ウィタナミド及びウィタノリド組成物及びその使用法
新規の単離及び精製ウィタナミド及びウィタノリドが記載されている。特に、ウィタニアソムニフェラの果実からの化合物は、ウィタナミド及びウィタノリドの好ましい源であるが、これらは、他の植物源からであってもよい。強力な抗酸化物質としてのその使用に加えて、ウィタナミド及びウィタノリドは、うつ病、アルツハイマー病、肥満及び偏頭痛を治療するためにも役立ちうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
なし
【０００２】
本発明は、アルツハイマー病、うつ病、肥満及び偏頭痛などの様々な疾患を治療する際の単離及び精製されたウィタナミド（ｗｉｔｈａｎａｍｉｄｅ）及びウィタノリド（ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ）の使用に関する。ウィタナミド及びウィタノリドは特に、ウィタニアソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の果実から単離、精製された。
【背景技術】
【０００３】
ナス科のウィタニアソムニフェラ（Ｌ）デュナル（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ（Ｌ）Ｄｕｎａｌ）は、インドの乾燥地域に分布している直立性常緑低木である。アズワガンダ（Ａｓｗａｇａｎｄｈａ）として知られているＷ．ソムニフェラは、原住民治療（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）におけるその使用に関してよく知られている。アズワガンダ根抽出物は、アデノパシー、関節炎、喘息、高血圧、炎症及びリウマチのための民間療法として報告されている（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．、「インドの代表的薬草（Ｍａｊｏｒ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｉｎｄｉａ）；Ｅｄ．；Ｃｅｎｔｒａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ，５３１（１９８９））。Ｗ．ソムニフェラの葉も、腫瘍、炎症、結膜炎及び結核を含むいくつかの疾患のための治療薬として使用されている（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．、「インドの代表的薬草（Ｍａｊｏｒ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｉｎｄｉａ）；Ｅｄ．；Ｃｅｎｔｒａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｄｅｉｃｉｎａｌ ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ，５３１（１９８９））。現在では、この植物の粉末化された根又は根抽出物は、米国において食品サプリメントとして使用されている。
【０００４】
Ｗ．ソムニフェラから報告されている主な化学成分は、ウィタノリドと称される。これらの化合物は、Ｃ−２２及びＣ−２６が酸化されてδラクトンを形成しているエルゴステロール骨格を有する構造的に多様なステロイド化合物である（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｍｅ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４）。Ｗ．ソムニフェラの根及び葉の化学的研究により、いくつかのウィタノリドが単離、同定された（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，１４９９−１５０７（２００１））。この植物の果実は、とても小さいオレンジ色の液果であり、飽和及び不飽和脂肪酸を含有すると報告されている（Ｓｔｏｌｌｅｒ Ｅ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｌｏｙｄｉａ，３７，３０９−３１２（１９７４）；Ｍｏｎｉｋａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６，４４２−４４４（１９９４）；及びＭｏｎｉｋａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．５，８１−８３（１９９３））。しかしながら、葉及び果実は、生体活性に関して十分には研究されていない。ウィタノリドは、その構造骨格によって分類されており（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｍｅ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４）、その構造の多様性が、幅広い薬理学的活性アレイに寄与している。ウィタノリドは、その抗炎症、抗腫瘍、細胞毒、免疫調整活性、並びにＣＣｌ４誘発肝毒性に対する保護に関して研究されている（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｍｅ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４）；及びＡｎｊａｎｅｙｕｌｕ，Ａ．Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，「天然産物化学の研究：構造と化学」（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｐａｒｔ Ｆ）；Ｅｄ．Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ，Ｖｏｌ．２０，１３５−２６１（１９９８））。これらには動物モデルにおいてＩＩ相酵素を誘発することが報告されており、これががんの化学的予防におけるメカニズムの１つと考えられている。（Ｍｉｓｉｃｏ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６５，６７７−６８０（２００２）及びＳｕ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８，３４５３−３４６６（２００２））。
【０００５】
生命を維持する酸素は、大抵の好気性生物にとって、より高い濃度にさらされると、毒性になる。この毒性の理由は、ミトコンドリア中で酸素が水に変化する間に、スーパーオキシド（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びヒドロキシル（−ＯＨ・）基が形成することによる。環境汚染から生じた遊離基や、薬物、毒素及びストレスなどの外因子により生じた遊離基は、生体高分子構造及び機能に酸化ダメージをもたらす（Ｗｉｃｋｅｎｓ，Ａ．Ｐ．、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２８ ３７１−３８９１（２００１））。次いでこれは、アテローム硬化症、心臓血管疾患及びがんを含む多くの疾患プロセスの進行をもたらすであろう。いくつかの研究は、反応性酸素及び窒素の発生と加齢プロセスとを結びつけている（Ｖａｙａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍ．，Ｅｎｄｏｃ．＆Ｍｅｔａｂ．Ａｇｅｎｔｓ １ ９９−１１７（２００１））。酸化ストレスはさらに、膵臓β細胞の機能を損ない、糖尿病をもたらす（Ｗｅｓｔ，Ｉ．Ｃ．，Ｄｉａｂｅｔ Ｍｅｄ．１７ １７１−１８０（２０００））。１重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ）は、多不飽和脂肪酸と反応して、過酸化脂質を形成するが、これは、分解して、変異誘発物質の形成を開始する。したがって、１重項種を捕捉する能力を有する天然産物又は化学物質は、生体障害を低減し、これにより、様々な加齢関連疾患の進行を制限することができる。多くの疫学的研究により、抗酸化物質に富んだ食事は、心疾患、がん、糖尿病及びアルツハイマー病の予防において主要な役割を果たすことが判明している（Ｔｅｍｐｌｅ，Ｎ．Ｊ．，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．２０ ４４９−４５９及びそこに挙げられている参照文献（２０００））。
【０００６】
うつ病又は不安のために処方される医薬品のうちの数種は、天然抗酸化物質を含有する。アスコルビン酸、ピリドキシン、カロテン、ビタミンＥ、Ｚｎ、ニコチンアミド及びＳｅの混合物が、うつ病又は不安を治療するために有効に使用されている（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ，Ｄ．Ｆ．，ＰＣＴ 国際出願ＷＯ９８−４８７８８、Ａ１ １９９８１１０５（１９９８））。天然抗酸化物質は、脂質過酸化を阻止し、食品の栄養品質を維持する食品添加物として使用される。さらに、抗酸化物質は、がん治療の間の化学療法の副作用を低下させることが知られている（Ｃｏｎｃｌｉｎ，Ｋ．Ａ．，Ｎｕｔ．Ｃａｎｃ．３７ １−１８（２０００））。食品での脂質過酸化を予防するために使用される合成抗酸化物質は、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル（ＰＧ）及びｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）である。しかしながら、合成抗酸化物質は、発ガン物質でありうると考えられ（Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｃ．Ａ．，Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐ．Ｓｕｐｐ．１０４ １０６５−１０７３（１９９６））、したがって、安全な天然抗酸化物質を開発することには大いに関心がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の課題は、ウィタナミド及びウィタノリド治療を受け入れ可能な哺乳動物の疾患を阻害するための組成物及び方法を提供することである。この課題及び他の課題は、下記の記載及び図面を参照することにより、さらに明白になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下式の単離、精製されたウィタナミドに関する：
【化１】
［上式中、
Ｒは、
【化２】
からなる群から選択される］。
【０００９】
本発明はさらに、下式の単離、精製された化合物に関する。
【化３】
【００１０】
さらに本発明は、哺乳動物における疾患をｉｎ ｖｉｖｏで治療する方法であって、
単離、精製された下式の化合物：
【化４】
［上式中、
Ｒは、
【化５】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化６】
下式の化合物：
【化７】
及びこれらの混合物を、それを必要とする哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することを含む、方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、その必要のある組成物に酸化をもたらす（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）方法であって、
【化８】
［上式中、
Ｒは、
【化９】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化１０】
下式の化合物：
【化１１】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離及び精製された化合物を有効量で、組成物に加えることを含む、方法に関する。
【００１２】
本発明はさらに、
（ａ）抗酸化活性を必要とする組成物と、
（ｂ）抗酸化活性をもたらすに十分な量の、
【化１２】
［上式中、
Ｒは、
【化１３】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化１４】
下式の化合物：
【化１５】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離、精製された化合物と
を含む組成物に関する。
【００１３】
本発明はさらに、医薬品として使用するための組成物であって、
（ａ）
【化１６】
［上式中、
Ｒは、
【化１７】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化１８】
下式の化合物：
【化１９】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離及び精製された化合物と、
（ｂ）薬学的に許容できる担体と
を含む、組成物に関する。
【００１４】
