イオンチャネル活性を阻害するためのイミノ糖誘導体の使用
ＨＣＶ ｐ７タンパク質の活性を阻害するのに有効であるイミノ糖誘導体化合物を投与することによってＨＣＶ感染を処置する方法およびキット、ならびにｐ７タンパク質またはその変異体の活性を阻害する化合物をスクリーニングするための方法を開示する。開示したＮ置換イミノ化合物、およびその薬学的組成物は、ＨＣＶ ｐ７が膜を透過する能力を阻害する。特に有効な化合物は、Ｎ−アルキル化ピペリジンに由来するイミノ糖である。潜在的なＨＣＶ抗ウイルス剤をスクリーニングするための方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００２年９月２３日に提出された米国仮出願第６０／４１２，５６０号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、末期肝硬変および肝細胞癌の著しい危険を伴う慢性肝炎の主な原因である（Ｄｉ Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ，Ａ．Ｍ．，（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６（３ Ｓｕｐｐｉ．１）：３４５−３８５を参照）。ＨＣＶは、３つの属：フラビウイルス、ぺスチウイルス、およびヘパシウイルスよりなるフラビウイルス科に属する。適切な小動物モデルおよびＨＣＶに対する信頼できるインビトロ感染性アッセイの両方がない場合、有望な抗ウイルス薬は最初に、関連するぺスチウイルスである、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）を用いて試験する。ＢＶＤＶインビトロ感染性アッセイは、デオキシノジリマイシンすなわち「ＤＮＪ」とも呼ばれるグルコース類似体、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、あるいはデオキシガラクトノジリマイシンすなわち「ＤＧＪ」とも呼ばれるガラクトース類似体、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトールのどちらかを含有するアルキル化イミノ糖誘導体が強力な抗ウイルスインヒビターであることを証明するのに使用されてきた（Ｄｕｒａｎｔｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：８９８７−９８を参照）。
【０００３】
ＤＮＪ誘導体は、ＥＲα−グルコシダーゼＩおよびＩＩを阻害するので、少なくとも部分的に抗ウイルスインヒビターである。これらの酵素は、Ｎ−グリカン前駆体の一部を形成する３つのグルコース残基を除去し、それらは揃ってＥＲ中の初期糖タンパク質に運搬される。ＥＲα−グルコシダーゼ阻害は、モノグリコシル化、Ｎ結合オリゴ糖含有糖タンパク質の形成ならびに、それに続くＥＲ内在シャペロンのカルネキシンおよびカルレチクリンとの相互作用を防止する（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９（３）：ｐ．１２４−８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ＪＲ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ６（９）：１１７３−８４を参照）。カルネキシン相互作用は、ＢＶＤＶおよびＨＣＶのエンベロープ糖タンパク質を含む、多くの宿主およびウイルスにコードされた糖タンパク質の適正なフォールディングにとって重要である（Ｂｒａｎｚａ−Ｎｉｃｈｉｔａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７５（８）：３５２７−３６；Ｃｈｏｕｋｈｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８ ７２（５）：３８５１−８を参照）。ＢＶＤＶエンベロープ糖タンパク質のミスフォールディングは、感染細胞からのビリオンの分泌障害を引き起こすことがある。
【０００４】
以前の実験は、長鎖アルキル誘導体Ｎ−ノニル−ＤＮＪ（ＮＮ−ＤＮＪ）の抗ウイルス効果が、短鎖アルキル誘導体Ｎ−ブチル−ＤＮＪ（ＮＢ−ＤＮＪ）の抗ウイルス効果よりも顕著であるが、後者は細胞内でさらに効果的なＥＲα−グルコシダーゼ阻害を達成することを示した（Ｄｕｒａｎｔｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：８９８７−９８を参照）。加えて、ＥＲα−グルコシダーゼによって認識されず、ＥＲα−グルコシダーゼを阻害しない長鎖アルキルＤＧＪ誘導体も、強力な抗ウイルス活性を示す。したがってＥＲα−グルコシダーゼ阻害は、観察された抗ウイルス効果と直接相関せず、唯一の抗ウイルス機構として除外される。
【０００５】
短鎖Ｎ−ブチル−ＤＧＪ（ＮＢ−ＤＧＪ）が抗ウイルス活性を示さないのに対して、長鎖アルキル誘導体ＮＮ−ＤＧＪは強力なインヒビターであるため、さらなる作用機構は、アルキル側鎖の長さと明らかに関連している。しかしながら、構造的に類似した洗浄剤、ｎ−オクチルグルコシド（ｎ−ＯＧ）およびＮ−ノニルグルコシドはインビトロＢＶＤＶ感染性アッセイにおいて抗ウイルス性でないため、それは両親媒性のアルキル化イミノ糖誘導体の洗浄剤様効果と関連していない（Ｄｕｒａｎｔｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：８９８７−９８を参照）。薬物処置は、ウイルス膜糖タンパク質の二量化に影響を及ぼし、分泌されたＢＶＤＶビリオンの膜糖タンパク質組成を変化させるが、ウイルスのＲＮＡ複製またはタンパク質合成のどちらにも影響しない。
【０００６】
長鎖および短鎖アルキルＤＮＪ誘導体はどちらも、そのＥＲα−グルコシダーゼ阻害活性により、デングウイルス（ＤＥＮＶ）および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）などのフラビウイルスに対して抗ウイルス性である（Ｃｏｕｒａｇｅｏｔ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７４（１）：５６４−７２；Ｗｕ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（８）：３５９６−６０４を参照）。これに対して、ＤＧＪ誘導体はフラビウイルスに対して抗ウイルス活性を示さないが、長鎖アルキルＤＧＪ誘導体は、ぺスチウイルスの強力なインヒビターである。密接に関連したペスチウイルスおよびヘパシウイルスとは異なり、フラビウイルスは、ｐ７または同等の小さい膜貫通タンパク質を含有しない。そのためＤＮＪおよびＤＧＪ誘導体は、ｐ７または同等のタンパク質を阻害することによって、ウイルス複製を阻害する。
【０００７】
ＨＣＶ陽性鎖ＲＮＡゲノムは、約３０００個のアミノ酸残基の単一ポリタンパク質前駆体をコードする。ポリタンパク質は、ウイルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼによって翻訳と同時に、および翻訳後に処理されて、成熟した構造性タンパク質および非構造性タンパク質Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを生成して（Ｒｅｅｄ，Ｋ．Ｅ．およびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，（２０００に概説されている）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ ＩｍｍｕｎｏＬ ２４２：ｐ．５５−８４）、潜在的なさらなるＦタンパク質がポリタンパク質のＮ末端領域におけるリボソームのフレームシフトから生じる（Ｘｕ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．２０（１４）：ｐ．３８４０−８を参照）。ポリタンパク質前駆体における大半の開裂は翻訳中または翻訳直後に効率的に完了するが、開裂はＥ２／ｐ７およびｐ７／ＮＳ２部位にて遅延され、Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２前駆体の生成を引き起こす。さらにＥ２とｐ７の間の処理が不完全であり、Ｅ２およびｐ７と同様に、Ｅ２−ｐ７の生成も引き起こす（Ｌｉｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（８）：ｐ．５０６３−７３；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（１０）：ｐ．６２１５−２２を参照）。
【０００８】
ＨＣＶ複製用の細胞培養モデルが利用できないため、ＨＣＶ複製に関する情報は、ＢＶＤＶ細胞培養モデルを使用して得られる。そのため大半の実用的なデータは、非常にＨＣＶ ｐ７に類似した、アミノ酸７０個のタンパク質であるＢＶＤＶ ｐ７の研究から得られる。ＢＶＤＶ ｐ７に関する実用的なデータは、ＢＶＤＶの感染性ｃＤＮＡクローン内に変異を導入することによって得られてきた。ｐ７遺伝子全体のフレーム内欠失は、ＢＶＤＶ ＲＮＡ複製に影響を及ぼさないが、非感染性ビリオンの生成を引き起こす。しかしながら感染性ウイルス粒子は、トランスのｐ７を補完することによって産生可能であり（Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，Ｎ．Ｔａｕｔｚ，ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｔｈｉｅｌ，（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２０）：９４９８−５０６を参照）、このことはぺスチウイルスｐ７が感染性子孫ウイルスの生成に不可欠であることを示唆している。
【０００９】
ＨＣＶ ｐ７タンパク質は、膜を２回通過し、細胞外環境に向けられたＮ末端およびＣ末端を有するポリトピック膜タンパク質であることが示されている、アミノ酸６３個のペプチドである（Ｃａｒｒｅｒｅ−Ｋｒｅｍｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（８）：３７２０−３０を参照）。そのためｐ７タンパク質は、２つの膜貫通ドメインを含むことが示されている。Ｎ末端膜貫通ドメインは、ほぼ位置１０からほぼ位置３２までのアミノ酸を含み、Ｃ末端膜貫通ドメインは、ほぼ位置３６からほぼ位置５８までのアミノ酸を含む。２つの膜貫通ドメイン内のアミノ酸は、すべてのＨＣＶ系統間で多少変化するが、報告された系統では、膜貫通ドメイン内のアミノ酸の大部分（通例、約７０％超）が、Ｆ、Ｉ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、およびＡとして特徴付けられる疎水性基の構成要素である。２つの膜貫通ドメインは非疎水性アミノ酸（ＫまたはＲ、Ｇ、ＲまたはＫ）によって連結され、ｐ７のコンセンサス配列は、ＡＬＥＮＬＶＶＬＮＡＡＳＡＡＧＴＨＧＩＬＷＦＬＶＦＦＣＡＡＷＹＶＫＧＲＬＶＰＧＡＴＹＳＬＬＧＬＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号１）である（Ｃａｒｒｅｒｅ−Ｋｒｅｍｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（８）：３７２０−３０を参照）。
【００１０】
サブゲノムレプリコンの研究は、ＨＣＶのｐ７がゲノム複製に必要でないことを示しているが（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（５４２４）：ｐ．１１０−３；Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（３）：ｐ．１２５２−６４を参照）、感染性ウイルス生成におけるその役割は未知である。ＨＣＶ ｐ７は、膜のカチオン透過率を左右し、ビリオンの放出または成熟にとって重要であるビロポリン（viroporin）として既知である、小タンパク質の群の推定構成要素であることが示唆されている。一部のビロポリンでは、膜貫通ドメインが、膜チャネルを形成するのに十分であることが示されている（Ｄｕｆｆ，Ｋ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ａｓｈｌｅｙ，（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０（１）：ｐ．４８５−９；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３０（６）：ｐ．４１６−２０を参照）。
【発明の開示】
【００１１】
１つの実施形態は、ＨＣＶ ｐ７タンパク質の活性をその必要のある対象者、特にヒトにおいて阻害するのに有効なイミノ糖誘導体化合物を投与することによって、ＨＣＶ感染を処置する方法に関する。説明した方法で利用した化合物は、ＨＣＶ ｐ７タンパク質が膜を透過する能力を阻害するのに有効である。最も広い態様において、化合物は以下の式ＩまたはＩＩによって表される：
【化１】
式中、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。
【００１２】
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基である。各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換され、置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の置換基によって置換され、選択された置換基は、同じでも異なっていてもよい。特に適切な置換基は、ノニル、７−オキサノニル、および１０−オキサウンデシルを含み、そして特に望ましい化合物は、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＮ−ＤＧＪ）、Ｎ−７−オキサノニル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ、Ｎ−７−オキサノニル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン、またはＮ−７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪ）、およびＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン、Ｎ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪ、Ｎ−１０−オキサウンデシル−６−デオキシ−ＤＧＪ、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（９−メトキシノニル）−２−メチル−３，４，５−ピペリジントリオール、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオアート（１：１）、またはＳＰ２４０）を含む。
【００１３】
化合物の１つ以上を、ＨＣＶ感染を処置するためのキットとしてパッケージすることができる。キットは、化合物を投与するための手段と同様に、ＨＣＶ感染を処置するための説明書を含むことができる。
【００１４】
別の実施形態は、化合物がＨＣＶ ｐ７活性を阻害する能力をスクリーニングする方法に関する。特に化合物は、ｐ７またはｐ７変異体が膜を透過する能力を化合物が阻害するかどうかに基づいてスクリーニングできる。そのような方法では、人工膜システムまたは細菌システムを利用することが望ましい。
【００１５】
定義
別途規定しない限り、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「１以上」を意味する。
【００１６】
別途規定しない限り、「アルキル」という用語は、本明細書で使用するように、１つ以上の炭素原子を含有する直鎖および分岐鎖アルキルラジカルを指し、例えば、メチル、エチル、ブチル、およびノニルを含む。
【００１７】
「アリール」という用語は、本明細書で使用するように、単環芳香族基、例えばインダニル、ナフチル、またはフルオレニルなどのフェニルまたはベンゾ縮合芳香族基を指す。
【００１８】
「ヘテロアリール」という用語は、１つ以上のヘテロ原子を含有する芳香族化合物を指す。例は、ピリジル、フリル、およびチエニル、あるいはインドリルまたはキノリルなどの、１つ以上のヘテロ原子を含有するベンゾ縮合芳香族（bezofused aromatic）を含む。
【００１９】
「ヘテロ原子」という用語は、本明細書で使用するように、Ｎ、Ｏ、およびＳなどの非炭素原子を指す。
【００２０】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書で使用するように、３、４、５、６、７、または８個の炭素を含有する炭素環を指し、例えば、シクロプロピルおよびシクロヘキシルを含む。
【００２１】
別途規定しない限り、「アルコキシ」という用語は、本明細書で使用するように、１つ以上の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルコキシを指し、例えば、メトキシおよびエトキシを含む。
【００２２】
「アルケニル」という用語は、本明細書で使用するように、エテニルおよびプロペニルなどの、１つ以上の二重結合を含有する直鎖または分岐鎖アルキルを指す。
【００２３】
「アラルキル」という用語は、本明細書で使用するように、ベンジルおよびフェネチルなどの、アリールによって置換されたアルキルを指す。
【００２４】
「アルキニル」という用語は、本明細書で使用するように、エチニルおよびプロピニルなどの、１つ以上の三重結合を含有する直鎖または分岐鎖アルキルを指す。
【００２５】
「アリールオキシ」という用語は、本明細書で使用するように、−ＯＨ基内の水素原子をアリール基と置換することによって作成された置換基を指し、例えばフェノキシを含む。
【００２６】
「アラルコキシ」という用語は、本明細書で使用するように、２−フェニルエトキシなどの、アリール基によって置換されたアルコキシ基を指す。
【００２７】
「アルキルアミノ」という用語は、本明細書で使用するように、メチルアミノ（−ＮＨＣＨ3）およびエチルアミノ（−ＮＨＣＨ2ＣＨ3）などの、１個のアルキル基と置換されたアミノ基を指す。
【００２８】
「ジアルキルアミノ」という用語は、本明細書で使用するように、ジメチルアミノ（−Ｎ（ＣＨ3）2）およびジエチルアミノ（−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ3）2）などの、２個のアルキル基と置換されたアミノ基を指す。
【００２９】
「ＤＮＧ」という用語は、本明細書で使用するように、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールすなわち「デオキシノジリマイシン」を意味する。
【００３０】
「ＤＧＪ」という用語は、本明細書で使用するように、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトールすなわち「デオキシガラクトノジリマイシン」を意味する。
【００３１】
「ＢＬＭ」という用語は、本明細書で使用するように「脂質黒膜（black lipid membrane）」を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
開示された方法で利用された化合物は、ＨＣＶ ｐ７のインヒビターとして有効である。最も広範な態様において、化合物は、式ＩまたはＩＩによって示される：
【化２】
【００３３】
１つの態様において、方法は、式Ｉの化合物を投与することを考慮している。Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択される。各置換基は同じでも異なっていてもよい。
【００３４】
好ましい実施形態において、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つは、ヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）である。あるいはＲ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'はの少なくとも１つは、ヒドロキシ基（−ＯＨ）である。最も好ましい実施形態は、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨから選択されることを考慮する。
【００３５】
Ｒ2は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルから選択される置換基である。直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルはそれぞれ任意選択的に置換され、置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；ならびに−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって置換される。
【００３６】
Ｒ2は好ましくは、直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、または置換Ｃ1-18アルキル基である。Ｒ2はさらに好ましくは、直鎖Ｃ7-11アルキル、分岐Ｃ7-11アルキル、置換Ｃ7-11アルキル、あるいはＣ1-6アルコキシによって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキルである。直鎖Ｃ7-11アルキル置換基であるＲ2の例は、ヘプチル、オクチル、およびノニルを含む。置換アルキル基であるＲ2の例は、７−オキサノニル（−ＣＨ2（ＣＨ2）5−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3）である。Ｒ2は最も好ましくは、Ｎ−ノニル、７−オキサノニル、または１０−オキサウンデシルである。
【００３７】
式Ｉのある実施形態において、化合物は、以下の式の１つとして表される：
【化３】
【００３８】
上の式の各環炭素原子における空間的配置は、他の環炭素原子における空間的配置と独立して変化する。さらに好ましくは、化合物は、表Ｉに示す式の１つを有する：
［表Ｉ］
【化４】
【００３９】
さらに好ましくは、化合物は式の１つを有する：
【化５】
【００４０】
