ＦＯＸＰ３蛋白質を用いた霊長類における免疫機能の調節方法
【課題】本発明は、ｓｃｕｒｆｙ関連疾患の診断に有用な方法および組成物を提供することを課題とする。
【解決手段】Ｆｋｈｓｆ、およびその突然変異株型をコードする単離された核酸分子を提供することによって、上記課題が解決された。また、このような核酸分子を発現するのに適切な発現ベクター、このような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供されている。免疫系を調節できる薬学的化合物、このような化合物を同定する方法もまた、提供されている。さらに、Ｓｃｕｒｆｉｎにより調節される蛋白質およびＦｏｘｐ３発現を誘導または阻害する蛋白質を同定するための方法を提供してる。
【解決手段】Ｆｋｈｓｆ、およびその突然変異株型をコードする単離された核酸分子を提供することによって、上記課題が解決された。また、このような核酸分子を発現するのに適切な発現ベクター、このような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供されている。免疫系を調節できる薬学的化合物、このような化合物を同定する方法もまた、提供されている。さらに、Ｓｃｕｒｆｉｎにより調節される蛋白質およびＦｏｘｐ３発現を誘導または阻害する蛋白質を同定するための方法を提供してる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に医薬品および方法に関し、詳しくは、免疫系統を調節できる化合物を同定する方法、更に、Ｓｃｕｒｆｉｎにより調節され、Ｆｏｘｐ３発現を誘導または阻害する蛋白質を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、および喘息は免疫調節不全に係わる。これらの全ての疾患において、サブセットＴ細胞は、過活性化され、自己に対する免疫反応に寄与する。近年、ＣＤ９５、ＣＤ９５−リガンド、ＣＴＬＡ−４またはＴＧＦ−βで突然変異されたマウスは、Ｔ細胞調節および免疫系統ホメオスタシスに係わる多くの経路を分析するのに有用であることが証明された。上記遺伝子が深く免疫応答を変化させた場合いずれかの突然変異を有するマウスは、Ｔ細胞機能を制御できないことに起因にする。
【０００３】
末梢でＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体とＣＤ２８との共刺激を経るシグナル伝達に係わる（非特許文献１〜３にレヴューされた）。末梢Ｔ細胞応答の下方調節は、若干の経路に係わる。これらの幾つかは、ＣＤ９５およびそのリガンドを含むＴＮＦＲファミリーのメンバーを介する細胞自滅、サイトカイン中止による活性化が誘導した死亡、およびＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）を経たネガティブシグナル伝達を含む（Ｌｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１７：２２１−２５３（１９９９）；Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１１：２９４−３００（１９９９）；Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１０：３１３−３２１（１９９８）；Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１７：３３１−３６７（１９９９））。これらの遺伝子のうちのいくつかのドミナントネガティブな形態の突然変異または発現は、末梢Ｔ細胞応答の調節における重要な役割が証明された。ＣＤ９５、ＣＤ９５Ｌ、ＴＧＦ−βまたはＣＴＬＡ−４における突然変異は、進行性自己免疫リンパ増殖性疾患に導く（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７７０−７７４（１９９３）；Ｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：６９３−６９９（１９９２）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７６：９６９−９７６（１９９４）；Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：５４１−５４７（１９９５）；Ｗａｔａｎｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６：３１４−３４７（１９９２）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：９８５−９８８（１９９５））。更に最近のデータによると、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞におけるＴ細胞活性の調節は、末梢Ｔ細胞寛容性の維持にも重要であることが示唆される。（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１２：６７６−６８３（２０００）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ １０１：４５５−４５８（２０００）；Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１８：４２３−４４９（２０００））。このような調節性Ｔ細胞の正常動物からの枯渇は、色々な自己免疫疾患の発展を導き、これらの調節性Ｔ細胞の養子免疫伝達も多くの系の生体内での疾患を防止することができる（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：３８７−３９６（１９９６）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５５：１１５１−１１６４（１９９５）；Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６０：１２１２−１２１８（１９９８））。
【０００４】
調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）がその抑制効果を媒介することによる特異メカニズムは最近まで不明である。ＴＧＦＢおよびＩＬ−１０は、抑制効果を媒介し、これらのサイトカインを遮断し、若干の生体内モデルでの抑制を排除するが、その他の分子も係わることを示す良い事実がある。累積した事実は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の活性化および／または機能におけるＣＤ１５２の役割を示す（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２（２０００）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：３０３−３１０（２０００））。面白いことに、若干の研究は、ＣＤ１５２を経たシグナル伝達がＴＧＦＢの誘導をきたすことを示唆する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１８４９−１８５７（１９９８）；Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２００１−２００８（２０００）；Ｋｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６９１−７０２（２０００））、ＴＧＦＢ−媒介抑制とＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制性活性との間の潜在的な関連を提供する。
【０００５】
Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患は、以下において見られる病原性と多くの特徴を共有する自発性突然変異の動物である、ｓｃｕｒｆｙ（ｓｆ）マウスにおいて観察された：ＣＴＬＡ−４の標的削除（Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：５４１−５４７（１９９５）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：９８５−９８８（１９９５））およびＴＧＦ−β（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７７０−７７４（１９９３）；Ｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：６９３−６９９（１９９２））、三週齢での死亡（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：２８１−２８６（１９９４）；Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５５２８−５５３２（１９９１）；Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９−１３８７（１９９１）；Ｋａｎａｎｇａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１６１−１６５（１９９６）；Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３−２４３７（１９９０））を含む。ｓｆ動物において、疾患はＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介され、これらの細胞は、生体内および生体外で活性化された表現型を呈する（Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３７６４−７７４（１９９４））。該疾患を担う特異な突然変異は、最近クローンされ、その遺伝子は、フォークヘッドファミリー転写因子の新メンバーとされることが示された（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：６８−７２（２００１））。この遺伝子はＦｏｘｐ３と呼ばれ、蛋白質生成物はｓｃｕｒｆｉｎと呼ばれる。ヒトオーソロガス遺伝子での突然変異は、治療しないで放っておくと一般に致命的である男性の子孫に罹る疾患の内の類似リンパ増殖性疾患を起こす（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：２０−２１（２００１）；Ｃｈａｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＪＭ２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：Ｒ７５−８１（２０００）；Ｗｉｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：１８−２０（２００１））。
【０００６】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【非特許文献１】Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ａ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：５５５−５５９（１９９５）
【非特許文献２】Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４４３−４４８（１９９４）
【非特許文献３】Ｒｕｄｄ，Ｃ．Ｅ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：５２７−５３４（１９９６） 本発明は、ｓｃｕｒｆｙ関連疾患の診断に有用な方法および組成物を開示し、より詳しくは、免疫系統を調節できる化合物を同定する方法、更に、Ｓｃｕｒｆｉｎにより調節された蛋白質を同定する方法およびＦｏｘｐ３発現を誘導または阻害する方法を開示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する：
（項目１） ｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ｓｃｕｒｆｉｎプロモーターに結合したリポーター遺伝子を含む組成物を提供する工程、
（ｂ）該組成物を試験化合物と接触させる工程、
（ｃ）リポーター遺伝子発現のレベルを測定する工程、および
（ｄ）（ｃ）におけるリポーター遺伝子発現のレベルと所定の発現レベルとを比較し、試験化合物がｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節するか否かを決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
（項目２） ｓｃｕｒｆｉｎ 発現のレベルが減少される項目１記載の方法。
（項目３） ｓｃｕｒｆｉｎ 発現のレベルが増加される項目１記載の方法。
（項目４） 試験化合物がモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ペプチド、および小分子からなる群より選ばれる、項目１記載の方法。
（項目５） 試験化合物が有機分子、天然の産物、ペプチド、オリゴ糖、核酸、リピド、および抗体またはその結合断片からなる群より選ばれる項目１記載の方法。
（項目６） 試験化合物が化合物のライブラリー由来である項目１記載の方法。
（項目７） ライブラリーがランダムなペプチドライブラリー、組合せのライブラリー、オリゴ糖ライブラリーおよびファージディスプレイライブラリーからなる群より選ばれる項目６記載の方法。
（項目８） 項目１記載の方法で同定された化合物。
（項目９） 哺乳類のＴ細胞を、Ｔ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物と接触させる工程であって、免疫応答が抑制される工程を含む、哺乳類における免疫応答を抑制する方法。
（項目１０） 哺乳類のＴ細胞を、Ｔ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を減少する化合物と接触させる工程であって、免疫応答を強化する工程を含む、哺乳類における免疫応答を強化する方法。
（項目１１） 被験体にｓｃｕｒｆｉｎ 発現を増加する化合物を投与して被験体による自己免疫の応答を阻害する工程を含む、被験体における自己免疫の応答を阻害する方法。
（項目１２） 自己免疫の応答が炎症性腸疾患、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬症、糖尿病、および喘息からなる群より選ばれる項目１１記載の方法。
（項目１３） 被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を減少する化合物を投与して被験体における疾患に対する自己免疫の応答を強化させる工程を包含する、被験体における疾患に対する自己免疫の応答を強化する方法。
（項目１４） 疾患がＡＩＤＳおよび癌からなる群より選ばれる項目１３記載の方法。
（項目１５） 被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加させる化合物を投与して被験体における対宿主性移植片病を阻害する工程を含む、被験体における対宿主性移植片病を阻害する方法。
（項目１６） 患者における自己免疫の応答を阻害する方法であって、
（ａ）患者からＴ細胞を分離する工程、
（ｂ）Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子で形質導入する工程、
（ｃ）形質導入されたＴ細胞を拡張する工程、および
（ｄ）患者に形質導入されたＴ細胞を再導入する工程であって、ここで、患者における自己免疫応答が阻害される工程、
を含む方法。
（項目１７） Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞である項目１６記載の方法。
（項目１８） 自己免疫病が炎症性腸疾患、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬症、糖尿病、および喘息からなる群より選ばれる項目１６記載の方法。
（項目１９） 形質導入ベクターがレトロウイルスベクターである項目１６記載の方法。
（項目２０） 患者における疾患に対する自己免疫の応答を強化する方法であって、
（ａ）患者からＴ細胞を分離する工程、
（ｂ）Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ発現を阻害する化合物でトランスフェクトする工程、
（ｃ）トランスフェクトされたＴ細胞を拡張する工程、および
（ｄ）患者にトランスフェクトされたＴ細胞を再導入する工程であって、患者における疾患に対する免疫応答が強化される工程、
を含む方法。
（項目２１） 該化合物がアンチセンス分子である項目２０記載の方法。
（項目２２） 該疾患がＡＩＤＳおよび癌からなる群より選ばれる項目２０記載の方法。
【０００８】
本発明は、一般的に言えば、突然変異した場合、リンパ増殖性疾患に深く致る新規遺伝子の発見に関する。特に、「Ｓｃｕｒｆｙ」と呼ばれる突然変異マウスが、戻し交雑分析、物理的遺伝地図作製および大規模ＤＮＡ配列決定を経て、この疾患を担う遺伝子を同定するのに用いられた。この遺伝子の配列の分析により、ウィングトヘリックスＤＮＡ結合ドメインの全てを含む相関する遺伝子ファミリーに属することが示されている。
【０００９】
従って、本発明は、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆをコードする単離した核酸分子（その突然変異形態も含む）を提供する。ある具体例には、任意タイプのＦｋｈｓｆは、例えばマウスまたはヒトのような温血動物由来である。更に具体例に、単離した核酸分子が提供され、その核酸分子は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または４を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）ストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または３のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、またはその相補体、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）でコードされたポリペプチドの機能断片をコードする核酸分子よりなる群から選ばれる。好ましくは、核酸分子ＪＭ２でない。なお、ベクター（発現ベクターを含む）、および組換え宿主細胞、ならびに上記核酸分子でコードされた蛋白質も提供される。更に、少なくとも一部分の上記核酸分子とその他の蛋白質のコード領域とを結合する融合蛋白質を提供する。上記配列に基づくオリゴヌクレオチド断片（プローブおよびプライマーを含む）も提供する。このような断片は、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、２０、または２５ヌクレオチドであり、１００、２００、５００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドまで延長され得る。
【００１０】
他の局面において、Ｆｋｈｓｆ蛋白質（任意のタイプ）を生産するための上記発現ベクターを使用する方法が提供され、この方法は、下記工程を含む：（ａ）発現ベクターを含み、Ｆｋｈｓｆ蛋白質を生産する組換え宿主細胞を培養する工程、（ｂ）培養した組換え宿主細胞から蛋白質を単離する工程。
【００１１】
また、特異的にＦｋｈｓｆ蛋白質に結合する抗体および抗体断片も提供する。このような抗体の代表例としては、ポリクロナールおよびモノクロナール抗体（マウスのハイブリドーマから得た、またはヒト型に誘導した）が挙げられる。抗体断片の代表例としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識単位または相補性決定領域が挙げられる。
【００１２】
なお他の局面において、被験体からの生物サンプルにおいて、Ｆｋｈｓｆ核酸配列の存在下で下記工程を含む検出方法を提供する：（ａ）Ｆｋｈｓｆ特異的核酸プローブをハイブリダイゼーション条件下（ｉ）該生物サンプルから単離したテスト核酸分子、または（ｉｉ）プローブがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または３のヌクレオチド配列の少なくとも一部分を認識するＲＮＡ分子から合成した核酸分子と接触させる工程、および（ｂ）核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程。
【００１３】
他の関連する実施形態は、生物サンプルにおいてＦｋｈｓｆ、またはその突然変異型の存在下で下記工程を含む検出方法を提供する：（ａ）生物サンプルと抗Ｆｋｈｓｆ抗体または抗体断片とを接触させ、その接触は、抗体または抗体断片の生物サンプルへの結合を許す条件下で行う工程、および（ｂ）結合された抗体または結合された抗体断片のいずれを検出する工程。
【００１４】
その他の局面において、本発明は、動物（例えば、ヒト、猿、犬、猫、ラット、またはマウス）に本明細書中に記載されるＦｋｈｓｆ核酸分子を投与する工程を含む、動物にＦｋｈｓｆ核酸分子を導入する方法を提供する。その一つの実施形態において、核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、少なくとも部分がレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはαウイルスから作製したベクター）に含まれ発現される。他の実施形態において、核酸分子は、プラスミドベクターにより発現または含まれる。このようなベクターは、生体内または生体外（例えば、造血細胞、例えばＴ細胞）に投与することができる。
【００１５】
その他の実施形態において、動物の細胞がＦｋｈｓｆ蛋白質をコードする配列を含む導入遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００１６】
１つの好ましい実施形態において、霊長類での免疫機能を調節する方法を提供する。この方法は、以下を包含する：Ｆｏｘｐ３蛋白質をコードした複数の核酸配列を霊長類のリンパ球に挿入し；この核酸配列をサイトカインｃの制御下に置き；サイトカインｃで核酸配列の発現を活性化し、この霊長類においてＦｏｘｐ３蛋白質の量を増加させる。
【００１７】
従って、本発明の目的はＦｏｘｐ３の発現を変化する因子を同定するに用いられる分析を提供する。詳しくは、いろいろな条件下Ｆｏｘｐ３の誘導または阻害を測定する分析を提供する。この発現を変化する因子として小分子、ペプチド、ポリヌクレオチド、サイトカイン、抗体およびＦａｂ’断片が挙げられる。
【００１８】
１つの好ましい実施形態には、ｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ｓｃｕｒｆｉｎプロモーターに結合するレポーター遺伝子を含む組成物を提供する工程；この組成物をテスト化合物と接触させる工程；レポーター遺伝子発現のレベルを決定する工程；および（ｃ）におけるレポーター遺伝子発現のレベルと前決定発現のレベルとを比較することによりテスト化合物がｓｃｕｒｆｉｎの発現を調節するかを決定する工程を含む。
【００１９】
好ましい実施形態には、この化合物はｓｃｕｒｆｉｎ発現のレベルを低下させる。
【００２０】
他の実施形態には、この化合物はｓｃｕｒｆｉｎのレベルを増加する。
【００２１】
一つの実施形態には、テスト化合物は下記からなる群より選ばれる：モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ペプチド、および小分子。
【００２２】
他の実施形態には、テスト化合物は下記からなる群より選ばれる：有機分子、天然産物、ペプチド、オリゴ糖、核酸、脂質、抗体またはその結合断片、および細胞。
【００２３】
又他の実施形態には、テスト化合物は化合物のライブラリ由来である。
【００２４】
他の実施形態で、このライブラリは下記からなる群より選ばれる：ランダムペプチドライブラリ、天然産物ライブラリ、コンビナトリアルライブラリ、オリゴ糖ライブラリおよびファージディスプレーライブラリ。
【００２５】
１つの好ましい実施形態には、哺乳類のＴ細胞と、Ｔ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物とを接触させる免疫応答を抑制する方法が提供され、免疫応答が抑制される。
【００２６】
１つの好ましい実施形態には、Ｔ細胞とＴ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を低下させる化合物とを接触させ免疫応答を強化する方法を提供し、免疫応答が強化する。
【００２７】
他の関連する実施形態には、被験体における自己免疫応答を阻害する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物を投与し、被験体による自己免疫応答を阻害する。
【００２８】
関連する実施形態において、自己免疫応答は下記からなる群より選ばれる：炎症性腸疾患、乾癬、糖尿病、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、および喘息。
【００２９】
１つの好ましい実施形態には、被験体での疾患に対する免疫応答を強化する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を低下する化合物を投与し、それによって被験体の疾患を治療する。
【００３０】
関連する実施形態には、被験体でのＨＩＶまたは癌に対する免疫応答を強化する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を低下する化合物を投与し、それによってＨＩＶおよび癌を治療する。
【００３１】
１つの好ましい実施形態には、被験体での対宿主性移植片疾患を阻害する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物を投与し、それによって被験体による組織移植拒絶を阻害する。
【００３２】
１つの好ましい実施形態には、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離し、Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子で形質導入する工程；形質導入されたＴ細胞を増加させる工程；および形質導入されたＴ細胞を該患者に再導入する工程。ここで患者における自己免疫疾患は阻害される。
【００３３】
関連する実施形態には、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供する。その方法は、患者からＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を単離する工程、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞にｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子を形質導入する工程、形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を増加させる工程、および形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を患者に再導入する工程を包含し、患者における自己免疫疾患が阻害される。
【００３４】
１つの好ましい実施形態において、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供し、その自己免疫疾患は下記からなる群より選ばれる：炎症性腸疾患、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、乾癬、糖尿病および喘息。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程；Ｔ細胞にｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子を形質導入する工程；形質導入されたＴ細胞を増加させる工程；および形質導入されたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者における自己免疫疾患は阻害される。
【００３５】
１つの好ましい実施形態において、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程；Ｔ細胞にレトロウイルスベクターに含まれるｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子を形質導入する工程；形質導入されたＴ細胞を増加させる工程；および形質導入されたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者における自己免疫疾患は阻害される。
【００３６】
他の好ましい実施形態において、患者での疾患に対する自己免疫応答を強化する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程、Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ発現を阻害するテスト化合物でトランスフェクトする工程、トランスフェクトされたＴ細胞を増加させる工程、およびトランスフェクトされたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者における疾患に対する免疫疾患は強化される。
【００３７】
他の好ましい実施形態において、患者でのＨＩＶおよび癌に対する免疫応答を強化する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程、Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ発現を阻害するテスト化合物でトランスフェクトする工程、トランスフェクトされたＴ細胞を増加させる工程、およびトランスフェクトされたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者におけるＨＩＶまたは癌に対する免疫応答は強化される。
【００３８】
本発明のこれらおよびその他の局面は、下記の詳しい説明および添付の図面を参照すれば明白になる。また、より詳しい特定の手法または組成物（例えば、プラスミド等）を記載している種々の参考文献を挙げ、その全体が参考として援用される。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、調節性Ｔ細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットの生産および／または活性に係わるｓｃｕｒｆｉｎ蛋白質の発見に関する。Ｆｏｘｐ３発現は、この調節性表現型の細胞と直接相関し、その発現は、この特定サブセットの活性化の際にユニークに増加する。突然変異（ｓｆ）動物は、このサブセットに欠けて、Ｆｏｘｐ３トランスジェニック動物は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の増加した割合を有するようである。更に、トランスジェニック動物由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットは、細胞ごとに基づき抑制的でないようであるが、Ｆｏｘｐ３の発現は、やはりそのＣＤ２５−対応物に対してこのサブセットにて上昇する。面白くも、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の過剰発現は、これらの細胞に抑制活性を付与するが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞より低い効果に止まる。結局、このデータは、最近述べられた転写因子、ｓｃｕｒｆｉｎが免疫細胞機能の重要な調節剤であり、主としてＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の生産および／または活性を経て働き得ることを示唆する。
【００４０】
実施例からの結果、ｓｃｕｒｆｉｎ（Ｆｏｘｐ３遺伝子）の発現は、調節性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞活性を部分的に経て免疫系を下方調節することができる。結果的に、内因性Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現がＴ細胞に誘導できれば、色々な自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、乾癬、糖尿病、および喘息またはその他の状況、例えば、移植片対宿主疾患における免疫応答の下方調節に用いられ得る。更に、ｓｃｕｒｆｉｎ発現は、癌またはＡＩＤＳにおける免疫系を下方調節して、活性化することができる。
【００４１】
定義
本発明を詳しくする前に、以下に特定の用語の定義を示し、そして本明細書以降で使用する略語をリストし定義することは、これらを理解するために有用であり得る。
【００４２】
”Ｓｃｕｒｆｙ”は、重症リンパ増殖性疾病を呈する、マウスの遺伝性疾患を指す（例えば、Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３，１９９０参照）。原因遺伝子（その突然変異型は該疾患の原因である）は配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏｓ．１および３に示す。
【００４３】
”Ｆｏｘｐ３”は、フォークヘッドドメインを含む遺伝子を指し、これはｓｃｕｒｆｙマウス突然変異株にて突然変異された。”Ｆｏｘｐ３”は、マウスＦｏｘｐ３遺伝子によってエンコードされる蛋白質を指す。”ＦＯＸＰ３”は、マウスＦｏｘｐ３のヒトオルソログを指す。”ＦＯＸＰ３”は、ヒトＦＯＸＰ３遺伝子によりエンコードされた蛋白質。マウスＦｏｘｐ３およびヒトＦＯＸＰ３のｃＤＮＡ配列は、米国特許出願０９／３７２，６６８に開示され、それにはマウスｓｃｕｒｆｙ遺伝子をＦｋｈｓｆに、ヒトオルソログをＦＫＨｓｆに指定する。ヒトＦＯＸＰ３ゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２３５０８７に開示している。Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＡＦ２３５０９７および米国特許出願０９／３７２，６６８は、全目的のためにその全体を参考文献とする。
【００４４】
”分子”は、蛋白質またはペプチド（例えば、抗体、組換え結合パートナー、所要の結合親和性を有するペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸分子、および核酸類縁物（例えばＰＮＡ））、および有機または無機化合物を包括することが理解される。
【００４５】
”核酸”または”核酸分子”は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生産された断片、および連結、分離、エンドヌクレアーゼ作用、およびエクソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生産された断片のいずれかを指す。核酸は、天然に発生のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、または天然に発生のヌクレオチドの類縁物（例えば、天然に発生のヌクレオチドのα−鏡像異性体型）、または両者の併合よりなる単量体から構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に修飾を有し得る。糖修飾は、例えば、一以上の水酸基がハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基で置換された糖を含むか、または糖は、エーテル類またはエステル類として機能する。更に、全糖部分は、立体的および電子的に類似の構造、例えばアザ糖類および炭環状糖類縁物で置換される。塩基部分における修飾の例は、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、またはその他の周知の複素環の置換基を包括する。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような結合の類縁物で連結され得る。ホスホジエステル結合の類縁物は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート等を包括する。名詞”核酸”とは天然に発生のまたは修飾の核酸塩基がポリアミドバックボーンに付着した所謂”ペプチド核酸”も包括する。核酸は、一本鎖または二本鎖でもよい。
【００４６】
”単離核酸分子”とは生物のゲノムＤＮＡに組み込まれてない核酸分子である。例えば、真核細胞のゲノムＤＮＡから分離された遺伝子に応答するＤＮＡ分子は単離ＤＮＡ分子であり、単離核酸分子の他の例は、生物のゲノムに組み込まれてない化学合成核酸分子である。
【００４７】
”プロモーター”は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列である。典型的にプロモーターは、遺伝子の５’域に位置され、構造遺伝子の転写開始サイトに近い。もしプロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は誘導剤に応答して増加する。これと反して、もしプロモーターが構成的プロモーターである場合、転写速度は誘導剤により調節されない。
【００４８】
”ベクター”は所要蛋白質の発現を指向できるアセンブリーを指す。ベクターは操作可能に対象の遺伝子に連結する転写プロモーターエレメントを包括する。ベクターは、デオキシリボ核酸（”ＤＮＡ”）、リボ核酸（”ＲＮＡ”）、または両者の組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）から構成され得る。ベクターは、任意にポリアデニル化配列、一以上の制限酵素切断サイト、並びに一以上の選択性マーカー、例えばネオマイシンリン酸転移酵素またはハイグロマイシンリン酸転移酵素を包括し得る。また、選ばれた宿主細胞および使用されたベクターに依存して、その他の遺伝子エレメント、例えば、複製起点、追加核酸制限認識サイト、エンハンサー、転写の誘導性を付与する配列、および選択性マーカーも上記ベクターに加える。
【００４９】
”単離された”は、蛋白質またはポリペプチドに関する場合、分子が他の生物学的マクロ分子が殆どなく存在することを指し、クーマシーブルー染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで通常単一バンドとして現れる。”単離された”は有機分子に関する場合、当該分野で周知の方法（例えば、ＮＭＲ、融点）を利用して、化合物の純度が９０％より高いこと意味する。
【００５０】
”クローニングベクター”は、例えば、宿主細胞において自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子を指す。クローニングベクターは、通常に外来のヌクレオチド配列がベクターの必要な生物機能を失わない決定可能な方式で挿入できる一または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識サイト、およびクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択での使用に適切なマーカー遺伝子をエンコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は、通常テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００５１】
”発現ベクター”は、宿主細胞にて発現される遺伝子をエンコードする核酸分子を指す。通常に、遺伝子発現は、プロモーターの制御下に置かれ、任意に、少なくとも一つの調節エレメントの制御下に置かれれる。このような遺伝子は、プロモーターに”操作可能に連結される”と言われる。同じく、調節エレメントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの活性を調節する場合、作動可能に連結される。
【００５２】
”組換え宿主”は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む原核または真核細胞のいずれかを指す。この用語は、宿主細胞の染色体またはゲノム中に遺伝子工学でクローンされた遺伝子を含むように操作された原核または真核細胞も包括する。
【００５３】
真核細胞において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、構造遺伝子を転写してｍＲＮＡを生産することを触媒する。核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含むように設計することができる、その内ＲＮＡ転写は特定ｍＲＮＡに相補的な配列を有する。このＲＮＡ転写は”アンチセンスＲＮＡ”と称し、アンチセンスＲＮＡをエンコードする核酸分子は”アンチセンス遺伝子”と称する。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合でき、ｍＲＮＡ翻訳を阻害する。
【００５４】
”Ｆｋｈｓｆに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”または”Ｆｋｈｓｆアンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）該遺伝子の一部と安定な三重螺旋を形成できる、または（ｂ）ｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重螺旋を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。同じく、”Ｆｋｈｓｆに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”または”Ｆｋｈｓｆアンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）該Ｆｋｈｓｆ遺伝子の一部と安定な三重螺旋を形成できる、または（ｂ）該Ｆｋｈｓｆ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重螺旋を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００５５】
”リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語はＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子を含む。リボザイムをエンコードする核酸分子を”リボザイム遺伝子”と称する。
【００５６】
略語：ＹＡＣ：酵母人工染色体；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写酵素（ＲＴ）を用いて最初の工程でＲＮＡを初めてＤＮＡに転写するＰＣＲ法；ｃＤＮＡ：ＲＮＡ配列をＤＮＡ形態にコピーして作られた任意のＤＮＡ。本明細書中で使用する場合、”Ｆｋｈｓｆ”とはＦｋｈｓｆ遺伝子（遺伝子がヒト、哺乳類、またはその他いずれの温血動物由来かに拘わらない）の遺伝子産物を指す。大文字”ＦＫＨｓｆ”の場合、遺伝子産物（および遺伝子）はヒト由来であると理解されるべきである。
【００５７】
上記の通り、本発明は一般に医薬品および方法、特に、ｓｃｕｒｆｙ−相関疾病の診断に有用な方法および組成物、および免疫系を調節できる化合物を同定する方法に関する。
【００５８】
以下、更に詳しくこの発見を討論することにより、免疫系のアゴニストまたは拮抗剤として作用し得る分子を選ぶに利用され得るアッセイの開発を導いている。更に、このようなアッセイは、免疫系調節と同じく活性な他の遺伝子および遺伝子産物を同定するために利用され得る。
【００５９】
Ｓｃｕｒｆｙ
簡潔には、本発明は、Ｆｋｈｓｆをエンコードする遺伝子における突然変異が、脾腫、肝腫、大きく拡大したリンパ節、ラント症候群、剥脱性皮膚炎、および厚悪形耳を含む粗大な形態学的症状を生じるリンパ節、脾臓、肝臓および皮膚の進行性リンパ球浸潤によって特徴付けられる希少な状況（ｓｃｕｒｆｙ）を生じるという意外な発見に基づく（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９，１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５５２８，１９９１）。羽付き螺旋（ｗｉｎｇｅｄ−ｈｅｌｉｘ）ファミリーのこの新メンバーは、免疫系の新規構成要素を代表する。
【００６０】
下記実施例１にｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子の発見に利用された方法を提供する。下記実施例２および３にマウスｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子およびヒトオルソログのクローニング方法を提供する。トランスジェニックマウスを利用して決定するように遺伝子の正体および遺伝子機能との相関を確認する方法も実施例に提供する。
【００６１】
本発明は、Ｆｋｈｓｆ遺伝子および遺伝子産物の存在を決定する方法も提供する。１実施形態において、そのような方法は、（ａ）Ｆｋｈｓｆ特異的核酸プローブを（ｉ）生物サンプルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成された核酸分子のいずれかとハイブリダイズする条件下で接触させる一般的工程（ここで、プローブは、Ｆｋｈｓｆヌクレオチド配列の少なくとも一部分を認識する）、および（ｂ）該核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する一般的工程、を包含する。色々な方法が、選択された配列を増幅するに用いられ得、これらの方法には、例えば、ＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２，１９８８；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：４０１−０２，１９８９；Ｌｏｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．３５（９）：１８２６−３１，１９８９；米国特許４，７８６，６００参照）、およびポリメラーゼ連鎖反応（”ＰＣＲ”）を用いた核酸増幅（米国特許４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、および４，８００，１５９参照）、逆転写酵素−ＰＣＲおよびＣＰＴ（米国特許４，８７６，１８７、および５，０１１，７６９参照）が挙げられる。
【００６２】
あるいは、抗体をＦｋｈｓｆ遺伝子産物の存在の検出に利用できる。特に、１実施形態において、生物サンプルにおけるＦｋｈｓｆペプチド、またはその突然変異株形態の存在を検出する、下記工程を含む具体的方法が提供される：（ａ）生物サンプルを抗Ｆｋｈｓｆ抗体または抗体断片と接触させる工程（該接触は該抗体または抗体断片の生物サンプルへの結合を許す条件で行う）、および（ｂ）任意の結合された抗体または結合された抗体断片を検出する工程。
【００６３】
このような方法は、広汎なバラエティのアッセイフォーマットで達成され得る、これには、例えば、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、放射免疫検定法、放射免疫沈澱、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｄｏｔ Ｂｌｏｔアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ（米国特許４，３７６，１１０および４，４８６，５３０；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，前出も参照）が挙げられる。
【００６４】
核酸分子、蛋白質、および蛋白質の生産方法
本明細書中で、色々なＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ蛋白質および核酸分子（またはその部分）が提供されたが、本発明に関して、一つ以上のこれらの蛋白質に対する言及は、実質的に類似な活性の蛋白質を含むと理解されるべきであることが理解される。本明細書中で使用する場合、蛋白質は、以下の場合、”実質的に類似”であると考えられる：（ａ）蛋白質をエンコードする遺伝子のコード領域から誘導されたヌクレオチド配列によりエンコードされる場合（例えば、配列の部分または配列の対立遺伝子バリエーションを含む）；（ｂ）中度、高度もしくは極高度のストリンジェンシーの下、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、または少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上が本明細書中で開示した配列と相同である場合、あるいは、（ｃ）ＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）に規定したＤＮＡ配列に対して、遺伝子コードの結果として縮重している場合。また、本明細書中に開示される核酸分子は、相補的配列および非相補的配列を含み、ただし、配列は、さもなければ本明細書に示される基準に符合する。本発明において、高度のストリンジェンシーとは標準ハイブリダイゼーション条件を意味する（例えば、６５℃で５ＸＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ、または相当するもの）。ハイブリダイゼーションの目的に、アミノ端ドメイン、ジンクフィンガードメイン、中間部ドメイン、またはフォークヘッドドメインをエンコードした核酸分子（実施例１０参照）を利用できる。
【００６５】
本明細書に記載される核酸分子でエンコードされた蛋白質の構造は、例えば、Ｐ／Ｃ ＧｅｇｅまたはＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３２，１９８２）による方法に従う、疎水性プロット関数を用いて一次翻訳産物より予測できる。
【００６６】
本発明の蛋白質は、酸性塩形態または塩基性塩形態、または中性形態でされ得る。また、個別のアミノ酸残基は、酸化または還元により修飾できる。更に、色々な置換、欠失、または付加をアミノ酸または核酸配列に行える。その正味の効果は、突然変異型または野生型蛋白質の生物活性を保持またはさらに強化もしくは減少させる。また、遺伝子コードの縮重により、例えば、同じアミノ酸配列をエンコードしたヌクレオチド配列におけるバリエーションが考えられ得る。
【００６７】
本明細書中に開示される蛋白質の他の誘導体として、他の蛋白質またはポリペプチドとのこの蛋白質の結合体が挙げられる。これは、例えば、蛋白質の純化または同定をし易くする為に加えられ得るＮ−端またはＣ−端融合蛋白質の合成により達成され得る（米国特許４，８５１，３４１、およびＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：１２０４，１９８８参照）。別に、融合蛋白質（例えば、ＦＫＨ−ルシフェラーゼまたはＦｋｈ−ルシフェラーゼあるいはＦＫＨ−ＧＦＰまたはＦｋｈ−ＧＦＰ）は、蛋白質の同定、発現、および分析を補助する為構築され得る。
【００６８】