本発明はさらに、患者におけるアルツハイマー病、肥満、偏頭痛及びうつ病からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、ウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を含有する組成物を有効量で患者に投与して、うつ病を緩和することを含む、方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物の抗酸化治療法であって、有効量のウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を哺乳動物に投与して、前記哺乳動物の抗酸化治療をもたらすことを含む、方法に関する。
【００１６】
さらに本発明は、下式の単離及び精製されたウィタノリドに関する。
【化２０】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本出願に挙げられている特許、特許出願、政府刊行物、政府規制及び文献参照は全て、参照により、その全体を本願明細書に援用する。矛盾する場合には、定義を含め本発明の記載が優先する。
【００１８】
Ｗ．ソムニフェラの種の抽出物は、優れた脂質過酸化阻害活性を有することが発見されている。Ｗ．ソムニフェラ種子抽出物からのいくつかの新規のウィタナミド及びウィタノリド並びにいくつかの既知のウィタノリドの単離及び同定を、開示する。
【００１９】
ウィタニアソムニフェラ果実のメタノール抽出物のバイオアッセイ誘導精製により、新規のウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）、新規のウィタノリド（１０）及び３種の既知のウィタノリド（１１〜１３）が得られた。
【化２１】
［上式中、
Ｒは、
【化２２−１】
【化２２−２】
【００２０】
これらの化合物の構造を、ＦＡＢＭＳ、ＨＲＦＡＭＢＳ、ＩＤ−及び２Ｄ−ＮＭＲスペクトル実験を使用することにより決定した。ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）は、長鎖ヒドロキシル脂肪酸と結合しているグリコシル化セロトニンであることが判明した。長鎖脂肪酸部分に位置するヒドロキシル基の立体化学を、化合物１に関して変更Ｍｏｓｈｅｒエステル法により決定した。化合物１〜１３を、大きな単膜ベシクル（ＬＵＶ）を使用するモデル系で脂質過酸化を阻害する能力に関して試験した。ウィタナミド１〜５及び９は、１μｇ／ｍＬで、脂質過酸化をそれぞれ９８、９３、７９、９４、８１及び８６％阻害した。しかしながら、化合物６〜８は、０．５μｇ／ｍＬで、過酸化脂質をそれぞれ８５、８２及び９０％阻害した。ウィタノリド１０及び１３は１００μｇ／ｍＬで試験し、このアッセイでは８４％及び２５％の阻害が得られた。化合物１１及び１２は、５０及び１０μｇ／ｍＬで、脂質過酸化をそれぞれ８６及び８２％阻害した。ウィタナミドＡ〜Ｉの構造活性相関（ＳＲＡ）を評価するために、化合物１４〜１６を購入し、同じリポソームモデル系を使用して、その抗酸化活性を決定した。食品防腐剤として使用されている市販の抗酸化物質ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）をさらに、この方法で１μｇ／ｍＬで試験すると、それぞれ、８０、８１及び８５％の阻害を示した。本発明の結果は、この新規の群の化合物により示される有望な抗酸化活性は、ヒドロキシル置換を伴う長鎖アシル基によると考えられることを教示している。これは、セロトニンに対するヒドロキシル脂肪酸及びグルコース単位の珍しい結合を伴うセロトニン結合体の初めての報告である。
【００２１】
Ｗ．ソムニフェラの果実を、ミシガン州立大学のＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｐｈｙｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）の温室で成育した植物から集めた。果実を粉砕し、室温でヘキサン、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨ及びアンモニアＭｅＯＨ（ｐＨ＝１１）で順次抽出した。ヘキサン及びＥｔＯＡｃ抽出物は、ＴＬＣ及びＧＣＭＳにより確認したところ、β−カロテン及び脂肪酸を含有していた。
【００２２】
ＭｅＯＨ抽出物の抗酸化アッセイ誘導分画により、５種の生物活性なフラクションが得られた。ＣＣ、逆相ＨＰＬＣ及び分取ＴＬＣによる活性フラクションの精製により、９種の新規ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）、１種の新規のウィタノリド及び３種の既知のウィタノリドが得られた。
【００２３】
ウィタナミドＡ（１）、Ｈ（８）及びＩ（９）
ウィタナミドＡ（１）は、［α］Ｄ＝−３５°を有する淡褐色の非晶質粉末として得られた。１のＨＲＦＡＢＭＳは、ｍ／ｚ７７９．４３２９（算出値７７９．４３３０）で［Ｍ＋Ｈ］＋イオンを示し、Ｃ４０Ｈ６２Ｎ２Ｏ１３としてその分子式を示した。ＩＲスペクトルは、１６３３、３４１３ｃｍ−１に吸収帯を示し、分子中にアミドカルボニル及びヒドロキシル基が存在することを示した。δ６．６６、６．９２、６．９９及び７．１５でのプロトンＮＭＲシグナルは、５−酸化トリプタミン誘導体１４に特徴的であり、それぞれＣ−６、Ｃ−４、Ｃ−２及びＣ−７プロトンに割り当てた。それぞれ１個のプロトンに集積されるδ４．３８及び４．３０での２つの二重項は、アノマープロトンに由来し、化合物１が二糖を含むことを示した。δ２．８４及び３．４２で観察された２つの三重項は、トリプタミン部分のそれぞれＨ−１０及びＨ−１１に割り当てた。δ１．２７でのブロード１重項に加えて、δ２．１２での３重項は、δ５．３１での４個のプロトンに集積される多重項と共に、その構造中に不飽和脂肪酸部分が存在することを示した。２重項として現れるδ１．１９での末端メチルシグナルは、脂肪酸部分のＣ−１７でのメチン炭素を明らかにした。さらに、１個のプロトンに集積されるδ３．７９での多重項により、Ｃ−１７でのヒドロキシル部分が確認された。δ２．０４、２．３０及び２．７５でのシグナルは、分子中のアリルメチレンプロトンに割り当てた。δ１１２．４、１１２．６、１１２．５、１５１．０及び１３３．０での１３Ｃ ＮＭＲシグナルはそれぞれ、５−酸化トリプタミン部分のＣ−６、Ｃ−７、Ｃ−３、Ｃ−５及びＣ−９に帰した。δ１７６．２でのシグナルは、ヒドロキシ脂肪酸成分が、アミド結合により５−酸化トリプタミン部分に結合していることを示した。δ７７．７及び２２．１でのシグナルは、それぞれ側鎖のヒドロキシル及びメチル炭素に帰していた。アリル炭素に帰するδ２８．２、２８．１及び２６．５での炭素シグナルは、化合物１中でのＺとしての二重結合の配置を示した。それというのも、Ｅ異性体中のアリル炭素は、３２ｐｐｍ付近に現れるためである（Ｓｐｉｎｅｌｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２ ５４７１−５４７５（１９９７）；及びＷｅｎｋｅｒｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ １３Ｃ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；Ｌｅｖｙ，Ｇ．Ｃ．，Ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．２，ｐ８１−１２１）。
【００２４】
１の酸加水分解により、セロトニン及び脂肪酸に加えて、唯一の糖としてグルコースが得られた。グルコースの同定を、グルコースの基準試料と加水分解からの生成物のＴＬＣとの比較により行った。Ｃ−６”に対して７ｐｐｍほどの、Ｃ−６’で観察されたダウンフィールドシフトは、グルコース部分の１”→６’結合を示した。１Ｈ−及び１３Ｃ ＮＭＲシグナルと文献値との比較により、化合物１中の２糖単位は、ジグルコシドとして同定された（Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５９ ８４１−８４９（２００３））。
【００２５】
その構造の付加的な証明が、そのＭＳ細分化パターン、ＮＯＥＳＹ、ＨＭＢＣ及びＣＯＳＹ研究から得られた。そのＭＳで観察されたｍ／ｚ６１７でのイオンにより、分子イオンからの１個のグルコース単位の喪失が確認された。ｍ／ｚ４５５でのフラグメントは、アグリコン部分に割り当てられ、ヒドロキシ脂肪酸側鎖が１８−炭素を含むことを示した。ジグルコシド単位は、Ｈ−１’とＨ−４とのＮＯＥＳＹ相関に基づきＣ−５に位置した（図１）。さらに、δ４．３０でのＨ−１”とδ６９．７でのＣ−６’とのＨＭＢＣ相関により、グルコース成分の１”→６’結合が確認された（図１）。化合物１のＴＯＣＳＹスペクトルデータにより、それぞれＣ−６”’及びＣ−９”’での二重結合の位置が確認された。δ３．７９でのヒドロキシルプロトン多重項は、そのＣＯＳＹスペクトルではメチル基に対応付けされ、Ｃ−１７での−ＯＨの帰属を支持し、さらに、ＨＭＢＣ相関により確認された（図１）。
【００２６】
Ｃ−１７での絶対配置を、Ｍｏｓｈｅｒエステル法により決定した（Ｒｅｚｎａｋａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４ ６３５−６４５（２０００））。化合物１をそれぞれ個別に、Ｒ（−）及びＳ（＋）αメトキシトリフルオロフェニルアセチル塩化物（ＭＴＰＡ）と無水ピリジン中で反応させた。反応混合物を精製すると、Ｒ及びＳ−ＭＴＰＡエステル誘導体が得られた。生じたエステルの１Ｈ ＮＭＲ分析により、Ｓ−ＭＴＰＡエステル中のＣ−１８は、Ｒ−ＭＴＰＡエステルにおいてよりも低いフィールドに現れることが判明した（支持情報）。同様に、Ｓ−ＭＴＰＡエステル中のＨ−１６は、Ｒ−ＭＴＰＡエステルにおいてよりも高いフィールドで現われた。Ｈ−１８及びＨ−１６でのΔδ（δｓ−δＲ）値は、それぞれ＋０．０３及び−０．０２であり、これにより、ＲとしてのＣ−１７での配置が確認された（Ｒｅｚｎａｋａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４ ６３５−６４５（２０００））。
【００２７】
化合物８は、分子イオンをｍ／ｚ７７５．４０１３でもたらした。また、その１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで観察された化合物１との相似は、８がその側鎖に２個の付加的なオレフィン結合を有するウィタナミドであることを示し、これは、さらにδ５．３４での８Ｈ多重項及びそれぞれδ１３２．６、１３２．２、１３１．４、１３０．１、１２８．７及び１２８．５での１３Ｃ ＮＭＲシフトにより支持される。６Ｈに関して集積されるδ２．８２でのシグナルは、Ｃ−６”’とＣ−７”’、Ｃ−９”’とＣ−１０”’、Ｃ−１２”’とＣ−１３”’、及びＣ−１５”’とＣ−１６”’とのオレフィン結合に位置するメチレン基に帰する。これらの二重結合のうちの１つは、Ｃ−１５”’及びＣ−１６”’に位置する。それというのも、このオレフィン多重項は、そのＴＯＣＳＹスペクトルにおいてこのメチル二重項に対応付けられ（図２）、これはさらに、末端メチル基の１．２４ｐｐｍへのダウンフィールドシフトにより証明された。アリル炭素がそれぞれ、その１３Ｃ ＮＭＲスペクトルにおいてδ２６．、６、２７．０及び２８．２に現われるので、二重結合の配置は、Ｚと推測される。したがって、ウィタナミドＨは、８に示されているように、１１，１５−デヒドロウィタナミドＡであることが確認された。
【００２８】
化合物９も、そのセロトニン及びヒドロキシル脂肪酸部分での化学シフトにより示されるように、化合物１のデータと類似の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータが得られた。脂肪酸部分中に２個の二重結合が存在することが、５．３３ｐｐｍでの４Ｈ多重項により確認された。ｍ／ｚ９４１．４８５７での［Ｍ＋Ｈ］＋イオンにより、９の分子式がＣ４６Ｈ７２Ｏ１８Ｎ２であることが確認された。加えて、δ４．３２、４．３６及び４．３９で現われた３種のアノマープロトンの存在は、ウィタナミドＩ（９）がトリグルコシドであることを示した。ウィタナミドＡ（１）の場合と同様に、２個のグルコース単位の結合が、Ｃ６’プロトンのダウンフィールドシフトにより示されるように、Ｃ−１”→Ｃ−６’として確定された。同様の結合が、第３のグルコース部分に関して確定された。したがって、９におけるグルコシド単位が、β−Ｄ−グルコピラノシル（１”−６’）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１”’→６”）−β−Ｄ−グルコピラノシドと確定された。化合物９の１Ｈ−ＮＭＲにおいて、２重項として末端メチル基が現われたことにより、化合物９中の長鎖脂肪酸成分の末端置換は、ウィタナミドＡ（１）と同様であることが示された。
【００２９】
ウィタナミドＢ〜Ｅ（２〜５）。
