ＲＮＡ干渉のためのカチオン性ｓｉＲＮＡ、合成及び使用
本発明は、カチオン性ｓｉＲＮＡであって、それらは二本鎖ＲＮＡフラグメントであり、その末端にオリゴカチオンがグラフトされ、カチオン電荷の数は、ＲＮＡ鎖のヌクレオチド内ホスファートによって有されるアニオン電荷の数に匹敵するかまたはそれより大きいことを特徴とするカチオン性ｓｉＲＮＡに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン性siRNA（small interfering ribonucleic acid：低分子干渉リボ核酸）、それらの自動合成、及びRNA干渉のメカニズムに関与するそれらの細胞内浸透特性に基づく、それらの生物学的応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉は、内在性又は外来性の遺伝子の発現の配列特異的制御を可能にする細胞内メカニズムである。このメカニズムのメディエータは、約２ターンのビカテナリーリボ核酸の小さいヘリックス（siRNA）であり、標的遺伝子のフラグメントと同一配列である。RNA干渉は、細胞のクロマチンにおける標的遺伝子の永続的な修飾をもたらし得るが、細胞内におけるsiRNAの導入のほとんどの即時的効果は標的メッセンジャーRNAの不活性化である。siRNAは、通常、3’-dTdT伸長を含む相補配列の２つの１９塩基長のオリゴリボヌクレオチドから形成されるが、２７塩基長までのわずかな不完全な対形成又は配列が効果的である場合もある。
【０００３】
タンパク質の消失又はウイルスRNAの選択的破壊は、腫瘍、アレルギー又は感染症のような領域において広範囲に興味のある治療への応用を有するかもしれない。残念なことに、培養液又はインビボにおいて細胞内にsiRNAそれ自体を導入するための無益な試みにより示されるように、無傷の動物細胞は核酸に対して不浸透性である。それにもかかわらず、動物実験は、細胞を急速に再生し得る器官である肝臓、又は特に大きくかつ強健な筋細胞がsiRNAを取り込み、注入工程により誘発されるそれらの細胞膜の破裂を免れることができることを示す。しかし、大量の液体の急速静注又は筋肉内注射の非常に限局的な性質は、ヒトの治療における使用に適合しない。
【０００４】
細胞膜を破裂させることなく、細胞の細胞質にsiRNAをトランスフェクトすることは、過剰のカチオン性トランスポータと混合した後に得られ得る。ポリエチレンイミンのようなポリカチオン性高分子又はカチオン性脂質凝集体は、このベクターの役割を果たし得る（非特許文献１）。具体的には、ポリアニオン性siRNA分子は、過剰のトランスポータにより凝集し、微細なカチオン性沈殿物を形成する。これらの粒子は、細胞表面に存在するアニオン性ヘパランスルファートによって、培養下の多くの細胞内へのsiRNAの効率的なトランスフェクションを可能にする（非特許文献２）。
【０００５】
動物において、同じことはもはや当てはまらない。血中に注射される場合、粒子は吸収され、微生物粒子を貪食する細胞により消化される。組織又は腫瘍に注射される場合、それらのサイズ（１００〜１０００ｎｍ）は、注射部位を超えて位置する細胞に向かう、それらの拡散を防止する。それにもかかわらず、最近の研究（非特許文献３〜４）は、粒子をポリエチレングリコール残基で粒子を覆うことにより（ステルス粒子）、細胞結合を全体的に阻害することなく、血液の食細胞を回避することが可能であることを示す。
【０００６】
これらの考察により、発明者らは、本質的にカチオン性のsiRNA、すなわち、カチオン電荷が、核酸のホスファートにより生じるアニオン電荷を相殺する、修飾siRNA分子の合成を想像するに至った。これらの化合物は、おそらく細胞に入るためのベクターなしで済ますことができ、その結果として薬物は粒子でなく分子であるという利点を有するだろう。
【０００７】
メッセンジャーRNAを破壊するタンパク質複合体へのsiRNAの結合又はハイブリダイゼーションによる後者の認識のいずれかを乱さないように、化学修飾は、核酸の末端においてのみ可能である。
【０００８】
過去において、オリゴヌクレオチドの末端に、アンチセンスアプローチによる治療目的のためにそれらの細胞透過を増大させることを目的として、非常に多数の化学ユニットがグラフトされていた。ごく最近発表された多くの論文は、siRNAの分野において類似の試みを報告している。
【０００９】
２００６年に発表された最初の論文は、ジスルフィド架橋を介したポリエチレングリコールのsiRNAへのコンジュゲーションについて言及しているが、細胞のインターナリゼーションは、それにもかかわらずカチオン性ポリマーを混合することによる非共有結合性会合（association）を必要とする（非特許文献５）。
【００１０】
２００７年において、２つの論文により、７又は８個のカチオン電荷を含む種々のカチオン性ペプチドにコンジュゲートされたsiRNA（４０個のアニオン電荷）の使用が記載された。これらのsiRNAは、著者自身も認めているようにアニオン性が大きいままであり、細胞内浸透及び効果は増大しない（非特許文献６及び７）。
【００１１】
前記論文に記載されたように、前もって製造されたポリカチオンのオリゴヌクレオチドへの直接的化学グラフト処理が可能であるが、沈殿の問題を引き起こし、オリゴヌクレオチドの電荷に匹敵する多くの電荷を含むポリカチオンを操作する問題になる場合に、カチオン性ポリマーの多分散の評価における特徴づけを不明確にし得る。発明者らは、オリゴヌクレオチド配列自体の合成に用いられるものと同一のコンジュゲーションケミストリーを介したオリゴカチオンの逐次的合成の技術を頼りにすることにより上記問題を克服した。オリゴデオキシリボヌクレオチド−オリゴスペルミンコンジュゲートの自動合成は、先行のＰＣＴ国際特許出願（特許文献１）の対象であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０７／０６９０９２号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ボルカト−ベレミン・エイ・エル（BOLCATO-BELLEMIN, A.L）、ボネット・エム・イー（BONNET, M. E.）、クロウサト・ジー（CREUSAT, G.）、エルバヒア・ピー（ERBACHER, P.）およびベヘル・ジェイ・ピー（BEHR, JP）著、「スティッキー・オーバーハングス・エンハンス・ｓｉＲＮＡ−メディエイテッド・ジーン・サイレンシング（Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing.）」、Proc Natl Acad Sci U S A、2007年、第104巻、ｐ．16050-16055
【非特許文献２】コパツ・アイ（KOPATZ, I.）、レミー・ジェイ・エス（REMY, J.S.）およびベヒア・ジェイ・ピー（BEHR, J. P.）著、「ア・モデル・フォー・ノン・ヴイラル・ジーン・デリバリー・スルー・シンデカン・アドヘション・モレキュールス・アンド・パワード・バイ・アクション（A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin）」、 J Gene Med、2004年、第6巻、ｐ．769-776
【非特許文献３】ジンメルマン・ティー・エス（ZIMMERMANN, T.S.）、リー・エイ・シー（LEE, A.C.）、アキンク・エイ（AKINC, A.）、ブラムラゲ・ビー（BRAMLAGE, B.）、（バンクロト・ティー・ディー（BUMCROT, D.）、フェドラック・エム・エヌ（FEDORUK, M. N.）、ハルボルス・ジェイ（HARBORTH, J.）、ヘイス・ジェイ・エイ（HEYES, J.A.）、ジェフェス・エル・ビー（JEFFS, L.B.）、ジョン・エム（JOHN, M.）、ジャッジ・エイ・ディー（JUDGE, A.D.）、ラム・ケイ（LAM, K.）、マックリントック・ケイ（MCCLINTOCK, K.）、ネチェフ・エル・ブイ（NECHEV, L.V.）、パルマー・エル・アール（PALMER, L. R.）、ラシー・ティー（RACIE, T.）、ロール・アイ（ROHL, I.）、セイフェルト・エス（SEIFFERT, S.）、シャンムガン・エス（SHANMUGAM, S.）、ソド・ブイ（SOOD, V.）、ソウチェク・ジェイ（SOUTSCHEK, J.）、トウドジャルスカ・アイ（TOUDJARSKA, I.）、フェート・エイ・ジェイ（WHEAT, AJ.）、ヤウォルスキ・イー（YAWORSKI, E.）、ゼダリス・ダブリュー（ZEDALIS, W.）、コテリアンスキ・ブイ（KOTELIANSKY, V.）、マンノハラン・エム（MANOHARAN, M.）、ボルンロシア・エイチ・ピー（VORNLOCHER, H. P.）およびマクラキアン・アイ（MACLACHLAN, I.）著、「ＲＮＡｉ−メディエイテッド・ジーン・サイレンシング・ノン−ヒューマン・プライメイツ（RNAi-mediated gene silencing in non-human primates.）」、 Nature、2006年、第441号 、ｐ．111 -114
【非特許文献４】サンテル・エイ（SANTEL, A.）、アレク・エム（ALEKU, M.）ケイル・オー（KEIL, O.）、エンドルシャット・ジェイ（ENDRUSCHAT, J.）、エシェ・ブイ（ESCHE, V.）、フィッシュ・ジー（FISCH, G.）、ダメス・エス（DAMES, S.）、ロフェラー・ケイ（LOFFLER, K.）、フェチトナー・エム（FECHTNER, M.）、アーノルド・ダブリュー（ARNOLD, W.）、ギエス・ケイ（GIESE, K.）、クリッペル・エイ（KLIPPEL, A.）およびカウフマン・ジェイ（KAUFMANN, J.）著、「ア・ノベル・ｓｉＲＮＡ−リポプレックス・テクノロジー・フォー・ＲＮＡ・インターフェアランス・イン・ザ・マウス・バスキュラー・エンドセリウム（A novel siRNA-lipoplex technology for RNA interference in the mouse vascular endothelium.）」、Gene Ther、2006年、第13巻、ｐ．1222-1234
【非特許文献５】キム・エス・エイチ（KIM, S. H.）、ヨン・ジェイ・エイチ（JEONG, J. H.）、イ・エス・エイチ（LEE, S. H.）、キム・エス・ダブリュー（KIM, S.W.）およびパク・ティー・ジー（PARK, T.G.）著、「ＰＥＧコンジュゲーテッド・ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡフォー・アンチ−アンジオゲニック・ジーン・セラピー（PEG conjugated VEGF siRNA for anti-angiogenic gene therapy.）」、Journal of Controlled Release、2006年、第116巻、ｐ．123-129
【非特許文献６】モショス・エス・エイ（MOSCHOS, S.A.）、ウィリアムス・エイ・イー（WILLIAMS, A.E.）およびリンドセイ・エム・エイ（LINDSAY, M.A.）著、「セル−ペネトレーティング−ペプチド−メディエイテッドsiRNAラング・デリバリー（Cell-penetrating- peptide-mediated siRNA lung delivery.）」、Biochemical Society Transactions、2007年、第35巻、ｐ．807- 810
【非特許文献７】ターナー・ジェイ・ジェイ（TURNER, JJ.）、ジョーンズ・エス（JONES, S.）、ファバニ・エム・エム（FABANI, M. M.）、イバノバ・ジー（IVANOVA, G.）、アルズマノフ・エイ・エイ（ARZUMANOV, A.A.）およびガイト・エム・ジェイ（GAIT, MJ.）著、「ＲＮＡターゲッティングウィズ・ペプチド・コンジュゲーツ・オフ・オリゴヌクレオチド，ｓｉＲＮＡ・アンドＰＮＡ（RNA targeting with peptide conjugates of oligonucleotides, siRNA and PNA.）」、Blood CeIIs, Molecules, and Diseases 、2007年、第38巻、ｐ．1-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
