ＤＮＡ点変異の検出方法（ＳＮＰ分析法）および装置
ＳＮＰ分析においては、ＤＮＡハイブリダイゼーションが利用され、ＤＮＡチップが使用される。詳細には、定められた時間的経過において、分析すべき液体ＤＮＡプローブがＤＮＡチップ上に導かれる。低い厳格条件のもとでハイブリダイゼーションが行なわれた後に、捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドが融解されるように温度が定められた変化をさせられ、捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドの融解は温度に依存して検出され評価される。公知のＤＮＡチップ（１）のほかに、少なくとも１つの温度制御もしくは温度調節装置（１０）と、ＤＮＡチップ（１）の表面（２）の横方向の流れ装置（２０，３０）とが存在する。適切な測定手段により、互いに適合する（マッチ）ハイブリッドおよび互いに適合しない（ミスマッチ／１点ミスマッチ）ハイブリッドのための要因を検出および評価することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出すべき標的ＤＮＡがＤＮＡチップ上に位置固有に固定された捕捉体ＤＮＡに結合すること（ハイブリダイゼーション）を利用するＤＮＡ点変異の検出方法（ＳＮＰ分析法）に関する。
【０００２】
ハイブリダイゼーション技術によるＤＮＡ分析は公知の方法である（「Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９９」発行、Ｇ．ＧａｓｓｅｎおよびＧ．Ｓｃｈｒｉｍｐｆによる「“Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ”（遺伝子工学方法）」の第２４３〜２６１頁における第１１章「“Ｂｌｏｔｔｉｎｇｖｅｒｆａｈｒｅｎ ｕｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇｅｎ”（ブロット法およびハイブリダイゼーション）」参照）。固体の担体物質上にＤＮＡプローブ分子、いわゆる捕捉体オリゴヌクレオチドが固定される。ＤＮＡプローブ分子は、相補的なプローブＤＮＡとの固有の親和性に基づいて、それらがいわゆるハイブリッドつまり捕捉体分子と標的分子との対を形成することによって相補的なプローブＤＮＡを「捕捉」する。この結合事象は一般に光学的または酵素性リポータ分子によって表示される。
【０００３】
このようなＤＮＡ分析の応用例は例えば結核やＨＩＶのような感染病原体の検出である。いわゆる「Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（一塩基多型）」、略してＳＮＰにおいては、ＤＮＡ分析化学に対して特別な要求が出される。この場合、約２０個の異なるヌクレオチドからなる１つの捕捉体分子が、１つのヌクレオチドのみが相違する標的分子に選択的に結合するかもしくは結合しないことが必要である。結合エネルギー差が非常に小さいので、ＤＮＡセンサの選択性への要求が非常に高い。
【０００４】
ＤＮＡセンサは従来技術から知られており、このために、本出願人による例えば公開されていない独国特許出願第１０２５９８２０号明細書および独国特許出願第１０２５９８２１号明細書を参照されたい。捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドの形成は特殊な境界条件のもとに行なわれ、相互に適合する捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対は誤塩基対合を有するものよりも高い結合エネルギーを持つ。ＳＮＰにおける僅かな結合エネルギー差により、「パーフェクトマッチ（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）」と「シングルポイントミスマッチ（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｍｉｓｍａｔｃｈ）」とはしばしば明確に区別されない。
【０００５】
最後の問題は、これまで、従来技術の分析方法においていわゆる「厳格な洗浄ステップ」が導入されることによって、つまり洗浄液のイオン濃度が、当初は特殊でない結合をしている「一塩基ミスマッチ」の標的分子が捕捉体から分離されるが、しかし「パーフェクトマッチ」の標的分子は捕捉体分子に結合されたままに保たれるように選択されることによって解決された。同様に、さらに高価な光学的融点分析も可能である。この方法の場合には、ＤＮＡ二重鎖の融解時における光吸収の固有変化が利用され、光学的なラベルは必要としない。厳格な洗浄法の場合にも光学的融点分析法の場合にも、さらに比較的多量のＤＮＡが必要であり、かつ液相における検出のための分光測定器が不可欠であり、しかも条件が大抵は唯一のＳＮＰにしか設定できない。センサ上に複数のＳＮＰが存在する場合に、全ての誤対合の分離はできない。
【０００６】
融解曲線の光学的検出の場合にしばしば、連続測定もしくは反復測定に対して、光学的信号（ＤＮＡ固有活性もしくはラベル）の必要な安定性が得られない。同じことが非可逆の検出方法に対しても当てはまる。特に、チップは厳格な洗浄後には光学的な読み取りを行う前に乾燥されなければならない。
【０００７】
更に、「ＩＥＥＥ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９６」の第１００〜１０４頁、Ｍ．Ｈｅｌｌｅｒによる「“Ａｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ”（多重化ＤＮＡ分析のための活性マイクロエレクトロニクス装置）」には、電極を備えたチップ上でハイブリダイゼーションが行なわれるいわゆる「電気的厳格処理」が記載されている。シングルポイントミスマッチハイブリッドがＤＮＡのポリ陰イオン特性に基づいて電極の負の分極によって分離される。しかしながら、この方法はしっかりした一般的に広まった方法として定着できなかった。更に、この方法の場合に、電位や、場合によってはパルス幅や強さのような個々の電気的条件を設定できるようにするためには、その都度のＳＮＰエネルギー差の正確な知識が必要である。エネルギーの豊富なパルスの使用によってＤＮＡが傷つけられることがある。
【０００８】
従って、本発明の課題は、簡単かつしっかりし、そして傷つけることのないかつ可逆である方法であって、動作経過中に理想的には既知でない種々の融解温度を有する複数のＳＮＰも確実に検出することができる方法を提案し、しかもその方法を実施するための装置を提供することにある。
【０００９】
この課題は、本発明によれば、請求項１による方法ステップの連続によって解決される。好ましい実施態様は従属請求項に記載されている。
【００１０】
本発明による方法を実施するための装置は請求項２８の対象である。この装置の実施態様は該当の従属請求項に記載されている。
【００１１】
特別な実施態様において、本発明による方法は、酵素ラベルもしくは酵素による増幅と組み合わせた電気化学的検出法、特に酸化還元サイクル法を有効に利用する。この場合に使用される酵素は熱的安定性を有すると好ましい。ＤＮＡ捕捉体分子は、固定の担体物質、好ましくはシリコンチップまたは電極を備えた絶縁体の上に存在する。
【００１２】
本発明による装置においては、チップのハイブリダイゼーション位置における液体の少なくとも１つの温度制御もしくは温度調節装置と、液体の流速調節装置と、付属の検出手段とが存在する。詳細にはこのためにセンサチップが精密ポンプを含むマイクロ流体システムに接続されている。
【００１３】
以下における図面に基づく実施例の説明から本発明の他の詳細および利点を明らかにする。
図１ａ、図１ｂおよび図１ｃは、時間に依存する予め与えられた温度プロフィール（温度推移）の３つの例、１つの液体流れプロフィール（流れ推移）ならびに個々のハイブリダイゼーションのセンサ信号を用いて本発明における方法の進行を示す。
図２および図３は、図１ｃによるセンサ信号（電流曲線）から導き出され、温度関数としての電流の初期勾配もしくは４０℃信号で正規化された電流増大を有する評価もしくは融解曲線を示す。
図４はこの方法を実施するための装置を概略的に示す。
図５および図６は、図４による装置における２つの挙動状態の拡大表示を示す。
図７および図８は説明されたＳＮＰ法における光学的検出の実施例を示す。
図９および図１０は本方法の電気化学的酵素による変形例を示す。
【００１４】
検出すべき標的ＤＮＡがＤＮＡチップ上に位置固有に固定された捕捉体ＤＮＡに結合すること、すなわちハイブリダイゼーションを利用するＤＮＡ点変異の検出方法（ＳＮＰ分析法）を実施するものとする。
【００１５】
