ａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌及びその利用
【課題】製麹等の過程における麹からの胞子の飛散を効率的に抑制された麹菌及びその利用方法を提供する。
【解決手段】麹菌において、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損させることによって、親株よりも胞子形成能が著しく低下しているために、胞子をほぼ飛散させることがなく、しかも親株以上の総プロテアーゼ活性を有するために、醸造調味料の製造においてきわめて実用的な麹菌及びその利用法を提供する。
【解決手段】麹菌において、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損させることによって、親株よりも胞子形成能が著しく低下しているために、胞子をほぼ飛散させることがなく、しかも親株以上の総プロテアーゼ活性を有するために、醸造調味料の製造においてきわめて実用的な麹菌及びその利用法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損した麹菌、および該麹菌を用いて麹または調味料を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
焼酎、清酒、みりん、味噌、醤油等の調味料の製造では、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）といった麹菌が用いられている。
【０００３】
麹菌は、各種酵素の生産に適しており、その用途に応じて、その各種酵素系の発現に適した製麹方法が採られている。例えば醤油の製造においては、蒸煮した穀類等の固体原料に麹菌の胞子を散布し、その表面で麹菌を増殖させることによって製麹を行っている。
【０００４】
麹の原料となる大豆、小麦、米の種類により、また、それらのα化度、水分量により、製麹中の温度、湿度、培養時間、手入れ条件、通風・換気条件等のさまざまな製麹条件を調整して、各種酵素を効率よく産生させるように管理するのが一般的である。
【０００５】
製麹過程において麹菌は、生育するに従い多量の胞子を着生するために、大量の胞子が空気中に飛散する。この飛散した胞子が調味料製造の作業環境を悪化させ、あるいは胞子が作業者の体内に入ることによってアレルギーを引き起こす原因物質となるおそれのあることは、従来問題とされてきた。
【０００６】
上記問題を解決するため、従来、集塵機を用いて胞子を空気と共に排除したり、密閉式ベルトコンベア内で麹に液体を散布するなど物理的な方法で飛散した胞子を除去する方法や、長毛の麹菌と短毛の麹菌をブレンドした種麹を用いて製麹することで分生子の着生を抑制する方法が報告されている（非特許文献１）。
【０００７】
しかしながら、麹の製造工程において多量の胞子が空気中に飛散する問題を解決する手段として、従来、飛散した胞子を大型換気扇、集塵機、密閉式のベルトコンベアや散水装置などの設備を用いて除去するなどの方法が知られてきたが、当該方法では、胞子を完全に除去することは不可能である上に、大型設備の導入や運転には多大なコストが必要であって、実用的な方法であるとは言えなかった。
【０００８】
また、長毛の麹菌と短毛の麹菌を混和して使用する方法についても、胞子の飛散を抑制することはできるものの、完全に防除することは困難であった。
【０００９】
一方、アスペルギルス・オリゼーなどの糸状菌は、ゲノム中にａｌｐＡ、ａｌｐＢと呼ばれる２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼをコードする遺伝子を保持することが知られており、糸状菌においてアルカリプロテアーゼ遺伝子を欠損させると、総プロテアーゼ活性が低下し、結果、当該糸状菌を用いて異種タンパク質を合成する際にもタンパク質の分解が生じないために、遺伝子組換え等によって目的のタンパク質を高収量に獲得できるような糸状菌を作製できることが報告されている（特許文献１）。
【００１０】
しかしながら、記載されている遺伝子の塩基配列の比較を行ったところ、上記文献に記載の麹菌は、２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼのうち、ａｌｐＡ遺伝子だけを欠損させたものであって、ａｌｐＢ遺伝子を欠損させた場合にどのような表現型を持つ糸状菌が得られるかついては、これまで全く知られていなかった。
【００１１】
本発明者は、ａｌｐＡ遺伝子の機能を欠損した麹菌株の様々な形質を検討したところ、実施例に詳述しているように、上記ａｌｐＡ欠損株は、親株と比較して胞子形成能がほとんど低下しておらず、また総プロテアーゼ活性も著しく低下しているものであり、醸造食品等の製造等に応用するには全く適さないものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０００−５０７１０６
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】日本醸造協会誌 Ｖｏｌ．９２ ８６０−８６７、１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このように、麹菌の胞子形成を抑制し、かつ調味料製造に影響を及ぼさない麹菌の育種に関しては、従来全く報告されていないのが現状である。そこで、本発明の目的は、製麹等の過程における麹からの胞子の飛散を効率的に抑制でき、かつ醸造食品の製造に適した麹菌を育種し、当該麹菌を用いた麹及び調味料の製造法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、麹菌の育種に関し、種々検討を重ねる過程で、麹菌ゲノム中の２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能のみを欠損させると、（１）ａｌｐＡをコードする遺伝子の機能を欠損させた場合とは全く異なって、親株よりも胞子形成能が著しく低下し、調味料製造の過程において胞子をほぼ飛散することがないこと、しかも（２）当該麹菌株は、全く意外なことに親株に比べて著しく高い総プロテアーゼ活性を有しており、調味料製造においても、原料の歩留まりの向上を期待できるなど、きわめて実用的な麹菌であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
したがって、本発明は以下の通りである。
【００１７】
（１） サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌。
