ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体
【課題】水溶液中での分散性と酵素活性の向上を同時に図ることができる、酵素が施与された炭素同素体を提供する。
【解決手段】ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体、及び前記炭素同素体の製造方法。並びに、前記炭素同素体を用いて酵素反応を行う方法。
【解決手段】ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体、及び前記炭素同素体の製造方法。並びに、前記炭素同素体を用いて酵素反応を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサー、診断機器、ドラッグデリバリー、微生物、動物細胞培養などのバイオテクノロジーの分野において、タンパク質、核酸などの機能性生体分子を、その特性を損なうことなく、効率的に担体などの固相に固定する技術は、当該分野において常に必要とされている。
【０００３】
炭素同素体であるカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）又はフラーレン化合物は、新しい機能材料として、様々な分野で近年注目されている。これまでに、バイオセンサーへの応用を目的に、ＣＮＴに酵素を施与したＣＮＴ-酵素複合体に関する基礎研究の成果が報告されている（非特許文献１〜７）。さらに、ポリメラーゼ酵素や制限酵素、各種酵素（ペルオキシターゼ、プロテアーゼ等）をＣＮＴに施与した場合の、それぞれの酵素活性への影響も検討されている。低濃度のＣＮＴの添加は、ＰＣＲ反応の反応効率を上昇させたとする報告（非特許文献８）がある一方で、ＣＮＴによって制限酵素やポリメラーゼの酵素反応が阻害されるとする報告もされている（非特許文献９）。また、ＣＮＴ上に施与されたプロテアーゼは、遊離プロテアーゼの約５３％の活性であったと報告されている（非特許文献１０）。このため、一般的には、ＣＮＴは酵素活性の阻害作用があるものと考えられているが、酵素が施与されたＣＮＴにおいて、酵素活性の阻害要因は何であるかは明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. Sotiropoulou et al. Anal Bioanal. Chem. 375: 103-105 (2003)
【非特許文献２】J. Z. Xu et al. Electroanalysis 15: 219- 224 (2003)
【非特許文献３】V. G. Gavalas et al.Anal Biochem. 329: 247-252 (2004)
【非特許文献４】P. W. Barone et al. Nat Mater 4: 86-92 (2005)
【非特許文献５】K. A. Joshi et al. Electroanalysis 17: 54-58 (2005)
【非特許文献６】N. S. Lawrence et al. Electroanalysis 17: 65-72 (2005)
【非特許文献７】A. Merkoci et al. Trends Analyt Chem 24: 826-838 (2005)
【非特許文献８】D.Cui et al. Nanotechnology 15: 154-157(2004)
【非特許文献９】C.Yi et al. Nanotechnology 18: 025102 (2007)
【非特許文献１０】P. Asuri et al. Langmuir, 23, 12318-12321 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、酵素活性を低下することなく、ＣＮＴ等の炭素同素体上に、該酵素を施与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、最初に炭素同素体にＤＮＡを施与し、該ＤＮＡが施与された炭素同素体に酵素を施与したところ、酵素活性の顕著な向上を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体及びその製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、水溶液中に安定に分散し、かつ酵素単体と比べて顕著に高い酵素活性を示す。従って、バイオリアクター分野、バイオセンサー分野、分析分野、医薬分野、農薬分野などへの応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴの相対プロテアーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴの相対プロテアーゼ活性における、ＣＮＴの長さ等の影響を示すグラフである。
【図３】各種合成オリゴＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴの相対プロテアーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】合成ヌクレオチド及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴにおける、ヌクレオチドの長さが相対プロテアーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたフラーレンと、ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴのプロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図６】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与された各種フラーレンの相対プロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図７】ＤＮＡ及びカタラーゼが施与されたＣＮＴの、相対カタラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図８】ＤＮＡ及びアミラーゼが施与されたＣＮＴの、相対アミラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】ＤＮＡ及びリパーゼが施与されたＣＮＴの、相対リパーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１０】ＤＮＡ及びエステラーゼが施与されたＣＮＴの、相対エステラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１１】ＤＮＡ及びエラスターゼが施与されたＣＮＴの、相対エラスターゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】ＤＮＡ及びグルコースオキシターゼが施与されたＣＮＴの、相対グルコースオキシターゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、炭素同素体には、ＣＮＴ類及びフラーレン類が含まれる。該ＣＮＴ類には単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、二層カーボンナノチューブ（ＤＷＮＴ）及び多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）などの各種ＣＮＴが含まれる。該フラーレン類には、フラーレン（Ｃ６０）のみならず、水素化フラーレン、酸化フラーレン、水酸化フラーレン等の修飾フラーレンも含まれる。
【００１１】
本発明において、ＤＮＡは炭素同素体の分散性を向上すると共に、炭素同素体と酵素とを繋ぐ作用を奏していると考えられる。Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）を含む天然物由来のＤＮＡだけでなく、合成オリゴＤＮＡでも同様の効果が奏されることから、広く、塩基配列、立体構造に拠らず種々の天然由来ＤＮＡを使用することができる。該天然物由来のＤＮＡの好ましいものとして、１０〜７００塩基長、より好ましくは１００〜５００塩基長、例えばサケ精子ＤＮＡ（フナコシ社）が挙げられる。
【００１２】