ＳＮＰ分析を有利に実現するために特に次のとおり進行される。少なくとも１つのハイブリダイゼーション位置と、例えばマイクロ貴金属電極の形での好ましくは電気化学的トランスデューサとを有するトランスデューサチップ、例えばシリコンチップまたはその他の好ましくは平面状のアレイが、少なくとも一種のＤＮＡ捕捉体プローブを載せられる。トランスデューサは例えば１８０μｍの直径および２００×２００μｍの２次元の網目サイズを有する。トランスデューサアレイは１０〜１００個の多数の位置を有する。ＳＮＰ分析を実現するために捕捉体プローブのシーケンスはその都度ＳＮＰの４つずつの可能なヌクレオチド変異がスポットされるように選択される。理想的対合（マッチ）および誤対合（ミスマッチ）の融解条件の正確な知識において、唯一の種類の捕捉体プローブが作動する。その際に融解曲線の位置からマッチまたはミスマッチが推定される。全部で３つの可能な分析状態（１：マッチのみ、２：ミスマッチのみ、３：マッチとミスマッチとの組み合わせ）を確実に検出できるようにするために、最も簡単な場合に、マッチ捕捉体プローブもしくはミスマッチ捕捉体プローブを有する２つの測定位置が必要である。
【００１６】
新しい測定法の実際の変換のために、トランデューサアレイまたはセンサアレイを形成するチップのハイブリダイゼーション位置上に薄い液体膜を可能にする流路セルの中にチップが組み入れられる。検体ＤＮＡプローブ、特にビオチン化されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションは、全てのマッチハイブリッドが生じ得るがしかしミスマッチハイブリッドも生じ得るような温度で行なわれる。引続いて、ビオチン化された標的ＤＮＡを介してストレプトアビジン−酵素対が結合される。
【００１７】
今や、その酵素に対して固有の基質を有する溶液がポンプによりセンサチップ上に送り出される。ポンプは例えば５〜１０秒の間特に一定の温度で停止され、電流増大の初期勾配が測定される。電流増大は、ラベル酵素（例えば熱安定エステラーゼ）が酵素基質（その酵素に対応する例えばｐ−アミノフェニルアセテート）を変換し、それにより生じる反応生成物（相応のｐ−アミノフェノール）がトランスデューサ電極において電気化学的に変換され、それによって反応生成物に比例した電流が発生されるという事実から生じる。電流の増大は、酵素が結合位置に連続的に反応生成物を補給し、それにより生成物濃度の上昇が起こり、このことが電流を増大させるという事実から生じる。
【００１８】
強調すべきことは、検出すべき反応生成物（例えばｐ−アミノフェノール）が、結合されたラベル酵素において解放されて自由に拡散し得るか、もしくは酵素基質液体の流れにより洗い流され得ることである。とりわけ電極における電気化学的変換または光学的検出（例えば適切な光学的に活性な反応生成物の吸収測定）による検出は、酵素基質溶液の流速が検出のために明白に低減されるか、または好ましくは零に設定されるときにのみ行なわれるとよい。
【００１９】
引続いて液体ポンプが再び運転され（数μｌ／ｍｉｎ）、同時に温度が定められた数℃、例えば２℃だけ高められる。この措置によって、一方では増加した反応生成物が検出位置から遠ざけられ、他方では温度上昇およびそれにともなう融解によってミスマッチ標的ＤＮＡ−捕捉体ＤＮＡハイブリッドが溶かされ、ハイブリダイゼーション位置つまり検出位置から運び去られる。それによって、一方では先に増大した電気化学的信号が再び下げ戻され（必ずしも零には戻されないが明白に低減させられ）、他方では誤って対にされた標的ＤＮＡと捕捉体ＤＮＡとの再ハイブリダイゼーションが濃度低減により防止される。前もって下げ戻されたセンサ信号は更なる測定を可能にする。このために数秒後、例えば２０秒後にポンプが再び例えば５〜１０秒間停止され、電流増大が新たに記録される。
【００２０】
上述の過程は、全てのＤＮＡ標的分子がそれらの融解点に従って相次いで捕捉体プローブから分離されるまで繰り返される。それにより得られた融解曲線、すなわち温度の関数としての全てのトランスデューサ位置の電流増大が評価される。これは、特にコンピュータ制御により予め与えられたソフトウェアプログラムに従って行なわれる。
【００２１】
方法全体は約１０分後に終了し、従って従来技術に比べて特に高速の方法であり、この方法は酵素による増幅の使用により高い感度を有し、従って高い信頼性を有する。
【００２２】
上述の融解曲線を取得するための典型的な温度範囲は約４０℃〜７０℃である。酵素、特に文献により公知のラベル酵素は一般に約４０℃までしか安定でなく、すなわちこの温度以上では変性し、それにより測定に必要な触媒作用を失うので、本発明によれば特に、例えば熱安定エステラーゼのような熱安定酵素が使用される。
【００２３】
図１に基づいて上述の測定方法論を明確に説明する。部分図１ａ，１ｂ，１ｃにはそれぞれ横座標に時間が等しい目盛でとられ、縦座標として図１ａでは５０°と６０°との間の温度がとられ、図１ｂでは流れが目盛のない単位でとられ、そして図１ｃではセンサ信号（酸化還元サイクル電流）がとられている。温度が予め与え得るステップで、もしくは直線状に高められ、これに関連して（同期して）流れが変化される。好ましくは、その都度一定の温度に調整後に流れが変化され、特に零に調整される。捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドの融解温度が到達されているかぎり、標的ＤＮＡが酵素標識を含めて統計学的分布の原則のもとに捕捉体ＤＮＡから溶かされ、液体の流れによってそれぞれのトランスデューサ位置から遠ざけられ、廃棄容器内へ洗い流される。融解温度がまだ到達されていない標的ＤＮＡ−捕捉体ＤＮＡハイブリッドは、それらのハイブリダイゼーション位置にそのまま維持される。洗浄液中には、まだ結合している酵素ラベルによって生成物に変換される酵素固有の基質が存在する。変化された（特に零にセットされた）流れにより、その生成物がハイブリダイゼーション位置に集積し、センサ電極へ拡散させられて、電気化学的に検出される。それにより、図１ｃにおいて電流測定値の著しい増大が生じ、この電流増大がその都度、捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対の健全なハイブリダイゼーションを特徴づける。特に、電流増大の初期勾配が評価に利用される。温度が高まり、流れが出発値に戻されると、新たな液体がハイブリダイゼーション位置に達し、同じ測定個所の他の分子もしくは他の測定個所の最初の分子がより高い融解温度で融解されて洗い流される。
【００２４】
曲線２１に対応したランプ状ステップでの温度上昇の代わりに、場合によっては、温度上昇は、曲線２１’もしくは２１”に対応して連続的にまたは予め与え得るプロフィール（推移）に従って行なわれてもよい。流れは必ずしも停止させる必要がなく、変化させることだけが重要である。それぞれ互いに合わせられたプロフィール曲線２１，２２が可変量として与えられる。その都度の定常状態もしくは準定常状態の調整が重要である。図１ｃには、例えば電流値として測定されるセンサ信号が２３で示され、センサ信号の固有の勾配値が２４で示されている。図２は、位置固有のトランスデューサにおいて図１ｃに従って測定された因子Ｖ−ＰＣＲ生成物についての多数のマッチ−ハイブリダイゼーション位置の融解曲線３１と、多数の一塩基ミスマッチ−ハイブリダイゼーション位置の融解曲線３２とを示し、電流増大率ｄＩ／ｄｔがｎＡ／ｍｉｎの単位で温度の関数として描出されている。
【００２５】
図３は、図２から正規化された測定値、すなわち、
電流増大率（Ｔ）／電流増大率（Ｔ＝４０℃）
を曲線３１’，３２’として示し、個々の曲線が対比可能である。因子Ｖ−ＰＣＲ生成物における因子Ｖは血液凝固にとって重要である遺伝子である。
【００２６】
詳しくは、図２および図３において、図１ｃのトランスデューサ位置つまり測定位置の例におけるような電流測定値の初期勾配（ｄＩ／ｄｔ）が、その都度調整された温度値に依存して描出されている。個々の捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対について、重要な、特にＳ字状の滴定曲線に似た曲線経過３１，３２が生じる。この場合に重要なことは、互いに適合している（マッチ）捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対が、互いに適合していない（ミスマッチ）捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対とは大きく異なる信号経過もしくは横座標に沿って異なる曲線位置も有することである。特に、互いに適合している捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡにおける融解過程およびそれに結び付いた融解曲線の降下は、互いに適合していない捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡにおける温度よりも高い温度で生じる。
