ＵＶＡ／ＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤
本発明は、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）およびＵＶＢ線耐性の新規な皮膚光保護剤に関し、該皮膚光保護剤は、南極大陸原産の草科の植物（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）から得られた水性抽出物を含み、過度のＵＶ光を拡散する抗酸化特性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）、ＵＶＢ線および可視太陽光線の有害な影響から人間の皮膚を保護する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽は根源的なエネルギー源であり、エネルギー源自体は、主に光および熱の形態で現れ、波動および粒子の形態で空間を移動する電磁放射線を発する。波動は、それらの周波数（ν）またはそれらの波長（λ）で表される。以下の表は、太陽の電磁放射線（日射）のスペクトルを示している。
【０００３】
【表１】
【０００４】
地球は、日射をフィルタリングして減衰させる大気ガス層によって保護されているので、これらの日射の部分が反射されるか、吸収されるかまたは拡散されるため、日射の全てが地球に達するとは限らない。２９０〜１，８００ｎｍの放射線（ＵＶＢ線、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）、可視光および近赤外線）は地面の表面に達する。この波長領域に関連して、ＵＶＢ線およびＵＶＡ線（ＩとＩＩ）は、オゾン層によってフィルタリングされるので表面に最も少なく達するものであるが、人類を含む生物圏に最も影響を与えるものでもある。他方、日射の有害な影響に関して、特に、日射に対するフィルタリング効果を減少させるオゾン層破壊の現象に関して、ますます関心が寄せられている（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｌ．Ｍｏｅｌｌｅｒ Ｅｄ．のＭ．Ｊ．ＭｏｌｉｎａおよびＬｕｉｓａ Ｔ．ＭｉｌｉｎａによるＯｚｏｎｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｆｆｅｃｔｓ（２００２年９月２４日）ＥＮＶＩＭＥＤ参照）。
【０００５】
ＵＶＢ線に対する露光過多は、短期間において皮膚に有害な影響を与え、皮膚の赤みを伴う周知の炎症プロセスである紅斑を生じさせる。他方、ＵＶＡ線に対する露光過多は、長期間において有害な影響を与える。公表されているグラフから、太陽スペクトルが、波長、紅斑作用スペクトル、および図１における波長と紅斑作用スペクトルとの関係に関連して地球に達していることを認識することができる。このグラフは、上記のこと、すなわち、紅斑は主にＵＶＢ線の入射によって皮膚に発生するが、これに対して、ＵＶＡ線のＩとＩＩ（３２０〜４００ｎｍ）はこのような皮膚反応を生じさせないことを示している。しかし、ＵＶＡ線のＩとＩＩは、光老化および光発癌等のはるかに有害な他の影響を長期間にわたってもたらす（Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．のＦｒ．Ｒ．ｄｅ ＧｒｕｊｉｌによるＰｈｏｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：ＵＶＡ ｖｓ ＵＶＢ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ（２００２年）１５：３１６〜３２０ページ参照）。
【０００６】
皮膚に対するＵＶＢ線とＵＶＡ線の有害な影響の主な違いを以下の表に示す。
【０００７】
【表２】
【０００８】
皮膚は、核酸およびタンパク質芳香残基に加えて、ＵＶＡ線を吸収することができる発色団、主にメラニンおよびウロカニン酸を有する。
【０００９】
より強い皮膚侵入の故に、ＵＶＡ線は、そのより高い光力学作用に関連して長期間にわたり皮膚変質の影響をもたらす。ＵＶＡ線によって生じる光力学作用は、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）のエネルギー（ｈν）と、皮膚の光感作物質、または空気中に酸素が存在する環境との反応によるものである。これにより、遊離基および一重項酸素として知られている反応性酸素種（ＲＯＳ）が発生する（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＦｅｒｒｙ Ｍ．Ｈａｎｓｏｎらによる「Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ」（２００６年）４１の１２０５〜１２１２ページ参照）。当然、遊離基は反応性化学種であり、それらは、それらのそれぞれの軌道関数において不対電子を含み、中性であるか、負帯電するかまたは正帯電し得る。それらの遊離基は、非常に不安定であり、したがって、反応を起こして細胞成分を変質させる傾向がある。したがって、それらの遊離基は、他の疾患の中のものである光老化、黒色腫および皮膚癌と関係している（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．による「Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９４年）１０２：６７１〜６７５ページ、およびＪ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．による「Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ，Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｔｏｐｉｃａｌ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」（２００３年）４８：１〜１９ページ、１９９７年のＴｅｄｅｓｃｏＡＣらのものを参照）。
【００１０】
Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．のＰ．ＫｕｌｌａｖａｎｉｊａｙａおよびＨ．Ｗ．Ｌｉｍによる「Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」（２００５年）５２：９３７〜５８ページ、ならびにＢｉｏｌ．Ｒｅｖ．による「Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」（１９９９年）７４、３１１〜３４５ページ等の、皮膚に対するこれらの有害な影響を回避することに焦点が当てられた化学フィルターおよび物理的フィルターについて多くの研究が行われており、その目的は、ＵＶＢ線およびＵＶＡ線を吸収してフィルタリングする物体（化学フィルター）、皮膚に形成される反応性酸素種（遊離基および一重項酸素）を抗酸化剤によって不活性化または破壊する物体、あるいはＴｉＯ２またはＺｎＯ等の物理的フィルターによる拡散によって放射線を反射する物体で局所光保護を行うことである。実際に、野菜抽出物が、ＴｉＯ２によって生じる酸化の影響を相殺することができる抗酸化特性を有することが認識されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙの「Ｐｌｙｐｏｄｉｕｍ Ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔｒａｎｓ−Ｕｒｏｃａｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」（２００６年）８２の１７３〜１７９ページ参照）。
【００１１】
他方、ＵＶＢ紫外線およびＵＶＡ紫外線の影響は植物にも影響を与え（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年１０月２５日）の第７６号の第１章〜第３章の６１〜６８ページ参照）、人間が元々メラニン等の光保護物質を生成するように、植物もそれら自体の防御機構を有する。さらに、非常に強い日射が続く中、超低温下で成長するＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ等の植物は、それら自体の防御を行う。これにより、上記植物は、有効な防御機構を形成して、これらの極限状態に対処する。放射しないように過度のＵＶ放射線を少量の熱として処理する大きな能力と共に、抗酸化能力を向上させることによって、反応性酸素種（ＲＯＳ）を拡散することができる。この植物は、南極大陸で成長しかつ問題なくその生息地の極限状態に耐えるという点で特有である。数種類の植物の１つはこのような極限の気候状態に耐えることができるので、南極の冬の間における氷および雪にさらされても、年中、緑化していることができる。（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙの「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ」（２００４年）３１、７３１〜７４１ページ参照）。
