アレルギー性疾患の疾患マーカーおよびその利用
【課題】喘息を始めとするアレルギー疾患のための確実かつ容易な診断ツール、および特に喀痰の分泌や上皮細胞のリモデリングを調節可能な薬剤の開発に寄与する手段の提供。
【解決手段】アンフィレギュリン遺伝子の連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー、アンフィレギュリンを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー、前記疾患マーカーを用いるアレルギー性疾患の診断方法、およびアンフィレギュリンの発現または機能を抑制する物質のスクリーニング方法。
【解決手段】アンフィレギュリン遺伝子の連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー、アンフィレギュリンを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー、前記疾患マーカーを用いるアレルギー性疾患の診断方法、およびアンフィレギュリンの発現または機能を抑制する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性疾患の疾患マーカーおよびその利用に関する。詳しくは、喘息の喀痰検査等の診断に適するマーカーおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息は、可逆的な気流の閉塞や気道の過剰反応を生理学的特徴とする。杯状（Goblet）細胞過形成は、軽症、中程度、および重症の喘息の病理的特徴として確立されている。杯状細胞数の異常には、蓄積され分泌されるムチン（粘素）の変化が伴う。粘液の過剰分泌は、特に喘息発作重積状態において顕著な特徴であることが多い。粘液の過剰分泌があるということは、１秒間の努力呼出気量（ＦＥＶ１：１秒量）が有意に大きく低下することと関連している。現在、グルココルチコイドの局所適用が気管支喘息の第一選択治療として広く認識されている。ステロイドを用いる治療は、動物モデルにおいてアレルゲンで誘導される杯状細胞過形成の発症を防止することが報告されているけれども、一旦杯状細胞過形成が確立されてしまうと効果が低下する。さらに、ヒトにおいては、グルココルチコイド等のコルチコステロイドを用いる治療は、病理学的にも臨床的にも、組織のリモデリングと粘液の産生との関係においては概ね効果がない。粘液の過剰分泌は、喘息患者の病的状態と死に至ることの重要な原因であり、現在では特効的な治療がないことから、さらなる治療標的および治療戦略が緊急に必要とされている。
【０００３】
過剰な喀痰分泌を伴う疾患として、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および感染による気管支炎などが知られている。ＣＯＰＤの一部の患者に喘息の合併はあるが、胸部画像所見や臨床症状によりＣＯＰＤと喘息の鑑別は可能である。感染の合併のない喘息患者およびＣＯＰＤ患者は、粘着性で弾力があって白色の喀痰を伴う。他方、感染性の気管支炎では、黄色っぽい喀痰を生じることが多い。このような観点から、喀痰の性状に基づく定性的な検査によって喘息に感染を合併しているかどうかを判別しているのが現状である。喘息患者の３０％は慢性的に喀痰を有し、７０％は喀痰が発作中の重大な症状であることが示されているが、喘息に特徴的な指標に基づく喀痰の検査方法は確立されていない。
【０００４】
実験レベルにおいては、アレルゲンで感作し暴露した動物は顕著な杯状細胞過形成を発症する（非特許文献１、２）。マウスにおけるアレルゲンで誘導された杯状細胞過形成の根底にある病因論は、おそらくムチン遺伝子（例、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子等）の発現のアップレギュレーションによって、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−９を含む様々なメディエーター、上皮成長因子（ＥＧＦ）系、disintegrinおよびメタロプロテアーゼファミリー、ならびにｇｏｂ−５(ヒトではｈＣＬＣＡ１)などのイオンチャンネルが関与すると思われる。主なエフェクター細胞は、ＣＤ４＋リンパ球のＴｈ２サブタイプであると思われる。しかしながら、アレルゲンでチャレンジしたＩｇＥ高アフィニティー受容体（ＦｃεＲＩ）ノックアウトマウスは、対照と比較すると、気道の炎症および杯状細胞過形成がいずれも少なく、肺のホモジネート中のＩＬ−１３のレベルが低かった（非特許文献３）。さらに、ヒト気道上皮細胞培養系では、ＩＬ−４でもＩＬ−１３でもなくＩＬ−９のみがムチン遺伝子の発現を上昇させた（非特許文献４）。
【０００５】
肥満細胞は、喘息に導きうる即時型の炎症性アレルギー反応において中枢の役割を果たす。肥満細胞上のＦｃεＲＩを架橋させると、脱顆粒、アラキドン酸代謝物のde novoの合成および種々のサイトカイン／ケモカインの産生に導くシグナル伝達経路を活性化する。本発明者らは、ヒト肥満細胞はＦｃεＲＩが介在する特異的遺伝子の１つとしてepiregulinを発現することを報告した（非特許文献５）。EpiregulinはＥＧＦファミリーのメンバーであり、ＥＧＦファミリーは、ＥＧＦ、アンフィレギュリン（amphiregulin：ＡＲＥＧ)、ヘパリン結合性ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、betacellulin、 epiregulinおよび neuregulinからなる。
【０００６】
ＡＲＥＧは、12-ο-テトラデカノイルホルボール-13-アセテートで処理したＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞のならし培地から最初に精製された（非特許文献６）。ＡＲＥＧ分子のカルボキシ末端側は、ＥＧＦに特徴的なホモロジーを示し、それゆえにＥＧＦファミリーのメンバーとして分類しうるものである。ＡＲＥＧは、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αと同様に、細胞増殖、細胞生存および細胞分化に重要な役割を果たしている。ＡＲＥＧは、プロテアーゼ切断により最終的に放出される分泌型タンパク質の特徴をもった膜貫通型前駆体として合成される。in vitroでは、肥満細胞で産生されたＡＲＥＧのレベルは、上皮細胞で産生されたレベルよりも高いことが報告されている（非特許文献７）。
【非特許文献１】Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 674-679
【非特許文献２】Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 627-635
【非特許文献３】J Immunol 2004; 172: 6398-6406
【非特許文献４】J Clin Invest 1999; 104: 1375-1382
【非特許文献５】Blood 2003; 102: 2547-2554
【非特許文献６】Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85: 6528-6532
【非特許文献７】Am J Respir Cell Mol Biol 2004; 30: 470-478
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、喘息を始めとするアレルギー疾患のための確実かつ容易な診断ツール、および特に喀痰の分泌や上皮細胞のリモデリングを調節可能な薬剤の開発に寄与する手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト肥満細胞はＦｃεＲＩの凝集の後に杯状細胞過形成を誘導する分子を産生すること、およびこれらの分子の発現はグルココルチコイドによって阻害されないという仮説を立てた。本発明者らは、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイを用いてＦｃεＲＩが介在する遺伝子発現プロファイルを調べ、ヒト肥満細胞でＦｃεＲＩが介在する遺伝子発現におけるグルココルチコイドの効果に依存するクラスタリング分析を行った。本発明者らは、デキサメタゾンではその発現が阻害されなかったクラスター遺伝子の中で、リモデリングに関連する分子を見出し、さらに、ヒト血中単核球、好酸球および好中球の遺伝子発現プロファイルとの比較により肥満細胞特異的分子を選択した。このように選択されたアンフィレギュリン遺伝子は、ＦｃεＲＩの凝集によりアップレギュレートするがデキサメタゾンでの前処理によりダウンレギュレートしない遺伝子のサブセットに含まれるものであった。
【０００９】
本発明者らは、in vitroおよび in vivoでヒト上皮細胞でのムチン遺伝子発現におけるアンフィレギュリンの作用を調べた結果、アンフィレギュリンの発現と抗原感作による疾患との密接な関係を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【００１０】
〔１〕 アンフィレギュリン遺伝子の連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
〔２〕 前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブまたはプライマーとして使用される上記〔１〕記載の疾患マーカー。
〔３〕 前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される上記〔１〕または〔２〕に記載の疾患マーカー。
〔４〕 下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリン遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔５〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと上記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔６〕 工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる、上記〔５〕に記載の診断方法。
〔７〕 アンフィレギュリンを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
〔８〕 前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブとして使用される上記〔７〕記載の疾患マーカー。
〔９〕 前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される上記〔７〕または〔８〕に記載の疾患マーカー。
〔１０〕 下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリンの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔１１〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むアレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と上記〔７〕〜〔９〕いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、および
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔１２〕 工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる上記〔１１〕記載のアレルギー性疾患の診断方法。
〔１３〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンの発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質とアンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
〔１４〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させたアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を抑制する被験物質を選択する工程。
〔１５〕 アレルギー性疾患の治療剤の有効成分を探索するための方法である、上記〔１３〕または〔１４〕に記載のスクリーニング方法。
〔１６〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、喀痰分泌を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質およびアンフィレギュリンと、ムチンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、喀痰分泌を抑制する被験物質を選択する工程。
〔１７〕 前記喀痰分泌がアレルギー性疾患に伴うものである、上記〔１６〕に記載のスクリーニング方法。
〔１８〕 アンフィレギュリンに結合する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の治療剤。
〔１９〕 アンフィレギュリンの発現量またはＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
〔２０〕 前記物質がアンフィレギュリンに対する抗体もしくはドミナントネガティブ変異体または当該抗体もしくはドミナントネガティブ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである上記〔１９〕に記載の治療剤。
〔２１〕 喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである上記〔１８〕〜〔２０〕のいずれかに記載の治療剤。
〔２２〕 アンフィレギュリン遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
〔２３〕 前記物質が、アンフィレギュリン遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡである上記〔２２〕に記載の治療剤。
〔２４〕 喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである上記〔２２〕または〔２３〕に記載の治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の疾患マーカーによると、喘息、アトピーおよびアレルギー性鼻炎等のアレルギー性疾患の指標を提供することが可能となり、当該疾患の容易かつ的確な診断をすることができる。本発明のアレルギー性疾患の診断方法によると、肥満細胞特異的に発現するアンフィレギュリンの作用との関連性が明確になり、喀痰の分泌や上皮細胞のリモデリングに関する診断等が可能となる。本発明のスクリーニング方法によると、アンフィレギュリンの作用機序に基づく新規なアレルギー性疾患の治療剤の開発が可能となる。本発明の治療剤によると、アンフィレギュリンの作用を特異的に調節することができ、副作用の少ないアレルギー性疾患の治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１３】
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(ＤＮＡ)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列（配列番号：１）で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログ、スプライスバリアントなど）、変異体および誘導体）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」としては、具体的には、後述のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：１で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。
【００１４】
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１５】
本明細書において「アンフィレギュリン遺伝子」または「アンフィレギュリンのＤＮＡ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定塩基配列（配列番号１）で示されるヒトアンフィレギュリン遺伝子（ＤＮＡ）や、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:１に記載のヒトアンフィレギュリン遺伝子（GenBank Accession No. NM_001657）や、そのマウスホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_009704）、ラットホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_017123）などが包含される。
【００１６】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２）で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「アンフィレギュリンタンパク質」または単に「アンフィレギュリン（以下、ＡＲＥＧと略することもある）」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２）で示されるヒトアンフィレギュリンやその同族体、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２（GenBank Accession No. NM_001657）に記載のアミノ酸配列を有するヒトアンフィレギュリンや、そのマウスホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_009704）、ラットホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_017123）などが包含される。
【００１８】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１９】
本明細書において「疾患マーカー」とは、アレルギー性疾患の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、またアレルギー性疾患の予防、治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、アレルギー性疾患の罹患に関連して生体内、特に気管支粘膜上皮細胞または肥満細胞において、発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子およびタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００２０】
本明細書において診断対象となる「生体組織」とは、抗原刺激によるアレルギー性疾患に伴い本発明のアンフィレギュリン遺伝子が発現上昇する組織または細胞をいう。具体的には、気管支粘膜上皮細胞、肥満細胞、好酸球などがあげられる。
【００２１】
本明細書において「アレルギー疾患」とは、抗原刺激により発症する疾患をいい、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーなどがあげられる。好ましくは、アンフィレギュリン遺伝子の発現上昇によって粘液の分泌過剰やリモデリングの亢進が関与する喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎であり、より好ましくはステロイド耐性の喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎である。
【００２２】
本発明の疾患マーカーは、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有することを特徴とするものである。
【００２３】
具体的には、本発明の疾患マーカーは、配列番号1に記載のアンフィレギュリン遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有するものを挙げることができる。
【００２４】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体またはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００２５】
ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００２６】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００２７】
本発明のアレルギー性疾患の疾患マーカーは、具体的には、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。またこれらアンフィレギュリン遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２８】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、アンフィレギュリン遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法においては、アンフィレギュリン遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００２９】
本発明の疾患マーカーは、例えば配列番号１に記載のヒトアンフィレギュリン遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）またはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、もしくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００３０】
本発明の疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００３１】
本発明疾患マーカーをアレルギー性疾患の検出においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