先行のＰＣＴ出願において記載された化合物の合成／精製／特徴づけ／貯蔵に対して重要な修飾がなされた。２’−ＯＨ基の存在が合成をより困難にし、上記全てが化合物をより不安定にするからである。その脱保護は、追加の工程を必要とする−痕跡量のＲＮアーゼがＲＮＡを分解し−スペルミンのアンモニウム／アミン基は、オリゴリボヌクレオチド−オリゴスペルミンコンジュゲートの加水分解をもたらす酸／塩基触媒である。
【００１５】
従って、本発明は、本質的にカチオン性のsiRNAを提供するために行われる。
【００１６】
本発明はまた、ＧＭＰ生産を目的として工業スケールに拡張され得る、これらのカチオン性siRNAの合成方法のために行われる。
【００１７】
他の態様によると、本発明はまた、薬学及び生物工学の分野における、新規なsiRNAの適用のために行われる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明のカチオン性siRNAは、それらが二本鎖RNAのフラグメントであり、その末端においてグラフトされたオリゴカチオンがあり、グラフトされたカチオン電荷の総数が、RNA鎖のヌクレオシド内のホスファートにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか又はそれより大きいことを特徴とする。
【００１９】
意外にも、また、実施例において与えられる結果により証明されるように、このようなカチオン性siRNAは任意のトランスフェクション剤の非存在下にRNA干渉を誘導し得る。この証明は、培地中の細胞において、大部分がアニオン性のままであるカチオン性siRNA−オリゴペプチドコンジュゲートが効果を示さない制御環境においてなされる（上記参照）。
【００２０】
「二本鎖RNA」なる用語は、リボースの２’位のＨ以外の原子の存在により誘導されるＡファミリーの核酸の二重らせんを意味する（DNAの対語として、これはＢヘリックスである）。
【００２１】
カチオン性siRNAの全体の電荷Σ、すなわち、（化学的にグラフトされたカチオン電荷の合計）−（ヌクレオシド内ホスファート基のアニオン電荷の合計）は−３０〜＋５０である。具体的には、配列番号１のGRKKRRQRRRPPQC（電荷＋９；Σ＝−３１）のTATペプチド、又は配列番号２のRQIKIWFQNRRMKWKKC（電荷＋８；Σ＝−３２）の透過ペプチドにグラフトされたsiRNA（電荷−４０）は、ベクターなしでRNA干渉を誘導することができない（９）。
【００２２】
RNA二重らせんの塩基相補性は全てであるか、又は部分的であり得る。
【００２３】
一実施態様の変形において、各オリゴリボヌクレオチドは二重らせんの３’末端に一本鎖伸長を有する。
【００２４】
他の変形において、オリゴカチオンは、センス鎖の３’及び／又は５’末端で、及び／又はアンチセンス鎖の３’末端でグラフトされており、アンチセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡの分解に関与するタンパク質複合体を導くものである。アンチセンス鎖の５’位におけるグラフト処理は、RNA干渉の効果を無効にする。
【００２５】
好ましくは、本発明の対象であるカチオン性siRNAは、１５〜３０リボヌクレオチド長、特に１９〜３０リボヌクレオチド長の二本鎖RNAフラグメントから形成され、その末端において、１〜３個のオリゴカチオンと共有結合によりグラフトされており、その累積カチオン電荷の数が、RNAにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか、又はそれより大きい。
【００２６】
本発明は、より特定的には、カチオン性siRNAであって、少なくとも１本の鎖が式（Ｉ）
【００２７】
【化１】
【００２８】
［式中、
Ｎｉはｉ塩基長のオリゴリボヌクレオチドを表し、ここで、ｉ＝１５〜３０、特に１９〜３０であり、また、siRNAの二重らせんのＡ型を保存する任意の化学的修飾又は置換がなされ、
Ａｊはｊ塩基長のオリゴカチオンを表し、ここで、ｊ＝１〜５０であり、Ａは、
− 式（II）
【００２９】
【化２】
【００３０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、ＸはＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎ１＝２〜２０である）、又は
− 式（III）
【００３１】
【化３】
【００３２】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１はプトレシン、スペルミジン又はスペルミンから選ばれる）、又は
− 式（IV）
【００３３】
【化４】
【００３４】
（式中、Ｒ７及びＲ８は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表わし、(aa)n2はアルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸のようなカチオン性側鎖を有する、天然のアミノ酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）］
に相当するカチオン性siRNAのために行われる。
【００３５】
本明細書及び特許請求の範囲において、「低級アルキレン基」なる用語は、線状（linear）、分枝鎖又は置換Ｃ１−Ｃ５アルキレン基を意味する。
【００３６】
本発明の好ましい一実施態様において、オリゴカチオンはオリゴアミンである。これらのオリゴアミンは、有利には、スペルミン、スペルミジン又はプトレシンを含む群から選択される。
【００３７】
対応するカチオン性siRNAは、有利には、構造（V）
【００３８】
【化５】
【００３９】
（式中、Ｎ、ｉ及びｊは前記に定義した通りである）
のオリゴヌクレオチド−オリゴスペルミンである。
【００４０】
RNA干渉の適用分野は拡大している。siRNAは、薬学及び生物工学産業により用いられ、遺伝子、疾患及びこれらの疾患に対して潜在的に活性である分子の間の関連性が確立されている；これらは基本的に、動物細胞におけるハイスループットスクリーニング技術である。本発明のカチオン性siRNAは、スクリーニングを簡素化し、中でも、前臨床段階の化合物の検証において生理学、生体分布および排出が考慮に入れられた場合、動物まで技術を拡張し、それ故に、臨床段階において成功の機会が増大させられ、費用のかかる失敗が低減させられる。
【００４１】
しかし、siRNAの最も大きな可能性は、患者の細胞内におけるRNA又はタンパク質の生合成を阻害するための薬物としてのそれらの直接的使用において見いだされる。その結果、癌、ウイルス感染、ぜん息又は自己免疫疾患のような非常に多様な病的状態が治療可能である。
【００４２】
従って、本発明は、これらの適用のためのカチオン性siRNAの使用に及ぶ。
【００４３】
従って、本発明は、薬物として用いられる、前記に定義されたカチオン性siRNAのために行われる。
【００４４】
より詳細には、本発明は、上記に定義された少なくとも１種のsiRNAの有効量を、薬学的に不活性な担体と組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物のために行われる。
【００４５】
本発明はまた、分子生物学、機能的ゲノミクス及びスクリーニング技術における、前記カチオン性siRNAの適用のために行われる。
【００４６】
本発明はまた、カチオン性siRNAの鎖の自動合成であって、３’から５’へのリボヌクレオチドの固相担体への逐次的カップリングと、それに先行するおよび／またはそれに続く、カチオン性シントンの逐次的カップリングを含み、該鎖は、式（VI）：
【００４７】
【化６】
【００４８】
（式中、Ｎ、ｉ、Ａおよびｊは上記定義の通りである）
に対応することを特徴とする自動合成のために行われる。
【００４９】
本発明は、より詳細には、カチオン性siRNAを合成する方法であって、カチオン性シントンは、ホスホラミダイトオリゴアミンであり、
− 式（VII）：
【００５０】
【化７】
【００５１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｎ１は上記定義の通りであり、Ｘは保護された基ＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ又は低級アルキレン基であり、Ｒ１０は低級アルキレン基であるか、又は−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノ基であり、Protは、ＤＭＴ又はＭＭＴのようなオリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基である）、
− 式（VIII）：
【００５２】
【化８】
【００５３】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１は、適切な保護基を有するプトレシン、スペルミジン又はスペルミンであり、Ｒ９及びＲ１０は上記定義の通りである）、または
−式（IX）：
【００５４】
【化９】
【００５５】
（式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２及びProtは上記定義の通りであり、(aa)n2は、保護されたカチオン性側鎖を有する天然のアミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
に対応する方法のために行われる。
【００５６】
本発明の好ましい一実施形態において、オリゴアミンはオリゴスペルミンである。
【００５７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例において与えられる。
【００５８】
オリゴリボヌクレオチド−オリゴスペルミンコンジュゲートの合成及び精製の特徴、並びに対応するsiRNAのRNA干渉特性は、これらの実施例に詳述されているが、本発明は、これらの個々の化合物に限定されない。特に、ルシフェラーゼについてスクリーニングし、かつ、３０個までのスペルミンユニットを含む２１塩基長の合成が記載される。カチオン電荷の数が、対応するsiRNAにより生じるホスファートの数と類似している場合、この遺伝子を構成的に発現する細胞系において、ルシフェラーゼ遺伝子の特に大きい選択的消退が観察される。
【００５９】
実施例において、図１〜６が参照されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】水中のオリゴヌクレオチド＜ＧＬ３ｓｓ＞Ｓ５の分解を示すＨＰＬＣ分析。
【図２】オリゴヌクレオチド＜ＧＬ３ｓｓ＞Ｓｎ（ｎ＝０、１、３、５である）、及び＜ＧＬ３ａｓ＞Ｓｎ（ｎ＝０、１である）のＨＰＬＣプロファイル。
【図３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。
【図４】スペルミン数に応じたルシフェラーゼ遺伝子の消退。
【図５】siRNA濃度に応じたルシフェラーゼ遺伝子の消退。
【図６】特異性の制御。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（実施例１：下記式の、ｎ個のスペルミンを含む２１塩基長のオリゴヌクレオチドの合成、精製及び特徴づけ）
【００６２】
【化１０】
【００６３】
（式中、＜ＧＬ３ｓｓ＞は２１塩基長のオリゴヌクレオチドであり、Ｓはホスホスペルミン残基であり、ｎ＝０、１、３、５、２０、３０である）
自動合成：一連の保護された２１塩基長の配列番号３：3’dTdT-AGCUUCAUGAGUCGCAUUC5’のオリゴヌクレオチド＜ＧＬ３ｓｓ＞−そのリボヌクレオチド部分は、プラスミドGL3（promega）中に存在するフォチナス・ピラリス（photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド１５３〜１７１に対応し、β−シアノエチル（cyanoethyl：ＣＥ）ホスホラミダイドケミストリーを用いて、Expedite合成機上で固相合成された。樹脂は、２個の予めグラフトされたデオキシチミジンを既に含んでいた。合成は、スペルミンホスホラミダイトシントンを用いてｎサイクル継続された。樹脂に結合した、下記構造を有する化合物（ｎ＝０、１、３、５、２０、３０）が得られた。
【００６４】
【化１１】
【００６５】
自動合成に用いられる、ＣＥホスホラミダイト（Ultramild担体）及び一般的な試薬は、Glen Research（Eurogentec）から得られる。スペルミンホスホラミダイトはNovalystから得られる。Ultramild試薬は、核酸塩基上の保護基の脱保護及び固相担体からのオリゴの同時切断を、より穏やかなアルカリ性条件下に可能にする。用いられるモノマー、すなわち、フェノキシアセチル基で保護されたＡ（Pac-A-CE）、４−イソプロピルフェノキシアセチル基で保護されたＧ（(iPr-Pac)-G-CE）、アセチル基で保護されたＣ（Ac-C-CE）は、ワークアップの間の化合物の分解を防止した。ヌクレオチドの２’−ＯＨ位は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（tert-butyldimethylsilyl：ＴＢＤＭＳ）保護基で保護された。
