的部位が同定されると、標的に十分に相補的な（すなわち、十分にハイブリダイズし、そして十分な特異性を有する）オリゴヌクレオチドが選択されて、所望の効果を与える。
【００２４】
したがって、本発明は、８から５０個の核酸塩基を含む配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその模倣物に関する。該オリゴヌクレオチドは、８から５０個の核酸塩基を有する配列番号１または配列番号２または配列番号９４〜９６の一部を示す。さらに、８から５０個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２または配列番号９４〜９６の正確な部分配列である必要はない。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６に見られる部分配列と少なくとも８０％、好ましくは８４％、より好ましくは８８％、そして最も好ましくは９２％同一であれば、十分である。好ましいオリゴヌクレオチドは、８から５０個の核酸塩基を含む配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、該配列は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域、あるいはＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と十分にハイブリダイズし得、該ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩが「ループ」または「バルジ」であり、そして二次構造の部分ではない。これは、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子の対応する領域と少なくとも８０％の相補的な配列を有するか、または好ましくは（ａ）ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域と、または（ｂ）「ループ」または「バルジ」であり、すなわち二次構造の部分ではないＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と、少なくとも８０％相補的な配列を有することを意味する。
【００２５】
８から５０個の核酸塩基、好ましくは１５から２５個の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましく、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域と、あるいはＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と、十分にハイブリダイズし得、該ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩが「ループ」または「バルジ」であり、そして二次構造の部分ではない。
【００２６】
好ましくは、以下の配列番号３の延長された配列であり、これは以下の一般式によって表され得る：
５’−ＸＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＺ−３’
【００２７】
ここでＸは、以下のオリゴヌクレオチドを含む群から選択される。
ＡＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＴＧＡＧ、ＣＴＧＡＧ、ＴＧＡＧ、ＧＡＧ、ＡＧ、Ｇ、
【００２８】
そして、Ｚは、以下のオリゴヌクレオチドを含む群から選択される。
ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣ、ＧＣＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡ、ＧＣ、Ｇ、
【００２９】
そして、ＸおよびＺはともに、３４個以下の核酸塩基およびその模倣物を含む。
【００３０】
より好ましくは、以下のオリゴヌクレオチド配列およびその変異体または模倣物である。
配列番号３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４：５’−ＧＣＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡ−３’
配列番号５：５’−ＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＧＴ−３’
配列番号６：５’−ＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴ−３’
配列番号７：５’−ＧＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡ−３’
配列番号８：５’−ＧＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＴ−３’
配列番号９：５’−ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡ−３’
配列番号１０：５’−ＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧ−３’
配列番号１１：５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴＧ−３’
配列番号１２：５’−ＧＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡ−３’
配列番号１３：５’−ＴＡＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＧ−３’
配列番号１４：５’−ＴＴＴＴＧＡＡＡＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣ−３’
配列番号１５：５’−ＴＣＡＧＣＣＡＧＴＡＴＴＧＴＴＴＣＣＣＣ−３’
配列番号１６：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＴＡＧ−３’
配列番号１７：５’−ＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＡ−３’
配列番号１８：５’−ＴＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＡＧＧＧＡＧＣＣＧ−３’
配列番号１９：５’−ＴＡＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＡＧＧＧ−３’
配列番号２０：５’−ＡＧＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’
配列番号２１：５’−ＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣ−３’
配列番号２２：５’−ＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣ−３’
配列番号２３：５’−ＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＧ−３’
配列番号２４：５’−ＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧ−３’
配列番号２５：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧ−３’
配列番号２６：５’−ＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＧＧＣＡＣＡ−３’
配列番号２７：５’−ＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴ−３’
配列番号２８：５’−ＣＣＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴ−３’
配列番号２９：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣ−３’
配列番号３０：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣ−３’
配列番号３１：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’
配列番号３２：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号３３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号３４：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号３５：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号３６：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号３７：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣ−３’
配列番号３８：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’
配列番号３９：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号４０：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号４１：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４２：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号４３：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４４：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４５：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’
配列番号４６：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号４７：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号４８：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４９：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５０：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５１：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５２：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号５３：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号５４：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号５５：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５６：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５７：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５８：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号５９：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号６０：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号６１：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号６２：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６３：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号６４：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号６５：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号６６：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６７：５’−ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号６８：５’−ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号６９：５’−ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７０：５’−ＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号７１：５’−ＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７２：５’−ＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
【００３１】
さらにより好ましくは、以下のオリゴヌクレオチド配列およびその変異体および模倣物である。
配列番号３３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号３４：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号３５：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号３６：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４１：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４２：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号４３：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４４：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４９：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５０：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５１：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５６：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５７：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６２：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７３：５’−ＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣ−３’
配列番号７４：５’−ＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣ−３’
配列番号７５：５’−ＡＡＣＧＧＣＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴ−３’
配列番号７６：５’−ＡＡＣＡＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣ−３’
配列番号７７：５’−ＡＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＴ−３’
配列番号７８：５’−ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡ−３’
配列番号７９：５’−ＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴ−３’
配列番号８０：５’−ＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣ−３’
配列番号８１：５’−ＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡ−３’
配列番号８２：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号８３：５’−ＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’
配列番号８４：５’−ＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴ−３’
配列番号８５：５’−ＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣ−３’
配列番号８６：５’−ＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡ−３’
配列番号８７：５’−ＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴ−３’
配列番号８８：５’−ＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣ−３’
配列番号８９：５’−ＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧ−３’
配列番号９０：５’−ＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧ−３’
配列番号９１：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号９２：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＴＴＧＣ−３’
配列番号９３：５’−ＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧ−３’
【００３２】
本発明の請求の範囲から外れるのは、次の２つの公知の配列である：５’−ＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣ−３’（J. Clin. Endocrinology & Metabolism 2003, 88(10), 4967-4976）および５’−ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＴＣ−３’（Developmental Biology 1996, 180, 242-257）。
【００３３】
特に好ましくは、配列番号３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’の配列である。
【００３４】
したがって、本発明はまた、配列番号３〜配列番号９３のいずれかと密接に関連する配列に関する。該配列は、本明細書において「変異体」という。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの異なる方法によって改変され得る。骨格内での改変が可能であり、そしてヌクレオシド間の骨格においてリン原子が部分的にまたは完全に他の原子に置換されたオリゴヌクレオチドをいう。好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸エステルを含むメチル、エチルおよびＣ３〜Ｃ１０アルキルホスホン酸エステルおよびキラルのホスホン酸エステル、ホスフィン酸エステル、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホン酸エステル、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合、２’−５’結合したその類似体を有するボラノリン酸エステル、およびこれらの反転された極性を有するものが挙げられる。ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’結合される。これらの種々の塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
【００３５】
３’末端および／または５’末端に、１、２、３、４、または５個のさらなる核酸塩基が付加された配列番号３〜配列番号９３の変異体もまた好ましい。このようなさらなる核酸塩基は、好ましくは配列番号１、２、９４、９５、または９６内の５個の核酸塩基であり、それらは、それぞれの配列の前後に直接にくる。さらに、この好ましい変異体は、１、２、３、または４個の核酸塩基置換を有し得、すなわち、この好ましい変異体の内部で、１、２、３、または４個のヌクレオチドが、別の核酸塩基によって置換され得る。これらの変異体はまた、本明細書に開示されている骨格または塩基または糖部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）の改変のいずれかも含み得ることが強調されるべきである。
【００３６】
リン原子を含まない好ましい改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有する骨格；シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格、上述の骨格タイプの混合および混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびＣＨ２構成部分を有するその他の骨格を含む。
【００３７】
本発明のさらに好ましい実施態様は、ホスホロチオエート骨格またはヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドを含み、そして特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、天然のホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される）を有するオリゴヌクレオチドを含む。骨格中にモルホリノ部分を有するオリゴヌクレオチドまたはモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドまたはアミノアルキルアミド骨格を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい（下記を参照のこと）。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖の模倣物を有し得る。
【００３８】
【化１】
【００３９】
Ｂとは、プリンまたはピリミジン基のような塩基部分をいい、さらに誘導化され得る。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つの改変は、オリゴヌクレオチドに１つまたはそれ以上の部分または結合体を化学結合することを含み、そしてそれはオリゴヌクレオチドの活性を高め、細胞分布または細胞への取り込みを増強する。改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１またはそれ以上の置換されたまたは改変された糖部分を含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含む：−ＯＨ、−Ｆ、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｎ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｓ−アルケニル、−Ｎ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｓ−アルキニル、−Ｎ−アルキニル、−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０のアルキルまたはＣ２からＣ１０のアルケニルおよびＣ２からＣ１０のアルキニルであり得る。特に好ましい改変された糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これはまた、２’−Ｏ−（２−メトキシエトキシ）または２’−ＭＯＥとして知られている）およびＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）のような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（２’−ＤＭＡＯＥとして知られている）である。特に好ましくはまた、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］であり、ここで、ｎおよびｍは、それぞれ独立して１から１０の整数である。他の好ましい改変は、２’−メトキシ、２’−アミノプロポキシ、および２’−フルオロを含む。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の基の１つを含む：−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣ３Ｈ７、−Ｏ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣ（ＣＨ３）３、−ＯＣ４Ｈ９、−ＯＰｈ、−ＯＣＨ２−Ｐｈ、−ＮＯ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｎ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＮＣＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＣ３Ｈ７、−ＣＯ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＳＨ、−ＳＣＨ３、−ＳＣ２Ｈ５、−ＳＣ３Ｈ７、−Ｓ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＳＯＣＨ３、−ＳＯＣ２Ｈ５、−ＳＯＣ３Ｈ７、−ＳＯ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２Ｃ２Ｈ５、−ＳＯ２Ｃ３Ｈ７、−ＳＯ２−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣ２Ｈ５、−ＮＨＣ３Ｈ７、−ＮＨ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２、−Ｎ（Ｃ３Ｈ７）２、−Ｎ（シクロ−Ｃ３Ｈ５）２、−Ｎ［ＣＨ（ＣＨ３）２］２−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ５Ｈ１１、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）２、−Ｃ２Ｈ４−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ６Ｈ１３、−Ｃ３Ｈ６−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ２Ｈ４−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ２Ｈ４−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ７〜Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ脱離基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物速度特性および／または薬力学特性を改善するための基、または類似の特性を有する置換基。デオキシ核酸塩基も好ましい。
【００４１】
類似の改変はまた、ヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位または２’−５’結合したオリゴヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位にも行われ得る。
【００４２】
好ましい改変は、以下の構造断片によって表され得る。
【００４３】
【化２】
【００４４】
ここで、Ｒは、２’位についての上述の置換基のいずれかを表し、特に、−Ｈ、−Ｆ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３を表し、ＸおよびＸ’は、それぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−であり、そしてＹは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３を表す。より好ましくは、ＸおよびＸ’が酸素を表し、そしてＹが硫黄を表す変異体である。
【００４５】
さらに、純粋なジアステレオマーオリゴヌクレオチドまたはその模倣物または変異体が好ましい。特に好ましくは、ＳｐジアステレオマーおよびＲｐジアステレオマーである。
【００４６】
【化３】
【００４７】
最も好ましくはまた、配列番号３〜配列番号９３の配列、そして特に配列番号３の配列であり、ここで、本明細書に開示されている１またはそれ以上の改変が存在する。好ましくは、骨格中にホスホロチオエート部分または完全なホスホロチオエート骨格であり、ホスホロチオエートのＲｐジアステレオマーおよびＳｐジアステレオマーが好ましい。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基置換を含み得る。核酸塩基は、４つの標準のヌクレオチド塩基のアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）である。改変された核酸塩基は、その他の合成および天然の核酸塩基を含み、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体；ウラシル（Ｕ）、６−カルボキシウラシル、Ｎ６−メチルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル；８−ハロ−、８−アミノ−、８−チオール−、８−チオアルキル−、８−ヒドロキシル−およびその他の８−置換されたアデニンおよびグアニン；５−ハロ−、特に５−ブロモ−、５−トリフルオロメチル−およびその他の５−置換されたウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニン；７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシンなどが挙げられ、５−メチルシトシン置換が好ましい。なぜなら、これらの改変は、核酸の二重鎖の安定性を増加させることが示されているからである。
