ＤＮＡ混合体及びその使用並びに真偽判別方法
【課題】 ハイブリダイゼーション法を用い、短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定する。また、付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に増幅し、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって、目的とするＤＮＡ配列が存在するか否かを識別することが可能なＤＮＡ混合体及びその利用並びに真偽判別方法を提供する。
【解決手段】 一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素で標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ３種類のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）を配置し、この一対のプライマー間のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列が、固有情報を含んだ情報部分としたＤＮＡである。
【解決手段】 一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素で標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ３種類のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）を配置し、この一対のプライマー間のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列が、固有情報を含んだ情報部分としたＤＮＡである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ混合体及びその使用並びに真偽判別方法に関する。特に銀行券、有価証券、身分証明書、重要書類等の複写による偽造印刷物に対して抑止力のあるＤＮＡ混合体及び真偽判別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、カラー複写機の普及により誰でも簡単に高精度な複写物を得ることができるようになっており、銀行券、有価証券、身分証明書及び重要書類等の印刷物が容易に偽造されるということが問題になっている。このような偽造印刷物の作製を牽制する目的で、種々の偽造防止技術が考えられ提案されている。
【０００３】
情報の分野では電子すかしを入れたり、インキ材料の分野では蛍光又は燐光等の機能性インキを用いて印刷物を作製する技術が数多く提案されている。
【０００４】
また、最近では特定のＤＮＡの塩基配列を利用してＤＮＡインキを作製し、このＤＮＡインキを用いて商品等に印刷することで偽造や改ざんを防止する技術も提案されている。特定の物質で作製した人工ＤＮＡを組成物として含む添加物をセキュリティー管理における個人の識別や商品の真偽鑑定などに利用する識別情報保持物（例えば、特許文献１参照）が開示されている。
【０００５】
また、合成ＤＮＡ及び又はダミーＤＮＡを含有する組成物及びその利用物を得ることで、偽造や複製をより困難とするインキ及び印刷物（例えば、特許文献２参照）が開示されている。
【０００６】
また、ＤＮＡ試料に含まれる４種類の塩基配列を決定する速度は重要な技術的課題であり、従来より、ＤＮＡを重合酵素連続反応（以下、「ＰＣＲ」という。（Polymerase Chain Reaction））を通じて同じ塩基配列を有するＤＮＡとして大量増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基配列を、シークエンシング（塩基配列の決定）又はＤＮＡチップで分析することにより、極微量として存在する元の核酸の塩基配列を決定していた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１５７００４号公報
【特許文献２】特開２００５−９７３４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１では、特定の物質で作製した人工ＤＮＡを組成物や人の口腔から採取したもの、つまり唾液を単純に添加しているだけなので、最新の分析技術を駆使すればその塩基配列が解読されてしまうという問題がある。
【０００９】
また、特許文献２では、数種類の合成ＤＮＡと、より多くのダミーＤＮＡを混入させたＤＮＡインキを作成しているが、一つの合成ＤＮＡは一つの情報部分を有する構成であるので、偽造を防止するために多くの情報を付与するためには、多くの種類の合成ＤＮＡが必要になり、インキの組成物のＤＮＡ分析に際して非常に多くの時間が必要となり、その結果、その塩基配列情報を読み出すまでの膨大な手間と時間を要すという問題がある。
【００１０】
さらに、従来の測定法では、結果が判別できるまでに長時間を要していた。また、判定に要する時間を短縮するために、ゲル電気泳動法のみで判定を行う方法がとられていたが、ゲル電気泳動法のみでは精度が悪く、精度を上げるために、シークエンシングもしくはＤＮＡチップ等で確認を行う方法では、高度の技術と設備が必要となり、時間もかかるという問題があった。
【００１１】
そこで、近年、核酸の配列を決定する方法としては、ハイブリダイゼーション法が有利となってきた。本発明の目的は、上記問題点を解決するためになされたものであり、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡとから成る一組のＤＮＡの一方をダミーとすることで、製品に対してより偽造又は改ざんを防止することが可能となるＤＮＡ混合体及び真偽判別方法を提供するものであり、ハイブリダイゼーション法を用いて短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定する。また、付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に増幅し、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって目的とするＤＮＡ配列が存在するか識別することが可能な、ＤＮＡ混合体及びその利用並びに真偽判別方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは今般、ゲル電気泳動法を用いることなく、ハイブリダイゼーション法により短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定することができるＤＮＡを設計することができた。また、これらのＤＮＡを、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計することにより、特定の塩基配列に情報を付与することができるという知見を得た。本発明は、かかる知見によるものである。
すなわち、本発明のＤＮＡ混合体は、一対のプライマー間に、前述のプライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置し、前述のプローブの少なくとも一つが固有の塩基配列に基づく情報を付与して設計された第1のＤＮＡと、前記第1のＤＮＡと同一のプライマーで、前述のプライマーとは異なる塩基配列を有する一つ以上のプローブが情報を付与しないで設計された第２のＤＮＡとを含んで成るものである。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡ混合体は、一組のＤＮＡにおいて、一対のプライマー間のアンプリコンサイズと塩基組成比率とプローブの塩基鎖長とが同じであるように設計されたものである。
【００１４】
また、本発明のＤＮＡ混合体は、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されたものである。
【００１５】
また、本発明の別の態様としての印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙の真偽判別方法は、印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡ混合体からＤＮＡを抽出する工程と、前記抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブ法を用いて蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光によって、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光の有無を検出する工程とよりなるものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡの一組のＤＮＡの一方をダミーとしたＤＮＡ混合体とすることで、製品に対してより偽造又は改ざんを防止することが可能となり、ＤＮＡ混合体に付与した固有情報を短時間で精度よく、迅速に読み出すことができる。