【００６６】
自動合成は、より長い反応時間（２０分）及びより濃いホスホラミダイト溶液（０．１Ｍ、すなわち、無水アセトニトリルの容積（ｍＬ）あたり１２０ｍｇ）を必要とするスペルミンホスホラミダイトのカップリングの場合を除き、標準的カップリング条件下に実施された。２０及び３０個のスペルミンのカップリングの場合、最初の４個のスペルミンの場合に二重カップリング反応が必要であった。
【００６７】
合成の各工程において放出される、着色したジメトキシトリチルカチオンを含む画分を集め、希釈し、分光光度法により分析し、カップリング工程についての収率が決定された。４種の天然のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）のカップリングについて、収率は９７％を超えたが、スペルミンホスホラミダイトのカップリングについての収率は９０〜９８％であった。
【００６８】
同様に、以下を合成した：
− ２０個のスペルミンを含むネガティブコントロール配列である配列番号４−その配列は、GL2プラスミド（Promega）のルシフェラーゼの対応領域に由来する：3’dTdT-AGCUUCAUAAGGCGCAUGC5’。オリゴヌクレオチド＜ＧＬ２ｓｓ＞Ｓ２０は、GL3のホモログ配列と比べて３個のミスマッチを含み、結果として、対応するsiRNAは、細胞により産生されるGL3ルシフェラーゼのメッセンジャーRNAと干渉する能力を有しない；
− アンチセンス配列である配列番号５：3’dTdT-GAAUGCGACUCAUGAAGCU5’。このものは、５’スペルミンを含む。この場合、それはカチオン部分を有するsiRNAの二重らせんの他の鎖＜ＧＬ３ａｓ＞Ｓ１である。
【００６９】
【表１】
【００７０】
全ての場合において、オリゴマーの最終的な５’位にＤＭＴ基を保存して精製を容易にするＤＭＴ−ＯＮ戦略が用いられた。
【００７１】
合成後処理：自動合成の後、オリゴマーは、標準的なUltramild条件下、室温で２８％アンモニア水による終夜の処理によって、固相担体から開放され、同時に脱保護された。
【００７２】
凍結乾燥後、第２工程は、テトラブチルアンモニウムフルオリド（tetrabutylammonium fluoride：ＴＢＡＦ）の１．０ＭのＴＨＦ溶液（Aldrich）を用いて、２’−ＯＨ位のＴＢＤＭＳ基を脱保護することに存する。オリゴヌクレオチドを、暗所中室温で、ＴＢＤＭＳ基あたり５０当量のＴＢＡＦで１５時間にわたって処理した。
【００７３】
精製：オリゴヌクレオチドは、Poly-Pak II（登録商標）カラム（Glen Research/Eurogentec）を用い、供給業者により与えられる使用説明書に従って精製された。最終的な溶出は、アセトニトリル／水の混合液（５０／５０）を用いて行われたが、２０および３０個のスペルミンを含むオリゴヌクレオチドについては除かれ、これは、１／２０に希釈されたアセトニトリル／２８％アンモニア水の使用を必要とした（２０／８０）。オリゴヌクレオチドを含むフラクションは、それらの１滴を蛍光薄層シリカプレート上に置くことによって明らかにされ、直ぐに混合され、凍結乾燥させられ、溶媒が除去され、かつ、分解が回避された。白色粉末がこのようにして得られた。
【００７４】
オリゴリボヌクレオチドの操作は、リボヌクレアーゼの供給源の細心の排除も必要とする。従って、手の上に存在するRNアーゼによる汚染を回避するために手袋を着用することが必須である。全て、層流煙霧カップボード下に、滅菌機器（ピペット、エッペンチューブ）が用いられた。
【００７５】
最初に、RNAサンプルを水に溶解させ、冷凍庫に保存した。これらの条件下に、数ヶ月後であっても修飾されていない鎖は安定なままであるが、ＨＰＬＣ分析は、オリゴリボヌクレオチド−オリゴスペルミンが非常に速く分解されたことを示した（図１、ＨＰＬＣ条件は以下を参照）。
【００７６】
従って、オリゴヌクレオチドをｐＨ５．６のホスファートバッファー（５０ｍＭ）に溶解させ、−２０℃で保存し、３月後でさえ、スペルミンが触媒する加水分解による化合物の分解を回避する（ＨＰＬＣモニタリング）。
【００７７】
オリゴヌクレオチドの濃度は、以下のモル吸光係数（２６０ｎｍ、ｍｏｌ−１ｄｍ３ｃｍ−１）を用いて決定された。
【００７８】
【数１】
【００７９】
それぞれ０、１、３及び５個のスペルミンを含む、全体として負に荷電したオリゴヌクレオチドを、０〜１００％の範囲のＢの直線的な勾配のＢを有する陰イオン交換ＨＰＬＣ（Macherey Nagel SAX 1000-8）により１５分間かけて分析した（Ａ：ＫＨ２ＰＯ４ ２０ｍＭ、ＡｃＣＮ ２０％；Ｂ：Ａ、１Ｍ ＮａＣｌ）。ＨＰＬＣプロファイルを図２に示す。
【００８０】
オリゴヌクレオチドを、蒸留水５００μＬに溶解させた。プレート上で、サンプル及びβ−ヒドロキシピルビン酸マトリクスを一緒に混合した。結晶化した時点で、サンプルをBruker Ultrafex機器で分析した。質量スペクトルを図３に示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
（実施例２：RNA干渉；カチオン性siRNAを用いたルシフェラーゼ遺伝子の消退。カチオン電荷の数の効果）
細胞培養：プラスミドpGL3（Promega）の安定なトランスフェクションにより、ヒト気管支上皮細胞（CCL-185、ATCC）から細胞系A549Lucを得る。
【００８３】
A549Luc細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Perbio）、２ｍＭのグルタマックス（Eurobio）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Eurobio）及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Eurobio）を追加した全RPMI 1640培地（Eurobio）中で培養し、水分飽和雰囲気中、３７℃及び５％ ＣＯ２でインキュベートした。
【００８４】
siRNAのトランスフェクションの１日前に、トリプシン（Eurobio）を用いて細胞を剥離し、RPMI/FCS培地に再懸濁させ、これに１６μＬ／ｍＬの抗生物質G-418（Promega）を加えた。２４ウェルのプレートに、全培地１ｍＬ中、ウェルあたり２５０００細胞を調製した。
【００８５】
二本鎖siRNAの形成及び細胞とのインキュベーション：最初に、二本鎖siRNAが、それらの２つの相補鎖の等モル混合、７０℃に加熱することによるハイブリダイゼーションおよび冷却によって調製された。濃度は、細胞に関して１、１０または１００ｎＭの最終濃度に調節された。最終濃度は、細胞に対し、１、１０又は１００ｎＭに調整した。次いで、形成された二本鎖をRPMI培地１００μＬ中に希釈した。
【００８６】
siRNAの細胞内への浸透のためのポジティブコントロールは、製造業者の推奨に従って用いられる、脂質トランスフェクション剤であるINTERFERin（Polyplus−トランスフェクション）を用いて実施された。INTERFERin（２μＬ）をsiRNAに加えた。混合物をすぐに均質化させ、室温で１０分間にわたって置き、複合体の形成を促進した。
【００８７】
この時間の間、細胞培地を吸引し、付着した細胞をホスファートバッファー（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、５００μＬのRPMIを各ウェルに加えた。
【００８８】
細胞に二本鎖siRNA（又はsiRNA/INTERFERin）を加えた（１００μＬ／ウェル）。手動で回転させることによりプレートを均質化させた。各条件は三重で実施された。
【００８９】
プレートを、３７℃及び５％ＣＯ２で４時間にわたってインキュベートした。この時間の後、細胞を顕微鏡下に観察し、毒性のないことを確認し、２０％ＦＣＳを追加したRPMI ５００μＬを各ウェルに加えた。
【００９０】
プレートをオーブン中３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間にわたってインキュベートした。
【００９１】
ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定：４８時間後、細胞をPBSで洗浄し、次いで、５倍希釈された市販貯蔵液（Promega）を用いて溶解させた。次いで、プレートを、室温で３０分間にわたってインキュベートした。溶液をマイクロチューブ内に回収し、４℃で５分間にわたって１４００ｒｐｍの遠心分離にかけた。
【００９２】
各サンプル１０μＬを９６ウェルのプレート上に沈着させた。ルミノメータ（Mediators PhL又はBerthold Centro LB690）を用いてプレートを分析した。各サンプルについて、ルシフェラーゼタンパク質により触媒される反応により放射される光を測定し、１０秒の期間で企画化した。
【００９３】
全細胞タンパク質のアッセイ：較正の機能を果たすためにＢＳＡ（bovine serum albumin：ウシ血清アルブミン）範囲が事前に調製された。試験管毎に溶解バッファー１５μＬを加えた。分析されるべき各サンプル１５μＬを試験管に入れた。溶解バッファー１５μＬから形成された３個のブランクがそれぞれ調製された。１ｍＬのＢＣＡ（bicinchoninic acid：ビシンコニン酸）混合溶液を各試験管に加えた。次いで、得られた混合物を６０℃の水浴中に３０分間にわたって置いた。５６２ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００９４】
ルシフェラーゼ遺伝子の消退の評価：結果は、まず、１０秒間に取り込まれたＲＬＵ（Relative Light Units：相対的光単位）で表され、細胞溶解物のタンパク質の重量（ミリグラム）あたりに規格化された。各条件における遺伝子の消退の有効性を、siRNA存在下にインキュベートされない細胞中のルシフェラーゼの発現率（％）として表した。各バーは、ルシフェラーゼ遺伝子の発現率（％）の平均値及びその標準偏差を表わす。
【００９５】
図４は、上から下に、連続して以下を示す。
【００９６】
− ルシフェラーゼGL3の配列のセンス(ss)及びアンチセンス(as)鎖から形成されるsiRNA＜ＧＬ３ｓｓ＞＜ＧＬ３ａｓ＞は活性ではない；
− この同じsiRNAは、それがカチオン性脂質INTERFERinによりベクトル化させられる場合、ルシフェラーゼの発現を失わせる；
− 分子内への１〜３個のスペルミンの導入は、ルシフェラーゼの発現にほとんど効果がない；
− siRNAへの２０〜３０個のスペルミンの導入は、INTERFERinベクターを用いて得られる消退に匹敵する消退を誘導する；
− ３０個のスペルミンを有するsiRNAの有効性は、脂質媒体と組み合わせて更に約１０倍に上昇する。
【００９７】
これらの効果が、ナノモル濃度、すなわち、ペプチドTATおよびペネトラチンにより行われる実験（９）において用いられる濃度より１００００倍低い濃度で観察されることは極めて顕著である。
【００９８】
（実施例３：RNA干渉；カチオン性siRNAを用いたルシフェラーゼ遺伝子の消退。濃度の効果）
図５は、上から下に以下を示す。
【００９９】
− INTERFERinによりベクトル化させられたスペルミンを有しないsiRNAのコントロールは１ｎＭで効果を示す；
− 細胞が、グラフトされたスペルミン及びINTERFERinを有しないsiRNAとインキュベートされる場合に、ルシフェラーゼGL3の発現は濃度に関係なく低下しない；
− ２０及び３０個のスペルミンを含むsiRNAの存在下、ルシフェラーゼの濃度依存は減少する。
【０１００】
（実施例４：RNA干渉；カチオン性siRNAを用いたルシフェラーゼ遺伝子の消退。検証実験）
図６は、特許請求の範囲及びRNA干渉の特異性を検証する。
【０１０１】
ネガティブコントロール（細胞単独の１００％発現）及びポジティブコントロール（INTERFERinによりベクトル化させられた配列GL3のsiRNAの存在下におけるルシフェラーゼGL3の２７％の発現）の後に、siRNA＜ＧＬ３ｓｓ＞＜ＧＬＳ３ａｓ＞Ｓ１（この時、アンチセンス鎖の５’位にグラフトされたスペルミンを含む）が試験された。
