βアミロイド前駆体タンパク質の構造およびプロセシングを調節する薬剤の同定のための方法
本発明はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰ）の切断を改変できる分子構造の大型のライブラリから薬剤をスクリーニングして発見するための方法を提供する。ＡＰＰの切断を変化させる本発明の方法により発見される薬剤は、アルツハイマー病の治療および予防のために使用できる。更にまた、方法はＡＰＰプロセシングのための条件と同じか同一である生理学的条件を可能にするインビボの系において実施される薬剤は、特にペプチド薬剤は、アルツハイマー病または他の何れかのアミロイド関連またはプリオン関連の疾患を治療するための、ペプチドミメティック、等配電子置換化合物、Ｄ−アミノ酸類縁体、または、非ペプチジル化合物に変換される。薬剤またはその誘導体は静脈内、非経腸、局所、除放性、鼻内または吸入の用途のために製剤できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００２年１１月４日出願の米国出願６０／４２４，０３１号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アルツハイマー病の神経病理学的特徴は、脳内の細胞外タンパク質付着物の蓄積である。これ等の付着物にはアミロイド含有プラークおよび血管壁内のアミロイドを含む。アミロイドプラークの主要成分はβ−アミロイド（Ａβ）と称される３９〜４２アミノ酸残基の自己凝集性ペプチドである。特にアルツハイマー病の家族型におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびプレセニリン（ＰＳ）ノ遺伝子ノ突然変異の発見の後、疾患を誘発する機序の理解がかなり進歩した。これ等の突然変異は脳内のＡβタンパク質の上昇した水準をもたらす（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ ８１：７４１−７６６，２００１）。
【０００３】
Ａβタンパク質は身体の大部分の組織に渡って発現される膜貫通タンパク質であるＡＰＰのタンパク質分解フラグメントである。図２はＡＰＰの構造、形成されるタンパク質分解フラグメントおよびこれ等のフラグメントを生成することがわかっているそれぞれのプロセシング酵素を示す。ＡＰＰタンパク質はα−セクレターゼ、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼを含む少なくとも３種の異なるプロテアーゼによりプロセシングされる。アミノ末端切断に関与するβ−セクレターゼは最近発見され、クローニングされた（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：５３７−５４０，１９９９）。このＢＡＣＥプロテアーゼはＡｓｐ−１およびＧｌｕ−１１で開始するＡβを優先的に放出する。ＡＰＰのカルボキシ末端を放出するγ−セクレターゼ切断は見かけ上はＡＰＰの予測される膜貫通ドメインにおいて起こる。γ−セクレターゼはタンパク質の複合体、最も重要なものはプレセニリン１であるタンパク質の複合体よりなる（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：２１７−２２４，２０００）。
【０００４】
β−およびγ−セクレターゼの切断により分泌された可溶性Ａβペプチドが生じる。ニューロンにおいては、僅か５％のＡＰＰ分子のみがＡβ発生経路を経由するのに対し、９５％のＡＰＰ分子はＡβの形成を抑制する非アミロイド原性経路を通じてα−セクレターゼによりプロセシングされる（Ｌａｍｍｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：３９２２−２９２７，１９９９）。より量が酢ｋなくより疎水性であるＡβ物質種であるＡβ１−４２は最近になってアルツハイマー病において観察される早期の病理学的変化に関連することがわかった。アルツハイマー病の家族型に関連する突然変異はＡβの細胞生産を増大させることがわかっている。即ちＡβペプチドは、Ａβがプロトフィブリル、フィブリルおよびその後のアミロイドプラークを形成するアルツハイマー病をもたらす病理学的過程における中枢的な分子である。即ち、Ａβの増大した生産または低減したクリアランスはアミロイドプラークの形成とその後のニューロン変性をもたらす過程を開始させる。最近の研究によれば、プロトフィブリルと称されるＡβの凝集物はニューロン死に寄与する毒性の実体であることが示唆されている（Ｇｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１４９１−１４９５，２００１）。従って、アルツハイマー病患者の脳におけるＡβペプチドを低下させる何れかの治療法は大きな臨床的価値を有すると考えられる。図１はアミロイドカスケードと称される過程としての疾患の現在の知見である。
【０００５】
タンパク質の構造、そして、結果としてタンパク質の活性またはそれが基質として機能する能力も修飾する分子（エフェクター）の発見は、タンパク質の内因的構造の性質および生体系における他の構造とどのように相互作用するかにより異なる。タンパク質機能はタンパク質のアミノ酸組成およびアミノ酸配列により決定される３次元構造に依存している。タンパク質はその構造に基づいて生体系中の他のタンパク質および構造、および、他の相互作用分子の構造により影響を受ける。タンパク質の構造は、タンパク質の活性または他のタンパク質による影響の受け易さを増大または低減する場合がある他の分子との相互作用（アロステリック相互作用）により変化する場合がある。例えばβ−セクレターゼの切断部位の近傍に位置するＡＰＰ突然変異の研究によれば、局所的なα−へリックス性は、恐らくはエンドプロテアーゼとその構造との直接の相互作用により切断効力に寄与していることが示唆されている（Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６０７５−６０７９，１９９２）。同様に、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異（Ｍｕｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：３４５−３４７）として発見されたＡＰＰのアミノ酸配列の変化が、ＡＰＰの構造を変化させ、そして、α切断部位におけるＡＰＰのプロセシングを増大させる。
【０００６】
ペプチドはタンパク質と相互作用してその構造、そして結果としてタンパク質の活性または他のタンパク質による影響の受け易さを変化させることができる構造である。構造的エフェクターとしてのペプチドは、極めて大きい構造的多様性を有するライブラリが組み換え法により容易に作成でき、そして好ましい表現型の挙動を発見する操作法を用いて容易にスクリーニングできることから、注目に値するものである。これ等のペプチドエフェクターはある構造が所望の構造的変化を誘発する有効性をバリデーションするために使用できる。ペプチド構造は例えば生物学的に安定で、血管脳関門を容易に通過し、そして経口製剤に適しているペプチドミメティック構造を設計し、開発するためのモデル化合物構造として使用できる。
【０００７】
タンパク質への特異的結合を介して細胞の家庭に影響するペプチド（本明細書においては「ペプチドエフェクター」とも称する）を発見するためのスクリーニング方法が開発されている。ランダムペプチドライブラリの利用は構造的に多様なペプチドの大きいライブラリを作成してスクリーニングするために開発された多くの方法により明らかにされている。化学的戦略のほかに、このような方法には生物学的発生に依存した系を含んでいる（例えばＳｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｎｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０，１９９０（ファージディスプレイ）；Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許５，６５８，７５４号（インビトロリボソームディスプレイ）；Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９，１９９２（ｌａｃリプレッサーノＣ末端上に発現されたランダムペプチド配列）；Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３６６−３７２，１９９５（Ｅ．ｃｏｌｉのフラゲリン上に発現されたチオレドキシンランダムペプチドライブラリ）；Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６９−２７２，１９９７（細菌の表面上に発現された反復ポリペプチド）；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ａｎｄ Ｈａｍｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１５：３８８−４０４，２００１（ｍＲＮＡディスプレイ）；Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５４６７−５４７３，２００１（采ディスプレイペプチドライブラリ）を参照）。最も最近では、Ｒｉｇｅｌ Ｉｎｃ．が哺乳類細胞において表現型の変化を改変するペプチドを発見するためのランダムペプチドライブラリのインビボの導入の利用を明らかにしている（例えばＫｉｎｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．２７７：３７５１２−３７５１８，２００２参照）。
【０００８】
しかしながら、現在の方法は細胞分泌経路において標的分子と相互作用するペプチドエフェクターの発見を可能にしておらず、従って、分泌経路を経由する移行の間のＡＰＰのプロセシングに影響するこのようなペプチドの発見には適していない。ＡＰＰと同様、ＡＰＰプロセシング酵素、例えばα−、β−およびγ−セクレターゼは分泌経路を通過し、そして細胞表面上にも存在する。一部の方法は原形質内において細胞内で小型のペプチドおよびポリペプチドをスクリーニングするために開発されているが（例えばＦｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−４６，１９８９；Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−６９，１９９２；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１３：３６６−７２，１９９５；国際特許出願ＷＯ９９／２４６１７；Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：５９１−９５，１９９９）；国際特許出願ＷＯ９８／３９４８３）参照）、ＡＰＰおよびＡＰＰプロセシング酵素のような分泌分子は大部分の他のシトゾル分子またはオルガネラと混合されないコンパートメント内に封鎖されている。このため、現在の方法はＡＰＰのネイティブの分泌環境を温存していない。
【０００９】
更にまた、現在の方法は細胞外の空間の内部で作用するペプチドを含む治療上有望な薬剤の効率的な発見を制約する種々の難点を有している。その結果、現在の方法はまた細胞表面上のＡＰＰのプロセシングに影響するペプチドの効率的な発見には適していない。従来のペプチドライブラリ（例えばファージディスプレイライブラリ、コンビナトリアルライブラリ、ペプチドミメティックライブラリおよび１ビーズ１構造のコンビナトリアルライブラリ）を使用するスクリーニング方法の大部分はインビトロでの標的への結合を示すのみである。正常な構造、活性、および何れかの必要な調節分子は、細胞外のタンパク質が精製されたりそのネイティブな細胞外環境から取り出されると、消失する場合がある。即ち、これ等の方法は相当するインビボの生物学的作用を有する細胞外標的に結合するペプチドを発見できない場合が多い。
【００１０】
ＡＰＰプロセシング酵素の切断活性に一般的に影響する薬剤を発見するよりはむしろ、ＡＰＰに特異的に結合してそのプロセシングを改変しＡβの量を低減する分子エフェクターを発見するスクリーニング方法が望まれている。酵素的経路の混乱を指向した現在の方法は、典型的には酵素系のスクリーニングに着目している。しかしながら、ＡＰＰプロセシング酵素は他の重要な生物学的課程に関与している。一般的にアルツハイマー病の危険性を低減するとしてもこれ等の酵素の活性を改変することは、他の有害な生物学的作用を誘発する場合がある。例えば、α−セクレターゼの活性を増大させるとＡβの遍在性が低下する。しかしながら、α−セクレターゼはアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、即ち血圧の調節物質の形成にも関与している（Ｐａｒｖａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１６８０−１６８５，１９９８）。α−セクレターゼの活性を増大させることは心臓疾患の危険性を増大させる血圧を上昇させる。
【００１１】
更にまた、細胞内経路のネイティブのシトゾル性の構成要素を温存しながら原形質において細胞内で小型ペプチドおよびポリペプチドをスクリーニングするために開発された方法は、該当する生理学的条件下では細胞外でＡＰＰプロセシングに影響するペプチドのスクリーニングを可能としない。真核細胞上において細胞外でペプチドライブラリ配列を発現させる他の方法も報告されているが（例えば米国特許６，１５３，３８０号；国際特許出願ＷＯ９８／３９４８３）、これ等の方法はなお未希釈の血液、血漿、血清または他の複合的な生物学的液体の存在下のような生理学的条件下ではＡＰＰとのペプチドの相互作用をスクリーニングできない。例えば１つの方法は、ランダム化されたペプチドを宿主細胞内に挿入し、そして、使用する融合構築物に応じて、細胞外または細胞内の細胞表面に局在化させるか、または、可溶性形態で分泌させる（米国特許６，１５３，３８０参照）。次にペプチドを、宿主細胞または他の細胞集団の表現型を改変するその能力について試験することにより、選択することができる。細胞外の相互作用に影響できるペプチドの発見を可能にするが、この方法はＡＰＰプロセシングに対してネイティブである生理学的条件を再現する試験条件の必要性に着目していない。分子のコンホーメーション、安定性、結合速度論的動態等を含むこのような条件はα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼのようなＡＰＰプロセシング酵素を含む他の細胞外巨大分子とのＡＰＰの正常な相互作用を維持するために重要である。
【００１２】
従って、ＡＰＰ分泌経路の分子および細胞の構成成分を温存し、そして、細胞外環境の複合的な生理学的条件を複製する条件下でＡＰＰプロセシングの分子エフェクターを発見するスクリーニング方法が必要とされている。ＡＰＰプロセシングに対してネイティブである複合的状態を維持することは非特異的な結合の事象を低減し、ネイティブの分子構造および速度論敵動態を保持し、そして、調節分子の存在を維持することから、開示した生理学的および分泌系のスクリーニングはＡβの生産を改変する薬剤を含むＡＰＰプロセシングを改変する薬剤をより発見しやすいといえる。
【００１３】
ＡＰＰプロセシングにおいて重要である分泌および細胞外の条件を温存するスクリーニング方法、並びにＡＰＰに特異的に結合するエフェクターを発見する方法の開発は、生理学的に該当する条件下、旨適特異性でＡβの量を低減する薬剤の発見を容易にすることにより、アルツハイマー病の治療のためのより効果的な薬剤および治療方法の発見を容易にするために必要とされている。本発明はこのような方法を提供し、それは本明細書に記載される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は一般的にβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変する薬剤を発見する方法に関する。１つの特徴において、方法は、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞に薬剤を接触させること、および、宿主細胞表眼上の改変されたＡＰＰプロセシングを検出してＡＰＰのプロセシングを改変する薬剤を発見することを含む。宿主細胞により発現されるＡＰＰプロセシング酵素は例えばα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼを包含する。検出されるＡＰＰプロセシングの壊変は例えば、アミロイドβ−タンパク質（Ａβ）の生産の低減をもたらすプロセシングである。更に改変されたＡＰＰプロセシングの結果として低減した生産を示すアミロイドβ−タンパク質はアルツハイマー病の増大した危険性に関連するＡβタンパク質、例えばＡβ１−３９、Ａβ１−４０および／またはＡβ１−４２であることができる。
【００１５】
ＡＰＰおよびＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞は例えば哺乳類宿主細胞であることができる。動物宿主細胞は内因性ＡＰＰおよびＡＰＰプロセシング酵素を発現する組み換え宿主細胞、または単離された宿主細胞であることができる。
【００１６】
特定の実施形態においては、改変されたＡＰＰプロセシングを検出することは宿主細胞の表眼上のＡＰＰフラグメントの少なくとも１つの物質種の相対的な存在または非存在を評価することを含む。評価されるＡＰＰフラグメントの物質種は例えばＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βまたはＡＰＰｓ−γを包含できる。ＡＰＰフラグメントの少なくとも１つの物質種の相対的な存在または非存在を評価することが、例えば、ＡＰＰフラグメントに特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーに宿主細胞を接触させること、および、結合した標識されたマーカーを検出することを含む。ＡＰＰフラグメントの存在または非存在を検出するためのマーカーは、例えばＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの所定のエピトープに結合する抗体であることができる。特定の実施形態においては、ＡＰＰフラグメントの相対的な存在または非存在を評価することが、ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異的な少なくとも２つの標識された抗体の検出シグナルの比を測定することを含む。宿主細胞の表面上の改変されたＡＰＰプロセシングの検出は、例えばフローサイトメーターまたはセルソーターの使用を含むことができる。
【００１７】
宿主細胞に接触させる薬剤は例えば小型分子または生体分子であることができる。特定の実施形態においては、宿主細胞と接触させる生体分子はペプチドである。薬剤は化合物ライブラリ、例えば組合せ化学ライブラリ、天然産物ライブラリまたはペプチドライブラリより得ることができる。薬剤はＡＰＰのアロステリックエフェクターであることができるｒ。
【００１８】
特定の実施形態においては、薬剤は実質的に生理学的な条件下に宿主細胞に接触させる。実質的に生理学的な条件は複合生物学的液体、例えば血液、血清、血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）の存在を包含することができる。
【００１９】
宿主細胞をペプチドと接触させる実施形態においては、ペプチドは例えばペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの転写および翻訳により生産することができる。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの長さは例えば約１８〜約１２０ヌクレオチド、２１〜約６０ヌクレオチドまたは約３６〜約６０ヌクレオチドであることができる。１つの実施形態においては、宿主細胞とのペプチドの接触は、宿主細胞内にペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することを包含する。発現ベクターが導入された宿主細胞は分泌経路内および細胞表面上においてペプチドを発現し提示する。
【００２０】
宿主細胞内に導入されるオリゴヌクレオチドは例えばオリゴヌクレオチドの大多数が異なるペプチドをコードする異なる配列を有するオリゴヌクレオチドインサートを含む発現ライブラリに由来するものであることができる。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドの配列はランダム化される。発現ライブラリはＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞に導入される。発現ライブラリを導入された宿主細胞は分泌経路内および細胞表面上において異なるペプチドを発現し提示する。特定の実施形態においては、異なるペプチドは実質的に生理学的な条件下で宿主細胞によりディスプレイされる。
【００２１】
別の実施形態においては、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞のサブセットを宿主細胞から選択する。この宿主細胞サブセットより、発現ライブラリのサブライブラリを発見し、サブライブラリにはＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードするオリゴヌクレオチド少なくとも１つが含まれる。
【００２２】
特定の実施形態においては、発現ライブラリが導入された宿主細胞は、異なるペプチドを提示する宿主細胞に関して富化することができる。宿主細胞は発現構築物中に選択可能なマーカーを含ませることにより富化することができる。発現構築物は例えばＶ５、ＦＬＡＧ、プロテインＡまたはチオレドキシンであることができる。マーカーの選択には例えば磁気ビーズ選択蛍光活性化細胞ソーティングが包含される。特定の実施形態においては、ペプチドを提示する細胞について富化された宿主細胞は高コピー数の異なるペプチドを発現できる。
【００２３】
１つの実施形態においては、ペプチドは提示分子との融合タンパク質としてディスプレイされる。提示分子は例えばＣＤ２４、ＩＬ−３受容体、プロテインＡまたはチオレドキシン等であることができる。融合タンパク質は更にマーカーエピトープ、例えばポリヒスチジン、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはｍｙｃ等を含むことができる。融合タンパク質はまたグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナルを含むことができる。
【００２４】
別の実施形態において、発現ライブラリは宿主細胞へのライブラリの導入よりも前に、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドについて予備富化（プレエンリッチ）されることができる。予備富化はファージの表面上のオリゴヌクレオチド配列によりコードされるペプチドを発現できるファージディスプレイベクター内に発現ライブラリを導入すること；ファージの表面上に異なるペプチドを発現すること；ＡＰＰに特異的に結合するペプチドを発現するファージ粒子のサブセットを選択すること；および、選択されたファージ粒子からオリゴヌクレオチド配列を回収すること；を包含することができる。予備富化された発現ライブラリはＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞内に導入することができる。予備富化されたライブラリが導入された宿主細胞は分泌経路内および細胞表面上においてＡＰＰ結合ペプチドを発現し提示する。改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞のサブセットは予備富化ライブラリを発現する宿主細胞から選択する。この宿主細胞サブセットより、予備富化された発現ライブラリのサブライブラリを発見し、サブライブラリにはＡＰＰのプロセシングを改変するＡＰＰ結合ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド少なくとも１つが含まれる。
【００２５】
本発明の性質および利点のこれ以上の理解については明細書の残余の部分を参照することにより明らかになる。
【００２６】
（特定の実施形態の記述）
本発明はβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変し、これによりβ−アミロイド（Ａβ）の生産を改変するペプチドおよび他の小型分子を含む分子および薬剤の発見のためのスクリーニング方法を提供する。提供されるスクリーニング法はＡβの生産に相関するプロセシング酵素切断部位における細胞内ＡＰＰの切断を増大または低減することができるエフェクター薬剤の発見を可能にする。これ等のスクリーニング方法はアルツハイマー病（ＡＤ）の原因として示唆されているα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼのようなＡＰＰプロセシング酵素の活性化における不均衡を是正または部分的に是正するＡＤの治療のための治療用分子の開発を促進することができる。
【００２７】
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書において使用する特定の用語の意味を説明することが本発明を更に理解するために有用である。
【００２８】
（定義）
「ＡＰＰプロセシング酵素」という用語は細胞の分泌経路（例えばトランスゴルジネットワークおよび分泌ベシクル）を経由する、または、細胞外の細胞表面上の通過の間にアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の翻訳後の修飾に関与するタンパク質分解酵素を指す。ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングは細胞により生産されるＡβの相対的量に影響する。ＡＰＰプロセシング酵素は例えばα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼを包含する。
【００２９】
「改変されたＡＰＰプロセシング」という用語は細胞により生産される１種以上のＡＰＰフラグメントの総大量の変化を指す。ＡＰＰフラグメントには例えばＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βおよびＡＰＰｓ−γが包含される（図２参照）。１種以上のＡＰＰフラグメントの総大量は生産されるＡβの量と創刊しているため、「改変されたＡＰＰプロセシング」は本明細書においては一般的に細胞により生産されたＡβの量の変化をもたらすＡＰＰプロセシングにおける変化も一般的に指している。
【００３０】
「薬剤」、「分子」および「化合物」という用語は、本明細書においては、同義語であり、そして一般的に、非共有結合相互作用、例えば水素結合、イオン結合、ファンデルワールス引力または疎水性相互作用を介して細胞の構成成分と構造的な相互作用をすることが潜在的に可能である分子を指す。例えば薬剤は最も典型的にはタンパク質、糖タンパク質および／または他の巨大分子との構造的相互作用のために必要な官能基、特に水素結合に関与する基を有する分子を包含する。
【００３１】
薬剤は小型の有機分子、例えば脂肪族炭素または環状炭素（例えば複素環または炭素環の構造および／または芳香族またはポリ亜炉な構造等）を包含できる。これ等の構造は１つ以上の官能基、例えばアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基で置換されていることができる。更にまた、これ等の構造は他の置換基、例えば炭化水素（例えば脂肪族、脂環族、芳香族等）、非炭化水素基（例えばハロゲン、アルコキシ、アセチル、カルボニル、メルカプト、スルホキシ、ニトロ、アミド等）またはヘテロ置換基（例えば非炭素原子原子、例えばイオウ、酸素または窒素を含むもの）を包含できる。
【００３２】
薬剤は生体分子も包含する。「生体分子」とは生体系の中に存在、および／またはこれにより生産されることができる分子並びにそのような分子から誘導された構造のクラスを指す。生体分子は典型的には例えばタンパク質、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類およびその誘導体、構造的類縁体またはその組み合わせを包含する。生体分子は１つ以上の官能基、例えばアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を包含できる。
【００３３】
薬剤は合成により、または生物学的に生産されるものを包含し、そして、組み換えにより生産された構造、例えばペプチド提示融合タンパク質を包含できる。「融合タンパク質」という用語は２つ以上の配列モチーフの組み換え組み合わせにより生産されるアミノ酸の重合体を指し、特定の長さの産物を指すものではなく；即ち、融合タンパク質はアフィニティー標識、例えば６−ヒスチジンに連結したペプチド配列を包含できる。
【００３４】
「エフェクター薬剤」または「分子エフェクター」という用語は、本明細書においては、他の巨大分子とのタンパク質の相互作用に影響する分子を指す。即ち「ＡＰＰプロセシングの分子エフェクター」とは、例えばＡＰＰまたはＡＰＰプロセシング酵素との相互作用を介してＡＰＰプロセシングを改変する分子を指す。
【００３５】
「特異的結合」という用語はある薬剤とＡＰＰの間の直接の相互作用を指す。薬剤とＡＰＰの間の相互作用は直接または間接の分析により検出できる。
【００３６】
「アロステリックエフェクター」という用語は、タンパク質に特異的に結合してそのコンホーメーションを変化させることにより、特定のタンパク質の活性または相互作用をを活性化または抑制するエフェクター薬剤を指す。即ち「ＡＰＰのアロステリックエフェクター」とはＡＰＰに特異的に結合し、１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素によるプロセシングが改変されるようにそのコンホーメーションを変化させる薬剤を指す。アロステリックエフェクターの特異的結合部位は本明細書においては「アロステリック部位」と称する。
【００３７】
「Ｎ末端短縮ＡＰＰ」という用語は本明細書においては、α−および／またはβ−セクレターゼ切断部位に対してＮ末端側の部位におけるＮ末端において短縮されているＡＰＰポリペプチドの形態を指す。これ等のＮ末端短縮型は、例えばＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害ドメインに対してすぐの３’側のヌクレオチド４５７から始まり、もう一方がヌクレオチド５５０にあるＡＰＰコーディング配列の領域によりコードされるポリペプチド、および、Ｎ末端官能基を除外するが、膜の外部のアミノ酸残基までのβ切断部位近傍のランダムコイル配列を含むより短い形態を包含する。
【００３８】
「宿主細胞」という用語は幾つかの手段により導入することができるエフェクター薬剤を試験するためのベヒクルとして機能できる細胞を指す。本発明に適する宿主細胞はＡＰＰおよび１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素、例えばα−、β−および／またはγ−セクレターゼを発現するものである。更にまた、本発明における使用に適する宿主細胞は典型的には動物細胞、特に哺乳類細胞である。宿主細胞はまた「組み換え宿主細胞」であることもできる。「組み換え宿主細胞」という用語は本明細書においては１つ以上の組み換えタンパク質、例えば組み換えＡＰＰおよび／または１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素を発現する宿主細胞を意味する。適当な宿主細胞はヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、ヒト神経芽細胞系統Ｂａ／Ｆ３、ＡＣ２（例えばＧａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｋｉｎｎａｉｒｄ，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ＲＥｓ．５：Ｓ１４５−Ｓ１５０（１９８６）参照）、Ｂ９、ＨｅｐＧ２、ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞を包含する。宿主細胞は幾つかの操作法の何れか１つにより導入される遺伝子ライブラリに対するレシピエントとして機能することができる。遺伝子ライブラリのレシピエントとして機能する宿主細胞はライブラリインサートを含有するベクターの複製および分離を可能にする場合が多い。しかしながら、特定の実施形態においては、複製および分離は意義を有さず；ライブラリインサートの発現のみが必要な全てである。
【００３９】
「遺伝子ライブラリ」という用語は個々が数塩基対〜約１００万塩基対の範囲の大きさを有する核酸フラグメントの集合体を指す。典型的には、本発明の範囲において使用する場合は、遺伝子ライブラリはペプチドまたはポリペプチドをコードするランダムまたは半ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは例えば約１０塩基〜約６０塩基の平均長を有することができる。特定の実施形態においては、ライブラリは細菌および／または哺乳類細胞のような特定の宿主細胞において増殖することができるベクター中のインサートとして含まれる。
【００４０】
「化合物ライブラリ」という用語は本明細書においては分子構造の複数を含む薬剤の何れかの集合体を指す。化合物ライブラリは例えば後に詳述する組合せ化学ライブラリ、天然産物ライブラリおよびペプチドライブラリを包含できる。特定の実施形態においては、ペプチドライブラリうは遺伝子ライブラリ内に含まれる核酸配列から転写および翻訳により発生させることができる。
【００４１】
「サブライブラリ」という用語は本発明による方法により単離されている化合物ライブラリまたは遺伝子ライブラリの部分を指す。
【００４２】
遺伝子ライブラリの範囲内における「インサート」という用語は単一のベクター（例えば発現ベクター）または発現構築物内に典型的にインサートされる個々の核酸フラグメントを指す。
【００４３】
遺伝子ライブラリの範囲内における「カバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）」という用語は遺伝子ライブラリの重複の量を指す。当業者の知るとおり、遺伝子ライブラリの重複はそのライブラリの核酸配列内に特定の配列が実際に存在する確率に一般的には関連している。カバレッジはライブラリインサート、例えばペプチドコードオリゴヌクレオチドの数を平均のインサートのサイズと掛け合わせ、ライブが示す核酸配列の総コンプレキシティーで割った比である。
【００４４】
「ベクター」という用語は非相同核酸のインサートを収容できる特定の宿主細胞において増殖することが可能な核酸配列を指す。典型的にはベクターはクローニング部位内に非相同核酸を挿入するようにインビトロで操作される。ベクターはウィルスベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは感染によるなど、安定または一過性の態様で宿主細胞に導入できる。
【００４５】
「発現ベクター」という用語は挿入された核酸を発現するように設計されたベクターである。このようなベクターは例えば１つ以上の以下に示す作動可能に関連したエレメント、即ち、核酸の挿入部位（例えばクローニング部位）の上流に位置するプロモーター、転写停止シグナル、翻訳停止シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含有することができる。発現ベクターはまた薬剤体制遺伝子（例えばハイグロマイシンまたはネオマイシン体制）のような選択可能なマーカーも包含することができる（例えばＳａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７−１５６（１９８４）参照）。発現ベクターはまたウィルス粒子内へのパッケージングのための配列も包含する。
【００４６】
「高コピー数」という用語はライブラリインサートによりコードされる少なくとも数百〜数千の分子の宿主細胞の細胞外表面上の発現を指す。
【００４７】
核酸の範囲における「発現」という用語はｍＲＮＡおよび／またはタンパク質内への核酸の転写および／または翻訳を指す。
【００４８】
「発現ライブラリ」という用語は発現構築物またはベクターの複数を指し、構築物またはベクターのコピーの大多数は遺伝子ライブラリに由来する核酸フラグメントのインサートを含有するものである。
【００４９】
「提示分子」という用語は融合タンパク質の一部としてペプチドまたはポリペプチドを辞するために使用できるポリペプチドを指す。
【００５０】
「安定な発現」という用語は本発明の方法を実施するために必要な程度長期にわたる期間の、宿主細胞における核酸配列の持続的存在および発現を指す。安定な発現は、宿主細胞染色体内への核酸の組み込みによるか、または、核酸を宿主（例えば発現ベクターまたは人工の染色体）内のその持続的複製および分裂を確保するエレメントをそれが保有するように、或は、選択条件下（例えば薬剤含有培地）で宿主細胞を生育することにより核酸の安定な発現が確保されるように核酸が選択可能なマーカー（例えば薬剤体制遺伝子）を含有するように、またはそれが宿主ゲノム内に組み込まれることになるウィルスゲノムとして導入できるように、操作することにより、達成できる。
【００５１】
「特異的結合」という用語はある薬剤とＡＰＰとの間の直接の相互作用を指す。薬剤とＡＰＰとの間の相互作用は直接または間接の分析のいずれかにより検出できる。
【００５２】
「生理学的条件」および「実質的に生理学的な条件」という用語は、細胞外空間内、細胞外表面上（例えば細胞膜上）、ゴルジネットワーク、分泌小嚢内、および／または複合生物学的液体内において、正常に存在するか、または、正常に存在するものに実質的に近似している条件を指す。例えば「実質的に生理学的な条件」は細胞外の標的が活性であるかその活性（例えば酵素活性、受容体、基質、スカホールド分子または他の結合相手への結合等）を発現する場合に存在するものである。
【００５３】
「複合生物学的液体」という用語は生体の液体、例えば自系（即ち同じ動物に由来）、相同（即ち同じ種の動物に由来）または非相同（即ち異なる種に由来）の血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）等を指す。複合生物学的液体は未希釈または実質的に希釈されていることができる。「実質的に未希釈の複合生物学的液体」という用語は未希釈であるか、または、典型的には約５０％濃度以上に生理学的緩衝液中に希釈されている複合生物学的液体を指す。実質的に未希釈の複合生物学的液体、即ち未希釈の液の約５０％濃度以上のものは、未希釈の液とほぼ同じ絶対濃度の溶液中に、実質的に同じイオンの組成および濃度、および、実質的に同じ巨大分子の構造を有する。
【００５４】
「形質転換」または「トランスフェクション」という用語は、レシピエント（例えば宿主）の細胞内に核酸を導入する過程を指す。これは典型的にはレシピエント細胞の表現型の変化により検出される。「形質転換」という用語は一般的には微生物に適用され、「トランスフェクション」は多細胞生物に由来する細胞におけるこの過程を指すために使用する。
【００５５】
「感染する」または「感染された」という用語はウィルスベクターを用いることによりレシピエント（例えば宿主）細胞内に核酸を導入する過程を指す。
【００５６】
「フローソーター」という用語は細胞または他のオブジェクトから生じる光発射強度を分析し、そして、光発射強度のようなパラメーターに従ってこれ等の細胞または他のオブジェクトを分離する装置を指す。適当なフローソーターは例えば蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）、分光光度計、マイクロ滴定プレートリーダー、電荷結合デバイスカメラおよびリーダー、蛍光顕微鏡または同様の装置を包含する。
【００５７】
フローソーターの範囲における「高輝度（ｂｒｉｇｈｔ）」および「低輝度（ｄｉｍ）」という用語は特定の細胞により示される傾向（または光発射の他の様式）の強度の水準を指し；高輝度の細胞は細胞の多数集団に対して相対的に高い強度の発射、そして推定により高い水準のレポーターを有し；低輝度の細胞は細胞の多数集団に対して相対的に低い強度の発射、そして推定により低い水準のレポーターを有する。
【００５８】
「ビーズ選択」という用語は細胞の混合物から細胞を選択的に除去するためのビーズの使用を指す。ビーズは抗体または他の結合相手のような巨大分子を包含する。特定の実施形態においては、ビーズ選択は誘導された磁気ビーズを使用する。例えば、細胞表面上にＦＬＡＧエピトープを発現する細胞は、抗ＦＬＡＧ抗体でコーティングされた磁気ビーズ上で予備選択できる。次に磁気ビーズを強磁場を用いて収集することができる。
【００５９】
（宿主細胞系統の選択／樹立）
本発明のスクリーニング法で使用する宿主細胞は、ＡＰＰおよびα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼのようなＡＰＰプロセシング酵素１つ以上の両方を発現する。宿主細胞はＡＰＰおよび／または少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を内因的に発現する単離された細胞であることができる。更に、宿主細胞はＡＰＰの組み換え型、例えばＮ末端短縮ＡＰＰおよび／または１つのタンパク質酵素の少なくとも１つの組み換え型を発現する組み換え宿主細胞であることができる。従って宿主細胞は１つのこのようなＡＰＰまたは酵素に関して内因性の発現を示す一方で、別のこのような分子に関して「組み換え宿主細胞」であることができる。
【００６０】
本発明の１つの例示的実施形態においては、宿主細胞はＡＰＰに関して組み換え体であり、そして内因性のα−セクレターゼ、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼを含有する。ＤＮＡコードＡＰＰは例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｒｏｇｄａｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＩＭＡＴ）より入手でき、或は、当該分野で知られた方法、例えばＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列分析評価により得ることができる。ｃＤＮＡは例えば哺乳類発現ベクター内に挿入し、そして、知られた方法、例えばエレクトロポレーションを用いて親哺乳類細胞系統（例えば神経芽細胞系統またはヒト胚腎細胞系統（ＨＥＫ））にトランスフェクトする。これ等の細胞系統のＡＰＰ発現は、当該分野で知られた方法、例えば蛍光顕微鏡観察または抗ＡＰＰ抗体を用いたＦＡＣＳ分析により評価することができる。例えば、種々のＡＰＰフラグメントに対する抗体が知られており、例えばＡＰＰｓ−β（例えばＡＰＰ中央領域に特異的なＡ３または１Ｇ７、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７３８６−１７３８９，１９９４）、ＡＰＰｓ−α（例えば６Ｅ１０、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２、ＡＰＰｓ−αのカルボキシ末端またはβおよびα切断部位の間のＡＰＰ領域に特異的）およびｐ３（例えば４Ｇ８、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）が挙げられる。
【００６１】
別の実施形態においては、これ等の細胞を次に、各発現ベクターがＡＰＰプロセシング酵素１つ以上をコードする１つ以上の発現ベクターにトランスフェクトする。例えば１つがα−セクレターゼをコードし、もう一方がβ−またはγ−セクレターゼをコードする２種の個別の発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。セクレターゼをコードするＤＮＡは、例えばＡＴＣＣまたはＩＭＡＴから入手でき、或は、当該分野で知られた方法、例えばＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列分析評価により得ることができる。
【００６２】
（化合物ライブラリ）
本発明の１つの実施形態において、ＡＰＰプロセシングを改変するエフェクター薬剤をスクリーニングするために化合物ライブラリを宿主細胞に接触させる。化合部ライブラリは例えば薬学的研究の過程において合成された化合物の歴史ｈ的収集物；推論的設計（一般的にはＣｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔ．３０５−３１６，１９９８；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１２：５９７−６０４，１９９８参照；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、例えばコンビナトリアル化学（組合せ化学ライブラリの説明は下記参照）により作成された化合物誘導体のライブラリ；天然産物ライブラリ（例えば細菌、藻類、真菌、コウボ、カビ、種々の植物または植物の部分、動物の体液、分泌物等から誘導した複合的抽出物を含むライブラリ；このようなライブラリは例えば薬学的研究の過程において形成されたものを含むことができる）；ペプチドライブラリ（ペプチドライブラリの説明は下記参照）等から作成することができる。
【００６３】
組合せ化学ライブラリ：別の実施形態においては、かごうぶつライブラリは組合せ化学ライブラリの合成により作成できる（一般的にはＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９−６９１３，１９９３；国際特許出願ＷＯ９４／０８０５１；Ｂａｕｍ，Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ，７２：２０−２５，１９９４；Ｂｕｒｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０２７−６０３１，１９９５；Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５５８８−５５８９，１９９５；Ｎｅｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：４７２３−４７２４，１９９４；Ｂｏｒｅｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３７３−３７４，１９９４；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０９９２−１０９２６；およびＬｏｎｇｍａｎ，Ｗｉｎｄｈｏｖｅｒ’ｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔｈｅ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔ １２：２３−３１，１９９４参照；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００６４】