【００３２】
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダーゼーション法などの特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によってアレルギー性疾患におけるアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
【００３３】
本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリン遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【００３４】
例えば、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと本発明疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【００３５】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、具体的には、本発明の診断方法は、本発明の疾患マーカーをプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などにより前記疾患マーカーへのＲＮＡまたはその転写物の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００３６】
測定対象の生体試料としては、使用する検出手段の種類に応じて、被験者の生体組織の一部（気管支粘膜、鼻粘膜、胃粘膜など）をバイオプシ（生検）等で採取するか、または体液中（血液、痰、鼻汁、胃液など）に存在する細胞を回収して得られた検体から常法に従って調製したtotal ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００３７】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中のアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された疾患マーカー（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（ＲＩもしくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、Alk Phos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブＤＮＡ）を標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中のアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のアンフィレギュリン遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００３９】
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、例えば、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製し、ビオチンで標識されたｃＲＮＡとハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、蛍光標識されたアビジンで検出する方法を挙げることができる。
【００４０】
In situハイブリダイゼーション法を利用する場合は、前述の被験者の生体組織を生検によって採取し、切片を調製する。本発明の疾患マーカー遺伝子の特異的アンチセンスプローブまたはセンスプローブを作製する。前記プローブは、ＲＩ標識または非ＲＩ標識（例えば、ＤＩＧ標識）でラベリングする。前記切片を脱パラフィン（パラフィン切片の場合）および前処理した後、エタノール等で固定する。固定した切片をプレハイブリダイズし、前記プローブとハイブリダイズした後、洗浄およびＲＮａｓｅ処理を行い、標識に応じた検出方法（例えば、ＲＩ標識の場合は現像、非ＲＩ標識の場合は免疫学的検出と検鏡）により生体組織におけるアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。
【００４１】
本発明の診断方法において、前記工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われることが好ましい。
【００４２】
前記アレルギー性疾患が喘息の場合、好ましい診断として、喀痰検査による喘息とその他の気管支炎との区別があげられる。この場合、その他の気管支炎由来の喀痰と比較して、喘息患者由来の喀痰では本発明の疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、高い結合量の場合は喘息の可能性が高いと判断し、低い結合量の場合は気管支炎の可能性が高いと判断することができる。
【００４３】
別の態様として、本発明の疾患マーカーは、アンフィレギュリンを認識する抗体を含有することを特徴とするものである。
【００４４】
前記抗体は、被験者の生体試料におけるアンフィレギュリンタンパク質の有無またはその程度を検出することによって、該被験者がアレルギー性疾患に罹患しているか否かまたはその程度を測定することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
【００４５】
また前記抗体は、後述するアレルギー性疾患の症状の予防、予想において、アンフィレギュリンタンパク質の発現変動を検出するためのツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００４６】
前記抗体は、その形態に特に制限はなく、アンフィレギュリンタンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子に基づいて作製されたキメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントであってもよい。
【００４７】
これらの抗体の製造方法は公知であり、前記抗体も常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したアンフィレギュリンタンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したアンフィレギュリンタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００４８】
抗体の作製に免疫抗原として使用されるアンフィレギュリンタンパク質は、本発明等により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１等）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【００４９】
具体的には、アンフィレギュリンタンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これらアンフィレギュリンタンパク質の部分ペプチドは、本発明等により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号２等）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００５０】
本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリンの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【００５１】
１つの態様において、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、本発明の疾患マーカーを用いることを特徴とする。前記疾患マーカーは、アンフィレギュリンタンパク質に特異的に結合する性質を有することから、動物の組織内に発現した前記アンフィレギュリンタンパク質を特異的に検出することができる。
【００５２】
例えば、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程(ａ)、(ｂ)および(ｃ)を含む方法によって実施することができる：
(ａ)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と本発明の疾患マーカー（抗体）とを結合させる工程、
(ｂ)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(ｃ)上記(ｂ)の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の罹患を判断する工程。
【００５３】
測定対象物としてタンパク質を利用する場合、具体的には、本発明の診断方法は、本発明の疾患マーカー（抗体）をプローブとして用いて、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、免疫組織染色法などの検出手段により前記疾患マーカーへのタンパク質の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００５４】
測定対象試料としては、使用する検出手段の種類に応じて、被験者の組織の一部（気管支粘膜、鼻粘膜、胃粘膜など）をバイオプシ等で採取するか、または体液中（血液、痰、鼻汁、胃液など）に存在する細胞等を回収して得られた検体から常法に従って調製したタンパク質または体液中に溶解しているタンパク質を用いることができる。
【００５５】
より具体的には、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、本発明の疾患マーカー（抗体）を用いて、ウェスタンブロット法などにより当該マーカーへのアンフィレギュリンタンパク質の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００５６】
ウェスタンブロット法を利用する場合は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した二次抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
【００５７】
免疫組織染色法を利用する場合は、後述する実施例４に記載の方法に準じて、例えば、アンフィレギュリン陽性細胞を酵素標識抗体とその発色基質を用いて測定することができる。
【００５８】
アレルギー性疾患の診断は、例えば、喀痰検査の場合、被験者の喀痰中のアンフィレギュリン遺伝子の発現レベル、またはアンフィレギュリンタンパク質の量、機能もしくは活性（以下これらを合わせて「タンパク質レベル」ということがある）を、対照の喀痰中の当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質レベルと比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。組織のリモデリングの診断の場合、アンフィレギュリンの発現量と杯状細胞の過形成の程度の間に統計的有意な相関があることから、被験者の喀痰中のアンフィレギュリン濃度（タンパク質量）を、対照および同一被験者の経時的、喀痰中の当該タンパク質と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
【００５９】
前記「リモデリング」とは、炎症を起こした部分が傷跡を残さず全く元どおりに再生することを完全修復というのに対し、前記部分が線維質に置き換わり（瘢痕）、傷跡を残して再生すること、すなわち、不完全修復（リモデリング）をいう。
【００６０】
この場合、対照として正常な組織から採取調製した生体試料（ＲＮＡまたはタンパク質を含む試料）が必要であるが、これらはアレルギー性疾患に罹患していない人の組織の一部をバイオプシ等で採取するか、体液中に存在する細胞等を回収して得られた検体から常法に従って調製したタンパク質または体液中に溶解しているタンパク質を用いることができる。なお、ここでいう「アレルギー性疾患に罹患していない人」とは、少なくともアレルギー性疾患の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法の結果が、例えば、ＩｇＥ（ＲＡＳＴ）値正常、各種特異的ＩｇＥ（ＲＩＳＴ）値正常、プリックテスト陰性であり、アレルギー性疾患でないと診断された人をいう。なお、当該「アレルギー性疾患に罹患していない人」を、本明細書では単に正常者という場合もある。
【００６１】
被験者の組織と正常な組織との遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたアンフィレギュリン遺伝子の発現レベル、もしくはアンフィレギュリンタンパク質レベルの平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベルもしくはタンパク質の量として、比較に用いることができる。
【００６２】
被験者が、アレルギー性疾患であるかどうかの判断は、該被験者の組織中のアンフィレギュリン遺伝子の発現レベル、またはアンフィレギュリンタンパク質レベルが、正常者のそれらのレベルと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。被験者の上記遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルが、正常者におけるレベルに比べて多ければ、該被験者はアレルギー性疾患であると判断できるか、該疾患の罹患が疑われる。前記発現レベルまたはタンパク質レベルと重症度との関係は、当該レベルが高いほど重症度が高いと判断することができる。また、被験者がステロイド等の薬剤により一見症状が治まっているような場合でも組織のリモデリングが起きている可能性があるが、このような場合においても、リモデリングが疑われる組織における当該レベルの高低を比較することにより、リモデリングの存否を判断することができる。
【００６３】
本発明のアンフィレギュリンの発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とアンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量と比較する工程、
（ｃ）前記(ｂ)の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００６４】
工程（ａ）において、被験物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
【００６５】
工程（ａ）において、アンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞としては、内在性および外来性を問わずアンフィレギュリンを発現する培養細胞全般、レポーター遺伝子を含む細胞などを挙げることができる。培養細胞においてこれら遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
【００６６】
具体的には、例えば、アレルギー性疾患の動物より単離、調製した肥満細胞またはその細胞株；本発明遺伝子のいずれかを導入した細胞；レポーター（ルシフェラーゼ、ＧＦＰ等）遺伝子を導入した細胞等を挙げることができる。
【００６７】
前記動物モデルとしては、アレルギー性疾患の動物モデルとして周知である如何なる動物モデルをも用いることができ、具体的には、アルブミン感作マウス喘息モデルなどをあげることができる。
【００６８】
前記遺伝子導入用の細胞としては、ＣＨＯ、ＭＣＦ−７Mammary carcinoma cell、Ｈ２９５Ｒ adrenal cellなどをあげることができる。
【００６９】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞と培養培地中で接触される。前記細胞としては、肥満細胞の細胞膜上のＦｃεＲＩをＩｇＥにより架橋させ、さらに抗ＩｇＥ抗体で刺激した細胞が好ましく用いられ得る。前記培養培地は、アンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００７０】
工程（ｂ）において、発現量の測定は、ｍＲＮＡまたはタンパク質を対象として行なわれる。ｍＲＮＡの発現量は、例えば、細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどにより測定される。タンパク質の発現量は、例えば、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法などを用いることができる。また、レポーター遺伝子を含む細胞（例、アンフィレギュリンのプロモーターの下流に機能可能にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）が連結されたベクターが導入された細胞）が用いられた場合、発現量は、レポーター遺伝子のシグナル強度に基づき測定される。
【００７１】
工程（ｂ）において、発現量の比較は、被験物質の存在下、非存在下において、アンフィレギュリンの発現量における有意差の有無に基づいて行なわれる。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００７２】
工程（ｃ）において、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質が選択される。このように選択された被験物質には、本スクリーニング方法の性質上、アンフィレギュリンの発現量を変動させ得る物質をも含まれる。選択された被験物質は、アレルギー性疾患の治療剤（例えば、喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤）の候補のみならず、免疫調節剤または研究用試薬としても有用である。
【００７３】
また、本発明のアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
(ａ) 被験物質と、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させたアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を抑制する被験物質を選択する工程。
【００７４】
工程（ａ）において、被験物質としては、前記したとおりである。
【００７５】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体と接触される。工程（ａ）において、接触方法は特に限定されるものではないが、例えば、２５〜３７℃の生理条件下でアンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体を所定の濃度で混合し、被験物質を添加する方法、ＥＧＦ受容体を固相に固定し、被験物質の存在下アンフィレギュリンと結合させる方法、あるいはアンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体を発現する細胞の培養液に被験物質を添加する方法などがあげられる。
【００７６】
工程（ｂ）において、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合活性は、以下の例にあげるような方法で測定できる。
b-1）抗アンフィレギュリン抗体または抗ＥＧＦ受容体抗体を用いて免疫沈降し、免疫沈降で使用しなかった抗体でウェスタンブロッティングを行い、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合量を測定する方法。
b-2）アンフィレギュリンまたはＥＧＦ受容体のいずれか一方を、ポリヒスチジンもしくはＧＳＴなどの標識との融合タンパク質として発現させ、またはビオチン化させ、ポリヒスチジンはニッケルに、ＧＳＴはグルタチオンに、ビオチンはアビジンに結合することから、それらを利用して結合体を回収し、b-1）と同様のウェスタンブロッティングで結合量を測定する方法。
b-3）表面プラズモン共鳴法（ビアコア）。
b-4）蛍光標識したアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体発現細胞への結合をフローサイトメーターで測定する方法。
【００７７】
工程（ｂ）において、結合活性の比較は、例えば、被験物質の存在下、非存在下において、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合量の有意差の有無に基づいて行なわれる。
【００７８】
工程（ｃ）において、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を減少させる被験物質が選択される。選択された被験物質は、アレルギー性疾患の治療剤（例えば、喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤）の候補のみならず、免疫調節剤または研究用試薬としても有用である。
【００７９】
また、本発明の喀痰分泌を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
(ａ)被験物質およびアンフィレギュリンと、ムチンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、喀痰分泌を抑制する被験物質を選択する工程。
【００８０】
工程（ａ）において、被験物質としては、前記したとおりである。
【００８１】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンとともにムチンの発現を測定可能な細胞と接触される。ここで、ムチンとは、気管、胃腸などの消化管、生殖腺などの内腔を覆う粘液の主要な糖タンパク質をいいい、本発明においては、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ６などがあげられ、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣが好ましい。「ムチンの発現を測定可能な細胞」としては、内在性および外来性を問わずムチンを発現する培養細胞全般、レポーター遺伝子を含む細胞などを挙げることができる。培養細胞においてこれら遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