−３４°の［α］Ｄを伴う無色の非晶質粉末であるウィタナミドＢ（２）は、ｍ／ｚ７５５．４３３０に［Ｍ＋Ｈ］＋を示し、Ｃ３８Ｈ６３Ｎ２Ｏ１３として分子式が確認された（算出値７５５．４３３１）。２の１Ｈ−及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、δ５．３２にオレフィンプロトンシグナルが存在しない化合物１のスペクトルと非常に似ていた。２の分子イオンは、化合物１のものよりも２４ａｍｕ少ない。このことは、２中の側鎖は飽和されていて、１６個の炭素のみを含むことを示していた。グルコース成分内の結合は、δ６９．７へのＣ−６−ダウンフィールドシフトにより、且つＣ−１”及びＨ−６’の間に観察されるＨＭＢＣ相関により、１”→６’であることが明らかになった（図３）。メチルプロトンは、そのＨＭＢＣスペクトルにおいて、δ７７．７での炭素に相関しており、Ｃ−１５”’での−ＯＨ置換が確認された（図３）。２の提示された構造は、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＤＥＰＴ及びＮＯＥＳＹ実験により確認された。
【００３０】
化合物３の１Ｈ−ＮＭＲは、δ０．９１での−ＣＨ３３重項を除いて、化合物２に似ていた。加えて、これにより、化合物２と同一の分子式Ｃ３８Ｈ６３Ｎ２Ｏ１３が得られた。このことは、化合物３が２の異性体であることを示していた。３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでの主要な差異は、メチレン基の１つのアップフィールドシフトであり、これは、δ２６．３で現われた。通常の脂肪酸（１４．０ｐｐｍ）に比較してδ１０．１でのメチル炭素の出現及び長鎖ヒドロキシル炭素のダウンフィールドシフト（δ８２．０）は、Ｃ−１４”’にヒドロキシル基が存在することを示していた。δ０．９１での３重項は、δ３．６３でのプロトンに関連しているδ１．５２でのメチレンプロトンとのＣＯＳＹ相関を示し、Ｃ−１４”’でのヒドロキシル部分を支持した（図３）。Ｃ−１４”’での−ＯＨの存在はさらに、δ０．９１でのメチル３重項とδ８２．０でのヒドロキシル炭素とのＨＭＢＣ相関により実証された（図３）。したがって、化合物３は、２の位置異性体と確認された。
【００３１】
化合物４のＭＳは、ｍ／ｚ８０５．４４６２で［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンを示し、その分子式がＣ４０Ｈ６６Ｏ１３Ｎ２と確認された。４の１Ｈ−及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータは、化合物２のスペクトルデータと似ていて、分子中の飽和側鎖を示していた。さらに、ＭＳデータにより、化合物４中の側鎖が１８個の炭素を含むことが確認された。
【００３２】
淡褐色の固体である化合物５は、ｍ／ｚ７８３．４６４５で［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンを示し、その分子式がＣ４０Ｈ６６Ｎ２Ｏ１３と確認された。５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータは、ウィタナミドＣ（３）と似ていて、飽和側鎖の存在を示した。δ０．９１でのメチル３重項は、化合物５中の末端炭素は、３と同様の置換パターンを有することを示した。３に比較して２８ａｍｕの分子イオンの差は、５に２個の付加的なメチレン基が存在することを示していた。したがって、化合物５は、Ｃ−１６”’にヒドロキシル基を伴うヒドロキシル酸脂肪酸側鎖中に１８個の炭素を有していた。したがって、化合物５は、４の位置異性体であった。
【００３３】
ウィタナミドＦ及びＧ（６、７）。
ウィタナミドＦ（６）は、少量不純物として脂肪酸グリコシドを有する分離不可能な混合物として得られた。６の１Ｈ ＮＭＲデータは、ウィタナミドＡ（１）と類似していた。しかしながら、これは、側鎖中に二重結合に由来するδ５．３３での２Ｈ多重項を示した。化合物６中に、δ８２．０での炭素に関するシグナルと共に、δ０．９１でのメチル３重項が現われることは、脂肪酸成分中の末端炭素が、化合物３及び５と同様の置換パターンを有することを示した。６中のオレフィン炭素は、それぞれδ１３０．９及び１３０．７に現われた。したがって、これら２個のオレフィン炭素の化学シフトは、０．２ｐｐｍ異なり、オレフィン部分は、Ｃ−９に割り当てられた。二重結合の配置は、Ｃ−８及びＣ−１１がδ２８．１で現われたので、Ｚと推測された（Ｓｐｉｎｅｌｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｆ．Ｃｈｅｍ．６２ ５４７１−５４７５（１９９７）。６のＨＲＦＡＢＭＳは、ｍ／ｚ８０３．４３０４［Ｍ＋Ｎａ］＋で分子イオンを示し、さらに、その構造中のＣ−１８脂肪酸部分を支持した。
【００３４】
ｍ／ｚ７５３．４１７３での化合物７の［Ｍ＋Ｈ］＋は、２の分子イオンよりも２質量単位少なく（７５５．４３３１）、したがって、その中に１個の不飽和を伴う１６Ｃ側鎖の存在を示した。δ５．３４での２Ｈ多重項も、オレフィン結合を支持した。２重項がメチルプロトンに由来するδ１．２１で現われ、脂肪酸側鎖に存在する−ＯＨ部分が、化合物１及び２での置換と同様に置換されていることを示した。少量の試料により、１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、分子中の全ての炭素に関するシグナルをもたらすような情報をもたらさなかった。しかしながら、δ２７．０及び２８．１で現われるアリル炭素シグナルにより、二重結合の配置がＺと確認された。ウィタナミドのうちのいくつか（１、６〜９）は、Ｃ−９及びＣ−１０位に二重結合を有することと、生物発生的考慮から、ウィタナミドＧ中の二重結合が、Ｃ−９に由来すると考慮された。
【００３５】
２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩ（１０）
化合物１０は、無色の非晶質粉末として単離され、そのＦＡＢＭＳスペクトルでｍ／ｚ７８５で分子イオンを示した。１０における３４２１、１７２４及び１６６３ｃｍ−１でのＩＲ吸収バンドは、分子中に−ＯＨ及び飽和ラクトンが存在することを示した。ＨＲＦＡＢＭＳにより、その分子式がＣ４０Ｈ６５Ｏ１５（Ｍ＋Ｈ）＋７８５．４３２５；算出値７８５．４３２３）と確認された。δ０．８９、１．０１、１．２５での１重項及びδ１．１７及び１．１５での２重項は、その１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいてそれぞれメチル基に割り当てられた。１個のプロトンに関してそれぞれ集積されるδ５．５２でのブロード２重項及びδ４．３９及び４．３６での２重項はそれぞれ、オレフィン及びアノマープロトンに割り当てられた。δ４．２４での２重項の２重項及びδ４．０での多重項はそれぞれ、Ｈ−２２及びＨ−３に割り当てられた。化合物１０及びウィタノリドＶＩ（１１）は、同様の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトを示した（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９ １４９９−１５０７（２００１）。１０中での２個のメチル２重項の出現は、α，β−不飽和δラクトン部分中に二重結合が存在しないことを示していた。１１と比較して、１０において２個のオレフィン炭素が不存在であり、δ１７８．９でのＣ＝Ｏが出現していたことから、その分子中の飽和ラクトン環が確認された。アノマー炭素に由来するδ１０４．８及び１０３．１での２個のシグナルは、分子中のジグルコシド部分を支持していた。Ｃ−６”プロトン（δ３．８４、３．６６）に比較して、Ｃ−６’プロトンのダウンフィールドシフト（４．１２及び３．７６ｐｐｍ）は、２個のグルコース成分の１”→６’結合を示した。さらに、ウィタナミドと同様に、Ｃ−６（δ６９．７）のダウンフィールドシフトによりさらに、グルコシド結合が１”→６’と確認された。δ８１．９、５８．１、５６．１、１３９．１、１２５．５、７５．１及び７３．６でのシグナルはそれぞれ、Ｃ−２２、Ｃ−１４、Ｃ−１７、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−１及びＣ−３に割り当てられた。δ１４．２、１４．４、１９．９、２０．５及び２１．２で現われた他のシグナルはそれぞれ、１８、２８、１９、２７及び２１メチル炭素に割り当てられた。ジグルコシド単位は、１０のスペクトルデータとウィタノリド１１〜１３のスペクトルデータを比較すると、Ｃ−３に位置付けられた。ラクトン炭素シグナルを除き、１０中の他の１３Ｃ ＮＭＲ化学シフトは全て、ウィタノシドＶＩ（１１）と同様であった。したがって、１０の構造は、２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩ（１２）と導き出された。ウィタノシドＶよりも２質量単位ほど高いｍ／ｚ７８４での分子イオンはさらに、化合物１０に関して提示された構造を支持した。前記のスペクトルデータから、化合物１０の構造は、２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩと導き出された。
【００３６】
神経伝達物質であるセロトニンが、ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）の構造における基本骨格を構成していた。したがって、これらの化合物の構造及び活性を比較するために、トリプタミン（１４）、５−メトキシセロトニン（１５）及びセロトニン（１６）を購入した。大きな単膜ベシクル（ＬＵＶ）モデル系を使用することにより、化合物１〜１６及び市販の抗酸化物質ＢＨＴ、ＢＨＡ及びＴＢＨＱを脂質過酸化の阻害に関して試験した（Ａｒｏｒａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４ １３５５−１３６３（１９９８））。用量応答試験を全ての化合物に関して行い、図４に報告されている活性濃度を、１ｐｐｍ濃度で評価された市販の抗酸化物質の活性プロファイルと比較した。ＢＨＡ、ＢＨＴ及びＴＢＨＱはそれぞれ、１μｇ／ｍｌで、脂質過酸化を８０、８１及び８５％阻害した（図４）。ウィタナミドＢ（２）は、飽和側鎖を含み、１μｇ／ｍで、脂質過酸化を９３％阻害した。一方、２の位置異性体であるウィタナミドＣ（３）は、７９％の阻害を示した。同様に、ウィタナミドＤ（４）及びＥ（５）で観察された阻害はそれぞれ、１μｇ／ｍＬで９４％及び８１％であった。その側鎖に１個の二重結合を有する化合物６及び７はそれぞれ、０．５μｇ／ｍｌで、８５％及び８２％の阻害を示した。同様に、ウィタナミドＨ（８）は、このアッセイで、０．５μｇ／ｍｌで９０％の阻害を示した。しかしながら、その側鎖に２個の二重結合を有するジグルコシドであるウィタナミドＡ（１）は、脂質過酸化を９８％阻害した。一方、トリグルコシドであるウィタナミドＩ（９）は、１μｇ／ｍｌで８６％の阻害を示した（図４）。このことは、グリコシド単位の数も、これらの化合物の抗酸化活性において重要な役割を果たすことを示していた。
【００３７】
トリプタミン（１４）は、１００μｇ／ｍｌで４０％の阻害を示し、その５−メトキシ誘導体である化合物１５は、脂質過酸化を５０μｇ／ｍＬで、３０％しか阻害しなかった。セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）塩酸塩は、１０μｇ／ｍＬで４４％の阻害を示した。化合物１４から１６では、１μｇ／ｍＬでのウィタナミドと同様の脂質過酸化のほぼ１００％の阻害が、試験化合物濃度を２倍にした際に観察された。５−メトキシトリプタミン（１５）は、トリプタミン（７）よりも高い活性を示し、このことは、５−酸化は、活性を増大させることを示した。セロトニン塩酸塩では、その５−メチル誘導体に比較すると、高い阻害が観察され、このことは、５位の遊離ヒドロキシルは、遊離ラジカル捕捉活性に非常に重要であることを示した。ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）は、市販の抗酸化物質と同等以上で、セロトニンよりもかなり良好な優れた脂質過酸化阻害活性を示した（図４）。セロトニン核及びヒドロキシ脂肪酸側鎖が、抗酸化活性に顕著に貢献していた。ウィタナミドの中では、不飽和側鎖を有する化合物が、飽和側鎖よりも活性であった。１５及び１７位にヒドロキシル基を有する化合物２及び４はそれぞれ、その異性体３及び５よりも活性であり、このことは、ヒドロキシル基の位置も、その抗酸化活性において重要な役割を果たすことを示していた。この結果は、Ｆｅ２＋とのウィタナミドのキレート化の可能性を排除する。それというのも、セロトニン、５−メトキシセロトニン及びトリプタミンは、ウィタナミドに比較してかなり高い濃度でしか活性でないためである。
【００３８】
本発明において果実から単離されたウィタノリドはさらに、脂質過酸化を阻害した（図５）。Ｗ．ソムニフェラ種子から単離される主な化合物の１種であるウィタノシドＶ（１２）は、１０ｐｐｍで脂質過酸化の８２．５％の阻害を示した。一方で、ウィタノシドＩＶ（１３）阻害は、１００μｇ／ｍＬで２５％であった。ウィタノリドＶＩ（１１）は、５０ｐｐｍで８６％の脂質過酸化阻害活性を示し、その２３，２４−ジヒドロ誘導体（１０）は、１００ｐｐｍで同様の活性を示した（図５）。化合物１０のラクトン部分の飽和は、そのデヒドロ誘導体１１に比較して、活性を低下させ、このことは、α，β−不飽和δラクトンは、ウィタノリドの脂質過酸化能に関して重要であることを示した。化合物１１及び１３は、１２のヒドロキシル化誘導体であった。１３のＣ−２７での水酸化は、Ｃ−２０での水酸化よりも活性を低下させた。これは、ラクトンのＣ２７ヒドロキシルとカルボニル基との水素結合によると思われる。