また、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって目的とするＤＮＡ配列が存在するか否かを破壊又は非破壊のどちらの方法でも識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明の実施の形態による、ＤＮＡ混合体及び真偽判別方法について、図面を用いて説明する。本発明において、ＤＮＡ、プローブ、ハイブリダイゼーション、プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ法、ＰＣＲ法及びＲＴ−ＰＣＲ等の用語は、現在分子生物学、遺伝子工学及び微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１８】
本実施の形態により設計されるＤＮＡは、従来のＤＮＡが、一つのＤＮＡは一つの情報部分を有する構成であるために、多くの情報を付与するためには、多くの種類のＤＮＡが必要になるという問題があり、また、例えば一つの製品に数種類のＤＮＡを混入し、それらを同定することで真偽判別の効果をあげるという手法を用いる場合には、多種類のＤＮＡが必要になり、かつ判別に長時間を要するという問題を解決するためになされたものである。
【００１９】
本実施の形態において設計したＤＮＡ混合体の構成としては、一組のＤＮＡを構成する、第１のＤＮＡの一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素とで標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ、少なくとも２種類以上のプローブを組み込んで構成し、第２のＤＮＡは、第１のＤＮＡと同一のプライマーで、このプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素とで標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ、一つ以上のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡ混合体としている。
【００２０】
ＤＮＡ混合体の真偽判別方法としては、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているかどうかを短時間で迅速かつ精度良く情報の分析を行う方法として、特定の塩基配列と相補的な関係にある蛍光色素とドナー色素とを含んだプローブを使用するハイブリダイゼーションプローブ法を用いる。
【００２１】
第２のＤＮＡは、ＤＮＡの分析を妨げることが可能な成分であり、ダミーＤＮＡとして設計する。前述したように、ダミーＤＮＡの設計は、一対のプライマー間に一つのプローブのみを配置する。このプローブは分析の対象となるＤＮＡと同種のものでも異種のものでもよい。ダミーＤＮＡを人為的に入れることで、情報が抽出されるのを防ぐようにしている。また、ダミーＤＮＡは分析の対象となるＤＮＡより過剰に添加する、少なくとも試料中の分析対象となるＤＮＡ量の等倍以上とすることで、ＤＮＡの検出をダミーＤＮＡによって妨害することが可能となる。
【００２２】
蛍光色素は、一般にプローブに標識して、核酸の測定及び検定に用いられるものが使用でき、例えば、フルオレイセン又はその誘導体類、ローダミン又はその誘導体類などが好適に用いられる。
【００２３】
例えば、２種類のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡの場合、一般的な６波長での検出が可能であるとするならば２１種類、３種類のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡの場合は５６種類のＤＮＡを識別することが可能となる。
このように組み込むプローブの数を増やすことにより、一つのＤＮＡに多くの固有の情報を入れることが可能となる。
【００２４】
本実施の形態により設計されたＤＮＡを用いた印刷物の真偽判別に用いるハイブリダイゼーションプローブ法についての概要を述べる。
リアルタイム検出ＰＣＲ法は定量性が高く、被検ＤＮＡの定量には優れた方法である。リアルタイム検出ＰＣＲ法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ法）では、その原理において蛍光色素であるフルオレイセン（６-ＦＡＭ）の強度を測定する場合が多い。
また、蛍光色素の組合せは周知であり市販もされている。ドナー色素の例として、フルオレイセン、アクセプター蛍光色素の例として、ＬＣ Ｒｅｄ６４０等がある。
【００２５】
各蛍光色素は、増幅産物とハイブリダイズした状態において、各核酸の互いに近接する末端領域に結合されることより、一組のプローブが増幅産物にハイブリダイズした状態では、ドナー色素とアクセプター色素とが近接して存在するので、蛍光共鳴エネルギー転移効果が起き、蛍光を発する。
目的とするＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）に、これらのプローブを入れてＰＣＲを行うと、プライマーのアニーリングと同時にプローブのアニーリングが起き、蛍光を発する。その後、通常のＰＣＲと同様に、ポリメラーゼ反応により新しいＤＮＡが複製され、ハイブリダイゼーションがはずれて消光する。
【００２６】
（実施例１）
図１及び図２に、実施例１としてＤＮＡの設計の一例を示す。本実施例において用いるＤＮＡとしては、タカラバイオ社製のラットの遺伝子断片（塩基鎖長３００ｂｐ）をＩＣＡＮ法により増幅したものを用いた。
【００２７】
一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素で標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ３種類のプローブで構成されるＤＮＡの設計をする。設計されたＤＮＡのプローブに、あらかじめ塩基配列として固有の情報を組み込んで作製し、このＤＮＡの各プローブの塩基配列と、該プローブに組み込んだ情報を関連付けてデータベースに記憶しておく。
【００２８】
＜ＤＮＡ（Ｘ）の設計＞
図１に、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）の設計図の一例を示す。
ＤＮＡ（Ｘ）の構成としては、一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素で標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ３種類のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）を配置する。この一対のプライマー間のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列が、固有情報を含んだ情報部分となる部分である
【００２９】
本実施例では、塩基鎖数は３００ｂｐ、アンプリコンサイズは２８６ｂｐとしているが、塩基配列及び鎖長においての制限は特にない。また、プライマー部分に関しても特に制限はないが、８塩基鎖長以上が適当である。
プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の情報の付与の方法に関しての制限はない。
また、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列はそれぞれ異なっていても、また同じでも良い。さらにまた、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）はＤＮＡ（Ｘ）上にあれば、同一の鎖上でなくともよい。
本実施例では、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列をハイブリダイゼーションプローブ法で同定できた場合のみ、固有情報（Ｘ）を読み取ることができる、という設定条件としている。
【００３０】
（ハイブリダイゼーションプローブの作製）
ハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ´の組）は、片方のプローブをドナー色素、もう片方のプローブを蛍光発光する色素で標識した一組のプローブで構成される。このハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ´の組）は、ＤＮＡ（Ｘ）上のプローブ（Ａ）と相補的な塩基配列を有し、ドナー色素で標識したプローブと蛍光発光する色素で標識したプローブの一組が近接した位置に同時にＤＮＡ（Ｘ）のプローブ（Ａ）とハイブリダイズしたときのみ蛍光を発する。
同様に、ハイブリダイゼーションプローブ（ｂ−ｂ´の組）はプローブ（Ｂ）と、ハイブリダイゼーションプローブ（ｃ−ｃ´の組）はプローブ（Ｃ）と相補的な塩基配列を有していて、一組のプローブが近接した位置に同時にプローブとハイブリダイズしたときのみ蛍光を発する。