本発明の蛋白質は、本明細書中に記載の広汎なバラエティの技術で構築され得る。また、突然変異は、天然配列の断片に連結できる制限エンドヌクレアーゼ認識サイトに隣接する突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の座位に導入され得る。連結後、得られた再構築配列は、希望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する誘導物をエンコードする。
【００６９】
別に、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的サイト（またはセグメント特異的）突然変異の生成手法は、求められる置換、欠失、または挿入により変化する特定のコドンを有する変化遺伝子を提供するに用いられ得る。上記変化作成の例示的方法は、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）により開示されている。蛋白質の欠失または短縮誘導物（例えば、可溶性細胞外部分）も希望の欠失に隣接する手近な制限エンドヌクレアーゼサイトを利用して構築され得る。制限エンドヌクレアーゼ消化の次に、オーバーハングを填入し、ＤＮＡを再結合する。上記変化作成の方法の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）により開示されている。
【００７０】
本発明の核酸分子に作成される突然変異は、好ましくはコード配列のリーディングフレームを保存する。更に、突然変異は、好ましくはハイブリダイズしてｍＲＮＡの翻訳に不良な影響を及ぼす二次ｍＲＮＡ構造、例えば、ループまたはヘアピンを生成する相補的領域を作らない。突然変異サイトは予定できるが、突然変異自体の性質は予定する必要がない。例えば、所定サイトでの突然変異の最適特徴を選択するため、ランダムな突然変異生成を目標コドンで行い得、そして発現突然変異株を指示的な生物活性についてスクリーニングし得る。別に、天然配列の断片に連結できる制限サイトに隣接する突然変異株配列を含むオリゴヌクレオチドを合成して突然変異を特定の座位に導入し、を側面連接する。連結後、得られた再構築配列は希望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する誘導物をエンコードしている。突然変異は、蛋白質の活性を保存または増加させる、または蛋白質を減少または無能にする目的で導入され得る（例えば、突然変異株Ｆｋｈ）。
【００７１】
本発明の蛋白質をエンコードする核酸分子は、ＰＣＲ突然変異生成の技術、化学突然変異生成（Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，ＰＮＡＳ ８３：３４０２−０６，１９８６）、強制ヌクレオチド誤組み込み（例えば、Ｌｉａｏ ａｎｄ Ｗｉｓｅ Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１，１９９０）、またはランダムな突然変異オリゴヌクレオチドの使用（Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１７，１９８９）を利用しても構築できる。
【００７２】
本発明は、上記の遺伝子を発現できるベクターを含む宿主細胞の培養により上記遺伝子の操作および発現も提供する。このようなベクターまたはベクター構築物は、希望の蛋白質をエンコードした合成核酸分子またはｃＤＮＡ誘導核酸分子のいずれかを含み、これは適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、昆虫、または植物の遺伝子を含む色々なソースから誘導され得る。適切な調節エレメントの選択は、選ばれた宿主細胞に依存し、当業者により容易に達成され得る。調節エレメントの実例には、転写プロモーターおよびエンヘンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、および翻訳開始シグナルを含むリボゾーム結合配列を挙げられる。
【００７３】
上記蛋白質のいずれかをエンコードする核酸分子は、細菌、哺乳類、酵母またはその他の真菌、ウイルス、昆虫、または植物細胞を含む広汎なバラエティの原核および真核宿主細胞により容易に発現され得る。このような細胞に外来のＤＮＡを発現させる形質転換またはトランスフェクションする方法は当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，７０４，３６２；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−３３，１９７８；Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許 ４，８０１，５４２；Ｕｐｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，米国
特許４，９３５，３４９；Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，７８４，９５０；Ａｘｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，３９９，２１６；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，７６６，０７５；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；植物細胞についてはＣｚａｋｏ ａｎｄ Ｍａｒｔｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７−７１，１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−９２，１９９２参照）。
【００７４】
本発明を行う適切な細菌の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する色々な種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が挙げられる。細菌宿主細胞の代表的実例としてＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【００７５】
細菌の発現ベクターは、好ましくは宿主細胞にて機能するプロモーター、一以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌複製起点を含む。代表的なプロモーターとして、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖プロモーター系（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８参照）、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８７：１２３−２６，１９９０）、ｔｒｐプロモーター（Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５，１９８３）およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２０：２３１，１９８２）が挙げられる。代表的な選択マーカーには、例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子等の色々な抗生物質耐性マーカーが含まれる。宿主細胞の形質転換に適切な多くのプラスミドは当該分野で周知であり、とりわけ、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２：９５，１９７７）、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７，１９８３およびＶｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ １９：２５９−６８，１９８２参照）、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【００７６】
本発明を行う適切な酵母および真菌宿主細胞として、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の色々な種（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９３５，３４９）が挙げられる。酵母および真菌に適切な発現ベクターとして、とりわけ、酵母についてＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７４１９）、およびａｍｄＳクローニンベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１６９，１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８：１２１−３３，１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４−０８，１９７８）およびその誘導物が挙げられる。
【００７７】
酵母に適用の好ましいプロモーターとして、酵母糖分解遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−０８０，１９８０；Ａｌｂｅｒ ａｎｄ Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−３４，１９８２）またはアルコール脱水素酵素遺伝子（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２，ｐ．３５５；Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１，１９８３）由来のプロモーターが挙げられる。真菌ベクターに有用なプロモーターの実例として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ 糖分解の遺伝子から誘導された、例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−９９，１９８５）が挙げられる。この発現ユニットは、転写ターミネーターも含み得る。適切なターミネーターの実例はａｄｈ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．，１９８５）。
【００７８】
細菌のベクターのように、酵母ベクターは、一般に選択マーカーを含み、表現型分析が、変換株が選択可能なように存在する優性表現型を呈するいずれかのうちの一つの遺伝子であり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完するか、抗生物質耐性を提供するかまたは細胞が特定の炭素源を利用できるようにするマーカーであり、そして、ｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８：１７，１９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．）が挙げられる。別の適切な選択マーカーは、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するｃａｔ遺伝子である。
【００７９】
真菌の形質転換技術は文献に周知であり、例えば、Ｂｅｇｇｓ （ｉｂｉｄ．）、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−３３，１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１７４０−４７，１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３０１：１６７−６９，１９８３）に開示している。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクターに存在する選択可能なマーカーにより補足される遺伝子欠陥を含み得る。特定の宿主および選択可能なマーカーの選択は当該分野の通常の技術レベル内である。
【００８０】
酵母の形質転換のプロトコルも当業者に周知である。例えば、ＤＮＡで酵母のスフェロプラストを製造するか（Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７８を参照のこと）またはアルカリ塩、例えばＬｉＣｌで処理する（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３，１９８３を参照のこと）ことにより形質転換が容易に達成され得る。真菌の形質転換も、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３６９，１９８７）に記載されるように、ポリエチレングリコールを用いて行われ得る。
【００８１】
ウイルスベクターとして、上記のような希望の蛋白質をコードした単離核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むものが挙げられる。広汎なバラエティのプロモーターが本発明の状況において利用され得、例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、Ｆｒｉｅｎｄ ＭｕＬＶ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター （Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−８４，１９９４）、ネオマイシンリン酸基転移酵素プロモーター／エンハンサー、後期パーボウイルスプロモーター （Ｋｏｅｒｉｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−６３，１９９４）、疱疹ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／プロモーター、巨細胞ウイルス早期即時のプロモーター、および巨細胞ウイルス後期即時のプロモーター等のプロモーターが挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ ９１／０２８０５； ＥＰ ０，４１５，７３１；およびＷＯ ９０／０７９３６）である。適切な組織特異的プロモーターの代表例として、神経特異的エノラーゼプロモーター、血小板誘導の成長因子βプロモーター、ヒトα１−キマエリンプロモーター、シナプシンＩプロモーターおよびシナプシンＩＩプロモーターが挙げられる。上記プロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記、および他の例えばＨＩＶ プロモーターを含む）、肝炎、疱疹（例えば、ＥＢＶ）、および細菌、真菌または寄生虫（例えば、マラリア）特異的プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫に感染した特定の細胞および組織を標的化するために利用され得る。
【００８２】
本発明を行うに適切な哺乳類の細胞として、ＰＣ１２ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、Ｎ１Ｅ−１１５ 神経芽細胞腫、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ 神経芽細胞腫、ＳＨＳＹ５ アドレナリン作用性神経芽細胞腫、ＮＳ２０ＹおよびＮＧ１０８−１５マウスコリン作用性細胞株、またはラットＦ２後根神経節細胞株、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ６２８１； ＢＨＫ ５７０ 細胞株（受託番号ＣＲＬ １０３１４としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託））、ＣＨＯ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ ６１）、ＨｅＬａ （例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ２）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５７３； Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）およびＮＳ−１細胞が挙げられる。本発明に用いられ得る他の哺乳類の細胞株として、ラット Ｈｅｐ Ｉ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １６００）、ラットＨｅｐ ＩＩ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １３９）、ヒト肺 （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ７５．１）、ヒト肝癌 （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−５２）、Ｈｅｐ Ｇ２ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ８０６５）、マウス肝臓（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ２９．１）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ９．１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５８１）、ＨＩＴ−Ｔ１５ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７７７）、Ｊｕｒｋａｔ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．Ｔｉｂ １５２）およびＲＩＮｍ ５ＡＨＴ２Ｂ （Ｏｒｓｋｏｖ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｏｎ，ＦＥＢＳ ２２９（１）：１７５−１７８，１９８８）が挙げられる。
【００８３】
本発明を実施する際の使用のための哺乳類の発現ベクターとして、クローン遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向し得るプロモーターが挙げられる。好ましいプロモーターとして、ウイルスプロモーターおよび細胞のプロモーターがある。ウイルスプロモーターには、巨細胞ウイルス早期即時のプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−３０，１９８５）、巨細胞ウイルス後期即時のプロモーター、ＳＶ４０ プロモーター （Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−６４，１９８１）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａが挙げられる。細胞のプロモーターには、マウスメタロチオネイン−１ プロモーター （Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許 ４，５７９，８２１）、マウスＶκ プロモーター （Ｂｅｒｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７０４１−４５，１９８３； Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４９６，１９８７）およびマウスＶＨプロモーター （Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３，１９８３）が挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも一部は所望の発現のレベルまたはトランスフェクトされるレシピエント細胞株により決まる。
【００８４】
このような発現ベクターは、プロモーターからの下流および目的のペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡ配列からの上流に位置するＲＮＡスプライス部位のセットも含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。目的のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルもまた発現ベクターに含まれる。適切なポリアデニル化シグナルとして、ＳＶ４０からの早期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ｉｂｉｄ．）、アデノウイルス５ Ｅ１Ｂ領域およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーターからのポリアデニル化シグナル（ＤｅＮｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３０，１９８１）が挙げられる。発現ベクターとして、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する非コードウイルスリーダー配列（例えば、アデノウイルス２三連リーダー）が挙げられ得る。好ましいベクターには、エンハンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサー配列も含まれ得る。発現ベクターには、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列も含まれる。適切な発現ベクターは、市場から得られ得る（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【００８５】
クローン化されたＤＮＡ配列を含むクター構築物を、培養された哺乳類の細胞に、例えば、リン酸カルシウム−媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４：７２５，１９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３，１９８１； Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７３）、エレクトロポレーション （Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−４５，１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７）により導入することができる。クローンＤＮＡが安定に組み込まれた細胞を同定するため、一般に選択可能なマーカーを目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞へ導入する。培養された哺乳類の細胞に用いる好ましい選択可能なマーカーとして、薬物（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。他の選択可能なマーカーとして、蛍光蛋白質、例えば、ＧＦＰ （緑色蛍光蛋白質）またはＢＦＰ （青色蛍光蛋白質）が挙げられる。選択可能なマーカーは、増幅可能な選択可能なマーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択可能なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙによりレビューされている（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）。
【００８６】
適切なベクターを含む哺乳類の細胞は、一定期間、通常１−２日間増殖させられ、目的のＤＮＡ配列の発現を開始する。次に薬物選択は、安定な方式で選択可能なマーカーを発現している細胞の増殖を選択するように適用される。増幅可能な選択可能なマーカーでトランスフェクトされた増殖細胞に対して、薬物濃度を段階的な様式で増加させ、増加したコピー数のクローン配列を選択することにより発現レベルを増加し得る。導入された配列を発現している細胞を希望の形態または希望のレベルでの目的の蛋白質の産生について選択しスクリーニングする。次にこれらの基準を満足した細胞をクローン化し得、そして生産規模にする。細胞は流動細胞算器を用いてＧＦＰ−ポジティブ細胞を選ぶことにより、そのＧＦＰの発現に基づいて、トランスフェクションについて選択され得る。
【００８７】
哺乳類細胞のトランスフェクションのプロトコルは当業者に周知である。代表的な方法として、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス、アデノウイルスおよび原形質体融合−媒介移入（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）が挙げられる。裸のベクター構築物は、哺乳類（または他の動物）の筋肉に注射した後、筋肉細胞または他の適切な細胞に取り入れられ得る。
【００８８】
当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞も、本明細書を考慮して、本発明において有用であり得る、例えば、昆虫細胞において異種のＤＮＡ配列を発現するベクターとしてバキュロウイルスを使用することが、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２４，１９９０）にレヴューされている。
【００８９】
当該分野で公知の多数の植物宿主細胞も、本明細書を考慮して、本発明において有用であり得る、例えば、植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを使用することがＳｉｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ） １１：４７−５８，１９８７）にレヴューされている。
【００９０】
本発明の関連した局面において、本発明の蛋白質は、生殖細胞および体細胞遺伝子が、希望の蛋白質をコードし、そして、その遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結される遺伝子を含むトランスジェニック動物において発現され得る。あるいは、類似な方式で希望の遺伝子が欠けてるトランスジェニック動物（例えば、“ノックアウト”マウス）を調製し得る。このようなトランスジェニックは、マウス、ラット、兎、羊、犬、山羊および豚を含む色々な非ヒト動物で調製し得る（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−８３，１９８５，Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−１４，１９８３，Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４２，１９８５，Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ ４１：３４３−４５，１９８５，ａｎｄ 米国特許５，１７５，３８３， ５，０８７，５７１， ４，７３６，８６６， ５，３８７，７４２， ５，３４７，０７５， ５，２２１，７７８，および５，１７５，３８４）。要するに、適切に位置付けた発現制御配列と一緒に発現される核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、顕微鏡下注射により受精卵の前核に導入される。注射済みＤＮＡの組込みは、組織サンプルからのＤＮＡのブロット分析で検出される。好ましくは、動物の後代に伝えるように導入したＤＮＡを動物の生殖細胞系に組み込む。組織特異的発現は、組織特異的プロモーター、または、例えば、メタロチオネイン遺伝子プロモーター等の誘導性プロモーターを用いて達成し得る（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ｉｂｉｄ）、これは導入遺伝子の調節された発現を許す。
【００９１】
天然発生ｓｃｕｒｆｙ突然変異体（“ｓｆ”）以外のＦｋｈｓｆの突然変異型または天然発生突然変異体と遺伝背景が異なる突然変異型を産生する動物は、本明細書の開示を考慮すれば、容易に産生され得る。
【００９２】
蛋白質は、とりわけ、適切な宿主およびベクター系を培養し、本発明の組換え翻訳物を生産する方法で単離される。次にこのような細胞株からの上澄、または蛋白質が上澄に排泄されない蛋白質含有物または全細胞を、希望の蛋白質を単離するための色々な精製手法で処理し得る。例えば、上澄を先ず、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットのような市販の蛋白質濃縮フィルターを用いて濃縮し得る。濃縮後、濃縮液を適切な精製マトリックス（例えば、適切なサポートに結合した抗蛋白質抗体）に施し得る。あるいは、アニオンまたはカチオン交換樹脂を蛋白質の精製に用いる。または、一つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて更に蛋白質を精製し得る。本発明の蛋白質を単離する他の方法は当該分野で周知技術である。
【００９３】
本発明において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の次にクーマシーブルー染色を行い他の蛋白質（望まれていない）が検出されない場合、蛋白質は“単離された”と認定する。他の実施形態において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の次に銀染色を行い他の蛋白質（望まれていない）が検出されないように所望の蛋白質を単離し得る。
【００９４】
免疫系を調節する分子の選択分析
上記の通り、本発明は免疫系を調節できる分子の選択および／または単離する方法を提供する。適切な分析の代表例は、酵母と哺乳類の２−ハイブリッド系（例えば、Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：９５４，１９９１； Ｆｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７９５８，１９９２）、ＤＮＡ結合分析、アンチセンス分析、伝統的蛋白質結合分析（例えば、１２５Ｉまたは経時解析蛍光）、ゲル電気泳動および直接蛋白質シークエンシングを組み合わせた免疫沈澱、Ｆｋｈｓｆ調節された遺伝子の転写分析、サイトカイン生産および増殖分析を含む。
【００９５】
例えば、一実施形態において、Ｆｋｈｓｆと直接作用する蛋白質は、例えば、酵母２−ハイブリッド結合系のような分析で検出され得る（例えば、米国特許５，２８３，１７３、５，４６８，６１４、５，６１０，０１５、および５，６６７，９７３）。要するに、２−ハイブリッド系には、ＤＮＡ−結合領域−Ｆｋｈｓｆ 蛋白質の融合（例えば、ＧＡＬ４−Ｆｋｈｓｆ融合）は、選択可能なマーカー遺伝子に連結されるＧＡＬ４結合部位を含む細胞に構築され、トランスフェクトされる。全Ｆｋｈｓｆ蛋白質またはＦｋｈｓｆの次領域を使うことができる。ＧＡＬ４活性化域に融合されたｃＤＮＡのライブラリーも構築され、同時トランスフェクトされる。ｃＤＮＡ−ＧＡＬ４活性化領域融合中のｃＤＮＡは、Ｆｋｈｓｆと相互作用する蛋白質をコードすれば、選択可能なマーカーは発現される。次にｃＤＮＡを含む細胞は増殖し、構築物は、単離され特徴化される。他の分析も相互作用している蛋白質を同定するために用いられ得る。このような分析として、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、共免疫沈澱、インビトロ転写／翻訳分析等があげられる。
【００９６】
本発明の別の局面において、選択された分子が免疫系を調節できるか否かを決定するために下記の工程を含む方法が提供される：（ａ）選択された候補分子を、Ｆｋｈｓｆ、または、突然変異株Ｆｋｈｓｆを発現する細胞に曝す工程、および（ｂ）該分子がＦｋｈｓｆの活性を調節できるか否かを決定し、それにより該分子が免疫系を調節できるか否かを決定する工程。このテスト用の細胞は、（ａ）正常のリンパ球、（ｂ）ＦＫＨｓｆ（またはＦｋｈｓｆ）蛋白質（またはその突然変異形態）を過剰発現するよう設計した細胞株、または（ｃ）該蛋白質を発現するよう設計したトランスジェニック動物から誘導され得る。このようなトランスジェニックマウスからの細胞は、一部は、細胞数の減少および色々な刺激に対する応答性の減少を含む低応答性状態にあることで特徴付けられる（例えば、実施例 ８）。
【００９７】
本明細書中で記載される方法は、個別の試験分子の分析をいい得、本発明をそう制限すべきではないことに留意すべきである。特に、選択された分子は、化合物の混合物に含まれ得る。従って、記載された方法は、更に希望の分子を単離する工程を含み得る。また、候補分子は、例えば、Ｔ−細胞増殖、サイトカイン生産等を含む多数のパラメーターにより免疫系を調節できる能力について評価され得る。
【００９８】
候補分子
広汎なバラエティの分子は、その免疫系を調節する能力について分析され得る。以下でさらに詳細に議論される代表例、有機分子、蛋白質またはペプチド、および核酸分子が挙げられる。
【００９９】
１．有機分子
多数の有機分子は、その免疫系を調節する能力について分析され得る。例えば、本発明の一実施形態において、適切な有機分子は、化学品を個別に分析する化学ライブラリー、または複数の化合物を一度に分析し、次いで、最も活性な化合物を決定し、単離するようにデコンボレーションされるコンビナトリアル化学ライブラリーのいずれかから選択され得る。
【０１００】
このようなコンビナトリアル化学ライブラリーの代表例として下記に記載のものが挙げられる：Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｄｅｓｉｒｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”米国特許５，４６３，５６４； Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，”ＷＯ９５／０２５６６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ，” ＷＯ９５／２４１８６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ ｌｉｂｒａｒｙ，” ＷＯ９５／３０６４２； Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，“Ｎｅｗ ｋｉｔ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” ＷＯ９５／１６９１８； Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，” ＷＯ９５／１６７１２； Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，“Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ，” 米国特許５，２８８，５１４； Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” ＷＯ９５／１６２０９； Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” ＷＯ９３／２０２４２； Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌｉｂｒａｒｙ，” ＷＯ９５／０４２７７； Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｄ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ，“Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ，” 米国特許５，５０６，３３７； Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓ，Ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，” ＷＯ９６／００１４８； Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｂ．ａｎｄ Ｇ．Ｐ．Ｗｅｉ，“Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ，” Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７：４８８７−９０，１９９６； Ｒｕｈｌａｎｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ β−Ｌａｃｔａｍｓ，” Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３−５４，１９９６； Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ４−Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” Ｂｉｏｏｒｇ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：７０７−１２，１９９６。
【０１０１】
２．蛋白質およびペプチド
広汎な蛋白質およびペプチドは、免疫系を調節するために候補分子と同様にに用いられる。
【０１０２】
ａ．組み合わせペプチドライブラリー
免疫系を調節するペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを経て得られ得る。このようなライブラリーは当業者により調製され得るか（例えば、米国特許４，５２８，２６６および４，３５９，５３５，およびＰａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＷＯ ９２／１５６７９，ＷＯ ９２／１５６７７，ＷＯ ９０／０７８６２，ＷＯ ９０／０２８０９を参照のこと）、または販売元から購入され得る（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ）。
【０１０３】
ｂ．抗体
免疫系を調節する抗体は、本明細書中の開示を考慮して容易に製造され得る。本発明において、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、アンチイデオタイプ抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ可変領域、または相補性決定領域）を含むことが理解される。上記の通り、抗体は１０７Ｍ以上、好ましくは１０８Ｍ以上のＫａで結合した場合、Ｆｋｈｓｆに対して特異的であると理解される。モノクロナール抗体または結合パートナーの親和性、および結合の阻害は、当業者により容易に決定できる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−７２，１９４９）。
【０１０４】
要するに、ポリクロナール抗体は、当業者により色々な温血動物、例えば馬、牛、色々な鳥、兎、マウス、またはラットから容易に産生され得る。通常、Ｆｋｈｓｆ、またはそのユニークな１３−２０アミノ酸のペプチド（好ましくはグルタルアルデヒドとの架橋によりキーホールリンペットヘモシアニンに接合する）を用いて、例えば、フロインド完全または不完全アジュバント等と共に腹腔内、筋肉内、眼内、または皮下注射で動物を免疫させる。若干の追加免疫後、血漿のサンプルを集めて蛋白質またはペプチドに対する反応性をテストする。特に好ましいポリクロナール抗血清は、これらの分析の一つにおいてバックグラウンドよりも少なくとも三倍大きいシグナルを与えた。一旦、動物の力価において、蛋白質に対する反応性についてプラトーに達したら、毎週の採血または全採血のいずれかにより大量の抗血清が容易に得られ得る。
【０１０５】
モノクロナール抗体は伝統的な技術を用いても容易に産生され得る（米国特許ＲＥ ３
２，０１１， ４，９０２，６１４， ４，５４３，４３９，および４，４１１，９９３これは本明細書中で参考として援用される； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ （ｅｄｓ．），１９８０，およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）。
【０１０６】
他の技術もモノクロナール抗体を構築するために用いられる（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８９を参照のこと； Ｌ．Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８−３２，１９８９年８月； Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，” Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９，１９９０年１月）。
【０１０７】
広汎なバラエティの分析が、Ｆｋｈｓｆ（または本明細書中で上記のＦｋｈｓｆの突然変異形態）に対して反応性である抗体の存在を決定するのに利用され得る、例えば、逆電流免疫電気泳動、放射免疫検定法、放射免疫沈澱、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット分析、ウエスタンブロット、免疫沈澱、阻害分析または競合分析、およびサンドイッチ分析（米国特許４，３７６，１１０および４，４８６，５３０； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照のこと）。
【０１０８】
適切な抗体が一旦得られると、この抗体は、当業者に周知の多くの技術により単離または精製され得る（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照のこと）。適切な技術として、ペプチドまたは蛋白質親和性カラム、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの精製、またはこれらの技術のいずれの併用が挙げられる。
【０１０９】
本発明の抗体は、免疫系の調節のみならず、診断テスト（例えば、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ蛋白質またはペプチドの存在の決定）、治療目的、または蛋白質の精製にも用いられ得る。
【０１１０】
ｃ．突然変異体Ｆｋｈｓｆ
本明細書中および下記の実施例で述べる通り、Ｆｋｈｓｆの改変されたバージョンは、Ｆｋｈｓｆの正常な活性を抑制するのに利用され得、それにより、免疫系を調節する（一般に、上記核酸分子および蛋白質を参照）。
【０１１１】
さらに、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆの突然変異体または改変された形態は、広汎なバラエティのインビトロでの分析（例えば、色々なモデルにおけるこのような蛋白質の効果を検査するため）、または抗体の開発のために利用される。
【０１１２】
３．核酸分子
本発明の他の局面では、免疫系を調節できる核酸分子を提供する。例えば、一つの実施形態において、特にＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ核酸配列、または突然変異体ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆの発現を抑制するアンチセンス オリゴヌクレオチド分子を提供する（一般に、Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ： Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ （Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ ａｎｄ Ｂ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ，ｅｄｓ．１９８７ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐ．４０１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，ｅｄ．，１９８９ ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）； Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４−１２，１９９３； ＷＯ ９５／１０６０７； 米国特許５，３５９，０５１； ＷＯ ９２／０６６９３；およびＥＰ−Ａ２−６１２８４４を参照のこと）。要するに、このような分子は、転写されたＦｋｈｓｆ ｍＲＮＡ配列の領域を有するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対に相補的で、且つＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成できるように構築される。得られた二本鎖核酸はｍＲＮＡの次のプロセシングと干渉し、蛋白質の合成を阻止する。
【０１１３】
本発明の他の局面において、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ、または突然変異型ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆを抑制できるリボザイムを提供する。本明細書中で用いる場合、「リボザイム」とは特異認識のアンチセンス配列、およびＲＮＡ−切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むことを意図する。この触媒鎖は、より高い化学量論の濃度で目標ＲＮＡ中の特定の部位を切断する。本発明において、広汎なバラエティのリボザイムが利用され得る、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ ４８：２１１−２０，１９８７；Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５９６−６００，１９８８；Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｂｒｕｅｎｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：１９６，１９８８；Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５，１９８８により記載される）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．米国特許５，２５４，６７８，１９９３年１０月１９日発行およびＨｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．欧州特許公報０ ３６０ ２５７，１９９０年３月２６日発行）；およびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボソームＲＮＡベースのリボザイム（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許４，９８７，０７１）。本発明のリボザイムは、通常ＲＮＡからなる、ただしＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からも構成され得る。
【０１１４】
４．ラベル
ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ、（およびその突然変異型）、または、上記および下記いずれの候補分子は、例えば、蛍光分子、トキシン、および放射性核種等の色々な化合物でラベル付けができる。蛍光分子の代表的な例として、フルオレセイン、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉ蛋白質、例えば、フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびルシフェラーゼが挙げられる。トキシンの代表的な例として、リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａトキシン、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡが挙げられる。放射性核種の代表的な例として、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１２が挙げられる。なお、上記の抗体は、リガンド結合対の１パートナーもラベル付けまたは結合体化できる。代表的な例として、アビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合蛋白質が挙げられる。
【０１１５】
本明細書中に記載される分子を、上記の代表的なラベルと結合体化または上記の代表的なラベルでラベル付けする方法は、当該業者により容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許４，７４４，９８１；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許５，１０６，９５１；Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、米国特許４，０１８，８８４；Ｍｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、米国特許４，８９７，２５５；およびＭｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、米国特許４，９８８，４９６を参照のこと；Ｉｎｍａｎ，Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３４，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７４，ｐ．３０もまた参照のこと；Ｗｉｌｃｈｅｋ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ，「Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２，１９８８もまた参照のこと）。
【０１１６】
医薬組成物
上記の通り、本発明は、色々な医薬組成物も提供する、それには、免疫系を調節する一つの上記の分子および薬学上または生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤が含まれる。一般に、このような担体は、使用する投与量と濃度でレシピエントに無毒であるべきである。通常、このような組成物の調製は、治療剤に緩衝剤、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、炭水化物（ブドウ糖、ショ糖またはデキストリン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、グルタチオンおよび他の安定剤および賦形剤を配合する。中性緩衝化生理食塩水または非特異的血漿アルブミンと混合した生理食塩水は適切な希釈剤である。好ましくは、医薬組成物（または「医薬品」）を消毒して、無発熱性物質の型で提供する。
【０１１７】
なお、本発明の医薬組成物は、色々な異なるルートによる投与のために調製され得る。また、本発明の医薬組成物は、そのような医薬組成物の使用に関する指示書を提供する包装材料と共に容器に入れ得る。一般に、このような指示書には、薬剤濃度を記載した具体的な表記、特定の実施形態では、医薬組成物の再構築に必要とされ得る相対量の賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）が含まれている。
【０１１８】
治療の方法