（２） ゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌のａｌｐＢをコードする遺伝子のみを欠損させ、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜する方法で得られる、（１）記載の麹菌。
（３） 麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である（１）に記載の麹菌。
（４） （１）に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
（５） （１）に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の麹菌は、胞子形成能が著しく低下しており、食品の醸造工程において、大規模な設備の導入を行わずとも胞子の飛散をほぼ完全に抑制できる。一方で、当該麹菌は高い総プロテアーゼ活性をも有していることから、調味料の効率的な製造に寄与し、産業上の利用可能性が非常に高いものである。また、胞子を飛散させる事がないことから、固体培養による組換えタンパク質の大量発現などを行わせる際にも、組換え遺伝子を含む胞子を管理区域外に放散させる危険性がなく、宿主菌株として安全に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例で行ったａｌｐＢ遺伝子破壊ベクターの作成工程を模式的に表したものである。
【図２】図２は、育種した麹菌の生育速度を親株と比較した結果である。◆は親株、□はａｌｐＡ遺伝子破壊株、△はａｌｐＢ遺伝子破壊株における測定値を示す。
【図３】図３は、親株とａｌｐＡ破壊株（ΔａｌｐＡ）、ａｌｐＢ破壊株（ΔａｌｐＢ）それぞれの麹菌の総プロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ／ｍｌ）比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において親株として用いられる麹菌とは、そのゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌であれば、いずれも使用可能である。具体的には、焼酎、清酒、みりん、醤油、味噌等の調味料の製造に使用可能で、プロテアーゼ活性を有するアスペルギルス属に属する麹菌であれば特に限定はされず、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ等が好ましい。中でも特に好ましいのはアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤである。さらに、上記の麹菌株を親株として、人為的に改変された遺伝子組換え株、あるいは天然に存在する変異株なども用いることができる。
【００２１】
本発明において、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼをコードするａｌｐＢ遺伝子は、ゲノムデータベースＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）において定義される。すなわち、ＩＤがＡＯ０９０００３００１０３６である遺伝子がａｌｐＡ、ＡＯ０９００２００００５１７である遺伝子がａｌｐＢである。
【００２２】
本願発明における、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌とは、相同組換えによる遺伝子破壊法または変異導入法によってａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が失われた麹菌株のことを指す。
【００２３】
相同組み換えによる遺伝子破壊法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、ａｌｐＢ遺伝子の断片もしくはその上流・下流の領域とマーカー遺伝子とを組み合わせたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、プロトプラスト−ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法などによってベクターを糸状菌に取り込ませ、相同組み換えによって当該ＤＮＡ断片を糸状菌のゲノム中に導入する方法などを挙げられる。ＤＮＡ断片を麹菌細胞中に取り込ませる他の方法としてはパーティクルガン法、アグロバクテリウム法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
【００２４】
相同組み換え法によって所期の遺伝子が麹菌に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法などが挙げられる。ただし、このような栄養要求性だけでは、目的とする遺伝子座が導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できない。従って、栄養要求性に合わせて適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。
【００２５】
また、変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、紫外線を照射させる方法を挙げることができる。
【００２６】
上記のような遺伝子破壊法、または変異導入法によってａｌｐＢ遺伝子に変異、もしくは欠損が生じ、胞子形成能が著しく低下した株をスクリーニングする方法としては、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜し、選抜した候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、シークエンス解析で確認する方法などを挙げることができる。他の方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法等を利用することができる。
【００２７】
本発明において、胞子形成能の著しく低下した株とは、親株に比べて胞子数が１／１０以下である麹菌株を指す。胞子数を測定する方法としては、たとえば胞子縣濁液を作成し、一定対数あたりの胞子数を血球計算盤で測定することで、プレート一枚当たりに形成された胞子数を算出するなどの方法などを挙げることができる。
【００２８】
また、本発明における総プロテアーゼ活性が上昇した株とは、醤油原料培地などにおいて親株に比べて総プロテアーゼ活性が１．１倍以上向上した株を指す。なお、総プロテアーゼ活性の測定方法としては、通常用いられている方法を利用することができ、たとえば「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所・編集発行）に記載の方法を用いることができる。