【００３１】
本実施例では、ハイブリダイゼーションプローブを次のように設計した。
ハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ´の組）は、塩基鎖長５３ｂｐで２４番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２６番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６４０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６４０nmである。
ハイブリダイゼーションプローブ（ｂ−ｂ´の組）は、塩基鎖長５７ｂｐで２８番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに３０番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ７０５ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は７０５nmである。
ハイブリダイゼーションプローブ（ｃ−ｃ´の組）は、塩基鎖長５４ｂｐで２８番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに３０番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６１０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６１０ｎｍである。
【００３２】
（ダミーＤＮＡ（Ｄ）設計）
図２に、ダミーとなるＤＮＡ（Ｄ）の設計図の一例を示す。
ダミーＤＮＡ（Ｄ）は、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）と同一の塩基配列から成る一対のプライマー間に、プローブ（Ｃ）のみを配置する。プローブ（Ｃ）はポジティブコントロールとして用いるものであり、塩基配列には固有の情報を埋め込む必要はない。ただし、ダミーＤＮＡ（Ｄ）の塩基鎖数、アンプリコンサイズ、塩基組成比率は固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）と同一とする。
【００３３】
ハイブリダイゼーションプローブを構成するドナー色素で標識されるプローブと、蛍光発光する色素で標識したプローブとの間隔は、１〜５塩基以内が望ましく、１〜２塩基が最も望ましい。
ハイブリダイゼーションプローブを構成する、ドナー色素は特にフルオレイセンに限定されるものではなく、また、蛍光発光する色素は、前述の色素の限定されるものではない。
【００３４】
（ＤＮＡの判別）
以上のように固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）を設計することで、同一のプライマーを有する２種類のＤＮＡを判別に用いることが可能となる。
【００３５】
また、ハイブリダイゼーションプローブは、波長の異なる蛍光物質の組合せが可能であるため、本実施例１のように、一対のプライマー間に３種類のプローブを組み込んでもその判別が可能となる。例えば、Ａ、Ｂ及びＣ３種類の蛍光物質をハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合には、ＡＡＢ、ＡＢＢ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＢＢＣ、ＢＣＣ及びＡＢＣの７種類の組合せが考えられるので、それぞれの場合の判別が可能となる。
【００３６】
また、同一の蛍光物質の組合せにおいては、さらに検出のための増幅に関わる時間の短縮が可能となると共に発光強度比による判定も可能となる。
【００３７】
さらに、ＤＮＡの構成として、以下に示した波長の異なる蛍光発光するハイブリダイゼーションプローブを用いる場合には、５０種類の組合せの利用が考えられ、その判別が可能となる。
プローブＡ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５３０標識・・検出波長５３０ｎｍ
プローブＢ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５５５標識・・検出波長５５５ｎｍ
プローブＣ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６１０標識・・検出波長６１０ｎｍ
プローブＤ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６４０標識・・検出波長６４０ｎｍ
プローブＥ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６７０標識・・検出波長６７０ｎｍ
プローブＦ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ７１０標識・・検出波長７１０ｎｍ
【００３８】
この場合のダミーＤＮＡ（Ｄ）の構成としては、前述と同じように、一対のプライマー間に固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）と同一なプローブを一つのみ配置すればよい。
【００３９】
以上のようにして設計したＤＮＡを用いた使用例としては、複数の固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）とを、一般に公知のインキ製造過程で、インキの一成分として混入してＤＮＡ入りインキを製造することができる。
【００４０】
また、別の使用例として、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）とを水溶性高分子と混合して混合物とし、該混合物を固化して得られた硬化物を含んだＤＮＡ含有物を製造することができる。
【００４１】
以上のように、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列のうち、例えばプローブ（Ａ）とプローブ（Ｂ）又はプローブ（Ａ）とプローブ（Ｃ）が同定できた場合のみ固有情報（Ｘ）を読み取ることができる、というような設定条件とすることで、例えば、前述したＤＮＡ入りインキ又はＤＮＡ含有物に適用すると、何通りもの組合せが考えられる。
【００４２】
（実施例２）
図３、図４及び図５に、実施例２として、実施例１で作製したＤＮＡ入りインキ又はＤＮＡ含有物を用いて印刷物を作製し、作製した印刷物から固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）を抽出し、さらにプローブに組み込まれた塩基配列を解読することで、情報を読み出して真偽判別する方法について説明する。実施例２では、ＤＮＡ入りインキを用いて説明する。
【００４３】
ＤＮＡ入りインキに混入されている、実施例１で設計した固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）、一対のプライマーとプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）、プローブ（Ｃ）のそれぞれの塩基配列情報は、あらかじめ記録部に記録するなどして管理しておく。
【００４４】
（ＤＮＡ入りインキによるオフセット印刷物の作製）
一般に公知のインキ製造方法により、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）を０．００５％、ダミーＤＮＡ（Ｄ）を０．０５％含むＤＮＡ入りオフセットインキを製造する。このＤＮＡ入りオフセットインキを用いて印刷適性印刷機によりオフセット印刷物を作製する。
但し、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）の含有量≪ダミーＤＮＡ（Ｄ）の含有量とする。
【００４５】
（ＤＮＡ入りオフセット印刷物からのＤＮＡの抽出）
ＤＮＡの抽出法としては、ＤＮＡを含む部分を破壊しないで抽出する方法、又はＤＮＡを含む部分を切り抜き、破断して抽出に用いる方法等がある。本実施例においては、ＤＮＡを含む部分を切り抜き、破断して用いる方法を用いるが、非破壊で溶出転写する方法でも同様の結果を得ることができる。
オフセット印刷により得られた印刷物をφ５mmに打ち抜き、バッファ５０μｌを加えて超音波抽出を行ない、抽出液を得た。
【００４６】