【００１２】
ＵＶＡ線およびＵＶＢ線によって生じる悪影響に対して永続的に皮膚を保護する製品を実現することが、今日、極めて必要である。抗酸化剤が、反応性酸素種（ＲＯＳ）によって生じる光力学作用を中和することが知られているが、どの抗酸化剤が適切であるかを見出すことおよびそれらの抗酸化の効果を確認することが必要である。なぜなら、それらの抗酸化剤が、連鎖伝播を生じさせて、より悪い他の結果をもたらすことがあるので、それらの抗酸化剤の全てが有益であるとは限らないからである。さらに、皮膚親和性等の種々の生物学的因子を考慮しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】波長と紅斑作用スペクトルとの関係を示す図。
【図２】５０μｇ／ｍｌのフェルラ酸を有する５００μｇ／ｍｌのＡＥＤＡの相対的なスペクトル吸収を示す図。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科に属する植物、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（又は、以下にＤＡと称す）の水性抽出物の抗酸化特性および過度のＵＶ光を拡散する特性を用いて、これらの特性を有する光保護剤を実現することに基づく。以下でＡＥＤＡ（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ：Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ水性抽出物）と呼ばれる、上記特性を有する水性抽出物が、ＵＶＢ線およびＵＶＡ線（ＩとＩＩ）に対して光保護特性を有することが確認された。その理由は以下のことによる。
【００１５】
ｉ） 一方では、ＵＶＡ線のＩＩが光感作物質および酸素の存在下で皮膚を照射するときに、上記水性抽出物の抗酸化が、ＵＶＡ線のＩＩの光力学作用の結果として主にＵＶＡ線のＩＩによって生じる遊離基の形成によってもたらされる負の効果を相殺することを含むことであり、
ｉｉ） 他方では、最も重要な皮膚のクロモフォレと、それとは異なる機構を用いるＤＡの両方のメラニンが過度の放射エネルギーを排除することができることが重要である。メラニンの場合、過度の放射エネルギーが小さな熱パルスの形態で排除され（「超段階内部変換」）、ＤＡの場合、「光化学抑制」が用いられ、いずれにしろ、生物学的光阻害をブロックすることができることである。
【００１６】
この技術分野において、抗酸化剤の全てが光保護剤になるとは限らないことを考慮しつつ、光保護に対する、特定の植物の抗酸化特性を用いることと、それらの抗酸化特性の可能な適用を行うことに関連する本発明は、水性抽出物を得て、皮膚光保護剤として使用するためのこの植物の抗酸化特性および過度のＵＶ光を拡散する特性について言及する。
【００１７】
本発明によるＡＥＤＡは、その自然環境由来の植物から、または人工環境で繁殖させた植物から抽出され得る。植物は、その保護目的のために厳しい規制に従う地方である南極大陸で自然に成長するものであり、この植物を利用すること、したがって、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａを商業目的で利用することは不可能である。したがって、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの実際の生息地以外の人工的な手段によってＡＥＤＡを得る必要がある。
【００１８】
Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物（ＡＥＤＡ）は、著者が予め確立した水性方法を用いる手順によって得られる。これにより、汚染問題と、抽出物から排除することが困難である残基とをもたらす有機溶剤の使用が回避される。
【００１９】
このようにして得られたＡＥＤＡを使用して、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）およびＵＶＢ線用の皮膚光保護剤を得ることが可能である。活性化するこの光保護剤と従来の賦形剤および添加剤とを混合して、その配合物を、局所皮膚塗布用のローション、オイル、懸濁液または軟膏におけるクリーム、ゲルまたは液体として得ることが可能である。
【００２０】
このようにして得られたＡＥＤＡは、その物理化学的特性および薬理学的特性を確認するために試験された。
【００２１】
以下のものはこれらの試験の概要である。
＜薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）＞
ＴＬＣ技術が、混合物の部分を形成する化合物を分離するために利用された（添付文書１）。得られたＡＥＤＡは、以下のような溶剤を使用してシリカゲル６０ Ｆ２５４プレート（ＭＥＲＣＫ）に滴下(spot)された。
【００２２】
●Ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（５０対５０）
●エチルアセテート：メタノール（８０対２０）
●エチルアセテート：ギ酸：氷酢酸：蒸留水（６７対６．４対６．４対１８．２）
ＡＥＤＡに存在するＵＶ吸収特性を有する化合物の吸収性のピークを決定するために、ＡＥＤＡが２００〜４００ｎｍのＵＶ／ＶＩＳのスペクトル分析にかけられた。可視スペクトルが得られるまで、サンプルがエタノールで希釈された状態でＳＨＩＭＡＤＺＵ（島津製） ＵＶ−１６０分光光度計が上記目的のために使用された。
＜ＡＥＤＡの抗酸化作用の定量化＞
Ｆｏｌｉｎの比色分析試験を行って、ＡＥＤＡのポリフェノールの量を測定した。この反応は、ヒドロキシル基がベンゼンリングに付着した上記化合物の特性である。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ試薬は、フェノールが存在する場合に黄色から青色に変化した。青色の強度は、７６５ｎｍの波長の分光光度計によって測定される（添付文書３）。ＡＥＤＡの抗酸化特性はＡＢＴＳ比色分析法によって評価された。このＡＢＴＳ比色分析法は安定基ＡＢＴＳ＋カチオンの連続発生に基づいており、その存在は、７３４ｎｍの波長（このカチオンが、抗酸化物質との相互作用によって、カチオンの最大吸収ピークの１つとカチオンの変質またはキレート化とを生じさせる波長）においてシステムの吸収性が減少することによって検出される。
【００２３】
分析されたＡＥＤＡのケルセチンインデックスを決定して、フェノール化合物インデックスの指標を得ているが、その理由は、このＡＥＤＡが、炭素２と３の二重結合部と位置３の遊離ＯＨ基と位置４のカルボニル基とによる、化合物の抗酸化強度を向上させるフラボノイドであるからである。０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．８ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でケルセチンによる校正曲線を準備し、次に、３５０ｎｍの波長スペクトルおよび０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、異なるＡＥＤＡの吸収性を測定した。
＜水性ＡＥＤＡのＨＰＬＣ基準＞
ＵＶ検出器によるＨＰＬＣ分析を実行して、得られたＡＥＤＡに存在し得る化合物の基準を得た。ＨＰＬＣのために、ＲＰ−１８．５μｍ ２５ｃｍのカラムを有するＳｈｉｍａｄｚｕ（島津製） ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰダイオードアレイ検出器が使用されており、ここで、メタノール：水の混合物が溶剤として使用されており、サンプルが、０．７〜０．８ｍｌ／ｍｉｎの流れ勾配を有するプログラムで動作した。
【００２４】
ＡＥＤＡを吸収したテンジクネズミを用いて、異なる試験を行って、これらの齧歯類の皮膚におけるＵＶＢ線およびＵＶＡ線（ＩとＩＩ）に対するＡＥＤＡの光保護効果を実証した。
＜Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物（ＡＥＤＡ）の細胞生存性の調査（細胞サイクル）＞
Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物である（ＡＥＤＡ）の細胞生存性の調査（細胞サイクル）が、ＨａＣａＴ細胞に紫外線が存在する状態において１０ｍｇ／ｍｌの投与量で行われた。人間のＨａＣａＴケラチノサイトラインが、１０％のウシ胎仔血清を有するＤＭＥＭ媒体で培養された。
【００２５】
【表３】
【００２６】
制御グループ（ＡＥＤＡを有しない）およびＡＥＤＡ Ｍ２を有するグループがこの最初の試験で使用された。この最初の試験では、実験を開始した後に、９．７５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ線＋０．７５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢ線の投与量のシミュレートされた太陽紫外線によって４時間照射が行われた。
【００２７】
添加剤を使用せずに、培養を２４時間続けた。その後、細胞が、トリプシンで分離され、６０％のエタノールに浸され、ヨウ化プロピジウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＲＮＡｓｅの緩衝液で培養された。ヨウ化プロピジウムは、ＤＮＡに付着して、フローサイトメータによって測定される蛍光を発する。これによって、細胞の総数と、休止／老化段階（Ｇ０／Ｇ１）における、合成（Ｓ）におけるまたは有糸分裂（Ｍ／Ｇ２）における割合と、アポトーシス（Ｓｕｂ−Ｇ０）の細胞とが決定された。この手法により、ＡＥＤＡが有毒物または有糸分裂促進物質であるかどうかを決定すること、およびＡＥＤＡの能力により、太陽紫外線の損傷を回復させることが可能になる。
【００２８】
実験を比較することができるように、および容易に理解可能な値を得ることができるように、添加剤なしの制御グループに対する細胞数の変化が計算された。合計３，０００〜５，０００個の細胞が評価されて、各実験で１００個に標準化された。このようにして、細胞の４１％が段階Ｇ０／Ｇ１にあり、３９％が、添加剤なしの制御の段階Ｇ２／Ｓにあることが確認された場合に、ＡＥＤＡで観察された変化が、制御グループに対する結果と比較された。
【００２９】
得られた結果が以下の表４に示され、負の値は、制御グループと比較された細胞数の減少を示し、正の値は、制御グループと比較された増加を示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
Ｍ２が、照射されていない細胞の増殖を増加させ、照射下でも増加が記録されたことが理解できる。
【００３２】
この実験の繰り返しにより、同様の効果、すなわち、ＵＶ光照射後の増殖効果とアポトーシスに対する耐性とが示された。この新しい調査では、以前の調査（以前の調査では５％のＧ２／Ｓ細胞対３９％のＧ２／Ｓ細胞）のより多くの増殖状態と比較して、細胞が主に休止／老化状態にあるということが重要である。その結果が以下の表５に示される。
【００３３】
【表５】
【００３４】
両方の実験の結果を平均化すると、Ｍ２がＧ２／Ｓ段階で細胞数をほとんど変化させなかったこと、およびＵＶ光の照射後に、Ｍ２のアポトーシスにおける細胞数が７％減少したことが結論付けられる。
＜ＵＶＢ線下におけるネズミの皮膚に対するＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物（ＡＥＤＡ）の効果＞
ａ）月曜日から金曜日にかけて、３００ｍｇ／ｍｌの濃度のＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａを準備して、０．１ｍｌを１日１回投与しつつ、３匹の雄ネズミに対するＵＶＢ線の影響を評価するような最初の試験が行われた。中央領域が周辺領域と比較され、その結果、各動物はそれ自体が制御を行っていた。２９０〜３５０ｎｍの（広帯域とみなされる）領域において主に３１３ｎｍで照射を行う、ＵＶＣ紫外線がフィルタリングされた６＊４０Ｗの光源から８ｃｍの部分に動物達を置いた状態で、Ｚｉｎｄｅｒと共編者、および他の著者によって示された方法に従って、ＵＶＢ線（２９０〜３５０ｎｍ）に曝露した後、形成された紅斑が×印で主観的に評価され、周辺領域（未処理）と中央領域（処理）とを区別して、曝露後に２４時間撮影された。結果は以下のようなものであった。
【００３５】
【表６】
【００３６】
これらの結果から、３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡが、ＵＶＢ線によって生じた紅斑の強度を減少させたことを結論付けることが可能であった。
【００３７】
ｂ）皮膚紅斑の形成、およびＵＶ光スペクトル内の２９０〜３２０ｎｍの強い照射源へのネズミの皮膚の曝露による「日焼けした」細胞と呼ばれる焼けた細胞の出現に対するＡＥＤＡの効果が、第２の試験で調査された。
【００３８】
その結果がフェルラ酸の効果と比較されており、このフェルラ酸は、基準物質として使用されており、植物界で非常に広く普及している非常に毒性の低い抗酸化剤であり、細胞膜を脂質酸化から保護し、細胞ゲノムを突然変異誘発および酸化損傷から保護する（３）。
＜材料および方法＞
２０グラムよりも多い重量の４０匹の雄ネズミが使用された。４０匹の雄ネズミは、収容した後に７日間試験が行われた位置に順応させられた。動物達は、制御温度が２２℃であり、相対湿度が５０％〜７５％であり、新鮮な空気が約１０時間毎に取り入れられ、そして１２時間毎に明るくなり、暗くなる（７：００から１９：００までが明るくなり、１９：００から７：００までが暗くなる）サイクルの部屋に置かれた。この期間中およびその実験期間中に、動物達には、標準的な齧歯類用食餌および水道水が任意量与えられた。
【００３９】
【表７】
【００４０】
●蒸留水（ＷＤＡ）またはエタノール（フェルラ酸）に溶解され、媒介物として不活性カルボポールゲルに懸濁されている。
【００４１】
動物達は、表１０に示されているように、１０匹の動物の４つの実験グループにそれぞれランダムにグループ化された。試験すべき製品がゲルとして皮膚に直接塗布された。試験は、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ ＰｈａｒｍａｃｏｄｙｎのＷｉｎｄｅｒらによる「Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｅｒｙｔｈｅｍａ ｉｎ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇｓ」（１９５８年）１１６：２６１〜２９２ページと、Ｂｒ．Ｊ．ＰｈａｒｍａｃｏｌのＷｅｎｄｙ，Ｊら等の他の著者による「Ｔｈｅ Ｌｏｃａｌ Ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ａｎｄ Ｔｏｐｉｃａｌ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｏｐｙｌ Ｇａｌｌａｔｅ ｉｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ」（１９７６年）５８：５７３〜５８１ページと、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．のＫａｔｉｙａｒ，Ｓ．Ｋ．らによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｐｈｏｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ」（１９９７年）８９：５５６〜６５ページとに示された方法に従いつつ、僅かな修正を加えて行われた。
【００４２】
試験前に動物達を６日間にわたってきれいに剃毛して、体毛の全ての跡を排除し、動物達の皮膚から全てのものを取り除いて裸にした。
【００４３】
試験すべき物質のためにまたは基準のために午前（１０：００ｈ）および午後（２０：００ｈ）に投与する方式で、最初の日の試験が開始され、ランダムに適当に３日間にわたって続けられた。３日目、対応する午前の処理を適用した後に、動物達は機器の曝露プラットフォームに置かれて固定された。ここで、動物達は、３１３ｎｍの基本周波数で照射を行いおよび約２９０〜３５０ｎｍの領域の、抗ＵＶＣフィルターを有する４＊４０Ｗの紫外線源から８ｃｍの部分に置かれた。
【００４４】
全ての動物が、紫外線検出器によって決定された照射量である約２．５ｋＪ／ｍ２の総投与量を受けるまで、曝露が続けられた。動物達の背中が曝露後に２４時間撮影され、それらの動物達が頸部転位を被っていた。組織学的調査のためのパラフィン含有物の処理および準備を開始する前に、背中の皮膚が剥がされ、試験すべき物質が塗布された領域の２ｘ２ｃｍの断片が、タンポン挿入された１０％のホルマリンを有するジャーに置かれて６時間保持された。