上記の合成オリゴＤＮＡの例としては、ポリ（ｄＡ）ｎ、ポリ（ｄＧ）ｎ、及びポリ（ｄＣ）ｎが挙げられる。ここで、ｎは８〜３０の間の整数である。好ましくは、ポリ（ｄＧ）ｎ及びポリ（ｄＣ）ｎである。
【００１３】
上記のポリ（ｄＧ）ｎのｎの範囲は、好ましくは８〜２５の整数であり、より好ましくはｎは５〜１５である。
【００１４】
上記のポリ（ｄＣ）ｎのｎの範囲は、好ましくは１０〜３０の整数であり、より好ましくはｎは１０〜２０である。
【００１５】
酵素は、特に限定されず種々のものを使用することができ、例えば、加水分解酵素、酸化還元酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ、転移酵素などが挙げられる。
【００１６】
前記加水分解酵素は、好ましくはタンパク質分解酵素、アミラーゼ、リパーゼ、又はエステラーゼである。
【００１７】
前記タンパク質分解酵素はセリンプロテアーゼであることが好ましい。より好ましくは、ズブチリシン、トリプシン又はエラスターゼである。
【００１８】
前記酸化還元酵素は、好ましくはカタラーゼ、グルコースオキシゲナーゼ、又はコレステロールオキシターゼである。
【００１９】
斯かるＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、酵素単体よりも高い単位質量当たりの酵素活性を有する。酵素活性の測定方法は、複合体を形成する酵素の性質に依存するが、例えば、酵素がプロテアーゼである場合該活性は、アンソン法（Ａｎｓｏｎ ＭＬ （１９３８）, Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２２, ７９-８９）により測定することができる。
【００２０】
本発明のＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、
（１）炭素同素体にＤＮＡを施与するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた該炭素同素体に、酵素を施与するステップ
とを含む、製造方法により得られる。
【００２１】
上記ステップ（１）において、ＤＮＡの施与はＤＮＡ溶液中に炭素同素体を分散させることによって行うことができる。或いは、予め炭素同素体の分散液を調製しておき、ＤＮＡ溶液と混合してもよい。該炭素同素体の分散液は、分散媒、例えば蒸留水、と炭素同素体を軽く混合した後、分散手段により、十分に分散させることが好ましく、例えば、６〜１０時間程度超音波処理を行う。上記炭素同素体の分散液中の炭素同素体濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であり得るが、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．８〜１．２ｍｇ／ｍｌである。
【００２２】
得られた炭素同素体分散液に、天然物由来のＤＮＡと炭素同素体の重量混合比が、２：１〜７：１の範囲、好ましくは３：１〜６：１となる量のＤＮＡを添加する。或いは、ＤＮＡを０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは１．０〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは８．０〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む水溶液を混合してもよい。合成オリゴヌクレオチドを施与する場合、得られた炭素同素体分散液に、４０〜２００ｍＭの、好ましくは８０ｍＭ〜１７０ｍＭの合成オリゴヌクレオチド水溶液を混合してもよい。
【００２３】
ＤＮＡの施与は、数１０分〜数時間、２０〜４０℃の範囲であるが、好ましくは２５〜３０℃で、振盪処理することによって行うことができる。
【００２４】
上記（２）のステップにおける酵素の添加量は０．１〜０．９ｇの範囲であるが、０．２５〜０．９ｇが好ましい。
【００２５】
上記ステップ（２）において、酵素の施与はステップ（１）で得られた分散液に酵素の水溶液を添加して、数１０分〜数時間、４〜４０℃の範囲であるが、好ましくは５０〜８０分間、２５〜３０℃で、振盪処理することによって行うことができる。その後、炭素同素体を蒸留水で洗浄して、未吸着の酵素を除去する。洗浄回数は、３〜１０回の範囲であるが、３〜５回が好ましい。その後、蒸留水を添加して酵素濃度０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌの分散液を調製する。
【００２６】
本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例】
【００２７】
［材料］
実施例において、使用したものは以下のとおりである。
ＣＮＴ：
＃１：Ｌ−ＳＷＮＴ（直径２ｎｍ未満、長さ５〜１５μｍ、純度９０％）
＃２：Ｓ−ＳＷＮＴ（直径２ｎｍ未満、長さ１〜５μｍ、純度６０％）
＃３：Ｌ−ＭＷＮＴ（直径６０〜１００ｎｍ、長さ５〜１５μｍ、純度９５〜９８％）
＃４：Ｓ−ＭＷＮＴ（直径６０〜１００ｎｍ、長さ１〜２μｍ、純度９５〜９８％）
（いずれもＳｈｅｎｚｅｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｏｒｔ（ＮＴＰ）社製）
＃５：ＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴ（直径約２ｎｍ、長さ約１μｍ）（ＵＮＩＤＹＭ, ＩＮＣ.）
フラーレン：
＃６：フラーレン（Ｃ６０）
＃７：水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ；ｎ＝約１０）
＃８：酸化フラーレン（Ｃ６０Ｏ：約４０％、Ｃ６０Ｏ２：約３０％）
＃９：水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ；ｎ＝約１０）
いずれもフロンティアカーボン株式会社製
ＤＮＡ：サケ精子ＤＮＡ（フナコシ社製）
合成オリゴヌクレオチド：オペロン社に合成委託、製造
酵素：
Ａ：ズブチリシンカールスベルグ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｒｉｃｈ社、米国）
Ｂ：トリプシン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）
Ｃ：カタラーゼ（ウシ肝臓由来：和光純薬工業株式会社）
Ｄ：α-アミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来：和光純薬工業株式会社）
Ｅ：リパーゼ（ブタ膵臓由来：和光純薬工業株式会社）
Ｆ：エステラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来：Ｆｌｕｋａ（シグマ・アルドリッチ）社）
Ｇ：エラスターゼ（ブタ膵臓由来：和光純薬工業株式会社）
Ｈ：グルコースオキシターゼ（インビトロジェン社製）
振とう機：ＴＡＩＴＥＣ ＢｉｏＳｈａｋｅｒ Ｍ・ＢＲ-０２２ＵＰ
【００２８】
［酵素活性の算出方法］
酵素のＮａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（以下、基準酵素活性）は、何の処理も施していない酵素の単位質量（ｍｇ）あたりの酵素活性である。ＤＮＡ／炭素同素体／酵素複合体、又は炭素同素体／酵素複合体の酵素活性は、後述する方法で、ＤＮＡ／炭素同素体又は炭素同素体に施与された酵素量単位質量あたりの酵素活性を、上記基準酵素活性で除して、相対酵素活性を算出した。
【００２９】
［実施例１〜１３］
表１に示す組み合わせで、以下の方法により、酵素が施与された炭素同素体を調製した。
【００３０】
［ＤＮＡが施与された炭素同素体の調製］
最初に、炭素同素体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に添加後、８時間超音波処理を行い、以後の炭素同素体分散液とした。次に、１０ｍｇ／ｍｌに調製したＤＮＡ水溶液を１５μｌ、１ｍｇ／ｍｌの炭素同素体分散液を５０μｌ、蒸留水２３５μｌを混合し、振とう処理を１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間行った。
【００３１】