【００２９】
この様にして育種した麹菌を用いた麹の製法および当該麹を用いた調味料を製造する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、調味料として醤油を製造する場合においては、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に、上記のａｌｐＢ遺伝子の機能が欠損した麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ３〜６ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とすればよい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３１】
実施例１
（１）相同組換え法によるａｌｐＡ遺伝子破壊株およびａｌｐＢ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＡ、ａｌｐＢそれぞれの遺伝子破壊株の単離には、まず親株として、硫酸（硫黄源）を資化することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリゼーΔｌｉｇＤ株を用いた。なお、ΔｌｉｇＤ株は、公知文献（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ．４５（２００８）、８７８−８８９）に従い、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株（ＡＴＣＣ４２１４９）を元に作成された株である。また、マーカー遺伝子としては、硫酸（硫黄源）を資化する機能をもつアスペルギルス・ニドランスｓＣ遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９５ Ｍａｙ ２０；２４７（４）：４２３−４２９．）を用いた。
【００３２】
ａｌｐＡまたはａｌｐＢが相同組み換えによって欠損した株は、マーカーであるｓＣ遺伝子が導入されることによってΔｌｉｇＤ株の栄養要求性が回復していることから、硫黄源として硫酸塩だけが含まれる培地においても生育することができる。このことから、ａｌｐＡ、またはａｌｐＢ遺伝子破壊株を容易に単離することができる。
【００３３】
（１−１）ａｌｐＡ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＡ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＡ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＡ ＯＲＦ下流領域）までをプライマーＡとＢを用いてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡ライフサイエンス）を用い、条件は附属のプロトコルに従った。以下で行うＰＣＲ反応についても、同様の条件を用いた。該増幅産物をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターをプライマーＣとＤを用いて再度ＰＣＲ法により増幅し、増幅断片「い」を得た。
【００３４】
一方アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓＣ遺伝子領域をプライマーＥとＦを用いてＰＣＲ法で増幅し、増幅断片「ろ」を得た。２つの増幅断片「い」と「ろ」とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて融合することで、ａｌｐＡ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩ処理することで直鎖状のベクターとし、これをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。
【００３５】
選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継いでａｌｐＡ遺伝子破壊候補株を得た。これらの株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてａｌｐＡ遺伝子の増幅をＰＣＲ法でおこなった。ａｌｐＡ遺伝子が破壊されていた場合、ａｌｐＡ遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株を選抜してａｌｐＡ遺伝子破壊株を取得した。
【００３６】
なお、本明細書中において「トレースエレメント」とは以下に示した組成の水溶液のことを指す。
トレースエレメント組成：硫酸鉄七水和物０．１％、硫酸亜鉛七水和物０．８８％、硫酸銅五水和物０．０４％、硫酸マンガン四水和物０．０１５％、四ホウ酸ナトリウム十水和物０．０１％、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００５％。
【００３７】
使用したプライマーの配列を表１に示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（１−２）ａｌｐＢ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＢ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＢ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＢ ＯＲＦ下流領域）までをプライマー１と２を用いてＰＣＲ法により増幅した。該増幅断片をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターを制限酵素ＮｄｅＩサイト、ＳｐｈＩサイトを付加したプライマー３と４を用いて再度ＰＣＲ法により増幅した。増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで処理し、ａｌｐＢのＯＲＦ部分を欠損した直鎖状の配列（甲）を得た。
【００４０】
