アミノ酸源として酵母または大豆抽出物を含み、動物起源のタンパク質複合体を含まない培養培地
【課題】動物起源でないタンパク質性物質の病原性細菌の培養のための培地成分としての使用を提供すること。
【解決手段】病原性細菌の免疫原性因子を調製するためのプロセスであって、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉから選択される病原性細菌を、少なくとも２０乾燥重量％の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来タンパク質性物質を含まない培地中で培養する工程、および必要に応じて、該培地から該免疫原性因子を精製する工程を包含し、ここで、該動物由来でないタンパク質性物質は、酵母抽出物および／または大豆由来タンパク質組成物である、プロセス。
【解決手段】病原性細菌の免疫原性因子を調製するためのプロセスであって、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉから選択される病原性細菌を、少なくとも２０乾燥重量％の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来タンパク質性物質を含まない培地中で培養する工程、および必要に応じて、該培地から該免疫原性因子を精製する工程を包含し、ここで、該動物由来でないタンパク質性物質は、酵母抽出物および／または大豆由来タンパク質組成物である、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性細菌を培養するための培地に関する。本発明はまた、この培地を使用して、病原性細菌を培養し、培養された細菌から免疫原性因子を得、そして免疫原性因子を用いてワクチンを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌ワクチンは、培地で病原性細菌を培養し、免疫原性因子を単離し、そして単離した免疫原性因子に基づいてワクチンを調製することによって産生される。このような方法は、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９８４，Ｒｅｎｅ Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ編、およびＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，第１３巻，１９９０，Ａ．Ｍｉｚｒａｈｉ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ編に記載されている。従来の方法では、病原性細菌は、動物起源のタンパク質性物質を含む培地で培養される。これらの化合物は病原性細菌の増殖に必須ないくらかの増殖因子が、血液、脳心臓注入物（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、肉などのような動物起源の化合物にのみ存在していたという信念で使用されている。例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎｉは、心臓注入物およびカゼインの酵素消化物を含む培地で増殖され；Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは牛肉注入物を必要とし；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉはペプタミンおよびトリプトンを含む培地で増殖され；そしてＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅはプロテオースペプトンを含む培地で増殖される。世界保健機構報告第８００巻（１９９０）および同第８１４巻（１９９１）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉおよびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを増殖するために、動物起源の化合物を含む培地が必要であることを示している。
【０００３】
培地における動物起源のタンパク質性物質の必要性は、培地の汚染の可能性の心配を生じている。特に、培地がウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の原因となる物質または他の感染性物質および有害物質により汚染され得るという懸念は、特に治療用途において、このような培養物由来のいずれの因子の有用性をも制限している。
【０００４】
動物起源でないタンパク質性物質が病原性細菌の増殖を維持し得、そして細菌による免疫原性因子の産生を可能にすることが、驚くべきことに見出された。
【０００５】
特許出願ＤＤ ２９４ ５０２−Ａでは、繊毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）の微生物培養における大豆加水分解物を調製するプロセスおよび大豆加水分解物の使用が開示されている。大豆加水分解物は、ストレプトマイシン株で大豆粉末含有培地を培養することにより調製される。大豆加水分解物は、存在する多糖類の高い割合により炭素源として使用され、そして乾燥重量のタンパク質で２０％未満を含有する。
【０００６】
動物起源でないタンパク質性物質（例えば、大豆、綿実、ジャガイモなどに由来のタンパク質）の、病原性細菌の培養のための培地成分としての使用は、任意の後続の治療的または予防的用途においてヒトに移される動物由来の汚染（例えば、ＢＳＥ）の危険性を完全に取り除く。
【０００７】
植物由来のタンパク質性物質の使用に関連するさらなる利点は、この物質を生成する経費の削減およびこの物質の増加された一貫性である（動物由来でないタンパク質性物質は、動物由来の物質よりもその組成においてより均一である）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地を提供し、ここでこの培地は、乾燥重量で少なくとも２０％の動物由来でないタンパク質性物質を含有し、そして動物由来のタンパク質性物質を含有しない。
【０００９】
細菌を培養するための任意の標準培地が、動物由来のタンパク質性物質を含まないという条件で、本発明の培地の基礎として使用され得る。
【００１０】
好ましくは、本発明の培地は、炭素およびエネルギー源、窒素源、必須塩類、ならびに必要に応じて培養されるべき微生物を選択するための選択剤（例えば、抗生物質）を含有する。
【００１１】
本発明の培地は、固体または液体培地であり得る。本発明の培地の基礎を形成し得る標準液体培地の例には、Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス（トリプトンおよびペプタミンなし）、Ｗａｔｓｏｎ培地（カザミノ酸なし）、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｍｉｌｌｅｒ培地（心臓注入物およびカゼイン加水分解物なし）、ＣＬ培地（カザミノ酸なし）、およびＦｒａｎｚ Ａ培地が挙げられる。標準固体培地は、寒天のような凝固剤の添加により、任意の液体培地から調製され得る。
【００１２】
本明細書中で使用される用語「培養する」は、細菌の維持、好ましくは増殖を意味する。細菌増殖は、本明細書中では、細菌生物量の増加として定義される。
【００１３】
本明細書中で使用される用語「病原性細菌」は、疾患の病原性に関与する任意の細菌を意味する。好ましい病原性細菌には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが挙げられる。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「免疫原性因子」は、ヒトまたは動物の免疫系を刺激し得る任意の因子を意味する。このような免疫原性因子には、抗原性タンパク質、特に毒性因子およびそのフラグメントが挙げられる。毒性因子は、細菌の毒性に関連するものとして定義され、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉにより産生される液胞（ｖａｃｕｌａｔｉｎｇ）細胞毒素ＶａｃＡのような因子を含む。他の毒性因子は、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｍｅｅｔｉｎｇ （Ｇｅｎｏｖａ，１９９３年６月１８日〜１９日） Ｊ．Ｊ．Ｍｉｓｉｅｗｉｃｚ編 （ＣＳ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ），Ｓ７６〜Ｓ７８頁（本明細書中で参考として援用される）により記載されている。免疫原性因子は、毒素化（ｔｏｘｏｉｄｉｎｇ）プロセスにより遺伝的に解毒されるかまたは処理され得る。免疫原性因子を遺伝的に解毒および毒素化の方法は、当業者に周知であり、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．、Ｖａｃｃｉｎｅ，１２，５７９−５８１，（１９９４）（本明細書中で参考として援用される）により記載される方法を含む。
【００１５】
本明細書中で使用される用語「タンパク質性物質」は、タンパク質、および遊離のアミノ酸を含むタンパク質分解産物を意味する。好ましくはタンパク質性物質は、タンパク質加水分解物である。
【００１６】
本明細書中で使用される動物由来でないタンパク質性物質は、非哺乳動物源（例えば、植物、鳥、魚、酵母、真菌、藻類、および微生物）由来のタンパク質性物質を意味する。より好ましくは、動物由来でないタンパク質性物質は、植物、酵母、藻類および微生物由来のタンパク質性物質を意味する。最も好ましくは、動物由来でないタンパク質性物質は、大豆、綿実、ジャガイモ等由来のタンパク質組成物のような、植物由来のタンパク質性物質を意味する。
【００１７】
好ましい動物由来でないタンパク質性物質には、ＨＹ ＹＥＳＴ （Ｑｕｅｓｔ）のような酵母抽出物、ならびにＨｙｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ）、Ａｍｉｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ）、Ｎ−Ｚ ｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ）およびＳｏｙｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）のような大豆由来のタンパク質組成物が挙げられる。
【００１８】
酵母抽出物は、当業者に周知の標準的手順により調製され得る。さらに、酵母抽出物は、ＳｉｇｍａおよびＱｕｅｓｔを含む多数の供給源から市販されている。
【００１９】
大豆由来のタンパク質組成物は、パパインのような標準的酵素を用いて、大豆粉または大豆単離物の酵素的消化によって調製され得る。例えば、Ｎ−Ｚ ｓｏｙは、大豆単離物の酵素的消化により生成される可溶性タンパク質組成物であり、そしてＨｙｓｏｙは、大豆粉のパパイン消化物である。大豆由来のタンパク質組成物はまた、大豆単離物の酸加水分解により得られ得る。例えば、Ａｍｉｓｏｙは、大豆単離物の酸加水分解により生成されるアミノ酸およびペプチド供給源である。
【００２０】
他の動物由来でないタンパク質性物質は、非哺乳動物源の物質を含むタンパク質の酵素的消化または酸加水分解のいずれかにより得られ得る。
【００２１】
本発明の培地における動物由来でないタンパク質性物質は、２つ以上の異なる動物由来でないタンパク質性物質（例えば、Ｈｙｓｏｙ、Ａｍｉｓｏｙ、Ｎ−Ｚ ｓｏｙおよびＳｏｙｔｏｎｅのような大豆由来のタンパク質性組成物の混合物）を含み得る。
【００２２】
動物由来のタンパク質性物質には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテオースペプトン、カザミノ酸、トリプトン、ペプタミン、およびカゼイン加水分解物などのタンパク質組成物が挙げられる。
【００２３】
好ましくは、本発明の培地は、乾燥重量で少なくとも２０％の動物由来でないタンパク質性物質、より好ましくは乾燥重量で少なくとも３０％の動物由来でないタンパク質性物質、最も好ましくは乾燥重量で少なくとも５０％の動物由来でないタンパク質性物質を含む。
【００２４】
本発明の培地を使用した病原性細菌の培養が、動物由来のタンパク質性物質を含む培地における病原性細菌の培養と比較して、細菌増殖の増加および免疫原性因子の収量の増加をもたらすことが、驚くべきことに見出された。
【００２５】
本発明はさらに、免疫原性因子を産生するための病原性細菌の培養のための培地の作製プロセスを提供し、このプロセスは、細菌培養のための標準培地に十分な量の動物由来でないタンパク質性物質を添加する工程を包含し、これは動物由来のタンパク質性物質を含まず、故に、病原性細菌の培養のためのこの培地は、乾燥重量で少なくとも２０％の動物由来でないタンパク質性物質を含みかつ動物由来のタンパク質性物質を含まない。
【００２６】
標準的液体培地の例には、Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス（トリプトンおよびペプタミンなし）、Ｗａｔｓｏｎ培地（カザミノ酸なし）、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｍｉｌｌｅｒ培地（心臓注入物およびカゼイン加水分解物なし）、ＣＬ培地（カザミノ酸なし）、およびＦｒａｎｚ Ａ培地が挙げられる。標準的固体培地は、寒天などの凝固剤の添加により、任意の液体培地から調製され得る。
【００２７】
本発明はさらに、任意の前記したおよび病原性細菌の培地を包含する培養を提供する。好ましい病原性細菌には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが挙げられる。最も好ましくは、病原性細菌はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉである。
【００２８】
本発明はまた、病原性細菌の免疫原性因子を調製するプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の培地において細菌を培養する工程、および必要に応じて培地から免疫原性因子を精製する工程を包含する。
【００２９】
好ましくは、病原性細菌は、本発明の培地において、少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも３６時間、最も好ましくは少なくとも７２時間、免疫原性因子の産生に適した条件下で、培養される。
【００３０】
免疫原性因子の産生に適した培養条件（培養期間を含む）は、培養する細菌に依存して変化する。しかし、当業者は、免疫原性因子の産生に必要な培養条件を、標準的プロトコール（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．のシリーズ（本明細書中で参考として援用される）に記載のプロトコール）に従うことによって、そして必要ならば、適切な培養条件を決定するための多くの標準的実験を行うことによって、容易に決定し得る。
【００３１】
免疫原性因子は、多数の標準的技術（Ｍａｎｅｔｔｉ，Ｒ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３，４４７６−４４８０，（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている技術を含む）を用いて、細菌培養物より単離され得る。
【００３２】
本発明はまた、病原性細菌の免疫原性因子を調製する工程を包含するワクチン生成のプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の培地において細菌を培養する工程、必要に応じて培地から免疫原性因子を精製する工程、および（必要に応じて毒素化された）上記因子を薬学的に受容可能なキャリアと会合させる工程を包含する。ワクチンを産生するのに適した方法は、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．，Ｎｅｗ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ａｎｄ Ｔｅｔａｎｕｓ．（１９９０），２５１−２６８，Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｍ．Ｍ Ｌｅｖｉｎｅ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００３３】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、それらを使用するとき、アジュバントの添加を必要とする。適切なアジュバントは、Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１３，１２６３−１２７６，（１９９５）に記載されている。