以下の文献、即ち、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４３１−１４３６，１９９５；Ｄｏｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：９７３−９８０，１９９４；Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８３：１０８５−１１００，１９９４は原料分子の選択の方法および／またはその選択において使用する基準を記載しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。コンビナトリアルライブラリの作成方法は当該分野で知られており、以下の文献、即ち米国特許５，９５８，７９２；５，８０７，６３８；６，００４，６１７；６，０７７，９５４号を包含し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６５】
「コンビナトリアルライブラリ」は収集物の化合物がサブユニットの１つ以上の型よりなるような化合物の収集物である。サブユニットは天然および非天然の部分、例えばジエン、芳香族またはポリ芳香族化合物、アルカン、シクロアルカン、ラクトン、ジラクトン、アミノ酸等から選択できる。コンビナトリアルライブラリの化合物は化合物を含むサブユニットの数、順序、型またはその１つ以上に対して行われた修飾の種類に関して１つ以上の態様において異なっている。或は、コンビナトリアルライブラリは「コア分子」の収集物ということもでき、これ等は、それらが含むＲ基の数、型または位置および／またはコア分子を構成する分子自体において異なる。化合物の収集物は典型的には系統的な方法で発生させる。上記した態様の１つ以上において相互に異なる化合物の収集物を発生させる方法はコンビナトリアルライブラリであることができる。
【００６６】
コンビナトリアルライブラリは１つ以上の固相結合樹脂原料から固相上で合成できる。ライブラリは相互に異なる有機性分子１０個以上、典型的には５０個以上を含む（即ち１０種の異なる分子であり、同じ分子の１０コピーではない）。異なる分子（異なる基本構造および／または異なる置換基）の各々はその存在が何らかの手段で測定できる（例えば結合相手または適当なプローブを用いて単離、分析、検出できる）ような量で存在する。その存在が測定できるために必要な各々の異なる分子の実際の量は使用する操作法により異なる場合があり、そして単離、検出および分析の技術が進歩するに従い変化する場合がある。分子が実質的に等モル量で存在する場合は、例えば１００ピコモル以上の量を検出できる。典型的なライブラリは実質的に等モル量の各々の望ましい反応産物を含み、典型的には何れかの所定の分子を比較的に大量または少量含むことはなく、これにより、何れかの試験において、そのような分子の存在が優勢になるか、または完全に抑制されるようにする。
【００６７】
コンビナトリアルライブラリは一般的には固相支持体（例えばビーズ）上に原料化合物を誘導することにより作成される。一般的に、個体支持体はＲｉｎｋまたはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒｅｓｉｎのような市販の樹脂結合物である。原料化合物の結合の後、置換基を原料化合物に結合させる。例えば芳香族（例えばベンゼン）化合物はＲｉｎｋ樹脂を介して支持体に結合できる。芳香族環は置換基（例えばアミド）と同時に反応させる。置換基を原料化合物に添加し、置換基を添加するための反応体の混合物を準備することにより変動できる。適当な置換基の例は、例えば以下のものである。
【００６８】
（１）炭化水素置換基、即ち、脂肪族（例えばアルキルまたはアルケニル）、脂環族（例えばシクロアルキルまたはシクロアルケニル等）置換基、芳香族、脂肪族および脂環族置換芳香族核等、並びに環状置換基；
（２）置換された炭化水素置換基、即ち、主に炭化水素の置換基を改変しない非炭化水素基を含む置換基；当業者の知る基（例えばハロ（特にクロロおよびフルオロ）、アルコキシ、メルカプト、アリールメルカプト、ニトロ、ニトロソ，スルホキシ等）；
（３）ヘテロ置換基、即ち主に炭化水素特性を有しながら炭素原子以外を含む置換基。適当なヘテロ原子は当業者の知るもの、例えばイオウ、酸素、窒素であり、そして置換基はピリジル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル等。
【００６９】
天然産物ライブラリ：本発明の別の実施形態においては、化合物ライブラリは天然産物ライブラリである。天然産物ライブラリは例えば多様な天然産物原料に由来する天然産物のライブラリ（例えば薬学的研究の過程において蓄積された天然産物）、或は、単一の天然産物原料に由来する化合物の収集物（例えば微生物、植物、動物の体液または他の生物学的材料、例えば土壌または泥炭に由来する１つ以上の溶解物、ホモジネートまたは化学抽出液）であることができる。
【００７０】
１つの実施形態において、天然産物ライブラリを作成するための原料は泥炭材料である。これ等の材料は一般的には極めて多数の種類の化合物を含有する。１つの特定の実施形態において、天然産物ライブラリは米国ワシントン州のボナパルト湖近傍の泥炭地であるボナパルト低地から得られる泥炭材料に由来する（米国特許６，２５７，９６２号参照）。特定の用途のための泥炭材料の使用とスクリーニングに関する操作法は当該分野で一般的に知られている（例えば米国特許６，２６７，９６２号および６，３６５，６３４号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば材料の抽出および分画の一般的な方法の１つでは、まずエタノールに曝露して非極性〜極性の広範な種類の特性を有する分子を抽出する。その後の画分には、例えば酸性化またはアルカリ性かされ例えばクロロホルムを用いた相分離に付されたものが包含される。得られた画分を例えばシリカゲルクロマトグラフィーおよび／または逆相ＨＰＬＣにより更に分画で切る。所望の画分が得られた後、これを例えば標準的な操作法を用いて緩衝液交換し、使用する特定のスクリーニング法に従ったその使用を容易にすることができる。
【００７１】
ペプチドライブラリ：１つの実施形態において、化合物ライブラリはペプチドライブラリである。一般的に約４アミノ酸〜約１００アミノ酸の大きさの範囲のペプチドを使用することができ、約６または７〜約４０のペプチドが典型的であり、約７〜約２０がより典型的である。
【００７２】
特定の実施形態においては、ライブラリは合成ペプチドを含むことができる。例えば長さＮ（Ｎは正の整数）の全ての可能なアミノ酸配列を提示する合成ペプチドの集団、または全ての可能な配列のサブセットがペプチドライブラリを校正することができる。このようなペプチドは当該分野で知られた標準的な科学的方法（例えばＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１，１９８４；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｅｄ，ＩＬ，（１９８４）参照）、例えば自動ペプチド合成器により合成できる。更にまた所望により非伝統的なアミノ酸または化学アミノ酸類縁体もまた伝統的なアミノ酸の大体として、またはそれに加えて使用することができる。非伝統的アミノ酸は例えば一般的なアミノ酸のＤ異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルギロシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、セレノシステイン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸および全般的にアミノ酸類縁体である。更にまた、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることができる。
【００７３】
他の実施形態においては、ペプチドライブラリは核酸配列のライブラリから転写および翻訳により生産できる。１つの例示的実施形態において、ライブラリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを宿主細胞内に導入する（後記のＧｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｉｎｆｒａ）。
【００７４】
（遺伝子ライブラリ）
本発明の１つの特徴において、スクリーニング法はＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する宿主細胞内に発現ライブラリを導入することを包含する。
【００７５】
本発明の遺伝子ライブラリは少なくとも部分的に異種核酸フラグメントの収集物を含む。このような核酸フラグメントは例えば合成ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、異種ＲＮＡ等を包含できる。核酸フラグメントは例えばゲノムのような核酸の集団、ｍＲＮＡの集団、または目的の核酸配列を含有する核酸の何らかの他のセットの全部または一部であることができる。遺伝子ライブラリは操作することができる形態の配列を含有する。
【００７６】
本発明は典型的には合成ＤＮＡから、または、特定の生物のゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡのフラグメントから誘導した遺伝子ライブラリを使用する。このようなライブラリ配列は典型的には約１０塩基〜約１０キロ塩基の範囲である。ライブラリ配列は場合により例えば平均長約１０塩基〜約６０塩基のオリゴヌクレオチドであることができる。
【００７７】
合成ＤＮＡの作成方法は当該分野で知られている（例えばＧｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９８）参照）。ランダムに共有されているゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡの作成およびこのようなＤＮＡの操作の方法は当該分野でよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１９；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）；参照によりその本明細書に組み込まれる）。ライブの構築、操作および維持に関する詳細も当該分野で知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。
【００７８】
一部の特徴において、ライブラリは合成核酸フラグメントより作成する。例えば長さＮ（Ｎは正の整数）の全ての可能な配列を提示する合成ペプチドの集団、または全ての可能な配列のサブセットがライブラリのための核酸であることができる。長さＮの全ての可能なアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドの集団、または、全ての可能な配列のサブセットもまたライブラリのための核酸であることができる。或は、半ランダムライブラリも使用できる。例えば半ランダムライブラリは宿主細胞のコドン使用の優先性に従って、または、コードされたアミノ酸配列における翻訳停止コドンの包含を最小限にするために設計することができる。後者の例として、各コドンの１位において、等モル量のＣ、ＡおよびＧおよび半モル量のＴを使用する。２位においては、Ａを半モル量で使用し、Ｃ、ＴおよびＧを等モル量で使用する。３位においては、等モル量のＧおよびＣのみを使用する。
【００７９】
合成オリゴヌクレオチドは場合により何れかの適当なシス調節配列、例えばプロモーター、翻訳開始コドン、翻訳停止シグナル、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナル、クローニング部位（例えば制限酵素部位または粘性末端）、エピトープをコードする配列および／またはプライミングセグメントを含むことができる。例えばライブラリはＡＴＧ開始コドン、Ｎヌクレオチドのランダムまたは半ランダム配列、翻訳停止コドン、プライマー結合部位に作動可能に会合した一端の近傍の制限酵素部位、および、もう一端における制限酵素部位を有するＤＮＡフラグメントを包含できる。このようなフラグメントの収集物は発現構築物内、ベクター内、発現ベクター内等に直接ライゲーションすることができる。フラグメントは１本鎖または２本鎖のＤＮＡとして、そしてセンスまたはアンチセンス鎖の何れかとして導入できる。当業者の知るとおり２本鎖核酸は例えば相補１本鎖核酸を共にアニーリングすることにより、または、相補プライマーを核酸にアニーリング氏、次にポリメラーゼおよびヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドトリホスフェート）を添加して２本鎖核酸を形成することにより、形成することができる。２本鎖核酸はまた５’および３’オーバーハンギング末端を有する部位内に１本鎖核酸（例えばＤＮＡ）をライゲーションし、次にポリメラーゼおよびヌクレオチドトリホスフェートで部分的に１本鎖の核酸をフィルインすることにより形成することもできる。オリゴヌクレオチドの操作およびクローニングの詳細は当該分野でよく知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。
【００８０】
ライブラリは最も典型的にはライブラリ配列の核酸の可能な順列を超過するカバレッジを有する核酸を含む。例えば、ライブラリは約５倍核酸配列の可能な順列を超過する核酸の数を含むことができるが、より大量または少量のランダム性も本発明の範囲に包含される。ライブラリの構築、操作および維持に関する操作は当該分野でよく知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。
【００８１】
例示的実施形態において、ライブラリは当該分野で知られた方法を用いて胃可能操作法に従って作成する。２本鎖ＤＮＡフラグメントをランダムまたは半ランダムな合成オリゴヌクレオチド、ランダムに切断されたゲノムＤＮＡおよび／またはランダムに切断されたｃｄＮＡ化から作成する。これ等のフラグメントを必要に応じて酵素で処理することにより、その末端の修復、および／または発現ベクター内のクローニング部位に適合する末端の形成を行う。発現ライブラリを適当な宿主系統、例えばＥ．ｃｏｌｉ系統に導入し、そしてクローンを選択する。個々のクローンの数は典型的には原料の可能な順列の合理的なカバレッジを達せいするために十分なものである。クローンをあわせ、大量培養またはプール中に生育させ、レジデントベクターおよびそのインサートの単離に付す。この工程により大量の発現ライブラリを本明細書に記載するその後の操作法のための準備において得ることができるようになる。
【００８２】
（発現カセットおよびベクター）
別の特徴において、発現カセットおよび／またはベクターをっ用いて発現ライブラリの配列によりコードされるペプチドおよび／または融合タンパク質を発現する。多くの発現カセットおよびベクターが当該分野で知られており、それらは容易に入手できる（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。これ等のカセットおよびベクターの一部は特定の細胞型における使用のために専用となっており、一部は広範な種類の細胞型に使用できる。哺乳類細胞においては、ウィルス転写調節エレメントはライブラリ配列のような外因性コーディング配列の発現を駆動するための典型的な選択肢となっている。発現カセットまたはベクターは発現ベクターおよび／または発現ライブラリを含有する宿主細胞を発見するための選択可能なマーカー１つ以上を含むこともできる。
【００８３】
ペプチドの発現を行うためには、発現カセットは例えば転写の方向に関して５’から３’の方向に、ライブラリ配列の挿入のためのクローニング部位に作動可能に会合しているプロモーター領域および場合により転写停止領域を包含でき、これは場合によりポリアデニル化（ポリＡ）配列を有する。発現カセットは場合ｂによりリボソーム結合配列、翻訳化医師コドンおよび／または転写停止コドンを包含できる。分泌シグナルおよび／または細胞表面に発現タンパク質の固定されるためのドメインは典型的には隣接するクローニング部位に包含される。
【００８４】
適当な分泌シグナルは例えばＣＤ２４由来のものである。適当な細胞表面固定設置ドメインは例えばグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定または膜貫通ドメイン（例えばＣＤ２４、ＩＬ−３受容体の膜貫通ドメイン等）を包含する。
【００８５】
特定の型の宿主細胞内のライブラリ配列の発現を行うためには、ライブラリインサートの頑健で高度または中高度の発現を与えることができるプロモーターが好ましい。適当なプロモーター配列は例えばエンハンサーおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩ）に結合できるＴＡＴＡボックス配列を包含できる。プロモーターは構成的に活性である（例えばウィルスプロモーター）か、または誘導できるものである。誘導プロモーターは、ライブラリセ系の制御された発現が望まれる場合、および／またはペプチド配列および／または融合タンパク質の発現または過剰発現に関連する毒性の副反応を回避するために使用できる。適当な誘導プロモーターは例えばインターフェロン誘導プロモーター系、３’−５’ポリ（Ａ）シンターゼに対するプロモーターまたはＭｘタンパク質（例えばＳｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０３：１４４−１４８，１９９４）、ＨＬＶ−ＬＴＲ、メタロチオイネンプロモーター（例えばＨａｓｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：８５７２−８５７６，１９８５）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０，１９８１）、ラウス肉腫ウィルスの３’長末端リピートに含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１４４１−１４４５，１９８１）等を包含する。
【００８６】
他の適当なプロモーターは高度または合理的に高度な水準で発現されるハウスキーピング遺伝子から誘導することができる。例えばβ−アクチンのプロモーターは高発現に有用である（例えばＱｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：３５５−３６０，１９９３）。同様に、サイトメガロウィルスプロモーターおよび翻訳伸長因子ＥＦ−１αプロモーターは発現に有用な他の強力なプロモーターである。一般的に、適当なプロモーター、例えばハウスキーピングまたはウィルス遺伝子プロモーターはよく知られた分子遺伝子的方法を用いて発見できる。
【００８７】
特定の実施形態においては、クローニング部位は翻訳停止配列の１つ以上に隣接しており、これにより何れかの得られる発現されたペプチドの長さがライブラリ配列のコーディング領域と実質的に同様になる。本明細書においては「実質的に同じ長さ」という表現は、発現されたペプチドの長さがライブラリ配列内のコーディング領域の長さに相当し、そして、更に例えば開始コドンに相当するメチオニン残基、コーディング領域内のリンカー核酸から生じる何れかの別のアミノ酸、翻訳または翻訳後の修飾、エピトープ１つ以上などを更にコードすることができることを意味する。
【００８８】
一部の実施形態においては、クローニング部位はマーカーエピトープによりフランキングされている。適当なマーカーエピトープは例えばＸｐｒｅｓｓ（商標）リーダーペプチド（Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、配列番号１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｍｙｃエピトープ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ、配列番号２：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖ５エピトープ（Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ；配列番号３）、ＦＬＡＧタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ｌｙｓ、配列番号４；（例えばＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０５−１２１０，１９８８参照）、ｌｅｘＡタンパク質、チオレドキシン、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン等を包含できる。
【００８９】
例示的実施形態において、発現されたペプチド配列に別の構造を付与するために、発現されたペプチドが末端にシステイン残基を含むようにシステインをコードする配列によりクローニング部位をフランキングすることができる。
【００９０】
特定の実施形態においては、、クローニング部位はペプチドの細胞外ディスプレイのための融合タンパク質のコーディング領域に会合している（「提示分子」とも称する）。このような融合タンパク質は例えば（１）宿主細胞内または宿主細胞表面上に存在する相同タンパク質ドメイン、タンパク質フラグメントまたはタンパク質、および／または（２）別の型の細胞に由来する非相同のタンパク質ドメイン、タンパク質フラグメントまたはタンパク質を包含できる。融合タンパク質の選択は宿主細胞の型、融合タンパク質の安定席、発現されるペプチドの所望のコンホーメーション（例えば制約または非制約型）により異なる。提示分子は典型的にはシグナル配列および膜貫通ドメインを包含する。
【００９１】
提示分子はＮ末端またはその近傍、Ｃ末端またはその近傍または提示分子の内部においてペプチドを提示することができる。例示的実施形態においては、提示分子はＮ末端のペプチドをディスプレイし、そして提示分子のＣ末端部分は膜貫通ドメインまたはＧＰＩ固定により細胞膜に固定を置かれる。提示分子はペプチドとＡＰＰとの間の特異的結合のための適切な立体的方向を達成する可能性を向上させるために宿主細胞表面から種々の距離にペプチドを位置づけるように修飾できる。更にまた、スペーサー（例えばグリシンスペーサー）を提示分子とペプチドとの間に含めることにより柔軟性を付与し、そして、ＡＰＰまたはＡＰＰプロセシング酵素のペプチドの相互作用を含む細胞外の空間内、または、分泌経路内におけるペプチドの相互作用による提示分子からの立体障害を最小限にすることができる。このようなスペーサーはまた細胞表面に柔軟性を付与するために、提示分子と際病表面固定設置ドメインとの間に含めることができる。
【００９２】
適当な提示分子は例えばリンパ球抗原ＣＤ２０、修飾ＩＬ−３受容体、ＣＤ２４（例えばＰｏｎｃｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）９１：４００−４０，１９９６）、タンパク質Ａ等を包含する。図６に示すとおり、ｐＩｃｏＤｕａｌベクターは例示される発現カセットを含んでいる。例えば１つの発現カセットはＣＤ２４−Ｖ５融合タンパク質をコードし、そしてライブラリ配列のインサートに対する独特の制限部位１つ以上を包含する。別の適当な融合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉチオレドキシンおよびＦＬＡＧエピトープを包含する。チオレドキシンとＦＬＡＧコーディング配列の間の接合部において、独特のＸｂａＩ制限部位により、融合タンパク質コーディング領域内へのライブラリ配列の挿入が可能となる。
【００９３】
発現カセットは場合により発現ベクターの部分であることができる。適当な発現ベクターは当該分野でよく知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。特定の実施形態においては、制御されたプラスミド増幅系を哺乳類細胞における発現のために使用する。このような系は種々の細胞における制御されたプラスミド増幅を可能にする。増大したプラスミドコピー数はまたコードされたペプチドの上昇した発現をもたらす。ペプチドの高水準の発現は細胞外表面上にディスプレイされるペプチドの数を増大させる。このような制御された増幅系はまた哺乳類細胞における持続的な一過性発現を可能にする。持続的な一過性発現は、より多数のペプチドを効率的にスクリーニングすることを可能にする安定なトランスフェクションと比較して典型的には１０倍多い細胞が一過性の発現を示すことから、好都合なものである。プラスミド増幅はまたプラスミドまたは目的のペプチドをコードする配列の回収を容易にする。
【００９４】
例示的実施形態においては、制御されたプラスミド増幅系はＳＶ４０増幅系を利用する。発現ベクターはＳＶ４０の早期プロモーターおよびＬａｒｇｅＴ抗原のコーディング領域の融合を含み、これによりＬａｒｇｅＴ抗原の転写はＳＶ４０の早期プロモーターの制御下になる。ベクターはまた複製のＳＶ４０起点も含有する。このベクターが細胞内に進入すると、ＳＶ４０早期プロモーターはＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡの転写を促進する。ＲＮＡはＬａｒｇｅＴ抗原内に翻訳される。ＬａｒｇｅＴ抗原はＳＶ４０起点に結合し、プラスミドの増幅を誘発する。ＬａｒｇｅＴ抗原の濃度が細胞内で上昇するに従って、ＬａｒｇｅＴ抗原のＳＶ４０早期プロモーターへの結合がＳＶ４０早期プロモーターを、そしてその結果としてＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡ合成もシャットダウンする。従ってシステムは自己調節性である。プラスミドコピー数が増加するに従って、細胞死の時点までプラスミド増幅をエスカレートさせ続けるＬａｒｇｅＴ抗原の生産の増大がなくなる。細胞内のＬａｒｇｅＴ抗原の量はＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡの量、ＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡの安定性、ＬａｒｇｅＴ抗原タンパク質の安定性、複製起点とＳＶ４０早期プロモーターの相対的親和性、および、細胞分裂によるベクター、ＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡおよびＬａｒｇｅＴ抗原の量の低下の関数である。増幅系はベクター上に含有されるため、プラスミドの増幅は典型的にはＣＯＳ７宿主細胞の使用に限定されず、むしろプラスミドの増幅は殆どの哺乳類細胞型に対して使用できる。
【００９５】
他の複製系に関しては、発現ベクターは、それがウィルス起源である場合は、細菌宿主中の増殖を必要としない場合がある。しかしながらより典型的には、ベクターは細菌宿主中で増殖させ、Ｅ．ｃｏｌｉの複製と選択に必要な配列、例えばｃｏｌＥＩレプリコンおよび抗生物質耐性遺伝子を含有する。
【００９６】
発現ベクターは場合により選択可能なマーカー１つ以上を含有できる。例えば真核細胞のトランスフェクションのための適当な選択可能なマーカーはハイグロマイシン耐性、ネオマイシン耐性、ブラスチシジン耐性、ゼオシン耐性、ドキソルビシン耐性等のための遺伝子を包含する。他の細胞のための適当な選択可能なマーカーは抗生物質耐性遺伝子および栄養要求性（例えばアミノ酸栄養要求性）を補うものを包含する。発現ベクターはまた場合により宿主細胞が発現ベクターを含有するようにシグナリングするための選択可能なマーカーを包含できる。適当な選択可能なマーカーは緑蛍光タンパク質またはマーカーエピトープ、例えばポリヒスチジン、Ｘｐｒｅｓｓ（商標）リーダーペプチド（Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、配列番号１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｍｙｃエピトープ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ、配列番号２：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＬＡＧタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ｌｙｓ、配列番号４；（例えばＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０５−１２１０，１９８８参照）、ｌｅｘＡタンパク質または細菌チオレドキシンを包含する。マーカーは例えば酵素試験により、蛍光により、フローソーターまたは同様の装置を用い、抗体（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）を用い、ビーズ選択を用いる等して検出することができる。マーカーが細胞表面上に存在する場合は、それらはマーカーを発現する細胞を単離するか、これ等を富化させるために使用できる。
【００９７】
（核酸転移）
種々の方法を用いて宿主細胞内にライブラリ配列を転移できる（一般的にＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。一部の方法は宿主細胞内の一過性の発現を主にもたらす（即ち、発現は細胞集団から徐々に消失する）。他の方法はライブラリ配列を安定に発現する細胞を発生できるが、安定な発現体の比率は典型的には一過性の発現体よりも低地である。このような方法は核酸転移のためのウィルスおよび非ウィルスの機序を包含する。
【００９８】
適当な哺乳類細胞は例えば、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、ヒト神経芽細胞系統、Ｋ５６２、ＣＯＳ７、Ｂａ／Ｆ３、ＡＣ２（例えばＧａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｋｉｎｎａｉｒｄ，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．５：Ｓ１４５−Ｓ１５０，１９８６）、Ｂ９、ＨｅｐＧ２、ＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞等を包含する。動物宿主細胞は例えば癌組織および腫瘍、例えば黒色腫、結腸、前立腺、白血球、肝、腎、子宮等から単離した細胞である。特定の細胞および細胞系統は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから市販されている。
【００９９】
ウィルスベクターに関しては、ライブラリ配列は典型的にはウィルスパッケージの一部として宿主細胞に運搬される。ウィルスの型に応じて、核酸は染色体外エレメントとして残存させる（例えばアデノウィルス（例えばＡｍａｌｆｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：３３５２−３３５６，１９９６）またはアデノ関連ウィルス）か、または、それは宿主染色体内に取り込む（例えばレトロウィルス（Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６０５４−６０５９，１９９６））。
【０１００】
非ウィルス発現ベクターの転移のためには、多くの方法が用いられる（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。核酸転移のための１つの方法は核酸のリン酸カルシウム同時沈殿である。この方法は核酸がカルシウムおよびホスフェートイオンと同時沈殿して比較的不溶性のリン酸カルシウム複合体となり、これが培養皿底部上の付着細胞の表面上に沈着するという能力に依存している。他の方法は脂質ミセルを形成しながら伝家相互作用により核酸に結合する親油性カチオンを使用する。これ等のミセルは細胞膜と融合し、核酸を宿主細胞に導入し、ここで発現させる。別の核酸転移方法はエレクロトポレーションであり、これでは、核酸および宿主細胞を含有する緩衝液を通過するコンデンサーのプレートからの放電を行う。この工程は緩衝液に含有される核酸がこれ等の膜を貫通できる程度に十分に細胞膜を撹乱させる。別の方法は核酸の進入および培養細胞中での発現を媒介するカチオン性重合体、例えばＤＥＡＥデキストランの使用を含む。別の方法は細胞内への核酸の弾道的デリバリーを使用する。最後に核酸のマイクロインジェクションも用いることができる。
【０１０１】
マルチコピーベクターを保有する細菌のスフェロプラストに動物細胞を融合させることにより、多数の同一のベクター（例えばライブラリ配列を含有する発現ベクター）を各細胞内に導入することができる。融合は平均して１つの動物細胞との１つのスフェロプラストの融合を可能にする態様において行う。例えば、ｐＵＣプラスミドのように高コピー数のプラスミドを使用する場合は、多くの同一のプラスミドが典型的には各動物細胞に導入される。この方法は動物干せないのベクターの増幅の必要性をなくし、そして宿主細胞内の高コピー数およびその結果としてのライブラリ配列の高水準発現を可能にする。この操作法はまた動物宿主細胞内でベクターを増幅する必要なく、一過性の発現のより長い期間を可能にする。ベクターの高コピー数はまたレポーター発現の変化を示す動物宿主細胞からライブラリ配列の回収をより容易にする。
【０１０２】
一部の方法においては、標的分子と相互作用するポリペプチドをコードする複数の核酸を個々の細胞に導入する。複数のフラグメントの転移を最小限にする方法は当該分野で知られている。例えば「キャリア」核酸（例えばサケまたはニシン精子ＤＮＡのようなＤＮＡ、ｔＲＮＡ等）を用いることにより、または、宿主細胞に適用する核酸の総量を低減することにより、複数フラグメント進入の問題を低減できる。更に、各レシピエント細胞は複数の核酸フラグメントを受け取ることができる。宿主細胞を介するライブラリの複数の継代は、当初は擬陽性として存在した他の配列から目的の配列を最終的に分離可能とする。
【０１０３】
好ましい実施形態においては、レトロウィルスベクターは１つのペプチドを配列を各細胞に導入する。これは頑健なシグナルを供給し、何れかの所定の細胞内の複数の発現ベクターからのシグナルに対する希釈作用を低減する。
【０１０４】
（宿主細胞ディスプレイペプチド）
例示的実施形態において、発現ライブラリを含むオリゴヌクレオチドにコードされるペプチドは発現ライブラリが導入されていり宿主細胞の分泌経路および細胞外表面においてディスプレイされる。発現ライブラリ配列によりトランスフェクトされている宿主細胞は、エフェクターペプチドと共に分泌経路を同時に通過しそしてＡＰＰと共に細胞表面に束縛されるペプチド分子と共にＡＰＰを同時発現する。即ち発現されるペプチドはＡＰＰプロセシングの間ＡＰＰ分子と共に存在し、従って、これ等のペプチドはＡＡＰＰ、ＡＰＰプロセシング酵素またはＡＰＰプロセシングに関与する他の巨大分子と相互作用するために使用できる。更にまた、分泌経路を通過する際に、ライブラリペプチドはＡＰＰプロセシングにとってネイティブである生理学的条件下に発現される。同様に、宿主細胞の細胞外環境が実質的に生理学的な条件下に維持されている場合、細胞外表面上のライブラリペプチドは細胞外環境におけるＡＰＰプロセシングにとってネイティブであるものを温存するかこれに近似している条件下に発現される。
【０１０５】
ペプチドは典型的には哺乳類細胞のような宿主細胞の表目上の実質的に声楽的な条件下にディスプレイされる。各宿主細胞はその表面上にライブラリペプチドの１つ以上の数百、そして恐らくは数千のコピーを発現し、その大多数は典型的には細胞外ＡＰＰ標的分子への結合のために使用される。ペプチドは典型的には持続的な期間に渡り細胞の表面上に存在する。
【０１０６】
特定の実施形態においては、ペプチドライブラリを発現する宿主細胞は新しく作成するか、生存細胞である。別の実施形態においては、ペプチドライブラリ発現細胞はパラホルムアルデヒド化他の適当な固定剤中に固定することができる。このような固定されたペプチドライブラリ発現細胞は場合により使用時まで適当な温度（例えば４℃）で保存できる。ペプチドは典型的には延長された期間に渡り細胞の表面上に存在する。
【０１０７】
一部の実施形態においては、発現ライブラリでトランスフェクトされた宿主細胞は、発現ベクターを含有し場合によりライブラリペプチドを発現する細胞について富化される。このような選択は典型的には、ライブラリ発現ベクター内に含有される選択可能なマーカーに基づく（例えば発現カセットおよびベクターを参照）。選択可能なマーカーを用いた選択の方法は当該分野で知られている。例えばＦＡＣＳを用いて、発現ベクターにコードされるエピトープ（例えばＶ５、ＦＬＡＧ、チオレドキシン等）または提示分子そのもの（例えばＣＤ２４）に対する蛍光標識抗体を検出できる。更にまた、磁気ビーズ選択を知られた方法で使用できる。
【０１０８】
（ＡＰＰに特異的に結合する薬剤を得るための薬剤の予備スクリーニング）
特定の実施形態においては、化合物ライブラリおよび発現ライブラリはＡＰＰに特異的に結合する薬剤を発見するために予備スクリーニングできる。予備スクリーニングは例えば実質的に生理学的な条件下に実施できる。ＡＰＰに特異的に結合するものとして発見された薬剤を用いてＡＰＰ結合薬剤に関して富化された化合物または発現ライブラリを作成することができる（「予備富化化合物ライブラリ」または「予備富化発現ライブラリ」）。
【０１０９】
例えば、これはＨｉｓタグのようなアフィニティータグを有するＡＰＰの外部ドメイン（ｅｄＡＰＰ）を発現させ、ｅｄＡＰＰをカラムに結合させ、カラムに化合物ライブラリを通し、そして、富化された化合物を溶出することにより達成できる。次に富化された化合物を本発明の細胞系試験において試験する。
【０１１０】
更に、特定の実施形態においては、ＡＰＰのＮ末端短縮型を用いてＡＰＰに対する特異的結合に関し、薬剤を予備スクリーニングする。コレラノ短縮型はペプチド富化のためのより特異的な標的であるという利点を有する。より短い型を用いることの利点は、αおよびβ切断部位がＡＰＰのＮ末端配列の大部分の除去により有意な影響を受けないという事実で強調されてきた（例えばＤｅＳｔｏｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３０３１０−３０３１４，１９９５；Ｌａｍｍｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３９２２−３９２７，１９９９）。より短い型は例えばチオレドキシン、セイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、プロテインＡまたは他の提示タンパク質のＮまたはＣ末端融合タンパク質として発現することができる。ＡＰＰ６９５の分泌型もまた可溶性組み換えタンパク質として市販されている（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１１１】
本発明の例示的実施形態においては、ペプチド発現ライブラリはＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを発見するために予備スクリーニングされる。ＡＰＰ結合ペプチドをコードするものとして発見されたこれ等のクローンを回収し、そして当該分野で知られた方法を用いて増幅することにより、予備富化された発現ライブラリを作成できる。この予備富化発現ライブラリはＡＰＰに結合するペプチドをコードするものについて富化されたオリゴヌクレオチド配列の集団を含む。次にオリゴヌクレオチド配列の富化されたライブラリを本発明の方法に従って宿主細胞に導入し、ＡＰＰプロセシングを改変するＡＰＰ結合ペプチドを発見することができる。
【０１１２】
例えば、当該分野で知られた方法を用いて、発現ライブラリを発現のための動物宿主細胞に導入するか、または、例えばファージディスプレイのような非動物系を用いて発現させる。次に発現されたペプチドを標識されたＡＰＰおよび／またはＡＰＰのＮ末端短縮型の可溶性型（例えばＡＰＰの細胞外ドメインまたはＮ末端短縮型）または動物宿主細胞の表面上に発現されたものと接触させる。適当な標識は例えば、放射性標識（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、蛍光分子（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド、フルオレｓカミン、ペリジニン−クロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、Ｃｙ３（インドカルボシアニン）、Ｃｙ５（インドジカルボシアニン）、ランタニドホスファー等）、酵素（例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチニル基、前述したタグエピトープ等を包含する。一部の実施形態においては、検出可能な標識は種々の長さのスペーサーアームにより連結され、これにより潜在的な立体障害を低減する。或は、標識された結合相手、例えば標的分子に結合する抗体を使用できる。１つの例示的実施形態においては、ＡＰＰ分子はＨｉｓタグエピトープ標識により標識される。
【０１１３】
次に、ＡＰＰまたは種々の細胞外ドメインを含有するＡＰＰの短縮された形態の１つに結合する発現ペプチドを当該分野で知られた標識および方法を用いて発見する。例えばペプチドを発現し、Ｈｉｓタグ細胞外ドメインＡＰＰに曝露されたファージまたは細胞をＨｉｓタグアフィニティーカラムに通してＡＰＰ結合ペプチドを発現するこれ等のファージまたは細胞を富化することができる。或は、例えばペプチド発現動物細胞を蛍光タグ付けされた細胞外ＡＰＰまたは短縮されたＡＰＰに曝露し、そしてＡＰＰ結合細胞をＦＡＣＳで発見して分類することにより、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドを発現する細胞を得ることができる。このような富化の複数のラウンドを実施することができる。
【０１１４】
ＡＰＰ結合ペプチドを発現する細胞またはファージの富化の後、ペプチドコード配列を、予備富化に用いられた発現ベクターから切り出し、そして知られた方法を用いてＡＰＰプロセシングを改変するＡＰＰ結合ペプチドに関するスクリーニングのための適切なベクター（後述する発現カセットおよびベクターを参照）に転移させることができる。動物宿主細胞を予備富化に用いる本発明の一部の実施形態においては、ＡＰＰプロセシングを改変するペプチドのスクリーニングに使用する発現ベクターは予備スクリーニング中のペプチド発現のために使用したものと同じであることができる。
【０１１５】
（ＡＰＰプロセシングを改変する薬剤の検出）
別の特徴において、ＡＰＰプロセシングに対する化合物または発現ライブラリ内の薬剤の作用を試験する。ＡＰＰを発現する宿主細胞および少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を薬剤と接触させ、次に宿主細胞により発現されたＡＰＰのプロセシングに対する作用について宿主細胞を試験する。一部の実施形態においては宿主細胞は実質的に生理学的な条件下で薬剤と接触させる。例示的実施形態においては、ペプチド発現ライブラリを含むペプチドのＡＰＰプロセシングに対する作用を試験し、ここでは発現ライブラリは宿主細胞に導入されている（例えば上述した遺伝子ライブラリ、発現カセットおよびベクター、核酸転移および宿主細胞ディスプレイペプチドを参照）。別の実施形態においては、本発明の薬剤を含有する例えば植物から得た抽出物、例えば泥炭抽出物を作用を検出するために十分な時間、宿主細胞と混合する。
【０１１６】
ＡＰＰプロセシングに対するライブラリ内の薬剤の作用は、何れかの適当な検出手段、例えば特定のＡＰＰフラグメント、例えばＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βまたはＡＰＰｓ−γに特異的に結合するマーカーの使用により検出できる。このようなマーカーを用いれば、薬剤と接触させていない、または、ライブラリペプチド配列を発現しない宿主細胞と比較した場合の、Ａβの生産に相関する特定のＡＰＰフラグメントの相対的な存在または非存在を測定できる。例えば、ＡＰＰ特異的結合マーカーを蛍光タグで標識し、例えばＦＡＣＳ］分析のような知られた方法でこのようなマーカーの相対的存在または非存在について宿主細胞を試験することができる。例示的実施形態において、マーカーはＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの特定のエピトープに特異的な抗体である。特定のＡＰＰフラグメントに対する抗体、例えばＡＰＰｓ−β（例えばＡＰＰ中央領域に特異的なＡ３または１Ｇ７、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７３８６−１７３８９，１９９４）、ＡＰＰｓ−α（例えば６Ｅ１０、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２、ＡＰＰｓ−αのカルボキシ末端またはβおよびα切断部位の間のＡＰＰ領域に特異的）およびｐ３（例えば４Ｇ８、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）が挙げられる。
【０１１７】
宿主細胞が１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素を発現する例示される実施形態においては、少なくとも２つのＡＰＰフラグメントフラグメントに特異的な少なくとも２つの標識マーカーの検出シグナルの比を測定する。次に、宿主細胞発現ライブラリ配列中のこの比の変化を検出することにより改変されたＡＰＰプロセシングを測定できる。例えばα−およびβ−セクレターゼの両方を発現する宿主細胞において、ＡＰＰｓ−αおよびＡＰＰｓ−βに特異的な抗体を２種の蛍光タグ（例えばＦＩＴＣおよびＰＥ）で標識し、結合した標識抗体の存在をＦＡＣＳで測定することができる。次にライブラリペプチドを発現する宿主細胞をβ−セクレターゼプロセシングの低下を示すＡＰＰｓ−β：ＡＰＰｓ−αのシグナル比の増大に従って選択する。
【０１１８】
一部の実施形態においては、ＡＰＰプロセシングに対する作用を有するものとして発見された薬剤を用いてＡＰＰプロセシングに影響する薬剤について富化されたサブライブラリを構築することができる。次にこのサブライブラリをスクリーニングのその後のラウンドにおいて宿主細胞に接触させることにより所望の特性を有する薬剤を発見できる（後述するライブラリ構成成分の特徴付けを参照）。