【０１０２】
バー３〜６により、アンチセンス鎖の５’位へのスペルミンのグラフト処理は、ルシフェラーゼ消退効果を消失させることが示される。具体的には、RNA干渉を示すために、siRNAのこの位置は細胞によってあらかじめリン酸化させられなければならないことが知られている。
【０１０３】
バー７及び８により、１０倍より高い濃度であっても、標的GL3と比べて３個のミスマッチを含む２０個のスペルミンを有するsiRNA GL2は、ルシフェラーゼGL3の発現を減少させないことが示される。
【０１０４】
（書誌参照）
1 - BOLCATO-BELLEMIN, A.L., BONNET, M. E., CREUSAT, G., ERBACHER, P., and BEHR, JP. (2007). Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 16050-16055
2 - KOPATZ, I., REMY, J.S., and BEHR, J. P. (2004). A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin. J Gene Med 6, 769-776
3 - ZIMMERMANN, T.S., LEE, A.C., AKINC, A., BRAMLAGE, B., BUMCROT, D., FEDORUK, M. N., HARBORTH, J., HEYES, J.A., JEFFS, L.B., JOHN, M., JUDGE, A.D., LAM, K., MCCLINTOCK, K., NECHEV, L.V., PALMER, L. R., RACIE, T., ROHL, I., SEIFFERT, S., SHANMUGAM, S., SOOD, V., SOUTSCHEK, J., TOUDJARSKA, I., WHEAT, AJ. , YAWORSKI, E., ZEDALIS, W., KOTELIANSKY, V., MANOHARAN, M., VORNLOCHER, H. P., and MACLACHLAN, I. (2006). RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature 441 , 111 -114
4 - SANTEL, A., ALEKU, M., KEIL, O., ENDRUSCHAT, J., ESCHE, V., FISCH, G., DAMES, S., LOFFLER, K., FECHTNER, M., ARNOLD, W., GIESE, K., KLIPPEL, A., and KAUFMANN, J. (2006). A novel siRNA-lipoplex technology for RNA interference in the mouse vascular endothelium. Gene Ther 13, 1222-1234
5 - KIM, S. H., JEONG, J. H., LEE, S. H., KIM, S.W., and PARK, T.G. (2006). PEG conjugated VEGF siRNA for anti-angiogenic gene therapy. Journal of Controlled Release 116, 123-129
6 - MOSCHOS, S.A., WILLIAMS, A.E., and LINDSAY, M.A. (2007). Cell-penetrating- peptide-mediated siRNA lung delivery. Biochemical Society Transactions 35, 807- 810
7 - TURNER, JJ. , JONES, S., FABANI, M. M., IVANOVA, G., ARZUMANOV, A.A., and GAIT, MJ. (2007). RNA targeting with peptide conjugates of oligonucleotides, siRNA and PNA. Blood CeIIs, Molecules, and Diseases 38, 1-7
8 - demande PCT/IB2006/004085 ; WO2007/069092 ; inventeurs : J. P. Behr, M. Kotera, B. Pons, E. Voirin, et J. S. Remy
9 - MOSCHOS, S.A., JONES, S.W., PERRY, M. M., WILLIAMS, A.E., ERJEFALT, J.S., TURNER, JJ., BARNES, PJ., SPROAT, B.S., GAIT, MJ., and LINDSAY, M.A. (2007). Lung delivery studies using siRNA conjugated to TAT(48-60) and penetratin reveal peptide induced reduction in gene expression and induction of innate immunity. Bioconjug Chem 18, 1450-1459
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン性siRNA（small interfering ribonucleic acid：低分子干渉リボ核酸）、それらの自動合成、及びRNA干渉のメカニズムに関与するそれらの細胞内浸透特性に基づく、それらの生物学的応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉は、内在性又は外来性の遺伝子の発現の配列特異的制御を可能にする細胞内メカニズムである。このメカニズムのメディエータは、約２ターンのビカテナリーリボ核酸の小さいヘリックス（siRNA）であり、標的遺伝子のフラグメントと同一配列である。RNA干渉は、細胞のクロマチンにおける標的遺伝子の永続的な修飾をもたらし得るが、細胞内におけるsiRNAの導入のほとんどの即時的効果は標的メッセンジャーRNAの不活性化である。siRNAは、通常、3’-dTdT伸長を含む相補配列の２つの１９塩基長のオリゴリボヌクレオチドから形成されるが、２７塩基長までのわずかな不完全な対形成又は配列が効果的である場合もある。
【０００３】
タンパク質の消失又はウイルスRNAの選択的破壊は、腫瘍、アレルギー又は感染症のような領域において広範囲に興味のある治療への応用を有するかもしれない。残念なことに、培養液又はインビボにおいて細胞内にsiRNAそれ自体を導入するための無益な試みにより示されるように、無傷の動物細胞は核酸に対して不浸透性である。それにもかかわらず、動物実験は、細胞を急速に再生し得る器官である肝臓、又は特に大きくかつ強健な筋細胞がsiRNAを取り込み、注入工程により誘発されるそれらの細胞膜の破裂を免れることができることを示す。しかし、大量の液体の急速静注又は筋肉内注射の非常に限局的な性質は、ヒトの治療における使用に適合しない。
【０００４】
細胞膜を破裂させることなく、細胞の細胞質にsiRNAをトランスフェクトすることは、過剰のカチオン性トランスポータと混合した後に得られ得る。ポリエチレンイミンのようなポリカチオン性高分子又はカチオン性脂質凝集体は、このベクターの役割を果たし得る（非特許文献１）。具体的には、ポリアニオン性siRNA分子は、過剰のトランスポータにより凝集し、微細なカチオン性沈殿物を形成する。これらの粒子は、細胞表面に存在するアニオン性ヘパランスルファートによって、培養下の多くの細胞内へのsiRNAの効率的なトランスフェクションを可能にする（非特許文献２）。
【０００５】
動物において、同じことはもはや当てはまらない。血中に注射される場合、粒子は吸収され、微生物粒子を貪食する細胞により消化される。組織又は腫瘍に注射される場合、それらのサイズ（１００〜１０００ｎｍ）は、注射部位を超えて位置する細胞に向かう、それらの拡散を防止する。それにもかかわらず、最近の研究（非特許文献３〜４）は、粒子をポリエチレングリコール残基で粒子を覆うことにより（ステルス粒子）、細胞結合を全体的に阻害することなく、血液の食細胞を回避することが可能であることを示す。
【０００６】
これらの考察により、発明者らは、本質的にカチオン性のsiRNA、すなわち、カチオン電荷が、核酸のホスファートにより生じるアニオン電荷を相殺する、修飾siRNA分子の合成を想像するに至った。これらの化合物は、おそらく細胞に入るためのベクターなしで済ますことができ、その結果として薬物は粒子でなく分子であるという利点を有するだろう。
【０００７】
メッセンジャーRNAを破壊するタンパク質複合体へのsiRNAの結合又はハイブリダイゼーションによる後者の認識のいずれかを乱さないように、化学修飾は、核酸の末端においてのみ可能である。
【０００８】
過去において、オリゴヌクレオチドの末端に、アンチセンスアプローチによる治療目的のためにそれらの細胞透過を増大させることを目的として、非常に多数の化学ユニットがグラフトされていた。ごく最近発表された多くの論文は、siRNAの分野において類似の試みを報告している。
【０００９】
２００６年に発表された最初の論文は、ジスルフィド架橋を介したポリエチレングリコールのsiRNAへのコンジュゲーションについて言及しているが、細胞のインターナリゼーションは、それにもかかわらずカチオン性ポリマーを混合することによる非共有結合性会合（association）を必要とする（非特許文献５）。
【００１０】
２００７年において、２つの論文により、７又は８個のカチオン電荷を含む種々のカチオン性ペプチドにコンジュゲートされたsiRNA（４０個のアニオン電荷）の使用が記載された。これらのsiRNAは、著者自身も認めているようにアニオン性が大きいままであり、細胞内浸透及び効果は増大しない（非特許文献６及び７）。
【００１１】
前記論文に記載されたように、前もって製造されたポリカチオンのオリゴヌクレオチドへの直接的化学グラフト処理が可能であるが、沈殿の問題を引き起こし、オリゴヌクレオチドの電荷に匹敵する多くの電荷を含むポリカチオンを操作する問題になる場合に、カチオン性ポリマーの多分散の評価における特徴づけを不明確にし得る。発明者らは、オリゴヌクレオチド配列自体の合成に用いられるものと同一のコンジュゲーションケミストリーを介したオリゴカチオンの逐次的合成の技術を頼りにすることにより上記問題を克服した。オリゴデオキシリボヌクレオチド−オリゴスペルミンコンジュゲートの自動合成は、先行のＰＣＴ国際特許出願（特許文献１）の対象であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０７／０６９０９２号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ボルカト−ベレミン・エイ・エル（BOLCATO-BELLEMIN, A.L）、ボネット・エム・イー（BONNET, M. E.）、クロウサト・ジー（CREUSAT, G.）、エルバヒア・ピー（ERBACHER, P.）およびベヘル・ジェイ・ピー（BEHR, JP）著、「スティッキー・オーバーハングス・エンハンス・ｓｉＲＮＡ−メディエイテッド・ジーン・サイレンシング（Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing.）」、Proc Natl Acad Sci U S A、2007年、第104巻、ｐ．16050-16055
【非特許文献２】コパツ・アイ（KOPATZ, I.）、レミー・ジェイ・エス（REMY, J.S.）およびベヒア・ジェイ・ピー（BEHR, J. P.）著、「ア・モデル・フォー・ノン・ヴイラル・ジーン・デリバリー・スルー・シンデカン・アドヘション・モレキュールス・アンド・パワード・バイ・アクション（A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin）」、 J Gene Med、2004年、第6巻、ｐ．769-776