【００４９】
好ましくは、１、２、３、または４個の核酸塩基が、その他の核酸塩基または化学的に改変された核酸塩基によって置換される配列番号３〜配列番号９３のいずれか１つの配列を有する変異体である。変異体とは、１〜４個の核酸塩基が、例えば、ウラシル（Ｕ）、５−ハロウラシル、５−メチルシトシン、および／またはＮ６−メチルアデニンによって置換される配列番号３〜配列番号９３の配列をいう。特に好ましくは、１、２または３個の核酸塩基が、上述の部分によって置換される配列番号３の変異体である。
【００５０】
「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物または変異体のオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性のヌクレオシド（骨格）間の結合で構成されるオリゴヌクレオチド、および天然には存在しない同様に機能する部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような改変されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞の取り込みが高められる、核酸標的への親和性が高められる、およびヌクレアーゼの存在下で安定性が増加するという所望の特性のため、しばしば天然の形態よりも好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の形態が好ましいが、本発明は、その他のオリゴマーのアンチセンス化合物を含み、以下に記載されているようなオリゴヌクレオチド模倣物に制限されずに含む。本発明のアンチセンス化合物は、約８から約５０個の核酸塩基（すなわち、約８から約５０個の結合されたヌクレオシド）を含み、好ましくは９〜４２個、１０〜３６個、１１〜３２個、１２〜３０個、１３〜２８個、１４〜２６個、そして最も好ましくは１５〜２５個の核酸塩基を含む。
【００５１】
特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは約１５から約２５個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、およびその他の短触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドを含み、それらは、標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する。
【００５２】
用語「塩」とは、生理学的および／または薬学的に受容可能な化合物の塩、特に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩をいう。薬学的に受容可能な塩基付加塩は、無機塩基を用いて形成される。適切な有機塩基または無機塩基の例は、金属イオン（例えば、アルミニウム、ナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属イオン、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリ土類金属イオン）、またはアミン塩イオンまたはアルカリまたはアルカリ土類水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩から誘導される塩基である。例えば、水溶性のＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、炭酸カリウム、アンモニアおよび重炭酸ナトリウム、アンモニウム塩、１級、２級および３級アミン（例えば、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、メチルアミン、ｔ−ブチルアミンのような低級アルキルアミン、プロカイン、エタノールアミン、ジベンジルアミンおよびＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンのようなアリールアルキルアミン、Ｎ−エチルピペリジンのような低級アルキルピペリジン、シクロヘキシルアミンまたはジシクロヘキシルアミンのようなシクロアルキルアミン、モルホリン、グルカミン、Ｎ−メチルおよびＮ，Ｎ−ジメチルグルカミン、１−アダマンチルアミン、ベンザチン）、またはアルギニン、リジン、オルニチンまたは元来中性または酸性のアミノ酸のアミドのようなアミノ酸から誘導される塩、クロロプロカイン、コリン、プロカインなどを含む。
【００５３】
塩基性である本発明の化合物は、有機酸または無機酸の薬学的に受容可能な塩を形成し得る。このような酸付加塩形成に適切な酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸、硝酸、ギ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸、キナ酸（china acid）、マンデル酸、ｏ−メチルマンデル酸、水素−ベンゼンスルホン酸、ピクリン酸、アジピン酸、Ｄ−ｏ−トリル酒石酸、タルトロン酸、α−トルイル酸、（ｏ、ｍ、ｐ）−トルイル酸、ナフチルアミンスルホン酸、およびその他の当業者に周知の鉱酸またはカルボン酸が挙げられる。塩は、遊離の塩基形態に十分な量の所望の酸を接触させることによって調製されて、従来の方法で塩を製造する。
【００５４】
遊離の塩基形態は、適切な薄い塩基の水溶液（例えば、希水酸化ナトリウム水溶液、希炭酸カリウム水溶液、希アンモニア水、および希重炭酸ナトリウム水溶液）で塩を処理することによって再生され得る。遊離の塩基形態は、それらに対応する塩形態と、多少特定の物理的特性（例えば、極性溶媒中の溶解性）が異なるが、塩は、その他の点では、本発明の目的についてそれらの対応する遊離の塩基形態と同等である。
【００５５】
あるいは、本発明の薬学的組成物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを（例えば、哺乳動物宿主中で）転写させるベクターを含む。好ましくは、このようなベクターは、遺伝子治療のために有用なベクターである。遺伝子治療のために有用な好ましいベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、牛痘）であり、またはより好ましくはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスである。さらにより好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたは鳥類のレトロウイルス誘導体である。このような本発明に用いられ得るレトロウイルスベクターは、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーヴィマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳ガンウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である。最も好ましくは、マウスベクターと比較してより幅広い宿主範囲を与えるヒト以外の霊長類レトロウイルスベクターが用いられる（例えば、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ））。組換えレトロウイルスが不完全なので、感染性の粒子を産生するために、補助が要求される。このような補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下で、レトロウイルスの構造遺伝子のすべてをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を用いることによって与えられ得る。適切なヘルパー細胞株は、当業者に周知である。このベクターは、さらに、選択マーカーをコードする遺伝子を含み得、そのため形質導入された細胞が同定され得る。さらに、レトロウイルスベクターは、標的特異的になるような方法で改変され得る。これは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって達成され得る。当業者は、標的特異的ベクターを生成させるためのさらなる方法を知っている。さらに、インビトロまたはインビボでの遺伝子治療に適切なベクターおよび方法は文献に記載され、当業者に公知である（例えば、ＷＯ９４／２９４６９またはＷＯ９７／００９５７を参照のこと）。標的器官（例えば、脳組織）のみでの発現を達成するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のためのＤＮＡ配列は、組織特異的なプロモーターに連結され得、そして遺伝子治療のために用いられ得る。
【００５６】
オリゴヌクレオチドの構造内で、リン酸基は、一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものをいう。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’から５’ホスホジエステル結合である。本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物または変異体の特定の例としては、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保持するものおよび骨格中にリン原子を保持しないものを含む。安定性を増加させ得る改変されたオリゴヌクレオチド骨格は、当業者に公知であり、好ましくはこのような改変が、ホスホロチオエート結合、またはホスホネート（ホスホン酸）基またはスルフェート（硫酸）基またはスルホネート（スルホン酸）基またはスルホキシドによる１またはそれ以上のホスフェート基（リン酸基）の置換である。好ましいオリゴヌクレオチドの模倣物は、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチドの模倣物であり、そしてペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換される。核酸塩基は保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される（例えば、Nielsenら、Science 254 (1991), 1497-1500を参照のこと）。
【００５７】
本発明において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシド間またはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。本明細書で用いられるように、用語「相補的」とは、２つのヌクレオチド間で正確な対になるための能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができれば、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考えられる。それぞれの分子中の対応する位置の十分な数が互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズし得る」および「相補的な」は、安定かつ特異的な結合がオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間に生じるような十分な程度の相補性、または正確な対を示すために用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列が、特異的にハイブリダイズし得る標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが当業者に理解される。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し、そのため有用性の喪失の原因となる場合、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズし得、そして特異的な結合が所望される条件下で（すなわち、治療的処置の場合）、非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的な結合を避けるために十分な程度の相補性がある。
【００５８】
その他の好ましいオリゴヌクレオチドの模倣物において、糖およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち、ヌクレオチド単位の骨格）は、新しい基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。例えば、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されるこのようなオリゴヌクレオチドの模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換される。核酸塩基は保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つの改変は、１つまたはそれ以上の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを含み、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する。このような部分は、コレステロール部分のような脂質部分、コール酸、チオエーテル、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明において、「キメラの」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであって、それらは、２またはそれ以上の化学的に異なる領域を含み、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチド）から作製される。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には少なくとも１つの領域を含み、ここで、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する高められた耐性、高められた細胞取り込み、および／または標的核酸に対する高められた結合親和性を与えるように改変さる。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂し得る酵素に対する基質として働き得る。例としては、ＲＮアーゼＨは、細胞エンドヌクレアーゼであり、それは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の開裂を生じ、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が非常に高められる。したがって、キメラオリゴヌクレオチドが用いられると、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、かなりの結果が、しばしばより短いオリゴヌクレオチドで得られ得る。本発明のキメラアンチセンス化合物は、２またはそれ以上のオリゴヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／または上述のようなオリゴヌクレオチドの模倣物の複合構造として形成され得る。このような化合物はまた、当業者にはハイブリッドまたはギャップマー（gapmer）といわれている。
【００６０】
特に、本発明は、神経変性疾患、神経外傷、神経血管性および神経炎症性を含む感染後の疾患の予防および治療のための、本明細書に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその変異体または模倣物の使用に関する。用語「神経変性疾患および神経炎症性疾患」とは、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（Multisystem Atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性髄膜脳炎、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、卒中を含む急性虚血／低酸素性障害、ＣＮＳ外傷、頭部外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病、白質病変、網膜変性、蝸牛変性、黄斑変性、迷路性難聴、ＡＩＤＳ関連痴呆、色素性網膜炎、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）をいう。
【００６１】
より一般的には、本発明は、疾患を治療するための本明細書に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその変異体または模倣物の使用に関し、その疾患は、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの（例えば、ＴＧＦ−βの高められたレベルによる）アップレギュレートされたまたは高められたシグナリングに関連する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それによって、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害する。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせる代わりに、アンチセンス化合物が用いられ得る。アンチセンス化合物とは、本明細書に開示されているようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを転写させるベクター、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、および短触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドをいい、それらは、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズする。このアンチセンス化合物は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害する。したがって、この場合、疾患状態の間に存在するＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの量は減少する。
【００６２】
本明細書に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス化合物は、損傷を受けた神経経路の再生および機能的な再連結のために、ならびに種々の神経変性疾患および神経炎症性疾患の治療のために有用である。
【００６３】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性を妨害するために有用な化合物は、レセプターへのＴＧＦ−β１の結合を減少させるまたは阻害する化合物である。このような化合物の好ましい例は、ＴＧＦ−βレセプター、好ましくはＴＧＦ−βレセプターＩＩに対する（中和）抗体である（Linら、1992を参照のこと）。用語「抗体」とは、好ましくは、プールされた異なるエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体、および全く異なるモノクローナル抗体調製物から本質的になる抗体に関する。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって、例えば、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩまたは対応するレセプターのフラグメントを含む抗原から作製される。本明細書で用いられるように、用語「抗体（Ａｂ）」または「モノクローナル抗体（Ｍａｂ）」とは、完全な分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図され、それらは、タンパク質に特異的に結合し得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に除去され、そして完全な抗体よりも非特異的な組織結合を有し得ない（Wahlら、J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)）。したがって、これらのフラグメントは、ＦＡＢまたはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と同様に好ましい。さらに、本発明の目的のために有用な抗体としては、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。
【００６４】
本発明の使用のためのさらなる好ましい化合物は、可溶性ＴＧＦ−βレセプターである。このような可溶性ＴＧＦ−βレセプターは、抗体のＦｃ領域とＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメインとの融合タンパク質である。このような分子は、可溶性ＴＧＦ−βへの高い親和性を有する。したがって、遊離のＴＧＦ−β１の濃度は劇的に減少する。製造者のプロトコルによれば（R&D Systems、ドイツ）、ヒトＴＧＦ−βＲＩＩの１５９個のアミノ酸残基の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列は（Linら、Cell 1992, 68(4),775-785）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合され、そしてこのキメラタンパク質が、マウス骨肉腫細胞株ＮＳＯで発現された。
【００６５】
レセプターに関して、本明細書で用いられている用語「可溶性」とは、好ましくはレセプターの細胞外ドメインのみを含むレセプターのフラグメント、またはその天然のリガンド（例えば、ＴＧＦ−β１）になお結合し得る部分に関する。当業者は、このようなフラグメントをレセプターの公知のアミノ酸配列に基づいて決定し得、そしてレセプターの細胞外ドメインの決定は、周知の方法の使用によって、例えば、コンピュータプログラム（親水性プロット）によって行われ得る。本発明の使用の特に好ましい実施態様では、可溶性ＴＧＦ−βレセプターは、ＴＧＦ−βレセプターＩＩである。
【００６６】
本発明はまた、（ａ）ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性、またはＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現、または（ｂ）ＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−Ｒシグナリングを妨害する化合物を同定する方法に関し、
（ａ）ＴＧＦ−β１およびニューロン前駆細胞を含む試験システムとともに、候補化合物をインキュベートする工程；および
（ｂ）活性なＴＧＦレセプターの発現または該ニューロン前駆細胞の増殖をアッセイする工程；を包含し、
（ｃ）該試験化合物の不在下での試験システムと比較して、（ｉ）活性なＴＧＦレセプターの発現の抑制の廃絶、または（ｉｉ）ニューロン前駆細胞の増殖の抑制の廃絶が、所望の特性を有する候補化合物の存在が示される。
【００６７】
このような候補化合物の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、またはモール分子（mall molecule）が挙げられる。このような分子は、公知の技術を用いて、合理的に設計され得る。好ましくは、スクリーニングのために用いられる試験システムは、類似の化学的および／または物理的特性の物質を含み、最も好ましくは、この物質は同一である。本発明の使用によって調製および同定され得る化合物は、発現ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリー）、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さな有機化合物、リガンド、ホルモン、ペプチド模倣物、ＰＮＡなどであり得る。より最近では、ＷＯ９８／２５１４６は、所望の特性、特に、ポリペプチドまたはその細胞レセプターに作動、結合、または拮抗できる能力を有する化合物について複合体のライブラリーをスクリーニングするためのさらなる方法を記載した。このようなライブラリー中の複合体は、試験を受ける化合物、化合物の合成における少なくとも１つの工程を記録するタグ、およびレポーター分子による影響を受けやすい改変つなぎ鎖を含む。つなぎ鎖の改変は、複合体が所望の特性を有する化合物を含むことを示すために用いられる。タグは、このような化合物の合成における少なくとも１つの工程を示すために解読され得る。本発明のＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩまたはこのような分子をコードする核酸分子と相互作用する化合物を同定するためのその他の方法は、例えば、ファージディスプレーシステムを用いるインビトロスクリーニングおよびフィルター結合アッセイまたは例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ装置（Pharmacia）を用いる相互作用の「リアルタイム」測定である。これらのすべての方法は、本発明において用いられ得、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性または該レセプターの発現、またはＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−Ｒシグナリングを妨害する化合物を同定する。
【００６８】
例えば、ＴＧＦ−βレセプターへの基質またはリガンドとして作用し得る小さな有機化合物の模倣物を設計、合成、および評価し得ることはまた、当業者に周知である。例えば、ハパロシン（hapalosin）のＤ−グルコース模倣物は、細胞毒性において、多剤耐性補助に関連するタンパク質と拮抗しているハパロシンとしての類似の有効性を示すことが記載されている（Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987を参照のこと）。ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−Ｒをコードする遺伝子はまた、インヒビターをスクリーニングするための標的として用い得る。インヒビターは、例えば、ＴＧＦ−Ｒ、好ましくはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のｍＲＮＡに結合するタンパク質を含み得、それによって、ｍＲＮＡの天然の構造を不安定にし、そして転写および／または翻訳を妨げる。さらに、そのフラグメントは、定義されたまたは定義されていない標的ＲＮＡ分子の構造を模倣し、このＲＮＡ分子に化合物が細胞増殖の遅延または細胞死を生じる細胞の内部で結合するＲＮＡフラグメントのような核酸分子を同定するための方法は、文献に記載されている（例えば、ＷＯ９８／１８９４７およびその引用文献を参照のこと）。これらの核酸分子は、薬学的に関心のある未知の化合物および疾患の治療における使用のための未知のＲＮＡ標的を同定するために用いられ得る。これらの方法および組成物は、ＴＧＦ−β１および／または対応するレセプターの発現レベルを減少させるために有用な化合物の同定に用いられ得る。本発明の方法により試験され同定され得る化合物は、発現ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリー）、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さな有機化合物、ホルモン、ペプチド模倣物、ＰＮＡなどであり得る（Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 7 (1994), 193-198および上述の引用文献）。さらに、ＴＧＦ−β１の推定レギュレーターをコードする遺伝子および／またはＴＧＦ−Ｐ１の上流または下流で効果を発揮する遺伝子は、例えば、挿入突然変異誘発を用いて、例えば、当業者に公知の遺伝子ターゲティングベクター用いて同定され得る。この化合物はまた、公知のインヒビターの機能的誘導体または類似体であり得る。このような有用な化合物は、例えば、トランス作用因子であり得、これは、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩまたはそれをコードする遺伝子の調節配列に結合する。トランス作用因子の同定は、当該技術分野で標準の方法を用いて行われ得る。タンパク質がタンパク質自身または調節配列に結合するか否か決定するために、標準的な天然のゲルシフト分析が行われ得る。タンパク質または調節配列に結合するトランス作用因子を同定するために、タンパク質または調節配列が、標準的なタンパク質精製法における親和性試薬として、または発現ライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩと相互作用するポリペプチドをコードする核酸分子の同定は、例えば、いわゆる酵母「２−ハイブリッドシステム」の使用によってin Scofield（Science 274 (1996), 2063-2065）にＴＧＦ−β１について記載されているように達成され得る。このシステムでは、ＴＧＦ−β１は、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに連結される。この融合ポリペプチドを発現し、適切なプロモーターによって駆動されるｌａｃＺレポーター遺伝子を含む酵母株は、ＧＡＬ４転写因子によって認識されており、活性化ドメインと融合される植物タンパク質またはそのペプチドを発現するｃＤＮＡのライブラリーで形質転換される。したがって、ｃＤＮＡの１つによってコードされるペプチドが、例えばＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩのペプチドを含む融合ペプチドと相互作用し得ると、複合体は、レポーター遺伝子の発現を示し得る。この方法では、例えば、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩおよびそれぞれのレセプターをコードする遺伝子は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩと相互作用するペプチドおよびタンパク質を同定するために用いられ得る。このシステムおよび類似のシステムが、インヒビターの同定のために、さらに利用され得ることは、当業者に明らかである。最後に、本発明は、疾患の予防または治療のための薬学的組成物の調製物についての上述の方法によって同定される化合物の使用に関し、神経発生または神経再生が有用な効果を有する。以下の実施例で、より詳細に本発明を説明する。