【０１１９】
例示的な実施形態においては、本明細書に記載した方法のいずれかにより単離または収集されたペプチドライブラリを発現する宿主細胞を用いて遺伝子ライブラリ配列を再単離することにより、ＡＰＰプロセシングに影響するものについて富化された配列のサブライブラリを構築できる。当業者の知るとおり、このような配列は、特に、選択されたクローンから発現ベクター核酸を回収し、そしてそれらを適当な細菌宿主系統に憩室転換することによるか、オリゴヌクレオチドインサートにフランキングする何れかの適当なプライミング部位を用いたＰＣＲによるライブラリオリゴヌクレオチドのクローニングによるか、別のベクター内への元の発現ベクター由来のオリゴヌクレオチドのサブクローニングによるなどして、単離することができる。オリゴヌクレオチドのサブライブラリは場合により発現カセットまたはベクターに必要に応じて再クローニングし、そして、宿主細胞内に再導入してスクリーニングのその後のラウンドに付すことができる。スクリーニング／選択のサイクルは必要に応じて何回も反復できる。
【０１２０】
特定の実施形態においては、十分な回数のサイクルの後、試験シグナルまたはその比においてかなりの相違が観察され、ペプチド配列の富化されたサブライブラリと元のペプチドライブラリとの間にＡＰＰフラグメントの存在における（例えば強度分布における）相違が示される。発現ライブラリまたはその部分の逐次的な導入、フローソーターまたは類似の装置における分類および所望の試験結果を示す宿主細胞からの核酸の単離の過程により、所望のペプチドをコードするライブラリオリゴヌクレオチドのある集団が発見できる。次にオリゴヌクレオチドを単離し、分子クローニングおよび核酸配列分析により個別に試験する。十分な回数のサイクルを実施した後には、多くの、そして典型的には殆どのここのオリゴヌクレオチドは宿主細胞上で発現された場合と本発明棒同様の作用の結合事象をもたらすペプチドをコードするはずである。
【０１２１】
（アロステリックエフェクターの発見）
特定の実施形態においては、エフェクター薬剤を試験することによりＡＰＰのアロステリックエフェクターを発見することができる。アロステリックエフェクターの発見はＡＰＰプロセシングのエフェクターとして発見された薬剤に対する二次的スクリーニングとして実施できる。或は、化合物ライブラリまたはペプチド発現ライブラリを予備スクリーニングしてＡＰＰ上の潜在的アロステリック部位に結合する薬剤を発見することができる。アロステリックエフェクターの発見は細胞系試験を用い、その後ＡＰＰに結合する薬剤を発見し、そして知られた方法でＡＰＰの構造における何らかの変化を測定することにより直接行うことができる。予備スクリーニング工程を含む方法においては、系はＡＰＰアロステリックエフェクターの発見に適合されている。
【０１２２】
（ライブラリ構成成分の特徴付け）
本明細書に記載した操作法のいずれかを用いて発見されたエフェクター剤を更に特徴付けすることができる。宿主細胞の分泌経路および細胞外表面においてペプチドを提示するために発現ライブラリを用いる場合は、ライブラリ配列は何れかの適当な方法、例えばＨＩＲＴ細胞溶解および細菌宿主細胞中のベクターの回収、ポリメラーゼ連鎖反応等により宿主細胞から単離することができる（例えばＨｉｒｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５−３６９，１９６７；米国特許４，６８３，２０２号、４，６８３，１９５号および４，８００，１５９号；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８９）；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９９）；Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ），ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６）；ＥＰ３２０３０８；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照：参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２３】
スクリーニングのその後のラウンドは場合によりＡＰＰプロセシングはＡＰＰプロセシングを改変する薬剤について富化するために実施することができる。化合物のサブライブラリまたは発現ライブラリを別のスクリーニングおよび／または選択に付すことによりより望ましい性質を有する薬剤またはオリゴヌクレオチド配列について富化することができる。より望ましい性質を有するエフェクター薬剤を富化するためには、例えばＡＰＰに対する進歩した特異性または親和力を有するか、ＡＰＰプロセシングに対する増大した作用を有する薬剤について富化するための別のスクリーニングにサブライブラリ（上記した方法のいずれかにより単離されている）を通すことが望ましい。例えば、望ましくない分泌または細胞外の相互作用に対する僅かな作用を適切な二次スクリーニングにより排除することができる。所望により、別の標識を用いて分泌または細胞外の分子の相互作用に影響するライブラリペプチド配列を発見することができる。更に、分泌または細胞外の分子の相互作用に対して一般化された非特異的な作用を有するエフェクター薬剤も、ＡＰＰまたはＡＰＰプロセシング酵素発現を欠損した異なる宿主細胞に化合物のサブライブラリまたはここのエフェクター薬剤を接触させる（または発現サブライブラリまたはここのライブラリペプチド配列を通過させる）こと、および、次にプロセシングの改変または他の非ＡＰＰ分泌または細胞表面分子に対する別の作用について試験するこれ等の細胞に対するスクリーニングを実施することにより、発見できる。
【０１２４】
一部の場合において、本発明により発見されたエフェクター薬剤を用いてＡＰＰプロセシングを改変する他の薬剤を発見できる。例えばＡＰＰプロセシング意の分子エフェクターとして発見された小型の有機分子を例えば低下した毒性または増大した薬効を含む向上した特性を有する薬剤を発見するための指向性スクリーニング法において使用できる。例えば、エフェクター薬剤を含むサブユニット１つ以上に対し修飾を行うことができる。修飾はＲ基の型、数または位置に関する変動を包含できる。次に修飾された小型分子のエフェクター薬剤は、向上した特性を有する薬剤を得るために本明細書に記載した方法を用いてスクリーニングに付される。
【０１２５】
更にまた、ペプチド発現ライブラリを含むペプチドライブラリを用いる場合、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドの配列を修飾できる。一部の場合において、元のライブラリは長さＮのアミノ酸配列の全ての可能な順列を含有しない場合がある（例えばもとのライブラリが半ランダムライブラリの場合）。このような場合は、発見されたペプチドを原料（「リード化合物」）として単離して使用することにより、別のペプチドまたは元のペプチドと比較して増強された機能（例えばより高い親和力または親和性）を有するペプチドを発見することができる。ライブラリ配列の変異体を単離するためには、核酸の増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応による）を用いて複製過程の間に配列の変化を導入することができる（例えばＣｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３５４６−３５５１，１９９６参照）。このような突然変異はより効果的な性質を有する配列変異体をもたらすことができる。或は、例えばインビトロ突然変異誘発、易エラー製ＰＣＲおよび／または組み換えＰＣＲによるなどして核酸の突然変異および／または組み換えを増強する条件に増幅工程を故意に付すことにより既存の配列の改善された変異体を探索することが望ましい場合がある（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１，１９９４参照）。このような条件は当該分野で知られており、そして、元のライブラリにより発現される配列と比較して、より低濃度で活性であり、および／または増大した特異性および／または活性を示す配列を検索するための手段を提供する。
【０１２６】
（ＡＰＰプロセシングの分子エフェクターの適用）
本発明の方法は特に生理学的条件下でＡＰＰに結合してそのプロセシングを改変する生理学的に該当するエフェクター薬剤を発見する能力を提供する。
【０１２７】
本明細書に記載した方法を用いて発見されたエフェクター薬剤は例えば動物モデルにおいてインビボで試験できる。発見された薬剤は例えばα−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを刺激する（「ＥＭα」）か、または、β−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを抑制する（「ＥＭβ」）ものとして発見されるエフェクター分子（「ＥＭ」）であることができる。好ましい実施形態においては、動物は典型的にはアルツハイマー病、特にＡβの上昇した水準に関連する病理学的条件を示すものである。例えば、動物は例えばＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）（Ｈａｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２，１９９６）またはＰＤＡＰＰ（Ｖ１７１Ｆ）（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５２３−５２７，１９９５）のようなアルツハイマー病に関連する病理学的突然変異を有するトランスジェニックマウスであることができる。
【０１２８】
特定の実施形態においては、発見された薬剤を例えば直接の注射または経口投与により、動物に直接投与できる。更に、エフェクター薬剤がペプチドである場合は、発見されたペプチドは動物モデルにおいてペプチドを発現させることにより試験することもできる。例えば、１つの実施形態においては、ペプチドをコードする構築物を例えば直接の注射により動物の特定の標的組織（例えばＣＳＦまたは脳）に導入することができる。別の実施形態においては、エフェクターペプチドをコードする構築物はトランスジェニックマウスモデル中で発現されたトランスジーンである。エフェクターペプチドトランスジーンを発現するトランスジェニックマウスはまた、例えば病原性アルツハイマー病突然変異を有するトランスジェニックマウス（例えばＳｗｅｄｉｓｈおよび／またはＡｒｃｔｉｃ突然変異を有するＡＰＰ遺伝子を有するトランスジェニックマウス）
と交配することができる。発見されたエフェクターペプチドは膜結合提示分子として細胞外に発現され提示されるか、または膜固定を伴うことなく細胞外の空間に分泌される。更にまたエフェクターペプチドの発現は例えば組織特異的プロモーター（例えば神経組織中の発現のためのＴｈｙ１プロモーター）を用いて特定の組織にターゲティングすることができる。
【０１２９】
薬剤を動物に導入した後、改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的状態または症状、例えばＣＳＦ、脳細胞および／または血清中のＡβ濃度を低下させる能力；プラーク抑制；またはアルツハイマー病に関連する他の病理学的状態または適応症の低減に対する作用について動物をモニタリングする。
【０１３０】
（ペプチドエフェクターの機能を増強する別の修飾）
前述した通りＡＰＰの識別的プロセシングに影響するペプチド配列は種々の態様でその作用を発揮できる。当業者の知るとおり、ペプチドの変異体または類縁体を合成することによりペプチドの有効性を向上させることができる。例えば、ペプチドの有効性はペプチド自体（即ち如何なる付属の配列も伴わない）を投与することにより向上する。
【０１３１】
当業者の知るとおり、ペプチドの構造的類縁体および誘導体（例えば保存的なアミノ酸の挿入、欠失または置換を有するペプチド、ペプチドミメティック、ジスルフィド交差結合、人工の交差結合等）もまた治療薬として有用である。例えば、天然のアミノ酸を含むことができる上記したペプチドに加えて、テンプレートペプチドと類似している性質を有する非ペプチド薬剤としてペプチド類縁体を使用することができる。これ等の型の非ペプチド化合物は、例えばコンピュータ化された分子モデリングを用いて開発することができる（例えばＦａｕｃｈｅｒｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．１５：２９，１９８６；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ３９２，１９８５；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９，１９８７参照）。このような類縁体、またはペプチドミメティックティいくは構造的には治療上または予防上有用なペプチドと同様であり、等価な治療上または予防上の作用をもたらすために使用できる。一部の場合においては、ペプチドミメティックは例えばより経済的な生産、より大きい化学的安定性、増強された薬理学的性質（例えば半減期、吸収、力価、薬効等）、改変された特異性（例えばより広い生物活性スペクトル）、増大した、低減した抗原性、増大した血液脳関門を越える通過性、および他の所望の性質を含めて、ペプチドを越えた顕著な利点を有している。
【０１３２】
ペプチドミメティックは当該分野で知られ、そして以下の参考文献、即ち、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ）２６７，１９８３；Ｓｐａｔｏｌａ，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ，ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｍａｒｃｈ １９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，ｐｐ．４６３−４６８，１９８０；Ｈｕｄｏｓｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５，１９７９；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９，１９８６；Ｈａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．ｐｐ．３０７−３１４，１９８２；Ａｌｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８，１９８０；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２３５５，１９８２；欧州特許出願ＥＰ４５６６５、１９８２；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ９７：３９４０５，１９８２；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４，１９８３；およびＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９，１９８２に更に記載された方法により作成できる。
【０１３３】
１つの特徴において、ペプチド（または類縁体またはミメティック）の薬学的に許容される塩は従来の方法で容易に調製できる。例えばそのような塩は薬学的に許容される所望の金属水酸化物または金属塩基の水溶液でペプチドを処理すること、そして、得られた溶液を典型的には窒素雰囲気中減圧下で蒸発乾固させることにより調製できる。或は、ペプチドの溶液を所望の金属のアルコキシドと混合し、その後溶液を蒸発乾固させる。薬学的に許容される水酸化物、塩基およびアルコキシドはこの目的のためのカチオン、例えばカリウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムとのものを包含する。他の代表的な薬学的に許容される塩は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩等を包含する。
【０１３４】
ペプチドまたはその類縁体または誘導体を安定化させることによりそのシェルフライフおよび薬物動態半減期を増大させることが望ましい。シェルフライフ安定性は賦形剤、例えばａ）疎水性物質（例えばグリセロール）；ｂ）糖類（例えばスクロース、マンノース、ソルビトール、ラムノースまたはキシロース）；ｃ）複合炭水化物（例えば乳糖）；および／またはｄ）殺菌剤を添加することにより向上できる。ペプチドの薬物動態半減期は、化学的誘導化を用いて担体ペプチド、ポリペプチドおよび炭水化物にカップリングすることにより（例えば側鎖またはＮまたはＣ末端残基をカップリングすることにより）、または、対象ペプチドのアミノ酸を化学的に改変することにより修飾できる。これ等のペプチドの薬物動態半減期および薬力学的特徴はまたａ）カプセル化（例えばリポソーム中）；ｂ）水和の程度の制御（例えばペプチドのグリコシル化の範囲と種類の制御による）；ｃ）ペプチドの静電的荷電および疎水性の制御；およびｄ）ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体等のような薬学的に許容されるデポ剤中の製剤により変更することもできる。
【０１３５】
治療上の投与のためには薬剤および本発明のミメティックを薬学的に許容される担体中に製剤できる。本明細書においては、「薬学的に許容される担体」には全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗カビ剤、等張性付与剤および吸収増強または遅延剤、および、生理学的に適合する他の賦形剤または添加剤が包含される。特定の実施形態においては、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、経口、または経皮投与に適している。投与経路に応じて、活性薬剤は酸および薬剤を不活性化する可能性のある他の天然の条件の作用から薬剤を保護するための物質でコーティングすることができる。
【０１３６】
本発明の医薬組成物を調製する際には、薬剤を週ｈ即するか、薬剤またはミメティック化合物を他の薬剤と組み合わせるかコンジュゲートすることにより、選択された薬剤の薬物動態および生体分布を改変することが望ましい場合がある。薬物動態および生体分布を改変するための多くの方法は当業者の知るとおりである。このような方法の例は種々の薬剤、ペプチドまたはその複合体を、他のタンパク質、脂質、炭水化物または合成重合体よりなるベシクル中で保護することを包含する。例えば本発明の薬剤をリポソームに取り込ませることにより薬物動態および生体分布の特性を増強することができる。リポソームを調製するための種々の方法が知られており、例えばＳｚｏｋａ ｅｔ ａｌ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７，１９８０；米国特許４，２３５，８７１号；４，５０１，７２８号；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。リポソームデリバリーと共に使用するためには、薬剤は典型的にはリポソームまたは脂質ベシクル内部に捕獲するか、または、ベシクルの外面に結合させる。特定の組織および特定の細胞型にリポソームをターゲティングすることによりリポソーム媒介デリバリーの効率を上昇させるための数種の手法が考案されている。リポソーム製剤、例えばカチオン性脂質を含有するものは、ヒト患者において安全であり十分耐容性があることがわかっている（Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ．８２：１７０６−１７１０，１９９０）。
【０１３７】
或は、本発明の組成物は薬学的に許容される担体、適切な生理学的条件のために必要な物質、例えばｐＨ調節剤および緩衝剤、浸透圧調節剤、水和剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有することができる。
【０１３８】
固体組成物の場合は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を使用でき、これにや、例えば、薬品用等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が包含される。経口投与のためには、薬学的に許容される非毒性の組成物は、前述の担体のような通常用いられる賦形剤の何れか、および、一般的には約１０〜９５％、より典型的には約２５％〜７５％の活性成分を配合することにより形成する。
【０１３９】
薬剤を投与するための治療用組成物はまた、溶液、マイクロエマルジョンまたは高濃度の活性成分に適する他の秩序のある構造物として製剤できる。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび脂質ポリエチレングリコール等）およびこれ等の適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。溶液の適切な流体性は例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散製剤の場合は所望の粒径を維持することにより、そして界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合において、等張性付与剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが望ましい。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアレート塩およびゼラチンを組成物中に含有させることにより達成できる。
【０１４０】
本発明の特定の実施形態においては、薬剤は除放性製剤中、例えば遅延放出重合体を含む組成物中で、または、デポ注射により投与する。活性剤またはミメティックは急速な放出から保護する担体、例えば制御放出ベシクル、例えばインプラント、経皮パッチまたはマイクロカプセル化デリバリーシステムと共に調製できる。本発明の種々の組成物中の薬剤またはその生物活性類縁体またはミメティックの延長されたデリバリーは吸収をを遅延させる薬剤、例えばものステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを組成物中に含有させることにより達成できる。薬剤の制御放出製剤が望まれる場合は、本発明に従って使用するために適する制御放出バインダーは活性成分に対して不活性であり、選択された薬剤の取り込みが可能な何れかの生体適合性の制御放出物質を包含する。このような物質は多くのものが知られている。有用な制御放出バインダーは哺乳類において皮下または筋肉内注射の後に生理学的条件下で（即ちそこに存在する体液の存在下において）緩徐に代謝される物質である。適切なバインダーは例えば除放性製剤の技術分野において以前より使用されている生体適合性重合体および共重合体を包含する。このような生体適合性の化合物は例えば皮下または筋肉内注射の後周囲の組織に対して非毒性および不活性であり、そして免疫応答、炎症等のような顕著に有害な作用を誘発しない。それらは生体適合性であり身体から容易に排出される代謝産物に代謝される。
【０１４１】
例えば加水分解可能なエステル結合を有する共重合体および単独重合体であるポリエステルから誘導された重合体マトリックスを使用してよい。これ等の多くのものは生体分解性であり、そして毒性が全く無いか低い分解性生物をもたらすことが当該分野においてわかっている。例示される重合体はポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ−乳酸グリコール酸共重合体）（ＤＬＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ−乳酸グリコール酸共重合体）（ＤＰＬＧＡ）およびポリ（Ｌ−乳酸グリコール酸共重合体）（ＬＰＬＧＡ）を包含する。他の有用な生体分解性または生体侵食性の重合体は例えば、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン乳酸共重合体）、ポリ（イプシロン−カプロラクトングリコール酸共重合体）、ポリ（ベータ−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）、ヒドロゲル、例えばポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（即ちＬ−ロイシン、グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルタミド）、ポリアセタール重合体、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、多糖類およびそれらの共重合体を包含する。このような製剤を調整するための多くの方法は当該分野で知られている（例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８参照）。有用な製剤は制御放出組成物、例えばマイクロカプセル（米国特許４，６５２，４４１号および４，９１７，８９３号、各々は参照により本明細書に組み込まれる）、注射用製剤（米国特許４，８４９，２２８号、参照により本明細書に組み込まれる）、マイクロカプセルまたは注射用製剤の作成において有用である乳酸グリコール酸共重合体（米国特許４，６７７，１９１号および４，７２８，７２１号、各々は参照により本明細書に組み込まれる）および水溶性ペプチド用の除放性組成物（米国特許４，６７５，１８９号、参照により本明細書に組み込まれる）を包含する。長期持続性放出インプラントもまた使用できる。これ等は少なくとも１０〜２０日間、場合により少なくとも３０日間、そして６０日間より長期にわたり選択された薬剤の治療濃度を供給するように容易に構築できる。長期持続性放出インプラントは当該分野でよく知られており、そして上記した吸収支援成分の一部を配合できる。このようなインプラントは印譜ｒんとを標的組織または細胞集団の近傍に、または直接内部に留置することにより目的の部位１つ以上において薬剤の局在化した高用量を影響させるため、特に有用なものである。
【０１４２】
本発明の選択された薬剤はハードまたはソフトシェルのゼラチンカプセルに封入するか、圧縮成型して錠剤とするか、または、対象の食餌に直接配合できる。経口治療投与のためには、薬剤を賦形剤とともに配合し、摂取可能な錠剤、口内用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用できる。当然ながら、味覚改善物質を経口剤型の場合には添加することができる。これ等の組成物および調製物中の選択された薬剤の比率（例えば重量または体積による）もまた当然ながら変動できる。上記したとおり、治療上有用な組成物中の選択された薬剤の量は一般的には治療有効用量が供給されるようにする。
【０１４３】
経口投与のためには、選択された薬剤は、恐らくは更にステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、「カーボワックス」またはポリエチレングリコールのような潤滑剤を添加することにより、固体担体物質、例えばクエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムまたはリン酸２カルシウム、および、バインダー、例えばポリビニルピロリドン、ゼラチンまたはセルロース誘導体と共に混合することにより、錠剤または他の固体形態とされる。固体デリバリーベヒクルは目的の薬剤、例えばペプチドを、充填剤、例えば乳糖、サッカロース、マンニトール、デンプン、例えばバレイショ澱粉またはアミロペクチン、セルロース誘導体または高分散ケイ酸と野混合物中に含有できる。ソフトゼラチンカプセルにおいては、活性物質を植物油または液体ポリエチレングリコールのような適当な液体中に溶解または懸濁する。更に別の形態として、例えばハードゼラチンのプラグカプセル、並びに軟化剤または可塑剤、例えばグリセリンを含有する投薬用ソフトゼラチンカプセルを使用することもできる。
【０１４４】
或は、選択された薬剤を供給するための液体剤型は、水、薬学的に許容される脂肪または油脂、アルコールまたは他の有機溶媒、例えばエステル中の溶液または懸濁液、乳液、シロップまたはエリキシル、懸濁液、非発泡性顆粒から希釈調整した溶液および／または懸濁液、および、発泡性顆粒から希釈調整した発泡性調製物を包含する。このような液体剤型は、例えば適当な溶媒、保存料、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、濃厚化剤および溶融剤を含有できる。経口剤型は場合によりフレーバー剤および着色剤を含有する。非経腸および静脈内の剤型もまたミネラル類や選択されたデリバリーシステムの型に適合するための他の物質を含有できる。
【０１４５】
本発明の治療用組成物は典型的には製造、保存および使用の全ての条件下において滅菌され安定でなければならない。滅菌注射用溶液は必要に応じて上記した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の選択された薬剤を配合し、その後濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、塩基性非分散媒体および上記した他の必要成分を含有する滅菌ベヒクル中に薬剤を配合することにより調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、製造方法は、活性成分＋何れかの付加的な所望の成分の粉末を、それらの予備濾過滅菌溶液からもたらすような、真空乾燥および凍結乾燥を含む。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により達成できる。
【０１４６】
本発明のより詳細な特徴において、選択された薬剤は対象にデリバリーされた後のその有効な半減期を延長するために、特に生理学的環境内（例えば血流、脳脊髄液中、または、結合組織コンパートメントまたは体液充填体腔内部）における活性状態の代謝的存続を延長するために、安定化させる。この目的のためには、選択された結合剤は化学的手段、例えば化学的コンジュゲーション、Ｎ末端キャッピング、ＰＥＧ化または組み換え手段、例えば部位指向性突然変異誘発または融合タンパク質の構築により修飾するか、または、種々の安定化剤または担体と共に製剤してよい。このように安定化すれば、上記したとおり投与された選択された薬剤は非安定化形態と比較して生理学的条件下で延長された期間に渡り活性を保持する（例えば２〜３から５〜１０倍の大きい安定性）。例えば本発明の薬剤は、特に薬剤がペプチドまたはその類縁体である場合は、他の知られた保護または安定化化合物にコンジュゲートすることにより、または免疫グロブリン鎖１つ以上のような担体タンパク質１つ以上に連結したペプチドまたは類縁体との融合タンパク質の作成により、薬剤を遮蔽することにより循環半減期が長くなるように修飾できる（例えば米国特許５，７５０，３７５；５，８４３，７２５；５，５６７，５８４および６，０１８，０２６号参照；各々は参照により本明細書に組み込まれる）。これ等の修飾は薬剤の分解、封鎖またはクリアランスを低減し、そして生理学的環境中（例えば循環系または脳脊髄液中）でのより長い半減期をもたらす。従って安定化方法により修飾された薬剤は本発明の方法において増強された薬効を持って有用となる。特にこのように修飾された薬剤は未修飾のペプチドまたは類縁体と比較してデリバリーの標的部位においてより長い期間、活性を維持する。
【０１４７】
本発明はまた上記した医薬組成物、活性成分および／またはアルツハイマー病の治療において使用するためのその投与手段を含むキット、パッケージおよびマルチコンテナ単位を包含する。慨すれば、これ等のキットは典型的には生物学的に適当である担体と共に薬学的調製物中に製剤された薬剤を含有するコンテナまたは処方を包含する。薬剤は場合により大量供給用コンテナまたはマルチ単位投与形態に含有される。パッケージ材料は場合によりそこにパッケージされた医薬品がアルツハイマー病の治療に使用できることを示したラベルまたは取扱説明書を含む。キットはまた適当な緩衝液、保存料、例えばプロテアーゼ阻害剤も含有してよい。
【実施例】
【０１４８】
以下の実施例は本発明の種々の特徴を説明しているのみであり、本発明を如何なる点においても制約するものではない。
【０１４９】
（実施例１：宿主細胞における遺伝子ライブラリの調製）
遺伝子ライブラリを発現ベクターのクローニング部位内にランダムオリゴヌクレオチドを挿入することにより調製する。発現ベクターは、転写の方向に対して相対的に５’の方向に、プロモーター、シグナル配列をコードする核酸、提示分子をコードする核酸、提示分子をコードする核酸の５’末端に位置するクローニング部位、膜貫通ドメインをコードする核酸および転写ターミネーターを含む発現カセットを有する。発現ベクターは複製起点（ＣｏｌＥ１）およびＥ．ｃｏｌｉ内での選択のための抗生物質耐性マーカーを含む。ランダムオリゴヌクレオチドは約７〜約２０アミノ酸残基のペプチドをコードする。オリゴヌクレオチドを含有するベクターを宿主細菌に形質転換し、そして、選択可能な条件下に生育させることにより約１０百万〜数１０億個の独立した単離株のライブラリを樹立する。ベクターＤＮＡをこのライブラリから調製する。このベクターＤＮＡを動物細胞、例えばヒト細胞、哺乳類細胞または他の動物細胞に導入する。
【０１５０】
（実施例２：ＡＰＰエフェクターの発現のためのランダムペプチドベクターの操作）
ＡＰＰエフェクターの発現のための好ましいランダムペプチドは図３に示すカセットインサートを有するレトロウィルスベクターである。カセットはプラスミド；分泌経路にタンパク質を進入させるための分泌配列；ランダムアミノ酸配列に構造を付与するジスルフィド架橋の形成を誘発するためのランダム配列の末端においてシステインをコードするランダムペプチド配列；グリシンスペーサー；提示タンパク質；細胞表面に可撓性を与えるための第２のグリシンスペーサー；および融合タンパク質を細胞表面に束縛させるためのＧＰＩリンカー配列をコードする。提示タンパク質はランダムペプチド配列が束縛され提示される球状の不活性タンパク質である。この配置によりランダムアミノ酸のペプチド環が可撓性を与えるグリシンのストリングの端部に束縛される。細胞と提示タンパク質との間のグリシンスペーサーもまた全体の束縛分子の可撓性をもたらす。ペプチド環に対する可撓性はＡＰへのランダムアミノ酸配列の結合による提示タンパク質からの立体障害を最小限にする。
【０１５１】
（実施例３：発現ベクターの構築）
宿主細胞の表面上のライブラリペプチドの高い発現水準を達成するために、発現ベクターを使用する。発現ベクターは細菌内における増殖および選択のために必要なマーカー、哺乳類細胞転写プロモーター（例えばサイトメガロウィルスまたはＥＦ−１αプロモーター等）を含む発現カセット、提示分子をコードする核酸および転写ターミネーターを包含する。ランダムライブラリ配列は提示分子をコードする核酸のＮ末端、Ｃ末端または内部に挿入でき、そして、提示分子の線状または制約されたループアレイ中か露出ループ中にあることができる。
【０１５２】
提示分子を宿主細胞の表面に結合させるためには、提示分子をコードする核酸は分泌シグナル配列をコードする配列および細胞表面に融合タンパク質を束縛するエレメント（例えばグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナルまたは膜貫通および細胞内ドメイン）を包含する。適当な提示分子は例えばＩＬ−３受容体、プロテインＡ、チオレドキシン、ＣＤ４、ＣＤ２０またはＣＤ２４を包含する。提示分子はまた１つ以上のエピトープ、例えばＦＬＡＧ、Ｖ５またはポリヒスチジンも包含できる。転写ターミネーターは、例えばヒト成長ホルモン由来のものであることができる。
【０１５３】
ＣＯＳ７およびＫ５６２細胞のような哺乳類細胞の細胞表面のペプチドライブラリを提示するために２つの異なる発現ベクターを構築した。１つの構築物は線状構造のＮ末端に約７〜約１２アミノ酸残基を有するペプチドを置き、もう一方の構築物はＮ末端における制約されたループを形成するためにペプチド配列の各末端においてシステイン残基を含む。各構築物はプロテインＡ、チオレドキシン、Ｖ５またはＦＬＡＧエピトープを含む提示分子、分泌のためのＣＤ２４由来の分泌シグナル配列、および、宿主細胞の表面への結合のためのＣＤ２４由来のＧＰＩ連結用配列コードしている。かなり大きい多様性のライブラリを作成できるが、完成したペプチド発現ベクターの各々の概ねの多様性は約１ｘ１０９のユニークペプチドである。
【０１５４】
（実施例４：ＡＰＰエフェクターの発見のための試験細胞系統の樹立）
ＡＰＰのエフェクターを発見するための試験細胞系統には以下の４つの主要な条件が存在し、即ち、１）細胞はＡＰＰプロセシング酵素の天然の補体を保有する必要があり、２）細胞はＡＰＰを構成的に生産する必要があり、３）細胞はこれ等の実験の高スループットの条件を促進するために懸濁細胞であり、そして４）スクリーニング系はＡＰＰの発現とプロセシングに関連する天然の生理学的条件を模倣する必要がある。
【０１５５】
ＡＰＰ発現細胞系統は、ＡＰＰをコードする哺乳類発現ベクターを構築すること、および、この発現ベクターを親細胞系統に導入することにより調製する。２種の細胞系統、即ち神経芽細胞系統およびヒト胚腎細胞系統（ＨＥＫ）がこれ等の試験のために典型的に使用されている。これ等の細胞系統の両方ともＡＰＰ実験において使用されている（Ｃｅｄａｚｏ−Ｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．３５：３０７−３１５，１９９９；Ｌｏｐｅｚ−Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７３：２０５６−２０６２，１９９９）。ＨＥＫ細胞系統は成育が容易であり、そして神経芽細胞系統よりも問題点が少なく、従ってこれ等の実験のために好適である。神経芽細胞系統は代替としての細胞系統である。
【０１５６】
これらの実験を容易にするために、ＨＥＫ細胞をスピナー培養条件に適合させる。適合は、細胞が血清非含有培地中で生育可能となるまで、静置培養において培地中の血清の量を徐々に減少させることにより達成される。次に細胞をスピナー培養容器に移して生育させる。これ等の操作法の両方でかなりの細胞死があるが、一部の細胞は生存し、生育する。これ等の条件下で最も良好に生育した細胞は、良好度が低い細胞よりも早く成育史、血清非含有スピナー培養条件下で良好に生育するように適合された細胞をもたらす。これ等の操作法は当業者の理解する通りである。
【０１５７】
ＡＰＰをコードするｃＤＮＡはＡＴＣＣまたはＩＭＡＴから入手するか、または、ＰＣＲ増幅により得られ、そしてＤＮＡ配列分析により確認する。ＡＰＰコードｃＤＮＡを哺乳類発現ベクター内に挿入し、親哺乳類細胞系統にエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションされた細胞をネオマイシン選択下でウェルの５０％において細胞生育が可能となる密度でマイクロプレート中にプレーティングし、クローン単離が可能な条件を得る。これ等の細胞系統のＡＰＰ発現は下記に示す通り蛍光顕微鏡観察および抗ＡＰＰ抗体を用いたＦＡＣＳ分析により評価する。
【０１５８】
本出願に記載したスクリーニング手法を良好に実施するためには、多数の細胞およびペプチド配列を操作してスクリーニングできることが重要である。懸濁培養細胞およびスピナー培養容器を使用することにより、一日当たり何十億もの細胞を生育、取り扱いおよび利用する方法が実施可能となる。
【０１５９】
（実施例５：ＡＰＰのインビトロ発現および産物の分析）
野生型のＡＰＰおよびＳｗｅｄｉｓｈ、Ａｒｃｔｉｃおよび／またはＤｕｔｃｈ突然変異を含むＡＰＰのクローンをＨＥＫ−２９３細胞において発現させた。突然変異体クローンの発現はＡＰＰプロセシングのエフェクターに関するインビトロのスクリーニング試験におけるプロセシングの相違を示すための対照として有用である。
【０１６０】
発現プラスミドを構築するために、完全長の野生型６９５アミノ酸ヒトＡＰＰをコードするクローン（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７３３−７３６，１９８７）を入手した。エクソン１のＮｒｕＩ部位〜３’ＵＴＲのＳｍａＩの３ｋｂのフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。このベクターはＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する。同様にＡＰＰＳｗｅおよびＡＰＰＡｒｃをコードするクローンをＣＭＶ−ＡＰＰＳｗｅおよびＣＭＶ−ＡＰＰＡｒｃの構築のための原料として使用した。
【０１６１】
これ等の構築物をＨＥＫ−２９３細胞に導入した。内因性セクレターゼによる切断によりＡＰＰタンパク質は数個のフラグメントにプロセシングされた。ＡＰＰタンパク質発現およびプロセシングは溶解物および擬似トランスフェクトされた（即ちＡＰＰ配列を有さないプラスミドでトランスフェクトされた）およびＡＰＰＳｗｅトランスフェクトされた細胞のコンディショニングされた培地のウエスタンブロット分析により評価した。完全長ＡＰＰおよびＣ末端フラグメントＣ９９、Ａβ、ＡＰＰＳ−αおよびＡＰＰｓ−βはＡβ配列のアミノ酸１〜１６を認識する６Ｅ１０抗体を用いて検出した。完全長ＡＰＰ、Ｃ９９およびＡβはＡＰＰＳｗｅトランスフェクト体由来の細胞溶解物中に存在した。細胞溶解物中のＡβの発見は分泌経路内のプロセシングの結果であると考えられる。ＡＰＰＳ−αおよびＡβはＡＰＰＳｗｅトランスフェクト体由来のコンディショニング培地中にも検出された。ＡＰＰＳ−αおよびＡＰＰｓ−βはそれぞれ６Ｅ１０抗体およびＳｗ１９２抗体を用いたＳｗｅｄｉｓｈまたはＳｗｅｄｉｓｈ／Ａｒｃｔｉｃ突然変異をトランスフェクトした細胞のコンディショニング培地中にも発見された。抗体Ｓｗ１９２（Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）はβ−セクレターゼ如リ切断された場合にのみＡＰＰＳｗｅのアミノ酸５９０〜５９６を認識する。
【０１６２】
（実施例６：レトロウィルス感染）
レトロウィルス発現ベクターはパッキング細胞系統（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９，１９９３）中にパッケージされ、セクレターゼプロセシング酵素およびＡＰＰを含有する試験細胞を感染するために利用される。融合タンパク質は分泌シグナルの影響下に分泌経路を介して進入して通過し、細胞表面上の提示を持って終了する。細胞表面において、提示タンパク質、グリシンスペーサーおよびランダムアミノ酸配列を含む融合タンパク質（ディスプレイ複合体）はＧＰＩ連結部を介して細胞に結合する。セクレターゼの一部によるＡＰＰのプロセシングは分泌経路の通過中、並びに、細胞表面において起こると考えられる（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．８１：７４１−７６７，２００１）。ディスプレイ複合体およびＡＰＰは同様に分泌経路を通過し、そして共通の過程において細胞の表面上にディスプレイされる。従って、ランダムアミノ酸配列が存在し、そして、有効なペプチドは分泌経路内並びに細胞表面上でその構造を改変するＡＰＰに結合する機会を有する。図４はディスプレイ複合体の立体配置を示す。
【０１６３】
（実施例７：トランスフェクトされた細胞の富化）
細胞はＤＮＡを取り込んでそれを発現する効率が異なる。発現可能なＤＮＡの導入がそれほど効率的でない場合は、場合により、発現ベクター（例えばプラスミド）を含有し、そしてＤＮＡを旨適発現する細胞を富化することができる。遺伝子ライブラリを含有する細胞の富化を行うためには、マーカーをコードする配列のような標識を発現ベクターに包含させる。このようなマーカーは典型的には細胞に結合したまま残存する。マーカーをコードするこの配列は例えば転写プロモーターおよびターミネーター、分泌シグナル配列（例えばＣＤ２４）をコードする配列、１つ以上の細胞外ドメイン（例えばＶ５、ＦＬＡＧ等）およびマーカーを細胞表面に束縛する配列（例えばグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナル）であることができる。２つの異なるマーカー（例えばＶ５とＦＬＡＧ）の間にペプチドライブラリを置くことは提示分子中の両方のマーカーを含有し、そして宿主細胞の表面上で発現される細胞のみを選択することによりペプチドライブラリの一貫性を確実にする。
【０１６４】
実施例３に記載した発現ベクターを使用することにより、平均で細胞当り１個または数個のみのベクターが導入されるような条件を用いたエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞をトランスフェクトした。細胞をトランスフェクト後に培地に入れ、そして種々の時点において、ＦＡＣＳで分析することにより細胞表面または内部におけるチオレドキシンまたはＦＬＡＧの発現を検出した。各場合において、比較的高い比率の細胞がトランスフェクト後の１日に提示分子（例えばチオレドキシン−抗チオレドキシン抗体を用いて検出）を発現し、分子は次の週にわたって持続していた。これ等の結果は提示分子が数日間比較的高い水準で発現されることを示している。
【０１６５】
ペプチドライブラリを発現するトランスフェクトされた宿主細胞はまたＦＡＣＳ分析または磁気ビーズ上の選択を行う前に、パラホルムアルデヒドに固定した。結果によれば、マーカーエピトープは固定後もなお抗体に接触可能であり、ライブラリペプチドが標的分子への結合のために使用できたことを示していた。
【０１６６】
同様の実験によれば、ペプチドライブラリをコードするプラスミドベクターでエレクトロポレーションによりトランスフェクトしたＫ５６２細胞は８０％細胞生存率で約５０％の効率でトランスフェクトされた。旨適発現期間はトランスフェクトした後１日〜２日であった。Ｋ５６２細胞上で発現された提示分子の水準は、Ｋ５６２細胞はＣＯＳ７細胞と同様にプラスミドベクターを増幅しないため、ＣＯＳ７細胞より低値であった。しかしながら、標識抗ＦＬＡＧ抗体の局在により示されるとおり、十分な提示分子がＫ５６２細胞表面上に発現された。
【０１６７】
結果によれば、哺乳類細胞の表面上のペプチドライブラリのディスプレイのための頑健な系であることがわかった。細胞へのＧＰＩ連結を介した提示分子の束縛およびチオレドキシンおよびＣＤ２４由来のドメインの使用により、ペプチドライブラリの持続的で安定な発現がもたらされる。更にまた、提示分子のＮ末端におけるペプチドの設置は、細胞表面から比較的遠隔であり、そして高度に望ましい親水的な環境において潜在的標的分子へのペプチドの妨害されない接触を確保するものである。
【０１６８】
（実施例８：ＡＰＰに結合するペプチドの予備スクリーニング）