なおさらに好ましくは、Ｒ2はノニル、７−オキサノニル、または１０−オキサウンデシルであり、最も好ましい化合物は、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＮ−ＤＧＪ）、Ｎ−７−オキサノニル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ、Ｎ−７−オキサノニル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン、またはＮ−７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪ）、およびＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン、Ｎ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪ、Ｎ−１０−オキサウンデシル−６−デオキシ−ＤＧＪ、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（９−メトキシノニル）−２−メチル−３，４，５−ピペリジントリオール、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオアート（１：１）、またはＳＰ２４０）およびその異性体、例えば：
【化６】
を含む。
【００４１】
開示した方法の別の態様は、式ＩＩの化合物を投与することを考慮する。Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；およびヘテロアリールからなる群より選択される。各置換基は同じでも異なっていてもよい。
【００４２】
好ましい実施形態において、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも１つは、ヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）である。あるいはＲ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つは、ヒドロキシ基（−ＯＨ）である。最も好ましい実施形態は、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨから選択されることを考慮する。
【００４３】
式ＩＩにおいて、Ｒ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルから選択される置換基である。直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルはそれぞれ任意選択的に置換され、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；ならびに−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって置換される。
【００４４】
Ｒ4は好ましくは、直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、または置換されたＣ1-18アルキル基である。Ｒ4はさらに好ましくは、直鎖Ｃ7-11直鎖１アルキル、分岐Ｃ7-11アルキル、置換されたＣ7-11アルキル、あるいはＣ1-6アルコキシによって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキルである。直鎖Ｃ7-11アルキル置換基であるＲ4の例は、ヘプチル、オクチル、およびノニルを含む。置換アルキル基であるＲ4の例は、７−オキサノニル（−ＣＨ2（ＣＨ2）5−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3）である。Ｒ4は最も好ましくは、Ｎ−ノニル、７−オキサノニル、または１０−ウンデシルである。
【００４５】
１つの実施形態において、ＨＣＶ ｐ７タンパク質またはｐ７タンパク質を含む膜の成分のどちらかを、ｐ７タンパク質の活性を阻害する１つ以上の化合物と接触させることを含む、ＨＣＶ感染を処置する方法が開示される。発明者らは、ｐ７タンパク質がおそらく膜チャネルタンパク質として作用することによって、膜の透過性を上昇させることを示した。加えて発明者らは、特定の化合物がｐ７の膜を透過する能力を阻害することを示した。しかしながら開示した方法は、本明細書で開示した化合物がｐ７タンパク質の他の活性も阻害することを考慮している。
【００４６】
選択した化合物は、ｐ７タンパク質の１つ以上の活性を、タンパク質と相互作用することによって阻害する。この例では、詳細な結合アッセイで示すように、ｐ７タンパク質と、ほぼ、Ｋapp＝１３０μＭ（すなわちＫapp＝１１４．２（±１８．３）μＭ）を超えない見かけの結合定数で結合する化合物を選択することが望ましい。あるいは、詳細な透過性アッセイで示すように、化合物が約１８０μＭを超えない濃度で存在する場合に、ｐ７タンパク質が膜を透過する能力を遮断する化合物を選択することが望ましい。
【００４７】
選択した化合物がｐ７の膜を透過する能力を阻害する場合、化合物はｐ７がチャネルを形成するのを防止するか、または化合物はチャネルが形成された後にチャネルを遮断する（すなわちチャネルブロッカーとして）。あるいは化合物は、リン脂質などの膜の１つ以上の成分と相互作用して、それにより膜の流動性または局所特性を変化させることによって、ｐ７タンパク質を阻害する。そのため化合物は、ｐ７が機能性膜チャネルを形成する能力を阻害できる。
【００４８】
なお別の実施形態において、ＨＣＶ ｐ７の活性を阻害するために有効な、潜在的な抗ウイルス剤をスクリーニングする方法が提供される。通例、方法は、ｐ７またはｐ７変異体を膜システムに包含させることと、例えば標準方法を用いて、膜に通じる電流を記録することによって、透過性の上昇を観察することと、を含む。次に試験化合物を膜システムに添加して、ｐ７が膜を透過する能力を、化合物が阻害するかどうかを判定する。理想的な化合物は、約１８０μＭを超えない濃度にて、ｐ７が膜を透過する能力を完全に遮断する。
【００４９】
脂質黒膜（「ＢＬＭ」）は、本発明の方法で使用されるが、他の膜システムも同様に利用できる。脂質黒膜は当分野で周知であり、ＢＬＭは、例えばチャネル形成タンパク質によって仲介されるような膜透過性を研究するために一般に使用される（Ｄｕｆｆ，Ｋ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ａｓｈｌｅｙ，（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０（１）：ｐ．４８５−９を参照）。
【００５０】
ｐ７活性を観察するための適切な膜システムを選択した後、ｐ７含有膜を形成するためにｐ７を膜に包含させることができる。ｐ７タンパク質は、ｐ７タンパク質が選択した膜の透過性の向上を示すことができるどのＨＣＶ系統から選択してもよい。例えば、ＨＣＶ−Ｈ系統からのｐ７タンパク質が選択可能であり（すなわちＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号：１））、または別の系統からのｐ７タンパク質が選択できる。報告されたｐ７タンパク質のアミノ酸配列を比較することによって得られるｐ７コンセンサス配列を使用することが望ましく、または特定のＨＣＶクレード（例えばクレード１）からのｐ７タンパク質を選択することが望ましい。
【００５１】
スクリーニング方法の別の実施形態において、変異体（variant）が機能性である（例えば変異体が当分野で既知の方法によって判定されるように、選択した膜を透過することが示される）という条件で、選択したｐ７タンパク質の変異体を使用することが望ましい。考えられる変異体は、融合、欠失、および／または変異あるいは置換を含む。例えば、上述の方法での使用のために、ビオチン化ｐ７タンパク質を作成することが望ましい。別の例において、選択した膜を透過することを示すことができる、（例えば選択したｐ７タンパク質または変異体が、ＢＬＭにおいて約６０ｐＳ（すなわち８６±２２ｐＳ）以上の伝導度レベルを示す）ｐ７またはｐ７の誘導体の少なくとも部分を使用することが望ましい。選択したｐ７アミノ酸配列内に変異を作成することも望ましい。変異を作成する場合、ＨＣＶ系統間の比較に基づく、所与の位置におけるアミノ酸の決定的特徴を維持することが望ましい。例えば、異なるＨＣＶ系統からのｐ７配列の比較は、あるアミノ酸位置が「疎水性」、「中性」、または「親水性」として特徴付けられることを示している（Ｃａｒｒｅｒｅ−Ｋｒｅｍｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（８）：３７２０−３０を参照）。「疎水性アミノ酸」は、群Ｆ、Ｉ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、およびＡに属するとして特徴付けられる。
【００５２】
選択したｐ７タンパク質または変異体は、人工的に合成するか、あるいは細菌細胞または真核細胞などの適切な生体系で発現させることができる。タンパク質が選択した膜システムに包含された後、膜の透過性を測定してタンパク質が（例えば透過性の上昇または細胞生存性の低下を引き起こす）活性を示すかどうかを判定することができる。試験化合物をタンパク質および／またはｐ７含有膜の成分と接触させて、化合物がタンパク質の活性を阻害するかどうかを判定することができる。上述の方法において、試験化合物は、ｐ７を膜に含有させる前および／または後に、ｐ７および／またはｐ７含有膜の成分に接触させることができる。
【００５３】
１つの実施形態において、スクリーニング方法でイミノ糖誘導体を試験化合物として使用することが望ましい。特にＤＧＪまたはＤＮＪのアルキル化誘導体を、本明細書で述べられているように試験化合物として使用することが望ましい。アルキル化イミノ糖の誘導体Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＮ−ＤＧＪ）、Ｎ−７−オキサノニル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ、Ｎ−７−オキサノニル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン、またはＮ−７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪ）、およびＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン、Ｎ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪ、Ｎ−１０−オキサウンデシル−６−デオキシ−ＤＧＪ、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（９−メトキシノニル）−２−メチル−３，４，５−ピペリジントリオール、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオアート（１：１）、またはＳＰ２４０）および／またはその異性体が特に望ましい。
【００５４】
別の実施形態において、方法における試験化合物としてのｐ７または他の膜成分と相互作用することが示された化合物またはその誘導体を使用することが望ましい（例えばｐ７とインビトロで相互作用することが示された化合物）。なお別の実施形態において、ｐ７または他のタンパク質のどちらかによるチャネル形成を妨害することが示された化合物、および／またはｐ７または他のタンパク質によって形成されたチャネルの既知のブロッカーである化合物、またはその誘導体を方法における試験化合物として使用することが望ましい。例えばアマンタジンは、インフルエンザＡ型ウイルスＭ２チャネルの既知のチャネルブロッカーである（Ｈａｙ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４（１１）：ｐ．３０２１−４；Ｄｕｆｆ，Ｋ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ａｓｈｌｅｙ，（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０（１）：ｐ．４８５−９；Ｓｕｎｓｔｒｏｍ、Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１５０（２）：ｐ．１２７−３２；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３０（６）：ｐ．４１６−２０を参照）。近年、他者は、ｐ７が、アマンタジンによって遮断されるイオンチャネルを形成することを示唆している（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３，Ｊａｎ．２０；５３５（１−３）：３４−８）。そのため、アマンタジンまたはその誘導体を方法における試験化合物として使用することが望ましい。
【００５５】
１つの実施形態において、誘導型細菌システムを利用して透過性を観察することが可能であり、細菌細胞膜の透過性の上昇は、細胞増殖の停止を引き起こす。例えばｐ７またはその変異体が、適切な細菌システムから誘導型プロモーターから発現されて、細胞が細胞増殖の停止を示すかどうかを判定することができる。あるいは透過性の上昇は、ｐ７発現の誘導前に［3Ｈ］−ウリジンなどの放射性分子で細胞を標識することによって確認できる。ｐ７発現の誘導後に、［3Ｈ］−ウリジンの培地への放出を測定することによって透過性を評価できる。試験化合物を細菌に投与して、化合物が細胞増殖を停止させるかどうか、および／または化合物が［3Ｈ］−ウリジンの培地への放出を防止するかどうかを判定することができる。
【００５６】
化合物の調製
本明細書で述べた方法の使用のための化合物は、開始物質として使用した市販のイミノ化合物から調製できる。市販元は、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ；英国チェシア州ノリッジのＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；およびカナダオンタリオ州のＴｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓを含む。
【００５７】
あるいは本化合物は、当業者に既知の合成方法によって調製できる。例えば、各種のデオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）誘導体の合成は、米国特許第５，６２２，９７２号、米国特許第５，２００，５２３号、米国特許第５，０４３，２７３号、米国特許第４，９４４，５７２号、米国特許第４，２４６，３４５号、米国特許第４，２６６，０２５号、米国特許第４，４０５，７１４号、および米国特許第４，８０６，６５０号ならびに米国特許出願第１０／０３１，１４５号に述べられている。本明細書で述べる他のイミノ糖化合物が既知であり、米国特許第４，８６１，８９２号、米国特許第４，８９４，３８８号、米国特許第４，９１０，３１０号、米国特許第４，９９６，３２９号、米国特許第５，０１１，９２９号、米国特許第５，０１３，８４２号、米国特許第５，０１７，７０４号、米国特許第５，５８０，８８４号、米国特許第５，２８６，８７７号、米国特許第５，１００，７９７号、および米国特許第６，２９１，６５７号に示されている方法によって調製できる。
【００５８】
薬学的組成物
化合物を薬学的組成物または医薬品として投与することが望ましい場合、本明細書で開示した化合物は、各種の投与方式のために処方することができる。技法および処方は一般に、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１８ｔｈ ｅｄ．），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０）に見出される。
【００５９】
医薬品は、いずれかの適切な経路による、例えば経口（頬側または舌下を含む）、直腸、経鼻、局所（頬側、舌下または経皮を含む）、あるいは非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路による投与に適しているが、経口投与が好ましい。そのような組成物は、製薬業界で既知のいずれかの方法によって、例えば滅菌条件下で活性成分を担体と混合することによって調製できる。
【００６０】
薬学的に許容される塩は当業者に一般に周知であり、一例としてこれに限定されるわけではないが、アセテート、ベンゼンスルホナート、ベシラート、ベンゾアート、バイカーボネート、バイタートラート、ブロミド、カルシウムエデタート、カムシラート、カーボネート、シトレート、エデタート、エディシラート、エストラート、エシラート、フマレート、グルセプタート、グルコナート、グルタメート、グリコリルアルサニラート、ヘキシルレソルシナート、ヒドラバミン、ヒドロブロミド、ヒドロクロライド、ヒドロキシナフトアート、ヨージド、イセチオナート、ラクテート、ラクトビオナート、マラート、マレアート、マンデラート、メシラート、ムカート、ナプシラート、ニトレート、パモアート（エンボナート）、パントテナート、ホスフェート／ジホスフェート、ポリガラクツロナート、サリチラート、ステアラート、サブアセテート、スクシナート、サルフェート、タンナート、タートラート、またはテオクラートを含む。他の薬学的に許容される塩は、例えば、前記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１８ｔｈ ｅｄ．）に見出される。
【００６１】
好ましい薬学的に許容される塩は例えば、アセテート、ベンゾアート、ブロミド、カーボネート、シトレート、グルコナート、ヒドロブロミド、ヒドロクロライド、マレアート、メシラート、ナプシラート、パモアート（エンボナート）、ホスフェート、サリチラート、スクシナート、サルフェート、またはタルトラートを含む。
【００６２】
注射の場合、化合物および薬剤は、水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理的食塩緩衝液などの、生理学的に適合性の緩衝液中で調合できる。そのような経粘膜の場合、透過されるバリアに適した浸透剤を調合物中で使用する。そのような浸透剤は一般に当分野で既知である。
【００６３】
方法の実施のために本明細書で開示した化合物を全身投与に適切な投薬形に調合するための、薬学的に許容される担体の使用は、本発明の方法の範囲内である。担体および適切な製造慣行の適正な選択によって、本発明の方法の組成物、溶液として調合される組成物は、例えば静脈内注射によって非経口的に投与できる。化合物は、当分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して、経口投薬に適切な投薬形にただちに調合できる。そのような担体は、処置される患者による経口摂取のために、方法の化合物が錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして調合できるようにする。
【００６４】
本方法での使用に適切な薬学的組成物は、その意図する目的を達成するために、活性成分が有効量で含有される組成物を含む。有効量の決定は、特に本明細書で提供された詳細な開示に照らして、当業者の能力の十分範囲内である。
【００６５】
活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用できる調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む、薬学的に許容される適切な担体を含有する。経口投与用に調合された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、または溶液の形である。
【００６６】
本明細書で述べ、本明細書で提供する方法でも使用される医薬品は、以下の１つ以上：保存料、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、着臭剤、塩、緩衝剤、コーティング剤または抗酸化剤を含むことができる。それらは、本明細書で述べた化合物および／または薬剤に加えて、治療的に活性な薬剤も含有できる。経口用の薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠の核を得るために、化合物を固体賦形剤と組合せることと、任意選択的に、得られた混合物を粉砕することと、望ましい場合には適切な助剤を添加した後に細粒の混合物を加工することによって得られる。適切な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）である。望ましい場合、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を添加できる。
【００６７】
経口的に使用できる薬学的調製物は、ゼラチンよりなるプッシュフィット型カプセルはもちろんのこと、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤よりなる軟質の密封カプセルも含む。プッシュフィット型カプセルは、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどのバインダー、および／またはタルクまたはステアリル酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択的に、安定剤などと混合して含有できる。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの適切な液体に溶解または懸濁させることができる。加えて、安定剤を添加できる。
【００６８】
投与経路
ここで各種の投与経路を詳細に検討する。
ａ．経口投与
経口投与に適した医薬品は、カプセルまたは錠剤として、粉末または細粒として、（水性または非水性液体中の）溶液、シロップまたは懸濁物として、食用フォームまたはホイップとして、あるいはエマルジョンとして提供される。
【００６９】
錠剤または硬質ゼラチンカプセルは、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリル酸またはその塩を含む。
【００７０】
軟質ゼラチンカプセルは、植物油、ワックス、脂質、半固体または液体ポリオールなどを含む。
【００７１】
溶液およびシロップは、水、ポリオールおよび糖を含む。懸濁物の調製の場合、油（例えば植物油）を用いて、水中油型懸濁物または油中水型懸濁物を提供できる。