【００６９】
本発明はまた、ＴＧＦ−ＲシステムまたはＴＧＦ−ＲＩＩシステムの調節によって誘導された幹細胞／前駆細胞集団での治療または予防／予防処置の効果を同定するための方法に関する。これは、特に、個々の患者において、例えば、個々に合った服用をさせるなどの、好結果の治療を確立するのに役に立ち得る。診断方法は、以下を含む。
【００７０】
（ａ）ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩに対する特異的抗体であり、および核医学診断のための特定の核種（ヨウ素、テクネチウム、フッ素１８）または磁気共鳴画像での使用のためのガドリニウム塩、パーフルオロカーボン、またはその他の希土類生成物／常磁性化合物／鉄粒子のいずれかで標識された抗体の全身適用。本明細書では、ノイズ比を越える十分なシグナルがない場合、上衣下層で脳血液関門を手短に開く必要があり得る。この領域は、高度に血管が形成され、そしてコントラストが、３テスラ機具での視覚化のために十分であり得るが、ＢＢＢの開放が、さらなる補助であり得る。これは、高浸透圧溶液（例えば、グリセロール）またはＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）のいずれかの静脈内注射で行われ得る。
【００７１】
（ｂ）ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩに特異的なオリゴヌクレオチド（上述と同じ分子）の全身適用。それらは、次のように標識される：Ｇｄまたは１１１Ｉｎ−ＤＴＰＨ（５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’−ビオチン）−（ＳＡ−ＯＸ２６、８Ｄ３またはＡｋ−ＨＩＲのいずれか）（これによって、ＧｄはＭＲＩのために用いられ、１１１Ｉｎは放射線診断のために用いられ；ＯＸ２６はマウスの実験のために用いられ、マウストランスフェリンレセプターをターゲットし、８Ｄ３はマウス抗ラットトランスフェリンレセプター抗体であり、ＡＫ−ＨＩＲはヒトインスリンレセプターに対する抗体である）。これらの化合物は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩに対して活性なｍＲＮＡを有するそれらの細胞にのみハイブリダイズし信号を送る。ＤＴＰＨは、キレート形成剤として用いられ、Ａｋ−ＨＩＲはインスリンレセプターを用いて、異なった関門を通過するオリゴヌクレオチドを往復輸送し、トランスフェリンレセプター抗体の場合、後者が膜横断シャトルに用いられる。多数のｍＲＮＡが利用可能な細胞には、特異なハイブリダイゼーションの安定性があり、したがって、はるかに強いシグナルが検出され得る（Susuki T, Schlachetzki Fら、J. Nucl. Med. 45:1766-1775, 2004, Susuki T, Zhang Y, Zhang Y-f, Schlachetzki F, Pardridgeら、Mol. Imaging 2005, 3, 356-363）。
【００７２】
（ｃ）（ｂ）のように同一の標識でダブルコルチン（Doublecortin）（ＤＣＸ）に特異的なオリゴヌクレオチド（上述と同じ分子）の全身適用（ＷＯ２００４／０６７７５１を参照のこと）。
【００７３】
好ましくは、薬学的組成物において、上述のこのような化合物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられる。「薬学的に受容可能」とは、活性成分の生物学的活性の効果を妨害せず、そして投与される宿主に対して有毒ではない任意のキャリアを含むことを意味する。適切な薬学的なキャリアの例は、当業者に公知であり、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このようなキャリアは、従来の方法によって処方され得、そして活性な化合物が、被験者に有効量で投与され得る。「有効量」とは、疾患の進行および重篤さに影響し、このような病状の減少または鎮静に導くのに十分な活性成分の量をいう。これらの疾病または疾患を治療および／または予防するために有用な「有効量」は、当業者に公知の方法を用いて決定され得る。適切な組成物の投与は、種々の方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内の投与によって行われ得る。投与経路は、当然治療の種類および薬学的組成物に含まれる化合物の種類に依存する。さらに、本発明の化合物は、リポソーム、複合体形成剤、レセプターをターゲットした分子、溶媒、保存剤および／または希釈剤と混合し投与され得る。
【００７４】
活性成分の連続放出、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその変異体または模倣物の少なくとも１つの連続放出のための注入液または固体マトリックス形態の薬学的調製物が好ましい。脳への局所的な投与に適している溶液または固体マトリックス形態の薬学的調製物がより好ましい。
【００７５】
用法用量は、主治医およびその他の臨床的な要因によって決定され得る。医薬分野においては周知であるように、任意の患者について用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間および投与経路、治療の種類、健康状態および同時に投与されるその他の薬剤を含む多くの要因に依存する。
【００７６】
本発明は、上述のように、オリゴヌクレオチド、その変異体または模倣物の少なくとも１つを含む薬学的調製物に関する。少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりにまたはこれに加えて、少なくとも１つのアンチセンス化合物が存在し得る。アンチセンス化合物とは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、本明細書に開示されているようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つを転写させるベクター、またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、および短触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドをいい、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸をハイブリダイズする。このアンチセンス化合物は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害し、好ましくは、形成されるＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの量をそれぞれ減少させ得る。
【００７７】
本発明の好ましい実施態様では、予防および／または治療され得る疾患は、神経変性疾患、ＣＮＳの神経炎症性疾患、急性虚血または脳外傷、低酸素性脳損傷である。神経変性疾患または神経炎症性疾患の好ましい例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（multisystem atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎およびウイルス性髄膜脳炎（幹細胞増殖の炎症後の低下を防止）、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、急性虚血／低酸素性障害、ＣＮＳ外傷、頭部外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病、白質病変、ＡＩＤＳ関連痴呆、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）；網膜変性、黄斑変性、色素性網膜炎、蝸牛変性、迷路性難聴が挙げられる。幹細胞再生の加齢依存的な減少もまた、記載され得る。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
ＴＧＦ−β１は、げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞の増殖を阻害する。
成体の雌性マウス（種々の系統）またはFischer-344ラット（３〜４カ月齢：Charles River、ドイツ）を屠殺し、そして脳および脊髄を取り出して、４．５ｇｍ／ｌのグルコース（Merck、ドイツ）を含む４℃のＤＰＢＳ（PAN、ドイツ）（ＤＰＢＳ／ｇｌｕ）に入れる。上に重なっている髄膜および血管を取り出す。海馬および上衣領域（側脳室の外側壁由来の上衣下および副脳室領域を含む（ＳＶＺ））を無菌的に取り出す。切り出した組織を新鮮なＤＰＢＳ／ｇｌｕに移し、１回洗浄し、ペトリ皿に移し、そして機械的に解離する。細胞懸濁液をＤＰＢＳ／ｇｌｕで洗浄して過剰の血液をすすぎ、そして０．０１％のパパイン（Worthington Biochemicals、英国）、０．１％のディスパーゼＩＩ（dispase II）（Boehringer Mannheim, Mannheim、ドイツ）、０．０１％のＤＮアーゼＩ（Worthington Biochemicals）、およびＨＢＳＳ（PAN）中に１２．４ｍＭのＭｇＳＯ４を含むＭｇ２／Ｃａ２（PAA、ドイツ）を含まないＰＰＤ溶液に再懸濁し、そして室温で３０〜４０分間消化する。細胞懸濁液を１０分ごとにすりつぶす。解離した細胞を回収し、そして２ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．１ｇｍ／ｌペニシリン／ストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁し、的確にすりつぶしながら３回洗浄する。最後に、単一細胞懸濁液を、Ｂ２７（Gibco BRL）（ＮＢ／Ｂ２７）、２ｍＭのＬ−グルタミン（PAN）、０．１ｇｍ／ｌペニシリン／ストレプトマイシン（PAN）、２ｇ／ｍｌヘパリン（Sigma, Taufkirchen、ドイツ）、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ−２（R&D Systems、ドイツ）、および２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（R&D Systems、ドイツ）が添加されたＮＢ培地（Gibco BRL、ドイツ）に再懸濁する。生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。細胞をＴ−２５培養フラスコに播種し、そして５％ＣＯ２のインキュベータ中で３７℃に維持する。単一細胞が懸濁培養の５〜７日以内に球体を形成し始め、次の週の間、塊および数が増え続ける。培地の半分を７日ごとに交換する。３〜２０継代数の細胞を実験に用いる（Wachs, F. P., S. Couillard-Despresら., Lab Invest 2003, 83(7), 949-962）。神経幹細胞および前駆細胞の培養は、さらにＮＳＣという。解離工程において、浮遊神経球体を含んでいる培養培地を、１５ｍｌの遠心管に回収し１２０ｒｃｆで５分間遠心分離する。ペレットを２００μｌのAccutase（Innovative Cell Technologies Inc., PAAによって配布されている）に再懸濁し、そして約１０回ピペットを用いてすりつぶす。次いで、細胞懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートする。解離した球体を再度すりつぶし、８００μｌのＮＢ／Ｂ２７培地に再懸濁する。解離した細胞を１２０ｒｃｆで５分間遠心分離し、そしてＮＢ／Ｂ２７培地に再懸濁する。アリコートを、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数して、生存細胞の量を決定する。細胞（１０５個）を、ＮＢ／Ｂ２７培地で長期継代のために、Ｔ７５培養フラスコにプレーティングする（フラスコごとに１０ｍｌの培養培地）。初代神経球体のAccutase処理後に得られた細胞は増殖し、二次神経球体を得る。初代神経球体細胞の培養後７〜９日、二次神経球体を継代する。初代培養および初代神経球体と同様に、二次神経球体の解離後に得られた単一細胞は増殖し、三次神経球体を得る（Wachs, F. P., S. Couillard-Despresら、Lab Invest 2003, 83(7), 949-962）。
【００７９】
１０４個のＮＳＣを、１ｍｌの容量のＮＢ／Ｂ２７培地を含む１２ウェルプレートに播種し、７日間培養する。播種後２時間、３日、および６日に、細胞を種々の濃度（０、２．５、５、１０、５０、および１００ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒトトランスホーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）（R&D Systems、ドイツ）の添加によって刺激する。７日目に、AccutaseＴＭの使用によって培養物を解離し、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。インビトロで、ＴＧＦ−β１は、用量依存様式で成熟した神経幹細胞および前駆細胞の増殖を阻害する（図１Ａ）。
【００８０】
類似の効果をヒト胎児神経前駆細胞で観察した。５０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１での処理により、７日以内にコントロールの約５０％まで細胞増殖が減少した（図１Ｂ）。
【００８１】
（実施例２）
神経幹細胞および前駆細胞におけるＴＧＦ−β１の効果は可逆的である。
ＴＧＦ−β１で誘導した増殖阻害が可逆的効果であるか否かを決定するために、ＮＳＣを実施例１に記載されているプロトコルに従って１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で７日間刺激する。解離後、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数し、そして増殖因子刺激された１０４個のＮＳＣを再播種し、そして実施例１に記載されているプロトコルに従って１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を用いてまたは用いず培養する。この解離／計数／再播種の手順を、７日ごとに行う。図２に示すように、培養３週後、最初にＴＧＦ−β１処理され現在ＴＧＦ−β１なしで増殖している細胞の増殖割合は、以前の処理されていない細胞と比較した場合、通常まで戻る。これは、成熟した神経幹細胞および前駆細胞におけるＴＧＦ−β１の効果が可逆的であることを示す。ＴＧＦ−β１を用いた長期間のインキュベーションは、さらに、細胞増殖を減少させない。
【００８２】
（実施例３）
ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体は、げっ歯動物の成体のＮＳＣにおけるＴＧＦ−β１効果を減少させ得る。
低い継代数の刺激されていない７日齢の神経球体を、実施例１に記載されているようにAccutaseＴＭの使用によって解離する。得られた単一細胞懸濁液を、ブロッキング分析のために使用した。げっ歯動物の成体のＮＳＣを、１ｍｌの容量のＮＢ／Ｂ２７培地を含む１２ウェルプレートに１０４個の細胞の密度で播種した。播種２時間後および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１での刺激１時間前に、種々の濃度の中和抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体（R&D Systems、ドイツ）を培養培地に添加した。播種３日および６日後に、細胞を１日目に行われた手順と同一の抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体およびＴＧＦ−β１の添加によって再刺激する。７日目に、培養物をAccutaseＴＭの使用によって解離し、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。興味深いことに、抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体自体の添加によりＮＳＣの増殖が減少する。ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体は、使用した最も高い濃度（１０μｇ／ｍｌ）での使用でさえも、ＴＧＦ−β１で誘導される効果を部分的にのみ阻害し得る（図３）。
【００８３】
（実施例４）
可溶性ＴＧＦ−ＲＩＩは、ＮＳＣ増殖のＴＧＦ−β１で誘導される抑制を完全に阻害する。
製造者のプロトコルに従って（R&D Systems、ドイツ）、ヒトＴＧＦ−ＲＩＩの１５９個のアミノ酸残基の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を（Linら, Cell 1992, 68(4), 775-785）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合し、そしてキメラタンパク質を、マウス骨髄腫細胞株ＮＳＯで発現させた。低い継代数の刺激されていない７日齢の神経球体を、実施例１に記載されているようにAccutaseＴＭの使用によって解離する。得られた単一細胞懸濁液を、ブロッキング分析のために使用した。げっ歯動物の成体のＮＳＣを、１ｍｌの容量のＮＢ／Ｂ２７培地を含む１２ウェルプレートに１０４個の細胞の密度で播種した。播種２時間後および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１での刺激１時間前に、種々の濃度の生物学的活性を有する可溶性組換えヒトＴＧＦ−βｓＲＩＩ／Ｆｃキメラ（R&D Systems、ドイツ）を培養培地に添加した。播種３日および６日後に、細胞を１日目に行われた手順と同一のＴＧＦ−βｓＲＩＩ／ＦｃキメラおよびＴＧＦ−β１の添加によって再刺激する。７日目に、培養物をAccutaseＴＭの使用によって解離し、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。興味深いことに、ＴＧＦ−βｓＲＩＩ／Ｆｃキメラの添加により、用量依存様式でＴＧＦ−β１で誘導される効果を完全にブロックし得る（データは示さず）。明らかに、可溶性組換えヒトＴＧＦ−βｓＲＩＩ／Ｆｃキメラ（可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ）の前投与による細胞培養上清中の活性なＴＧＦ−β１の廃絶は、ＴＧＦ−β１で誘導される成熟神経幹細胞および前駆細胞の増殖抑制を完全にブロックする（図４）。
【００８４】
（実施例５）
ＴＧＦ−βＲＩＩを発現する細胞は、細胞選別技術を用いて単離され得る。
現在の方法は、神経幹細胞および前駆細胞の迅速かつ信頼できる分離および精製ができない。所定の表面マーカーの発現に基づいて純粋な神経幹細胞および前駆細胞集団の単離の可能性を研究するために、本発明者らは、種々の技術によってＴＧＦ−βＲＩＩの発現による神経幹細胞および前駆細胞を単離する。ＴＧＦ−βＲＩＩを発現する神経幹細胞および前駆細胞を２つの技術で単離することが可能である：（ｉ）ＦＡＣＳ選別（データは示さず）、および（ｉｉ）ＭＡＣＳ選別。解離した成熟神経幹細胞および前駆細胞を、１０μｇ／ｍｌのＴＧＦ−ＲＩＩに対する一次抗体（R&D Systems、ドイツ）を用いて、室温で２０分間インキュベートする。ＰＢＳでの１回の洗浄工程後、細胞をウサギ抗ヤギＰＥ（１：５００）二次抗体（Dianova）を用いてインキュベートする。ＰＢＳでの１回の洗浄工程後、製造者のプロトコルに従って（Miltenyi Biotech、ドイツ）、細胞を常磁性ビーズに連結されたＰＥに対する三次抗体で染色する。細胞懸濁液を、製造者のプロトコルに従って（Miltenyi Biotech、ドイツ）ＭＡＣＳシステムを用いて磁気選別し、そして選別後の負および正の細胞を計数し、培養を行う（図５）。選別されたすべての細胞の約２０％が、ＴＧＦ−βＲＩＩに対して陽性に染色した。
【００８５】
（実施例６）
ＴＧＦ−βＲＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで、成熟神経幹細胞および前駆細胞の増殖のＴＧＦ−β１で誘導されたダウンレギュレートを阻害する。
細胞を、実施例１に記載されているように調製し、解離し、そしてプレーティングした。次いで、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１、１０μＭのＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ｃａｇｃｃｃｃｃｇａｃｃｃａｔｇ−３’（配列番号３）、センスオリゴヌクレオチド５’−ｃａｔｇｇｇｔｃｇｇｇｇｇｃｔｇ−３’、またはミスセンス５’−ｃａｔｃｃｃｃｇｇａｃｃｃｇｔｇ−３’を用いてまたは用いずに１週間インキュベートした。オリゴヌクレオチドをホスホロチオエート改変し、そしてオリゴヌクレオチドを含む培地を毎日交換した。ＴＧＦ−β１で誘導される神経幹細胞および前駆細胞の増殖の阻害が、アンチセンス（配列番号３）処理によって、完全にそして特異的にブロックされたことに留意すること（図６）。
【００８６】
（実施例７）
ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を救済する。
この実施例は、（ｉ）インビボでの神経幹細胞および祖先細胞の増殖におけるＴＧＦ−β１注入の効果、および（ｉｉ）ＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド処理によるこの効果の救済を示す。したがって、以下の実験を設計した。
【００８７】
ＴＧＦ−β１を２週間脳室内に注入し、次いで、ＴＧＦ−β１とオリゴヌクレオチドとを共注入した。動物実験を、１９８６年１１月２４日の欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に従って行った。浸透圧ミニポンプに接続されたステンレススチールのカニューレ（Model 2001, Alza, Stadt, Land）を、記載されているように脳室内の注入のために、２カ月齢の雄性Fischer-344ラット（ｎ＝２４）に移植した。動物に、組換えＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）またはコントロールとして人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）のいずれかを（それぞれｎ＝８）、０．５μｌ／時間の流速で２週間投与した。第２週の後、ポンプを交換し、ａＣＳＦ、ＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）、またはホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ポンプ中に１．６４ｍＭの濃度で存在）と組み合わせたＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）を、さらに２週間、脳室中に注入した。オリゴヌクレオチドは、実施例６に記載されている通りであった。２７日目に、動物に、２００ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を単回腹腔内注射した。１日後、動物に、４％のパラホルムアルデヒドを心臓内潅流した。組織を、発色性またはエピ蛍光免疫検出のために、記載されているように４０μｍの矢状切片に加工した。エピ蛍光分析を、SpotTMディジタルカメラ（Diagnostic Instrument Inc, Sterling Heights、アメリカ）または共焦点走査レーザー顕微鏡（Leica TCS-NT, Bensheim、ドイツ）を装着したLeica顕微鏡（Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar、ドイツ）を用いて行った。一次抗体は、ラットα−ＢｒｄＵ １：２５０（Oxford Biotechnology, Oxford、イギリス）であった。二次抗体は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミンＸ（ＲＨＯＸ）、ＣＹ５、またはビオチン１：５００（Jackson Immuno Research, West Grove, PA、アメリカ）と結合したロバα−ヤギ、マウス、ウサギ、またはラットであった。計数のために、体系的なおよびランダムな手順を用いた。ＢｒｄＵ陽性細胞を、ＳＶＺの最低部分、中間部分、および上部に配置された区分あたり、５０μｍ×５０μｍの３つの計数フレーム内で計数した。計数フレームの最上の焦点面（排除面）または側面排除境界と交差した陽性プロファイルは、計数しなかった。陽性プロファイルの総数を、それぞれの構造について推定数のＢｒｄＵ陽性細胞を得るために、参照容量と試料容量との比によって増加させた。すべての外挿を、１つの大脳半球について計算し、総脳値を表すために２倍にした。データを、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計分析を、ＴＧＦ−β１処理群とコントロール群との間の対応のない両側ｔ検定比較−スチューデントのｔ検定を用いて行った（StatView Software, Cary, NC、アメリカ）。有意水準を、ｐ＜０．０５と仮定した。
【００８８】
図７は、海馬歯状回（図７Ａ）および副脳室領域（図７Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されたダウンレギュレーションを示す。ミスセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、この効果をブロックしなかった。対照的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理（配列番号３）は、ＴＧＦ−β１の効果をブロックした（図７ＡおよびＢ）。
【００８９】
（実施例８）
ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を抑える。
この実施例は、ＴＧＦ−βＲＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処理が、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されたダウンギュレーションを抑え得ることを示す。
【００９０】
オリゴヌクレオチドを１週間脳室内に注入し、次いで、ＴＧＦ−β１とオリゴヌクレオチドとを共注入した。動物実験を、１９８６年１１月２４日の欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に従って行った。浸透圧ミニポンプに接続されたステンレススチールのカニューレ（Model 2001, Alza, Stadt, Land）を、記載されているように脳室内の注入のために、２カ月齢の雄性Fischer-344ラット（ｎ＝２４）に移植した。動物に、第１週の間はホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ポンプ中に１．６４ｍＭの濃度で存在）またはａＣＳＦのいずれかを、そして第２および第３週の間はａＣＳＦ、ＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）、またはＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）とホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ポンプ中に１．６４ｍＭの濃度で存在）との共注入を投与した。オリゴヌクレオチドは、実施例６に記載されている通りであった。２０日目に、動物に、２００ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を単回腹腔内注射した。１日後、動物に、４％のパラホルムアルデヒドを心臓内潅流した。組織を、実施例７に記載されているように加工して分析した。図８は、海馬歯状回（図８Ａ）および副脳室領域（図８Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導したダウンギュレーションが、ＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３）処理での前処理によって抑えられ得ることを示す。
【００９１】
（実施例９）
少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的処方物。
アンチセンスオリゴヌクレオチドについての３つの代表的な水性処方物：
１．ａＣＳＦ中：１４８．０ｍＭのＮａＣｌ、３．０ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、１００μｇ／ｍｌのラット血清アルブミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
２．０．９％ＮａＣｌ中
３．Ｈ２Ｏ中
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＴＧＦ−β１は、げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞の増殖を抑制する。（Ａ）げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞（ＮＳＣ）の培養物を、種々の濃度（０、５、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数した。データを、３連で行われた３つの実験からの平均細胞数±ＳＤとして表す。（Ｂ）は、ヒト胎児ニューロン前駆細胞におけるＴＧＦ−β１の効果を示す。
【図２】ＮＳＣにおけるＴＧＦ−β１の効果は可逆性である。げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞の培養物を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、細胞を解離し、トリパンブルー排除アッセイによって計数し、そしてＴＧＦ−β１で前処理した細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を含むまたは含まずに、再播種した。この手順を７日ごとに行った。データを、３連で行われた３つの実験からの平均細胞数±ＳＤとして表す。
【図３】ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体は、げっ歯動物の成体のＮＳＣにおいてＴＧＦ−β１効果を減少させ得る。げっ歯動物の成体のＮＳＣ培養物を、抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数した。データを、３連で行われた３つの実験からの平均細胞数±ＳＤとして表す。