【００４５】
それらの準備は光学顕微鏡下で観察され、準備する毎に、表皮と皮膚との空間が５つの異なる位置においてｘ１００倍率で撮影された。細胞が、その隣接物の核とは異なる小さくて黒ずんだ不規則な密集核を有する超好酸性細胞質を有した場合に、細胞が日焼けしているとみなして、日焼けした細胞の計数が各写真に対して行われた。
【００４６】
紅斑の評価を陽画／陰画に基づいて行って、保護された動物達の割合を得た。
【００４７】
（日焼けした）ピクノティック核を有する超好酸性細胞の数は、各組織準備において、５つの異なるセクタ毎の写真領域で計数された。５回の計数の和が各動物に関する値とみなされた。ここで、各実験グループの個々の結果に関する平均±ｓ．ｅ．ｍ．が得られ、割合の変化が、試験すべき物質に曝露されて処理されたグループのために計算され、制御グループと比較され、さらには、曝露されていない制御グループと比較された。
<結果>
ｉ）ＵＶＢ線に曝露されなかった「ブランクの媒介物」（グループ１）のネズミの皮膚の様子は、完全に正常であり、ピンクがかっており、紅斑なしと示された。正常な皮膚組織は組織準備中に観察され、この皮膚組織は、（きめの細かい）正常な角質層、薄い顆粒層および有棘層からなり、細胞の結合が強く、機能的ケラチノサイトの基底細胞層（基底層）には、完全に規則正しい細胞が支持され、１つの細胞において、表皮と皮膚との間の分離部をはっきりとおよび明らかに区切る深い層がグループ化されている。「日焼けした」という用語の定義に適合する細胞の存在はこれらの準備のいずれにおいても観察されなかった。
【００４８】
ｉｉ）「能動的な制御媒介物」（グループ２）における全ての動物は、曝露後、小さな点状出血からはっきりと出血を伴う外傷までの範囲にある変化する赤血球の溢出領域を有する明らかな炎症症状、ときには非常に強い炎症症状を伴う強度の紅斑を２４時間にわたって示した。表皮の細胞組織の重大な変化は、細胞組織の層の構造が損なわれたときに、顕微写真で観察された。顆粒層も有棘層も見分けることができなかった。
【００４９】
基底層が一群のピクノティック細胞に置き換えられ、この間に、「日焼けした」細胞はかなりの数に達した。
【００５０】
０．５％のフェルラ酸による処理（グループ４）は動物達を７０％の紅斑から効果的に保護し、皮膚は常態に一致するバラ色の様子を示した。これにもかかわらず、影響を受けた動物達の小さな紅斑点および点状出血はそれほど重大でないことが明らかになった。組織の画像は、ＵＶＢ線が皮膚をほんの僅かに変化させたことを示している。表皮と皮膚とを分離する基底層はほぼ一体的に保持された。顆粒層および有棘層は薄くなり、角質層は厚くなった。日焼けした細胞の数は少ないが、多数のピクノティック核が観察され、表皮の組織が、ある程度損傷したことを示している。
【００５１】
ｉｉｉ）同様に、３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡで処理されたグループ（グループ３）において、ほぼ正常な有棘層と角質層の肥厚部とを有する正常な基底層が観察されている。日焼けした細胞の数は極めて少なかった。したがって、動物達の背中には赤みがなく、全ての動物達が紅斑を有していないことが示された。ＵＶＢ線によってネズミに生じる紅斑に対する３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡのおよび０．５％のフェルラ酸の光保護剤の効果は、表１１に示される。その結果は、処理された領域において、紅斑が存在するか（＋）または存在しないか（−）あるいはその発現が生じたかについて述べている。「保護された」という用語は、曝露領域で徴候がないか、または徴候があった場合には稀であり重要であるそれらの動物達を指し、「抑制」という用語は、紅斑および他の発現が生じた（主観的な基準）能動的な制御媒介物と比較して、紅斑および他の発現の強度が低下したことを指す。
【００５２】
【表８】
【００５３】
【表９】
【００５４】
差の統計的有意性は、フィッシャー試験またはΧ２（カイ二乗）等の非パラメトリック試験によって評価された。表１２は、ＵＶＢ線によってネズミに生じている「日焼けした」細胞の存在を示しており、その結果は、処理領域における組織準備時の細胞の数に関連して表されている。
【００５５】
図２は、５０μｇ／ｍｌのフェルラ酸を有する５００μｇ／ｍｌのＡＥＤＡの相対的なスペクトル吸収を示している。ＡＥＤＡの吸収スペクトルは２４０ｎｍの波長の最大吸収を示している。約２５０ｎｍ〜３５０ｎｍの帯域において、ＡＥＤＡは、ＵＶＣ線、ＵＶＢ線のかなりの量とＵＶＡ線のより強力な部分とをブロックする０．７５〜１．５ＵＡの安定した吸収性を提供する。したがって、その効果の部分は、皮膚に達する光照射を防止するスクリーン効果によるものであり得る。
【００５６】
比較してみると、フェルラ酸は、比較図２に見られ得る３つの吸収ピークを示している。最初の２つの吸収ピークはＵＶＣ域の前に配置され、３つ目の吸収ピークは２８５ｎｍよりも上に見られ、約３４０ｎｍに及ぶ。この作用は、多数の植物内に存在するポリフェノールの代表的なものであり、これらのポリフェノールは、植物を太陽光から保護する有効なスクリーン効果を提供する。同様の吸収性に達するのに必要な濃度を比較すると、フェルラ酸が、５０μｇ／ｍｌでその有効なブロック能力をもたらし、これに対して、ＡＥＤＡでは、５００μｇ／ｍｌで、５０μｇ／ｍｌのフェルラ酸により得られるブロックの５０％に等しいブロックがもたらされることを確認することができる。同様のブロック強度を得るには、ＡＥＤＡの必要な濃度を、フェルラ酸よりも１０〜５０倍高くしなければならない。
【００５７】
要約すると、以下のように示すことが可能である。
ａ）３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡを局所的に塗布することにより、ＵＶＢ線によって生じた紅斑が効果的に減少される。
ｂ）３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡを局所的に塗布することにより、日焼けした細胞の出現が９５．１１％抑制される。
ｃ）この試験で準備されたＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａの強度は、０．５％のフェルラ酸によって示された強度よりも僅かに優れている。
ｄ）ＵＶ光をブロックするのに必要なＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの濃度は、フェルラ酸よりも１０〜５０倍高くしなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）、ＵＶＢ線および可視太陽光線の有害な影響から人間の皮膚を保護する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽は根源的なエネルギー源であり、エネルギー源自体は、主に光および熱の形態で現れ、波動および粒子の形態で空間を移動する電磁放射線を発する。波動は、それらの周波数（ν）またはそれらの波長（λ）で表される。以下の表は、太陽の電磁放射線（日射）のスペクトルを示している。
【０００３】
【表１】
【０００４】
地球は、日射をフィルタリングして減衰させる大気ガス層によって保護されているので、これらの日射の部分が反射されるか、吸収されるかまたは拡散されるため、日射の全てが地球に達するとは限らない。２９０〜１，８００ｎｍの放射線（ＵＶＢ線、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）、可視光および近赤外線）は地面の表面に達する。この波長領域に関連して、ＵＶＢ線およびＵＶＡ線（ＩとＩＩ）は、オゾン層によってフィルタリングされるので表面に最も少なく達するものであるが、人類を含む生物圏に最も影響を与えるものでもある。他方、日射の有害な影響に関して、特に、日射に対するフィルタリング効果を減少させるオゾン層破壊の現象に関して、ますます関心が寄せられている（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｌ．Ｍｏｅｌｌｅｒ Ｅｄ．のＭ．Ｊ．ＭｏｌｉｎａおよびＬｕｉｓａ Ｔ．ＭｉｌｉｎａによるＯｚｏｎｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｆｆｅｃｔｓ（２００２年９月２４日）ＥＮＶＩＭＥＤ参照）。
【０００５】