ＡＰＰに結合してその構造を改変するペプチドの構造の利点のため、そしてＡＰＰに結合するペプチドの全てがタンパク質のタンパク質分解プロセシングをモジュレートしないがプロセシングに影響するペプチドの全てがＡＰＰに対する高親和性の結合を有することが期待されるため、ＡＰＰに単純に結合するペプチドの予備富化が行われる。本方法により作成されスクリーニングされる構造は多数であるため、この富化過程のためにはファージディスプレイを使用する。更にまた、ファージディスプレイ選択法は高親和性結合ペプチドの発見のための更にストリンジェントなスクリーニング条件を可能にする。ファージディスプレイペプチドライブラリは市販品（即ちＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるか構築することができる。ペプチド配列は線状の可撓性の構造として、または、相対的に剛性の構造を示す制約されたループとして整列させることができる。エフェクターペプチドは３または４アミノ酸残基長の小型、５、６、７〜２０アミノ酸またはより多いアミノ酸残基長のものであることができる。
【０１６９】
ＡＰＰ細胞外ドメインおよびＮ末端短縮型は、精製を容易にするためのＨｉｓタグを使用しながら細菌およびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞または他の哺乳類宿主細胞中で発現させる。これ等の形態はＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ抑制剤ドメイン配列のすぐ３’側のヌクレオチド４５７から始まり、他端がヌクレオチド５５０にある分子、およびＮ末端官能基は除外されるが膜外のアミノ酸残基にβ切断部位近傍でランダムコイル配列を含む分子を包含する。これ等のアフィニティー分子の生産、安定性および精製に容易さにより選択される分子が決定される。
【０１７０】
ランダムペプチド配列を発現するファージをＨｉｓタグ細胞外ドメインＡＰＰに曝露し、そしてＨｉｓアフィニティーカラムに通すか、または、表面Ｎｉ２＋を含有する磁気ビーズに予め結合させたＨｉｓタグＡＰＰ分子の特定の形態に曝露する。富化の２または３ラウンドの後、ランダムペプチドををコードするヌクレオチド配列を富化されたファージのＤＮＡから切り出し、そしてレトロウィルスベクターに転移させる。この富化工程により、プロセシング酵素の活性を改変したり何らかの他の態様でプロセシングの変化をもたらすよりはむしろ、ＡＰＰに結合することによりＡＰＰプロセシングを改変するペプチドの発見の確率が高くなる。ランダムに選択されたペプチドはまたコンセンサス結合モチーフの存在を評価するために配列決定される。
【０１７１】
（実施例９：エフェクターペプチドのスクリーニング）
試験細胞を約数十億以上の多数で成育させる。細胞をペプチドライブラリをコードするレトロウィルスに感染させる。生育２日の後、ビオチニル化抗提示タンパク質抗体およびストレプトアビジンコーティングビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてディスプレイ複合体を発現している細胞を得るための磁気ビーズ選択法により細胞を選択する。選択により細胞表面上にディスプレイ複合体を発現している細胞が富化される。これにより感染していない細胞およびランダムＤＮＡ配列内の終止コドンにより早期に停止している配列を発現する細胞が排除される。ランダムペプチド配列をコードする半ランダムＤＮＡを用いて終止コドンを最小限にできるが、完全には排除しない（ＬａＢｅａｎ ａｎｄ Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：１２４９−１２５４，１９９３）。終止コドンの頻度はランダムペプチド配列の長さに関係する。約７、または約１２、または約１６アミノ酸残基のアミノ酸長芽典型的には使用される。
【０１７２】
磁気ビーズ選択法はまた、感染しており、完全長の束縛されたディスプレイ複合体を合成する能力を有するが、例えば染色体内のサイレントな発現部位への組み込みのためディスプレイ複合体の十分な量を発現しない細胞も排除する。従って選択はＡＰＰの構造を改変するために有効なディスプレイタンパク質の十分な水準を発現する細胞を与える。この立体配置の有効性はトロンボポエチン受容体を発現する生育依存性Ｂａ−Ｆ３細胞中で束縛されたエフェクターペプチド配列を発現することにより明らかにされている。束縛されたエフェクターペプチドは以前の生育依存性の細胞系統に成育非依存性を付与する。これは受容体の活性化および細胞の生存をもたらす細胞表面受容体の構造を束縛ペプチドが改変できることを示している。
【０１７３】
ビーズ富化細胞は、ＡＰＰの異なるフラグメントを認識する識別的に標識された抗体を利用した蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により分類する。増大したα−セクレターゼプロセシングをもたらすペプチドを富化したい場合は、ソーティングは、ＡＰＰＳ−αのＣ末端に相当するａ−ｂ内のアミノ酸３〜１０を認識するＰＥ標識抗体（６Ｅ１０、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）とｐ３のＮ末端に相当するＡβのアミノ酸１６〜２４を認識するＦＩＴＣ標識抗ｐ３抗体（４Ｇ８、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）との間の蛍光の比の変化に基づいて行われる（図５参照）。ランダムペプチド配列を有さない発現ベクターを感染させた対照細胞は対照ＰＥ／ＦＩＴＣ比を与える。低下したＰＥ／ＦＩＴＣ蛍光比を有する細胞を収集する。
【０１７４】
同様に、ＦＩＴＣ標識抗ＡＰＰｓ−β（ＡＰＰ中央領域に特異的なＡ３またはＩｇ７、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｍ．２６９：１７３８６−１７３８９，１９９４）のＰＥ標識抗体（６Ｅ１０）抗ＡＰＰＳ−α蛍光に対する増大した比を有する細胞を収集することによりβ−セクレターゼのタンパク質の低減をもたらすペプチドを得るために細胞を分類する（図５参照）。
【０１７５】
ＡＰＰエフェクター試験系をセットアップして試験するために、αおよびβ部位における切断の量に影響する試薬および条件を使用して試験の感度および有効性を明らかにする。例えば、試験細胞をα−またはβ−セクレターゼをコードする発現ベクターでトランスフェクトする。これによりこれ等の部位におけるプロセシングが増大し、細胞試験により明らかにされる。ＦＡＣＳで富化細胞が得られた後、ランダムペプチドをコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅により細胞から回収し、そしてペプチドライブラリ発現ベクター内に再クローニングする。当業者の知るほう操作法を用いる。単離されたクローンは細菌中で増幅し、レトロウィルスパッキング細胞に再パッケージし、ナイーブの試験細胞を感染させる多面胃使用し、そして、真のエフェクターペプチドをコードするクローンが得られるまで富化工程を反復する。ランダムペプチド配列をコードするクローンのＤＮＡ配列分析によりエフェクターペプチドの配列が明らかになる。
【０１７６】
１つ以上のエフェクターペプチドが発見された後、エフェクターペプチドがＡＰＰの構造に影響する能力について試験する。エフェクターペプチドの結合のための方法はよく知られており、そして、ペプチドライブラリを予備スクリーニングするための上記した方法を包含する。
【０１７７】
（実施例１０：エフェクターペプチドの特徴付け）
エフェクターペプチドを特徴付けすることにより可溶性Ａβがエフェクターペプチドの影響下の培養において低減することを示す。エフェクターペプチドの発現の存在下および非存在下における試験細胞由来の培地のＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを用いて所望の作用を確認する。
【０１７８】
１つの試験においては、ＡＰＰのα−セクレターゼプロセシングを増大させるエフェクターペプチド（本明細書においては「ＥＭαペプチド」）をＨＥＫ２９３細胞またはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中でヒトＡＰＰと同時発現する。完全長ＡＰＰの発現水準はウエスタンブロット分析（抗体６Ｅ１０または２２Ｃ１１）によりエフェクターペプチドの存在下または非存在下において測定する。更にまた、エフェクターペプチドを試験する効率は、それがペプチド発現後の培地Ｔｕｍ−でプロトフィブリルおよび単量体可溶性Ａβ１〜４０およびＡβ１〜４２の水準を低減する能力を評価する。ＡβプロトフィブリルおよびＡβ１−４０／４２の水準は種々の異なる抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定する。市販の抗体（即ちＢｉｏｓｏｕｒｃｅ／ＱＣＢ ｃａｔ＃４４−３４８および４４−３４４）を用いてそれぞれＡβ４０およびＡβ４２を特異的に定量する。
【０１７９】
同様に、ＡＰＰおよびＡβ４０およびＡβ４２の発現水準に対するＡＰＰのβ−セクレターゼプロセシングを低減するペプチド（本明細書においては「ＥＭβペプチド」）の作用を同様の態様で特徴付けする。
【０１８０】
近傍のプロセシング活性に対するＥＭαおよびＥＭβペプチドの作用もまた特徴付けする。ＥＭαペプチドを発現する細胞においては、ＡＰＰｓβ、ＡＰＰｓγ並びにＣ末端フラグメントＣＴ９９の放出を、ＥＭαペプチドが発現されない場合のこれ等のフラグメントの放出と比較する。異なるフラグメントパターンは干渉作用を示している。同様にして、ＡＰＰｓα、ＡＰＰｓγ、ｐ３およびＣＴ５７／５９の放出をＥＭβペプチドの発現の存在下または非存在下において測定する。
【０１８１】
ＥＭαまたはＥＭβペプチドの特異性または薬効が家族性ＡＤ突然変異において改変されているかどうかも調べる。以下のＡＰＰ突然変異をこの試験において使用する。
（ａ）Ｓｗｅｄｉｓｈ（Ｌｙｓ６７０Ａｓｎ；Ｍｅｔ６７１Ｌｅｕ）、β−切断部位に対しＮ末端の２アミノ酸；
（ｂ）Ｆｌｅｍｉｓｈ（Ａｌａ６９２Ｇｌｙ）、α−切断部位に対しＣ末端の５アミノ酸；
（ｃ）Ｄｕｔｃｈ（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ）、α−切断部位に対しＣ末端の６アミノ酸；
（ｄ）Ａｒｃｔｉｃ（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｙ）、α−切断部位に対しＣ末端の６アミノ酸；および、
（ｅ）Ｉｏｗａ（Ａｓｐ６９４Ａｓｎ）、α−切断部位に対しＣ末端の７アミノ酸。
【０１８２】
更にまたＡＰＰタンパク質およびＡＰＰプロセシング比に対するＥＭαまたはＥＭβペプチドの親和性または会合の速度動態にＡＰＰ突然変異が影響するかどうかも調べる。結合試験は野生型ＡＰＰおよび突然変異形態のＡＰＰを発現するＨＥＫ２９３細胞とともに放射標識ＥＭαまたはＥＭβをインキュベートすることにより実施する。
【０１８３】
β−部位のプロセシングはＡＰＰがＳｗｅｄｉｓｈ突然変異を含んでいる場合に有意に増大する（Ｍｕｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３４５−３４７，１９９２参照）。例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異を含んでいるヒトＡＰＰを発現するトランスジェニックマウス（ハムスタープリオンプロモーター−ｈＡＰＰＳｗｅ）において、ＳＤＳ可溶性Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドは５箇月齢の２１および６ｐｍｏｌ／ｇから２１ヶ月の１１，１００および２，０００ｐｍｏｌ／ｇにそれぞれ増大する（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３７２−３８１，２００１）。ＡＰＰＳｗｅとのＥＭβペプチドの同時トランスフェクションは、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異がβ−部位切断に対するＥＭβペプチドの抑制作用に影響するかどうかを示す。同様に、ＥＭαペプチド刺激α−切断に対する上記したα−部位近傍のＡＰＰ突然変異（ｂ）−（ｅ）の作用も評価する。
【０１８４】
Ａβの量の低減におけるエフェクターペプチド（ＥＰ）の効力もまたＡβを過剰発現する適当なトランスジェニック動物モデル、例えばＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．Ｋ６７０Ｎ／＜６７１Ｌ）２５６７またはＰＤＡＰＰにおいて評価できる（例えば後述する実施例１１および１２参照）。
【０１８５】
更に別の特徴付けではペプチドの標的の発見を行う。これらの実験はディスプレイ複合体（束縛されたペプチドを有する提示タンパク質）並びにペプチド単独をアフィニティー標識として利用する。ＡＰＰへのペプチドの結合はペプチドを標識すること、および、ＡＰＰの細胞外ドメインへの結合を評価することにより調べる。蛍光標識されたペプチドもまた、ＡＰＰを発現しない対照試験細胞と比較しながら、ＡＰＰを発現する試験細胞への結合を評価するために使用される。
【０１８６】
プロセシング酵素への結合を評価するために、標識されたペプチドを用いて親試験細胞へのペプチドの結合およびプロセシング酵素を発現しないことがわかっている細胞への比較ペプチドの結合を測定する。更に別の特徴付けは、可溶化細胞溶解液と混合され、そしてイオン交換およびサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより分画された標識ペプチド、２−Ｄ電気泳動およびタンパク質スポットの質量スペクトル分析により他の細胞成分への結合を測定することを含む。エフェクターペプチドは、ＡＰＰへの結合を伴うことなく、または他の重要な生体分子のプロセシングを改変することなく、Ａβの減少をもたらす別の細胞分子に結合して機能を改変することもありえる。
【０１８７】
（実施例１１：トランスジェニックマウスにおけるＡＰＰプロセシングのエフェクターのインビボの薬効の試験−直接ペプチド投与）
ＥＭαペプチドのインビボの薬効試験は、ＡＰＰα−セクレターゼの切断速度を刺激するその能力、および、脳におけるＡβプロトフィブリルおよびＡβ４０／４２の水準を低下させることを測定する。プロトフィブリルの濃度および脳分布はＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学法によりプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体を用いて試験する。プラーク負荷は４％パラホルムアルデヒド中の脳組織の灌流と固定化、および、Ａβ抗体による免疫染色を含む標準的な操作法を用いて測定する（例えば前述した６Ｅ１０を用いる（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１４４４−１４５１，２００１参照））。
【０１８８】
ＥＭαおよびＥＭβペプチドの初期の試験は血液脳関門通過特性を測定するためにＴｇマウスへの皮下または腹腔内注射によるペプチドの直接投与を含んでいる。通過は、それぞれ、抗ＥＭαまたは抗ＥＭβペプチドＥＬＩＳＡ法を用いてＣＳＦおよび脳灌流後の脳ホモジネート中のＥＭαまたはＥＭβを測定することにより評価する。異なる用量を試験し、脳およびＣＳＦ中で得られるペプチドの水準に相関付ける。インビボ実験はそれぞれ有意なα−セクレターゼの刺激またはβ−セクレターゼの阻害を得るために必要とされるＥＭαまたはＥＭβペプチドの濃度に関する情報を与える。代替となる更に高感度の方法は、ペプチドを放射標識（ヨウ素化）してＣＳＦおよび脳ホモジネート中の放射能を測定することである。この方法はより高感度であるが、ペプチドの修飾のために誤差のある結果が得られる場合がある。更にまた、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの半減期は、動物薬効試験における用量頻度に関する指針として、標準的な方法を用いてＣＳＦ、脳および血清中で測定する。経時的にＥＭαまたはＥＭβペプチドのＣＳＦ／脳濃度が一定であることが典型的には望ましい。ＥＭαまたはＥＭβペプチドが満足できる通過特性を示す場合、次に薬効試験を実施する。しかしながら、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの通過特性が満足できない場合は、ペプチドの直接のｓｃまたはｉｐ投与による薬効試験は実施しない。代替法は浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を用いたｉｃｖによりペプチドを供給するか、または、Ｔｇマウスの脳内のペプチドの直接の発現（後述参照）による。
【０１８９】
１つの試験において、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの薬効試験は直接ペプチド投与による。直接投与による薬効試験ではＴｇマウスに４〜６ヶ月ＥＭαまたはＥＭβを投与し、エンドポイントとしてＡβ４０／４２およびＡβプロトフィブリルの水準を低下させる。Ａβ水準の低下は、プロトフィブリルの形成はＡβ１−４０およびＡβ１−４２の濃度に依存していることから、Ａβプロトフィブリルの低下をもたらすと考えられる。適当なマウス系統はｍＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅであり、これは本発明者等の研究室で進行中であり、十分樹立されたＡＤモデルと同様であるＳｗｅｄｉｓｈ突然変異を含有するヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の６９５アミノ酸のアイソフォームに対するトランスジーンコーディングを担持している（Ｈｉｓａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２，１９９６参照）。即ち、ｍＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅはＡβ１−４０およびＡβ１−４２の有意な時間依存性の増大、大量のアミロイドの付着、加齢相関性の脳コレステロールおよびＡｐｏＥの上昇、並びに、改変されたシナプス有効性を示すと考えられる（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３７２−３８１，２００１）参照。この「Ｈｉｓａｏ−ＡＰＰマウス」モデルはまた挙動不全を発症することがわかっている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１８５８−１８６７，２００２参照）。
【０１９０】
薬効試験はまたＳｗｅｄｉｓｈおよびＡｒｃｔｉｃ突然変異の両方を含有する二重トランスジェニックモデル（ｍＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅＡｒｃ）においても実施する。このモデルは脳におけるＡβＡｒｃプロトフィブリルの高水準をもたらすモデルを樹立するために開発された。Ａβプロトフィブリルは神経毒性（Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８８７６−８８８４，１９９９参照）であり、そして早期シナプス機能に影響する（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：７８９−７９１，２００２参照）。Ｎｉｅｌｓｂｅｒｔｈ等（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：８８７−８９３，２００１）はＡｒｃｔｉｃ突然変異がより高いプロトフィブリル安定性および形成速度を与え、これによりＡＤの早期の発症をもたらすことを明らかにしている。
【０１９１】
アミロイド付着前の早年期における、そして、Ａβ水準が殆ど加齢依存性を示さない時期におけるＥＭαまたはＥＭβペプチドの短期の投与（２〜３週間）はインビボのＡＰＰプロセシングを改変するそれらの機械的能力を評価するものである。更にまた、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの予防上の作用はアミロイド付着の発症前に開始し、トランスジェニックマウスモデルが頑健なアミロイド付着を示すことがわかっている磁気まで継続する長期の投与により、若年Ｔｇマウスにおいて評価される。最後に、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの治療上の作用はアミロイド付着の発症後の加齢マウスへの長期の投与により検討される。アミロイドの病理の種々の尺度を測定することにより薬効および安全性が評価される（例えばＡβおよびチオフラビンＳプラーク負荷、抽出可能なＡβ１−４０およびＡβ１−４２、Ａβプロトフィブリル、逐次抽出により評価（トリス緩衝食塩水、トリトンＸ−１００、ＳＤＳおよびギ酸）およびＥＬＩＳＡ）。神経変性変化のような二次的な組織の損傷（ニューライトの萎縮、シナプス消失、酸化的損傷）もまた主に免疫組織化学的検査および定量的な画像分析により分析される。脳炎の伝統的なマーカー、例えばＧＦＡＰ（大グリア細胞腫）およびＭＡＣ−１／ＣＤ１１およびＩＬ−１（小神経膠細胞症）並びに他のプロ炎症性サイトカイン、例えばγ−ＩＦＮ、ＩＬ−２およびＩＬ−６および抗炎症サイトカイン、例えばＴＧＦ−α、ＩＬ−４およびＩＬ−１０が測定される。認識不全の予防は伝統的なＭｏｒｒｉｓの水迷路よりも「エピソード様」の記憶に対してより感受性が高いラジアルアームの水迷路において試験される。
【０１９２】
（実施例１２：トランスジェニックマウスにおけるＡＰＰプロセシングのエフェクターのインビボの薬効試験−インビボペプチド発現）
ＥＭαまたはＥＭβペプチドの血液脳関門通過特性が満足できない場合は、薬効試験の代替の手法をトランスジェニックマウスの脳におけるエフェクターペプチドの直接インビボ発現により行う。ともにＥＭαまたはＥＭβペプチドのコーディング配列が例えばＴｈｙ−１プロモーターを用いてニューロン内で発現される２種の異なる発現ベクター構築物を作成する。１つのＤＮＡ構築物（本明細書においてはＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＳ）はエフェクターペプチドが脳内で分泌（Ｓ）された形態において発現されるように操作され；他方のＤＮＡ構築物（本明細書においてはＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＭ）はＧＰＩリンカーを含有し、これにより発現されたペプチドをニューロン膜（Ｍ）にターゲティングさせる（図８参照）。次にＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＳおよびＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＭトランスジェニックマウスを標準的な操作法を用いて作成する。
【０１９３】
Ｔｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＳおよびＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＭトランスジェニックマウスをＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅおよびｍＴｈｙ−ｈＡＰＰＳｗｅＡｒｃトランスジェニックマウスと高配させ、インビボのＥＭαまたはＥＭβペプチドの薬効を測定する。これ等の複数のトランスジェニックモデルはまたＡＰＰプロセシングのコンパートメント化に対するペプチドの作用を特徴付けするためにも使用される。分泌型または膜結合型（例えばＥＲ−、Ｇｏｌｇｉ−、原形質膜−結合型）ＥＭαペプチドのＡＰＰα−セクレターゼ分解速度に対する作用を測定する。同様に、分泌型または膜結合型びＥＭβペプチドのβ−セクレターゼ分解速度に対する作用を測定する。これらの被験は重要なインビボのデータ、例えば増大したα部位プロセシングまたは低減したβ部位プロセシングがＡβプロトフィブリルおよびＡβ４０／４２の水準の低下、より低いアミロイド付着、低い炎症および／または改善された認識機能に翻訳されるかどうかに関するものを与える。
【０１９４】
本発明は請求した本発明の範囲を説明するためのものでありこれを限定するものではない。本発明の他の変形例は当業者には自明であり、添付の請求項に包含される。本明細書において引用した全ての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】図１はアルツハイマー病をもたらすアミロイドカスケードを示す。
【図２】図２はβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびその主な代謝誘導体の模式的ダイアグラムである。上のダイアグラムは７７０アミノ酸を含む既知のＡＰＰオルタナティブスプライシング型の最大のものを示す。アミノ酸７７０〜７２３における単一の膜貫通ドメインは垂直の破線で示す。β−アミロイド（Ａβ）フラグメントは膜外側の２８アミノ酸プラスＴＭドメインの最初の１２〜１４残基を含む。矢印はプロセシング酵素によるタンパク質分解の部位を示す。種々のタンパク質分解フラグメントを標識する（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．８１：７４１−７６７，２００１）。
【図３】図３はＡＰＰのエフェクターペプチドの発見のためのレトロウィルス構築物用のランダムペプチドおよび提示タンパク質の発現のための発現カセットの代表を示す。
【図４】図４はシステインループの立体配置におけるランダムペプチド配列を有する細胞の表面上に発現された提示タンパク質の代表を示す。
【図５】図５は標識されたフラグメントを有する細胞表面上のＡＰＰ、切断部位、ＡＰＰのフラグメントを認識する抗体、および、ＡＰＰの改変されたプロセシングを検出するための蛍光の比を使用した手法を示す。
【図６】図６は本発明で使用するために適するＣＤ２４Ｖ５融合タンパク質およびチオレドキシン−ＦＬＡＧ融合タンパク質をコードするｐＩｃｏＤｕａｌと命名された発現ベクターの一例を示す。
【図７】図７はＣＤ２４Ｖ５融合タンパク質およびチオレドキシン−ＦＬＡＧ融合タンパク質をコードするｐＩｃｏＦＬＡＧＸａと命名された発現ベクターを示し、ここでＸａ因子アミノ酸基質配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ（配列番号５）をコードするＤＮＡがランダムペプチド配列をコードする部位に挿入されている。
【図８】図８はトランスジェニックマウスにおけるエフェクターペプチドのインビボの発現のためのＴｈｙ１−ＥＭα／ＥＭβＳ（Ｓ）およびＴｈｙ１−ＥＭα／ＥＭβＭ（Ｍ）発現構築物を示す。「ＥＭα／ＥＭβ配列」とはＥＭαペプチド（即ちα−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを刺激するエフェクターペプチド）またはＥＭβペプチド（即ちβ−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを抑制するエフェクターペプチド）の何れかのヌクレオチドコーディング配列を示す。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００２年１１月４日出願の米国出願６０／４２４，０３１号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アルツハイマー病の神経病理学的特徴は、脳内の細胞外タンパク質付着物の蓄積である。これ等の付着物にはアミロイド含有プラークおよび血管壁内のアミロイドを含む。アミロイドプラークの主要成分はβ−アミロイド（Ａβ）と称される３９〜４２アミノ酸残基の自己凝集性ペプチドである。特にアルツハイマー病の家族型におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびプレセニリン（ＰＳ）ノ遺伝子ノ突然変異の発見の後、疾患を誘発する機序の理解がかなり進歩した。これ等の突然変異は脳内のＡβタンパク質の上昇した水準をもたらす（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ ８１：７４１−７６６，２００１）。
【０００３】
Ａβタンパク質は身体の大部分の組織に渡って発現される膜貫通タンパク質であるＡＰＰのタンパク質分解フラグメントである。図２はＡＰＰの構造、形成されるタンパク質分解フラグメントおよびこれ等のフラグメントを生成することがわかっているそれぞれのプロセシング酵素を示す。ＡＰＰタンパク質はα−セクレターゼ、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼを含む少なくとも３種の異なるプロテアーゼによりプロセシングされる。アミノ末端切断に関与するβ−セクレターゼは最近発見され、クローニングされた（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：５３７−５４０，１９９９）。このＢＡＣＥプロテアーゼはＡｓｐ−１およびＧｌｕ−１１で開始するＡβを優先的に放出する。ＡＰＰのカルボキシ末端を放出するγ−セクレターゼ切断は見かけ上はＡＰＰの予測される膜貫通ドメインにおいて起こる。γ−セクレターゼはタンパク質の複合体、最も重要なものはプレセニリン１であるタンパク質の複合体よりなる（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：２１７−２２４，２０００）。
【０００４】
β−およびγ−セクレターゼの切断により分泌された可溶性Ａβペプチドが生じる。ニューロンにおいては、僅か５％のＡＰＰ分子のみがＡβ発生経路を経由するのに対し、９５％のＡＰＰ分子はＡβの形成を抑制する非アミロイド原性経路を通じてα−セクレターゼによりプロセシングされる（Ｌａｍｍｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：３９２２−２９２７，１９９９）。より量が酢ｋなくより疎水性であるＡβ物質種であるＡβ１−４２は最近になってアルツハイマー病において観察される早期の病理学的変化に関連することがわかった。アルツハイマー病の家族型に関連する突然変異はＡβの細胞生産を増大させることがわかっている。即ちＡβペプチドは、Ａβがプロトフィブリル、フィブリルおよびその後のアミロイドプラークを形成するアルツハイマー病をもたらす病理学的過程における中枢的な分子である。即ち、Ａβの増大した生産または低減したクリアランスはアミロイドプラークの形成とその後のニューロン変性をもたらす過程を開始させる。最近の研究によれば、プロトフィブリルと称されるＡβの凝集物はニューロン死に寄与する毒性の実体であることが示唆されている（Ｇｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１４９１−１４９５，２００１）。従って、アルツハイマー病患者の脳におけるＡβペプチドを低下させる何れかの治療法は大きな臨床的価値を有すると考えられる。図１はアミロイドカスケードと称される過程としての疾患の現在の知見である。
【０００５】
タンパク質の構造、そして、結果としてタンパク質の活性またはそれが基質として機能する能力も修飾する分子（エフェクター）の発見は、タンパク質の内因的構造の性質および生体系における他の構造とどのように相互作用するかにより異なる。タンパク質機能はタンパク質のアミノ酸組成およびアミノ酸配列により決定される３次元構造に依存している。タンパク質はその構造に基づいて生体系中の他のタンパク質および構造、および、他の相互作用分子の構造により影響を受ける。タンパク質の構造は、タンパク質の活性または他のタンパク質による影響の受け易さを増大または低減する場合がある他の分子との相互作用（アロステリック相互作用）により変化する場合がある。例えばβ−セクレターゼの切断部位の近傍に位置するＡＰＰ突然変異の研究によれば、局所的なα−へリックス性は、恐らくはエンドプロテアーゼとその構造との直接の相互作用により切断効力に寄与していることが示唆されている（Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６０７５−６０７９，１９９２）。同様に、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異（Ｍｕｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：３４５−３４７）として発見されたＡＰＰのアミノ酸配列の変化が、ＡＰＰの構造を変化させ、そして、α切断部位におけるＡＰＰのプロセシングを増大させる。
【０００６】
ペプチドはタンパク質と相互作用してその構造、そして結果としてタンパク質の活性または他のタンパク質による影響の受け易さを変化させることができる構造である。構造的エフェクターとしてのペプチドは、極めて大きい構造的多様性を有するライブラリが組み換え法により容易に作成でき、そして好ましい表現型の挙動を発見する操作法を用いて容易にスクリーニングできることから、注目に値するものである。これ等のペプチドエフェクターはある構造が所望の構造的変化を誘発する有効性をバリデーションするために使用できる。ペプチド構造は例えば生物学的に安定で、血管脳関門を容易に通過し、そして経口製剤に適しているペプチドミメティック構造を設計し、開発するためのモデル化合物構造として使用できる。
【０００７】
タンパク質への特異的結合を介して細胞の家庭に影響するペプチド（本明細書においては「ペプチドエフェクター」とも称する）を発見するためのスクリーニング方法が開発されている。ランダムペプチドライブラリの利用は構造的に多様なペプチドの大きいライブラリを作成してスクリーニングするために開発された多くの方法により明らかにされている。化学的戦略のほかに、このような方法には生物学的発生に依存した系を含んでいる（例えばＳｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｎｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０，１９９０（ファージディスプレイ）；Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許５，６５８，７５４号（インビトロリボソームディスプレイ）；Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９，１９９２（ｌａｃリプレッサーノＣ末端上に発現されたランダムペプチド配列）；Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３６６−３７２，１９９５（Ｅ．ｃｏｌｉのフラゲリン上に発現されたチオレドキシンランダムペプチドライブラリ）；Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６９−２７２，１９９７（細菌の表面上に発現された反復ポリペプチド）；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ａｎｄ Ｈａｍｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１５：３８８−４０４，２００１（ｍＲＮＡディスプレイ）；Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５４６７−５４７３，２００１（采ディスプレイペプチドライブラリ）を参照）。最も最近では、Ｒｉｇｅｌ Ｉｎｃ．が哺乳類細胞において表現型の変化を改変するペプチドを発見するためのランダムペプチドライブラリのインビボの導入の利用を明らかにしている（例えばＫｉｎｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．２７７：３７５１２−３７５１８，２００２参照）。
【０００８】
しかしながら、現在の方法は細胞分泌経路において標的分子と相互作用するペプチドエフェクターの発見を可能にしておらず、従って、分泌経路を経由する移行の間のＡＰＰのプロセシングに影響するこのようなペプチドの発見には適していない。ＡＰＰと同様、ＡＰＰプロセシング酵素、例えばα−、β−およびγ−セクレターゼは分泌経路を通過し、そして細胞表面上にも存在する。一部の方法は原形質内において細胞内で小型のペプチドおよびポリペプチドをスクリーニングするために開発されているが（例えばＦｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−４６，１９８９；Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−６９，１９９２；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１３：３６６−７２，１９９５；国際特許出願ＷＯ９９／２４６１７；Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：５９１−９５，１９９９）；国際特許出願ＷＯ９８／３９４８３）参照）、ＡＰＰおよびＡＰＰプロセシング酵素のような分泌分子は大部分の他のシトゾル分子またはオルガネラと混合されないコンパートメント内に封鎖されている。このため、現在の方法はＡＰＰのネイティブの分泌環境を温存していない。
【０００９】
更にまた、現在の方法は細胞外の空間の内部で作用するペプチドを含む治療上有望な薬剤の効率的な発見を制約する種々の難点を有している。その結果、現在の方法はまた細胞表面上のＡＰＰのプロセシングに影響するペプチドの効率的な発見には適していない。従来のペプチドライブラリ（例えばファージディスプレイライブラリ、コンビナトリアルライブラリ、ペプチドミメティックライブラリおよび１ビーズ１構造のコンビナトリアルライブラリ）を使用するスクリーニング方法の大部分はインビトロでの標的への結合を示すのみである。正常な構造、活性、および何れかの必要な調節分子は、細胞外のタンパク質が精製されたりそのネイティブな細胞外環境から取り出されると、消失する場合がある。即ち、これ等の方法は相当するインビボの生物学的作用を有する細胞外標的に結合するペプチドを発見できない場合が多い。
【００１０】
ＡＰＰプロセシング酵素の切断活性に一般的に影響する薬剤を発見するよりはむしろ、ＡＰＰに特異的に結合してそのプロセシングを改変しＡβの量を低減する分子エフェクターを発見するスクリーニング方法が望まれている。酵素的経路の混乱を指向した現在の方法は、典型的には酵素系のスクリーニングに着目している。しかしながら、ＡＰＰプロセシング酵素は他の重要な生物学的課程に関与している。一般的にアルツハイマー病の危険性を低減するとしてもこれ等の酵素の活性を改変することは、他の有害な生物学的作用を誘発する場合がある。例えば、α−セクレターゼの活性を増大させるとＡβの遍在性が低下する。しかしながら、α−セクレターゼはアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、即ち血圧の調節物質の形成にも関与している（Ｐａｒｖａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１６８０−１６８５，１９９８）。α−セクレターゼの活性を増大させることは心臓疾患の危険性を増大させる血圧を上昇させる。
【００１１】
更にまた、細胞内経路のネイティブのシトゾル性の構成要素を温存しながら原形質において細胞内で小型ペプチドおよびポリペプチドをスクリーニングするために開発された方法は、該当する生理学的条件下では細胞外でＡＰＰプロセシングに影響するペプチドのスクリーニングを可能としない。真核細胞上において細胞外でペプチドライブラリ配列を発現させる他の方法も報告されているが（例えば米国特許６，１５３，３８０号；国際特許出願ＷＯ９８／３９４８３）、これ等の方法はなお未希釈の血液、血漿、血清または他の複合的な生物学的液体の存在下のような生理学的条件下ではＡＰＰとのペプチドの相互作用をスクリーニングできない。例えば１つの方法は、ランダム化されたペプチドを宿主細胞内に挿入し、そして、使用する融合構築物に応じて、細胞外または細胞内の細胞表面に局在化させるか、または、可溶性形態で分泌させる（米国特許６，１５３，３８０参照）。次にペプチドを、宿主細胞または他の細胞集団の表現型を改変するその能力について試験することにより、選択することができる。細胞外の相互作用に影響できるペプチドの発見を可能にするが、この方法はＡＰＰプロセシングに対してネイティブである生理学的条件を再現する試験条件の必要性に着目していない。分子のコンホーメーション、安定性、結合速度論的動態等を含むこのような条件はα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼのようなＡＰＰプロセシング酵素を含む他の細胞外巨大分子とのＡＰＰの正常な相互作用を維持するために重要である。
【００１２】
従って、ＡＰＰ分泌経路の分子および細胞の構成成分を温存し、そして、細胞外環境の複合的な生理学的条件を複製する条件下でＡＰＰプロセシングの分子エフェクターを発見するスクリーニング方法が必要とされている。ＡＰＰプロセシングに対してネイティブである複合的状態を維持することは非特異的な結合の事象を低減し、ネイティブの分子構造および速度論敵動態を保持し、そして、調節分子の存在を維持することから、開示した生理学的および分泌系のスクリーニングはＡβの生産を改変する薬剤を含むＡＰＰプロセシングを改変する薬剤をより発見しやすいといえる。
【００１３】
ＡＰＰプロセシングにおいて重要である分泌および細胞外の条件を温存するスクリーニング方法、並びにＡＰＰに特異的に結合するエフェクターを発見する方法の開発は、生理学的に該当する条件下、旨適特異性でＡβの量を低減する薬剤の発見を容易にすることにより、アルツハイマー病の治療のためのより効果的な薬剤および治療方法の発見を容易にするために必要とされている。本発明はこのような方法を提供し、それは本明細書に記載される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は一般的にβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変する薬剤を発見する方法に関する。１つの特徴において、方法は、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞に薬剤を接触させること、および、宿主細胞表眼上の改変されたＡＰＰプロセシングを検出してＡＰＰのプロセシングを改変する薬剤を発見することを含む。宿主細胞により発現されるＡＰＰプロセシング酵素は例えばα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼを包含する。検出されるＡＰＰプロセシングの壊変は例えば、アミロイドβ−タンパク質（Ａβ）の生産の低減をもたらすプロセシングである。更に改変されたＡＰＰプロセシングの結果として低減した生産を示すアミロイドβ−タンパク質はアルツハイマー病の増大した危険性に関連するＡβタンパク質、例えばＡβ１−３９、Ａβ１−４０および／またはＡβ１−４２であることができる。
【００１５】
ＡＰＰおよびＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞は例えば哺乳類宿主細胞であることができる。動物宿主細胞は内因性ＡＰＰおよびＡＰＰプロセシング酵素を発現する組み換え宿主細胞、または単離された宿主細胞であることができる。
【００１６】
特定の実施形態においては、改変されたＡＰＰプロセシングを検出することは宿主細胞の表眼上のＡＰＰフラグメントの少なくとも１つの物質種の相対的な存在または非存在を評価することを含む。評価されるＡＰＰフラグメントの物質種は例えばＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βまたはＡＰＰｓ−γを包含できる。ＡＰＰフラグメントの少なくとも１つの物質種の相対的な存在または非存在を評価することが、例えば、ＡＰＰフラグメントに特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーに宿主細胞を接触させること、および、結合した標識されたマーカーを検出することを含む。ＡＰＰフラグメントの存在または非存在を検出するためのマーカーは、例えばＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの所定のエピトープに結合する抗体であることができる。特定の実施形態においては、ＡＰＰフラグメントの相対的な存在または非存在を評価することが、ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異的な少なくとも２つの標識された抗体の検出シグナルの比を測定することを含む。宿主細胞の表面上の改変されたＡＰＰプロセシングの検出は、例えばフローサイトメーターまたはセルソーターの使用を含むことができる。
【００１７】
宿主細胞に接触させる薬剤は例えば小型分子または生体分子であることができる。特定の実施形態においては、宿主細胞と接触させる生体分子はペプチドである。薬剤は化合物ライブラリ、例えば組合せ化学ライブラリ、天然産物ライブラリまたはペプチドライブラリより得ることができる。薬剤はＡＰＰのアロステリックエフェクターであることができるｒ。
【００１８】
特定の実施形態においては、薬剤は実質的に生理学的な条件下に宿主細胞に接触させる。実質的に生理学的な条件は複合生物学的液体、例えば血液、血清、血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）の存在を包含することができる。
【００１９】
宿主細胞をペプチドと接触させる実施形態においては、ペプチドは例えばペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの転写および翻訳により生産することができる。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの長さは例えば約１８〜約１２０ヌクレオチド、２１〜約６０ヌクレオチドまたは約３６〜約６０ヌクレオチドであることができる。１つの実施形態においては、宿主細胞とのペプチドの接触は、宿主細胞内にペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することを包含する。発現ベクターが導入された宿主細胞は分泌経路内および細胞表面上においてペプチドを発現し提示する。
【００２０】