【００３４】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、細菌感染に対して個体をワクチン接種するために使用され得る。ワクチン接種され得る好ましい細菌感染には、Ｂ型胃炎、細菌性髄膜炎、ジフテリア、破傷風、および百日咳が挙げられる。
【００３５】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、上記したように薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバントと混合した本発明のワクチンを含有する薬学的組成物として提供され得る。
【００３６】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、経口または非経口経路（静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、直腸および局所的投与を含む）により、投与され得る。
【００３７】
経口投与の場合、本発明の化合物は一般的に、錠剤もしくはカプセル剤の形状で、または水性溶液もしくは懸濁液として、提供される。
【００３８】
経口使用のための錠剤は、薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、矯味剤、着色剤、および保存剤）と混合された有効成分（ワクチン成分）を含み得る。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびに乳酸が挙げられるが、コーンスターチおよびアルギン酸が適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよび他の周知の試薬を含み得るが、もし存在する場合、滑沢剤は一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。所望であるならば、錠剤は、消化管における吸収を遅延するために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の物質でコーティングされ得る。
【００３９】
経口使用のためのカプセルとしては、有効成分が固体希釈剤と混合される硬質カプセル、および有効成分が水または油（例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油）と混合される軟質カプセルが挙げられる。
【００４０】
筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内の使用について、本発明の化合物は、一般に、適切なｐＨおよび等張性に緩衝化された、滅菌で水性の溶液または懸濁液中に提供される。適切な水性ビヒクルとしては、リンゲル液および等張性の塩化ナトリウムが挙げられる。本発明に従う水性懸濁液としては、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、およびトラガカントゴムのような懸濁剤、ならびにレシチンのような湿潤剤が挙げられる。水性懸濁液に適切な保存剤としては、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。
【００４１】
本発明のプロセスによって調製されるワクチンはまた、リポソーム処方物として提供され得る。
・本発明はまた、以下を提供し得る：
・（項目１） 免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地であって、上記培地は、少なくとも２０乾燥重量％の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来のタンパク質性物質を含まない、培地。
・（項目２） 項目１に記載の培地であって、上記動物由来でないタンパク質性物質は、酵母抽出物および／またはダイズ由来タンパク質組成物である、培地。
・（項目３） 項目１または項目２に記載の培地であって、上記病原性細菌は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉである、培地。
・（項目４） 項目１〜３のうちのいずれか１項に記載の培地と、病原性細菌とを含む、培養物。
・（項目５） 病原性細菌の免疫原性因子を調製するためのプロセスであって、
上記細菌を、項目１〜３のうちのいずれか１項に記載の培地中で培養する工程、および
必要に応じて、
上記培地から上記免疫原性因子を精製する工程を包含する、プロセス。
・（項目６） ワクチン生成のためのプロセスであって、
項目５に記載のプロセスによって病原性細菌の免疫原性因子を調製する工程、および
上記因子を薬学的に受容可能なキャリアと結合させる工程
を包含し、ここで、上記因子は必要に応じてトキソイド化される、プロセス。
・（項目７） 免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地の作製プロセスであって、
病原性細菌を培養するための上記培地が、少なくとも２０乾燥重量％の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来のタンパク質性物質を含まないように、充分な動物由来でないタンパク質性物質を、細菌を培養するための動物由来タンパク質性物質を含まない標準培地に添加する工程
を包含する、プロセス。
【００４２】
本発明は、ここに、以下の実施例および図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、トリプトンおよびペプタミン（ｐｅｐｔａｍｉｎ）を含有するＢＢにおけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４の増殖の動力学を示す。
【図２】図２は、Ｓｏｙｔｏｎｅを含有する単純化ＢＢにおけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４の増殖の動力学を示す。
【図３】図３は、Ｈｙｓｏｙを含有する単純化ＢＢにおけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４の増殖の動力学を示す。
【図４】図４は、ＶａｃＡイムノブロットを示し、ここで、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、ＶａｃＡ標準７５０ｎｇであり、レーン３は、ＶａｃＡ標準５００ｎｇであり、レーン４は、ＶａｃＡ標準４００ｎｇであり、レーン５は、ＶａｃＡ標準１５０ｎｇであり、レーン６は、ＶａｃＡ標準２０ｎｇであり、レーン７は、発酵の終りで生成されるＶａｃＡであり、レーン８は、培養の４８時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン９は、培養の３０時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン１０は、培養の２３時間後に生成されるＶａｃＡである。
【図５】図５は、ＶａｃＡイムノブロットを示し、ここで、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、ＶａｃＡ標準７５０ｎｇであり、レーン３は、ＶａｃＡ標準５００ｎｇであり、レーン４は、ＶａｃＡ標準４００ｎｇであり、レーン５は、ＶａｃＡ標準１５０ｎｇであり、レーン６は、ＶａｃＡ標準２０ｎｇであり、レーン７は、発酵の終りで生成されるＶａｃＡであり、レーン８は、培養の３１．５時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン９は、培養の３０時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン１０は、培養の２４時間後に生成されるＶａｃＡである。
【図６】図６は、ＶａｃＡのイムノブロットを示し、ここで、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、ＶａｃＡ標準７５０ｎｇであり、レーン３は、ＶａｃＡ標準５００ｎｇであり、レーン４は、ＶａｃＡ標準４００ｎｇであり、レーン５は、ＶａｃＡ標準２０ｎｇであり、レーン６は、発酵の終りで生成されるＶａｃＡであり、レーン７は、培養の４８時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン８は、培養の３１時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン９は、培養の２４．５時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン１０は、ＶａｃＡ標準１５０ｎｇである。
【図７】図７は、Ｓｏｙｔｏｎｅまたはプロテオースペプトンを含有する単純化Ｆｒａｎｚ培地中でのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂの増殖の動力学を示す。
【図８】図８は、カザミノ酸またはＡｍｉｓｏｙを含有するＷａｔｓｏｎ培地中でのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの増殖の動力学を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
実施例
全ての引用文献は、本明細書中に参考として援用される。
実施例Ｉ
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉは、約１０年前に単離された湾曲したグラム陰性の微好気性細菌であり、ヒトにおいてＢ型胃炎と関連する。この細菌は、ヒト胃粘膜にコロニーを形成し、そして胃潰瘍および十二指腸潰瘍を生じ得（Ｂｌａｓｅｒ、Ｍ．Ｊ．、（１９９０）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６１、６２９−６３３）、および胃ガン腫の発症についての危険因子であり得る（Ｐａｒｓｏｎｎｅｔ、Ｊ．ら（１９９１）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２５、１１２７−１１３１）慢性の感染を確立する。
【００４５】
長期的には、感染および疾患はワクチン接種によって予防および処置され得る。現在、細菌接着、コロニー形成、および発病力に関与するいくつかの因子が同定されている。疾患に関与する最も興味深い因子のうちの１つは、液胞形成細胞毒（ＶａｃＡ）であり、これはいくつかの哺乳動物細胞株において大量の液胞形成を引き起こす（Ｌｅｕｎｋ、Ｒ．Ｄ．、（１９９１）、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１３（増刊８）、Ｓ６８３−６８９）。液胞はまた、慢性胃炎を伴う患者の胃上皮において観察されている（Ｔｒｉｃｏｔｔｅｔ、Ｖ．ら（１９８６）、Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ．Ｐａｔｈｏｌ．、１０、１１３−１１７）。このタンパク質は、マウスにおいて潰瘍形成を引き起こすことが示されており（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９４）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９、１６５３−１６５８）、そしてワクチンの候補である。精製された細胞毒は、細菌培養上清から非常に小量で精製され得る８７〜９４ｋＤのタンパク質である。
【００４６】
材料および方法
細菌株
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４（株型、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｔｅｂｏｒｇ）を使用した。
【００４７】
培地および補充物
２ｇ／ｌの（２，６−ジ−０−メチル）−ｂ−シクロデキストリン（ＣＤ）（Ｔｅｉｊｉｎ Ｌｉｍ．Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）および２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを補充した、Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｂｒｏｔｈ（トリプトン１０ｇ／ｌ、ペプタミン１０ｇ／ｌ、デキストロース１ｇ／ｌ、酵母抽出物２ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、および亜硫酸水素ナトリウム０．１ｇ／ｌ）（ＢＢ）（Ｄｉｆｃｏ）を、比較目的のための液体培地
として使用した。ＢＢに存在するトリプトンおよびペプタミンの代わりに、ＨｙｓｏｙまたはＳｏｙｔｏｎｅを、１０ｇ／Ｌの濃度で使用した。
【００４８】
保存
接種物の凍結アリコートを、グリセロール４０％、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）２０％、および０．４％ ＣＤから構成される溶液で１：２希釈した、２×１０８ＣＦＵ／ｍｌのフラスコ培養物から調製した。得られた懸濁液を、３ｍｌバイアル中に分注し、そして−８０℃で保存し、そしてＳｏｙｔｏｎｅ ２０％でＦＣＳを置換して調製した新規の凍結バイアルとの比較のために、開始凍結バイアルとして使用した。
【００４９】
液体培地中での増殖
最初の培養を、１００ｍｌの液体培地を含有する５００ｍｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で行った。培養物に、３ｍｌの凍結ストックを接種し、そして微好気性環境において、３６℃で３６時間、振とうしながら（１００ｒｐｍ、２．５ｃｍの偏心距離）インキュベートした。フラスコを、嫌気性のジャーの内側におき、ここではＢＢＬ Ｃａｍｐｙ Ｐａｋエンベロープ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、正確な条件を発生させた。次いで、これらの培養物を使用して、２５０ｍｌの培地を含有する１０００ｍｌのフラスコに接種し、そして上記と同じ条件下でインキュベートし、そしてこれを使用して、バイオリアクターに接種した。
【００５０】
培養容器および増殖条件
バッチ発酵を、５ｌの培地を含有する７リットルのバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ＡＧ、８６２０ Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、ＣＨ）中で行った。全ての培養物を、３６℃で増殖した。ｐＨ値は制御しなかった。溶存酸素圧力（ＤＯＴ）を、２工程手順によって、予め設定したレベル（３％）にて自動的に維持した。先ず、空気流量速度を、０．１から０．５ｌ／ｌ／分まで増加して、培養物の増加するＯ２要求性を満たした。さらなる増加が必要である場合、純粋なＯ２を最大０．４ｌ／ｌ／分まで供給することによって得た。最初の１２時間の増殖の間、Ｎ２およびＣＯ２の一定の流量を、それぞれ、０．２ｌ／ｌ／分および０．０２ｌ／ｌ／分に等しく維持した。攪拌速度を、１３０ｒｐｍに維持した。攪拌器シャフトは、直径７ｃｍの２つのＲｈｕｓｔｏｎタービンを備え、そしてバイオリアクターの直径は、１７ｃｍであった。
【００５１】
グルコース供給
５０％グルコース溶液を、時間０で添加して、５ｇ／Ｌの最終濃度を与えた。５ｇ／Ｌの別の添加を、ＯＤが２〜３の範囲にある場合に行った。
【００５２】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５分光光度計）、光路１ｃｍに対して、５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度のチェックを、グラム染色によって行った。
【００５３】
ＶａｃＡタンパク質の分析
発酵の間の決められた時点で、培養サンプルを、１０分間当たり８，３００×ｇで、遠心分離した（Ｂｉｏｆｕｇｅ Ａ、Ｈｅａｒｅｕｓ）。上清を、トリクロロ酢酸で沈殿し、そしてＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ装置を使用して９％ ＳＤＳ−Ｐａｇｅに供した。タンパク質を、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、次いでＶａｃＡタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗血清（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９、１６５３−１６５８）とともに、一晩、インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ）との２時間のインキュベーション後、免疫反応性のバンドを、４−クロロ−ナフトール染色によって可視化した。