【図４】可溶性ＴＧＦ−ＲＩＩは、ＴＧＦ−β１誘発されたＮＣＳ増殖の抑制を阻害する。げっ歯動物の成体のＮＳＣ培養物を、可溶性抗ＴＧＦ−βＲＩＩ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数した。データを、３連で行われた３つの実験からの平均±ＳＤとして表す。
【図５】ＴＧＦ−βＲＩＩ発現細胞は、細胞選別技術を用いて単離され得る。げっ歯動物の成体のＮＳＣを、実施例１に記載のように調製した。ＴＧＦ−βＲＩＩを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体を用いて精製した。ＮＳＣの約２０％がレセプターを発現し、この細胞集団は、このアプローチによって富化され得る。
【図６】ＴＧＦ−βＲＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロでＴＧＦ−β１で誘導される成熟神経幹細胞および前駆細胞の増殖のダウンレギュレートを阻害する。ＴＧＦ−β１で誘導される神経幹細胞および前駆細胞の増殖の阻害が、アンチセンス処理によって完全におよび特異的にブロックされたことを示す。
【図７】ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を救済する。図７は、海馬歯状回（図７Ａ）および副脳室領域（図７Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されるダウンレギュレートを示す。ミスセンスオリゴヌクレオチド処理は、この効果をブロックしないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理は、ＴＧＦ−β１の効果をブロックした（図７Ａおよび７Ｂ）。
【図８】ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を妨げる。図８は、海馬歯状回（図８Ａ）および副脳室領域（図８Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されるダウンレギュレートは、ＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド処理での前処理によって妨げられ得ることを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の予防または治療のための薬学的組成物の調製のためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。ここで、神経発生および／または神経再生は、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性萎縮症、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、レーヴィ体痴呆、筋萎縮性側索硬化症およびその他の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳萎縮症、クロイツフェルトヤコブ病およびその他の重症のプリオン疾患、前頭側頭型痴呆、ピック病、エイズ痴呆複合症、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病のような神経変性疾患、血管性痴呆、卒中、脳外傷および脊髄損傷、色素性網膜炎、黄斑変性、緑内障、うつ病および精神分裂病のような脳血管疾患、およびダウン症候群のような発達障害は、有用な効果を有する。
【背景技術】
【０００２】
多くの重篤な神経変性疾患は、現在社会で厳しい社会経済的な影響を有し、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群のような痴呆を伴う発達障害、パーキンソン病、レーヴィ体痴呆、前頭側頭型痴呆、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳萎縮症、クロイツフェルトヤコブ病、エイズ痴呆複合症、血管性痴呆、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、多発性萎縮症、ハンチントン病、卒中、脳外傷、色素性網膜炎、黄斑変性、緑内障、うつ病、精神分裂病、および多発性硬化症のような疾患がある。共通の病態生理学的原因は、遺伝的、後成的、または後天的な欠損が見られ、しばしば細胞破壊片の凝集形成または蓄積が生じ、結局、進行性機能障害を導き、そして最終的に、神経細胞およびグリア細胞の死ならびに構造の崩壊に至ることに見られる。ミクログリア細胞および血管周囲の休眠マクロファージが誘引および活性化されて、細胞破壊片および組織破壊片を取り除こうと試みる。これは、クロイツフェルトヤコブ病では、非常に短い期間に起こり得、または例えば、パーキンソン病または多発性硬化症では、数十年にわたり起こり得る。活性化されたミクログリア細胞／マクロファージ細胞集団は、多くの炎症性サイトカインを細胞外マトリックスに放出して、これらを小静脈またはＣＳＦ腔のいずれかに排出する。不運にも、上述のこれらの疾患の臨床経過に有利な効果を有し得る神経発生および神経再生は（個々の具体的な病態生理学的メカニズムにもかかわらず）、現在のところ未知のメカニズムによって抑制されている。したがって、本発明の根底にある技術的問題は、神経発生および神経再生の抑制を阻害することによって、神経変性疾患または少なくとも該疾患に関連する症状の治療または予防に適切な手段を提供することである。
【０００３】
上記技術的問題の解決は、請求項で特徴付けられる実施態様の提供によって達成される。タンパク質のＴＧＦ−βファミリー、すなわち特異的な細胞表面レセプターＴＧＦ−ＲＩ、ＴＧＦ−ＲＩＩ、ＴＧＦ−ＲＩＩＩを有するＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は、胚のおよび主に間葉／神経外胚葉の器官発達のいくつかの重大な局面に作用することが知られている。それらは、胚幹細胞をニューロン前駆細胞に分化させ、そして傷ついた成熟ニューロンに対して神経保護的である。さらに、それらは、造血幹細胞分化に重大な影響を有し、増殖および分化も制御することが知られている。本発明に導く実験の過程で、ＴＧＦ−Ｒ（すなわち、ＴＧＦ−ＲＩおよびＴＧＦ−ＲＩＩ）が、神経発生および神経再生の抑制に関連する重要な要因であり、したがって、このＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性を妨害し得る化合物が、神経変性疾患および／または炎症性神経疾患の治療／予防のために有用であることがわかった。
【発明の開示】
【０００４】
要約すると、本発明に導く実験の結果としては、以下の通りである：
１．個々の成分は当然知られているけれども（ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−ＲＩＩ、脳脊髄液コンパートメント、硝子体液、内リンパ液、ニューロン前駆細胞など）、生理学的な調節回路は、前駆細胞／幹細胞による効果的なＣＮＳ再生のレベルを明らかにすることが認識されている。この回路は、心室壁で発現される重要な標的分子ＴＧＦ−ＲＩＩを有し、ＣＮＳ病理学の大部分において消滅した神経再生に原因がある。
２．興味深いことに、調節は、血液、リンパ管、細胞外マトリックスを介してではなく液体コンパートメント（脳脊髄液など）を介して起こり、その液体コンパートメントは、神経細胞およびそれらの前駆細胞または幹細胞に直接接触する。
３．ニューロンの／乏突起神経膠のまたは星状細胞の再生のための生理学的阻害回路は、ＣＮＳ内の損傷を修復する方策のための理想的な標的であるとして発見され、圧倒的に、神経系においてほとんどすべての破壊性の病状に適用され得る。ＴＧＦ−βについてのこれまでの知識から、ＴＧＦ−βの機能を減少させるよりもむしろ増加させようと試みされており（５を参照のこと）、そのためＣＮＳにおいて公知の神経保護または免疫抑制の活性を増強する：ここで、本発明者らは、心室壁でＴＧＦ−ＲＩＩシグナリングをブロックすることによって、幹細胞再生に対するその阻害機能を減少させると仮定する。
４．炎症過程が神経変性に重要な役割を果たし、および比較的大量の臨床前および臨床データがこの考えを支持すると思われると長期間にわたり推測されていたが、主回路は、現在、開示されており、それは、すべての単一の調節副回路、例えば、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２）などを組み合わせる。
５．さらに、自然（Ｎａｔｕｒｅ）に神経保護が設置され、そして神経再生に優先してＣＮＳに免疫特権が与えられることに留意し得る。今のところ、免疫特権が与えられおよび高度に保護されたＣＮＳ（免疫攻撃および神経アポトーシスに対して特異的に保護される）は、ＴＧＦ−βシステムのために重要な部分であり、これが、正確な免疫特権および同一のＴＧＦ−β分子のため神経再生に欠損を有することは示されていない。進化の概念は、非常に精巧なＣＮＳの急激な神経保護およびその最も複雑な機能性を支持して主張するように思われる。この意味で、個々の神経再生は、個人の神経保護よりも進化には重要ではないと思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（調節回路）
生理学的な脳の神経発生により、機能不全のまたは老化している神経細胞、乏突起神経膠細胞または星状細胞が、それぞれの前駆細胞によって継続的に修復／置換される。脳での修復のための神経発生は、ＴＧＦ−β−ＴＧＦ−Ｒ系（特にＴＧＦ−ＲＩＩだけでなく、ＴＧＦ−ＲＩもまた）によって、脳脊髄液を介して調節される。主な組み合わせは、ＴＧＦ−βを産生しそしてＣＳＦ（および硝子体、内リンパ）コンパートメント内へ細胞外腔を介してこれを分泌するミクログリア／マクロファージ系統細胞、および表面構造上に高度に発現されたＴＧＦ−ＲＩＩまたはＴＧＦ−ＲＩ、または同一のレセプターを有する上衣裏層を通じて、ＣＳＦを介して（および硝子体、内リンパへ）、このシグナルを受ける神経前駆細胞／幹細胞である。多くのＣＮＳ病理では、神経発生は、重度に障害されまたは機能不全になる。神経発生の調節は、通常、任意の特定の疾患の病理の状況において起こるＣＮＳのミクログリア細胞／マクロファージの活性化によって調節、通常は抑制される。このルート（ＣＳＦから副脳室領域／その他の神経性の領域へ）によって活性化されたミクログリア細胞／マクロファージは、神経変性性、急性および慢性、炎症性、低酸素性、アテローム性動脈硬化性または加齢性の脳の柔組織の再生を抑制する。ニューロンの分化が影響されるだけではなく、乏突起神経膠細胞および星状細胞系も影響される。ニューロンの／乏突起神経膠の／星状細胞の再生を改善するために、この回路を妨害するすべての分子は、治療として請求されている。この回路を使用するＣＮＳ病理の診断、予防処置、予防、または予後のための方法はまた、治療処置の効果をモニタリングするために、考えられるところでは非常に重要である。
【０００６】
上記の疾患では、ミクログリア細胞、および潜在的には血管周囲の休眠マクロファージは、タンパク質凝集体、細胞破壊片、炎症、アテローム性動脈硬化における炎症性応答、または急性の外傷／低酸素性に関連する細胞死から誘引される。これは、急性、亜急性、または慢性の過程であり得る。活性化過程の間、活性化されたミクログリア細胞集団（血管壁由来またはその他の由来のマクロファージを含む）は、大量の炎症性サイトカインを細胞外マトリックスに放出し、小静脈または直接的にＣＳＦ腔のいずれかに流出する。これらのサイトカインは、ＣＳＦコンパートメントに達し、直ちにすべての場所で利用され、そしてＣＳＦによっていくらかの範囲まで取り囲まれる。これらのサイトカインの中では、ＴＧＦ−βである。神経炎症が神経発生を阻害すること、およびインドメタシン（一般的な非ステロイド系の抗炎症薬）での炎症の阻害が、内毒素で誘導された炎症後に神経発生を回復し、そして頭蓋照射後に神経発生が増加することが示された（Monje, M. L., H. Todaら、(2003).「Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis.」Science 302 (5651):1760-1765）。
【０００７】
しかし、従来技術は、ＴＧＦ−βを、損傷後あるいは病理学的状態下で神経発生および神経修復をダウンレギュレートする主なレギュレーターとして開示していない。対照的に、従来技術は、ＴＧＦ−βを、損傷したニューロンまたは障害のあるニューロンの細胞死を妨げる神経保護剤として考え、ＣＮＳ疾患状態でＴＧＦ−βをアップレギュレートしようと試みた。
【０００８】
Zhangら（Zhang, J. M., R. Hoffmannら、(1997).「Mitogenic and antiproliferative signals for neural crest cells and the neurogenic action of TGF-beta1.」Dev. Dyn. 208(3):375-386.）は、ＴＧＦ−βがウズラの神経冠細胞の発生に効果を有することを示す。ここで、ＴＧＦ−βは、多分化能性神経冠細胞（および／またはそれらの直接の誘導体）および単分化能メラニン形成細胞の両方の増殖を阻害し、コロニーの大きさを減少させる。さらに、本発明とは対照的に、神経発生は、ＴＧＦ−βの存在下で顕著に増加した。アドレナリン細胞および感覚ニューロン前駆体の両方のコロニーあたりの数は、ＴＧＦ−β処理された神経芽細胞陽性コロニーで増加した。
【０００９】
ＴＧＦ−βは、細胞の成長および分化、器官発生、マトリックス形成、傷の修復、および免疫機能において重要な役割を有する。ＴＧＦ−βは、多くの細胞タイプに対して強力な成長阻害物質であるけれども、線維芽細胞および骨芽細胞の増殖を刺激する。これはまた、線維芽細胞および骨芽細胞による細胞外マトリックス産生の強力な刺激物質でもあり、マトリックス分解を阻害し、そしてマトリックス相互作用のためにレセプターをアップレギュレートする。ＴＧＦ−β１は、肝臓線維症の病因における主要な要因として、ならびに免疫系および腎臓におけるシクロスポリンＡの有益および有害な両方の効果の重要なメディエータの少なくとも１つとして関与している。さらに、ヒトおよび実験モデルにおける、種々の慢性の進行性線維症の腎臓疾患は、ＴＧＦ−β系の刺激に関連することが示されている。
【００１０】
ＴＧＦ−β１は、Ｇ１およびＧ２サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリンを、キナーゼ活性およびタンパク質の量の両方でダウンレギュレートする。ＴＧＦ−β１はまた、ヒト骨髄性白血病細胞中の多数のセリンおよびスレオニン残基に対する網膜芽腫サプレッサー遺伝子ｐＲｂの産生物のリン酸化を阻害する。十分にリン酸化されていないｐＲｂは、Ｇ１相で転写因子Ｅ２Ｆ−４に関連するが、リン酸化されたｐＲｂは、主にＥ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−３と結合する。ＴＧＦ−β１は、ｐ１３０（ｐＲｂファミリーメンバー）／Ｅ２Ｆ−４複合体形成をアップレギュレートし、そしてｐ１０７（ｐＲｂファミリーメンバー）／Ｅ２Ｆ−４複合体形成をダウンレギュレートしてＥ２Ｆ−４レベルを一定に保持するので、これらの結果は、細胞が細胞周期を逸脱しＧ１中に引き止められると、ＴＧＦ−β１の作用によって、Ｅ２Ｆ−４がｐ１０７からｐＲｂおよびｐ１３０に転換されることを示唆する。「ｃｄｋインヒビター」ｐ２７は、ＴＧＦ−β１に媒介された細胞周期制御の正および負の両方のレギュレーターである。ＴＧＦ−β１は、正常な原始造血幹細胞の選択されたインヒビターであることが報告されているが、ＴＧＦ−βは、原始およびより分化した骨髄性白血病細胞株の両方ともを阻害する。ＴＧＦ−β１の神経保護活性、神経発達におけるその役割、および免疫応答を調節するその役割に多くの関心が寄せられる。ＴＧＦ−β１は、インビトロおよびインビボでの神経保護することが多くの研究で示されている。アゴニスト研究は、ＴＧＦ−β１が中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の後の神経細胞死および梗塞の大きさを減少させることを示すが、逆に、アンタゴニスト研究は、ＭＣＡＯ後に神経細胞死および梗塞の大きさを増加させることを示しており、これはＴＧＦ−β１が、大脳虚血において神経保護の役割を有することを示唆している。マウスにおけるインビボでのＴＧＦ−β１のアデノウイルスに媒介された過剰発現についての最近の研究は、さらに、大脳虚血においてＴＧＦ−β１が神経保護の役割に関連し、これは、神経細胞死、梗塞の大きさ、および神経学的結果の減少によって明らかである。さらに、多くのインビトロでの研究は、ラット、マウス、ニワトリ、およびヒトを含む様々な種由来のニューロンにおけるＴＧＦ−β１の神経保護の能力を示している。非常に興味深いことに、ＴＧＦ−β１は、広範な死誘導薬剤／損傷（低酸素性／虚血、グルタミン酸興奮毒性、β−アミロイド、酸化的損傷、およびヒト免疫不全ウイルスを含む）に対して保護することが示された。ＴＧＦ−β１の神経保護効果は、ミトコンドリア膜ポテンシャルを維持する能力、Ｃａ２＋ホメオスタシスを安定化する能力、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ１の発現を増加させる能力、カスパーゼ３活性化を阻害する能力、およびプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１を誘導する能力に関連している。胚幹細胞の研究は、ＴＧＦ−β関連シグナリングによって負に調節される神経系統の詳細の構成要素として原始神経幹細胞を示している。もう１つのＴＧＦファミリーのメンバーであるＴＧＦ−αの内因性の発現は、成体の神経発生を正に調節することを示している。ＴＧＦ−αは、上衣下に存在する祖先細胞の十分な増殖および嗅球に移動する神経前駆体の十分な産生のために必要である。ＴＧＦ−αノックアウトマウスでは、これらの祖先細胞の増殖もまた、おそらく細胞周期の延長のため、加齢とともに減少する。老化現象または内因性ＴＧＦ−αの不在は、インビトロで上皮増殖因子の存在下において、単離される神経幹細胞の数に影響を与えない。
【００１１】
ヒトにおける免疫修飾のためのＴＧＦ−βの使用は、その毒性（マトリックス産生の過度の刺激を含む）、腎毒性、およびその他の有害な影響によって厳しく制限される。ＴＧＦ−βは、腫瘍形成の可能性を有し、そして糸球体症、肺線維症、硬皮症、および慢性的な移植片対宿主病に関与している。さらに、ＴＧＦ−βは、極めて強力な免疫抑制性のサイトカインであるが、証拠のいくつかの系統は、疾患に関連するかまたはトランスジェニック動物モデルにおけるかの両方のＴＧＦ−β発現の慢性的な刺激が、自己免疫炎症に逆説的に導き得るかまたは増強し得ることを示す。
【００１２】
Ｔ細胞免疫応答の負のレギュレーターとしてＴＧＦ−βの強力な抗炎症特性は、種々のＣＮＳ病理の病態生理学において重要な役割を果たすという証拠が増加している。したがって、このサイトカインは、損傷に関連するペプチドおよび治療介入のための可能性のある標的とみなされる。神経炎症およびミクログリア病理は、多くの神経学的疾患と関連する。ここで、最も古典的な疾患は、明らかに多発性硬化症のような神経免疫学的疾患である。しかし、これはまた、例えば、アルツハイマー病、レーヴィ体痴呆、エイズ痴呆複合症、血管性痴呆のような記憶喪失を顕著に特徴とする、または例えば、ピック病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、およびクロイツフェルトヤコブ病のような記憶喪失をあまり顕著に特徴としない認知の疾患も含む。さらに、炎症プログラムは、卒中、脳外傷、および脊髄損傷のような急性の傷害の後、活性化される。クロイツフェルトヤコブ病の異なる動物モデルでは、ミクログリアの活性化およびＴＧＦ−β１のアップレギュレーションが報告されている（Baker, C. A., Z. Y. Luら、(1999).「Microglial activation varies in different models of Creutzfeldt-Jakob disease.」J Virol 73(6):5089-5097）。
【００１３】
数百もの異なる神経変性疾患の中で、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症を含む一握りにしか注意が向けられていない。同様の神経変性の過程が、脳の異なる領域に影響を与え得、所定の疾患を徴候の観点から非常に異なるように見せているということを述べる価値がある。中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性疾患は、大脳皮質の疾患（アルツハイマー病）、大脳基底核の疾患（パーキンソン病）、脳幹および小脳の疾患、または脊髄の疾患（筋萎縮性側索硬化症）に分類され得る。
【００１４】
例えば、神経変性および神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（Multisystem Atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性髄膜脳炎、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、急性虚血／低酸素性障害、ＣＮＳ外傷、頭部外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病、白質病変、網膜変性、蝸牛変性、黄斑変性、迷路性難聴、ＡＩＤＳ関連痴呆、色素性網膜炎、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）がある。
【００１５】
（ＴＧＦ−β１のレベルへの影響）
（ＴＧＦ−β１のアップレギュレーションおよびその効果）
多くの研究は、神経保護または免疫調節の目的のためにＴＧＦ−β１のレベルを増加させようと試みた。アゴニスト研究は、ＴＧＦ−β１が中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の後の神経細胞死および梗塞の大きさを減少させることを示すが、逆に、アンタゴニスト研究は、ＭＣＡＯ後に神経細胞死および梗塞の大きさを増加させることを示しており、これはＴＧＦ−β１が、大脳虚血において神経保護の役割を有することを示唆している。マウスにおけるインビボでのＴＧＦ−β１のアデノウイルスに媒介された過剰発現についての最近の研究は、さらに、大脳虚血においてＴＧＦ−β１が神経保護の役割に関連し、これは、神経細胞死、梗塞の大きさ、および神経学的結果の減少によって明らかである。さらに、多くのインビトロでの研究は、ラット、マウス、ニワトリ、およびヒトを含む様々な種由来のニューロンにおけるＴＧＦ−β１の神経保護の能力を示している。非常に興味深いことには、ＴＧＦ−β１は、広範な死誘導薬剤／損傷（低酸素性／虚血、グルタミン酸興奮毒性、β−アミロイド、酸化的損傷、およびヒト免疫不全ウイルスを含む）に対して保護することが示された。ＴＧＦ−β１の神経保護効果は、ミトコンドリア膜ポテンシャルを維持する能力、Ｃａ２＋ホメオスタシスを安定化する能力、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ１の発現を増加させる能力、カスパーゼ３活性化を阻害する能力、およびプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１を誘導する能力に関連している。
【００１６】
ヒトにおける免疫修飾のためのＴＧＦ−βの使用は、その毒性（マトリックス産生の過度の刺激を含む）、腎毒性、およびその他の有害な影響によって厳しく制限される。ＴＧＦ−βは、腫瘍形成の可能性を有し、そして糸球体症、肺線維症、硬皮症、および慢性的な移植片対宿主病に関与している。さらに、ＴＧＦ−βは、極めて強力な免疫抑制性のサイトカインであるが、証拠のいくつかの系統は、疾患に関連するかまたはトランスジェニック動物モデルにおけるかの両方のＴＧＦ−β発現の慢性的な刺激が、自己免疫炎症に逆説的に導き得るかまたは増強し得ることを示す。
【００１７】
本発明者らの主な所見は、上記ＣＮＳにおける保護効果について記載されている同一のＴＧＦ−βが、生理学およびほとんどすべてのＣＮＳの病理学においてＣＮＳ幹細胞修復の主な負の調節分子であることである。ミクログリア細胞によって（疾患に対する応答において低い生理学的なレベルまたは高いレベルのいずれかで）産生されるＴＧＦ−βは、細胞間マトリックスを介してＣＳＦ中へ漏出する。そこで、上衣下の祖先を含む細胞層領域または潜在的なその他のＣＮＳ幹細胞再生の領域で、ＣＮＳの前駆細胞集団／幹細胞集団において非常に調節および発現されるＴＧＦ−ＲＩＩおよびＴＧＦ−ＲＩと、自由におよび直接的に相互作用し得る。この所見は、負の調節からなり、逆に、高いＣＳＦ−ＴＧＦ−βレベルの場合に低い幹細胞再生を生じる。普通でなく意外なことに、ＴＧＦ−ＲＩＩの極端に高い発現レベルおよび活性は、本発明者らのＳＶＺまたは海馬の実験では、前駆細胞／幹細胞増殖の部位にある。例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）のような緩衝液を介したシグナルの伝達もまた、普通ではない。したがって、完全な調節回路であり、そこでは、生理学的および病理学的な調節が非常に類似しているが、強度によってのみ変化する（すなわち、ＣＳＦ中のＴＧＦ−βのレベル、および標的細胞でのＴＧＦ−Ｒ発現のレベル）。個々の疾患の病理学的表現型は、遺伝学的な欠損（例えば、シヌクレイノパチー、スーパーオキサイドジスムターゼ変異、トリヌクレオチド反復疾患）または外傷、低酸素性、血管疾患または炎症、またはＣＮＳの老化のような多様な変化によって特徴付けられる。しかし、疾患病理学の執行者は、常にミクログリア細胞／マクロファージ集団が産生したＴＧＦ−βである。一方では、それは、神経保護および免疫抑制であり、潜在的に疾患病理学によって与えられる柔組織への急性炎症性損傷および神経損失を減少させることを助ける。間接的には、ヤヌス頭のように、同一の分子は、前駆細胞または幹細胞レベルで、ＴＧＦ−β−ＴＧＦ−Ｒループを妨げることによって、自身の幹細胞／前駆細胞によるＣＮＳの損傷修復を妨げ、それによって幹細胞の増殖を顕著に抑制する。この場合、幹細胞としては、ＣＮＳ内からの前駆細胞に由来する細胞のみが見られるだけではなく、おそらく、それらの幹細胞／前駆細胞もまた、骨髄のそれぞれの血管からＣＮＳ柔組織に浸入しようと試みる。これはまた、柔組織中のＴＧＦ−βレベルが単に減少することによって、ＣＮＳにおける神経保護／免疫抑制効果が、炎症および／または直接的な神経のアポトーシスによる重篤な急性損傷を導くことを廃止することを意味する。
【００１８】
したがって、ＴＧＦ−Ｒレベルでの局所的な介入は、修復のための安定な介入への唯一の魅力的な経路であるように思われ、脳へのＴＧＦ−βの有用な効果を危険にさらさない。したがって、本発明は、ＴＧＦ−Ｒを発現する前駆細胞／幹細胞プールにおけるＴＧＦ−β１の生物学的活性を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。このオリゴヌクレオチドまたはこのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む薬学的組成物は、疾患の診断／予防処置／予防または治療に有用であり、ここで、神経発生または神経再生に、有用な効果を有する。それらはまた、治療的予防（例えば、卒中または頭部損傷の後）において、これ以下に記載されるメカニズムが効果的である前に、本発明者らの実験に示されるように、有用である。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「妨害する」は、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性またはその発現を調節すること、好ましくは減少させることまたは消失させることを意味する。生物学的活性の調節は、直接的相互作用、すなわち、ＴＧＦ−Ｒ、好ましくはＴＧＦ−ＲＩＩへの化合物の結合によって、あるいは間接的な相互作用、例えば、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性に関連する化合物との相互作用によって、引き起こされ得る。局所的または全身的な移植のすべてのタイプ（例えば、エクスビボ増殖、同種異系細胞）を含む、ＣＮＳでの神経再生を改善する目的または神経／造血幹細胞もしくは前駆細胞を増加させる目的で、この調節回路を妨害するためのＴＧＦ−βＲＩ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、またはそのシグナル伝達をターゲティングする薬剤として作用する適切な化合物を、以下に列挙する。
【００２０】
（ａ）プラスミド、ベクターまたは天然の／合成の／突然変異したウイルス、種々の改変型のオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ、ＬＮＡ、２’Ｆ−ＡＮＡ、タンパク質−ヌクレオチド複合体、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたはマイクロｍｉＲＮＡ、メチルメトキシ、ホスホロアミデート、ＰＮＡ、モルホリノ、ホスホラミデート、シクロヘキセン（ＣｅＮＡ）、ギャップマー（gap-mere）、リボザイム、アプタマー、ＣｐＧオリゴ、ＤＮＡザイム、リボスイッチ、または脂質もしくは脂質含有分子）、
（ｂ）リンカーのすべてのタイプを含むペプチド、ペプチド複合体、
（ｃ）低分子、ラフト（raft）またはカベオリ（caveoli）改変剤、
（ｄ）ゴルジ体の改変剤、
（ｅ）抗体およびそれらの誘導体、特にキメラ、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント、または
（ｆ）キャリア、リポソーム、ナノ粒子、複合体、または上述の構成物を含む任意のその他の送達システム
が、上述の回路を標的とするために用いられ得、そのため神経再生が回復または改善される。
【００２１】
しかし、上述の薬剤の中で、アンチセンスオリゴヌクレオチドが最も好ましい。なぜなら、それらは、非常に早い段階でＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの形成を妨害するからである。これらの分子の主な利点は、それらの極端に良好な全身的および局所的な耐性と組み合わせた、極端に高い標的特異性にある。それらは、柔組織またはＣＳＦ腔のいずれかへのＣＮＳへの局所的な適用に、非常によく適している。さらに、それらは非常に安定であり、したがって、移植されたポンプシステムから容易に適用され得る。その費用効果もまた注目すべきである。
【００２２】