【００３９】
ウィタナミドＡ〜Ｃ（１〜３）及びウィタノシドＶ（１２）を、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）酵素を阻害する能力に関して試験した（Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５９ ８４１−８４９（２００３））。これらの化合物は、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２酵素を、１００μｇ／ｍＬで阻害しなかった。これらをさらに、ＭＴＴアッセイを使用して、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、ＳＦ−２６８（中枢神経系；ＣＮＳ）及びＭＣＦ−７（乳房）ヒト腫瘍細胞系に対する抗増殖活性に関して試験したが（Ｔｉａｎ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ ４０ １８０−１８４（２００１））、不活性であった。このことは、これらの化合物が、毒性を殆んど若しくは全く有さないことを証明した。
【００４０】
セロトニンは、人体での多くの生理学的機能を制御する際に重要な役割を果たしている。その放出は、睡眠の開始、疼痛感受性、血圧制御及び気分の制御における決定因子である。セロトニンレベルの低下、体重増加に到る炭水化物及び一定の食品群の過剰消費（Ｌｉｎｎｏｉｌａ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ５３ ４６−５１（１９９２））、抑鬱症状、不眠、攻撃性及び慢性頭痛（Ｗｕｒｔｍａｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４９ ３７−３９（１９９８））を生じさせる。セロトニン前駆体である５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンは、様々なセロトニン関連疾患を治療するために市販薬（ＯＴＣ）として使用されている（Ｂｉｒｄｓａｌｌ，Ｔ．Ｃ．，Ａｌｔｅｒｎ Ｍｅｄ Ｒｅｖ．３ ２７１−２８０及びそこに挙げられている参考文献（１９９８年））。胃でウィタナミドがセロトニンに変化する可能性があり、経口摂取された場合には、その遊離のセロトニンが吸収される可能性がある。したがって、Ｗ．ソムニフェラ種から単離されたウィタナミドは、体内でセロトニンレベルを高める可能性を有し、ヒトでのセロトニン不足に関連する様々な疾患に対処するためのサプリメントとして使用することができる。さらに、２種のトリプタミン類似体（スマトリプタン（ｓｕｍａｔｒｙｐｔａｎ）及びエリトリプタン（ｅｌｉｔｒｙｐｔａｎ））は、偏頭痛関連疾患を治療するために使用されている（Ｎｅｗｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６６ １０２２−１０３７（２００３））。したがって、ウィタナミドは、偏頭痛を治療するための有望な候補物質として考えることができる。ウィタナミドは、有望な抗酸化活性を示したので、これは、アルツハイマー病及びアテローム硬化症を予防するために使用することができる。
【００４１】
ウィタナミド１〜９は、新規のヒドロキシル置換脂肪酸及びグルコース単位を有する新規のセロトニン誘導体である。ウィタナミド１〜９は０．５〜１μｇ／ｍｌで、ＢＨＡ、ＢＨＴ及びＴＢＨＱと同等か、それ以上、脂質抗酸化を阻害し、このことは、これらが、市販の抗酸化物質よりも良好な抗酸化物質であることを示している。Ｗ．コアグレンス（ｃｏａｇｕｌｅｎｃｅ）及びＷ．ソムニフェラの種子は、古代からインドでは、牛乳を濃縮するために使用されていた。これらの化合物が、ヒト腫瘍細胞アッセイにおいて、細胞毒性を示さなかったことは、特記すべき重要な事項である。したがって、Ｗ．ソムニフェラ種子又はウィタナミドは、ヒトが消費するための新規で安全な抗酸化物質を開発するための有望な候補物質である。さらに、化合物１〜９は、Ｗ．ソムニフェラ種子を使用して、アルツハイマー病、パーキンソン病及び心臓血管疾患などの様々な加齢関連疾患を治療するための食品サプリメントを開発する際に大きな役割を果たすと思われる。
【実施例】
【００４２】
実験手順の一般的な事項
ＨＲＦＡＢ及びＦＡＢ（陽イオン方式）質量スペクトルを、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ＣｅｎｔｅｒにあるＪＥＯＬ ＭＸ１１０質量分析計で測定した。旋光性を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ ３４１（Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）で、ＭＥＯＨ中、２０℃で測定した。標準的なパルスシーケンスを使用して、１Ｈ（５０ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）及び２Ｄ ＮＭＲ実験をＩＮＯＶＡ ＶＡＲＩＡＮ ＶＲＸ ５００装置で実施した。化学シフトを、ＣＤ３ＯＤ中で測定し、δ（ｐｐｍ）で表した。ＨＭＢＣをＪ＝８Ｈｚのために最適化した。ＩＲスペクトルをＭａｔｔｓｏｎ Ｇａｌａｘｙ Ｓｅｒｉｅｓ ＦＴＩＲ３００でＷｉｎＦＩＲＳＴソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｏｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）分光計を使用して記録した。単離及び精製のために使用された溶剤は全て、ＡＣＳ級である。ＭＰＬＣのために使用されたシリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（粒度３５〜７０μｍ）であった。ＳｉゲルＰＴＬＣプレート（２０×２０、５００μｍ）をＡｎａｌｔｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）から購入した。再生分取ＨＰＬＣ（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．ＬＣ−２０モデル）を、化合物を分離するためのＪＡＩＧＥＬ−ＯＤＳ−Ｃ１８カラムと共に使用した。陽性対照のブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びｔ−ブチルヒドロキノン９（ＴＢＨＱ）、セロトニン、５−メトキシセロトニン及びトリプタミンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。脂質の１−ステアロイル２−リノレオイルｓｎ−グリセロール３−ホスホコリン（ＳＬＰＣ）をＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。蛍光プローブの３−［ｐ−（６−フェニル）−１，３，５−ヘキサトリエニル］−フェニルプロピオン酸を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入し、Ｒ−及びＳ−メトキシ−（トリフルオロメチル）フェニルアセチル（ＭＴＰＡ）塩化物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。
【００４３】
植物原料
植物ウィタニアソムニフェラを、ミシガン州立大学にあるＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｐｈｙｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの温室で成育した。植物を、１２時間の光周期、７５華氏温度で、ローム性砂及びバクト（ｂａｃｔｏ）ミックスからなる１：１混合物中、６”プラスチック鉢内で成育した。植物に水を与え、２０：２０：２０（Ｎ：Ｐ：Ｋ）を使用して毎日、肥料を与えた。十分に熟した種子を集め、室温で乾燥させ、直ちに抽出した。
【００４４】
抽出及び単離
Ｗ．ソムニフェラの乾燥させ、粉砕した果実（１００ｇ）をｎ−ヘキサン（３×５００ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（３×５００ｍＬ）、ＭｅＯＨ（５×５００ｍＬ）及びアンモニアＭｅＯＨ（３×５００ｍＬ）で順次抽出した。減圧下に溶剤を蒸発させ、ｎ−ヘキサン（８ｇ）、ＥｔＯＡｃ（２ｇ）、ＭｅＯＨ（８ｇ）及びアンモニアＭｅＯＨ（２ｇ）の粗製抽出物を得た。ＭｅＯＨ抽出物（７ｇ）をｎ−ヘキサン（５×１５０ｍｌ）を用いて脱脂し（１．５ｇ）、７０％のＣＨＣｌ３から８０％のＭｅＯＨへの勾配条件下に、シリカゲル中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）により分画した。７０％ＣＨＣｌ３溶離液を、それぞれ４０ｍｌの１０個のフラクションにおいて収集し、ＴＬＣ上で同様に、貯留して、濃縮すると、フラクションＩ（３００ｍｇ）が得られた。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１：１）溶離から得られた同様のフラクション（８個のフラクション、それぞれ５０ｍＬ）を合わせて、濃縮すると、フラクションＩＩ（１００ｍｇ）が得られた。ＣＨＣｌ３ＭｅＯＨ（４０：６０）溶離液から、１５個のフラクション（それぞれ５０ｍＬ）が得られ、これらは同様に、貯留し、蒸発させると、フラクションＩＩＩ（２ｇ）が得られた。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（３０：７０溶離）からの６種の同様のフラクション（それぞれ４５ｍＬ）の濃縮により、フラクションＩＶ（１．８ｇ）が得られた。８０％ＭｅＯＨ溶離液を貯留し、蒸発させると、Ｖ（２００ｍｇ）が得られた。
【００４５】
ＴＬＣにより示されたように、フラクションＩ及びＩＩは主に、脂肪酸を含有した。ＪＡＩＧＥＬ−ＯＤＳ−Ｃ１８カラム及び移動相として３ｍＬ／分のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏを使用する分取ＨＰＬＣにより、フラクションＩＩＩ（１．８ｇ）を精製した。集められたフラクションは、Ａ（１５〜３０分、５００ｍｇ）、Ｂ（３１〜４１分、２００ｍｇ）、Ｃ（４２〜５６分、５００ｍｇ）、Ｄ（５８〜７０分、２００ｍｇ）及びＥ（７１〜９５分、５０ｍｇ）であった。ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（６２．５：３７．５、ｖ／ｖ）を使用する分取ＨＰＬＣにより、フラクションＣをさらに精製し、純粋な化合物１（８１．９５分、６２ｍｇ）、２（９２．０分、７１ｍｇ）及びフラクション（１０４分、３５ｍｇ）を得た。ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）を使用する分取ＨＰＬＣにより、化合物１及び２を再び精製して、純粋な化合物１（３５分、５０ｍｇ）及び２（３８．０、７０ｍｇ）を得た。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）を使用する分取ＴＬＣで、１０４分でのフラクションをさらに精製して、同じ移動相で３回展開すると、純粋な化合物３（Ｒｆ＝０．５、１２ｍｇ）が得られた。ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（７６：２４、ｖ／ｖ）を使用するＨＰＬＣにより、フラクションＤを精製すると、純粋な化合物１２（６７．３分、１５０ｍｇ）が得られた。ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（７５：２５）を使用するＨＰＬＣにより、フラクションＥを精製すると、３種のフラクションＦ（７１分、１４ｍｇ）、Ｇ（１０１分、５ｍｇ）、Ｈ（１１２分、４．０ｍｇ）が得られた。
【００４６】
分取ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、４：１）で、フラクションＧを精製すると、化合物４（Ｒｆ＝０．６、２．５ｍｇ）が得られた。移動相でＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（５：１）を使用するＰＴＬＣで、フラクションＦ及びＨを精製すると、５（Ｒｆ＝０．６５、８ｍｇ）及び６（Ｒｆ＝０．５８、３．０ｍｇ）が得られた。フラクションＩＩを、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（３４：６６、ｖ／ｖ）を使用するＨＰＬＣに掛けると、５種のフラクションｆｒ．１（３７．０分、３８．１ｍｇ）、ｆｒ．２（４５〜７０分、６８．８ｍｇ）、ｆｒ．３（８４．４分、１９．８ｍｇ）及びｆｒ．４（９４．９分、１１．４ｍｇ）が得られた。