ＵＶＢ線に対する露光過多は、短期間において皮膚に有害な影響を与え、皮膚の赤みを伴う周知の炎症プロセスである紅斑を生じさせる。他方、ＵＶＡ線に対する露光過多は、長期間において有害な影響を与える。公表されているグラフから、太陽スペクトルが、波長、紅斑作用スペクトル、および図１における波長と紅斑作用スペクトルとの関係に関連して地球に達していることを認識することができる。このグラフは、上記のこと、すなわち、紅斑は主にＵＶＢ線の入射によって皮膚に発生するが、これに対して、ＵＶＡ線のＩとＩＩ（３２０〜４００ｎｍ）はこのような皮膚反応を生じさせないことを示している。しかし、ＵＶＡ線のＩとＩＩは、光老化および光発癌等のはるかに有害な他の影響を長期間にわたってもたらす（Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．のＦｒ．Ｒ．ｄｅ ＧｒｕｊｉｌによるＰｈｏｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：ＵＶＡ ｖｓ ＵＶＢ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ（２００２年）１５：３１６〜３２０ページ参照）。
【０００６】
皮膚に対するＵＶＢ線とＵＶＡ線の有害な影響の主な違いを以下の表に示す。
【０００７】
【表２】
【０００８】
皮膚は、核酸およびタンパク質芳香残基に加えて、ＵＶＡ線を吸収することができる発色団、主にメラニンおよびウロカニン酸を有する。
【０００９】
より強い皮膚侵入の故に、ＵＶＡ線は、そのより高い光力学作用に関連して長期間にわたり皮膚変質の影響をもたらす。ＵＶＡ線によって生じる光力学作用は、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）のエネルギー（ｈν）と、皮膚の光感作物質、または空気中に酸素が存在する環境との反応によるものである。これにより、遊離基および一重項酸素として知られている反応性酸素種（ＲＯＳ）が発生する（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＦｅｒｒｙ Ｍ．Ｈａｎｓｏｎらによる「Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ」（２００６年）４１の１２０５〜１２１２ページ参照）。当然、遊離基は反応性化学種であり、それらは、それらのそれぞれの軌道関数において不対電子を含み、中性であるか、負帯電するかまたは正帯電し得る。それらの遊離基は、非常に不安定であり、したがって、反応を起こして細胞成分を変質させる傾向がある。したがって、それらの遊離基は、他の疾患の中のものである光老化、黒色腫および皮膚癌と関係している（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．による「Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９４年）１０２：６７１〜６７５ページ、およびＪ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．による「Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ，Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｔｏｐｉｃａｌ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」（２００３年）４８：１〜１９ページ、１９９７年のＴｅｄｅｓｃｏＡＣらのものを参照）。
【００１０】
Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．のＰ．ＫｕｌｌａｖａｎｉｊａｙａおよびＨ．Ｗ．Ｌｉｍによる「Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」（２００５年）５２：９３７〜５８ページ、ならびにＢｉｏｌ．Ｒｅｖ．による「Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」（１９９９年）７４、３１１〜３４５ページ等の、皮膚に対するこれらの有害な影響を回避することに焦点が当てられた化学フィルターおよび物理的フィルターについて多くの研究が行われており、その目的は、ＵＶＢ線およびＵＶＡ線を吸収してフィルタリングする物体（化学フィルター）、皮膚に形成される反応性酸素種（遊離基および一重項酸素）を抗酸化剤によって不活性化または破壊する物体、あるいはＴｉＯ２またはＺｎＯ等の物理的フィルターによる拡散によって放射線を反射する物体で局所光保護を行うことである。実際に、野菜抽出物が、ＴｉＯ２によって生じる酸化の影響を相殺することができる抗酸化特性を有することが認識されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙの「Ｐｌｙｐｏｄｉｕｍ Ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔｒａｎｓ−Ｕｒｏｃａｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」（２００６年）８２の１７３〜１７９ページ参照）。
【００１１】
他方、ＵＶＢ紫外線およびＵＶＡ紫外線の影響は植物にも影響を与え（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年１０月２５日）の第７６号の第１章〜第３章の６１〜６８ページ参照）、人間が元々メラニン等の光保護物質を生成するように、植物もそれら自体の防御機構を有する。さらに、非常に強い日射が続く中、超低温下で成長するＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ等の植物は、それら自体の防御を行う。これにより、上記植物は、有効な防御機構を形成して、これらの極限状態に対処する。放射しないように過度のＵＶ放射線を少量の熱として処理する大きな能力と共に、抗酸化能力を向上させることによって、反応性酸素種（ＲＯＳ）を拡散することができる。この植物は、南極大陸で成長しかつ問題なくその生息地の極限状態に耐えるという点で特有である。数種類の植物の１つはこのような極限の気候状態に耐えることができるので、南極の冬の間における氷および雪にさらされても、年中、緑化していることができる。（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙの「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ」（２００４年）３１、７３１〜７４１ページ参照）。
【００１２】
ＵＶＡ線およびＵＶＢ線によって生じる悪影響に対して永続的に皮膚を保護する製品を実現することが、今日、極めて必要である。抗酸化剤が、反応性酸素種（ＲＯＳ）によって生じる光力学作用を中和することが知られているが、どの抗酸化剤が適切であるかを見出すことおよびそれらの抗酸化の効果を確認することが必要である。なぜなら、それらの抗酸化剤が、連鎖伝播を生じさせて、より悪い他の結果をもたらすことがあるので、それらの抗酸化剤の全てが有益であるとは限らないからである。さらに、皮膚親和性等の種々の生物学的因子を考慮しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】波長と紅斑作用スペクトルとの関係を示す図。
【図２】５０μｇ／ｍｌのフェルラ酸を有する５００μｇ／ｍｌのＡＥＤＡの相対的なスペクトル吸収を示す図。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科に属する植物、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（又は、以下にＤＡと称す）の水性抽出物の抗酸化特性および過度のＵＶ光を拡散する特性を用いて、これらの特性を有する光保護剤を実現することに基づく。以下でＡＥＤＡ（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ：Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ水性抽出物）と呼ばれる、上記特性を有する水性抽出物が、ＵＶＢ線およびＵＶＡ線（ＩとＩＩ）に対して光保護特性を有することが確認された。その理由は以下のことによる。
【００１５】
ｉ） 一方では、ＵＶＡ線のＩＩが光感作物質および酸素の存在下で皮膚を照射するときに、上記水性抽出物の抗酸化が、ＵＶＡ線のＩＩの光力学作用の結果として主にＵＶＡ線のＩＩによって生じる遊離基の形成によってもたらされる負の効果を相殺することを含むことであり、