したがって、本発明の好ましい実施態様では、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードしている遺伝子の発現を妨害するために有用な化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成は、アンチセンス相互作用のためのＴＧＦ−Ｒ遺伝子またはＴＧＦ−ＲＩＩ遺伝子内の部位の決定を含み、そのため所望の効果（例えば、タンパク質の発現の阻害）が生じる。好ましい遺伝子内の部位は、（ａ）遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または翻訳終止コドンを含む領域または（ｂ）「ループ」または「バルジ」であり、すなわち二次構造の部分ではないｍＲＮＡの領域である。一旦、１またはそれ以上の標的部位が同定されると、標的に十分に相補的な（すなわち、十分にハイブリダイズし、そして十分な特異性を有する）オリゴヌクレオチドが選択されて、所望の効果を与える。
【００２４】
したがって、本発明は、８から５０個の核酸塩基を含む配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその模倣物に関する。該オリゴヌクレオチドは、８から５０個の核酸塩基を有する配列番号１または配列番号２または配列番号９４〜９６の一部を示す。さらに、８から５０個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２または配列番号９４〜９６の正確な部分配列である必要はない。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６に見られる部分配列と少なくとも８０％、好ましくは８４％、より好ましくは８８％、そして最も好ましくは９２％同一であれば、十分である。好ましいオリゴヌクレオチドは、８から５０個の核酸塩基を含む配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、該配列は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域、あるいはＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と十分にハイブリダイズし得、該ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩが「ループ」または「バルジ」であり、そして二次構造の部分ではない。これは、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子の対応する領域と少なくとも８０％の相補的な配列を有するか、または好ましくは（ａ）ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域と、または（ｂ）「ループ」または「バルジ」であり、すなわち二次構造の部分ではないＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と、少なくとも８０％相補的な配列を有することを意味する。
【００２５】
８から５０個の核酸塩基、好ましくは１５から２５個の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましく、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域と、あるいはＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と、十分にハイブリダイズし得、該ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩが「ループ」または「バルジ」であり、そして二次構造の部分ではない。
【００２６】
好ましくは、以下の配列番号３の延長された配列であり、これは以下の一般式によって表され得る：
５’−ＸＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＺ−３’
【００２７】
ここでＸは、以下のオリゴヌクレオチドを含む群から選択される。
ＡＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＧＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＣＴＧＡＧ、ＣＣＴＧＡＧ、ＣＴＧＡＧ、ＴＧＡＧ、ＧＡＧ、ＡＧ、Ｇ、
【００２８】
そして、Ｚは、以下のオリゴヌクレオチドを含む群から選択される。
ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧ、ＧＣＡＧＡＣＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣＣ、ＧＣＡＧＡＣＣ、ＧＣＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡ、ＧＣ、Ｇ、
【００２９】
そして、ＸおよびＺはともに、３４個以下の核酸塩基およびその模倣物を含む。
【００３０】
より好ましくは、以下のオリゴヌクレオチド配列およびその変異体または模倣物である。
配列番号３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４：５’−ＧＣＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡ−３’
配列番号５：５’−ＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＧＴ−３’
配列番号６：５’−ＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴ−３’
配列番号７：５’−ＧＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡ−３’
配列番号８：５’−ＧＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＴ−３’
配列番号９：５’−ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡ−３’
配列番号１０：５’−ＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧ−３’
配列番号１１：５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴＧ−３’
配列番号１２：５’−ＧＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡ−３’
配列番号１３：５’−ＴＡＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＡＧＡＣＡＴＧＧ−３’
配列番号１４：５’−ＴＴＴＴＧＡＡＡＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣ−３’
配列番号１５：５’−ＴＣＡＧＣＣＡＧＴＡＴＴＧＴＴＴＣＣＣＣ−３’
配列番号１６：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＴＡＧ−３’
配列番号１７：５’−ＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＡ−３’
配列番号１８：５’−ＴＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＡＧＧＧＡＧＣＣＧ−３’
配列番号１９：５’−ＴＡＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＡＧＧＧ−３’
配列番号２０：５’−ＡＧＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡ−３’
配列番号２１：５’−ＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣ−３’
配列番号２２：５’−ＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣ−３’
配列番号２３：５’−ＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＴＡＧＡＣＡＴＣＧＧ−３’
配列番号２４：５’−ＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧ−３’
配列番号２５：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧ−３’
配列番号２６：５’−ＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＧＧＣＡＣＡ−３’
配列番号２７：５’−ＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴ−３’
配列番号２８：５’−ＣＣＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴ−３’
配列番号２９：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣ−３’
配列番号３０：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣ−３’
配列番号３１：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’
配列番号３２：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号３３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号３４：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号３５：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号３６：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号３７：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣ−３’
配列番号３８：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’
配列番号３９：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号４０：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号４１：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４２：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号４３：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４４：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４５：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’
配列番号４６：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号４７：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号４８：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４９：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５０：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５１：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５２：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡ−３’
配列番号５３：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号５４：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号５５：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５６：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５７：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５８：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号５９：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号６０：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号６１：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号６２：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６３：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号６４：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号６５：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号６６：５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６７：５’−ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号６８：５’−ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号６９：５’−ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７０：５’−ＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号７１：５’−ＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７２：５’−ＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
【００３１】
さらにより好ましくは、以下のオリゴヌクレオチド配列およびその変異体および模倣物である。
配列番号３３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号３４：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号３５：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号３６：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４１：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４２：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号４３：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４４：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４９：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５０：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５１：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５６：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５７：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６２：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７３：５’−ＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣ−３’
配列番号７４：５’−ＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣ−３’
配列番号７５：５’−ＡＡＣＧＧＣＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴ−３’
配列番号７６：５’−ＡＡＣＡＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣ−３’
配列番号７７：５’−ＡＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＴ−３’
配列番号７８：５’−ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡ−３’
配列番号７９：５’−ＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴ−３’
配列番号８０：５’−ＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣ−３’
配列番号８１：５’−ＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡ−３’
配列番号８２：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号８３：５’−ＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’
配列番号８４：５’−ＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴ−３’
配列番号８５：５’−ＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣ−３’
配列番号８６：５’−ＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡ−３’
配列番号８７：５’−ＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴ−３’
配列番号８８：５’−ＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣ−３’
配列番号８９：５’−ＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧ−３’
配列番号９０：５’−ＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧ−３’
配列番号９１：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号９２：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＴＴＧＣ−３’
配列番号９３：５’−ＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧ−３’
【００３２】
本発明の請求の範囲から外れるのは、次の２つの公知の配列である：５’−ＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣ−３’（J. Clin. Endocrinology & Metabolism 2003, 88(10), 4967-4976）および５’−ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＴＣ−３’（Developmental Biology 1996, 180, 242-257）。
【００３３】
特に好ましくは、配列番号３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’の配列である。
【００３４】
したがって、本発明はまた、配列番号３〜配列番号９３のいずれかと密接に関連する配列に関する。該配列は、本明細書において「変異体」という。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの異なる方法によって改変され得る。骨格内での改変が可能であり、そしてヌクレオシド間の骨格においてリン原子が部分的にまたは完全に他の原子に置換されたオリゴヌクレオチドをいう。好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸エステルを含むメチル、エチルおよびＣ３〜Ｃ１０アルキルホスホン酸エステルおよびキラルのホスホン酸エステル、ホスフィン酸エステル、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホン酸エステル、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合、２’−５’結合したその類似体を有するボラノリン酸エステル、およびこれらの反転された極性を有するものが挙げられる。ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’結合される。これらの種々の塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
【００３５】
３’末端および／または５’末端に、１、２、３、４、または５個のさらなる核酸塩基が付加された配列番号３〜配列番号９３の変異体もまた好ましい。このようなさらなる核酸塩基は、好ましくは配列番号１、２、９４、９５、または９６内の５個の核酸塩基であり、それらは、それぞれの配列の前後に直接にくる。さらに、この好ましい変異体は、１、２、３、または４個の核酸塩基置換を有し得、すなわち、この好ましい変異体の内部で、１、２、３、または４個のヌクレオチドが、別の核酸塩基によって置換され得る。これらの変異体はまた、本明細書に開示されている骨格または塩基または糖部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）の改変のいずれかも含み得ることが強調されるべきである。
【００３６】
リン原子を含まない好ましい改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有する骨格；シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格、上述の骨格タイプの混合および混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびＣＨ２構成部分を有するその他の骨格を含む。
【００３７】
本発明のさらに好ましい実施態様は、ホスホロチオエート骨格またはヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドを含み、そして特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、天然のホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される）を有するオリゴヌクレオチドを含む。骨格中にモルホリノ部分を有するオリゴヌクレオチドまたはモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドまたはアミノアルキルアミド骨格を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい（下記を参照のこと）。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖の模倣物を有し得る。
【００３８】
【化１】
【００３９】
Ｂとは、プリンまたはピリミジン基のような塩基部分をいい、さらに誘導化され得る。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つの改変は、オリゴヌクレオチドに１つまたはそれ以上の部分または結合体を化学結合することを含み、そしてそれはオリゴヌクレオチドの活性を高め、細胞分布または細胞への取り込みを増強する。改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１またはそれ以上の置換されたまたは改変された糖部分を含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含む：−ＯＨ、−Ｆ、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｎ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｓ−アルケニル、−Ｎ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｓ−アルキニル、−Ｎ−アルキニル、−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０のアルキルまたはＣ２からＣ１０のアルケニルおよびＣ２からＣ１０のアルキニルであり得る。特に好ましい改変された糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これはまた、２’−Ｏ−（２−メトキシエトキシ）または２’−ＭＯＥとして知られている）およびＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）のような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（２’−ＤＭＡＯＥとして知られている）である。特に好ましくはまた、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］であり、ここで、ｎおよびｍは、それぞれ独立して１から１０の整数である。他の好ましい改変は、２’−メトキシ、２’−アミノプロポキシ、および２’−フルオロを含む。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の基の１つを含む：−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣ３Ｈ７、−Ｏ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣ（ＣＨ３）３、−ＯＣ４Ｈ９、−ＯＰｈ、−ＯＣＨ２−Ｐｈ、−ＮＯ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｎ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＮＣＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＣ３Ｈ７、−ＣＯ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＳＨ、−ＳＣＨ３、−ＳＣ２Ｈ５、−ＳＣ３Ｈ７、−Ｓ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＳＯＣＨ３、−ＳＯＣ２Ｈ５、−ＳＯＣ３Ｈ７、−ＳＯ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２Ｃ２Ｈ５、−ＳＯ２Ｃ３Ｈ７、−ＳＯ２−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣ２Ｈ５、−ＮＨＣ３Ｈ７、−ＮＨ−シクロ−Ｃ３Ｈ５、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２、−Ｎ（Ｃ３Ｈ７）２、−Ｎ（シクロ−Ｃ３Ｈ５）２、−Ｎ［ＣＨ（ＣＨ３）２］２−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ５Ｈ１１、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）２、−Ｃ２Ｈ４−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ６Ｈ１３、−Ｃ３Ｈ６−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ２Ｈ４−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ２Ｈ４−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ（ＣＨ３）３、Ｃ７〜Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ脱離基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物速度特性および／または薬力学特性を改善するための基、または類似の特性を有する置換基。デオキシ核酸塩基も好ましい。
【００４１】
類似の改変はまた、ヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位または２’−５’結合したオリゴヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位にも行われ得る。
【００４２】
好ましい改変は、以下の構造断片によって表され得る。
【００４３】
【化２】
【００４４】
ここで、Ｒは、２’位についての上述の置換基のいずれかを表し、特に、−Ｈ、−Ｆ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３を表し、ＸおよびＸ’は、それぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−であり、そしてＹは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３を表す。より好ましくは、ＸおよびＸ’が酸素を表し、そしてＹが硫黄を表す変異体である。
【００４５】
さらに、純粋なジアステレオマーオリゴヌクレオチドまたはその模倣物または変異体が好ましい。特に好ましくは、ＳｐジアステレオマーおよびＲｐジアステレオマーである。
【００４６】
【化３】
【００４７】