一方アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓＣ遺伝子領域をＮｄｅＩサイト、ＳｐｈＩサイトを付加したプライマー５と６を用いてＰＣＲ法で増幅した後、ｐＣＲＢｌｕｎｔベクターに導入し、ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩ処理し、ｓＣ領域断片（乙）を得た。甲と乙の各断片をＤＮＡリガーゼを用いて融合することで、ａｌｐＢ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩ処理して得られた直鎖状のベクターをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。
【００４１】
選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継ぎ、培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株のみを選抜してａｌｐＢ遺伝子破壊候補株とした。これらの株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてａｌｐＢ遺伝子の増幅をＰＣＲ法でおこなった。ａｌｐＢ遺伝子が破壊されていた場合、ａｌｐＢ遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株を選抜してａｌｐＢ遺伝子破壊株を取得した。
【００４２】
使用したプライマーの配列を表２に示した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
（２）作成した遺伝子組換え株の形質の確認
上記（１）で作成したアスペルギルス・オリゼーａｌｐＡ欠損株およびａｌｐＢ欠損株について、胞子形成能、生育および総プロテアーゼ活性を確認した。
（２−１）胞子形成能
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌を播種した。３０℃で７日間培養した後、０．０３％ツイーンを含む滅菌蒸留水２０ｍｌを加え、胞子を激しく縣濁し、ミラクロス（コスモバイオ社）でろ過することで、胞子縣濁液を得た。得られた胞子縣濁液の胞子数を血球計算盤で測定し、プレート一枚当たりに形成された胞子数を測定した。その結果、ａｌｐＡ遺伝子破壊株とは対照的に、ａｌｐＢ遺伝子破壊株はほとんど胞子を形成しないことが明らかとなった（表３）。なお表３中、ΔｌｉｇＤは親株、ΔａｌｐＡはａｌｐＡ遺伝子破壊株、ΔａｌｐＢはａｌｐＢ遺伝子破壊株をそれぞれ示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
（２−２）生育の確認
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌をプレートの中央に播種した。３０℃で２４時間おきにコロニーの直径を測定した。その結果、親株であるΔｌｉｇＤ株、ａｌｐＡ破壊株、ａｌｐＢ破壊株間で生育に差がないことが明らかとなった（図２）。
【００４７】
（２−３）製麹工程における胞子形成能の確認
脱脂大豆５ｇに８ｍｌの滅菌蒸留水を散水し、５ｇの割砕小麦を加えてよく攪拌し、４０分オートクレーブ処理を行った原料を醤油原料培地とした。該醤油原料培地１ｇ当たり、胞子数が１０6個となるように該麹菌の胞子を散布し、よく攪拌して、２８℃で４８時間程度培養した。結果、培養した麹では、胞子の形成はほとんど観察されなかった。
【００４８】
（２−４）総プロテアーゼ活性の測定
上記の麹に１４０ｍｌの冷水を添加しよく攪拌した後４時間放置し、これをろ紙でろ過し、酵素溶液を調整した。調整した酵素溶液を用いて総プロテアーゼ活性を測定した。測定には「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所）に記載の方法を用い、以下の手順で行った。
【００４９】
１．５％ミルクカゼイン溶液１ｍｌと蒸留水１ｍｌを試験管にとり、３０℃の恒温槽で５分間予熱した。５分後１ｍｌの酵素液を加え、１０分間反応を行った後、０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液３ｍｌを加え反応を停止した。さらに３０℃で３０分放置して、沈殿をろ紙で除いた後、ろ液２ｍｌを取り、０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎ試薬１ｍｌを加え３０℃で３０分反応させ、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。同様の方法で、チロシン標準液を用いて検量線を作成し、１分間にチロシン１μｇを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ａｌｐＡ破壊株は親株に比べて総プロテアーゼ活性が有意に低く、一方ａｌｐＢ破壊株は親株に比べて総プロテアーゼ活性が有意に高かった（表４、図３）。
【００５０】
【表４】
【００５１】
（２−５）まとめ
以上の結果より、ａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損させることによって、胞子形成能が著しく低く、しかも総プロテアーゼ活性が親株に比べて高くなっている所期の麹菌を得ることができることが明かとなった。なお、上記の特性は、多少の程度の差はあるものの、取得したａｌｐＢ破壊株すべてにおいて観察されたことから、ａｌｐＢ破壊に由来することが確認された。
【００５２】
実施例２
実施例１で選択したａｌｐＢ破壊株を使用して醤油を製造し、醸造特性を調べた。すなわち、脱脂大豆５ｋｇに１５０％散水し、２ｋｇ／ｃｍ2で１３分間加圧蒸煮後、４０℃に冷却したものに炒熬割砕した小麦４．８ｋｇを混合して粉合せ原料を得、これにａｌｐＢ破壊株を接種混合して小型通風製麹装置内で送風温度２８℃で２４時間、次いで２６℃で２０時間製麹して醤油麹を得た。
【００５３】
得られた麹１０ｋｇに２４．５％食塩水１５．３リットル（Ｌ）を加えて小型容器に仕込み、１５℃で１ヶ月、次いで３０℃で５ヶ月間発酵熟成させた。対照として、親株であるΔｌｉｇＤ株を用いて同様にして醤油諸味を得た。得られた諸味を濾紙濾過により、液汁と固形分に分け諸味液汁を得、諸味液汁を加熱処理して醤油を得た。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損した麹菌、および該麹菌を用いて麹または調味料を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
焼酎、清酒、みりん、味噌、醤油等の調味料の製造では、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）といった麹菌が用いられている。
【０００３】