本発明はまた、免疫系を調節する方法を提供する。この免疫系を調節する本明細書中に記載される分子を使用することにより、温血動物における広汎なバラエティの状態を容易に治療または予防できる。治療され得る温血動物の実例は、脊椎動物と哺乳類の両方を含み、例えば、ヒト、馬、牛、豚、羊、犬、猫、ラットおよびマウスが挙げられる。このような方法は、変化した免疫系を有する患者において治療価値を有し得る。これには色々な免疫不全症候群を有する化学治療を受けてる患者、およびＴ細胞が媒介した自己免疫疾患を有する患者が含まれる。治療価値はまた、ワクチンアジュバントとしての有用性から認識され得る。
【０１１９】
分子の型に依存する治療分子は、色々な処方で色々なルートを介して投与され得る。例えば、一つの実施形態として有機分子を経口ルートまたは経鼻ルート、または注射（例えば、筋肉内、静脈内等）で投与される。
【０１２０】
１つの局面において、免疫系を調節する方法を提供する、それには、リンパ系細胞に免疫系を調節する分子の発現を指向するベクターを導入し、そのベクターを含む細胞を温血動物に投与する工程を包含する。他の関連する実施形態には、そのベクターは希望の目標部位（例えば、骨髄）に直接投与される。
【０１２１】
このような治療目的にウイルスベクターおよび非ウイルス ベクターの両方を含む広汎なバラエティのベクターを利用できる。適切なウイルス ベクターの代表的な例として、疱疹ウイルス ベクター（例えば、米国特許５，２８８，６４１）、アデノウイルスベクター（例えば、ＷＯ ９４／２６９１４、ＷＯ ９３／９１９１ ＷＯ ９９／２０７７８；ＷＯ ９９／２０７７３；ＷＯ ９９／２０７７９；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９１（１）：２１５−１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９０（２４）：１１４９８−５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（６）：２８３８−４８，１９９３；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−０７，１９９３；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７５（２）：２０７−１６，１９９３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−０９，１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−９１，１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−３４，１９９３；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−７８，１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０１（２）：１９５−２０２，１９９１）、アデノ随伴ウイルスベクター（ＷＯ ９５／１３３６５；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−６３，１９９４）、ポックスウイルスベクター（Ｐａｎｉｃａｌｉ ａｎｄ Ｐａｏｌｅｔｔｉ，ＰＮＡＳ ７９：４９２７−３１，１９８２；およびＯｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６０，１９９３）、およびレトロウイルス（例えば、ＥＰ ０，４１５，７３１；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９１／０２８５、ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ ９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；米国特許５，２１９，７４０；ＷＯ ９３／１１２３０；ＷＯ ９３／１０２１８）が挙げられる。異なるウイルスまたは非ウイルス供与源由来の異なる構成成分（例えば、プロモーター、エンベロープ配列等）の混合物を含むウイルスベクターも同じく構築される。色々な実施形態において、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子を下記の方法および組成物に利用できる。
【０１２２】
本発明の他の実施形態において、免疫系を調節する分子をコードする核酸分子（例えば、突然変異体 Ｆｋｈｓｆ、またはＦｋｈｓｆを切断するアンチセンスまたはリボザイム分子）は色々な代替技術で投与できる、例えば、ポリ−Ｌ−リシンＤＮＡ複合体と結合体化したアジアルーソムコイド（ＡＳＯＲ）（Ｃｒｉｓｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９２１２２−１２６，１９９３）、死菌アデノウイルスに連結されたＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−５４，１９９２）、サイトフェクチン−媒介導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ，Ｖｉｃａｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、直接ＤＮＡ注射（Ａｃｓａｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−１８，１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−９８７，１９８９）；リポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−１７，１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ．８９（１）：１３−２１，１９９４；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８４：７８５１−５５，１９８７）；微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８８：２７２６−３０，１９９１）；および蛋白質自体をいずれか単独でコードする核酸の直接送達（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−６４，１９９３）、またはＰＥＧ−核酸複合体を利用する送達が挙げられる。
【０１２３】
本発明のベクターにより発現され得る分子の代表的な例は、リボザイムおよびアンチセンス分子が挙げられる、いずれも上記に詳しく討論されている。
【０１２４】
当該業者に明白となるように、投与の量と頻度は当然、患者の処置されるべき症状の性質および重篤度、希望する反応、状態等のような因子に依存する。通常、組成物は上記の通り色々な技術で投与され得る。
【０１２５】
以下の実施例は説明の為であり、限定するものではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
Ｓｃｕｒｆｙ 突然変異に応答する遺伝子の同定
Ａ．Ｓｃｕｒｆｙ遺伝子のクローニング
オリジナルのｓｃｕｒｆｙ突然変異は、１９４９年にＯａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＲＮＬ）に寄託した部分的近交系のＭＲにて自然発生させた。戻し交雑分析をマウスＳｃｕｒｆｙ突然変異を含むＸ染色体の原動体周囲領域をファインマップするために用いた。同じ領域をカバーする実質的地図は、重なる酵母と細菌の人工染色体（ＹＡＣｓおよびＢＡＣｓ）の単離を経て同時に産生させた。候補領域は一旦、約５００キロ塩基対（ｋｂ）以下に狭まると、大規模のＤＮＡシークエンシングを、４つの重複ＢＡＣクローンで行う。この５００ｋｂ領域における全ての転写ユニットは、配列データベース検索とコンピュータエクソン予測プログラムの適用の組み合わせを経て同定された。次に候補遺伝子は、正常およびＳｃｕｒｆｙ−誘導ＲＮＡサンプルより、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手法で得られｃＤＮＡｓの配列を比較しＳｃｕｒｆｙ−特異突然変異をスクリーンした。一つの遺伝子（本明細書中でＦｋｈｓｆと呼ばれる）において、正常ｃＤＮＡに対し二つの塩基対（ｂｐ）挿入がＳｃｕｒｆｙ ｃＤＮＡのコード領域に見られた。Ｓｃｕｒｆｙ突然変異を含むいくつかのマウス系のゲノムＤＮＡから誘導されたＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を比較することにより、挿入が確認された。また、２ｂｐの挿入はＳｃｕｒｆｙサンプルのみにしか見られなかった、これをＳｃｕｒｆｙ欠損の可能な原因と確証した。
【０１２７】
マウスＦｋｈｓｆ遺伝子は、ＢＡＣクローン８Ｃ２２に含まれ、完全に配列決定されている。それは約１４ｋｂに及び、１１のコードエクソンを含む。エクソン ブレークの位置は、最初にＧｅｎＳｃａｎエクソン予測プログラムを用いて、ゲノムＤＮＡ配列のコンピュータ分析により同定され、次にエクソン位置は、正常マウス組織から誘導されたｃＤＮＡ配列とゲノム配列とを直接比較することにより確認した。
【０１２８】
得られたｃＤＮＡの長さは２１６０ ｂｐであり、コード領域は１２８７ｂｐに及び、これは４２９のアミノ酸の蛋白質をコードする。図１はマウスＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す、翻訳は、２５９位で始まり、１５４６位で終わると予測する。図２は、マウスＦｋｈｓｆのアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
Ｂ．Ｆｋｈｓｆトランスジェニックマウスの産生 Ｓｃｕｒｆｙ表現型の本当の原因としてのＦｋｈｓｆ遺伝子の正体を、トランスジェニックマウスにて確認した。要するに、Ｆｋｈｓｆ遺伝子の約７ｋｂコード領域、および上流の隣接配列の約２０ｋｂおよび下流配列の約４ｋｂを含む正常ゲノムＤＮＡの３０ｋｂ断片（図５）を正常マウスの単一細胞胚に微量注射した。それぞれ区別可能な組込みを有する五匹の個別の創始動物を産生し、各トランスジェニック系統からの雄の動物を雌のｓｆキャリアと交配した。導入遺伝子（正常 Ｆｋｈｓｆ）およびｓｆ突然変異（突然変異体 Ｆｋｈｓｆ）の両方を有する雄の後代を分析した。
【０１３０】
分析は、ラント症候群、鱗状皮膚、毛不正常性及び他のｓｃｕｒｆｙ表現型のホールマークに対する動物検査からなる。また、リンパ系組織（胸腺、脾臓およびリンパ節）を採集し、その大きさおよび細胞数を検査し、正常動物およびｓｃｕｒｆｙマウスと比較した。全五匹のトランスジェニック系統について、導入遺伝子を有する雄のｓｆ 後代は、大きさと体重が正常であらゆる点において健康である。これらのトランスジェニックマウスにおけるリンパ節サイズは正常動物と類似し（またはより小さい）（図６）、活性化されたＴ細胞の徴候がない。これらのパラメーターはｓｆマウスと極端異なり、正常Ｆｋｈｓｆ遺伝子の付加は、ｓｃｕｒｆｙマウスにおいて見出される欠損を克服することを示し、従って、Ｆｋｈｓｆ 遺伝子における突然変異がＳｃｕｒｆｙ病の原因であることを確認した。
【０１３１】
実施例２
ＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡの生成
完全マウスＦｋｈｓｆ蛋白質をコードする相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手法より得られる。より具体的には、第一鎖ｃＤＮＡを適切な供与源（例えば、マウス脾臓）からの全ＲＮＡ（５μｇ）のオリゴ ｄＴプライミング、および標準条件（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｋｉｔ）下、逆転写酵素用いる伸長によって生成させる。次に第一鎖ｃＤＮＡのアリコートを前方向および逆方向のプライマー（前方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣ ＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣ ＴＴＣ；逆方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡ ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴ ＣＴＧ）（０．２ ｍＭの最終濃度）、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ ｍＭ 硫酸アンモニウム、１．５ ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２ ｍＭ各ｄＮＴＰおよび１単位のＴａｑポリメラーゼの存在下、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃ ３０秒、６３℃ ３０秒、７２℃ ２分）を行う。
【０１３２】
実施例３
マウスＦＫＨｓｆに対するヒトオルソログの生成
完全 ＦＫＨｓｆ蛋白質をコードしたヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡは、実施例２に記載されるのと本質的に同じ手法で得られる。特に、全脾臓ＲＮＡから始め、下記オリゴヌクレオチドプライマー（前方向プライマー：ＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴ ＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡ Ｃ；逆方向プライマー：ＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡ Ｃ）、および６０℃アニーリング温度の他は上記と同じＰＣＲ条件を利用する。
【０１３３】
図３は、今まで得た１８６９ｂｐ ｃＤＮＡ（１２９３ｂｐコード領域を含む）のヌクレオチド配列を示す、翻訳は１８９位で始まり、１４８２位で終わると予測される。図４は、４３１アミノ酸を有するヒトＦＫＨｓｆ 蛋白質の配列を示す。ヒト遺伝子の予測コード領域とマウスｃＤＮＡ配列との比較は、殆ど同じのエクソン構造および全蛋白質にわたって８６．１％ アミノ酸配列同一性を示す。
【０１３４】
実施例４
Ｓｃｕｒｆｙ突然変異を検出する方法
上記の通り、Ｓｃｕｒｆｙ突然変異は、元来ｓｆおよび正常マウスＲＮＡサンプルのＲＴ−ＰＣＲより誘導されたｃＤＮＡを直接シークエンシングすることによって発見され、ゲノムＤＮＡと同じ領域をシークエンシングすることによって確認された。突然変異の性質（即ち２ｂｐの挿入）は、それ自体が多数の異なる突然変異検出分析をさせる。先ずはオリゴヌクレオチドプローブのディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく。このようなハイブリダイゼーション−ベースの分析は、アレイ特異的発現の定量分析を可能にする。
【０１３５】
例として、３６０ ｂｐ ＤＮＡ断片は、下記のオリゴを用いて、第１鎖ｃＤＮＡから増幅される：
ＤＭＯ５９８５（前方向）：ＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧ（図１のヌクレオチド８２５−８４４）
ＤＭＯ６７２４（逆方向）：ＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣ（ヌクレオチド１２２１−１１９９）。
【０１３６】
ＰＣＲ生成物を１．８％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜に転写して、Ｓｃｕｒｆｙ−特異的２ｂｐ挿入部位に対応する領域に相補的である末端ラベル付けオリゴヌクレオチドでプローブする。下記オリゴヌクレオチド（２ｂｐ挿入部位は太線で示した）を用いて２つの別々のハイブリダイゼーション反応を行い、正常なＰＣＲ生成物およびＳｃｕｒｆｙ ＰＣＲ生成物を検出する：
【０１３７】
【化１】
【０１３８】
Ｓｃｕｒｆｙ突然変異は、コールドシングルストランドコンホメーション多型（ｃｏｌｄ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ｃＳＳＣＰ）分析によっても検出され得る。この分析において、上記と同じＰＣＲ生成物を、鎖変性後に、２０％アクリルアミド（ＴＢＥ）ゲルで泳動する。Ｓｃｕｒｆｙ挿入物は、正常配列に対して鎖移動度におけるシフトを起こし、そしてエチジウムブロマイドで染色した後に、別々の鎖が検出される。
【０１３９】
実施例５
ＦＫＨｓｆ遺伝子発現
半定量ＲＴ−ＰＣＲを広汎なバラエティの組織と細胞株におけるマウスおよびヒトＦｋｈｓｆ遺伝子発現のパターンの分析に用いた。発現のレベルは、遍在して発現したＤＡＤ−１遺伝子に正規化される。要するに、Ｆｋｈｓｆ遺伝子は、胸腺、脾臓、分類されたＣＤ４＋とＣＤ４−ＣＤ８− Ｔ−リンパ球、および腎臓、脳、および色々なマウスとヒトのＴ−細胞株およびヒト腫瘍を含む、これまでに検査された殆ど全ての組織において、極低いレベルで発現される。しかし、発現の欠如は、新しく分類されたマウスＢ−細胞に見られた。
【０１４０】
予想通り、ＲＴ−ＰＣＲ分析において、正常組織 対 Ｓｃｕｒｆｙ組織における発現レベルの差は見られなかった。
【０１４１】
実施例６
ＦＫＨｓｆの生体外表現
マウスおよびヒトの全長のＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡ、およびこのｃＤＮＡの色々な小領域を、哺乳類の細胞（例えば、ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ−細胞株）、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母において発現されるベクターにクローン化する。Ｅ．ｃｏｌｉ系または酵母系を、Ｆｋｈｓｆ−特異抗体（下記参照）を惹起するための蛋白質の生産に用い得る。
【０１４２】
実施例７
抗−ＦＫＨｓｆ 抗体の作製
実施例６記載のベクターから発現される蛋白質を、ＦＫＨｓｆ特異抗体の作製のために適当な動物に免疫するために用いる。全長蛋白質または切断された蛋白質のいずれかをこの目的に使う。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、昆虫細胞または哺乳類の細胞から蛋白質が得られる。動物の種類として、マウス、兎、モルモット、ニワトリなどが挙げられる。生化学的特徴付け（免疫沈澱およびウェスタンブロッティング）により測定した場合、ＦＫＨｓｆに特異的な兎抗血清が産生された。
【０１４３】
実施例８
ＦＫＨｓｆ遺伝子の機能の分析
ＦＫＨｓｆ蛋白質の機能の損失がｓｃｕｒｆｙ動物において観察される表現型（衰弱、過剰免疫応答および死亡）を生じるので、ＦＫＨｓｆ蛋白質の過剰表現を評価する分析について述べる。トランスジェニック動物（実施例１に記載）に若干の異なるパラメーターを用いて免疫能の状態を検査する。動物は、リンパ節および胸腺に存在するリンパ系細胞の数（図７）およびＴ細胞のインビトロでの刺激に対する応答性（図８）について検査する。
【０１４４】
Ｓｃｕｒｆｙ突然変異動物は、リンパ節において、正常動物よりも約二倍多い細胞を有するが、過剰なレベルの正常ＦＫＨｓｆ蛋白質を発現したマウスでは約１／３の細胞を含む（図７）。また、胸腺細胞の数は、標準抗血清を用いたフローサイトメトリーにより評価した場合、その細胞表面表現型と同様に（図示してない）、正常であり（図７）、このことは、過剰なＦＫＨｓｆ蛋白質に関係する発生異常がないことを示す。
【０１４５】
さらに、正常な動物、ｓｃｕｒｆｙ動物およびトランスジェニック動物を、Ｔ細胞刺激に対する増殖応答について検査する。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体と反応させ、その増殖応答を放射性チミジン取り込みで測定する。ｓｃｕｒｆｙ細胞のみが刺激なくても分裂するが、正常細胞は刺激後よく応答する。ＦＫＨｓｆトランスジェニック細胞も刺激に応答するが、この応答は正常細胞の応答ほど顕著ではない（図８）。これは、過剰のＦＫＨｓｆを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞が、刺激に応答する能力が低下していることを示す。
【０１４６】
実施例９
ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ配列はＪＭ２に相関する
ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ配列の改変バージョンは、ＧｅｎＢａｎｋ 公共配列データベースに存在する。この配列はＪＭ２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．＃ ＡＪ００５８９１）と称し、エクソン予測プログラムをＦＫＨｓｆ遺伝子を含むゲノム配列に適用した結果である（Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，未公開 ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．＃ ＡＪ００５８９１参照）。これに反し、ＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡの構造は、実験的に決定されている。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ） Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＧＡＰプログラムを、２つの配列の比較に用い、その差異を図９に示す。２つの配列の５’端は、ゲノムＤＮＡ配列内でその位置が異なり、ＦＫＨｓｆの第二コードエクソンはＪＭ２から省略され、ＦＫＨｓｆ遺伝子の最終イントロンは、ＪＭ２ 配列にスプライスされていない。これらの差異は、ＦＫＨｓｆに対してより短いアミノ末端領域を有するＪＭ２蛋白質、およびカルボキシ末端におけるフォークヘッド領域内に大きな挿入物（下記参照）を生じる。
【０１４７】
実施例１０
ＦＫＨｓｆ蛋白質は、種間で保存されている
ＦＫＨｓｆ蛋白質は、機能的ドメインを示し得る配列モチーフに基づき部分領域に分け得る。ＦＫＨｓｆにおける二つの主なモチーフは、蛋白質の中間部分におけるＣ２Ｈ２クラスの単一ジンクフィンガー（ＺＮＦ）、および蛋白質のカルボキシ末端におけるフォークヘッド（または羽付き螺旋）ドメインである。ＦＫＨｓｆと他の蛋白質と間の相同性の程度を特徴付けるため、蛋白質を４領域まで分けた：
アミノ末端ドメイン：図２の残基１−１９７ 図４の残基１−１９８
ジンクフィンガードメイン：図２の残基１９８−２２１ 図４の残基１９９−２２２
中間ドメイン：図２の残基２２２−３３６ 図４の残基２２３−３３６
フォークヘッドドメイン： 図２の残基３３７−４２９ 図４の残基３３７−４３
１。
【０１４８】
ＤＮＡＳｔａｒ配列分析パッケージよりＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを用いて、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを使用して、これらの４ドメインを経たヒトＦＫＨｓｆ蛋白質とマウスＦｋｈｓｆ蛋白質との間の類似性の程度を決定した。結果は図１０に示す。この類似性の指数は８２．８％〜９６．４％の範囲であり、この蛋白質が非常に高く種間で保存されていることを示す。
【０１４９】
実施例１１
新規なＦＫＨｓｆ相関遺伝子の同定
ＦＫＨｓｆ遺伝子配列のユニークな特徴は、フォークヘッド含有分子の同じサブクラスに入る他の新規な遺伝子（および蛋白質）を同定するために用いられ得る。ＦＫＨｓｆ蛋白質は、フォークヘッドドメインのアミノ末端側に単一のジンクフィンガードメインを有すること、および、フォークヘッドドメインのカルボキシ末端にユニークなところがある。縮重ＰＣＲアプローチを、フォークヘッドドメインの上流にジンクフィンガー配列を含む新規な遺伝子を単離するために取り得る。例として、下記縮重プライマーを合成した（縮重の位置を括弧で示し、“Ｉ”はヌクレオシドイノシンを示す）：
順方向プライマー：ＣＡ（ＴＣ）ＧＧＩＧＡ（ＧＡ）ＴＧ（ＣＴ）ＡＡ（ＧＡ）ＴＧＧ
逆方向プライマー：（ＧＡ）ＡＡＣＣＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＧ）ＴＡ（ＡＧＴ）ＡＴ（ＣＴ）ＴＣ（ＧＡ）ＴＴ。
【０１５０】
順方向プライマーはジンクフィンガー配列内の領域に対応し、逆方向プライマーはフォークヘッドドメインの中間の領域に対応する。これらのプライマーを、色々なヒト組織（肝臓、脾臓、脳、肺、腎臓等を含む）から実施例２のように生成された第一鎖ｃＤＮＡを増幅するために用いた。下記ＰＣＲ条件が用いられた：最終濃度０．２ｍＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭ 硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰおよび１単位のＴａｑ重合酵素を、３５サイクル（９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ２分）に供した。ＰＣＲ生成物を、１．８％アガロースゲル（１×ＴＡＥ中で泳動）上で可視化し、ＴＡクローニンベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した、個別のクローンを配列決定し、全長ｃＤＮＡを更に特徴付けするために用いた。
【０１５１】
あるいは、ＦＫＨｓｆ遺伝子のユニーク領域（即ち、“アミノ末端”ドメインおよび“中間”ドメイン）は、ハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために用い得る。色々なヒト組織および／またはマウス組織から誘導され、λファージベクター（例えば、λｇｔ１１）中で増殖されたｃＤＮＡライブラリを、アガロースにプレートして、溶菌斑をナイロン膜に移し、ＦＫＨｓｆ遺伝子のユニーク領域から誘導された断片でプローブした。高ストリンジェンシー条件（例えば、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ中６５℃でのハイブリダイゼーション、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ中６５℃での洗浄）下、極近く相関する配列だけハイブリッド形成が期待される（即ち、９０−１００％相同性）。低ストリンジェンシー下、例えば４５℃〜５５℃にて上記と同じ緩衝剤中でのハイブリダイゼーションおよび洗浄では、ＦＫＨｓｆに関する遺伝子（６５−９０％相同性）を同定し得る。ＦＫＨｓｆのユニーク配列で公共データベースを検索して得られた結果に基づき、低〜中度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション実験を経て同定されたいずれの遺伝子も、“ＦＫＨｓｆファミリー”の新規なメンバーを代表することが期待される。
【０１５２】
実施例１２
野生型Ｆｏｘｐ３遺伝子の過剰発現は末梢Ｔ細胞数を減少する結果になる
ｓｃｕｒｆｙマウスのオリジンナル育種系統を、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＲＮＬ）から得、その後、帝王切開によりＳＰＦ条件へと誘導した。トランスジェニックマウスを、ＤＮＸ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）による卵母細胞マイクロインジェクションにより産生した（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。２８２６マウス系について、３０．８ｋｂコスミド構築物を、注入のためにマウスＢＡＣ Ｋ６０から産生した。このコスミドは、５’配列の約１８ｋｂｐおよび３’配列の４ｋｂｐと共に全Ｆｏｘｐ３遺伝子が含まれている。遺伝子の発現は組織分布に関して内在性遺伝子の発現と平行である（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。ｌｃｋ−Ｆｏｘｐ３トランスジェニック動物を、発現を駆動するｌｃｋプロモーターを用いて産生した（Ｇａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２（２）：１７３，１９９０）。全ての研究に、トランスジェニックマウスおよびｓｃｕｒｆｙマウスの両方をＣ５７Ｂ１／６バックグランド（ＪＡＸ）に４−６世代戻し交雑した。戻し交雑の際、応答性または表現型の差異は見られなかった。ノーザンブロット分析を、以前に記載されたように行った（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。
【０１５３】
Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスに関わる最初の実験は、分別可能な初代動物から生成した５／５系において、野生型Ｆｏｘｐ３導入遺伝子の発現がｓｆ／Ｙ変異株マウスにて疾患を予防することを示した（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。更なる分析は、導入遺伝子のコピー数が、ｍＲＮＡレベルにおける遺伝子の発現と直接相関することを示す（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。これは導入遺伝子構築物が５’配列の実質部分および多くの調節性領域を含む大ゲノム断片よりなった事実が原因であろう。色々なトランスジェニック系を分析すると、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現とリンパ節細胞数との間に直接関係があったことも明らかになる（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。導入遺伝子のコピー数と細胞数との間の関係が、初代のうちの３つについて示され、ｓｃｕｒｆｙ変異株動物（ｓｆ／Ｙ）と正常同腹子対照（ＮＬＣ）を比較した（下記表１参照）。トランスジェニック（２８２６系，１２９２系および２８２８系）、正常同腹子対照およびｓｃｕｒｆｙ変異株（ｓｆ／Ｙ）マウスからのリンパ性細胞数を、齢が一致した（４週齢）代表的なマウスからの色々な組織で決定した。およその導入遺伝子コピー数を、サザンブロット分析により決定し、これは、Ｆｏｘｐ３遺伝子発現とよく相関した（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。トランスジェニックマウスの脾臓細胞数には劇的でないが一致した差異が存在するが、胸腺細胞数は、顕著には影響されていない。特に注してない限り、簡略のため、残りの実験に２８２６トランスジェニック系を用いた。この系からの動物は一般に健康でＳＰＦ条件下で一年より長く生存する。その系は約１６コピーの導入遺伝子があり、ノーザンブロット分析は、リンパ系組織の内在性遺伝子のレベルの１０−２０倍で表された（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。導入遺伝子は、内在性遺伝子のように、非リンパ系組織にて僅かしか発現せず、これはおそらく、その内在性プロモーターの制御下での発現の結果である。この系からのマウスにおけるリンパ節細胞数は正常の１５−５０％で、年齢につれて細胞数が蓄積する。脾臓細胞数はあまり激変しないが、一般に減少して、正常の２５−９０％である。
【０１５４】
【表１】
【０１５５】
実施例１３
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウスの胸腺表現型
胸腺選択におけるＦｏｘｐ３遺伝子の役目は未だ不明である。スーパー抗原特異的Ｖβ保有胸腺細胞の欠失は、ｓｆ／Ｙトランスジェニックマウスおよび２８２６トランスジェニックマウス共に正常のようである。これと一致して、それ自体の内在性プロモーターを用いたＦｏｘｐ３遺伝子の過剰発現（２８２６系）も胸腺の発育または選択における如何なる明白な変化も見られない。主な表現型サブセット中の胸腺細胞の数（表Ｉ）およびその分布は、同腹子対照動物と区別できない。胸腺組織、リンパ節組織および脾臓組織を上記のように集め（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：２５４６，１９９９）、染色緩衝剤（１％ ＢＳＡ、０．１％ アジ化ナトリウム／ＰＢＳ）で細胞密度２０×１０６／ｍＬに再懸濁した。細胞アリコートを２％正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ）で処理して非特異結合を遮断してから、下記フルオロクロム結合体化抗マウスモノクロナール抗体（ｍＡｂ）：ＣＤ３、ＣＤ８β、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＩｇＧ２ａ対照（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）；ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９５（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の併合剤で氷の上で３０分間インキュベートすることによって染色した。約１０５細胞の蛍光強度をＭｏＦｌｏＴＭフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）によりヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ）を加えて死亡細胞を排除して検査した。
【０１５６】
ＣＤ４−８−サブセットの更に詳しい検査は、γ−δ細胞およびＣＤ２５＋細胞の正常分布も示す。重要なことは、成熟マーカーＣＤ６９およびＨＳＡを発現するＣＤ４＋８−胸腺細胞の画分は２８２６および対照動物にて同じであり、成熟プロセスが正常であることを示唆する。
【０１５７】
胸腺単独におけるＦｏｘｐ３遺伝子の過剰発現は、上記２８２６マウスからの顕著に異なる表現型を有する。ｌｃｋ近位プロモーターの制御下で胸腺においてＦｏｘｐ３選択的発現するトランスジェニックマウス（１６．５および８．３）を、ｓｆ／＋キャリア雌と交配させた。胸腺特異導入遺伝子を持つ雄ｓｃｕｒｆｙマウス（ｓｆ／Ｙ）（１６．５および８．３）は、非トランスジェニック同腹子と同じ時間および同じ方式で疾患に負ける。その内在性調節性配列の制御下でＦｏｘｐ３を発現するＳｆ／Ｙトランスジェニック動物（２８２６）は疾患に負けた。細胞数は、野生型Ｆｏｘｐ３遺伝子に加えて導入遺伝子を持ったマウスから誘導される。
【０１５８】
胸腺のみに（ｌｃｋ近位プロモーターの制御下で）Ｆｏｘｐ３遺伝子を発現するトランスジェニック動物は、ｓｆ／Ｙマウスを疾患から助けられない（下記表２参照）。２匹別々の初代動物を、疾患を防止するためにｓｃｕｒｆｙキャリア雌と交配させた。いずれの場合においても、ｌｃｋ近位プロモーター−Ｆｏｘｐ３導入遺伝子を持つｓｆ／Ｙマウスは急性リンパ増殖性疾患を発症し、重篤度および時間経過において非トランスジェニックｓｆ／Ｙ兄弟と同じであった。いずれの場合においても、導入遺伝子の発現は、胸腺に限られ、脾臓を含む末梢器官にて検出できる発現がなかった。ノーザンブロット分析を実施例１と同じく行った。さらに、ｌｃｋに駆動される導入遺伝子の胸腺発現は、実質的に２８２６トランスジェニック動物でのその遺伝子または正常同腹子対照マウスにおける内在性遺伝子より大きかった。従って、ｓｆ／Ｙマウスに見られる致命性リンパ増殖性疾患は、胸腺におけるｓｃｕｒｆｉｎ媒介の発育欠損の結果として生じない。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
ｌｃｋに駆動される導入遺伝子を保有するトランスジェニック（非ｓｆ）動物は、一般に正常に見えるが、胸腺における導入遺伝子の高度発現は、正常（非ｓｆ）動物にて表現型の結果を有さない。導入遺伝子の発現が顕著に増加した以外は正常なマウスは、二重ポジティブ胸腺細胞％が相対的に減少して、二重ネガティブ（ＤＮ）細胞％が対応して増加し、全胸腺細胞数の減少を来たす（表２参照）。Ｔ細胞発生は、これらの動物にも発生する、それはＣＤ４単ポジティブ細胞およびＣＤ８単ポジティブ細胞の生成、およびリンパ節と脾臓との両方に比較的正常数の末梢Ｔ細胞が存在することにより評価される（表２参照）。胸腺由来のＣＤ４＋８−細胞におけるＣＤ６９発現は、トランスジェニック同腹子および野生型同腹子に類似し、ポジティブ選択がおそらく正常に進行することを示唆するが、ＤＮ区画内では、ＣＤ２５を発現する細胞の画分は野生型動物と比較して減少される。これらのトランスジェニック動物は、胸腺区画内でのＦｏｘｐ３遺伝子の過剰発現が特に胸腺発生を変化し得るが、末梢Ｔ細胞活性の調節に影響はないようであることを示す。
【０１６１】
実施例１４
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウス由来の末梢Ｔ細胞の変化した表現型
２８２６マウスにおける末梢Ｔ細胞数の減少に加えて、ＮＬＣに対するリンパ節および脾臓の両方におけるＣＤ４＋８−細胞％のわずかな減少がある。ＣＤ３レベルは、末梢Ｔ細胞にて正常であるようであるが、変化された発現レベルを有する複数の他の表面マーカーがある。トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４＋８−細胞について、最も一致する変化は、ＣＤ６２ＬとＣＤ４５ＲＢの発現の小さな減少およびＣＤ９５の発現の増加である。比較すると、ｓｆ変異株動物由来の細胞に甚だ異なる表現型がある。これらのマウス由来のＣＤ４＋８−細胞は、大きく、そして明確に活性化されている。それらは主にＣＤ４４Ｈ１、ＣＤ４５ＲＢＬＯ、ＣＤ６２ＬＬＯであり、部分的にＣＤ６９＋である（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：２５４６）。
【０１６２】
ＣＤ４−８＋細胞数は、ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウスの脾臓およびリンパ節の両方でも減少した。この減少は、代表的には、ＣＤ４＋８−区画における減少（２５−５０％）より激烈である（５０−７５％）。ＣＤ４−８＋Ｔ細胞は、ＮＬＣと比較して細胞表面におけるＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ９５のレベルにおいて、比較的少数の様様な変化を呈する。ＣＤ４＋８−Ｔ細胞とは対照的に、ＣＤ４４ＨＩでもあったＣＤ４−８＋Ｔ細胞の％はより顕著に増加する。全体から言えば、ＣＤ４−Ｓ＋細胞は、かれらを特にナイーブ、活性化または記憶であると特徴付けるレベルで表面マーカーを発現しない。
【０１６３】
実施例１５
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウスの組織学分析
２８２６マウスにおける末梢Ｔ細胞は明らかに減少するが、リンパ系器官の構造も混乱したかの決定を行った。主なリンパ系器官（胸腺、リンパ節および脾臓）の組織学検査は、最も顕著な変化は、腸間膜リンパ節および末梢リンパ節に見られることを示した。組織学分析用の組織を生後約８週齢のマウスから摘出し、緩衝された１０％ホルマリンに直ちに固定した。パラフィン包埋片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色処理して、代表的マウスにて組織病理学比較を行った。期待通り、胸腺は比較的正常のようであり、胸腺髄質の大きさがやや減少するが、十分確定された皮質−髄質接合部がある。トランスジェニック動物は、より小さい末梢リンパ節を有し、強く正常に分布したリンパ小節が欠け、小節と小節間区域との間に鮮明な縁が欠け、正常同腹子対照マウスのリンパ節に見られるものより明らかな空洞がある。脾臓およびパイエル板の大きさおよび微小構造がほぼ正常であるようであると言えども、全細胞数は緩やかに減少し、これらの組織の胚中心の証明がないかまたは少ない。ここで、注目された変化は、リンパ節に発育がない複数の他の目標変異と区別できる細胞下（ｈｙｐｏｃｅｌｌｕｌａｒ）状態を反映する。従って、Ｔ細胞は明らかに正常な方式で発育できるが、その末梢リンパ性組織内の代表、特にリンパ節は、実質的に減少している。
【０１６４】
実施例１６
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウス由来のＣＤ４＋８−細胞の減少された機能応答
表現型データおよび細胞数データは、２８２６トランスジェニック動物由来のＣＤ４Ｔ細胞に生物学的に特異的欠損があることを示唆する。これらの動物由来のＴ細胞の、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を含むいくつかの刺激に対する機能応答を評価した。ＮＬＣ、２８２６トランスジェニックマウスまたはｓｃｕｒｆｙ（変異株）マウスの色々な組織からリンパ球を単離して、ＣＤ４細胞を細胞選別により精製した。胸腺、リンパ節および脾臓組織を適切な動物から摘出して、無菌顕微鏡スライド間で柔らかくし、無菌７０μｍナイロンメッシュを通して濾過し、遠心分離で集めた。これらの組織から、ＭｏＦｌｏを用いたポジティブ選択でＣＤ４＋Ｔリンパ球を選別精製した。選別後分析で決定した選別純度は、通常９５％より高い。細胞の培養は、３７℃の完全ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）（１０％ ウシ胎仔血清、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、それぞれ１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよびグルタミン）を用いて９６ウェル丸底組織培養プレートにて行った。培養ウェルは、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）に対する指定濃度の精製抗体とともに無菌ＰＢＳ中で４時間３７℃でプレインキュベーションすることにより、Ｔ細胞活性化のため調製した。精製α−マウスＣＤ２８（クローン３７．５１）またはα−マウスＫＬＨ（対照抗体）を、１μｇ／ｍｌ最終濃度で共固定した。
【０１６５】
Ｔ細胞を、細胞密度１×１０４〜５×１０４細胞／ウェルで２００μＬ ｃＲＰＭＩ中にて７２時間培養した。上澄み（１００μｌ）を、４８時間目にサイトカイン生産の分析のため摘出した。ウェルを、培養の最後の８−１２時間に１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）でパルスしてから回収した（Ｔｏｍｔｅｃ）。報告した増殖データは、三連ウェルの平均値に基づき、少なくとも３実験の値を代表する。サイトカインのレベルは、製造業者の指示（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）に従いＥＬＩＳＡ分析で測定した。
【０１６６】
増殖およびＩＬ−２生産の試験のために、Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞の単一細胞懸濁液を産生し、刺激因子細胞として使用した。これらの細胞を照射（３３００ｒａｄ）し、そしてｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニック脾臓細胞またはＮＬＣ脾臓細胞と１０：１（刺激因子：エフェクター）でインキュベートした。若干の培養には、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌ加えた。増殖分析には、５日後に細胞を上記のようにパルスしそして回収した。トランスジェニック動物由来の細胞において、その同腹子に比べ、増殖およびＩＬ−２生産の両方が顕著に減少した。トランスジェニック動物は、刺激増加につれて応答性が増加するが、ＮＬＣにより達成されるレベルには滅多に達さなかった。これは、２８２６マウス由来の細胞が低量〜検出できない量のこのサイトカインを生成するＩＬ−２生産では、特にあてはまる。類似の結果が、細胞が脾臓またはリンパ節から誘導された場合に見られた。
【０１６７】
期待通り、ｓｃｕｒｆｙ動物の細胞は、刺激に過剰応答性であった。そしてこの細胞は、増加した量のＩＬ−２を生成する。導入遺伝子効果は、系と独立しており、少なくとも世代Ｎ６を経てＣ５７Ｂｌ／６に至る動物の戻し交雑の間にて維持された。この分析ではトランスジェニックマウスのＴ細胞は抗ＣＤ２８に対して応答性のままであったが、抗ＣＤ３および対照Ｉｇでの刺激は、一般に応答が貧弱で、ＮＬＣ応答より低かったが類似した。ＩＬ−２の高使用量の添加は、２８２６マウスのＣＤ４＋８−Ｔ細胞の増殖欠損を部分的に克服できるが、一般に野生型動物に対する応答を回復できない。
【０１６８】
末梢Ｔ細胞とは対照的であるが上記表現型データと一致して、胸腺ＣＤ４＋８−細胞の増殖応答は、トランスジェニックマウスとＮＬＣマウスとの間でほぼ比敵する。しかし、胸腺ＣＤ４＋８−細胞によるＩＬ−２生産は、トランスジェニック動物から実質的に減少する。胸腺細胞によるＩＬ−２生産の減少は、リンパ節または脾臓にて見られるものよりいくらか変化があり、生産されたＩＬ−２は培養中に消費もされることを示唆し得る。あるいは、胸腺細胞は、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現によってあまり影響されない他の成長因子を生産し得る。それにもかかわらず、このデータは、一般に、トランスジェニック動物の主な欠損は胸腺および末梢Ｔ細胞にＩＬ−２を生産させる能力にあるという結論を支持する。
【０１６９】
実施例１７
ＳｃｕｒｆｉｎトランスジェニックＣＤ４−８＋Ｔ細胞の変化した機能応答
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）として産生および機能するトランスジェニックＴ細胞の能力を生体外の分析で測定した。Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞の単一細胞懸濁液を産生し、刺激因子細胞として使用した。これらの細胞を照射（３３００ｒａｄ）して、ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニック脾臓細胞またはＮＬＣ脾臓細胞と１０：１（刺激因子：エフェクター）の比でインキュベートした。若干の培養物には、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌ加えた。ＣＴＬの生成には、脾臓Ｔ細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下にて類似の方式で刺激した。５日後、細胞をＪＡＭ分析（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５（１−２）：１８５（１９９１））で分析するか、または新刺激細胞層に再刺激した。細胞は約９５％ＣＤ４−８＋であった。
【０１７０】
トランスジェニックＴ細胞は、ＩＬ−２の存在下または非存在下で、漸増数の照射された同種異系刺激因子細胞を含む混合リンパ球培養物中で刺激した。次に、トランスジェニック細胞またはＮＬＣエフェクター細胞の増殖応答を測定した。トランスジェニック動物のＴ細胞は外因性ＩＬ−２の非存在下で応答が貧弱で、精製ＣＤ４＋８−細胞のデータ（上記）と一致していた。外因性ＩＬ−２の存在下で、トランスジェニックＴ細胞は、増加した増殖応答を示したが、対照細胞と類似なレベルの増殖に達するには更に多数の刺激因子細胞を必要とした。この分析にて混合Ｔ細胞集団が刺激に応答する能力は、これらの培養物におけるＣＤ４＋８−Ｔ細胞およびＣＤ４−８＋Ｔ細胞の存在を反映し得る。
【０１７１】
ＣＤ４−８＋活性の直接的な指標として、Ｔ細胞の細胞毒性能力を標準的な標的細胞溶解分析で分析した。ＣＤ４−８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２の存在下、同種異系フィーダ細胞で産生させ、分析しこれらの細胞が標的細胞を溶解する能力を決定した。Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞をイオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激して細胞への３［Ｈ］−チミジンの効率的負荷を可能にした。２４時間後、３［Ｈ］−チミジン（５μＣｉ／ｍｌ）をＰＭＡ＋イオノマイシン−刺激Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞に加えた。細胞を３７℃で１８時間培養した後、洗浄した。ＣＤ４−８＋効果細胞を最終容量１００μｌの９６−ウェル平底プレート（実験）で標的Ｂａｌｂ／ｃ細胞の増加率が１．５：１〜５０：１（効果細胞：標的細胞）でプレートした。細胞を遠心分離により沈殿させて、３７℃にて４時間培養した。ラベルしたＢａｌｂ／ｃ細胞のみ含むプレートを直ちに回収し全数（ＴＣ）を測定した。ラベルしたＢａｌｂ／ｃ細胞のみ含む第二プレートも３７℃にて４時間培養し、自発性放出（ＳＲ）を測定した。培養の４時間後、細胞をガラス繊維の上に回収し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０１７２】
溶解％は次のように測定した：｛［（全−ＳＲ）−（実験−ＳＲ）］／（全数−ＳＲ）｝＊１００＝％溶解。高い効果細胞−対−標的細胞率（５０：１および２５：１）において、標的細胞を溶解する際にｓｃｕｒｆｉｎ−トランスジェニックＣＤ４−８＋細胞は、ＮＬＣから産生した細胞のように有効であるが、中間率（１２．５〜３：１）においては、ＮＬＣに比べ、トランスジェニック細胞は細胞溶解機能が有意に減少した。しかし、トランスジェニック細胞は、これらの中間率においてまだ５０−６０％の溶解に有効である。全体から言えば、これらのデーターは、ｓｃｕｒｆｉｎ−トランスジェニックＴ細胞に細胞溶解活性があるが、ＮＬＣほど有効でないことを示唆する。また、外因性ＩＬ−２が、機能性ＣＤ４−８＋Ｔ細胞の産生が要求されるが、これはこのサイトカインの貧弱な内在性生産のためであろう。
【０１７３】
Ｔ細胞応答性の更なる指標として、生体内抗原に対する２８２６トランスジェニック動物の機能応答性に取り組んだ。オキサザロンをチャレンジ剤とする接触感受性応答を２８２６マウスおよびその同腹仔対照において行った。週齢が近似の動物に２％オキサザロン（オリーブ油／アセトンに希釈）最終容量２５μｌで左耳に処理した。７日後、耳の厚さをバネ付きカリパスで測定し、マウスの右耳に２％オキサザロン（８μｌ／耳）でチャレンジした。耳の厚さを２４時間目に測定し、チャレンジ前と比較した耳厚さの変化を報告した。対照マウスはチャレンジのみである。最初の初回刺激（チャレンジ前）した後の耳の厚さは未処理耳と変わりがない。マウスは続いて初回刺激した耳にＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ；８μｌ／耳）で処理した。耳の厚さを１８時間目に測定し、治療前の厚さと比較した耳厚さの変化を報告した。
【０１７４】
これらの研究において、検査した全時間においてトランスジェニック動物は、一致してオキサザロンに応答が貧弱であるが、対照動物の応答は正常である。しかしトランスジェニック動物は、ＰＭＡでのチャレンジに正常応答した。このことは、これらのトランスジェニック動物が、強力な非抗原特異的チャレンジに対して炎症性反応を産生できることを示す。また、ＴＣＲおよびＦｏｘｐ３の両方についてトランスジェニックである動物を用いた研究は、生体内応答における応答を更に詳しく検定する。
【０１７５】
実施例 １８
ＳＣＵＲＦＹ Ｔ細胞は生体内野生型Ｔ細胞により抑制され得る