【００７２】
ｂ．経皮投与
経皮投与に適した医薬品は、長期間に渡ってレシピエントの表皮との密接接触を維持することを目的とした個別パッチとして提供できる。例えば活性成分は、イオン導入によってパッチから送達できる（イオン導入は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（６）：３１８（１９８６）に述べられている）。
【００７３】
ｃ．局所投与
局所投与に適した医薬品は、軟膏、クリーム、懸濁ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾールまたはオイルとして提供できる。
【００７４】
目または他の外部組織、例えば口および皮膚の感染では、好ましくは局所軟膏またはクリームが使用される。軟膏を調合する場合、活性成分は、パラフィン性または水混和性軟膏ベースのどちらかと共に利用できる。あるいは活性成分は、水中油型または油中水型ベースを用いてクリームに調合できる。
【００７５】
目への局所投与に適した医薬品は、点眼液を含む。ここで活性成分は、適切な担体、例えば水溶液に溶解または懸濁させることができる。
【００７６】
口での局所投与に適した医薬品は、トローチ剤、ドロップ、およびマウスウォッシュを含む。
【００７７】
ｄ．直腸投与
直腸投与に適した医薬品は、坐薬または浣腸剤として提供できる。
【００７８】
ｅ．経鼻投与
固体担体を使用する経鼻投与に適した医薬品は、粗粉末を含む（２０〜５００ミクロンの範囲の粒子を有する）。これは、嗅剤が摂取される方法、すなわち鼻付近に保持された粉末容器から鼻を通じた迅速な吸引によって投与することができる。
【００７９】
液体担体を使用する経鼻投与に適した組成物は、鼻用スプレーまたは点鼻剤を含む。これらは活性成分の水性または油性溶液を含むことができる。
【００８０】
吸入による投与に適した医薬品は、各種の器具、例えば加圧エアゾール、噴霧器または吸入器によって生成される、微粒子粉末またはミストを含む。そのような器具は、活性成分の規定投薬量を提供するように構成できる。
【００８１】
ｆ．非経口投与
非経口投与に適した医薬品は、水性および非水性滅菌注射用溶液または懸濁物を含む。これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および組成物を対象となるレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含有できる。そのような組成物中に存在する他の成分は、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油を含む。非経口投与に適した組成物は、単位用量または複数回用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供可能であり、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用滅菌水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵できる。即時使用のための注射溶液および懸濁物は、滅菌粉末、細粒および錠剤から調製できる。
【００８２】
ｇ．投薬量
投薬量は、通常の試験によってただちに決定でき、医師または臨床医の管理下に置かれるであろう。適切な用量を決定するための指針は、適切に有効であるが非毒性の、または許容される毒性の、物質の量の送達であろう（例えばＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照）。ＮＮ−ＤＮＪまたは同様の化合物の場合、成人の１日投薬量は、活性剤０．１ｍｇから５ｇまでの範囲であると予想され、３から２４００ｍｇまで、好ましくは５から８００ｍｇまで、さらに好ましくは１５から４００ｍｇまで、そして最も好ましくは１５から１００ｍｇまでの範囲である。投薬量は、単一の１日用量あるいは１日に２、３回またはそれ以上の用量で投与できる。
【００８３】
以下の実施例は、上述の方法を説明するためにだけ提供する。それらは本明細書で述べた発明の範囲を決して制限するものではない。
【実施例１】
【００８４】
細菌における誘導型ｐ７発現
以下の一連の実験は、ｐ７が細菌中で誘導的に発現できることを証明する。実験を利用して、ｐ７またはｐ７変異体が膜を透過できるかどうかを判断できる。実験は、ｐ７発現が細胞増殖の停止をもたらし、さらにｐ７発現が放射性標識ウリジンの放出をもたらすことも示している。
【００８５】
実施例１．１ 物質及び方法
ｐ７発現プラスミドの作成
ＤＮＡ操作による組換えプラスミドの作成には、標準クローニング手順を使用した。ＨＣＶ ｐ７のコード領域は、Ｊ．Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎが快く提供してくれたＨＣＶ １ａ系統ｃＤＮＡをコードするプラスミドｐＴＭ１／ＣＥ１Ｅ２ｐ７（ＡＦ００９６０６）をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲ反応は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー１，ＡＡＧＣＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＣＧＴＡＡＴＡＣ（配列番号２）およびオリゴヌクレオチドプライマー２、ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣ（配列番号３）を使用して実施した。プライマー１および２は、ｐ７の５’および３’末端領域をそれぞれコードする。５’末端のＮｃｏＩ制限部位および３’末端のＥｃｏＲＩ制限部位を作成するために、下線配列をプライマー内に導入した。得られたＰＣＲ生成物を精製し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩによって事前に消化したｐＴｒｉＥｘ１．１発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）と連結させた。連結混合物を使用して、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｒ．ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞（ＣＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を形質転換した。組換えプラスミドを含有する細菌性クローンを５０μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｓｉｇｍａ）含有培地で培養した。ＰＣＲ反応中に変異が導入された可能性を排除するために、プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析を受けさせ、Ｔ７プロモーターのプライマーおよびプライマー２を使用して配列決定した。単離したｐ７含有プラスミドをｐＴｒｉＥｘ１．１ｐ７と命名した。
【００８６】
細菌におけるｐ７発現の誘導
ｐＴｒｉＥｘ１．１またはｐＴｒｉＥｘ１．１ｐ７プラスミドのどちらかを含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｒ．ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞のコロニー１個をＬＢ培地中、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンの存在下で、ＯＤ600nmが０．５に達するまで、３７℃にて振とうすることによって培養した。これらのスターター培地３ｍｌを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび０．４％のグルコースを含有するＬＢ培地１００ｍｌに添加し、同じ条件下で細胞を増殖させた。細胞が０．５〜０．７のＯＤ600nmに達したときに、１ｍＭのイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｒｏｃｈｅ）を添加してｐ７発現を誘導し、ＯＤ600nmを監視することによって、そのさらなる増殖を追跡した。非形質転換細菌（ｐＴｒｉＥｘ１．１プラスミドなし）をカルベニシリンの存在下で培養した。
【００８７】
細菌細胞からの［3Ｈ］−ウリジンの放出
細菌は上述のように、しかし今回は、２μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］−ウリジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）の存在下で、ＯＤ600nmが０．５に達するまで増殖させた。次に細胞をペレット化し、ＰＢＳによって３回洗浄し、２５ｍｌの培地中で再懸濁させた。１５分後、１ｍＭのＩＰＴＧの添加によりｐ７発現を誘導した。各種の誘導後時間に分割量０．５ｍｌを取出し、遠心分離によって細胞をペレット化して、上澄みをＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル（Ｐａｃｋａｒｄ，英国）３．５ｍｌと混合し、培地中に放出された放射能を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ３８０１シンチレーションカウンタを用いてシンチレーション計数によって定量した。
【００８８】
実施例１．１ 結果
細菌における誘導型ｐ７発現
膜透過性に対するＨＣＶ ｐ７の効果を評価するために、厳密に制御されたＴ７ｌａｃプロモーターによって調節されたＩＰＴＧ誘導系を使用して、ｐ７をＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞にて発現させた（Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９（１）：ｐ．４５−５９を参照）。Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを有し、十分なｌａｃリプレッサーをｐＬａｃＩプラスミドから供給して、非誘導状態における厳密な抑制を確保する（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ａｎｄ Ｂ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ，（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９（１）：ｐ．１１３−３０を参照）。宿主細胞に対するｐ７発現の効果は、ＩＰＴＧによる誘導後の各種時間における細胞密度を監視することによって追跡した。ＩＰＴＧ添加は、非形質転換細胞（図１Ａ、上パネル）およびｐＴｒｉＥｘ１．１によって形質転換された細胞（図１Ｂ、上パネル）に対して効果を持たなかったのに対して、ｐ７の発現は、たいてい大腸菌細胞膜での孔形成のために、細胞数増殖の停止を引き起こした（図１Ｃ、上パネル）。
【００８９】
ＨＣＶ ｐ７を発現する細菌からの化合物の流出を分析するために、組換えクローンに放射性標識ウリジンを装填して、放射能の放出を誘導後の各種の時点で測定した（図１、下パネル）。［3Ｈ］−ウリジンの著しい流出は、非形質転換細胞または親プラスミドを有するクローンによっては観察されなかった（図１ＡおよびＢ、下パネル）。ｐ７を発現する細胞は、ｐ７合成の誘導の２時間後に、培地中に［3Ｈ］−ウリジンの放出を開始した。［3Ｈ］−ウリジンの放出は、４時間の監視期間中に上昇し（図１Ｃ）、ｐ７が外部細胞膜の透過性を誘導したことを示す。
【実施例２】
【００９０】
合成ｐ７のＢＬＭへの取り込み
以下の一連の実験は、チャネル記録によって測定されたように、合成ｐ７がＢＬＭの透過性を上昇できることを証明する。実験は、長鎖アルキルイミノ糖誘導体がｐ７活性を阻害することも示す。
【００９１】
実施例２．１ 物質および方法
ペプチド合成および生成物の品質管理
Ｎ末端にビオチンタグが添加されたｐ７（ＨＣＶ Ｈ系統）に該当するペプチド（ビオチン−ＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号４））５０ｍｇは、英国のＡｌｂａｃｈｅｍが合成した。ｐ７ペプチドは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって分析した。ｐ７タンパク質を４０％のアセトニトリルに溶解して、１ｍｇ／ｍｌのペプチドを含有する溶液を与えた。この溶液の分割量１μｌを、１６ｍＭのオクチル−グルコシド溶液を含有する飽和α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の９５：５アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）溶液１μｌと混合した。この混合物の分割量（１μｌ）を質量分析計ターゲットに置き、空気乾燥させた。検出した質量は、トリプシン自家消化を使用して外部校正した。質量スペクトルは、リフレクトロンモードで動作しているＴｏｆＳｐｅｃ ２Ｅ質量分析計（英国、マンチェスター、ウィゼンショー、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を用いて記録した。ソース電圧、抽出電圧および焦点電圧はそれぞれ、２００００、１９９５０および１６０００Ｖであった。すべてのデータは、Ｍａｓｓ Ｌｙｎｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２ソフトウェアを用いて解析した。ＭＡＬＤＩ質量分析法解析の後、全長ｐ７ペプチドに相当する、すなわちｍ／ｚ ７２４７．８におけるピークを観測した。
【００９２】
全長ペプチドの純度を測定するために、ペプチドは、Ｓｃｈａｇｇｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６（２）：ｐ．３６８−７９が開発した方法の改訂版を使用してトリス−トリシンゲル電気泳動をさらに受けさせた。簡単には、４０％のアセトニトリル／水（５００μｇ／ｍｌ）に溶解させたｐ７（５μｇ）をトリシンサンプル緩衝液中で、分離ゲル（２０．１８％のＴ、０．８３％のＣ）、スペーサーゲル（１１．４４％のＴ、０．３４％のＣ）、およびスタックゲル（１０．９％のＴ、０．３２％のＣ）よりなるゲル（８×１０ｃｍ2）に付着させ、Ｔは両方のモノマー（アクリルアミドおよびビスアクリルアミド）の総パーセンテージ濃度であり、Ｃは、Ｔに対する架橋剤のパーセンテージ濃度である。ゲルは、サンプルがスタックゲルに完全に入るまで３０Ｖの一定電圧で泳動させ、その後、電圧を１１０Ｖまで上昇させた。
【００９３】
ゲルは、銀染色法およびウェスタンブロッティングの両方によって分析した。銀染色法では、ゲルを５０％メタノール中で１０分間、５％メタノール中で１０分間洗浄した。次にゲルを４０μＭのＤＴＴ溶液で１０分間インキュベートしてから水ですすぎ、０．１％ＡｇＮＯ3水溶液で１０分間インキュベートした。次に水で１０秒間、３回洗浄してから、展開溶液（水２５０ｍｌ中に７．５ｇのＮａＣＯ3、ホルムアルデヒド１２５μｌ）を添加した。展開プロセスは固体クエン酸１水和物の添加によって停止させた。ゲルを水ですすいで、乾燥前に３５％エタノール／２％グリセロールに浸漬した。
【００９４】
ウェスタンブロット分析では、ゲルからのタンパク質を、セミドライ電気ブロッター（４０ｍＡにて２時間）（Ｍｅｒｃｋ）を用いて、トランスファー緩衝液（２４ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）中で、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）に移した。３％のミルクを含有するＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ中で膜を一晩ブロッキングして、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ、１％ミルク中に１μｇ／ｍｌ）を用いて室温にて３時間インキュベートした。次にＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ、１％ミルクで洗浄し、メーカーの説明書に従ってＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を用いて展開した。
【００９５】
銀染色したゲルおよびウェスタンブロットの両方が、予想された分子量の１つの主要な種を明らかにし（図２）、ロードしたタンパク質の少なくとも一部が全長のビオチン化ｐ７タンパク質を含有することを示した。しかし、尿素を含むゲルと含まないゲルとの分離の差は、以前に観察されているため、尿素の非存在下で化学合成ｐ７を再分析した。ストレプトアビジンプローブ化ウェスタンブロットは、全長ビオチン化ｐ７の存在を明らかにしたが、銀染色したゲルでは、全ｐ７の５０〜６０％を構成する、見かけの分子量のほぼ半分のさらなる広いバンドが観察された。この広いバンドは、質量分析法によって観察された種に由来する、より小さい非ビオチン化ｐ７に該当し、その質量は理論的に、Ｎ末端膜貫通ドメインを含有するｐ７の断片に一致する。ｐ７の切断形からの全長ｐ７の分離が困難であることが判明したため、次に、脂質黒膜でのチャネル記録では混合物を使用した。
【００９６】
脂質黒膜（ＢＬＭ）でのチャネル記録
膜力学を調査するためのＢＬＭの作成は、当分野で周知である。ＢＬＭは、テフロン（登録商標）薄膜（厚さ約２５μｍ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国、オハイオ州）の縦軸の直径約１００μｍの楕円形開口に渡って作成した（Ｍｏｎｔａｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９（１２）：ｐ．３５６１−６を参照）。脂質（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）：１パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）（４：１（ｗ／ｗ））の混合物４０μｌをペンタン（５ｍｇ／ｍｌ）に溶解させ、水副相（０．５Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）の上に広げた。これにより、脂質約０．２ｍｇがテフロン（登録商標）薄膜の各側に被着した。溶媒が蒸発する１０分間の期間の後、チャンバ内の緩衝液レベルをテフロン（登録商標）膜の穴より上に上昇させて、ＢＬＭを形成させた。安定なＢＬＭの形成の後、最終濃度約５０μＭを達成するために、（エタノールに溶解させた）ＨＣＶ ｐ７タンパク質を２００倍過剰のストック溶液から接地したトランス側チャンバの水副相に添加した（二層の両側の各チャンバの体積：２ｍｌ）。記録は、約１０分間の時間遅延の後に出現した。電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ １Ｄ増幅器を用いて、５ｋＨｚの割合で記録した。データは、５０Ｈｚのカットオフ周波数を用いてフィルタリングして、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ ５．０を使用してさらに解析した。ＮＮ−ＤＮＪ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＮＮ−ＤＧＪ（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびＮ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）の１０ｍＭストック溶液からの、ならびにＮＢ−ＤＮＪ（Ｓｉｇｍａ）およびＮＢ−ＤＧＪの１００ｍＭストック溶液からの薬剤を、シス側またはトランス側のどちらかに添加した。薬剤濃度の上昇は、測定チャンバへの等量の連続添加によって実施した。データは、薬剤添加の約１分後に、１００ｍＶにて約３分間記録した。
【００９７】
実施例２．２． 結果
ＢＬＭへのｐ７の取り込み
ｐ７の緩衝液チャンバへの添加は、ＢＬＭに渡るチャネルシグナルを記録することによって決定されたように、ＢＬＭの透過性を向上させる。チャネルは、−１００ｍＶにて最大２ｎＳの伝導度レベルを有していた（図３Ａ）。検出された最小平均伝導度レベルは、＋５０ｍＶにおいて約８６±２２ｐＳであった（表１）。
【００９８】
【表１】
【００９９】
定義した伝導度レベルの継続期間は、数百ミリ秒から数秒までの範囲である。安定した長期継続する伝導状態は、約１００ｐＳ（およびその倍数）だけ異なり、伝導度が約１００ｐｓの、かなり安定したチャネルの形成を示唆している。記録の変動は、サブ伝導状態の存在を示す。＋１００ｍＶにて得たヒストグラム例を、図３Ｂに示す。同じサンプルを用いた長期測定は、ノイズレベルの上昇を生じさせ、これは定義された伝導度レベルの割当を最終的に除外した（図３Ｃ）。一部の実験では、ＢＬＭへのｐ７の挿入は、爆発様活性を生じさせた（例えば図４、左上パネル）。
【０１００】
ビオチン−ｐ７タンパク質を含有する膜のストレプトアビジン金染色および続いての透過電子顕微鏡法による複合体の検出は、生合成によって合成されたＨＣＶ ｐ７で報告されたように、ビオチン−ｐ７タンパク質がチャネルのように見えることを示している（データは示さず）（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３，Ｊａｎ．２０；５３５（１−３）：３４−８を参照）。（Ｐａｖｌｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００３，Ｍａｙ １３；１００（１０）：６１０４−８も参照）。
【０１０１】
ＢＬＭに添加された膜貫通ドメインＩ（「ＴＭＤ Ｉ」）、（例えばＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫ（配列番号５））を含むペプチドも、膜貫通ドメインＩＩ（「ＴＭＤ ＩＩ」）、（例えばＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号６））を含むペプチドも、チャネルシグナルの欠如によって判断されるように、それ自体でチャネルを形成することができなかった（データは示さず）。両方のドメインをＢＬＭに添加しても、チャネルは形成されなかった（データは示さず）。
【０１０２】