宿主細胞内に導入されるオリゴヌクレオチドは例えばオリゴヌクレオチドの大多数が異なるペプチドをコードする異なる配列を有するオリゴヌクレオチドインサートを含む発現ライブラリに由来するものであることができる。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドの配列はランダム化される。発現ライブラリはＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞に導入される。発現ライブラリを導入された宿主細胞は分泌経路内および細胞表面上において異なるペプチドを発現し提示する。特定の実施形態においては、異なるペプチドは実質的に生理学的な条件下で宿主細胞によりディスプレイされる。
【００２１】
別の実施形態においては、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞のサブセットを宿主細胞から選択する。この宿主細胞サブセットより、発現ライブラリのサブライブラリを発見し、サブライブラリにはＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードするオリゴヌクレオチド少なくとも１つが含まれる。
【００２２】
特定の実施形態においては、発現ライブラリが導入された宿主細胞は、異なるペプチドを提示する宿主細胞に関して富化することができる。宿主細胞は発現構築物中に選択可能なマーカーを含ませることにより富化することができる。発現構築物は例えばＶ５、ＦＬＡＧ、プロテインＡまたはチオレドキシンであることができる。マーカーの選択には例えば磁気ビーズ選択蛍光活性化細胞ソーティングが包含される。特定の実施形態においては、ペプチドを提示する細胞について富化された宿主細胞は高コピー数の異なるペプチドを発現できる。
【００２３】
１つの実施形態においては、ペプチドは提示分子との融合タンパク質としてディスプレイされる。提示分子は例えばＣＤ２４、ＩＬ−３受容体、プロテインＡまたはチオレドキシン等であることができる。融合タンパク質は更にマーカーエピトープ、例えばポリヒスチジン、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはｍｙｃ等を含むことができる。融合タンパク質はまたグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナルを含むことができる。
【００２４】
別の実施形態において、発現ライブラリは宿主細胞へのライブラリの導入よりも前に、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドについて予備富化（プレエンリッチ）されることができる。予備富化はファージの表面上のオリゴヌクレオチド配列によりコードされるペプチドを発現できるファージディスプレイベクター内に発現ライブラリを導入すること；ファージの表面上に異なるペプチドを発現すること；ＡＰＰに特異的に結合するペプチドを発現するファージ粒子のサブセットを選択すること；および、選択されたファージ粒子からオリゴヌクレオチド配列を回収すること；を包含することができる。予備富化された発現ライブラリはＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞内に導入することができる。予備富化されたライブラリが導入された宿主細胞は分泌経路内および細胞表面上においてＡＰＰ結合ペプチドを発現し提示する。改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞のサブセットは予備富化ライブラリを発現する宿主細胞から選択する。この宿主細胞サブセットより、予備富化された発現ライブラリのサブライブラリを発見し、サブライブラリにはＡＰＰのプロセシングを改変するＡＰＰ結合ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド少なくとも１つが含まれる。
【００２５】
本発明の性質および利点のこれ以上の理解については明細書の残余の部分を参照することにより明らかになる。
【００２６】
（特定の実施形態の記述）
本発明はβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変し、これによりβ−アミロイド（Ａβ）の生産を改変するペプチドおよび他の小型分子を含む分子および薬剤の発見のためのスクリーニング方法を提供する。提供されるスクリーニング法はＡβの生産に相関するプロセシング酵素切断部位における細胞内ＡＰＰの切断を増大または低減することができるエフェクター薬剤の発見を可能にする。これ等のスクリーニング方法はアルツハイマー病（ＡＤ）の原因として示唆されているα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼのようなＡＰＰプロセシング酵素の活性化における不均衡を是正または部分的に是正するＡＤの治療のための治療用分子の開発を促進することができる。
【００２７】
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書において使用する特定の用語の意味を説明することが本発明を更に理解するために有用である。
【００２８】
（定義）
「ＡＰＰプロセシング酵素」という用語は細胞の分泌経路（例えばトランスゴルジネットワークおよび分泌ベシクル）を経由する、または、細胞外の細胞表面上の通過の間にアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の翻訳後の修飾に関与するタンパク質分解酵素を指す。ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングは細胞により生産されるＡβの相対的量に影響する。ＡＰＰプロセシング酵素は例えばα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼを包含する。
【００２９】
「改変されたＡＰＰプロセシング」という用語は細胞により生産される１種以上のＡＰＰフラグメントの総大量の変化を指す。ＡＰＰフラグメントには例えばＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βおよびＡＰＰｓ−γが包含される（図２参照）。１種以上のＡＰＰフラグメントの総大量は生産されるＡβの量と創刊しているため、「改変されたＡＰＰプロセシング」は本明細書においては一般的に細胞により生産されたＡβの量の変化をもたらすＡＰＰプロセシングにおける変化も一般的に指している。
【００３０】
「薬剤」、「分子」および「化合物」という用語は、本明細書においては、同義語であり、そして一般的に、非共有結合相互作用、例えば水素結合、イオン結合、ファンデルワールス引力または疎水性相互作用を介して細胞の構成成分と構造的な相互作用をすることが潜在的に可能である分子を指す。例えば薬剤は最も典型的にはタンパク質、糖タンパク質および／または他の巨大分子との構造的相互作用のために必要な官能基、特に水素結合に関与する基を有する分子を包含する。
【００３１】
薬剤は小型の有機分子、例えば脂肪族炭素または環状炭素（例えば複素環または炭素環の構造および／または芳香族またはポリ亜炉な構造等）を包含できる。これ等の構造は１つ以上の官能基、例えばアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基で置換されていることができる。更にまた、これ等の構造は他の置換基、例えば炭化水素（例えば脂肪族、脂環族、芳香族等）、非炭化水素基（例えばハロゲン、アルコキシ、アセチル、カルボニル、メルカプト、スルホキシ、ニトロ、アミド等）またはヘテロ置換基（例えば非炭素原子原子、例えばイオウ、酸素または窒素を含むもの）を包含できる。
【００３２】
薬剤は生体分子も包含する。「生体分子」とは生体系の中に存在、および／またはこれにより生産されることができる分子並びにそのような分子から誘導された構造のクラスを指す。生体分子は典型的には例えばタンパク質、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類およびその誘導体、構造的類縁体またはその組み合わせを包含する。生体分子は１つ以上の官能基、例えばアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を包含できる。
【００３３】
薬剤は合成により、または生物学的に生産されるものを包含し、そして、組み換えにより生産された構造、例えばペプチド提示融合タンパク質を包含できる。「融合タンパク質」という用語は２つ以上の配列モチーフの組み換え組み合わせにより生産されるアミノ酸の重合体を指し、特定の長さの産物を指すものではなく；即ち、融合タンパク質はアフィニティー標識、例えば６−ヒスチジンに連結したペプチド配列を包含できる。
【００３４】
「エフェクター薬剤」または「分子エフェクター」という用語は、本明細書においては、他の巨大分子とのタンパク質の相互作用に影響する分子を指す。即ち「ＡＰＰプロセシングの分子エフェクター」とは、例えばＡＰＰまたはＡＰＰプロセシング酵素との相互作用を介してＡＰＰプロセシングを改変する分子を指す。
【００３５】
「特異的結合」という用語はある薬剤とＡＰＰの間の直接の相互作用を指す。薬剤とＡＰＰの間の相互作用は直接または間接の分析により検出できる。
【００３６】
「アロステリックエフェクター」という用語は、タンパク質に特異的に結合してそのコンホーメーションを変化させることにより、特定のタンパク質の活性または相互作用をを活性化または抑制するエフェクター薬剤を指す。即ち「ＡＰＰのアロステリックエフェクター」とはＡＰＰに特異的に結合し、１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素によるプロセシングが改変されるようにそのコンホーメーションを変化させる薬剤を指す。アロステリックエフェクターの特異的結合部位は本明細書においては「アロステリック部位」と称する。
【００３７】
「Ｎ末端短縮ＡＰＰ」という用語は本明細書においては、α−および／またはβ−セクレターゼ切断部位に対してＮ末端側の部位におけるＮ末端において短縮されているＡＰＰポリペプチドの形態を指す。これ等のＮ末端短縮型は、例えばＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害ドメインに対してすぐの３’側のヌクレオチド４５７から始まり、もう一方がヌクレオチド５５０にあるＡＰＰコーディング配列の領域によりコードされるポリペプチド、および、Ｎ末端官能基を除外するが、膜の外部のアミノ酸残基までのβ切断部位近傍のランダムコイル配列を含むより短い形態を包含する。
【００３８】
「宿主細胞」という用語は幾つかの手段により導入することができるエフェクター薬剤を試験するためのベヒクルとして機能できる細胞を指す。本発明に適する宿主細胞はＡＰＰおよび１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素、例えばα−、β−および／またはγ−セクレターゼを発現するものである。更にまた、本発明における使用に適する宿主細胞は典型的には動物細胞、特に哺乳類細胞である。宿主細胞はまた「組み換え宿主細胞」であることもできる。「組み換え宿主細胞」という用語は本明細書においては１つ以上の組み換えタンパク質、例えば組み換えＡＰＰおよび／または１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素を発現する宿主細胞を意味する。適当な宿主細胞はヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、ヒト神経芽細胞系統Ｂａ／Ｆ３、ＡＣ２（例えばＧａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｋｉｎｎａｉｒｄ，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ＲＥｓ．５：Ｓ１４５−Ｓ１５０（１９８６）参照）、Ｂ９、ＨｅｐＧ２、ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞を包含する。宿主細胞は幾つかの操作法の何れか１つにより導入される遺伝子ライブラリに対するレシピエントとして機能することができる。遺伝子ライブラリのレシピエントとして機能する宿主細胞はライブラリインサートを含有するベクターの複製および分離を可能にする場合が多い。しかしながら、特定の実施形態においては、複製および分離は意義を有さず；ライブラリインサートの発現のみが必要な全てである。
【００３９】
「遺伝子ライブラリ」という用語は個々が数塩基対〜約１００万塩基対の範囲の大きさを有する核酸フラグメントの集合体を指す。典型的には、本発明の範囲において使用する場合は、遺伝子ライブラリはペプチドまたはポリペプチドをコードするランダムまたは半ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは例えば約１０塩基〜約６０塩基の平均長を有することができる。特定の実施形態においては、ライブラリは細菌および／または哺乳類細胞のような特定の宿主細胞において増殖することができるベクター中のインサートとして含まれる。
【００４０】
「化合物ライブラリ」という用語は本明細書においては分子構造の複数を含む薬剤の何れかの集合体を指す。化合物ライブラリは例えば後に詳述する組合せ化学ライブラリ、天然産物ライブラリおよびペプチドライブラリを包含できる。特定の実施形態においては、ペプチドライブラリうは遺伝子ライブラリ内に含まれる核酸配列から転写および翻訳により発生させることができる。
【００４１】
「サブライブラリ」という用語は本発明による方法により単離されている化合物ライブラリまたは遺伝子ライブラリの部分を指す。
【００４２】
遺伝子ライブラリの範囲内における「インサート」という用語は単一のベクター（例えば発現ベクター）または発現構築物内に典型的にインサートされる個々の核酸フラグメントを指す。
【００４３】
遺伝子ライブラリの範囲内における「カバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）」という用語は遺伝子ライブラリの重複の量を指す。当業者の知るとおり、遺伝子ライブラリの重複はそのライブラリの核酸配列内に特定の配列が実際に存在する確率に一般的には関連している。カバレッジはライブラリインサート、例えばペプチドコードオリゴヌクレオチドの数を平均のインサートのサイズと掛け合わせ、ライブが示す核酸配列の総コンプレキシティーで割った比である。
【００４４】
「ベクター」という用語は非相同核酸のインサートを収容できる特定の宿主細胞において増殖することが可能な核酸配列を指す。典型的にはベクターはクローニング部位内に非相同核酸を挿入するようにインビトロで操作される。ベクターはウィルスベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは感染によるなど、安定または一過性の態様で宿主細胞に導入できる。
【００４５】
「発現ベクター」という用語は挿入された核酸を発現するように設計されたベクターである。このようなベクターは例えば１つ以上の以下に示す作動可能に関連したエレメント、即ち、核酸の挿入部位（例えばクローニング部位）の上流に位置するプロモーター、転写停止シグナル、翻訳停止シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含有することができる。発現ベクターはまた薬剤体制遺伝子（例えばハイグロマイシンまたはネオマイシン体制）のような選択可能なマーカーも包含することができる（例えばＳａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７−１５６（１９８４）参照）。発現ベクターはまたウィルス粒子内へのパッケージングのための配列も包含する。
【００４６】
「高コピー数」という用語はライブラリインサートによりコードされる少なくとも数百〜数千の分子の宿主細胞の細胞外表面上の発現を指す。
【００４７】
核酸の範囲における「発現」という用語はｍＲＮＡおよび／またはタンパク質内への核酸の転写および／または翻訳を指す。
【００４８】
「発現ライブラリ」という用語は発現構築物またはベクターの複数を指し、構築物またはベクターのコピーの大多数は遺伝子ライブラリに由来する核酸フラグメントのインサートを含有するものである。
【００４９】
「提示分子」という用語は融合タンパク質の一部としてペプチドまたはポリペプチドを辞するために使用できるポリペプチドを指す。
【００５０】
「安定な発現」という用語は本発明の方法を実施するために必要な程度長期にわたる期間の、宿主細胞における核酸配列の持続的存在および発現を指す。安定な発現は、宿主細胞染色体内への核酸の組み込みによるか、または、核酸を宿主（例えば発現ベクターまたは人工の染色体）内のその持続的複製および分裂を確保するエレメントをそれが保有するように、或は、選択条件下（例えば薬剤含有培地）で宿主細胞を生育することにより核酸の安定な発現が確保されるように核酸が選択可能なマーカー（例えば薬剤体制遺伝子）を含有するように、またはそれが宿主ゲノム内に組み込まれることになるウィルスゲノムとして導入できるように、操作することにより、達成できる。
【００５１】
「特異的結合」という用語はある薬剤とＡＰＰとの間の直接の相互作用を指す。薬剤とＡＰＰとの間の相互作用は直接または間接の分析のいずれかにより検出できる。
【００５２】
「生理学的条件」および「実質的に生理学的な条件」という用語は、細胞外空間内、細胞外表面上（例えば細胞膜上）、ゴルジネットワーク、分泌小嚢内、および／または複合生物学的液体内において、正常に存在するか、または、正常に存在するものに実質的に近似している条件を指す。例えば「実質的に生理学的な条件」は細胞外の標的が活性であるかその活性（例えば酵素活性、受容体、基質、スカホールド分子または他の結合相手への結合等）を発現する場合に存在するものである。
【００５３】
「複合生物学的液体」という用語は生体の液体、例えば自系（即ち同じ動物に由来）、相同（即ち同じ種の動物に由来）または非相同（即ち異なる種に由来）の血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）等を指す。複合生物学的液体は未希釈または実質的に希釈されていることができる。「実質的に未希釈の複合生物学的液体」という用語は未希釈であるか、または、典型的には約５０％濃度以上に生理学的緩衝液中に希釈されている複合生物学的液体を指す。実質的に未希釈の複合生物学的液体、即ち未希釈の液の約５０％濃度以上のものは、未希釈の液とほぼ同じ絶対濃度の溶液中に、実質的に同じイオンの組成および濃度、および、実質的に同じ巨大分子の構造を有する。
【００５４】
「形質転換」または「トランスフェクション」という用語は、レシピエント（例えば宿主）の細胞内に核酸を導入する過程を指す。これは典型的にはレシピエント細胞の表現型の変化により検出される。「形質転換」という用語は一般的には微生物に適用され、「トランスフェクション」は多細胞生物に由来する細胞におけるこの過程を指すために使用する。
【００５５】
「感染する」または「感染された」という用語はウィルスベクターを用いることによりレシピエント（例えば宿主）細胞内に核酸を導入する過程を指す。
【００５６】
「フローソーター」という用語は細胞または他のオブジェクトから生じる光発射強度を分析し、そして、光発射強度のようなパラメーターに従ってこれ等の細胞または他のオブジェクトを分離する装置を指す。適当なフローソーターは例えば蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）、分光光度計、マイクロ滴定プレートリーダー、電荷結合デバイスカメラおよびリーダー、蛍光顕微鏡または同様の装置を包含する。
【００５７】
フローソーターの範囲における「高輝度（ｂｒｉｇｈｔ）」および「低輝度（ｄｉｍ）」という用語は特定の細胞により示される傾向（または光発射の他の様式）の強度の水準を指し；高輝度の細胞は細胞の多数集団に対して相対的に高い強度の発射、そして推定により高い水準のレポーターを有し；低輝度の細胞は細胞の多数集団に対して相対的に低い強度の発射、そして推定により低い水準のレポーターを有する。
【００５８】
「ビーズ選択」という用語は細胞の混合物から細胞を選択的に除去するためのビーズの使用を指す。ビーズは抗体または他の結合相手のような巨大分子を包含する。特定の実施形態においては、ビーズ選択は誘導された磁気ビーズを使用する。例えば、細胞表面上にＦＬＡＧエピトープを発現する細胞は、抗ＦＬＡＧ抗体でコーティングされた磁気ビーズ上で予備選択できる。次に磁気ビーズを強磁場を用いて収集することができる。
【００５９】
（宿主細胞系統の選択／樹立）
本発明のスクリーニング法で使用する宿主細胞は、ＡＰＰおよびα−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼのようなＡＰＰプロセシング酵素１つ以上の両方を発現する。宿主細胞はＡＰＰおよび／または少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を内因的に発現する単離された細胞であることができる。更に、宿主細胞はＡＰＰの組み換え型、例えばＮ末端短縮ＡＰＰおよび／または１つのタンパク質酵素の少なくとも１つの組み換え型を発現する組み換え宿主細胞であることができる。従って宿主細胞は１つのこのようなＡＰＰまたは酵素に関して内因性の発現を示す一方で、別のこのような分子に関して「組み換え宿主細胞」であることができる。
【００６０】
本発明の１つの例示的実施形態においては、宿主細胞はＡＰＰに関して組み換え体であり、そして内因性のα−セクレターゼ、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼを含有する。ＤＮＡコードＡＰＰは例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｒｏｇｄａｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＩＭＡＴ）より入手でき、或は、当該分野で知られた方法、例えばＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列分析評価により得ることができる。ｃＤＮＡは例えば哺乳類発現ベクター内に挿入し、そして、知られた方法、例えばエレクトロポレーションを用いて親哺乳類細胞系統（例えば神経芽細胞系統またはヒト胚腎細胞系統（ＨＥＫ））にトランスフェクトする。これ等の細胞系統のＡＰＰ発現は、当該分野で知られた方法、例えば蛍光顕微鏡観察または抗ＡＰＰ抗体を用いたＦＡＣＳ分析により評価することができる。例えば、種々のＡＰＰフラグメントに対する抗体が知られており、例えばＡＰＰｓ−β（例えばＡＰＰ中央領域に特異的なＡ３または１Ｇ７、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７３８６−１７３８９，１９９４）、ＡＰＰｓ−α（例えば６Ｅ１０、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２、ＡＰＰｓ−αのカルボキシ末端またはβおよびα切断部位の間のＡＰＰ領域に特異的）およびｐ３（例えば４Ｇ８、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）が挙げられる。
【００６１】
別の実施形態においては、これ等の細胞を次に、各発現ベクターがＡＰＰプロセシング酵素１つ以上をコードする１つ以上の発現ベクターにトランスフェクトする。例えば１つがα−セクレターゼをコードし、もう一方がβ−またはγ−セクレターゼをコードする２種の個別の発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。セクレターゼをコードするＤＮＡは、例えばＡＴＣＣまたはＩＭＡＴから入手でき、或は、当該分野で知られた方法、例えばＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列分析評価により得ることができる。
【００６２】
（化合物ライブラリ）
本発明の１つの実施形態において、ＡＰＰプロセシングを改変するエフェクター薬剤をスクリーニングするために化合物ライブラリを宿主細胞に接触させる。化合部ライブラリは例えば薬学的研究の過程において合成された化合物の歴史ｈ的収集物；推論的設計（一般的にはＣｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔ．３０５−３１６，１９９８；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１２：５９７−６０４，１９９８参照；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、例えばコンビナトリアル化学（組合せ化学ライブラリの説明は下記参照）により作成された化合物誘導体のライブラリ；天然産物ライブラリ（例えば細菌、藻類、真菌、コウボ、カビ、種々の植物または植物の部分、動物の体液、分泌物等から誘導した複合的抽出物を含むライブラリ；このようなライブラリは例えば薬学的研究の過程において形成されたものを含むことができる）；ペプチドライブラリ（ペプチドライブラリの説明は下記参照）等から作成することができる。
【００６３】
組合せ化学ライブラリ：別の実施形態においては、かごうぶつライブラリは組合せ化学ライブラリの合成により作成できる（一般的にはＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９−６９１３，１９９３；国際特許出願ＷＯ９４／０８０５１；Ｂａｕｍ，Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ，７２：２０−２５，１９９４；Ｂｕｒｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０２７−６０３１，１９９５；Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５５８８−５５８９，１９９５；Ｎｅｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：４７２３−４７２４，１９９４；Ｂｏｒｅｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３７３−３７４，１９９４；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０９９２−１０９２６；およびＬｏｎｇｍａｎ，Ｗｉｎｄｈｏｖｅｒ’ｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔｈｅ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔ １２：２３−３１，１９９４参照；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００６４】
以下の文献、即ち、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４３１−１４３６，１９９５；Ｄｏｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：９７３−９８０，１９９４；Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８３：１０８５−１１００，１９９４は原料分子の選択の方法および／またはその選択において使用する基準を記載しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。コンビナトリアルライブラリの作成方法は当該分野で知られており、以下の文献、即ち米国特許５，９５８，７９２；５，８０７，６３８；６，００４，６１７；６，０７７，９５４号を包含し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６５】
「コンビナトリアルライブラリ」は収集物の化合物がサブユニットの１つ以上の型よりなるような化合物の収集物である。サブユニットは天然および非天然の部分、例えばジエン、芳香族またはポリ芳香族化合物、アルカン、シクロアルカン、ラクトン、ジラクトン、アミノ酸等から選択できる。コンビナトリアルライブラリの化合物は化合物を含むサブユニットの数、順序、型またはその１つ以上に対して行われた修飾の種類に関して１つ以上の態様において異なっている。或は、コンビナトリアルライブラリは「コア分子」の収集物ということもでき、これ等は、それらが含むＲ基の数、型または位置および／またはコア分子を構成する分子自体において異なる。化合物の収集物は典型的には系統的な方法で発生させる。上記した態様の１つ以上において相互に異なる化合物の収集物を発生させる方法はコンビナトリアルライブラリであることができる。
【００６６】
コンビナトリアルライブラリは１つ以上の固相結合樹脂原料から固相上で合成できる。ライブラリは相互に異なる有機性分子１０個以上、典型的には５０個以上を含む（即ち１０種の異なる分子であり、同じ分子の１０コピーではない）。異なる分子（異なる基本構造および／または異なる置換基）の各々はその存在が何らかの手段で測定できる（例えば結合相手または適当なプローブを用いて単離、分析、検出できる）ような量で存在する。その存在が測定できるために必要な各々の異なる分子の実際の量は使用する操作法により異なる場合があり、そして単離、検出および分析の技術が進歩するに従い変化する場合がある。分子が実質的に等モル量で存在する場合は、例えば１００ピコモル以上の量を検出できる。典型的なライブラリは実質的に等モル量の各々の望ましい反応産物を含み、典型的には何れかの所定の分子を比較的に大量または少量含むことはなく、これにより、何れかの試験において、そのような分子の存在が優勢になるか、または完全に抑制されるようにする。
【００６７】
コンビナトリアルライブラリは一般的には固相支持体（例えばビーズ）上に原料化合物を誘導することにより作成される。一般的に、個体支持体はＲｉｎｋまたはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒｅｓｉｎのような市販の樹脂結合物である。原料化合物の結合の後、置換基を原料化合物に結合させる。例えば芳香族（例えばベンゼン）化合物はＲｉｎｋ樹脂を介して支持体に結合できる。芳香族環は置換基（例えばアミド）と同時に反応させる。置換基を原料化合物に添加し、置換基を添加するための反応体の混合物を準備することにより変動できる。適当な置換基の例は、例えば以下のものである。
【００６８】
（１）炭化水素置換基、即ち、脂肪族（例えばアルキルまたはアルケニル）、脂環族（例えばシクロアルキルまたはシクロアルケニル等）置換基、芳香族、脂肪族および脂環族置換芳香族核等、並びに環状置換基；
（２）置換された炭化水素置換基、即ち、主に炭化水素の置換基を改変しない非炭化水素基を含む置換基；当業者の知る基（例えばハロ（特にクロロおよびフルオロ）、アルコキシ、メルカプト、アリールメルカプト、ニトロ、ニトロソ，スルホキシ等）；
（３）ヘテロ置換基、即ち主に炭化水素特性を有しながら炭素原子以外を含む置換基。適当なヘテロ原子は当業者の知るもの、例えばイオウ、酸素、窒素であり、そして置換基はピリジル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル等。
【００６９】
天然産物ライブラリ：本発明の別の実施形態においては、化合物ライブラリは天然産物ライブラリである。天然産物ライブラリは例えば多様な天然産物原料に由来する天然産物のライブラリ（例えば薬学的研究の過程において蓄積された天然産物）、或は、単一の天然産物原料に由来する化合物の収集物（例えば微生物、植物、動物の体液または他の生物学的材料、例えば土壌または泥炭に由来する１つ以上の溶解物、ホモジネートまたは化学抽出液）であることができる。
【００７０】
１つの実施形態において、天然産物ライブラリを作成するための原料は泥炭材料である。これ等の材料は一般的には極めて多数の種類の化合物を含有する。１つの特定の実施形態において、天然産物ライブラリは米国ワシントン州のボナパルト湖近傍の泥炭地であるボナパルト低地から得られる泥炭材料に由来する（米国特許６，２５７，９６２号参照）。特定の用途のための泥炭材料の使用とスクリーニングに関する操作法は当該分野で一般的に知られている（例えば米国特許６，２６７，９６２号および６，３６５，６３４号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば材料の抽出および分画の一般的な方法の１つでは、まずエタノールに曝露して非極性〜極性の広範な種類の特性を有する分子を抽出する。その後の画分には、例えば酸性化またはアルカリ性かされ例えばクロロホルムを用いた相分離に付されたものが包含される。得られた画分を例えばシリカゲルクロマトグラフィーおよび／または逆相ＨＰＬＣにより更に分画で切る。所望の画分が得られた後、これを例えば標準的な操作法を用いて緩衝液交換し、使用する特定のスクリーニング法に従ったその使用を容易にすることができる。
【００７１】
ペプチドライブラリ：１つの実施形態において、化合物ライブラリはペプチドライブラリである。一般的に約４アミノ酸〜約１００アミノ酸の大きさの範囲のペプチドを使用することができ、約６または７〜約４０のペプチドが典型的であり、約７〜約２０がより典型的である。
【００７２】
特定の実施形態においては、ライブラリは合成ペプチドを含むことができる。例えば長さＮ（Ｎは正の整数）の全ての可能なアミノ酸配列を提示する合成ペプチドの集団、または全ての可能な配列のサブセットがペプチドライブラリを校正することができる。このようなペプチドは当該分野で知られた標準的な科学的方法（例えばＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１，１９８４；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｅｄ，ＩＬ，（１９８４）参照）、例えば自動ペプチド合成器により合成できる。更にまた所望により非伝統的なアミノ酸または化学アミノ酸類縁体もまた伝統的なアミノ酸の大体として、またはそれに加えて使用することができる。非伝統的アミノ酸は例えば一般的なアミノ酸のＤ異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルギロシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、セレノシステイン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸および全般的にアミノ酸類縁体である。更にまた、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることができる。
【００７３】
他の実施形態においては、ペプチドライブラリは核酸配列のライブラリから転写および翻訳により生産できる。１つの例示的実施形態において、ライブラリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを宿主細胞内に導入する（後記のＧｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｉｎｆｒａ）。
【００７４】
（遺伝子ライブラリ）
本発明の１つの特徴において、スクリーニング法はＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する宿主細胞内に発現ライブラリを導入することを包含する。
【００７５】
本発明の遺伝子ライブラリは少なくとも部分的に異種核酸フラグメントの収集物を含む。このような核酸フラグメントは例えば合成ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、異種ＲＮＡ等を包含できる。核酸フラグメントは例えばゲノムのような核酸の集団、ｍＲＮＡの集団、または目的の核酸配列を含有する核酸の何らかの他のセットの全部または一部であることができる。遺伝子ライブラリは操作することができる形態の配列を含有する。
【００７６】
本発明は典型的には合成ＤＮＡから、または、特定の生物のゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡのフラグメントから誘導した遺伝子ライブラリを使用する。このようなライブラリ配列は典型的には約１０塩基〜約１０キロ塩基の範囲である。ライブラリ配列は場合により例えば平均長約１０塩基〜約６０塩基のオリゴヌクレオチドであることができる。
【００７７】
合成ＤＮＡの作成方法は当該分野で知られている（例えばＧｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９８）参照）。ランダムに共有されているゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡの作成およびこのようなＤＮＡの操作の方法は当該分野でよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１９；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）；参照によりその本明細書に組み込まれる）。ライブの構築、操作および維持に関する詳細も当該分野で知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。
【００７８】
一部の特徴において、ライブラリは合成核酸フラグメントより作成する。例えば長さＮ（Ｎは正の整数）の全ての可能な配列を提示する合成ペプチドの集団、または全ての可能な配列のサブセットがライブラリのための核酸であることができる。長さＮの全ての可能なアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドの集団、または、全ての可能な配列のサブセットもまたライブラリのための核酸であることができる。或は、半ランダムライブラリも使用できる。例えば半ランダムライブラリは宿主細胞のコドン使用の優先性に従って、または、コードされたアミノ酸配列における翻訳停止コドンの包含を最小限にするために設計することができる。後者の例として、各コドンの１位において、等モル量のＣ、ＡおよびＧおよび半モル量のＴを使用する。２位においては、Ａを半モル量で使用し、Ｃ、ＴおよびＧを等モル量で使用する。３位においては、等モル量のＧおよびＣのみを使用する。
【００７９】
合成オリゴヌクレオチドは場合により何れかの適当なシス調節配列、例えばプロモーター、翻訳開始コドン、翻訳停止シグナル、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナル、クローニング部位（例えば制限酵素部位または粘性末端）、エピトープをコードする配列および／またはプライミングセグメントを含むことができる。例えばライブラリはＡＴＧ開始コドン、Ｎヌクレオチドのランダムまたは半ランダム配列、翻訳停止コドン、プライマー結合部位に作動可能に会合した一端の近傍の制限酵素部位、および、もう一端における制限酵素部位を有するＤＮＡフラグメントを包含できる。このようなフラグメントの収集物は発現構築物内、ベクター内、発現ベクター内等に直接ライゲーションすることができる。フラグメントは１本鎖または２本鎖のＤＮＡとして、そしてセンスまたはアンチセンス鎖の何れかとして導入できる。当業者の知るとおり２本鎖核酸は例えば相補１本鎖核酸を共にアニーリングすることにより、または、相補プライマーを核酸にアニーリング氏、次にポリメラーゼおよびヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドトリホスフェート）を添加して２本鎖核酸を形成することにより、形成することができる。２本鎖核酸はまた５’および３’オーバーハンギング末端を有する部位内に１本鎖核酸（例えばＤＮＡ）をライゲーションし、次にポリメラーゼおよびヌクレオチドトリホスフェートで部分的に１本鎖の核酸をフィルインすることにより形成することもできる。オリゴヌクレオチドの操作およびクローニングの詳細は当該分野でよく知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。
【００８０】
ライブラリは最も典型的にはライブラリ配列の核酸の可能な順列を超過するカバレッジを有する核酸を含む。例えば、ライブラリは約５倍核酸配列の可能な順列を超過する核酸の数を含むことができるが、より大量または少量のランダム性も本発明の範囲に包含される。ライブラリの構築、操作および維持に関する操作は当該分野でよく知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。
【００８１】
例示的実施形態において、ライブラリは当該分野で知られた方法を用いて胃可能操作法に従って作成する。２本鎖ＤＮＡフラグメントをランダムまたは半ランダムな合成オリゴヌクレオチド、ランダムに切断されたゲノムＤＮＡおよび／またはランダムに切断されたｃｄＮＡ化から作成する。これ等のフラグメントを必要に応じて酵素で処理することにより、その末端の修復、および／または発現ベクター内のクローニング部位に適合する末端の形成を行う。発現ライブラリを適当な宿主系統、例えばＥ．ｃｏｌｉ系統に導入し、そしてクローンを選択する。個々のクローンの数は典型的には原料の可能な順列の合理的なカバレッジを達せいするために十分なものである。クローンをあわせ、大量培養またはプール中に生育させ、レジデントベクターおよびそのインサートの単離に付す。この工程により大量の発現ライブラリを本明細書に記載するその後の操作法のための準備において得ることができるようになる。
【００８２】
（発現カセットおよびベクター）
別の特徴において、発現カセットおよび／またはベクターをっ用いて発現ライブラリの配列によりコードされるペプチドおよび／または融合タンパク質を発現する。多くの発現カセットおよびベクターが当該分野で知られており、それらは容易に入手できる（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。これ等のカセットおよびベクターの一部は特定の細胞型における使用のために専用となっており、一部は広範な種類の細胞型に使用できる。哺乳類細胞においては、ウィルス転写調節エレメントはライブラリ配列のような外因性コーディング配列の発現を駆動するための典型的な選択肢となっている。発現カセットまたはベクターは発現ベクターおよび／または発現ライブラリを含有する宿主細胞を発見するための選択可能なマーカー１つ以上を含むこともできる。
【００８３】
ペプチドの発現を行うためには、発現カセットは例えば転写の方向に関して５’から３’の方向に、ライブラリ配列の挿入のためのクローニング部位に作動可能に会合しているプロモーター領域および場合により転写停止領域を包含でき、これは場合によりポリアデニル化（ポリＡ）配列を有する。発現カセットは場合ｂによりリボソーム結合配列、翻訳化医師コドンおよび／または転写停止コドンを包含できる。分泌シグナルおよび／または細胞表面に発現タンパク質の固定されるためのドメインは典型的には隣接するクローニング部位に包含される。
【００８４】
適当な分泌シグナルは例えばＣＤ２４由来のものである。適当な細胞表面固定設置ドメインは例えばグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定または膜貫通ドメイン（例えばＣＤ２４、ＩＬ−３受容体の膜貫通ドメイン等）を包含する。
【００８５】
特定の型の宿主細胞内のライブラリ配列の発現を行うためには、ライブラリインサートの頑健で高度または中高度の発現を与えることができるプロモーターが好ましい。適当なプロモーター配列は例えばエンハンサーおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩ）に結合できるＴＡＴＡボックス配列を包含できる。プロモーターは構成的に活性である（例えばウィルスプロモーター）か、または誘導できるものである。誘導プロモーターは、ライブラリセ系の制御された発現が望まれる場合、および／またはペプチド配列および／または融合タンパク質の発現または過剰発現に関連する毒性の副反応を回避するために使用できる。適当な誘導プロモーターは例えばインターフェロン誘導プロモーター系、３’−５’ポリ（Ａ）シンターゼに対するプロモーターまたはＭｘタンパク質（例えばＳｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０３：１４４−１４８，１９９４）、ＨＬＶ−ＬＴＲ、メタロチオイネンプロモーター（例えばＨａｓｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：８５７２−８５７６，１９８５）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０，１９８１）、ラウス肉腫ウィルスの３’長末端リピートに含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１４４１−１４４５，１９８１）等を包含する。
【００８６】
他の適当なプロモーターは高度または合理的に高度な水準で発現されるハウスキーピング遺伝子から誘導することができる。例えばβ−アクチンのプロモーターは高発現に有用である（例えばＱｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：３５５−３６０，１９９３）。同様に、サイトメガロウィルスプロモーターおよび翻訳伸長因子ＥＦ−１αプロモーターは発現に有用な他の強力なプロモーターである。一般的に、適当なプロモーター、例えばハウスキーピングまたはウィルス遺伝子プロモーターはよく知られた分子遺伝子的方法を用いて発見できる。
【００８７】
特定の実施形態においては、クローニング部位は翻訳停止配列の１つ以上に隣接しており、これにより何れかの得られる発現されたペプチドの長さがライブラリ配列のコーディング領域と実質的に同様になる。本明細書においては「実質的に同じ長さ」という表現は、発現されたペプチドの長さがライブラリ配列内のコーディング領域の長さに相当し、そして、更に例えば開始コドンに相当するメチオニン残基、コーディング領域内のリンカー核酸から生じる何れかの別のアミノ酸、翻訳または翻訳後の修飾、エピトープ１つ以上などを更にコードすることができることを意味する。
【００８８】