なお、実施例３及び４においては、１５μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＨｉＰｃｏ社製のＳＷＮＴ（直径約２ｎｍ、長さ約１ｎｍ）、７５μｌの２００ｍＭポリＡ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＴオリゴヌクレオチド、及び１０μｌの蒸留水を混合後、１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間振とう処理を行った。
【００３２】
［ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体の調製］
上記で調製したＤＮＡが施与された炭素同素体の分散液に、２０ｍｇ／ｍｌの酵素溶液を４５μｌ加え、１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間振とう処理を行った。処理後、該溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心処理し、遠心上清を取り除いた。沈殿物を滅菌蒸留水に再分散して、さらにマイクロピペットを用いたピペッティング操作で沈殿を懸濁後、上清を取り除いた。この操作を５回繰り返した。
【００３３】
毎回の遠心後に回収した遠心上清中の酵素量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定し、上清中に含まれる遊離酵素量の総和を算出した。初めに炭素同素体／ＤＮＡ混合溶液中に加えた酵素量から、全上清中の酵素量の合計（遊離酵素量の総和）を引いて、炭素同素体に施与された推定酵素量を算出した。濃度測定に用いたＢＣＡアッセイは、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ、及びＭｉｃｒｏＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔを用いて行った。
【００３４】
実施例及び比較例における、炭素同素体、ＤＮＡ、酵素の組み合わせを、表１に示す。
【表１】
【００３５】
[比較例１−１及び１−２]
比較例１−１及び１−２では、ＣＮＴを用いず、１０ｍｇ／ｍｌに調製したＤＮＡ水溶液を１５μｌと、２０ｍｇ／ｍｌの酵素溶液を４５μｌとを混合し、１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間振とうして、混合液を調製した。
【００３６】
[比較例２−１、２−２及び３]
比較例２−１、２−２及び３では、ＤＮＡの施与を行わずに、炭素同素体の分散液にプロテアーゼのみを実施例１と同様にして施与した。
【００３７】
以上のようにして得られた試料について、下記評価を行った。
【００３８】
［実施例１−１、１−２、比較例１−１、１−２、２−１及び２−２：プロテアーゼ活性の比較］
下表２に示す各試料のプロテアーゼ活性を、アンソン法（Ａｎｓｏｎ ＭＬ （１９３８）, Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２２, ７９-８９）で測定した。基質にハマステインカゼイン（メルク社製）を用い、ズブチリシンは５０℃、トリプシンは３７℃で、ｐＨ１０．５で反応させた。結果を図１に示す。いずれのプロテアーゼも、実施例１では基準プロテアーゼ活性の６〜１１倍の相対プロテアーゼ活性を示したが、ＤＮＡを用いていない比較例２では、基準プロテアーゼ活性の２０％程度の相対プロテアーゼ活性を示した。以上の結果から、ＣＮＴとＤＮＡの２つの要素が、プロテアーゼ活性を相乗的に高めると考えられた。
【表２】
【００３９】
［実施例２−１〜２−４：単層ＣＮＴ及び多層ＣＮＴの比較］
下表３に示す各試料のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様に測定した。結果を図２に示す。試験したすべての形状のＣＮＴで、基準プロテアーゼ活性の２〜６倍の相対プロテアーゼ活性が確認できた。
【表３】
【００４０】
［実施例３−１〜３−４：合成オリゴヌクレオチド種の比較］
下表４に示す各試料のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様に測定した。結果を図３に示す。ポリＧ及びポリｄＣでは１２〜２０倍の相対プロテアーゼ活性が観測された。
【表４】
【００４１】
［実施例４：合成オリゴヌクレオチドの塩基長がプロテアーゼ活性に及ぼす影響］
プロテアーゼ活性は実施例１と同様に測定した。結果を図４に示す。ポリｄＧでは８〜２５塩基長の間で全体的に相対プロテアーゼ活性が７〜２５倍の範囲であり、１０塩基長の場合、相対プロテアーゼ活性が最も高かった。ポリｄＣでは、１０〜３０塩基長の間で相対プロテアーゼ活性が９〜４６倍の範囲であり、１５塩基長の場合に相対プロテアーゼ活性が最も高くなった。
【００４２】
［実施例５：ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与されたＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴの相対プロテアーゼ活性］
プロテアーゼ活性は実施例１と同様に測定した。結果を図５に示す。ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与されたＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴも、高い相対プロテアーゼ活性（約６倍）を示した。
【００４３】
［実施例６及び比較例３：ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与されたフラーレンの相対プロテアーゼ活性］
プロテアーゼ活性は実施例１と同様に測定した。結果を図５に示す。ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたフラーレンは、ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴと同様に、高い相対プロテアーゼ活性（約４．５倍）を示した。ＤＮＡを用いていない比較例３では、ほとんどプロテアーゼ活性を示さなかった。以上の結果から、フラーレンとＤＮＡの２つの要素も、プロテアーゼ活性を相乗的に高めると考えられた。
【００４４】
［実施例７−１〜７−４、比較例１−１及び比較例３：ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与された修飾フラーレンの相対プロテアーゼ活性の比較］
下表５に示す各試料のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様に測定した。結果を図６に示す。いずれのＤＮＡ及びプロテアーゼが施与された修飾フラーレンも、ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたフラーレンと同様の相対プロテアーゼ活性を示した。
【表５】
【００４５】
［実施例８：ＤＮＡおよびカタラーゼが施与されたＣＮＴの相対カタラーゼ活性］
カタラーゼ活性は、Ｃａｔａｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社）を用い、添付の使用説明書に従って測定した。結果を図７に示す。ＤＮＡ及びカタラーゼが施与されたＣＮＴは、基準カタラーゼ活性の約２．５倍の相対カタラーゼ活性を示した。
【００４６】
［実施例９：ＤＮＡおよびアミラーゼが施与されたＣＮＴの相対アミラーゼ活性］
アミラーゼ活性は、０．２ｍｇ／ｍｌのアミラーゼ溶液、又は酵素濃度 ０．１２ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ及びアミラーゼが施与された炭素同素体の分散液０．２ｍｌを、反応緩衝液（５０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮａ−ＣＨ３ＣＯＯＨ （ｐＨ４．８））０．１ｍｌ、５ｍＭの合成基質（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−α−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｅｎｔａｏｓｉｄｅ（シグマ・アルドリッチ社））０．１ｍｌ、脱イオン水０．１ｍｌを混合した溶液に加え、２０℃で１時間処理した後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加え、４００ｎｍで吸光度を測定した。基準アミラーゼ活性は、上記のＤＮＡ及びアミラーゼが施与された炭素同素体の分散液に代えて、０．２ｍｇ／ｍｌのアミラーゼ溶液を用いて測定した。