【００５４】
結果
Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｂｒｏｔｈは、トリプトン１０ｇ／ｌ、ペプタミン１０ｇ／ｌ、デキストロース１ｇ／ｌ、酵母抽出物２ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、および亜硫酸水素ナトリウム０．１ｇ／ｌから構成される複合培地である。この培地は、血液誘導体が補充された場合にのみ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉの増殖を支持し得るとして多くの文献において記載されている（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．およびＢｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、１０５７０−１０５７５；Ｓｈａｈａｍａｔ，Ｍ．ら（１９９１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９、２８３５−２８３７；Ｂｕｃｋ、Ｇ．Ｅ．およびＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｓ．（１９８７）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２５、５９７−５９９；ならびにＭｏｒｇａｎ、Ｄ．Ｒ．ら（１９８７）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２５、２１２３−２１２５）。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ増殖培地の実質的な単純化は、シクロデキストリンが、血液誘導体の代わりに使用され得ることが発見された近年、得られた（Ｏｌｉｖｉｅｒｉ，Ｒ．ら、（１９９３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１、１６０−１６２）。この単純化培地およびグルコース供給を使用する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの増殖は、図１において報告される。グルコース供給は、炭素およびエネルギー供給源が、常に培地に存在することを確実にするために使用された。
【００５５】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを、これらの条件下で培養した場合、培地中のＶａｃＡの生成を、上記のように測定した。結果を、図５および図６において示す。
【００５６】
増殖培地におけるＳｏｙｔｏｎｅおよびＨｙｓｏｙの使用は、それぞれ、図２および３において報告される結果を与えた。ＶａｃＡ産生は、Ｓｏｙｔｏｎｅが使用された場合、図５において報告され、そしてＨｙｓｏｙを使用した場合、図６において報告される。
【００５７】
結果は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ増殖の増殖培地および発酵条件に対する改善、ならびに液胞形成細胞毒（ＶａｃＡ）の生成における改善を示す。
【００５８】
実施例ＩＩ
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、子供における細菌性髄膜炎の主要な原因である、小さな非運動性のグラム陰性菌である。これらの微生物は主に、毒素産生性ではなく、侵襲性である。これらは、呼吸管の居住者であり（共生性および病原性）、そしてこれらは、抗食作用性の多糖カプセルを有する。
【００５９】
材料および方法
細菌株
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ ＡＴＣＣ １０２１１。
【００６０】
培地および補充物
培地の調製は、以下のように異なる溶液の使用を含む：
「Ｆｒａｎｚ Ａ培地」調製
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １．６ｇ＋／−０．０１ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４１２Ｈ２Ｏ ５．０３ｇ＋／−０．０５ｇ
ＫＣｌ ０．８９２＋／−０．００８ｇ
ＮａＣｌ ６．００５ｇ＋／−０．０６ｇ
ＮＨ４Ｃｌ １．２５ｇ＋／−０．０１ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝８．２に必要なだけ
上述の成分を、混合しながら溶解する。３Ｎ ＮａＯＨを、溶液のｐＨをｐＨ＝８．２にするために使用する。
【００６１】
限外濾過されたＳｏｙｔｏｎｅ調製
成分 １リットル当たりの量
Ｓｏｙｔｏｎｅ ３３．３ｇ＋／−０．０３ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、３０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過した。
【００６２】
限外濾過されたプロテオースペプトン
成分 １リットル当たりの量
プロテオースペプトン ３３．３＋／−０．０３ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、３０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過した。
【００６３】
限外濾過されたＹＥ調製
成分 １リットル当たりの量
酵母抽出物 １００ｇ＋／−０．０２ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
使用した酵母抽出物は、Ｑｕｅｓｔから入手可能なＨＹ ＥＡＳＴであった。この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過した。
【００６４】
５０％グルコース溶液
成分 １リットル当たりの量
グルコース（無水 ５００ｇ＋／−５ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量。
【００６５】
ＮＡＤ ０．１％溶液
成分 １リットル当たりの量
ＮＡＤ １．０ｇ＋／−０．００５ｇ
ＴＲＩＳ １．２１ｇ＋／−０．０１ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
ＨＣｌ ３７％ ｐＨ７．４±０．２に必要なだけ。
【００６６】
ヘミン０．４％溶液
成分 １リットル当たりの量
ヘミン ４ｇ＋／−０．０２ｇ
０．２Ｎ ＮａＯＨ １．０リットルに十分な量
使用するヘミンは、好ましくは、化学的に合成される。化学的に合成されたヘミンは、Ｆｌｕｋａから市販されている。
【００６７】
５５０ｍｌのＦｒａｎｚ Ａを、４５０ｍｌの限外濾過したＳｏｙｔｏｎｅまたはプロテオースペプトンと混合して、１リットルのＨｉｂ基本培地を得、これを、１２１℃で３０分間、オートクレーブすることによって、滅菌した。
【００６８】
冷却後、濾過によって滅菌した、１０ｍｌ／Ｌグルコース溶液、２０ｍｌ／ＬのＹＥ、２ｍｌ／ＬのＮＡＤ溶液を、添加し（上記の付加を伴って）、そしてこの培地を「Ｈｉｂ完全培地」と呼んだ。
【００６９】
液体培地中での増殖
暖める前の、非整流（ｕｎｂａｆｆｅｌｅｄ）振とうフラスコ（５００／１５０）に、１．０ｍＬのそれぞれの有効な（ｗｏｒｋｉｎｇ）ストックバイアルを接種した。振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、１５０ＲＰＭにて６時間、（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置いた。
【００７０】
６時間後、振とうフラスコの適切な量を、０．５Ｌの暖める前の「Ｈｉｂ完全培地」を含有する１つの２リットルの非整流振とうフラスコに移した。振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、２００ｒｐｍにて、９時間、（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置き、次いで、内容物を滅菌接種に移し、次いで、接種物を発酵器に移した。
【００７１】
培養容器および増殖条件
バッチ発酵を、２０ｌの培地を含有する３０リットルバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ＡＧ、８６２０ Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、ＣＨ）において行った。
【００７２】
培養物は、３５℃および２ｐｓｉの背圧で増殖した。ｐＨを、３Ｎ ＮａＯＨで７．３に制御した。最初の攪拌速度を、最小の１５０ｒｐｍに設定し、そして最低通気を１０Ｌ／分に設定した。ＤＯＴを、１５０〜４００の範囲にｒｐｍを制御し、次いで、必要であれば、酸素を補充することによって３５％に維持した。。泡止め剤を、泡立ちを制御するために手動で添加した。グルコースの残余の濃度を検出し、そしてこれが約２ｇ／Ｌであった場合、０．２リットルのグルコース溶液を添加した。
【００７３】
バイオマス測定。
【００７４】
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５ 分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【００７５】
Ｈｉｂ ＰＳの分析。
【００７６】
この分析を、Ｗｅｅｋｅ，Ｂ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２、３７−４６、（１９７３）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されるように、Ｒｏｃｋｅｔ免疫電気泳動によって行った。
【００７７】
結果
Ｓｏｙｔｏｎｅを用いて得られた増殖曲線、およびプロテオースペプトンを用いて得られた増殖曲線を、図７において比較する。Ｈｉｂ ＰＳの収量は、Ｓｏｙｔｏｎｅおよびプロテオースペプトンを含有する培地において、それぞれ、６００ｍｇ／Ｌおよび１５０ｍｇ／Ｌであった。増殖曲線は、２つの培地を使用してかなり類似するが、Ｓｏｙｔｏｎｅを使用するＨｉｂ ＰＳの収量は４倍増加する。植物由来のタンパク質性物質を含有する培養培地の使用は、動物由来のタンパク質性物質を含有する培養培地の使用に比較して、Ｈｉｂ ＰＳのような多糖の収量増加を導く。
【００７８】
実施例ＩＩＩ
Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは、グラム陽性の、桿体様の微生物であり、柵をまとっている。バクテリオファージによるＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ溶原化は、強力な毒素の合成を引き起こし、この発現は、鉄濃度によって調節される。
【００７９】
材料および方法
細菌株
Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ ＣＮ ２０００。
【００８０】
培地および補充物
培地の調製は、以下のような異なる溶液の使用を含む：
Ａ．限外濾過された酵母抽出物（ＹＥ）およびカザミノ酸（ＣＡＡ）
成分 量ｇ／Ｌ
精製水 ８００ｍｌ
酵母抽出物 ２０ｇ／Ｌ
カザミノ酸 １０ｇ／Ｌ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱鉄酸塩化（ｄｅｆｅｒｒａｔｉｏｎ）容器に添加した。
【００８１】
Ａ．Ａ 限外濾過された酵母抽出物（ＹＥ）およびＳｏｙｔｏｎｅ
成分 量ｇ／Ｌ
精製水 ８００ｍｌ
酵母抽出物 ２０ｇ／Ｌ
Ｓｏｙｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱酸素塩容器に添加した。
【００８２】
Ａ．Ｂ 限外濾過された酵母抽出物
成分 量ｇ／Ｌ
精製水 ８００ｍｌ
酵母抽出物 ３０ｇ／Ｌ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱鉄酸塩化容器に添加した。
【００８３】
Ａ．１ 脱鉄酸塩化
以下の成分を、攪拌容器に導入した
成分 量
ＵＦ（ＹＥ＋ＣＡＡ）溶液 １Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、５０％（ｗ／ｖ） ２ｍＬ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン、１％（ｗ／ｖ） ５ｍＬ／Ｌ（０．０５ｇ／Ｌ）
３Ｎ ＮａＯＨ （ｐＨ７．４に補正するために十分な量）
ＵＦは、溶液が限外濾過されることを示す。
【００８４】
攪拌しながら、溶液を１００℃に加熱する。１００℃で１分間保持し、次いで、３７℃に培地を冷却する。濾過は、一旦３７℃を下回ると開始し得る。濾過後、培地を、「ＣＡＡを含有するＣＹベース培地」として記載する。
【００８５】
Ａ．１．Ａ 脱鉄酸塩化
以下の成分を、攪拌容器に導入する
成分 量
ＵＦ（ＹＥ＋Ｓｏｙｔｏｎｅ）溶液 １Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、５０％（ｗ／ｖ） ２ｍＬ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン、１％（ｗ／ｖ） ５ｍＬ／Ｌ（０．０５ｇ／Ｌ）
３Ｎ ＮａＯＨ （ｐＨ７．４に補正するために十分な量）。
【００８６】
攪拌しながら、溶液を１００℃に加熱する。１００℃で１分間保持し、次いで、３７℃に培地を冷却する。濾過は、一旦３７℃を下回ると開始し得る。濾過後、培地を、「Ｓｏｙｔｏｎｅを含有するＣＹベース培地」として記載する。
【００８７】
Ａ．１．Ｂ 脱鉄酸塩化
以下の成分を、攪拌容器に導入する
成分 量
ＵＦ ＹＥ溶液 １Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、５０％（ｗ／ｖ） ２ｍＬ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン、１％（ｗ／ｖ） ５ｍＬ／Ｌ（０．０５ｇ／Ｌ）
３Ｎ ＮａＯＨ （ｐＨ７．４に補正するために十分な量）。
【００８８】
攪拌しながら、溶液を１００℃に加熱する。１００℃で１分間保持し、次いで、３７℃に培地を冷却する。濾過は、一旦３７℃を下回ると開始し得る。濾過後、培地を、「ＹＥのみを含有するＣＹベース培地」として記載する。
【００８９】
Ｂ．「補充物」溶液
Ｂ１）溶液Ａ
成分 １リットル当たりの量
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ２２５ｇ
β−アラニン １．１５ｇ
ニコチン酸 １．１５ｇ
ピメリン酸 ０．０７５ｇ
ＣｕＳＯ４ ０．５０ｇ
ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．４０ｇ
ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ ０．１５ｇ
ＨＣｌ、３７％ ３０ｍＬ
精製水 １．０リットルに十分な量。
【００９０】
Ｂ２）溶液Ｂ
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
Ｌ−シスチン ２００ｇ
ＨＣｌ、３７％ ２００ｍＬ。
【００９１】
溶液を、個々に１０分間、混合する。溶解後、２０ｍＬの溶液Ａおよび１０ｍＬの溶液Ｂを混合し、そして０．２ミクロンのフィルターを介して濾過する。溶液を、光から覆って、４℃で保存する。
【００９２】
フラスコ滅菌化
一旦脱鉄酸塩化したら、濾過した培地（Ａ．１またはＡ．１．ＡまたはＡ．１．Ｂ）を、フラスコにロードする。フラスコを、２５分間、１２１℃で滅菌する。
【００９３】
滅菌後の調整
１．「５０％マルトース」を添加する ３０ｍｌ／Ｌ
２．「補充物」を添加する ３．０ｍｌ／Ｌ
上述の１＋２を含有する培地：「ＣＡＡまたはＳｏｙｔｏｎｅまたは酵母のみを含有する完全ＣＹ培地」。
【００９４】
液体培地中での増殖
各１００ｍｌの培地を含有する５００ｍｌの非整流振とうフラスコに、１．０ｍＬの有効なストックバイアルを接種する。
【００９５】
振とうフラスコを、（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に、３５＋／−１℃で、１００ｒｐｍにて、５時間、置く。５時間後、攪拌を、２５０ｒｐｍ、４３時間に増加する。
【００９６】