【００２７】
図４には具体的に使用された測定構成を有する一般的な装置が示されている。この装置は多数のハイブリダイゼーション位置５，５’，…，５n’を有する１つのチップからなる。図４には、従来技術から知られているいわゆるＤＮＡチップが１で示されている。このようなＤＮＡチップ１はその表面２に例えばアレイの形の多数の測定位置５，５’，…，５n’を有する。各測定位置５，５’，…，５n’には捕捉体ＤＮＡ分子が固定されて配置されている。例えば固定点６に捕捉体ＤＮＡ１００が配置されている。捕捉体ＤＮＡ１００には標的ＤＮＡ２００が付加され得る。標的ＤＮＡ２００はラベルを備えることができる。ラベルは生物触媒作用による標識としての酵素であってよい。この場合に酵素標識は熱安定酵素を含むと好ましい。
【００２８】
捕捉体ＤＮＡ１００の固定のための個々の測定位置は、以下の全ての図において、５，５’，…，５n’で示されている。シリコンまたはその他の半導体材料から形成されているチップ１内には、とりわけ、ひとまとめに３で符号を付されている増幅および測定装置が組み込まれている。しかし、チップ１は集積化信号処理部を有していない金属電極を備えた絶縁材料から成っていてもよい。
【００２９】
測定チップ１には温度調整もしくは温度調節装置１０が付設されている。このためには例えばペルチエ素子などが考慮の対象となる。温度測定はチップおよび／または場合によっては温度調節装置において行なわれる。
【００３０】
チップ１の測定側としての表面２は流路２０に向けられている。この流路を通して、標的ＤＮＡ２００および場合によっては標識酵素のような分析過程のために必要な全ての基質が、もしくはリザーバ４０から場合によっては酵素固有の基質Ｓを有する洗浄液が予め与え得る流れで導かれる。予め与えられた時間間隔の間その都度正確な流れを維持しかつ定められた流れ停止を保証する流れ調節要素３０が存在し、更にもはや必要でない基質のための収容もしくは廃棄容器５０が存在する。
【００３１】
図４に基づいて説明した装置により、特に酵素基質Ｓを備えた洗浄液を精密な温度制御のもとでチップ上に薄い液体膜として導くことができる。この場合に予め与え得る流れ制御および正確な測定ならびに評価が可能である。
【００３２】
図５および図６には２つの挙動状態が共通の形で示され、チップ１には付属の温度調節装置１０および流路２０が付設されている。拡大表示で、個々の多型および付属の点変異を有する捕捉体ＤＮＡ１００および標的ＤＮＡ２００が示されている。特に、例えば５０℃の温度においては、全ての捕捉体ＤＮＡ１００が標的ＤＮＡ２００を結合させていることが明らかであり、特にいわゆるマッチ結合Ａ−Ｔ，Ｇ−Ｃが存在し、しかしミスマッチ結合Ｇ//Ａ，Ｃ//ＡおよびＡ//Ａも存在する。マッチ結合はミスマッチ結合より強いことが明白である。
【００３３】
特に図６には例えば６０℃の温度調節を有する状態が示され、この温度においてはミスマッチ結合が融解されるので、引続いてミスマッチ標的ＤＮＡが洗い流される。洗い流された標的ＤＮＡ分子は廃棄容器５０まで運ばれる。しかし、どの測定位置からももはや検出することができないように、洗い流された標的ＤＮＡ分子を測定位置から僅かな距離だけ遠ざけるだけで十分である。
【００３４】
ミスマッチ結合の融解は位置固有に温度に依存して検出され評価される。このために、一方では図７および図８に、そして他方では図９および図１０に２つの選択可能な測定が示されている。
【００３５】
図７および図８は、図４ならびに図５および図６を出発点とし、標的ＤＮＡ２００が蛍光ラベルＦを備えている。このような蛍光標識された標的ＤＮＡ２００の場合には光学的な読み出しが可能である。光信号７５が、図７および図８には詳細に示されていない分光計により、位置正しく検出されて評価される。
【００３６】
図７および図８の比較から、融解温度を上回った際に、例えば６０℃の温度においてミスマッチ結合が融解され、これに関する標的ＤＮＡ２００が蛍光ラベルＦを含めて洗い流されていることが明らかである。そのかぎりでは、ミスマッチ位置では低減した信号が生じる。
【００３７】
有利な酵素による測定および電気化学的測定において、酵素による触媒反応が次の式が当てはまる生成物Ｐの形成のために利用される。
【数１】
ただし、Ｓは酵素基質、Ｅは酵素ラベル、Ｐは反応生成物を意味する。
【００３８】
図９において標的ＤＮＡ分子２００は酵素ラベルＥを備え、矢印によって酵素による触媒反応および電気的測定位置への反応生成物Ｐの拡散が示されている。チップ１の測定位置５，５’，…，５n’には電気化学的信号検出器つまりトランスデューサ９５，９５’が存在し、チップ１のシリコン内の既述の信号処理部３と関連して直接に、反応生成物Ｐの濃度の尺度である例えば電流の如き電気信号を検出することができる。
【００３９】
更に、図７および図８と同様に、図９および図１０に、５０℃の温度および６０℃の温度における２つの状態が示されている。従って、第１の状態ではＳからＰへの変換によって全ての測定位置において大きな電気信号が生じ、第２の状態ではミスマッチ位置においては低減した信号が生じるかもしくは全く信号が生じないが、しかしマッチ位置においては比較的大きな電気化学信号が生じる。洗い流された標的ＤＮＡ分子ならびに洗い流された反応生成物Ｐはここでも廃棄容器５０へ運ばれる。しかし、洗い流される標的ＤＮＡ分子および反応生成物は、存在する測定位置ではもはや検出することができないように測定位置から僅かな距離だけ遠ざけられるだけでも十分である。
【００４０】
酵素による測定方法および電気化学的測定方法の特別な利点は、電流増大率ｄＩ／ｄｔが評価に利用され、絶対電流信号自体が利用されるのではないので、例えば光学的方法に比べて大幅に背景信号に依存しないという事実にある。それによって、酵素標識された標的ＤＮＡならびにそれによって発生された反応生成物Ｐを廃棄容器まで運ぶ必要はない。反応生成物Ｐの測定位置固有の集積が短時間の洗浄によって取除かれさえすればよい。それによって、後続の洗浄過程ではポンプが洗浄液を吸引したり吐出したりすることでも十分であり、それにより洗浄液の節約が可能になり、これは特に集積化され小型化された実施形態の場合に有利である。
【００４１】
電流信号は図１ｃにおけるピークに対応し、図２および図３においてそれらの初期勾配ｄＩ／ｄｔは図１ｃの直線２４，２４’，２４”，…に対応する。
【００４２】
検出が光学的ラベルまたは酵素ラベルを介して行なわれる両例のほかに、結合された標的ＤＮＡ２００のラベルなしの検出も可能である。ラベルなしの光学的検出の場合、ＤＮＡ二重鎖の融解時におけるＵＶ吸収の固有変化が検出される。これに対して、ラベルなしの電気的検出の場合、固有のグアニン酸化のプロセスが利用される。ラベルなしの他の検出は電気化学的インピーダンス法により行なわれる。更に、質量変化の測定によるラベルなしの検出、すなわち例えば表面波センサ（いわゆるＳＡＷ）の如き音響法を介する重量測定による検出も可能である。
【００４３】
ラベル法において、磁場センサと組み合わせた磁気的ラベルの使用も可能である。
【００４４】
以上に説明した方法において重要なことは、測定および付属の評価が自動化可能であることである。この自動化に関連してその都度の流れプロフィール（流れ推移）が生じる。このプロフィールにおいては、一方ではまず予め与えられた温度調整時に、融解されたミスマッチ結合が洗い流され、他方では位置固有に結合された標的ＤＮＡの検出が「移動を停止された」洗浄液において行なわれる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】時間に依存する予め与えられた温度プロフィールの３つの例（ａ）、液体流れプロフィール（ｂ）および個々のハイブリダイゼーションのセンサ信号（ｃ）による本発明における方法の進行を示す説明図
【図２】図１ｃによるセンサ信号（電流曲線）から導き出され、温度関数としての電流の初期勾配を有する評価もしくは融解曲線を示す特性曲線図
【図３】図１ｃによるセンサ信号（電流曲線）から導き出され、温度関数としての４０℃信号で正規化された電流増大を有する評価もしくは融解曲線を示す特性曲線図
【図４】この方法を実施するための装置の概略図
【図５】図４による装置における２つの挙動状態の一方の状態を示す拡大図
【図６】図４による装置における２つの挙動状態の他方の状態を示す拡大図
【図７】ＳＮＰ法での光学的検出の実施例を一方の状態で示す概略図
【図８】ＳＮＰ法での光学的検出の実施例を他方の状態で示す概略図