【００８２】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンとともにムチンの発現を測定可能な細胞と培養培地中で接触される。前記培養培地は、ムチンの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００８３】
工程（ｂ）において、発現量の測定は、ｍＲＮＡまたはタンパク質を対象として行なわれる。ｍＲＮＡの発現量は、例えば、細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどにより測定される。タンパク質の発現量は、例えば、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法などを用いることができる。また、レポーター遺伝子を含む細胞（例、ムチン遺伝子のプロモーターの下流に機能可能にレポーター（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）遺伝子が連結されたベクターが導入された細胞）が用いられた場合、発現量は、レポーター遺伝子のシグナル強度に基づき測定される。
【００８４】
工程（ｂ）において、発現量の比較は、被験物質の存在下、非存在下において、ムチンの発現量における有意差の有無に基づいて行なわれる。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００８５】
工程（ｃ）において、アンフィレギュリンの発現を介したムチンの発現量を減少させる被験物質が選択される。このように選択された被験物質には、本スクリーニング方法の性質上、ムチンの発現量を変動させ得る物質をも含まれる。選択された被験物質は、アレルギー性疾患の治療剤（例えば、喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤）の候補のみならず、免疫調節剤または研究用試薬としても有用である。
【００８６】
本発明の疾患マーカーのうち、上記抗体を含有する疾患マーカーは、動物に適用することによって、アレルギー性疾患の状態の変動を予防または治療することができ、本発明はかかる方法を提供する。上記抗体の中でも、特に、中和抗体、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合を阻害し得る抗体が好ましい。
【００８７】
前記動物は、ヒトおよびヒトを除く脊椎動物であることが好ましく、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ネコ等の家畜または愛玩動物が好ましい。
【００８８】
本発明は、前記疾患マーカーの量または活性を低減させる物質を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療剤を提供する。
【００８９】
本発明の治療剤は、アンフィレギュリンの量または活性を低減させるものであれば特に制限されるものではなく、アンフィレギュリンまたはＥＧＦ受容体に特異的に結合する各種化合物を有効成分として含有するものがあげられる。
【００９０】
前記化合物としては、前記各種抗体、公知の受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例、AG1478、gefitinib(ZD1839)）、抗ＥＧＦ受容体抗体などがあげられ、好ましくはアンフィレギュリンに対する中和抗体もしくはドミナントネガティブ変異体、または抗ＥＧＦ受容体抗体である。ここで、「ドミナントネガティブ変異体」とは、アンフィレギュリンに対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。当該ドミナントネガティブ変異体は、天然のアンフィレギュリンと競合することで間接的にその活性を阻害することができる。アンフィレギュリンのドミナントネガティブ変異体は、アンフィレギュリンに変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、Ｎ末端領域における１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加などが挙げられる。
【００９１】
本発明の治療剤は、アレルギー性疾患の治療剤、好ましくは喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤として用いられる。
【００９２】
本発明の治療剤は、前記有効成分そのままであってもよく、公知の薬学的に許容される担体などを含んでもよい。前記担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００９３】
別の態様として、本発明の治療剤は、アンフィレギュリン遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有するものである。
【００９４】
前記物質は、アンフィレギュリン遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【００９５】
「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。
【００９６】
「リボザイム」とは、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。
【００９７】
「デコイ核酸」とは、転写調節因子が結合する領域を模倣する核酸分子をいい、アンフィレギュリンの発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、アンフィレギュリンに対する転写活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子であり得る。本発明では、デコイ核酸としては、リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、又はリン酸ジエステル結合を電荷を持たないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチドなど、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチドなどが含まれる。デコイ核酸は転写活性化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、アンフィレギュリンに対する転写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよい。デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されない。また、デコイ核酸は、同一領域を反復して含んでいてもよい。
【００９８】
「ｓｉＲＮＡ」とは、アンフィレギュリンｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡである。ｓｉＲＮＡを細胞に導入することによって、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象が起こり、前記リボザイムと同様の効果が期待される。
【００９９】
前記アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、およびｓｉＲＮＡは、公知の方法にしたがって作製することができる。
【実施例】
【０１００】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【０１０１】
[サイトカインおよび抗体]
組換え（ｒ）ヒト（ｈ）ＩＬ−３は、Intergen社より購入した。ｒｈＩＬ−６およびｒｈＳＣＦは、Pepro Tech EC社より購入した。ｒｈＡＲＥＧ、ｒｈＥＧＦおよびマウス抗ヒトＡＲＥＧモノクローナル抗体（ｍＡＧ）は、Genzyme Techne社より購入した。マウス抗ヒトtryptase ｍＡｂ（クローンＡＡ１）は、Dako社より購入した。
【０１０２】
[臍帯血（ＣＢ）由来肥満細胞および成人末梢血（ＰＢ）由来肥満細胞の生成]
本研究におけるすべてのヒト検体は、文書によるインフォームドコンセントをもって提供され、本研究は、各病院の倫理検討委員会により承認された。ヒトＣＢ単核球（以下、単核球をＭＮＣと省略する場合がある）およびＰＢ単核球を、Ficoll-Isopaque（Nycomed社）を用いた密度勾配遠心分離により単離した。直系血統でない単核球をＣＢ単核球およびＰＢ単核球から選択した後、無血清のIscoveメチルセルロース培地（Stem Cell Technologies社）およびIscove改変Dulbecco培地（SCF 200 ng/mL, IL-6 50ng/mL, IL-3 1ng/mL含有）で培養した（Blood 2003; 102: 2547-2554）。培養４２日目に、メチルセルロースをＰＢＳに溶解して細胞を再懸濁し、２％ＦＣＳを補足したIscove改変Dulbecco培地（SCF 100 ng/mL, IL-6 50ng/mL含有）で培養した。
【０１０３】
[白血球の精製]
顆粒球および単核球を、正常ボランティアの静脈血から分離した。好酸球を、Percoll(1.090 g/mL)密度遠心分離により単離した後、抗ＣＤ１６結合マイクロ磁気ビーズを用いたネガティブセレクションによりさらに精製した（Blood 1995; 86: 1437-1443）。このネガティブセレクションの後、好中球をPercoll(1.085 g/mL)密度遠心分離により単離した。単離した好中球は、混在する好酸球を除去するために抗ＣＤ８１抗体を用いたネガティブセレクションによりさらに精製した。
【０１０４】
［ヒト肥満細胞の活性化］
ヒト肥満細胞表面のＦｃεＲＩの凝集による活性化のため、肥満細胞を、３７℃で２４時間、１μｇ／ｍＬのヒト骨髄腫ＩｇＥ（CosmoBio社）で最初に感作した。洗浄後、前記細胞を、３７℃で所定の時間、ウサギ抗ヒトＩｇＥ Ａｂ（Dako社）または培地のみでチャレンジした。ＩｇＥ介在遺伝子発現プロファイルおよび肥満細胞によるＡＲＥＧの産生におけるデキサメタゾン（Pepro Tech EC社；グルココルチコイド）の作用を調べるため、肥満細胞を、活性化の２４時間前に１０-6 Ｍのデキサメタゾンで前処理した。すべての条件において、細胞をＳＣＦおよびＩＬ−６を含む完全Iscove改変Dulbecco培地に懸濁した。１０-6 Ｍのデキサメタゾン、および／またはＩｇＥ／抗ＩｇＥでの肥満細胞の処理は、細胞の生存能または細胞数を有意に変化させないことを確認した。
【０１０５】
［患者］
日本アレルギー学会の基準に基づいて、喘息症状の段階および症状の頻度を組み合わせて、疾患の重症度を規定した４０名の患者と、喘息をもたない６名の正常対照を研究した（表１）。現在も喫煙している患者はいなかった。また、過去２年間喫煙していた患者もいなかった。検査に先立つ１月間に、気管支または呼吸器を感染した患者もいなかった。本研究は、獨協医科大学の倫理委員会により承認され、すべての患者は、インフォームドコンセントを文書で同意した。各喘息患者および正常対照における基底膜の総厚は、既報にしたがって評価した（Chest 1997; 111: 852-857）。気道の過敏性は、アセチルコリンが段階的に増加する濃度で連続吸入中に呼気耐性が増加し始める時点のアセチルコリンの最小累積用量として測定した。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
［気管支のバイオプシ］
喘息患者の組織試料は、既報（Chest 1997; 111: 852-857）に従って、光ファイバーの気管支鏡検査中に標準ピンセットを用いて、右下葉気管支と中央下葉気管支との間の竜骨下（subcarina）（右Ｂ６気管支の起点）から採取した。各バイオプシ検体を直ちにＯＣＴ培地中に入れ、液体窒素中で瞬時に凍結し、クリオスタットでの切片の作製時まで−８０℃で保存した。
【０１０８】
[統計学的解析]
対になった２つの群間の偏差は、片側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定により解析し、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。値は、平均±ＳＥＭで表す。
【０１０９】
［参考例１］
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲおよびジーンチップ発現解析
全細胞ＲＮＡを、RNeasy Mini Kits(Qiagen)を用いて製造業者の仕様書に従って、肥満細胞から単離した。１０6個の肥満細胞当たりのＲＮＡの収量は、２．４（２．０−２．８）μｇ（メジアンとレンジ、ｎ＝６）であった。等量のＲＮＡ（５０ｎｇ）をＲＴ-ＰＣＲ解析に用いた。ＰＣＲは、サーモサイクラー中、下記条件：
９４℃で１分の後、４０増幅サイクル（９４℃で１分；６０℃で３０秒；７２℃で２分）
で行った。ＡＲＥＧに対するプライマーの配列は、
5’プライマー：5’-AGAGTTGAACAGGTAGTTAAGCCCC-3’（配列番号３）および
3’プライマー：5’-GTCGAAGTTTCTTTCGTTCCTCAG-3’（配列番号４）であった。等量のＰＣＲ増幅産物を臭化エチジウムで可視化した。ＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡを陽性対照として検出した。ｃＤＮＡなしのＰＣＲは、コンタミネーションを除外するために行った。
【０１１０】
次に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のGeneAmp 7900 シークエンス検出システム（Applied Biosystems）を用いて、MUC2およびMUC5AC ｍＲＮＡの発現を測定した。全細胞ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの合成は、前述のように行った。ＰＣＲは、TaqMan Universal PCR Master Mix Kit（Applied Biosystems）および蛍光プローブ（Applied Biosystems）を用いて製造業者のプロトコールに従って行った。MUC5AC検出のために使用したプライマーの配列は、
forward: 5’-TCAACGGAGACTGCGAGTACAC-3’（配列番号５）
reverse: 5’-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3’（配列番号６）であり、ＦＡＭレポーターダイ−標識ハイブリダイゼーションプローブ：5’-FAM-ACTCCTTTCCTGTTGTCACCGAGAACGTC-TAMRA-3’（配列番号７）であった。MUC2検出のために使用したプライマーの配列は、
forward: 5’-GCCCTGGCTTCGAACTCAT-3’（配列番号８）
reverse: 5’-TCTTCGGGTCGCTCTTGAA-3’（配列番号９）であり、ＦＡＭレポーターダイ−標識ハイブリダイゼーションプローブ：5’-FAM-CACTGTATCATCAAACGGCCCGACAA-TAMRA-3’（配列番号１０）であった。標的ｍＲＮＡのレベルと逆に相関する閾値サイクルＣｔは、レポーター蛍光放出が増幅曲線に沿って対数増殖期の中点を越えて増加したときのサイクル数として定義した。相対発現レベルは、サイクル閾値と競合Ｃｔ法を用いて決定し、共増幅するハウスキーピング遺伝子レベル、２倍増幅／サイクル率および対照試料の参照発現レベルを調整した。
【０１１１】
ジーンチップ発現解析
ヒトゲノムワイドの遺伝子発現は、約23000の全長遺伝子および発現配列タグ（ＥＳＴ）に対するオリゴヌクレオチドプローブセットを含むHuman Genome U95A およびU133Aプローブアレイ（GeneChip, Affymetrix社）を用いて、製造業者のプロトコール（Expresion Analysis Technical Mannual）および既報に従って調べた。約１０７個の細胞から全ＲＮＡ（３−１０μｇ）を抽出した。二本鎖ｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡを、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸の存在下でin vitroの転写に付した。ビオチン化ｃＲＮＡを４５℃で１６時間プローブアレイとハイブリダイズし、ハイブリダイズしたビオチン化ｃＲＮＡをストレプトアビジン−ＰＥ（Phycoerythrin）で染色した後、Hewlett-Packard Gene Array Scannerで走査した。各プローブの蛍光強度は、コンピュータープログラムGeneChip Analysis Suite 5.0 (Affymetrix社）を用いて定量した。一本鎖ｍＲＮＡの発現レベルは、25マーのオリゴヌクレオチドからなる１１対の（完全マッチおよびシングルヌクレオチドミスマッチ）プローブにより得られた強度の中で平均蛍光強度として決定した。ミスマッチプローブの強度が非常に高い場合、GeneChip Analysis Suite 5.0 プログラムで高い平均蛍光が得られたとしても、遺伝子発現は存在しないと判定した。遺伝子発現のレベルは、GeneChipソフトウエアを用いて、平均偏差（ＡＤ）として決定した。次いで、ハウスキーピング遺伝子（β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ）の６つのプローブセットの平均ＡＤレベルに対する特異的ＡＤレベルの割合を計算した。
【０１１２】
さらに、GeneSpring ソフトウエア version 6 (Silicon Genetics)を用いて、データ解析を行った。チップ間の染色強度の変化を正規化するために、与えられたチップ上のすべての遺伝子に対するＡＤ値をそのチップ上のすべての測定値のメジアンで除した。バックグランドノイズのレンジ内の変化を除外し、最も差異的に発現した遺伝子を選択するため、生のデータ値が１００ＡＤを超え、遺伝子発現がAffymetrixデータ解析により存在すると判定された場合にのみそのデータを使用した。標準相関との階層的なクラスタリング解析を用いて、遺伝子のクラスタを同定した。特定の試料を相互に正規化した、すなわち、試料を対照試料のメジアンに対して正規化した。これらの特定試料中の各遺伝子に対する各測定値は、対応する対照試料におけるその遺伝子の測定値のメジアンで除した。分割比を０．５に設定した。０以下の正規値は、０に設定した。データは、
(i)少なくとも２倍（活性化プログラム）の発現変化および
(ii) 増加した遺伝子発現が少なくとも１つ存在するcall(Affymetrix アルゴリズム)を含む場合、データを有意とみなした。アップレギュレート遺伝子またはダウンレギュレート遺伝子として分類する限定は、正規化した値に適用した。
【０１１３】
以下の基準に基づいて遺伝子の発現レベルを比較することにより、肥満細胞特異的転写物を同定した。
・ 肥満細胞における各遺伝子の平均発現レベルが他の細胞型の最高レベルよりも５倍以上大きい。
・ ３個または４個の独立した実験で、非存在または限界callが１以下である。
・ 標準偏差が平均値未満である。
・ 異なるプローブセットにより得られた多数の転写物が同一のGenebankまたはUnigene accession numberを有する場合、最も高い発現レベルを示す転写物を表中に選択する。
【０１１４】
[結果]
ヒト肥満細胞でデキサメタゾンにより制御される遺伝子発現のクラスタリング解析
ＦｃεＲＩの凝集によりアップレギュレートするがデキサメタゾンでの前処理によりダウンレギュレートしない遺伝子を同定するために、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイ（GeneChip）を用いてヒト肥満細胞における遺伝子発現プロファイルを探査した。本発明者らは、前記遺伝子を下記４つのセットに分けた。
セットＩ：下記遺伝子を含む
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に少なくとも２倍（活性化プログラム）変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍未満まで低下する（図１、Ｉ）。
セットII：下記遺伝子を含む
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に少なくとも２倍（活性化プログラム）変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍以上変化する（図１、II）。
セットIII：下記遺伝子からなる
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に２倍未満変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍未満まで変化する（図１、III）。
セットIV：下記遺伝子を含む
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に２倍未満変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍以上変化する（図１、IV）。
【０１１５】
さらに、ヒト末梢血単核球、好酸球および好中球の遺伝子発現プロファイルとの比較に基づいて、肥満細胞特異的遺伝子を選択した。上述のように、肥満細胞における発現レベルがヒト末梢血単核球、好酸球および好中球の最大発現レベルよりも少なくとも５倍高い場合に、そのデータを肥満細胞特異的とみなした。このようにして、２４個の遺伝子をセットＩの肥満細胞特異的であると同定した。これらの遺伝子は、サイトカイン（ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ）およびケモカイン（ＭＣＰ−１およびＩ−３０９）等のＮＦ−κＢ経路のメンバーであった（表２)。セットIIに同定された１７個の肥満細胞特異的遺伝子は、ＡＲＥＧ、ならびにα１−（Ｅ）カテニンという接着分子を含む（表３）。セットIIIにおいて、２２個の遺伝子を肥満細胞特異的と同定し、それらの遺伝子にはカテプシンＧ、キマーゼおよびメタロプロテアーゼを含んでいた。最後に、セットIVにおいて、２３６個の遺伝子を肥満細胞特異的遺伝子として選択した。これらの遺伝子は、トリプターゼ、主要塩基性タンパク質、ＰＧＤ２シンターゼ、およびc-kitを含む。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