ｓｆのるいそうおよび皮膚損傷特徴により測定されたように、ｓｆマウスからのＣＤ４＋８−Ｔ細胞の養子移入はヌードマウスに疾患を移入することが以前に報告されている。しかし、ｓｆ胸腺の正常マウスへの移植は疾患を伝達しないことは、免疫コンピテントマウスにｓｆ細胞を抑制する能力があることを示唆する（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：２８１−２８６，１９９４）。阻害のメカニズムをよく理解するため、３×１０６ｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞または野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはｓｆと野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞混合細胞を同系Ｃ３Ｈ−ＳＣＩＤマウスに養子移入した。
【０１７６】
Ｃ３Ｈ ＳＣＩＤマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。全ての動物は特定の無病原環境で飼育し、ＰＨＳガイドラインに従い研究した。もともとの二重変異体、ｓｆ（ｓｆ）および密接に連鎖した薄毛系（Ｏｔｃｓｐｆ）をＯａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。二重変異体は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃａｓｔａｎｅｏｕｓに戻し交雑し、（Ｏｔｃｓｐｆ）変異またはｓｆ変異（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎ ２７：６８−７２，２００１）を持つ組換え体を得た。ｓｆ遺伝子をクローニングする前に、ｓｆ変異についての雌のキャリアを、プライマー５’−ＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）および５’−ＡＣＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＴＡＴＧＴＧＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）（戻し交雑の間、ｓｆ表現型から分離しないことが見出されたマイクロサテライトマーカーＤＸＭｉｔ１３６のプライマー）でゲノミックＤＮＡの増幅により同定した。
【０１７７】
単一変異体ｓｆ系統は、雌のキャリアを（Ｃ３Ｈｆ／ｒｌ×１０１／Ｒｌ）または（１０１／Ｒｌ×Ｃ３Ｈ／Ｒｌ）のＦ１雄に交配することで維持された。雄のＳｆは１５〜２１日齢で、野生型対照動物は６〜１２週齢のものを使用した。Ｓｃｕｒｆｙまたは野生型ＣＤ４＋Ｔは、細胞選別により純化した。細胞は、０．９％生理食塩水ｐＨ７．２に再懸濁し、最終容量２００μｌを異なる率で混合し、ＳＣＩＤマウスの尾静脈へ注射した。マウスの体重損失を毎週追跡した。約５０μｌの血液を目から集めた。赤血球を溶解し、白血球５×１０４細胞／ウェルを固定された抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。
【０１７８】
ｓｆ Ｔ細胞を受けたマウスは、移入後３〜４週、るいそう（体重損失が見られる）の症状が見られ、段段と悪くなったが、ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系を受けたマウスでは、その年齢に対応する正常の体重増加が見られた（図１１Ａ）。野生型Ｔ細胞のみしか受けてないマウスは年齢に応じた類似の体重増加が見られた。また、ｓｆ Ｔ細胞のみしか受けてないマウスには炎症性反応が目の周りに発症したが、目の中にはなく、これは実験中続いた。疾患を進行させ続けた場合、ｓｆ Ｔ細胞のみのレシピエントは、移入後８〜１６週で死亡した。ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系を受けたレシピエントは実験中（実験は１６週続けた）健康であった。
【０１７９】
ｓｆ Ｔ細胞を受けたマウスの大腸の組織学検査には、腺窩膿瘍、厚上皮、増加した上皮細胞性および結腸壁における細胞の浸潤、増殖性大腸炎との一致性を示す（図１１Ｂ）。比較上、ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系（または野生型細胞単独）を受けたマウスの腸は正常に見え、これらのマウスにるいそうが見られないことと相関する。
【０１８０】
組織学検査について、組織は、ｓｆ Ｔ細胞、野生型Ｔ細胞またはｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系を受けたＣ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスから摘出した。腸を冷却ＰＢＳで洗い、直ちに１０％ホルマリンに固定した。パラフィン包埋片をヘマトキシリンおよびエオシン染色して、組織病理学比較を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ Ｉｓ．，ＷＡ）。
【０１８１】
細胞浸潤および炎症は、ｓｆ Ｔ細胞のみを受けたマウスの多数の他の器官（腎臓、肝臓および皮膚を含む）に見られ、このような細胞は野生型細胞を受けた動物には見られない。また、ｓｆ−レシピエント動物のリンパ節および脾臓は、その対照と比べて顕著なリンパ増殖を含み実質的拡大している。リンパ節を６〜１２週齢マウスから集めて、無菌顕微鏡スライドの磨りガラス端の間にてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで浸軟した。細胞は７０μＭナイロンメッシュで濾過し、遠心分離で集めて、約５０×１０６細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁した。
【０１８２】
ｓｆマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、過増殖して大量のサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γを分泌することが示されている（Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３７６４−７７４（１９９４）；Ｋａｎａｎｇａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１６１−１６５（１９９６））。ＳＣＩＤ動物へ移入したＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化状態を追跡するため、レシピエントマウスのＰＢＭＣによるＩＬ−４分泌を測定した。色々なレシピエントからのＰＢＭＣを生体外にて抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４８時間刺激して、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）により製造業者の指示書に従ってＩＬ−４分泌を検出した。移入後の早い時点（８〜１０日目）において、ＩＬ−４は全てのレシピエントからのＰＢＭＣにより生産された（図１１ｃ）。後の時点（２週間目またはそれ以上）において、ｓｆ Ｔ細胞のレシピエントからのＰＢＭＣは顕著な量のＩＬ−４を分泌するが、ただ野生型Ｔ細胞のみまたはｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合体を受けたマウスのＰＢＭＣはほとんどＩＬ−４を分泌しない。ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合体を受けたマウスには体重損失、組織浸潤およびＩＬ−４分泌の抑制が欠けていることは、野生型Ｔ細胞が活性化およびｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入と通常関連する疾患の進行を抑制することを示す。
【０１８３】
実施例 １９
Ｓｆ細胞はＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ−調節性細胞により調節される
多数の報告によると、末梢 ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞） のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ サブセットは、生体内および生体外の他のＴ細胞の調節に係わる（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１２：６７６−６８３ （２０００）； Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ １０１：４５５−４５８ （２０００）； Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１８：４２３−４４９ （２０００））。従って、このようなＴ−ｒｅｇ細胞が生体内でのｓｆおよび野生型 ＣＤ４＋ Ｔ細胞共移入後に見られる疾患を抑制できるかを決定すべきである。２００万のｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を野生型 ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞とまたは野生型 ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞と異なる比率で混合し、Ｃ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスに注射した。レシピエントは実施例 １記載のように、体重損失およびＰＢＭＣによるＩＬ−４分泌を追跡した。Ｔ−ｒｅｇ細胞を分離するに、これらを抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ （Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）および抗ＣＤ２５−ビオチン（Ｃａｌｔａｇ）で氷上にて３０分間染色した。細胞をＰＢＳで二回洗いストレプアビジン−ＡＰＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で氷上にて２０分間染色した。細胞を二回洗い、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞をポジティブ選別した。
【０１８４】
上記の通り、ｓｆ Ｔ細胞単独をうけたマウスは、衰弱の徴候（図１２）およびＩＬ−４生産を示した。しかし、ｓｆ Ｔ細胞および大量（１１０、０００またはそれ以上）の野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の混合を受けたマウスは、疾患の症候、例えば、体重損失が顕著に減少した。比較すると、ｓｆおよびＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の混合を受けたマウスは、ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の数が１．１百万以上のを除く全ての量で症候を示す。少量のサプレスが多数のＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞に見られることは、サプレスの更なるメカニズムまたはＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞移入後に起きることを示す。ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ−ｒｅｇによる抑制のメカニズムは、リンパ空間の生体内競合に係わらないようである、何故ならば、僅か１．１ｘ１０５ Ｔ−ｒｅｇで２ｘ１０６ ｓｆ Ｔ細胞の活性を抑制できるからである。
【０１８５】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞によるｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の抑制のメカニズムをよく理解するため、生体外の混合実験を行った。Ｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞または野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞を色々な応答細胞：サプレス細胞率でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の存在または不存在下、抗ＣＤ３で活性化した。図１３は、ＡＰＣおよび抗ＣＤ３で刺激された野生型 ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖応答がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞を加えることにより顕著にサプレスされたことを示す。これらのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞はｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖応答も抑制する。しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、野生型ＣＤ４＋ Ｔ細胞よりもｓｆ ＣＤ４＋
Ｔ細胞を抑制するに有効でない。 この結果により、生体内での共移入に見られるように、ｓｆ Ｔ細胞の高応答性状態がＴ−ｒｅｇ細胞により調節されることが示される。
【０１８６】
ＡＰＣのため、リンパ節と類似な方式で脾臓を集めて、抗Ｔｈｙ−１−ＦＩＴＣまたは抗Ｔｈｙ１−ＰＥ （Ｃａｌｔａｇ）で染色した。細胞を洗い、Ｔｈｙ−１をネガティブ選別した。細胞は、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター （Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）およびＣｙｃｌｏｐｓ （Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）ソフトウェアーを用いて速度１０−２０、０００／ｍｉｎで選別した。双および単球細胞を前および側散乱ゲートの基底に消失させ、死細胞を沃化プロピジウム（１０ mｇ／ｍｌ）染色
により排除した。選別された細胞個体群の純度は通常に９０−９９％であった。Ｔｈｙ−１− ＡＰＣをマイトマイシン Ｃ （Ｓｉｇｍａ，５０ μｇ／ｍｌ）で３７°Ｃにて２０分間処理して、増殖分析に使う前にＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ で三回洗った。調節性Ｔ細胞分析のため、ＣＤ ４＋ Ｔ細胞５ ｘ １０４細胞／ウェルを２００ｕｌ ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳにて可溶性抗ＣＤ３ （２Ｃ１１； Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ） １μｇ／ｍｌおよび脾臓からの同数マイトマイシン Ｃ処理したＴｈｙ−１− ＡＰＣで刺激した。Ｔ−ｒｅｇ分析のため、ＭｏＦｌｏ 選別したＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を色々な比率で加えた。
【０１８７】
培地を３７°Ｃに７２時間培養して、培養の最後の８−１２時間に１ μＣｉ／ウェルと［３Ｈ］ チミジン （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）を加えた。生体外での前活性化のため、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞は、５ ｘ １０４細胞／ウェルで２００μｌ ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳと可溶性抗ＣＤ３ （野生型細胞には１μｇ／ｍｌ、またはＦｏｘｐ３トランスジェニック細胞には１０ μｇ／ｍｌ）、４ ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ−２ （Ｃｈｉｒｏｎ）および脾臓からの同数マイトマイシン Ｃ処理したＴｈｙ−１− ＡＰＣで刺激した。細胞は７２時間で回収し、ＣＤ４−ＦＩＴＣまたはＣＤ４−ＰＥで染色して、上記のようなＭｏＦｌｏフローサイトメーターを用いてＣＤ４ポジティブ選別した。次にこれらの細胞を上記のような調節性Ｔ細胞分析に新しく単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞と同じ比率で加えた。
【０１８８】
実施例 ２０
ＴＧＦ−β はＳＦ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を抑制しない
最近の研究ではＣＴＬＡ−４およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞生体内の調節性機能におけるＴＧＦ−βの分泌の重要な役割が説明された（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２，２０００）； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：３０３−３１０，２０００）。ｓｆ細胞がＴＧＦ−βでの抑制に感受性であるかを試験するため、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を外因性ＴＧＦ−βの添加が有りまたは無しで刺激した。ＴＧＦ−β分析のために、抗ＣＤ３ （異なる濃度、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２８ （１μｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をプラスチックに固定した。ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ）を最終濃度２．５ ｎｇ／ｍｌに加えた。培養は３７°Ｃ で指定期間培養した。各ウェルに、１ μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］ チミジン （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）を、培養の最終８−１２時間加えた。増殖データは、三重複ウェルの平均値であり、少なくとも３実験の値を代表する。
【０１８９】
期待通り、抗ＣＤ３単独（図１４Ａ）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の組み合わせで刺激された野生型ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＴＧＦ−βにより顕著に抑制された（図１４Ｂ）。しかし、抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたｓｆ細胞は、抗ＣＤ３またはＴＧＦ−βの量に拘わらずＴＧＦ−βでの抑制に感受性でなかった。ＴＧＦ−β抑制の欠如はＴ細胞に特異的であった。何故ならば、ｓｆマウスからの共にＬＰＳで刺激されたＢ細胞および単球細胞による増殖およびサイトカイン生産はＴＧＦ−βでの抑制に感受性であるからである。しかし、高レベルの外因性ＩＬ−２は、潜在的にＴＧＦ−β受容体表現の下方調節により、Ｔ細胞におけるＴＧＦ−βの抑制効果を大きく克服できることに注意すべきである（Ｃｏｔｔｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７７３−７７８，２００１）。ｓｆ動物からのＴ細胞は刺激により極めて高度レベルのＩＬ−２を生産し、これはｓｆマウスのＴ細胞機能におけるＴＧＦ−βによる抑制欠如からである。また、生体外の分析におけるＴ−ｒｅｇ細胞によるＴＧＦ−β生産の役割は不明である。殆どの実験系ではこの系におけるＴＧＦ−βの役割を指さないが、生体内データはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の抑制活性におけるＴＧＦ−βの重要な役割を示す（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２，２０００）。
【０１９０】
実施例 ２１
Ｆｏｘｐ３発現はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−Ｒｅｇ細胞にて上方調節されている
リンパ性組織 例えば、胸腺、リンパ節および脾臓にてＦｏｘｐ３遺伝子は、最も高いレベルで発現される（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
２７：６８−７２，２００１）。Ｆｏｘｐ３のリンパ系における発現は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞に現れるようである。なぜなら、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＢ細胞における表現のレベルは顕著に低いかまたは検出できないからである（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：６８−７２，２００１）。
【０１９１】
Ｆｏｘｐ３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞における役割を果たすかを評価するため、正常およびＦｏｘｐ３ トランスジェニックマウス（約１６コピーのＦｏｘｐ３ 導入遺伝子）からのＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３転写の発現を比較した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞個体群を上記のように集めた。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてこれらの細胞からＯｌｉｇｏ ｄＴ プライムされた第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ 機器を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの鋳型とした。Ｆｏｘｐ３ 発現の測定にプライマー ５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡ−３’（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１７）および５’−ＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８） 最終濃度３００ｎＭおよび内部ＴａｑＭａｎプローブ ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＡＧ−ＡＡＴＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９） 最終濃度１００ ｎＭを用いた。Ｄａｄ１ を内在性基準（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）にした。Ｄａｄ１プライマーを５’−ＣＣＴＣＴＣＴＧ−ＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）および５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）最終濃度５０ ｎＭで使い、ＴａｑＭａｎ プローブを ５’−６ＦＡＭ−ＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＡＣ−ＴＡＭＡＲＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）最終濃度１００ ｎＭで使用した。ＰＣＲ混合の他の成分は、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から得た。ＰＣＲ循環条件は、５０°Ｃ ２分間；９５°Ｃ １０分間；および４０循環の９５°Ｃ １５秒、６０°Ｃ １分間であった。
【０１９２】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．４でデーターを集めた。未知サンプルと同時に行った標準ｃＤＮＡサンプルの希釈系列（１ｘ，１：１０， １：１００， １：１０００， １：１０，０００）から標準曲線を得た。ソフトウェアは、許容限界循環（ＣＴ） 対 出発量の曲線をプロットし、ＣＴを用いて未知サンプルの相対的レベルを計算することに基づいて、各未知物の相対的量を決定する。各サンプルを２連で実行し、平均値を計算に用いた。データを正規化したＦｏｘｐ３発現として表し、それは各サンプルについてのＦｏｘｐ３の相対的量を同サンプルについてのＤａｄ１の相対的量で割って得られた。
【０１９３】
興味深いことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３発現のレベルは殆ど検出できないが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、これまでのところ記載されていない、Ｆｏｘｐ３の最高量を発現する（図１５Ａ）。Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスのＴ細胞サブセットにおけるＦｏｘｐ３発現のレベルも決定した。これらの動物は、野生型動物に見られるＦｏｘｐ３メッセージの約１６倍の量がある。Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスにおいて、Ｆｏｘｐ３発現は、ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞は共に検出されるが、野生型細胞のように、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞は顕著により大きいレベルのＦｏｘｐ３を発現した。ｓｆ 突然変異動物のＣＤ４＋細胞のサブセットもＣＤ２５を発現するが、この集団はサイズが大きく、ＣＤ６９を発現し、このことは、恐らく、前にインビボで活性化された細胞であることを示す。しかし、ｓｆ 突然変異動物からのこれらのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、増大した量のＦｏｘｐ３メッセージを示さず、このことは、これらの細胞は性質が恐らくＴ−ｒｅｇではないことを示すと決められた。
【０１９４】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、活性化Ｔ細胞の特徴である、特定のマーカー、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲを発現する（ＭｃＨｕｇｈ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６： ３１１−２３，２００２）； Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３： １３５−４２，２００２）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３発現がＴ細胞の活性化によるものであるか否かを評価するため、インビトロでの活性化の前後にＣＤ４ Ｔ細胞のＣＤ２５＋サブセットおよびＣＤ２５−サブセットにおけるＦｏｘｐ３発現を測定した（図１５Ｂ）。インビトロで抗ＣＤ３およびＩＬ−２を用いた後でさえ、ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞は、いかなるＦｏｘｐ３も発現しない。面白いことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現は活性化後にやや減少する。これは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞についてこれまで報告されたいかなる他のマーカーとも異なるＦｏｘｐ３が、このサブセットに特異的であり、そしてこれらの細胞の活性化／記憶表現型と関係がなかったことを示した。
【０１９５】
実施例 ２２
Ｆｏｘｐ３の過剰発現はＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞数の増加を導くが調節性活性の増加を導かない
Ｔ−ｒｅｇサブセット内のＦｏｘｐ３の比較的排他的な発現は、この転写因子が、このサブセットの生成を要求するかまたは直接その機能に係わることを示す。Ｆｏｘｐ３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞機能において役割を果たすか否かを決定するために、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞サブセットの機能活性を検査した。これらの動物は、野生型動物に見られるＦｏｘｐ３メッセージよりも１６倍多いＦｏｘｐ３メッセージを有し、これはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ サブセットにおいて量が非常に多い。さらに、これらのトランスジェニック動物において全ＣＤ４＋細胞は少なく、これらの細胞はその同腹子対照に対して低応答性である。一方、トランスジェニックマウスにおいてわずかに増加した％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞が存在し、ＣＤ２５の発現はより広汎であり、野生型動物と異なり、これらの細胞は明確な細胞のサブセットを含まない（図１６）。野生型からのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞とＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞との機能活性の比較は、トランスジェニックマウスからの細胞が調節性活性を示すが、細胞ごと基準におけるその野生型対応物に対する抑制能力の顕著の増加はなかった（図１７）。
【０１９６】
Ｔ−ｒｅｇ分析条件下、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞は、応答細胞と同時に活性化した。Ｆｏｘｐ３導入遺伝子からのＣＤ４＋Ｔ細胞はＴＣＲ刺激に低応答性であるから、分析においてこれらのＦｏｘｐ３−Ｔｇ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞は野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞と同じ程度に活性化しなかったようであった。これは、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞が野生型細胞と同じ程度に活性化した場合、より高い調節性活性を呈する可能性を起こす。
【０１９７】
この問題に取り組むために、前に出版したプロトコル（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６４：１８３−１９０，２０００）により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＡＰＣおよびＩＬ−２の存在下、抗ＣＤ３と生体外で７２時間の前活性化させた。本発明者らの前の観察に基づき、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＴ細胞は、生体外で大量の抗ＣＤ３を用いて活性化して野生型細胞に匹敵する増殖が得られた。これらの前活性化Ｔ細胞は、次にＴ−ｒｅｇ分析で試験した。他の報告のように、生体外でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の前活性化は、それらの細胞をより強力なサプレッサーにさせた。しかし、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックＴ−ｒｅｇ細胞の前活性化は、それらの細胞を野生型Ｔ−ｒｅｇ細胞に匹敵するサプレッサー活性にさせた（図１７）。これは、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＴ−ｒｅｇ細胞に内因性の欠損がなかったことを示唆した。しかし、閾値レベルを超えたＦｏｘｐ３の過剰発現はＴ−ｒｅｇ活性を更に強化しなかった。
【０１９８】
実施例 ２３
Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は調節性活性を示す
Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞より高いレベルでＦｏｘｐ３を発現するので、次にＴ調節性細胞に伴う表面マーカーの発現およびこれらの細胞の抑制活性を評価した。面白くも、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）も発現し、これは最近Ｔ−ｒｅｇ活性を調節することが示されている（図１８）。これらの細胞は、他の活性化を伴うＴ細胞マーカー、例えば、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ４またはＬｙ−６Ａ／Ｅ（データーは示されていない）を発現しなかった。更に重要なことは、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからの新しく単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞をＴ−ｒｅｇ分析における機能を試験した場合、顕著な抑制活性を有した（図１９）。この活性は通常同じマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性に匹敵から低いに至る。期待する通り、このような抑制活性は、野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞には検出されたことがなかった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と対照的に、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の抑制活性は、抗ＣＤ３およびＩＬ−２での生体外の前活性化で強化され得なかった（データーは示していない）。これはまたＦｏｘｐ３の発現が調節活性との直接相関がなく、Ｔ−細胞をＴ−ｒｅｇ系列にゆだねるという考えを支持する。
【０１９９】
ｓｆマウス（Ｆｏｘｐ３）において突然変異した遺伝子は、末梢Ｔ細胞応答の調節における重要な役割がある。この遺伝子における突然変異の機能消失は、マウスおよびヒトにおける可能な致命性Ｔ細胞が媒介する自己免疫病に導く（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：２０−２１（２００１）；Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３−２４３７（１９９０）；Ｗｉｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：１８−２０（２００１））。また、トランスジェニックマウスにおけるｓｃｕｒｆｉｎの過剰発現は、末梢Ｔ細胞数減少ならびに増殖およびＩＬ−２産生を含む色々なＴ細胞応答の阻害を導く。ｓｃｕｒｆｉｎによるＩＬ−２産生の阻害は、低応答性の唯一解釈ではない。なぜなら、外因性ＩＬ−２の添加は、ｓｃｕｒｆｉｎを過剰発現するマウスにおける正常Ｔ細胞応答を完全には回復しないからである。Ｆｏｘｐ３遺伝子により制御され得る免疫調節メカニズムをよく理解するため、この遺伝子の発現およびｓｃｕｒｆｉｎ発現細胞の生物学役割を研究した。
【０２００】
この実施例に示すように、野生型Ｔ細胞は、ｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスに養子移入することにより起きる疾患を阻害し得る。これらの観察は、調節性Ｔ細胞の活性を特徴付けした複数の他のグループによるものと非常に類似する。類似な観察がＰｏｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ．により行われた、ｓｆ細胞により起こる疾患は、少数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞でも阻害された。ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞は、このモデルにおけるｓｆ Ｔ細胞活性の阻害に余り有効でない、このことは、これらの細胞のサブセットがＴ−ｒｅｇ 細胞サブセットに発生し、適切な阻害因子を作ることに起因し得るか、または阻害の追加メカニズムに起因し得る。また、ｓｆ Ｔ細胞の生体外の過剰応答性状態は、野生型 ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の存在により阻害され得るが、ＴＧＦ−βの添加により阻害されない。一般に、生体外のＴ−ｒｅｇ 実験からのデータは、直接の細胞−細胞間相互作用にサイトカイン、例えばＴＧＦ−βの関与を要求しないことを示唆する （Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２８７−２９６ （１９９８）； Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６４：１８３−１９０ （２０００））。また、ＴＧＦ−βには、活性化Ｔ細胞に対する阻害効果がない（Ｃｏｔｔｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７７３−７７８（２００１））。このことは、生体内ｓｆ細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞阻害がＴＧＦ−βにより媒介されることを不可能にする。
【０２０１】
Ｆｏｘｐ３ 遺伝子生成物がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞機能における役割を担うか否かを評価するため、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５−
Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現を測定し、Ｆｏｘｐ３ 遺伝子を過剰発現したマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の調節性活性を測定した。野生型およびＦｏｘｐ３トランスジェニック体の両方において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、今日まで、全ての試験した異なる細胞個体群にＦｏｘｐ３ ｍＲＮＡの最高レベルを発現した。野生型およびＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の機能活性を比較すると、これらの細胞に最適刺激をしてもトランスジェニックマウスの細胞において調節性活性が増加しない。しかし、重要なことに、Ｆｏｘｐ３
トランスジェニック動物からのＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞に抑制活性があった。ｓｆ突然変異株マウスにおけるＴ−ｒｅｇ細胞のサブセットは、表現型に同定できないが（高レベルの内在性活性化により）、突然変異株動物から単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞はＦｏｘｐ３ 遺伝子も発現しなかったし、生体内でなんの抑制活性も表さなかった。
【０２０２】
これらの結果として、Ｆｏｘｐ３の発現はＴ 細胞をＴ−ｒｅｇ細胞株に拘束し得るが、Ｆｏｘｐ３の閾値レベルを超えた過剰発現は、調節性活性のさらなる強化をもたらさない。更に、Ｆｏｘｐ３ 自体の発現は、Ｔ−ｒｅｇ細胞を産生するに不十分なようである、それはＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５−は野生型Ｔ−ｒｅｇ細胞に匹敵するＦｏｘｐ３発現を有するが、抑制活性が少ないからである。この調節性活性に対する効果は、ＣＴＬＡ−４ 発現の効果によるものではないようである、それはＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスにＣＴＬＡ−４発現の増加がなく、ｓｆ 突然変異株動物はＣＴＬＡ−４の正常レベルを発現するからである。
【０２０３】
実施例 ２４；ＳＣＵＲＦＩＮ発現の調節
ｓｃｕｒｆｉｎ発現を調節する抗体またはＮＣＥは下記の方法で同定する：
ｓｃｕｒｆｉｎプロモーターを市販ルシフェラーゼリポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローンする。次にこの構築を細胞、例えば、マウスまたはヒトＴ細胞株にトランスフェクトをする。例えば、Ｔ細胞に対して惹起された抗体、サイトカイン、リセプター、または他の蛋白質、並びに小分子、ペプチド、およびサイトカイン等の薬剤をトランスフェクトされた細胞の処理に用いる。次にルシフェラーゼ活性のレベルを市販ルシフェラーゼ分析系（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造業者の指示書に従って、ｓｃｕｒｆｉｎの発現を増加または減少する薬剤を同定する。
【０２０４】
別のアプローチでは、例えば、上記の薬剤を、初代Ｔ細胞と、ｓｃｕｒｆｉｎ発現を調節させる条件下にて培養する。ｓｃｕｒｆｉｎ発現の測定に上記実施例 ２１ のＲＴ−ＰＣＲ方法が用いられる。上記いずれの方法で同定された薬剤は直接に自己免疫病の治療に用いる。別に、Ｔ細胞は自己免疫病の患者から単離され、上記の同定された特定の薬剤で処理され、ｓｃｕｒｆｉｎ発現を誘導して、患者に移入され、他のＴ細胞の活性化を抑制する。
【０２０５】
実施例の結果を纏めると、Ｆｏｘｐ３発現は主にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇサブセットに見られ、調節性活性の基礎レベルと相関することが、実施例の結果により示される。この遺伝子の過剰発現は、ＣＤ２５が欠けてるＣＤ４＋細胞に対して調節性機能を与え得る。このことは、この因子がこの機能的系列への拘束に直接係わり得ることを示唆する。
【０２０６】
この明細書中で言及されたか、および／または出願データシートにリストされ参考される、全ての上記米国特許、米国特許出願公報、米国特許公報、外国特許、外国特許出願公報および非特許文献は、その全体が、本明細書において参考として援用される。
【０２０７】
以上、本発明の特定の実施形態を説明の目的で挙げたが、本発明の精神と範囲を離れないで色々な変化することができる。よって、本発明は添付の請求の範囲以外には限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、マウスＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のヌクレオチド配列を示す；翻訳は２５９位に始まり、１５４６位に終わると予測される。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、マウスＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のヌクレオチド配列を示す；翻訳は２５９位に始まり、１５４６位に終わると予測される。
【図２】図２はマウスＦｋｈｓｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；１２９３ｂｐコード領域を含む）に対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列を示す；翻訳は５５位に始まり、１３４８位に終わると予測される。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；１２９３ｂｐコード領域を含む）に対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列を示す； 翻訳は５５位に始まり、１３４８位に終わると予測される。
【図４】図４は、４３１アミノ酸のヒトＦＫＨｓｆ蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の配列を示す。
【図５】図５は、ＦＫＨｓｆトランスジェニックマウスの作製のためのベクターを示す。
【図６】図６は、ＦＫＨｓｆ導入遺伝子がｓｃｕｒｆｙ動物における欠損を正したことを説明する写真である。
【図７】図７は、ＦＫＨｓｆ ｔｇマウスが、正常マウスに比べリンパ節細胞を減少していることを示す。
【図８】図８は、ＦＫＨｓｆトランスジェニックマウスが、生体外刺激に貧弱に応答することを示す。
【図９】図９は、ＦＫＨｓｆとＪＭ２ ｃＤＮＡとの比較である。
【図１０】図１０は、ヒトＦＫＨｓｆおよびマウスＦｋｈｓｆの色々な領域における相同性を比較する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｓｃｕｒｆｙマウスおよび野生型マウスの体重を追跡したグラフである。マウスの体重減少を規則的時間を隔て１０週間追跡した。各値点は、３匹マウスの平均であり、ｓｆ ＣＤ４移入群における３匹マウスのうちの１匹が死んだ第５週後を除く（グラフにて矢印で示す）。データは３より多くの独立実験を表す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、組織断面の写真である。ｓｆＴ細胞（左面）またはＷＴおよびｓｆＴ細胞の混合物（右面）のいずれかを受けたＣ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスの大腸をホルマリンに固定し、切片化してヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｓｆＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＷＴとｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞の混合物またはＷＴ ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかを受けたＣ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスから５×１０４ ＰＢＭＣより生産したＩＬ−４を５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８で刺激して、丸底板に固定したグラフを示す。上澄を４８時間に収集し、ＩＬ−４濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ−調節性細胞で処理したマウスの体重減少を示すグラフである。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性サブセットは生体内でｓｆＴ細胞により起される疾患の抑制を媒介する。４×１０６ ｓｆＴ細胞と異なる数の野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（ａ）またはＣＤ４＋ＣＤ２５−（ｂ）Ｔ 細胞との混合物を尾静脈注射でＣ３／ＳＣＩＤマウスに移植した。これらのマウスは、体重減少を一期間追跡した。各値点は、各群に２匹のマウスを有するｓｆ ＣＤ４移植群およびｓｆ ＣＤ４＋１．１×１０６ ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を除く３匹のマウスの平均である。また、グラフ上の矢印は、死亡したマウスまたは疾患の進行により殺したものを指す。
【図１３】図１３は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ調節性細胞の抑制または活性を決定する増殖分析を示すグラフである。ｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生体外でＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性細胞により阻害することができる。５×１０４ＷＴまたはｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および５×１０４ミトマイシンＣで処理したＴｈｙ−１− ＡＰＣで刺激された。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性細胞を、色々な比で分析に加えた。細胞を７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、５×１０４ ＷＴまたはｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞を固定した抗ＣＤ３で刺激した増殖分析を示すグラフである。ＴＧＦ−βを、分析の始に最後の濃度２．５ ｎｇ／ｍｌで加えた。細胞を７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、５×１０４ＷＴまたはｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞を固定した抗ＣＤ３（色々な濃度）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で刺激した増殖分析を示すグラフである。ＴＧＦ−βを、分析の始に最後の濃度２．５ｎｇ／ｍｌで加えた。細胞は７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｄａｄ１を内因性参照遺伝子とするリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ方法を用いた色々な細胞サブセットからのｃＤＮＡサンプルにてＦｏｘｐ３発現を検査したグラフである。正常化されたＦｏｘｐ３値は、Ｆｏｘｐ３発現対Ｄａｄ１発現の比から誘導された。
【図１６】図１６は、ＷＴ動物、Ｆｏｘｐ３トランスジェニック動物、およびｓｃｕｒｆｙ動物からのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５表面発現のレベルを示す。ｓｆ、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックまたは同腹子コントロールからのリンパ節細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現の発現を検査した。データは、６匹の個々の検査されたマウスを表す。
【図１７】図１７は、５×１０４ ＷＴ ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のレベルが抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および５×１０４ミトマイシン Ｃ処理したＴｈｙ−１−ＡＰＣで刺激されたことを示すグラフである。ＷＴまたはＦｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性細胞を色々な比で分析に加えた。細胞は７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１８】図１８は、Ｔ調節性細胞に付随する表面マーカーの発現およびこれらの細胞の抑制活性を評価するＦＡＣＳプロットである。