【図９】電気化学的酵素による方法の実施例を一方の状態で示す概略図
【図１０】電気化学的酵素による方法の実施例を他方の状態で示す概略図
【符号の説明】
【００４６】
１ ＤＮＡチップ
２ 表面
３ 増幅および測定装置
５，５’，…，５n’ 測定位置
６，６’，…，６n’ 固定点
１０ 温度調整もしくは温度調節装置
２０ 流路
２１，２１’，２２” 温度プロフィール曲線
２２ 流れプロフィール曲線
２３ センサ信号プロフィール曲線
２４，２４’，２４”，… 初期勾配
３０ 流れ調節要素
３１ 曲線経過
３２ 曲線経過
３１’ 曲線経過
３２’ 曲線経過
４０ 洗浄液リザーバ
５０ 廃棄容器
７５ 光信号
９５，９５’ トランスデューサ
１００ 捕捉体ＤＮＡ
２００ 標的ＤＮＡ
Ｅ 酵素ラベル
Ｆ 蛍光ラベル
Ｐ 反応生成物
Ｓ 酵素基質
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出すべき標的ＤＮＡがＤＮＡチップ上に位置固有に固定された捕捉体ＤＮＡに結合すること（ハイブリダイゼーション）を利用するＤＮＡ点変異の検出方法（ＳＮＰ分析法）に関する。
【０００２】
ハイブリダイゼーション技術によるＤＮＡ分析は公知の方法である（「Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９９」発行、Ｇ．ＧａｓｓｅｎおよびＧ．Ｓｃｈｒｉｍｐｆによる「“Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ”（遺伝子工学方法）」の第２４３〜２６１頁における第１１章「“Ｂｌｏｔｔｉｎｇｖｅｒｆａｈｒｅｎ ｕｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇｅｎ”（ブロット法およびハイブリダイゼーション）」参照）。固体の担体物質上にＤＮＡプローブ分子、いわゆる捕捉体オリゴヌクレオチドが固定される。ＤＮＡプローブ分子は、相補的なプローブＤＮＡとの固有の親和性に基づいて、それらがいわゆるハイブリッドつまり捕捉体分子と標的分子との対を形成することによって相補的なプローブＤＮＡを「捕捉」する。この結合事象は一般に光学的または酵素性リポータ分子によって表示される。
【０００３】
このようなＤＮＡ分析の応用例は例えば結核やＨＩＶのような感染病原体の検出である。いわゆる「Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（一塩基多型）」、略してＳＮＰにおいては、ＤＮＡ分析化学に対して特別な要求が出される。この場合、約２０個の異なるヌクレオチドからなる１つの捕捉体分子が、１つのヌクレオチドのみが相違する標的分子に選択的に結合するかもしくは結合しないことが必要である。結合エネルギー差が非常に小さいので、ＤＮＡセンサの選択性への要求が非常に高い。
【０００４】
ＤＮＡセンサは従来技術から知られており、このために、本出願人による例えば公開されていない独国特許出願第１０２５９８２０号明細書および独国特許出願第１０２５９８２１号明細書を参照されたい。捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドの形成は特殊な境界条件のもとに行なわれ、相互に適合する捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対は誤塩基対合を有するものよりも高い結合エネルギーを持つ。ＳＮＰにおける僅かな結合エネルギー差により、「パーフェクトマッチ（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）」と「シングルポイントミスマッチ（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｍｉｓｍａｔｃｈ）」とはしばしば明確に区別されない。
【０００５】
最後の問題は、これまで、従来技術の分析方法においていわゆる「厳格な洗浄ステップ」が導入されることによって、つまり洗浄液のイオン濃度が、当初は特殊でない結合をしている「一塩基ミスマッチ」の標的分子が捕捉体から分離されるが、しかし「パーフェクトマッチ」の標的分子は捕捉体分子に結合されたままに保たれるように選択されることによって解決された。同様に、さらに高価な光学的融点分析も可能である。この方法の場合には、ＤＮＡ二重鎖の融解時における光吸収の固有変化が利用され、光学的なラベルは必要としない。厳格な洗浄法の場合にも光学的融点分析法の場合にも、さらに比較的多量のＤＮＡが必要であり、かつ液相における検出のための分光測定器が不可欠であり、しかも条件が大抵は唯一のＳＮＰにしか設定できない。センサ上に複数のＳＮＰが存在する場合に、全ての誤対合の分離はできない。
【０００６】
融解曲線の光学的検出の場合にしばしば、連続測定もしくは反復測定に対して、光学的信号（ＤＮＡ固有活性もしくはラベル）の必要な安定性が得られない。同じことが非可逆の検出方法に対しても当てはまる。特に、チップは厳格な洗浄後には光学的な読み取りを行う前に乾燥されなければならない。
【０００７】
更に、「ＩＥＥＥ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９６」の第１００〜１０４頁、Ｍ．Ｈｅｌｌｅｒによる「“Ａｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ”（多重化ＤＮＡ分析のための活性マイクロエレクトロニクス装置）」には、電極を備えたチップ上でハイブリダイゼーションが行なわれるいわゆる「電気的厳格処理」が記載されている。シングルポイントミスマッチハイブリッドがＤＮＡのポリ陰イオン特性に基づいて電極の負の分極によって分離される。しかしながら、この方法はしっかりした一般的に広まった方法として定着できなかった。更に、この方法の場合に、電位や、場合によってはパルス幅や強さのような個々の電気的条件を設定できるようにするためには、その都度のＳＮＰエネルギー差の正確な知識が必要である。エネルギーの豊富なパルスの使用によってＤＮＡが傷つけられることがある。
【０００８】
従って、本発明の課題は、簡単かつしっかりし、そして傷つけることのないかつ可逆である方法であって、動作経過中に理想的には既知でない種々の融解温度を有する複数のＳＮＰも確実に検出することができる方法を提案し、しかもその方法を実施するための装置を提供することにある。
【０００９】
この課題は、本発明によれば、請求項１による方法ステップの連続によって解決される。好ましい実施態様は従属請求項に記載されている。
【００１０】
本発明による方法を実施するための装置は請求項２８の対象である。この装置の実施態様は該当の従属請求項に記載されている。
【００１１】
特別な実施態様において、本発明による方法は、酵素ラベルもしくは酵素による増幅と組み合わせた電気化学的検出法、特に酸化還元サイクル法を有効に利用する。この場合に使用される酵素は熱的安定性を有すると好ましい。ＤＮＡ捕捉体分子は、固定の担体物質、好ましくはシリコンチップまたは電極を備えた絶縁体の上に存在する。
【００１２】
本発明による装置においては、チップのハイブリダイゼーション位置における液体の少なくとも１つの温度制御もしくは温度調節装置と、液体の流速調節装置と、付属の検出手段とが存在する。詳細にはこのためにセンサチップが精密ポンプを含むマイクロ流体システムに接続されている。
【００１３】
以下における図面に基づく実施例の説明から本発明の他の詳細および利点を明らかにする。
図１ａ、図１ｂおよび図１ｃは、時間に依存する予め与えられた温度プロフィール（温度推移）の３つの例、１つの液体流れプロフィール（流れ推移）ならびに個々のハイブリダイゼーションのセンサ信号を用いて本発明における方法の進行を示す。
図２および図３は、図１ｃによるセンサ信号（電流曲線）から導き出され、温度関数としての電流の初期勾配もしくは４０℃信号で正規化された電流増大を有する評価もしくは融解曲線を示す。
図４はこの方法を実施するための装置を概略的に示す。
図５および図６は、図４による装置における２つの挙動状態の拡大表示を示す。
図７および図８は説明されたＳＮＰ法における光学的検出の実施例を示す。
図９および図１０は本方法の電気化学的酵素による変形例を示す。
【００１４】
検出すべき標的ＤＮＡがＤＮＡチップ上に位置固有に固定された捕捉体ＤＮＡに結合すること、すなわちハイブリダイゼーションを利用するＤＮＡ点変異の検出方法（ＳＮＰ分析法）を実施するものとする。
【００１５】