本実施例２においては、ロッシュ社製のリアルタイムＰＣＲ装置（ライトサイクラー４００ ＤＸシステム（商品名））を使用した。次に、印刷物からの抽出液、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）、ダミーＤＮＡ（Ｄ）及びネガティブコントロールとしての水を用いて、リアルタイムＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）装置を使用してＤＮＡの検出を行う。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲ装置におけるＰＣＲ中のＤＮＡの蛍光標識方法にはいくつかの方法があり、一つは、２本鎖状態のＤＮＡに特異的に結合するサイバーグリーンという蛍光標識を利用するサイバーグリーン法、他の一つには、ＰＣＲにより合成されたＤＮＡの内部の塩基配列に特異的に結合する蛍光標識を利用するハイブリダイゼーションプローブ法がある。
【００４８】
（ハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ）
図５に、印刷物からの抽出液、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）、ダミーＤＮＡ（Ｄ）及びネガティブコントロールとしての水を用い、ハイブリダイゼーションプローブ法によりＲＴ−ＰＣＲを行った蛍光検出の結果を示す。
【００４９】
固有情報を有するＤＮＡ（Ａ）は、実施例１で設計した通りに、６４０nm、７０５nm、６１０nmのいずれの波長においても蛍光が検出された。
ダミーＤＮＡ（Ｄ）は実施例１で設計した通り、プローブ（Ｃ）の６１０nmの波長においてのみ蛍光が検出できた。
印刷物からの抽出液では、６４０nm、７０５nm、６１０nmのいずれの波長においても蛍光が検出された。また、表１の立ち上がりサイクル数の表より、６１０nmにおける立ち上がりのサイクル数は１１サイクルで、６４０nm、７０５nmにおける立ち上がりのサイクル数１３より早かった。
ネガティブコントロールでは、いずれの波長においても蛍光は検出されなかった。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（比較例１：サイバーグリーン法）
図３に、本実施例の比較例１として、サイバーグリーン法を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った際の、融解曲線を測定した結果を示す。融解曲線から、印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）の塩基組成が同一であることが分かる。従って、融解曲線から印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物を差別化して真偽判別することはできない。
【００５２】
（比較例２：ゲル電気泳動方法）
図４に、本実施例の比較例２として、ゲル電気泳動の結果を示す。印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）の塩基鎖長が同一であることが分かる。したがって、ゲル電気泳動からも印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物を差別化して真偽判別することはできない。
【００５３】
したがって、印刷物からの抽出液、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）の識別は、ハイブリダイゼーションプローブ法によってのみ真偽判別が可能であった。
【００５４】
（情報の読み出し（表２））
ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光が検出されたプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）の塩基配列から、あらかじめ設定した固有情報（Ｘ）を読み取る。
表２に示すように、プローブ（Ａ）及びプローブ（Ｂ）による蛍光が検出されずにプローブ（Ｃ）の蛍光のみが検出されている場合は、“偽造の可能性”があるものと推定する。
プローブ（Ｃ）の蛍光も検出されない場合は、抽出操作を見直す必要がある。
【００５５】
【表２】
【００５６】
本実施例の方法を用いた一連の作業時間の一例として、以下に示すように約６０分でＤＮＡの抽出及び確認を終了することが可能となった。
ＤＮＡ抽出が１０分、試薬調整が２０分で準備が６０分、ＲＴ−ＰＣＲが３０分（３０サイクル）。
【００５７】
以上詳述した、ＤＮＡの分析による本実施例と比較例による結果の比較をまとめたものを表３に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】
以上の実施例は、塩基配列を同一にしているが、異なる塩基配列情報を有するプローブを組み込んだＤＮＡを使用した場合には、鍵となる蛍光発光させる側のプローブとのマッチングによって真正同士の間における差別化が可能となり、真偽判別のみならず製造履歴等の固有情報を引き出す方法としても利用できる。
【００６０】
以上、本発明に係るＤＮＡ入りインキを用いて印刷物を作製した実施例について説明したが、ＤＮＡ入り含有物を用いた用紙を使用した印刷物も同様の操作で真偽判別を行うことが可能である。また、プローブの塩基配列の設計を替えることにより組合せの数が多くなるので、少ないＤＮＡで多くの固有情報の付与が可能となり、従来のように、一つのＤＮＡは一つの情報部分を有する構成では、偽造を防止するために多くの情報を付与するために、多くのＤＮＡが必要となるという問題があったが、本発明によれば一つのＤＮＡに少なくとも２種類以上の情報を付与することが可能となるので、経済的で作業時間が短縮されるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１における固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）を示す図である。
【図２】実施例１におけるダミーＤＮＡ（Ｄ）を示す図である。
【図３】融解曲線を示す図である。
【図４】ゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ混合体及びその使用並びに真偽判別方法に関する。特に銀行券、有価証券、身分証明書、重要書類等の複写による偽造印刷物に対して抑止力のあるＤＮＡ混合体及び真偽判別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、カラー複写機の普及により誰でも簡単に高精度な複写物を得ることができるようになっており、銀行券、有価証券、身分証明書及び重要書類等の印刷物が容易に偽造されるということが問題になっている。このような偽造印刷物の作製を牽制する目的で、種々の偽造防止技術が考えられ提案されている。
【０００３】
情報の分野では電子すかしを入れたり、インキ材料の分野では蛍光又は燐光等の機能性インキを用いて印刷物を作製する技術が数多く提案されている。
【０００４】
また、最近では特定のＤＮＡの塩基配列を利用してＤＮＡインキを作製し、このＤＮＡインキを用いて商品等に印刷することで偽造や改ざんを防止する技術も提案されている。特定の物質で作製した人工ＤＮＡを組成物として含む添加物をセキュリティー管理における個人の識別や商品の真偽鑑定などに利用する識別情報保持物（例えば、特許文献１参照）が開示されている。
【０００５】
また、合成ＤＮＡ及び又はダミーＤＮＡを含有する組成物及びその利用物を得ることで、偽造や複製をより困難とするインキ及び印刷物（例えば、特許文献２参照）が開示されている。
【０００６】
また、ＤＮＡ試料に含まれる４種類の塩基配列を決定する速度は重要な技術的課題であり、従来より、ＤＮＡを重合酵素連続反応（以下、「ＰＣＲ」という。（Polymerase Chain Reaction））を通じて同じ塩基配列を有するＤＮＡとして大量増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基配列を、シークエンシング（塩基配列の決定）又はＤＮＡチップで分析することにより、極微量として存在する元の核酸の塩基配列を決定していた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１５７００４号公報
【特許文献２】特開２００５−９７３４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１では、特定の物質で作製した人工ＤＮＡを組成物や人の口腔から採取したもの、つまり唾液を単純に添加しているだけなので、最新の分析技術を駆使すればその塩基配列が解読されてしまうという問題がある。
【０００９】
また、特許文献２では、数種類の合成ＤＮＡと、より多くのダミーＤＮＡを混入させたＤＮＡインキを作成しているが、一つの合成ＤＮＡは一つの情報部分を有する構成であるので、偽造を防止するために多くの情報を付与するためには、多くの種類の合成ＤＮＡが必要になり、インキの組成物のＤＮＡ分析に際して非常に多くの時間が必要となり、その結果、その塩基配列情報を読み出すまでの膨大な手間と時間を要すという問題がある。
【００１０】
さらに、従来の測定法では、結果が判別できるまでに長時間を要していた。また、判定に要する時間を短縮するために、ゲル電気泳動法のみで判定を行う方法がとられていたが、ゲル電気泳動法のみでは精度が悪く、精度を上げるために、シークエンシングもしくはＤＮＡチップ等で確認を行う方法では、高度の技術と設備が必要となり、時間もかかるという問題があった。