プロセスは、２つの異なる相を有する：１）指数関数的な増殖、および２）産生相。２つの相からの移行は、徐々におこり、そして細胞増殖速度および酸素要求性の減少によって記される。
【００９７】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５ 分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【００９８】
結果
４８時間のインキュベーション後、フラスコ中のＯＤおよびＬｆ／ｍｌは以下のとおりであった：
ＣＡＡを含有する培地 ＯＤ＝７．５ Ｌｆ／ｍｌ＝５０
Ｓｏｙｔｏｎｅを含有する培地 ＯＤ＝７．８７ Ｌｆ／ｍｌ＝６０
ＹＥのみを含有する培地 ＯＤ＝８．０７ Ｌｆ／ｍｌ＝６０。
【００９９】
実施例ＩＶ
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、非運動性のグラム陰性球菌であり、最もしばしば、対で増殖するが、必要に応じて、四分子およびクラスターで増殖する。
これらは、血清群についての基準である抗食作用性の多糖カプセルを有する。
【０１００】
材料および方法
細菌株
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．Ｃ１１。
【０１０１】
培地および補充物
培地の調製は、以下のような異なる溶液の使用を含む：
「Ｆｒａｎｚ培地」調製。
【０１０２】
接種振とうフラスコ培地調製
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １．６ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ １５．５ｇ
ＫＣｌ ０．０９ｇ
ＮＨ４Ｃｌ １．２５ｇ
精製水 １リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝７．６について必要とされるように。
【０１０３】
上述の成分を混合しながら溶解する。１２１℃で、３０分間、オートクレーブすることによって、滅菌する。冷却後、「５０％グルコース」および「Ｍｅｎ Ｃ補充物」を、以下のように添加する。
【０１０４】
「５０％グルコース」 １０ｍＬ／Ｌ＋／−０．３ｍＬ
「Ｍｅｎ Ｃ発酵補充物」 ２０ｍＬ／Ｌ＋／−０．３ｍＬ
グルコースおよび補充物溶液の添加を伴って、培地は「Ｆｒａｎｚ完全培地」と呼ばれ得る。
【０１０５】
２０Ｌ発酵器の調製
Ａ．ＣＡＡを含有する２０ＬのＷａｔｓｏｎベース培地を作製するために、以下の成分が、混合容器に導入され、そして溶解されなければならない。
【０１０６】
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １ｇ＋／−０．０１ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ３．２５ｇ＋／−０．０３ｇ
ＫＣｌ ０．０９ｇ＋／−０．００１ｇ
カザミノ酸 １０ｇ＋／−０．１ｇ
精製水 １リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝７．６に必要なだけ。
【０１０７】
Ａ．Ａ Ａｍｉｓｏｙを含有する２０ＬのＷａｔｓｏｎベース培地を作製するために、以下の成分が、混合容器に導入され、そして溶解されなければならない。
【０１０８】
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １ｇ＋／−０．０１ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ３．２５ｇ＋／−０．０３ｇ
ＫＣｌ ０．０９ｇ＋／−０．００１ｇ
Ａｍｉｓｏｙ １０ｇ＋／−０．１ｇ
精製水 １リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝７．６に必要なだけ。
【０１０９】
Ｂ．発酵器滅菌
２５分間、１２１℃で発酵器を滅菌する。滅菌後、以下の条件を設定する：温度、３５℃；１０Ｌ／分での通気；１５０ｒｐｍでの攪拌、および０．２バールでの背圧。発酵器を３５℃に冷却した後、ｐＨを測定するためのサンプルを採取し、発酵器のｐＨプローブ校正を調整し、次いで、培地のｐＨを７．６に調整する。
【０１１０】
Ｃ．滅菌後の調整
１．「５０％グルコース」を添加する １０ｍｌ／Ｌ
２．「Ｍｅｎ Ｃ補充物」を添加する ２０ｍｌ／Ｌ
上述の１＋２を含有する培地：「Ｗａｔｓｏｎ完全培地」。
【０１１１】
Ａ．「５０％グルコース」溶液
成分 １リットル当たりの量
グルコース（無水物） ５００ｇ＋／−５ｇ
精製水 １リットルに十分な量
この溶液を、１２１℃で３０分間、オートクレーブすることによって滅菌する。
【０１１２】
Ｂ．「Ｍｅｎ Ｃ補充物」溶液
Ｂ．１限外濾過されたＹＥ
成分 量
精製水 １Ｌに十分な量
酵母抽出物 １２５ｇ／Ｌ
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過する。
【０１１３】
保持物を、必要な透過物が回収された後に廃棄し、そして透過物を補充物を含有する容器に添加する。
【０１１４】
Ｂ．２
成分 ＵＦ ＹＥの１リットル当たりの量
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ３０ｇ＋／−０．５ｇ
Ｌ−システイン−ＨＣｌ １．５ｇ＋／−０．２ｇ
１ＬのＵＦ ＹＥに化学物質を添加し、１０分間混合し、０．２ミクロンフィルターを介して濾過滅菌し、そして発酵器に移す。
【０１１５】
Ｃ．３Ｎ ＮａＯＨ
３Ｎ ＮａＯＨ＝１２％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ＝１２０ｇ／Ｌ ＮａＯＨ。
【０１１６】
Ｄ．泡止め剤
使用する泡止め剤は、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ１５１０である。これを、１２１℃で３０分間、オートクレーブすることによって滅菌する。
【０１１７】
液体培地中での増殖
５００ミリリットルフラスコに、１．０ｍＬの有効なストックバイアルを接種する。振とうフラスコは、１５０ｍＬの完全「Ｆｒａｎｚ培地」を含む。
【０１１８】
接種した振とうフラスコを、３５＋／−１℃で１５０ｒｐｍの（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置く。１０時間後、フラスコを、無菌にサンプリングする。光学密度は、（５９０ｎｍで）１．３〜３．３の間にあるべきであり、その場合、４つの２Ｌ振とうフラスコに、それぞれ、１５０ｍＬ振とうフラスコからの適切な容量を接種する。
【０１１９】
各２Ｌ振とうフラスコは、０．２Ｌの暖める前の「Ｆｒａｎｚ完全培地」を含む。
【０１２０】
振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、２００ｒｐｍの（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置く。１０時間後、各振とうフラスコの内容物を、滅菌接種に移し、そして発酵器に接種する。
【０１２１】
培養容器および増殖条件
バッチ発酵を、２０Ｌの培地を含有する３０リットルのバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ＡＧ、８６２０ Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、ＣＨ）中で行った。
【０１２２】
培養物は、３５℃および１４×１０３Ｎ／ｍ２（２ｐｓｉ）背圧で増殖していた。ｐＨを、３Ｎ ＮａＯＨで７．３に制御した。最初の攪拌速度を、最小の１５０ｒｐｍに設定し、そして最低通気を、１０Ｌ／分に設定した。ＤＯＴを、１５０〜４００の範囲にｒｐｍを制御し、次いで、必要であれば、酸素を補充することによって３５％に維持した。泡止め剤を、泡立ちを制御するために手動で添加した。グルコースの残余の濃度を検出し、そしてこれが約２ｇ／Ｌであった場合、０．２リットルのグルコース溶液を添加した。
【０１２３】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【０１２４】
ＭｅｎＣ ＰＳの分析
多糖の定量的評価を、Ｌａｒｓ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍによって、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（１９５７）、２１、６１０において報告された方法に従って、シアル酸含量を分析することによって行った。
【０１２５】
結果
Ａｍｉｓｏｙを用いて得られた増殖曲線、およびカザミノ酸を用いて得られた増殖曲線を、図８において比較する。ＭｅｎＣ ＰＳの収量は、Ａｍｉｓｏｙおよびカザミノ酸を含有する培地において、それぞれ、３０７ｍｇ／Ｌおよび３４５ｍｇ／Ｌであった。増殖曲線およびＰＳ産生は、２つの培地を使用してかなり類似する。
【０１２６】
本発明が、例示の手段としてのみ上記され、そしてび改変が、添付の請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内でなされる得ることが理解される。
【０１２７】
実施例Ｖ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉは、２μｍ長、および０．３〜０．５μｍ幅である細長い桿菌である。これはしばしば、より長い微細線維様の細胞の形態で存在する。胞子が形成される場合、この桿菌は、特徴的なドラムスティックの外見をとる。これは、運動性の生物体であり、グラム陽性であるが、そのグラム染色は、変化し得るか、または老化した培養物においては陰性でさえある。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉは、厳密に嫌気性であり、そして２つの外毒素を生成する。これらのうちの１つの、テタノスパスミン（ｔｅｔａｎｏ ｓｐａｓｍｉｎ）は、疾患の臨床像全体を担う神経毒である。
【０１２８】
材料および方法
細菌株
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｈａｒｖａｒｙ Ｙ−ＶＩ−３。
【０１２９】
培地
種培養物を、ｇ／Ｌで表わされる、以下に報告される培地を使用して調製した。
【０１３０】
成分 量ｇ／Ｌ
Ｎ−Ｚ Ｓｏｙ １５．０
グルコース ５．５
酵母抽出物 ５．０
ＮａＣｌ ２．５
Ｌ−システイン ０．５
ナトリウムチオグリコール酸 ０．５
寒天 ０．７５
ＰＨ＝７．１。
産生培地を、ＷＨＯ／ＶＳＱ／ＧＥＮ／９４（１９９０）において記載されるＭｕｅｌｌｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒ培地の改変として調製した。この培地においては、ウシ心臓注入液およびカゼイン溶液が使用されているが、ｇ／Ｌで表わされる、以下に報告される改変培地においては、ウシ心臓注入液およびカゼイン溶液の代わりにＨｙｓｏｙおよびＳｏｙｔｏｎｅを使用した：
成分 量ｇ／Ｌ
グルコース−Ｈ２Ｏ １２．１
ＮａＣｌ ２．５
Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ ２．５
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１５
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１５
アミノ酸溶液 １７．５ｍｌ
ビタミン溶液 ４．２ｍｌ
ＮａＯＨ ５Ｍ ４．０ｍｌ
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ（１％溶液） ４．０ｍｌ
Ｓｏｙ誘導体 ２０．０
ＰＨ＝７．３
１２０℃で２０分間、オートクレーブすることによって滅菌する。
【０１３１】
アミノ酸溶液
成分
Ｌ−チロシン ２８．５１ｇ／Ｌ
ウラシル ０．１４２ｇ／Ｌ
Ｌ−システイン １４．２５ｇ／Ｌ
ＨＣｌ ３７％ １３１．６ｍｌ／Ｌ。
【０１３２】
ビタミン溶液：
成分
パントテン酸Ｃａ
（Ｃａ ｐａｎｔｉｔｈｅｎａｔｅ） ２３８．１ｍｇ／Ｌ
チアミン ５９．７ｍｇ／Ｌ
ピリドキシン ５９．７ｍｇ／Ｌ
リボフラビン ５９．７ｍｇ／Ｌ
ビオチン ０．７３ｍｇ／Ｌ
エタノール ２５６．４ｍｌ／Ｌ。
【０１３３】
液体培地中での増殖
１５ｍｌの種培地を含有する、２つの２５ｍｌチューブに、０．５ｍｌの有効な種バイアルのそれぞれを接種し、そして３５℃で、２９時間、嫌気性ジャーにおいてインキュベートし、ここでは、Ｇａｓ生成キット（ＯＸＯＩＤ）を使用した。第２の一連のチューブに、１．５ｍｌの第１のチューブを接種し、そして上記の同じ条件で、２４時間、インキュベートした。
【０１３４】
これらの培養物の７ｍｌを使用して、７５ｍｌの同じ培地を含有する１００ｍｌチューブに接種した。これらのチューブを、上記と同じ条件で、２４時間、インキュベートした。
【０１３５】
これらのチューブの全内容物を使用して、２５００ｍｌの産生培地を含有する５０００ｍｌビーカーに接種した。
【０１３６】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【０１３７】
結果
１８６時間のインキュベーション後、ビーカー中のＯＤおよびＬｆ／ｍｌは以下のとおりであった：
Ｈｙｓｏｙを含有する培地 ＯＤ＝１．０８ Ｌｆ／ｍｌ＝６０
Ｓｏｙｔｏｎｅを含有する培地 ＯＤ＝０．７４ Ｌｆ／ｍｌ＝６０
ウシ心臓注入液および
カゼイン溶液を含有する培地 ＯＤ＝１．２３６ Ｌｆ／ｍｌ＝６０。
【０１３８】
実施例ＶＩ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、約０．５μｍの直径および０．５〜２μｍの長さのグラム陰性球状桿菌である。その栄養要求性は、単純であり、そしてこれは、糖を必要としない。これは、脂肪酸に極めて感受性であり、防御因子がないと生存は不十分である。
【０１３９】
材料および方法
細菌株
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ９Ｋ／１２９Ｇ（Ｐｉｚｚａ，Ｍ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、４９７−５００）。
【０１４０】
培地
種培養物および産生培養物を、ｇ／Ｌで表わされる、以下に報告されるＣＬ培地（Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ａ．ら（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４１（３）、１１３８−１１４３）を使用して調製した：
成分 量ｇ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム １０．７
Ｌ−プロリン ０．２４
ＮａＣｌ ２．５
ＫＨ２ＰＯ４ ０．５
ＫＣｌ ０．２
ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ ０．１
ＣａＣｌ２ ０．０２
Ｔｒｉｓ ６．１
Ｌ−システイン＊ ０．０４
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ＊ ０．０１
ナイアシン＊ ０．００４
還元型グルタチオン＊ ０．１５
アスコルビン酸＊ ０．４
カザミノ酸 １０．０
ジメチル−Ｂ−シクロデキストリン １．０
ＰＨを、ＨＣｌで７．６に調整する
＊濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブした培地に無菌的に添加する。改変培地は、カザミノ酸の代わりに１０ｇ／ｌのＮ−Ｚ Ｓｏｙを含んだ。
【０１４１】
液体培地中での増殖
各１００ｍｌのＣＬ培地または改変培地を含有する５００ｍｌの非整流振とうフラスコに、３．０ｍＬの有効なストックバイアルを接種した。
【０１４２】
振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、１００ＲＰＭにて、１２時間、（１”の偏心距離）インキュベーター−振とう器に置いた。１２時間後、攪拌を、さらに１６時間、２５０ＲＰＭに増加した。
【０１４３】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【０１４４】
ＰＴの分析
この分析を、ＥＬＩＳＡ（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ，Ｌ．ら（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８、１３０６−１３１５）によって行った。
【０１４５】
結果
２８時間のインキュベーション後、フラスコ中のＯＤおよびＰＴ（ｍｇ／Ｌ）は、以下のとおりであった：