ＳＮＰ分析を有利に実現するために特に次のとおり進行される。少なくとも１つのハイブリダイゼーション位置と、例えばマイクロ貴金属電極の形での好ましくは電気化学的トランスデューサとを有するトランスデューサチップ、例えばシリコンチップまたはその他の好ましくは平面状のアレイが、少なくとも一種のＤＮＡ捕捉体プローブを載せられる。トランスデューサは例えば１８０μｍの直径および２００×２００μｍの２次元の網目サイズを有する。トランスデューサアレイは１０〜１００個の多数の位置を有する。ＳＮＰ分析を実現するために捕捉体プローブのシーケンスはその都度ＳＮＰの４つずつの可能なヌクレオチド変異がスポットされるように選択される。理想的対合（マッチ）および誤対合（ミスマッチ）の融解条件の正確な知識において、唯一の種類の捕捉体プローブが作動する。その際に融解曲線の位置からマッチまたはミスマッチが推定される。全部で３つの可能な分析状態（１：マッチのみ、２：ミスマッチのみ、３：マッチとミスマッチとの組み合わせ）を確実に検出できるようにするために、最も簡単な場合に、マッチ捕捉体プローブもしくはミスマッチ捕捉体プローブを有する２つの測定位置が必要である。
【００１６】
新しい測定法の実際の変換のために、トランデューサアレイまたはセンサアレイを形成するチップのハイブリダイゼーション位置上に薄い液体膜を可能にする流路セルの中にチップが組み入れられる。検体ＤＮＡプローブ、特にビオチン化されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションは、全てのマッチハイブリッドが生じ得るがしかしミスマッチハイブリッドも生じ得るような温度で行なわれる。引続いて、ビオチン化された標的ＤＮＡを介してストレプトアビジン−酵素対が結合される。
【００１７】
今や、その酵素に対して固有の基質を有する溶液がポンプによりセンサチップ上に送り出される。ポンプは例えば５〜１０秒の間特に一定の温度で停止され、電流増大の初期勾配が測定される。電流増大は、ラベル酵素（例えば熱安定エステラーゼ）が酵素基質（その酵素に対応する例えばｐ−アミノフェニルアセテート）を変換し、それにより生じる反応生成物（相応のｐ−アミノフェノール）がトランスデューサ電極において電気化学的に変換され、それによって反応生成物に比例した電流が発生されるという事実から生じる。電流の増大は、酵素が結合位置に連続的に反応生成物を補給し、それにより生成物濃度の上昇が起こり、このことが電流を増大させるという事実から生じる。
【００１８】
強調すべきことは、検出すべき反応生成物（例えばｐ−アミノフェノール）が、結合されたラベル酵素において解放されて自由に拡散し得るか、もしくは酵素基質液体の流れにより洗い流され得ることである。とりわけ電極における電気化学的変換または光学的検出（例えば適切な光学的に活性な反応生成物の吸収測定）による検出は、酵素基質溶液の流速が検出のために明白に低減されるか、または好ましくは零に設定されるときにのみ行なわれるとよい。
【００１９】
引続いて液体ポンプが再び運転され（数μｌ／ｍｉｎ）、同時に温度が定められた数℃、例えば２℃だけ高められる。この措置によって、一方では増加した反応生成物が検出位置から遠ざけられ、他方では温度上昇およびそれにともなう融解によってミスマッチ標的ＤＮＡ−捕捉体ＤＮＡハイブリッドが溶かされ、ハイブリダイゼーション位置つまり検出位置から運び去られる。それによって、一方では先に増大した電気化学的信号が再び下げ戻され（必ずしも零には戻されないが明白に低減させられ）、他方では誤って対にされた標的ＤＮＡと捕捉体ＤＮＡとの再ハイブリダイゼーションが濃度低減により防止される。前もって下げ戻されたセンサ信号は更なる測定を可能にする。このために数秒後、例えば２０秒後にポンプが再び例えば５〜１０秒間停止され、電流増大が新たに記録される。
【００２０】
上述の過程は、全てのＤＮＡ標的分子がそれらの融解点に従って相次いで捕捉体プローブから分離されるまで繰り返される。それにより得られた融解曲線、すなわち温度の関数としての全てのトランスデューサ位置の電流増大が評価される。これは、特にコンピュータ制御により予め与えられたソフトウェアプログラムに従って行なわれる。
【００２１】
方法全体は約１０分後に終了し、従って従来技術に比べて特に高速の方法であり、この方法は酵素による増幅の使用により高い感度を有し、従って高い信頼性を有する。
【００２２】
上述の融解曲線を取得するための典型的な温度範囲は約４０℃〜７０℃である。酵素、特に文献により公知のラベル酵素は一般に約４０℃までしか安定でなく、すなわちこの温度以上では変性し、それにより測定に必要な触媒作用を失うので、本発明によれば特に、例えば熱安定エステラーゼのような熱安定酵素が使用される。
【００２３】
図１に基づいて上述の測定方法論を明確に説明する。部分図１ａ，１ｂ，１ｃにはそれぞれ横座標に時間が等しい目盛でとられ、縦座標として図１ａでは５０°と６０°との間の温度がとられ、図１ｂでは流れが目盛のない単位でとられ、そして図１ｃではセンサ信号（酸化還元サイクル電流）がとられている。温度が予め与え得るステップで、もしくは直線状に高められ、これに関連して（同期して）流れが変化される。好ましくは、その都度一定の温度に調整後に流れが変化され、特に零に調整される。捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドの融解温度が到達されているかぎり、標的ＤＮＡが酵素標識を含めて統計学的分布の原則のもとに捕捉体ＤＮＡから溶かされ、液体の流れによってそれぞれのトランスデューサ位置から遠ざけられ、廃棄容器内へ洗い流される。融解温度がまだ到達されていない標的ＤＮＡ−捕捉体ＤＮＡハイブリッドは、それらのハイブリダイゼーション位置にそのまま維持される。洗浄液中には、まだ結合している酵素ラベルによって生成物に変換される酵素固有の基質が存在する。変化された（特に零にセットされた）流れにより、その生成物がハイブリダイゼーション位置に集積し、センサ電極へ拡散させられて、電気化学的に検出される。それにより、図１ｃにおいて電流測定値の著しい増大が生じ、この電流増大がその都度、捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対の健全なハイブリダイゼーションを特徴づける。特に、電流増大の初期勾配が評価に利用される。温度が高まり、流れが出発値に戻されると、新たな液体がハイブリダイゼーション位置に達し、同じ測定個所の他の分子もしくは他の測定個所の最初の分子がより高い融解温度で融解されて洗い流される。
【００２４】
曲線２１に対応したランプ状ステップでの温度上昇の代わりに、場合によっては、温度上昇は、曲線２１’もしくは２１”に対応して連続的にまたは予め与え得るプロフィール（推移）に従って行なわれてもよい。流れは必ずしも停止させる必要がなく、変化させることだけが重要である。それぞれ互いに合わせられたプロフィール曲線２１，２２が可変量として与えられる。その都度の定常状態もしくは準定常状態の調整が重要である。図１ｃには、例えば電流値として測定されるセンサ信号が２３で示され、センサ信号の固有の勾配値が２４で示されている。図２は、位置固有のトランスデューサにおいて図１ｃに従って測定された因子Ｖ−ＰＣＲ生成物についての多数のマッチ−ハイブリダイゼーション位置の融解曲線３１と、多数の一塩基ミスマッチ−ハイブリダイゼーション位置の融解曲線３２とを示し、電流増大率ｄＩ／ｄｔがｎＡ／ｍｉｎの単位で温度の関数として描出されている。
【００２５】
図３は、図２から正規化された測定値、すなわち、
電流増大率（Ｔ）／電流増大率（Ｔ＝４０℃）
を曲線３１’，３２’として示し、個々の曲線が対比可能である。因子Ｖ−ＰＣＲ生成物における因子Ｖは血液凝固にとって重要である遺伝子である。
【００２６】
詳しくは、図２および図３において、図１ｃのトランスデューサ位置つまり測定位置の例におけるような電流測定値の初期勾配（ｄＩ／ｄｔ）が、その都度調整された温度値に依存して描出されている。個々の捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対について、重要な、特にＳ字状の滴定曲線に似た曲線経過３１，３２が生じる。この場合に重要なことは、互いに適合している（マッチ）捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対が、互いに適合していない（ミスマッチ）捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡ対とは大きく異なる信号経過もしくは横座標に沿って異なる曲線位置も有することである。特に、互いに適合している捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡにおける融解過程およびそれに結び付いた融解曲線の降下は、互いに適合していない捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡにおける温度よりも高い温度で生じる。