【００４７】
移動相（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、１：１、ｖ／ｖ）を使用する分取ＴＬＣにより、ｆｒ．１を精製すると、純粋なウィタノリド１３（Ｒｆ＝０．４０、７．０ｍｇ）が得られた。ＰＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７５：２５、ｖ／ｖ）によりｆｒ．４を繰り返し精製すると、純粋な化合物８（Ｒｆ＝０．７２、２ｍｇ）が得られた。同様に、ＰＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７０：３０、ｖ／ｖ）によりｆｒ．３を精製すると、化合物７（Ｒｆ＝０．６１、１．０ｍｇ）及び９（Ｒｆ＝０．８、０．７ｍｇ）が得られた。ＰＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、１：１、ｖ／ｖ）によるｆｒ．２の精製により、Ｒｆ＝０．５（２５．０ｍｇ）のバンドが得られ、移動相としてＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（３３：６７）を使用する分取ＨＰＬＣによりさらに精製すると、ウィタノリド１０（６２．４分、６．０ｍｇ）及び１１（７０．８分、４．０ｍｇ）が得られた。
【００４８】
ウィタナミドＡ（１）非晶質粉末
【化２３】
【００４９】
ウィタナミドＢ（２）非晶質粉末
【化２４】
【００５０】
ウィタナミドＣ（３）非晶質粉末
【化２５】
【００５１】
ウィタナミドＤ（４）非晶質粉末
【化２６】
【００５２】
ウィタナミドＥ（５）非晶質粉末
【化２７】
【００５３】
ウィタナミドＦ（６）非晶質粉末
【化２８】
【００５４】
ウィタナミドＧ（７）非晶質粉末
【化２９】
【００５５】
ウィタナミドＨ（８）非晶質粉末
【化３０】
【００５６】
ウィタナミドＩ（９）非晶質粉末
【化３１】
【００５７】
２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩ（１０）無色、非晶質粉末
【化３２】
【００５８】
化合物１１〜１３
化合物１１〜１３の構造を、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲデータにより明らかにし、スペクトルデータと刊行結果とを比較することにより、その同定を行った（Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５９ ８４１−８４９（２００３）及びＭａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９ １４９９−１５０７（２００１）。
【００５９】
化合物１のＲ−及びＳ−ＭＴＰＡエステルの調製
化合物１（１．５ｍｇ）及びＲ−（−）のメトキシトリフルオロフェニルアセチル塩化物（Ｒ−ＭＴＰＡ）を含むピリジン中の混合物をジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）と共に（５時間）室温で攪拌した。溶剤を蒸発させ、得られた残留物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）を使用するＰＴＬＣで精製すると、Ｒ−ＭＴＰＡエステル（１．０ｍｇ）が得られた。同様に、化合物１（１．２ｍｇ）を、Ｓ−（＋）−メトキシトリフルオロフェニルアセチル塩化物で処理し、生じた生成物を精製すると、Ｓ−ＭＴＰＡエステル（０．９ｍｇ）が得られた。
【００６０】
抗酸化アッセイ
公表されている手順（Ａｒｏｒａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４ １３５５−１３６３（１９９８））に従い、大きな単膜ベシクル（リポソーム懸濁液）を使用して、化合物１〜１６を脂質過酸化の阻害に関して試験した。リン脂質１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＬＰＣ）及び蛍光試料［３−［ｐ−（６−フェニル）−１，３，５−ヘキサトリエニルフェニルプロピオン酸（ＤＰＨ−ＰＡ）とを混合することにより、リポソーム懸濁液を調製した。最終アッセイ容量は２ｍＬであり、ＨＥＰＥＳ（１００μＬ）、１ＭのＮａＣｌ（２００μＬ）、Ｎ２−スパージされた水（１．６４ｍｌ）、試験試料又はＤＭＳＯ（２０μＬ）及びリポソーム懸濁液（２０μＬ）から構成された。ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．５ｍＭ）２０μｌを加えることにより、過酸化を開始した。Ｔｕｒｎｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０ Ｄｉｇｉｔａｌ蛍光測定器を使用して、０、１、３分及び３分ごとに２１分まで、蛍光を監視した。一定期間にわたる（２１分）蛍光強度の低下は、過酸化速度を示した。脂質過酸化のパーセンテージを、ＤＭＳＯ溶剤対照に対して算出した。試料のストック溶液を１００μｇ／ｍｌで調製し、アッセイのためにさらに希釈した。
【００６１】
薬剤組成物
薬剤組成物において、ウィタナミド又はウィタノリドは、１ミリリットル又は１グラム当たり１から１０００マイクログラムの用量で阻害性を有する。好ましい一実施形態では、患者を治療するために、１種又は複数のウィタナミド又はウィタノリドを薬学的に許容できる担体中に阻害用量を含有させて患者に与えられる。このように、慣用の混合、顆粒化、コーティング、懸濁及びカプセル封入法などの当技術分野でよく知られている方法により、ウィタナミド又はウィタノリドを薬学的担体物質と共に処理して、経口又は直腸投与のための慣用の製剤にする。したがって、１種又は複数のアントラキノンと固体薬学的担体とを組合せ；任意に、生じた混合物を顆粒化し；この混合物又は顆粒物を望ましい場合には、及び／又は任意に適切な助剤を加えた後に処理して、錠剤又は糖衣剤核の形態にすることにより、経口投与のためのウィタノリド又はウィタナミド製剤を得ることができる。
【００６２】
固体製剤のための適切な薬学的担体は特に、糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マンニトール又はソルビトール）、セルロース製剤及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム）などの充填剤；さらに、使用する場合にはデンプンペースト（例えば、トウモロコシ、小麦、米又は馬鈴薯デンプン）、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン、一部遊離の官能基を有するポリアクリレート若しくはポリメタクリレートのエステルなどの結合剤；並びに／或いは、必要な場合には、前記のデンプン、さらにカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの発泡剤である。助剤は主に、流量調節剤及び滑剤、例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウムなどのその塩である。糖衣丸核は、任意に胃酸に対して耐性を有する適切なコーティングを備えていて、この際、特に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン及び／又は二酸化チタンを任意に含有する濃縮糖溶液、水性溶剤中のラッカー溶液或いは、胃液に対して耐性を有するコーティングを製造するためには、フタル酸エステル又はトリアセチンなどの適切な軟化剤を有するか、有しない、部分的に遊離な官能基を有するポリアクリレート若しくはポリメタクリレートのエステルの溶液又はフタル酸アセチルセルロース若しくはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース調整物の溶液が使用される。例えば、活性成分の様々な用量を特定又は表示するために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣丸コーティングに加えることもできる。
【００６３】
経口投与することができる１種又は複数のウィタノリド又はウィタナミド製剤はさらに、硬質ゼラチンカプセル、並びに、ゼラチン製の硬質若しくは軟質密封カプセル及び必要な場合には、グリセリン又はソルビトールなどの軟化剤を含有する。硬質ゼラチンカプセルは、１種又は複数のウィタノリドを、顆粒の形態で、例えば、トウモロコシデンプンなどの充填剤、任意に顆粒化された小麦デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム又はコロイドケイ酸などの結合剤又は潤滑剤、及び任意に安定剤との混合物として含有することができる。密封カプセルでは、１種又は複数のウィタノリドは、粉末又は顆粒の形態であるか；好ましくは、適切な溶剤中の懸濁液の形態で存在するので、懸濁液を安定化するために、例えば、モノステアリン酸グリセリンを加えることができる。
【００６４】
経口投与するための他のウィタノリド又はウィタナミド製剤は例えば、通常の方法で調製される水性懸濁液であり、この懸濁液は、１種又は複数の化合物を、懸濁された形態で１回用量に十分な濃度で含有する。水性懸濁液は、最小量の安定剤及び／又は着香物質を含有し、例えば、サッカリンナトリウム又はシロップなどの甘味料は、一定量の糖及び／又はソルビトール又は同様の物質を含有する。さらに、シェーキを調製するためには、例えば、濃縮物又は濃縮懸濁液が適している。このような濃縮物も、１回用量にパッケージングすることができる。
【００６５】
直腸投与のための適切なウィタノリド又はウィタナミド製剤は、例えば、１種又は複数のウィタノリドと座薬ファンデーション物質との混合物からなる座薬である。このような物質は特に好ましくは、天然若しくは合成のトリグリセリド混合物である。さらに、ファウンデーション物質中に１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを含む懸濁液からなるゼラチン直腸カプセルが適している。適切なファウンデーション物質は例えば、高飽和又は、特に好ましくは中飽和脂肪酸の液体トリグリセリドである。
【００６６】
同様に、微細に粉砕された、好ましくは、粒度中央値５μｍ未満を有する１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを、デンプンと、特に好ましくはトウモロコシデンプン又は小麦デンプンと、または例えば、馬鈴薯デンプン又は米デンプンと混合された形態で含有する製剤が、特に好ましい。好ましくは、大量の成分の場合には、必要ならば冷却しながら、プロペラ様の薄刃攪拌装置を備えた高速ミキサー中で、例えば３から１０分間の混合時間で簡単に混合することにより、これを製造する。この混合プロセスでは、粒子のサイズを継続的に低下させながら、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの粒子を均一にデンプン粒子の上に堆積させる。前記の混合物を、慣用の、例えば前記の助剤と共に、固体用量単位に処理する。即ち、例えば圧縮して、錠剤又は糖衣丸の形態にするか、カプセルに充填する。しかしながらこれらは、そのままで、又は助剤、例えば、高級脂肪酸とのポリオキシエチレンソルビタンのエステル又は硫酸ラウリルナトリウムなどの薬学的に許容できる湿潤剤及び分散剤及び／又は着香物質を加えた後に、水性懸濁液を調製するための、例えば約５から２０倍量の水を伴う濃縮物として使用することもできる。ウィタノリド又はウィタナミド／デンプン混合物と界面活性物質又は他の助剤とを組み合わせる代わりに、これらの物質を、懸濁液を調製するために使用される水に加えることもできる。１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミド／デンプン混合物及び場合により助剤を含む懸濁液を製造するための濃縮物を、必要ならば気密及び防湿に、１回用量でパッケージングすることもできる。
【００６７】
加えて、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを、患者に腹腔内、鼻腔内、皮下又は静脈内投与することができる。通常、腹腔内、鼻腔内、皮下又は静脈内投与では、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤及び防腐剤などの慣用の添加剤と共に、植物性又は他の同様のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル又はプロピレングリコールなどの水性又は非水性溶剤中に溶解、懸濁又は乳化させることにより、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを与える。好ましくは、１種又は複数のウィタノリドを、温血動物又はヒトでの腹腔内、皮下又は静脈内使用に許容される組成物の形態で提供する。例えば、このような組成物は、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドのための担体として、緩衝リン酸塩溶液などの生理学的に許容される溶液を含有してもよい。好ましくは、溶液は、生理学的ｐＨである。特別な実施形態では、組成物を、直接患者に注入して、静脈内投与により腫瘍に灌流させる。