【００４７】
結果を図８に示す。ＤＮＡ及びアミラーゼが施与されたＣＮＴは、基準アミラーゼ活性の約６倍の相対アミラーゼ活性を示した。
【００４８】
［実施例１０：ＤＮＡおよびリパーゼが施与されたＣＮＴの相対リパーゼ活性］
リパーゼ活性は、酵素濃度 ０．３ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ及びリパーゼが施与された炭素同素体の分散液０．２ｍｌを、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０））０．１ｍｌ、５ｍＭの合成基質（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｓｔｅａｒａｔｅ（シグマ・アルドリッチ社））０．１ｍｌ、脱イオン水０．１ｍｌを混合した溶液に加え、３７℃で１時間処理した後、１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加え、４００ｎｍで吸光度を測定した。基準リパーゼ活性は、上記のＤＮＡ及びリパーゼが施与された炭素同素体の分散液に代えて、０．３ｍｇ／ｍｌのリパーゼ溶液を用いて測定した。
【００４９】
結果を図９に示す。ＤＮＡ及びリパーゼが施与されたＣＮＴは、基準リパーゼ活性の約４．５倍の相対リパーゼ活性を示した。
【００５０】
［実施例１１：ＤＮＡおよびエステラーゼが施与されたＣＮＴの相対エステラーゼ活性］
エステラーゼ活性は、酵素濃度０．２５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ及びエステラーゼが施与された炭素同素体の分散液０．２ｍｌを反応緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＭＯＰＳ・Ｎａ（ｐＨ７．０））０．１ｍｌ、５ｍＭの合成基質（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｂｕｔｙｌａｔｅ（シグマ・アルドリッチ社製））０．１ｍｌ、脱イオン水０．１ｍｌを混合した溶液に加え、３０℃で１時間処理した後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加え、４００ｎｍで吸光度を測定した。基準エステラーゼ活性は、上記のＤＮＡ及びエステラーゼが施与された炭素同素体の分散液に代えて、０．６５ｍｇ／ｍｌのエステラーゼ溶液を用いて測定した。
【００５１】
結果を図１０に示す。ＤＮＡ及びエステラーゼが施与されたＣＮＴは、基準エステラーゼ活性の約１０倍の相対エラスターゼ活性を示した。
【００５２】
［実施例１２：ＤＮＡおよびエラスターゼが施与されたＣＮＴの相対エラスターゼ活性］
エラスターゼ活性は、エラスチン‐コンゴーレッドを基質として、消化によって可溶化される色調を４８５ｎｍで測定する、和光純薬工業株式会社コードＮｏ．０５８−０５３６１の活性測定法に準じて行った（Ｈａｌｌ, Ｄ．Ａ. : Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.,１０１, ２９（１９６６）、Ｓａｃｈａｒ， Ｌ． Ａ．， Ｗｉｎｔｅｒ， Ｋ． Ｋ．， Ｓｉｃｈｅｒ， Ｎ． ａｎｄ Ｆｒａｎｋｅｌ, S. : Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．，９０，３２３（１９５５）、Ｈｕｅｂｎｅｒ， Ｐ． Ｆ．: Ａｍａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７４，４１９ （１９７６）、Ｓｈｏｔｔｏｎ， Ｄ． Ｍ．: Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９，１１３ （１９７０）等を参照）。
【００５３】
結果を図１１に示す。ＤＮＡ及びエラスターゼが施与されたＣＮＴは、基準エラスターゼ活性の１５倍の相対エラスターゼ活性を示した。
【００５４】
［実施例１３：ＤＮＡ及びグルコースオキシターゼが施与されたＣＮＴの相対グルコースオキシターゼ活性］
グルコースオキシダーゼ活性測定は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて行った。検出波長は５９０ｎｍで行った。結果を図１２に示す。ＤＮＡ及びグルコースオキシターゼが施与されたＣＮＴは、基準グルコースオキシターゼ活性の３．２倍の相対グルコースオキシターゼ活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、酵素分野、バイオリアクター分野、バイオセンサー分野、分析分野、医薬分野、農薬分野などへの応用に好適である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサー、診断機器、ドラッグデリバリー、微生物、動物細胞培養などのバイオテクノロジーの分野において、タンパク質、核酸などの機能性生体分子を、その特性を損なうことなく、効率的に担体などの固相に固定する技術は、当該分野において常に必要とされている。
【０００３】
炭素同素体であるカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）又はフラーレン化合物は、新しい機能材料として、様々な分野で近年注目されている。これまでに、バイオセンサーへの応用を目的に、ＣＮＴに酵素を施与したＣＮＴ-酵素複合体に関する基礎研究の成果が報告されている（非特許文献１〜７）。さらに、ポリメラーゼ酵素や制限酵素、各種酵素（ペルオキシターゼ、プロテアーゼ等）をＣＮＴに施与した場合の、それぞれの酵素活性への影響も検討されている。低濃度のＣＮＴの添加は、ＰＣＲ反応の反応効率を上昇させたとする報告（非特許文献８）がある一方で、ＣＮＴによって制限酵素やポリメラーゼの酵素反応が阻害されるとする報告もされている（非特許文献９）。また、ＣＮＴ上に施与されたプロテアーゼは、遊離プロテアーゼの約５３％の活性であったと報告されている（非特許文献１０）。このため、一般的には、ＣＮＴは酵素活性の阻害作用があるものと考えられているが、酵素が施与されたＣＮＴにおいて、酵素活性の阻害要因は何であるかは明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. Sotiropoulou et al. Anal Bioanal. Chem. 375: 103-105 (2003)
【非特許文献２】J. Z. Xu et al. Electroanalysis 15: 219- 224 (2003)
【非特許文献３】V. G. Gavalas et al.Anal Biochem. 329: 247-252 (2004)
【非特許文献４】P. W. Barone et al. Nat Mater 4: 86-92 (2005)
【非特許文献５】K. A. Joshi et al. Electroanalysis 17: 54-58 (2005)
【非特許文献６】N. S. Lawrence et al. Electroanalysis 17: 65-72 (2005)
【非特許文献７】A. Merkoci et al. Trends Analyt Chem 24: 826-838 (2005)
【非特許文献８】D.Cui et al. Nanotechnology 15: 154-157(2004)
【非特許文献９】C.Yi et al. Nanotechnology 18: 025102 (2007)