【００２７】
図４には具体的に使用された測定構成を有する一般的な装置が示されている。この装置は多数のハイブリダイゼーション位置５，５’，…，５n’を有する１つのチップからなる。図４には、従来技術から知られているいわゆるＤＮＡチップが１で示されている。このようなＤＮＡチップ１はその表面２に例えばアレイの形の多数の測定位置５，５’，…，５n’を有する。各測定位置５，５’，…，５n’には捕捉体ＤＮＡ分子が固定されて配置されている。例えば固定点６に捕捉体ＤＮＡ１００が配置されている。捕捉体ＤＮＡ１００には標的ＤＮＡ２００が付加され得る。標的ＤＮＡ２００はラベルを備えることができる。ラベルは生物触媒作用による標識としての酵素であってよい。この場合に酵素標識は熱安定酵素を含むと好ましい。
【００２８】
捕捉体ＤＮＡ１００の固定のための個々の測定位置は、以下の全ての図において、５，５’，…，５n’で示されている。シリコンまたはその他の半導体材料から形成されているチップ１内には、とりわけ、ひとまとめに３で符号を付されている増幅および測定装置が組み込まれている。しかし、チップ１は集積化信号処理部を有していない金属電極を備えた絶縁材料から成っていてもよい。
【００２９】
測定チップ１には温度調整もしくは温度調節装置１０が付設されている。このためには例えばペルチエ素子などが考慮の対象となる。温度測定はチップおよび／または場合によっては温度調節装置において行なわれる。
【００３０】
チップ１の測定側としての表面２は流路２０に向けられている。この流路を通して、標的ＤＮＡ２００および場合によっては標識酵素のような分析過程のために必要な全ての基質が、もしくはリザーバ４０から場合によっては酵素固有の基質Ｓを有する洗浄液が予め与え得る流れで導かれる。予め与えられた時間間隔の間その都度正確な流れを維持しかつ定められた流れ停止を保証する流れ調節要素３０が存在し、更にもはや必要でない基質のための収容もしくは廃棄容器５０が存在する。
【００３１】
図４に基づいて説明した装置により、特に酵素基質Ｓを備えた洗浄液を精密な温度制御のもとでチップ上に薄い液体膜として導くことができる。この場合に予め与え得る流れ制御および正確な測定ならびに評価が可能である。
【００３２】
図５および図６には２つの挙動状態が共通の形で示され、チップ１には付属の温度調節装置１０および流路２０が付設されている。拡大表示で、個々の多型および付属の点変異を有する捕捉体ＤＮＡ１００および標的ＤＮＡ２００が示されている。特に、例えば５０℃の温度においては、全ての捕捉体ＤＮＡ１００が標的ＤＮＡ２００を結合させていることが明らかであり、特にいわゆるマッチ結合Ａ−Ｔ，Ｇ−Ｃが存在し、しかしミスマッチ結合Ｇ//Ａ，Ｃ//ＡおよびＡ//Ａも存在する。マッチ結合はミスマッチ結合より強いことが明白である。
【００３３】
特に図６には例えば６０℃の温度調節を有する状態が示され、この温度においてはミスマッチ結合が融解されるので、引続いてミスマッチ標的ＤＮＡが洗い流される。洗い流された標的ＤＮＡ分子は廃棄容器５０まで運ばれる。しかし、どの測定位置からももはや検出することができないように、洗い流された標的ＤＮＡ分子を測定位置から僅かな距離だけ遠ざけるだけで十分である。
【００３４】
ミスマッチ結合の融解は位置固有に温度に依存して検出され評価される。このために、一方では図７および図８に、そして他方では図９および図１０に２つの選択可能な測定が示されている。
【００３５】
図７および図８は、図４ならびに図５および図６を出発点とし、標的ＤＮＡ２００が蛍光ラベルＦを備えている。このような蛍光標識された標的ＤＮＡ２００の場合には光学的な読み出しが可能である。光信号７５が、図７および図８には詳細に示されていない分光計により、位置正しく検出されて評価される。
【００３６】
図７および図８の比較から、融解温度を上回った際に、例えば６０℃の温度においてミスマッチ結合が融解され、これに関する標的ＤＮＡ２００が蛍光ラベルＦを含めて洗い流されていることが明らかである。そのかぎりでは、ミスマッチ位置では低減した信号が生じる。
【００３７】
有利な酵素による測定および電気化学的測定において、酵素による触媒反応が次の式が当てはまる生成物Ｐの形成のために利用される。
【数１】
ただし、Ｓは酵素基質、Ｅは酵素ラベル、Ｐは反応生成物を意味する。
【００３８】
図９において標的ＤＮＡ分子２００は酵素ラベルＥを備え、矢印によって酵素による触媒反応および電気的測定位置への反応生成物Ｐの拡散が示されている。チップ１の測定位置５，５’，…，５n’には電気化学的信号検出器つまりトランスデューサ９５，９５’が存在し、チップ１のシリコン内の既述の信号処理部３と関連して直接に、反応生成物Ｐの濃度の尺度である例えば電流の如き電気信号を検出することができる。
【００３９】
更に、図７および図８と同様に、図９および図１０に、５０℃の温度および６０℃の温度における２つの状態が示されている。従って、第１の状態ではＳからＰへの変換によって全ての測定位置において大きな電気信号が生じ、第２の状態ではミスマッチ位置においては低減した信号が生じるかもしくは全く信号が生じないが、しかしマッチ位置においては比較的大きな電気化学信号が生じる。洗い流された標的ＤＮＡ分子ならびに洗い流された反応生成物Ｐはここでも廃棄容器５０へ運ばれる。しかし、洗い流される標的ＤＮＡ分子および反応生成物は、存在する測定位置ではもはや検出することができないように測定位置から僅かな距離だけ遠ざけられるだけでも十分である。
【００４０】
酵素による測定方法および電気化学的測定方法の特別な利点は、電流増大率ｄＩ／ｄｔが評価に利用され、絶対電流信号自体が利用されるのではないので、例えば光学的方法に比べて大幅に背景信号に依存しないという事実にある。それによって、酵素標識された標的ＤＮＡならびにそれによって発生された反応生成物Ｐを廃棄容器まで運ぶ必要はない。反応生成物Ｐの測定位置固有の集積が短時間の洗浄によって取除かれさえすればよい。それによって、後続の洗浄過程ではポンプが洗浄液を吸引したり吐出したりすることでも十分であり、それにより洗浄液の節約が可能になり、これは特に集積化され小型化された実施形態の場合に有利である。
【００４１】
電流信号は図１ｃにおけるピークに対応し、図２および図３においてそれらの初期勾配ｄＩ／ｄｔは図１ｃの直線２４，２４’，２４”，…に対応する。
【００４２】
検出が光学的ラベルまたは酵素ラベルを介して行なわれる両例のほかに、結合された標的ＤＮＡ２００のラベルなしの検出も可能である。ラベルなしの光学的検出の場合、ＤＮＡ二重鎖の融解時におけるＵＶ吸収の固有変化が検出される。これに対して、ラベルなしの電気的検出の場合、固有のグアニン酸化のプロセスが利用される。ラベルなしの他の検出は電気化学的インピーダンス法により行なわれる。更に、質量変化の測定によるラベルなしの検出、すなわち例えば表面波センサ（いわゆるＳＡＷ）の如き音響法を介する重量測定による検出も可能である。
【００４３】
ラベル法において、磁場センサと組み合わせた磁気的ラベルの使用も可能である。
【００４４】
以上に説明した方法において重要なことは、測定および付属の評価が自動化可能であることである。この自動化に関連してその都度の流れプロフィール（流れ推移）が生じる。このプロフィールにおいては、一方ではまず予め与えられた温度調整時に、融解されたミスマッチ結合が洗い流され、他方では位置固有に結合された標的ＤＮＡの検出が「移動を停止された」洗浄液において行なわれる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】時間に依存する予め与えられた温度プロフィールの３つの例（ａ）、液体流れプロフィール（ｂ）および個々のハイブリダイゼーションのセンサ信号（ｃ）による本発明における方法の進行を示す説明図
【図２】図１ｃによるセンサ信号（電流曲線）から導き出され、温度関数としての電流の初期勾配を有する評価もしくは融解曲線を示す特性曲線図
【図３】図１ｃによるセンサ信号（電流曲線）から導き出され、温度関数としての４０℃信号で正規化された電流増大を有する評価もしくは融解曲線を示す特性曲線図
【図４】この方法を実施するための装置の概略図
【図５】図４による装置における２つの挙動状態の一方の状態を示す拡大図
【図６】図４による装置における２つの挙動状態の他方の状態を示す拡大図
【図７】ＳＮＰ法での光学的検出の実施例を一方の状態で示す概略図
【図８】ＳＮＰ法での光学的検出の実施例を他方の状態で示す概略図
【図９】電気化学的酵素による方法の実施例を一方の状態で示す概略図
【図１０】電気化学的酵素による方法の実施例を他方の状態で示す概略図
【符号の説明】
【００４６】
１ ＤＮＡチップ
２ 表面
３ 増幅および測定装置