【非特許文献３】ジンメルマン・ティー・エス（ZIMMERMANN, T.S.）、リー・エイ・シー（LEE, A.C.）、アキンク・エイ（AKINC, A.）、ブラムラゲ・ビー（BRAMLAGE, B.）、（バンクロト・ティー・ディー（BUMCROT, D.）、フェドラック・エム・エヌ（FEDORUK, M. N.）、ハルボルス・ジェイ（HARBORTH, J.）、ヘイス・ジェイ・エイ（HEYES, J.A.）、ジェフェス・エル・ビー（JEFFS, L.B.）、ジョン・エム（JOHN, M.）、ジャッジ・エイ・ディー（JUDGE, A.D.）、ラム・ケイ（LAM, K.）、マックリントック・ケイ（MCCLINTOCK, K.）、ネチェフ・エル・ブイ（NECHEV, L.V.）、パルマー・エル・アール（PALMER, L. R.）、ラシー・ティー（RACIE, T.）、ロール・アイ（ROHL, I.）、セイフェルト・エス（SEIFFERT, S.）、シャンムガン・エス（SHANMUGAM, S.）、ソド・ブイ（SOOD, V.）、ソウチェク・ジェイ（SOUTSCHEK, J.）、トウドジャルスカ・アイ（TOUDJARSKA, I.）、フェート・エイ・ジェイ（WHEAT, AJ.）、ヤウォルスキ・イー（YAWORSKI, E.）、ゼダリス・ダブリュー（ZEDALIS, W.）、コテリアンスキ・ブイ（KOTELIANSKY, V.）、マンノハラン・エム（MANOHARAN, M.）、ボルンロシア・エイチ・ピー（VORNLOCHER, H. P.）およびマクラキアン・アイ（MACLACHLAN, I.）著、「ＲＮＡｉ−メディエイテッド・ジーン・サイレンシング・ノン−ヒューマン・プライメイツ（RNAi-mediated gene silencing in non-human primates.）」、 Nature、2006年、第441号 、ｐ．111 -114
【非特許文献４】サンテル・エイ（SANTEL, A.）、アレク・エム（ALEKU, M.）ケイル・オー（KEIL, O.）、エンドルシャット・ジェイ（ENDRUSCHAT, J.）、エシェ・ブイ（ESCHE, V.）、フィッシュ・ジー（FISCH, G.）、ダメス・エス（DAMES, S.）、ロフェラー・ケイ（LOFFLER, K.）、フェチトナー・エム（FECHTNER, M.）、アーノルド・ダブリュー（ARNOLD, W.）、ギエス・ケイ（GIESE, K.）、クリッペル・エイ（KLIPPEL, A.）およびカウフマン・ジェイ（KAUFMANN, J.）著、「ア・ノベル・ｓｉＲＮＡ−リポプレックス・テクノロジー・フォー・ＲＮＡ・インターフェアランス・イン・ザ・マウス・バスキュラー・エンドセリウム（A novel siRNA-lipoplex technology for RNA interference in the mouse vascular endothelium.）」、Gene Ther、2006年、第13巻、ｐ．1222-1234
【非特許文献５】キム・エス・エイチ（KIM, S. H.）、ヨン・ジェイ・エイチ（JEONG, J. H.）、イ・エス・エイチ（LEE, S. H.）、キム・エス・ダブリュー（KIM, S.W.）およびパク・ティー・ジー（PARK, T.G.）著、「ＰＥＧコンジュゲーテッド・ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡフォー・アンチ−アンジオゲニック・ジーン・セラピー（PEG conjugated VEGF siRNA for anti-angiogenic gene therapy.）」、Journal of Controlled Release、2006年、第116巻、ｐ．123-129
【非特許文献６】モショス・エス・エイ（MOSCHOS, S.A.）、ウィリアムス・エイ・イー（WILLIAMS, A.E.）およびリンドセイ・エム・エイ（LINDSAY, M.A.）著、「セル−ペネトレーティング−ペプチド−メディエイテッドsiRNAラング・デリバリー（Cell-penetrating- peptide-mediated siRNA lung delivery.）」、Biochemical Society Transactions、2007年、第35巻、ｐ．807- 810
【非特許文献７】ターナー・ジェイ・ジェイ（TURNER, JJ.）、ジョーンズ・エス（JONES, S.）、ファバニ・エム・エム（FABANI, M. M.）、イバノバ・ジー（IVANOVA, G.）、アルズマノフ・エイ・エイ（ARZUMANOV, A.A.）およびガイト・エム・ジェイ（GAIT, MJ.）著、「ＲＮＡターゲッティングウィズ・ペプチド・コンジュゲーツ・オフ・オリゴヌクレオチド，ｓｉＲＮＡ・アンドＰＮＡ（RNA targeting with peptide conjugates of oligonucleotides, siRNA and PNA.）」、Blood CeIIs, Molecules, and Diseases 、2007年、第38巻、ｐ．1-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
先行のＰＣＴ出願において記載された化合物の合成／精製／特徴づけ／貯蔵に対して重要な修飾がなされた。２’−ＯＨ基の存在が合成をより困難にし、上記全てが化合物をより不安定にするからである。その脱保護は、追加の工程を必要とする−痕跡量のＲＮアーゼがＲＮＡを分解し−スペルミンのアンモニウム／アミン基は、オリゴリボヌクレオチド−オリゴスペルミンコンジュゲートの加水分解をもたらす酸／塩基触媒である。
【００１５】
従って、本発明は、本質的にカチオン性のsiRNAを提供するために行われる。
【００１６】
本発明はまた、ＧＭＰ生産を目的として工業スケールに拡張され得る、これらのカチオン性siRNAの合成方法のために行われる。
【００１７】
他の態様によると、本発明はまた、薬学及び生物工学の分野における、新規なsiRNAの適用のために行われる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明のカチオン性siRNAは、それらが二本鎖RNAのフラグメントであり、その末端においてグラフトされたオリゴカチオンがあり、グラフトされたカチオン電荷の総数が、RNA鎖のヌクレオシド内のホスファートにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか又はそれより大きいことを特徴とする。
【００１９】
意外にも、また、実施例において与えられる結果により証明されるように、このようなカチオン性siRNAは任意のトランスフェクション剤の非存在下にRNA干渉を誘導し得る。この証明は、培地中の細胞において、大部分がアニオン性のままであるカチオン性siRNA−オリゴペプチドコンジュゲートが効果を示さない制御環境においてなされる（上記参照）。
【００２０】
「二本鎖RNA」なる用語は、リボースの２’位のＨ以外の原子の存在により誘導されるＡファミリーの核酸の二重らせんを意味する（DNAの対語として、これはＢヘリックスである）。
【００２１】
カチオン性siRNAの全体の電荷Σ、すなわち、（化学的にグラフトされたカチオン電荷の合計）−（ヌクレオシド内ホスファート基のアニオン電荷の合計）は−３０〜＋５０である。具体的には、配列番号１のGRKKRRQRRRPPQC（電荷＋９；Σ＝−３１）のTATペプチド、又は配列番号２のRQIKIWFQNRRMKWKKC（電荷＋８；Σ＝−３２）の透過ペプチドにグラフトされたsiRNA（電荷−４０）は、ベクターなしでRNA干渉を誘導することができない（９）。
【００２２】
RNA二重らせんの塩基相補性は全てであるか、又は部分的であり得る。
【００２３】
一実施態様の変形において、各オリゴリボヌクレオチドは二重らせんの３’末端に一本鎖伸長を有する。
【００２４】
他の変形において、オリゴカチオンは、センス鎖の３’及び／又は５’末端で、及び／又はアンチセンス鎖の３’末端でグラフトされており、アンチセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡの分解に関与するタンパク質複合体を導くものである。アンチセンス鎖の５’位におけるグラフト処理は、RNA干渉の効果を無効にする。
【００２５】
好ましくは、本発明の対象であるカチオン性siRNAは、１５〜３０リボヌクレオチド長、特に１９〜３０リボヌクレオチド長の二本鎖RNAフラグメントから形成され、その末端において、１〜３個のオリゴカチオンと共有結合によりグラフトされており、その累積カチオン電荷の数が、RNAにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか、又はそれより大きい。
【００２６】
本発明は、より特定的には、カチオン性siRNAであって、少なくとも１本の鎖が式（Ｉ）
【００２７】
【化１】
【００２８】
［式中、
Ｎｉはｉ塩基長のオリゴリボヌクレオチドを表し、ここで、ｉ＝１５〜３０、特に１９〜３０であり、また、siRNAの二重らせんのＡ型を保存する任意の化学的修飾又は置換がなされ、
Ａｊはｊ塩基長のオリゴカチオンを表し、ここで、ｊ＝１〜５０であり、Ａは、
− 式（II）
【００２９】
【化２】
【００３０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、ＸはＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎ１＝２〜２０である）、又は
− 式（III）
【００３１】
【化３】
【００３２】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１はプトレシン、スペルミジン又はスペルミンから選ばれる）、又は
− 式（IV）
【００３３】
【化４】
【００３４】
（式中、Ｒ７及びＲ８は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表わし、(aa)n2はアルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸のようなカチオン性側鎖を有する、天然のアミノ酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）］
に相当するカチオン性siRNAのために行われる。
【００３５】
本明細書及び特許請求の範囲において、「低級アルキレン基」なる用語は、線状（linear）、分枝鎖又は置換Ｃ１−Ｃ５アルキレン基を意味する。
【００３６】
本発明の好ましい一実施態様において、オリゴカチオンはオリゴアミンである。これらのオリゴアミンは、有利には、スペルミン、スペルミジン又はプトレシンを含む群から選択される。
【００３７】
対応するカチオン性siRNAは、有利には、構造（V）
【００３８】
【化５】
【００３９】
（式中、Ｎ、ｉ及びｊは前記に定義した通りである）
のオリゴヌクレオチド−オリゴスペルミンである。
【００４０】
RNA干渉の適用分野は拡大している。siRNAは、薬学及び生物工学産業により用いられ、遺伝子、疾患及びこれらの疾患に対して潜在的に活性である分子の間の関連性が確立されている；これらは基本的に、動物細胞におけるハイスループットスクリーニング技術である。本発明のカチオン性siRNAは、スクリーニングを簡素化し、中でも、前臨床段階の化合物の検証において生理学、生体分布および排出が考慮に入れられた場合、動物まで技術を拡張し、それ故に、臨床段階において成功の機会が増大させられ、費用のかかる失敗が低減させられる。
【００４１】
しかし、siRNAの最も大きな可能性は、患者の細胞内におけるRNA又はタンパク質の生合成を阻害するための薬物としてのそれらの直接的使用において見いだされる。その結果、癌、ウイルス感染、ぜん息又は自己免疫疾患のような非常に多様な病的状態が治療可能である。
【００４２】
従って、本発明は、これらの適用のためのカチオン性siRNAの使用に及ぶ。
【００４３】
従って、本発明は、薬物として用いられる、前記に定義されたカチオン性siRNAのために行われる。
【００４４】
より詳細には、本発明は、上記に定義された少なくとも１種のsiRNAの有効量を、薬学的に不活性な担体と組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物のために行われる。
【００４５】
本発明はまた、分子生物学、機能的ゲノミクス及びスクリーニング技術における、前記カチオン性siRNAの適用のために行われる。
【００４６】
本発明はまた、カチオン性siRNAの鎖の自動合成であって、３’から５’へのリボヌクレオチドの固相担体への逐次的カップリングと、それに先行するおよび／またはそれに続く、カチオン性シントンの逐次的カップリングを含み、該鎖は、式（VI）：
【００４７】
【化６】
【００４８】
（式中、Ｎ、ｉ、Ａおよびｊは上記定義の通りである）
に対応することを特徴とする自動合成のために行われる。
【００４９】
本発明は、より詳細には、カチオン性siRNAを合成する方法であって、カチオン性シントンは、ホスホラミダイトオリゴアミンであり、