脚注：MC1(2)c:未処理対照肥満細胞、MC1(2)a:抗IgE刺激肥満細胞、MC1(2)d:抗IgEおよびデキサメタゾンで処理した細胞、Eo:好酸球、MNC:単核球、Ne:好酸球、specif:肥満細胞特異性（他の白血球に対する比）、CCL:CC-ケモカインリガンド、CXCL: CXC-ケモカインリガンド。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
脚注：MC1(2)c:未処理対照肥満細胞、MC1(2)a:抗IgE刺激肥満細胞、MC1(2)d:抗IgEおよびデキサメタゾンで処理した細胞、Eo:好酸球、MNC:単核球、Ne:好酸球、specif:肥満細胞特異性（他の白血球に対する比）。
【０１２０】
ＡＲＥＧは、ＥＧＦファミリーのサイトカインであるので、本発明者らは、肥満細胞特異的遺伝子の中でも、ＦｃεＲＩの凝集によりアップレギュレートするがデキサメタゾン前処理によりダウンレギュレートしないＡＲＥＧに焦点を当てた。
【０１２１】
ＡＲＥＧに焦点を当てた理由は、以下のとおりである。
(i) ＡＲＥＧは、マウスにおいて肺の分枝の形態形成の過程に関与していること、
(ii) 後述する実施例に示すように、ＡＲＥＧは、粘膜上皮ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞においてＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡをＥＧＦと同程度に誘導したこと、
(iii)ＡＲＥＧは、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼによるＡＲＥＧの放出を通してＮＣＩ−Ｈ２９２細胞でのムチン発現を増加させたこと、および
(iv) ＡＲＥＧは、ＥＧＦと異なり、肥満細胞特異性が高く発現しているので、アレルギー症状を制御可能な分子標的として優れていること。
【０１２２】
［実施例１］
ヒト肥満細胞におけるＡＲＥＧ発現の解析
肥満細胞を骨髄腫ＩｇＥで感作し、洗浄し、次いで１．５μｇ／ｍＬの抗ＩｇＥで、または抗体なしで２４時間チャレンジした後、培養上清を回収した。細胞が密になるまで増殖し、培地中の血清が枯渇したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（American Type Culture Collection: ATCC）を、１０μｇ／ｍｌの抗ＡＲＥＧ中和抗体またはイソ型対照ｍＩｇＧ１で２０分間処理した後、前記肥満細胞の培養上清を添加した。また、前記培養上清中のヒトＡＲＥＧを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Systems）を用いて、当該キットに添付されたプロトコールに従って測定した。ヒトＡＲＥＧのアッセイの感度は、５ｐｇ／ｍＬであった。
【０１２３】
[結果]
ＡＲＥＧ ｍＲＮＡは、ＩｇＥまたは抗ＩｇＥ活性化肥満細胞で明確に検出された（図２Ａ）。ＡＲＥＧ ｍＲＮＡは、ＦｃεＲＩ凝集後の肥満細胞のデキサメタゾン前処理によりアップレギュレートするように見受けられた（図２Ａ）。ＡＲＥＧの分泌を検証するために、ＥＬＩＳＡキットを用いて活性化された肥満細胞の培養上清を調べ、ＡＲＥＧの存在を確認した。デキサメタゾン前処理は、ＡＲＥＧのＩｇＥ介在放出をアップレギュレートするように思われるが、有意ではなかった（図２Ｂ）。図２Ｃは、ＦｃεＲＩ凝集後の肥満細胞によるＡＲＥＧ産生の経時変化を示す。ＡＲＥＧ産生は、ＦｃεＲＩ架橋後少なくとも３６時間まで増加し続けた。デキサメタゾン単独では、培地単独の場合とほぼ同様の結果であった。ＡＲＥＧ産生は、ＦｃεＲＩ架橋後３６時間肥満細胞のデキサメタゾン前処理によりアップレギュレートすることが示唆された（図２Ｃ）。ＡＲＥＧは、濃度依存的様式で抗ＩｇＥにより放出された（図２Ｄ）。
【０１２４】
［実施例２］
ＡＲＥＧによるＭＵＣ２およびＭＵＣ５Ａ発現の解析
実施例１で処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５Ａの発現を定量リアルタイムＰＣＲにより解析した。
【０１２５】
[結果]
図３Ａおよび３Ｂに示すように、ＡＲＥＧはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において、用量依存的にＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現を増加させた。１０ｎｇ／ｍｌでは、ＡＲＥＧは、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現をそれぞれ３倍および１３倍増加させた。ＡＲＥＧで誘導されたＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣの発現増加は、ＥＧＦにより誘導されたものとほぼ同じだった。
【０１２６】
［実施例３］
活性化肥満細胞培養上清によるＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現の増加
密に増殖させて血清を枯渇させたＮＣＩ−２９２細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＡＲＥＧ中和抗体または１μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１とともに前処理した後、刺激していない肥満細胞由来の培養上清（Unsti MC SN）または活性化肥満細胞培養上清（Stim MC SN）とともに２４時間インキュベートした。ＮＣＩ−２９２細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣｍＲＮＡの量を決定した。刺激していない肥満細胞培養上清とともにインキュベートした細胞と比較して、活性化された肥満細胞培養上清とともにインキュベートした抗ＡＲＥＧ ｍＡｂまたはｍＩｇＧ１処理細胞のムチンｍＲＮＡレベルの倍数変化（平均±ＳＥＭ）として示す（図４）。
【０１２７】
[結果]
図４Ａおよび４Ｂより、活性化された肥満細胞の培養上清は、ＡＲＥＧが介在するＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現をさらに増加させることがわかる。これらの増加は、ＡＲＥＧに対する中和抗体により有意に阻害された。
【０１２８】
［実施例４］
免疫組織化学
表１に記載の喘息患者および正常被験者由来の呼吸器粘膜の３μｍの連続切片を、ＡＢＣキット（Vector Laboratories）を用いて抗ＡＲＥＧ ｍＡｂおよび抗トリプターゼｍＡｂで染色した。具体的には、スライドを３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間クエンチングして内因性のペルオキシダーゼをブロックし、ＰＢＳ中で洗浄した。切片を一次抗体とともに１時間、次いで、ビオチン化二次抗体とともにインキュベートした後、ＡＢＣ試薬を用いた。発色は、ジアミノベンジジンを基質として用いて行った。スライドをMayerのヘマトキシリンで対比染色した。特異的ブロッキングペプチドと一次抗体とのプレインキュベーションまたは一次抗体の無関係なＩｇＧでの置換を、陰性対照として用いた。ＡＲＥＧ陽性細胞は、３名の別々の観察者によって各試料の少なくとも６つの高倍率の視野で計数した。Hanselの染色（鳥居薬品）を用いて、好酸球を同定した。気道組織切片の連続アルシャンブルー染色および過ヨウ素酸−Schiff染色により、分泌細胞におけるムチンが明確に可視化された。上皮分泌細胞の細胞内ムチン性糖タンパク質は、多様な大きさの紫色の長円板として認識された。
【０１２９】
杯状細胞の分泌応答を解析するために、下記のように、各分泌細胞における粘液の量をランク付けすることにより組織切片から粘性度を決定した。段階１では、染色域の垂直距離は、基底膜から細胞の頂点まで測定した上皮層の１／３以下である。段階２では、染色域の垂直距離は、上皮層の１／３を超える。染色域は、気管の２つの壁に沿って２０個の連続する高倍率視野でランク付けした。各ドナーにおいて、粘液スコアは、ｎ１＋２ｎ２（ｎ１およびｎ２はそれぞれ、段階１および段階２の細胞の総数である）として計算した。各研究者による各試料に与えられた平均スコアを最初に計算し、次いで３名の研究者による各試料に対する平均スコアを計算し、データとして記録した。
【０１３０】
[結果]
喘息患者の気管支肥満細胞におけるＡＲＥＧの発現
ＡＲＥＧ陽性（ＡＲＥＧ＋）細胞を肥満細胞であると同定するために、連続切片を用いて、１つの切片を抗tryptase ｍＡｂで染色し、別の切片を抗ＡＲＥＧ ｍＡｂで染色した。正常対照被験者由来の気管支バイプシ試料は、ＡＲＥＧに対してほとんど免疫反応性を示さなかった。対照的に、喘息患者由来のバイプシ試料は、気管支の肥満細胞において、ＡＲＥＧに対して明確に陽性の免疫反応性を示した（図５Ａ）。次に、tryptase陽性（tryptase＋）細胞におけるＡＲＥＧ＋細胞の数を計数した。ＡＲＥＧ＋肥満細胞の割合は、軽度、中度、および重症の喘息患者において、それぞれ平均３５％、５２．８％および５２％であった。喘息検体および対照検体の気管支粘膜の１ｍｍ２におけるＡＲＥＧ＋細胞の数（ＡＲＥＧ＋細胞／ｍｍ２）を計数した（図５Ｂ）。ＡＲＥＧ＋細胞／ｍｍ２の数は、対照検体に比べて喘息検体で有意に増加していた（Ｐ＜０．０１）。喘息患者および正常被験者の両方の気道上皮細胞は、ＡＲＥＧに対してほとんど免疫反応性を示さなかった。次に、このことを明確にするために、ＡＲＥＧ＋tryptase＋／ｍｍ２の数を計数した（図５Ｃ）。さらに、正常および喘息の肺の試料において、全ＡＲＥＧ＋細胞の中でのＡＲＥＧ＋上皮細胞、好酸球およびその他の割合を計数した。その結果、全ＡＲＥＧ＋細胞の１０％未満が上皮細胞および好酸球であることがわかった（図５Ｄ）。他の細胞は１％未満であった。したがって、ＡＲＥＧ＋細胞の数は、肥満細胞の総数とほぼ同じであった。次に、ＡＲＥＧ＋肥満細胞の数と粘膜スコアとの関係を調べた。その結果、これらの２つの数値の間に有意な相関関係があることが明らかになった（図５Ｅ、Ｐ＜０．００５、ｒ＝０．５４）。このことは、ＡＲＥＧが杯状細胞の過形成を誘導することを示唆するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明によれば、喘息、アトピーおよびアレルギー性鼻炎等のアレルギー性疾患の指標を提供することが可能となり、当該疾患の容易かつ的確な診断をすることができるとともに、アンフィレギュリンの作用機序に基づく新規なアレルギー性疾患の治療剤の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、対照肥満細胞、抗ＩｇＥで刺激した肥満細胞および抗ＩｇＥとデキサメタゾンで刺激した肥満細胞におけるｍＲＮＡ発現レベルを表す図である。ヒト肥満細胞をデキサメタゾンの存在下または非存在下でＩｇＥとともに前培養し、次いで抗ＩｇＥで６時間活性化した。着色したバーの各横列は、１つの遺伝子を表し、各縦列は、１つの刺激を表す。着色バーは、示されたスケールにしたがって各遺伝子の応答の強さを示す。Ｉは、抗ＩｇＥ刺激によりアップレギュレートするが抗ＩｇＥで活性化した後にデキサメタゾンで前処理すると低下した遺伝子のセットを示す。IIは、抗ＩｇＥ刺激によりアップレギュレートするが抗ＩｇＥで活性化した後にデキサメタゾンでの前処理により影響を受けない遺伝子のセットを示す。IIIは、抗ＩｇＥ刺激により影響を受けないが抗ＩｇＥでの活性化の前にデキサメタゾンで処理することによりダウンレギュレートした遺伝子のセットを示す。IVは、抗ＩｇＥ刺激により影響を受けないがデキサメタゾンでの前処理によりアップレギュレートした遺伝子のセットを示す。
【図２】図２は、ヒト肥満細胞によるＡＲＥＧの発現を示す図である。２Ａ：ＦｃεＲＩ介在の活性化によるヒト肥満細胞におけるＡＲＥＧ発現のアップレギュレーション。デキサメタゾンの存在下(＋)または非存在下（−）で前処理したヒト肥満細胞を、ＩｇＥとともに前培養し、次いで１．５μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥで活性化した。ＡＲＥＧおよびＧＡＰＤＨに対する細胞内ｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。２Ｂ：デキサメタゾンの前処理の有(＋)または無（−）で、１．５μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥ刺激後の肥満細胞由来のＡＲＥＧ分泌。２４時間で細胞培養上清を回収し、ＡＲＥＧに対するＥＬＩＳＡを行った（ｎ＝３ドナー）。２Ｃ：デキサメタゾンの前処理の有(ドットを付したバー)または無（黒色のバー）で、抗ＩｇＥ（１．５μｇ／ｍｌ）で刺激したヒト肥満細胞によるＡＲＥＧ産生の経時変化。対照細胞をデキサメタゾンの存在下（斜線入りバー）または非存在下（白色バー）でＩｇＥとともにインキュベートしたが、抗ＩｇＥ処理は除外した。２Ｄ：ヒト肥満細胞による抗ＩｇＥ誘導性ＡＲＥＧ産生の濃度−応答研究。肥満細胞をＩｇＥで前インキュベートし、次いで0.1、0.5、1.5、または5μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥで２４時間活性化した。Ｎ．Ｄ．は検出されないことを意味する。
【図３】図３は、ＮＣＩ−２９２細胞におけるＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ発現に対するＡＲＥＧの影響を表すグラフである。ＮＣＩ−２９２細胞をｒｈＡＲＥＧまたはｒｈＥＧＦとともにインキュベートし、前記細胞から抽出した全ＲＮＡを用いて、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＭＵＣ２（Ａ）およびＭＵＣ５ＡＣ（Ｂ）ｍＲＮＡの量を決定した。結果を、ＡＲＥＧまたはＥＧＦ未処理細胞と比較して、ＡＲＥＧまたはＥＧＦ処理細胞のムチンｍＲＮＡレベルの倍数変化（平均±ＳＥＭ）として示す（ｎ＝３）。*Ｐ＜０．０５、ＡＲＥＧまたはＥＧＦで処理していない細胞との比較。
【図４】図４は、活性化された肥満細胞培養上清がＡＲＥＧが介在するＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現を増加させることを示すグラフである。休止期のＮＣＩ−２９２細胞を、抗ＡＲＥＧ中和抗体またはマウスＩｇＧ１で前処理した後、刺激していない肥満細胞由来の培養上清（Unsti MC SN）または活性化肥満細胞培養上清（Stim MC SN）とともに２４時間インキュベートした。ＮＣＩ−２９２細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＭＵＣ２（Ａ）およびＭＵＣ５ＡＣ（Ｂ）ｍＲＮＡの量を決定した。結果を、刺激していない肥満細胞培養上清とともにインキュベートした細胞と比較して、活性化された肥満細胞培養上清とともにインキュベートした抗ＡＲＥＧ ｍＡｂまたはｍＩｇＧ１処理細胞のムチンｍＲＮＡレベルの倍数変化（平均±ＳＥＭ）として示す（ｎ＝３）。*Ｐ＜０．０５、抗ＡＲＥＧ中和抗体で処理した細胞とｍＩｇＧ１処理した細胞との比較。
【図５】図５は、喘息患者の気道におけるＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数と杯状細胞の過形成の程度との相関を示す図である。５Ａ：tryptase＋肥満細胞におけるＡＲＥＧの共存。喘息患者由来の気管支バイオプシ検体の２つの連続する３μｍの切片をtryptase（左パネル）およびＡＲＥＧ（右パネル）で免疫染色した。５Ｂ：正常対照（Control）および喘息患者(Asthma)の気管支粘膜の１ｍｍ２当たりのＡＲＥＧ＋細胞の数。ＡＲＥＧ＋細胞を、３名の別々の観察者によって各試料の少なくとも６つの高倍率の視野で計数した。**Ｐ＜０．０１、正常対照および喘息患者におけるＡＲＥＧ＋細胞の数間を比較。５Ｃ：正常対照（Control）および喘息患者(Asthma)の気管支粘膜１ｍｍ２当たりのＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数。**Ｐ＜０．０１、正常対照および喘息患者におけるＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数間を比較。５Ｄ：全ＡＲＥＧ＋細胞正常検体（白抜きバー）と喘息患者の肺検体（黒塗りバー）との間のＡＲＥＧ＋上皮細胞および好酸球の割合。*Ｐ＜０．０５、対照被験者および喘息患者におけるＡＲＥＧ＋上皮細胞の割合に対して。５Ｅ：肥満細胞におけるＡＲＥＧの発現と喘息患者における杯状細胞過形成の程度との相関。杯状細胞過形成の程度は、実施例４に記載のように求め、喘息患者の気道におけるＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数との相関を解析した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性疾患の疾患マーカーおよびその利用に関する。詳しくは、喘息の喀痰検査等の診断に適するマーカーおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息は、可逆的な気流の閉塞や気道の過剰反応を生理学的特徴とする。杯状（Goblet）細胞過形成は、軽症、中程度、および重症の喘息の病理的特徴として確立されている。杯状細胞数の異常には、蓄積され分泌されるムチン（粘素）の変化が伴う。粘液の過剰分泌は、特に喘息発作重積状態において顕著な特徴であることが多い。粘液の過剰分泌があるということは、１秒間の努力呼出気量（ＦＥＶ１：１秒量）が有意に大きく低下することと関連している。現在、グルココルチコイドの局所適用が気管支喘息の第一選択治療として広く認識されている。ステロイドを用いる治療は、動物モデルにおいてアレルゲンで誘導される杯状細胞過形成の発症を防止することが報告されているけれども、一旦杯状細胞過形成が確立されてしまうと効果が低下する。さらに、ヒトにおいては、グルココルチコイド等のコルチコステロイドを用いる治療は、病理学的にも臨床的にも、組織のリモデリングと粘液の産生との関係においては概ね効果がない。粘液の過剰分泌は、喘息患者の病的状態と死に至ることの重要な原因であり、現在では特効的な治療がないことから、さらなる治療標的および治療戦略が緊急に必要とされている。
【０００３】
過剰な喀痰分泌を伴う疾患として、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および感染による気管支炎などが知られている。ＣＯＰＤの一部の患者に喘息の合併はあるが、胸部画像所見や臨床症状によりＣＯＰＤと喘息の鑑別は可能である。感染の合併のない喘息患者およびＣＯＰＤ患者は、粘着性で弾力があって白色の喀痰を伴う。他方、感染性の気管支炎では、黄色っぽい喀痰を生じることが多い。このような観点から、喀痰の性状に基づく定性的な検査によって喘息に感染を合併しているかどうかを判別しているのが現状である。喘息患者の３０％は慢性的に喀痰を有し、７０％は喀痰が発作中の重大な症状であることが示されているが、喘息に特徴的な指標に基づく喀痰の検査方法は確立されていない。
【０００４】
実験レベルにおいては、アレルゲンで感作し暴露した動物は顕著な杯状細胞過形成を発症する（非特許文献１、２）。マウスにおけるアレルゲンで誘導された杯状細胞過形成の根底にある病因論は、おそらくムチン遺伝子（例、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子等）の発現のアップレギュレーションによって、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−９を含む様々なメディエーター、上皮成長因子（ＥＧＦ）系、disintegrinおよびメタロプロテアーゼファミリー、ならびにｇｏｂ−５(ヒトではｈＣＬＣＡ１)などのイオンチャンネルが関与すると思われる。主なエフェクター細胞は、ＣＤ４＋リンパ球のＴｈ２サブタイプであると思われる。しかしながら、アレルゲンでチャレンジしたＩｇＥ高アフィニティー受容体（ＦｃεＲＩ）ノックアウトマウスは、対照と比較すると、気道の炎症および杯状細胞過形成がいずれも少なく、肺のホモジネート中のＩＬ−１３のレベルが低かった（非特許文献３）。さらに、ヒト気道上皮細胞培養系では、ＩＬ−４でもＩＬ−１３でもなくＩＬ−９のみがムチン遺伝子の発現を上昇させた（非特許文献４）。
【０００５】
肥満細胞は、喘息に導きうる即時型の炎症性アレルギー反応において中枢の役割を果たす。肥満細胞上のＦｃεＲＩを架橋させると、脱顆粒、アラキドン酸代謝物のde novoの合成および種々のサイトカイン／ケモカインの産生に導くシグナル伝達経路を活性化する。本発明者らは、ヒト肥満細胞はＦｃεＲＩが介在する特異的遺伝子の１つとしてepiregulinを発現することを報告した（非特許文献５）。EpiregulinはＥＧＦファミリーのメンバーであり、ＥＧＦファミリーは、ＥＧＦ、アンフィレギュリン（amphiregulin：ＡＲＥＧ)、ヘパリン結合性ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、betacellulin、 epiregulinおよび neuregulinからなる。
【０００６】
ＡＲＥＧは、12-ο-テトラデカノイルホルボール-13-アセテートで処理したＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞のならし培地から最初に精製された（非特許文献６）。ＡＲＥＧ分子のカルボキシ末端側は、ＥＧＦに特徴的なホモロジーを示し、それゆえにＥＧＦファミリーのメンバーとして分類しうるものである。ＡＲＥＧは、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αと同様に、細胞増殖、細胞生存および細胞分化に重要な役割を果たしている。ＡＲＥＧは、プロテアーゼ切断により最終的に放出される分泌型タンパク質の特徴をもった膜貫通型前駆体として合成される。in vitroでは、肥満細胞で産生されたＡＲＥＧのレベルは、上皮細胞で産生されたレベルよりも高いことが報告されている（非特許文献７）。
【非特許文献１】Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 674-679
【非特許文献２】Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 627-635
【非特許文献３】J Immunol 2004; 172: 6398-6406
【非特許文献４】J Clin Invest 1999; 104: 1375-1382
【非特許文献５】Blood 2003; 102: 2547-2554
【非特許文献６】Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85: 6528-6532