【図１９】図１９は、Ｔ−ｒｅｇ分析でテストされたＦｏｘｐ３トランスジェニックから新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＴ細胞阻害のレベルを示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に医薬品および方法に関し、詳しくは、免疫系統を調節できる化合物を同定する方法、更に、Ｓｃｕｒｆｉｎにより調節され、Ｆｏｘｐ３発現を誘導または阻害する蛋白質を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、および喘息は免疫調節不全に係わる。これらの全ての疾患において、サブセットＴ細胞は、過活性化され、自己に対する免疫反応に寄与する。近年、ＣＤ９５、ＣＤ９５−リガンド、ＣＴＬＡ−４またはＴＧＦ−βで突然変異されたマウスは、Ｔ細胞調節および免疫系統ホメオスタシスに係わる多くの経路を分析するのに有用であることが証明された。上記遺伝子が深く免疫応答を変化させた場合いずれかの突然変異を有するマウスは、Ｔ細胞機能を制御できないことに起因にする。
【０００３】
末梢でＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体とＣＤ２８との共刺激を経るシグナル伝達に係わる（非特許文献１〜３にレヴューされた）。末梢Ｔ細胞応答の下方調節は、若干の経路に係わる。これらの幾つかは、ＣＤ９５およびそのリガンドを含むＴＮＦＲファミリーのメンバーを介する細胞自滅、サイトカイン中止による活性化が誘導した死亡、およびＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）を経たネガティブシグナル伝達を含む（Ｌｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１７：２２１−２５３（１９９９）；Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１１：２９４−３００（１９９９）；Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１０：３１３−３２１（１９９８）；Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１７：３３１−３６７（１９９９））。これらの遺伝子のうちのいくつかのドミナントネガティブな形態の突然変異または発現は、末梢Ｔ細胞応答の調節における重要な役割が証明された。ＣＤ９５、ＣＤ９５Ｌ、ＴＧＦ−βまたはＣＴＬＡ−４における突然変異は、進行性自己免疫リンパ増殖性疾患に導く（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７７０−７７４（１９９３）；Ｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：６９３−６９９（１９９２）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７６：９６９−９７６（１９９４）；Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：５４１−５４７（１９９５）；Ｗａｔａｎｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６：３１４−３４７（１９９２）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：９８５−９８８（１９９５））。更に最近のデータによると、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞におけるＴ細胞活性の調節は、末梢Ｔ細胞寛容性の維持にも重要であることが示唆される。（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１２：６７６−６８３（２０００）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ １０１：４５５−４５８（２０００）；Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１８：４２３−４４９（２０００））。このような調節性Ｔ細胞の正常動物からの枯渇は、色々な自己免疫疾患の発展を導き、これらの調節性Ｔ細胞の養子免疫伝達も多くの系の生体内での疾患を防止することができる（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：３８７−３９６（１９９６）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５５：１１５１−１１６４（１９９５）；Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６０：１２１２−１２１８（１９９８））。
【０００４】
調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）がその抑制効果を媒介することによる特異メカニズムは最近まで不明である。ＴＧＦＢおよびＩＬ−１０は、抑制効果を媒介し、これらのサイトカインを遮断し、若干の生体内モデルでの抑制を排除するが、その他の分子も係わることを示す良い事実がある。累積した事実は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の活性化および／または機能におけるＣＤ１５２の役割を示す（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２（２０００）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：３０３−３１０（２０００））。面白いことに、若干の研究は、ＣＤ１５２を経たシグナル伝達がＴＧＦＢの誘導をきたすことを示唆する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１８４９−１８５７（１９９８）；Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２００１−２００８（２０００）；Ｋｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６９１−７０２（２０００））、ＴＧＦＢ−媒介抑制とＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制性活性との間の潜在的な関連を提供する。
【０００５】
Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患は、以下において見られる病原性と多くの特徴を共有する自発性突然変異の動物である、ｓｃｕｒｆｙ（ｓｆ）マウスにおいて観察された：ＣＴＬＡ−４の標的削除（Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：５４１−５４７（１９９５）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：９８５−９８８（１９９５））およびＴＧＦ−β（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７７０−７７４（１９９３）；Ｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：６９３−６９９（１９９２））、三週齢での死亡（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：２８１−２８６（１９９４）；Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５５２８−５５３２（１９９１）；Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９−１３８７（１９９１）；Ｋａｎａｎｇａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１６１−１６５（１９９６）；Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３−２４３７（１９９０））を含む。ｓｆ動物において、疾患はＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介され、これらの細胞は、生体内および生体外で活性化された表現型を呈する（Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３７６４−７７４（１９９４））。該疾患を担う特異な突然変異は、最近クローンされ、その遺伝子は、フォークヘッドファミリー転写因子の新メンバーとされることが示された（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：６８−７２（２００１））。この遺伝子はＦｏｘｐ３と呼ばれ、蛋白質生成物はｓｃｕｒｆｉｎと呼ばれる。ヒトオーソロガス遺伝子での突然変異は、治療しないで放っておくと一般に致命的である男性の子孫に罹る疾患の内の類似リンパ増殖性疾患を起こす（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：２０−２１（２００１）；Ｃｈａｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＪＭ２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：Ｒ７５−８１（２０００）；Ｗｉｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：１８−２０（２００１））。
【０００６】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【非特許文献１】Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ａ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：５５５−５５９（１９９５）
【非特許文献２】Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４４３−４４８（１９９４）
【非特許文献３】Ｒｕｄｄ，Ｃ．Ｅ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：５２７−５３４（１９９６） 本発明は、ｓｃｕｒｆｙ関連疾患の診断に有用な方法および組成物を開示し、より詳しくは、免疫系統を調節できる化合物を同定する方法、更に、Ｓｃｕｒｆｉｎにより調節された蛋白質を同定する方法およびＦｏｘｐ３発現を誘導または阻害する方法を開示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する：
（項目１） ｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ｓｃｕｒｆｉｎプロモーターに結合したリポーター遺伝子を含む組成物を提供する工程、
（ｂ）該組成物を試験化合物と接触させる工程、
（ｃ）リポーター遺伝子発現のレベルを測定する工程、および
（ｄ）（ｃ）におけるリポーター遺伝子発現のレベルと所定の発現レベルとを比較し、試験化合物がｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節するか否かを決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
（項目２） ｓｃｕｒｆｉｎ 発現のレベルが減少される項目１記載の方法。
（項目３） ｓｃｕｒｆｉｎ 発現のレベルが増加される項目１記載の方法。
（項目４） 試験化合物がモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ペプチド、および小分子からなる群より選ばれる、項目１記載の方法。
（項目５） 試験化合物が有機分子、天然の産物、ペプチド、オリゴ糖、核酸、リピド、および抗体またはその結合断片からなる群より選ばれる項目１記載の方法。
（項目６） 試験化合物が化合物のライブラリー由来である項目１記載の方法。
（項目７） ライブラリーがランダムなペプチドライブラリー、組合せのライブラリー、オリゴ糖ライブラリーおよびファージディスプレイライブラリーからなる群より選ばれる項目６記載の方法。
（項目８） 項目１記載の方法で同定された化合物。
（項目９） 哺乳類のＴ細胞を、Ｔ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物と接触させる工程であって、免疫応答が抑制される工程を含む、哺乳類における免疫応答を抑制する方法。
（項目１０） 哺乳類のＴ細胞を、Ｔ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を減少する化合物と接触させる工程であって、免疫応答を強化する工程を含む、哺乳類における免疫応答を強化する方法。
（項目１１） 被験体にｓｃｕｒｆｉｎ 発現を増加する化合物を投与して被験体による自己免疫の応答を阻害する工程を含む、被験体における自己免疫の応答を阻害する方法。
（項目１２） 自己免疫の応答が炎症性腸疾患、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬症、糖尿病、および喘息からなる群より選ばれる項目１１記載の方法。
（項目１３） 被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を減少する化合物を投与して被験体における疾患に対する自己免疫の応答を強化させる工程を包含する、被験体における疾患に対する自己免疫の応答を強化する方法。
（項目１４） 疾患がＡＩＤＳおよび癌からなる群より選ばれる項目１３記載の方法。
（項目１５） 被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加させる化合物を投与して被験体における対宿主性移植片病を阻害する工程を含む、被験体における対宿主性移植片病を阻害する方法。
（項目１６） 患者における自己免疫の応答を阻害する方法であって、
（ａ）患者からＴ細胞を分離する工程、
（ｂ）Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子で形質導入する工程、
（ｃ）形質導入されたＴ細胞を拡張する工程、および
（ｄ）患者に形質導入されたＴ細胞を再導入する工程であって、ここで、患者における自己免疫応答が阻害される工程、
を含む方法。
（項目１７） Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞である項目１６記載の方法。
（項目１８） 自己免疫病が炎症性腸疾患、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬症、糖尿病、および喘息からなる群より選ばれる項目１６記載の方法。
（項目１９） 形質導入ベクターがレトロウイルスベクターである項目１６記載の方法。
（項目２０） 患者における疾患に対する自己免疫の応答を強化する方法であって、
（ａ）患者からＴ細胞を分離する工程、
（ｂ）Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ発現を阻害する化合物でトランスフェクトする工程、
（ｃ）トランスフェクトされたＴ細胞を拡張する工程、および
（ｄ）患者にトランスフェクトされたＴ細胞を再導入する工程であって、患者における疾患に対する免疫応答が強化される工程、
を含む方法。
（項目２１） 該化合物がアンチセンス分子である項目２０記載の方法。
（項目２２） 該疾患がＡＩＤＳおよび癌からなる群より選ばれる項目２０記載の方法。
【０００８】
本発明は、一般的に言えば、突然変異した場合、リンパ増殖性疾患に深く致る新規遺伝子の発見に関する。特に、「Ｓｃｕｒｆｙ」と呼ばれる突然変異マウスが、戻し交雑分析、物理的遺伝地図作製および大規模ＤＮＡ配列決定を経て、この疾患を担う遺伝子を同定するのに用いられた。この遺伝子の配列の分析により、ウィングトヘリックスＤＮＡ結合ドメインの全てを含む相関する遺伝子ファミリーに属することが示されている。
【０００９】
従って、本発明は、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆをコードする単離した核酸分子（その突然変異形態も含む）を提供する。ある具体例には、任意タイプのＦｋｈｓｆは、例えばマウスまたはヒトのような温血動物由来である。更に具体例に、単離した核酸分子が提供され、その核酸分子は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または４を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）ストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または３のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、またはその相補体、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）でコードされたポリペプチドの機能断片をコードする核酸分子よりなる群から選ばれる。好ましくは、核酸分子ＪＭ２でない。なお、ベクター（発現ベクターを含む）、および組換え宿主細胞、ならびに上記核酸分子でコードされた蛋白質も提供される。更に、少なくとも一部分の上記核酸分子とその他の蛋白質のコード領域とを結合する融合蛋白質を提供する。上記配列に基づくオリゴヌクレオチド断片（プローブおよびプライマーを含む）も提供する。このような断片は、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、２０、または２５ヌクレオチドであり、１００、２００、５００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドまで延長され得る。
【００１０】
他の局面において、Ｆｋｈｓｆ蛋白質（任意のタイプ）を生産するための上記発現ベクターを使用する方法が提供され、この方法は、下記工程を含む：（ａ）発現ベクターを含み、Ｆｋｈｓｆ蛋白質を生産する組換え宿主細胞を培養する工程、（ｂ）培養した組換え宿主細胞から蛋白質を単離する工程。
【００１１】
また、特異的にＦｋｈｓｆ蛋白質に結合する抗体および抗体断片も提供する。このような抗体の代表例としては、ポリクロナールおよびモノクロナール抗体（マウスのハイブリドーマから得た、またはヒト型に誘導した）が挙げられる。抗体断片の代表例としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識単位または相補性決定領域が挙げられる。
【００１２】
なお他の局面において、被験体からの生物サンプルにおいて、Ｆｋｈｓｆ核酸配列の存在下で下記工程を含む検出方法を提供する：（ａ）Ｆｋｈｓｆ特異的核酸プローブをハイブリダイゼーション条件下（ｉ）該生物サンプルから単離したテスト核酸分子、または（ｉｉ）プローブがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または３のヌクレオチド配列の少なくとも一部分を認識するＲＮＡ分子から合成した核酸分子と接触させる工程、および（ｂ）核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程。
【００１３】
他の関連する実施形態は、生物サンプルにおいてＦｋｈｓｆ、またはその突然変異型の存在下で下記工程を含む検出方法を提供する：（ａ）生物サンプルと抗Ｆｋｈｓｆ抗体または抗体断片とを接触させ、その接触は、抗体または抗体断片の生物サンプルへの結合を許す条件下で行う工程、および（ｂ）結合された抗体または結合された抗体断片のいずれを検出する工程。
【００１４】
その他の局面において、本発明は、動物（例えば、ヒト、猿、犬、猫、ラット、またはマウス）に本明細書中に記載されるＦｋｈｓｆ核酸分子を投与する工程を含む、動物にＦｋｈｓｆ核酸分子を導入する方法を提供する。その一つの実施形態において、核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、少なくとも部分がレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはαウイルスから作製したベクター）に含まれ発現される。他の実施形態において、核酸分子は、プラスミドベクターにより発現または含まれる。このようなベクターは、生体内または生体外（例えば、造血細胞、例えばＴ細胞）に投与することができる。
【００１５】
その他の実施形態において、動物の細胞がＦｋｈｓｆ蛋白質をコードする配列を含む導入遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００１６】
１つの好ましい実施形態において、霊長類での免疫機能を調節する方法を提供する。この方法は、以下を包含する：Ｆｏｘｐ３蛋白質をコードした複数の核酸配列を霊長類のリンパ球に挿入し；この核酸配列をサイトカインｃの制御下に置き；サイトカインｃで核酸配列の発現を活性化し、この霊長類においてＦｏｘｐ３蛋白質の量を増加させる。
【００１７】
従って、本発明の目的はＦｏｘｐ３の発現を変化する因子を同定するに用いられる分析を提供する。詳しくは、いろいろな条件下Ｆｏｘｐ３の誘導または阻害を測定する分析を提供する。この発現を変化する因子として小分子、ペプチド、ポリヌクレオチド、サイトカイン、抗体およびＦａｂ’断片が挙げられる。
【００１８】
１つの好ましい実施形態には、ｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ｓｃｕｒｆｉｎプロモーターに結合するレポーター遺伝子を含む組成物を提供する工程；この組成物をテスト化合物と接触させる工程；レポーター遺伝子発現のレベルを決定する工程；および（ｃ）におけるレポーター遺伝子発現のレベルと前決定発現のレベルとを比較することによりテスト化合物がｓｃｕｒｆｉｎの発現を調節するかを決定する工程を含む。
【００１９】
好ましい実施形態には、この化合物はｓｃｕｒｆｉｎ発現のレベルを低下させる。
【００２０】
他の実施形態には、この化合物はｓｃｕｒｆｉｎのレベルを増加する。
【００２１】
一つの実施形態には、テスト化合物は下記からなる群より選ばれる：モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、ペプチド、および小分子。
【００２２】
他の実施形態には、テスト化合物は下記からなる群より選ばれる：有機分子、天然産物、ペプチド、オリゴ糖、核酸、脂質、抗体またはその結合断片、および細胞。
【００２３】
又他の実施形態には、テスト化合物は化合物のライブラリ由来である。
【００２４】
他の実施形態で、このライブラリは下記からなる群より選ばれる：ランダムペプチドライブラリ、天然産物ライブラリ、コンビナトリアルライブラリ、オリゴ糖ライブラリおよびファージディスプレーライブラリ。
【００２５】
１つの好ましい実施形態には、哺乳類のＴ細胞と、Ｔ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物とを接触させる免疫応答を抑制する方法が提供され、免疫応答が抑制される。
【００２６】
１つの好ましい実施形態には、Ｔ細胞とＴ細胞におけるｓｃｕｒｆｉｎ発現を低下させる化合物とを接触させ免疫応答を強化する方法を提供し、免疫応答が強化する。
【００２７】
他の関連する実施形態には、被験体における自己免疫応答を阻害する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物を投与し、被験体による自己免疫応答を阻害する。
【００２８】
関連する実施形態において、自己免疫応答は下記からなる群より選ばれる：炎症性腸疾患、乾癬、糖尿病、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、および喘息。
【００２９】
１つの好ましい実施形態には、被験体での疾患に対する免疫応答を強化する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を低下する化合物を投与し、それによって被験体の疾患を治療する。
【００３０】
関連する実施形態には、被験体でのＨＩＶまたは癌に対する免疫応答を強化する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を低下する化合物を投与し、それによってＨＩＶおよび癌を治療する。
【００３１】
１つの好ましい実施形態には、被験体での対宿主性移植片疾患を阻害する方法を提供し、その方法は、被験体にｓｃｕｒｆｉｎ発現を増加する化合物を投与し、それによって被験体による組織移植拒絶を阻害する。
【００３２】
１つの好ましい実施形態には、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離し、Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子で形質導入する工程；形質導入されたＴ細胞を増加させる工程；および形質導入されたＴ細胞を該患者に再導入する工程。ここで患者における自己免疫疾患は阻害される。
【００３３】
関連する実施形態には、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供する。その方法は、患者からＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を単離する工程、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞にｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子を形質導入する工程、形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を増加させる工程、および形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を患者に再導入する工程を包含し、患者における自己免疫疾患が阻害される。
【００３４】
１つの好ましい実施形態において、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供し、その自己免疫疾患は下記からなる群より選ばれる：炎症性腸疾患、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、乾癬、糖尿病および喘息。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程；Ｔ細胞にｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子を形質導入する工程；形質導入されたＴ細胞を増加させる工程；および形質導入されたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者における自己免疫疾患は阻害される。
【００３５】
１つの好ましい実施形態において、患者での自己免疫応答を阻害する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程；Ｔ細胞にレトロウイルスベクターに含まれるｓｃｕｒｆｉｎ遺伝子を形質導入する工程；形質導入されたＴ細胞を増加させる工程；および形質導入されたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者における自己免疫疾患は阻害される。
【００３６】
他の好ましい実施形態において、患者での疾患に対する自己免疫応答を強化する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程、Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ発現を阻害するテスト化合物でトランスフェクトする工程、トランスフェクトされたＴ細胞を増加させる工程、およびトランスフェクトされたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者における疾患に対する免疫疾患は強化される。
【００３７】
他の好ましい実施形態において、患者でのＨＩＶおよび癌に対する免疫応答を強化する方法を提供する。その方法は、患者からＴ細胞を単離する工程、Ｔ細胞をｓｃｕｒｆｉｎ発現を阻害するテスト化合物でトランスフェクトする工程、トランスフェクトされたＴ細胞を増加させる工程、およびトランスフェクトされたＴ細胞を該患者に再導入する工程を包含し、ここで患者におけるＨＩＶまたは癌に対する免疫応答は強化される。
【００３８】
本発明のこれらおよびその他の局面は、下記の詳しい説明および添付の図面を参照すれば明白になる。また、より詳しい特定の手法または組成物（例えば、プラスミド等）を記載している種々の参考文献を挙げ、その全体が参考として援用される。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、調節性Ｔ細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットの生産および／または活性に係わるｓｃｕｒｆｉｎ蛋白質の発見に関する。Ｆｏｘｐ３発現は、この調節性表現型の細胞と直接相関し、その発現は、この特定サブセットの活性化の際にユニークに増加する。突然変異（ｓｆ）動物は、このサブセットに欠けて、Ｆｏｘｐ３トランスジェニック動物は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の増加した割合を有するようである。更に、トランスジェニック動物由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットは、細胞ごとに基づき抑制的でないようであるが、Ｆｏｘｐ３の発現は、やはりそのＣＤ２５−対応物に対してこのサブセットにて上昇する。面白くも、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の過剰発現は、これらの細胞に抑制活性を付与するが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞より低い効果に止まる。結局、このデータは、最近述べられた転写因子、ｓｃｕｒｆｉｎが免疫細胞機能の重要な調節剤であり、主としてＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の生産および／または活性を経て働き得ることを示唆する。
【００４０】
実施例からの結果、ｓｃｕｒｆｉｎ（Ｆｏｘｐ３遺伝子）の発現は、調節性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞活性を部分的に経て免疫系を下方調節することができる。結果的に、内因性Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現がＴ細胞に誘導できれば、色々な自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、多発硬化症、リュウマチ様関節炎、乾癬、糖尿病、および喘息またはその他の状況、例えば、移植片対宿主疾患における免疫応答の下方調節に用いられ得る。更に、ｓｃｕｒｆｉｎ発現は、癌またはＡＩＤＳにおける免疫系を下方調節して、活性化することができる。
【００４１】
定義
本発明を詳しくする前に、以下に特定の用語の定義を示し、そして本明細書以降で使用する略語をリストし定義することは、これらを理解するために有用であり得る。
【００４２】
”Ｓｃｕｒｆｙ”は、重症リンパ増殖性疾病を呈する、マウスの遺伝性疾患を指す（例えば、Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３，１９９０参照）。原因遺伝子（その突然変異型は該疾患の原因である）は配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏｓ．１および３に示す。
【００４３】
”Ｆｏｘｐ３”は、フォークヘッドドメインを含む遺伝子を指し、これはｓｃｕｒｆｙマウス突然変異株にて突然変異された。”Ｆｏｘｐ３”は、マウスＦｏｘｐ３遺伝子によってエンコードされる蛋白質を指す。”ＦＯＸＰ３”は、マウスＦｏｘｐ３のヒトオルソログを指す。”ＦＯＸＰ３”は、ヒトＦＯＸＰ３遺伝子によりエンコードされた蛋白質。マウスＦｏｘｐ３およびヒトＦＯＸＰ３のｃＤＮＡ配列は、米国特許出願０９／３７２，６６８に開示され、それにはマウスｓｃｕｒｆｙ遺伝子をＦｋｈｓｆに、ヒトオルソログをＦＫＨｓｆに指定する。ヒトＦＯＸＰ３ゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２３５０８７に開示している。Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＡＦ２３５０９７および米国特許出願０９／３７２，６６８は、全目的のためにその全体を参考文献とする。
【００４４】
”分子”は、蛋白質またはペプチド（例えば、抗体、組換え結合パートナー、所要の結合親和性を有するペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸分子、および核酸類縁物（例えばＰＮＡ））、および有機または無機化合物を包括することが理解される。
【００４５】
”核酸”または”核酸分子”は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生産された断片、および連結、分離、エンドヌクレアーゼ作用、およびエクソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生産された断片のいずれかを指す。核酸は、天然に発生のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、または天然に発生のヌクレオチドの類縁物（例えば、天然に発生のヌクレオチドのα−鏡像異性体型）、または両者の併合よりなる単量体から構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に修飾を有し得る。糖修飾は、例えば、一以上の水酸基がハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基で置換された糖を含むか、または糖は、エーテル類またはエステル類として機能する。更に、全糖部分は、立体的および電子的に類似の構造、例えばアザ糖類および炭環状糖類縁物で置換される。塩基部分における修飾の例は、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、またはその他の周知の複素環の置換基を包括する。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような結合の類縁物で連結され得る。ホスホジエステル結合の類縁物は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート等を包括する。名詞”核酸”とは天然に発生のまたは修飾の核酸塩基がポリアミドバックボーンに付着した所謂”ペプチド核酸”も包括する。核酸は、一本鎖または二本鎖でもよい。
【００４６】
”単離核酸分子”とは生物のゲノムＤＮＡに組み込まれてない核酸分子である。例えば、真核細胞のゲノムＤＮＡから分離された遺伝子に応答するＤＮＡ分子は単離ＤＮＡ分子であり、単離核酸分子の他の例は、生物のゲノムに組み込まれてない化学合成核酸分子である。
【００４７】
”プロモーター”は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列である。典型的にプロモーターは、遺伝子の５’域に位置され、構造遺伝子の転写開始サイトに近い。もしプロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は誘導剤に応答して増加する。これと反して、もしプロモーターが構成的プロモーターである場合、転写速度は誘導剤により調節されない。
【００４８】
”ベクター”は所要蛋白質の発現を指向できるアセンブリーを指す。ベクターは操作可能に対象の遺伝子に連結する転写プロモーターエレメントを包括する。ベクターは、デオキシリボ核酸（”ＤＮＡ”）、リボ核酸（”ＲＮＡ”）、または両者の組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）から構成され得る。ベクターは、任意にポリアデニル化配列、一以上の制限酵素切断サイト、並びに一以上の選択性マーカー、例えばネオマイシンリン酸転移酵素またはハイグロマイシンリン酸転移酵素を包括し得る。また、選ばれた宿主細胞および使用されたベクターに依存して、その他の遺伝子エレメント、例えば、複製起点、追加核酸制限認識サイト、エンハンサー、転写の誘導性を付与する配列、および選択性マーカーも上記ベクターに加える。
【００４９】
”単離された”は、蛋白質またはポリペプチドに関する場合、分子が他の生物学的マクロ分子が殆どなく存在することを指し、クーマシーブルー染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで通常単一バンドとして現れる。”単離された”は有機分子に関する場合、当該分野で周知の方法（例えば、ＮＭＲ、融点）を利用して、化合物の純度が９０％より高いこと意味する。
【００５０】
”クローニングベクター”は、例えば、宿主細胞において自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子を指す。クローニングベクターは、通常に外来のヌクレオチド配列がベクターの必要な生物機能を失わない決定可能な方式で挿入できる一または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識サイト、およびクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択での使用に適切なマーカー遺伝子をエンコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は、通常テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００５１】
”発現ベクター”は、宿主細胞にて発現される遺伝子をエンコードする核酸分子を指す。通常に、遺伝子発現は、プロモーターの制御下に置かれ、任意に、少なくとも一つの調節エレメントの制御下に置かれれる。このような遺伝子は、プロモーターに”操作可能に連結される”と言われる。同じく、調節エレメントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの活性を調節する場合、作動可能に連結される。
【００５２】
”組換え宿主”は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む原核または真核細胞のいずれかを指す。この用語は、宿主細胞の染色体またはゲノム中に遺伝子工学でクローンされた遺伝子を含むように操作された原核または真核細胞も包括する。
【００５３】
真核細胞において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、構造遺伝子を転写してｍＲＮＡを生産することを触媒する。核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含むように設計することができる、その内ＲＮＡ転写は特定ｍＲＮＡに相補的な配列を有する。このＲＮＡ転写は”アンチセンスＲＮＡ”と称し、アンチセンスＲＮＡをエンコードする核酸分子は”アンチセンス遺伝子”と称する。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合でき、ｍＲＮＡ翻訳を阻害する。
【００５４】
”Ｆｋｈｓｆに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”または”Ｆｋｈｓｆアンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）該遺伝子の一部と安定な三重螺旋を形成できる、または（ｂ）ｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重螺旋を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。同じく、”Ｆｋｈｓｆに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”または”Ｆｋｈｓｆアンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）該Ｆｋｈｓｆ遺伝子の一部と安定な三重螺旋を形成できる、または（ｂ）該Ｆｋｈｓｆ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重螺旋を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００５５】
”リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語はＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子を含む。リボザイムをエンコードする核酸分子を”リボザイム遺伝子”と称する。
【００５６】
略語：ＹＡＣ：酵母人工染色体；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写酵素（ＲＴ）を用いて最初の工程でＲＮＡを初めてＤＮＡに転写するＰＣＲ法；ｃＤＮＡ：ＲＮＡ配列をＤＮＡ形態にコピーして作られた任意のＤＮＡ。本明細書中で使用する場合、”Ｆｋｈｓｆ”とはＦｋｈｓｆ遺伝子（遺伝子がヒト、哺乳類、またはその他いずれの温血動物由来かに拘わらない）の遺伝子産物を指す。大文字”ＦＫＨｓｆ”の場合、遺伝子産物（および遺伝子）はヒト由来であると理解されるべきである。
【００５７】
上記の通り、本発明は一般に医薬品および方法、特に、ｓｃｕｒｆｙ−相関疾病の診断に有用な方法および組成物、および免疫系を調節できる化合物を同定する方法に関する。
【００５８】
以下、更に詳しくこの発見を討論することにより、免疫系のアゴニストまたは拮抗剤として作用し得る分子を選ぶに利用され得るアッセイの開発を導いている。更に、このようなアッセイは、免疫系調節と同じく活性な他の遺伝子および遺伝子産物を同定するために利用され得る。
【００５９】
Ｓｃｕｒｆｙ
簡潔には、本発明は、Ｆｋｈｓｆをエンコードする遺伝子における突然変異が、脾腫、肝腫、大きく拡大したリンパ節、ラント症候群、剥脱性皮膚炎、および厚悪形耳を含む粗大な形態学的症状を生じるリンパ節、脾臓、肝臓および皮膚の進行性リンパ球浸潤によって特徴付けられる希少な状況（ｓｃｕｒｆｙ）を生じるという意外な発見に基づく（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９，１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５５２８，１９９１）。羽付き螺旋（ｗｉｎｇｅｄ−ｈｅｌｉｘ）ファミリーのこの新メンバーは、免疫系の新規構成要素を代表する。
【００６０】
下記実施例１にｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子の発見に利用された方法を提供する。下記実施例２および３にマウスｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子およびヒトオルソログのクローニング方法を提供する。トランスジェニックマウスを利用して決定するように遺伝子の正体および遺伝子機能との相関を確認する方法も実施例に提供する。
【００６１】
本発明は、Ｆｋｈｓｆ遺伝子および遺伝子産物の存在を決定する方法も提供する。１実施形態において、そのような方法は、（ａ）Ｆｋｈｓｆ特異的核酸プローブを（ｉ）生物サンプルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成された核酸分子のいずれかとハイブリダイズする条件下で接触させる一般的工程（ここで、プローブは、Ｆｋｈｓｆヌクレオチド配列の少なくとも一部分を認識する）、および（ｂ）該核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する一般的工程、を包含する。色々な方法が、選択された配列を増幅するに用いられ得、これらの方法には、例えば、ＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２，１９８８；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：４０１−０２，１９８９；Ｌｏｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．３５（９）：１８２６−３１，１９８９；米国特許４，７８６，６００参照）、およびポリメラーゼ連鎖反応（”ＰＣＲ”）を用いた核酸増幅（米国特許４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、および４，８００，１５９参照）、逆転写酵素−ＰＣＲおよびＣＰＴ（米国特許４，８７６，１８７、および５，０１１，７６９参照）が挙げられる。
【００６２】
あるいは、抗体をＦｋｈｓｆ遺伝子産物の存在の検出に利用できる。特に、１実施形態において、生物サンプルにおけるＦｋｈｓｆペプチド、またはその突然変異株形態の存在を検出する、下記工程を含む具体的方法が提供される：（ａ）生物サンプルを抗Ｆｋｈｓｆ抗体または抗体断片と接触させる工程（該接触は該抗体または抗体断片の生物サンプルへの結合を許す条件で行う）、および（ｂ）任意の結合された抗体または結合された抗体断片を検出する工程。
【００６３】
このような方法は、広汎なバラエティのアッセイフォーマットで達成され得る、これには、例えば、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、放射免疫検定法、放射免疫沈澱、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｄｏｔ Ｂｌｏｔアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ（米国特許４，３７６，１１０および４，４８６，５３０；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，前出も参照）が挙げられる。
【００６４】
核酸分子、蛋白質、および蛋白質の生産方法
本明細書中で、色々なＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ蛋白質および核酸分子（またはその部分）が提供されたが、本発明に関して、一つ以上のこれらの蛋白質に対する言及は、実質的に類似な活性の蛋白質を含むと理解されるべきであることが理解される。本明細書中で使用する場合、蛋白質は、以下の場合、”実質的に類似”であると考えられる：（ａ）蛋白質をエンコードする遺伝子のコード領域から誘導されたヌクレオチド配列によりエンコードされる場合（例えば、配列の部分または配列の対立遺伝子バリエーションを含む）；（ｂ）中度、高度もしくは極高度のストリンジェンシーの下、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、または少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上が本明細書中で開示した配列と相同である場合、あるいは、（ｃ）ＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）に規定したＤＮＡ配列に対して、遺伝子コードの結果として縮重している場合。また、本明細書中に開示される核酸分子は、相補的配列および非相補的配列を含み、ただし、配列は、さもなければ本明細書に示される基準に符合する。本発明において、高度のストリンジェンシーとは標準ハイブリダイゼーション条件を意味する（例えば、６５℃で５ＸＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ、または相当するもの）。ハイブリダイゼーションの目的に、アミノ端ドメイン、ジンクフィンガードメイン、中間部ドメイン、またはフォークヘッドドメインをエンコードした核酸分子（実施例１０参照）を利用できる。
【００６５】
本明細書に記載される核酸分子でエンコードされた蛋白質の構造は、例えば、Ｐ／Ｃ ＧｅｇｅまたはＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３２，１９８２）による方法に従う、疎水性プロット関数を用いて一次翻訳産物より予測できる。
【００６６】
本発明の蛋白質は、酸性塩形態または塩基性塩形態、または中性形態でされ得る。また、個別のアミノ酸残基は、酸化または還元により修飾できる。更に、色々な置換、欠失、または付加をアミノ酸または核酸配列に行える。その正味の効果は、突然変異型または野生型蛋白質の生物活性を保持またはさらに強化もしくは減少させる。また、遺伝子コードの縮重により、例えば、同じアミノ酸配列をエンコードしたヌクレオチド配列におけるバリエーションが考えられ得る。
【００６７】
本明細書中に開示される蛋白質の他の誘導体として、他の蛋白質またはポリペプチドとのこの蛋白質の結合体が挙げられる。これは、例えば、蛋白質の純化または同定をし易くする為に加えられ得るＮ−端またはＣ−端融合蛋白質の合成により達成され得る（米国特許４，８５１，３４１、およびＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：１２０４，１９８８参照）。別に、融合蛋白質（例えば、ＦＫＨ−ルシフェラーゼまたはＦｋｈ−ルシフェラーゼあるいはＦＫＨ−ＧＦＰまたはＦｋｈ−ＧＦＰ）は、蛋白質の同定、発現、および分析を補助する為構築され得る。
【００６８】
本発明の蛋白質は、本明細書中に記載の広汎なバラエティの技術で構築され得る。また、突然変異は、天然配列の断片に連結できる制限エンドヌクレアーゼ認識サイトに隣接する突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の座位に導入され得る。連結後、得られた再構築配列は、希望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する誘導物をエンコードする。
【００６９】
別に、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的サイト（またはセグメント特異的）突然変異の生成手法は、求められる置換、欠失、または挿入により変化する特定のコドンを有する変化遺伝子を提供するに用いられ得る。上記変化作成の例示的方法は、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）により開示されている。蛋白質の欠失または短縮誘導物（例えば、可溶性細胞外部分）も希望の欠失に隣接する手近な制限エンドヌクレアーゼサイトを利用して構築され得る。制限エンドヌクレアーゼ消化の次に、オーバーハングを填入し、ＤＮＡを再結合する。上記変化作成の方法の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）により開示されている。
【００７０】