上昇する薬剤濃度のイミノ糖誘導体を膜の片側で緩衝液に添加して、ｐ７誘導チャネル活性に対するその効果を追跡した。短鎖アルキル誘導体ＮＢ−ＤＧＪおよびＮＢ−ＤＮＪでは、ｐ７チャネル活性は不変のままである（図４、上パネル）。同様に、Ｎ−オクチルグルコシドは３．０ｍＭまで、チャネル活性に対する効果を持たなかった（データは示さず）。しかしながら、増加する量の長鎖アルキル誘導体ＮＮ−ＤＧＪ、ＮＮ−ＤＮＪおよびＮ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪの添加は、ｐ７チャネルシグナルの用量依存性阻害を引き起こした（図４、下パネル、および図５）。得られた積分正規化電流トレースのグラフ表示およびそれぞれのＳ字形適合（図６）から、おおよその結合定数を導出した。ＮＮ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１０．４（±１９．９）μＭ、ＮＮ−ＤＮＪでは、Ｋapp＝４５．２（±１０．７）μＭ、およびＮ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１４．２（±１８．３）μＭ。チャネル活性の完全な遮断は、ＮＮ−ＤＧＪでは約１４０μＭで、ＮＮ−ＤＮＪでは１０５μＭで、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪでは１８０μＭで観察された。漏れ電流は、いずれの薬剤の上昇濃度でも観察されなかった。
【０１０３】
同様に、増加する量の長鎖アルキル誘導体、ＳＰ２４０（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン）の添加は、ｐ７チャネルシグナルの用量依存性阻害を引き起こした（図７）。チャネル活性の完全な遮断は、ＳＰ２４０では約１００μＭで観察される。
【０１０４】
明細書で引用したすべての特許および他の参考文献は、本発明が関連する当業者の技能のレベルを示し、まるで各参考文献が参照によりその全体が個別に組み入れられているのと同程度に、すべての表および図を含めて、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１０５】
当業者は、本発明がその固有の目的および利点と同様に、目的および利点を達成するのに非常に適していることをただちに認識するであろう。好ましい実施形態の現在の代表として、本明細書で述べた方法、変化、および化合物／組成物は、例であり、本発明の範囲への制限ではない。当業者は、その中での変更および他の用途を思いつくであろうし、それらは本発明に含まれる。
【０１０６】
本明細書で開示した発明には、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々な代用および変更を行えることは、ただちに当業者に明らかとなるであろう。例えば、各種の結合対は、多種多様の各種の治療剤および診断剤と同様に利用することができる。それゆえ、そのような追加の実施形態は、本発明の範囲内である。
【０１０７】
本明細書で適切に説明的に述べた本発明は、本明細書で特に開示されたいずれかの要素または複数の要素、制限または複数の制限なしに実施できる。それゆえ例えば、本明細書の各例において、「comprising（含む）」、「consisting essentially of（から実質的になる）」および「consisting of（からなる）」という用語のいずれも、他の２つの用語のどちらかと置き換えることができる。利用した用語および表現は、制限の用語ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、提示および説明した特徴の等価物またはその一部を除外する意図はないが、本発明の範囲内で多様な変更が可能であることが認識される。それゆえ、本発明が好ましい実施形態および場合による特徴によって特に開示されていても、本明細書で開示した概念の変更および変形が当業者によって用いられることと、そのような変更および変形が本発明の範囲内であると見なされることを理解すべきである。
【０１０８】
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群または選択肢の他のグループ化によって述べられている場合、当業者は、本発明もそのため、マーカッシュ群または他の群の個々の構成要素または構成要素の下位群によって述べられることを認識するであろう。
【０１０９】
また別途明示しない限り、実施形態に各種の数値が与えられている場合、追加の実施形態は、範囲の終点として２つの異なる値を取ることによって説明される。そのような範囲も、説明した発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ】Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞の増殖曲線を示す。非形質転換細胞（Ａ）、ｐＴｒｉＥｘ１．１によって形質転換した細胞（Ｂ）、およびｐＴｉＥｘ１．１ｐ７によって形質転換した細胞（Ｃ）の光学密度（ＯＤ600nm）を、表示時間に監視した（誘導後の時間）。非誘導細胞（白丸）および１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導された細胞（白四角）の増殖曲線を示す。
【図１Ｂ】非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞（Ａ）、ｐＴｒｉＥｘ１．１によって形質転換した細胞（Ｂ）、およびｐＴｉＥｘ１．１ｐ７によって形質転換した細胞（Ｃ）による、表示時間における［3Ｈ］−ウリジンの放出を示す。非誘導細胞（白丸）および１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導された細胞（白四角）の増殖曲線を示す。
【図２】合成ＨＣＶ ｐ７のトリス−トリシンゲル電気泳動分析を示す。ゲルは、銀染色した（左パネル）か、膜に移して、続いてストレプトアビジンによってプローブ化した（右パネル）。
【図３Ａ】ＢＬＭ中に再構成された合成ＨＣＶ ｐ７のチャネル記録を示す。直線は閉止状態を示す。
【図３Ｂ】データ収集の約３０分後に記録した電流トレースを示す。
【図３Ｃ】図３Ａに示すような＋１００ｍＶ膜電位で記録されたトレースの電流ヒストグラムを示す。
【図４】ＢＬＭでのｐ７チャネルシグナルに対する、短鎖（ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＢ−ＤＧＪ）および長鎖（ＮＮ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＧＪ）アルキルイミノ糖誘導体の効果を示す。保持電位は、＋１００ｍＶで一定に保持して、イミノ糖誘導体を表示した最終濃度まで添加した。
【図５】ＢＬＭでのｐ７チャネルシグナルに対する、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ（あるいはＮ７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪと呼ばれる）の効果を示す。保持電位は、＋１００ｍＶで一定に保持して、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪを表示した最終濃度まで添加した。
【図６】正規化した積分電流トレースおよび標準偏差対薬剤濃度のグラフ表示を示す。データは、ＮＮ−ＤＮＪ（四角）およびＮＮ−ＤＧＪ（菱形）の４秒間の代表的なトレーススライス３つと、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ（三角）の３０秒間の代表的なトレーススライス３つの平均を表す。式「積分電流」＝１／（１＋（［薬剤］／Ｋapp））によるデータのＳ字形適合によって導出された、おおよその結合定数（Ｋapp）は：ＮＮ−ＤＮＪでは、Ｋapp＝４５．２（±１０．７）μＭ；ＮＮ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１０．４（±１９．９）μＭ；Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１４．２（±１８．３）μＭ。
【図７】ＢＬＭでのｐ７チャネルシグナルに対する、ＳＰ２４０（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン）の効果を示す。
【図１】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００２年９月２３日に提出された米国仮出願第６０／４１２，５６０号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、末期肝硬変および肝細胞癌の著しい危険を伴う慢性肝炎の主な原因である（Ｄｉ Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ，Ａ．Ｍ．，（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６（３ Ｓｕｐｐｉ．１）：３４５−３８５を参照）。ＨＣＶは、３つの属：フラビウイルス、ぺスチウイルス、およびヘパシウイルスよりなるフラビウイルス科に属する。適切な小動物モデルおよびＨＣＶに対する信頼できるインビトロ感染性アッセイの両方がない場合、有望な抗ウイルス薬は最初に、関連するぺスチウイルスである、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）を用いて試験する。ＢＶＤＶインビトロ感染性アッセイは、デオキシノジリマイシンすなわち「ＤＮＪ」とも呼ばれるグルコース類似体、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、あるいはデオキシガラクトノジリマイシンすなわち「ＤＧＪ」とも呼ばれるガラクトース類似体、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトールのどちらかを含有するアルキル化イミノ糖誘導体が強力な抗ウイルスインヒビターであることを証明するのに使用されてきた（Ｄｕｒａｎｔｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：８９８７−９８を参照）。
【０００３】
ＤＮＪ誘導体は、ＥＲα−グルコシダーゼＩおよびＩＩを阻害するので、少なくとも部分的に抗ウイルスインヒビターである。これらの酵素は、Ｎ−グリカン前駆体の一部を形成する３つのグルコース残基を除去し、それらは揃ってＥＲ中の初期糖タンパク質に運搬される。ＥＲα−グルコシダーゼ阻害は、モノグリコシル化、Ｎ結合オリゴ糖含有糖タンパク質の形成ならびに、それに続くＥＲ内在シャペロンのカルネキシンおよびカルレチクリンとの相互作用を防止する（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９（３）：ｐ．１２４−８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ＪＲ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ６（９）：１１７３−８４を参照）。カルネキシン相互作用は、ＢＶＤＶおよびＨＣＶのエンベロープ糖タンパク質を含む、多くの宿主およびウイルスにコードされた糖タンパク質の適正なフォールディングにとって重要である（Ｂｒａｎｚａ−Ｎｉｃｈｉｔａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７５（８）：３５２７−３６；Ｃｈｏｕｋｈｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８ ７２（５）：３８５１−８を参照）。ＢＶＤＶエンベロープ糖タンパク質のミスフォールディングは、感染細胞からのビリオンの分泌障害を引き起こすことがある。
【０００４】
以前の実験は、長鎖アルキル誘導体Ｎ−ノニル−ＤＮＪ（ＮＮ−ＤＮＪ）の抗ウイルス効果が、短鎖アルキル誘導体Ｎ−ブチル−ＤＮＪ（ＮＢ−ＤＮＪ）の抗ウイルス効果よりも顕著であるが、後者は細胞内でさらに効果的なＥＲα−グルコシダーゼ阻害を達成することを示した（Ｄｕｒａｎｔｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：８９８７−９８を参照）。加えて、ＥＲα−グルコシダーゼによって認識されず、ＥＲα−グルコシダーゼを阻害しない長鎖アルキルＤＧＪ誘導体も、強力な抗ウイルス活性を示す。したがってＥＲα−グルコシダーゼ阻害は、観察された抗ウイルス効果と直接相関せず、唯一の抗ウイルス機構として除外される。
【０００５】
短鎖Ｎ−ブチル−ＤＧＪ（ＮＢ−ＤＧＪ）が抗ウイルス活性を示さないのに対して、長鎖アルキル誘導体ＮＮ−ＤＧＪは強力なインヒビターであるため、さらなる作用機構は、アルキル側鎖の長さと明らかに関連している。しかしながら、構造的に類似した洗浄剤、ｎ−オクチルグルコシド（ｎ−ＯＧ）およびＮ−ノニルグルコシドはインビトロＢＶＤＶ感染性アッセイにおいて抗ウイルス性でないため、それは両親媒性のアルキル化イミノ糖誘導体の洗浄剤様効果と関連していない（Ｄｕｒａｎｔｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：８９８７−９８を参照）。薬物処置は、ウイルス膜糖タンパク質の二量化に影響を及ぼし、分泌されたＢＶＤＶビリオンの膜糖タンパク質組成を変化させるが、ウイルスのＲＮＡ複製またはタンパク質合成のどちらにも影響しない。
【０００６】
長鎖および短鎖アルキルＤＮＪ誘導体はどちらも、そのＥＲα−グルコシダーゼ阻害活性により、デングウイルス（ＤＥＮＶ）および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）などのフラビウイルスに対して抗ウイルス性である（Ｃｏｕｒａｇｅｏｔ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７４（１）：５６４−７２；Ｗｕ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（８）：３５９６−６０４を参照）。これに対して、ＤＧＪ誘導体はフラビウイルスに対して抗ウイルス活性を示さないが、長鎖アルキルＤＧＪ誘導体は、ぺスチウイルスの強力なインヒビターである。密接に関連したペスチウイルスおよびヘパシウイルスとは異なり、フラビウイルスは、ｐ７または同等の小さい膜貫通タンパク質を含有しない。そのためＤＮＪおよびＤＧＪ誘導体は、ｐ７または同等のタンパク質を阻害することによって、ウイルス複製を阻害する。
【０００７】
ＨＣＶ陽性鎖ＲＮＡゲノムは、約３０００個のアミノ酸残基の単一ポリタンパク質前駆体をコードする。ポリタンパク質は、ウイルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼによって翻訳と同時に、および翻訳後に処理されて、成熟した構造性タンパク質および非構造性タンパク質Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを生成して（Ｒｅｅｄ，Ｋ．Ｅ．およびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，（２０００に概説されている）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ ＩｍｍｕｎｏＬ ２４２：ｐ．５５−８４）、潜在的なさらなるＦタンパク質がポリタンパク質のＮ末端領域におけるリボソームのフレームシフトから生じる（Ｘｕ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．２０（１４）：ｐ．３８４０−８を参照）。ポリタンパク質前駆体における大半の開裂は翻訳中または翻訳直後に効率的に完了するが、開裂はＥ２／ｐ７およびｐ７／ＮＳ２部位にて遅延され、Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２前駆体の生成を引き起こす。さらにＥ２とｐ７の間の処理が不完全であり、Ｅ２およびｐ７と同様に、Ｅ２−ｐ７の生成も引き起こす（Ｌｉｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（８）：ｐ．５０６３−７３；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（１０）：ｐ．６２１５−２２を参照）。
【０００８】
ＨＣＶ複製用の細胞培養モデルが利用できないため、ＨＣＶ複製に関する情報は、ＢＶＤＶ細胞培養モデルを使用して得られる。そのため大半の実用的なデータは、非常にＨＣＶ ｐ７に類似した、アミノ酸７０個のタンパク質であるＢＶＤＶ ｐ７の研究から得られる。ＢＶＤＶ ｐ７に関する実用的なデータは、ＢＶＤＶの感染性ｃＤＮＡクローン内に変異を導入することによって得られてきた。ｐ７遺伝子全体のフレーム内欠失は、ＢＶＤＶ ＲＮＡ複製に影響を及ぼさないが、非感染性ビリオンの生成を引き起こす。しかしながら感染性ウイルス粒子は、トランスのｐ７を補完することによって産生可能であり（Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，Ｎ．Ｔａｕｔｚ，ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｔｈｉｅｌ，（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２０）：９４９８−５０６を参照）、このことはぺスチウイルスｐ７が感染性子孫ウイルスの生成に不可欠であることを示唆している。
【０００９】
ＨＣＶ ｐ７タンパク質は、膜を２回通過し、細胞外環境に向けられたＮ末端およびＣ末端を有するポリトピック膜タンパク質であることが示されている、アミノ酸６３個のペプチドである（Ｃａｒｒｅｒｅ−Ｋｒｅｍｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（８）：３７２０−３０を参照）。そのためｐ７タンパク質は、２つの膜貫通ドメインを含むことが示されている。Ｎ末端膜貫通ドメインは、ほぼ位置１０からほぼ位置３２までのアミノ酸を含み、Ｃ末端膜貫通ドメインは、ほぼ位置３６からほぼ位置５８までのアミノ酸を含む。２つの膜貫通ドメイン内のアミノ酸は、すべてのＨＣＶ系統間で多少変化するが、報告された系統では、膜貫通ドメイン内のアミノ酸の大部分（通例、約７０％超）が、Ｆ、Ｉ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、およびＡとして特徴付けられる疎水性基の構成要素である。２つの膜貫通ドメインは非疎水性アミノ酸（ＫまたはＲ、Ｇ、ＲまたはＫ）によって連結され、ｐ７のコンセンサス配列は、ＡＬＥＮＬＶＶＬＮＡＡＳＡＡＧＴＨＧＩＬＷＦＬＶＦＦＣＡＡＷＹＶＫＧＲＬＶＰＧＡＴＹＳＬＬＧＬＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号１）である（Ｃａｒｒｅｒｅ−Ｋｒｅｍｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（８）：３７２０−３０を参照）。
【００１０】
サブゲノムレプリコンの研究は、ＨＣＶのｐ７がゲノム複製に必要でないことを示しているが（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（５４２４）：ｐ．１１０−３；Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（３）：ｐ．１２５２−６４を参照）、感染性ウイルス生成におけるその役割は未知である。ＨＣＶ ｐ７は、膜のカチオン透過率を左右し、ビリオンの放出または成熟にとって重要であるビロポリン（viroporin）として既知である、小タンパク質の群の推定構成要素であることが示唆されている。一部のビロポリンでは、膜貫通ドメインが、膜チャネルを形成するのに十分であることが示されている（Ｄｕｆｆ，Ｋ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ａｓｈｌｅｙ，（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０（１）：ｐ．４８５−９；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３０（６）：ｐ．４１６−２０を参照）。
【発明の開示】
【００１１】
１つの実施形態は、ＨＣＶ ｐ７タンパク質の活性をその必要のある対象者、特にヒトにおいて阻害するのに有効なイミノ糖誘導体化合物を投与することによって、ＨＣＶ感染を処置する方法に関する。説明した方法で利用した化合物は、ＨＣＶ ｐ７タンパク質が膜を透過する能力を阻害するのに有効である。最も広い態様において、化合物は以下の式ＩまたはＩＩによって表される：
【化１】
式中、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。
【００１２】
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基である。各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換され、置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の置換基によって置換され、選択された置換基は、同じでも異なっていてもよい。特に適切な置換基は、ノニル、７−オキサノニル、および１０−オキサウンデシルを含み、そして特に望ましい化合物は、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＮ−ＤＧＪ）、Ｎ−７−オキサノニル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ、Ｎ−７−オキサノニル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン、またはＮ−７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪ）、およびＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン、Ｎ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪ、Ｎ−１０−オキサウンデシル−６−デオキシ−ＤＧＪ、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（９−メトキシノニル）−２−メチル−３，４，５−ピペリジントリオール、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオアート（１：１）、またはＳＰ２４０）を含む。