− 式（VII）：
【００５０】
【化７】
【００５１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｎ１は上記定義の通りであり、Ｘは保護された基ＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ又は低級アルキレン基であり、Ｒ１０は低級アルキレン基であるか、又は−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノ基であり、Protは、ＤＭＴ又はＭＭＴのようなオリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基である）、
− 式（VIII）：
【００５２】
【化８】
【００５３】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１は、適切な保護基を有するプトレシン、スペルミジン又はスペルミンであり、Ｒ９及びＲ１０は上記定義の通りである）、または
−式（IX）：
【００５４】
【化９】
【００５５】
（式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２及びProtは上記定義の通りであり、(aa)n2は、保護されたカチオン性側鎖を有する天然のアミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
に対応する方法のために行われる。
【００５６】
本発明の好ましい一実施形態において、オリゴアミンはオリゴスペルミンである。
【００５７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例において与えられる。
【００５８】
オリゴリボヌクレオチド−オリゴスペルミンコンジュゲートの合成及び精製の特徴、並びに対応するsiRNAのRNA干渉特性は、これらの実施例に詳述されているが、本発明は、これらの個々の化合物に限定されない。特に、ルシフェラーゼについてスクリーニングし、かつ、３０個までのスペルミンユニットを含む２１塩基長の合成が記載される。カチオン電荷の数が、対応するsiRNAにより生じるホスファートの数と類似している場合、この遺伝子を構成的に発現する細胞系において、ルシフェラーゼ遺伝子の特に大きい選択的消退が観察される。
【００５９】
実施例において、図１〜６が参照されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】水中のオリゴヌクレオチド＜ＧＬ３ｓｓ＞Ｓ５の分解を示すＨＰＬＣ分析。
【図２】オリゴヌクレオチド＜ＧＬ３ｓｓ＞Ｓｎ（ｎ＝０、１、３、５である）、及び＜ＧＬ３ａｓ＞Ｓｎ（ｎ＝０、１である）のＨＰＬＣプロファイル。
【図３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。
【図４】スペルミン数に応じたルシフェラーゼ遺伝子の消退。
【図５】siRNA濃度に応じたルシフェラーゼ遺伝子の消退。
【図６】特異性の制御。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（実施例１：下記式の、ｎ個のスペルミンを含む２１塩基長のオリゴヌクレオチドの合成、精製及び特徴づけ）
【００６２】
【化１０】
【００６３】
（式中、＜ＧＬ３ｓｓ＞は２１塩基長のオリゴヌクレオチドであり、Ｓはホスホスペルミン残基であり、ｎ＝０、１、３、５、２０、３０である）
自動合成：一連の保護された２１塩基長の配列番号３：3’dTdT-AGCUUCAUGAGUCGCAUUC5’のオリゴヌクレオチド＜ＧＬ３ｓｓ＞−そのリボヌクレオチド部分は、プラスミドGL3（promega）中に存在するフォチナス・ピラリス（photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド１５３〜１７１に対応し、β−シアノエチル（cyanoethyl：ＣＥ）ホスホラミダイドケミストリーを用いて、Expedite合成機上で固相合成された。樹脂は、２個の予めグラフトされたデオキシチミジンを既に含んでいた。合成は、スペルミンホスホラミダイトシントンを用いてｎサイクル継続された。樹脂に結合した、下記構造を有する化合物（ｎ＝０、１、３、５、２０、３０）が得られた。
【００６４】
【化１１】
【００６５】
自動合成に用いられる、ＣＥホスホラミダイト（Ultramild担体）及び一般的な試薬は、Glen Research（Eurogentec）から得られる。スペルミンホスホラミダイトはNovalystから得られる。Ultramild試薬は、核酸塩基上の保護基の脱保護及び固相担体からのオリゴの同時切断を、より穏やかなアルカリ性条件下に可能にする。用いられるモノマー、すなわち、フェノキシアセチル基で保護されたＡ（Pac-A-CE）、４−イソプロピルフェノキシアセチル基で保護されたＧ（(iPr-Pac)-G-CE）、アセチル基で保護されたＣ（Ac-C-CE）は、ワークアップの間の化合物の分解を防止した。ヌクレオチドの２’−ＯＨ位は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（tert-butyldimethylsilyl：ＴＢＤＭＳ）保護基で保護された。
【００６６】
自動合成は、より長い反応時間（２０分）及びより濃いホスホラミダイト溶液（０．１Ｍ、すなわち、無水アセトニトリルの容積（ｍＬ）あたり１２０ｍｇ）を必要とするスペルミンホスホラミダイトのカップリングの場合を除き、標準的カップリング条件下に実施された。２０及び３０個のスペルミンのカップリングの場合、最初の４個のスペルミンの場合に二重カップリング反応が必要であった。
【００６７】
合成の各工程において放出される、着色したジメトキシトリチルカチオンを含む画分を集め、希釈し、分光光度法により分析し、カップリング工程についての収率が決定された。４種の天然のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）のカップリングについて、収率は９７％を超えたが、スペルミンホスホラミダイトのカップリングについての収率は９０〜９８％であった。
【００６８】
同様に、以下を合成した：
− ２０個のスペルミンを含むネガティブコントロール配列である配列番号４−その配列は、GL2プラスミド（Promega）のルシフェラーゼの対応領域に由来する：3’dTdT-AGCUUCAUAAGGCGCAUGC5’。オリゴヌクレオチド＜ＧＬ２ｓｓ＞Ｓ２０は、GL3のホモログ配列と比べて３個のミスマッチを含み、結果として、対応するsiRNAは、細胞により産生されるGL3ルシフェラーゼのメッセンジャーRNAと干渉する能力を有しない；
− アンチセンス配列である配列番号５：3’dTdT-GAAUGCGACUCAUGAAGCU5’。このものは、５’スペルミンを含む。この場合、それはカチオン部分を有するsiRNAの二重らせんの他の鎖＜ＧＬ３ａｓ＞Ｓ１である。
【００６９】
【表１】
【００７０】
全ての場合において、オリゴマーの最終的な５’位にＤＭＴ基を保存して精製を容易にするＤＭＴ−ＯＮ戦略が用いられた。
【００７１】
合成後処理：自動合成の後、オリゴマーは、標準的なUltramild条件下、室温で２８％アンモニア水による終夜の処理によって、固相担体から開放され、同時に脱保護された。
【００７２】
凍結乾燥後、第２工程は、テトラブチルアンモニウムフルオリド（tetrabutylammonium fluoride：ＴＢＡＦ）の１．０ＭのＴＨＦ溶液（Aldrich）を用いて、２’−ＯＨ位のＴＢＤＭＳ基を脱保護することに存する。オリゴヌクレオチドを、暗所中室温で、ＴＢＤＭＳ基あたり５０当量のＴＢＡＦで１５時間にわたって処理した。
【００７３】
精製：オリゴヌクレオチドは、Poly-Pak II（登録商標）カラム（Glen Research/Eurogentec）を用い、供給業者により与えられる使用説明書に従って精製された。最終的な溶出は、アセトニトリル／水の混合液（５０／５０）を用いて行われたが、２０および３０個のスペルミンを含むオリゴヌクレオチドについては除かれ、これは、１／２０に希釈されたアセトニトリル／２８％アンモニア水の使用を必要とした（２０／８０）。オリゴヌクレオチドを含むフラクションは、それらの１滴を蛍光薄層シリカプレート上に置くことによって明らかにされ、直ぐに混合され、凍結乾燥させられ、溶媒が除去され、かつ、分解が回避された。白色粉末がこのようにして得られた。
【００７４】
オリゴリボヌクレオチドの操作は、リボヌクレアーゼの供給源の細心の排除も必要とする。従って、手の上に存在するRNアーゼによる汚染を回避するために手袋を着用することが必須である。全て、層流煙霧カップボード下に、滅菌機器（ピペット、エッペンチューブ）が用いられた。
【００７５】
最初に、RNAサンプルを水に溶解させ、冷凍庫に保存した。これらの条件下に、数ヶ月後であっても修飾されていない鎖は安定なままであるが、ＨＰＬＣ分析は、オリゴリボヌクレオチド−オリゴスペルミンが非常に速く分解されたことを示した（図１、ＨＰＬＣ条件は以下を参照）。
【００７６】
従って、オリゴヌクレオチドをｐＨ５．６のホスファートバッファー（５０ｍＭ）に溶解させ、−２０℃で保存し、３月後でさえ、スペルミンが触媒する加水分解による化合物の分解を回避する（ＨＰＬＣモニタリング）。
【００７７】
オリゴヌクレオチドの濃度は、以下のモル吸光係数（２６０ｎｍ、ｍｏｌ−１ｄｍ３ｃｍ−１）を用いて決定された。
【００７８】
【数１】
【００７９】
それぞれ０、１、３及び５個のスペルミンを含む、全体として負に荷電したオリゴヌクレオチドを、０〜１００％の範囲のＢの直線的な勾配のＢを有する陰イオン交換ＨＰＬＣ（Macherey Nagel SAX 1000-8）により１５分間かけて分析した（Ａ：ＫＨ２ＰＯ４ ２０ｍＭ、ＡｃＣＮ ２０％；Ｂ：Ａ、１Ｍ ＮａＣｌ）。ＨＰＬＣプロファイルを図２に示す。
【００８０】
オリゴヌクレオチドを、蒸留水５００μＬに溶解させた。プレート上で、サンプル及びβ−ヒドロキシピルビン酸マトリクスを一緒に混合した。結晶化した時点で、サンプルをBruker Ultrafex機器で分析した。質量スペクトルを図３に示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
（実施例２：RNA干渉；カチオン性siRNAを用いたルシフェラーゼ遺伝子の消退。カチオン電荷の数の効果）
細胞培養：プラスミドpGL3（Promega）の安定なトランスフェクションにより、ヒト気管支上皮細胞（CCL-185、ATCC）から細胞系A549Lucを得る。
【００８３】
A549Luc細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Perbio）、２ｍＭのグルタマックス（Eurobio）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Eurobio）及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Eurobio）を追加した全RPMI 1640培地（Eurobio）中で培養し、水分飽和雰囲気中、３７℃及び５％ ＣＯ２でインキュベートした。
【００８４】
siRNAのトランスフェクションの１日前に、トリプシン（Eurobio）を用いて細胞を剥離し、RPMI/FCS培地に再懸濁させ、これに１６μＬ／ｍＬの抗生物質G-418（Promega）を加えた。２４ウェルのプレートに、全培地１ｍＬ中、ウェルあたり２５０００細胞を調製した。
【００８５】
二本鎖siRNAの形成及び細胞とのインキュベーション：最初に、二本鎖siRNAが、それらの２つの相補鎖の等モル混合、７０℃に加熱することによるハイブリダイゼーションおよび冷却によって調製された。濃度は、細胞に関して１、１０または１００ｎＭの最終濃度に調節された。最終濃度は、細胞に対し、１、１０又は１００ｎＭに調整した。次いで、形成された二本鎖をRPMI培地１００μＬ中に希釈した。
【００８６】
siRNAの細胞内への浸透のためのポジティブコントロールは、製造業者の推奨に従って用いられる、脂質トランスフェクション剤であるINTERFERin（Polyplus−トランスフェクション）を用いて実施された。INTERFERin（２μＬ）をsiRNAに加えた。混合物をすぐに均質化させ、室温で１０分間にわたって置き、複合体の形成を促進した。
【００８７】