【非特許文献７】Am J Respir Cell Mol Biol 2004; 30: 470-478
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、喘息を始めとするアレルギー疾患のための確実かつ容易な診断ツール、および特に喀痰の分泌や上皮細胞のリモデリングを調節可能な薬剤の開発に寄与する手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト肥満細胞はＦｃεＲＩの凝集の後に杯状細胞過形成を誘導する分子を産生すること、およびこれらの分子の発現はグルココルチコイドによって阻害されないという仮説を立てた。本発明者らは、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイを用いてＦｃεＲＩが介在する遺伝子発現プロファイルを調べ、ヒト肥満細胞でＦｃεＲＩが介在する遺伝子発現におけるグルココルチコイドの効果に依存するクラスタリング分析を行った。本発明者らは、デキサメタゾンではその発現が阻害されなかったクラスター遺伝子の中で、リモデリングに関連する分子を見出し、さらに、ヒト血中単核球、好酸球および好中球の遺伝子発現プロファイルとの比較により肥満細胞特異的分子を選択した。このように選択されたアンフィレギュリン遺伝子は、ＦｃεＲＩの凝集によりアップレギュレートするがデキサメタゾンでの前処理によりダウンレギュレートしない遺伝子のサブセットに含まれるものであった。
【０００９】
本発明者らは、in vitroおよび in vivoでヒト上皮細胞でのムチン遺伝子発現におけるアンフィレギュリンの作用を調べた結果、アンフィレギュリンの発現と抗原感作による疾患との密接な関係を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【００１０】
〔１〕 アンフィレギュリン遺伝子の連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
〔２〕 前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブまたはプライマーとして使用される上記〔１〕記載の疾患マーカー。
〔３〕 前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される上記〔１〕または〔２〕に記載の疾患マーカー。
〔４〕 下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリン遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔５〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと上記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔６〕 工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる、上記〔５〕に記載の診断方法。
〔７〕 アンフィレギュリンを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
〔８〕 前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブとして使用される上記〔７〕記載の疾患マーカー。
〔９〕 前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される上記〔７〕または〔８〕に記載の疾患マーカー。
〔１０〕 下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリンの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔１１〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むアレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と上記〔７〕〜〔９〕いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、および
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
〔１２〕 工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる上記〔１１〕記載のアレルギー性疾患の診断方法。
〔１３〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンの発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質とアンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
〔１４〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させたアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を抑制する被験物質を選択する工程。
〔１５〕 アレルギー性疾患の治療剤の有効成分を探索するための方法である、上記〔１３〕または〔１４〕に記載のスクリーニング方法。
〔１６〕 下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、喀痰分泌を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質およびアンフィレギュリンと、ムチンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、喀痰分泌を抑制する被験物質を選択する工程。
〔１７〕 前記喀痰分泌がアレルギー性疾患に伴うものである、上記〔１６〕に記載のスクリーニング方法。
〔１８〕 アンフィレギュリンに結合する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の治療剤。
〔１９〕 アンフィレギュリンの発現量またはＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
〔２０〕 前記物質がアンフィレギュリンに対する抗体もしくはドミナントネガティブ変異体または当該抗体もしくはドミナントネガティブ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである上記〔１９〕に記載の治療剤。
〔２１〕 喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである上記〔１８〕〜〔２０〕のいずれかに記載の治療剤。
〔２２〕 アンフィレギュリン遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
〔２３〕 前記物質が、アンフィレギュリン遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡである上記〔２２〕に記載の治療剤。
〔２４〕 喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである上記〔２２〕または〔２３〕に記載の治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の疾患マーカーによると、喘息、アトピーおよびアレルギー性鼻炎等のアレルギー性疾患の指標を提供することが可能となり、当該疾患の容易かつ的確な診断をすることができる。本発明のアレルギー性疾患の診断方法によると、肥満細胞特異的に発現するアンフィレギュリンの作用との関連性が明確になり、喀痰の分泌や上皮細胞のリモデリングに関する診断等が可能となる。本発明のスクリーニング方法によると、アンフィレギュリンの作用機序に基づく新規なアレルギー性疾患の治療剤の開発が可能となる。本発明の治療剤によると、アンフィレギュリンの作用を特異的に調節することができ、副作用の少ないアレルギー性疾患の治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１３】
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(ＤＮＡ)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列（配列番号：１）で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログ、スプライスバリアントなど）、変異体および誘導体）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」としては、具体的には、後述のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：１で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。
【００１４】
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１５】
本明細書において「アンフィレギュリン遺伝子」または「アンフィレギュリンのＤＮＡ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定塩基配列（配列番号１）で示されるヒトアンフィレギュリン遺伝子（ＤＮＡ）や、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:１に記載のヒトアンフィレギュリン遺伝子（GenBank Accession No. NM_001657）や、そのマウスホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_009704）、ラットホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_017123）などが包含される。
【００１６】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２）で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「アンフィレギュリンタンパク質」または単に「アンフィレギュリン（以下、ＡＲＥＧと略することもある）」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２）で示されるヒトアンフィレギュリンやその同族体、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２（GenBank Accession No. NM_001657）に記載のアミノ酸配列を有するヒトアンフィレギュリンや、そのマウスホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_009704）、ラットホモログ（例えば、GenBank Accession No. NM_017123）などが包含される。
【００１８】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１９】
本明細書において「疾患マーカー」とは、アレルギー性疾患の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、またアレルギー性疾患の予防、治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、アレルギー性疾患の罹患に関連して生体内、特に気管支粘膜上皮細胞または肥満細胞において、発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子およびタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００２０】
本明細書において診断対象となる「生体組織」とは、抗原刺激によるアレルギー性疾患に伴い本発明のアンフィレギュリン遺伝子が発現上昇する組織または細胞をいう。具体的には、気管支粘膜上皮細胞、肥満細胞、好酸球などがあげられる。
【００２１】
本明細書において「アレルギー疾患」とは、抗原刺激により発症する疾患をいい、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーなどがあげられる。好ましくは、アンフィレギュリン遺伝子の発現上昇によって粘液の分泌過剰やリモデリングの亢進が関与する喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎であり、より好ましくはステロイド耐性の喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎である。
【００２２】
本発明の疾患マーカーは、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有することを特徴とするものである。
【００２３】
具体的には、本発明の疾患マーカーは、配列番号1に記載のアンフィレギュリン遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有するものを挙げることができる。
【００２４】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体またはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００２５】
ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００２６】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００２７】
本発明のアレルギー性疾患の疾患マーカーは、具体的には、前記アンフィレギュリン遺伝子の塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。またこれらアンフィレギュリン遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２８】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、アンフィレギュリン遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法においては、アンフィレギュリン遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００２９】
本発明の疾患マーカーは、例えば配列番号１に記載のヒトアンフィレギュリン遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）またはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、もしくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００３０】
本発明の疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００３１】
本発明疾患マーカーをアレルギー性疾患の検出においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
【００３２】
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダーゼーション法などの特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によってアレルギー性疾患におけるアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
【００３３】
本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリン遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【００３４】
例えば、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと本発明疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【００３５】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、具体的には、本発明の診断方法は、本発明の疾患マーカーをプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などにより前記疾患マーカーへのＲＮＡまたはその転写物の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００３６】
測定対象の生体試料としては、使用する検出手段の種類に応じて、被験者の生体組織の一部（気管支粘膜、鼻粘膜、胃粘膜など）をバイオプシ（生検）等で採取するか、または体液中（血液、痰、鼻汁、胃液など）に存在する細胞を回収して得られた検体から常法に従って調製したtotal ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００３７】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中のアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された疾患マーカー（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（ＲＩもしくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、Alk Phos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブＤＮＡ）を標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中のアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のアンフィレギュリン遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００３９】
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、例えば、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製し、ビオチンで標識されたｃＲＮＡとハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、蛍光標識されたアビジンで検出する方法を挙げることができる。
【００４０】
In situハイブリダイゼーション法を利用する場合は、前述の被験者の生体組織を生検によって採取し、切片を調製する。本発明の疾患マーカー遺伝子の特異的アンチセンスプローブまたはセンスプローブを作製する。前記プローブは、ＲＩ標識または非ＲＩ標識（例えば、ＤＩＧ標識）でラベリングする。前記切片を脱パラフィン（パラフィン切片の場合）および前処理した後、エタノール等で固定する。固定した切片をプレハイブリダイズし、前記プローブとハイブリダイズした後、洗浄およびＲＮａｓｅ処理を行い、標識に応じた検出方法（例えば、ＲＩ標識の場合は現像、非ＲＩ標識の場合は免疫学的検出と検鏡）により生体組織におけるアンフィレギュリン遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。
【００４１】
本発明の診断方法において、前記工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われることが好ましい。
【００４２】
前記アレルギー性疾患が喘息の場合、好ましい診断として、喀痰検査による喘息とその他の気管支炎との区別があげられる。この場合、その他の気管支炎由来の喀痰と比較して、喘息患者由来の喀痰では本発明の疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、高い結合量の場合は喘息の可能性が高いと判断し、低い結合量の場合は気管支炎の可能性が高いと判断することができる。
【００４３】
別の態様として、本発明の疾患マーカーは、アンフィレギュリンを認識する抗体を含有することを特徴とするものである。
【００４４】
前記抗体は、被験者の生体試料におけるアンフィレギュリンタンパク質の有無またはその程度を検出することによって、該被験者がアレルギー性疾患に罹患しているか否かまたはその程度を測定することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
【００４５】
また前記抗体は、後述するアレルギー性疾患の症状の予防、予想において、アンフィレギュリンタンパク質の発現変動を検出するためのツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００４６】
前記抗体は、その形態に特に制限はなく、アンフィレギュリンタンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子に基づいて作製されたキメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントであってもよい。
【００４７】
これらの抗体の製造方法は公知であり、前記抗体も常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したアンフィレギュリンタンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したアンフィレギュリンタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００４８】
抗体の作製に免疫抗原として使用されるアンフィレギュリンタンパク質は、本発明等により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１等）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【００４９】