本発明の核酸分子に作成される突然変異は、好ましくはコード配列のリーディングフレームを保存する。更に、突然変異は、好ましくはハイブリダイズしてｍＲＮＡの翻訳に不良な影響を及ぼす二次ｍＲＮＡ構造、例えば、ループまたはヘアピンを生成する相補的領域を作らない。突然変異サイトは予定できるが、突然変異自体の性質は予定する必要がない。例えば、所定サイトでの突然変異の最適特徴を選択するため、ランダムな突然変異生成を目標コドンで行い得、そして発現突然変異株を指示的な生物活性についてスクリーニングし得る。別に、天然配列の断片に連結できる制限サイトに隣接する突然変異株配列を含むオリゴヌクレオチドを合成して突然変異を特定の座位に導入し、を側面連接する。連結後、得られた再構築配列は希望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する誘導物をエンコードしている。突然変異は、蛋白質の活性を保存または増加させる、または蛋白質を減少または無能にする目的で導入され得る（例えば、突然変異株Ｆｋｈ）。
【００７１】
本発明の蛋白質をエンコードする核酸分子は、ＰＣＲ突然変異生成の技術、化学突然変異生成（Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，ＰＮＡＳ ８３：３４０２−０６，１９８６）、強制ヌクレオチド誤組み込み（例えば、Ｌｉａｏ ａｎｄ Ｗｉｓｅ Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１，１９９０）、またはランダムな突然変異オリゴヌクレオチドの使用（Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１７，１９８９）を利用しても構築できる。
【００７２】
本発明は、上記の遺伝子を発現できるベクターを含む宿主細胞の培養により上記遺伝子の操作および発現も提供する。このようなベクターまたはベクター構築物は、希望の蛋白質をエンコードした合成核酸分子またはｃＤＮＡ誘導核酸分子のいずれかを含み、これは適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、昆虫、または植物の遺伝子を含む色々なソースから誘導され得る。適切な調節エレメントの選択は、選ばれた宿主細胞に依存し、当業者により容易に達成され得る。調節エレメントの実例には、転写プロモーターおよびエンヘンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、および翻訳開始シグナルを含むリボゾーム結合配列を挙げられる。
【００７３】
上記蛋白質のいずれかをエンコードする核酸分子は、細菌、哺乳類、酵母またはその他の真菌、ウイルス、昆虫、または植物細胞を含む広汎なバラエティの原核および真核宿主細胞により容易に発現され得る。このような細胞に外来のＤＮＡを発現させる形質転換またはトランスフェクションする方法は当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，７０４，３６２；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−３３，１９７８；Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許 ４，８０１，５４２；Ｕｐｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，米国
特許４，９３５，３４９；Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，７８４，９５０；Ａｘｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，３９９，２１６；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，７６６，０７５；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；植物細胞についてはＣｚａｋｏ ａｎｄ Ｍａｒｔｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７−７１，１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−９２，１９９２参照）。
【００７４】
本発明を行う適切な細菌の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する色々な種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が挙げられる。細菌宿主細胞の代表的実例としてＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【００７５】
細菌の発現ベクターは、好ましくは宿主細胞にて機能するプロモーター、一以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌複製起点を含む。代表的なプロモーターとして、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖プロモーター系（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８参照）、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８７：１２３−２６，１９９０）、ｔｒｐプロモーター（Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５，１９８３）およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２０：２３１，１９８２）が挙げられる。代表的な選択マーカーには、例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子等の色々な抗生物質耐性マーカーが含まれる。宿主細胞の形質転換に適切な多くのプラスミドは当該分野で周知であり、とりわけ、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２：９５，１９７７）、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７，１９８３およびＶｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ １９：２５９−６８，１９８２参照）、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【００７６】
本発明を行う適切な酵母および真菌宿主細胞として、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の色々な種（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９３５，３４９）が挙げられる。酵母および真菌に適切な発現ベクターとして、とりわけ、酵母についてＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７４１９）、およびａｍｄＳクローニンベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１６９，１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８：１２１−３３，１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４−０８，１９７８）およびその誘導物が挙げられる。
【００７７】
酵母に適用の好ましいプロモーターとして、酵母糖分解遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−０８０，１９８０；Ａｌｂｅｒ ａｎｄ Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−３４，１９８２）またはアルコール脱水素酵素遺伝子（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２，ｐ．３５５；Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１，１９８３）由来のプロモーターが挙げられる。真菌ベクターに有用なプロモーターの実例として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ 糖分解の遺伝子から誘導された、例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−９９，１９８５）が挙げられる。この発現ユニットは、転写ターミネーターも含み得る。適切なターミネーターの実例はａｄｈ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．，１９８５）。
【００７８】
細菌のベクターのように、酵母ベクターは、一般に選択マーカーを含み、表現型分析が、変換株が選択可能なように存在する優性表現型を呈するいずれかのうちの一つの遺伝子であり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完するか、抗生物質耐性を提供するかまたは細胞が特定の炭素源を利用できるようにするマーカーであり、そして、ｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８：１７，１９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．）が挙げられる。別の適切な選択マーカーは、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するｃａｔ遺伝子である。
【００７９】
真菌の形質転換技術は文献に周知であり、例えば、Ｂｅｇｇｓ （ｉｂｉｄ．）、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−３３，１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１７４０−４７，１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３０１：１６７−６９，１９８３）に開示している。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクターに存在する選択可能なマーカーにより補足される遺伝子欠陥を含み得る。特定の宿主および選択可能なマーカーの選択は当該分野の通常の技術レベル内である。
【００８０】
酵母の形質転換のプロトコルも当業者に周知である。例えば、ＤＮＡで酵母のスフェロプラストを製造するか（Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７８を参照のこと）またはアルカリ塩、例えばＬｉＣｌで処理する（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３，１９８３を参照のこと）ことにより形質転換が容易に達成され得る。真菌の形質転換も、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３６９，１９８７）に記載されるように、ポリエチレングリコールを用いて行われ得る。
【００８１】
ウイルスベクターとして、上記のような希望の蛋白質をコードした単離核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むものが挙げられる。広汎なバラエティのプロモーターが本発明の状況において利用され得、例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、Ｆｒｉｅｎｄ ＭｕＬＶ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター （Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−８４，１９９４）、ネオマイシンリン酸基転移酵素プロモーター／エンハンサー、後期パーボウイルスプロモーター （Ｋｏｅｒｉｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−６３，１９９４）、疱疹ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／プロモーター、巨細胞ウイルス早期即時のプロモーター、および巨細胞ウイルス後期即時のプロモーター等のプロモーターが挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ ９１／０２８０５； ＥＰ ０，４１５，７３１；およびＷＯ ９０／０７９３６）である。適切な組織特異的プロモーターの代表例として、神経特異的エノラーゼプロモーター、血小板誘導の成長因子βプロモーター、ヒトα１−キマエリンプロモーター、シナプシンＩプロモーターおよびシナプシンＩＩプロモーターが挙げられる。上記プロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記、および他の例えばＨＩＶ プロモーターを含む）、肝炎、疱疹（例えば、ＥＢＶ）、および細菌、真菌または寄生虫（例えば、マラリア）特異的プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫に感染した特定の細胞および組織を標的化するために利用され得る。
【００８２】
本発明を行うに適切な哺乳類の細胞として、ＰＣ１２ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、Ｎ１Ｅ−１１５ 神経芽細胞腫、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ 神経芽細胞腫、ＳＨＳＹ５ アドレナリン作用性神経芽細胞腫、ＮＳ２０ＹおよびＮＧ１０８−１５マウスコリン作用性細胞株、またはラットＦ２後根神経節細胞株、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ６２８１； ＢＨＫ ５７０ 細胞株（受託番号ＣＲＬ １０３１４としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託））、ＣＨＯ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ ６１）、ＨｅＬａ （例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ２）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５７３； Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）およびＮＳ−１細胞が挙げられる。本発明に用いられ得る他の哺乳類の細胞株として、ラット Ｈｅｐ Ｉ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １６００）、ラットＨｅｐ ＩＩ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １３９）、ヒト肺 （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ７５．１）、ヒト肝癌 （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−５２）、Ｈｅｐ Ｇ２ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ ８０６５）、マウス肝臓（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ２９．１）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ９．１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５８１）、ＨＩＴ−Ｔ１５ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７７７）、Ｊｕｒｋａｔ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．Ｔｉｂ １５２）およびＲＩＮｍ ５ＡＨＴ２Ｂ （Ｏｒｓｋｏｖ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｏｎ，ＦＥＢＳ ２２９（１）：１７５−１７８，１９８８）が挙げられる。
【００８３】
本発明を実施する際の使用のための哺乳類の発現ベクターとして、クローン遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向し得るプロモーターが挙げられる。好ましいプロモーターとして、ウイルスプロモーターおよび細胞のプロモーターがある。ウイルスプロモーターには、巨細胞ウイルス早期即時のプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−３０，１９８５）、巨細胞ウイルス後期即時のプロモーター、ＳＶ４０ プロモーター （Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−６４，１９８１）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａが挙げられる。細胞のプロモーターには、マウスメタロチオネイン−１ プロモーター （Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許 ４，５７９，８２１）、マウスＶκ プロモーター （Ｂｅｒｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７０４１−４５，１９８３； Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４９６，１９８７）およびマウスＶＨプロモーター （Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３，１９８３）が挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも一部は所望の発現のレベルまたはトランスフェクトされるレシピエント細胞株により決まる。
【００８４】
このような発現ベクターは、プロモーターからの下流および目的のペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡ配列からの上流に位置するＲＮＡスプライス部位のセットも含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。目的のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルもまた発現ベクターに含まれる。適切なポリアデニル化シグナルとして、ＳＶ４０からの早期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ｉｂｉｄ．）、アデノウイルス５ Ｅ１Ｂ領域およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーターからのポリアデニル化シグナル（ＤｅＮｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３０，１９８１）が挙げられる。発現ベクターとして、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する非コードウイルスリーダー配列（例えば、アデノウイルス２三連リーダー）が挙げられ得る。好ましいベクターには、エンハンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサー配列も含まれ得る。発現ベクターには、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列も含まれる。適切な発現ベクターは、市場から得られ得る（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【００８５】
クローン化されたＤＮＡ配列を含むクター構築物を、培養された哺乳類の細胞に、例えば、リン酸カルシウム−媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４：７２５，１９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３，１９８１； Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７３）、エレクトロポレーション （Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−４５，１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７）により導入することができる。クローンＤＮＡが安定に組み込まれた細胞を同定するため、一般に選択可能なマーカーを目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞へ導入する。培養された哺乳類の細胞に用いる好ましい選択可能なマーカーとして、薬物（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。他の選択可能なマーカーとして、蛍光蛋白質、例えば、ＧＦＰ （緑色蛍光蛋白質）またはＢＦＰ （青色蛍光蛋白質）が挙げられる。選択可能なマーカーは、増幅可能な選択可能なマーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択可能なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙによりレビューされている（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）。
【００８６】
適切なベクターを含む哺乳類の細胞は、一定期間、通常１−２日間増殖させられ、目的のＤＮＡ配列の発現を開始する。次に薬物選択は、安定な方式で選択可能なマーカーを発現している細胞の増殖を選択するように適用される。増幅可能な選択可能なマーカーでトランスフェクトされた増殖細胞に対して、薬物濃度を段階的な様式で増加させ、増加したコピー数のクローン配列を選択することにより発現レベルを増加し得る。導入された配列を発現している細胞を希望の形態または希望のレベルでの目的の蛋白質の産生について選択しスクリーニングする。次にこれらの基準を満足した細胞をクローン化し得、そして生産規模にする。細胞は流動細胞算器を用いてＧＦＰ−ポジティブ細胞を選ぶことにより、そのＧＦＰの発現に基づいて、トランスフェクションについて選択され得る。
【００８７】
哺乳類細胞のトランスフェクションのプロトコルは当業者に周知である。代表的な方法として、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス、アデノウイルスおよび原形質体融合−媒介移入（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）が挙げられる。裸のベクター構築物は、哺乳類（または他の動物）の筋肉に注射した後、筋肉細胞または他の適切な細胞に取り入れられ得る。
【００８８】
当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞も、本明細書を考慮して、本発明において有用であり得る、例えば、昆虫細胞において異種のＤＮＡ配列を発現するベクターとしてバキュロウイルスを使用することが、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２４，１９９０）にレヴューされている。
【００８９】
当該分野で公知の多数の植物宿主細胞も、本明細書を考慮して、本発明において有用であり得る、例えば、植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを使用することがＳｉｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ） １１：４７−５８，１９８７）にレヴューされている。
【００９０】
本発明の関連した局面において、本発明の蛋白質は、生殖細胞および体細胞遺伝子が、希望の蛋白質をコードし、そして、その遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結される遺伝子を含むトランスジェニック動物において発現され得る。あるいは、類似な方式で希望の遺伝子が欠けてるトランスジェニック動物（例えば、“ノックアウト”マウス）を調製し得る。このようなトランスジェニックは、マウス、ラット、兎、羊、犬、山羊および豚を含む色々な非ヒト動物で調製し得る（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−８３，１９８５，Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−１４，１９８３，Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４２，１９８５，Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ ４１：３４３−４５，１９８５，ａｎｄ 米国特許５，１７５，３８３， ５，０８７，５７１， ４，７３６，８６６， ５，３８７，７４２， ５，３４７，０７５， ５，２２１，７７８，および５，１７５，３８４）。要するに、適切に位置付けた発現制御配列と一緒に発現される核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、顕微鏡下注射により受精卵の前核に導入される。注射済みＤＮＡの組込みは、組織サンプルからのＤＮＡのブロット分析で検出される。好ましくは、動物の後代に伝えるように導入したＤＮＡを動物の生殖細胞系に組み込む。組織特異的発現は、組織特異的プロモーター、または、例えば、メタロチオネイン遺伝子プロモーター等の誘導性プロモーターを用いて達成し得る（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ｉｂｉｄ）、これは導入遺伝子の調節された発現を許す。
【００９１】
天然発生ｓｃｕｒｆｙ突然変異体（“ｓｆ”）以外のＦｋｈｓｆの突然変異型または天然発生突然変異体と遺伝背景が異なる突然変異型を産生する動物は、本明細書の開示を考慮すれば、容易に産生され得る。
【００９２】
蛋白質は、とりわけ、適切な宿主およびベクター系を培養し、本発明の組換え翻訳物を生産する方法で単離される。次にこのような細胞株からの上澄、または蛋白質が上澄に排泄されない蛋白質含有物または全細胞を、希望の蛋白質を単離するための色々な精製手法で処理し得る。例えば、上澄を先ず、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットのような市販の蛋白質濃縮フィルターを用いて濃縮し得る。濃縮後、濃縮液を適切な精製マトリックス（例えば、適切なサポートに結合した抗蛋白質抗体）に施し得る。あるいは、アニオンまたはカチオン交換樹脂を蛋白質の精製に用いる。または、一つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて更に蛋白質を精製し得る。本発明の蛋白質を単離する他の方法は当該分野で周知技術である。
【００９３】
本発明において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の次にクーマシーブルー染色を行い他の蛋白質（望まれていない）が検出されない場合、蛋白質は“単離された”と認定する。他の実施形態において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の次に銀染色を行い他の蛋白質（望まれていない）が検出されないように所望の蛋白質を単離し得る。
【００９４】
免疫系を調節する分子の選択分析
上記の通り、本発明は免疫系を調節できる分子の選択および／または単離する方法を提供する。適切な分析の代表例は、酵母と哺乳類の２−ハイブリッド系（例えば、Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：９５４，１９９１； Ｆｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７９５８，１９９２）、ＤＮＡ結合分析、アンチセンス分析、伝統的蛋白質結合分析（例えば、１２５Ｉまたは経時解析蛍光）、ゲル電気泳動および直接蛋白質シークエンシングを組み合わせた免疫沈澱、Ｆｋｈｓｆ調節された遺伝子の転写分析、サイトカイン生産および増殖分析を含む。
【００９５】
例えば、一実施形態において、Ｆｋｈｓｆと直接作用する蛋白質は、例えば、酵母２−ハイブリッド結合系のような分析で検出され得る（例えば、米国特許５，２８３，１７３、５，４６８，６１４、５，６１０，０１５、および５，６６７，９７３）。要するに、２−ハイブリッド系には、ＤＮＡ−結合領域−Ｆｋｈｓｆ 蛋白質の融合（例えば、ＧＡＬ４−Ｆｋｈｓｆ融合）は、選択可能なマーカー遺伝子に連結されるＧＡＬ４結合部位を含む細胞に構築され、トランスフェクトされる。全Ｆｋｈｓｆ蛋白質またはＦｋｈｓｆの次領域を使うことができる。ＧＡＬ４活性化域に融合されたｃＤＮＡのライブラリーも構築され、同時トランスフェクトされる。ｃＤＮＡ−ＧＡＬ４活性化領域融合中のｃＤＮＡは、Ｆｋｈｓｆと相互作用する蛋白質をコードすれば、選択可能なマーカーは発現される。次にｃＤＮＡを含む細胞は増殖し、構築物は、単離され特徴化される。他の分析も相互作用している蛋白質を同定するために用いられ得る。このような分析として、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、共免疫沈澱、インビトロ転写／翻訳分析等があげられる。
【００９６】
本発明の別の局面において、選択された分子が免疫系を調節できるか否かを決定するために下記の工程を含む方法が提供される：（ａ）選択された候補分子を、Ｆｋｈｓｆ、または、突然変異株Ｆｋｈｓｆを発現する細胞に曝す工程、および（ｂ）該分子がＦｋｈｓｆの活性を調節できるか否かを決定し、それにより該分子が免疫系を調節できるか否かを決定する工程。このテスト用の細胞は、（ａ）正常のリンパ球、（ｂ）ＦＫＨｓｆ（またはＦｋｈｓｆ）蛋白質（またはその突然変異形態）を過剰発現するよう設計した細胞株、または（ｃ）該蛋白質を発現するよう設計したトランスジェニック動物から誘導され得る。このようなトランスジェニックマウスからの細胞は、一部は、細胞数の減少および色々な刺激に対する応答性の減少を含む低応答性状態にあることで特徴付けられる（例えば、実施例 ８）。
【００９７】
本明細書中で記載される方法は、個別の試験分子の分析をいい得、本発明をそう制限すべきではないことに留意すべきである。特に、選択された分子は、化合物の混合物に含まれ得る。従って、記載された方法は、更に希望の分子を単離する工程を含み得る。また、候補分子は、例えば、Ｔ−細胞増殖、サイトカイン生産等を含む多数のパラメーターにより免疫系を調節できる能力について評価され得る。
【００９８】
候補分子
広汎なバラエティの分子は、その免疫系を調節する能力について分析され得る。以下でさらに詳細に議論される代表例、有機分子、蛋白質またはペプチド、および核酸分子が挙げられる。
【００９９】
１．有機分子
多数の有機分子は、その免疫系を調節する能力について分析され得る。例えば、本発明の一実施形態において、適切な有機分子は、化学品を個別に分析する化学ライブラリー、または複数の化合物を一度に分析し、次いで、最も活性な化合物を決定し、単離するようにデコンボレーションされるコンビナトリアル化学ライブラリーのいずれかから選択され得る。
【０１００】
このようなコンビナトリアル化学ライブラリーの代表例として下記に記載のものが挙げられる：Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｄｅｓｉｒｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”米国特許５，４６３，５６４； Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，”ＷＯ９５／０２５６６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ，” ＷＯ９５／２４１８６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ ｌｉｂｒａｒｙ，” ＷＯ９５／３０６４２； Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，“Ｎｅｗ ｋｉｔ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” ＷＯ９５／１６９１８； Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，” ＷＯ９５／１６７１２； Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，“Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ，” 米国特許５，２８８，５１４； Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” ＷＯ９５／１６２０９； Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” ＷＯ９３／２０２４２； Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌｉｂｒａｒｙ，” ＷＯ９５／０４２７７； Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｄ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ，“Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ，” 米国特許５，５０６，３３７； Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓ，Ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，” ＷＯ９６／００１４８； Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｂ．ａｎｄ Ｇ．Ｐ．Ｗｅｉ，“Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ，” Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７：４８８７−９０，１９９６； Ｒｕｈｌａｎｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ β−Ｌａｃｔａｍｓ，” Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３−５４，１９９６； Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ４−Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” Ｂｉｏｏｒｇ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：７０７−１２，１９９６。
【０１０１】
２．蛋白質およびペプチド
広汎な蛋白質およびペプチドは、免疫系を調節するために候補分子と同様にに用いられる。
【０１０２】
ａ．組み合わせペプチドライブラリー
免疫系を調節するペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを経て得られ得る。このようなライブラリーは当業者により調製され得るか（例えば、米国特許４，５２８，２６６および４，３５９，５３５，およびＰａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＷＯ ９２／１５６７９，ＷＯ ９２／１５６７７，ＷＯ ９０／０７８６２，ＷＯ ９０／０２８０９を参照のこと）、または販売元から購入され得る（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ）。
【０１０３】
ｂ．抗体
免疫系を調節する抗体は、本明細書中の開示を考慮して容易に製造され得る。本発明において、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、アンチイデオタイプ抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ可変領域、または相補性決定領域）を含むことが理解される。上記の通り、抗体は１０７Ｍ以上、好ましくは１０８Ｍ以上のＫａで結合した場合、Ｆｋｈｓｆに対して特異的であると理解される。モノクロナール抗体または結合パートナーの親和性、および結合の阻害は、当業者により容易に決定できる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−７２，１９４９）。
【０１０４】
要するに、ポリクロナール抗体は、当業者により色々な温血動物、例えば馬、牛、色々な鳥、兎、マウス、またはラットから容易に産生され得る。通常、Ｆｋｈｓｆ、またはそのユニークな１３−２０アミノ酸のペプチド（好ましくはグルタルアルデヒドとの架橋によりキーホールリンペットヘモシアニンに接合する）を用いて、例えば、フロインド完全または不完全アジュバント等と共に腹腔内、筋肉内、眼内、または皮下注射で動物を免疫させる。若干の追加免疫後、血漿のサンプルを集めて蛋白質またはペプチドに対する反応性をテストする。特に好ましいポリクロナール抗血清は、これらの分析の一つにおいてバックグラウンドよりも少なくとも三倍大きいシグナルを与えた。一旦、動物の力価において、蛋白質に対する反応性についてプラトーに達したら、毎週の採血または全採血のいずれかにより大量の抗血清が容易に得られ得る。
【０１０５】
モノクロナール抗体は伝統的な技術を用いても容易に産生され得る（米国特許ＲＥ ３
２，０１１， ４，９０２，６１４， ４，５４３，４３９，および４，４１１，９９３これは本明細書中で参考として援用される； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ （ｅｄｓ．），１９８０，およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）。
【０１０６】
他の技術もモノクロナール抗体を構築するために用いられる（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８９を参照のこと； Ｌ．Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８−３２，１９８９年８月； Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，” Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９，１９９０年１月）。
【０１０７】
広汎なバラエティの分析が、Ｆｋｈｓｆ（または本明細書中で上記のＦｋｈｓｆの突然変異形態）に対して反応性である抗体の存在を決定するのに利用され得る、例えば、逆電流免疫電気泳動、放射免疫検定法、放射免疫沈澱、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット分析、ウエスタンブロット、免疫沈澱、阻害分析または競合分析、およびサンドイッチ分析（米国特許４，３７６，１１０および４，４８６，５３０； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照のこと）。
【０１０８】
適切な抗体が一旦得られると、この抗体は、当業者に周知の多くの技術により単離または精製され得る（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照のこと）。適切な技術として、ペプチドまたは蛋白質親和性カラム、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの精製、またはこれらの技術のいずれの併用が挙げられる。
【０１０９】
本発明の抗体は、免疫系の調節のみならず、診断テスト（例えば、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ蛋白質またはペプチドの存在の決定）、治療目的、または蛋白質の精製にも用いられ得る。
【０１１０】
ｃ．突然変異体Ｆｋｈｓｆ
本明細書中および下記の実施例で述べる通り、Ｆｋｈｓｆの改変されたバージョンは、Ｆｋｈｓｆの正常な活性を抑制するのに利用され得、それにより、免疫系を調節する（一般に、上記核酸分子および蛋白質を参照）。
【０１１１】
さらに、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆの突然変異体または改変された形態は、広汎なバラエティのインビトロでの分析（例えば、色々なモデルにおけるこのような蛋白質の効果を検査するため）、または抗体の開発のために利用される。
【０１１２】
３．核酸分子
本発明の他の局面では、免疫系を調節できる核酸分子を提供する。例えば、一つの実施形態において、特にＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ核酸配列、または突然変異体ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆの発現を抑制するアンチセンス オリゴヌクレオチド分子を提供する（一般に、Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ： Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ （Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ ａｎｄ Ｂ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ，ｅｄｓ．１９８７ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐ．４０１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，ｅｄ．，１９８９ ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）； Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４−１２，１９９３； ＷＯ ９５／１０６０７； 米国特許５，３５９，０５１； ＷＯ ９２／０６６９３；およびＥＰ−Ａ２−６１２８４４を参照のこと）。要するに、このような分子は、転写されたＦｋｈｓｆ ｍＲＮＡ配列の領域を有するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対に相補的で、且つＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成できるように構築される。得られた二本鎖核酸はｍＲＮＡの次のプロセシングと干渉し、蛋白質の合成を阻止する。
【０１１３】
本発明の他の局面において、ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ、または突然変異型ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆを抑制できるリボザイムを提供する。本明細書中で用いる場合、「リボザイム」とは特異認識のアンチセンス配列、およびＲＮＡ−切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むことを意図する。この触媒鎖は、より高い化学量論の濃度で目標ＲＮＡ中の特定の部位を切断する。本発明において、広汎なバラエティのリボザイムが利用され得る、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ ４８：２１１−２０，１９８７；Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５９６−６００，１９８８；Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｂｒｕｅｎｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：１９６，１９８８；Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５，１９８８により記載される）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．米国特許５，２５４，６７８，１９９３年１０月１９日発行およびＨｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．欧州特許公報０ ３６０ ２５７，１９９０年３月２６日発行）；およびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボソームＲＮＡベースのリボザイム（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許４，９８７，０７１）。本発明のリボザイムは、通常ＲＮＡからなる、ただしＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からも構成され得る。
【０１１４】
４．ラベル
ＦＫＨｓｆまたはＦｋｈｓｆ、（およびその突然変異型）、または、上記および下記いずれの候補分子は、例えば、蛍光分子、トキシン、および放射性核種等の色々な化合物でラベル付けができる。蛍光分子の代表的な例として、フルオレセイン、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉ蛋白質、例えば、フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびルシフェラーゼが挙げられる。トキシンの代表的な例として、リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａトキシン、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡが挙げられる。放射性核種の代表的な例として、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１２が挙げられる。なお、上記の抗体は、リガンド結合対の１パートナーもラベル付けまたは結合体化できる。代表的な例として、アビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合蛋白質が挙げられる。
【０１１５】
本明細書中に記載される分子を、上記の代表的なラベルと結合体化または上記の代表的なラベルでラベル付けする方法は、当該業者により容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許４，７４４，９８１；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許５，１０６，９５１；Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、米国特許４，０１８，８８４；Ｍｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、米国特許４，８９７，２５５；およびＭｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、米国特許４，９８８，４９６を参照のこと；Ｉｎｍａｎ，Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３４，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７４，ｐ．３０もまた参照のこと；Ｗｉｌｃｈｅｋ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ，「Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２，１９８８もまた参照のこと）。
【０１１６】
医薬組成物
上記の通り、本発明は、色々な医薬組成物も提供する、それには、免疫系を調節する一つの上記の分子および薬学上または生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤が含まれる。一般に、このような担体は、使用する投与量と濃度でレシピエントに無毒であるべきである。通常、このような組成物の調製は、治療剤に緩衝剤、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、炭水化物（ブドウ糖、ショ糖またはデキストリン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、グルタチオンおよび他の安定剤および賦形剤を配合する。中性緩衝化生理食塩水または非特異的血漿アルブミンと混合した生理食塩水は適切な希釈剤である。好ましくは、医薬組成物（または「医薬品」）を消毒して、無発熱性物質の型で提供する。
【０１１７】
なお、本発明の医薬組成物は、色々な異なるルートによる投与のために調製され得る。また、本発明の医薬組成物は、そのような医薬組成物の使用に関する指示書を提供する包装材料と共に容器に入れ得る。一般に、このような指示書には、薬剤濃度を記載した具体的な表記、特定の実施形態では、医薬組成物の再構築に必要とされ得る相対量の賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）が含まれている。
【０１１８】
治療の方法
本発明はまた、免疫系を調節する方法を提供する。この免疫系を調節する本明細書中に記載される分子を使用することにより、温血動物における広汎なバラエティの状態を容易に治療または予防できる。治療され得る温血動物の実例は、脊椎動物と哺乳類の両方を含み、例えば、ヒト、馬、牛、豚、羊、犬、猫、ラットおよびマウスが挙げられる。このような方法は、変化した免疫系を有する患者において治療価値を有し得る。これには色々な免疫不全症候群を有する化学治療を受けてる患者、およびＴ細胞が媒介した自己免疫疾患を有する患者が含まれる。治療価値はまた、ワクチンアジュバントとしての有用性から認識され得る。
【０１１９】
分子の型に依存する治療分子は、色々な処方で色々なルートを介して投与され得る。例えば、一つの実施形態として有機分子を経口ルートまたは経鼻ルート、または注射（例えば、筋肉内、静脈内等）で投与される。
【０１２０】
１つの局面において、免疫系を調節する方法を提供する、それには、リンパ系細胞に免疫系を調節する分子の発現を指向するベクターを導入し、そのベクターを含む細胞を温血動物に投与する工程を包含する。他の関連する実施形態には、そのベクターは希望の目標部位（例えば、骨髄）に直接投与される。
【０１２１】