麹菌は、各種酵素の生産に適しており、その用途に応じて、その各種酵素系の発現に適した製麹方法が採られている。例えば醤油の製造においては、蒸煮した穀類等の固体原料に麹菌の胞子を散布し、その表面で麹菌を増殖させることによって製麹を行っている。
【０００４】
麹の原料となる大豆、小麦、米の種類により、また、それらのα化度、水分量により、製麹中の温度、湿度、培養時間、手入れ条件、通風・換気条件等のさまざまな製麹条件を調整して、各種酵素を効率よく産生させるように管理するのが一般的である。
【０００５】
製麹過程において麹菌は、生育するに従い多量の胞子を着生するために、大量の胞子が空気中に飛散する。この飛散した胞子が調味料製造の作業環境を悪化させ、あるいは胞子が作業者の体内に入ることによってアレルギーを引き起こす原因物質となるおそれのあることは、従来問題とされてきた。
【０００６】
上記問題を解決するため、従来、集塵機を用いて胞子を空気と共に排除したり、密閉式ベルトコンベア内で麹に液体を散布するなど物理的な方法で飛散した胞子を除去する方法や、長毛の麹菌と短毛の麹菌をブレンドした種麹を用いて製麹することで分生子の着生を抑制する方法が報告されている（非特許文献１）。
【０００７】
しかしながら、麹の製造工程において多量の胞子が空気中に飛散する問題を解決する手段として、従来、飛散した胞子を大型換気扇、集塵機、密閉式のベルトコンベアや散水装置などの設備を用いて除去するなどの方法が知られてきたが、当該方法では、胞子を完全に除去することは不可能である上に、大型設備の導入や運転には多大なコストが必要であって、実用的な方法であるとは言えなかった。
【０００８】
また、長毛の麹菌と短毛の麹菌を混和して使用する方法についても、胞子の飛散を抑制することはできるものの、完全に防除することは困難であった。
【０００９】
一方、アスペルギルス・オリゼーなどの糸状菌は、ゲノム中にａｌｐＡ、ａｌｐＢと呼ばれる２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼをコードする遺伝子を保持することが知られており、糸状菌においてアルカリプロテアーゼ遺伝子を欠損させると、総プロテアーゼ活性が低下し、結果、当該糸状菌を用いて異種タンパク質を合成する際にもタンパク質の分解が生じないために、遺伝子組換え等によって目的のタンパク質を高収量に獲得できるような糸状菌を作製できることが報告されている（特許文献１）。
【００１０】
しかしながら、記載されている遺伝子の塩基配列の比較を行ったところ、上記文献に記載の麹菌は、２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼのうち、ａｌｐＡ遺伝子だけを欠損させたものであって、ａｌｐＢ遺伝子を欠損させた場合にどのような表現型を持つ糸状菌が得られるかついては、これまで全く知られていなかった。
【００１１】
本発明者は、ａｌｐＡ遺伝子の機能を欠損した麹菌株の様々な形質を検討したところ、実施例に詳述しているように、上記ａｌｐＡ欠損株は、親株と比較して胞子形成能がほとんど低下しておらず、また総プロテアーゼ活性も著しく低下しているものであり、醸造食品等の製造等に応用するには全く適さないものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０００−５０７１０６
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】日本醸造協会誌 Ｖｏｌ．９２ ８６０−８６７、１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このように、麹菌の胞子形成を抑制し、かつ調味料製造に影響を及ぼさない麹菌の育種に関しては、従来全く報告されていないのが現状である。そこで、本発明の目的は、製麹等の過程における麹からの胞子の飛散を効率的に抑制でき、かつ醸造食品の製造に適した麹菌を育種し、当該麹菌を用いた麹及び調味料の製造法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、麹菌の育種に関し、種々検討を重ねる過程で、麹菌ゲノム中の２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能のみを欠損させると、（１）ａｌｐＡをコードする遺伝子の機能を欠損させた場合とは全く異なって、親株よりも胞子形成能が著しく低下し、調味料製造の過程において胞子をほぼ飛散することがないこと、しかも（２）当該麹菌株は、全く意外なことに親株に比べて著しく高い総プロテアーゼ活性を有しており、調味料製造においても、原料の歩留まりの向上を期待できるなど、きわめて実用的な麹菌であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
したがって、本発明は以下の通りである。
【００１７】
（１） サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌。
（２） ゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌のａｌｐＢをコードする遺伝子のみを欠損させ、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜する方法で得られる、（１）記載の麹菌。
（３） 麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である（１）に記載の麹菌。
（４） （１）に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
（５） （１）に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の麹菌は、胞子形成能が著しく低下しており、食品の醸造工程において、大規模な設備の導入を行わずとも胞子の飛散をほぼ完全に抑制できる。一方で、当該麹菌は高い総プロテアーゼ活性をも有していることから、調味料の効率的な製造に寄与し、産業上の利用可能性が非常に高いものである。また、胞子を飛散させる事がないことから、固体培養による組換えタンパク質の大量発現などを行わせる際にも、組換え遺伝子を含む胞子を管理区域外に放散させる危険性がなく、宿主菌株として安全に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例で行ったａｌｐＢ遺伝子破壊ベクターの作成工程を模式的に表したものである。
【図２】図２は、育種した麹菌の生育速度を親株と比較した結果である。◆は親株、□はａｌｐＡ遺伝子破壊株、△はａｌｐＢ遺伝子破壊株における測定値を示す。