【００１１】
そこで、近年、核酸の配列を決定する方法としては、ハイブリダイゼーション法が有利となってきた。本発明の目的は、上記問題点を解決するためになされたものであり、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡとから成る一組のＤＮＡの一方をダミーとすることで、製品に対してより偽造又は改ざんを防止することが可能となるＤＮＡ混合体及び真偽判別方法を提供するものであり、ハイブリダイゼーション法を用いて短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定する。また、付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に増幅し、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって目的とするＤＮＡ配列が存在するか識別することが可能な、ＤＮＡ混合体及びその利用並びに真偽判別方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは今般、ゲル電気泳動法を用いることなく、ハイブリダイゼーション法により短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定することができるＤＮＡを設計することができた。また、これらのＤＮＡを、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計することにより、特定の塩基配列に情報を付与することができるという知見を得た。本発明は、かかる知見によるものである。
すなわち、本発明のＤＮＡ混合体は、一対のプライマー間に、前述のプライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置し、前述のプローブの少なくとも一つが固有の塩基配列に基づく情報を付与して設計された第1のＤＮＡと、前記第1のＤＮＡと同一のプライマーで、前述のプライマーとは異なる塩基配列を有する一つ以上のプローブが情報を付与しないで設計された第２のＤＮＡとを含んで成るものである。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡ混合体は、一組のＤＮＡにおいて、一対のプライマー間のアンプリコンサイズと塩基組成比率とプローブの塩基鎖長とが同じであるように設計されたものである。
【００１４】
また、本発明のＤＮＡ混合体は、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されたものである。
【００１５】
また、本発明の別の態様としての印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙の真偽判別方法は、印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡ混合体からＤＮＡを抽出する工程と、前記抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブ法を用いて蛍光を検出する工程と、前記検出した蛍光によって、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光の有無を検出する工程とよりなるものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡの一組のＤＮＡの一方をダミーとしたＤＮＡ混合体とすることで、製品に対してより偽造又は改ざんを防止することが可能となり、ＤＮＡ混合体に付与した固有情報を短時間で精度よく、迅速に読み出すことができる。
また、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって目的とするＤＮＡ配列が存在するか否かを破壊又は非破壊のどちらの方法でも識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明の実施の形態による、ＤＮＡ混合体及び真偽判別方法について、図面を用いて説明する。本発明において、ＤＮＡ、プローブ、ハイブリダイゼーション、プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ法、ＰＣＲ法及びＲＴ−ＰＣＲ等の用語は、現在分子生物学、遺伝子工学及び微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１８】
本実施の形態により設計されるＤＮＡは、従来のＤＮＡが、一つのＤＮＡは一つの情報部分を有する構成であるために、多くの情報を付与するためには、多くの種類のＤＮＡが必要になるという問題があり、また、例えば一つの製品に数種類のＤＮＡを混入し、それらを同定することで真偽判別の効果をあげるという手法を用いる場合には、多種類のＤＮＡが必要になり、かつ判別に長時間を要するという問題を解決するためになされたものである。
【００１９】
本実施の形態において設計したＤＮＡ混合体の構成としては、一組のＤＮＡを構成する、第１のＤＮＡの一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素とで標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ、少なくとも２種類以上のプローブを組み込んで構成し、第２のＤＮＡは、第１のＤＮＡと同一のプライマーで、このプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素とで標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ、一つ以上のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡ混合体としている。
【００２０】
ＤＮＡ混合体の真偽判別方法としては、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているかどうかを短時間で迅速かつ精度良く情報の分析を行う方法として、特定の塩基配列と相補的な関係にある蛍光色素とドナー色素とを含んだプローブを使用するハイブリダイゼーションプローブ法を用いる。
【００２１】
第２のＤＮＡは、ＤＮＡの分析を妨げることが可能な成分であり、ダミーＤＮＡとして設計する。前述したように、ダミーＤＮＡの設計は、一対のプライマー間に一つのプローブのみを配置する。このプローブは分析の対象となるＤＮＡと同種のものでも異種のものでもよい。ダミーＤＮＡを人為的に入れることで、情報が抽出されるのを防ぐようにしている。また、ダミーＤＮＡは分析の対象となるＤＮＡより過剰に添加する、少なくとも試料中の分析対象となるＤＮＡ量の等倍以上とすることで、ＤＮＡの検出をダミーＤＮＡによって妨害することが可能となる。
【００２２】
蛍光色素は、一般にプローブに標識して、核酸の測定及び検定に用いられるものが使用でき、例えば、フルオレイセン又はその誘導体類、ローダミン又はその誘導体類などが好適に用いられる。
【００２３】
例えば、２種類のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡの場合、一般的な６波長での検出が可能であるとするならば２１種類、３種類のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡの場合は５６種類のＤＮＡを識別することが可能となる。
このように組み込むプローブの数を増やすことにより、一つのＤＮＡに多くの固有の情報を入れることが可能となる。
【００２４】
本実施の形態により設計されたＤＮＡを用いた印刷物の真偽判別に用いるハイブリダイゼーションプローブ法についての概要を述べる。
リアルタイム検出ＰＣＲ法は定量性が高く、被検ＤＮＡの定量には優れた方法である。リアルタイム検出ＰＣＲ法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ法）では、その原理において蛍光色素であるフルオレイセン（６-ＦＡＭ）の強度を測定する場合が多い。
また、蛍光色素の組合せは周知であり市販もされている。ドナー色素の例として、フルオレイセン、アクセプター蛍光色素の例として、ＬＣ Ｒｅｄ６４０等がある。
【００２５】
各蛍光色素は、増幅産物とハイブリダイズした状態において、各核酸の互いに近接する末端領域に結合されることより、一組のプローブが増幅産物にハイブリダイズした状態では、ドナー色素とアクセプター色素とが近接して存在するので、蛍光共鳴エネルギー転移効果が起き、蛍光を発する。
目的とするＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）に、これらのプローブを入れてＰＣＲを行うと、プライマーのアニーリングと同時にプローブのアニーリングが起き、蛍光を発する。その後、通常のＰＣＲと同様に、ポリメラーゼ反応により新しいＤＮＡが複製され、ハイブリダイゼーションがはずれて消光する。