具体的には、アンフィレギュリンタンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これらアンフィレギュリンタンパク質の部分ペプチドは、本発明等により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号２等）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００５０】
本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリンの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【００５１】
１つの態様において、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、本発明の疾患マーカーを用いることを特徴とする。前記疾患マーカーは、アンフィレギュリンタンパク質に特異的に結合する性質を有することから、動物の組織内に発現した前記アンフィレギュリンタンパク質を特異的に検出することができる。
【００５２】
例えば、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、下記の工程(ａ)、(ｂ)および(ｃ)を含む方法によって実施することができる：
(ａ)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と本発明の疾患マーカー（抗体）とを結合させる工程、
(ｂ)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(ｃ)上記(ｂ)の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の罹患を判断する工程。
【００５３】
測定対象物としてタンパク質を利用する場合、具体的には、本発明の診断方法は、本発明の疾患マーカー（抗体）をプローブとして用いて、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、免疫組織染色法などの検出手段により前記疾患マーカーへのタンパク質の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００５４】
測定対象試料としては、使用する検出手段の種類に応じて、被験者の組織の一部（気管支粘膜、鼻粘膜、胃粘膜など）をバイオプシ等で採取するか、または体液中（血液、痰、鼻汁、胃液など）に存在する細胞等を回収して得られた検体から常法に従って調製したタンパク質または体液中に溶解しているタンパク質を用いることができる。
【００５５】
より具体的には、本発明のアレルギー性疾患の診断方法は、本発明の疾患マーカー（抗体）を用いて、ウェスタンブロット法などにより当該マーカーへのアンフィレギュリンタンパク質の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００５６】
ウェスタンブロット法を利用する場合は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した二次抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
【００５７】
免疫組織染色法を利用する場合は、後述する実施例４に記載の方法に準じて、例えば、アンフィレギュリン陽性細胞を酵素標識抗体とその発色基質を用いて測定することができる。
【００５８】
アレルギー性疾患の診断は、例えば、喀痰検査の場合、被験者の喀痰中のアンフィレギュリン遺伝子の発現レベル、またはアンフィレギュリンタンパク質の量、機能もしくは活性（以下これらを合わせて「タンパク質レベル」ということがある）を、対照の喀痰中の当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質レベルと比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。組織のリモデリングの診断の場合、アンフィレギュリンの発現量と杯状細胞の過形成の程度の間に統計的有意な相関があることから、被験者の喀痰中のアンフィレギュリン濃度（タンパク質量）を、対照および同一被験者の経時的、喀痰中の当該タンパク質と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
【００５９】
前記「リモデリング」とは、炎症を起こした部分が傷跡を残さず全く元どおりに再生することを完全修復というのに対し、前記部分が線維質に置き換わり（瘢痕）、傷跡を残して再生すること、すなわち、不完全修復（リモデリング）をいう。
【００６０】
この場合、対照として正常な組織から採取調製した生体試料（ＲＮＡまたはタンパク質を含む試料）が必要であるが、これらはアレルギー性疾患に罹患していない人の組織の一部をバイオプシ等で採取するか、体液中に存在する細胞等を回収して得られた検体から常法に従って調製したタンパク質または体液中に溶解しているタンパク質を用いることができる。なお、ここでいう「アレルギー性疾患に罹患していない人」とは、少なくともアレルギー性疾患の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法の結果が、例えば、ＩｇＥ（ＲＡＳＴ）値正常、各種特異的ＩｇＥ（ＲＩＳＴ）値正常、プリックテスト陰性であり、アレルギー性疾患でないと診断された人をいう。なお、当該「アレルギー性疾患に罹患していない人」を、本明細書では単に正常者という場合もある。
【００６１】
被験者の組織と正常な組織との遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたアンフィレギュリン遺伝子の発現レベル、もしくはアンフィレギュリンタンパク質レベルの平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベルもしくはタンパク質の量として、比較に用いることができる。
【００６２】
被験者が、アレルギー性疾患であるかどうかの判断は、該被験者の組織中のアンフィレギュリン遺伝子の発現レベル、またはアンフィレギュリンタンパク質レベルが、正常者のそれらのレベルと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。被験者の上記遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルが、正常者におけるレベルに比べて多ければ、該被験者はアレルギー性疾患であると判断できるか、該疾患の罹患が疑われる。前記発現レベルまたはタンパク質レベルと重症度との関係は、当該レベルが高いほど重症度が高いと判断することができる。また、被験者がステロイド等の薬剤により一見症状が治まっているような場合でも組織のリモデリングが起きている可能性があるが、このような場合においても、リモデリングが疑われる組織における当該レベルの高低を比較することにより、リモデリングの存否を判断することができる。
【００６３】
本発明のアンフィレギュリンの発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とアンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量と比較する工程、
（ｃ）前記(ｂ)の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００６４】
工程（ａ）において、被験物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
【００６５】
工程（ａ）において、アンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞としては、内在性および外来性を問わずアンフィレギュリンを発現する培養細胞全般、レポーター遺伝子を含む細胞などを挙げることができる。培養細胞においてこれら遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
【００６６】
具体的には、例えば、アレルギー性疾患の動物より単離、調製した肥満細胞またはその細胞株；本発明遺伝子のいずれかを導入した細胞；レポーター（ルシフェラーゼ、ＧＦＰ等）遺伝子を導入した細胞等を挙げることができる。
【００６７】
前記動物モデルとしては、アレルギー性疾患の動物モデルとして周知である如何なる動物モデルをも用いることができ、具体的には、アルブミン感作マウス喘息モデルなどをあげることができる。
【００６８】
前記遺伝子導入用の細胞としては、ＣＨＯ、ＭＣＦ−７Mammary carcinoma cell、Ｈ２９５Ｒ adrenal cellなどをあげることができる。
【００６９】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞と培養培地中で接触される。前記細胞としては、肥満細胞の細胞膜上のＦｃεＲＩをＩｇＥにより架橋させ、さらに抗ＩｇＥ抗体で刺激した細胞が好ましく用いられ得る。前記培養培地は、アンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００７０】
工程（ｂ）において、発現量の測定は、ｍＲＮＡまたはタンパク質を対象として行なわれる。ｍＲＮＡの発現量は、例えば、細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどにより測定される。タンパク質の発現量は、例えば、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法などを用いることができる。また、レポーター遺伝子を含む細胞（例、アンフィレギュリンのプロモーターの下流に機能可能にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）が連結されたベクターが導入された細胞）が用いられた場合、発現量は、レポーター遺伝子のシグナル強度に基づき測定される。
【００７１】
工程（ｂ）において、発現量の比較は、被験物質の存在下、非存在下において、アンフィレギュリンの発現量における有意差の有無に基づいて行なわれる。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００７２】
工程（ｃ）において、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質が選択される。このように選択された被験物質には、本スクリーニング方法の性質上、アンフィレギュリンの発現量を変動させ得る物質をも含まれる。選択された被験物質は、アレルギー性疾患の治療剤（例えば、喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤）の候補のみならず、免疫調節剤または研究用試薬としても有用である。
【００７３】
また、本発明のアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
(ａ) 被験物質と、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させたアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を抑制する被験物質を選択する工程。
【００７４】
工程（ａ）において、被験物質としては、前記したとおりである。
【００７５】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体と接触される。工程（ａ）において、接触方法は特に限定されるものではないが、例えば、２５〜３７℃の生理条件下でアンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体を所定の濃度で混合し、被験物質を添加する方法、ＥＧＦ受容体を固相に固定し、被験物質の存在下アンフィレギュリンと結合させる方法、あるいはアンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体を発現する細胞の培養液に被験物質を添加する方法などがあげられる。
【００７６】
工程（ｂ）において、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合活性は、以下の例にあげるような方法で測定できる。
b-1）抗アンフィレギュリン抗体または抗ＥＧＦ受容体抗体を用いて免疫沈降し、免疫沈降で使用しなかった抗体でウェスタンブロッティングを行い、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合量を測定する方法。
b-2）アンフィレギュリンまたはＥＧＦ受容体のいずれか一方を、ポリヒスチジンもしくはＧＳＴなどの標識との融合タンパク質として発現させ、またはビオチン化させ、ポリヒスチジンはニッケルに、ＧＳＴはグルタチオンに、ビオチンはアビジンに結合することから、それらを利用して結合体を回収し、b-1）と同様のウェスタンブロッティングで結合量を測定する方法。
b-3）表面プラズモン共鳴法（ビアコア）。
b-4）蛍光標識したアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体発現細胞への結合をフローサイトメーターで測定する方法。
【００７７】
工程（ｂ）において、結合活性の比較は、例えば、被験物質の存在下、非存在下において、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合量の有意差の有無に基づいて行なわれる。
【００７８】
工程（ｃ）において、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を減少させる被験物質が選択される。選択された被験物質は、アレルギー性疾患の治療剤（例えば、喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤）の候補のみならず、免疫調節剤または研究用試薬としても有用である。
【００７９】
また、本発明の喀痰分泌を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
(ａ)被験物質およびアンフィレギュリンと、ムチンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、喀痰分泌を抑制する被験物質を選択する工程。
【００８０】
工程（ａ）において、被験物質としては、前記したとおりである。
【００８１】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンとともにムチンの発現を測定可能な細胞と接触される。ここで、ムチンとは、気管、胃腸などの消化管、生殖腺などの内腔を覆う粘液の主要な糖タンパク質をいいい、本発明においては、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ６などがあげられ、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣが好ましい。「ムチンの発現を測定可能な細胞」としては、内在性および外来性を問わずムチンを発現する培養細胞全般、レポーター遺伝子を含む細胞などを挙げることができる。培養細胞においてこれら遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
【００８２】
工程（ａ）において、被験物質は、アンフィレギュリンとともにムチンの発現を測定可能な細胞と培養培地中で接触される。前記培養培地は、ムチンの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００８３】
工程（ｂ）において、発現量の測定は、ｍＲＮＡまたはタンパク質を対象として行なわれる。ｍＲＮＡの発現量は、例えば、細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどにより測定される。タンパク質の発現量は、例えば、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法などを用いることができる。また、レポーター遺伝子を含む細胞（例、ムチン遺伝子のプロモーターの下流に機能可能にレポーター（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）遺伝子が連結されたベクターが導入された細胞）が用いられた場合、発現量は、レポーター遺伝子のシグナル強度に基づき測定される。
【００８４】
工程（ｂ）において、発現量の比較は、被験物質の存在下、非存在下において、ムチンの発現量における有意差の有無に基づいて行なわれる。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００８５】
工程（ｃ）において、アンフィレギュリンの発現を介したムチンの発現量を減少させる被験物質が選択される。このように選択された被験物質には、本スクリーニング方法の性質上、ムチンの発現量を変動させ得る物質をも含まれる。選択された被験物質は、アレルギー性疾患の治療剤（例えば、喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤）の候補のみならず、免疫調節剤または研究用試薬としても有用である。
【００８６】
本発明の疾患マーカーのうち、上記抗体を含有する疾患マーカーは、動物に適用することによって、アレルギー性疾患の状態の変動を予防または治療することができ、本発明はかかる方法を提供する。上記抗体の中でも、特に、中和抗体、アンフィレギュリンとＥＧＦ受容体との結合を阻害し得る抗体が好ましい。
【００８７】
前記動物は、ヒトおよびヒトを除く脊椎動物であることが好ましく、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ネコ等の家畜または愛玩動物が好ましい。
【００８８】
本発明は、前記疾患マーカーの量または活性を低減させる物質を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療剤を提供する。
【００８９】
本発明の治療剤は、アンフィレギュリンの量または活性を低減させるものであれば特に制限されるものではなく、アンフィレギュリンまたはＥＧＦ受容体に特異的に結合する各種化合物を有効成分として含有するものがあげられる。
【００９０】
前記化合物としては、前記各種抗体、公知の受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例、AG1478、gefitinib(ZD1839)）、抗ＥＧＦ受容体抗体などがあげられ、好ましくはアンフィレギュリンに対する中和抗体もしくはドミナントネガティブ変異体、または抗ＥＧＦ受容体抗体である。ここで、「ドミナントネガティブ変異体」とは、アンフィレギュリンに対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。当該ドミナントネガティブ変異体は、天然のアンフィレギュリンと競合することで間接的にその活性を阻害することができる。アンフィレギュリンのドミナントネガティブ変異体は、アンフィレギュリンに変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、Ｎ末端領域における１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加などが挙げられる。
【００９１】
本発明の治療剤は、アレルギー性疾患の治療剤、好ましくは喘息時の粘液分泌を抑える去痰薬、リモデリングの抑制剤、杯状細胞の過形成の抑制剤、特に、ステロイド耐性の喘息等における去痰薬もしくはリモデリングの抑制剤として用いられる。
【００９２】
本発明の治療剤は、前記有効成分そのままであってもよく、公知の薬学的に許容される担体などを含んでもよい。前記担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００９３】
別の態様として、本発明の治療剤は、アンフィレギュリン遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有するものである。
【００９４】
前記物質は、アンフィレギュリン遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【００９５】
「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。
【００９６】
「リボザイム」とは、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。
【００９７】
「デコイ核酸」とは、転写調節因子が結合する領域を模倣する核酸分子をいい、アンフィレギュリンの発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、アンフィレギュリンに対する転写活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子であり得る。本発明では、デコイ核酸としては、リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、又はリン酸ジエステル結合を電荷を持たないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチドなど、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチドなどが含まれる。デコイ核酸は転写活性化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、アンフィレギュリンに対する転写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよい。デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されない。また、デコイ核酸は、同一領域を反復して含んでいてもよい。
【００９８】
「ｓｉＲＮＡ」とは、アンフィレギュリンｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡである。ｓｉＲＮＡを細胞に導入することによって、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象が起こり、前記リボザイムと同様の効果が期待される。
【００９９】
前記アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、およびｓｉＲＮＡは、公知の方法にしたがって作製することができる。