この時間の間、細胞培地を吸引し、付着した細胞をホスファートバッファー（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、５００μＬのRPMIを各ウェルに加えた。
【００８８】
細胞に二本鎖siRNA（又はsiRNA/INTERFERin）を加えた（１００μＬ／ウェル）。手動で回転させることによりプレートを均質化させた。各条件は三重で実施された。
【００８９】
プレートを、３７℃及び５％ＣＯ２で４時間にわたってインキュベートした。この時間の後、細胞を顕微鏡下に観察し、毒性のないことを確認し、２０％ＦＣＳを追加したRPMI ５００μＬを各ウェルに加えた。
【００９０】
プレートをオーブン中３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間にわたってインキュベートした。
【００９１】
ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定：４８時間後、細胞をPBSで洗浄し、次いで、５倍希釈された市販貯蔵液（Promega）を用いて溶解させた。次いで、プレートを、室温で３０分間にわたってインキュベートした。溶液をマイクロチューブ内に回収し、４℃で５分間にわたって１４００ｒｐｍの遠心分離にかけた。
【００９２】
各サンプル１０μＬを９６ウェルのプレート上に沈着させた。ルミノメータ（Mediators PhL又はBerthold Centro LB690）を用いてプレートを分析した。各サンプルについて、ルシフェラーゼタンパク質により触媒される反応により放射される光を測定し、１０秒の期間で企画化した。
【００９３】
全細胞タンパク質のアッセイ：較正の機能を果たすためにＢＳＡ（bovine serum albumin：ウシ血清アルブミン）範囲が事前に調製された。試験管毎に溶解バッファー１５μＬを加えた。分析されるべき各サンプル１５μＬを試験管に入れた。溶解バッファー１５μＬから形成された３個のブランクがそれぞれ調製された。１ｍＬのＢＣＡ（bicinchoninic acid：ビシンコニン酸）混合溶液を各試験管に加えた。次いで、得られた混合物を６０℃の水浴中に３０分間にわたって置いた。５６２ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００９４】
ルシフェラーゼ遺伝子の消退の評価：結果は、まず、１０秒間に取り込まれたＲＬＵ（Relative Light Units：相対的光単位）で表され、細胞溶解物のタンパク質の重量（ミリグラム）あたりに規格化された。各条件における遺伝子の消退の有効性を、siRNA存在下にインキュベートされない細胞中のルシフェラーゼの発現率（％）として表した。各バーは、ルシフェラーゼ遺伝子の発現率（％）の平均値及びその標準偏差を表わす。
【００９５】
図４は、上から下に、連続して以下を示す。
【００９６】
− ルシフェラーゼGL3の配列のセンス(ss)及びアンチセンス(as)鎖から形成されるsiRNA＜ＧＬ３ｓｓ＞＜ＧＬ３ａｓ＞は活性ではない；
− この同じsiRNAは、それがカチオン性脂質INTERFERinによりベクトル化させられる場合、ルシフェラーゼの発現を失わせる；
− 分子内への１〜３個のスペルミンの導入は、ルシフェラーゼの発現にほとんど効果がない；
− siRNAへの２０〜３０個のスペルミンの導入は、INTERFERinベクターを用いて得られる消退に匹敵する消退を誘導する；
− ３０個のスペルミンを有するsiRNAの有効性は、脂質媒体と組み合わせて更に約１０倍に上昇する。
【００９７】
これらの効果が、ナノモル濃度、すなわち、ペプチドTATおよびペネトラチンにより行われる実験（９）において用いられる濃度より１００００倍低い濃度で観察されることは極めて顕著である。
【００９８】
（実施例３：RNA干渉；カチオン性siRNAを用いたルシフェラーゼ遺伝子の消退。濃度の効果）
図５は、上から下に以下を示す。
【００９９】
− INTERFERinによりベクトル化させられたスペルミンを有しないsiRNAのコントロールは１ｎＭで効果を示す；
− 細胞が、グラフトされたスペルミン及びINTERFERinを有しないsiRNAとインキュベートされる場合に、ルシフェラーゼGL3の発現は濃度に関係なく低下しない；
− ２０及び３０個のスペルミンを含むsiRNAの存在下、ルシフェラーゼの濃度依存は減少する。
【０１００】
（実施例４：RNA干渉；カチオン性siRNAを用いたルシフェラーゼ遺伝子の消退。検証実験）
図６は、特許請求の範囲及びRNA干渉の特異性を検証する。
【０１０１】
ネガティブコントロール（細胞単独の１００％発現）及びポジティブコントロール（INTERFERinによりベクトル化させられた配列GL3のsiRNAの存在下におけるルシフェラーゼGL3の２７％の発現）の後に、siRNA＜ＧＬ３ｓｓ＞＜ＧＬＳ３ａｓ＞Ｓ１（この時、アンチセンス鎖の５’位にグラフトされたスペルミンを含む）が試験された。
【０１０２】
バー３〜６により、アンチセンス鎖の５’位へのスペルミンのグラフト処理は、ルシフェラーゼ消退効果を消失させることが示される。具体的には、RNA干渉を示すために、siRNAのこの位置は細胞によってあらかじめリン酸化させられなければならないことが知られている。
【０１０３】
バー７及び８により、１０倍より高い濃度であっても、標的GL3と比べて３個のミスマッチを含む２０個のスペルミンを有するsiRNA GL2は、ルシフェラーゼGL3の発現を減少させないことが示される。
【０１０４】
（書誌参照）
1 - BOLCATO-BELLEMIN, A.L., BONNET, M. E., CREUSAT, G., ERBACHER, P., and BEHR, JP. (2007). Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 16050-16055
2 - KOPATZ, I., REMY, J.S., and BEHR, J. P. (2004). A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin. J Gene Med 6, 769-776
3 - ZIMMERMANN, T.S., LEE, A.C., AKINC, A., BRAMLAGE, B., BUMCROT, D., FEDORUK, M. N., HARBORTH, J., HEYES, J.A., JEFFS, L.B., JOHN, M., JUDGE, A.D., LAM, K., MCCLINTOCK, K., NECHEV, L.V., PALMER, L. R., RACIE, T., ROHL, I., SEIFFERT, S., SHANMUGAM, S., SOOD, V., SOUTSCHEK, J., TOUDJARSKA, I., WHEAT, AJ. , YAWORSKI, E., ZEDALIS, W., KOTELIANSKY, V., MANOHARAN, M., VORNLOCHER, H. P., and MACLACHLAN, I. (2006). RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature 441 , 111 -114
4 - SANTEL, A., ALEKU, M., KEIL, O., ENDRUSCHAT, J., ESCHE, V., FISCH, G., DAMES, S., LOFFLER, K., FECHTNER, M., ARNOLD, W., GIESE, K., KLIPPEL, A., and KAUFMANN, J. (2006). A novel siRNA-lipoplex technology for RNA interference in the mouse vascular endothelium. Gene Ther 13, 1222-1234
5 - KIM, S. H., JEONG, J. H., LEE, S. H., KIM, S.W., and PARK, T.G. (2006). PEG conjugated VEGF siRNA for anti-angiogenic gene therapy. Journal of Controlled Release 116, 123-129
6 - MOSCHOS, S.A., WILLIAMS, A.E., and LINDSAY, M.A. (2007). Cell-penetrating- peptide-mediated siRNA lung delivery. Biochemical Society Transactions 35, 807- 810
7 - TURNER, JJ. , JONES, S., FABANI, M. M., IVANOVA, G., ARZUMANOV, A.A., and GAIT, MJ. (2007). RNA targeting with peptide conjugates of oligonucleotides, siRNA and PNA. Blood CeIIs, Molecules, and Diseases 38, 1-7
8 - demande PCT/IB2006/004085 ; WO2007/069092 ; inventeurs : J. P. Behr, M. Kotera, B. Pons, E. Voirin, et J. S. Remy
9 - MOSCHOS, S.A., JONES, S.W., PERRY, M. M., WILLIAMS, A.E., ERJEFALT, J.S., TURNER, JJ., BARNES, PJ., SPROAT, B.S., GAIT, MJ., and LINDSAY, M.A. (2007). Lung delivery studies using siRNA conjugated to TAT(48-60) and penetratin reveal peptide induced reduction in gene expression and induction of innate immunity. Bioconjug Chem 18, 1450-1459
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性siRNAであって、それは二本鎖RNAのフラグメントであり、その末端は、グラフトされたオリゴカチオンであり、グラフトされたカチオン電荷の数は、RNA鎖のヌクレオシド内ホスファートにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか又はそれより大きいことを特徴とするカチオン性siRNA。
【請求項２】
（グラフトされたオリゴカチオンのカチオン電荷の合計）−（ヌクレオシド内ホスファート基のアニオン電荷の合計）が、−３０〜＋５０であることを特徴とする請求項１に記載のカチオン性siRNA。
【請求項３】
鎖相補性が、二重らせん内において全てであるか、又は一部であることを特徴とする請求項１または２に記載のカチオン性siRNA。
【請求項４】
各オリゴリボヌクレオチドが、二重らせんの３’末端において一本鎖伸長を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項５】
オリゴカチオンは、センス鎖の３’及び／又は５’末端で、及び／又はアンチセンス鎖の３’末端でグラフトされていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項６】
前記フラグメントは、二本鎖RNAの１５〜３０のヌクレオチド長、特に１９〜３０のヌクレオチド長から形成され、その末端に、共有結合によって１〜３個のオリゴカチオンがグラフトされ、そのカチオン電荷の総数は、RNAにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか又はそれより大きいことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項７】
少なくとも１本の鎖が、式（I）
【化１】
に相当し、ここで、Ｎｉはｉ塩基長のオリゴヌクレオチドを表し、ここで、ｉ＝１５〜３０、特に１９〜３０であり、また、siRNAの二重らせんのＡ型を保存する任意の化学的修飾体又は置換体であり、
Ａｊはｊ塩基長のオリゴカチオンを表し、ここで、ｊ＝１〜５０であり、Ａは、
− 式（II）
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、ＸはＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎ１＝２〜２０である）、又は