【図３】図３は、親株とａｌｐＡ破壊株（ΔａｌｐＡ）、ａｌｐＢ破壊株（ΔａｌｐＢ）それぞれの麹菌の総プロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ／ｍｌ）比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において親株として用いられる麹菌とは、そのゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌であれば、いずれも使用可能である。具体的には、焼酎、清酒、みりん、醤油、味噌等の調味料の製造に使用可能で、プロテアーゼ活性を有するアスペルギルス属に属する麹菌であれば特に限定はされず、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ等が好ましい。中でも特に好ましいのはアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤである。さらに、上記の麹菌株を親株として、人為的に改変された遺伝子組換え株、あるいは天然に存在する変異株なども用いることができる。
【００２１】
本発明において、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼをコードするａｌｐＢ遺伝子は、ゲノムデータベースＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）において定義される。すなわち、ＩＤがＡＯ０９０００３００１０３６である遺伝子がａｌｐＡ、ＡＯ０９００２００００５１７である遺伝子がａｌｐＢである。
【００２２】
本願発明における、サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌とは、相同組換えによる遺伝子破壊法または変異導入法によってａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が失われた麹菌株のことを指す。
【００２３】
相同組み換えによる遺伝子破壊法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、ａｌｐＢ遺伝子の断片もしくはその上流・下流の領域とマーカー遺伝子とを組み合わせたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、プロトプラスト−ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法などによってベクターを糸状菌に取り込ませ、相同組み換えによって当該ＤＮＡ断片を糸状菌のゲノム中に導入する方法などを挙げられる。ＤＮＡ断片を麹菌細胞中に取り込ませる他の方法としてはパーティクルガン法、アグロバクテリウム法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
【００２４】
相同組み換え法によって所期の遺伝子が麹菌に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法などが挙げられる。ただし、このような栄養要求性だけでは、目的とする遺伝子座が導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できない。従って、栄養要求性に合わせて適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。
【００２５】
また、変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、紫外線を照射させる方法を挙げることができる。
【００２６】
上記のような遺伝子破壊法、または変異導入法によってａｌｐＢ遺伝子に変異、もしくは欠損が生じ、胞子形成能が著しく低下した株をスクリーニングする方法としては、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜し、選抜した候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、シークエンス解析で確認する方法などを挙げることができる。他の方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法等を利用することができる。
【００２７】
本発明において、胞子形成能の著しく低下した株とは、親株に比べて胞子数が１／１０以下である麹菌株を指す。胞子数を測定する方法としては、たとえば胞子縣濁液を作成し、一定対数あたりの胞子数を血球計算盤で測定することで、プレート一枚当たりに形成された胞子数を算出するなどの方法などを挙げることができる。
【００２８】
また、本発明における総プロテアーゼ活性が上昇した株とは、醤油原料培地などにおいて親株に比べて総プロテアーゼ活性が１．１倍以上向上した株を指す。なお、総プロテアーゼ活性の測定方法としては、通常用いられている方法を利用することができ、たとえば「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所・編集発行）に記載の方法を用いることができる。
【００２９】
この様にして育種した麹菌を用いた麹の製法および当該麹を用いた調味料を製造する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、調味料として醤油を製造する場合においては、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に、上記のａｌｐＢ遺伝子の機能が欠損した麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ３〜６ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とすればよい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３１】
実施例１
（１）相同組換え法によるａｌｐＡ遺伝子破壊株およびａｌｐＢ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＡ、ａｌｐＢそれぞれの遺伝子破壊株の単離には、まず親株として、硫酸（硫黄源）を資化することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリゼーΔｌｉｇＤ株を用いた。なお、ΔｌｉｇＤ株は、公知文献（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ．４５（２００８）、８７８−８８９）に従い、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株（ＡＴＣＣ４２１４９）を元に作成された株である。また、マーカー遺伝子としては、硫酸（硫黄源）を資化する機能をもつアスペルギルス・ニドランスｓＣ遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９５ Ｍａｙ ２０；２４７（４）：４２３−４２９．）を用いた。