【００６８】
本発明による製剤は、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを温血動物又はヒトに投与するために適した濃度で含有し、その濃度は、投与方法に応じて、約０．３％から９５％、好ましくは、約２．５％から９０％である。懸濁液の場合には、濃度は通常、３０％以下であり、好ましくは約２．５％であり；逆に、１種又は複数のアントラキノンを有する錠剤、糖衣丸及びカプセルでは、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの必要用量の容易な摂取を保証するために、濃度は好ましくは、約０．３％以上である。１種又は複数のウィタノリドを含有する製剤での患者の治療を好ましくは、一定期間にわたって脂質過酸化を実質的に阻害するに十分である１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの用量を１回又は複数回投与することにより実施する。必要ならば、用量を、毎日か、数時間間隔で投与される複数の部分用量に分けて投与することができる。特別な場合には、製剤を、放射線又は化学療法などの１種又は複数の他の療法と共に、又はその後に使用することができる。１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの投与用量は、治療される患者（温血動物種又はヒト）、治療される患者の全身状態及び治療される疾患のタイプに左右される。
【００６９】
前記の記載は本発明を詳述することを目的としているにすぎず、本発明は、添付の請求項にのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】化合物１で観察される選択ＨＭＢＣ（→）及びＣＯＳＹ（←→）相関を示す化学構造である。
【図２】化合物９の選択ＴＯＣＳＹ（→）相関を示す化学構造である。
【図３】化合物２及び３の重要なＨＭＢＣ（→）及びＣＯＳＹ（←→）相関を示す化学構造である。
【図４】化合物１〜９及び１４〜１６による脂質過酸化の阻害を示すグラフである。３分間隔で２１分間、蛍光強度を監視した。示されている阻害パーセンテージは、２１分目にＤＭＳＯ対照に対して算出した。試験された化合物の濃度は、１〜３、５及び９では１μｇ／ｍＬ；４、６〜８では０．５μｇ／ｍＬ；１５では１００μｇ／ｍＬ；１６では５０μｇ／ｍＬ；１７では１０μｇ／ｍＬであった。市販の抗酸化剤ＢＨＡ、ＢＨＴ及びＴＢＨＱは１μｇ／ｍＬで試験した。表されているデータは、平均±１標準偏差（ｎ＝２）を示している。
【図５】ウィタノリド１０〜１３による脂質過酸化の阻害パーセントを示すグラフである。試験された化合物は、１００μｇ／ｍＬの１０及び１３であり；１２及び１１はそれぞれ、１０及び５０μｇ／ｍＬであった。示されているデータは、平均±１標準偏差（ｎ＝２）を示している。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
なし
【０００２】
本発明は、アルツハイマー病、うつ病、肥満及び偏頭痛などの様々な疾患を治療する際の単離及び精製されたウィタナミド（ｗｉｔｈａｎａｍｉｄｅ）及びウィタノリド（ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ）の使用に関する。ウィタナミド及びウィタノリドは特に、ウィタニアソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の果実から単離、精製された。
【背景技術】
【０００３】
ナス科のウィタニアソムニフェラ（Ｌ）デュナル（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ（Ｌ）Ｄｕｎａｌ）は、インドの乾燥地域に分布している直立性常緑低木である。アズワガンダ（Ａｓｗａｇａｎｄｈａ）として知られているＷ．ソムニフェラは、原住民治療（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）におけるその使用に関してよく知られている。アズワガンダ根抽出物は、アデノパシー、関節炎、喘息、高血圧、炎症及びリウマチのための民間療法として報告されている（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．、「インドの代表的薬草（Ｍａｊｏｒ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｉｎｄｉａ）；Ｅｄ．；Ｃｅｎｔｒａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ，５３１（１９８９））。Ｗ．ソムニフェラの葉も、腫瘍、炎症、結膜炎及び結核を含むいくつかの疾患のための治療薬として使用されている（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．、「インドの代表的薬草（Ｍａｊｏｒ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｉｎｄｉａ）；Ｅｄ．；Ｃｅｎｔｒａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｄｅｉｃｉｎａｌ ａｎｄ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ，５３１（１９８９））。現在では、この植物の粉末化された根又は根抽出物は、米国において食品サプリメントとして使用されている。
【０００４】
Ｗ．ソムニフェラから報告されている主な化学成分は、ウィタノリドと称される。これらの化合物は、Ｃ−２２及びＣ−２６が酸化されてδラクトンを形成しているエルゴステロール骨格を有する構造的に多様なステロイド化合物である（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｍｅ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４）。Ｗ．ソムニフェラの根及び葉の化学的研究により、いくつかのウィタノリドが単離、同定された（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，１４９９−１５０７（２００１））。この植物の果実は、とても小さいオレンジ色の液果であり、飽和及び不飽和脂肪酸を含有すると報告されている（Ｓｔｏｌｌｅｒ Ｅ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｌｏｙｄｉａ，３７，３０９−３１２（１９７４）；Ｍｏｎｉｋａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６，４４２−４４４（１９９４）；及びＭｏｎｉｋａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．５，８１−８３（１９９３））。しかしながら、葉及び果実は、生体活性に関して十分には研究されていない。ウィタノリドは、その構造骨格によって分類されており（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｍｅ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４）、その構造の多様性が、幅広い薬理学的活性アレイに寄与している。ウィタノリドは、その抗炎症、抗腫瘍、細胞毒、免疫調整活性、並びにＣＣｌ４誘発肝毒性に対する保護に関して研究されている（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｍｅ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４）；及びＡｎｊａｎｅｙｕｌｕ，Ａ．Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，「天然産物化学の研究：構造と化学」（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｐａｒｔ Ｆ）；Ｅｄ．Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ，Ｖｏｌ．２０，１３５−２６１（１９９８））。これらには動物モデルにおいてＩＩ相酵素を誘発することが報告されており、これががんの化学的予防におけるメカニズムの１つと考えられている。（Ｍｉｓｉｃｏ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６５，６７７−６８０（２００２）及びＳｕ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８，３４５３−３４６６（２００２））。
【０００５】
生命を維持する酸素は、大抵の好気性生物にとって、より高い濃度にさらされると、毒性になる。この毒性の理由は、ミトコンドリア中で酸素が水に変化する間に、スーパーオキシド（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びヒドロキシル（−ＯＨ・）基が形成することによる。環境汚染から生じた遊離基や、薬物、毒素及びストレスなどの外因子により生じた遊離基は、生体高分子構造及び機能に酸化ダメージをもたらす（Ｗｉｃｋｅｎｓ，Ａ．Ｐ．、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２８ ３７１−３８９１（２００１））。次いでこれは、アテローム硬化症、心臓血管疾患及びがんを含む多くの疾患プロセスの進行をもたらすであろう。いくつかの研究は、反応性酸素及び窒素の発生と加齢プロセスとを結びつけている（Ｖａｙａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍ．，Ｅｎｄｏｃ．＆Ｍｅｔａｂ．Ａｇｅｎｔｓ １ ９９−１１７（２００１））。酸化ストレスはさらに、膵臓β細胞の機能を損ない、糖尿病をもたらす（Ｗｅｓｔ，Ｉ．Ｃ．，Ｄｉａｂｅｔ Ｍｅｄ．１７ １７１−１８０（２０００））。１重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ）は、多不飽和脂肪酸と反応して、過酸化脂質を形成するが、これは、分解して、変異誘発物質の形成を開始する。したがって、１重項種を捕捉する能力を有する天然産物又は化学物質は、生体障害を低減し、これにより、様々な加齢関連疾患の進行を制限することができる。多くの疫学的研究により、抗酸化物質に富んだ食事は、心疾患、がん、糖尿病及びアルツハイマー病の予防において主要な役割を果たすことが判明している（Ｔｅｍｐｌｅ，Ｎ．Ｊ．，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．２０ ４４９−４５９及びそこに挙げられている参照文献（２０００））。
【０００６】
うつ病又は不安のために処方される医薬品のうちの数種は、天然抗酸化物質を含有する。アスコルビン酸、ピリドキシン、カロテン、ビタミンＥ、Ｚｎ、ニコチンアミド及びＳｅの混合物が、うつ病又は不安を治療するために有効に使用されている（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ，Ｄ．Ｆ．，ＰＣＴ 国際出願ＷＯ９８−４８７８８、Ａ１ １９９８１１０５（１９９８））。天然抗酸化物質は、脂質過酸化を阻止し、食品の栄養品質を維持する食品添加物として使用される。さらに、抗酸化物質は、がん治療の間の化学療法の副作用を低下させることが知られている（Ｃｏｎｃｌｉｎ，Ｋ．Ａ．，Ｎｕｔ．Ｃａｎｃ．３７ １−１８（２０００））。食品での脂質過酸化を予防するために使用される合成抗酸化物質は、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル（ＰＧ）及びｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）である。しかしながら、合成抗酸化物質は、発ガン物質でありうると考えられ（Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｃ．Ａ．，Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐ．Ｓｕｐｐ．１０４ １０６５−１０７３（１９９６））、したがって、安全な天然抗酸化物質を開発することには大いに関心がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の課題は、ウィタナミド及びウィタノリド治療を受け入れ可能な哺乳動物の疾患を阻害するための組成物及び方法を提供することである。この課題及び他の課題は、下記の記載及び図面を参照することにより、さらに明白になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下式の単離、精製されたウィタナミドに関する：