最も好ましくはまた、配列番号３〜配列番号９３の配列、そして特に配列番号３の配列であり、ここで、本明細書に開示されている１またはそれ以上の改変が存在する。好ましくは、骨格中にホスホロチオエート部分または完全なホスホロチオエート骨格であり、ホスホロチオエートのＲｐジアステレオマーおよびＳｐジアステレオマーが好ましい。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基置換を含み得る。核酸塩基は、４つの標準のヌクレオチド塩基のアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）である。改変された核酸塩基は、その他の合成および天然の核酸塩基を含み、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体；ウラシル（Ｕ）、６−カルボキシウラシル、Ｎ６−メチルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル；８−ハロ−、８−アミノ−、８−チオール−、８−チオアルキル−、８−ヒドロキシル−およびその他の８−置換されたアデニンおよびグアニン；５−ハロ−、特に５−ブロモ−、５−トリフルオロメチル−およびその他の５−置換されたウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニン；７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシンなどが挙げられ、５−メチルシトシン置換が好ましい。なぜなら、これらの改変は、核酸の二重鎖の安定性を増加させることが示されているからである。
【００４９】
好ましくは、１、２、３、または４個の核酸塩基が、その他の核酸塩基または化学的に改変された核酸塩基によって置換される配列番号３〜配列番号９３のいずれか１つの配列を有する変異体である。変異体とは、１〜４個の核酸塩基が、例えば、ウラシル（Ｕ）、５−ハロウラシル、５−メチルシトシン、および／またはＮ６−メチルアデニンによって置換される配列番号３〜配列番号９３の配列をいう。特に好ましくは、１、２または３個の核酸塩基が、上述の部分によって置換される配列番号３の変異体である。
【００５０】
「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物または変異体のオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性のヌクレオシド（骨格）間の結合で構成されるオリゴヌクレオチド、および天然には存在しない同様に機能する部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような改変されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞の取り込みが高められる、核酸標的への親和性が高められる、およびヌクレアーゼの存在下で安定性が増加するという所望の特性のため、しばしば天然の形態よりも好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の形態が好ましいが、本発明は、その他のオリゴマーのアンチセンス化合物を含み、以下に記載されているようなオリゴヌクレオチド模倣物に制限されずに含む。本発明のアンチセンス化合物は、約８から約５０個の核酸塩基（すなわち、約８から約５０個の結合されたヌクレオシド）を含み、好ましくは９〜４２個、１０〜３６個、１１〜３２個、１２〜３０個、１３〜２８個、１４〜２６個、そして最も好ましくは１５〜２５個の核酸塩基を含む。
【００５１】
特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは約１５から約２５個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、およびその他の短触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドを含み、それらは、標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する。
【００５２】
用語「塩」とは、生理学的および／または薬学的に受容可能な化合物の塩、特に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩をいう。薬学的に受容可能な塩基付加塩は、無機塩基を用いて形成される。適切な有機塩基または無機塩基の例は、金属イオン（例えば、アルミニウム、ナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属イオン、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリ土類金属イオン）、またはアミン塩イオンまたはアルカリまたはアルカリ土類水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩から誘導される塩基である。例えば、水溶性のＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、炭酸カリウム、アンモニアおよび重炭酸ナトリウム、アンモニウム塩、１級、２級および３級アミン（例えば、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、メチルアミン、ｔ−ブチルアミンのような低級アルキルアミン、プロカイン、エタノールアミン、ジベンジルアミンおよびＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンのようなアリールアルキルアミン、Ｎ−エチルピペリジンのような低級アルキルピペリジン、シクロヘキシルアミンまたはジシクロヘキシルアミンのようなシクロアルキルアミン、モルホリン、グルカミン、Ｎ−メチルおよびＮ，Ｎ−ジメチルグルカミン、１−アダマンチルアミン、ベンザチン）、またはアルギニン、リジン、オルニチンまたは元来中性または酸性のアミノ酸のアミドのようなアミノ酸から誘導される塩、クロロプロカイン、コリン、プロカインなどを含む。
【００５３】
塩基性である本発明の化合物は、有機酸または無機酸の薬学的に受容可能な塩を形成し得る。このような酸付加塩形成に適切な酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸、硝酸、ギ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸、キナ酸（china acid）、マンデル酸、ｏ−メチルマンデル酸、水素−ベンゼンスルホン酸、ピクリン酸、アジピン酸、Ｄ−ｏ−トリル酒石酸、タルトロン酸、α−トルイル酸、（ｏ、ｍ、ｐ）−トルイル酸、ナフチルアミンスルホン酸、およびその他の当業者に周知の鉱酸またはカルボン酸が挙げられる。塩は、遊離の塩基形態に十分な量の所望の酸を接触させることによって調製されて、従来の方法で塩を製造する。
【００５４】
遊離の塩基形態は、適切な薄い塩基の水溶液（例えば、希水酸化ナトリウム水溶液、希炭酸カリウム水溶液、希アンモニア水、および希重炭酸ナトリウム水溶液）で塩を処理することによって再生され得る。遊離の塩基形態は、それらに対応する塩形態と、多少特定の物理的特性（例えば、極性溶媒中の溶解性）が異なるが、塩は、その他の点では、本発明の目的についてそれらの対応する遊離の塩基形態と同等である。
【００５５】
あるいは、本発明の薬学的組成物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを（例えば、哺乳動物宿主中で）転写させるベクターを含む。好ましくは、このようなベクターは、遺伝子治療のために有用なベクターである。遺伝子治療のために有用な好ましいベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、牛痘）であり、またはより好ましくはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスである。さらにより好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたは鳥類のレトロウイルス誘導体である。このような本発明に用いられ得るレトロウイルスベクターは、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーヴィマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳ガンウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である。最も好ましくは、マウスベクターと比較してより幅広い宿主範囲を与えるヒト以外の霊長類レトロウイルスベクターが用いられる（例えば、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ））。組換えレトロウイルスが不完全なので、感染性の粒子を産生するために、補助が要求される。このような補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下で、レトロウイルスの構造遺伝子のすべてをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を用いることによって与えられ得る。適切なヘルパー細胞株は、当業者に周知である。このベクターは、さらに、選択マーカーをコードする遺伝子を含み得、そのため形質導入された細胞が同定され得る。さらに、レトロウイルスベクターは、標的特異的になるような方法で改変され得る。これは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって達成され得る。当業者は、標的特異的ベクターを生成させるためのさらなる方法を知っている。さらに、インビトロまたはインビボでの遺伝子治療に適切なベクターおよび方法は文献に記載され、当業者に公知である（例えば、ＷＯ９４／２９４６９またはＷＯ９７／００９５７を参照のこと）。標的器官（例えば、脳組織）のみでの発現を達成するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のためのＤＮＡ配列は、組織特異的なプロモーターに連結され得、そして遺伝子治療のために用いられ得る。
【００５６】
オリゴヌクレオチドの構造内で、リン酸基は、一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものをいう。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’から５’ホスホジエステル結合である。本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物または変異体の特定の例としては、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保持するものおよび骨格中にリン原子を保持しないものを含む。安定性を増加させ得る改変されたオリゴヌクレオチド骨格は、当業者に公知であり、好ましくはこのような改変が、ホスホロチオエート結合、またはホスホネート（ホスホン酸）基またはスルフェート（硫酸）基またはスルホネート（スルホン酸）基またはスルホキシドによる１またはそれ以上のホスフェート基（リン酸基）の置換である。好ましいオリゴヌクレオチドの模倣物は、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチドの模倣物であり、そしてペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換される。核酸塩基は保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される（例えば、Nielsenら、Science 254 (1991), 1497-1500を参照のこと）。
【００５７】
本発明において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシド間またはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。本明細書で用いられるように、用語「相補的」とは、２つのヌクレオチド間で正確な対になるための能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができれば、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考えられる。それぞれの分子中の対応する位置の十分な数が互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズし得る」および「相補的な」は、安定かつ特異的な結合がオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間に生じるような十分な程度の相補性、または正確な対を示すために用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列が、特異的にハイブリダイズし得る標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが当業者に理解される。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し、そのため有用性の喪失の原因となる場合、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズし得、そして特異的な結合が所望される条件下で（すなわち、治療的処置の場合）、非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的な結合を避けるために十分な程度の相補性がある。
【００５８】
その他の好ましいオリゴヌクレオチドの模倣物において、糖およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち、ヌクレオチド単位の骨格）は、新しい基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。例えば、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されるこのようなオリゴヌクレオチドの模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換される。核酸塩基は保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つの改変は、１つまたはそれ以上の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを含み、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する。このような部分は、コレステロール部分のような脂質部分、コール酸、チオエーテル、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明において、「キメラの」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであって、それらは、２またはそれ以上の化学的に異なる領域を含み、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチド）から作製される。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には少なくとも１つの領域を含み、ここで、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する高められた耐性、高められた細胞取り込み、および／または標的核酸に対する高められた結合親和性を与えるように改変さる。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂し得る酵素に対する基質として働き得る。例としては、ＲＮアーゼＨは、細胞エンドヌクレアーゼであり、それは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の開裂を生じ、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が非常に高められる。したがって、キメラオリゴヌクレオチドが用いられると、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、かなりの結果が、しばしばより短いオリゴヌクレオチドで得られ得る。本発明のキメラアンチセンス化合物は、２またはそれ以上のオリゴヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／または上述のようなオリゴヌクレオチドの模倣物の複合構造として形成され得る。このような化合物はまた、当業者にはハイブリッドまたはギャップマー（gapmer）といわれている。
【００６０】
特に、本発明は、神経変性疾患、神経外傷、神経血管性および神経炎症性を含む感染後の疾患の予防および治療のための、本明細書に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその変異体または模倣物の使用に関する。用語「神経変性疾患および神経炎症性疾患」とは、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（Multisystem Atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性髄膜脳炎、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、卒中を含む急性虚血／低酸素性障害、ＣＮＳ外傷、頭部外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病、白質病変、網膜変性、蝸牛変性、黄斑変性、迷路性難聴、ＡＩＤＳ関連痴呆、色素性網膜炎、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）をいう。
【００６１】
より一般的には、本発明は、疾患を治療するための本明細書に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその変異体または模倣物の使用に関し、その疾患は、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの（例えば、ＴＧＦ−βの高められたレベルによる）アップレギュレートされたまたは高められたシグナリングに関連する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それによって、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害する。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせる代わりに、アンチセンス化合物が用いられ得る。アンチセンス化合物とは、本明細書に開示されているようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを転写させるベクター、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、および短触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドをいい、それらは、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズする。このアンチセンス化合物は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害する。したがって、この場合、疾患状態の間に存在するＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの量は減少する。
【００６２】
本明細書に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス化合物は、損傷を受けた神経経路の再生および機能的な再連結のために、ならびに種々の神経変性疾患および神経炎症性疾患の治療のために有用である。
【００６３】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性を妨害するために有用な化合物は、レセプターへのＴＧＦ−β１の結合を減少させるまたは阻害する化合物である。このような化合物の好ましい例は、ＴＧＦ−βレセプター、好ましくはＴＧＦ−βレセプターＩＩに対する（中和）抗体である（Linら、1992を参照のこと）。用語「抗体」とは、好ましくは、プールされた異なるエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体、および全く異なるモノクローナル抗体調製物から本質的になる抗体に関する。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって、例えば、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩまたは対応するレセプターのフラグメントを含む抗原から作製される。本明細書で用いられるように、用語「抗体（Ａｂ）」または「モノクローナル抗体（Ｍａｂ）」とは、完全な分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図され、それらは、タンパク質に特異的に結合し得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に除去され、そして完全な抗体よりも非特異的な組織結合を有し得ない（Wahlら、J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)）。したがって、これらのフラグメントは、ＦＡＢまたはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と同様に好ましい。さらに、本発明の目的のために有用な抗体としては、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。
【００６４】
本発明の使用のためのさらなる好ましい化合物は、可溶性ＴＧＦ−βレセプターである。このような可溶性ＴＧＦ−βレセプターは、抗体のＦｃ領域とＴＧＦ−βレセプターの細胞外ドメインとの融合タンパク質である。このような分子は、可溶性ＴＧＦ−βへの高い親和性を有する。したがって、遊離のＴＧＦ−β１の濃度は劇的に減少する。製造者のプロトコルによれば（R&D Systems、ドイツ）、ヒトＴＧＦ−βＲＩＩの１５９個のアミノ酸残基の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列は（Linら、Cell 1992, 68(4),775-785）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合され、そしてこのキメラタンパク質が、マウス骨肉腫細胞株ＮＳＯで発現された。
【００６５】
レセプターに関して、本明細書で用いられている用語「可溶性」とは、好ましくはレセプターの細胞外ドメインのみを含むレセプターのフラグメント、またはその天然のリガンド（例えば、ＴＧＦ−β１）になお結合し得る部分に関する。当業者は、このようなフラグメントをレセプターの公知のアミノ酸配列に基づいて決定し得、そしてレセプターの細胞外ドメインの決定は、周知の方法の使用によって、例えば、コンピュータプログラム（親水性プロット）によって行われ得る。本発明の使用の特に好ましい実施態様では、可溶性ＴＧＦ−βレセプターは、ＴＧＦ−βレセプターＩＩである。
【００６６】
本発明はまた、（ａ）ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性、またはＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現、または（ｂ）ＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−Ｒシグナリングを妨害する化合物を同定する方法に関し、
（ａ）ＴＧＦ−β１およびニューロン前駆細胞を含む試験システムとともに、候補化合物をインキュベートする工程；および
（ｂ）活性なＴＧＦレセプターの発現または該ニューロン前駆細胞の増殖をアッセイする工程；を包含し、
（ｃ）該試験化合物の不在下での試験システムと比較して、（ｉ）活性なＴＧＦレセプターの発現の抑制の廃絶、または（ｉｉ）ニューロン前駆細胞の増殖の抑制の廃絶が、所望の特性を有する候補化合物の存在が示される。
【００６７】
このような候補化合物の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、またはモール分子（mall molecule）が挙げられる。このような分子は、公知の技術を用いて、合理的に設計され得る。好ましくは、スクリーニングのために用いられる試験システムは、類似の化学的および／または物理的特性の物質を含み、最も好ましくは、この物質は同一である。本発明の使用によって調製および同定され得る化合物は、発現ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリー）、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さな有機化合物、リガンド、ホルモン、ペプチド模倣物、ＰＮＡなどであり得る。より最近では、ＷＯ９８／２５１４６は、所望の特性、特に、ポリペプチドまたはその細胞レセプターに作動、結合、または拮抗できる能力を有する化合物について複合体のライブラリーをスクリーニングするためのさらなる方法を記載した。このようなライブラリー中の複合体は、試験を受ける化合物、化合物の合成における少なくとも１つの工程を記録するタグ、およびレポーター分子による影響を受けやすい改変つなぎ鎖を含む。つなぎ鎖の改変は、複合体が所望の特性を有する化合物を含むことを示すために用いられる。タグは、このような化合物の合成における少なくとも１つの工程を示すために解読され得る。本発明のＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩまたはこのような分子をコードする核酸分子と相互作用する化合物を同定するためのその他の方法は、例えば、ファージディスプレーシステムを用いるインビトロスクリーニングおよびフィルター結合アッセイまたは例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ装置（Pharmacia）を用いる相互作用の「リアルタイム」測定である。これらのすべての方法は、本発明において用いられ得、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性または該レセプターの発現、またはＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−Ｒシグナリングを妨害する化合物を同定する。
【００６８】
例えば、ＴＧＦ−βレセプターへの基質またはリガンドとして作用し得る小さな有機化合物の模倣物を設計、合成、および評価し得ることはまた、当業者に周知である。例えば、ハパロシン（hapalosin）のＤ−グルコース模倣物は、細胞毒性において、多剤耐性補助に関連するタンパク質と拮抗しているハパロシンとしての類似の有効性を示すことが記載されている（Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987を参照のこと）。ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−Ｒをコードする遺伝子はまた、インヒビターをスクリーニングするための標的として用い得る。インヒビターは、例えば、ＴＧＦ−Ｒ、好ましくはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のｍＲＮＡに結合するタンパク質を含み得、それによって、ｍＲＮＡの天然の構造を不安定にし、そして転写および／または翻訳を妨げる。さらに、そのフラグメントは、定義されたまたは定義されていない標的ＲＮＡ分子の構造を模倣し、このＲＮＡ分子に化合物が細胞増殖の遅延または細胞死を生じる細胞の内部で結合するＲＮＡフラグメントのような核酸分子を同定するための方法は、文献に記載されている（例えば、ＷＯ９８／１８９４７およびその引用文献を参照のこと）。これらの核酸分子は、薬学的に関心のある未知の化合物および疾患の治療における使用のための未知のＲＮＡ標的を同定するために用いられ得る。これらの方法および組成物は、ＴＧＦ−β１および／または対応するレセプターの発現レベルを減少させるために有用な化合物の同定に用いられ得る。本発明の方法により試験され同定され得る化合物は、発現ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリー）、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さな有機化合物、ホルモン、ペプチド模倣物、ＰＮＡなどであり得る（Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 7 (1994), 193-198および上述の引用文献）。さらに、ＴＧＦ−β１の推定レギュレーターをコードする遺伝子および／またはＴＧＦ−Ｐ１の上流または下流で効果を発揮する遺伝子は、例えば、挿入突然変異誘発を用いて、例えば、当業者に公知の遺伝子ターゲティングベクター用いて同定され得る。この化合物はまた、公知のインヒビターの機能的誘導体または類似体であり得る。このような有用な化合物は、例えば、トランス作用因子であり得、これは、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩまたはそれをコードする遺伝子の調節配列に結合する。トランス作用因子の同定は、当該技術分野で標準の方法を用いて行われ得る。タンパク質がタンパク質自身または調節配列に結合するか否か決定するために、標準的な天然のゲルシフト分析が行われ得る。タンパク質または調節配列に結合するトランス作用因子を同定するために、タンパク質または調節配列が、標準的なタンパク質精製法における親和性試薬として、または発現ライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩと相互作用するポリペプチドをコードする核酸分子の同定は、例えば、いわゆる酵母「２−ハイブリッドシステム」の使用によってin Scofield（Science 274 (1996), 2063-2065）にＴＧＦ−β１について記載されているように達成され得る。このシステムでは、ＴＧＦ−β１は、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに連結される。この融合ポリペプチドを発現し、適切なプロモーターによって駆動されるｌａｃＺレポーター遺伝子を含む酵母株は、ＧＡＬ４転写因子によって認識されており、活性化ドメインと融合される植物タンパク質またはそのペプチドを発現するｃＤＮＡのライブラリーで形質転換される。したがって、ｃＤＮＡの１つによってコードされるペプチドが、例えばＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩのペプチドを含む融合ペプチドと相互作用し得ると、複合体は、レポーター遺伝子の発現を示し得る。この方法では、例えば、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩおよびそれぞれのレセプターをコードする遺伝子は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩと相互作用するペプチドおよびタンパク質を同定するために用いられ得る。このシステムおよび類似のシステムが、インヒビターの同定のために、さらに利用され得ることは、当業者に明らかである。最後に、本発明は、疾患の予防または治療のための薬学的組成物の調製物についての上述の方法によって同定される化合物の使用に関し、神経発生または神経再生が有用な効果を有する。以下の実施例で、より詳細に本発明を説明する。