− 式（III）
【化３】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１はプトレシン、スペルミジン又はスペルミンから選ばれる）、又は
− 式（IV）
【化４】
（式中、Ｒ７及びＲ８は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表わし、(aa)n2はアルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸のようなカチオン性側鎖を有する天然のアミノ酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
に相当することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項８】
オリゴカチオンはオリゴアミンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項９】
オリゴアミンは、スペルミン、スペルミジン又はプトレシンを含む群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のカチオン性siRNA。
【請求項１０】
構造：
【化５】
（式中、Ｎ、ｉ及びｊは請求項７に定義された通りである）
のオリゴヌクレオチド−オリゴスペルミンであることを特徴とする請求項９に記載のカチオン性siRNA。
【請求項１１】
薬物として用いられる、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載の少なくとも１種のカチオン性siRNAの有効量を、薬学的に不活性な担体、カチオン性脂質又はカチオン性ポリマーと組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
分子生物学及び機能的ゲノミクスにおける、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のカチオン性siRNAの適用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載のカチオン性siRNAの鎖の自動合成方法であって、
１９〜３０のリボヌクレオチドの３’から５’の固相担体への逐次的カップリングと、これに先行するおよび／またはこれに続く、カチオン性シントンの逐次的カップリングとを含み、該鎖は、式（VI）：
【化６】
（式中、Ｎ、ｉ、Ａおよびｊは請求項７において定義された通りである）
に対応することを特徴とする方法。
【請求項１５】
カチオン性シントンは、ホスホラミダイトオリゴアミンであり、
− 式（VII）
【化７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｎ１は上記に定義の通りであり、Ｘは保護された基ＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ又は低級アルキレン基であり、Ｒ１０は低級アルキレン基であるか、又は−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノ基であり、Protは、ＤＭＴ又はＭＭＴのようなオリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基である）、又は
− 式（VIII）
【化８】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１は、適切な保護基を有するプトレシン、スペルミジン又はスペルミンであり、Ｒ９及びＲ１０は上記定義の通りである）、又は
− 式（IX）
【化９】
（式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２及びProtは上記定義の通りであり、(aa)n2は、保護カチオン性側鎖を有する天然のアミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）に相当することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
カチオン性siRNAであって、それは二本鎖RNAのフラグメントであり、その末端は、グラフトされたオリゴカチオンであり、グラフトされたカチオン電荷の数は、RNA鎖のヌクレオシド内ホスファートにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか又はそれより大きいことを特徴とするカチオン性siRNA。
【請求項２】
（グラフトされたオリゴカチオンのカチオン電荷の合計）−（ヌクレオシド内ホスファート基のアニオン電荷の合計）が、−３０〜＋５０であることを特徴とする請求項１に記載のカチオン性siRNA。
【請求項３】
鎖相補性が、二重らせん内において全てであるか、又は一部であることを特徴とする請求項１または２に記載のカチオン性siRNA。
【請求項４】
各オリゴリボヌクレオチドが、二重らせんの３’末端において一本鎖伸長を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項５】
オリゴカチオンは、センス鎖の３’及び／又は５’末端で、及び／又はアンチセンス鎖の３’末端でグラフトされていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項６】
前記フラグメントは、二本鎖RNAの１５〜３０のヌクレオチド長、特に１９〜３０のヌクレオチド長から形成され、その末端に、共有結合によって１〜３個のオリゴカチオンがグラフトされ、そのカチオン電荷の総数は、RNAにより生じるアニオン電荷の数に匹敵するか又はそれより大きいことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項７】
少なくとも１本の鎖が、式（I）
【化１】
に相当し、ここで、Ｎｉはｉ塩基長のオリゴヌクレオチドを表し、ここで、ｉ＝１５〜３０、特に１９〜３０であり、また、siRNAの二重らせんのＡ型を保存する任意の化学的修飾体又は置換体であり、
Ａｊはｊ塩基長のオリゴカチオンを表し、ここで、ｊ＝１〜５０であり、Ａは、
− 式（II）
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、ＸはＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎ１＝２〜２０である）、又は
− 式（III）
【化３】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１はプトレシン、スペルミジン又はスペルミンから選ばれる）、又は
− 式（IV）
【化４】
（式中、Ｒ７及びＲ８は同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表わし、(aa)n2はアルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸のようなカチオン性側鎖を有する天然のアミノ酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
に相当することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項８】
オリゴカチオンはオリゴアミンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項９】
オリゴアミンは、スペルミン、スペルミジン又はプトレシンを含む群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のカチオン性siRNA。
【請求項１０】
構造：
【化５】
（式中、Ｎ、ｉ及びｊは請求項７に定義された通りである）
のオリゴヌクレオチド−オリゴスペルミンであることを特徴とする請求項９に記載のカチオン性siRNA。
【請求項１１】
薬物として用いられる、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のカチオン性siRNA。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載の少なくとも１種のカチオン性siRNAの有効量を、薬学的に不活性な担体、カチオン性脂質又はカチオン性ポリマーと組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
分子生物学及び機能的ゲノミクスにおける、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のカチオン性siRNAの適用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載のカチオン性siRNAの鎖の自動合成方法であって、
１９〜３０のリボヌクレオチドの３’から５’の固相担体への逐次的カップリングと、これに先行するおよび／またはこれに続く、カチオン性シントンの逐次的カップリングとを含み、該鎖は、式（VI）：
【化６】
（式中、Ｎ、ｉ、Ａおよびｊは請求項７において定義された通りである）
に対応することを特徴とする方法。
【請求項１５】
カチオン性シントンは、ホスホラミダイトオリゴアミンであり、
− 式（VII）
【化７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｎ１は上記に定義の通りであり、Ｘは保護された基ＮＨ又はＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ又は低級アルキレン基であり、Ｒ１０は低級アルキレン基であるか、又は−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノ基であり、Protは、ＤＭＴ又はＭＭＴのようなオリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基である）、又は
− 式（VIII）
【化８】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、低級アルキレン基を表し、Ｘ１は、適切な保護基を有するプトレシン、スペルミジン又はスペルミンであり、Ｒ９及びＲ１０は上記定義の通りである）、又は
− 式（IX）
【化９】
（式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２及びProtは上記定義の通りであり、(aa)n2は、保護カチオン性側鎖を有する天然のアミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はジアミノプロピオン酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）に相当することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５１１７７６（Ｐ２０１１−５１１７７６Ａ）
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４４８３６（Ｐ２０１０−５４４８３６）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５０３７９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５８８７
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０００４９３６９）サーントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シャーンティフィク (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５０３７９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５８８７
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０００４９３６９）サーントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シャーンティフィク (14)
【Ｆターム（参考）】
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