【化１】
［上式中、
Ｒは、
【化２】
からなる群から選択される］。
【０００９】
本発明はさらに、下式の単離、精製された化合物に関する。
【化３】
【００１０】
さらに本発明は、哺乳動物における疾患をｉｎ ｖｉｖｏで治療する方法であって、
単離、精製された下式の化合物：
【化４】
［上式中、
Ｒは、
【化５】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化６】
下式の化合物：
【化７】
及びこれらの混合物を、それを必要とする哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することを含む、方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、その必要のある組成物に酸化をもたらす（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）方法であって、
【化８】
［上式中、
Ｒは、
【化９】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化１０】
下式の化合物：
【化１１】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離及び精製された化合物を有効量で、組成物に加えることを含む、方法に関する。
【００１２】
本発明はさらに、
（ａ）抗酸化活性を必要とする組成物と、
（ｂ）抗酸化活性をもたらすに十分な量の、
【化１２】
［上式中、
Ｒは、
【化１３】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化１４】
下式の化合物：
【化１５】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離、精製された化合物と
を含む組成物に関する。
【００１３】
本発明はさらに、医薬品として使用するための組成物であって、
（ａ）
【化１６】
［上式中、
Ｒは、
【化１７】
からなる群から選択される］；
下式の化合物：
【化１８】
下式の化合物：
【化１９】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離及び精製された化合物と、
（ｂ）薬学的に許容できる担体と
を含む、組成物に関する。
【００１４】
本発明はさらに、患者におけるアルツハイマー病、肥満、偏頭痛及びうつ病からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、ウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を含有する組成物を有効量で患者に投与して、うつ病を緩和することを含む、方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物の抗酸化治療法であって、有効量のウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を哺乳動物に投与して、前記哺乳動物の抗酸化治療をもたらすことを含む、方法に関する。
【００１６】
さらに本発明は、下式の単離及び精製されたウィタノリドに関する。
【化２０】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本出願に挙げられている特許、特許出願、政府刊行物、政府規制及び文献参照は全て、参照により、その全体を本願明細書に援用する。矛盾する場合には、定義を含め本発明の記載が優先する。
【００１８】
Ｗ．ソムニフェラの種の抽出物は、優れた脂質過酸化阻害活性を有することが発見されている。Ｗ．ソムニフェラ種子抽出物からのいくつかの新規のウィタナミド及びウィタノリド並びにいくつかの既知のウィタノリドの単離及び同定を、開示する。
【００１９】
ウィタニアソムニフェラ果実のメタノール抽出物のバイオアッセイ誘導精製により、新規のウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）、新規のウィタノリド（１０）及び３種の既知のウィタノリド（１１〜１３）が得られた。
【化２１】
［上式中、
Ｒは、
【化２２−１】
【化２２−２】
【００２０】
これらの化合物の構造を、ＦＡＢＭＳ、ＨＲＦＡＭＢＳ、ＩＤ−及び２Ｄ−ＮＭＲスペクトル実験を使用することにより決定した。ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）は、長鎖ヒドロキシル脂肪酸と結合しているグリコシル化セロトニンであることが判明した。長鎖脂肪酸部分に位置するヒドロキシル基の立体化学を、化合物１に関して変更Ｍｏｓｈｅｒエステル法により決定した。化合物１〜１３を、大きな単膜ベシクル（ＬＵＶ）を使用するモデル系で脂質過酸化を阻害する能力に関して試験した。ウィタナミド１〜５及び９は、１μｇ／ｍＬで、脂質過酸化をそれぞれ９８、９３、７９、９４、８１及び８６％阻害した。しかしながら、化合物６〜８は、０．５μｇ／ｍＬで、過酸化脂質をそれぞれ８５、８２及び９０％阻害した。ウィタノリド１０及び１３は１００μｇ／ｍＬで試験し、このアッセイでは８４％及び２５％の阻害が得られた。化合物１１及び１２は、５０及び１０μｇ／ｍＬで、脂質過酸化をそれぞれ８６及び８２％阻害した。ウィタナミドＡ〜Ｉの構造活性相関（ＳＲＡ）を評価するために、化合物１４〜１６を購入し、同じリポソームモデル系を使用して、その抗酸化活性を決定した。食品防腐剤として使用されている市販の抗酸化物質ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）をさらに、この方法で１μｇ／ｍＬで試験すると、それぞれ、８０、８１及び８５％の阻害を示した。本発明の結果は、この新規の群の化合物により示される有望な抗酸化活性は、ヒドロキシル置換を伴う長鎖アシル基によると考えられることを教示している。これは、セロトニンに対するヒドロキシル脂肪酸及びグルコース単位の珍しい結合を伴うセロトニン結合体の初めての報告である。
【００２１】
Ｗ．ソムニフェラの果実を、ミシガン州立大学のＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｐｈｙｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）の温室で成育した植物から集めた。果実を粉砕し、室温でヘキサン、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨ及びアンモニアＭｅＯＨ（ｐＨ＝１１）で順次抽出した。ヘキサン及びＥｔＯＡｃ抽出物は、ＴＬＣ及びＧＣＭＳにより確認したところ、β−カロテン及び脂肪酸を含有していた。
【００２２】
ＭｅＯＨ抽出物の抗酸化アッセイ誘導分画により、５種の生物活性なフラクションが得られた。ＣＣ、逆相ＨＰＬＣ及び分取ＴＬＣによる活性フラクションの精製により、９種の新規ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）、１種の新規のウィタノリド及び３種の既知のウィタノリドが得られた。
【００２３】
ウィタナミドＡ（１）、Ｈ（８）及びＩ（９）
ウィタナミドＡ（１）は、［α］Ｄ＝−３５°を有する淡褐色の非晶質粉末として得られた。１のＨＲＦＡＢＭＳは、ｍ／ｚ７７９．４３２９（算出値７７９．４３３０）で［Ｍ＋Ｈ］＋イオンを示し、Ｃ４０Ｈ６２Ｎ２Ｏ１３としてその分子式を示した。ＩＲスペクトルは、１６３３、３４１３ｃｍ−１に吸収帯を示し、分子中にアミドカルボニル及びヒドロキシル基が存在することを示した。δ６．６６、６．９２、６．９９及び７．１５でのプロトンＮＭＲシグナルは、５−酸化トリプタミン誘導体１４に特徴的であり、それぞれＣ−６、Ｃ−４、Ｃ−２及びＣ−７プロトンに割り当てた。それぞれ１個のプロトンに集積されるδ４．３８及び４．３０での２つの二重項は、アノマープロトンに由来し、化合物１が二糖を含むことを示した。δ２．８４及び３．４２で観察された２つの三重項は、トリプタミン部分のそれぞれＨ−１０及びＨ−１１に割り当てた。δ１．２７でのブロード１重項に加えて、δ２．１２での３重項は、δ５．３１での４個のプロトンに集積される多重項と共に、その構造中に不飽和脂肪酸部分が存在することを示した。２重項として現れるδ１．１９での末端メチルシグナルは、脂肪酸部分のＣ−１７でのメチン炭素を明らかにした。さらに、１個のプロトンに集積されるδ３．７９での多重項により、Ｃ−１７でのヒドロキシル部分が確認された。δ２．０４、２．３０及び２．７５でのシグナルは、分子中のアリルメチレンプロトンに割り当てた。δ１１２．４、１１２．６、１１２．５、１５１．０及び１３３．０での１３Ｃ ＮＭＲシグナルはそれぞれ、５−酸化トリプタミン部分のＣ−６、Ｃ−７、Ｃ−３、Ｃ−５及びＣ−９に帰した。δ１７６．２でのシグナルは、ヒドロキシ脂肪酸成分が、アミド結合により５−酸化トリプタミン部分に結合していることを示した。δ７７．７及び２２．１でのシグナルは、それぞれ側鎖のヒドロキシル及びメチル炭素に帰していた。アリル炭素に帰するδ２８．２、２８．１及び２６．５での炭素シグナルは、化合物１中でのＺとしての二重結合の配置を示した。それというのも、Ｅ異性体中のアリル炭素は、３２ｐｐｍ付近に現れるためである（Ｓｐｉｎｅｌｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２ ５４７１−５４７５（１９９７）；及びＷｅｎｋｅｒｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ １３Ｃ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；Ｌｅｖｙ，Ｇ．Ｃ．，Ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．２，ｐ８１−１２１）。
【００２４】
１の酸加水分解により、セロトニン及び脂肪酸に加えて、唯一の糖としてグルコースが得られた。グルコースの同定を、グルコースの基準試料と加水分解からの生成物のＴＬＣとの比較により行った。Ｃ−６”に対して７ｐｐｍほどの、Ｃ−６’で観察されたダウンフィールドシフトは、グルコース部分の１”→６’結合を示した。１Ｈ−及び１３Ｃ ＮＭＲシグナルと文献値との比較により、化合物１中の２糖単位は、ジグルコシドとして同定された（Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５９ ８４１−８４９（２００３））。
【００２５】
その構造の付加的な証明が、そのＭＳ細分化パターン、ＮＯＥＳＹ、ＨＭＢＣ及びＣＯＳＹ研究から得られた。そのＭＳで観察されたｍ／ｚ６１７でのイオンにより、分子イオンからの１個のグルコース単位の喪失が確認された。ｍ／ｚ４５５でのフラグメントは、アグリコン部分に割り当てられ、ヒドロキシ脂肪酸側鎖が１８−炭素を含むことを示した。ジグルコシド単位は、Ｈ−１’とＨ−４とのＮＯＥＳＹ相関に基づきＣ−５に位置した（図１）。さらに、δ４．３０でのＨ−１”とδ６９．７でのＣ−６’とのＨＭＢＣ相関により、グルコース成分の１”→６’結合が確認された（図１）。化合物１のＴＯＣＳＹスペクトルデータにより、それぞれＣ−６”’及びＣ−９”’での二重結合の位置が確認された。δ３．７９でのヒドロキシルプロトン多重項は、そのＣＯＳＹスペクトルではメチル基に対応付けされ、Ｃ−１７での−ＯＨの帰属を支持し、さらに、ＨＭＢＣ相関により確認された（図１）。
【００２６】
Ｃ−１７での絶対配置を、Ｍｏｓｈｅｒエステル法により決定した（Ｒｅｚｎａｋａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４ ６３５−６４５（２０００））。化合物１をそれぞれ個別に、Ｒ（−）及びＳ（＋）αメトキシトリフルオロフェニルアセチル塩化物（ＭＴＰＡ）と無水ピリジン中で反応させた。反応混合物を精製すると、Ｒ及びＳ−ＭＴＰＡエステル誘導体が得られた。生じたエステルの１Ｈ ＮＭＲ分析により、Ｓ−ＭＴＰＡエステル中のＣ−１８は、Ｒ−ＭＴＰＡエステルにおいてよりも低いフィールドに現れることが判明した（支持情報）。同様に、Ｓ−ＭＴＰＡエステル中のＨ−１６は、Ｒ−ＭＴＰＡエステルにおいてよりも高いフィールドで現われた。Ｈ−１８及びＨ−１６でのΔδ（δｓ−δＲ）値は、それぞれ＋０．０３及び−０．０２であり、これにより、ＲとしてのＣ−１７での配置が確認された（Ｒｅｚｎａｋａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４ ６３５−６４５（２０００））。
【００２７】