【００６９】
本発明はまた、ＴＧＦ−ＲシステムまたはＴＧＦ−ＲＩＩシステムの調節によって誘導された幹細胞／前駆細胞集団での治療または予防／予防処置の効果を同定するための方法に関する。これは、特に、個々の患者において、例えば、個々に合った服用をさせるなどの、好結果の治療を確立するのに役に立ち得る。診断方法は、以下を含む。
【００７０】
（ａ）ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩに対する特異的抗体であり、および核医学診断のための特定の核種（ヨウ素、テクネチウム、フッ素１８）または磁気共鳴画像での使用のためのガドリニウム塩、パーフルオロカーボン、またはその他の希土類生成物／常磁性化合物／鉄粒子のいずれかで標識された抗体の全身適用。本明細書では、ノイズ比を越える十分なシグナルがない場合、上衣下層で脳血液関門を手短に開く必要があり得る。この領域は、高度に血管が形成され、そしてコントラストが、３テスラ機具での視覚化のために十分であり得るが、ＢＢＢの開放が、さらなる補助であり得る。これは、高浸透圧溶液（例えば、グリセロール）またはＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）のいずれかの静脈内注射で行われ得る。
【００７１】
（ｂ）ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩに特異的なオリゴヌクレオチド（上述と同じ分子）の全身適用。それらは、次のように標識される：Ｇｄまたは１１１Ｉｎ−ＤＴＰＨ（５’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ３’−ビオチン）−（ＳＡ−ＯＸ２６、８Ｄ３またはＡｋ−ＨＩＲのいずれか）（これによって、ＧｄはＭＲＩのために用いられ、１１１Ｉｎは放射線診断のために用いられ；ＯＸ２６はマウスの実験のために用いられ、マウストランスフェリンレセプターをターゲットし、８Ｄ３はマウス抗ラットトランスフェリンレセプター抗体であり、ＡＫ−ＨＩＲはヒトインスリンレセプターに対する抗体である）。これらの化合物は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩに対して活性なｍＲＮＡを有するそれらの細胞にのみハイブリダイズし信号を送る。ＤＴＰＨは、キレート形成剤として用いられ、Ａｋ−ＨＩＲはインスリンレセプターを用いて、異なった関門を通過するオリゴヌクレオチドを往復輸送し、トランスフェリンレセプター抗体の場合、後者が膜横断シャトルに用いられる。多数のｍＲＮＡが利用可能な細胞には、特異なハイブリダイゼーションの安定性があり、したがって、はるかに強いシグナルが検出され得る（Susuki T, Schlachetzki Fら、J. Nucl. Med. 45:1766-1775, 2004, Susuki T, Zhang Y, Zhang Y-f, Schlachetzki F, Pardridgeら、Mol. Imaging 2005, 3, 356-363）。
【００７２】
（ｃ）（ｂ）のように同一の標識でダブルコルチン（Doublecortin）（ＤＣＸ）に特異的なオリゴヌクレオチド（上述と同じ分子）の全身適用（ＷＯ２００４／０６７７５１を参照のこと）。
【００７３】
好ましくは、薬学的組成物において、上述のこのような化合物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられる。「薬学的に受容可能」とは、活性成分の生物学的活性の効果を妨害せず、そして投与される宿主に対して有毒ではない任意のキャリアを含むことを意味する。適切な薬学的なキャリアの例は、当業者に公知であり、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このようなキャリアは、従来の方法によって処方され得、そして活性な化合物が、被験者に有効量で投与され得る。「有効量」とは、疾患の進行および重篤さに影響し、このような病状の減少または鎮静に導くのに十分な活性成分の量をいう。これらの疾病または疾患を治療および／または予防するために有用な「有効量」は、当業者に公知の方法を用いて決定され得る。適切な組成物の投与は、種々の方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内の投与によって行われ得る。投与経路は、当然治療の種類および薬学的組成物に含まれる化合物の種類に依存する。さらに、本発明の化合物は、リポソーム、複合体形成剤、レセプターをターゲットした分子、溶媒、保存剤および／または希釈剤と混合し投与され得る。
【００７４】
活性成分の連続放出、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその変異体または模倣物の少なくとも１つの連続放出のための注入液または固体マトリックス形態の薬学的調製物が好ましい。脳への局所的な投与に適している溶液または固体マトリックス形態の薬学的調製物がより好ましい。
【００７５】
用法用量は、主治医およびその他の臨床的な要因によって決定され得る。医薬分野においては周知であるように、任意の患者について用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間および投与経路、治療の種類、健康状態および同時に投与されるその他の薬剤を含む多くの要因に依存する。
【００７６】
本発明は、上述のように、オリゴヌクレオチド、その変異体または模倣物の少なくとも１つを含む薬学的調製物に関する。少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりにまたはこれに加えて、少なくとも１つのアンチセンス化合物が存在し得る。アンチセンス化合物とは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、本明細書に開示されているようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つを転写させるベクター、またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、および短触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドをいい、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸をハイブリダイズする。このアンチセンス化合物は、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害し、好ましくは、形成されるＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩの量をそれぞれ減少させ得る。
【００７７】
本発明の好ましい実施態様では、予防および／または治療され得る疾患は、神経変性疾患、ＣＮＳの神経炎症性疾患、急性虚血または脳外傷、低酸素性脳損傷である。神経変性疾患または神経炎症性疾患の好ましい例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（multisystem atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎およびウイルス性髄膜脳炎（幹細胞増殖の炎症後の低下を防止）、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、急性虚血／低酸素性障害、ＣＮＳ外傷、頭部外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病、白質病変、ＡＩＤＳ関連痴呆、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）；網膜変性、黄斑変性、色素性網膜炎、蝸牛変性、迷路性難聴が挙げられる。幹細胞再生の加齢依存的な減少もまた、記載され得る。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
ＴＧＦ−β１は、げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞の増殖を阻害する。
成体の雌性マウス（種々の系統）またはFischer-344ラット（３〜４カ月齢：Charles River、ドイツ）を屠殺し、そして脳および脊髄を取り出して、４．５ｇｍ／ｌのグルコース（Merck、ドイツ）を含む４℃のＤＰＢＳ（PAN、ドイツ）（ＤＰＢＳ／ｇｌｕ）に入れる。上に重なっている髄膜および血管を取り出す。海馬および上衣領域（側脳室の外側壁由来の上衣下および副脳室領域を含む（ＳＶＺ））を無菌的に取り出す。切り出した組織を新鮮なＤＰＢＳ／ｇｌｕに移し、１回洗浄し、ペトリ皿に移し、そして機械的に解離する。細胞懸濁液をＤＰＢＳ／ｇｌｕで洗浄して過剰の血液をすすぎ、そして０．０１％のパパイン（Worthington Biochemicals、英国）、０．１％のディスパーゼＩＩ（dispase II）（Boehringer Mannheim, Mannheim、ドイツ）、０．０１％のＤＮアーゼＩ（Worthington Biochemicals）、およびＨＢＳＳ（PAN）中に１２．４ｍＭのＭｇＳＯ４を含むＭｇ２／Ｃａ２（PAA、ドイツ）を含まないＰＰＤ溶液に再懸濁し、そして室温で３０〜４０分間消化する。細胞懸濁液を１０分ごとにすりつぶす。解離した細胞を回収し、そして２ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．１ｇｍ／ｌペニシリン／ストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁し、的確にすりつぶしながら３回洗浄する。最後に、単一細胞懸濁液を、Ｂ２７（Gibco BRL）（ＮＢ／Ｂ２７）、２ｍＭのＬ−グルタミン（PAN）、０．１ｇｍ／ｌペニシリン／ストレプトマイシン（PAN）、２ｇ／ｍｌヘパリン（Sigma, Taufkirchen、ドイツ）、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ−２（R&D Systems、ドイツ）、および２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（R&D Systems、ドイツ）が添加されたＮＢ培地（Gibco BRL、ドイツ）に再懸濁する。生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。細胞をＴ−２５培養フラスコに播種し、そして５％ＣＯ２のインキュベータ中で３７℃に維持する。単一細胞が懸濁培養の５〜７日以内に球体を形成し始め、次の週の間、塊および数が増え続ける。培地の半分を７日ごとに交換する。３〜２０継代数の細胞を実験に用いる（Wachs, F. P., S. Couillard-Despresら., Lab Invest 2003, 83(7), 949-962）。神経幹細胞および前駆細胞の培養は、さらにＮＳＣという。解離工程において、浮遊神経球体を含んでいる培養培地を、１５ｍｌの遠心管に回収し１２０ｒｃｆで５分間遠心分離する。ペレットを２００μｌのAccutase（Innovative Cell Technologies Inc., PAAによって配布されている）に再懸濁し、そして約１０回ピペットを用いてすりつぶす。次いで、細胞懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートする。解離した球体を再度すりつぶし、８００μｌのＮＢ／Ｂ２７培地に再懸濁する。解離した細胞を１２０ｒｃｆで５分間遠心分離し、そしてＮＢ／Ｂ２７培地に再懸濁する。アリコートを、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数して、生存細胞の量を決定する。細胞（１０５個）を、ＮＢ／Ｂ２７培地で長期継代のために、Ｔ７５培養フラスコにプレーティングする（フラスコごとに１０ｍｌの培養培地）。初代神経球体のAccutase処理後に得られた細胞は増殖し、二次神経球体を得る。初代神経球体細胞の培養後７〜９日、二次神経球体を継代する。初代培養および初代神経球体と同様に、二次神経球体の解離後に得られた単一細胞は増殖し、三次神経球体を得る（Wachs, F. P., S. Couillard-Despresら、Lab Invest 2003, 83(7), 949-962）。
【００７９】
１０４個のＮＳＣを、１ｍｌの容量のＮＢ／Ｂ２７培地を含む１２ウェルプレートに播種し、７日間培養する。播種後２時間、３日、および６日に、細胞を種々の濃度（０、２．５、５、１０、５０、および１００ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒトトランスホーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）（R&D Systems、ドイツ）の添加によって刺激する。７日目に、AccutaseＴＭの使用によって培養物を解離し、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。インビトロで、ＴＧＦ−β１は、用量依存様式で成熟した神経幹細胞および前駆細胞の増殖を阻害する（図１Ａ）。
【００８０】
類似の効果をヒト胎児神経前駆細胞で観察した。５０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１での処理により、７日以内にコントロールの約５０％まで細胞増殖が減少した（図１Ｂ）。
【００８１】
（実施例２）
神経幹細胞および前駆細胞におけるＴＧＦ−β１の効果は可逆的である。
ＴＧＦ−β１で誘導した増殖阻害が可逆的効果であるか否かを決定するために、ＮＳＣを実施例１に記載されているプロトコルに従って１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で７日間刺激する。解離後、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数し、そして増殖因子刺激された１０４個のＮＳＣを再播種し、そして実施例１に記載されているプロトコルに従って１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を用いてまたは用いず培養する。この解離／計数／再播種の手順を、７日ごとに行う。図２に示すように、培養３週後、最初にＴＧＦ−β１処理され現在ＴＧＦ−β１なしで増殖している細胞の増殖割合は、以前の処理されていない細胞と比較した場合、通常まで戻る。これは、成熟した神経幹細胞および前駆細胞におけるＴＧＦ−β１の効果が可逆的であることを示す。ＴＧＦ−β１を用いた長期間のインキュベーションは、さらに、細胞増殖を減少させない。
【００８２】
（実施例３）
ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体は、げっ歯動物の成体のＮＳＣにおけるＴＧＦ−β１効果を減少させ得る。
低い継代数の刺激されていない７日齢の神経球体を、実施例１に記載されているようにAccutaseＴＭの使用によって解離する。得られた単一細胞懸濁液を、ブロッキング分析のために使用した。げっ歯動物の成体のＮＳＣを、１ｍｌの容量のＮＢ／Ｂ２７培地を含む１２ウェルプレートに１０４個の細胞の密度で播種した。播種２時間後および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１での刺激１時間前に、種々の濃度の中和抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体（R&D Systems、ドイツ）を培養培地に添加した。播種３日および６日後に、細胞を１日目に行われた手順と同一の抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体およびＴＧＦ−β１の添加によって再刺激する。７日目に、培養物をAccutaseＴＭの使用によって解離し、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。興味深いことに、抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体自体の添加によりＮＳＣの増殖が減少する。ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体は、使用した最も高い濃度（１０μｇ／ｍｌ）での使用でさえも、ＴＧＦ−β１で誘導される効果を部分的にのみ阻害し得る（図３）。
【００８３】
（実施例４）
可溶性ＴＧＦ−ＲＩＩは、ＮＳＣ増殖のＴＧＦ−β１で誘導される抑制を完全に阻害する。
製造者のプロトコルに従って（R&D Systems、ドイツ）、ヒトＴＧＦ−ＲＩＩの１５９個のアミノ酸残基の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を（Linら, Cell 1992, 68(4), 775-785）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合し、そしてキメラタンパク質を、マウス骨髄腫細胞株ＮＳＯで発現させた。低い継代数の刺激されていない７日齢の神経球体を、実施例１に記載されているようにAccutaseＴＭの使用によって解離する。得られた単一細胞懸濁液を、ブロッキング分析のために使用した。げっ歯動物の成体のＮＳＣを、１ｍｌの容量のＮＢ／Ｂ２７培地を含む１２ウェルプレートに１０４個の細胞の密度で播種した。播種２時間後および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１での刺激１時間前に、種々の濃度の生物学的活性を有する可溶性組換えヒトＴＧＦ−βｓＲＩＩ／Ｆｃキメラ（R&D Systems、ドイツ）を培養培地に添加した。播種３日および６日後に、細胞を１日目に行われた手順と同一のＴＧＦ−βｓＲＩＩ／ＦｃキメラおよびＴＧＦ−β１の添加によって再刺激する。７日目に、培養物をAccutaseＴＭの使用によって解離し、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数する。興味深いことに、ＴＧＦ−βｓＲＩＩ／Ｆｃキメラの添加により、用量依存様式でＴＧＦ−β１で誘導される効果を完全にブロックし得る（データは示さず）。明らかに、可溶性組換えヒトＴＧＦ−βｓＲＩＩ／Ｆｃキメラ（可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ）の前投与による細胞培養上清中の活性なＴＧＦ−β１の廃絶は、ＴＧＦ−β１で誘導される成熟神経幹細胞および前駆細胞の増殖抑制を完全にブロックする（図４）。
【００８４】
（実施例５）
ＴＧＦ−βＲＩＩを発現する細胞は、細胞選別技術を用いて単離され得る。
現在の方法は、神経幹細胞および前駆細胞の迅速かつ信頼できる分離および精製ができない。所定の表面マーカーの発現に基づいて純粋な神経幹細胞および前駆細胞集団の単離の可能性を研究するために、本発明者らは、種々の技術によってＴＧＦ−βＲＩＩの発現による神経幹細胞および前駆細胞を単離する。ＴＧＦ−βＲＩＩを発現する神経幹細胞および前駆細胞を２つの技術で単離することが可能である：（ｉ）ＦＡＣＳ選別（データは示さず）、および（ｉｉ）ＭＡＣＳ選別。解離した成熟神経幹細胞および前駆細胞を、１０μｇ／ｍｌのＴＧＦ−ＲＩＩに対する一次抗体（R&D Systems、ドイツ）を用いて、室温で２０分間インキュベートする。ＰＢＳでの１回の洗浄工程後、細胞をウサギ抗ヤギＰＥ（１：５００）二次抗体（Dianova）を用いてインキュベートする。ＰＢＳでの１回の洗浄工程後、製造者のプロトコルに従って（Miltenyi Biotech、ドイツ）、細胞を常磁性ビーズに連結されたＰＥに対する三次抗体で染色する。細胞懸濁液を、製造者のプロトコルに従って（Miltenyi Biotech、ドイツ）ＭＡＣＳシステムを用いて磁気選別し、そして選別後の負および正の細胞を計数し、培養を行う（図５）。選別されたすべての細胞の約２０％が、ＴＧＦ−βＲＩＩに対して陽性に染色した。
【００８５】
（実施例６）
ＴＧＦ−βＲＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで、成熟神経幹細胞および前駆細胞の増殖のＴＧＦ−β１で誘導されたダウンレギュレートを阻害する。
細胞を、実施例１に記載されているように調製し、解離し、そしてプレーティングした。次いで、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１、１０μＭのＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ｃａｇｃｃｃｃｃｇａｃｃｃａｔｇ−３’（配列番号３）、センスオリゴヌクレオチド５’−ｃａｔｇｇｇｔｃｇｇｇｇｇｃｔｇ−３’、またはミスセンス５’−ｃａｔｃｃｃｃｇｇａｃｃｃｇｔｇ−３’を用いてまたは用いずに１週間インキュベートした。オリゴヌクレオチドをホスホロチオエート改変し、そしてオリゴヌクレオチドを含む培地を毎日交換した。ＴＧＦ−β１で誘導される神経幹細胞および前駆細胞の増殖の阻害が、アンチセンス（配列番号３）処理によって、完全にそして特異的にブロックされたことに留意すること（図６）。
【００８６】
（実施例７）
ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を救済する。
この実施例は、（ｉ）インビボでの神経幹細胞および祖先細胞の増殖におけるＴＧＦ−β１注入の効果、および（ｉｉ）ＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド処理によるこの効果の救済を示す。したがって、以下の実験を設計した。
【００８７】
ＴＧＦ−β１を２週間脳室内に注入し、次いで、ＴＧＦ−β１とオリゴヌクレオチドとを共注入した。動物実験を、１９８６年１１月２４日の欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に従って行った。浸透圧ミニポンプに接続されたステンレススチールのカニューレ（Model 2001, Alza, Stadt, Land）を、記載されているように脳室内の注入のために、２カ月齢の雄性Fischer-344ラット（ｎ＝２４）に移植した。動物に、組換えＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）またはコントロールとして人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）のいずれかを（それぞれｎ＝８）、０．５μｌ／時間の流速で２週間投与した。第２週の後、ポンプを交換し、ａＣＳＦ、ＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）、またはホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ポンプ中に１．６４ｍＭの濃度で存在）と組み合わせたＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）を、さらに２週間、脳室中に注入した。オリゴヌクレオチドは、実施例６に記載されている通りであった。２７日目に、動物に、２００ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を単回腹腔内注射した。１日後、動物に、４％のパラホルムアルデヒドを心臓内潅流した。組織を、発色性またはエピ蛍光免疫検出のために、記載されているように４０μｍの矢状切片に加工した。エピ蛍光分析を、SpotTMディジタルカメラ（Diagnostic Instrument Inc, Sterling Heights、アメリカ）または共焦点走査レーザー顕微鏡（Leica TCS-NT, Bensheim、ドイツ）を装着したLeica顕微鏡（Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar、ドイツ）を用いて行った。一次抗体は、ラットα−ＢｒｄＵ １：２５０（Oxford Biotechnology, Oxford、イギリス）であった。二次抗体は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミンＸ（ＲＨＯＸ）、ＣＹ５、またはビオチン１：５００（Jackson Immuno Research, West Grove, PA、アメリカ）と結合したロバα−ヤギ、マウス、ウサギ、またはラットであった。計数のために、体系的なおよびランダムな手順を用いた。ＢｒｄＵ陽性細胞を、ＳＶＺの最低部分、中間部分、および上部に配置された区分あたり、５０μｍ×５０μｍの３つの計数フレーム内で計数した。計数フレームの最上の焦点面（排除面）または側面排除境界と交差した陽性プロファイルは、計数しなかった。陽性プロファイルの総数を、それぞれの構造について推定数のＢｒｄＵ陽性細胞を得るために、参照容量と試料容量との比によって増加させた。すべての外挿を、１つの大脳半球について計算し、総脳値を表すために２倍にした。データを、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計分析を、ＴＧＦ−β１処理群とコントロール群との間の対応のない両側ｔ検定比較−スチューデントのｔ検定を用いて行った（StatView Software, Cary, NC、アメリカ）。有意水準を、ｐ＜０．０５と仮定した。
【００８８】
図７は、海馬歯状回（図７Ａ）および副脳室領域（図７Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されたダウンレギュレーションを示す。ミスセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、この効果をブロックしなかった。対照的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理（配列番号３）は、ＴＧＦ−β１の効果をブロックした（図７ＡおよびＢ）。
【００８９】
（実施例８）
ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を抑える。
この実施例は、ＴＧＦ−βＲＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処理が、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されたダウンギュレーションを抑え得ることを示す。
【００９０】
オリゴヌクレオチドを１週間脳室内に注入し、次いで、ＴＧＦ−β１とオリゴヌクレオチドとを共注入した。動物実験を、１９８６年１１月２４日の欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に従って行った。浸透圧ミニポンプに接続されたステンレススチールのカニューレ（Model 2001, Alza, Stadt, Land）を、記載されているように脳室内の注入のために、２カ月齢の雄性Fischer-344ラット（ｎ＝２４）に移植した。動物に、第１週の間はホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ポンプ中に１．６４ｍＭの濃度で存在）またはａＣＳＦのいずれかを、そして第２および第３週の間はａＣＳＦ、ＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）、またはＴＧＦ−β１（ポンプ中に５００ｎｇ／ｍｌで存在）とホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ポンプ中に１．６４ｍＭの濃度で存在）との共注入を投与した。オリゴヌクレオチドは、実施例６に記載されている通りであった。２０日目に、動物に、２００ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を単回腹腔内注射した。１日後、動物に、４％のパラホルムアルデヒドを心臓内潅流した。組織を、実施例７に記載されているように加工して分析した。図８は、海馬歯状回（図８Ａ）および副脳室領域（図８Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導したダウンギュレーションが、ＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３）処理での前処理によって抑えられ得ることを示す。
【００９１】
（実施例９）
少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的処方物。
アンチセンスオリゴヌクレオチドについての３つの代表的な水性処方物：
１．ａＣＳＦ中：１４８．０ｍＭのＮａＣｌ、３．０ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、１００μｇ／ｍｌのラット血清アルブミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
２．０．９％ＮａＣｌ中
３．Ｈ２Ｏ中
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＴＧＦ−β１は、げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞の増殖を抑制する。（Ａ）げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞（ＮＳＣ）の培養物を、種々の濃度（０、５、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数した。データを、３連で行われた３つの実験からの平均細胞数±ＳＤとして表す。（Ｂ）は、ヒト胎児ニューロン前駆細胞におけるＴＧＦ−β１の効果を示す。