【実施例】
【０１００】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【０１０１】
[サイトカインおよび抗体]
組換え（ｒ）ヒト（ｈ）ＩＬ−３は、Intergen社より購入した。ｒｈＩＬ−６およびｒｈＳＣＦは、Pepro Tech EC社より購入した。ｒｈＡＲＥＧ、ｒｈＥＧＦおよびマウス抗ヒトＡＲＥＧモノクローナル抗体（ｍＡＧ）は、Genzyme Techne社より購入した。マウス抗ヒトtryptase ｍＡｂ（クローンＡＡ１）は、Dako社より購入した。
【０１０２】
[臍帯血（ＣＢ）由来肥満細胞および成人末梢血（ＰＢ）由来肥満細胞の生成]
本研究におけるすべてのヒト検体は、文書によるインフォームドコンセントをもって提供され、本研究は、各病院の倫理検討委員会により承認された。ヒトＣＢ単核球（以下、単核球をＭＮＣと省略する場合がある）およびＰＢ単核球を、Ficoll-Isopaque（Nycomed社）を用いた密度勾配遠心分離により単離した。直系血統でない単核球をＣＢ単核球およびＰＢ単核球から選択した後、無血清のIscoveメチルセルロース培地（Stem Cell Technologies社）およびIscove改変Dulbecco培地（SCF 200 ng/mL, IL-6 50ng/mL, IL-3 1ng/mL含有）で培養した（Blood 2003; 102: 2547-2554）。培養４２日目に、メチルセルロースをＰＢＳに溶解して細胞を再懸濁し、２％ＦＣＳを補足したIscove改変Dulbecco培地（SCF 100 ng/mL, IL-6 50ng/mL含有）で培養した。
【０１０３】
[白血球の精製]
顆粒球および単核球を、正常ボランティアの静脈血から分離した。好酸球を、Percoll(1.090 g/mL)密度遠心分離により単離した後、抗ＣＤ１６結合マイクロ磁気ビーズを用いたネガティブセレクションによりさらに精製した（Blood 1995; 86: 1437-1443）。このネガティブセレクションの後、好中球をPercoll(1.085 g/mL)密度遠心分離により単離した。単離した好中球は、混在する好酸球を除去するために抗ＣＤ８１抗体を用いたネガティブセレクションによりさらに精製した。
【０１０４】
［ヒト肥満細胞の活性化］
ヒト肥満細胞表面のＦｃεＲＩの凝集による活性化のため、肥満細胞を、３７℃で２４時間、１μｇ／ｍＬのヒト骨髄腫ＩｇＥ（CosmoBio社）で最初に感作した。洗浄後、前記細胞を、３７℃で所定の時間、ウサギ抗ヒトＩｇＥ Ａｂ（Dako社）または培地のみでチャレンジした。ＩｇＥ介在遺伝子発現プロファイルおよび肥満細胞によるＡＲＥＧの産生におけるデキサメタゾン（Pepro Tech EC社；グルココルチコイド）の作用を調べるため、肥満細胞を、活性化の２４時間前に１０-6 Ｍのデキサメタゾンで前処理した。すべての条件において、細胞をＳＣＦおよびＩＬ−６を含む完全Iscove改変Dulbecco培地に懸濁した。１０-6 Ｍのデキサメタゾン、および／またはＩｇＥ／抗ＩｇＥでの肥満細胞の処理は、細胞の生存能または細胞数を有意に変化させないことを確認した。
【０１０５】
［患者］
日本アレルギー学会の基準に基づいて、喘息症状の段階および症状の頻度を組み合わせて、疾患の重症度を規定した４０名の患者と、喘息をもたない６名の正常対照を研究した（表１）。現在も喫煙している患者はいなかった。また、過去２年間喫煙していた患者もいなかった。検査に先立つ１月間に、気管支または呼吸器を感染した患者もいなかった。本研究は、獨協医科大学の倫理委員会により承認され、すべての患者は、インフォームドコンセントを文書で同意した。各喘息患者および正常対照における基底膜の総厚は、既報にしたがって評価した（Chest 1997; 111: 852-857）。気道の過敏性は、アセチルコリンが段階的に増加する濃度で連続吸入中に呼気耐性が増加し始める時点のアセチルコリンの最小累積用量として測定した。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
［気管支のバイオプシ］
喘息患者の組織試料は、既報（Chest 1997; 111: 852-857）に従って、光ファイバーの気管支鏡検査中に標準ピンセットを用いて、右下葉気管支と中央下葉気管支との間の竜骨下（subcarina）（右Ｂ６気管支の起点）から採取した。各バイオプシ検体を直ちにＯＣＴ培地中に入れ、液体窒素中で瞬時に凍結し、クリオスタットでの切片の作製時まで−８０℃で保存した。
【０１０８】
[統計学的解析]
対になった２つの群間の偏差は、片側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定により解析し、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。値は、平均±ＳＥＭで表す。
【０１０９】
［参考例１］
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲおよびジーンチップ発現解析
全細胞ＲＮＡを、RNeasy Mini Kits(Qiagen)を用いて製造業者の仕様書に従って、肥満細胞から単離した。１０6個の肥満細胞当たりのＲＮＡの収量は、２．４（２．０−２．８）μｇ（メジアンとレンジ、ｎ＝６）であった。等量のＲＮＡ（５０ｎｇ）をＲＴ-ＰＣＲ解析に用いた。ＰＣＲは、サーモサイクラー中、下記条件：
９４℃で１分の後、４０増幅サイクル（９４℃で１分；６０℃で３０秒；７２℃で２分）
で行った。ＡＲＥＧに対するプライマーの配列は、
5’プライマー：5’-AGAGTTGAACAGGTAGTTAAGCCCC-3’（配列番号３）および
3’プライマー：5’-GTCGAAGTTTCTTTCGTTCCTCAG-3’（配列番号４）であった。等量のＰＣＲ増幅産物を臭化エチジウムで可視化した。ＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡを陽性対照として検出した。ｃＤＮＡなしのＰＣＲは、コンタミネーションを除外するために行った。
【０１１０】
次に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のGeneAmp 7900 シークエンス検出システム（Applied Biosystems）を用いて、MUC2およびMUC5AC ｍＲＮＡの発現を測定した。全細胞ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの合成は、前述のように行った。ＰＣＲは、TaqMan Universal PCR Master Mix Kit（Applied Biosystems）および蛍光プローブ（Applied Biosystems）を用いて製造業者のプロトコールに従って行った。MUC5AC検出のために使用したプライマーの配列は、
forward: 5’-TCAACGGAGACTGCGAGTACAC-3’（配列番号５）
reverse: 5’-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3’（配列番号６）であり、ＦＡＭレポーターダイ−標識ハイブリダイゼーションプローブ：5’-FAM-ACTCCTTTCCTGTTGTCACCGAGAACGTC-TAMRA-3’（配列番号７）であった。MUC2検出のために使用したプライマーの配列は、
forward: 5’-GCCCTGGCTTCGAACTCAT-3’（配列番号８）
reverse: 5’-TCTTCGGGTCGCTCTTGAA-3’（配列番号９）であり、ＦＡＭレポーターダイ−標識ハイブリダイゼーションプローブ：5’-FAM-CACTGTATCATCAAACGGCCCGACAA-TAMRA-3’（配列番号１０）であった。標的ｍＲＮＡのレベルと逆に相関する閾値サイクルＣｔは、レポーター蛍光放出が増幅曲線に沿って対数増殖期の中点を越えて増加したときのサイクル数として定義した。相対発現レベルは、サイクル閾値と競合Ｃｔ法を用いて決定し、共増幅するハウスキーピング遺伝子レベル、２倍増幅／サイクル率および対照試料の参照発現レベルを調整した。
【０１１１】
ジーンチップ発現解析
ヒトゲノムワイドの遺伝子発現は、約23000の全長遺伝子および発現配列タグ（ＥＳＴ）に対するオリゴヌクレオチドプローブセットを含むHuman Genome U95A およびU133Aプローブアレイ（GeneChip, Affymetrix社）を用いて、製造業者のプロトコール（Expresion Analysis Technical Mannual）および既報に従って調べた。約１０７個の細胞から全ＲＮＡ（３−１０μｇ）を抽出した。二本鎖ｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡを、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸の存在下でin vitroの転写に付した。ビオチン化ｃＲＮＡを４５℃で１６時間プローブアレイとハイブリダイズし、ハイブリダイズしたビオチン化ｃＲＮＡをストレプトアビジン−ＰＥ（Phycoerythrin）で染色した後、Hewlett-Packard Gene Array Scannerで走査した。各プローブの蛍光強度は、コンピュータープログラムGeneChip Analysis Suite 5.0 (Affymetrix社）を用いて定量した。一本鎖ｍＲＮＡの発現レベルは、25マーのオリゴヌクレオチドからなる１１対の（完全マッチおよびシングルヌクレオチドミスマッチ）プローブにより得られた強度の中で平均蛍光強度として決定した。ミスマッチプローブの強度が非常に高い場合、GeneChip Analysis Suite 5.0 プログラムで高い平均蛍光が得られたとしても、遺伝子発現は存在しないと判定した。遺伝子発現のレベルは、GeneChipソフトウエアを用いて、平均偏差（ＡＤ）として決定した。次いで、ハウスキーピング遺伝子（β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ）の６つのプローブセットの平均ＡＤレベルに対する特異的ＡＤレベルの割合を計算した。
【０１１２】
さらに、GeneSpring ソフトウエア version 6 (Silicon Genetics)を用いて、データ解析を行った。チップ間の染色強度の変化を正規化するために、与えられたチップ上のすべての遺伝子に対するＡＤ値をそのチップ上のすべての測定値のメジアンで除した。バックグランドノイズのレンジ内の変化を除外し、最も差異的に発現した遺伝子を選択するため、生のデータ値が１００ＡＤを超え、遺伝子発現がAffymetrixデータ解析により存在すると判定された場合にのみそのデータを使用した。標準相関との階層的なクラスタリング解析を用いて、遺伝子のクラスタを同定した。特定の試料を相互に正規化した、すなわち、試料を対照試料のメジアンに対して正規化した。これらの特定試料中の各遺伝子に対する各測定値は、対応する対照試料におけるその遺伝子の測定値のメジアンで除した。分割比を０．５に設定した。０以下の正規値は、０に設定した。データは、
(i)少なくとも２倍（活性化プログラム）の発現変化および
(ii) 増加した遺伝子発現が少なくとも１つ存在するcall(Affymetrix アルゴリズム)を含む場合、データを有意とみなした。アップレギュレート遺伝子またはダウンレギュレート遺伝子として分類する限定は、正規化した値に適用した。
【０１１３】
以下の基準に基づいて遺伝子の発現レベルを比較することにより、肥満細胞特異的転写物を同定した。
・ 肥満細胞における各遺伝子の平均発現レベルが他の細胞型の最高レベルよりも５倍以上大きい。
・ ３個または４個の独立した実験で、非存在または限界callが１以下である。
・ 標準偏差が平均値未満である。
・ 異なるプローブセットにより得られた多数の転写物が同一のGenebankまたはUnigene accession numberを有する場合、最も高い発現レベルを示す転写物を表中に選択する。
【０１１４】
[結果]
ヒト肥満細胞でデキサメタゾンにより制御される遺伝子発現のクラスタリング解析
ＦｃεＲＩの凝集によりアップレギュレートするがデキサメタゾンでの前処理によりダウンレギュレートしない遺伝子を同定するために、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイ（GeneChip）を用いてヒト肥満細胞における遺伝子発現プロファイルを探査した。本発明者らは、前記遺伝子を下記４つのセットに分けた。
セットＩ：下記遺伝子を含む
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に少なくとも２倍（活性化プログラム）変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍未満まで低下する（図１、Ｉ）。
セットII：下記遺伝子を含む
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に少なくとも２倍（活性化プログラム）変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍以上変化する（図１、II）。
セットIII：下記遺伝子からなる
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に２倍未満変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍未満まで変化する（図１、III）。
セットIV：下記遺伝子を含む
(i)その発現がＦｃεＲＩの凝集後に２倍未満変化する、および
(ii)その増加した遺伝子発現がデキサメタゾン前処理後に０．５倍以上変化する（図１、IV）。
【０１１５】
さらに、ヒト末梢血単核球、好酸球および好中球の遺伝子発現プロファイルとの比較に基づいて、肥満細胞特異的遺伝子を選択した。上述のように、肥満細胞における発現レベルがヒト末梢血単核球、好酸球および好中球の最大発現レベルよりも少なくとも５倍高い場合に、そのデータを肥満細胞特異的とみなした。このようにして、２４個の遺伝子をセットＩの肥満細胞特異的であると同定した。これらの遺伝子は、サイトカイン（ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ）およびケモカイン（ＭＣＰ−１およびＩ−３０９）等のＮＦ−κＢ経路のメンバーであった（表２)。セットIIに同定された１７個の肥満細胞特異的遺伝子は、ＡＲＥＧ、ならびにα１−（Ｅ）カテニンという接着分子を含む（表３）。セットIIIにおいて、２２個の遺伝子を肥満細胞特異的と同定し、それらの遺伝子にはカテプシンＧ、キマーゼおよびメタロプロテアーゼを含んでいた。最後に、セットIVにおいて、２３６個の遺伝子を肥満細胞特異的遺伝子として選択した。これらの遺伝子は、トリプターゼ、主要塩基性タンパク質、ＰＧＤ２シンターゼ、およびc-kitを含む。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
脚注：MC1(2)c:未処理対照肥満細胞、MC1(2)a:抗IgE刺激肥満細胞、MC1(2)d:抗IgEおよびデキサメタゾンで処理した細胞、Eo:好酸球、MNC:単核球、Ne:好酸球、specif:肥満細胞特異性（他の白血球に対する比）、CCL:CC-ケモカインリガンド、CXCL: CXC-ケモカインリガンド。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
脚注：MC1(2)c:未処理対照肥満細胞、MC1(2)a:抗IgE刺激肥満細胞、MC1(2)d:抗IgEおよびデキサメタゾンで処理した細胞、Eo:好酸球、MNC:単核球、Ne:好酸球、specif:肥満細胞特異性（他の白血球に対する比）。
【０１２０】
ＡＲＥＧは、ＥＧＦファミリーのサイトカインであるので、本発明者らは、肥満細胞特異的遺伝子の中でも、ＦｃεＲＩの凝集によりアップレギュレートするがデキサメタゾン前処理によりダウンレギュレートしないＡＲＥＧに焦点を当てた。
【０１２１】
ＡＲＥＧに焦点を当てた理由は、以下のとおりである。
(i) ＡＲＥＧは、マウスにおいて肺の分枝の形態形成の過程に関与していること、
(ii) 後述する実施例に示すように、ＡＲＥＧは、粘膜上皮ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞においてＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡをＥＧＦと同程度に誘導したこと、
(iii)ＡＲＥＧは、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼによるＡＲＥＧの放出を通してＮＣＩ−Ｈ２９２細胞でのムチン発現を増加させたこと、および
(iv) ＡＲＥＧは、ＥＧＦと異なり、肥満細胞特異性が高く発現しているので、アレルギー症状を制御可能な分子標的として優れていること。
【０１２２】
［実施例１］
ヒト肥満細胞におけるＡＲＥＧ発現の解析
肥満細胞を骨髄腫ＩｇＥで感作し、洗浄し、次いで１．５μｇ／ｍＬの抗ＩｇＥで、または抗体なしで２４時間チャレンジした後、培養上清を回収した。細胞が密になるまで増殖し、培地中の血清が枯渇したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（American Type Culture Collection: ATCC）を、１０μｇ／ｍｌの抗ＡＲＥＧ中和抗体またはイソ型対照ｍＩｇＧ１で２０分間処理した後、前記肥満細胞の培養上清を添加した。また、前記培養上清中のヒトＡＲＥＧを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Systems）を用いて、当該キットに添付されたプロトコールに従って測定した。ヒトＡＲＥＧのアッセイの感度は、５ｐｇ／ｍＬであった。
【０１２３】
[結果]
ＡＲＥＧ ｍＲＮＡは、ＩｇＥまたは抗ＩｇＥ活性化肥満細胞で明確に検出された（図２Ａ）。ＡＲＥＧ ｍＲＮＡは、ＦｃεＲＩ凝集後の肥満細胞のデキサメタゾン前処理によりアップレギュレートするように見受けられた（図２Ａ）。ＡＲＥＧの分泌を検証するために、ＥＬＩＳＡキットを用いて活性化された肥満細胞の培養上清を調べ、ＡＲＥＧの存在を確認した。デキサメタゾン前処理は、ＡＲＥＧのＩｇＥ介在放出をアップレギュレートするように思われるが、有意ではなかった（図２Ｂ）。図２Ｃは、ＦｃεＲＩ凝集後の肥満細胞によるＡＲＥＧ産生の経時変化を示す。ＡＲＥＧ産生は、ＦｃεＲＩ架橋後少なくとも３６時間まで増加し続けた。デキサメタゾン単独では、培地単独の場合とほぼ同様の結果であった。ＡＲＥＧ産生は、ＦｃεＲＩ架橋後３６時間肥満細胞のデキサメタゾン前処理によりアップレギュレートすることが示唆された（図２Ｃ）。ＡＲＥＧは、濃度依存的様式で抗ＩｇＥにより放出された（図２Ｄ）。
【０１２４】
［実施例２］
ＡＲＥＧによるＭＵＣ２およびＭＵＣ５Ａ発現の解析
実施例１で処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５Ａの発現を定量リアルタイムＰＣＲにより解析した。
【０１２５】
[結果]
図３Ａおよび３Ｂに示すように、ＡＲＥＧはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において、用量依存的にＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現を増加させた。１０ｎｇ／ｍｌでは、ＡＲＥＧは、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現をそれぞれ３倍および１３倍増加させた。ＡＲＥＧで誘導されたＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣの発現増加は、ＥＧＦにより誘導されたものとほぼ同じだった。
【０１２６】
［実施例３］
活性化肥満細胞培養上清によるＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現の増加
密に増殖させて血清を枯渇させたＮＣＩ−２９２細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＡＲＥＧ中和抗体または１μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１とともに前処理した後、刺激していない肥満細胞由来の培養上清（Unsti MC SN）または活性化肥満細胞培養上清（Stim MC SN）とともに２４時間インキュベートした。ＮＣＩ−２９２細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣｍＲＮＡの量を決定した。刺激していない肥満細胞培養上清とともにインキュベートした細胞と比較して、活性化された肥満細胞培養上清とともにインキュベートした抗ＡＲＥＧ ｍＡｂまたはｍＩｇＧ１処理細胞のムチンｍＲＮＡレベルの倍数変化（平均±ＳＥＭ）として示す（図４）。
【０１２７】
[結果]
図４Ａおよび４Ｂより、活性化された肥満細胞の培養上清は、ＡＲＥＧが介在するＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現をさらに増加させることがわかる。これらの増加は、ＡＲＥＧに対する中和抗体により有意に阻害された。
【０１２８】
［実施例４］
免疫組織化学
表１に記載の喘息患者および正常被験者由来の呼吸器粘膜の３μｍの連続切片を、ＡＢＣキット（Vector Laboratories）を用いて抗ＡＲＥＧ ｍＡｂおよび抗トリプターゼｍＡｂで染色した。具体的には、スライドを３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間クエンチングして内因性のペルオキシダーゼをブロックし、ＰＢＳ中で洗浄した。切片を一次抗体とともに１時間、次いで、ビオチン化二次抗体とともにインキュベートした後、ＡＢＣ試薬を用いた。発色は、ジアミノベンジジンを基質として用いて行った。スライドをMayerのヘマトキシリンで対比染色した。特異的ブロッキングペプチドと一次抗体とのプレインキュベーションまたは一次抗体の無関係なＩｇＧでの置換を、陰性対照として用いた。ＡＲＥＧ陽性細胞は、３名の別々の観察者によって各試料の少なくとも６つの高倍率の視野で計数した。Hanselの染色（鳥居薬品）を用いて、好酸球を同定した。気道組織切片の連続アルシャンブルー染色および過ヨウ素酸−Schiff染色により、分泌細胞におけるムチンが明確に可視化された。上皮分泌細胞の細胞内ムチン性糖タンパク質は、多様な大きさの紫色の長円板として認識された。