５，５’，…，５n’ 測定位置
６，６’，…，６n’ 固定点
１０ 温度調整もしくは温度調節装置
２０ 流路
２１，２１’，２２” 温度プロフィール曲線
２２ 流れプロフィール曲線
２３ センサ信号プロフィール曲線
２４，２４’，２４”，… 初期勾配
３０ 流れ調節要素
３１ 曲線経過
３２ 曲線経過
３１’ 曲線経過
３２’ 曲線経過
４０ 洗浄液リザーバ
５０ 廃棄容器
７５ 光信号
９５，９５’ トランスデューサ
１００ 捕捉体ＤＮＡ
２００ 標的ＤＮＡ
Ｅ 酵素ラベル
Ｆ 蛍光ラベル
Ｐ 反応生成物
Ｓ 酵素基質
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出すべき標的ＤＮＡがＤＮＡチップ上に位置固有に固定された捕捉体ＤＮＡに結合すること（ハイブリダイゼーション）を利用するＤＮＡ点変異の検出方法（ＳＮＰ分析法）において、
ａ）洗浄液が調節された流速でＤＮＡチップ上に導かれ、
ｂ）ハイブリダイゼーション位置の温度が決められたとおりに変化され、
ｃ）捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドが温度に依存して融解され、流動する洗浄液によってハイブリダイゼーション位置から遠ざけられ、
ｄ）流速が予め与えられた時間間隔内において零に調節され、
ｅ）現在の温度においてなおも結合している標的ＤＮＡが位置固有に検出され、位置固有に結合している標的ＤＮＡの検出が洗浄液の移動を停止された状態で行なわれ、
ｆ）信号が予め与えられたプログラムに従って評価される
ことを特徴とするＤＮＡ点変異の検出方法。
【請求項２】
方法ステップａ）〜ｅ）が複数回繰り返されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
温度変化は連続的な上昇であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
連続的な温度上昇は時間関数として直線であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
連続的な温度上昇は時間関数として保持時間を有するランプ関数で行なわれることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
保持時間中にＤＮＡチップ上の流れが停止されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
結合している標的ＤＮＡの検出はラベルなしに（標識なしに）行なわれることを特徴とする請求項１乃至６の１つに記載の方法。
【請求項８】
ラベルなしの検出は光学的に行なわれることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項９】
光学的検出はＤＮＡ二重鎖の融解時におけるＵＶ吸収の固有変化を利用することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ラベルなしの検出は電気的に行なわれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ラベルなしの検出は固有のグアニン酸化により行なわれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１２】
ラベルなしの検出は電気化学的インピーダンス法により行なわれることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ラベルなしの検出は重量測定により行なわれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１４】
結合している標的ＤＮＡの検出はラベル（標識）の利用により行なわれることを特徴とする請求項１乃至５の１つに記載の方法。
【請求項１５】
検出は光学的ラベルにより行なわれることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
検出は磁気的ラベルにより行なわれることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
検出は酵素ラベルにより行なわれることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
洗浄液は酵素基質を含んでいることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
酵素は使用された温度範囲において安定（活性）であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
酵素ラベルは光学的に検出可能である反応に触媒作用を及ぼすことを特徴とする請求項１６乃至１９の１つに記載の方法。
【請求項２１】
酵素ラベルは電気化学的に検出可能である反応に触媒作用を及ぼすことを特徴とする請求項１６乃至１９の１つに記載の方法。
【請求項２２】
電気化学的検出方法は酸化還元サイクルにより増幅される電流測定であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
基質または生成物の濃度変化が検出されて評価されることを特徴とする請求項１６乃至１９の１つに記載の方法。
【請求項２４】
センサ信号（検出信号）の評価および表示が温度の関数として行なわれることを特徴とする請求項１乃至２３の１つに記載の方法。
【請求項２５】
定められた温度で融解曲線の正規化が行なわれることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
評価はコンピュータ制御されることを特徴とする請求項１乃至２５の１つに記載の方法。
【請求項２７】
評価はソフトウェアにより実施されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＤＮＡチップ（１）と、付属の測定手段とを含み、少なくとも１つの温度制御および／または温度調節装置（１０）と、流れ制御装置（３０）を備えチップ表面（２）に洗浄液を流す装置（２０）と、融解プロセスの検出手段（１〜５，７５，９５）とが設けられていることを特徴とする請求項１乃至２７の１つに記載の方法を実施するための装置。
【請求項２９】
ＤＮＡチップ（１）は、チップ表面（２）上にＤＮＡ捕捉体プローブ（１００）を固定するためのアレイの一部としてのトランスデューサ（５，５´、・・・、９５）を形成することを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３０】
洗浄液は酵素基質（Ｓ）であることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
酵素ラベル（Ｅ）が標的ＤＮＡ（１００）の標識として存在することを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３２】
酵素ラベル（Ｅ）は熱安定であることを特徴とする請求項３１記載の装置。
【請求項３３】
少なくとも１つの温度制御および温度調節装置（１０）は時間的に予め与え得る温度プロフィールを設定することを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３４】
ＤＮＡチップ（１）に洗浄液を流す装置（３０）は、予め与えられた流れプロフィールで、設定された温度に依存して調節可能であることを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３５】
検出手段（１〜５，９５）は酵素による代謝を電気化学的に検出するように構成されていることを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３６】
検出手段（１〜５，９５）は電流および／または電位を測定するように構成されていることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項１】
検出すべき標的ＤＮＡがＤＮＡチップ上に位置固有に固定された捕捉体ＤＮＡに結合すること（ハイブリダイゼーション）を利用するＤＮＡ点変異の検出方法（ＳＮＰ分析法）において、
ａ）洗浄液が調節された流速でＤＮＡチップ上に導かれ、
ｂ）ハイブリダイゼーション位置の温度が決められたとおりに変化され、
ｃ）捕捉体ＤＮＡ−標的ＤＮＡハイブリッドが温度に依存して融解され、流動する洗浄液によってハイブリダイゼーション位置から遠ざけられ、
ｄ）流速が予め与えられた時間間隔内において零に調節され、
ｅ）現在の温度においてなおも結合している標的ＤＮＡが位置固有に検出され、位置固有に結合している標的ＤＮＡの検出が洗浄液の移動を停止された状態で行なわれ、