【非特許文献１０】P. Asuri et al. Langmuir, 23, 12318-12321 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、酵素活性を低下することなく、ＣＮＴ等の炭素同素体上に、該酵素を施与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、最初に炭素同素体にＤＮＡを施与し、該ＤＮＡが施与された炭素同素体に酵素を施与したところ、酵素活性の顕著な向上を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体及びその製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、水溶液中に安定に分散し、かつ酵素単体と比べて顕著に高い酵素活性を示す。従って、バイオリアクター分野、バイオセンサー分野、分析分野、医薬分野、農薬分野などへの応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴの相対プロテアーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴの相対プロテアーゼ活性における、ＣＮＴの長さ等の影響を示すグラフである。
【図３】各種合成オリゴＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴの相対プロテアーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】合成ヌクレオチド及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴにおける、ヌクレオチドの長さが相対プロテアーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたフラーレンと、ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴのプロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図６】ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与された各種フラーレンの相対プロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図７】ＤＮＡ及びカタラーゼが施与されたＣＮＴの、相対カタラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図８】ＤＮＡ及びアミラーゼが施与されたＣＮＴの、相対アミラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】ＤＮＡ及びリパーゼが施与されたＣＮＴの、相対リパーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１０】ＤＮＡ及びエステラーゼが施与されたＣＮＴの、相対エステラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１１】ＤＮＡ及びエラスターゼが施与されたＣＮＴの、相対エラスターゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】ＤＮＡ及びグルコースオキシターゼが施与されたＣＮＴの、相対グルコースオキシターゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、炭素同素体には、ＣＮＴ類及びフラーレン類が含まれる。該ＣＮＴ類には単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、二層カーボンナノチューブ（ＤＷＮＴ）及び多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）などの各種ＣＮＴが含まれる。該フラーレン類には、フラーレン（Ｃ６０）のみならず、水素化フラーレン、酸化フラーレン、水酸化フラーレン等の修飾フラーレンも含まれる。
【００１１】
本発明において、ＤＮＡは炭素同素体の分散性を向上すると共に、炭素同素体と酵素とを繋ぐ作用を奏していると考えられる。Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）を含む天然物由来のＤＮＡだけでなく、合成オリゴＤＮＡでも同様の効果が奏されることから、広く、塩基配列、立体構造に拠らず種々の天然由来ＤＮＡを使用することができる。該天然物由来のＤＮＡの好ましいものとして、１０〜７００塩基長、より好ましくは１００〜５００塩基長、例えばサケ精子ＤＮＡ（フナコシ社）が挙げられる。
【００１２】
上記の合成オリゴＤＮＡの例としては、ポリ（ｄＡ）ｎ、ポリ（ｄＧ）ｎ、及びポリ（ｄＣ）ｎが挙げられる。ここで、ｎは８〜３０の間の整数である。好ましくは、ポリ（ｄＧ）ｎ及びポリ（ｄＣ）ｎである。
【００１３】
上記のポリ（ｄＧ）ｎのｎの範囲は、好ましくは８〜２５の整数であり、より好ましくはｎは５〜１５である。
【００１４】
上記のポリ（ｄＣ）ｎのｎの範囲は、好ましくは１０〜３０の整数であり、より好ましくはｎは１０〜２０である。
【００１５】
酵素は、特に限定されず種々のものを使用することができ、例えば、加水分解酵素、酸化還元酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ、転移酵素などが挙げられる。
【００１６】
前記加水分解酵素は、好ましくはタンパク質分解酵素、アミラーゼ、リパーゼ、又はエステラーゼである。
【００１７】
前記タンパク質分解酵素はセリンプロテアーゼであることが好ましい。より好ましくは、ズブチリシン、トリプシン又はエラスターゼである。
【００１８】
前記酸化還元酵素は、好ましくはカタラーゼ、グルコースオキシゲナーゼ、又はコレステロールオキシターゼである。
【００１９】
斯かるＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、酵素単体よりも高い単位質量当たりの酵素活性を有する。酵素活性の測定方法は、複合体を形成する酵素の性質に依存するが、例えば、酵素がプロテアーゼである場合該活性は、アンソン法（Ａｎｓｏｎ ＭＬ （１９３８）, Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２２, ７９-８９）により測定することができる。
【００２０】
本発明のＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、
（１）炭素同素体にＤＮＡを施与するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた該炭素同素体に、酵素を施与するステップ
とを含む、製造方法により得られる。
【００２１】
上記ステップ（１）において、ＤＮＡの施与はＤＮＡ溶液中に炭素同素体を分散させることによって行うことができる。或いは、予め炭素同素体の分散液を調製しておき、ＤＮＡ溶液と混合してもよい。該炭素同素体の分散液は、分散媒、例えば蒸留水、と炭素同素体を軽く混合した後、分散手段により、十分に分散させることが好ましく、例えば、６〜１０時間程度超音波処理を行う。上記炭素同素体の分散液中の炭素同素体濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であり得るが、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．８〜１．２ｍｇ／ｍｌである。
【００２２】
得られた炭素同素体分散液に、天然物由来のＤＮＡと炭素同素体の重量混合比が、２：１〜７：１の範囲、好ましくは３：１〜６：１となる量のＤＮＡを添加する。或いは、ＤＮＡを０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは１．０〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは８．０〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む水溶液を混合してもよい。合成オリゴヌクレオチドを施与する場合、得られた炭素同素体分散液に、４０〜２００ｍＭの、好ましくは８０ｍＭ〜１７０ｍＭの合成オリゴヌクレオチド水溶液を混合してもよい。
【００２３】
ＤＮＡの施与は、数１０分〜数時間、２０〜４０℃の範囲であるが、好ましくは２５〜３０℃で、振盪処理することによって行うことができる。
【００２４】