【００３２】
ａｌｐＡまたはａｌｐＢが相同組み換えによって欠損した株は、マーカーであるｓＣ遺伝子が導入されることによってΔｌｉｇＤ株の栄養要求性が回復していることから、硫黄源として硫酸塩だけが含まれる培地においても生育することができる。このことから、ａｌｐＡ、またはａｌｐＢ遺伝子破壊株を容易に単離することができる。
【００３３】
（１−１）ａｌｐＡ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＡ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＡ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＡ ＯＲＦ下流領域）までをプライマーＡとＢを用いてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡ライフサイエンス）を用い、条件は附属のプロトコルに従った。以下で行うＰＣＲ反応についても、同様の条件を用いた。該増幅産物をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターをプライマーＣとＤを用いて再度ＰＣＲ法により増幅し、増幅断片「い」を得た。
【００３４】
一方アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓＣ遺伝子領域をプライマーＥとＦを用いてＰＣＲ法で増幅し、増幅断片「ろ」を得た。２つの増幅断片「い」と「ろ」とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて融合することで、ａｌｐＡ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩ処理することで直鎖状のベクターとし、これをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。
【００３５】
選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継いでａｌｐＡ遺伝子破壊候補株を得た。これらの株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてａｌｐＡ遺伝子の増幅をＰＣＲ法でおこなった。ａｌｐＡ遺伝子が破壊されていた場合、ａｌｐＡ遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株を選抜してａｌｐＡ遺伝子破壊株を取得した。
【００３６】
なお、本明細書中において「トレースエレメント」とは以下に示した組成の水溶液のことを指す。
トレースエレメント組成：硫酸鉄七水和物０．１％、硫酸亜鉛七水和物０．８８％、硫酸銅五水和物０．０４％、硫酸マンガン四水和物０．０１５％、四ホウ酸ナトリウム十水和物０．０１％、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００５％。
【００３７】
使用したプライマーの配列を表１に示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（１−２）ａｌｐＢ遺伝子破壊株の作成
ａｌｐＢ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＢ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ａｌｐＢ ＯＲＦ下流領域）までをプライマー１と２を用いてＰＣＲ法により増幅した。該増幅断片をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターを制限酵素ＮｄｅＩサイト、ＳｐｈＩサイトを付加したプライマー３と４を用いて再度ＰＣＲ法により増幅した。増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで処理し、ａｌｐＢのＯＲＦ部分を欠損した直鎖状の配列（甲）を得た。
【００４０】
一方アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓＣ遺伝子領域をＮｄｅＩサイト、ＳｐｈＩサイトを付加したプライマー５と６を用いてＰＣＲ法で増幅した後、ｐＣＲＢｌｕｎｔベクターに導入し、ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩ処理し、ｓＣ領域断片（乙）を得た。甲と乙の各断片をＤＮＡリガーゼを用いて融合することで、ａｌｐＢ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩ処理して得られた直鎖状のベクターをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。
【００４１】
選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継ぎ、培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株のみを選抜してａｌｐＢ遺伝子破壊候補株とした。これらの株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてａｌｐＢ遺伝子の増幅をＰＣＲ法でおこなった。ａｌｐＢ遺伝子が破壊されていた場合、ａｌｐＢ遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株を選抜してａｌｐＢ遺伝子破壊株を取得した。
【００４２】
使用したプライマーの配列を表２に示した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
（２）作成した遺伝子組換え株の形質の確認
上記（１）で作成したアスペルギルス・オリゼーａｌｐＡ欠損株およびａｌｐＢ欠損株について、胞子形成能、生育および総プロテアーゼ活性を確認した。
（２−１）胞子形成能