一部の実施形態においては、クローニング部位はマーカーエピトープによりフランキングされている。適当なマーカーエピトープは例えばＸｐｒｅｓｓ（商標）リーダーペプチド（Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、配列番号１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｍｙｃエピトープ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ、配列番号２：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖ５エピトープ（Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ；配列番号３）、ＦＬＡＧタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ｌｙｓ、配列番号４；（例えばＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０５−１２１０，１９８８参照）、ｌｅｘＡタンパク質、チオレドキシン、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン等を包含できる。
【００８９】
例示的実施形態において、発現されたペプチド配列に別の構造を付与するために、発現されたペプチドが末端にシステイン残基を含むようにシステインをコードする配列によりクローニング部位をフランキングすることができる。
【００９０】
特定の実施形態においては、、クローニング部位はペプチドの細胞外ディスプレイのための融合タンパク質のコーディング領域に会合している（「提示分子」とも称する）。このような融合タンパク質は例えば（１）宿主細胞内または宿主細胞表面上に存在する相同タンパク質ドメイン、タンパク質フラグメントまたはタンパク質、および／または（２）別の型の細胞に由来する非相同のタンパク質ドメイン、タンパク質フラグメントまたはタンパク質を包含できる。融合タンパク質の選択は宿主細胞の型、融合タンパク質の安定席、発現されるペプチドの所望のコンホーメーション（例えば制約または非制約型）により異なる。提示分子は典型的にはシグナル配列および膜貫通ドメインを包含する。
【００９１】
提示分子はＮ末端またはその近傍、Ｃ末端またはその近傍または提示分子の内部においてペプチドを提示することができる。例示的実施形態においては、提示分子はＮ末端のペプチドをディスプレイし、そして提示分子のＣ末端部分は膜貫通ドメインまたはＧＰＩ固定により細胞膜に固定を置かれる。提示分子はペプチドとＡＰＰとの間の特異的結合のための適切な立体的方向を達成する可能性を向上させるために宿主細胞表面から種々の距離にペプチドを位置づけるように修飾できる。更にまた、スペーサー（例えばグリシンスペーサー）を提示分子とペプチドとの間に含めることにより柔軟性を付与し、そして、ＡＰＰまたはＡＰＰプロセシング酵素のペプチドの相互作用を含む細胞外の空間内、または、分泌経路内におけるペプチドの相互作用による提示分子からの立体障害を最小限にすることができる。このようなスペーサーはまた細胞表面に柔軟性を付与するために、提示分子と際病表面固定設置ドメインとの間に含めることができる。
【００９２】
適当な提示分子は例えばリンパ球抗原ＣＤ２０、修飾ＩＬ−３受容体、ＣＤ２４（例えばＰｏｎｃｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）９１：４００−４０，１９９６）、タンパク質Ａ等を包含する。図６に示すとおり、ｐＩｃｏＤｕａｌベクターは例示される発現カセットを含んでいる。例えば１つの発現カセットはＣＤ２４−Ｖ５融合タンパク質をコードし、そしてライブラリ配列のインサートに対する独特の制限部位１つ以上を包含する。別の適当な融合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉチオレドキシンおよびＦＬＡＧエピトープを包含する。チオレドキシンとＦＬＡＧコーディング配列の間の接合部において、独特のＸｂａＩ制限部位により、融合タンパク質コーディング領域内へのライブラリ配列の挿入が可能となる。
【００９３】
発現カセットは場合により発現ベクターの部分であることができる。適当な発現ベクターは当該分野でよく知られている（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。特定の実施形態においては、制御されたプラスミド増幅系を哺乳類細胞における発現のために使用する。このような系は種々の細胞における制御されたプラスミド増幅を可能にする。増大したプラスミドコピー数はまたコードされたペプチドの上昇した発現をもたらす。ペプチドの高水準の発現は細胞外表面上にディスプレイされるペプチドの数を増大させる。このような制御された増幅系はまた哺乳類細胞における持続的な一過性発現を可能にする。持続的な一過性発現は、より多数のペプチドを効率的にスクリーニングすることを可能にする安定なトランスフェクションと比較して典型的には１０倍多い細胞が一過性の発現を示すことから、好都合なものである。プラスミド増幅はまたプラスミドまたは目的のペプチドをコードする配列の回収を容易にする。
【００９４】
例示的実施形態においては、制御されたプラスミド増幅系はＳＶ４０増幅系を利用する。発現ベクターはＳＶ４０の早期プロモーターおよびＬａｒｇｅＴ抗原のコーディング領域の融合を含み、これによりＬａｒｇｅＴ抗原の転写はＳＶ４０の早期プロモーターの制御下になる。ベクターはまた複製のＳＶ４０起点も含有する。このベクターが細胞内に進入すると、ＳＶ４０早期プロモーターはＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡの転写を促進する。ＲＮＡはＬａｒｇｅＴ抗原内に翻訳される。ＬａｒｇｅＴ抗原はＳＶ４０起点に結合し、プラスミドの増幅を誘発する。ＬａｒｇｅＴ抗原の濃度が細胞内で上昇するに従って、ＬａｒｇｅＴ抗原のＳＶ４０早期プロモーターへの結合がＳＶ４０早期プロモーターを、そしてその結果としてＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡ合成もシャットダウンする。従ってシステムは自己調節性である。プラスミドコピー数が増加するに従って、細胞死の時点までプラスミド増幅をエスカレートさせ続けるＬａｒｇｅＴ抗原の生産の増大がなくなる。細胞内のＬａｒｇｅＴ抗原の量はＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡの量、ＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡの安定性、ＬａｒｇｅＴ抗原タンパク質の安定性、複製起点とＳＶ４０早期プロモーターの相対的親和性、および、細胞分裂によるベクター、ＬａｒｇｅＴ抗原ＲＮＡおよびＬａｒｇｅＴ抗原の量の低下の関数である。増幅系はベクター上に含有されるため、プラスミドの増幅は典型的にはＣＯＳ７宿主細胞の使用に限定されず、むしろプラスミドの増幅は殆どの哺乳類細胞型に対して使用できる。
【００９５】
他の複製系に関しては、発現ベクターは、それがウィルス起源である場合は、細菌宿主中の増殖を必要としない場合がある。しかしながらより典型的には、ベクターは細菌宿主中で増殖させ、Ｅ．ｃｏｌｉの複製と選択に必要な配列、例えばｃｏｌＥＩレプリコンおよび抗生物質耐性遺伝子を含有する。
【００９６】
発現ベクターは場合により選択可能なマーカー１つ以上を含有できる。例えば真核細胞のトランスフェクションのための適当な選択可能なマーカーはハイグロマイシン耐性、ネオマイシン耐性、ブラスチシジン耐性、ゼオシン耐性、ドキソルビシン耐性等のための遺伝子を包含する。他の細胞のための適当な選択可能なマーカーは抗生物質耐性遺伝子および栄養要求性（例えばアミノ酸栄養要求性）を補うものを包含する。発現ベクターはまた場合により宿主細胞が発現ベクターを含有するようにシグナリングするための選択可能なマーカーを包含できる。適当な選択可能なマーカーは緑蛍光タンパク質またはマーカーエピトープ、例えばポリヒスチジン、Ｘｐｒｅｓｓ（商標）リーダーペプチド（Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、配列番号１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｍｙｃエピトープ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ、配列番号２：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＬＡＧタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳｐ−Ｌｙｓ、配列番号４；（例えばＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０５−１２１０，１９８８参照）、ｌｅｘＡタンパク質または細菌チオレドキシンを包含する。マーカーは例えば酵素試験により、蛍光により、フローソーターまたは同様の装置を用い、抗体（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）を用い、ビーズ選択を用いる等して検出することができる。マーカーが細胞表面上に存在する場合は、それらはマーカーを発現する細胞を単離するか、これ等を富化させるために使用できる。
【００９７】
（核酸転移）
種々の方法を用いて宿主細胞内にライブラリ配列を転移できる（一般的にＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。一部の方法は宿主細胞内の一過性の発現を主にもたらす（即ち、発現は細胞集団から徐々に消失する）。他の方法はライブラリ配列を安定に発現する細胞を発生できるが、安定な発現体の比率は典型的には一過性の発現体よりも低地である。このような方法は核酸転移のためのウィルスおよび非ウィルスの機序を包含する。
【００９８】
適当な哺乳類細胞は例えば、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、ヒト神経芽細胞系統、Ｋ５６２、ＣＯＳ７、Ｂａ／Ｆ３、ＡＣ２（例えばＧａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｋｉｎｎａｉｒｄ，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．５：Ｓ１４５−Ｓ１５０，１９８６）、Ｂ９、ＨｅｐＧ２、ＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞等を包含する。動物宿主細胞は例えば癌組織および腫瘍、例えば黒色腫、結腸、前立腺、白血球、肝、腎、子宮等から単離した細胞である。特定の細胞および細胞系統は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから市販されている。
【００９９】
ウィルスベクターに関しては、ライブラリ配列は典型的にはウィルスパッケージの一部として宿主細胞に運搬される。ウィルスの型に応じて、核酸は染色体外エレメントとして残存させる（例えばアデノウィルス（例えばＡｍａｌｆｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：３３５２−３３５６，１９９６）またはアデノ関連ウィルス）か、または、それは宿主染色体内に取り込む（例えばレトロウィルス（Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６０５４−６０５９，１９９６））。
【０１００】
非ウィルス発現ベクターの転移のためには、多くの方法が用いられる（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照）。核酸転移のための１つの方法は核酸のリン酸カルシウム同時沈殿である。この方法は核酸がカルシウムおよびホスフェートイオンと同時沈殿して比較的不溶性のリン酸カルシウム複合体となり、これが培養皿底部上の付着細胞の表面上に沈着するという能力に依存している。他の方法は脂質ミセルを形成しながら伝家相互作用により核酸に結合する親油性カチオンを使用する。これ等のミセルは細胞膜と融合し、核酸を宿主細胞に導入し、ここで発現させる。別の核酸転移方法はエレクロトポレーションであり、これでは、核酸および宿主細胞を含有する緩衝液を通過するコンデンサーのプレートからの放電を行う。この工程は緩衝液に含有される核酸がこれ等の膜を貫通できる程度に十分に細胞膜を撹乱させる。別の方法は核酸の進入および培養細胞中での発現を媒介するカチオン性重合体、例えばＤＥＡＥデキストランの使用を含む。別の方法は細胞内への核酸の弾道的デリバリーを使用する。最後に核酸のマイクロインジェクションも用いることができる。
【０１０１】
マルチコピーベクターを保有する細菌のスフェロプラストに動物細胞を融合させることにより、多数の同一のベクター（例えばライブラリ配列を含有する発現ベクター）を各細胞内に導入することができる。融合は平均して１つの動物細胞との１つのスフェロプラストの融合を可能にする態様において行う。例えば、ｐＵＣプラスミドのように高コピー数のプラスミドを使用する場合は、多くの同一のプラスミドが典型的には各動物細胞に導入される。この方法は動物干せないのベクターの増幅の必要性をなくし、そして宿主細胞内の高コピー数およびその結果としてのライブラリ配列の高水準発現を可能にする。この操作法はまた動物宿主細胞内でベクターを増幅する必要なく、一過性の発現のより長い期間を可能にする。ベクターの高コピー数はまたレポーター発現の変化を示す動物宿主細胞からライブラリ配列の回収をより容易にする。
【０１０２】
一部の方法においては、標的分子と相互作用するポリペプチドをコードする複数の核酸を個々の細胞に導入する。複数のフラグメントの転移を最小限にする方法は当該分野で知られている。例えば「キャリア」核酸（例えばサケまたはニシン精子ＤＮＡのようなＤＮＡ、ｔＲＮＡ等）を用いることにより、または、宿主細胞に適用する核酸の総量を低減することにより、複数フラグメント進入の問題を低減できる。更に、各レシピエント細胞は複数の核酸フラグメントを受け取ることができる。宿主細胞を介するライブラリの複数の継代は、当初は擬陽性として存在した他の配列から目的の配列を最終的に分離可能とする。
【０１０３】
好ましい実施形態においては、レトロウィルスベクターは１つのペプチドを配列を各細胞に導入する。これは頑健なシグナルを供給し、何れかの所定の細胞内の複数の発現ベクターからのシグナルに対する希釈作用を低減する。
【０１０４】
（宿主細胞ディスプレイペプチド）
例示的実施形態において、発現ライブラリを含むオリゴヌクレオチドにコードされるペプチドは発現ライブラリが導入されていり宿主細胞の分泌経路および細胞外表面においてディスプレイされる。発現ライブラリ配列によりトランスフェクトされている宿主細胞は、エフェクターペプチドと共に分泌経路を同時に通過しそしてＡＰＰと共に細胞表面に束縛されるペプチド分子と共にＡＰＰを同時発現する。即ち発現されるペプチドはＡＰＰプロセシングの間ＡＰＰ分子と共に存在し、従って、これ等のペプチドはＡＡＰＰ、ＡＰＰプロセシング酵素またはＡＰＰプロセシングに関与する他の巨大分子と相互作用するために使用できる。更にまた、分泌経路を通過する際に、ライブラリペプチドはＡＰＰプロセシングにとってネイティブである生理学的条件下に発現される。同様に、宿主細胞の細胞外環境が実質的に生理学的な条件下に維持されている場合、細胞外表面上のライブラリペプチドは細胞外環境におけるＡＰＰプロセシングにとってネイティブであるものを温存するかこれに近似している条件下に発現される。
【０１０５】
ペプチドは典型的には哺乳類細胞のような宿主細胞の表目上の実質的に声楽的な条件下にディスプレイされる。各宿主細胞はその表面上にライブラリペプチドの１つ以上の数百、そして恐らくは数千のコピーを発現し、その大多数は典型的には細胞外ＡＰＰ標的分子への結合のために使用される。ペプチドは典型的には持続的な期間に渡り細胞の表面上に存在する。
【０１０６】
特定の実施形態においては、ペプチドライブラリを発現する宿主細胞は新しく作成するか、生存細胞である。別の実施形態においては、ペプチドライブラリ発現細胞はパラホルムアルデヒド化他の適当な固定剤中に固定することができる。このような固定されたペプチドライブラリ発現細胞は場合により使用時まで適当な温度（例えば４℃）で保存できる。ペプチドは典型的には延長された期間に渡り細胞の表面上に存在する。
【０１０７】
一部の実施形態においては、発現ライブラリでトランスフェクトされた宿主細胞は、発現ベクターを含有し場合によりライブラリペプチドを発現する細胞について富化される。このような選択は典型的には、ライブラリ発現ベクター内に含有される選択可能なマーカーに基づく（例えば発現カセットおよびベクターを参照）。選択可能なマーカーを用いた選択の方法は当該分野で知られている。例えばＦＡＣＳを用いて、発現ベクターにコードされるエピトープ（例えばＶ５、ＦＬＡＧ、チオレドキシン等）または提示分子そのもの（例えばＣＤ２４）に対する蛍光標識抗体を検出できる。更にまた、磁気ビーズ選択を知られた方法で使用できる。
【０１０８】
（ＡＰＰに特異的に結合する薬剤を得るための薬剤の予備スクリーニング）
特定の実施形態においては、化合物ライブラリおよび発現ライブラリはＡＰＰに特異的に結合する薬剤を発見するために予備スクリーニングできる。予備スクリーニングは例えば実質的に生理学的な条件下に実施できる。ＡＰＰに特異的に結合するものとして発見された薬剤を用いてＡＰＰ結合薬剤に関して富化された化合物または発現ライブラリを作成することができる（「予備富化化合物ライブラリ」または「予備富化発現ライブラリ」）。
【０１０９】
例えば、これはＨｉｓタグのようなアフィニティータグを有するＡＰＰの外部ドメイン（ｅｄＡＰＰ）を発現させ、ｅｄＡＰＰをカラムに結合させ、カラムに化合物ライブラリを通し、そして、富化された化合物を溶出することにより達成できる。次に富化された化合物を本発明の細胞系試験において試験する。
【０１１０】
更に、特定の実施形態においては、ＡＰＰのＮ末端短縮型を用いてＡＰＰに対する特異的結合に関し、薬剤を予備スクリーニングする。コレラノ短縮型はペプチド富化のためのより特異的な標的であるという利点を有する。より短い型を用いることの利点は、αおよびβ切断部位がＡＰＰのＮ末端配列の大部分の除去により有意な影響を受けないという事実で強調されてきた（例えばＤｅＳｔｏｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３０３１０−３０３１４，１９９５；Ｌａｍｍｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３９２２−３９２７，１９９９）。より短い型は例えばチオレドキシン、セイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、プロテインＡまたは他の提示タンパク質のＮまたはＣ末端融合タンパク質として発現することができる。ＡＰＰ６９５の分泌型もまた可溶性組み換えタンパク質として市販されている（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１１１】
本発明の例示的実施形態においては、ペプチド発現ライブラリはＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを発見するために予備スクリーニングされる。ＡＰＰ結合ペプチドをコードするものとして発見されたこれ等のクローンを回収し、そして当該分野で知られた方法を用いて増幅することにより、予備富化された発現ライブラリを作成できる。この予備富化発現ライブラリはＡＰＰに結合するペプチドをコードするものについて富化されたオリゴヌクレオチド配列の集団を含む。次にオリゴヌクレオチド配列の富化されたライブラリを本発明の方法に従って宿主細胞に導入し、ＡＰＰプロセシングを改変するＡＰＰ結合ペプチドを発見することができる。
【０１１２】
例えば、当該分野で知られた方法を用いて、発現ライブラリを発現のための動物宿主細胞に導入するか、または、例えばファージディスプレイのような非動物系を用いて発現させる。次に発現されたペプチドを標識されたＡＰＰおよび／またはＡＰＰのＮ末端短縮型の可溶性型（例えばＡＰＰの細胞外ドメインまたはＮ末端短縮型）または動物宿主細胞の表面上に発現されたものと接触させる。適当な標識は例えば、放射性標識（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、蛍光分子（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド、フルオレｓカミン、ペリジニン−クロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、Ｃｙ３（インドカルボシアニン）、Ｃｙ５（インドジカルボシアニン）、ランタニドホスファー等）、酵素（例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチニル基、前述したタグエピトープ等を包含する。一部の実施形態においては、検出可能な標識は種々の長さのスペーサーアームにより連結され、これにより潜在的な立体障害を低減する。或は、標識された結合相手、例えば標的分子に結合する抗体を使用できる。１つの例示的実施形態においては、ＡＰＰ分子はＨｉｓタグエピトープ標識により標識される。
【０１１３】
次に、ＡＰＰまたは種々の細胞外ドメインを含有するＡＰＰの短縮された形態の１つに結合する発現ペプチドを当該分野で知られた標識および方法を用いて発見する。例えばペプチドを発現し、Ｈｉｓタグ細胞外ドメインＡＰＰに曝露されたファージまたは細胞をＨｉｓタグアフィニティーカラムに通してＡＰＰ結合ペプチドを発現するこれ等のファージまたは細胞を富化することができる。或は、例えばペプチド発現動物細胞を蛍光タグ付けされた細胞外ＡＰＰまたは短縮されたＡＰＰに曝露し、そしてＡＰＰ結合細胞をＦＡＣＳで発見して分類することにより、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドを発現する細胞を得ることができる。このような富化の複数のラウンドを実施することができる。
【０１１４】
ＡＰＰ結合ペプチドを発現する細胞またはファージの富化の後、ペプチドコード配列を、予備富化に用いられた発現ベクターから切り出し、そして知られた方法を用いてＡＰＰプロセシングを改変するＡＰＰ結合ペプチドに関するスクリーニングのための適切なベクター（後述する発現カセットおよびベクターを参照）に転移させることができる。動物宿主細胞を予備富化に用いる本発明の一部の実施形態においては、ＡＰＰプロセシングを改変するペプチドのスクリーニングに使用する発現ベクターは予備スクリーニング中のペプチド発現のために使用したものと同じであることができる。
【０１１５】
（ＡＰＰプロセシングを改変する薬剤の検出）
別の特徴において、ＡＰＰプロセシングに対する化合物または発現ライブラリ内の薬剤の作用を試験する。ＡＰＰを発現する宿主細胞および少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を薬剤と接触させ、次に宿主細胞により発現されたＡＰＰのプロセシングに対する作用について宿主細胞を試験する。一部の実施形態においては宿主細胞は実質的に生理学的な条件下で薬剤と接触させる。例示的実施形態においては、ペプチド発現ライブラリを含むペプチドのＡＰＰプロセシングに対する作用を試験し、ここでは発現ライブラリは宿主細胞に導入されている（例えば上述した遺伝子ライブラリ、発現カセットおよびベクター、核酸転移および宿主細胞ディスプレイペプチドを参照）。別の実施形態においては、本発明の薬剤を含有する例えば植物から得た抽出物、例えば泥炭抽出物を作用を検出するために十分な時間、宿主細胞と混合する。
【０１１６】
ＡＰＰプロセシングに対するライブラリ内の薬剤の作用は、何れかの適当な検出手段、例えば特定のＡＰＰフラグメント、例えばＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βまたはＡＰＰｓ−γに特異的に結合するマーカーの使用により検出できる。このようなマーカーを用いれば、薬剤と接触させていない、または、ライブラリペプチド配列を発現しない宿主細胞と比較した場合の、Ａβの生産に相関する特定のＡＰＰフラグメントの相対的な存在または非存在を測定できる。例えば、ＡＰＰ特異的結合マーカーを蛍光タグで標識し、例えばＦＡＣＳ］分析のような知られた方法でこのようなマーカーの相対的存在または非存在について宿主細胞を試験することができる。例示的実施形態において、マーカーはＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの特定のエピトープに特異的な抗体である。特定のＡＰＰフラグメントに対する抗体、例えばＡＰＰｓ−β（例えばＡＰＰ中央領域に特異的なＡ３または１Ｇ７、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７３８６−１７３８９，１９９４）、ＡＰＰｓ−α（例えば６Ｅ１０、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２、ＡＰＰｓ−αのカルボキシ末端またはβおよびα切断部位の間のＡＰＰ領域に特異的）およびｐ３（例えば４Ｇ８、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）が挙げられる。
【０１１７】
宿主細胞が１つ以上のＡＰＰプロセシング酵素を発現する例示される実施形態においては、少なくとも２つのＡＰＰフラグメントフラグメントに特異的な少なくとも２つの標識マーカーの検出シグナルの比を測定する。次に、宿主細胞発現ライブラリ配列中のこの比の変化を検出することにより改変されたＡＰＰプロセシングを測定できる。例えばα−およびβ−セクレターゼの両方を発現する宿主細胞において、ＡＰＰｓ−αおよびＡＰＰｓ−βに特異的な抗体を２種の蛍光タグ（例えばＦＩＴＣおよびＰＥ）で標識し、結合した標識抗体の存在をＦＡＣＳで測定することができる。次にライブラリペプチドを発現する宿主細胞をβ−セクレターゼプロセシングの低下を示すＡＰＰｓ−β：ＡＰＰｓ−αのシグナル比の増大に従って選択する。
【０１１８】
一部の実施形態においては、ＡＰＰプロセシングに対する作用を有するものとして発見された薬剤を用いてＡＰＰプロセシングに影響する薬剤について富化されたサブライブラリを構築することができる。次にこのサブライブラリをスクリーニングのその後のラウンドにおいて宿主細胞に接触させることにより所望の特性を有する薬剤を発見できる（後述するライブラリ構成成分の特徴付けを参照）。
【０１１９】
例示的な実施形態においては、本明細書に記載した方法のいずれかにより単離または収集されたペプチドライブラリを発現する宿主細胞を用いて遺伝子ライブラリ配列を再単離することにより、ＡＰＰプロセシングに影響するものについて富化された配列のサブライブラリを構築できる。当業者の知るとおり、このような配列は、特に、選択されたクローンから発現ベクター核酸を回収し、そしてそれらを適当な細菌宿主系統に憩室転換することによるか、オリゴヌクレオチドインサートにフランキングする何れかの適当なプライミング部位を用いたＰＣＲによるライブラリオリゴヌクレオチドのクローニングによるか、別のベクター内への元の発現ベクター由来のオリゴヌクレオチドのサブクローニングによるなどして、単離することができる。オリゴヌクレオチドのサブライブラリは場合により発現カセットまたはベクターに必要に応じて再クローニングし、そして、宿主細胞内に再導入してスクリーニングのその後のラウンドに付すことができる。スクリーニング／選択のサイクルは必要に応じて何回も反復できる。
【０１２０】
特定の実施形態においては、十分な回数のサイクルの後、試験シグナルまたはその比においてかなりの相違が観察され、ペプチド配列の富化されたサブライブラリと元のペプチドライブラリとの間にＡＰＰフラグメントの存在における（例えば強度分布における）相違が示される。発現ライブラリまたはその部分の逐次的な導入、フローソーターまたは類似の装置における分類および所望の試験結果を示す宿主細胞からの核酸の単離の過程により、所望のペプチドをコードするライブラリオリゴヌクレオチドのある集団が発見できる。次にオリゴヌクレオチドを単離し、分子クローニングおよび核酸配列分析により個別に試験する。十分な回数のサイクルを実施した後には、多くの、そして典型的には殆どのここのオリゴヌクレオチドは宿主細胞上で発現された場合と本発明棒同様の作用の結合事象をもたらすペプチドをコードするはずである。
【０１２１】
（アロステリックエフェクターの発見）
特定の実施形態においては、エフェクター薬剤を試験することによりＡＰＰのアロステリックエフェクターを発見することができる。アロステリックエフェクターの発見はＡＰＰプロセシングのエフェクターとして発見された薬剤に対する二次的スクリーニングとして実施できる。或は、化合物ライブラリまたはペプチド発現ライブラリを予備スクリーニングしてＡＰＰ上の潜在的アロステリック部位に結合する薬剤を発見することができる。アロステリックエフェクターの発見は細胞系試験を用い、その後ＡＰＰに結合する薬剤を発見し、そして知られた方法でＡＰＰの構造における何らかの変化を測定することにより直接行うことができる。予備スクリーニング工程を含む方法においては、系はＡＰＰアロステリックエフェクターの発見に適合されている。
【０１２２】
（ライブラリ構成成分の特徴付け）
本明細書に記載した操作法のいずれかを用いて発見されたエフェクター剤を更に特徴付けすることができる。宿主細胞の分泌経路および細胞外表面においてペプチドを提示するために発現ライブラリを用いる場合は、ライブラリ配列は何れかの適当な方法、例えばＨＩＲＴ細胞溶解および細菌宿主細胞中のベクターの回収、ポリメラーゼ連鎖反応等により宿主細胞から単離することができる（例えばＨｉｒｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５−３６９，１９６７；米国特許４，６８３，２０２号、４，６８３，１９５号および４，８００，１５９号；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８９）；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９９）；Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ），ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６）；ＥＰ３２０３０８；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上出を参照：参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２３】
スクリーニングのその後のラウンドは場合によりＡＰＰプロセシングはＡＰＰプロセシングを改変する薬剤について富化するために実施することができる。化合物のサブライブラリまたは発現ライブラリを別のスクリーニングおよび／または選択に付すことによりより望ましい性質を有する薬剤またはオリゴヌクレオチド配列について富化することができる。より望ましい性質を有するエフェクター薬剤を富化するためには、例えばＡＰＰに対する進歩した特異性または親和力を有するか、ＡＰＰプロセシングに対する増大した作用を有する薬剤について富化するための別のスクリーニングにサブライブラリ（上記した方法のいずれかにより単離されている）を通すことが望ましい。例えば、望ましくない分泌または細胞外の相互作用に対する僅かな作用を適切な二次スクリーニングにより排除することができる。所望により、別の標識を用いて分泌または細胞外の分子の相互作用に影響するライブラリペプチド配列を発見することができる。更に、分泌または細胞外の分子の相互作用に対して一般化された非特異的な作用を有するエフェクター薬剤も、ＡＰＰまたはＡＰＰプロセシング酵素発現を欠損した異なる宿主細胞に化合物のサブライブラリまたはここのエフェクター薬剤を接触させる（または発現サブライブラリまたはここのライブラリペプチド配列を通過させる）こと、および、次にプロセシングの改変または他の非ＡＰＰ分泌または細胞表面分子に対する別の作用について試験するこれ等の細胞に対するスクリーニングを実施することにより、発見できる。
【０１２４】
一部の場合において、本発明により発見されたエフェクター薬剤を用いてＡＰＰプロセシングを改変する他の薬剤を発見できる。例えばＡＰＰプロセシング意の分子エフェクターとして発見された小型の有機分子を例えば低下した毒性または増大した薬効を含む向上した特性を有する薬剤を発見するための指向性スクリーニング法において使用できる。例えば、エフェクター薬剤を含むサブユニット１つ以上に対し修飾を行うことができる。修飾はＲ基の型、数または位置に関する変動を包含できる。次に修飾された小型分子のエフェクター薬剤は、向上した特性を有する薬剤を得るために本明細書に記載した方法を用いてスクリーニングに付される。
【０１２５】
更にまた、ペプチド発現ライブラリを含むペプチドライブラリを用いる場合、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドの配列を修飾できる。一部の場合において、元のライブラリは長さＮのアミノ酸配列の全ての可能な順列を含有しない場合がある（例えばもとのライブラリが半ランダムライブラリの場合）。このような場合は、発見されたペプチドを原料（「リード化合物」）として単離して使用することにより、別のペプチドまたは元のペプチドと比較して増強された機能（例えばより高い親和力または親和性）を有するペプチドを発見することができる。ライブラリ配列の変異体を単離するためには、核酸の増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応による）を用いて複製過程の間に配列の変化を導入することができる（例えばＣｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３５４６−３５５１，１９９６参照）。このような突然変異はより効果的な性質を有する配列変異体をもたらすことができる。或は、例えばインビトロ突然変異誘発、易エラー製ＰＣＲおよび／または組み換えＰＣＲによるなどして核酸の突然変異および／または組み換えを増強する条件に増幅工程を故意に付すことにより既存の配列の改善された変異体を探索することが望ましい場合がある（例えばＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上出；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１，１９９４参照）。このような条件は当該分野で知られており、そして、元のライブラリにより発現される配列と比較して、より低濃度で活性であり、および／または増大した特異性および／または活性を示す配列を検索するための手段を提供する。
【０１２６】
（ＡＰＰプロセシングの分子エフェクターの適用）
本発明の方法は特に生理学的条件下でＡＰＰに結合してそのプロセシングを改変する生理学的に該当するエフェクター薬剤を発見する能力を提供する。
【０１２７】
本明細書に記載した方法を用いて発見されたエフェクター薬剤は例えば動物モデルにおいてインビボで試験できる。発見された薬剤は例えばα−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを刺激する（「ＥＭα」）か、または、β−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを抑制する（「ＥＭβ」）ものとして発見されるエフェクター分子（「ＥＭ」）であることができる。好ましい実施形態においては、動物は典型的にはアルツハイマー病、特にＡβの上昇した水準に関連する病理学的条件を示すものである。例えば、動物は例えばＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）（Ｈａｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２，１９９６）またはＰＤＡＰＰ（Ｖ１７１Ｆ）（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５２３−５２７，１９９５）のようなアルツハイマー病に関連する病理学的突然変異を有するトランスジェニックマウスであることができる。
【０１２８】
特定の実施形態においては、発見された薬剤を例えば直接の注射または経口投与により、動物に直接投与できる。更に、エフェクター薬剤がペプチドである場合は、発見されたペプチドは動物モデルにおいてペプチドを発現させることにより試験することもできる。例えば、１つの実施形態においては、ペプチドをコードする構築物を例えば直接の注射により動物の特定の標的組織（例えばＣＳＦまたは脳）に導入することができる。別の実施形態においては、エフェクターペプチドをコードする構築物はトランスジェニックマウスモデル中で発現されたトランスジーンである。エフェクターペプチドトランスジーンを発現するトランスジェニックマウスはまた、例えば病原性アルツハイマー病突然変異を有するトランスジェニックマウス（例えばＳｗｅｄｉｓｈおよび／またはＡｒｃｔｉｃ突然変異を有するＡＰＰ遺伝子を有するトランスジェニックマウス）
と交配することができる。発見されたエフェクターペプチドは膜結合提示分子として細胞外に発現され提示されるか、または膜固定を伴うことなく細胞外の空間に分泌される。更にまたエフェクターペプチドの発現は例えば組織特異的プロモーター（例えば神経組織中の発現のためのＴｈｙ１プロモーター）を用いて特定の組織にターゲティングすることができる。
【０１２９】
薬剤を動物に導入した後、改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的状態または症状、例えばＣＳＦ、脳細胞および／または血清中のＡβ濃度を低下させる能力；プラーク抑制；またはアルツハイマー病に関連する他の病理学的状態または適応症の低減に対する作用について動物をモニタリングする。
【０１３０】
（ペプチドエフェクターの機能を増強する別の修飾）
前述した通りＡＰＰの識別的プロセシングに影響するペプチド配列は種々の態様でその作用を発揮できる。当業者の知るとおり、ペプチドの変異体または類縁体を合成することによりペプチドの有効性を向上させることができる。例えば、ペプチドの有効性はペプチド自体（即ち如何なる付属の配列も伴わない）を投与することにより向上する。
【０１３１】
当業者の知るとおり、ペプチドの構造的類縁体および誘導体（例えば保存的なアミノ酸の挿入、欠失または置換を有するペプチド、ペプチドミメティック、ジスルフィド交差結合、人工の交差結合等）もまた治療薬として有用である。例えば、天然のアミノ酸を含むことができる上記したペプチドに加えて、テンプレートペプチドと類似している性質を有する非ペプチド薬剤としてペプチド類縁体を使用することができる。これ等の型の非ペプチド化合物は、例えばコンピュータ化された分子モデリングを用いて開発することができる（例えばＦａｕｃｈｅｒｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．１５：２９，１９８６；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ３９２，１９８５；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９，１９８７参照）。このような類縁体、またはペプチドミメティックティいくは構造的には治療上または予防上有用なペプチドと同様であり、等価な治療上または予防上の作用をもたらすために使用できる。一部の場合においては、ペプチドミメティックは例えばより経済的な生産、より大きい化学的安定性、増強された薬理学的性質（例えば半減期、吸収、力価、薬効等）、改変された特異性（例えばより広い生物活性スペクトル）、増大した、低減した抗原性、増大した血液脳関門を越える通過性、および他の所望の性質を含めて、ペプチドを越えた顕著な利点を有している。
【０１３２】
ペプチドミメティックは当該分野で知られ、そして以下の参考文献、即ち、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ）２６７，１９８３；Ｓｐａｔｏｌａ，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ，ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｍａｒｃｈ １９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，ｐｐ．４６３−４６８，１９８０；Ｈｕｄｏｓｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５，１９７９；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９，１９８６；Ｈａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．ｐｐ．３０７−３１４，１９８２；Ａｌｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８，１９８０；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２３５５，１９８２；欧州特許出願ＥＰ４５６６５、１９８２；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ９７：３９４０５，１９８２；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４，１９８３；およびＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９，１９８２に更に記載された方法により作成できる。
【０１３３】
１つの特徴において、ペプチド（または類縁体またはミメティック）の薬学的に許容される塩は従来の方法で容易に調製できる。例えばそのような塩は薬学的に許容される所望の金属水酸化物または金属塩基の水溶液でペプチドを処理すること、そして、得られた溶液を典型的には窒素雰囲気中減圧下で蒸発乾固させることにより調製できる。或は、ペプチドの溶液を所望の金属のアルコキシドと混合し、その後溶液を蒸発乾固させる。薬学的に許容される水酸化物、塩基およびアルコキシドはこの目的のためのカチオン、例えばカリウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムとのものを包含する。他の代表的な薬学的に許容される塩は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩等を包含する。
【０１３４】
ペプチドまたはその類縁体または誘導体を安定化させることによりそのシェルフライフおよび薬物動態半減期を増大させることが望ましい。シェルフライフ安定性は賦形剤、例えばａ）疎水性物質（例えばグリセロール）；ｂ）糖類（例えばスクロース、マンノース、ソルビトール、ラムノースまたはキシロース）；ｃ）複合炭水化物（例えば乳糖）；および／またはｄ）殺菌剤を添加することにより向上できる。ペプチドの薬物動態半減期は、化学的誘導化を用いて担体ペプチド、ポリペプチドおよび炭水化物にカップリングすることにより（例えば側鎖またはＮまたはＣ末端残基をカップリングすることにより）、または、対象ペプチドのアミノ酸を化学的に改変することにより修飾できる。これ等のペプチドの薬物動態半減期および薬力学的特徴はまたａ）カプセル化（例えばリポソーム中）；ｂ）水和の程度の制御（例えばペプチドのグリコシル化の範囲と種類の制御による）；ｃ）ペプチドの静電的荷電および疎水性の制御；およびｄ）ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体等のような薬学的に許容されるデポ剤中の製剤により変更することもできる。
【０１３５】
治療上の投与のためには薬剤および本発明のミメティックを薬学的に許容される担体中に製剤できる。本明細書においては、「薬学的に許容される担体」には全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗カビ剤、等張性付与剤および吸収増強または遅延剤、および、生理学的に適合する他の賦形剤または添加剤が包含される。特定の実施形態においては、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、経口、または経皮投与に適している。投与経路に応じて、活性薬剤は酸および薬剤を不活性化する可能性のある他の天然の条件の作用から薬剤を保護するための物質でコーティングすることができる。
【０１３６】
本発明の医薬組成物を調製する際には、薬剤を週ｈ即するか、薬剤またはミメティック化合物を他の薬剤と組み合わせるかコンジュゲートすることにより、選択された薬剤の薬物動態および生体分布を改変することが望ましい場合がある。薬物動態および生体分布を改変するための多くの方法は当業者の知るとおりである。このような方法の例は種々の薬剤、ペプチドまたはその複合体を、他のタンパク質、脂質、炭水化物または合成重合体よりなるベシクル中で保護することを包含する。例えば本発明の薬剤をリポソームに取り込ませることにより薬物動態および生体分布の特性を増強することができる。リポソームを調製するための種々の方法が知られており、例えばＳｚｏｋａ ｅｔ ａｌ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７，１９８０；米国特許４，２３５，８７１号；４，５０１，７２８号；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。リポソームデリバリーと共に使用するためには、薬剤は典型的にはリポソームまたは脂質ベシクル内部に捕獲するか、または、ベシクルの外面に結合させる。特定の組織および特定の細胞型にリポソームをターゲティングすることによりリポソーム媒介デリバリーの効率を上昇させるための数種の手法が考案されている。リポソーム製剤、例えばカチオン性脂質を含有するものは、ヒト患者において安全であり十分耐容性があることがわかっている（Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ．８２：１７０６−１７１０，１９９０）。
【０１３７】
或は、本発明の組成物は薬学的に許容される担体、適切な生理学的条件のために必要な物質、例えばｐＨ調節剤および緩衝剤、浸透圧調節剤、水和剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有することができる。
【０１３８】
固体組成物の場合は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を使用でき、これにや、例えば、薬品用等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が包含される。経口投与のためには、薬学的に許容される非毒性の組成物は、前述の担体のような通常用いられる賦形剤の何れか、および、一般的には約１０〜９５％、より典型的には約２５％〜７５％の活性成分を配合することにより形成する。