上記（２）のステップにおける酵素の添加量は０．１〜０．９ｇの範囲であるが、０．２５〜０．９ｇが好ましい。
【００２５】
上記ステップ（２）において、酵素の施与はステップ（１）で得られた分散液に酵素の水溶液を添加して、数１０分〜数時間、４〜４０℃の範囲であるが、好ましくは５０〜８０分間、２５〜３０℃で、振盪処理することによって行うことができる。その後、炭素同素体を蒸留水で洗浄して、未吸着の酵素を除去する。洗浄回数は、３〜１０回の範囲であるが、３〜５回が好ましい。その後、蒸留水を添加して酵素濃度０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌの分散液を調製する。
【００２６】
本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例】
【００２７】
［材料］
実施例において、使用したものは以下のとおりである。
ＣＮＴ：
＃１：Ｌ−ＳＷＮＴ（直径２ｎｍ未満、長さ５〜１５μｍ、純度９０％）
＃２：Ｓ−ＳＷＮＴ（直径２ｎｍ未満、長さ１〜５μｍ、純度６０％）
＃３：Ｌ−ＭＷＮＴ（直径６０〜１００ｎｍ、長さ５〜１５μｍ、純度９５〜９８％）
＃４：Ｓ−ＭＷＮＴ（直径６０〜１００ｎｍ、長さ１〜２μｍ、純度９５〜９８％）
（いずれもＳｈｅｎｚｅｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｏｒｔ（ＮＴＰ）社製）
＃５：ＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴ（直径約２ｎｍ、長さ約１μｍ）（ＵＮＩＤＹＭ, ＩＮＣ.）
フラーレン：
＃６：フラーレン（Ｃ６０）
＃７：水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ；ｎ＝約１０）
＃８：酸化フラーレン（Ｃ６０Ｏ：約４０％、Ｃ６０Ｏ２：約３０％）
＃９：水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ；ｎ＝約１０）
いずれもフロンティアカーボン株式会社製
ＤＮＡ：サケ精子ＤＮＡ（フナコシ社製）
合成オリゴヌクレオチド：オペロン社に合成委託、製造
酵素：
Ａ：ズブチリシンカールスベルグ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｒｉｃｈ社、米国）
Ｂ：トリプシン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）
Ｃ：カタラーゼ（ウシ肝臓由来：和光純薬工業株式会社）
Ｄ：α-アミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来：和光純薬工業株式会社）
Ｅ：リパーゼ（ブタ膵臓由来：和光純薬工業株式会社）
Ｆ：エステラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来：Ｆｌｕｋａ（シグマ・アルドリッチ）社）
Ｇ：エラスターゼ（ブタ膵臓由来：和光純薬工業株式会社）
Ｈ：グルコースオキシターゼ（インビトロジェン社製）
振とう機：ＴＡＩＴＥＣ ＢｉｏＳｈａｋｅｒ Ｍ・ＢＲ-０２２ＵＰ
【００２８】
［酵素活性の算出方法］
酵素のＮａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（以下、基準酵素活性）は、何の処理も施していない酵素の単位質量（ｍｇ）あたりの酵素活性である。ＤＮＡ／炭素同素体／酵素複合体、又は炭素同素体／酵素複合体の酵素活性は、後述する方法で、ＤＮＡ／炭素同素体又は炭素同素体に施与された酵素量単位質量あたりの酵素活性を、上記基準酵素活性で除して、相対酵素活性を算出した。
【００２９】
［実施例１〜１３］
表１に示す組み合わせで、以下の方法により、酵素が施与された炭素同素体を調製した。
【００３０】
［ＤＮＡが施与された炭素同素体の調製］
最初に、炭素同素体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に添加後、８時間超音波処理を行い、以後の炭素同素体分散液とした。次に、１０ｍｇ／ｍｌに調製したＤＮＡ水溶液を１５μｌ、１ｍｇ／ｍｌの炭素同素体分散液を５０μｌ、蒸留水２３５μｌを混合し、振とう処理を１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間行った。
【００３１】
なお、実施例３及び４においては、１５μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＨｉＰｃｏ社製のＳＷＮＴ（直径約２ｎｍ、長さ約１ｎｍ）、７５μｌの２００ｍＭポリＡ、ポリＧ、ポリＣ、ポリＴオリゴヌクレオチド、及び１０μｌの蒸留水を混合後、１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間振とう処理を行った。
【００３２】
［ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体の調製］
上記で調製したＤＮＡが施与された炭素同素体の分散液に、２０ｍｇ／ｍｌの酵素溶液を４５μｌ加え、１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間振とう処理を行った。処理後、該溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心処理し、遠心上清を取り除いた。沈殿物を滅菌蒸留水に再分散して、さらにマイクロピペットを用いたピペッティング操作で沈殿を懸濁後、上清を取り除いた。この操作を５回繰り返した。
【００３３】
毎回の遠心後に回収した遠心上清中の酵素量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定し、上清中に含まれる遊離酵素量の総和を算出した。初めに炭素同素体／ＤＮＡ混合溶液中に加えた酵素量から、全上清中の酵素量の合計（遊離酵素量の総和）を引いて、炭素同素体に施与された推定酵素量を算出した。濃度測定に用いたＢＣＡアッセイは、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ、及びＭｉｃｒｏＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔを用いて行った。
【００３４】
実施例及び比較例における、炭素同素体、ＤＮＡ、酵素の組み合わせを、表１に示す。
【表１】
【００３５】
[比較例１−１及び１−２]
比較例１−１及び１−２では、ＣＮＴを用いず、１０ｍｇ／ｍｌに調製したＤＮＡ水溶液を１５μｌと、２０ｍｇ／ｍｌの酵素溶液を４５μｌとを混合し、１２００ｒｐｍ、３０℃で１時間振とうして、混合液を調製した。
【００３６】
[比較例２−１、２−２及び３]
比較例２−１、２−２及び３では、ＤＮＡの施与を行わずに、炭素同素体の分散液にプロテアーゼのみを実施例１と同様にして施与した。
【００３７】
以上のようにして得られた試料について、下記評価を行った。
【００３８】
［実施例１−１、１−２、比較例１−１、１−２、２−１及び２−２：プロテアーゼ活性の比較］
下表２に示す各試料のプロテアーゼ活性を、アンソン法（Ａｎｓｏｎ ＭＬ （１９３８）, Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２２, ７９-８９）で測定した。基質にハマステインカゼイン（メルク社製）を用い、ズブチリシンは５０℃、トリプシンは３７℃で、ｐＨ１０．５で反応させた。結果を図１に示す。いずれのプロテアーゼも、実施例１では基準プロテアーゼ活性の６〜１１倍の相対プロテアーゼ活性を示したが、ＤＮＡを用いていない比較例２では、基準プロテアーゼ活性の２０％程度の相対プロテアーゼ活性を示した。以上の結果から、ＣＮＴとＤＮＡの２つの要素が、プロテアーゼ活性を相乗的に高めると考えられた。
【表２】
【００３９】
［実施例２−１〜２−４：単層ＣＮＴ及び多層ＣＮＴの比較］
下表３に示す各試料のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様に測定した。結果を図２に示す。試験したすべての形状のＣＮＴで、基準プロテアーゼ活性の２〜６倍の相対プロテアーゼ活性が確認できた。
【表３】