ＣＡＡを含有する培地 ＯＤ＝２．３１ ＰＴ＝２．４ｍｇ／Ｌ
ＮＺ−Ｓｏｙを含有する培地 ＯＤ＝１．９９ ＰＴ＝２．２５ｍｇ／Ｌ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性細菌を培養するための培地に関する。本発明はまた、この培地を使用して、病原性細菌を培養し、培養された細菌から免疫原性因子を得、そして免疫原性因子を用いてワクチンを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌ワクチンは、培地で病原性細菌を培養し、免疫原性因子を単離し、そして単離した免疫原性因子に基づいてワクチンを調製することによって産生される。このような方法は、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９８４，Ｒｅｎｅ Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ編、およびＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，第１３巻，１９９０，Ａ．Ｍｉｚｒａｈｉ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ編に記載されている。従来の方法では、病原性細菌は、動物起源のタンパク質性物質を含む培地で培養される。これらの化合物は病原性細菌の増殖に必須ないくらかの増殖因子が、血液、脳心臓注入物（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、肉などのような動物起源の化合物にのみ存在していたという信念で使用されている。例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎｉは、心臓注入物およびカゼインの酵素消化物を含む培地で増殖され；Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは牛肉注入物を必要とし；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉはペプタミンおよびトリプトンを含む培地で増殖され；そしてＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅはプロテオースペプトンを含む培地で増殖される。世界保健機構報告第８００巻（１９９０）および同第８１４巻（１９９１）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉおよびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを増殖するために、動物起源の化合物を含む培地が必要であることを示している。
【０００３】
培地における動物起源のタンパク質性物質の必要性は、培地の汚染の可能性の心配を生じている。特に、培地がウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の原因となる物質または他の感染性物質および有害物質により汚染され得るという懸念は、特に治療用途において、このような培養物由来のいずれの因子の有用性をも制限している。
【０００４】
動物起源でないタンパク質性物質が病原性細菌の増殖を維持し得、そして細菌による免疫原性因子の産生を可能にすることが、驚くべきことに見出された。
【０００５】
特許出願ＤＤ ２９４ ５０２−Ａでは、繊毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）の微生物培養における大豆加水分解物を調製するプロセスおよび大豆加水分解物の使用が開示されている。大豆加水分解物は、ストレプトマイシン株で大豆粉末含有培地を培養することにより調製される。大豆加水分解物は、存在する多糖類の高い割合により炭素源として使用され、そして乾燥重量のタンパク質で２０％未満を含有する。
【０００６】
動物起源でないタンパク質性物質（例えば、大豆、綿実、ジャガイモなどに由来のタンパク質）の、病原性細菌の培養のための培地成分としての使用は、任意の後続の治療的または予防的用途においてヒトに移される動物由来の汚染（例えば、ＢＳＥ）の危険性を完全に取り除く。
【０００７】
植物由来のタンパク質性物質の使用に関連するさらなる利点は、この物質を生成する経費の削減およびこの物質の増加された一貫性である（動物由来でないタンパク質性物質は、動物由来の物質よりもその組成においてより均一である）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地を提供し、ここでこの培地は、乾燥重量で少なくとも２０％の動物由来でないタンパク質性物質を含有し、そして動物由来のタンパク質性物質を含有しない。
【０００９】
細菌を培養するための任意の標準培地が、動物由来のタンパク質性物質を含まないという条件で、本発明の培地の基礎として使用され得る。
【００１０】
好ましくは、本発明の培地は、炭素およびエネルギー源、窒素源、必須塩類、ならびに必要に応じて培養されるべき微生物を選択するための選択剤（例えば、抗生物質）を含有する。
【００１１】
本発明の培地は、固体または液体培地であり得る。本発明の培地の基礎を形成し得る標準液体培地の例には、Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス（トリプトンおよびペプタミンなし）、Ｗａｔｓｏｎ培地（カザミノ酸なし）、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｍｉｌｌｅｒ培地（心臓注入物およびカゼイン加水分解物なし）、ＣＬ培地（カザミノ酸なし）、およびＦｒａｎｚ Ａ培地が挙げられる。標準固体培地は、寒天のような凝固剤の添加により、任意の液体培地から調製され得る。
【００１２】
本明細書中で使用される用語「培養する」は、細菌の維持、好ましくは増殖を意味する。細菌増殖は、本明細書中では、細菌生物量の増加として定義される。
【００１３】
本明細書中で使用される用語「病原性細菌」は、疾患の病原性に関与する任意の細菌を意味する。好ましい病原性細菌には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが挙げられる。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「免疫原性因子」は、ヒトまたは動物の免疫系を刺激し得る任意の因子を意味する。このような免疫原性因子には、抗原性タンパク質、特に毒性因子およびそのフラグメントが挙げられる。毒性因子は、細菌の毒性に関連するものとして定義され、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉにより産生される液胞（ｖａｃｕｌａｔｉｎｇ）細胞毒素ＶａｃＡのような因子を含む。他の毒性因子は、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｍｅｅｔｉｎｇ （Ｇｅｎｏｖａ，１９９３年６月１８日〜１９日） Ｊ．Ｊ．Ｍｉｓｉｅｗｉｃｚ編 （ＣＳ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ），Ｓ７６〜Ｓ７８頁（本明細書中で参考として援用される）により記載されている。免疫原性因子は、毒素化（ｔｏｘｏｉｄｉｎｇ）プロセスにより遺伝的に解毒されるかまたは処理され得る。免疫原性因子を遺伝的に解毒および毒素化の方法は、当業者に周知であり、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．、Ｖａｃｃｉｎｅ，１２，５７９−５８１，（１９９４）（本明細書中で参考として援用される）により記載される方法を含む。
【００１５】
本明細書中で使用される用語「タンパク質性物質」は、タンパク質、および遊離のアミノ酸を含むタンパク質分解産物を意味する。好ましくはタンパク質性物質は、タンパク質加水分解物である。
【００１６】
本明細書中で使用される動物由来でないタンパク質性物質は、非哺乳動物源（例えば、植物、鳥、魚、酵母、真菌、藻類、および微生物）由来のタンパク質性物質を意味する。より好ましくは、動物由来でないタンパク質性物質は、植物、酵母、藻類および微生物由来のタンパク質性物質を意味する。最も好ましくは、動物由来でないタンパク質性物質は、大豆、綿実、ジャガイモ等由来のタンパク質組成物のような、植物由来のタンパク質性物質を意味する。
【００１７】
好ましい動物由来でないタンパク質性物質には、ＨＹ ＹＥＳＴ （Ｑｕｅｓｔ）のような酵母抽出物、ならびにＨｙｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ）、Ａｍｉｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ）、Ｎ−Ｚ ｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ）およびＳｏｙｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）のような大豆由来のタンパク質組成物が挙げられる。
【００１８】
酵母抽出物は、当業者に周知の標準的手順により調製され得る。さらに、酵母抽出物は、ＳｉｇｍａおよびＱｕｅｓｔを含む多数の供給源から市販されている。
【００１９】
大豆由来のタンパク質組成物は、パパインのような標準的酵素を用いて、大豆粉または大豆単離物の酵素的消化によって調製され得る。例えば、Ｎ−Ｚ ｓｏｙは、大豆単離物の酵素的消化により生成される可溶性タンパク質組成物であり、そしてＨｙｓｏｙは、大豆粉のパパイン消化物である。大豆由来のタンパク質組成物はまた、大豆単離物の酸加水分解により得られ得る。例えば、Ａｍｉｓｏｙは、大豆単離物の酸加水分解により生成されるアミノ酸およびペプチド供給源である。
【００２０】
他の動物由来でないタンパク質性物質は、非哺乳動物源の物質を含むタンパク質の酵素的消化または酸加水分解のいずれかにより得られ得る。
【００２１】
本発明の培地における動物由来でないタンパク質性物質は、２つ以上の異なる動物由来でないタンパク質性物質（例えば、Ｈｙｓｏｙ、Ａｍｉｓｏｙ、Ｎ−Ｚ ｓｏｙおよびＳｏｙｔｏｎｅのような大豆由来のタンパク質性組成物の混合物）を含み得る。
【００２２】
動物由来のタンパク質性物質には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテオースペプトン、カザミノ酸、トリプトン、ペプタミン、およびカゼイン加水分解物などのタンパク質組成物が挙げられる。
【００２３】
好ましくは、本発明の培地は、乾燥重量で少なくとも２０％の動物由来でないタンパク質性物質、より好ましくは乾燥重量で少なくとも３０％の動物由来でないタンパク質性物質、最も好ましくは乾燥重量で少なくとも５０％の動物由来でないタンパク質性物質を含む。
【００２４】
本発明の培地を使用した病原性細菌の培養が、動物由来のタンパク質性物質を含む培地における病原性細菌の培養と比較して、細菌増殖の増加および免疫原性因子の収量の増加をもたらすことが、驚くべきことに見出された。
【００２５】
本発明はさらに、免疫原性因子を産生するための病原性細菌の培養のための培地の作製プロセスを提供し、このプロセスは、細菌培養のための標準培地に十分な量の動物由来でないタンパク質性物質を添加する工程を包含し、これは動物由来のタンパク質性物質を含まず、故に、病原性細菌の培養のためのこの培地は、乾燥重量で少なくとも２０％の動物由来でないタンパク質性物質を含みかつ動物由来のタンパク質性物質を含まない。
【００２６】
標準的液体培地の例には、Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス（トリプトンおよびペプタミンなし）、Ｗａｔｓｏｎ培地（カザミノ酸なし）、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｍｉｌｌｅｒ培地（心臓注入物およびカゼイン加水分解物なし）、ＣＬ培地（カザミノ酸なし）、およびＦｒａｎｚ Ａ培地が挙げられる。標準的固体培地は、寒天などの凝固剤の添加により、任意の液体培地から調製され得る。
【００２７】
本発明はさらに、任意の前記したおよび病原性細菌の培地を包含する培養を提供する。好ましい病原性細菌には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが挙げられる。最も好ましくは、病原性細菌はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉである。
【００２８】
本発明はまた、病原性細菌の免疫原性因子を調製するプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の培地において細菌を培養する工程、および必要に応じて培地から免疫原性因子を精製する工程を包含する。
【００２９】
好ましくは、病原性細菌は、本発明の培地において、少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも３６時間、最も好ましくは少なくとも７２時間、免疫原性因子の産生に適した条件下で、培養される。
【００３０】
免疫原性因子の産生に適した培養条件（培養期間を含む）は、培養する細菌に依存して変化する。しかし、当業者は、免疫原性因子の産生に必要な培養条件を、標準的プロトコール（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．のシリーズ（本明細書中で参考として援用される）に記載のプロトコール）に従うことによって、そして必要ならば、適切な培養条件を決定するための多くの標準的実験を行うことによって、容易に決定し得る。
【００３１】
免疫原性因子は、多数の標準的技術（Ｍａｎｅｔｔｉ，Ｒ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３，４４７６−４４８０，（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている技術を含む）を用いて、細菌培養物より単離され得る。
【００３２】
本発明はまた、病原性細菌の免疫原性因子を調製する工程を包含するワクチン生成のプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の培地において細菌を培養する工程、必要に応じて培地から免疫原性因子を精製する工程、および（必要に応じて毒素化された）上記因子を薬学的に受容可能なキャリアと会合させる工程を包含する。ワクチンを産生するのに適した方法は、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．，Ｎｅｗ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ａｎｄ Ｔｅｔａｎｕｓ．（１９９０），２５１−２６８，Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｍ．Ｍ Ｌｅｖｉｎｅ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００３３】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、それらを使用するとき、アジュバントの添加を必要とする。適切なアジュバントは、Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１３，１２６３−１２７６，（１９９５）に記載されている。
【００３４】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、細菌感染に対して個体をワクチン接種するために使用され得る。ワクチン接種され得る好ましい細菌感染には、Ｂ型胃炎、細菌性髄膜炎、ジフテリア、破傷風、および百日咳が挙げられる。
【００３５】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、上記したように薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバントと混合した本発明のワクチンを含有する薬学的組成物として提供され得る。
【００３６】
本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、経口または非経口経路（静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、直腸および局所的投与を含む）により、投与され得る。
【００３７】
経口投与の場合、本発明の化合物は一般的に、錠剤もしくはカプセル剤の形状で、または水性溶液もしくは懸濁液として、提供される。