【０１３９】
薬剤を投与するための治療用組成物はまた、溶液、マイクロエマルジョンまたは高濃度の活性成分に適する他の秩序のある構造物として製剤できる。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび脂質ポリエチレングリコール等）およびこれ等の適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。溶液の適切な流体性は例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散製剤の場合は所望の粒径を維持することにより、そして界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合において、等張性付与剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが望ましい。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアレート塩およびゼラチンを組成物中に含有させることにより達成できる。
【０１４０】
本発明の特定の実施形態においては、薬剤は除放性製剤中、例えば遅延放出重合体を含む組成物中で、または、デポ注射により投与する。活性剤またはミメティックは急速な放出から保護する担体、例えば制御放出ベシクル、例えばインプラント、経皮パッチまたはマイクロカプセル化デリバリーシステムと共に調製できる。本発明の種々の組成物中の薬剤またはその生物活性類縁体またはミメティックの延長されたデリバリーは吸収をを遅延させる薬剤、例えばものステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを組成物中に含有させることにより達成できる。薬剤の制御放出製剤が望まれる場合は、本発明に従って使用するために適する制御放出バインダーは活性成分に対して不活性であり、選択された薬剤の取り込みが可能な何れかの生体適合性の制御放出物質を包含する。このような物質は多くのものが知られている。有用な制御放出バインダーは哺乳類において皮下または筋肉内注射の後に生理学的条件下で（即ちそこに存在する体液の存在下において）緩徐に代謝される物質である。適切なバインダーは例えば除放性製剤の技術分野において以前より使用されている生体適合性重合体および共重合体を包含する。このような生体適合性の化合物は例えば皮下または筋肉内注射の後周囲の組織に対して非毒性および不活性であり、そして免疫応答、炎症等のような顕著に有害な作用を誘発しない。それらは生体適合性であり身体から容易に排出される代謝産物に代謝される。
【０１４１】
例えば加水分解可能なエステル結合を有する共重合体および単独重合体であるポリエステルから誘導された重合体マトリックスを使用してよい。これ等の多くのものは生体分解性であり、そして毒性が全く無いか低い分解性生物をもたらすことが当該分野においてわかっている。例示される重合体はポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ−乳酸グリコール酸共重合体）（ＤＬＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ−乳酸グリコール酸共重合体）（ＤＰＬＧＡ）およびポリ（Ｌ−乳酸グリコール酸共重合体）（ＬＰＬＧＡ）を包含する。他の有用な生体分解性または生体侵食性の重合体は例えば、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン乳酸共重合体）、ポリ（イプシロン−カプロラクトングリコール酸共重合体）、ポリ（ベータ−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）、ヒドロゲル、例えばポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（即ちＬ−ロイシン、グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルタミド）、ポリアセタール重合体、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、多糖類およびそれらの共重合体を包含する。このような製剤を調整するための多くの方法は当該分野で知られている（例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８参照）。有用な製剤は制御放出組成物、例えばマイクロカプセル（米国特許４，６５２，４４１号および４，９１７，８９３号、各々は参照により本明細書に組み込まれる）、注射用製剤（米国特許４，８４９，２２８号、参照により本明細書に組み込まれる）、マイクロカプセルまたは注射用製剤の作成において有用である乳酸グリコール酸共重合体（米国特許４，６７７，１９１号および４，７２８，７２１号、各々は参照により本明細書に組み込まれる）および水溶性ペプチド用の除放性組成物（米国特許４，６７５，１８９号、参照により本明細書に組み込まれる）を包含する。長期持続性放出インプラントもまた使用できる。これ等は少なくとも１０〜２０日間、場合により少なくとも３０日間、そして６０日間より長期にわたり選択された薬剤の治療濃度を供給するように容易に構築できる。長期持続性放出インプラントは当該分野でよく知られており、そして上記した吸収支援成分の一部を配合できる。このようなインプラントは印譜ｒんとを標的組織または細胞集団の近傍に、または直接内部に留置することにより目的の部位１つ以上において薬剤の局在化した高用量を影響させるため、特に有用なものである。
【０１４２】
本発明の選択された薬剤はハードまたはソフトシェルのゼラチンカプセルに封入するか、圧縮成型して錠剤とするか、または、対象の食餌に直接配合できる。経口治療投与のためには、薬剤を賦形剤とともに配合し、摂取可能な錠剤、口内用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用できる。当然ながら、味覚改善物質を経口剤型の場合には添加することができる。これ等の組成物および調製物中の選択された薬剤の比率（例えば重量または体積による）もまた当然ながら変動できる。上記したとおり、治療上有用な組成物中の選択された薬剤の量は一般的には治療有効用量が供給されるようにする。
【０１４３】
経口投与のためには、選択された薬剤は、恐らくは更にステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、「カーボワックス」またはポリエチレングリコールのような潤滑剤を添加することにより、固体担体物質、例えばクエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムまたはリン酸２カルシウム、および、バインダー、例えばポリビニルピロリドン、ゼラチンまたはセルロース誘導体と共に混合することにより、錠剤または他の固体形態とされる。固体デリバリーベヒクルは目的の薬剤、例えばペプチドを、充填剤、例えば乳糖、サッカロース、マンニトール、デンプン、例えばバレイショ澱粉またはアミロペクチン、セルロース誘導体または高分散ケイ酸と野混合物中に含有できる。ソフトゼラチンカプセルにおいては、活性物質を植物油または液体ポリエチレングリコールのような適当な液体中に溶解または懸濁する。更に別の形態として、例えばハードゼラチンのプラグカプセル、並びに軟化剤または可塑剤、例えばグリセリンを含有する投薬用ソフトゼラチンカプセルを使用することもできる。
【０１４４】
或は、選択された薬剤を供給するための液体剤型は、水、薬学的に許容される脂肪または油脂、アルコールまたは他の有機溶媒、例えばエステル中の溶液または懸濁液、乳液、シロップまたはエリキシル、懸濁液、非発泡性顆粒から希釈調整した溶液および／または懸濁液、および、発泡性顆粒から希釈調整した発泡性調製物を包含する。このような液体剤型は、例えば適当な溶媒、保存料、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、濃厚化剤および溶融剤を含有できる。経口剤型は場合によりフレーバー剤および着色剤を含有する。非経腸および静脈内の剤型もまたミネラル類や選択されたデリバリーシステムの型に適合するための他の物質を含有できる。
【０１４５】
本発明の治療用組成物は典型的には製造、保存および使用の全ての条件下において滅菌され安定でなければならない。滅菌注射用溶液は必要に応じて上記した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の選択された薬剤を配合し、その後濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、塩基性非分散媒体および上記した他の必要成分を含有する滅菌ベヒクル中に薬剤を配合することにより調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、製造方法は、活性成分＋何れかの付加的な所望の成分の粉末を、それらの予備濾過滅菌溶液からもたらすような、真空乾燥および凍結乾燥を含む。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により達成できる。
【０１４６】
本発明のより詳細な特徴において、選択された薬剤は対象にデリバリーされた後のその有効な半減期を延長するために、特に生理学的環境内（例えば血流、脳脊髄液中、または、結合組織コンパートメントまたは体液充填体腔内部）における活性状態の代謝的存続を延長するために、安定化させる。この目的のためには、選択された結合剤は化学的手段、例えば化学的コンジュゲーション、Ｎ末端キャッピング、ＰＥＧ化または組み換え手段、例えば部位指向性突然変異誘発または融合タンパク質の構築により修飾するか、または、種々の安定化剤または担体と共に製剤してよい。このように安定化すれば、上記したとおり投与された選択された薬剤は非安定化形態と比較して生理学的条件下で延長された期間に渡り活性を保持する（例えば２〜３から５〜１０倍の大きい安定性）。例えば本発明の薬剤は、特に薬剤がペプチドまたはその類縁体である場合は、他の知られた保護または安定化化合物にコンジュゲートすることにより、または免疫グロブリン鎖１つ以上のような担体タンパク質１つ以上に連結したペプチドまたは類縁体との融合タンパク質の作成により、薬剤を遮蔽することにより循環半減期が長くなるように修飾できる（例えば米国特許５，７５０，３７５；５，８４３，７２５；５，５６７，５８４および６，０１８，０２６号参照；各々は参照により本明細書に組み込まれる）。これ等の修飾は薬剤の分解、封鎖またはクリアランスを低減し、そして生理学的環境中（例えば循環系または脳脊髄液中）でのより長い半減期をもたらす。従って安定化方法により修飾された薬剤は本発明の方法において増強された薬効を持って有用となる。特にこのように修飾された薬剤は未修飾のペプチドまたは類縁体と比較してデリバリーの標的部位においてより長い期間、活性を維持する。
【０１４７】
本発明はまた上記した医薬組成物、活性成分および／またはアルツハイマー病の治療において使用するためのその投与手段を含むキット、パッケージおよびマルチコンテナ単位を包含する。慨すれば、これ等のキットは典型的には生物学的に適当である担体と共に薬学的調製物中に製剤された薬剤を含有するコンテナまたは処方を包含する。薬剤は場合により大量供給用コンテナまたはマルチ単位投与形態に含有される。パッケージ材料は場合によりそこにパッケージされた医薬品がアルツハイマー病の治療に使用できることを示したラベルまたは取扱説明書を含む。キットはまた適当な緩衝液、保存料、例えばプロテアーゼ阻害剤も含有してよい。
【実施例】
【０１４８】
以下の実施例は本発明の種々の特徴を説明しているのみであり、本発明を如何なる点においても制約するものではない。
【０１４９】
（実施例１：宿主細胞における遺伝子ライブラリの調製）
遺伝子ライブラリを発現ベクターのクローニング部位内にランダムオリゴヌクレオチドを挿入することにより調製する。発現ベクターは、転写の方向に対して相対的に５’の方向に、プロモーター、シグナル配列をコードする核酸、提示分子をコードする核酸、提示分子をコードする核酸の５’末端に位置するクローニング部位、膜貫通ドメインをコードする核酸および転写ターミネーターを含む発現カセットを有する。発現ベクターは複製起点（ＣｏｌＥ１）およびＥ．ｃｏｌｉ内での選択のための抗生物質耐性マーカーを含む。ランダムオリゴヌクレオチドは約７〜約２０アミノ酸残基のペプチドをコードする。オリゴヌクレオチドを含有するベクターを宿主細菌に形質転換し、そして、選択可能な条件下に生育させることにより約１０百万〜数１０億個の独立した単離株のライブラリを樹立する。ベクターＤＮＡをこのライブラリから調製する。このベクターＤＮＡを動物細胞、例えばヒト細胞、哺乳類細胞または他の動物細胞に導入する。
【０１５０】
（実施例２：ＡＰＰエフェクターの発現のためのランダムペプチドベクターの操作）
ＡＰＰエフェクターの発現のための好ましいランダムペプチドは図３に示すカセットインサートを有するレトロウィルスベクターである。カセットはプラスミド；分泌経路にタンパク質を進入させるための分泌配列；ランダムアミノ酸配列に構造を付与するジスルフィド架橋の形成を誘発するためのランダム配列の末端においてシステインをコードするランダムペプチド配列；グリシンスペーサー；提示タンパク質；細胞表面に可撓性を与えるための第２のグリシンスペーサー；および融合タンパク質を細胞表面に束縛させるためのＧＰＩリンカー配列をコードする。提示タンパク質はランダムペプチド配列が束縛され提示される球状の不活性タンパク質である。この配置によりランダムアミノ酸のペプチド環が可撓性を与えるグリシンのストリングの端部に束縛される。細胞と提示タンパク質との間のグリシンスペーサーもまた全体の束縛分子の可撓性をもたらす。ペプチド環に対する可撓性はＡＰへのランダムアミノ酸配列の結合による提示タンパク質からの立体障害を最小限にする。
【０１５１】
（実施例３：発現ベクターの構築）
宿主細胞の表面上のライブラリペプチドの高い発現水準を達成するために、発現ベクターを使用する。発現ベクターは細菌内における増殖および選択のために必要なマーカー、哺乳類細胞転写プロモーター（例えばサイトメガロウィルスまたはＥＦ−１αプロモーター等）を含む発現カセット、提示分子をコードする核酸および転写ターミネーターを包含する。ランダムライブラリ配列は提示分子をコードする核酸のＮ末端、Ｃ末端または内部に挿入でき、そして、提示分子の線状または制約されたループアレイ中か露出ループ中にあることができる。
【０１５２】
提示分子を宿主細胞の表面に結合させるためには、提示分子をコードする核酸は分泌シグナル配列をコードする配列および細胞表面に融合タンパク質を束縛するエレメント（例えばグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナルまたは膜貫通および細胞内ドメイン）を包含する。適当な提示分子は例えばＩＬ−３受容体、プロテインＡ、チオレドキシン、ＣＤ４、ＣＤ２０またはＣＤ２４を包含する。提示分子はまた１つ以上のエピトープ、例えばＦＬＡＧ、Ｖ５またはポリヒスチジンも包含できる。転写ターミネーターは、例えばヒト成長ホルモン由来のものであることができる。
【０１５３】
ＣＯＳ７およびＫ５６２細胞のような哺乳類細胞の細胞表面のペプチドライブラリを提示するために２つの異なる発現ベクターを構築した。１つの構築物は線状構造のＮ末端に約７〜約１２アミノ酸残基を有するペプチドを置き、もう一方の構築物はＮ末端における制約されたループを形成するためにペプチド配列の各末端においてシステイン残基を含む。各構築物はプロテインＡ、チオレドキシン、Ｖ５またはＦＬＡＧエピトープを含む提示分子、分泌のためのＣＤ２４由来の分泌シグナル配列、および、宿主細胞の表面への結合のためのＣＤ２４由来のＧＰＩ連結用配列コードしている。かなり大きい多様性のライブラリを作成できるが、完成したペプチド発現ベクターの各々の概ねの多様性は約１ｘ１０９のユニークペプチドである。
【０１５４】
（実施例４：ＡＰＰエフェクターの発見のための試験細胞系統の樹立）
ＡＰＰのエフェクターを発見するための試験細胞系統には以下の４つの主要な条件が存在し、即ち、１）細胞はＡＰＰプロセシング酵素の天然の補体を保有する必要があり、２）細胞はＡＰＰを構成的に生産する必要があり、３）細胞はこれ等の実験の高スループットの条件を促進するために懸濁細胞であり、そして４）スクリーニング系はＡＰＰの発現とプロセシングに関連する天然の生理学的条件を模倣する必要がある。
【０１５５】
ＡＰＰ発現細胞系統は、ＡＰＰをコードする哺乳類発現ベクターを構築すること、および、この発現ベクターを親細胞系統に導入することにより調製する。２種の細胞系統、即ち神経芽細胞系統およびヒト胚腎細胞系統（ＨＥＫ）がこれ等の試験のために典型的に使用されている。これ等の細胞系統の両方ともＡＰＰ実験において使用されている（Ｃｅｄａｚｏ−Ｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．３５：３０７−３１５，１９９９；Ｌｏｐｅｚ−Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７３：２０５６−２０６２，１９９９）。ＨＥＫ細胞系統は成育が容易であり、そして神経芽細胞系統よりも問題点が少なく、従ってこれ等の実験のために好適である。神経芽細胞系統は代替としての細胞系統である。
【０１５６】
これらの実験を容易にするために、ＨＥＫ細胞をスピナー培養条件に適合させる。適合は、細胞が血清非含有培地中で生育可能となるまで、静置培養において培地中の血清の量を徐々に減少させることにより達成される。次に細胞をスピナー培養容器に移して生育させる。これ等の操作法の両方でかなりの細胞死があるが、一部の細胞は生存し、生育する。これ等の条件下で最も良好に生育した細胞は、良好度が低い細胞よりも早く成育史、血清非含有スピナー培養条件下で良好に生育するように適合された細胞をもたらす。これ等の操作法は当業者の理解する通りである。
【０１５７】
ＡＰＰをコードするｃＤＮＡはＡＴＣＣまたはＩＭＡＴから入手するか、または、ＰＣＲ増幅により得られ、そしてＤＮＡ配列分析により確認する。ＡＰＰコードｃＤＮＡを哺乳類発現ベクター内に挿入し、親哺乳類細胞系統にエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションされた細胞をネオマイシン選択下でウェルの５０％において細胞生育が可能となる密度でマイクロプレート中にプレーティングし、クローン単離が可能な条件を得る。これ等の細胞系統のＡＰＰ発現は下記に示す通り蛍光顕微鏡観察および抗ＡＰＰ抗体を用いたＦＡＣＳ分析により評価する。
【０１５８】
本出願に記載したスクリーニング手法を良好に実施するためには、多数の細胞およびペプチド配列を操作してスクリーニングできることが重要である。懸濁培養細胞およびスピナー培養容器を使用することにより、一日当たり何十億もの細胞を生育、取り扱いおよび利用する方法が実施可能となる。
【０１５９】
（実施例５：ＡＰＰのインビトロ発現および産物の分析）
野生型のＡＰＰおよびＳｗｅｄｉｓｈ、Ａｒｃｔｉｃおよび／またはＤｕｔｃｈ突然変異を含むＡＰＰのクローンをＨＥＫ−２９３細胞において発現させた。突然変異体クローンの発現はＡＰＰプロセシングのエフェクターに関するインビトロのスクリーニング試験におけるプロセシングの相違を示すための対照として有用である。
【０１６０】
発現プラスミドを構築するために、完全長の野生型６９５アミノ酸ヒトＡＰＰをコードするクローン（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７３３−７３６，１９８７）を入手した。エクソン１のＮｒｕＩ部位〜３’ＵＴＲのＳｍａＩの３ｋｂのフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。このベクターはＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する。同様にＡＰＰＳｗｅおよびＡＰＰＡｒｃをコードするクローンをＣＭＶ−ＡＰＰＳｗｅおよびＣＭＶ−ＡＰＰＡｒｃの構築のための原料として使用した。
【０１６１】
これ等の構築物をＨＥＫ−２９３細胞に導入した。内因性セクレターゼによる切断によりＡＰＰタンパク質は数個のフラグメントにプロセシングされた。ＡＰＰタンパク質発現およびプロセシングは溶解物および擬似トランスフェクトされた（即ちＡＰＰ配列を有さないプラスミドでトランスフェクトされた）およびＡＰＰＳｗｅトランスフェクトされた細胞のコンディショニングされた培地のウエスタンブロット分析により評価した。完全長ＡＰＰおよびＣ末端フラグメントＣ９９、Ａβ、ＡＰＰＳ−αおよびＡＰＰｓ−βはＡβ配列のアミノ酸１〜１６を認識する６Ｅ１０抗体を用いて検出した。完全長ＡＰＰ、Ｃ９９およびＡβはＡＰＰＳｗｅトランスフェクト体由来の細胞溶解物中に存在した。細胞溶解物中のＡβの発見は分泌経路内のプロセシングの結果であると考えられる。ＡＰＰＳ−αおよびＡβはＡＰＰＳｗｅトランスフェクト体由来のコンディショニング培地中にも検出された。ＡＰＰＳ−αおよびＡＰＰｓ−βはそれぞれ６Ｅ１０抗体およびＳｗ１９２抗体を用いたＳｗｅｄｉｓｈまたはＳｗｅｄｉｓｈ／Ａｒｃｔｉｃ突然変異をトランスフェクトした細胞のコンディショニング培地中にも発見された。抗体Ｓｗ１９２（Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）はβ−セクレターゼ如リ切断された場合にのみＡＰＰＳｗｅのアミノ酸５９０〜５９６を認識する。
【０１６２】
（実施例６：レトロウィルス感染）
レトロウィルス発現ベクターはパッキング細胞系統（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９，１９９３）中にパッケージされ、セクレターゼプロセシング酵素およびＡＰＰを含有する試験細胞を感染するために利用される。融合タンパク質は分泌シグナルの影響下に分泌経路を介して進入して通過し、細胞表面上の提示を持って終了する。細胞表面において、提示タンパク質、グリシンスペーサーおよびランダムアミノ酸配列を含む融合タンパク質（ディスプレイ複合体）はＧＰＩ連結部を介して細胞に結合する。セクレターゼの一部によるＡＰＰのプロセシングは分泌経路の通過中、並びに、細胞表面において起こると考えられる（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．８１：７４１−７６７，２００１）。ディスプレイ複合体およびＡＰＰは同様に分泌経路を通過し、そして共通の過程において細胞の表面上にディスプレイされる。従って、ランダムアミノ酸配列が存在し、そして、有効なペプチドは分泌経路内並びに細胞表面上でその構造を改変するＡＰＰに結合する機会を有する。図４はディスプレイ複合体の立体配置を示す。
【０１６３】
（実施例７：トランスフェクトされた細胞の富化）
細胞はＤＮＡを取り込んでそれを発現する効率が異なる。発現可能なＤＮＡの導入がそれほど効率的でない場合は、場合により、発現ベクター（例えばプラスミド）を含有し、そしてＤＮＡを旨適発現する細胞を富化することができる。遺伝子ライブラリを含有する細胞の富化を行うためには、マーカーをコードする配列のような標識を発現ベクターに包含させる。このようなマーカーは典型的には細胞に結合したまま残存する。マーカーをコードするこの配列は例えば転写プロモーターおよびターミネーター、分泌シグナル配列（例えばＣＤ２４）をコードする配列、１つ以上の細胞外ドメイン（例えばＶ５、ＦＬＡＧ等）およびマーカーを細胞表面に束縛する配列（例えばグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナル）であることができる。２つの異なるマーカー（例えばＶ５とＦＬＡＧ）の間にペプチドライブラリを置くことは提示分子中の両方のマーカーを含有し、そして宿主細胞の表面上で発現される細胞のみを選択することによりペプチドライブラリの一貫性を確実にする。
【０１６４】
実施例３に記載した発現ベクターを使用することにより、平均で細胞当り１個または数個のみのベクターが導入されるような条件を用いたエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞をトランスフェクトした。細胞をトランスフェクト後に培地に入れ、そして種々の時点において、ＦＡＣＳで分析することにより細胞表面または内部におけるチオレドキシンまたはＦＬＡＧの発現を検出した。各場合において、比較的高い比率の細胞がトランスフェクト後の１日に提示分子（例えばチオレドキシン−抗チオレドキシン抗体を用いて検出）を発現し、分子は次の週にわたって持続していた。これ等の結果は提示分子が数日間比較的高い水準で発現されることを示している。
【０１６５】
ペプチドライブラリを発現するトランスフェクトされた宿主細胞はまたＦＡＣＳ分析または磁気ビーズ上の選択を行う前に、パラホルムアルデヒドに固定した。結果によれば、マーカーエピトープは固定後もなお抗体に接触可能であり、ライブラリペプチドが標的分子への結合のために使用できたことを示していた。
【０１６６】
同様の実験によれば、ペプチドライブラリをコードするプラスミドベクターでエレクトロポレーションによりトランスフェクトしたＫ５６２細胞は８０％細胞生存率で約５０％の効率でトランスフェクトされた。旨適発現期間はトランスフェクトした後１日〜２日であった。Ｋ５６２細胞上で発現された提示分子の水準は、Ｋ５６２細胞はＣＯＳ７細胞と同様にプラスミドベクターを増幅しないため、ＣＯＳ７細胞より低値であった。しかしながら、標識抗ＦＬＡＧ抗体の局在により示されるとおり、十分な提示分子がＫ５６２細胞表面上に発現された。
【０１６７】
結果によれば、哺乳類細胞の表面上のペプチドライブラリのディスプレイのための頑健な系であることがわかった。細胞へのＧＰＩ連結を介した提示分子の束縛およびチオレドキシンおよびＣＤ２４由来のドメインの使用により、ペプチドライブラリの持続的で安定な発現がもたらされる。更にまた、提示分子のＮ末端におけるペプチドの設置は、細胞表面から比較的遠隔であり、そして高度に望ましい親水的な環境において潜在的標的分子へのペプチドの妨害されない接触を確保するものである。
【０１６８】
（実施例８：ＡＰＰに結合するペプチドの予備スクリーニング）
ＡＰＰに結合してその構造を改変するペプチドの構造の利点のため、そしてＡＰＰに結合するペプチドの全てがタンパク質のタンパク質分解プロセシングをモジュレートしないがプロセシングに影響するペプチドの全てがＡＰＰに対する高親和性の結合を有することが期待されるため、ＡＰＰに単純に結合するペプチドの予備富化が行われる。本方法により作成されスクリーニングされる構造は多数であるため、この富化過程のためにはファージディスプレイを使用する。更にまた、ファージディスプレイ選択法は高親和性結合ペプチドの発見のための更にストリンジェントなスクリーニング条件を可能にする。ファージディスプレイペプチドライブラリは市販品（即ちＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるか構築することができる。ペプチド配列は線状の可撓性の構造として、または、相対的に剛性の構造を示す制約されたループとして整列させることができる。エフェクターペプチドは３または４アミノ酸残基長の小型、５、６、７〜２０アミノ酸またはより多いアミノ酸残基長のものであることができる。
【０１６９】
ＡＰＰ細胞外ドメインおよびＮ末端短縮型は、精製を容易にするためのＨｉｓタグを使用しながら細菌およびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞または他の哺乳類宿主細胞中で発現させる。これ等の形態はＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ抑制剤ドメイン配列のすぐ３’側のヌクレオチド４５７から始まり、他端がヌクレオチド５５０にある分子、およびＮ末端官能基は除外されるが膜外のアミノ酸残基にβ切断部位近傍でランダムコイル配列を含む分子を包含する。これ等のアフィニティー分子の生産、安定性および精製に容易さにより選択される分子が決定される。
【０１７０】
ランダムペプチド配列を発現するファージをＨｉｓタグ細胞外ドメインＡＰＰに曝露し、そしてＨｉｓアフィニティーカラムに通すか、または、表面Ｎｉ２＋を含有する磁気ビーズに予め結合させたＨｉｓタグＡＰＰ分子の特定の形態に曝露する。富化の２または３ラウンドの後、ランダムペプチドををコードするヌクレオチド配列を富化されたファージのＤＮＡから切り出し、そしてレトロウィルスベクターに転移させる。この富化工程により、プロセシング酵素の活性を改変したり何らかの他の態様でプロセシングの変化をもたらすよりはむしろ、ＡＰＰに結合することによりＡＰＰプロセシングを改変するペプチドの発見の確率が高くなる。ランダムに選択されたペプチドはまたコンセンサス結合モチーフの存在を評価するために配列決定される。
【０１７１】
（実施例９：エフェクターペプチドのスクリーニング）
試験細胞を約数十億以上の多数で成育させる。細胞をペプチドライブラリをコードするレトロウィルスに感染させる。生育２日の後、ビオチニル化抗提示タンパク質抗体およびストレプトアビジンコーティングビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてディスプレイ複合体を発現している細胞を得るための磁気ビーズ選択法により細胞を選択する。選択により細胞表面上にディスプレイ複合体を発現している細胞が富化される。これにより感染していない細胞およびランダムＤＮＡ配列内の終止コドンにより早期に停止している配列を発現する細胞が排除される。ランダムペプチド配列をコードする半ランダムＤＮＡを用いて終止コドンを最小限にできるが、完全には排除しない（ＬａＢｅａｎ ａｎｄ Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：１２４９−１２５４，１９９３）。終止コドンの頻度はランダムペプチド配列の長さに関係する。約７、または約１２、または約１６アミノ酸残基のアミノ酸長芽典型的には使用される。
【０１７２】
磁気ビーズ選択法はまた、感染しており、完全長の束縛されたディスプレイ複合体を合成する能力を有するが、例えば染色体内のサイレントな発現部位への組み込みのためディスプレイ複合体の十分な量を発現しない細胞も排除する。従って選択はＡＰＰの構造を改変するために有効なディスプレイタンパク質の十分な水準を発現する細胞を与える。この立体配置の有効性はトロンボポエチン受容体を発現する生育依存性Ｂａ−Ｆ３細胞中で束縛されたエフェクターペプチド配列を発現することにより明らかにされている。束縛されたエフェクターペプチドは以前の生育依存性の細胞系統に成育非依存性を付与する。これは受容体の活性化および細胞の生存をもたらす細胞表面受容体の構造を束縛ペプチドが改変できることを示している。
【０１７３】
ビーズ富化細胞は、ＡＰＰの異なるフラグメントを認識する識別的に標識された抗体を利用した蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により分類する。増大したα−セクレターゼプロセシングをもたらすペプチドを富化したい場合は、ソーティングは、ＡＰＰＳ−αのＣ末端に相当するａ−ｂ内のアミノ酸３〜１０を認識するＰＥ標識抗体（６Ｅ１０、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）とｐ３のＮ末端に相当するＡβのアミノ酸１６〜２４を認識するＦＩＴＣ標識抗ｐ３抗体（４Ｇ８、Ｐｉｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２７：９０−９５，１９９４，ＭｃＬａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：１２６３−１２６９，２００２）との間の蛍光の比の変化に基づいて行われる（図５参照）。ランダムペプチド配列を有さない発現ベクターを感染させた対照細胞は対照ＰＥ／ＦＩＴＣ比を与える。低下したＰＥ／ＦＩＴＣ蛍光比を有する細胞を収集する。
【０１７４】
同様に、ＦＩＴＣ標識抗ＡＰＰｓ−β（ＡＰＰ中央領域に特異的なＡ３またはＩｇ７、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｍ．２６９：１７３８６−１７３８９，１９９４）のＰＥ標識抗体（６Ｅ１０）抗ＡＰＰＳ−α蛍光に対する増大した比を有する細胞を収集することによりβ−セクレターゼのタンパク質の低減をもたらすペプチドを得るために細胞を分類する（図５参照）。
【０１７５】
ＡＰＰエフェクター試験系をセットアップして試験するために、αおよびβ部位における切断の量に影響する試薬および条件を使用して試験の感度および有効性を明らかにする。例えば、試験細胞をα−またはβ−セクレターゼをコードする発現ベクターでトランスフェクトする。これによりこれ等の部位におけるプロセシングが増大し、細胞試験により明らかにされる。ＦＡＣＳで富化細胞が得られた後、ランダムペプチドをコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅により細胞から回収し、そしてペプチドライブラリ発現ベクター内に再クローニングする。当業者の知るほう操作法を用いる。単離されたクローンは細菌中で増幅し、レトロウィルスパッキング細胞に再パッケージし、ナイーブの試験細胞を感染させる多面胃使用し、そして、真のエフェクターペプチドをコードするクローンが得られるまで富化工程を反復する。ランダムペプチド配列をコードするクローンのＤＮＡ配列分析によりエフェクターペプチドの配列が明らかになる。
【０１７６】
１つ以上のエフェクターペプチドが発見された後、エフェクターペプチドがＡＰＰの構造に影響する能力について試験する。エフェクターペプチドの結合のための方法はよく知られており、そして、ペプチドライブラリを予備スクリーニングするための上記した方法を包含する。
【０１７７】
（実施例１０：エフェクターペプチドの特徴付け）
エフェクターペプチドを特徴付けすることにより可溶性Ａβがエフェクターペプチドの影響下の培養において低減することを示す。エフェクターペプチドの発現の存在下および非存在下における試験細胞由来の培地のＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを用いて所望の作用を確認する。
【０１７８】
１つの試験においては、ＡＰＰのα−セクレターゼプロセシングを増大させるエフェクターペプチド（本明細書においては「ＥＭαペプチド」）をＨＥＫ２９３細胞またはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中でヒトＡＰＰと同時発現する。完全長ＡＰＰの発現水準はウエスタンブロット分析（抗体６Ｅ１０または２２Ｃ１１）によりエフェクターペプチドの存在下または非存在下において測定する。更にまた、エフェクターペプチドを試験する効率は、それがペプチド発現後の培地Ｔｕｍ−でプロトフィブリルおよび単量体可溶性Ａβ１〜４０およびＡβ１〜４２の水準を低減する能力を評価する。ＡβプロトフィブリルおよびＡβ１−４０／４２の水準は種々の異なる抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定する。市販の抗体（即ちＢｉｏｓｏｕｒｃｅ／ＱＣＢ ｃａｔ＃４４−３４８および４４−３４４）を用いてそれぞれＡβ４０およびＡβ４２を特異的に定量する。
【０１７９】
同様に、ＡＰＰおよびＡβ４０およびＡβ４２の発現水準に対するＡＰＰのβ−セクレターゼプロセシングを低減するペプチド（本明細書においては「ＥＭβペプチド」）の作用を同様の態様で特徴付けする。
【０１８０】
近傍のプロセシング活性に対するＥＭαおよびＥＭβペプチドの作用もまた特徴付けする。ＥＭαペプチドを発現する細胞においては、ＡＰＰｓβ、ＡＰＰｓγ並びにＣ末端フラグメントＣＴ９９の放出を、ＥＭαペプチドが発現されない場合のこれ等のフラグメントの放出と比較する。異なるフラグメントパターンは干渉作用を示している。同様にして、ＡＰＰｓα、ＡＰＰｓγ、ｐ３およびＣＴ５７／５９の放出をＥＭβペプチドの発現の存在下または非存在下において測定する。
【０１８１】
ＥＭαまたはＥＭβペプチドの特異性または薬効が家族性ＡＤ突然変異において改変されているかどうかも調べる。以下のＡＰＰ突然変異をこの試験において使用する。
（ａ）Ｓｗｅｄｉｓｈ（Ｌｙｓ６７０Ａｓｎ；Ｍｅｔ６７１Ｌｅｕ）、β−切断部位に対しＮ末端の２アミノ酸；
（ｂ）Ｆｌｅｍｉｓｈ（Ａｌａ６９２Ｇｌｙ）、α−切断部位に対しＣ末端の５アミノ酸；
（ｃ）Ｄｕｔｃｈ（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ）、α−切断部位に対しＣ末端の６アミノ酸；
（ｄ）Ａｒｃｔｉｃ（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｙ）、α−切断部位に対しＣ末端の６アミノ酸；および、
（ｅ）Ｉｏｗａ（Ａｓｐ６９４Ａｓｎ）、α−切断部位に対しＣ末端の７アミノ酸。
【０１８２】
更にまたＡＰＰタンパク質およびＡＰＰプロセシング比に対するＥＭαまたはＥＭβペプチドの親和性または会合の速度動態にＡＰＰ突然変異が影響するかどうかも調べる。結合試験は野生型ＡＰＰおよび突然変異形態のＡＰＰを発現するＨＥＫ２９３細胞とともに放射標識ＥＭαまたはＥＭβをインキュベートすることにより実施する。
【０１８３】
β−部位のプロセシングはＡＰＰがＳｗｅｄｉｓｈ突然変異を含んでいる場合に有意に増大する（Ｍｕｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３４５−３４７，１９９２参照）。例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異を含んでいるヒトＡＰＰを発現するトランスジェニックマウス（ハムスタープリオンプロモーター−ｈＡＰＰＳｗｅ）において、ＳＤＳ可溶性Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドは５箇月齢の２１および６ｐｍｏｌ／ｇから２１ヶ月の１１，１００および２，０００ｐｍｏｌ／ｇにそれぞれ増大する（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３７２−３８１，２００１）。ＡＰＰＳｗｅとのＥＭβペプチドの同時トランスフェクションは、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異がβ−部位切断に対するＥＭβペプチドの抑制作用に影響するかどうかを示す。同様に、ＥＭαペプチド刺激α−切断に対する上記したα−部位近傍のＡＰＰ突然変異（ｂ）−（ｅ）の作用も評価する。
【０１８４】
Ａβの量の低減におけるエフェクターペプチド（ＥＰ）の効力もまたＡβを過剰発現する適当なトランスジェニック動物モデル、例えばＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．Ｋ６７０Ｎ／＜６７１Ｌ）２５６７またはＰＤＡＰＰにおいて評価できる（例えば後述する実施例１１および１２参照）。
【０１８５】
更に別の特徴付けではペプチドの標的の発見を行う。これらの実験はディスプレイ複合体（束縛されたペプチドを有する提示タンパク質）並びにペプチド単独をアフィニティー標識として利用する。ＡＰＰへのペプチドの結合はペプチドを標識すること、および、ＡＰＰの細胞外ドメインへの結合を評価することにより調べる。蛍光標識されたペプチドもまた、ＡＰＰを発現しない対照試験細胞と比較しながら、ＡＰＰを発現する試験細胞への結合を評価するために使用される。
【０１８６】
プロセシング酵素への結合を評価するために、標識されたペプチドを用いて親試験細胞へのペプチドの結合およびプロセシング酵素を発現しないことがわかっている細胞への比較ペプチドの結合を測定する。更に別の特徴付けは、可溶化細胞溶解液と混合され、そしてイオン交換およびサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより分画された標識ペプチド、２−Ｄ電気泳動およびタンパク質スポットの質量スペクトル分析により他の細胞成分への結合を測定することを含む。エフェクターペプチドは、ＡＰＰへの結合を伴うことなく、または他の重要な生体分子のプロセシングを改変することなく、Ａβの減少をもたらす別の細胞分子に結合して機能を改変することもありえる。
【０１８７】
（実施例１１：トランスジェニックマウスにおけるＡＰＰプロセシングのエフェクターのインビボの薬効の試験−直接ペプチド投与）
ＥＭαペプチドのインビボの薬効試験は、ＡＰＰα−セクレターゼの切断速度を刺激するその能力、および、脳におけるＡβプロトフィブリルおよびＡβ４０／４２の水準を低下させることを測定する。プロトフィブリルの濃度および脳分布はＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学法によりプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体を用いて試験する。プラーク負荷は４％パラホルムアルデヒド中の脳組織の灌流と固定化、および、Ａβ抗体による免疫染色を含む標準的な操作法を用いて測定する（例えば前述した６Ｅ１０を用いる（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１４４４−１４５１，２００１参照））。
【０１８８】
ＥＭαおよびＥＭβペプチドの初期の試験は血液脳関門通過特性を測定するためにＴｇマウスへの皮下または腹腔内注射によるペプチドの直接投与を含んでいる。通過は、それぞれ、抗ＥＭαまたは抗ＥＭβペプチドＥＬＩＳＡ法を用いてＣＳＦおよび脳灌流後の脳ホモジネート中のＥＭαまたはＥＭβを測定することにより評価する。異なる用量を試験し、脳およびＣＳＦ中で得られるペプチドの水準に相関付ける。インビボ実験はそれぞれ有意なα−セクレターゼの刺激またはβ−セクレターゼの阻害を得るために必要とされるＥＭαまたはＥＭβペプチドの濃度に関する情報を与える。代替となる更に高感度の方法は、ペプチドを放射標識（ヨウ素化）してＣＳＦおよび脳ホモジネート中の放射能を測定することである。この方法はより高感度であるが、ペプチドの修飾のために誤差のある結果が得られる場合がある。更にまた、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの半減期は、動物薬効試験における用量頻度に関する指針として、標準的な方法を用いてＣＳＦ、脳および血清中で測定する。経時的にＥＭαまたはＥＭβペプチドのＣＳＦ／脳濃度が一定であることが典型的には望ましい。ＥＭαまたはＥＭβペプチドが満足できる通過特性を示す場合、次に薬効試験を実施する。しかしながら、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの通過特性が満足できない場合は、ペプチドの直接のｓｃまたはｉｐ投与による薬効試験は実施しない。代替法は浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を用いたｉｃｖによりペプチドを供給するか、または、Ｔｇマウスの脳内のペプチドの直接の発現（後述参照）による。
【０１８９】
１つの試験において、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの薬効試験は直接ペプチド投与による。直接投与による薬効試験ではＴｇマウスに４〜６ヶ月ＥＭαまたはＥＭβを投与し、エンドポイントとしてＡβ４０／４２およびＡβプロトフィブリルの水準を低下させる。Ａβ水準の低下は、プロトフィブリルの形成はＡβ１−４０およびＡβ１−４２の濃度に依存していることから、Ａβプロトフィブリルの低下をもたらすと考えられる。適当なマウス系統はｍＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅであり、これは本発明者等の研究室で進行中であり、十分樹立されたＡＤモデルと同様であるＳｗｅｄｉｓｈ突然変異を含有するヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の６９５アミノ酸のアイソフォームに対するトランスジーンコーディングを担持している（Ｈｉｓａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２，１９９６参照）。即ち、ｍＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅはＡβ１−４０およびＡβ１−４２の有意な時間依存性の増大、大量のアミロイドの付着、加齢相関性の脳コレステロールおよびＡｐｏＥの上昇、並びに、改変されたシナプス有効性を示すと考えられる（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３７２−３８１，２００１）参照。この「Ｈｉｓａｏ−ＡＰＰマウス」モデルはまた挙動不全を発症することがわかっている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１８５８−１８６７，２００２参照）。
【０１９０】
薬効試験はまたＳｗｅｄｉｓｈおよびＡｒｃｔｉｃ突然変異の両方を含有する二重トランスジェニックモデル（ｍＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅＡｒｃ）においても実施する。このモデルは脳におけるＡβＡｒｃプロトフィブリルの高水準をもたらすモデルを樹立するために開発された。Ａβプロトフィブリルは神経毒性（Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８８７６−８８８４，１９９９参照）であり、そして早期シナプス機能に影響する（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：７８９−７９１，２００２参照）。Ｎｉｅｌｓｂｅｒｔｈ等（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：８８７−８９３，２００１）はＡｒｃｔｉｃ突然変異がより高いプロトフィブリル安定性および形成速度を与え、これによりＡＤの早期の発症をもたらすことを明らかにしている。
【０１９１】