ｆ）信号が予め与えられたプログラムに従って評価される
ことを特徴とするＤＮＡ点変異の検出方法。
【請求項２】
方法ステップａ）〜ｅ）が複数回繰り返されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
温度変化は連続的な上昇であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
連続的な温度上昇は時間関数として直線であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
連続的な温度上昇は時間関数として保持時間を有するランプ関数で行なわれることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
保持時間中にＤＮＡチップ上の流れが停止されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
結合している標的ＤＮＡの検出はラベルなしに（標識なしに）行なわれることを特徴とする請求項１乃至６の１つに記載の方法。
【請求項８】
ラベルなしの検出は光学的に行なわれることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項９】
光学的検出はＤＮＡ二重鎖の融解時におけるＵＶ吸収の固有変化を利用することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ラベルなしの検出は電気的に行なわれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ラベルなしの検出は固有のグアニン酸化により行なわれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１２】
ラベルなしの検出は電気化学的インピーダンス法により行なわれることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ラベルなしの検出は重量測定により行なわれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１４】
結合している標的ＤＮＡの検出はラベル（標識）の利用により行なわれることを特徴とする請求項１乃至５の１つに記載の方法。
【請求項１５】
検出は光学的ラベルにより行なわれることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
検出は磁気的ラベルにより行なわれることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
検出は酵素ラベルにより行なわれることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
洗浄液は酵素基質を含んでいることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
酵素は使用された温度範囲において安定（活性）であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
酵素ラベルは光学的に検出可能である反応に触媒作用を及ぼすことを特徴とする請求項１６乃至１９の１つに記載の方法。
【請求項２１】
酵素ラベルは電気化学的に検出可能である反応に触媒作用を及ぼすことを特徴とする請求項１６乃至１９の１つに記載の方法。
【請求項２２】
電気化学的検出方法は酸化還元サイクルにより増幅される電流測定であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
基質または生成物の濃度変化が検出されて評価されることを特徴とする請求項１６乃至１９の１つに記載の方法。
【請求項２４】
センサ信号（検出信号）の評価および表示が温度の関数として行なわれることを特徴とする請求項１乃至２３の１つに記載の方法。
【請求項２５】
定められた温度で融解曲線の正規化が行なわれることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
評価はコンピュータ制御されることを特徴とする請求項１乃至２５の１つに記載の方法。
【請求項２７】
評価はソフトウェアにより実施されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＤＮＡチップ（１）と、付属の測定手段とを含み、少なくとも１つの温度制御および／または温度調節装置（１０）と、流れ制御装置（３０）を備えチップ表面（２）に洗浄液を流す装置（２０）と、融解プロセスの検出手段（１〜５，７５，９５）とが設けられていることを特徴とする請求項１乃至２７の１つに記載の方法を実施するための装置。
【請求項２９】
ＤＮＡチップ（１）は、チップ表面（２）上にＤＮＡ捕捉体プローブ（１００）を固定するためのアレイの一部としてのトランスデューサ（５，５´、・・・、９５）を形成することを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３０】
洗浄液は酵素基質（Ｓ）であることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
酵素ラベル（Ｅ）が標的ＤＮＡ（１００）の標識として存在することを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３２】
酵素ラベル（Ｅ）は熱安定であることを特徴とする請求項３１記載の装置。
【請求項３３】
少なくとも１つの温度制御および温度調節装置（１０）は時間的に予め与え得る温度プロフィールを設定することを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３４】
ＤＮＡチップ（１）に洗浄液を流す装置（３０）は、予め与えられた流れプロフィールで、設定された温度に依存して調節可能であることを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３５】
検出手段（１〜５，９５）は酵素による代謝を電気化学的に検出するように構成されていることを特徴とする請求項２８記載の装置。
【請求項３６】
検出手段（１〜５，９５）は電流および／または電位を測定するように構成されていることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５０３０００（Ｐ２００７−５０３０００Ａ）
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２９９５２（Ｐ２００６−５２９９５２）
【出願日】平成１６年５月２８日（２００４．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５８２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５４６
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（３９００３９４１３）シーメンス アクチエンゲゼルシヤフト (2,104)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｅｍｅｎｓ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｗｉｔｔｅｌｓｂａｃｈｅｒｐｌａｔｚ ２， Ｄ−８０３３３ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２８日（２００４．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５８２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５４６
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（３９００３９４１３）シーメンス アクチエンゲゼルシヤフト (2,104)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｅｍｅｎｓ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｗｉｔｔｅｌｓｂａｃｈｅｒｐｌａｔｚ ２， Ｄ−８０３３３ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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