【００３８】
経口使用のための錠剤は、薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、矯味剤、着色剤、および保存剤）と混合された有効成分（ワクチン成分）を含み得る。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびに乳酸が挙げられるが、コーンスターチおよびアルギン酸が適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよび他の周知の試薬を含み得るが、もし存在する場合、滑沢剤は一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。所望であるならば、錠剤は、消化管における吸収を遅延するために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の物質でコーティングされ得る。
【００３９】
経口使用のためのカプセルとしては、有効成分が固体希釈剤と混合される硬質カプセル、および有効成分が水または油（例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油）と混合される軟質カプセルが挙げられる。
【００４０】
筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内の使用について、本発明の化合物は、一般に、適切なｐＨおよび等張性に緩衝化された、滅菌で水性の溶液または懸濁液中に提供される。適切な水性ビヒクルとしては、リンゲル液および等張性の塩化ナトリウムが挙げられる。本発明に従う水性懸濁液としては、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、およびトラガカントゴムのような懸濁剤、ならびにレシチンのような湿潤剤が挙げられる。水性懸濁液に適切な保存剤としては、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。
【００４１】
本発明のプロセスによって調製されるワクチンはまた、リポソーム処方物として提供され得る。
・本発明はまた、以下を提供し得る：
・（項目１） 免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地であって、上記培地は、少なくとも２０乾燥重量％の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来のタンパク質性物質を含まない、培地。
・（項目２） 項目１に記載の培地であって、上記動物由来でないタンパク質性物質は、酵母抽出物および／またはダイズ由来タンパク質組成物である、培地。
・（項目３） 項目１または項目２に記載の培地であって、上記病原性細菌は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉである、培地。
・（項目４） 項目１〜３のうちのいずれか１項に記載の培地と、病原性細菌とを含む、培養物。
・（項目５） 病原性細菌の免疫原性因子を調製するためのプロセスであって、
上記細菌を、項目１〜３のうちのいずれか１項に記載の培地中で培養する工程、および
必要に応じて、
上記培地から上記免疫原性因子を精製する工程を包含する、プロセス。
・（項目６） ワクチン生成のためのプロセスであって、
項目５に記載のプロセスによって病原性細菌の免疫原性因子を調製する工程、および
上記因子を薬学的に受容可能なキャリアと結合させる工程
を包含し、ここで、上記因子は必要に応じてトキソイド化される、プロセス。
・（項目７） 免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地の作製プロセスであって、
病原性細菌を培養するための上記培地が、少なくとも２０乾燥重量％の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来のタンパク質性物質を含まないように、充分な動物由来でないタンパク質性物質を、細菌を培養するための動物由来タンパク質性物質を含まない標準培地に添加する工程
を包含する、プロセス。
【００４２】
本発明は、ここに、以下の実施例および図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、トリプトンおよびペプタミン（ｐｅｐｔａｍｉｎ）を含有するＢＢにおけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４の増殖の動力学を示す。
【図２】図２は、Ｓｏｙｔｏｎｅを含有する単純化ＢＢにおけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４の増殖の動力学を示す。
【図３】図３は、Ｈｙｓｏｙを含有する単純化ＢＢにおけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４の増殖の動力学を示す。
【図４】図４は、ＶａｃＡイムノブロットを示し、ここで、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、ＶａｃＡ標準７５０ｎｇであり、レーン３は、ＶａｃＡ標準５００ｎｇであり、レーン４は、ＶａｃＡ標準４００ｎｇであり、レーン５は、ＶａｃＡ標準１５０ｎｇであり、レーン６は、ＶａｃＡ標準２０ｎｇであり、レーン７は、発酵の終りで生成されるＶａｃＡであり、レーン８は、培養の４８時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン９は、培養の３０時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン１０は、培養の２３時間後に生成されるＶａｃＡである。
【図５】図５は、ＶａｃＡイムノブロットを示し、ここで、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、ＶａｃＡ標準７５０ｎｇであり、レーン３は、ＶａｃＡ標準５００ｎｇであり、レーン４は、ＶａｃＡ標準４００ｎｇであり、レーン５は、ＶａｃＡ標準１５０ｎｇであり、レーン６は、ＶａｃＡ標準２０ｎｇであり、レーン７は、発酵の終りで生成されるＶａｃＡであり、レーン８は、培養の３１．５時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン９は、培養の３０時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン１０は、培養の２４時間後に生成されるＶａｃＡである。
【図６】図６は、ＶａｃＡのイムノブロットを示し、ここで、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、ＶａｃＡ標準７５０ｎｇであり、レーン３は、ＶａｃＡ標準５００ｎｇであり、レーン４は、ＶａｃＡ標準４００ｎｇであり、レーン５は、ＶａｃＡ標準２０ｎｇであり、レーン６は、発酵の終りで生成されるＶａｃＡであり、レーン７は、培養の４８時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン８は、培養の３１時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン９は、培養の２４．５時間後に生成されるＶａｃＡであり、レーン１０は、ＶａｃＡ標準１５０ｎｇである。
【図７】図７は、Ｓｏｙｔｏｎｅまたはプロテオースペプトンを含有する単純化Ｆｒａｎｚ培地中でのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂの増殖の動力学を示す。
【図８】図８は、カザミノ酸またはＡｍｉｓｏｙを含有するＷａｔｓｏｎ培地中でのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの増殖の動力学を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
実施例
全ての引用文献は、本明細書中に参考として援用される。
実施例Ｉ
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉは、約１０年前に単離された湾曲したグラム陰性の微好気性細菌であり、ヒトにおいてＢ型胃炎と関連する。この細菌は、ヒト胃粘膜にコロニーを形成し、そして胃潰瘍および十二指腸潰瘍を生じ得（Ｂｌａｓｅｒ、Ｍ．Ｊ．、（１９９０）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６１、６２９−６３３）、および胃ガン腫の発症についての危険因子であり得る（Ｐａｒｓｏｎｎｅｔ、Ｊ．ら（１９９１）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２５、１１２７−１１３１）慢性の感染を確立する。
【００４５】
長期的には、感染および疾患はワクチン接種によって予防および処置され得る。現在、細菌接着、コロニー形成、および発病力に関与するいくつかの因子が同定されている。疾患に関与する最も興味深い因子のうちの１つは、液胞形成細胞毒（ＶａｃＡ）であり、これはいくつかの哺乳動物細胞株において大量の液胞形成を引き起こす（Ｌｅｕｎｋ、Ｒ．Ｄ．、（１９９１）、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１３（増刊８）、Ｓ６８３−６８９）。液胞はまた、慢性胃炎を伴う患者の胃上皮において観察されている（Ｔｒｉｃｏｔｔｅｔ、Ｖ．ら（１９８６）、Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ．Ｐａｔｈｏｌ．、１０、１１３−１１７）。このタンパク質は、マウスにおいて潰瘍形成を引き起こすことが示されており（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９４）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９、１６５３−１６５８）、そしてワクチンの候補である。精製された細胞毒は、細菌培養上清から非常に小量で精製され得る８７〜９４ｋＤのタンパク質である。
【００４６】
材料および方法
細菌株
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４（株型、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｔｅｂｏｒｇ）を使用した。
【００４７】
培地および補充物
２ｇ／ｌの（２，６−ジ−０−メチル）−ｂ−シクロデキストリン（ＣＤ）（Ｔｅｉｊｉｎ Ｌｉｍ．Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）および２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを補充した、Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｂｒｏｔｈ（トリプトン１０ｇ／ｌ、ペプタミン１０ｇ／ｌ、デキストロース１ｇ／ｌ、酵母抽出物２ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、および亜硫酸水素ナトリウム０．１ｇ／ｌ）（ＢＢ）（Ｄｉｆｃｏ）を、比較目的のための液体培地
として使用した。ＢＢに存在するトリプトンおよびペプタミンの代わりに、ＨｙｓｏｙまたはＳｏｙｔｏｎｅを、１０ｇ／Ｌの濃度で使用した。
【００４８】
保存
接種物の凍結アリコートを、グリセロール４０％、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）２０％、および０．４％ ＣＤから構成される溶液で１：２希釈した、２×１０８ＣＦＵ／ｍｌのフラスコ培養物から調製した。得られた懸濁液を、３ｍｌバイアル中に分注し、そして−８０℃で保存し、そしてＳｏｙｔｏｎｅ ２０％でＦＣＳを置換して調製した新規の凍結バイアルとの比較のために、開始凍結バイアルとして使用した。
【００４９】
液体培地中での増殖
最初の培養を、１００ｍｌの液体培地を含有する５００ｍｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で行った。培養物に、３ｍｌの凍結ストックを接種し、そして微好気性環境において、３６℃で３６時間、振とうしながら（１００ｒｐｍ、２．５ｃｍの偏心距離）インキュベートした。フラスコを、嫌気性のジャーの内側におき、ここではＢＢＬ Ｃａｍｐｙ Ｐａｋエンベロープ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、正確な条件を発生させた。次いで、これらの培養物を使用して、２５０ｍｌの培地を含有する１０００ｍｌのフラスコに接種し、そして上記と同じ条件下でインキュベートし、そしてこれを使用して、バイオリアクターに接種した。
【００５０】
培養容器および増殖条件
バッチ発酵を、５ｌの培地を含有する７リットルのバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ＡＧ、８６２０ Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、ＣＨ）中で行った。全ての培養物を、３６℃で増殖した。ｐＨ値は制御しなかった。溶存酸素圧力（ＤＯＴ）を、２工程手順によって、予め設定したレベル（３％）にて自動的に維持した。先ず、空気流量速度を、０．１から０．５ｌ／ｌ／分まで増加して、培養物の増加するＯ２要求性を満たした。さらなる増加が必要である場合、純粋なＯ２を最大０．４ｌ／ｌ／分まで供給することによって得た。最初の１２時間の増殖の間、Ｎ２およびＣＯ２の一定の流量を、それぞれ、０．２ｌ／ｌ／分および０．０２ｌ／ｌ／分に等しく維持した。攪拌速度を、１３０ｒｐｍに維持した。攪拌器シャフトは、直径７ｃｍの２つのＲｈｕｓｔｏｎタービンを備え、そしてバイオリアクターの直径は、１７ｃｍであった。
【００５１】
グルコース供給
５０％グルコース溶液を、時間０で添加して、５ｇ／Ｌの最終濃度を与えた。５ｇ／Ｌの別の添加を、ＯＤが２〜３の範囲にある場合に行った。
【００５２】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５分光光度計）、光路１ｃｍに対して、５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度のチェックを、グラム染色によって行った。
【００５３】
ＶａｃＡタンパク質の分析
発酵の間の決められた時点で、培養サンプルを、１０分間当たり８，３００×ｇで、遠心分離した（Ｂｉｏｆｕｇｅ Ａ、Ｈｅａｒｅｕｓ）。上清を、トリクロロ酢酸で沈殿し、そしてＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ装置を使用して９％ ＳＤＳ−Ｐａｇｅに供した。タンパク質を、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、次いでＶａｃＡタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗血清（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９、１６５３−１６５８）とともに、一晩、インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ）との２時間のインキュベーション後、免疫反応性のバンドを、４−クロロ−ナフトール染色によって可視化した。
【００５４】
結果
Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｂｒｏｔｈは、トリプトン１０ｇ／ｌ、ペプタミン１０ｇ／ｌ、デキストロース１ｇ／ｌ、酵母抽出物２ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、および亜硫酸水素ナトリウム０．１ｇ／ｌから構成される複合培地である。この培地は、血液誘導体が補充された場合にのみ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉの増殖を支持し得るとして多くの文献において記載されている（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．およびＢｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、１０５７０−１０５７５；Ｓｈａｈａｍａｔ，Ｍ．ら（１９９１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９、２８３５−２８３７；Ｂｕｃｋ、Ｇ．Ｅ．およびＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｓ．（１９８７）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２５、５９７−５９９；ならびにＭｏｒｇａｎ、Ｄ．Ｒ．ら（１９８７）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２５、２１２３−２１２５）。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ増殖培地の実質的な単純化は、シクロデキストリンが、血液誘導体の代わりに使用され得ることが発見された近年、得られた（Ｏｌｉｖｉｅｒｉ，Ｒ．ら、（１９９３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１、１６０−１６２）。この単純化培地およびグルコース供給を使用する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの増殖は、図１において報告される。グルコース供給は、炭素およびエネルギー供給源が、常に培地に存在することを確実にするために使用された。
【００５５】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを、これらの条件下で培養した場合、培地中のＶａｃＡの生成を、上記のように測定した。結果を、図５および図６において示す。
【００５６】
増殖培地におけるＳｏｙｔｏｎｅおよびＨｙｓｏｙの使用は、それぞれ、図２および３において報告される結果を与えた。ＶａｃＡ産生は、Ｓｏｙｔｏｎｅが使用された場合、図５において報告され、そしてＨｙｓｏｙを使用した場合、図６において報告される。
【００５７】
結果は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ増殖の増殖培地および発酵条件に対する改善、ならびに液胞形成細胞毒（ＶａｃＡ）の生成における改善を示す。
【００５８】
実施例ＩＩ
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、子供における細菌性髄膜炎の主要な原因である、小さな非運動性のグラム陰性菌である。これらの微生物は主に、毒素産生性ではなく、侵襲性である。これらは、呼吸管の居住者であり（共生性および病原性）、そしてこれらは、抗食作用性の多糖カプセルを有する。
【００５９】
材料および方法
細菌株
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ ＡＴＣＣ １０２１１。
【００６０】
培地および補充物
培地の調製は、以下のように異なる溶液の使用を含む：
「Ｆｒａｎｚ Ａ培地」調製
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １．６ｇ＋／−０．０１ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４１２Ｈ２Ｏ ５．０３ｇ＋／−０．０５ｇ
ＫＣｌ ０．８９２＋／−０．００８ｇ
ＮａＣｌ ６．００５ｇ＋／−０．０６ｇ
ＮＨ４Ｃｌ １．２５ｇ＋／−０．０１ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝８．２に必要なだけ
上述の成分を、混合しながら溶解する。３Ｎ ＮａＯＨを、溶液のｐＨをｐＨ＝８．２にするために使用する。
【００６１】
限外濾過されたＳｏｙｔｏｎｅ調製
成分 １リットル当たりの量
Ｓｏｙｔｏｎｅ ３３．３ｇ＋／−０．０３ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、３０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過した。
【００６２】
限外濾過されたプロテオースペプトン
成分 １リットル当たりの量
プロテオースペプトン ３３．３＋／−０．０３ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、３０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過した。
【００６３】
限外濾過されたＹＥ調製
成分 １リットル当たりの量
酵母抽出物 １００ｇ＋／−０．０２ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
使用した酵母抽出物は、Ｑｕｅｓｔから入手可能なＨＹ ＥＡＳＴであった。この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過した。
【００６４】
５０％グルコース溶液
成分 １リットル当たりの量
グルコース（無水 ５００ｇ＋／−５ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量。
【００６５】
ＮＡＤ ０．１％溶液
成分 １リットル当たりの量
ＮＡＤ １．０ｇ＋／−０．００５ｇ
ＴＲＩＳ １．２１ｇ＋／−０．０１ｇ
精製水 １．０リットルに十分な量
ＨＣｌ ３７％ ｐＨ７．４±０．２に必要なだけ。
【００６６】
ヘミン０．４％溶液
成分 １リットル当たりの量
ヘミン ４ｇ＋／−０．０２ｇ
０．２Ｎ ＮａＯＨ １．０リットルに十分な量
使用するヘミンは、好ましくは、化学的に合成される。化学的に合成されたヘミンは、Ｆｌｕｋａから市販されている。
【００６７】
５５０ｍｌのＦｒａｎｚ Ａを、４５０ｍｌの限外濾過したＳｏｙｔｏｎｅまたはプロテオースペプトンと混合して、１リットルのＨｉｂ基本培地を得、これを、１２１℃で３０分間、オートクレーブすることによって、滅菌した。
【００６８】
冷却後、濾過によって滅菌した、１０ｍｌ／Ｌグルコース溶液、２０ｍｌ／ＬのＹＥ、２ｍｌ／ＬのＮＡＤ溶液を、添加し（上記の付加を伴って）、そしてこの培地を「Ｈｉｂ完全培地」と呼んだ。
【００６９】
液体培地中での増殖
暖める前の、非整流（ｕｎｂａｆｆｅｌｅｄ）振とうフラスコ（５００／１５０）に、１．０ｍＬのそれぞれの有効な（ｗｏｒｋｉｎｇ）ストックバイアルを接種した。振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、１５０ＲＰＭにて６時間、（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置いた。
【００７０】
６時間後、振とうフラスコの適切な量を、０．５Ｌの暖める前の「Ｈｉｂ完全培地」を含有する１つの２リットルの非整流振とうフラスコに移した。振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、２００ｒｐｍにて、９時間、（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置き、次いで、内容物を滅菌接種に移し、次いで、接種物を発酵器に移した。
【００７１】
培養容器および増殖条件
バッチ発酵を、２０ｌの培地を含有する３０リットルバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ＡＧ、８６２０ Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、ＣＨ）において行った。
【００７２】
培養物は、３５℃および２ｐｓｉの背圧で増殖した。ｐＨを、３Ｎ ＮａＯＨで７．３に制御した。最初の攪拌速度を、最小の１５０ｒｐｍに設定し、そして最低通気を１０Ｌ／分に設定した。ＤＯＴを、１５０〜４００の範囲にｒｐｍを制御し、次いで、必要であれば、酸素を補充することによって３５％に維持した。。泡止め剤を、泡立ちを制御するために手動で添加した。グルコースの残余の濃度を検出し、そしてこれが約２ｇ／Ｌであった場合、０．２リットルのグルコース溶液を添加した。
【００７３】
バイオマス測定。
【００７４】
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５ 分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【００７５】
Ｈｉｂ ＰＳの分析。
【００７６】
この分析を、Ｗｅｅｋｅ，Ｂ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２、３７−４６、（１９７３）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されるように、Ｒｏｃｋｅｔ免疫電気泳動によって行った。
【００７７】
結果
Ｓｏｙｔｏｎｅを用いて得られた増殖曲線、およびプロテオースペプトンを用いて得られた増殖曲線を、図７において比較する。Ｈｉｂ ＰＳの収量は、Ｓｏｙｔｏｎｅおよびプロテオースペプトンを含有する培地において、それぞれ、６００ｍｇ／Ｌおよび１５０ｍｇ／Ｌであった。増殖曲線は、２つの培地を使用してかなり類似するが、Ｓｏｙｔｏｎｅを使用するＨｉｂ ＰＳの収量は４倍増加する。植物由来のタンパク質性物質を含有する培養培地の使用は、動物由来のタンパク質性物質を含有する培養培地の使用に比較して、Ｈｉｂ ＰＳのような多糖の収量増加を導く。
【００７８】
実施例ＩＩＩ
Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは、グラム陽性の、桿体様の微生物であり、柵をまとっている。バクテリオファージによるＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ溶原化は、強力な毒素の合成を引き起こし、この発現は、鉄濃度によって調節される。
【００７９】
材料および方法
細菌株
Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ ＣＮ ２０００。
【００８０】
培地および補充物
培地の調製は、以下のような異なる溶液の使用を含む：
Ａ．限外濾過された酵母抽出物（ＹＥ）およびカザミノ酸（ＣＡＡ）
成分 量ｇ／Ｌ
精製水 ８００ｍｌ
酵母抽出物 ２０ｇ／Ｌ
カザミノ酸 １０ｇ／Ｌ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱鉄酸塩化（ｄｅｆｅｒｒａｔｉｏｎ）容器に添加した。
【００８１】
Ａ．Ａ 限外濾過された酵母抽出物（ＹＥ）およびＳｏｙｔｏｎｅ
成分 量ｇ／Ｌ
精製水 ８００ｍｌ
酵母抽出物 ２０ｇ／Ｌ
Ｓｏｙｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱酸素塩容器に添加した。
【００８２】
Ａ．Ｂ 限外濾過された酵母抽出物
成分 量ｇ／Ｌ
精製水 ８００ｍｌ
酵母抽出物 ３０ｇ／Ｌ
精製水 １．０リットルに十分な量
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱鉄酸塩化容器に添加した。
【００８３】
Ａ．１ 脱鉄酸塩化
以下の成分を、攪拌容器に導入した
成分 量
ＵＦ（ＹＥ＋ＣＡＡ）溶液 １Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、５０％（ｗ／ｖ） ２ｍＬ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン、１％（ｗ／ｖ） ５ｍＬ／Ｌ（０．０５ｇ／Ｌ）
３Ｎ ＮａＯＨ （ｐＨ７．４に補正するために十分な量）
ＵＦは、溶液が限外濾過されることを示す。
【００８４】
攪拌しながら、溶液を１００℃に加熱する。１００℃で１分間保持し、次いで、３７℃に培地を冷却する。濾過は、一旦３７℃を下回ると開始し得る。濾過後、培地を、「ＣＡＡを含有するＣＹベース培地」として記載する。
【００８５】
Ａ．１．Ａ 脱鉄酸塩化
以下の成分を、攪拌容器に導入する
成分 量
ＵＦ（ＹＥ＋Ｓｏｙｔｏｎｅ）溶液 １Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、５０％（ｗ／ｖ） ２ｍＬ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン、１％（ｗ／ｖ） ５ｍＬ／Ｌ（０．０５ｇ／Ｌ）
３Ｎ ＮａＯＨ （ｐＨ７．４に補正するために十分な量）。
【００８６】
攪拌しながら、溶液を１００℃に加熱する。１００℃で１分間保持し、次いで、３７℃に培地を冷却する。濾過は、一旦３７℃を下回ると開始し得る。濾過後、培地を、「Ｓｏｙｔｏｎｅを含有するＣＹベース培地」として記載する。
【００８７】
Ａ．１．Ｂ 脱鉄酸塩化
以下の成分を、攪拌容器に導入する
成分 量
ＵＦ ＹＥ溶液 １Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、５０％（ｗ／ｖ） ２ｍＬ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン、１％（ｗ／ｖ） ５ｍＬ／Ｌ（０．０５ｇ／Ｌ）
３Ｎ ＮａＯＨ （ｐＨ７．４に補正するために十分な量）。
【００８８】
攪拌しながら、溶液を１００℃に加熱する。１００℃で１分間保持し、次いで、３７℃に培地を冷却する。濾過は、一旦３７℃を下回ると開始し得る。濾過後、培地を、「ＹＥのみを含有するＣＹベース培地」として記載する。
【００８９】
Ｂ．「補充物」溶液
Ｂ１）溶液Ａ
成分 １リットル当たりの量
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ２２５ｇ
β−アラニン １．１５ｇ
ニコチン酸 １．１５ｇ
ピメリン酸 ０．０７５ｇ
ＣｕＳＯ４ ０．５０ｇ
ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．４０ｇ
ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ ０．１５ｇ
ＨＣｌ、３７％ ３０ｍＬ
精製水 １．０リットルに十分な量。
【００９０】
Ｂ２）溶液Ｂ
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
Ｌ−シスチン ２００ｇ
ＨＣｌ、３７％ ２００ｍＬ。
【００９１】
溶液を、個々に１０分間、混合する。溶解後、２０ｍＬの溶液Ａおよび１０ｍＬの溶液Ｂを混合し、そして０．２ミクロンのフィルターを介して濾過する。溶液を、光から覆って、４℃で保存する。
【００９２】
フラスコ滅菌化
一旦脱鉄酸塩化したら、濾過した培地（Ａ．１またはＡ．１．ＡまたはＡ．１．Ｂ）を、フラスコにロードする。フラスコを、２５分間、１２１℃で滅菌する。
【００９３】
滅菌後の調整
１．「５０％マルトース」を添加する ３０ｍｌ／Ｌ
２．「補充物」を添加する ３．０ｍｌ／Ｌ
上述の１＋２を含有する培地：「ＣＡＡまたはＳｏｙｔｏｎｅまたは酵母のみを含有する完全ＣＹ培地」。
【００９４】
液体培地中での増殖
各１００ｍｌの培地を含有する５００ｍｌの非整流振とうフラスコに、１．０ｍＬの有効なストックバイアルを接種する。
【００９５】
振とうフラスコを、（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に、３５＋／−１℃で、１００ｒｐｍにて、５時間、置く。５時間後、攪拌を、２５０ｒｐｍ、４３時間に増加する。
【００９６】
プロセスは、２つの異なる相を有する：１）指数関数的な増殖、および２）産生相。２つの相からの移行は、徐々におこり、そして細胞増殖速度および酸素要求性の減少によって記される。
【００９７】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５ 分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【００９８】
結果
４８時間のインキュベーション後、フラスコ中のＯＤおよびＬｆ／ｍｌは以下のとおりであった：
ＣＡＡを含有する培地 ＯＤ＝７．５ Ｌｆ／ｍｌ＝５０
Ｓｏｙｔｏｎｅを含有する培地 ＯＤ＝７．８７ Ｌｆ／ｍｌ＝６０
ＹＥのみを含有する培地 ＯＤ＝８．０７ Ｌｆ／ｍｌ＝６０。
【００９９】
実施例ＩＶ
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、非運動性のグラム陰性球菌であり、最もしばしば、対で増殖するが、必要に応じて、四分子およびクラスターで増殖する。
これらは、血清群についての基準である抗食作用性の多糖カプセルを有する。
【０１００】
材料および方法
細菌株
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．Ｃ１１。
【０１０１】
培地および補充物
培地の調製は、以下のような異なる溶液の使用を含む：
「Ｆｒａｎｚ培地」調製。
【０１０２】
接種振とうフラスコ培地調製