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌を播種した。３０℃で７日間培養した後、０．０３％ツイーンを含む滅菌蒸留水２０ｍｌを加え、胞子を激しく縣濁し、ミラクロス（コスモバイオ社）でろ過することで、胞子縣濁液を得た。得られた胞子縣濁液の胞子数を血球計算盤で測定し、プレート一枚当たりに形成された胞子数を測定した。その結果、ａｌｐＡ遺伝子破壊株とは対照的に、ａｌｐＢ遺伝子破壊株はほとんど胞子を形成しないことが明らかとなった（表３）。なお表３中、ΔｌｉｇＤは親株、ΔａｌｐＡはａｌｐＡ遺伝子破壊株、ΔａｌｐＢはａｌｐＢ遺伝子破壊株をそれぞれ示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
（２−２）生育の確認
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌をプレートの中央に播種した。３０℃で２４時間おきにコロニーの直径を測定した。その結果、親株であるΔｌｉｇＤ株、ａｌｐＡ破壊株、ａｌｐＢ破壊株間で生育に差がないことが明らかとなった（図２）。
【００４７】
（２−３）製麹工程における胞子形成能の確認
脱脂大豆５ｇに８ｍｌの滅菌蒸留水を散水し、５ｇの割砕小麦を加えてよく攪拌し、４０分オートクレーブ処理を行った原料を醤油原料培地とした。該醤油原料培地１ｇ当たり、胞子数が１０6個となるように該麹菌の胞子を散布し、よく攪拌して、２８℃で４８時間程度培養した。結果、培養した麹では、胞子の形成はほとんど観察されなかった。
【００４８】
（２−４）総プロテアーゼ活性の測定
上記の麹に１４０ｍｌの冷水を添加しよく攪拌した後４時間放置し、これをろ紙でろ過し、酵素溶液を調整した。調整した酵素溶液を用いて総プロテアーゼ活性を測定した。測定には「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所）に記載の方法を用い、以下の手順で行った。
【００４９】
１．５％ミルクカゼイン溶液１ｍｌと蒸留水１ｍｌを試験管にとり、３０℃の恒温槽で５分間予熱した。５分後１ｍｌの酵素液を加え、１０分間反応を行った後、０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液３ｍｌを加え反応を停止した。さらに３０℃で３０分放置して、沈殿をろ紙で除いた後、ろ液２ｍｌを取り、０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎ試薬１ｍｌを加え３０℃で３０分反応させ、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。同様の方法で、チロシン標準液を用いて検量線を作成し、１分間にチロシン１μｇを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ａｌｐＡ破壊株は親株に比べて総プロテアーゼ活性が有意に低く、一方ａｌｐＢ破壊株は親株に比べて総プロテアーゼ活性が有意に高かった（表４、図３）。
【００５０】
【表４】
【００５１】
（２−５）まとめ
以上の結果より、ａｌｐＢをコードする遺伝子の機能を欠損させることによって、胞子形成能が著しく低く、しかも総プロテアーゼ活性が親株に比べて高くなっている所期の麹菌を得ることができることが明かとなった。なお、上記の特性は、多少の程度の差はあるものの、取得したａｌｐＢ破壊株すべてにおいて観察されたことから、ａｌｐＢ破壊に由来することが確認された。
【００５２】
実施例２
実施例１で選択したａｌｐＢ破壊株を使用して醤油を製造し、醸造特性を調べた。すなわち、脱脂大豆５ｋｇに１５０％散水し、２ｋｇ／ｃｍ2で１３分間加圧蒸煮後、４０℃に冷却したものに炒熬割砕した小麦４．８ｋｇを混合して粉合せ原料を得、これにａｌｐＢ破壊株を接種混合して小型通風製麹装置内で送風温度２８℃で２４時間、次いで２６℃で２０時間製麹して醤油麹を得た。
【００５３】
得られた麹１０ｋｇに２４．５％食塩水１５．３リットル（Ｌ）を加えて小型容器に仕込み、１５℃で１ヶ月、次いで３０℃で５ヶ月間発酵熟成させた。対照として、親株であるΔｌｉｇＤ株を用いて同様にして醤油諸味を得た。得られた諸味を濾紙濾過により、液汁と固形分に分け諸味液汁を得、諸味液汁を加熱処理して醤油を得た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌のａｌｐＢをコードする遺伝子のみを欠損させ、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜する方法で得られる、請求項１記載の麹菌。
【請求項３】
麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である請求項１に記載の麹菌。
【請求項４】
請求項１に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
【請求項５】
請求項１に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【請求項１】
サブチリシンリレーテッドプロテアーゼａｌｐＢをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡ中に２種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ（ａｌｐＡ、ａｌｐＢ）をコードする遺伝子を保有する麹菌のａｌｐＢをコードする遺伝子のみを欠損させ、麹汁培地上で胞子を形成せず白色のコロニーを形成する株を選抜する方法で得られる、請求項１記載の麹菌。
【請求項３】
麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である請求項１に記載の麹菌。
【請求項４】
請求項１に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
【請求項５】
請求項１に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−４６０９（Ｐ２０１１−４６０９Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４８３４８（Ｐ２００９−１４８３４８）
【出願日】平成２１年６月２３日（２００９．６．２３）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２３日（２００９．６．２３）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
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