【００１３】
化合物の１つ以上を、ＨＣＶ感染を処置するためのキットとしてパッケージすることができる。キットは、化合物を投与するための手段と同様に、ＨＣＶ感染を処置するための説明書を含むことができる。
【００１４】
別の実施形態は、化合物がＨＣＶ ｐ７活性を阻害する能力をスクリーニングする方法に関する。特に化合物は、ｐ７またはｐ７変異体が膜を透過する能力を化合物が阻害するかどうかに基づいてスクリーニングできる。そのような方法では、人工膜システムまたは細菌システムを利用することが望ましい。
【００１５】
定義
別途規定しない限り、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「１以上」を意味する。
【００１６】
別途規定しない限り、「アルキル」という用語は、本明細書で使用するように、１つ以上の炭素原子を含有する直鎖および分岐鎖アルキルラジカルを指し、例えば、メチル、エチル、ブチル、およびノニルを含む。
【００１７】
「アリール」という用語は、本明細書で使用するように、単環芳香族基、例えばインダニル、ナフチル、またはフルオレニルなどのフェニルまたはベンゾ縮合芳香族基を指す。
【００１８】
「ヘテロアリール」という用語は、１つ以上のヘテロ原子を含有する芳香族化合物を指す。例は、ピリジル、フリル、およびチエニル、あるいはインドリルまたはキノリルなどの、１つ以上のヘテロ原子を含有するベンゾ縮合芳香族（bezofused aromatic）を含む。
【００１９】
「ヘテロ原子」という用語は、本明細書で使用するように、Ｎ、Ｏ、およびＳなどの非炭素原子を指す。
【００２０】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書で使用するように、３、４、５、６、７、または８個の炭素を含有する炭素環を指し、例えば、シクロプロピルおよびシクロヘキシルを含む。
【００２１】
別途規定しない限り、「アルコキシ」という用語は、本明細書で使用するように、１つ以上の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルコキシを指し、例えば、メトキシおよびエトキシを含む。
【００２２】
「アルケニル」という用語は、本明細書で使用するように、エテニルおよびプロペニルなどの、１つ以上の二重結合を含有する直鎖または分岐鎖アルキルを指す。
【００２３】
「アラルキル」という用語は、本明細書で使用するように、ベンジルおよびフェネチルなどの、アリールによって置換されたアルキルを指す。
【００２４】
「アルキニル」という用語は、本明細書で使用するように、エチニルおよびプロピニルなどの、１つ以上の三重結合を含有する直鎖または分岐鎖アルキルを指す。
【００２５】
「アリールオキシ」という用語は、本明細書で使用するように、−ＯＨ基内の水素原子をアリール基と置換することによって作成された置換基を指し、例えばフェノキシを含む。
【００２６】
「アラルコキシ」という用語は、本明細書で使用するように、２−フェニルエトキシなどの、アリール基によって置換されたアルコキシ基を指す。
【００２７】
「アルキルアミノ」という用語は、本明細書で使用するように、メチルアミノ（−ＮＨＣＨ3）およびエチルアミノ（−ＮＨＣＨ2ＣＨ3）などの、１個のアルキル基と置換されたアミノ基を指す。
【００２８】
「ジアルキルアミノ」という用語は、本明細書で使用するように、ジメチルアミノ（−Ｎ（ＣＨ3）2）およびジエチルアミノ（−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ3）2）などの、２個のアルキル基と置換されたアミノ基を指す。
【００２９】
「ＤＮＧ」という用語は、本明細書で使用するように、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールすなわち「デオキシノジリマイシン」を意味する。
【００３０】
「ＤＧＪ」という用語は、本明細書で使用するように、１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトールすなわち「デオキシガラクトノジリマイシン」を意味する。
【００３１】
「ＢＬＭ」という用語は、本明細書で使用するように「脂質黒膜（black lipid membrane）」を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
開示された方法で利用された化合物は、ＨＣＶ ｐ７のインヒビターとして有効である。最も広範な態様において、化合物は、式ＩまたはＩＩによって示される：
【化２】
【００３３】
１つの態様において、方法は、式Ｉの化合物を投与することを考慮している。Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択される。各置換基は同じでも異なっていてもよい。
【００３４】
好ましい実施形態において、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つは、ヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）である。あるいはＲ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'はの少なくとも１つは、ヒドロキシ基（−ＯＨ）である。最も好ましい実施形態は、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨから選択されることを考慮する。
【００３５】
Ｒ2は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルから選択される置換基である。直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルはそれぞれ任意選択的に置換され、置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；ならびに−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって置換される。
【００３６】
Ｒ2は好ましくは、直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、または置換Ｃ1-18アルキル基である。Ｒ2はさらに好ましくは、直鎖Ｃ7-11アルキル、分岐Ｃ7-11アルキル、置換Ｃ7-11アルキル、あるいはＣ1-6アルコキシによって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキルである。直鎖Ｃ7-11アルキル置換基であるＲ2の例は、ヘプチル、オクチル、およびノニルを含む。置換アルキル基であるＲ2の例は、７−オキサノニル（−ＣＨ2（ＣＨ2）5−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3）である。Ｒ2は最も好ましくは、Ｎ−ノニル、７−オキサノニル、または１０−オキサウンデシルである。
【００３７】
式Ｉのある実施形態において、化合物は、以下の式の１つとして表される：
【化３】
【００３８】
上の式の各環炭素原子における空間的配置は、他の環炭素原子における空間的配置と独立して変化する。さらに好ましくは、化合物は、表Ｉに示す式の１つを有する：
［表Ｉ］
【化４】
【００３９】
さらに好ましくは、化合物は式の１つを有する：
【化５】
【００４０】
なおさらに好ましくは、Ｒ2はノニル、７−オキサノニル、または１０−オキサウンデシルであり、最も好ましい化合物は、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＮ−ＤＧＪ）、Ｎ−７−オキサノニル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ、Ｎ−７−オキサノニル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン、またはＮ−７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪ）、およびＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン、Ｎ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪ、Ｎ−１０−オキサウンデシル−６−デオキシ−ＤＧＪ、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（９−メトキシノニル）−２−メチル−３，４，５−ピペリジントリオール、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオアート（１：１）、またはＳＰ２４０）およびその異性体、例えば：
【化６】
を含む。
【００４１】
開示した方法の別の態様は、式ＩＩの化合物を投与することを考慮する。Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；およびヘテロアリールからなる群より選択される。各置換基は同じでも異なっていてもよい。
【００４２】
好ましい実施形態において、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも１つは、ヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）である。あるいはＲ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つは、ヒドロキシ基（−ＯＨ）である。最も好ましい実施形態は、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨから選択されることを考慮する。
【００４３】
式ＩＩにおいて、Ｒ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルから選択される置換基である。直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルはそれぞれ任意選択的に置換され、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；ならびに−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって置換される。
【００４４】
Ｒ4は好ましくは、直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、または置換されたＣ1-18アルキル基である。Ｒ4はさらに好ましくは、直鎖Ｃ7-11直鎖１アルキル、分岐Ｃ7-11アルキル、置換されたＣ7-11アルキル、あるいはＣ1-6アルコキシによって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキルである。直鎖Ｃ7-11アルキル置換基であるＲ4の例は、ヘプチル、オクチル、およびノニルを含む。置換アルキル基であるＲ4の例は、７−オキサノニル（−ＣＨ2（ＣＨ2）5−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3）である。Ｒ4は最も好ましくは、Ｎ−ノニル、７−オキサノニル、または１０−ウンデシルである。
【００４５】
１つの実施形態において、ＨＣＶ ｐ７タンパク質またはｐ７タンパク質を含む膜の成分のどちらかを、ｐ７タンパク質の活性を阻害する１つ以上の化合物と接触させることを含む、ＨＣＶ感染を処置する方法が開示される。発明者らは、ｐ７タンパク質がおそらく膜チャネルタンパク質として作用することによって、膜の透過性を上昇させることを示した。加えて発明者らは、特定の化合物がｐ７の膜を透過する能力を阻害することを示した。しかしながら開示した方法は、本明細書で開示した化合物がｐ７タンパク質の他の活性も阻害することを考慮している。
【００４６】
選択した化合物は、ｐ７タンパク質の１つ以上の活性を、タンパク質と相互作用することによって阻害する。この例では、詳細な結合アッセイで示すように、ｐ７タンパク質と、ほぼ、Ｋapp＝１３０μＭ（すなわちＫapp＝１１４．２（±１８．３）μＭ）を超えない見かけの結合定数で結合する化合物を選択することが望ましい。あるいは、詳細な透過性アッセイで示すように、化合物が約１８０μＭを超えない濃度で存在する場合に、ｐ７タンパク質が膜を透過する能力を遮断する化合物を選択することが望ましい。
【００４７】
選択した化合物がｐ７の膜を透過する能力を阻害する場合、化合物はｐ７がチャネルを形成するのを防止するか、または化合物はチャネルが形成された後にチャネルを遮断する（すなわちチャネルブロッカーとして）。あるいは化合物は、リン脂質などの膜の１つ以上の成分と相互作用して、それにより膜の流動性または局所特性を変化させることによって、ｐ７タンパク質を阻害する。そのため化合物は、ｐ７が機能性膜チャネルを形成する能力を阻害できる。
【００４８】
なお別の実施形態において、ＨＣＶ ｐ７の活性を阻害するために有効な、潜在的な抗ウイルス剤をスクリーニングする方法が提供される。通例、方法は、ｐ７またはｐ７変異体を膜システムに包含させることと、例えば標準方法を用いて、膜に通じる電流を記録することによって、透過性の上昇を観察することと、を含む。次に試験化合物を膜システムに添加して、ｐ７が膜を透過する能力を、化合物が阻害するかどうかを判定する。理想的な化合物は、約１８０μＭを超えない濃度にて、ｐ７が膜を透過する能力を完全に遮断する。
【００４９】
脂質黒膜（「ＢＬＭ」）は、本発明の方法で使用されるが、他の膜システムも同様に利用できる。脂質黒膜は当分野で周知であり、ＢＬＭは、例えばチャネル形成タンパク質によって仲介されるような膜透過性を研究するために一般に使用される（Ｄｕｆｆ，Ｋ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ａｓｈｌｅｙ，（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０（１）：ｐ．４８５−９を参照）。
【００５０】
ｐ７活性を観察するための適切な膜システムを選択した後、ｐ７含有膜を形成するためにｐ７を膜に包含させることができる。ｐ７タンパク質は、ｐ７タンパク質が選択した膜の透過性の向上を示すことができるどのＨＣＶ系統から選択してもよい。例えば、ＨＣＶ−Ｈ系統からのｐ７タンパク質が選択可能であり（すなわちＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号：１））、または別の系統からのｐ７タンパク質が選択できる。報告されたｐ７タンパク質のアミノ酸配列を比較することによって得られるｐ７コンセンサス配列を使用することが望ましく、または特定のＨＣＶクレード（例えばクレード１）からのｐ７タンパク質を選択することが望ましい。
【００５１】
スクリーニング方法の別の実施形態において、変異体（variant）が機能性である（例えば変異体が当分野で既知の方法によって判定されるように、選択した膜を透過することが示される）という条件で、選択したｐ７タンパク質の変異体を使用することが望ましい。考えられる変異体は、融合、欠失、および／または変異あるいは置換を含む。例えば、上述の方法での使用のために、ビオチン化ｐ７タンパク質を作成することが望ましい。別の例において、選択した膜を透過することを示すことができる、（例えば選択したｐ７タンパク質または変異体が、ＢＬＭにおいて約６０ｐＳ（すなわち８６±２２ｐＳ）以上の伝導度レベルを示す）ｐ７またはｐ７の誘導体の少なくとも部分を使用することが望ましい。選択したｐ７アミノ酸配列内に変異を作成することも望ましい。変異を作成する場合、ＨＣＶ系統間の比較に基づく、所与の位置におけるアミノ酸の決定的特徴を維持することが望ましい。例えば、異なるＨＣＶ系統からのｐ７配列の比較は、あるアミノ酸位置が「疎水性」、「中性」、または「親水性」として特徴付けられることを示している（Ｃａｒｒｅｒｅ−Ｋｒｅｍｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（８）：３７２０−３０を参照）。「疎水性アミノ酸」は、群Ｆ、Ｉ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、およびＡに属するとして特徴付けられる。
【００５２】
選択したｐ７タンパク質または変異体は、人工的に合成するか、あるいは細菌細胞または真核細胞などの適切な生体系で発現させることができる。タンパク質が選択した膜システムに包含された後、膜の透過性を測定してタンパク質が（例えば透過性の上昇または細胞生存性の低下を引き起こす）活性を示すかどうかを判定することができる。試験化合物をタンパク質および／またはｐ７含有膜の成分と接触させて、化合物がタンパク質の活性を阻害するかどうかを判定することができる。上述の方法において、試験化合物は、ｐ７を膜に含有させる前および／または後に、ｐ７および／またはｐ７含有膜の成分に接触させることができる。
【００５３】
１つの実施形態において、スクリーニング方法でイミノ糖誘導体を試験化合物として使用することが望ましい。特にＤＧＪまたはＤＮＪのアルキル化誘導体を、本明細書で述べられているように試験化合物として使用することが望ましい。アルキル化イミノ糖の誘導体Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＮ−ＤＧＪ）、Ｎ−７−オキサノニル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ、Ｎ−７−オキサノニル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン、またはＮ−７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪ）、およびＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−６−メチルデオキシガラクトノジリマイシン、Ｎ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪ、Ｎ−１０−オキサウンデシル−６−デオキシ−ＤＧＪ、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（９−メトキシノニル）−２−メチル−３，４，５−ピペリジントリオール、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオアート（１：１）、またはＳＰ２４０）および／またはその異性体が特に望ましい。
【００５４】
別の実施形態において、方法における試験化合物としてのｐ７または他の膜成分と相互作用することが示された化合物またはその誘導体を使用することが望ましい（例えばｐ７とインビトロで相互作用することが示された化合物）。なお別の実施形態において、ｐ７または他のタンパク質のどちらかによるチャネル形成を妨害することが示された化合物、および／またはｐ７または他のタンパク質によって形成されたチャネルの既知のブロッカーである化合物、またはその誘導体を方法における試験化合物として使用することが望ましい。例えばアマンタジンは、インフルエンザＡ型ウイルスＭ２チャネルの既知のチャネルブロッカーである（Ｈａｙ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４（１１）：ｐ．３０２１−４；Ｄｕｆｆ，Ｋ．Ｃ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ａｓｈｌｅｙ，（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０（１）：ｐ．４８５−９；Ｓｕｎｓｔｒｏｍ、Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１５０（２）：ｐ．１２７−３２；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３０（６）：ｐ．４１６−２０を参照）。近年、他者は、ｐ７が、アマンタジンによって遮断されるイオンチャネルを形成することを示唆している（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３，Ｊａｎ．２０；５３５（１−３）：３４−８）。そのため、アマンタジンまたはその誘導体を方法における試験化合物として使用することが望ましい。
【００５５】
１つの実施形態において、誘導型細菌システムを利用して透過性を観察することが可能であり、細菌細胞膜の透過性の上昇は、細胞増殖の停止を引き起こす。例えばｐ７またはその変異体が、適切な細菌システムから誘導型プロモーターから発現されて、細胞が細胞増殖の停止を示すかどうかを判定することができる。あるいは透過性の上昇は、ｐ７発現の誘導前に［3Ｈ］−ウリジンなどの放射性分子で細胞を標識することによって確認できる。ｐ７発現の誘導後に、［3Ｈ］−ウリジンの培地への放出を測定することによって透過性を評価できる。試験化合物を細菌に投与して、化合物が細胞増殖を停止させるかどうか、および／または化合物が［3Ｈ］−ウリジンの培地への放出を防止するかどうかを判定することができる。
【００５６】
化合物の調製
本明細書で述べた方法の使用のための化合物は、開始物質として使用した市販のイミノ化合物から調製できる。市販元は、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ；英国チェシア州ノリッジのＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；およびカナダオンタリオ州のＴｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓを含む。
【００５７】