このような治療目的にウイルスベクターおよび非ウイルス ベクターの両方を含む広汎なバラエティのベクターを利用できる。適切なウイルス ベクターの代表的な例として、疱疹ウイルス ベクター（例えば、米国特許５，２８８，６４１）、アデノウイルスベクター（例えば、ＷＯ ９４／２６９１４、ＷＯ ９３／９１９１ ＷＯ ９９／２０７７８；ＷＯ ９９／２０７７３；ＷＯ ９９／２０７７９；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９１（１）：２１５−１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９０（２４）：１１４９８−５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（６）：２８３８−４８，１９９３；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−０７，１９９３；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７５（２）：２０７−１６，１９９３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−０９，１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−９１，１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−３４，１９９３；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−７８，１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０１（２）：１９５−２０２，１９９１）、アデノ随伴ウイルスベクター（ＷＯ ９５／１３３６５；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−６３，１９９４）、ポックスウイルスベクター（Ｐａｎｉｃａｌｉ ａｎｄ Ｐａｏｌｅｔｔｉ，ＰＮＡＳ ７９：４９２７−３１，１９８２；およびＯｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６０，１９９３）、およびレトロウイルス（例えば、ＥＰ ０，４１５，７３１；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９１／０２８５、ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ ９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；米国特許５，２１９，７４０；ＷＯ ９３／１１２３０；ＷＯ ９３／１０２１８）が挙げられる。異なるウイルスまたは非ウイルス供与源由来の異なる構成成分（例えば、プロモーター、エンベロープ配列等）の混合物を含むウイルスベクターも同じく構築される。色々な実施形態において、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子を下記の方法および組成物に利用できる。
【０１２２】
本発明の他の実施形態において、免疫系を調節する分子をコードする核酸分子（例えば、突然変異体 Ｆｋｈｓｆ、またはＦｋｈｓｆを切断するアンチセンスまたはリボザイム分子）は色々な代替技術で投与できる、例えば、ポリ−Ｌ−リシンＤＮＡ複合体と結合体化したアジアルーソムコイド（ＡＳＯＲ）（Ｃｒｉｓｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９２１２２−１２６，１９９３）、死菌アデノウイルスに連結されたＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−５４，１９９２）、サイトフェクチン−媒介導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ，Ｖｉｃａｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、直接ＤＮＡ注射（Ａｃｓａｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−１８，１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−９８７，１９８９）；リポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−１７，１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ．８９（１）：１３−２１，１９９４；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８４：７８５１−５５，１９８７）；微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８８：２７２６−３０，１９９１）；および蛋白質自体をいずれか単独でコードする核酸の直接送達（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−６４，１９９３）、またはＰＥＧ−核酸複合体を利用する送達が挙げられる。
【０１２３】
本発明のベクターにより発現され得る分子の代表的な例は、リボザイムおよびアンチセンス分子が挙げられる、いずれも上記に詳しく討論されている。
【０１２４】
当該業者に明白となるように、投与の量と頻度は当然、患者の処置されるべき症状の性質および重篤度、希望する反応、状態等のような因子に依存する。通常、組成物は上記の通り色々な技術で投与され得る。
【０１２５】
以下の実施例は説明の為であり、限定するものではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
Ｓｃｕｒｆｙ 突然変異に応答する遺伝子の同定
Ａ．Ｓｃｕｒｆｙ遺伝子のクローニング
オリジナルのｓｃｕｒｆｙ突然変異は、１９４９年にＯａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＲＮＬ）に寄託した部分的近交系のＭＲにて自然発生させた。戻し交雑分析をマウスＳｃｕｒｆｙ突然変異を含むＸ染色体の原動体周囲領域をファインマップするために用いた。同じ領域をカバーする実質的地図は、重なる酵母と細菌の人工染色体（ＹＡＣｓおよびＢＡＣｓ）の単離を経て同時に産生させた。候補領域は一旦、約５００キロ塩基対（ｋｂ）以下に狭まると、大規模のＤＮＡシークエンシングを、４つの重複ＢＡＣクローンで行う。この５００ｋｂ領域における全ての転写ユニットは、配列データベース検索とコンピュータエクソン予測プログラムの適用の組み合わせを経て同定された。次に候補遺伝子は、正常およびＳｃｕｒｆｙ−誘導ＲＮＡサンプルより、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手法で得られｃＤＮＡｓの配列を比較しＳｃｕｒｆｙ−特異突然変異をスクリーンした。一つの遺伝子（本明細書中でＦｋｈｓｆと呼ばれる）において、正常ｃＤＮＡに対し二つの塩基対（ｂｐ）挿入がＳｃｕｒｆｙ ｃＤＮＡのコード領域に見られた。Ｓｃｕｒｆｙ突然変異を含むいくつかのマウス系のゲノムＤＮＡから誘導されたＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を比較することにより、挿入が確認された。また、２ｂｐの挿入はＳｃｕｒｆｙサンプルのみにしか見られなかった、これをＳｃｕｒｆｙ欠損の可能な原因と確証した。
【０１２７】
マウスＦｋｈｓｆ遺伝子は、ＢＡＣクローン８Ｃ２２に含まれ、完全に配列決定されている。それは約１４ｋｂに及び、１１のコードエクソンを含む。エクソン ブレークの位置は、最初にＧｅｎＳｃａｎエクソン予測プログラムを用いて、ゲノムＤＮＡ配列のコンピュータ分析により同定され、次にエクソン位置は、正常マウス組織から誘導されたｃＤＮＡ配列とゲノム配列とを直接比較することにより確認した。
【０１２８】
得られたｃＤＮＡの長さは２１６０ ｂｐであり、コード領域は１２８７ｂｐに及び、これは４２９のアミノ酸の蛋白質をコードする。図１はマウスＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す、翻訳は、２５９位で始まり、１５４６位で終わると予測する。図２は、マウスＦｋｈｓｆのアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
Ｂ．Ｆｋｈｓｆトランスジェニックマウスの産生 Ｓｃｕｒｆｙ表現型の本当の原因としてのＦｋｈｓｆ遺伝子の正体を、トランスジェニックマウスにて確認した。要するに、Ｆｋｈｓｆ遺伝子の約７ｋｂコード領域、および上流の隣接配列の約２０ｋｂおよび下流配列の約４ｋｂを含む正常ゲノムＤＮＡの３０ｋｂ断片（図５）を正常マウスの単一細胞胚に微量注射した。それぞれ区別可能な組込みを有する五匹の個別の創始動物を産生し、各トランスジェニック系統からの雄の動物を雌のｓｆキャリアと交配した。導入遺伝子（正常 Ｆｋｈｓｆ）およびｓｆ突然変異（突然変異体 Ｆｋｈｓｆ）の両方を有する雄の後代を分析した。
【０１３０】
分析は、ラント症候群、鱗状皮膚、毛不正常性及び他のｓｃｕｒｆｙ表現型のホールマークに対する動物検査からなる。また、リンパ系組織（胸腺、脾臓およびリンパ節）を採集し、その大きさおよび細胞数を検査し、正常動物およびｓｃｕｒｆｙマウスと比較した。全五匹のトランスジェニック系統について、導入遺伝子を有する雄のｓｆ 後代は、大きさと体重が正常であらゆる点において健康である。これらのトランスジェニックマウスにおけるリンパ節サイズは正常動物と類似し（またはより小さい）（図６）、活性化されたＴ細胞の徴候がない。これらのパラメーターはｓｆマウスと極端異なり、正常Ｆｋｈｓｆ遺伝子の付加は、ｓｃｕｒｆｙマウスにおいて見出される欠損を克服することを示し、従って、Ｆｋｈｓｆ 遺伝子における突然変異がＳｃｕｒｆｙ病の原因であることを確認した。
【０１３１】
実施例２
ＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡの生成
完全マウスＦｋｈｓｆ蛋白質をコードする相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手法より得られる。より具体的には、第一鎖ｃＤＮＡを適切な供与源（例えば、マウス脾臓）からの全ＲＮＡ（５μｇ）のオリゴ ｄＴプライミング、および標準条件（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｋｉｔ）下、逆転写酵素用いる伸長によって生成させる。次に第一鎖ｃＤＮＡのアリコートを前方向および逆方向のプライマー（前方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣ ＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣ ＴＴＣ；逆方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡ ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴ ＣＴＧ）（０．２ ｍＭの最終濃度）、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ ｍＭ 硫酸アンモニウム、１．５ ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２ ｍＭ各ｄＮＴＰおよび１単位のＴａｑポリメラーゼの存在下、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃ ３０秒、６３℃ ３０秒、７２℃ ２分）を行う。
【０１３２】
実施例３
マウスＦＫＨｓｆに対するヒトオルソログの生成
完全 ＦＫＨｓｆ蛋白質をコードしたヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡは、実施例２に記載されるのと本質的に同じ手法で得られる。特に、全脾臓ＲＮＡから始め、下記オリゴヌクレオチドプライマー（前方向プライマー：ＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴ ＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡ Ｃ；逆方向プライマー：ＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡ Ｃ）、および６０℃アニーリング温度の他は上記と同じＰＣＲ条件を利用する。
【０１３３】
図３は、今まで得た１８６９ｂｐ ｃＤＮＡ（１２９３ｂｐコード領域を含む）のヌクレオチド配列を示す、翻訳は１８９位で始まり、１４８２位で終わると予測される。図４は、４３１アミノ酸を有するヒトＦＫＨｓｆ 蛋白質の配列を示す。ヒト遺伝子の予測コード領域とマウスｃＤＮＡ配列との比較は、殆ど同じのエクソン構造および全蛋白質にわたって８６．１％ アミノ酸配列同一性を示す。
【０１３４】
実施例４
Ｓｃｕｒｆｙ突然変異を検出する方法
上記の通り、Ｓｃｕｒｆｙ突然変異は、元来ｓｆおよび正常マウスＲＮＡサンプルのＲＴ−ＰＣＲより誘導されたｃＤＮＡを直接シークエンシングすることによって発見され、ゲノムＤＮＡと同じ領域をシークエンシングすることによって確認された。突然変異の性質（即ち２ｂｐの挿入）は、それ自体が多数の異なる突然変異検出分析をさせる。先ずはオリゴヌクレオチドプローブのディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく。このようなハイブリダイゼーション−ベースの分析は、アレイ特異的発現の定量分析を可能にする。
【０１３５】
例として、３６０ ｂｐ ＤＮＡ断片は、下記のオリゴを用いて、第１鎖ｃＤＮＡから増幅される：
ＤＭＯ５９８５（前方向）：ＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧ（図１のヌクレオチド８２５−８４４）
ＤＭＯ６７２４（逆方向）：ＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣ（ヌクレオチド１２２１−１１９９）。
【０１３６】
ＰＣＲ生成物を１．８％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜に転写して、Ｓｃｕｒｆｙ−特異的２ｂｐ挿入部位に対応する領域に相補的である末端ラベル付けオリゴヌクレオチドでプローブする。下記オリゴヌクレオチド（２ｂｐ挿入部位は太線で示した）を用いて２つの別々のハイブリダイゼーション反応を行い、正常なＰＣＲ生成物およびＳｃｕｒｆｙ ＰＣＲ生成物を検出する：
【０１３７】
【化１】
【０１３８】
Ｓｃｕｒｆｙ突然変異は、コールドシングルストランドコンホメーション多型（ｃｏｌｄ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ｃＳＳＣＰ）分析によっても検出され得る。この分析において、上記と同じＰＣＲ生成物を、鎖変性後に、２０％アクリルアミド（ＴＢＥ）ゲルで泳動する。Ｓｃｕｒｆｙ挿入物は、正常配列に対して鎖移動度におけるシフトを起こし、そしてエチジウムブロマイドで染色した後に、別々の鎖が検出される。
【０１３９】
実施例５
ＦＫＨｓｆ遺伝子発現
半定量ＲＴ−ＰＣＲを広汎なバラエティの組織と細胞株におけるマウスおよびヒトＦｋｈｓｆ遺伝子発現のパターンの分析に用いた。発現のレベルは、遍在して発現したＤＡＤ−１遺伝子に正規化される。要するに、Ｆｋｈｓｆ遺伝子は、胸腺、脾臓、分類されたＣＤ４＋とＣＤ４−ＣＤ８− Ｔ−リンパ球、および腎臓、脳、および色々なマウスとヒトのＴ−細胞株およびヒト腫瘍を含む、これまでに検査された殆ど全ての組織において、極低いレベルで発現される。しかし、発現の欠如は、新しく分類されたマウスＢ−細胞に見られた。
【０１４０】
予想通り、ＲＴ−ＰＣＲ分析において、正常組織 対 Ｓｃｕｒｆｙ組織における発現レベルの差は見られなかった。
【０１４１】
実施例６
ＦＫＨｓｆの生体外表現
マウスおよびヒトの全長のＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡ、およびこのｃＤＮＡの色々な小領域を、哺乳類の細胞（例えば、ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ−細胞株）、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母において発現されるベクターにクローン化する。Ｅ．ｃｏｌｉ系または酵母系を、Ｆｋｈｓｆ−特異抗体（下記参照）を惹起するための蛋白質の生産に用い得る。
【０１４２】
実施例７
抗−ＦＫＨｓｆ 抗体の作製
実施例６記載のベクターから発現される蛋白質を、ＦＫＨｓｆ特異抗体の作製のために適当な動物に免疫するために用いる。全長蛋白質または切断された蛋白質のいずれかをこの目的に使う。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、昆虫細胞または哺乳類の細胞から蛋白質が得られる。動物の種類として、マウス、兎、モルモット、ニワトリなどが挙げられる。生化学的特徴付け（免疫沈澱およびウェスタンブロッティング）により測定した場合、ＦＫＨｓｆに特異的な兎抗血清が産生された。
【０１４３】
実施例８
ＦＫＨｓｆ遺伝子の機能の分析
ＦＫＨｓｆ蛋白質の機能の損失がｓｃｕｒｆｙ動物において観察される表現型（衰弱、過剰免疫応答および死亡）を生じるので、ＦＫＨｓｆ蛋白質の過剰表現を評価する分析について述べる。トランスジェニック動物（実施例１に記載）に若干の異なるパラメーターを用いて免疫能の状態を検査する。動物は、リンパ節および胸腺に存在するリンパ系細胞の数（図７）およびＴ細胞のインビトロでの刺激に対する応答性（図８）について検査する。
【０１４４】
Ｓｃｕｒｆｙ突然変異動物は、リンパ節において、正常動物よりも約二倍多い細胞を有するが、過剰なレベルの正常ＦＫＨｓｆ蛋白質を発現したマウスでは約１／３の細胞を含む（図７）。また、胸腺細胞の数は、標準抗血清を用いたフローサイトメトリーにより評価した場合、その細胞表面表現型と同様に（図示してない）、正常であり（図７）、このことは、過剰なＦＫＨｓｆ蛋白質に関係する発生異常がないことを示す。
【０１４５】
さらに、正常な動物、ｓｃｕｒｆｙ動物およびトランスジェニック動物を、Ｔ細胞刺激に対する増殖応答について検査する。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体と反応させ、その増殖応答を放射性チミジン取り込みで測定する。ｓｃｕｒｆｙ細胞のみが刺激なくても分裂するが、正常細胞は刺激後よく応答する。ＦＫＨｓｆトランスジェニック細胞も刺激に応答するが、この応答は正常細胞の応答ほど顕著ではない（図８）。これは、過剰のＦＫＨｓｆを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞が、刺激に応答する能力が低下していることを示す。
【０１４６】
実施例９
ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ配列はＪＭ２に相関する
ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ配列の改変バージョンは、ＧｅｎＢａｎｋ 公共配列データベースに存在する。この配列はＪＭ２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．＃ ＡＪ００５８９１）と称し、エクソン予測プログラムをＦＫＨｓｆ遺伝子を含むゲノム配列に適用した結果である（Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，未公開 ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．＃ ＡＪ００５８９１参照）。これに反し、ＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡの構造は、実験的に決定されている。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ） Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＧＡＰプログラムを、２つの配列の比較に用い、その差異を図９に示す。２つの配列の５’端は、ゲノムＤＮＡ配列内でその位置が異なり、ＦＫＨｓｆの第二コードエクソンはＪＭ２から省略され、ＦＫＨｓｆ遺伝子の最終イントロンは、ＪＭ２ 配列にスプライスされていない。これらの差異は、ＦＫＨｓｆに対してより短いアミノ末端領域を有するＪＭ２蛋白質、およびカルボキシ末端におけるフォークヘッド領域内に大きな挿入物（下記参照）を生じる。
【０１４７】
実施例１０
ＦＫＨｓｆ蛋白質は、種間で保存されている
ＦＫＨｓｆ蛋白質は、機能的ドメインを示し得る配列モチーフに基づき部分領域に分け得る。ＦＫＨｓｆにおける二つの主なモチーフは、蛋白質の中間部分におけるＣ２Ｈ２クラスの単一ジンクフィンガー（ＺＮＦ）、および蛋白質のカルボキシ末端におけるフォークヘッド（または羽付き螺旋）ドメインである。ＦＫＨｓｆと他の蛋白質と間の相同性の程度を特徴付けるため、蛋白質を４領域まで分けた：
アミノ末端ドメイン：図２の残基１−１９７ 図４の残基１−１９８
ジンクフィンガードメイン：図２の残基１９８−２２１ 図４の残基１９９−２２２
中間ドメイン：図２の残基２２２−３３６ 図４の残基２２３−３３６
フォークヘッドドメイン： 図２の残基３３７−４２９ 図４の残基３３７−４３
１。
【０１４８】
ＤＮＡＳｔａｒ配列分析パッケージよりＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを用いて、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを使用して、これらの４ドメインを経たヒトＦＫＨｓｆ蛋白質とマウスＦｋｈｓｆ蛋白質との間の類似性の程度を決定した。結果は図１０に示す。この類似性の指数は８２．８％〜９６．４％の範囲であり、この蛋白質が非常に高く種間で保存されていることを示す。
【０１４９】
実施例１１
新規なＦＫＨｓｆ相関遺伝子の同定
ＦＫＨｓｆ遺伝子配列のユニークな特徴は、フォークヘッド含有分子の同じサブクラスに入る他の新規な遺伝子（および蛋白質）を同定するために用いられ得る。ＦＫＨｓｆ蛋白質は、フォークヘッドドメインのアミノ末端側に単一のジンクフィンガードメインを有すること、および、フォークヘッドドメインのカルボキシ末端にユニークなところがある。縮重ＰＣＲアプローチを、フォークヘッドドメインの上流にジンクフィンガー配列を含む新規な遺伝子を単離するために取り得る。例として、下記縮重プライマーを合成した（縮重の位置を括弧で示し、“Ｉ”はヌクレオシドイノシンを示す）：
順方向プライマー：ＣＡ（ＴＣ）ＧＧＩＧＡ（ＧＡ）ＴＧ（ＣＴ）ＡＡ（ＧＡ）ＴＧＧ
逆方向プライマー：（ＧＡ）ＡＡＣＣＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＧ）ＴＡ（ＡＧＴ）ＡＴ（ＣＴ）ＴＣ（ＧＡ）ＴＴ。
【０１５０】
順方向プライマーはジンクフィンガー配列内の領域に対応し、逆方向プライマーはフォークヘッドドメインの中間の領域に対応する。これらのプライマーを、色々なヒト組織（肝臓、脾臓、脳、肺、腎臓等を含む）から実施例２のように生成された第一鎖ｃＤＮＡを増幅するために用いた。下記ＰＣＲ条件が用いられた：最終濃度０．２ｍＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭ 硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰおよび１単位のＴａｑ重合酵素を、３５サイクル（９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ２分）に供した。ＰＣＲ生成物を、１．８％アガロースゲル（１×ＴＡＥ中で泳動）上で可視化し、ＴＡクローニンベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した、個別のクローンを配列決定し、全長ｃＤＮＡを更に特徴付けするために用いた。
【０１５１】
あるいは、ＦＫＨｓｆ遺伝子のユニーク領域（即ち、“アミノ末端”ドメインおよび“中間”ドメイン）は、ハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために用い得る。色々なヒト組織および／またはマウス組織から誘導され、λファージベクター（例えば、λｇｔ１１）中で増殖されたｃＤＮＡライブラリを、アガロースにプレートして、溶菌斑をナイロン膜に移し、ＦＫＨｓｆ遺伝子のユニーク領域から誘導された断片でプローブした。高ストリンジェンシー条件（例えば、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ中６５℃でのハイブリダイゼーション、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ中６５℃での洗浄）下、極近く相関する配列だけハイブリッド形成が期待される（即ち、９０−１００％相同性）。低ストリンジェンシー下、例えば４５℃〜５５℃にて上記と同じ緩衝剤中でのハイブリダイゼーションおよび洗浄では、ＦＫＨｓｆに関する遺伝子（６５−９０％相同性）を同定し得る。ＦＫＨｓｆのユニーク配列で公共データベースを検索して得られた結果に基づき、低〜中度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション実験を経て同定されたいずれの遺伝子も、“ＦＫＨｓｆファミリー”の新規なメンバーを代表することが期待される。
【０１５２】
実施例１２
野生型Ｆｏｘｐ３遺伝子の過剰発現は末梢Ｔ細胞数を減少する結果になる
ｓｃｕｒｆｙマウスのオリジンナル育種系統を、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＲＮＬ）から得、その後、帝王切開によりＳＰＦ条件へと誘導した。トランスジェニックマウスを、ＤＮＸ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）による卵母細胞マイクロインジェクションにより産生した（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。２８２６マウス系について、３０．８ｋｂコスミド構築物を、注入のためにマウスＢＡＣ Ｋ６０から産生した。このコスミドは、５’配列の約１８ｋｂｐおよび３’配列の４ｋｂｐと共に全Ｆｏｘｐ３遺伝子が含まれている。遺伝子の発現は組織分布に関して内在性遺伝子の発現と平行である（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。ｌｃｋ−Ｆｏｘｐ３トランスジェニック動物を、発現を駆動するｌｃｋプロモーターを用いて産生した（Ｇａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２（２）：１７３，１９９０）。全ての研究に、トランスジェニックマウスおよびｓｃｕｒｆｙマウスの両方をＣ５７Ｂ１／６バックグランド（ＪＡＸ）に４−６世代戻し交雑した。戻し交雑の際、応答性または表現型の差異は見られなかった。ノーザンブロット分析を、以前に記載されたように行った（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。
【０１５３】
Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスに関わる最初の実験は、分別可能な初代動物から生成した５／５系において、野生型Ｆｏｘｐ３導入遺伝子の発現がｓｆ／Ｙ変異株マウスにて疾患を予防することを示した（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。更なる分析は、導入遺伝子のコピー数が、ｍＲＮＡレベルにおける遺伝子の発現と直接相関することを示す（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。これは導入遺伝子構築物が５’配列の実質部分および多くの調節性領域を含む大ゲノム断片よりなった事実が原因であろう。色々なトランスジェニック系を分析すると、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現とリンパ節細胞数との間に直接関係があったことも明らかになる（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。導入遺伝子のコピー数と細胞数との間の関係が、初代のうちの３つについて示され、ｓｃｕｒｆｙ変異株動物（ｓｆ／Ｙ）と正常同腹子対照（ＮＬＣ）を比較した（下記表１参照）。トランスジェニック（２８２６系，１２９２系および２８２８系）、正常同腹子対照およびｓｃｕｒｆｙ変異株（ｓｆ／Ｙ）マウスからのリンパ性細胞数を、齢が一致した（４週齢）代表的なマウスからの色々な組織で決定した。およその導入遺伝子コピー数を、サザンブロット分析により決定し、これは、Ｆｏｘｐ３遺伝子発現とよく相関した（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。トランスジェニックマウスの脾臓細胞数には劇的でないが一致した差異が存在するが、胸腺細胞数は、顕著には影響されていない。特に注してない限り、簡略のため、残りの実験に２８２６トランスジェニック系を用いた。この系からの動物は一般に健康でＳＰＦ条件下で一年より長く生存する。その系は約１６コピーの導入遺伝子があり、ノーザンブロット分析は、リンパ系組織の内在性遺伝子のレベルの１０−２０倍で表された（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２７：６８−７２，２００１）。導入遺伝子は、内在性遺伝子のように、非リンパ系組織にて僅かしか発現せず、これはおそらく、その内在性プロモーターの制御下での発現の結果である。この系からのマウスにおけるリンパ節細胞数は正常の１５−５０％で、年齢につれて細胞数が蓄積する。脾臓細胞数はあまり激変しないが、一般に減少して、正常の２５−９０％である。
【０１５４】
【表１】
【０１５５】
実施例１３
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウスの胸腺表現型
胸腺選択におけるＦｏｘｐ３遺伝子の役目は未だ不明である。スーパー抗原特異的Ｖβ保有胸腺細胞の欠失は、ｓｆ／Ｙトランスジェニックマウスおよび２８２６トランスジェニックマウス共に正常のようである。これと一致して、それ自体の内在性プロモーターを用いたＦｏｘｐ３遺伝子の過剰発現（２８２６系）も胸腺の発育または選択における如何なる明白な変化も見られない。主な表現型サブセット中の胸腺細胞の数（表Ｉ）およびその分布は、同腹子対照動物と区別できない。胸腺組織、リンパ節組織および脾臓組織を上記のように集め（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：２５４６，１９９９）、染色緩衝剤（１％ ＢＳＡ、０．１％ アジ化ナトリウム／ＰＢＳ）で細胞密度２０×１０６／ｍＬに再懸濁した。細胞アリコートを２％正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ）で処理して非特異結合を遮断してから、下記フルオロクロム結合体化抗マウスモノクロナール抗体（ｍＡｂ）：ＣＤ３、ＣＤ８β、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＩｇＧ２ａ対照（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）；ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９５（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の併合剤で氷の上で３０分間インキュベートすることによって染色した。約１０５細胞の蛍光強度をＭｏＦｌｏＴＭフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）によりヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ）を加えて死亡細胞を排除して検査した。
【０１５６】
ＣＤ４−８−サブセットの更に詳しい検査は、γ−δ細胞およびＣＤ２５＋細胞の正常分布も示す。重要なことは、成熟マーカーＣＤ６９およびＨＳＡを発現するＣＤ４＋８−胸腺細胞の画分は２８２６および対照動物にて同じであり、成熟プロセスが正常であることを示唆する。
【０１５７】
胸腺単独におけるＦｏｘｐ３遺伝子の過剰発現は、上記２８２６マウスからの顕著に異なる表現型を有する。ｌｃｋ近位プロモーターの制御下で胸腺においてＦｏｘｐ３選択的発現するトランスジェニックマウス（１６．５および８．３）を、ｓｆ／＋キャリア雌と交配させた。胸腺特異導入遺伝子を持つ雄ｓｃｕｒｆｙマウス（ｓｆ／Ｙ）（１６．５および８．３）は、非トランスジェニック同腹子と同じ時間および同じ方式で疾患に負ける。その内在性調節性配列の制御下でＦｏｘｐ３を発現するＳｆ／Ｙトランスジェニック動物（２８２６）は疾患に負けた。細胞数は、野生型Ｆｏｘｐ３遺伝子に加えて導入遺伝子を持ったマウスから誘導される。
【０１５８】
胸腺のみに（ｌｃｋ近位プロモーターの制御下で）Ｆｏｘｐ３遺伝子を発現するトランスジェニック動物は、ｓｆ／Ｙマウスを疾患から助けられない（下記表２参照）。２匹別々の初代動物を、疾患を防止するためにｓｃｕｒｆｙキャリア雌と交配させた。いずれの場合においても、ｌｃｋ近位プロモーター−Ｆｏｘｐ３導入遺伝子を持つｓｆ／Ｙマウスは急性リンパ増殖性疾患を発症し、重篤度および時間経過において非トランスジェニックｓｆ／Ｙ兄弟と同じであった。いずれの場合においても、導入遺伝子の発現は、胸腺に限られ、脾臓を含む末梢器官にて検出できる発現がなかった。ノーザンブロット分析を実施例１と同じく行った。さらに、ｌｃｋに駆動される導入遺伝子の胸腺発現は、実質的に２８２６トランスジェニック動物でのその遺伝子または正常同腹子対照マウスにおける内在性遺伝子より大きかった。従って、ｓｆ／Ｙマウスに見られる致命性リンパ増殖性疾患は、胸腺におけるｓｃｕｒｆｉｎ媒介の発育欠損の結果として生じない。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
ｌｃｋに駆動される導入遺伝子を保有するトランスジェニック（非ｓｆ）動物は、一般に正常に見えるが、胸腺における導入遺伝子の高度発現は、正常（非ｓｆ）動物にて表現型の結果を有さない。導入遺伝子の発現が顕著に増加した以外は正常なマウスは、二重ポジティブ胸腺細胞％が相対的に減少して、二重ネガティブ（ＤＮ）細胞％が対応して増加し、全胸腺細胞数の減少を来たす（表２参照）。Ｔ細胞発生は、これらの動物にも発生する、それはＣＤ４単ポジティブ細胞およびＣＤ８単ポジティブ細胞の生成、およびリンパ節と脾臓との両方に比較的正常数の末梢Ｔ細胞が存在することにより評価される（表２参照）。胸腺由来のＣＤ４＋８−細胞におけるＣＤ６９発現は、トランスジェニック同腹子および野生型同腹子に類似し、ポジティブ選択がおそらく正常に進行することを示唆するが、ＤＮ区画内では、ＣＤ２５を発現する細胞の画分は野生型動物と比較して減少される。これらのトランスジェニック動物は、胸腺区画内でのＦｏｘｐ３遺伝子の過剰発現が特に胸腺発生を変化し得るが、末梢Ｔ細胞活性の調節に影響はないようであることを示す。
【０１６１】
実施例１４
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウス由来の末梢Ｔ細胞の変化した表現型
２８２６マウスにおける末梢Ｔ細胞数の減少に加えて、ＮＬＣに対するリンパ節および脾臓の両方におけるＣＤ４＋８−細胞％のわずかな減少がある。ＣＤ３レベルは、末梢Ｔ細胞にて正常であるようであるが、変化された発現レベルを有する複数の他の表面マーカーがある。トランスジェニックマウスにおけるＣＤ４＋８−細胞について、最も一致する変化は、ＣＤ６２ＬとＣＤ４５ＲＢの発現の小さな減少およびＣＤ９５の発現の増加である。比較すると、ｓｆ変異株動物由来の細胞に甚だ異なる表現型がある。これらのマウス由来のＣＤ４＋８−細胞は、大きく、そして明確に活性化されている。それらは主にＣＤ４４Ｈ１、ＣＤ４５ＲＢＬＯ、ＣＤ６２ＬＬＯであり、部分的にＣＤ６９＋である（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：２５４６）。
【０１６２】
ＣＤ４−８＋細胞数は、ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウスの脾臓およびリンパ節の両方でも減少した。この減少は、代表的には、ＣＤ４＋８−区画における減少（２５−５０％）より激烈である（５０−７５％）。ＣＤ４−８＋Ｔ細胞は、ＮＬＣと比較して細胞表面におけるＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ９５のレベルにおいて、比較的少数の様様な変化を呈する。ＣＤ４＋８−Ｔ細胞とは対照的に、ＣＤ４４ＨＩでもあったＣＤ４−８＋Ｔ細胞の％はより顕著に増加する。全体から言えば、ＣＤ４−Ｓ＋細胞は、かれらを特にナイーブ、活性化または記憶であると特徴付けるレベルで表面マーカーを発現しない。
【０１６３】
実施例１５
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウスの組織学分析
２８２６マウスにおける末梢Ｔ細胞は明らかに減少するが、リンパ系器官の構造も混乱したかの決定を行った。主なリンパ系器官（胸腺、リンパ節および脾臓）の組織学検査は、最も顕著な変化は、腸間膜リンパ節および末梢リンパ節に見られることを示した。組織学分析用の組織を生後約８週齢のマウスから摘出し、緩衝された１０％ホルマリンに直ちに固定した。パラフィン包埋片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色処理して、代表的マウスにて組織病理学比較を行った。期待通り、胸腺は比較的正常のようであり、胸腺髄質の大きさがやや減少するが、十分確定された皮質−髄質接合部がある。トランスジェニック動物は、より小さい末梢リンパ節を有し、強く正常に分布したリンパ小節が欠け、小節と小節間区域との間に鮮明な縁が欠け、正常同腹子対照マウスのリンパ節に見られるものより明らかな空洞がある。脾臓およびパイエル板の大きさおよび微小構造がほぼ正常であるようであると言えども、全細胞数は緩やかに減少し、これらの組織の胚中心の証明がないかまたは少ない。ここで、注目された変化は、リンパ節に発育がない複数の他の目標変異と区別できる細胞下（ｈｙｐｏｃｅｌｌｕｌａｒ）状態を反映する。従って、Ｔ細胞は明らかに正常な方式で発育できるが、その末梢リンパ性組織内の代表、特にリンパ節は、実質的に減少している。
【０１６４】
実施例１６
Ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニックマウス由来のＣＤ４＋８−細胞の減少された機能応答
表現型データおよび細胞数データは、２８２６トランスジェニック動物由来のＣＤ４Ｔ細胞に生物学的に特異的欠損があることを示唆する。これらの動物由来のＴ細胞の、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を含むいくつかの刺激に対する機能応答を評価した。ＮＬＣ、２８２６トランスジェニックマウスまたはｓｃｕｒｆｙ（変異株）マウスの色々な組織からリンパ球を単離して、ＣＤ４細胞を細胞選別により精製した。胸腺、リンパ節および脾臓組織を適切な動物から摘出して、無菌顕微鏡スライド間で柔らかくし、無菌７０μｍナイロンメッシュを通して濾過し、遠心分離で集めた。これらの組織から、ＭｏＦｌｏを用いたポジティブ選択でＣＤ４＋Ｔリンパ球を選別精製した。選別後分析で決定した選別純度は、通常９５％より高い。細胞の培養は、３７℃の完全ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）（１０％ ウシ胎仔血清、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、それぞれ１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよびグルタミン）を用いて９６ウェル丸底組織培養プレートにて行った。培養ウェルは、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）に対する指定濃度の精製抗体とともに無菌ＰＢＳ中で４時間３７℃でプレインキュベーションすることにより、Ｔ細胞活性化のため調製した。精製α−マウスＣＤ２８（クローン３７．５１）またはα−マウスＫＬＨ（対照抗体）を、１μｇ／ｍｌ最終濃度で共固定した。
【０１６５】
Ｔ細胞を、細胞密度１×１０４〜５×１０４細胞／ウェルで２００μＬ ｃＲＰＭＩ中にて７２時間培養した。上澄み（１００μｌ）を、４８時間目にサイトカイン生産の分析のため摘出した。ウェルを、培養の最後の８−１２時間に１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）でパルスしてから回収した（Ｔｏｍｔｅｃ）。報告した増殖データは、三連ウェルの平均値に基づき、少なくとも３実験の値を代表する。サイトカインのレベルは、製造業者の指示（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）に従いＥＬＩＳＡ分析で測定した。
【０１６６】
増殖およびＩＬ−２生産の試験のために、Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞の単一細胞懸濁液を産生し、刺激因子細胞として使用した。これらの細胞を照射（３３００ｒａｄ）し、そしてｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニック脾臓細胞またはＮＬＣ脾臓細胞と１０：１（刺激因子：エフェクター）でインキュベートした。若干の培養には、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌ加えた。増殖分析には、５日後に細胞を上記のようにパルスしそして回収した。トランスジェニック動物由来の細胞において、その同腹子に比べ、増殖およびＩＬ−２生産の両方が顕著に減少した。トランスジェニック動物は、刺激増加につれて応答性が増加するが、ＮＬＣにより達成されるレベルには滅多に達さなかった。これは、２８２６マウス由来の細胞が低量〜検出できない量のこのサイトカインを生成するＩＬ−２生産では、特にあてはまる。類似の結果が、細胞が脾臓またはリンパ節から誘導された場合に見られた。
【０１６７】
期待通り、ｓｃｕｒｆｙ動物の細胞は、刺激に過剰応答性であった。そしてこの細胞は、増加した量のＩＬ−２を生成する。導入遺伝子効果は、系と独立しており、少なくとも世代Ｎ６を経てＣ５７Ｂｌ／６に至る動物の戻し交雑の間にて維持された。この分析ではトランスジェニックマウスのＴ細胞は抗ＣＤ２８に対して応答性のままであったが、抗ＣＤ３および対照Ｉｇでの刺激は、一般に応答が貧弱で、ＮＬＣ応答より低かったが類似した。ＩＬ−２の高使用量の添加は、２８２６マウスのＣＤ４＋８−Ｔ細胞の増殖欠損を部分的に克服できるが、一般に野生型動物に対する応答を回復できない。
【０１６８】
末梢Ｔ細胞とは対照的であるが上記表現型データと一致して、胸腺ＣＤ４＋８−細胞の増殖応答は、トランスジェニックマウスとＮＬＣマウスとの間でほぼ比敵する。しかし、胸腺ＣＤ４＋８−細胞によるＩＬ−２生産は、トランスジェニック動物から実質的に減少する。胸腺細胞によるＩＬ−２生産の減少は、リンパ節または脾臓にて見られるものよりいくらか変化があり、生産されたＩＬ−２は培養中に消費もされることを示唆し得る。あるいは、胸腺細胞は、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現によってあまり影響されない他の成長因子を生産し得る。それにもかかわらず、このデータは、一般に、トランスジェニック動物の主な欠損は胸腺および末梢Ｔ細胞にＩＬ−２を生産させる能力にあるという結論を支持する。
【０１６９】
実施例１７
ＳｃｕｒｆｉｎトランスジェニックＣＤ４−８＋Ｔ細胞の変化した機能応答
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）として産生および機能するトランスジェニックＴ細胞の能力を生体外の分析で測定した。Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞の単一細胞懸濁液を産生し、刺激因子細胞として使用した。これらの細胞を照射（３３００ｒａｄ）して、ｓｃｕｒｆｉｎトランスジェニック脾臓細胞またはＮＬＣ脾臓細胞と１０：１（刺激因子：エフェクター）の比でインキュベートした。若干の培養物には、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌ加えた。ＣＴＬの生成には、脾臓Ｔ細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下にて類似の方式で刺激した。５日後、細胞をＪＡＭ分析（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５（１−２）：１８５（１９９１））で分析するか、または新刺激細胞層に再刺激した。細胞は約９５％ＣＤ４−８＋であった。
【０１７０】
トランスジェニックＴ細胞は、ＩＬ−２の存在下または非存在下で、漸増数の照射された同種異系刺激因子細胞を含む混合リンパ球培養物中で刺激した。次に、トランスジェニック細胞またはＮＬＣエフェクター細胞の増殖応答を測定した。トランスジェニック動物のＴ細胞は外因性ＩＬ−２の非存在下で応答が貧弱で、精製ＣＤ４＋８−細胞のデータ（上記）と一致していた。外因性ＩＬ−２の存在下で、トランスジェニックＴ細胞は、増加した増殖応答を示したが、対照細胞と類似なレベルの増殖に達するには更に多数の刺激因子細胞を必要とした。この分析にて混合Ｔ細胞集団が刺激に応答する能力は、これらの培養物におけるＣＤ４＋８−Ｔ細胞およびＣＤ４−８＋Ｔ細胞の存在を反映し得る。
【０１７１】
ＣＤ４−８＋活性の直接的な指標として、Ｔ細胞の細胞毒性能力を標準的な標的細胞溶解分析で分析した。ＣＤ４−８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２の存在下、同種異系フィーダ細胞で産生させ、分析しこれらの細胞が標的細胞を溶解する能力を決定した。Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞をイオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激して細胞への３［Ｈ］−チミジンの効率的負荷を可能にした。２４時間後、３［Ｈ］−チミジン（５μＣｉ／ｍｌ）をＰＭＡ＋イオノマイシン−刺激Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞に加えた。細胞を３７℃で１８時間培養した後、洗浄した。ＣＤ４−８＋効果細胞を最終容量１００μｌの９６−ウェル平底プレート（実験）で標的Ｂａｌｂ／ｃ細胞の増加率が１．５：１〜５０：１（効果細胞：標的細胞）でプレートした。細胞を遠心分離により沈殿させて、３７℃にて４時間培養した。ラベルしたＢａｌｂ／ｃ細胞のみ含むプレートを直ちに回収し全数（ＴＣ）を測定した。ラベルしたＢａｌｂ／ｃ細胞のみ含む第二プレートも３７℃にて４時間培養し、自発性放出（ＳＲ）を測定した。培養の４時間後、細胞をガラス繊維の上に回収し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０１７２】
溶解％は次のように測定した：｛［（全−ＳＲ）−（実験−ＳＲ）］／（全数−ＳＲ）｝＊１００＝％溶解。高い効果細胞−対−標的細胞率（５０：１および２５：１）において、標的細胞を溶解する際にｓｃｕｒｆｉｎ−トランスジェニックＣＤ４−８＋細胞は、ＮＬＣから産生した細胞のように有効であるが、中間率（１２．５〜３：１）においては、ＮＬＣに比べ、トランスジェニック細胞は細胞溶解機能が有意に減少した。しかし、トランスジェニック細胞は、これらの中間率においてまだ５０−６０％の溶解に有効である。全体から言えば、これらのデーターは、ｓｃｕｒｆｉｎ−トランスジェニックＴ細胞に細胞溶解活性があるが、ＮＬＣほど有効でないことを示唆する。また、外因性ＩＬ−２が、機能性ＣＤ４−８＋Ｔ細胞の産生が要求されるが、これはこのサイトカインの貧弱な内在性生産のためであろう。
【０１７３】
Ｔ細胞応答性の更なる指標として、生体内抗原に対する２８２６トランスジェニック動物の機能応答性に取り組んだ。オキサザロンをチャレンジ剤とする接触感受性応答を２８２６マウスおよびその同腹仔対照において行った。週齢が近似の動物に２％オキサザロン（オリーブ油／アセトンに希釈）最終容量２５μｌで左耳に処理した。７日後、耳の厚さをバネ付きカリパスで測定し、マウスの右耳に２％オキサザロン（８μｌ／耳）でチャレンジした。耳の厚さを２４時間目に測定し、チャレンジ前と比較した耳厚さの変化を報告した。対照マウスはチャレンジのみである。最初の初回刺激（チャレンジ前）した後の耳の厚さは未処理耳と変わりがない。マウスは続いて初回刺激した耳にＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ；８μｌ／耳）で処理した。耳の厚さを１８時間目に測定し、治療前の厚さと比較した耳厚さの変化を報告した。
【０１７４】
これらの研究において、検査した全時間においてトランスジェニック動物は、一致してオキサザロンに応答が貧弱であるが、対照動物の応答は正常である。しかしトランスジェニック動物は、ＰＭＡでのチャレンジに正常応答した。このことは、これらのトランスジェニック動物が、強力な非抗原特異的チャレンジに対して炎症性反応を産生できることを示す。また、ＴＣＲおよびＦｏｘｐ３の両方についてトランスジェニックである動物を用いた研究は、生体内応答における応答を更に詳しく検定する。
【０１７５】
実施例 １８
ＳＣＵＲＦＹ Ｔ細胞は生体内野生型Ｔ細胞により抑制され得る
ｓｆのるいそうおよび皮膚損傷特徴により測定されたように、ｓｆマウスからのＣＤ４＋８−Ｔ細胞の養子移入はヌードマウスに疾患を移入することが以前に報告されている。しかし、ｓｆ胸腺の正常マウスへの移植は疾患を伝達しないことは、免疫コンピテントマウスにｓｆ細胞を抑制する能力があることを示唆する（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：２８１−２８６，１９９４）。阻害のメカニズムをよく理解するため、３×１０６ｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞または野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはｓｆと野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞混合細胞を同系Ｃ３Ｈ−ＳＣＩＤマウスに養子移入した。
【０１７６】
Ｃ３Ｈ ＳＣＩＤマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。全ての動物は特定の無病原環境で飼育し、ＰＨＳガイドラインに従い研究した。もともとの二重変異体、ｓｆ（ｓｆ）および密接に連鎖した薄毛系（Ｏｔｃｓｐｆ）をＯａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。二重変異体は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃａｓｔａｎｅｏｕｓに戻し交雑し、（Ｏｔｃｓｐｆ）変異またはｓｆ変異（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎ ２７：６８−７２，２００１）を持つ組換え体を得た。ｓｆ遺伝子をクローニングする前に、ｓｆ変異についての雌のキャリアを、プライマー５’−ＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）および５’−ＡＣＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＴＡＴＧＴＧＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）（戻し交雑の間、ｓｆ表現型から分離しないことが見出されたマイクロサテライトマーカーＤＸＭｉｔ１３６のプライマー）でゲノミックＤＮＡの増幅により同定した。