ｉｉ） 他方では、最も重要な皮膚のクロモフォレと、それとは異なる機構を用いるＤＡの両方のメラニンが過度の放射エネルギーを排除することができることが重要である。メラニンの場合、過度の放射エネルギーが小さな熱パルスの形態で排除され（「超段階内部変換」）、ＤＡの場合、「光化学抑制」が用いられ、いずれにしろ、生物学的光阻害をブロックすることができることである。
【００１６】
この技術分野において、抗酸化剤の全てが光保護剤になるとは限らないことを考慮しつつ、光保護に対する、特定の植物の抗酸化特性を用いることと、それらの抗酸化特性の可能な適用を行うことに関連する本発明は、水性抽出物を得て、皮膚光保護剤として使用するためのこの植物の抗酸化特性および過度のＵＶ光を拡散する特性について言及する。
【００１７】
本発明によるＡＥＤＡは、その自然環境由来の植物から、または人工環境で繁殖させた植物から抽出され得る。植物は、その保護目的のために厳しい規制に従う地方である南極大陸で自然に成長するものであり、この植物を利用すること、したがって、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａを商業目的で利用することは不可能である。したがって、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの実際の生息地以外の人工的な手段によってＡＥＤＡを得る必要がある。
【００１８】
Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物（ＡＥＤＡ）は、著者が予め確立した水性方法を用いる手順によって得られる。これにより、汚染問題と、抽出物から排除することが困難である残基とをもたらす有機溶剤の使用が回避される。
【００１９】
このようにして得られたＡＥＤＡを使用して、ＵＶＡ線（ＩとＩＩ）およびＵＶＢ線用の皮膚光保護剤を得ることが可能である。活性化するこの光保護剤と従来の賦形剤および添加剤とを混合して、その配合物を、局所皮膚塗布用のローション、オイル、懸濁液または軟膏におけるクリーム、ゲルまたは液体として得ることが可能である。
【００２０】
このようにして得られたＡＥＤＡは、その物理化学的特性および薬理学的特性を確認するために試験された。
【００２１】
以下のものはこれらの試験の概要である。
＜薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）＞
ＴＬＣ技術が、混合物の部分を形成する化合物を分離するために利用された（添付文書１）。得られたＡＥＤＡは、以下のような溶剤を使用してシリカゲル６０ Ｆ２５４プレート（ＭＥＲＣＫ）に滴下(spot)された。
【００２２】
●Ｎ−ヘキサン：エチルアセテート（５０対５０）
●エチルアセテート：メタノール（８０対２０）
●エチルアセテート：ギ酸：氷酢酸：蒸留水（６７対６．４対６．４対１８．２）
ＡＥＤＡに存在するＵＶ吸収特性を有する化合物の吸収性のピークを決定するために、ＡＥＤＡが２００〜４００ｎｍのＵＶ／ＶＩＳのスペクトル分析にかけられた。可視スペクトルが得られるまで、サンプルがエタノールで希釈された状態でＳＨＩＭＡＤＺＵ（島津製） ＵＶ−１６０分光光度計が上記目的のために使用された。
＜ＡＥＤＡの抗酸化作用の定量化＞
Ｆｏｌｉｎの比色分析試験を行って、ＡＥＤＡのポリフェノールの量を測定した。この反応は、ヒドロキシル基がベンゼンリングに付着した上記化合物の特性である。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ試薬は、フェノールが存在する場合に黄色から青色に変化した。青色の強度は、７６５ｎｍの波長の分光光度計によって測定される（添付文書３）。ＡＥＤＡの抗酸化特性はＡＢＴＳ比色分析法によって評価された。このＡＢＴＳ比色分析法は安定基ＡＢＴＳ＋カチオンの連続発生に基づいており、その存在は、７３４ｎｍの波長（このカチオンが、抗酸化物質との相互作用によって、カチオンの最大吸収ピークの１つとカチオンの変質またはキレート化とを生じさせる波長）においてシステムの吸収性が減少することによって検出される。
【００２３】
分析されたＡＥＤＡのケルセチンインデックスを決定して、フェノール化合物インデックスの指標を得ているが、その理由は、このＡＥＤＡが、炭素２と３の二重結合部と位置３の遊離ＯＨ基と位置４のカルボニル基とによる、化合物の抗酸化強度を向上させるフラボノイドであるからである。０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．８ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でケルセチンによる校正曲線を準備し、次に、３５０ｎｍの波長スペクトルおよび０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、異なるＡＥＤＡの吸収性を測定した。
＜水性ＡＥＤＡのＨＰＬＣ基準＞
ＵＶ検出器によるＨＰＬＣ分析を実行して、得られたＡＥＤＡに存在し得る化合物の基準を得た。ＨＰＬＣのために、ＲＰ−１８．５μｍ ２５ｃｍのカラムを有するＳｈｉｍａｄｚｕ（島津製） ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰダイオードアレイ検出器が使用されており、ここで、メタノール：水の混合物が溶剤として使用されており、サンプルが、０．７〜０．８ｍｌ／ｍｉｎの流れ勾配を有するプログラムで動作した。
【００２４】
ＡＥＤＡを吸収したテンジクネズミを用いて、異なる試験を行って、これらの齧歯類の皮膚におけるＵＶＢ線およびＵＶＡ線（ＩとＩＩ）に対するＡＥＤＡの光保護効果を実証した。
＜Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物（ＡＥＤＡ）の細胞生存性の調査（細胞サイクル）＞
Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物である（ＡＥＤＡ）の細胞生存性の調査（細胞サイクル）が、ＨａＣａＴ細胞に紫外線が存在する状態において１０ｍｇ／ｍｌの投与量で行われた。人間のＨａＣａＴケラチノサイトラインが、１０％のウシ胎仔血清を有するＤＭＥＭ媒体で培養された。
【００２５】
【表３】
【００２６】
制御グループ（ＡＥＤＡを有しない）およびＡＥＤＡ Ｍ２を有するグループがこの最初の試験で使用された。この最初の試験では、実験を開始した後に、９．７５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ線＋０．７５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢ線の投与量のシミュレートされた太陽紫外線によって４時間照射が行われた。
【００２７】
添加剤を使用せずに、培養を２４時間続けた。その後、細胞が、トリプシンで分離され、６０％のエタノールに浸され、ヨウ化プロピジウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＲＮＡｓｅの緩衝液で培養された。ヨウ化プロピジウムは、ＤＮＡに付着して、フローサイトメータによって測定される蛍光を発する。これによって、細胞の総数と、休止／老化段階（Ｇ０／Ｇ１）における、合成（Ｓ）におけるまたは有糸分裂（Ｍ／Ｇ２）における割合と、アポトーシス（Ｓｕｂ−Ｇ０）の細胞とが決定された。この手法により、ＡＥＤＡが有毒物または有糸分裂促進物質であるかどうかを決定すること、およびＡＥＤＡの能力により、太陽紫外線の損傷を回復させることが可能になる。
【００２８】
実験を比較することができるように、および容易に理解可能な値を得ることができるように、添加剤なしの制御グループに対する細胞数の変化が計算された。合計３，０００〜５，０００個の細胞が評価されて、各実験で１００個に標準化された。このようにして、細胞の４１％が段階Ｇ０／Ｇ１にあり、３９％が、添加剤なしの制御の段階Ｇ２／Ｓにあることが確認された場合に、ＡＥＤＡで観察された変化が、制御グループに対する結果と比較された。
【００２９】
得られた結果が以下の表４に示され、負の値は、制御グループと比較された細胞数の減少を示し、正の値は、制御グループと比較された増加を示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
Ｍ２が、照射されていない細胞の増殖を増加させ、照射下でも増加が記録されたことが理解できる。
【００３２】