【００４０】
［実施例３−１〜３−４：合成オリゴヌクレオチド種の比較］
下表４に示す各試料のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様に測定した。結果を図３に示す。ポリＧ及びポリｄＣでは１２〜２０倍の相対プロテアーゼ活性が観測された。
【表４】
【００４１】
［実施例４：合成オリゴヌクレオチドの塩基長がプロテアーゼ活性に及ぼす影響］
プロテアーゼ活性は実施例１と同様に測定した。結果を図４に示す。ポリｄＧでは８〜２５塩基長の間で全体的に相対プロテアーゼ活性が７〜２５倍の範囲であり、１０塩基長の場合、相対プロテアーゼ活性が最も高かった。ポリｄＣでは、１０〜３０塩基長の間で相対プロテアーゼ活性が９〜４６倍の範囲であり、１５塩基長の場合に相対プロテアーゼ活性が最も高くなった。
【００４２】
［実施例５：ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与されたＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴの相対プロテアーゼ活性］
プロテアーゼ活性は実施例１と同様に測定した。結果を図５に示す。ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与されたＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴも、高い相対プロテアーゼ活性（約６倍）を示した。
【００４３】
［実施例６及び比較例３：ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与されたフラーレンの相対プロテアーゼ活性］
プロテアーゼ活性は実施例１と同様に測定した。結果を図５に示す。ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたフラーレンは、ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたＣＮＴと同様に、高い相対プロテアーゼ活性（約４．５倍）を示した。ＤＮＡを用いていない比較例３では、ほとんどプロテアーゼ活性を示さなかった。以上の結果から、フラーレンとＤＮＡの２つの要素も、プロテアーゼ活性を相乗的に高めると考えられた。
【００４４】
［実施例７−１〜７−４、比較例１−１及び比較例３：ＤＮＡおよびプロテアーゼが施与された修飾フラーレンの相対プロテアーゼ活性の比較］
下表５に示す各試料のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様に測定した。結果を図６に示す。いずれのＤＮＡ及びプロテアーゼが施与された修飾フラーレンも、ＤＮＡ及びプロテアーゼが施与されたフラーレンと同様の相対プロテアーゼ活性を示した。
【表５】
【００４５】
［実施例８：ＤＮＡおよびカタラーゼが施与されたＣＮＴの相対カタラーゼ活性］
カタラーゼ活性は、Ｃａｔａｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社）を用い、添付の使用説明書に従って測定した。結果を図７に示す。ＤＮＡ及びカタラーゼが施与されたＣＮＴは、基準カタラーゼ活性の約２．５倍の相対カタラーゼ活性を示した。
【００４６】
［実施例９：ＤＮＡおよびアミラーゼが施与されたＣＮＴの相対アミラーゼ活性］
アミラーゼ活性は、０．２ｍｇ／ｍｌのアミラーゼ溶液、又は酵素濃度 ０．１２ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ及びアミラーゼが施与された炭素同素体の分散液０．２ｍｌを、反応緩衝液（５０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮａ−ＣＨ３ＣＯＯＨ （ｐＨ４．８））０．１ｍｌ、５ｍＭの合成基質（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−α−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｅｎｔａｏｓｉｄｅ（シグマ・アルドリッチ社））０．１ｍｌ、脱イオン水０．１ｍｌを混合した溶液に加え、２０℃で１時間処理した後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加え、４００ｎｍで吸光度を測定した。基準アミラーゼ活性は、上記のＤＮＡ及びアミラーゼが施与された炭素同素体の分散液に代えて、０．２ｍｇ／ｍｌのアミラーゼ溶液を用いて測定した。
【００４７】
結果を図８に示す。ＤＮＡ及びアミラーゼが施与されたＣＮＴは、基準アミラーゼ活性の約６倍の相対アミラーゼ活性を示した。
【００４８】
［実施例１０：ＤＮＡおよびリパーゼが施与されたＣＮＴの相対リパーゼ活性］
リパーゼ活性は、酵素濃度 ０．３ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ及びリパーゼが施与された炭素同素体の分散液０．２ｍｌを、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０））０．１ｍｌ、５ｍＭの合成基質（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｓｔｅａｒａｔｅ（シグマ・アルドリッチ社））０．１ｍｌ、脱イオン水０．１ｍｌを混合した溶液に加え、３７℃で１時間処理した後、１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加え、４００ｎｍで吸光度を測定した。基準リパーゼ活性は、上記のＤＮＡ及びリパーゼが施与された炭素同素体の分散液に代えて、０．３ｍｇ／ｍｌのリパーゼ溶液を用いて測定した。
【００４９】
結果を図９に示す。ＤＮＡ及びリパーゼが施与されたＣＮＴは、基準リパーゼ活性の約４．５倍の相対リパーゼ活性を示した。
【００５０】
［実施例１１：ＤＮＡおよびエステラーゼが施与されたＣＮＴの相対エステラーゼ活性］
エステラーゼ活性は、酵素濃度０．２５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ及びエステラーゼが施与された炭素同素体の分散液０．２ｍｌを反応緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＭＯＰＳ・Ｎａ（ｐＨ７．０））０．１ｍｌ、５ｍＭの合成基質（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｂｕｔｙｌａｔｅ（シグマ・アルドリッチ社製））０．１ｍｌ、脱イオン水０．１ｍｌを混合した溶液に加え、３０℃で１時間処理した後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加え、４００ｎｍで吸光度を測定した。基準エステラーゼ活性は、上記のＤＮＡ及びエステラーゼが施与された炭素同素体の分散液に代えて、０．６５ｍｇ／ｍｌのエステラーゼ溶液を用いて測定した。
【００５１】
結果を図１０に示す。ＤＮＡ及びエステラーゼが施与されたＣＮＴは、基準エステラーゼ活性の約１０倍の相対エラスターゼ活性を示した。
【００５２】
［実施例１２：ＤＮＡおよびエラスターゼが施与されたＣＮＴの相対エラスターゼ活性］
エラスターゼ活性は、エラスチン‐コンゴーレッドを基質として、消化によって可溶化される色調を４８５ｎｍで測定する、和光純薬工業株式会社コードＮｏ．０５８−０５３６１の活性測定法に準じて行った（Ｈａｌｌ, Ｄ．Ａ. : Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.,１０１, ２９（１９６６）、Ｓａｃｈａｒ， Ｌ． Ａ．， Ｗｉｎｔｅｒ， Ｋ． Ｋ．， Ｓｉｃｈｅｒ， Ｎ． ａｎｄ Ｆｒａｎｋｅｌ, S. : Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．，９０，３２３（１９５５）、Ｈｕｅｂｎｅｒ， Ｐ． Ｆ．: Ａｍａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７４，４１９ （１９７６）、Ｓｈｏｔｔｏｎ， Ｄ． Ｍ．: Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９，１１３ （１９７０）等を参照）。