【０１２９】
杯状細胞の分泌応答を解析するために、下記のように、各分泌細胞における粘液の量をランク付けすることにより組織切片から粘性度を決定した。段階１では、染色域の垂直距離は、基底膜から細胞の頂点まで測定した上皮層の１／３以下である。段階２では、染色域の垂直距離は、上皮層の１／３を超える。染色域は、気管の２つの壁に沿って２０個の連続する高倍率視野でランク付けした。各ドナーにおいて、粘液スコアは、ｎ１＋２ｎ２（ｎ１およびｎ２はそれぞれ、段階１および段階２の細胞の総数である）として計算した。各研究者による各試料に与えられた平均スコアを最初に計算し、次いで３名の研究者による各試料に対する平均スコアを計算し、データとして記録した。
【０１３０】
[結果]
喘息患者の気管支肥満細胞におけるＡＲＥＧの発現
ＡＲＥＧ陽性（ＡＲＥＧ＋）細胞を肥満細胞であると同定するために、連続切片を用いて、１つの切片を抗tryptase ｍＡｂで染色し、別の切片を抗ＡＲＥＧ ｍＡｂで染色した。正常対照被験者由来の気管支バイプシ試料は、ＡＲＥＧに対してほとんど免疫反応性を示さなかった。対照的に、喘息患者由来のバイプシ試料は、気管支の肥満細胞において、ＡＲＥＧに対して明確に陽性の免疫反応性を示した（図５Ａ）。次に、tryptase陽性（tryptase＋）細胞におけるＡＲＥＧ＋細胞の数を計数した。ＡＲＥＧ＋肥満細胞の割合は、軽度、中度、および重症の喘息患者において、それぞれ平均３５％、５２．８％および５２％であった。喘息検体および対照検体の気管支粘膜の１ｍｍ２におけるＡＲＥＧ＋細胞の数（ＡＲＥＧ＋細胞／ｍｍ２）を計数した（図５Ｂ）。ＡＲＥＧ＋細胞／ｍｍ２の数は、対照検体に比べて喘息検体で有意に増加していた（Ｐ＜０．０１）。喘息患者および正常被験者の両方の気道上皮細胞は、ＡＲＥＧに対してほとんど免疫反応性を示さなかった。次に、このことを明確にするために、ＡＲＥＧ＋tryptase＋／ｍｍ２の数を計数した（図５Ｃ）。さらに、正常および喘息の肺の試料において、全ＡＲＥＧ＋細胞の中でのＡＲＥＧ＋上皮細胞、好酸球およびその他の割合を計数した。その結果、全ＡＲＥＧ＋細胞の１０％未満が上皮細胞および好酸球であることがわかった（図５Ｄ）。他の細胞は１％未満であった。したがって、ＡＲＥＧ＋細胞の数は、肥満細胞の総数とほぼ同じであった。次に、ＡＲＥＧ＋肥満細胞の数と粘膜スコアとの関係を調べた。その結果、これらの２つの数値の間に有意な相関関係があることが明らかになった（図５Ｅ、Ｐ＜０．００５、ｒ＝０．５４）。このことは、ＡＲＥＧが杯状細胞の過形成を誘導することを示唆するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明によれば、喘息、アトピーおよびアレルギー性鼻炎等のアレルギー性疾患の指標を提供することが可能となり、当該疾患の容易かつ的確な診断をすることができるとともに、アンフィレギュリンの作用機序に基づく新規なアレルギー性疾患の治療剤の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、対照肥満細胞、抗ＩｇＥで刺激した肥満細胞および抗ＩｇＥとデキサメタゾンで刺激した肥満細胞におけるｍＲＮＡ発現レベルを表す図である。ヒト肥満細胞をデキサメタゾンの存在下または非存在下でＩｇＥとともに前培養し、次いで抗ＩｇＥで６時間活性化した。着色したバーの各横列は、１つの遺伝子を表し、各縦列は、１つの刺激を表す。着色バーは、示されたスケールにしたがって各遺伝子の応答の強さを示す。Ｉは、抗ＩｇＥ刺激によりアップレギュレートするが抗ＩｇＥで活性化した後にデキサメタゾンで前処理すると低下した遺伝子のセットを示す。IIは、抗ＩｇＥ刺激によりアップレギュレートするが抗ＩｇＥで活性化した後にデキサメタゾンでの前処理により影響を受けない遺伝子のセットを示す。IIIは、抗ＩｇＥ刺激により影響を受けないが抗ＩｇＥでの活性化の前にデキサメタゾンで処理することによりダウンレギュレートした遺伝子のセットを示す。IVは、抗ＩｇＥ刺激により影響を受けないがデキサメタゾンでの前処理によりアップレギュレートした遺伝子のセットを示す。
【図２】図２は、ヒト肥満細胞によるＡＲＥＧの発現を示す図である。２Ａ：ＦｃεＲＩ介在の活性化によるヒト肥満細胞におけるＡＲＥＧ発現のアップレギュレーション。デキサメタゾンの存在下(＋)または非存在下（−）で前処理したヒト肥満細胞を、ＩｇＥとともに前培養し、次いで１．５μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥで活性化した。ＡＲＥＧおよびＧＡＰＤＨに対する細胞内ｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。２Ｂ：デキサメタゾンの前処理の有(＋)または無（−）で、１．５μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥ刺激後の肥満細胞由来のＡＲＥＧ分泌。２４時間で細胞培養上清を回収し、ＡＲＥＧに対するＥＬＩＳＡを行った（ｎ＝３ドナー）。２Ｃ：デキサメタゾンの前処理の有(ドットを付したバー)または無（黒色のバー）で、抗ＩｇＥ（１．５μｇ／ｍｌ）で刺激したヒト肥満細胞によるＡＲＥＧ産生の経時変化。対照細胞をデキサメタゾンの存在下（斜線入りバー）または非存在下（白色バー）でＩｇＥとともにインキュベートしたが、抗ＩｇＥ処理は除外した。２Ｄ：ヒト肥満細胞による抗ＩｇＥ誘導性ＡＲＥＧ産生の濃度−応答研究。肥満細胞をＩｇＥで前インキュベートし、次いで0.1、0.5、1.5、または5μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥで２４時間活性化した。Ｎ．Ｄ．は検出されないことを意味する。
【図３】図３は、ＮＣＩ−２９２細胞におけるＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ発現に対するＡＲＥＧの影響を表すグラフである。ＮＣＩ−２９２細胞をｒｈＡＲＥＧまたはｒｈＥＧＦとともにインキュベートし、前記細胞から抽出した全ＲＮＡを用いて、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＭＵＣ２（Ａ）およびＭＵＣ５ＡＣ（Ｂ）ｍＲＮＡの量を決定した。結果を、ＡＲＥＧまたはＥＧＦ未処理細胞と比較して、ＡＲＥＧまたはＥＧＦ処理細胞のムチンｍＲＮＡレベルの倍数変化（平均±ＳＥＭ）として示す（ｎ＝３）。*Ｐ＜０．０５、ＡＲＥＧまたはＥＧＦで処理していない細胞との比較。
【図４】図４は、活性化された肥満細胞培養上清がＡＲＥＧが介在するＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現を増加させることを示すグラフである。休止期のＮＣＩ−２９２細胞を、抗ＡＲＥＧ中和抗体またはマウスＩｇＧ１で前処理した後、刺激していない肥満細胞由来の培養上清（Unsti MC SN）または活性化肥満細胞培養上清（Stim MC SN）とともに２４時間インキュベートした。ＮＣＩ−２９２細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＭＵＣ２（Ａ）およびＭＵＣ５ＡＣ（Ｂ）ｍＲＮＡの量を決定した。結果を、刺激していない肥満細胞培養上清とともにインキュベートした細胞と比較して、活性化された肥満細胞培養上清とともにインキュベートした抗ＡＲＥＧ ｍＡｂまたはｍＩｇＧ１処理細胞のムチンｍＲＮＡレベルの倍数変化（平均±ＳＥＭ）として示す（ｎ＝３）。*Ｐ＜０．０５、抗ＡＲＥＧ中和抗体で処理した細胞とｍＩｇＧ１処理した細胞との比較。
【図５】図５は、喘息患者の気道におけるＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数と杯状細胞の過形成の程度との相関を示す図である。５Ａ：tryptase＋肥満細胞におけるＡＲＥＧの共存。喘息患者由来の気管支バイオプシ検体の２つの連続する３μｍの切片をtryptase（左パネル）およびＡＲＥＧ（右パネル）で免疫染色した。５Ｂ：正常対照（Control）および喘息患者(Asthma)の気管支粘膜の１ｍｍ２当たりのＡＲＥＧ＋細胞の数。ＡＲＥＧ＋細胞を、３名の別々の観察者によって各試料の少なくとも６つの高倍率の視野で計数した。**Ｐ＜０．０１、正常対照および喘息患者におけるＡＲＥＧ＋細胞の数間を比較。５Ｃ：正常対照（Control）および喘息患者(Asthma)の気管支粘膜１ｍｍ２当たりのＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数。**Ｐ＜０．０１、正常対照および喘息患者におけるＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数間を比較。５Ｄ：全ＡＲＥＧ＋細胞正常検体（白抜きバー）と喘息患者の肺検体（黒塗りバー）との間のＡＲＥＧ＋上皮細胞および好酸球の割合。*Ｐ＜０．０５、対照被験者および喘息患者におけるＡＲＥＧ＋上皮細胞の割合に対して。５Ｅ：肥満細胞におけるＡＲＥＧの発現と喘息患者における杯状細胞過形成の程度との相関。杯状細胞過形成の程度は、実施例４に記載のように求め、喘息患者の気道におけるＡＲＥＧ＋tryptase＋細胞の数との相関を解析した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフィレギュリン遺伝子の連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
【請求項２】
前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブまたはプライマーとして使用される請求項１記載の疾患マーカー。
【請求項３】
前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される請求項１または２に記載の疾患マーカー。
【請求項４】
下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリン遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項５】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項１〜３いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項６】
工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる、請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
アンフィレギュリンを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
【請求項８】
前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブとして使用される請求項７記載の疾患マーカー。
【請求項９】
前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される請求項７または８に記載の疾患マーカー。
【請求項１０】
下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリンの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むアレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項７〜９いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、および
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項１２】
工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる請求項１１記載のアレルギー性疾患の診断方法。
【請求項１３】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンの発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質とアンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１４】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させたアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項１５】
アレルギー性疾患の治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項１３または１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、喀痰分泌を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質およびアンフィレギュリンと、ムチンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、喀痰分泌を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項１７】
前記喀痰分泌がアレルギー性疾患に伴うものである、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
アンフィレギュリンに結合する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の治療剤。
【請求項１９】
アンフィレギュリンの発現量またはＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
【請求項２０】
前記物質がアンフィレギュリンに対する抗体もしくはドミナントネガティブ変異体または当該抗体もしくはドミナントネガティブ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである請求項１９に記載の治療剤。
【請求項２１】
喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである請求項１８〜２０のいずれかに記載の治療剤。
【請求項２２】
アンフィレギュリン遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
【請求項２３】
前記物質が、アンフィレギュリン遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡである請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２４】
喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである請求項２２または２３に記載の治療剤。
【請求項１】
アンフィレギュリン遺伝子の連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
【請求項２】
前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブまたはプライマーとして使用される請求項１記載の疾患マーカー。
【請求項３】
前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される請求項１または２に記載の疾患マーカー。
【請求項４】
下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリン遺伝子の発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項５】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項１〜３いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項６】
工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる、請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
アンフィレギュリンを認識する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の疾患マーカー。
【請求項８】
前記アレルギー性疾患が喘息、アトピーまたはアレルギー性鼻炎であり、当該疾患の検査においてプローブとして使用される請求項７記載の疾患マーカー。
【請求項９】
前記アレルギー性疾患が喘息であり、喀痰検査に使用される請求項７または８に記載の疾患マーカー。
【請求項１０】
下記の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、アレルギー性疾患の診断方法：
（Ａ）被験者の生体試料中のアンフィレギュリンの発現量を測定する工程、および
（Ｂ）前記（Ａ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むアレルギー性疾患の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項７〜９いずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、前記疾患マーカーを指標として測定する工程、および
（ｃ）前記（ｂ）の測定結果に基づいて、アレルギー性疾患の有無を判断する工程。
【請求項１２】
工程（ｃ）におけるアレルギー性疾患の有無の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる請求項１１記載のアレルギー性疾患の診断方法。
【請求項１３】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンの発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質とアンフィレギュリンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるアンフィレギュリンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるアンフィレギュリンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１４】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質と、アンフィレギュリンおよびＥＧＦ受容体とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させたアンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、アンフィレギュリンのＥＧＦ受容体との結合活性を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項１５】
アレルギー性疾患の治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項１３または１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、喀痰分泌を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質およびアンフィレギュリンと、ムチンの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞におけるムチンの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるムチンの発現量と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、喀痰分泌を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項１７】
前記喀痰分泌がアレルギー性疾患に伴うものである、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
アンフィレギュリンに結合する抗体を含有してなるアレルギー性疾患の治療剤。
【請求項１９】
アンフィレギュリンの発現量またはＥＧＦ受容体への結合活性を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
【請求項２０】
前記物質がアンフィレギュリンに対する抗体もしくはドミナントネガティブ変異体または当該抗体もしくはドミナントネガティブ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである請求項１９に記載の治療剤。
【請求項２１】
喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである請求項１８〜２０のいずれかに記載の治療剤。
【請求項２２】
アンフィレギュリン遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療剤。
【請求項２３】
前記物質が、アンフィレギュリン遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸またはｓｉＲＮＡである請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２４】
喀痰分泌抑制作用またはリモデリング抑制作用を有するものである請求項２２または２３に記載の治療剤。
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図５】
【図３】
【図４】
【図１】
【図５】
【公開番号】特開２００６−１７４７４０（Ｐ２００６−１７４７４０Ａ）
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６９９２５（Ｐ２００４−３６９９２５）
【出願日】平成１６年１２月２１日（２００４．１２．２１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２１日（２００４．１２．２１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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