あるいは本化合物は、当業者に既知の合成方法によって調製できる。例えば、各種のデオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）誘導体の合成は、米国特許第５，６２２，９７２号、米国特許第５，２００，５２３号、米国特許第５，０４３，２７３号、米国特許第４，９４４，５７２号、米国特許第４，２４６，３４５号、米国特許第４，２６６，０２５号、米国特許第４，４０５，７１４号、および米国特許第４，８０６，６５０号ならびに米国特許出願第１０／０３１，１４５号に述べられている。本明細書で述べる他のイミノ糖化合物が既知であり、米国特許第４，８６１，８９２号、米国特許第４，８９４，３８８号、米国特許第４，９１０，３１０号、米国特許第４，９９６，３２９号、米国特許第５，０１１，９２９号、米国特許第５，０１３，８４２号、米国特許第５，０１７，７０４号、米国特許第５，５８０，８８４号、米国特許第５，２８６，８７７号、米国特許第５，１００，７９７号、および米国特許第６，２９１，６５７号に示されている方法によって調製できる。
【００５８】
薬学的組成物
化合物を薬学的組成物または医薬品として投与することが望ましい場合、本明細書で開示した化合物は、各種の投与方式のために処方することができる。技法および処方は一般に、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１８ｔｈ ｅｄ．），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０）に見出される。
【００５９】
医薬品は、いずれかの適切な経路による、例えば経口（頬側または舌下を含む）、直腸、経鼻、局所（頬側、舌下または経皮を含む）、あるいは非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路による投与に適しているが、経口投与が好ましい。そのような組成物は、製薬業界で既知のいずれかの方法によって、例えば滅菌条件下で活性成分を担体と混合することによって調製できる。
【００６０】
薬学的に許容される塩は当業者に一般に周知であり、一例としてこれに限定されるわけではないが、アセテート、ベンゼンスルホナート、ベシラート、ベンゾアート、バイカーボネート、バイタートラート、ブロミド、カルシウムエデタート、カムシラート、カーボネート、シトレート、エデタート、エディシラート、エストラート、エシラート、フマレート、グルセプタート、グルコナート、グルタメート、グリコリルアルサニラート、ヘキシルレソルシナート、ヒドラバミン、ヒドロブロミド、ヒドロクロライド、ヒドロキシナフトアート、ヨージド、イセチオナート、ラクテート、ラクトビオナート、マラート、マレアート、マンデラート、メシラート、ムカート、ナプシラート、ニトレート、パモアート（エンボナート）、パントテナート、ホスフェート／ジホスフェート、ポリガラクツロナート、サリチラート、ステアラート、サブアセテート、スクシナート、サルフェート、タンナート、タートラート、またはテオクラートを含む。他の薬学的に許容される塩は、例えば、前記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１８ｔｈ ｅｄ．）に見出される。
【００６１】
好ましい薬学的に許容される塩は例えば、アセテート、ベンゾアート、ブロミド、カーボネート、シトレート、グルコナート、ヒドロブロミド、ヒドロクロライド、マレアート、メシラート、ナプシラート、パモアート（エンボナート）、ホスフェート、サリチラート、スクシナート、サルフェート、またはタルトラートを含む。
【００６２】
注射の場合、化合物および薬剤は、水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理的食塩緩衝液などの、生理学的に適合性の緩衝液中で調合できる。そのような経粘膜の場合、透過されるバリアに適した浸透剤を調合物中で使用する。そのような浸透剤は一般に当分野で既知である。
【００６３】
方法の実施のために本明細書で開示した化合物を全身投与に適切な投薬形に調合するための、薬学的に許容される担体の使用は、本発明の方法の範囲内である。担体および適切な製造慣行の適正な選択によって、本発明の方法の組成物、溶液として調合される組成物は、例えば静脈内注射によって非経口的に投与できる。化合物は、当分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して、経口投薬に適切な投薬形にただちに調合できる。そのような担体は、処置される患者による経口摂取のために、方法の化合物が錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして調合できるようにする。
【００６４】
本方法での使用に適切な薬学的組成物は、その意図する目的を達成するために、活性成分が有効量で含有される組成物を含む。有効量の決定は、特に本明細書で提供された詳細な開示に照らして、当業者の能力の十分範囲内である。
【００６５】
活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用できる調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む、薬学的に許容される適切な担体を含有する。経口投与用に調合された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、または溶液の形である。
【００６６】
本明細書で述べ、本明細書で提供する方法でも使用される医薬品は、以下の１つ以上：保存料、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、着臭剤、塩、緩衝剤、コーティング剤または抗酸化剤を含むことができる。それらは、本明細書で述べた化合物および／または薬剤に加えて、治療的に活性な薬剤も含有できる。経口用の薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠の核を得るために、化合物を固体賦形剤と組合せることと、任意選択的に、得られた混合物を粉砕することと、望ましい場合には適切な助剤を添加した後に細粒の混合物を加工することによって得られる。適切な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）である。望ましい場合、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を添加できる。
【００６７】
経口的に使用できる薬学的調製物は、ゼラチンよりなるプッシュフィット型カプセルはもちろんのこと、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤よりなる軟質の密封カプセルも含む。プッシュフィット型カプセルは、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどのバインダー、および／またはタルクまたはステアリル酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択的に、安定剤などと混合して含有できる。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの適切な液体に溶解または懸濁させることができる。加えて、安定剤を添加できる。
【００６８】
投与経路
ここで各種の投与経路を詳細に検討する。
ａ．経口投与
経口投与に適した医薬品は、カプセルまたは錠剤として、粉末または細粒として、（水性または非水性液体中の）溶液、シロップまたは懸濁物として、食用フォームまたはホイップとして、あるいはエマルジョンとして提供される。
【００６９】
錠剤または硬質ゼラチンカプセルは、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリル酸またはその塩を含む。
【００７０】
軟質ゼラチンカプセルは、植物油、ワックス、脂質、半固体または液体ポリオールなどを含む。
【００７１】
溶液およびシロップは、水、ポリオールおよび糖を含む。懸濁物の調製の場合、油（例えば植物油）を用いて、水中油型懸濁物または油中水型懸濁物を提供できる。
【００７２】
ｂ．経皮投与
経皮投与に適した医薬品は、長期間に渡ってレシピエントの表皮との密接接触を維持することを目的とした個別パッチとして提供できる。例えば活性成分は、イオン導入によってパッチから送達できる（イオン導入は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（６）：３１８（１９８６）に述べられている）。
【００７３】
ｃ．局所投与
局所投与に適した医薬品は、軟膏、クリーム、懸濁ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾールまたはオイルとして提供できる。
【００７４】
目または他の外部組織、例えば口および皮膚の感染では、好ましくは局所軟膏またはクリームが使用される。軟膏を調合する場合、活性成分は、パラフィン性または水混和性軟膏ベースのどちらかと共に利用できる。あるいは活性成分は、水中油型または油中水型ベースを用いてクリームに調合できる。
【００７５】
目への局所投与に適した医薬品は、点眼液を含む。ここで活性成分は、適切な担体、例えば水溶液に溶解または懸濁させることができる。
【００７６】
口での局所投与に適した医薬品は、トローチ剤、ドロップ、およびマウスウォッシュを含む。
【００７７】
ｄ．直腸投与
直腸投与に適した医薬品は、坐薬または浣腸剤として提供できる。
【００７８】
ｅ．経鼻投与
固体担体を使用する経鼻投与に適した医薬品は、粗粉末を含む（２０〜５００ミクロンの範囲の粒子を有する）。これは、嗅剤が摂取される方法、すなわち鼻付近に保持された粉末容器から鼻を通じた迅速な吸引によって投与することができる。
【００７９】
液体担体を使用する経鼻投与に適した組成物は、鼻用スプレーまたは点鼻剤を含む。これらは活性成分の水性または油性溶液を含むことができる。
【００８０】
吸入による投与に適した医薬品は、各種の器具、例えば加圧エアゾール、噴霧器または吸入器によって生成される、微粒子粉末またはミストを含む。そのような器具は、活性成分の規定投薬量を提供するように構成できる。
【００８１】
ｆ．非経口投与
非経口投与に適した医薬品は、水性および非水性滅菌注射用溶液または懸濁物を含む。これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および組成物を対象となるレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含有できる。そのような組成物中に存在する他の成分は、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油を含む。非経口投与に適した組成物は、単位用量または複数回用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供可能であり、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用滅菌水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵できる。即時使用のための注射溶液および懸濁物は、滅菌粉末、細粒および錠剤から調製できる。
【００８２】
ｇ．投薬量
投薬量は、通常の試験によってただちに決定でき、医師または臨床医の管理下に置かれるであろう。適切な用量を決定するための指針は、適切に有効であるが非毒性の、または許容される毒性の、物質の量の送達であろう（例えばＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照）。ＮＮ−ＤＮＪまたは同様の化合物の場合、成人の１日投薬量は、活性剤０．１ｍｇから５ｇまでの範囲であると予想され、３から２４００ｍｇまで、好ましくは５から８００ｍｇまで、さらに好ましくは１５から４００ｍｇまで、そして最も好ましくは１５から１００ｍｇまでの範囲である。投薬量は、単一の１日用量あるいは１日に２、３回またはそれ以上の用量で投与できる。
【００８３】
以下の実施例は、上述の方法を説明するためにだけ提供する。それらは本明細書で述べた発明の範囲を決して制限するものではない。
【実施例１】
【００８４】
細菌における誘導型ｐ７発現
以下の一連の実験は、ｐ７が細菌中で誘導的に発現できることを証明する。実験を利用して、ｐ７またはｐ７変異体が膜を透過できるかどうかを判断できる。実験は、ｐ７発現が細胞増殖の停止をもたらし、さらにｐ７発現が放射性標識ウリジンの放出をもたらすことも示している。
【００８５】
実施例１．１ 物質及び方法
ｐ７発現プラスミドの作成
ＤＮＡ操作による組換えプラスミドの作成には、標準クローニング手順を使用した。ＨＣＶ ｐ７のコード領域は、Ｊ．Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎが快く提供してくれたＨＣＶ １ａ系統ｃＤＮＡをコードするプラスミドｐＴＭ１／ＣＥ１Ｅ２ｐ７（ＡＦ００９６０６）をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲ反応は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー１，ＡＡＧＣＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＣＧＴＡＡＴＡＣ（配列番号２）およびオリゴヌクレオチドプライマー２、ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣ（配列番号３）を使用して実施した。プライマー１および２は、ｐ７の５’および３’末端領域をそれぞれコードする。５’末端のＮｃｏＩ制限部位および３’末端のＥｃｏＲＩ制限部位を作成するために、下線配列をプライマー内に導入した。得られたＰＣＲ生成物を精製し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩによって事前に消化したｐＴｒｉＥｘ１．１発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）と連結させた。連結混合物を使用して、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｒ．ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞（ＣＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を形質転換した。組換えプラスミドを含有する細菌性クローンを５０μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｓｉｇｍａ）含有培地で培養した。ＰＣＲ反応中に変異が導入された可能性を排除するために、プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析を受けさせ、Ｔ７プロモーターのプライマーおよびプライマー２を使用して配列決定した。単離したｐ７含有プラスミドをｐＴｒｉＥｘ１．１ｐ７と命名した。
【００８６】
細菌におけるｐ７発現の誘導
ｐＴｒｉＥｘ１．１またはｐＴｒｉＥｘ１．１ｐ７プラスミドのどちらかを含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｒ．ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞のコロニー１個をＬＢ培地中、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンの存在下で、ＯＤ600nmが０．５に達するまで、３７℃にて振とうすることによって培養した。これらのスターター培地３ｍｌを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび０．４％のグルコースを含有するＬＢ培地１００ｍｌに添加し、同じ条件下で細胞を増殖させた。細胞が０．５〜０．７のＯＤ600nmに達したときに、１ｍＭのイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｒｏｃｈｅ）を添加してｐ７発現を誘導し、ＯＤ600nmを監視することによって、そのさらなる増殖を追跡した。非形質転換細菌（ｐＴｒｉＥｘ１．１プラスミドなし）をカルベニシリンの存在下で培養した。
【００８７】
細菌細胞からの［3Ｈ］−ウリジンの放出
細菌は上述のように、しかし今回は、２μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］−ウリジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）の存在下で、ＯＤ600nmが０．５に達するまで増殖させた。次に細胞をペレット化し、ＰＢＳによって３回洗浄し、２５ｍｌの培地中で再懸濁させた。１５分後、１ｍＭのＩＰＴＧの添加によりｐ７発現を誘導した。各種の誘導後時間に分割量０．５ｍｌを取出し、遠心分離によって細胞をペレット化して、上澄みをＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル（Ｐａｃｋａｒｄ，英国）３．５ｍｌと混合し、培地中に放出された放射能を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ３８０１シンチレーションカウンタを用いてシンチレーション計数によって定量した。
【００８８】
実施例１．１ 結果
細菌における誘導型ｐ７発現
膜透過性に対するＨＣＶ ｐ７の効果を評価するために、厳密に制御されたＴ７ｌａｃプロモーターによって調節されたＩＰＴＧ誘導系を使用して、ｐ７をＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞にて発現させた（Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９（１）：ｐ．４５−５９を参照）。Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを有し、十分なｌａｃリプレッサーをｐＬａｃＩプラスミドから供給して、非誘導状態における厳密な抑制を確保する（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ａｎｄ Ｂ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ，（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９（１）：ｐ．１１３−３０を参照）。宿主細胞に対するｐ７発現の効果は、ＩＰＴＧによる誘導後の各種時間における細胞密度を監視することによって追跡した。ＩＰＴＧ添加は、非形質転換細胞（図１Ａ、上パネル）およびｐＴｒｉＥｘ１．１によって形質転換された細胞（図１Ｂ、上パネル）に対して効果を持たなかったのに対して、ｐ７の発現は、たいてい大腸菌細胞膜での孔形成のために、細胞数増殖の停止を引き起こした（図１Ｃ、上パネル）。
【００８９】
ＨＣＶ ｐ７を発現する細菌からの化合物の流出を分析するために、組換えクローンに放射性標識ウリジンを装填して、放射能の放出を誘導後の各種の時点で測定した（図１、下パネル）。［3Ｈ］−ウリジンの著しい流出は、非形質転換細胞または親プラスミドを有するクローンによっては観察されなかった（図１ＡおよびＢ、下パネル）。ｐ７を発現する細胞は、ｐ７合成の誘導の２時間後に、培地中に［3Ｈ］−ウリジンの放出を開始した。［3Ｈ］−ウリジンの放出は、４時間の監視期間中に上昇し（図１Ｃ）、ｐ７が外部細胞膜の透過性を誘導したことを示す。
【実施例２】
【００９０】
合成ｐ７のＢＬＭへの取り込み
以下の一連の実験は、チャネル記録によって測定されたように、合成ｐ７がＢＬＭの透過性を上昇できることを証明する。実験は、長鎖アルキルイミノ糖誘導体がｐ７活性を阻害することも示す。
【００９１】
実施例２．１ 物質および方法
ペプチド合成および生成物の品質管理
Ｎ末端にビオチンタグが添加されたｐ７（ＨＣＶ Ｈ系統）に該当するペプチド（ビオチン−ＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号４））５０ｍｇは、英国のＡｌｂａｃｈｅｍが合成した。ｐ７ペプチドは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって分析した。ｐ７タンパク質を４０％のアセトニトリルに溶解して、１ｍｇ／ｍｌのペプチドを含有する溶液を与えた。この溶液の分割量１μｌを、１６ｍＭのオクチル−グルコシド溶液を含有する飽和α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の９５：５アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）溶液１μｌと混合した。この混合物の分割量（１μｌ）を質量分析計ターゲットに置き、空気乾燥させた。検出した質量は、トリプシン自家消化を使用して外部校正した。質量スペクトルは、リフレクトロンモードで動作しているＴｏｆＳｐｅｃ ２Ｅ質量分析計（英国、マンチェスター、ウィゼンショー、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を用いて記録した。ソース電圧、抽出電圧および焦点電圧はそれぞれ、２００００、１９９５０および１６０００Ｖであった。すべてのデータは、Ｍａｓｓ Ｌｙｎｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２ソフトウェアを用いて解析した。ＭＡＬＤＩ質量分析法解析の後、全長ｐ７ペプチドに相当する、すなわちｍ／ｚ ７２４７．８におけるピークを観測した。
【００９２】
全長ペプチドの純度を測定するために、ペプチドは、Ｓｃｈａｇｇｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６（２）：ｐ．３６８−７９が開発した方法の改訂版を使用してトリス−トリシンゲル電気泳動をさらに受けさせた。簡単には、４０％のアセトニトリル／水（５００μｇ／ｍｌ）に溶解させたｐ７（５μｇ）をトリシンサンプル緩衝液中で、分離ゲル（２０．１８％のＴ、０．８３％のＣ）、スペーサーゲル（１１．４４％のＴ、０．３４％のＣ）、およびスタックゲル（１０．９％のＴ、０．３２％のＣ）よりなるゲル（８×１０ｃｍ2）に付着させ、Ｔは両方のモノマー（アクリルアミドおよびビスアクリルアミド）の総パーセンテージ濃度であり、Ｃは、Ｔに対する架橋剤のパーセンテージ濃度である。ゲルは、サンプルがスタックゲルに完全に入るまで３０Ｖの一定電圧で泳動させ、その後、電圧を１１０Ｖまで上昇させた。