【０１７７】
単一変異体ｓｆ系統は、雌のキャリアを（Ｃ３Ｈｆ／ｒｌ×１０１／Ｒｌ）または（１０１／Ｒｌ×Ｃ３Ｈ／Ｒｌ）のＦ１雄に交配することで維持された。雄のＳｆは１５〜２１日齢で、野生型対照動物は６〜１２週齢のものを使用した。Ｓｃｕｒｆｙまたは野生型ＣＤ４＋Ｔは、細胞選別により純化した。細胞は、０．９％生理食塩水ｐＨ７．２に再懸濁し、最終容量２００μｌを異なる率で混合し、ＳＣＩＤマウスの尾静脈へ注射した。マウスの体重損失を毎週追跡した。約５０μｌの血液を目から集めた。赤血球を溶解し、白血球５×１０４細胞／ウェルを固定された抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。
【０１７８】
ｓｆ Ｔ細胞を受けたマウスは、移入後３〜４週、るいそう（体重損失が見られる）の症状が見られ、段段と悪くなったが、ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系を受けたマウスでは、その年齢に対応する正常の体重増加が見られた（図１１Ａ）。野生型Ｔ細胞のみしか受けてないマウスは年齢に応じた類似の体重増加が見られた。また、ｓｆ Ｔ細胞のみしか受けてないマウスには炎症性反応が目の周りに発症したが、目の中にはなく、これは実験中続いた。疾患を進行させ続けた場合、ｓｆ Ｔ細胞のみのレシピエントは、移入後８〜１６週で死亡した。ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系を受けたレシピエントは実験中（実験は１６週続けた）健康であった。
【０１７９】
ｓｆ Ｔ細胞を受けたマウスの大腸の組織学検査には、腺窩膿瘍、厚上皮、増加した上皮細胞性および結腸壁における細胞の浸潤、増殖性大腸炎との一致性を示す（図１１Ｂ）。比較上、ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系（または野生型細胞単独）を受けたマウスの腸は正常に見え、これらのマウスにるいそうが見られないことと相関する。
【０１８０】
組織学検査について、組織は、ｓｆ Ｔ細胞、野生型Ｔ細胞またはｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合系を受けたＣ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスから摘出した。腸を冷却ＰＢＳで洗い、直ちに１０％ホルマリンに固定した。パラフィン包埋片をヘマトキシリンおよびエオシン染色して、組織病理学比較を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ Ｉｓ．，ＷＡ）。
【０１８１】
細胞浸潤および炎症は、ｓｆ Ｔ細胞のみを受けたマウスの多数の他の器官（腎臓、肝臓および皮膚を含む）に見られ、このような細胞は野生型細胞を受けた動物には見られない。また、ｓｆ−レシピエント動物のリンパ節および脾臓は、その対照と比べて顕著なリンパ増殖を含み実質的拡大している。リンパ節を６〜１２週齢マウスから集めて、無菌顕微鏡スライドの磨りガラス端の間にてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで浸軟した。細胞は７０μＭナイロンメッシュで濾過し、遠心分離で集めて、約５０×１０６細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁した。
【０１８２】
ｓｆマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、過増殖して大量のサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γを分泌することが示されている（Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３７６４−７７４（１９９４）；Ｋａｎａｎｇａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１６１−１６５（１９９６））。ＳＣＩＤ動物へ移入したＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化状態を追跡するため、レシピエントマウスのＰＢＭＣによるＩＬ−４分泌を測定した。色々なレシピエントからのＰＢＭＣを生体外にて抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４８時間刺激して、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）により製造業者の指示書に従ってＩＬ−４分泌を検出した。移入後の早い時点（８〜１０日目）において、ＩＬ−４は全てのレシピエントからのＰＢＭＣにより生産された（図１１ｃ）。後の時点（２週間目またはそれ以上）において、ｓｆ Ｔ細胞のレシピエントからのＰＢＭＣは顕著な量のＩＬ−４を分泌するが、ただ野生型Ｔ細胞のみまたはｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合体を受けたマウスのＰＢＭＣはほとんどＩＬ−４を分泌しない。ｓｆおよび野生型Ｔ細胞の混合体を受けたマウスには体重損失、組織浸潤およびＩＬ−４分泌の抑制が欠けていることは、野生型Ｔ細胞が活性化およびｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入と通常関連する疾患の進行を抑制することを示す。
【０１８３】
実施例 １９
Ｓｆ細胞はＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ−調節性細胞により調節される
多数の報告によると、末梢 ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞） のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ サブセットは、生体内および生体外の他のＴ細胞の調節に係わる（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１２：６７６−６８３ （２０００）； Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ １０１：４５５−４５８ （２０００）； Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１８：４２３−４４９ （２０００））。従って、このようなＴ−ｒｅｇ細胞が生体内でのｓｆおよび野生型 ＣＤ４＋ Ｔ細胞共移入後に見られる疾患を抑制できるかを決定すべきである。２００万のｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を野生型 ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞とまたは野生型 ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞と異なる比率で混合し、Ｃ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスに注射した。レシピエントは実施例 １記載のように、体重損失およびＰＢＭＣによるＩＬ−４分泌を追跡した。Ｔ−ｒｅｇ細胞を分離するに、これらを抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ （Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）および抗ＣＤ２５−ビオチン（Ｃａｌｔａｇ）で氷上にて３０分間染色した。細胞をＰＢＳで二回洗いストレプアビジン−ＡＰＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で氷上にて２０分間染色した。細胞を二回洗い、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞をポジティブ選別した。
【０１８４】
上記の通り、ｓｆ Ｔ細胞単独をうけたマウスは、衰弱の徴候（図１２）およびＩＬ−４生産を示した。しかし、ｓｆ Ｔ細胞および大量（１１０、０００またはそれ以上）の野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の混合を受けたマウスは、疾患の症候、例えば、体重損失が顕著に減少した。比較すると、ｓｆおよびＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の混合を受けたマウスは、ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の数が１．１百万以上のを除く全ての量で症候を示す。少量のサプレスが多数のＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞に見られることは、サプレスの更なるメカニズムまたはＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞移入後に起きることを示す。ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ−ｒｅｇによる抑制のメカニズムは、リンパ空間の生体内競合に係わらないようである、何故ならば、僅か１．１ｘ１０５ Ｔ−ｒｅｇで２ｘ１０６ ｓｆ Ｔ細胞の活性を抑制できるからである。
【０１８５】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞によるｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の抑制のメカニズムをよく理解するため、生体外の混合実験を行った。Ｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞または野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞を色々な応答細胞：サプレス細胞率でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の存在または不存在下、抗ＣＤ３で活性化した。図１３は、ＡＰＣおよび抗ＣＤ３で刺激された野生型 ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖応答がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞を加えることにより顕著にサプレスされたことを示す。これらのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞はｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖応答も抑制する。しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、野生型ＣＤ４＋ Ｔ細胞よりもｓｆ ＣＤ４＋
Ｔ細胞を抑制するに有効でない。 この結果により、生体内での共移入に見られるように、ｓｆ Ｔ細胞の高応答性状態がＴ−ｒｅｇ細胞により調節されることが示される。
【０１８６】
ＡＰＣのため、リンパ節と類似な方式で脾臓を集めて、抗Ｔｈｙ−１−ＦＩＴＣまたは抗Ｔｈｙ１−ＰＥ （Ｃａｌｔａｇ）で染色した。細胞を洗い、Ｔｈｙ−１をネガティブ選別した。細胞は、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター （Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）およびＣｙｃｌｏｐｓ （Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）ソフトウェアーを用いて速度１０−２０、０００／ｍｉｎで選別した。双および単球細胞を前および側散乱ゲートの基底に消失させ、死細胞を沃化プロピジウム（１０ mｇ／ｍｌ）染色
により排除した。選別された細胞個体群の純度は通常に９０−９９％であった。Ｔｈｙ−１− ＡＰＣをマイトマイシン Ｃ （Ｓｉｇｍａ，５０ μｇ／ｍｌ）で３７°Ｃにて２０分間処理して、増殖分析に使う前にＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ で三回洗った。調節性Ｔ細胞分析のため、ＣＤ ４＋ Ｔ細胞５ ｘ １０４細胞／ウェルを２００ｕｌ ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳにて可溶性抗ＣＤ３ （２Ｃ１１； Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ） １μｇ／ｍｌおよび脾臓からの同数マイトマイシン Ｃ処理したＴｈｙ−１− ＡＰＣで刺激した。Ｔ−ｒｅｇ分析のため、ＭｏＦｌｏ 選別したＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を色々な比率で加えた。
【０１８７】
培地を３７°Ｃに７２時間培養して、培養の最後の８−１２時間に１ μＣｉ／ウェルと［３Ｈ］ チミジン （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）を加えた。生体外での前活性化のため、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞は、５ ｘ １０４細胞／ウェルで２００μｌ ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳと可溶性抗ＣＤ３ （野生型細胞には１μｇ／ｍｌ、またはＦｏｘｐ３トランスジェニック細胞には１０ μｇ／ｍｌ）、４ ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ−２ （Ｃｈｉｒｏｎ）および脾臓からの同数マイトマイシン Ｃ処理したＴｈｙ−１− ＡＰＣで刺激した。細胞は７２時間で回収し、ＣＤ４−ＦＩＴＣまたはＣＤ４−ＰＥで染色して、上記のようなＭｏＦｌｏフローサイトメーターを用いてＣＤ４ポジティブ選別した。次にこれらの細胞を上記のような調節性Ｔ細胞分析に新しく単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞と同じ比率で加えた。
【０１８８】
実施例 ２０
ＴＧＦ−β はＳＦ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を抑制しない
最近の研究ではＣＴＬＡ−４およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞生体内の調節性機能におけるＴＧＦ−βの分泌の重要な役割が説明された（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２，２０００）； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：３０３−３１０，２０００）。ｓｆ細胞がＴＧＦ−βでの抑制に感受性であるかを試験するため、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を外因性ＴＧＦ−βの添加が有りまたは無しで刺激した。ＴＧＦ−β分析のために、抗ＣＤ３ （異なる濃度、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２８ （１μｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をプラスチックに固定した。ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ）を最終濃度２．５ ｎｇ／ｍｌに加えた。培養は３７°Ｃ で指定期間培養した。各ウェルに、１ μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］ チミジン （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）を、培養の最終８−１２時間加えた。増殖データは、三重複ウェルの平均値であり、少なくとも３実験の値を代表する。
【０１８９】
期待通り、抗ＣＤ３単独（図１４Ａ）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の組み合わせで刺激された野生型ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＴＧＦ−βにより顕著に抑制された（図１４Ｂ）。しかし、抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたｓｆ細胞は、抗ＣＤ３またはＴＧＦ−βの量に拘わらずＴＧＦ−βでの抑制に感受性でなかった。ＴＧＦ−β抑制の欠如はＴ細胞に特異的であった。何故ならば、ｓｆマウスからの共にＬＰＳで刺激されたＢ細胞および単球細胞による増殖およびサイトカイン生産はＴＧＦ−βでの抑制に感受性であるからである。しかし、高レベルの外因性ＩＬ−２は、潜在的にＴＧＦ−β受容体表現の下方調節により、Ｔ細胞におけるＴＧＦ−βの抑制効果を大きく克服できることに注意すべきである（Ｃｏｔｔｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７７３−７７８，２００１）。ｓｆ動物からのＴ細胞は刺激により極めて高度レベルのＩＬ−２を生産し、これはｓｆマウスのＴ細胞機能におけるＴＧＦ−βによる抑制欠如からである。また、生体外の分析におけるＴ−ｒｅｇ細胞によるＴＧＦ−β生産の役割は不明である。殆どの実験系ではこの系におけるＴＧＦ−βの役割を指さないが、生体内データはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の抑制活性におけるＴＧＦ−βの重要な役割を示す（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２，２０００）。
【０１９０】
実施例 ２１
Ｆｏｘｐ３発現はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−Ｒｅｇ細胞にて上方調節されている
リンパ性組織 例えば、胸腺、リンパ節および脾臓にてＦｏｘｐ３遺伝子は、最も高いレベルで発現される（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
２７：６８−７２，２００１）。Ｆｏｘｐ３のリンパ系における発現は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞に現れるようである。なぜなら、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＢ細胞における表現のレベルは顕著に低いかまたは検出できないからである（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：６８−７２，２００１）。
【０１９１】
Ｆｏｘｐ３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞における役割を果たすかを評価するため、正常およびＦｏｘｐ３ トランスジェニックマウス（約１６コピーのＦｏｘｐ３ 導入遺伝子）からのＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３転写の発現を比較した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞個体群を上記のように集めた。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてこれらの細胞からＯｌｉｇｏ ｄＴ プライムされた第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ 機器を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの鋳型とした。Ｆｏｘｐ３ 発現の測定にプライマー ５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡ−３’（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１７）および５’−ＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８） 最終濃度３００ｎＭおよび内部ＴａｑＭａｎプローブ ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＡＧ−ＡＡＴＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９） 最終濃度１００ ｎＭを用いた。Ｄａｄ１ を内在性基準（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）にした。Ｄａｄ１プライマーを５’−ＣＣＴＣＴＣＴＧ−ＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）および５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）最終濃度５０ ｎＭで使い、ＴａｑＭａｎ プローブを ５’−６ＦＡＭ−ＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＡＣ−ＴＡＭＡＲＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）最終濃度１００ ｎＭで使用した。ＰＣＲ混合の他の成分は、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から得た。ＰＣＲ循環条件は、５０°Ｃ ２分間；９５°Ｃ １０分間；および４０循環の９５°Ｃ １５秒、６０°Ｃ １分間であった。
【０１９２】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．４でデーターを集めた。未知サンプルと同時に行った標準ｃＤＮＡサンプルの希釈系列（１ｘ，１：１０， １：１００， １：１０００， １：１０，０００）から標準曲線を得た。ソフトウェアは、許容限界循環（ＣＴ） 対 出発量の曲線をプロットし、ＣＴを用いて未知サンプルの相対的レベルを計算することに基づいて、各未知物の相対的量を決定する。各サンプルを２連で実行し、平均値を計算に用いた。データを正規化したＦｏｘｐ３発現として表し、それは各サンプルについてのＦｏｘｐ３の相対的量を同サンプルについてのＤａｄ１の相対的量で割って得られた。
【０１９３】
興味深いことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３発現のレベルは殆ど検出できないが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、これまでのところ記載されていない、Ｆｏｘｐ３の最高量を発現する（図１５Ａ）。Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスのＴ細胞サブセットにおけるＦｏｘｐ３発現のレベルも決定した。これらの動物は、野生型動物に見られるＦｏｘｐ３メッセージの約１６倍の量がある。Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスにおいて、Ｆｏｘｐ３発現は、ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞は共に検出されるが、野生型細胞のように、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞は顕著により大きいレベルのＦｏｘｐ３を発現した。ｓｆ 突然変異動物のＣＤ４＋細胞のサブセットもＣＤ２５を発現するが、この集団はサイズが大きく、ＣＤ６９を発現し、このことは、恐らく、前にインビボで活性化された細胞であることを示す。しかし、ｓｆ 突然変異動物からのこれらのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、増大した量のＦｏｘｐ３メッセージを示さず、このことは、これらの細胞は性質が恐らくＴ−ｒｅｇではないことを示すと決められた。
【０１９４】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、活性化Ｔ細胞の特徴である、特定のマーカー、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲを発現する（ＭｃＨｕｇｈ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６： ３１１−２３，２００２）； Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３： １３５−４２，２００２）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３発現がＴ細胞の活性化によるものであるか否かを評価するため、インビトロでの活性化の前後にＣＤ４ Ｔ細胞のＣＤ２５＋サブセットおよびＣＤ２５−サブセットにおけるＦｏｘｐ３発現を測定した（図１５Ｂ）。インビトロで抗ＣＤ３およびＩＬ−２を用いた後でさえ、ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞は、いかなるＦｏｘｐ３も発現しない。面白いことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現は活性化後にやや減少する。これは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞についてこれまで報告されたいかなる他のマーカーとも異なるＦｏｘｐ３が、このサブセットに特異的であり、そしてこれらの細胞の活性化／記憶表現型と関係がなかったことを示した。
【０１９５】
実施例 ２２
Ｆｏｘｐ３の過剰発現はＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞数の増加を導くが調節性活性の増加を導かない
Ｔ−ｒｅｇサブセット内のＦｏｘｐ３の比較的排他的な発現は、この転写因子が、このサブセットの生成を要求するかまたは直接その機能に係わることを示す。Ｆｏｘｐ３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞機能において役割を果たすか否かを決定するために、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞サブセットの機能活性を検査した。これらの動物は、野生型動物に見られるＦｏｘｐ３メッセージよりも１６倍多いＦｏｘｐ３メッセージを有し、これはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ サブセットにおいて量が非常に多い。さらに、これらのトランスジェニック動物において全ＣＤ４＋細胞は少なく、これらの細胞はその同腹子対照に対して低応答性である。一方、トランスジェニックマウスにおいてわずかに増加した％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞が存在し、ＣＤ２５の発現はより広汎であり、野生型動物と異なり、これらの細胞は明確な細胞のサブセットを含まない（図１６）。野生型からのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞とＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞との機能活性の比較は、トランスジェニックマウスからの細胞が調節性活性を示すが、細胞ごと基準におけるその野生型対応物に対する抑制能力の顕著の増加はなかった（図１７）。
【０１９６】
Ｔ−ｒｅｇ分析条件下、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞は、応答細胞と同時に活性化した。Ｆｏｘｐ３導入遺伝子からのＣＤ４＋Ｔ細胞はＴＣＲ刺激に低応答性であるから、分析においてこれらのＦｏｘｐ３−Ｔｇ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞は野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞と同じ程度に活性化しなかったようであった。これは、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇ細胞が野生型細胞と同じ程度に活性化した場合、より高い調節性活性を呈する可能性を起こす。
【０１９７】
この問題に取り組むために、前に出版したプロトコル（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６４：１８３−１９０，２０００）により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＡＰＣおよびＩＬ−２の存在下、抗ＣＤ３と生体外で７２時間の前活性化させた。本発明者らの前の観察に基づき、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＴ細胞は、生体外で大量の抗ＣＤ３を用いて活性化して野生型細胞に匹敵する増殖が得られた。これらの前活性化Ｔ細胞は、次にＴ−ｒｅｇ分析で試験した。他の報告のように、生体外でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の前活性化は、それらの細胞をより強力なサプレッサーにさせた。しかし、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックＴ−ｒｅｇ細胞の前活性化は、それらの細胞を野生型Ｔ−ｒｅｇ細胞に匹敵するサプレッサー活性にさせた（図１７）。これは、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＴ−ｒｅｇ細胞に内因性の欠損がなかったことを示唆した。しかし、閾値レベルを超えたＦｏｘｐ３の過剰発現はＴ−ｒｅｇ活性を更に強化しなかった。
【０１９８】
実施例 ２３
Ｆｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は調節性活性を示す
Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞より高いレベルでＦｏｘｐ３を発現するので、次にＴ調節性細胞に伴う表面マーカーの発現およびこれらの細胞の抑制活性を評価した。面白くも、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）も発現し、これは最近Ｔ−ｒｅｇ活性を調節することが示されている（図１８）。これらの細胞は、他の活性化を伴うＴ細胞マーカー、例えば、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ４またはＬｙ−６Ａ／Ｅ（データーは示されていない）を発現しなかった。更に重要なことは、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからの新しく単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞をＴ−ｒｅｇ分析における機能を試験した場合、顕著な抑制活性を有した（図１９）。この活性は通常同じマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性に匹敵から低いに至る。期待する通り、このような抑制活性は、野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞には検出されたことがなかった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と対照的に、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の抑制活性は、抗ＣＤ３およびＩＬ−２での生体外の前活性化で強化され得なかった（データーは示していない）。これはまたＦｏｘｐ３の発現が調節活性との直接相関がなく、Ｔ−細胞をＴ−ｒｅｇ系列にゆだねるという考えを支持する。
【０１９９】
ｓｆマウス（Ｆｏｘｐ３）において突然変異した遺伝子は、末梢Ｔ細胞応答の調節における重要な役割がある。この遺伝子における突然変異の機能消失は、マウスおよびヒトにおける可能な致命性Ｔ細胞が媒介する自己免疫病に導く（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：２０−２１（２００１）；Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３−２４３７（１９９０）；Ｗｉｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：１８−２０（２００１））。また、トランスジェニックマウスにおけるｓｃｕｒｆｉｎの過剰発現は、末梢Ｔ細胞数減少ならびに増殖およびＩＬ−２産生を含む色々なＴ細胞応答の阻害を導く。ｓｃｕｒｆｉｎによるＩＬ−２産生の阻害は、低応答性の唯一解釈ではない。なぜなら、外因性ＩＬ−２の添加は、ｓｃｕｒｆｉｎを過剰発現するマウスにおける正常Ｔ細胞応答を完全には回復しないからである。Ｆｏｘｐ３遺伝子により制御され得る免疫調節メカニズムをよく理解するため、この遺伝子の発現およびｓｃｕｒｆｉｎ発現細胞の生物学役割を研究した。
【０２００】
この実施例に示すように、野生型Ｔ細胞は、ｓｆ ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスに養子移入することにより起きる疾患を阻害し得る。これらの観察は、調節性Ｔ細胞の活性を特徴付けした複数の他のグループによるものと非常に類似する。類似な観察がＰｏｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ．により行われた、ｓｆ細胞により起こる疾患は、少数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞でも阻害された。ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞は、このモデルにおけるｓｆ Ｔ細胞活性の阻害に余り有効でない、このことは、これらの細胞のサブセットがＴ−ｒｅｇ 細胞サブセットに発生し、適切な阻害因子を作ることに起因し得るか、または阻害の追加メカニズムに起因し得る。また、ｓｆ Ｔ細胞の生体外の過剰応答性状態は、野生型 ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の存在により阻害され得るが、ＴＧＦ−βの添加により阻害されない。一般に、生体外のＴ−ｒｅｇ 実験からのデータは、直接の細胞−細胞間相互作用にサイトカイン、例えばＴＧＦ−βの関与を要求しないことを示唆する （Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２８７−２９６ （１９９８）； Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６４：１８３−１９０ （２０００））。また、ＴＧＦ−βには、活性化Ｔ細胞に対する阻害効果がない（Ｃｏｔｔｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７７３−７７８（２００１））。このことは、生体内ｓｆ細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞阻害がＴＧＦ−βにより媒介されることを不可能にする。
【０２０１】
Ｆｏｘｐ３ 遺伝子生成物がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞機能における役割を担うか否かを評価するため、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５−
Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現を測定し、Ｆｏｘｐ３ 遺伝子を過剰発現したマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の調節性活性を測定した。野生型およびＦｏｘｐ３トランスジェニック体の両方において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞は、今日まで、全ての試験した異なる細胞個体群にＦｏｘｐ３ ｍＲＮＡの最高レベルを発現した。野生型およびＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ−ｒｅｇ細胞の機能活性を比較すると、これらの細胞に最適刺激をしてもトランスジェニックマウスの細胞において調節性活性が増加しない。しかし、重要なことに、Ｆｏｘｐ３
トランスジェニック動物からのＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞に抑制活性があった。ｓｆ突然変異株マウスにおけるＴ−ｒｅｇ細胞のサブセットは、表現型に同定できないが（高レベルの内在性活性化により）、突然変異株動物から単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞はＦｏｘｐ３ 遺伝子も発現しなかったし、生体内でなんの抑制活性も表さなかった。
【０２０２】
これらの結果として、Ｆｏｘｐ３の発現はＴ 細胞をＴ−ｒｅｇ細胞株に拘束し得るが、Ｆｏｘｐ３の閾値レベルを超えた過剰発現は、調節性活性のさらなる強化をもたらさない。更に、Ｆｏｘｐ３ 自体の発現は、Ｔ−ｒｅｇ細胞を産生するに不十分なようである、それはＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５−は野生型Ｔ−ｒｅｇ細胞に匹敵するＦｏｘｐ３発現を有するが、抑制活性が少ないからである。この調節性活性に対する効果は、ＣＴＬＡ−４ 発現の効果によるものではないようである、それはＦｏｘｐ３トランスジェニックマウスにＣＴＬＡ−４発現の増加がなく、ｓｆ 突然変異株動物はＣＴＬＡ−４の正常レベルを発現するからである。
【０２０３】
実施例 ２４；ＳＣＵＲＦＩＮ発現の調節
ｓｃｕｒｆｉｎ発現を調節する抗体またはＮＣＥは下記の方法で同定する：
ｓｃｕｒｆｉｎプロモーターを市販ルシフェラーゼリポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローンする。次にこの構築を細胞、例えば、マウスまたはヒトＴ細胞株にトランスフェクトをする。例えば、Ｔ細胞に対して惹起された抗体、サイトカイン、リセプター、または他の蛋白質、並びに小分子、ペプチド、およびサイトカイン等の薬剤をトランスフェクトされた細胞の処理に用いる。次にルシフェラーゼ活性のレベルを市販ルシフェラーゼ分析系（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造業者の指示書に従って、ｓｃｕｒｆｉｎの発現を増加または減少する薬剤を同定する。
【０２０４】
別のアプローチでは、例えば、上記の薬剤を、初代Ｔ細胞と、ｓｃｕｒｆｉｎ発現を調節させる条件下にて培養する。ｓｃｕｒｆｉｎ発現の測定に上記実施例 ２１ のＲＴ−ＰＣＲ方法が用いられる。上記いずれの方法で同定された薬剤は直接に自己免疫病の治療に用いる。別に、Ｔ細胞は自己免疫病の患者から単離され、上記の同定された特定の薬剤で処理され、ｓｃｕｒｆｉｎ発現を誘導して、患者に移入され、他のＴ細胞の活性化を抑制する。
【０２０５】
実施例の結果を纏めると、Ｆｏｘｐ３発現は主にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇサブセットに見られ、調節性活性の基礎レベルと相関することが、実施例の結果により示される。この遺伝子の過剰発現は、ＣＤ２５が欠けてるＣＤ４＋細胞に対して調節性機能を与え得る。このことは、この因子がこの機能的系列への拘束に直接係わり得ることを示唆する。
【０２０６】
この明細書中で言及されたか、および／または出願データシートにリストされ参考される、全ての上記米国特許、米国特許出願公報、米国特許公報、外国特許、外国特許出願公報および非特許文献は、その全体が、本明細書において参考として援用される。
【０２０７】
以上、本発明の特定の実施形態を説明の目的で挙げたが、本発明の精神と範囲を離れないで色々な変化することができる。よって、本発明は添付の請求の範囲以外には限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、マウスＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のヌクレオチド配列を示す；翻訳は２５９位に始まり、１５４６位に終わると予測される。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、マウスＦｋｈｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のヌクレオチド配列を示す；翻訳は２５９位に始まり、１５４６位に終わると予測される。
【図２】図２はマウスＦｋｈｓｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；１２９３ｂｐコード領域を含む）に対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列を示す；翻訳は５５位に始まり、１３４８位に終わると予測される。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ヒトＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；１２９３ｂｐコード領域を含む）に対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列を示す； 翻訳は５５位に始まり、１３４８位に終わると予測される。
【図４】図４は、４３１アミノ酸のヒトＦＫＨｓｆ蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の配列を示す。
【図５】図５は、ＦＫＨｓｆトランスジェニックマウスの作製のためのベクターを示す。
【図６】図６は、ＦＫＨｓｆ導入遺伝子がｓｃｕｒｆｙ動物における欠損を正したことを説明する写真である。
【図７】図７は、ＦＫＨｓｆ ｔｇマウスが、正常マウスに比べリンパ節細胞を減少していることを示す。
【図８】図８は、ＦＫＨｓｆトランスジェニックマウスが、生体外刺激に貧弱に応答することを示す。
【図９】図９は、ＦＫＨｓｆとＪＭ２ ｃＤＮＡとの比較である。
【図１０】図１０は、ヒトＦＫＨｓｆおよびマウスＦｋｈｓｆの色々な領域における相同性を比較する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｓｃｕｒｆｙマウスおよび野生型マウスの体重を追跡したグラフである。マウスの体重減少を規則的時間を隔て１０週間追跡した。各値点は、３匹マウスの平均であり、ｓｆ ＣＤ４移入群における３匹マウスのうちの１匹が死んだ第５週後を除く（グラフにて矢印で示す）。データは３より多くの独立実験を表す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、組織断面の写真である。ｓｆＴ細胞（左面）またはＷＴおよびｓｆＴ細胞の混合物（右面）のいずれかを受けたＣ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスの大腸をホルマリンに固定し、切片化してヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｓｆＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＷＴとｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞の混合物またはＷＴ ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかを受けたＣ３Ｈ／ＳＣＩＤマウスから５×１０４ ＰＢＭＣより生産したＩＬ−４を５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８で刺激して、丸底板に固定したグラフを示す。上澄を４８時間に収集し、ＩＬ−４濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ−調節性細胞で処理したマウスの体重減少を示すグラフである。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性サブセットは生体内でｓｆＴ細胞により起される疾患の抑制を媒介する。４×１０６ ｓｆＴ細胞と異なる数の野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（ａ）またはＣＤ４＋ＣＤ２５−（ｂ）Ｔ 細胞との混合物を尾静脈注射でＣ３／ＳＣＩＤマウスに移植した。これらのマウスは、体重減少を一期間追跡した。各値点は、各群に２匹のマウスを有するｓｆ ＣＤ４移植群およびｓｆ ＣＤ４＋１．１×１０６ ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を除く３匹のマウスの平均である。また、グラフ上の矢印は、死亡したマウスまたは疾患の進行により殺したものを指す。
【図１３】図１３は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ調節性細胞の抑制または活性を決定する増殖分析を示すグラフである。ｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生体外でＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性細胞により阻害することができる。５×１０４ＷＴまたはｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および５×１０４ミトマイシンＣで処理したＴｈｙ−１− ＡＰＣで刺激された。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性細胞を、色々な比で分析に加えた。細胞を７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、５×１０４ ＷＴまたはｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞を固定した抗ＣＤ３で刺激した増殖分析を示すグラフである。ＴＧＦ−βを、分析の始に最後の濃度２．５ ｎｇ／ｍｌで加えた。細胞を７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、５×１０４ＷＴまたはｓｆ ＣＤ４＋Ｔ細胞を固定した抗ＣＤ３（色々な濃度）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で刺激した増殖分析を示すグラフである。ＴＧＦ−βを、分析の始に最後の濃度２．５ｎｇ／ｍｌで加えた。細胞は７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｄａｄ１を内因性参照遺伝子とするリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ方法を用いた色々な細胞サブセットからのｃＤＮＡサンプルにてＦｏｘｐ３発現を検査したグラフである。正常化されたＦｏｘｐ３値は、Ｆｏｘｐ３発現対Ｄａｄ１発現の比から誘導された。
【図１６】図１６は、ＷＴ動物、Ｆｏｘｐ３トランスジェニック動物、およびｓｃｕｒｆｙ動物からのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５表面発現のレベルを示す。ｓｆ、Ｆｏｘｐ３トランスジェニックまたは同腹子コントロールからのリンパ節細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現の発現を検査した。データは、６匹の個々の検査されたマウスを表す。
【図１７】図１７は、５×１０４ ＷＴ ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のレベルが抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および５×１０４ミトマイシン Ｃ処理したＴｈｙ−１−ＡＰＣで刺激されたことを示すグラフである。ＷＴまたはＦｏｘｐ３トランスジェニックからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−調節性細胞を色々な比で分析に加えた。細胞は７２時間培養し、最後の８時間の培養を［３Ｈ］チミジンでパルスした。データは３連の平均である。
【図１８】図１８は、Ｔ調節性細胞に付随する表面マーカーの発現およびこれらの細胞の抑制活性を評価するＦＡＣＳプロットである。
【図１９】図１９は、Ｔ−ｒｅｇ分析でテストされたＦｏｘｐ３トランスジェニックから新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＴ細胞阻害のレベルを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の、ｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節する化合物を同定する方法。
【請求項１】
明細書に記載の、ｓｃｕｒｆｉｎの発現のレベルを調節する化合物を同定する方法。
【図１Ａ】
【図２】
【図３Ａ】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１Ｂ】
【図３Ｂ】
【図６】
【図１１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１Ｂ】
【図３Ｂ】
【図６】
【図１１Ｂ】
【公開番号】特開２００８−２２０３７９（Ｐ２００８−２２０３７９Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１７９２１（Ｐ２００８−１１７９２１）
【出願日】平成２０年４月２８日（２００８．４．２８）
【分割の表示】特願２００２−５８７６５９（Ｐ２００２−５８７６５９）の分割
【原出願日】平成１４年５月８日（２００２．５．８）
【出願人】（３９８０５５２２２）ダーウィン モレキュラー コーポレイション (1)
【出願人】（５０３０１４７６８）セルテック アール アンド ディー インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２８日（２００８．４．２８）
【分割の表示】特願２００２−５８７６５９（Ｐ２００２−５８７６５９）の分割
【原出願日】平成１４年５月８日（２００２．５．８）
【出願人】（３９８０５５２２２）ダーウィン モレキュラー コーポレイション (1)
【出願人】（５０３０１４７６８）セルテック アール アンド ディー インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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