【００２６】
（実施例１）
図１及び図２に、実施例１としてＤＮＡの設計の一例を示す。本実施例において用いるＤＮＡとしては、タカラバイオ社製のラットの遺伝子断片（塩基鎖長３００ｂｐ）をＩＣＡＮ法により増幅したものを用いた。
【００２７】
一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素で標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ３種類のプローブで構成されるＤＮＡの設計をする。設計されたＤＮＡのプローブに、あらかじめ塩基配列として固有の情報を組み込んで作製し、このＤＮＡの各プローブの塩基配列と、該プローブに組み込んだ情報を関連付けてデータベースに記憶しておく。
【００２８】
＜ＤＮＡ（Ｘ）の設計＞
図１に、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）の設計図の一例を示す。
ＤＮＡ（Ｘ）の構成としては、一対のプライマー間に、ハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素で標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ３種類のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）を配置する。この一対のプライマー間のプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列が、固有情報を含んだ情報部分となる部分である
【００２９】
本実施例では、塩基鎖数は３００ｂｐ、アンプリコンサイズは２８６ｂｐとしているが、塩基配列及び鎖長においての制限は特にない。また、プライマー部分に関しても特に制限はないが、８塩基鎖長以上が適当である。
プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の情報の付与の方法に関しての制限はない。
また、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列はそれぞれ異なっていても、また同じでも良い。さらにまた、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）はＤＮＡ（Ｘ）上にあれば、同一の鎖上でなくともよい。
本実施例では、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列をハイブリダイゼーションプローブ法で同定できた場合のみ、固有情報（Ｘ）を読み取ることができる、という設定条件としている。
【００３０】
（ハイブリダイゼーションプローブの作製）
ハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ´の組）は、片方のプローブをドナー色素、もう片方のプローブを蛍光発光する色素で標識した一組のプローブで構成される。このハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ´の組）は、ＤＮＡ（Ｘ）上のプローブ（Ａ）と相補的な塩基配列を有し、ドナー色素で標識したプローブと蛍光発光する色素で標識したプローブの一組が近接した位置に同時にＤＮＡ（Ｘ）のプローブ（Ａ）とハイブリダイズしたときのみ蛍光を発する。
同様に、ハイブリダイゼーションプローブ（ｂ−ｂ´の組）はプローブ（Ｂ）と、ハイブリダイゼーションプローブ（ｃ−ｃ´の組）はプローブ（Ｃ）と相補的な塩基配列を有していて、一組のプローブが近接した位置に同時にプローブとハイブリダイズしたときのみ蛍光を発する。
【００３１】
本実施例では、ハイブリダイゼーションプローブを次のように設計した。
ハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ´の組）は、塩基鎖長５３ｂｐで２４番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２６番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６４０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６４０nmである。
ハイブリダイゼーションプローブ（ｂ−ｂ´の組）は、塩基鎖長５７ｂｐで２８番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに３０番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ７０５ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は７０５nmである。
ハイブリダイゼーションプローブ（ｃ−ｃ´の組）は、塩基鎖長５４ｂｐで２８番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに３０番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６１０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６１０ｎｍである。
【００３２】
（ダミーＤＮＡ（Ｄ）設計）
図２に、ダミーとなるＤＮＡ（Ｄ）の設計図の一例を示す。
ダミーＤＮＡ（Ｄ）は、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）と同一の塩基配列から成る一対のプライマー間に、プローブ（Ｃ）のみを配置する。プローブ（Ｃ）はポジティブコントロールとして用いるものであり、塩基配列には固有の情報を埋め込む必要はない。ただし、ダミーＤＮＡ（Ｄ）の塩基鎖数、アンプリコンサイズ、塩基組成比率は固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）と同一とする。
【００３３】
ハイブリダイゼーションプローブを構成するドナー色素で標識されるプローブと、蛍光発光する色素で標識したプローブとの間隔は、１〜５塩基以内が望ましく、１〜２塩基が最も望ましい。
ハイブリダイゼーションプローブを構成する、ドナー色素は特にフルオレイセンに限定されるものではなく、また、蛍光発光する色素は、前述の色素の限定されるものではない。
【００３４】
（ＤＮＡの判別）
以上のように固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）を設計することで、同一のプライマーを有する２種類のＤＮＡを判別に用いることが可能となる。
【００３５】
また、ハイブリダイゼーションプローブは、波長の異なる蛍光物質の組合せが可能であるため、本実施例１のように、一対のプライマー間に３種類のプローブを組み込んでもその判別が可能となる。例えば、Ａ、Ｂ及びＣ３種類の蛍光物質をハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合には、ＡＡＢ、ＡＢＢ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＢＢＣ、ＢＣＣ及びＡＢＣの７種類の組合せが考えられるので、それぞれの場合の判別が可能となる。
【００３６】
また、同一の蛍光物質の組合せにおいては、さらに検出のための増幅に関わる時間の短縮が可能となると共に発光強度比による判定も可能となる。
【００３７】
さらに、ＤＮＡの構成として、以下に示した波長の異なる蛍光発光するハイブリダイゼーションプローブを用いる場合には、５０種類の組合せの利用が考えられ、その判別が可能となる。
プローブＡ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５３０標識・・検出波長５３０ｎｍ
プローブＢ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５５５標識・・検出波長５５５ｎｍ
プローブＣ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６１０標識・・検出波長６１０ｎｍ
プローブＤ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６４０標識・・検出波長６４０ｎｍ
プローブＥ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６７０標識・・検出波長６７０ｎｍ
プローブＦ：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ７１０標識・・検出波長７１０ｎｍ
【００３８】