【００９３】
ゲルは、銀染色法およびウェスタンブロッティングの両方によって分析した。銀染色法では、ゲルを５０％メタノール中で１０分間、５％メタノール中で１０分間洗浄した。次にゲルを４０μＭのＤＴＴ溶液で１０分間インキュベートしてから水ですすぎ、０．１％ＡｇＮＯ3水溶液で１０分間インキュベートした。次に水で１０秒間、３回洗浄してから、展開溶液（水２５０ｍｌ中に７．５ｇのＮａＣＯ3、ホルムアルデヒド１２５μｌ）を添加した。展開プロセスは固体クエン酸１水和物の添加によって停止させた。ゲルを水ですすいで、乾燥前に３５％エタノール／２％グリセロールに浸漬した。
【００９４】
ウェスタンブロット分析では、ゲルからのタンパク質を、セミドライ電気ブロッター（４０ｍＡにて２時間）（Ｍｅｒｃｋ）を用いて、トランスファー緩衝液（２４ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）中で、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）に移した。３％のミルクを含有するＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ中で膜を一晩ブロッキングして、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ、１％ミルク中に１μｇ／ｍｌ）を用いて室温にて３時間インキュベートした。次にＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ、１％ミルクで洗浄し、メーカーの説明書に従ってＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を用いて展開した。
【００９５】
銀染色したゲルおよびウェスタンブロットの両方が、予想された分子量の１つの主要な種を明らかにし（図２）、ロードしたタンパク質の少なくとも一部が全長のビオチン化ｐ７タンパク質を含有することを示した。しかし、尿素を含むゲルと含まないゲルとの分離の差は、以前に観察されているため、尿素の非存在下で化学合成ｐ７を再分析した。ストレプトアビジンプローブ化ウェスタンブロットは、全長ビオチン化ｐ７の存在を明らかにしたが、銀染色したゲルでは、全ｐ７の５０〜６０％を構成する、見かけの分子量のほぼ半分のさらなる広いバンドが観察された。この広いバンドは、質量分析法によって観察された種に由来する、より小さい非ビオチン化ｐ７に該当し、その質量は理論的に、Ｎ末端膜貫通ドメインを含有するｐ７の断片に一致する。ｐ７の切断形からの全長ｐ７の分離が困難であることが判明したため、次に、脂質黒膜でのチャネル記録では混合物を使用した。
【００９６】
脂質黒膜（ＢＬＭ）でのチャネル記録
膜力学を調査するためのＢＬＭの作成は、当分野で周知である。ＢＬＭは、テフロン（登録商標）薄膜（厚さ約２５μｍ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国、オハイオ州）の縦軸の直径約１００μｍの楕円形開口に渡って作成した（Ｍｏｎｔａｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９（１２）：ｐ．３５６１−６を参照）。脂質（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）：１パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）（４：１（ｗ／ｗ））の混合物４０μｌをペンタン（５ｍｇ／ｍｌ）に溶解させ、水副相（０．５Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）の上に広げた。これにより、脂質約０．２ｍｇがテフロン（登録商標）薄膜の各側に被着した。溶媒が蒸発する１０分間の期間の後、チャンバ内の緩衝液レベルをテフロン（登録商標）膜の穴より上に上昇させて、ＢＬＭを形成させた。安定なＢＬＭの形成の後、最終濃度約５０μＭを達成するために、（エタノールに溶解させた）ＨＣＶ ｐ７タンパク質を２００倍過剰のストック溶液から接地したトランス側チャンバの水副相に添加した（二層の両側の各チャンバの体積：２ｍｌ）。記録は、約１０分間の時間遅延の後に出現した。電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ １Ｄ増幅器を用いて、５ｋＨｚの割合で記録した。データは、５０Ｈｚのカットオフ周波数を用いてフィルタリングして、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ ５．０を使用してさらに解析した。ＮＮ−ＤＮＪ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＮＮ−ＤＧＪ（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびＮ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）の１０ｍＭストック溶液からの、ならびにＮＢ−ＤＮＪ（Ｓｉｇｍａ）およびＮＢ−ＤＧＪの１００ｍＭストック溶液からの薬剤を、シス側またはトランス側のどちらかに添加した。薬剤濃度の上昇は、測定チャンバへの等量の連続添加によって実施した。データは、薬剤添加の約１分後に、１００ｍＶにて約３分間記録した。
【００９７】
実施例２．２． 結果
ＢＬＭへのｐ７の取り込み
ｐ７の緩衝液チャンバへの添加は、ＢＬＭに渡るチャネルシグナルを記録することによって決定されたように、ＢＬＭの透過性を向上させる。チャネルは、−１００ｍＶにて最大２ｎＳの伝導度レベルを有していた（図３Ａ）。検出された最小平均伝導度レベルは、＋５０ｍＶにおいて約８６±２２ｐＳであった（表１）。
【００９８】
【表１】
【００９９】
定義した伝導度レベルの継続期間は、数百ミリ秒から数秒までの範囲である。安定した長期継続する伝導状態は、約１００ｐＳ（およびその倍数）だけ異なり、伝導度が約１００ｐｓの、かなり安定したチャネルの形成を示唆している。記録の変動は、サブ伝導状態の存在を示す。＋１００ｍＶにて得たヒストグラム例を、図３Ｂに示す。同じサンプルを用いた長期測定は、ノイズレベルの上昇を生じさせ、これは定義された伝導度レベルの割当を最終的に除外した（図３Ｃ）。一部の実験では、ＢＬＭへのｐ７の挿入は、爆発様活性を生じさせた（例えば図４、左上パネル）。
【０１００】
ビオチン−ｐ７タンパク質を含有する膜のストレプトアビジン金染色および続いての透過電子顕微鏡法による複合体の検出は、生合成によって合成されたＨＣＶ ｐ７で報告されたように、ビオチン−ｐ７タンパク質がチャネルのように見えることを示している（データは示さず）（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３，Ｊａｎ．２０；５３５（１−３）：３４−８を参照）。（Ｐａｖｌｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００３，Ｍａｙ １３；１００（１０）：６１０４−８も参照）。
【０１０１】
ＢＬＭに添加された膜貫通ドメインＩ（「ＴＭＤ Ｉ」）、（例えばＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫ（配列番号５））を含むペプチドも、膜貫通ドメインＩＩ（「ＴＭＤ ＩＩ」）、（例えばＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号６））を含むペプチドも、チャネルシグナルの欠如によって判断されるように、それ自体でチャネルを形成することができなかった（データは示さず）。両方のドメインをＢＬＭに添加しても、チャネルは形成されなかった（データは示さず）。
【０１０２】
上昇する薬剤濃度のイミノ糖誘導体を膜の片側で緩衝液に添加して、ｐ７誘導チャネル活性に対するその効果を追跡した。短鎖アルキル誘導体ＮＢ−ＤＧＪおよびＮＢ−ＤＮＪでは、ｐ７チャネル活性は不変のままである（図４、上パネル）。同様に、Ｎ−オクチルグルコシドは３．０ｍＭまで、チャネル活性に対する効果を持たなかった（データは示さず）。しかしながら、増加する量の長鎖アルキル誘導体ＮＮ−ＤＧＪ、ＮＮ−ＤＮＪおよびＮ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪの添加は、ｐ７チャネルシグナルの用量依存性阻害を引き起こした（図４、下パネル、および図５）。得られた積分正規化電流トレースのグラフ表示およびそれぞれのＳ字形適合（図６）から、おおよその結合定数を導出した。ＮＮ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１０．４（±１９．９）μＭ、ＮＮ−ＤＮＪでは、Ｋapp＝４５．２（±１０．７）μＭ、およびＮ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１４．２（±１８．３）μＭ。チャネル活性の完全な遮断は、ＮＮ−ＤＧＪでは約１４０μＭで、ＮＮ−ＤＮＪでは１０５μＭで、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪでは１８０μＭで観察された。漏れ電流は、いずれの薬剤の上昇濃度でも観察されなかった。
【０１０３】
同様に、増加する量の長鎖アルキル誘導体、ＳＰ２４０（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン）の添加は、ｐ７チャネルシグナルの用量依存性阻害を引き起こした（図７）。チャネル活性の完全な遮断は、ＳＰ２４０では約１００μＭで観察される。
【０１０４】
明細書で引用したすべての特許および他の参考文献は、本発明が関連する当業者の技能のレベルを示し、まるで各参考文献が参照によりその全体が個別に組み入れられているのと同程度に、すべての表および図を含めて、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１０５】
当業者は、本発明がその固有の目的および利点と同様に、目的および利点を達成するのに非常に適していることをただちに認識するであろう。好ましい実施形態の現在の代表として、本明細書で述べた方法、変化、および化合物／組成物は、例であり、本発明の範囲への制限ではない。当業者は、その中での変更および他の用途を思いつくであろうし、それらは本発明に含まれる。
【０１０６】
本明細書で開示した発明には、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々な代用および変更を行えることは、ただちに当業者に明らかとなるであろう。例えば、各種の結合対は、多種多様の各種の治療剤および診断剤と同様に利用することができる。それゆえ、そのような追加の実施形態は、本発明の範囲内である。
【０１０７】
本明細書で適切に説明的に述べた本発明は、本明細書で特に開示されたいずれかの要素または複数の要素、制限または複数の制限なしに実施できる。それゆえ例えば、本明細書の各例において、「comprising（含む）」、「consisting essentially of（から実質的になる）」および「consisting of（からなる）」という用語のいずれも、他の２つの用語のどちらかと置き換えることができる。利用した用語および表現は、制限の用語ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、提示および説明した特徴の等価物またはその一部を除外する意図はないが、本発明の範囲内で多様な変更が可能であることが認識される。それゆえ、本発明が好ましい実施形態および場合による特徴によって特に開示されていても、本明細書で開示した概念の変更および変形が当業者によって用いられることと、そのような変更および変形が本発明の範囲内であると見なされることを理解すべきである。
【０１０８】
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群または選択肢の他のグループ化によって述べられている場合、当業者は、本発明もそのため、マーカッシュ群または他の群の個々の構成要素または構成要素の下位群によって述べられることを認識するであろう。
【０１０９】
また別途明示しない限り、実施形態に各種の数値が与えられている場合、追加の実施形態は、範囲の終点として２つの異なる値を取ることによって説明される。そのような範囲も、説明した発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ】Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞の増殖曲線を示す。非形質転換細胞（Ａ）、ｐＴｒｉＥｘ１．１によって形質転換した細胞（Ｂ）、およびｐＴｉＥｘ１．１ｐ７によって形質転換した細胞（Ｃ）の光学密度（ＯＤ600nm）を、表示時間に監視した（誘導後の時間）。非誘導細胞（白丸）および１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導された細胞（白四角）の増殖曲線を示す。
【図１Ｂ】非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞（Ａ）、ｐＴｒｉＥｘ１．１によって形質転換した細胞（Ｂ）、およびｐＴｉＥｘ１．１ｐ７によって形質転換した細胞（Ｃ）による、表示時間における［3Ｈ］−ウリジンの放出を示す。非誘導細胞（白丸）および１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導された細胞（白四角）の増殖曲線を示す。
【図２】合成ＨＣＶ ｐ７のトリス−トリシンゲル電気泳動分析を示す。ゲルは、銀染色した（左パネル）か、膜に移して、続いてストレプトアビジンによってプローブ化した（右パネル）。
【図３Ａ】ＢＬＭ中に再構成された合成ＨＣＶ ｐ７のチャネル記録を示す。直線は閉止状態を示す。
【図３Ｂ】データ収集の約３０分後に記録した電流トレースを示す。
【図３Ｃ】図３Ａに示すような＋１００ｍＶ膜電位で記録されたトレースの電流ヒストグラムを示す。
【図４】ＢＬＭでのｐ７チャネルシグナルに対する、短鎖（ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＢ−ＤＧＪ）および長鎖（ＮＮ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＧＪ）アルキルイミノ糖誘導体の効果を示す。保持電位は、＋１００ｍＶで一定に保持して、イミノ糖誘導体を表示した最終濃度まで添加した。
【図５】ＢＬＭでのｐ７チャネルシグナルに対する、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ（あるいはＮ７−オキサノニル−メチル−ＤＧＪと呼ばれる）の効果を示す。保持電位は、＋１００ｍＶで一定に保持して、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪを表示した最終濃度まで添加した。
【図６】正規化した積分電流トレースおよび標準偏差対薬剤濃度のグラフ表示を示す。データは、ＮＮ−ＤＮＪ（四角）およびＮＮ−ＤＧＪ（菱形）の４秒間の代表的なトレーススライス３つと、Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪ（三角）の３０秒間の代表的なトレーススライス３つの平均を表す。式「積分電流」＝１／（１＋（［薬剤］／Ｋapp））によるデータのＳ字形適合によって導出された、おおよその結合定数（Ｋapp）は：ＮＮ−ＤＮＪでは、Ｋapp＝４５．２（±１０．７）μＭ；ＮＮ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１０．４（±１９．９）μＭ；Ｎ７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪでは、Ｋapp＝１１４．２（±１８．３）μＭ。
【図７】ＢＬＭでのｐ７チャネルシグナルに対する、ＳＰ２４０（すなわちＮ−１０−オキサウンデシル−１，６−ジデオキシガラクトノジリマイシン）の効果を示す。
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を処置する方法であって、
式ＩまたはＩＩ：
【化１】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換され；
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基であり；
ここで各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換され、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の基によって置換される）
の化合物、関連異性体、その薬学的に許容される塩および溶媒和物からなる群より選択される化合物を、その必要のある対象者に投与することを含む方法。
【請求項２】
ＨＣＶ ｐ７タンパク質およびｐ７タンパク質を含有する膜の成分のうち一方または両方を化合物に接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が式Ｉの化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つが−ＣＨ2ＯＨである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つが−ＯＨである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-18アルキル基、分岐Ｃ3-18アルキル基、または置換Ｃ1-18アルキル基である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-11アルキル基、分岐Ｃ7-11アルキル基、または置換Ｃ7-11アルキル基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、
【化２】
それらの関連異性体、およびそれらの混合物からなる群より選択される化合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が以下の表：
【化３】
に示す化合物からなる群より選択される化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、
【化４】
およびそれらの混合物からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-18アルキル基、分岐Ｃ3-18アルキル基、または置換Ｃ1-18アルキル基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-11アルキル基、分岐Ｃ7-11アルキル基、または置換Ｃ7-11アルキル基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-18アルキルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-11アルキルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ2がｎ−ノニルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ2が、Ｃ1-6アルコキシ基によって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキル基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ2が７−オキサノニルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ2が１０−ウンデシルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物がＮ−ノニル−ＤＮＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物がＮ−ノニル−ＤＧＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物がＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がＮ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が式ＩＩの化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも１つが−ＣＨ2ＯＨである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも１つが−ＯＨである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ4が直鎖Ｃ7-18アルキル基、分岐Ｃ3-18アルキル基、または置換Ｃ1-18アルキル基である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ4が直鎖Ｃ7-11アルキル基、分岐Ｃ7-11アルキル基、または置換Ｃ7-11アルキル基である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ4が、Ｃ1-6アルコキシ基によって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキル基である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ4がｎ−ノニルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ4が７−オキサノニルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ4が１０−オキサウンデシルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｐ７タンパク質を含有する膜が、ｐ７タンパク質を含有しない膜と比べて上昇した透過性を有し、前記化合物が上昇した透過性を低下させる、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物がチャネル形成を阻害する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物がチャネルブロッカーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