【００５３】
結果を図１１に示す。ＤＮＡ及びエラスターゼが施与されたＣＮＴは、基準エラスターゼ活性の１５倍の相対エラスターゼ活性を示した。
【００５４】
［実施例１３：ＤＮＡ及びグルコースオキシターゼが施与されたＣＮＴの相対グルコースオキシターゼ活性］
グルコースオキシダーゼ活性測定は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて行った。検出波長は５９０ｎｍで行った。結果を図１２に示す。ＤＮＡ及びグルコースオキシターゼが施与されたＣＮＴは、基準グルコースオキシターゼ活性の３．２倍の相対グルコースオキシターゼ活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体は、酵素分野、バイオリアクター分野、バイオセンサー分野、分析分野、医薬分野、農薬分野などへの応用に好適である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ及び酵素が施与されたことを特徴とする、炭素同素体。
【請求項２】
前記炭素同素体がカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）類又はフラーレン類である、請求項１に記載の炭素同素体。
【請求項３】
前記ＣＮＴ類が、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、二層カーボンナノチューブ（ＤＷＮＴ）及び多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）からなる群より選択される、請求項２に記載の炭素同素体。
【請求項４】
前記フラーレン類が、フラーレン、水素化フラーレン、酸化フラーレン、及び水酸化フラーレンからなる群より選択される、請求項２に記載の炭素同素体。
【請求項５】
前記ＤＮＡが天然物由来のＤＮＡ又は合成オリゴＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の炭素同素体。
【請求項６】
前記合成オリゴＤＮＡが、ポリ（ｄＡ）ｎ、ポリ（ｄＧ）ｎ、及びポリ（ｄＣ）ｎ（ｎは８〜３０の間の整数）からなる群より選択される、請求項５に記載の炭素同素体。
【請求項７】
前記ポリ（ｄＧ）ｎのｎが８〜２５の整数である、請求項６に記載の炭素同素体。
【請求項８】
前記ポリ（ｄＣ）ｎのｎが１０〜３０の整数である、請求項６に記載の炭素同素体。
【請求項９】
前記酵素が加水分解酵素、酸化還元酵素、除去付加酵素、異性化酵素、連結酵素、及び転移酵素からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の炭素同素体。
【請求項１０】
前記加水分解酵素が、タンパク質分解酵素、アミラーゼ、リパーゼ、又はエステラーゼである、請求項９に記載の炭素同素体。
【請求項１１】
前記タンパク質分解酵素がセリンプロテアーゼである、請求項１０に記載の炭素同素体。
【請求項１２】
前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシン、トリプシン又はエラスターゼである、請求項１１に記載の炭素同素体。
【請求項１３】
前記酸化還元酵素がカタラーゼ、グルコースオキシゲナーゼ、又はコレステロールオキシターゼである、請求項９に記載の炭素同素体。
【請求項１４】
（１）炭素同素体にＤＮＡを施与するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた炭素同素体に、酵素を施与するステップ
とを含む、ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体の製造方法。
【請求項１５】
前記ステップ（１）の施与が、ＤＮＡ溶液中に炭素同素体を分散させることによって行われる、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
（１）ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体を用意するステップと、
（２）ステップ（１）で用意した炭素同素体に、基質を接触させるステップと、
とを含む、酵素反応を行う方法。
【請求項１】
ＤＮＡ及び酵素が施与されたことを特徴とする、炭素同素体。
【請求項２】
前記炭素同素体がカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）類又はフラーレン類である、請求項１に記載の炭素同素体。
【請求項３】
前記ＣＮＴ類が、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、二層カーボンナノチューブ（ＤＷＮＴ）及び多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）からなる群より選択される、請求項２に記載の炭素同素体。
【請求項４】
前記フラーレン類が、フラーレン、水素化フラーレン、酸化フラーレン、及び水酸化フラーレンからなる群より選択される、請求項２に記載の炭素同素体。
【請求項５】
前記ＤＮＡが天然物由来のＤＮＡ又は合成オリゴＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の炭素同素体。
【請求項６】
前記合成オリゴＤＮＡが、ポリ（ｄＡ）ｎ、ポリ（ｄＧ）ｎ、及びポリ（ｄＣ）ｎ（ｎは８〜３０の間の整数）からなる群より選択される、請求項５に記載の炭素同素体。
【請求項７】
前記ポリ（ｄＧ）ｎのｎが８〜２５の整数である、請求項６に記載の炭素同素体。
【請求項８】
前記ポリ（ｄＣ）ｎのｎが１０〜３０の整数である、請求項６に記載の炭素同素体。
【請求項９】
前記酵素が加水分解酵素、酸化還元酵素、除去付加酵素、異性化酵素、連結酵素、及び転移酵素からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の炭素同素体。
【請求項１０】
前記加水分解酵素が、タンパク質分解酵素、アミラーゼ、リパーゼ、又はエステラーゼである、請求項９に記載の炭素同素体。
【請求項１１】
前記タンパク質分解酵素がセリンプロテアーゼである、請求項１０に記載の炭素同素体。
【請求項１２】
前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシン、トリプシン又はエラスターゼである、請求項１１に記載の炭素同素体。
【請求項１３】
前記酸化還元酵素がカタラーゼ、グルコースオキシゲナーゼ、又はコレステロールオキシターゼである、請求項９に記載の炭素同素体。
【請求項１４】
（１）炭素同素体にＤＮＡを施与するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた炭素同素体に、酵素を施与するステップ
とを含む、ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体の製造方法。
【請求項１５】
前記ステップ（１）の施与が、ＤＮＡ溶液中に炭素同素体を分散させることによって行われる、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
（１）ＤＮＡ及び酵素が施与された炭素同素体を用意するステップと、
（２）ステップ（１）で用意した炭素同素体に、基質を接触させるステップと、
とを含む、酵素反応を行う方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−４４８７８（Ｐ２０１２−４４８７８Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８７２５７（Ｐ２０１０−１８７２５７）
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【出願人】（５０１０６１３１９）学校法人 東洋大学 (68)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【出願人】（５０１０６１３１９）学校法人 東洋大学 (68)
【Ｆターム（参考）】
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