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １．６ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ １５．５ｇ
ＫＣｌ ０．０９ｇ
ＮＨ４Ｃｌ １．２５ｇ
精製水 １リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝７．６について必要とされるように。
【０１０３】
上述の成分を混合しながら溶解する。１２１℃で、３０分間、オートクレーブすることによって、滅菌する。冷却後、「５０％グルコース」および「Ｍｅｎ Ｃ補充物」を、以下のように添加する。
【０１０４】
「５０％グルコース」 １０ｍＬ／Ｌ＋／−０．３ｍＬ
「Ｍｅｎ Ｃ発酵補充物」 ２０ｍＬ／Ｌ＋／−０．３ｍＬ
グルコースおよび補充物溶液の添加を伴って、培地は「Ｆｒａｎｚ完全培地」と呼ばれ得る。
【０１０５】
２０Ｌ発酵器の調製
Ａ．ＣＡＡを含有する２０ＬのＷａｔｓｏｎベース培地を作製するために、以下の成分が、混合容器に導入され、そして溶解されなければならない。
【０１０６】
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １ｇ＋／−０．０１ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ３．２５ｇ＋／−０．０３ｇ
ＫＣｌ ０．０９ｇ＋／−０．００１ｇ
カザミノ酸 １０ｇ＋／−０．１ｇ
精製水 １リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝７．６に必要なだけ。
【０１０７】
Ａ．Ａ Ａｍｉｓｏｙを含有する２０ＬのＷａｔｓｏｎベース培地を作製するために、以下の成分が、混合容器に導入され、そして溶解されなければならない。
【０１０８】
成分 １リットル当たりの量
精製水 ８００ｍＬ
グルタミン酸 １ｇ＋／−０．０１ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ３．２５ｇ＋／−０．０３ｇ
ＫＣｌ ０．０９ｇ＋／−０．００１ｇ
Ａｍｉｓｏｙ １０ｇ＋／−０．１ｇ
精製水 １リットルに十分な量
３Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ＝７．６に必要なだけ。
【０１０９】
Ｂ．発酵器滅菌
２５分間、１２１℃で発酵器を滅菌する。滅菌後、以下の条件を設定する：温度、３５℃；１０Ｌ／分での通気；１５０ｒｐｍでの攪拌、および０．２バールでの背圧。発酵器を３５℃に冷却した後、ｐＨを測定するためのサンプルを採取し、発酵器のｐＨプローブ校正を調整し、次いで、培地のｐＨを７．６に調整する。
【０１１０】
Ｃ．滅菌後の調整
１．「５０％グルコース」を添加する １０ｍｌ／Ｌ
２．「Ｍｅｎ Ｃ補充物」を添加する ２０ｍｌ／Ｌ
上述の１＋２を含有する培地：「Ｗａｔｓｏｎ完全培地」。
【０１１１】
Ａ．「５０％グルコース」溶液
成分 １リットル当たりの量
グルコース（無水物） ５００ｇ＋／−５ｇ
精製水 １リットルに十分な量
この溶液を、１２１℃で３０分間、オートクレーブすることによって滅菌する。
【０１１２】
Ｂ．「Ｍｅｎ Ｃ補充物」溶液
Ｂ．１限外濾過されたＹＥ
成分 量
精製水 １Ｌに十分な量
酵母抽出物 １２５ｇ／Ｌ
この溶液を、１０ｋＤ ＴＦＦ装置を介して限外濾過する。
【０１１３】
保持物を、必要な透過物が回収された後に廃棄し、そして透過物を補充物を含有する容器に添加する。
【０１１４】
Ｂ．２
成分 ＵＦ ＹＥの１リットル当たりの量
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ３０ｇ＋／−０．５ｇ
Ｌ−システイン−ＨＣｌ １．５ｇ＋／−０．２ｇ
１ＬのＵＦ ＹＥに化学物質を添加し、１０分間混合し、０．２ミクロンフィルターを介して濾過滅菌し、そして発酵器に移す。
【０１１５】
Ｃ．３Ｎ ＮａＯＨ
３Ｎ ＮａＯＨ＝１２％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ＝１２０ｇ／Ｌ ＮａＯＨ。
【０１１６】
Ｄ．泡止め剤
使用する泡止め剤は、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ１５１０である。これを、１２１℃で３０分間、オートクレーブすることによって滅菌する。
【０１１７】
液体培地中での増殖
５００ミリリットルフラスコに、１．０ｍＬの有効なストックバイアルを接種する。振とうフラスコは、１５０ｍＬの完全「Ｆｒａｎｚ培地」を含む。
【０１１８】
接種した振とうフラスコを、３５＋／−１℃で１５０ｒｐｍの（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置く。１０時間後、フラスコを、無菌にサンプリングする。光学密度は、（５９０ｎｍで）１．３〜３．３の間にあるべきであり、その場合、４つの２Ｌ振とうフラスコに、それぞれ、１５０ｍＬ振とうフラスコからの適切な容量を接種する。
【０１１９】
各２Ｌ振とうフラスコは、０．２Ｌの暖める前の「Ｆｒａｎｚ完全培地」を含む。
【０１２０】
振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、２００ｒｐｍの（１インチの偏心距離）インキュベーター−振とう器に置く。１０時間後、各振とうフラスコの内容物を、滅菌接種に移し、そして発酵器に接種する。
【０１２１】
培養容器および増殖条件
バッチ発酵を、２０Ｌの培地を含有する３０リットルのバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ＡＧ、８６２０ Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、ＣＨ）中で行った。
【０１２２】
培養物は、３５℃および１４×１０３Ｎ／ｍ２（２ｐｓｉ）背圧で増殖していた。ｐＨを、３Ｎ ＮａＯＨで７．３に制御した。最初の攪拌速度を、最小の１５０ｒｐｍに設定し、そして最低通気を、１０Ｌ／分に設定した。ＤＯＴを、１５０〜４００の範囲にｒｐｍを制御し、次いで、必要であれば、酸素を補充することによって３５％に維持した。泡止め剤を、泡立ちを制御するために手動で添加した。グルコースの残余の濃度を検出し、そしてこれが約２ｇ／Ｌであった場合、０．２リットルのグルコース溶液を添加した。
【０１２３】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３５分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【０１２４】
ＭｅｎＣ ＰＳの分析
多糖の定量的評価を、Ｌａｒｓ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍによって、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（１９５７）、２１、６１０において報告された方法に従って、シアル酸含量を分析することによって行った。
【０１２５】
結果
Ａｍｉｓｏｙを用いて得られた増殖曲線、およびカザミノ酸を用いて得られた増殖曲線を、図８において比較する。ＭｅｎＣ ＰＳの収量は、Ａｍｉｓｏｙおよびカザミノ酸を含有する培地において、それぞれ、３０７ｍｇ／Ｌおよび３４５ｍｇ／Ｌであった。増殖曲線およびＰＳ産生は、２つの培地を使用してかなり類似する。
【０１２６】
本発明が、例示の手段としてのみ上記され、そしてび改変が、添付の請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内でなされる得ることが理解される。
【０１２７】
実施例Ｖ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉは、２μｍ長、および０．３〜０．５μｍ幅である細長い桿菌である。これはしばしば、より長い微細線維様の細胞の形態で存在する。胞子が形成される場合、この桿菌は、特徴的なドラムスティックの外見をとる。これは、運動性の生物体であり、グラム陽性であるが、そのグラム染色は、変化し得るか、または老化した培養物においては陰性でさえある。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉは、厳密に嫌気性であり、そして２つの外毒素を生成する。これらのうちの１つの、テタノスパスミン（ｔｅｔａｎｏ ｓｐａｓｍｉｎ）は、疾患の臨床像全体を担う神経毒である。
【０１２８】
材料および方法
細菌株
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｈａｒｖａｒｙ Ｙ−ＶＩ−３。
【０１２９】
培地
種培養物を、ｇ／Ｌで表わされる、以下に報告される培地を使用して調製した。
【０１３０】
成分 量ｇ／Ｌ
Ｎ−Ｚ Ｓｏｙ １５．０
グルコース ５．５
酵母抽出物 ５．０
ＮａＣｌ ２．５
Ｌ−システイン ０．５
ナトリウムチオグリコール酸 ０．５
寒天 ０．７５
ＰＨ＝７．１。
産生培地を、ＷＨＯ／ＶＳＱ／ＧＥＮ／９４（１９９０）において記載されるＭｕｅｌｌｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒ培地の改変として調製した。この培地においては、ウシ心臓注入液およびカゼイン溶液が使用されているが、ｇ／Ｌで表わされる、以下に報告される改変培地においては、ウシ心臓注入液およびカゼイン溶液の代わりにＨｙｓｏｙおよびＳｏｙｔｏｎｅを使用した：
成分 量ｇ／Ｌ
グルコース−Ｈ２Ｏ １２．１
ＮａＣｌ ２．５
Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ ２．５
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１５
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１５
アミノ酸溶液 １７．５ｍｌ
ビタミン溶液 ４．２ｍｌ
ＮａＯＨ ５Ｍ ４．０ｍｌ
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ（１％溶液） ４．０ｍｌ
Ｓｏｙ誘導体 ２０．０
ＰＨ＝７．３
１２０℃で２０分間、オートクレーブすることによって滅菌する。
【０１３１】
アミノ酸溶液
成分
Ｌ−チロシン ２８．５１ｇ／Ｌ
ウラシル ０．１４２ｇ／Ｌ
Ｌ−システイン １４．２５ｇ／Ｌ
ＨＣｌ ３７％ １３１．６ｍｌ／Ｌ。
【０１３２】
ビタミン溶液：
成分
パントテン酸Ｃａ
（Ｃａ ｐａｎｔｉｔｈｅｎａｔｅ） ２３８．１ｍｇ／Ｌ
チアミン ５９．７ｍｇ／Ｌ
ピリドキシン ５９．７ｍｇ／Ｌ
リボフラビン ５９．７ｍｇ／Ｌ
ビオチン ０．７３ｍｇ／Ｌ
エタノール ２５６．４ｍｌ／Ｌ。
【０１３３】
液体培地中での増殖
１５ｍｌの種培地を含有する、２つの２５ｍｌチューブに、０．５ｍｌの有効な種バイアルのそれぞれを接種し、そして３５℃で、２９時間、嫌気性ジャーにおいてインキュベートし、ここでは、Ｇａｓ生成キット（ＯＸＯＩＤ）を使用した。第２の一連のチューブに、１．５ｍｌの第１のチューブを接種し、そして上記の同じ条件で、２４時間、インキュベートした。
【０１３４】
これらの培養物の７ｍｌを使用して、７５ｍｌの同じ培地を含有する１００ｍｌチューブに接種した。これらのチューブを、上記と同じ条件で、２４時間、インキュベートした。
【０１３５】
これらのチューブの全内容物を使用して、２５００ｍｌの産生培地を含有する５０００ｍｌビーカーに接種した。
【０１３６】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【０１３７】
結果
１８６時間のインキュベーション後、ビーカー中のＯＤおよびＬｆ／ｍｌは以下のとおりであった：
Ｈｙｓｏｙを含有する培地 ＯＤ＝１．０８ Ｌｆ／ｍｌ＝６０
Ｓｏｙｔｏｎｅを含有する培地 ＯＤ＝０．７４ Ｌｆ／ｍｌ＝６０
ウシ心臓注入液および
カゼイン溶液を含有する培地 ＯＤ＝１．２３６ Ｌｆ／ｍｌ＝６０。
【０１３８】
実施例ＶＩ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、約０．５μｍの直径および０．５〜２μｍの長さのグラム陰性球状桿菌である。その栄養要求性は、単純であり、そしてこれは、糖を必要としない。これは、脂肪酸に極めて感受性であり、防御因子がないと生存は不十分である。
【０１３９】
材料および方法
細菌株
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ９Ｋ／１２９Ｇ（Ｐｉｚｚａ，Ｍ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、４９７−５００）。
【０１４０】
培地
種培養物および産生培養物を、ｇ／Ｌで表わされる、以下に報告されるＣＬ培地（Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ａ．ら（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４１（３）、１１３８−１１４３）を使用して調製した：
成分 量ｇ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム １０．７
Ｌ−プロリン ０．２４
ＮａＣｌ ２．５
ＫＨ２ＰＯ４ ０．５
ＫＣｌ ０．２
ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ ０．１
ＣａＣｌ２ ０．０２
Ｔｒｉｓ ６．１
Ｌ−システイン＊ ０．０４
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ＊ ０．０１
ナイアシン＊ ０．００４
還元型グルタチオン＊ ０．１５
アスコルビン酸＊ ０．４
カザミノ酸 １０．０
ジメチル−Ｂ−シクロデキストリン １．０
ＰＨを、ＨＣｌで７．６に調整する
＊濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブした培地に無菌的に添加する。改変培地は、カザミノ酸の代わりに１０ｇ／ｌのＮ−Ｚ Ｓｏｙを含んだ。
【０１４１】
液体培地中での増殖
各１００ｍｌのＣＬ培地または改変培地を含有する５００ｍｌの非整流振とうフラスコに、３．０ｍＬの有効なストックバイアルを接種した。
【０１４２】
振とうフラスコを、３５＋／−１℃で、１００ＲＰＭにて、１２時間、（１”の偏心距離）インキュベーター−振とう器に置いた。１２時間後、攪拌を、さらに１６時間、２５０ＲＰＭに増加した。
【０１４３】
バイオマス測定
増殖を、水ブランク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ分光光度計）、１ｃｍの光路に対する５９０ｎｍでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。
【０１４４】
ＰＴの分析
この分析を、ＥＬＩＳＡ（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ，Ｌ．ら（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８、１３０６−１３１５）によって行った。
【０１４５】
結果
２８時間のインキュベーション後、フラスコ中のＯＤおよびＰＴ（ｍｇ／Ｌ）は、以下のとおりであった：
ＣＡＡを含有する培地 ＯＤ＝２．３１ ＰＴ＝２．４ｍｇ／Ｌ
ＮＺ−Ｓｏｙを含有する培地 ＯＤ＝１．９９ ＰＴ＝２．２５ｍｇ／Ｌ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−５４９５（Ｐ２０１２−５４９５Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７９０９５（Ｐ２０１１−１７９０９５）
【出願日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【分割の表示】特願２００８−１０１７８８（Ｐ２００８−１０１７８８）の分割
【原出願日】平成１０年５月２８日（１９９８．５．２８）
【出願人】（５９２２４３７９３）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【分割の表示】特願２００８−１０１７８８（Ｐ２００８−１０１７８８）の分割
【原出願日】平成１０年５月２８日（１９９８．５．２８）
【出願人】（５９２２４３７９３）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (107)
【Ｆターム（参考）】
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