潜在的なＨＣＶ抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、
ｐ７を含有しない膜と比べて上昇した透過性を有するｐ７含有膜を作成するために、ｐ７タンパク質および変異体の少なくとも１つを膜に包含させるステップと、
該ｐ７含有膜の１つ以上の成分に試験化合物を接触させるステップと、
１つ以上の成分を試験化合物と接触させたｐ７含有膜の透過性を、いずれの成分も試験化合物と接触させていないｐ７含有膜の透過性と比較するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
前記ｐ７タンパク質がＨＣＶクレード１の構成要素から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｐ７タンパク質が、アミノ酸配列ＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号１）を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｐ７変異体が少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｐ７変異体が、選択されたｐ７タンパク質のほぼ位置１０からほぼ位置３２までのアミノ酸の配列、およびほぼ位置３６からほぼ位置５８までのアミノ酸の配列のうち、少なくとも１つを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
膜貫通ドメインのアミノ酸の約７０％超がＦ、Ｉ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、およびＡよりなる群の構成要素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｐ７変異体がビオチン化ｐ７タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｐ７タンパク質に試験化合物を接触させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記透過性が前記膜を通じる電流を記録することによって比較される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記膜が脂質黒膜を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記試験化合物がチャネル形成を阻害する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記試験化合物がチャネルブロッカーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試験化合物が式ＩまたはＩＩ：
【化５】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、各置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群から独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換され；
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基であり；
ここで各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換されていてもよく、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の基によって置換される）の化合物、関連異性体、その薬学的に許容される塩および溶媒和物からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記試験化合物がアマンタジンまたはその誘導体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を処置するためのキットであって、
（Ａ）式ＩまたはＩＩ：
【化６】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、各置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換され；
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基であり；
ここで各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換されていてもよく、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の基によって置換される）の化合物、関連異性体、その薬学的に許容される塩および溶媒和物と、
（Ｂ）ＨＣＶ感染を処置するための説明書と
を含むキット。
【請求項５３】
式ＩまたはＩＩ：
【化７】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、各置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換されていてもよく
Ｒ2およびＲ4は１０−オキサウンデシルである）の組成物、関連異性体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を処置する方法であって、
式ＩまたはＩＩ：
【化１】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互から独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換され；
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基であり；
ここで各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換され、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の基によって置換される）
の化合物、関連異性体、その薬学的に許容される塩および溶媒和物からなる群より選択される化合物を、その必要のある対象者に投与することを含む方法。
【請求項２】
ＨＣＶ ｐ７タンパク質およびｐ７タンパク質を含有する膜の成分のうち一方または両方を化合物に接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が式Ｉの化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つが−ＣＨ2ＯＨである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも１つが−ＯＨである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-18アルキル基、分岐Ｃ3-18アルキル基、または置換Ｃ1-18アルキル基である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-11アルキル基、分岐Ｃ7-11アルキル基、または置換Ｃ7-11アルキル基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、およびＲ15'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、
【化２】
それらの関連異性体、およびそれらの混合物からなる群より選択される化合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が以下の表：
【化３】
に示す化合物からなる群より選択される化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、
【化４】
およびそれらの混合物からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-18アルキル基、分岐Ｃ3-18アルキル基、または置換Ｃ1-18アルキル基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-11アルキル基、分岐Ｃ7-11アルキル基、または置換Ｃ7-11アルキル基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-18アルキルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ2が直鎖Ｃ7-11アルキルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ2がｎ−ノニルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ2が、Ｃ1-6アルコキシ基によって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキル基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ2が７−オキサノニルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ2が１０−ウンデシルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物がＮ−ノニル−ＤＮＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物がＮ−ノニル−ＤＧＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物がＮ−７−オキサノニル−６−デオキシ−ＤＧＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がＮ−１０−オキサウンデシル−メチル−ＤＧＪである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が式ＩＩの化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも１つが−ＣＨ2ＯＨである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも１つが−ＯＨである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'の少なくとも２つが−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、および−ＯＨからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ4が直鎖Ｃ7-18アルキル基、分岐Ｃ3-18アルキル基、または置換Ｃ1-18アルキル基である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ4が直鎖Ｃ7-11アルキル基、分岐Ｃ7-11アルキル基、または置換Ｃ7-11アルキル基である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ4が、Ｃ1-6アルコキシ基によって置換された直鎖または分岐Ｃ1-18アルキル基である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ4がｎ−ノニルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ4が７−オキサノニルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ4が１０−オキサウンデシルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｐ７タンパク質を含有する膜が、ｐ７タンパク質を含有しない膜と比べて上昇した透過性を有し、前記化合物が上昇した透過性を低下させる、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物がチャネル形成を阻害する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物がチャネルブロッカーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
潜在的なＨＣＶ抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、
ｐ７を含有しない膜と比べて上昇した透過性を有するｐ７含有膜を作成するために、ｐ７タンパク質および変異体の少なくとも１つを膜に包含させるステップと、
該ｐ７含有膜の１つ以上の成分に試験化合物を接触させるステップと、
１つ以上の成分を試験化合物と接触させたｐ７含有膜の透過性を、いずれの成分も試験化合物と接触させていないｐ７含有膜の透過性と比較するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
前記ｐ７タンパク質がＨＣＶクレード１の構成要素から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｐ７タンパク質が、アミノ酸配列ＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷＹＬＫＧＲＷＶＰＧＡＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲＡＹＡ（配列番号１）を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｐ７変異体が少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｐ７変異体が、選択されたｐ７タンパク質のほぼ位置１０からほぼ位置３２までのアミノ酸の配列、およびほぼ位置３６からほぼ位置５８までのアミノ酸の配列のうち、少なくとも１つを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
膜貫通ドメインのアミノ酸の約７０％超がＦ、Ｉ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、およびＡよりなる群の構成要素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｐ７変異体がビオチン化ｐ７タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｐ７タンパク質に試験化合物を接触させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記透過性が前記膜を通じる電流を記録することによって比較される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記膜が脂質黒膜を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記試験化合物がチャネル形成を阻害する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記試験化合物がチャネルブロッカーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試験化合物が式ＩまたはＩＩ：
【化５】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、各置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群から独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換され；
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基であり；
ここで各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換されていてもよく、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の基によって置換される）の化合物、関連異性体、その薬学的に許容される塩および溶媒和物からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記試験化合物がアマンタジンまたはその誘導体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を処置するためのキットであって、
（Ａ）式ＩまたはＩＩ：
【化６】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、各置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換され；
Ｒ2およびＲ4は、直鎖Ｃ7-18アルキル、置換Ｃ1-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルからなる群より相互に独立して選択された置換基であり；
ここで各直鎖Ｃ7-18アルキル、分岐Ｃ3-18アルキル、Ｃ2-18アルケニルおよびアルキニル、ならびにアラルキルは任意選択的に置換されていてもよく、各置換Ｃ1-18アルキルは、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨからなる群より独立して選択された１つ以上の基によって置換される）の化合物、関連異性体、その薬学的に許容される塩および溶媒和物と、
（Ｂ）ＨＣＶ感染を処置するための説明書と
を含むキット。
【請求項５３】
式ＩまたはＩＩ：
【化７】
（式中、各置換基Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ12、Ｒ12'、Ｒ13、Ｒ13'、Ｒ14、Ｒ14'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ31、Ｒ31'、Ｒ32、Ｒ32'、Ｒ33、Ｒ33'、Ｒ34、およびＲ34'はそれぞれ相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ；アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ；−ＮＯ2；−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；−ＮＨＯＨ；アリール；ならびにヘテロアリールからなる群より選択され、各置換基はそれぞれ同じでも異なっていてもよく；
ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリール基は、−ＯＨ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＨ2；アルキル−およびジアルキルアミノ；直鎖または分岐Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニルおよびアルキニル；アラルキル；直鎖または分岐Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ；アラルコキシ；−（アルキレン）オキシ（アルキル）；−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（アルキル）；−ＣＯＯ（アリール）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）；−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アリール）；スルホニル；（Ｃ1-6アルキル）スルホニル；アリールスルホニル；スルファモイル、（Ｃ1-6アルキル）スルファモイル；（Ｃ1-6アルキル）チオ；（Ｃ1-6アルキル）スルホンアミド；アリールスルホンアミド；−ＮＨＮＨ2；および−ＮＨＯＨから独立して選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換されていてもよく
Ｒ2およびＲ4は１０−オキサウンデシルである）の組成物、関連異性体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５１５５７７（Ｐ２００６−５１５５７７Ａ）
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５４８６７（Ｐ２００４−５５４８６７）
【出願日】平成１５年９月２３日（２００３．９．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００３／００６４７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４７７１９
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５１０３４５９）ザ・チャンセラー，マスターズ・アンド・スカラーズ・オヴ・ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・オックスフォード (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月２３日（２００３．９．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００３／００６４７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４７７１９
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５１０３４５９）ザ・チャンセラー，マスターズ・アンド・スカラーズ・オヴ・ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・オックスフォード (1)
【Ｆターム（参考）】
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