この実験の繰り返しにより、同様の効果、すなわち、ＵＶ光照射後の増殖効果とアポトーシスに対する耐性とが示された。この新しい調査では、以前の調査（以前の調査では５％のＧ２／Ｓ細胞対３９％のＧ２／Ｓ細胞）のより多くの増殖状態と比較して、細胞が主に休止／老化状態にあるということが重要である。その結果が以下の表５に示される。
【００３３】
【表５】
【００３４】
両方の実験の結果を平均化すると、Ｍ２がＧ２／Ｓ段階で細胞数をほとんど変化させなかったこと、およびＵＶ光の照射後に、Ｍ２のアポトーシスにおける細胞数が７％減少したことが結論付けられる。
＜ＵＶＢ線下におけるネズミの皮膚に対するＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの水性抽出物（ＡＥＤＡ）の効果＞
ａ）月曜日から金曜日にかけて、３００ｍｇ／ｍｌの濃度のＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａを準備して、０．１ｍｌを１日１回投与しつつ、３匹の雄ネズミに対するＵＶＢ線の影響を評価するような最初の試験が行われた。中央領域が周辺領域と比較され、その結果、各動物はそれ自体が制御を行っていた。２９０〜３５０ｎｍの（広帯域とみなされる）領域において主に３１３ｎｍで照射を行う、ＵＶＣ紫外線がフィルタリングされた６＊４０Ｗの光源から８ｃｍの部分に動物達を置いた状態で、Ｚｉｎｄｅｒと共編者、および他の著者によって示された方法に従って、ＵＶＢ線（２９０〜３５０ｎｍ）に曝露した後、形成された紅斑が×印で主観的に評価され、周辺領域（未処理）と中央領域（処理）とを区別して、曝露後に２４時間撮影された。結果は以下のようなものであった。
【００３５】
【表６】
【００３６】
これらの結果から、３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡが、ＵＶＢ線によって生じた紅斑の強度を減少させたことを結論付けることが可能であった。
【００３７】
ｂ）皮膚紅斑の形成、およびＵＶ光スペクトル内の２９０〜３２０ｎｍの強い照射源へのネズミの皮膚の曝露による「日焼けした」細胞と呼ばれる焼けた細胞の出現に対するＡＥＤＡの効果が、第２の試験で調査された。
【００３８】
その結果がフェルラ酸の効果と比較されており、このフェルラ酸は、基準物質として使用されており、植物界で非常に広く普及している非常に毒性の低い抗酸化剤であり、細胞膜を脂質酸化から保護し、細胞ゲノムを突然変異誘発および酸化損傷から保護する（３）。
＜材料および方法＞
２０グラムよりも多い重量の４０匹の雄ネズミが使用された。４０匹の雄ネズミは、収容した後に７日間試験が行われた位置に順応させられた。動物達は、制御温度が２２℃であり、相対湿度が５０％〜７５％であり、新鮮な空気が約１０時間毎に取り入れられ、そして１２時間毎に明るくなり、暗くなる（７：００から１９：００までが明るくなり、１９：００から７：００までが暗くなる）サイクルの部屋に置かれた。この期間中およびその実験期間中に、動物達には、標準的な齧歯類用食餌および水道水が任意量与えられた。
【００３９】
【表７】
【００４０】
●蒸留水（ＷＤＡ）またはエタノール（フェルラ酸）に溶解され、媒介物として不活性カルボポールゲルに懸濁されている。
【００４１】
動物達は、表１０に示されているように、１０匹の動物の４つの実験グループにそれぞれランダムにグループ化された。試験すべき製品がゲルとして皮膚に直接塗布された。試験は、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ ＰｈａｒｍａｃｏｄｙｎのＷｉｎｄｅｒらによる「Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｅｒｙｔｈｅｍａ ｉｎ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇｓ」（１９５８年）１１６：２６１〜２９２ページと、Ｂｒ．Ｊ．ＰｈａｒｍａｃｏｌのＷｅｎｄｙ，Ｊら等の他の著者による「Ｔｈｅ Ｌｏｃａｌ Ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ａｎｄ Ｔｏｐｉｃａｌ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｏｐｙｌ Ｇａｌｌａｔｅ ｉｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ」（１９７６年）５８：５７３〜５８１ページと、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．のＫａｔｉｙａｒ，Ｓ．Ｋ．らによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｐｈｏｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ」（１９９７年）８９：５５６〜６５ページとに示された方法に従いつつ、僅かな修正を加えて行われた。
【００４２】
試験前に動物達を６日間にわたってきれいに剃毛して、体毛の全ての跡を排除し、動物達の皮膚から全てのものを取り除いて裸にした。
【００４３】
試験すべき物質のためにまたは基準のために午前（１０：００ｈ）および午後（２０：００ｈ）に投与する方式で、最初の日の試験が開始され、ランダムに適当に３日間にわたって続けられた。３日目、対応する午前の処理を適用した後に、動物達は機器の曝露プラットフォームに置かれて固定された。ここで、動物達は、３１３ｎｍの基本周波数で照射を行いおよび約２９０〜３５０ｎｍの領域の、抗ＵＶＣフィルターを有する４＊４０Ｗの紫外線源から８ｃｍの部分に置かれた。
【００４４】
全ての動物が、紫外線検出器によって決定された照射量である約２．５ｋＪ／ｍ２の総投与量を受けるまで、曝露が続けられた。動物達の背中が曝露後に２４時間撮影され、それらの動物達が頸部転位を被っていた。組織学的調査のためのパラフィン含有物の処理および準備を開始する前に、背中の皮膚が剥がされ、試験すべき物質が塗布された領域の２ｘ２ｃｍの断片が、タンポン挿入された１０％のホルマリンを有するジャーに置かれて６時間保持された。
【００４５】
それらの準備は光学顕微鏡下で観察され、準備する毎に、表皮と皮膚との空間が５つの異なる位置においてｘ１００倍率で撮影された。細胞が、その隣接物の核とは異なる小さくて黒ずんだ不規則な密集核を有する超好酸性細胞質を有した場合に、細胞が日焼けしているとみなして、日焼けした細胞の計数が各写真に対して行われた。
【００４６】
紅斑の評価を陽画／陰画に基づいて行って、保護された動物達の割合を得た。
【００４７】
（日焼けした）ピクノティック核を有する超好酸性細胞の数は、各組織準備において、５つの異なるセクタ毎の写真領域で計数された。５回の計数の和が各動物に関する値とみなされた。ここで、各実験グループの個々の結果に関する平均±ｓ．ｅ．ｍ．が得られ、割合の変化が、試験すべき物質に曝露されて処理されたグループのために計算され、制御グループと比較され、さらには、曝露されていない制御グループと比較された。
<結果>
ｉ）ＵＶＢ線に曝露されなかった「ブランクの媒介物」（グループ１）のネズミの皮膚の様子は、完全に正常であり、ピンクがかっており、紅斑なしと示された。正常な皮膚組織は組織準備中に観察され、この皮膚組織は、（きめの細かい）正常な角質層、薄い顆粒層および有棘層からなり、細胞の結合が強く、機能的ケラチノサイトの基底細胞層（基底層）には、完全に規則正しい細胞が支持され、１つの細胞において、表皮と皮膚との間の分離部をはっきりとおよび明らかに区切る深い層がグループ化されている。「日焼けした」という用語の定義に適合する細胞の存在はこれらの準備のいずれにおいても観察されなかった。
【００４８】
ｉｉ）「能動的な制御媒介物」（グループ２）における全ての動物は、曝露後、小さな点状出血からはっきりと出血を伴う外傷までの範囲にある変化する赤血球の溢出領域を有する明らかな炎症症状、ときには非常に強い炎症症状を伴う強度の紅斑を２４時間にわたって示した。表皮の細胞組織の重大な変化は、細胞組織の層の構造が損なわれたときに、顕微写真で観察された。顆粒層も有棘層も見分けることができなかった。
【００４９】
基底層が一群のピクノティック細胞に置き換えられ、この間に、「日焼けした」細胞はかなりの数に達した。
【００５０】
０．５％のフェルラ酸による処理（グループ４）は動物達を７０％の紅斑から効果的に保護し、皮膚は常態に一致するバラ色の様子を示した。これにもかかわらず、影響を受けた動物達の小さな紅斑点および点状出血はそれほど重大でないことが明らかになった。組織の画像は、ＵＶＢ線が皮膚をほんの僅かに変化させたことを示している。表皮と皮膚とを分離する基底層はほぼ一体的に保持された。顆粒層および有棘層は薄くなり、角質層は厚くなった。日焼けした細胞の数は少ないが、多数のピクノティック核が観察され、表皮の組織が、ある程度損傷したことを示している。