アミロイド付着前の早年期における、そして、Ａβ水準が殆ど加齢依存性を示さない時期におけるＥＭαまたはＥＭβペプチドの短期の投与（２〜３週間）はインビボのＡＰＰプロセシングを改変するそれらの機械的能力を評価するものである。更にまた、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの予防上の作用はアミロイド付着の発症前に開始し、トランスジェニックマウスモデルが頑健なアミロイド付着を示すことがわかっている磁気まで継続する長期の投与により、若年Ｔｇマウスにおいて評価される。最後に、ＥＭαまたはＥＭβペプチドの治療上の作用はアミロイド付着の発症後の加齢マウスへの長期の投与により検討される。アミロイドの病理の種々の尺度を測定することにより薬効および安全性が評価される（例えばＡβおよびチオフラビンＳプラーク負荷、抽出可能なＡβ１−４０およびＡβ１−４２、Ａβプロトフィブリル、逐次抽出により評価（トリス緩衝食塩水、トリトンＸ−１００、ＳＤＳおよびギ酸）およびＥＬＩＳＡ）。神経変性変化のような二次的な組織の損傷（ニューライトの萎縮、シナプス消失、酸化的損傷）もまた主に免疫組織化学的検査および定量的な画像分析により分析される。脳炎の伝統的なマーカー、例えばＧＦＡＰ（大グリア細胞腫）およびＭＡＣ−１／ＣＤ１１およびＩＬ−１（小神経膠細胞症）並びに他のプロ炎症性サイトカイン、例えばγ−ＩＦＮ、ＩＬ−２およびＩＬ−６および抗炎症サイトカイン、例えばＴＧＦ−α、ＩＬ−４およびＩＬ−１０が測定される。認識不全の予防は伝統的なＭｏｒｒｉｓの水迷路よりも「エピソード様」の記憶に対してより感受性が高いラジアルアームの水迷路において試験される。
【０１９２】
（実施例１２：トランスジェニックマウスにおけるＡＰＰプロセシングのエフェクターのインビボの薬効試験−インビボペプチド発現）
ＥＭαまたはＥＭβペプチドの血液脳関門通過特性が満足できない場合は、薬効試験の代替の手法をトランスジェニックマウスの脳におけるエフェクターペプチドの直接インビボ発現により行う。ともにＥＭαまたはＥＭβペプチドのコーディング配列が例えばＴｈｙ−１プロモーターを用いてニューロン内で発現される２種の異なる発現ベクター構築物を作成する。１つのＤＮＡ構築物（本明細書においてはＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＳ）はエフェクターペプチドが脳内で分泌（Ｓ）された形態において発現されるように操作され；他方のＤＮＡ構築物（本明細書においてはＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＭ）はＧＰＩリンカーを含有し、これにより発現されたペプチドをニューロン膜（Ｍ）にターゲティングさせる（図８参照）。次にＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＳおよびＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＭトランスジェニックマウスを標準的な操作法を用いて作成する。
【０１９３】
Ｔｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＳおよびＴｈｙ１−Ｅｍα／ＥＭβＭトランスジェニックマウスをＴｈｙ１−ｈＡＰＰＳｗｅおよびｍＴｈｙ−ｈＡＰＰＳｗｅＡｒｃトランスジェニックマウスと高配させ、インビボのＥＭαまたはＥＭβペプチドの薬効を測定する。これ等の複数のトランスジェニックモデルはまたＡＰＰプロセシングのコンパートメント化に対するペプチドの作用を特徴付けするためにも使用される。分泌型または膜結合型（例えばＥＲ−、Ｇｏｌｇｉ−、原形質膜−結合型）ＥＭαペプチドのＡＰＰα−セクレターゼ分解速度に対する作用を測定する。同様に、分泌型または膜結合型びＥＭβペプチドのβ−セクレターゼ分解速度に対する作用を測定する。これらの被験は重要なインビボのデータ、例えば増大したα部位プロセシングまたは低減したβ部位プロセシングがＡβプロトフィブリルおよびＡβ４０／４２の水準の低下、より低いアミロイド付着、低い炎症および／または改善された認識機能に翻訳されるかどうかに関するものを与える。
【０１９４】
本発明は請求した本発明の範囲を説明するためのものでありこれを限定するものではない。本発明の他の変形例は当業者には自明であり、添付の請求項に包含される。本明細書において引用した全ての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】図１はアルツハイマー病をもたらすアミロイドカスケードを示す。
【図２】図２はβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびその主な代謝誘導体の模式的ダイアグラムである。上のダイアグラムは７７０アミノ酸を含む既知のＡＰＰオルタナティブスプライシング型の最大のものを示す。アミノ酸７７０〜７２３における単一の膜貫通ドメインは垂直の破線で示す。β−アミロイド（Ａβ）フラグメントは膜外側の２８アミノ酸プラスＴＭドメインの最初の１２〜１４残基を含む。矢印はプロセシング酵素によるタンパク質分解の部位を示す。種々のタンパク質分解フラグメントを標識する（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．８１：７４１−７６７，２００１）。
【図３】図３はＡＰＰのエフェクターペプチドの発見のためのレトロウィルス構築物用のランダムペプチドおよび提示タンパク質の発現のための発現カセットの代表を示す。
【図４】図４はシステインループの立体配置におけるランダムペプチド配列を有する細胞の表面上に発現された提示タンパク質の代表を示す。
【図５】図５は標識されたフラグメントを有する細胞表面上のＡＰＰ、切断部位、ＡＰＰのフラグメントを認識する抗体、および、ＡＰＰの改変されたプロセシングを検出するための蛍光の比を使用した手法を示す。
【図６】図６は本発明で使用するために適するＣＤ２４Ｖ５融合タンパク質およびチオレドキシン−ＦＬＡＧ融合タンパク質をコードするｐＩｃｏＤｕａｌと命名された発現ベクターの一例を示す。
【図７】図７はＣＤ２４Ｖ５融合タンパク質およびチオレドキシン−ＦＬＡＧ融合タンパク質をコードするｐＩｃｏＦＬＡＧＸａと命名された発現ベクターを示し、ここでＸａ因子アミノ酸基質配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ（配列番号５）をコードするＤＮＡがランダムペプチド配列をコードする部位に挿入されている。
【図８】図８はトランスジェニックマウスにおけるエフェクターペプチドのインビボの発現のためのＴｈｙ１−ＥＭα／ＥＭβＳ（Ｓ）およびＴｈｙ１−ＥＭα／ＥＭβＭ（Ｍ）発現構築物を示す。「ＥＭα／ＥＭβ配列」とはＥＭαペプチド（即ちα−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを刺激するエフェクターペプチド）またはＥＭβペプチド（即ちβ−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを抑制するエフェクターペプチド）の何れかのヌクレオチドコーディング配列を示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞に該薬剤を接触させる工程、および、
改変されたＡＰＰプロセシングを検出してＡＰＰのプロセシングを改変する該薬剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
改変されたＡＰＰプロセシングを検出する工程が、前記宿主細胞の表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を評価する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種が、ＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βまたはＡＰＰｓ−γである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つのＡＰＰプロセシング酵素が、α−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記改変されたＡＰＰプロセシングが、アミロイドβ−タンパク質（Ａβ）の低下した産生を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アミロイドβ−タンパク質が、アルツハイマー病の危険性の増加と関連する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アルツハイマー病の危険性の増大と関連する前記アミロイドβタンパク質が、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、化合物ライブラリ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物ライブラリが、組合せ化学ライブラリである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物ライブラリが、天然産物ライブラリである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物ライブラリが、ペプチドライブラリである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、低分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が、生体分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子が、ペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、該ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドから転写および翻訳により産生される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、約１８〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、約３６〜約６０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドの宿主細胞との接触工程が、宿主細胞に発現ベクターを導入する工程を包含し、該発現ベクターは、該ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含み、これにより該宿主細胞は、分泌経路内において、そして細胞外の細胞表面上で該ペプチドを発現し、提示する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリ由来であり、少なくとも大多数のオリゴヌクレオチドが、異なるペプチドをコードする異なる配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数のオリゴヌクレオチドの配列が、無作為化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現ライブラリが、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドについてあらかじめ富化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドの宿主細胞との接触工程が、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に前記発現ライブラリを導入する工程を包含し、該宿主細胞は、それによって、分泌経路内において、そして細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、さらに以下：
前記異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；および、
宿主細胞の該第１の部分から該ＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、少なくとも１つ含む発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１が、選択可能なマーカーを用いて富化されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択可能なマーカーが、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはチオレドキシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記富化工程が、磁気ビーズ選択を包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記富化工程が、蛍光活性化細胞分離による選択を包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する前記宿主細胞が、高コピー数の前記異なるペプチドを発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、提示分子との融合タンパク質として提示される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記提示分子が、ＣＤ２４である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記提示分子が、ＩＬ−３レセプターである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記提示分子が、チオレドキシンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質がさらに、マーカーエピトープを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記マーカーエピトープが、ポリヒスチジン、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはｍｙｃである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質がさらに、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナルを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記動物宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記動物宿主細胞が、組換え宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記動物宿主細胞が、単離された細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤が、実質的に生理学的な条件下で宿主細胞に接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記実質的に生理学的な条件が、複合生物学的液体の存在を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記複合生物学的液体が、血液、血清、血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を評価する工程が、ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種に特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーに宿主細胞を接触させる工程、および、結合した標識されたマーカーを検出する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのマーカーが、ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの所定のエピトープに結合する抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を評価する工程が、さらに、ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異的な少なくとも２つの標識された抗体の検出シグナルの比を測定する工程を包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記薬剤が、ＡＰＰのアロステリックエフェクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記宿主細胞の表面上の改変されたＡＰＰプロセシングを検出する工程が、フローソーターの使用を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の方法であって、動物に前記薬剤を投与する工程、および改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的条件に対する作用について、該動物をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与が、直接注射または経口投与によるものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記薬剤がペプチドであり、前記動物がペプチドをコードする発現構築物を含むトランスジェニックマウスであり、ここで、該発現構築物が、作動可能な組み合わせにおいて、（ａ）プロモーター、（ｂ）分泌配列、（ｃ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｄ）転写終結配列を含み；そして、該トランスジェニックマウスがインビボで検出可能なレベルのペプチドを発現する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記発現構築物が、細胞膜に固定される提示分子をコードし、該発現構築物がさらに、以下：
（ｅ）提示タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、該提示タンパク質コード配列は、ペプチドコード配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列、および、
（ｆ）膜貫通ドメインまたはＧＰＩリンカーをコードするヌクレオチド配列であって、該膜貫通ドメインまたはＧＰＩリンカー配列は、該提示タンパク質コード配列に対して３’に位置し、そして、転写終結配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列、
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的条件に対する作用が、ＡβプロトフィブリルまたはＡβ４０／４２のレベルの低下である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的条件に対する作用が、プラーク阻害である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に導入する工程であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも大部分は、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、該宿主細胞が、それによって分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、工程；
該異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；および、
宿主細胞の第１の部分からＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記動物宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記動物宿主細胞が、組換え宿主細胞である、請求項５３に載の方法。
【請求項５６】
前記動物宿主細胞が、単離された細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
複数の宿主細胞の第１が、実質的に生理学的な条件下で異なるペプチドを提示する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
（１）複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリをあらかじめ富化する工程であって、少なくとも多数のオリゴヌクレオチドが、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードする少なくとも一つのオリゴヌクレオチドについて、富化する工程であって、該あらかじめ富化する工程は、以下の工程：
（ａ）ファージの表面上のオリゴヌクレオチド配列によりコードされるペプチドを発現し得るファージディスプレイベクター内に発現ライブラリを導入する工程；
（ｂ）該ファージの表面上に異なるペプチドを発現する工程；
（ｃ）ＡＰＰまたはＮ末端短縮ＡＰＰに特異的に結合するペプチドを発現するファージ粒子の部分を選択する工程であって、ここで該Ｎ末端短縮ＡＰＰは、α−またはβ−セクレターゼ切断部位を有する、工程；および、
（ｄ）該選択されたファージ粒子からオリゴヌクレオチド配列を回収してあらかじめ富化した発現ライブラリを形成する工程；
を包含する、工程；
（２）ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１にあらかじめ富化された発現ライブラリを導入する工程であって、該宿主細胞に分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で少なくとも１つのＡＰＰ結合ペプチドを発現し、提示させる工程；
（３）少なくとも１つのＡＰＰ結合ペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；ならびに、
（４）宿主細胞の該第１の部分から、ＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むあらかじめ富化された発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項５９】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に、導入する工程であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも大部分は、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、該宿主細胞が、それによって分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、工程；
該異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；ここで改変されたＡＰＰプロセシングは、異なるペプチドを提示する該宿主細胞の表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を、ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種に特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーと、該宿主細胞を接触させる工程、および該結合した標識されたマーカーを検出する工程によって、評価する工程によって測定される工程；ならびに、
宿主細胞の該第１のサブセットからＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む該発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６０】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に、導入する工程であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも大部分は、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、それによって、該宿主細胞が、実質的に生理学的条件下で、分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、工程；
該異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；ここで改変されたＡＰＰプロセシングは、異なるペプチドを提示する該宿主細胞の表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を、ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種に特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーと、該宿主細胞を接触させる工程、および該結合した標識されたマーカーを検出する工程によって、評価する工程によって測定される工程；および、
宿主細胞の該第１のサブセットからＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む該発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６１】
前記薬剤がペプチドメティック、等配電子置換化合物、Ｄ−アミノ酸アナログ、または、非ペプチジル化合物に変換される、請求項１４に記載の方法により同定される、薬剤。
【請求項６２】
前記薬剤が、血管脳関門の通過を促進するように改変される、請求項１に記載の方法により同定される、薬剤。
【請求項６３】
前記薬剤が、非経口、経口、除放性、局所、鼻内または吸入の用途のために処方される、請求項１に記載の方法により同定される、薬剤。
【請求項１】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する動物宿主細胞に該薬剤を接触させる工程、および、
改変されたＡＰＰプロセシングを検出してＡＰＰのプロセシングを改変する該薬剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
改変されたＡＰＰプロセシングを検出する工程が、前記宿主細胞の表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を評価する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種が、ＡＰＰｓ−α、ＡＰＰｓ−βまたはＡＰＰｓ−γである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つのＡＰＰプロセシング酵素が、α−セクレターゼ、β−セクレターゼまたはγ−セクレターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記改変されたＡＰＰプロセシングが、アミロイドβ−タンパク質（Ａβ）の低下した産生を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アミロイドβ−タンパク質が、アルツハイマー病の危険性の増加と関連する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アルツハイマー病の危険性の増大と関連する前記アミロイドβタンパク質が、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、化合物ライブラリ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物ライブラリが、組合せ化学ライブラリである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物ライブラリが、天然産物ライブラリである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物ライブラリが、ペプチドライブラリである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、低分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が、生体分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子が、ペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、該ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドから転写および翻訳により産生される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、約１８〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、約３６〜約６０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドの宿主細胞との接触工程が、宿主細胞に発現ベクターを導入する工程を包含し、該発現ベクターは、該ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含み、これにより該宿主細胞は、分泌経路内において、そして細胞外の細胞表面上で該ペプチドを発現し、提示する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリ由来であり、少なくとも大多数のオリゴヌクレオチドが、異なるペプチドをコードする異なる配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数のオリゴヌクレオチドの配列が、無作為化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現ライブラリが、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドについてあらかじめ富化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドの宿主細胞との接触工程が、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に前記発現ライブラリを導入する工程を包含し、該宿主細胞は、それによって、分泌経路内において、そして細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、さらに以下：
前記異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；および、
宿主細胞の該第１の部分から該ＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、少なくとも１つ含む発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１が、選択可能なマーカーを用いて富化されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択可能なマーカーが、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはチオレドキシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記富化工程が、磁気ビーズ選択を包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記富化工程が、蛍光活性化細胞分離による選択を包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する前記宿主細胞が、高コピー数の前記異なるペプチドを発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、提示分子との融合タンパク質として提示される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記提示分子が、ＣＤ２４である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記提示分子が、ＩＬ−３レセプターである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記提示分子が、チオレドキシンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質がさらに、マーカーエピトープを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記マーカーエピトープが、ポリヒスチジン、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはｍｙｃである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質がさらに、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のためのシグナルを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記動物宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記動物宿主細胞が、組換え宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記動物宿主細胞が、単離された細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤が、実質的に生理学的な条件下で宿主細胞に接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記実質的に生理学的な条件が、複合生物学的液体の存在を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記複合生物学的液体が、血液、血清、血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を評価する工程が、ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種に特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーに宿主細胞を接触させる工程、および、結合した標識されたマーカーを検出する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのマーカーが、ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの所定のエピトープに結合する抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を評価する工程が、さらに、ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異的な少なくとも２つの標識された抗体の検出シグナルの比を測定する工程を包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記薬剤が、ＡＰＰのアロステリックエフェクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記宿主細胞の表面上の改変されたＡＰＰプロセシングを検出する工程が、フローソーターの使用を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の方法であって、動物に前記薬剤を投与する工程、および改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的条件に対する作用について、該動物をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与が、直接注射または経口投与によるものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記薬剤がペプチドであり、前記動物がペプチドをコードする発現構築物を含むトランスジェニックマウスであり、ここで、該発現構築物が、作動可能な組み合わせにおいて、（ａ）プロモーター、（ｂ）分泌配列、（ｃ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｄ）転写終結配列を含み；そして、該トランスジェニックマウスがインビボで検出可能なレベルのペプチドを発現する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記発現構築物が、細胞膜に固定される提示分子をコードし、該発現構築物がさらに、以下：
（ｅ）提示タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、該提示タンパク質コード配列は、ペプチドコード配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列、および、
（ｆ）膜貫通ドメインまたはＧＰＩリンカーをコードするヌクレオチド配列であって、該膜貫通ドメインまたはＧＰＩリンカー配列は、該提示タンパク質コード配列に対して３’に位置し、そして、転写終結配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列、
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的条件に対する作用が、ＡβプロトフィブリルまたはＡβ４０／４２のレベルの低下である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記改変されたＡＰＰプロセシングに関連する生理学的条件に対する作用が、プラーク阻害である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に導入する工程であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも大部分は、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、該宿主細胞が、それによって分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、工程；
該異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；および、
宿主細胞の第１の部分からＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記動物宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記動物宿主細胞が、組換え宿主細胞である、請求項５３に載の方法。
【請求項５６】
前記動物宿主細胞が、単離された細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
複数の宿主細胞の第１が、実質的に生理学的な条件下で異なるペプチドを提示する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
（１）複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリをあらかじめ富化する工程であって、少なくとも多数のオリゴヌクレオチドが、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、ＡＰＰに特異的に結合するペプチドをコードする少なくとも一つのオリゴヌクレオチドについて、富化する工程であって、該あらかじめ富化する工程は、以下の工程：
（ａ）ファージの表面上のオリゴヌクレオチド配列によりコードされるペプチドを発現し得るファージディスプレイベクター内に発現ライブラリを導入する工程；
（ｂ）該ファージの表面上に異なるペプチドを発現する工程；
（ｃ）ＡＰＰまたはＮ末端短縮ＡＰＰに特異的に結合するペプチドを発現するファージ粒子の部分を選択する工程であって、ここで該Ｎ末端短縮ＡＰＰは、α−またはβ−セクレターゼ切断部位を有する、工程；および、
（ｄ）該選択されたファージ粒子からオリゴヌクレオチド配列を回収してあらかじめ富化した発現ライブラリを形成する工程；
を包含する、工程；
（２）ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１にあらかじめ富化された発現ライブラリを導入する工程であって、該宿主細胞に分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で少なくとも１つのＡＰＰ結合ペプチドを発現し、提示させる工程；
（３）少なくとも１つのＡＰＰ結合ペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；ならびに、
（４）宿主細胞の該第１の部分から、ＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むあらかじめ富化された発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項５９】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に、導入する工程であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも大部分は、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、該宿主細胞が、それによって分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、工程；
該異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；ここで改変されたＡＰＰプロセシングは、異なるペプチドを提示する該宿主細胞の表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を、ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種に特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーと、該宿主細胞を接触させる工程、および該結合した標識されたマーカーを検出する工程によって、評価する工程によって測定される工程；ならびに、
宿主細胞の該第１のサブセットからＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む該発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６０】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを改変するペプチドを同定するための方法であって、以下：
複数のオリゴヌクレオチドを含む発現ライブラリを、ＡＰＰおよび少なくとも１つのＡＰＰプロセシング酵素を発現する複数の動物宿主細胞の第１に、導入する工程であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも大部分は、異なるペプチドをコードする異なる配列を有し、それによって、該宿主細胞が、実質的に生理学的条件下で、分泌経路内において、および細胞外の細胞表面上で異なるペプチドを発現し、提示する、工程；
該異なるペプチドを提示する複数の宿主細胞の第１から、改変されたＡＰＰプロセシングを示す宿主細胞の第１の部分を選択する工程；ここで改変されたＡＰＰプロセシングは、異なるペプチドを提示する該宿主細胞の表面上のＡＰＰフラグメントの少なくとも一種の相対的な存在または非存在を、ＡＰＰフラグメントの少なくとも一種に特異的に結合する少なくとも１つの検出可能に標識されたマーカーと、該宿主細胞を接触させる工程、および該結合した標識されたマーカーを検出する工程によって、評価する工程によって測定される工程；および、
宿主細胞の該第１のサブセットからＡＰＰのプロセシングを改変するペプチドをコードする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む該発現ライブラリの第１の部分ライブラリを同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６１】
前記薬剤がペプチドメティック、等配電子置換化合物、Ｄ−アミノ酸アナログ、または、非ペプチジル化合物に変換される、請求項１４に記載の方法により同定される、薬剤。
【請求項６２】
前記薬剤が、血管脳関門の通過を促進するように改変される、請求項１に記載の方法により同定される、薬剤。
【請求項６３】
前記薬剤が、非経口、経口、除放性、局所、鼻内または吸入の用途のために処方される、請求項１に記載の方法により同定される、薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００６−５０５２７２（Ｐ２００６−５０５２７２Ａ）
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５０５１９（Ｐ２００４−５５０５１９）
【出願日】平成１５年１１月４日（２００３．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５２９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４１２１３
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（５０５１６４０８１）バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー (2)
【出願人】（５０５１６３６６０）アイコジェネックス コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月４日（２００３．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５２９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４１２１３
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（５０５１６４０８１）バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー (2)
【出願人】（５０５１６３６６０）アイコジェネックス コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
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