【図２】ＮＳＣにおけるＴＧＦ−β１の効果は可逆性である。げっ歯動物の成体の神経幹細胞および前駆細胞の培養物を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、細胞を解離し、トリパンブルー排除アッセイによって計数し、そしてＴＧＦ−β１で前処理した細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を含むまたは含まずに、再播種した。この手順を７日ごとに行った。データを、３連で行われた３つの実験からの平均細胞数±ＳＤとして表す。
【図３】ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体は、げっ歯動物の成体のＮＳＣにおいてＴＧＦ−β１効果を減少させ得る。げっ歯動物の成体のＮＳＣ培養物を、抗ＴＧＦ−βＲＩＩ抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数した。データを、３連で行われた３つの実験からの平均細胞数±ＳＤとして表す。
【図４】可溶性ＴＧＦ−ＲＩＩは、ＴＧＦ−β１誘発されたＮＣＳ増殖の抑制を阻害する。げっ歯動物の成体のＮＳＣ培養物を、可溶性抗ＴＧＦ−βＲＩＩ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１で、７日間処理した。７日目に、生存細胞を、血球計数器で、トリパンブルー排除アッセイによって計数した。データを、３連で行われた３つの実験からの平均±ＳＤとして表す。
【図５】ＴＧＦ−βＲＩＩ発現細胞は、細胞選別技術を用いて単離され得る。げっ歯動物の成体のＮＳＣを、実施例１に記載のように調製した。ＴＧＦ−βＲＩＩを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲＩＩに対する抗体を用いて精製した。ＮＳＣの約２０％がレセプターを発現し、この細胞集団は、このアプローチによって富化され得る。
【図６】ＴＧＦ−βＲＩＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロでＴＧＦ−β１で誘導される成熟神経幹細胞および前駆細胞の増殖のダウンレギュレートを阻害する。ＴＧＦ−β１で誘導される神経幹細胞および前駆細胞の増殖の阻害が、アンチセンス処理によって完全におよび特異的にブロックされたことを示す。
【図７】ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を救済する。図７は、海馬歯状回（図７Ａ）および副脳室領域（図７Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されるダウンレギュレートを示す。ミスセンスオリゴヌクレオチド処理は、この効果をブロックしないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理は、ＴＧＦ−β１の効果をブロックした（図７Ａおよび７Ｂ）。
【図８】ＴＧＦ−ＲＩＩ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボ処理は、成熟脳における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導される遮断を妨げる。図８は、海馬歯状回（図８Ａ）および副脳室領域（図８Ｂ）における細胞増殖のＴＧＦ−β１で誘導されるダウンレギュレートは、ＴＧＦ−βＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチド処理での前処理によって妨げられ得ることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
８から５０個の核酸塩基を含む、配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列に少なくとも８０％同一の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、
該配列が、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域、あるいは「ループ」または「バルジ」でありそして二次構造の部分ではないＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と十分にハイブリダイズし得、そして該配列の模倣物、変異体、塩、および光学異性体である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
８から５０個の核酸塩基を含む配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列、ならびにその模倣物、変異体、塩、および光学異性体を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３から配列番号９３を含む群から選択される、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって、
配列番号３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号３３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号３４：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号３５：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号３６：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４１：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４２：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号４３：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４４：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４９：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５０：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５１：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５６：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５７：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６２：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７３：５’−ＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣ−３’
配列番号７４：５’−ＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣ−３’
配列番号７５：５’−ＡＡＣＧＧＣＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴ−３’
配列番号７６：５’−ＡＡＣＡＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣ−３’
配列番号７７：５’−ＡＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＴ−３’
配列番号７８：５’−ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡ−３’
配列番号７９：５’−ＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴ−３’
配列番号８０：５’−ＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣ−３’
配列番号８１：５’−ＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡ−３’
配列番号８２：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号８３：５’−ＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’
配列番号８４：５’−ＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴ−３’
配列番号８５：５’−ＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣ−３’
配列番号８６：５’−ＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡ−３’
配列番号８７：５’−ＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴ−３’
配列番号８８：５’−ＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣ−３’
配列番号８９：５’−ＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧ−３’
配列番号９０：５’−ＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧ−３’
配列番号９１：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号９２：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＴＴＧＣ−３’
配列番号９３：５’−ＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧ−３’
を含む群から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドならびにその模倣物、変異体、塩、および光学異性体の少なくとも１つ、および／または少なくとも１つのアンチセンス化合物を、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤の少なくとも１つとともに含む、薬学的調製物であって、
該アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写できるベクターおよび／またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、短触媒ＲＮＡ、および触媒オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む群より選択され、そしてＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、薬学的調製物。
【請求項６】
前記薬学的調製物が、活性成分の連続放出のための注入液または固体マトリックスである、請求項５に記載の薬学的調製物。
【請求項７】
前記薬学的調製物が、脳への局所投与に適している、請求項５または６に記載の薬学的調製物。
【請求項８】
損傷を受けた神経経路の好結果の再生および機能的な再連結を促進するための、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドならびにその模倣物および変異体の少なくとも１つおよび／または少なくとも１つのアンチセンス化合物または請求項５から７のいずれかの項に記載の薬学的調製物の使用であって、
該アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写できるベクターおよび／またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、短触媒ＲＮＡ、および触媒オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む群より選択され、そしてＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、使用。
【請求項９】
神経変性、外傷性の／外傷後の、血管の／低酸素性の、神経炎症性の、および感染後の中枢神経系疾患、および加齢に伴う神経幹細胞再生の減少の予防、治療的予防、および治療のための、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドならびにその模倣物および変異体の少なくとも１つおよび／または少なくとも１つのアンチセンス化合物または請求項５から７のいずれかの項に記載の薬学的調製物の使用であって、
該アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写できるベクターおよび／またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、短触媒ＲＮＡ、および触媒オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む群より選択され、そしてＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、使用。
【請求項１０】
アップレギュレートされたまたは高められたＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩのレベルに関連する疾患において、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害するための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アップレギュレートされたまたは高められたＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩのレベルに関連する疾患、または神経変性疾患および炎症性神経疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（Multisystem Atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、またはその他の運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性髄膜脳炎、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、急性虚血／低酸素性障害、卒中、ＣＮＳおよび脊髄外傷、頭部および脊柱外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病（白質病変）、網膜変性、蝸牛変性、黄斑変性、迷路性難聴、ＡＩＤＳ関連痴呆、色素性網膜炎、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）、加齢依存的記憶障害、痴呆に関連する神経発達障害、ダウン症候群、シヌクレイン障害、スーパーオキサイドジスムターゼ変異、トリヌクレオチド反復疾患、トラウマ、低酸素性、血管疾患、血管炎症、ＣＮＳ老化を含む群から選択される、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
（ａ）ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性、またはＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現、または（ｂ）ＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−Ｒシグナリングを妨害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＴＧＦ−β１およびニューロン前駆細胞を含む試験システムとともに、候補化合物をインキュベートする工程；および
（ｂ）活性なＴＧＦレセプターの発現または該ニューロン前駆細胞の増殖をアッセイする工程；
を包含し、
（ｃ）該試験化合物の不在下での試験システムと比較して、（ｉ）活性なＴＧＦレセプターの発現の抑制の廃絶、または（ｉｉ）ニューロン前駆細胞の増殖の抑制の廃絶が、所望の特性を有する候補化合物の存在を示す、
方法。
【請求項１】
８から５０個の核酸塩基を含む、配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列に少なくとも８０％同一の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、
該配列が、ＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを含む領域、あるいは「ループ」または「バルジ」でありそして二次構造の部分ではないＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードするｍＲＮＡの領域と十分にハイブリダイズし得、そして該配列の模倣物、変異体、塩、および光学異性体である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
８から５０個の核酸塩基を含む配列番号１または配列番号２または配列番号９４または配列番号９５または配列番号９６の部分配列、ならびにその模倣物、変異体、塩、および光学異性体を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３から配列番号９３を含む群から選択される、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって、
配列番号３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号３３：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’
配列番号３４：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号３５：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号３６：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４１：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’
配列番号４２：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号４３：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号４４：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４９：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’
配列番号５０：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５１：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号５６：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ−３’
配列番号５７：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号６２：５’−ＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号７３：５’−ＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣ−３’
配列番号７４：５’−ＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣ−３’
配列番号７５：５’−ＡＡＣＧＧＣＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴ−３’
配列番号７６：５’−ＡＡＣＡＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣ−３’
配列番号７７：５’−ＡＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＴ−３’
配列番号７８：５’−ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡ−３’
配列番号７９：５’−ＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴ−３’
配列番号８０：５’−ＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣ−３’
配列番号８１：５’−ＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡ−３’
配列番号８２：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号８３：５’−ＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’
配列番号８４：５’−ＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴ−３’
配列番号８５：５’−ＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣ−３’
配列番号８６：５’−ＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡ−３’
配列番号８７：５’−ＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴ−３’
配列番号８８：５’−ＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣ−３’
配列番号８９：５’−ＴＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧ−３’
配列番号９０：５’−ＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧ−３’
配列番号９１：５’−ＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧ−３’
配列番号９２：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＴＴＧＣ−３’
配列番号９３：５’−ＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧ−３’
を含む群から選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドならびにその模倣物、変異体、塩、および光学異性体の少なくとも１つ、および／または少なくとも１つのアンチセンス化合物を、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤の少なくとも１つとともに含む、薬学的調製物であって、
該アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写できるベクターおよび／またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、短触媒ＲＮＡ、および触媒オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む群より選択され、そしてＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、薬学的調製物。
【請求項６】
前記薬学的調製物が、活性成分の連続放出のための注入液または固体マトリックスである、請求項５に記載の薬学的調製物。
【請求項７】
前記薬学的調製物が、脳への局所投与に適している、請求項５または６に記載の薬学的調製物。
【請求項８】
損傷を受けた神経経路の好結果の再生および機能的な再連結を促進するための、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドならびにその模倣物および変異体の少なくとも１つおよび／または少なくとも１つのアンチセンス化合物または請求項５から７のいずれかの項に記載の薬学的調製物の使用であって、
該アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写できるベクターおよび／またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、短触媒ＲＮＡ、および触媒オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む群より選択され、そしてＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、使用。
【請求項９】
神経変性、外傷性の／外傷後の、血管の／低酸素性の、神経炎症性の、および感染後の中枢神経系疾患、および加齢に伴う神経幹細胞再生の減少の予防、治療的予防、および治療のための、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドならびにその模倣物および変異体の少なくとも１つおよび／または少なくとも１つのアンチセンス化合物または請求項５から７のいずれかの項に記載の薬学的調製物の使用であって、
該アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写できるベクターおよび／またはリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴザイム、短触媒ＲＮＡ、および触媒オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む群より選択され、そしてＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩをコードする標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、使用。
【請求項１０】
アップレギュレートされたまたは高められたＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩのレベルに関連する疾患において、ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現を阻害するための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アップレギュレートされたまたは高められたＴＧＦ−ＲまたはＴＧＦ−ＲＩＩのレベルに関連する疾患、または神経変性疾患および炎症性神経疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、ハレルフォルデンスパッツ病、ハンチントン病、多発性萎縮症（Multisystem Atrophy）、痴呆、前頭側頭型痴呆、またはその他の運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症（ＳＣＡ）、精神分裂病、感情の障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性髄膜脳炎、ＣＮＳ自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、急性虚血／低酸素性障害、卒中、ＣＮＳおよび脊髄外傷、頭部および脊柱外傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、微小血管性痴呆、ビンスワンゲル病（白質病変）、網膜変性、蝸牛変性、黄斑変性、迷路性難聴、ＡＩＤＳ関連痴呆、色素性網膜炎、脆弱Ｘ染色体に関連する震え／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）、加齢依存的記憶障害、痴呆に関連する神経発達障害、ダウン症候群、シヌクレイン障害、スーパーオキサイドジスムターゼ変異、トリヌクレオチド反復疾患、トラウマ、低酸素性、血管疾患、血管炎症、ＣＮＳ老化を含む群から選択される、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
（ａ）ＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの生物学的活性、またはＴＧＦ−Ｒおよび／またはＴＧＦ−ＲＩＩの発現、または（ｂ）ＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−Ｒシグナリングを妨害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＴＧＦ−β１およびニューロン前駆細胞を含む試験システムとともに、候補化合物をインキュベートする工程；および
（ｂ）活性なＴＧＦレセプターの発現または該ニューロン前駆細胞の増殖をアッセイする工程；
を包含し、
（ｃ）該試験化合物の不在下での試験システムと比較して、（ｉ）活性なＴＧＦレセプターの発現の抑制の廃絶、または（ｉｉ）ニューロン前駆細胞の増殖の抑制の廃絶が、所望の特性を有する候補化合物の存在を示す、
方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５２１８１５（Ｐ２００７−５２１８１５Ａ）
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１８２５（Ｐ２００６−５５１８２５）
【出願日】平成１７年２月９日（２００５．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１２９８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４９８１
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０６２７０７６５）レゲニオン ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月９日（２００５．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１２９８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４９８１
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０６２７０７６５）レゲニオン ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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