【００５１】
ｉｉｉ）同様に、３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡで処理されたグループ（グループ３）において、ほぼ正常な有棘層と角質層の肥厚部とを有する正常な基底層が観察されている。日焼けした細胞の数は極めて少なかった。したがって、動物達の背中には赤みがなく、全ての動物達が紅斑を有していないことが示された。ＵＶＢ線によってネズミに生じる紅斑に対する３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡのおよび０．５％のフェルラ酸の光保護剤の効果は、表１１に示される。その結果は、処理された領域において、紅斑が存在するか（＋）または存在しないか（−）あるいはその発現が生じたかについて述べている。「保護された」という用語は、曝露領域で徴候がないか、または徴候があった場合には稀であり重要であるそれらの動物達を指し、「抑制」という用語は、紅斑および他の発現が生じた（主観的な基準）能動的な制御媒介物と比較して、紅斑および他の発現の強度が低下したことを指す。
【００５２】
【表８】
【００５３】
【表９】
【００５４】
差の統計的有意性は、フィッシャー試験またはΧ２（カイ二乗）等の非パラメトリック試験によって評価された。表１２は、ＵＶＢ線によってネズミに生じている「日焼けした」細胞の存在を示しており、その結果は、処理領域における組織準備時の細胞の数に関連して表されている。
【００５５】
図２は、５０μｇ／ｍｌのフェルラ酸を有する５００μｇ／ｍｌのＡＥＤＡの相対的なスペクトル吸収を示している。ＡＥＤＡの吸収スペクトルは２４０ｎｍの波長の最大吸収を示している。約２５０ｎｍ〜３５０ｎｍの帯域において、ＡＥＤＡは、ＵＶＣ線、ＵＶＢ線のかなりの量とＵＶＡ線のより強力な部分とをブロックする０．７５〜１．５ＵＡの安定した吸収性を提供する。したがって、その効果の部分は、皮膚に達する光照射を防止するスクリーン効果によるものであり得る。
【００５６】
比較してみると、フェルラ酸は、比較図２に見られ得る３つの吸収ピークを示している。最初の２つの吸収ピークはＵＶＣ域の前に配置され、３つ目の吸収ピークは２８５ｎｍよりも上に見られ、約３４０ｎｍに及ぶ。この作用は、多数の植物内に存在するポリフェノールの代表的なものであり、これらのポリフェノールは、植物を太陽光から保護する有効なスクリーン効果を提供する。同様の吸収性に達するのに必要な濃度を比較すると、フェルラ酸が、５０μｇ／ｍｌでその有効なブロック能力をもたらし、これに対して、ＡＥＤＡでは、５００μｇ／ｍｌで、５０μｇ／ｍｌのフェルラ酸により得られるブロックの５０％に等しいブロックがもたらされることを確認することができる。同様のブロック強度を得るには、ＡＥＤＡの必要な濃度を、フェルラ酸よりも１０〜５０倍高くしなければならない。
【００５７】
要約すると、以下のように示すことが可能である。
ａ）３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡを局所的に塗布することにより、ＵＶＢ線によって生じた紅斑が効果的に減少される。
ｂ）３００ｍｇ／ｍｌのＡＥＤＡを局所的に塗布することにより、日焼けした細胞の出現が９５．１１％抑制される。
ｃ）この試験で準備されたＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａの強度は、０．５％のフェルラ酸によって示された強度よりも僅かに優れている。
ｄ）ＵＶ光をブロックするのに必要なＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａの濃度は、フェルラ酸よりも１０〜５０倍高くしなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤において、
研究所で成長させられるかまたは南極地方自体で収集された南極大陸原産のＧｒａｍｉｎｅａｅ科の植物から得られた水性抽出物のある含有量を有することを特徴とするＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤。
【請求項２】
前記水性抽出物が、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａという植物由来であることを特徴とする請求項１に記載のＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤。
【請求項３】
水性抽出物の３００ｍｇ／ｍｌの含有量を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤。
【請求項４】
皮膚塗布用のクリーム、ゲル、オイルまたはローションの形態の固体または液体の光保護組成物において、請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚光保護剤を含むことを特徴とする固体または液体の光保護組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の皮膚光保護剤を得るためのＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａという植物の使用法。
【請求項１】
ＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤において、
研究所で成長させられるかまたは南極地方自体で収集された南極大陸原産のＧｒａｍｉｎｅａｅ科の植物から得られた水性抽出物のある含有量を有することを特徴とするＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤。
【請求項２】
前記水性抽出物が、Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａという植物由来であることを特徴とする請求項１に記載のＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤。
【請求項３】
水性抽出物の３００ｍｇ／ｍｌの含有量を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＵＶＡ線およびＵＶＢ線に対する皮膚光保護剤。
【請求項４】
皮膚塗布用のクリーム、ゲル、オイルまたはローションの形態の固体または液体の光保護組成物において、請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚光保護剤を含むことを特徴とする固体または液体の光保護組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の皮膚光保護剤を得るためのＤｅｓｃｈａｍｐｓｉａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａという植物の使用法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５１６３１１（Ｐ２０１２−５１６３１１Ａ）
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４６８７９（Ｐ２０１１−５４６８７９）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／００００５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８６４６４
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５１１１４８２８２）ビトロヘン株式会社 (1)
【出願人】（５１１１４８２９３）アポテクノス・パラ・ラ・ピエル有限会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／００００５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８６４６４
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５１１１４８２８２）ビトロヘン株式会社 (1)
【出願人】（５１１１４８２９３）アポテクノス・パラ・ラ・ピエル有限会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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