この場合のダミーＤＮＡ（Ｄ）の構成としては、前述と同じように、一対のプライマー間に固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）と同一なプローブを一つのみ配置すればよい。
【００３９】
以上のようにして設計したＤＮＡを用いた使用例としては、複数の固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）とを、一般に公知のインキ製造過程で、インキの一成分として混入してＤＮＡ入りインキを製造することができる。
【００４０】
また、別の使用例として、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）とを水溶性高分子と混合して混合物とし、該混合物を固化して得られた硬化物を含んだＤＮＡ含有物を製造することができる。
【００４１】
以上のように、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列のうち、例えばプローブ（Ａ）とプローブ（Ｂ）又はプローブ（Ａ）とプローブ（Ｃ）が同定できた場合のみ固有情報（Ｘ）を読み取ることができる、というような設定条件とすることで、例えば、前述したＤＮＡ入りインキ又はＤＮＡ含有物に適用すると、何通りもの組合せが考えられる。
【００４２】
（実施例２）
図３、図４及び図５に、実施例２として、実施例１で作製したＤＮＡ入りインキ又はＤＮＡ含有物を用いて印刷物を作製し、作製した印刷物から固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）を抽出し、さらにプローブに組み込まれた塩基配列を解読することで、情報を読み出して真偽判別する方法について説明する。実施例２では、ＤＮＡ入りインキを用いて説明する。
【００４３】
ＤＮＡ入りインキに混入されている、実施例１で設計した固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）とダミーＤＮＡ（Ｄ）、一対のプライマーとプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）、プローブ（Ｃ）のそれぞれの塩基配列情報は、あらかじめ記録部に記録するなどして管理しておく。
【００４４】
（ＤＮＡ入りインキによるオフセット印刷物の作製）
一般に公知のインキ製造方法により、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）を０．００５％、ダミーＤＮＡ（Ｄ）を０．０５％含むＤＮＡ入りオフセットインキを製造する。このＤＮＡ入りオフセットインキを用いて印刷適性印刷機によりオフセット印刷物を作製する。
但し、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）の含有量≪ダミーＤＮＡ（Ｄ）の含有量とする。
【００４５】
（ＤＮＡ入りオフセット印刷物からのＤＮＡの抽出）
ＤＮＡの抽出法としては、ＤＮＡを含む部分を破壊しないで抽出する方法、又はＤＮＡを含む部分を切り抜き、破断して抽出に用いる方法等がある。本実施例においては、ＤＮＡを含む部分を切り抜き、破断して用いる方法を用いるが、非破壊で溶出転写する方法でも同様の結果を得ることができる。
オフセット印刷により得られた印刷物をφ５mmに打ち抜き、バッファ５０μｌを加えて超音波抽出を行ない、抽出液を得た。
【００４６】
本実施例２においては、ロッシュ社製のリアルタイムＰＣＲ装置（ライトサイクラー４００ ＤＸシステム（商品名））を使用した。次に、印刷物からの抽出液、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）、ダミーＤＮＡ（Ｄ）及びネガティブコントロールとしての水を用いて、リアルタイムＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）装置を使用してＤＮＡの検出を行う。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲ装置におけるＰＣＲ中のＤＮＡの蛍光標識方法にはいくつかの方法があり、一つは、２本鎖状態のＤＮＡに特異的に結合するサイバーグリーンという蛍光標識を利用するサイバーグリーン法、他の一つには、ＰＣＲにより合成されたＤＮＡの内部の塩基配列に特異的に結合する蛍光標識を利用するハイブリダイゼーションプローブ法がある。
【００４８】
（ハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ）
図５に、印刷物からの抽出液、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）、ダミーＤＮＡ（Ｄ）及びネガティブコントロールとしての水を用い、ハイブリダイゼーションプローブ法によりＲＴ−ＰＣＲを行った蛍光検出の結果を示す。
【００４９】
固有情報を有するＤＮＡ（Ａ）は、実施例１で設計した通りに、６４０nm、７０５nm、６１０nmのいずれの波長においても蛍光が検出された。
ダミーＤＮＡ（Ｄ）は実施例１で設計した通り、プローブ（Ｃ）の６１０nmの波長においてのみ蛍光が検出できた。
印刷物からの抽出液では、６４０nm、７０５nm、６１０nmのいずれの波長においても蛍光が検出された。また、表１の立ち上がりサイクル数の表より、６１０nmにおける立ち上がりのサイクル数は１１サイクルで、６４０nm、７０５nmにおける立ち上がりのサイクル数１３より早かった。
ネガティブコントロールでは、いずれの波長においても蛍光は検出されなかった。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（比較例１：サイバーグリーン法）
図３に、本実施例の比較例１として、サイバーグリーン法を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った際の、融解曲線を測定した結果を示す。融解曲線から、印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）の塩基組成が同一であることが分かる。従って、融解曲線から印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物を差別化して真偽判別することはできない。
【００５２】
（比較例２：ゲル電気泳動方法）
図４に、本実施例の比較例２として、ゲル電気泳動の結果を示す。印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）の塩基鎖長が同一であることが分かる。したがって、ゲル電気泳動からも印刷物からの抽出物のＰＣＲ産物を差別化して真偽判別することはできない。
【００５３】
したがって、印刷物からの抽出液、固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）及びダミーＤＮＡ（Ｄ）の識別は、ハイブリダイゼーションプローブ法によってのみ真偽判別が可能であった。
【００５４】
（情報の読み出し（表２））
ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光が検出されたプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）の塩基配列から、あらかじめ設定した固有情報（Ｘ）を読み取る。
表２に示すように、プローブ（Ａ）及びプローブ（Ｂ）による蛍光が検出されずにプローブ（Ｃ）の蛍光のみが検出されている場合は、“偽造の可能性”があるものと推定する。
プローブ（Ｃ）の蛍光も検出されない場合は、抽出操作を見直す必要がある。
【００５５】
【表２】
【００５６】
本実施例の方法を用いた一連の作業時間の一例として、以下に示すように約６０分でＤＮＡの抽出及び確認を終了することが可能となった。
ＤＮＡ抽出が１０分、試薬調整が２０分で準備が６０分、ＲＴ−ＰＣＲが３０分（３０サイクル）。
【００５７】
以上詳述した、ＤＮＡの分析による本実施例と比較例による結果の比較をまとめたものを表３に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】
以上の実施例は、塩基配列を同一にしているが、異なる塩基配列情報を有するプローブを組み込んだＤＮＡを使用した場合には、鍵となる蛍光発光させる側のプローブとのマッチングによって真正同士の間における差別化が可能となり、真偽判別のみならず製造履歴等の固有情報を引き出す方法としても利用できる。
【００６０】
以上、本発明に係るＤＮＡ入りインキを用いて印刷物を作製した実施例について説明したが、ＤＮＡ入り含有物を用いた用紙を使用した印刷物も同様の操作で真偽判別を行うことが可能である。また、プローブの塩基配列の設計を替えることにより組合せの数が多くなるので、少ないＤＮＡで多くの固有情報の付与が可能となり、従来のように、一つのＤＮＡは一つの情報部分を有する構成では、偽造を防止するために多くの情報を付与するために、多くのＤＮＡが必要となるという問題があったが、本発明によれば一つのＤＮＡに少なくとも２種類以上の情報を付与することが可能となるので、経済的で作業時間が短縮されるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１における固有情報を有するＤＮＡ（Ｘ）を示す図である。
【図２】実施例１におけるダミーＤＮＡ（Ｄ）を示す図である。
【図３】融解曲線を示す図である。
【図４】ゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対のプライマー間に、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置し、前記プローブの少なくとも１つが固有の塩基配列に基づく情報を付与して設計された第１のＤＮＡと、前記第１のＤＮＡと同一のプライマーで、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する１つ以上のプローブで情報を付与しないで設計された第２のＤＮＡとを含んで成ることを特徴とするＤＮＡ混合体。
【請求項２】
前記第１のＤＮＡと第２のＤＮＡから成る一組のＤＮＡにおいて、一対のプライマー間のアンプリコンサイズと塩基組成比率とプローブの塩基鎖長とが同じであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ混合体。
【請求項３】
前記ＤＮＡがハイブリタイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されている請求項１又は２に記載のＤＮＡ混合体。
【請求項４】
前記第１のＤＮＡと前記第２のＤＮＡの混合比率が１／１から１／１０００の範囲である、請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ混合体。
【請求項５】
請求項１から４に記載のＤＮＡ混合体を添加物として含有する、組成物。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ混合体と、染料又は／及び顔料と、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡインキ。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ混合体と、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡ塗工液。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ混合体と水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成るＤＮＡ含有物。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡと高分子とを含む混合物を、紡糸又は含浸して得られたＤＮＡ繊維。
【請求項１０】
請求項６に記載のＤＮＡインキを用いて基材に印刷した印刷物。
【請求項１１】
請求項７に記載のＤＮＡ塗工液を塗工してなる塗工紙。
【請求項１２】
請求項８に記載のＤＮＡ含有物を含む用紙。
【請求項１３】
請求項９に記載のＤＮＡ繊維を含む混抄紙。
【請求項１４】
請求項１０から請求項１３のいずれかに記載の印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙の真偽判別方法であって、印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡを含む部分からＤＮＡを抽出する工程と、
前記抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブ法を用いて蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光によって、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光の有無を検出する工程とを備えることを特徴とする真偽判別方法。
【請求項１５】
請求項１４において、蛍光発光の立ち上がりサイクル数及び波長ごとの蛍光強度比を検出し、抽出したＤＮＡに目的とするプローブが含まれているかを、あらかじめ記録部に記録してある発光波長及び発光強度と比較することから成る真偽判別方法。
【請求項１】
一対のプライマー間に、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置し、前記プローブの少なくとも１つが固有の塩基配列に基づく情報を付与して設計された第１のＤＮＡと、前記第１のＤＮＡと同一のプライマーで、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する１つ以上のプローブで情報を付与しないで設計された第２のＤＮＡとを含んで成ることを特徴とするＤＮＡ混合体。
【請求項２】
前記第１のＤＮＡと第２のＤＮＡから成る一組のＤＮＡにおいて、一対のプライマー間のアンプリコンサイズと塩基組成比率とプローブの塩基鎖長とが同じであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ混合体。
【請求項３】
前記ＤＮＡがハイブリタイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されている請求項１又は２に記載のＤＮＡ混合体。
【請求項４】
前記第１のＤＮＡと前記第２のＤＮＡの混合比率が１／１から１／１０００の範囲である、請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ混合体。
【請求項５】
請求項１から４に記載のＤＮＡ混合体を添加物として含有する、組成物。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ混合体と、染料又は／及び顔料と、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡインキ。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ混合体と、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡ塗工液。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ混合体と水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成るＤＮＡ含有物。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡと高分子とを含む混合物を、紡糸又は含浸して得られたＤＮＡ繊維。
【請求項１０】
請求項６に記載のＤＮＡインキを用いて基材に印刷した印刷物。
【請求項１１】
請求項７に記載のＤＮＡ塗工液を塗工してなる塗工紙。
【請求項１２】
請求項８に記載のＤＮＡ含有物を含む用紙。
【請求項１３】
請求項９に記載のＤＮＡ繊維を含む混抄紙。
【請求項１４】
請求項１０から請求項１３のいずれかに記載の印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙の真偽判別方法であって、印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡを含む部分からＤＮＡを抽出する工程と、
前記抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブ法を用いて蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光によって、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光の有無を検出する工程とを備えることを特徴とする真偽判別方法。
【請求項１５】
請求項１４において、蛍光発光の立ち上がりサイクル数及び波長ごとの蛍光強度比を検出し、抽出したＤＮＡに目的とするプローブが含まれているかを、あらかじめ記録部に記録してある発光波長及び発光強度と比較することから成る真偽判別方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１８７９９２（Ｐ２００８−１８７９９２Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８９５３（Ｐ２００７−２８９５３）
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（３０３０１７６７９）独立行政法人 国立印刷局 (471)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（３０３０１７６７９）独立行政法人 国立印刷局 (471)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]