化合物８は、分子イオンをｍ／ｚ７７５．４０１３でもたらした。また、その１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで観察された化合物１との相似は、８がその側鎖に２個の付加的なオレフィン結合を有するウィタナミドであることを示し、これは、さらにδ５．３４での８Ｈ多重項及びそれぞれδ１３２．６、１３２．２、１３１．４、１３０．１、１２８．７及び１２８．５での１３Ｃ ＮＭＲシフトにより支持される。６Ｈに関して集積されるδ２．８２でのシグナルは、Ｃ−６”’とＣ−７”’、Ｃ−９”’とＣ−１０”’、Ｃ−１２”’とＣ−１３”’、及びＣ−１５”’とＣ−１６”’とのオレフィン結合に位置するメチレン基に帰する。これらの二重結合のうちの１つは、Ｃ−１５”’及びＣ−１６”’に位置する。それというのも、このオレフィン多重項は、そのＴＯＣＳＹスペクトルにおいてこのメチル二重項に対応付けられ（図２）、これはさらに、末端メチル基の１．２４ｐｐｍへのダウンフィールドシフトにより証明された。アリル炭素がそれぞれ、その１３Ｃ ＮＭＲスペクトルにおいてδ２６．、６、２７．０及び２８．２に現われるので、二重結合の配置は、Ｚと推測される。したがって、ウィタナミドＨは、８に示されているように、１１，１５−デヒドロウィタナミドＡであることが確認された。
【００２８】
化合物９も、そのセロトニン及びヒドロキシル脂肪酸部分での化学シフトにより示されるように、化合物１のデータと類似の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータが得られた。脂肪酸部分中に２個の二重結合が存在することが、５．３３ｐｐｍでの４Ｈ多重項により確認された。ｍ／ｚ９４１．４８５７での［Ｍ＋Ｈ］＋イオンにより、９の分子式がＣ４６Ｈ７２Ｏ１８Ｎ２であることが確認された。加えて、δ４．３２、４．３６及び４．３９で現われた３種のアノマープロトンの存在は、ウィタナミドＩ（９）がトリグルコシドであることを示した。ウィタナミドＡ（１）の場合と同様に、２個のグルコース単位の結合が、Ｃ６’プロトンのダウンフィールドシフトにより示されるように、Ｃ−１”→Ｃ−６’として確定された。同様の結合が、第３のグルコース部分に関して確定された。したがって、９におけるグルコシド単位が、β−Ｄ−グルコピラノシル（１”−６’）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１”’→６”）−β−Ｄ−グルコピラノシドと確定された。化合物９の１Ｈ−ＮＭＲにおいて、２重項として末端メチル基が現われたことにより、化合物９中の長鎖脂肪酸成分の末端置換は、ウィタナミドＡ（１）と同様であることが示された。
【００２９】
ウィタナミドＢ〜Ｅ（２〜５）。
−３４°の［α］Ｄを伴う無色の非晶質粉末であるウィタナミドＢ（２）は、ｍ／ｚ７５５．４３３０に［Ｍ＋Ｈ］＋を示し、Ｃ３８Ｈ６３Ｎ２Ｏ１３として分子式が確認された（算出値７５５．４３３１）。２の１Ｈ−及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、δ５．３２にオレフィンプロトンシグナルが存在しない化合物１のスペクトルと非常に似ていた。２の分子イオンは、化合物１のものよりも２４ａｍｕ少ない。このことは、２中の側鎖は飽和されていて、１６個の炭素のみを含むことを示していた。グルコース成分内の結合は、δ６９．７へのＣ−６−ダウンフィールドシフトにより、且つＣ−１”及びＨ−６’の間に観察されるＨＭＢＣ相関により、１”→６’であることが明らかになった（図３）。メチルプロトンは、そのＨＭＢＣスペクトルにおいて、δ７７．７での炭素に相関しており、Ｃ−１５”’での−ＯＨ置換が確認された（図３）。２の提示された構造は、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＤＥＰＴ及びＮＯＥＳＹ実験により確認された。
【００３０】
化合物３の１Ｈ−ＮＭＲは、δ０．９１での−ＣＨ３３重項を除いて、化合物２に似ていた。加えて、これにより、化合物２と同一の分子式Ｃ３８Ｈ６３Ｎ２Ｏ１３が得られた。このことは、化合物３が２の異性体であることを示していた。３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでの主要な差異は、メチレン基の１つのアップフィールドシフトであり、これは、δ２６．３で現われた。通常の脂肪酸（１４．０ｐｐｍ）に比較してδ１０．１でのメチル炭素の出現及び長鎖ヒドロキシル炭素のダウンフィールドシフト（δ８２．０）は、Ｃ−１４”’にヒドロキシル基が存在することを示していた。δ０．９１での３重項は、δ３．６３でのプロトンに関連しているδ１．５２でのメチレンプロトンとのＣＯＳＹ相関を示し、Ｃ−１４”’でのヒドロキシル部分を支持した（図３）。Ｃ−１４”’での−ＯＨの存在はさらに、δ０．９１でのメチル３重項とδ８２．０でのヒドロキシル炭素とのＨＭＢＣ相関により実証された（図３）。したがって、化合物３は、２の位置異性体と確認された。
【００３１】
化合物４のＭＳは、ｍ／ｚ８０５．４４６２で［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンを示し、その分子式がＣ４０Ｈ６６Ｏ１３Ｎ２と確認された。４の１Ｈ−及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータは、化合物２のスペクトルデータと似ていて、分子中の飽和側鎖を示していた。さらに、ＭＳデータにより、化合物４中の側鎖が１８個の炭素を含むことが確認された。
【００３２】
淡褐色の固体である化合物５は、ｍ／ｚ７８３．４６４５で［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンを示し、その分子式がＣ４０Ｈ６６Ｎ２Ｏ１３と確認された。５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータは、ウィタナミドＣ（３）と似ていて、飽和側鎖の存在を示した。δ０．９１でのメチル３重項は、化合物５中の末端炭素は、３と同様の置換パターンを有することを示した。３に比較して２８ａｍｕの分子イオンの差は、５に２個の付加的なメチレン基が存在することを示していた。したがって、化合物５は、Ｃ−１６”’にヒドロキシル基を伴うヒドロキシル酸脂肪酸側鎖中に１８個の炭素を有していた。したがって、化合物５は、４の位置異性体であった。
【００３３】
ウィタナミドＦ及びＧ（６、７）。
ウィタナミドＦ（６）は、少量不純物として脂肪酸グリコシドを有する分離不可能な混合物として得られた。６の１Ｈ ＮＭＲデータは、ウィタナミドＡ（１）と類似していた。しかしながら、これは、側鎖中に二重結合に由来するδ５．３３での２Ｈ多重項を示した。化合物６中に、δ８２．０での炭素に関するシグナルと共に、δ０．９１でのメチル３重項が現われることは、脂肪酸成分中の末端炭素が、化合物３及び５と同様の置換パターンを有することを示した。６中のオレフィン炭素は、それぞれδ１３０．９及び１３０．７に現われた。したがって、これら２個のオレフィン炭素の化学シフトは、０．２ｐｐｍ異なり、オレフィン部分は、Ｃ−９に割り当てられた。二重結合の配置は、Ｃ−８及びＣ−１１がδ２８．１で現われたので、Ｚと推測された（Ｓｐｉｎｅｌｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｆ．Ｃｈｅｍ．６２ ５４７１−５４７５（１９９７）。６のＨＲＦＡＢＭＳは、ｍ／ｚ８０３．４３０４［Ｍ＋Ｎａ］＋で分子イオンを示し、さらに、その構造中のＣ−１８脂肪酸部分を支持した。
【００３４】
ｍ／ｚ７５３．４１７３での化合物７の［Ｍ＋Ｈ］＋は、２の分子イオンよりも２質量単位少なく（７５５．４３３１）、したがって、その中に１個の不飽和を伴う１６Ｃ側鎖の存在を示した。δ５．３４での２Ｈ多重項も、オレフィン結合を支持した。２重項がメチルプロトンに由来するδ１．２１で現われ、脂肪酸側鎖に存在する−ＯＨ部分が、化合物１及び２での置換と同様に置換されていることを示した。少量の試料により、１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、分子中の全ての炭素に関するシグナルをもたらすような情報をもたらさなかった。しかしながら、δ２７．０及び２８．１で現われるアリル炭素シグナルにより、二重結合の配置がＺと確認された。ウィタナミドのうちのいくつか（１、６〜９）は、Ｃ−９及びＣ−１０位に二重結合を有することと、生物発生的考慮から、ウィタナミドＧ中の二重結合が、Ｃ−９に由来すると考慮された。
【００３５】
２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩ（１０）
化合物１０は、無色の非晶質粉末として単離され、そのＦＡＢＭＳスペクトルでｍ／ｚ７８５で分子イオンを示した。１０における３４２１、１７２４及び１６６３ｃｍ−１でのＩＲ吸収バンドは、分子中に−ＯＨ及び飽和ラクトンが存在することを示した。ＨＲＦＡＢＭＳにより、その分子式がＣ４０Ｈ６５Ｏ１５（Ｍ＋Ｈ）＋７８５．４３２５；算出値７８５．４３２３）と確認された。δ０．８９、１．０１、１．２５での１重項及びδ１．１７及び１．１５での２重項は、その１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいてそれぞれメチル基に割り当てられた。１個のプロトンに関してそれぞれ集積されるδ５．５２でのブロード２重項及びδ４．３９及び４．３６での２重項はそれぞれ、オレフィン及びアノマープロトンに割り当てられた。δ４．２４での２重項の２重項及びδ４．０での多重項はそれぞれ、Ｈ−２２及びＨ−３に割り当てられた。化合物１０及びウィタノリドＶＩ（１１）は、同様の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトを示した（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９ １４９９−１５０７（２００１）。１０中での２個のメチル２重項の出現は、α，β−不飽和δラクトン部分中に二重結合が存在しないことを示していた。１１と比較して、１０において２個のオレフィン炭素が不存在であり、δ１７８．９でのＣ＝Ｏが出現していたことから、その分子中の飽和ラクトン環が確認された。アノマー炭素に由来するδ１０４．８及び１０３．１での２個のシグナルは、分子中のジグルコシド部分を支持していた。Ｃ−６”プロトン（δ３．８４、３．６６）に比較して、Ｃ−６’プロトンのダウンフィールドシフト（４．１２及び３．７６ｐｐｍ）は、２個のグルコース成分の１”→６’結合を示した。さらに、ウィタナミドと同様に、Ｃ−６（δ６９．７）のダウンフィールドシフトによりさらに、グルコシド結合が１”→６’と確認された。δ８１．９、５８．１、５６．１、１３９．１、１２５．５、７５．１及び７３．６でのシグナルはそれぞれ、Ｃ−２２、Ｃ−１４、Ｃ−１７、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−１及びＣ−３に割り当てられた。δ１４．２、１４．４、１９．９、２０．５及び２１．２で現われた他のシグナルはそれぞれ、１８、２８、１９、２７及び２１メチル炭素に割り当てられた。ジグルコシド単位は、１０のスペクトルデータとウィタノリド１１〜１３のスペクトルデータを比較すると、Ｃ−３に位置付けられた。ラクトン炭素シグナルを除き、１０中の他の１３Ｃ ＮＭＲ化学シフトは全て、ウィタノシドＶＩ（１１）と同様であった。したがって、１０の構造は、２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩ（１２）と導き出された。ウィタノシドＶよりも２質量単位ほど高いｍ／ｚ７８４での分子イオンはさらに、化合物１０に関して提示された構造を支持した。前記のスペクトルデータから、化合物１０の構造は、２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩと導き出された。
【００３６】
神経伝達物質であるセロトニンが、ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）の構造における基本骨格を構成していた。したがって、これらの化合物の構造及び活性を比較するために、トリプタミン（１４）、５−メトキシセロトニン（１５）及びセロトニン（１６）を購入した。大きな単膜ベシクル（ＬＵＶ）モデル系を使用することにより、化合物１〜１６及び市販の抗酸化物質ＢＨＴ、ＢＨＡ及びＴＢＨＱを脂質過酸化の阻害に関して試験した（Ａｒｏｒａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４ １３５５−１３６３（１９９８））。用量応答試験を全ての化合物に関して行い、図４に報告されている活性濃度を、１ｐｐｍ濃度で評価された市販の抗酸化物質の活性プロファイルと比較した。ＢＨＡ、ＢＨＴ及びＴＢＨＱはそれぞれ、１μｇ／ｍｌで、脂質過酸化を８０、８１及び８５％阻害した（図４）。ウィタナミドＢ（２）は、飽和側鎖を含み、１μｇ／ｍで、脂質過酸化を９３％阻害した。一方、２の位置異性体であるウィタナミドＣ（３）は、７９％の阻害を示した。同様に、ウィタナミドＤ（４）及びＥ（５）で観察された阻害はそれぞれ、１μｇ／ｍＬで９４％及び８１％であった。その側鎖に１個の二重結合を有する化合物６及び７はそれぞれ、０．５μｇ／ｍｌで、８５％及び８２％の阻害を示した。同様に、ウィタナミドＨ（８）は、このアッセイで、０．５μｇ／ｍｌで９０％の阻害を示した。しかしながら、その側鎖に２個の二重結合を有するジグルコシドであるウィタナミドＡ（１）は、脂質過酸化を９８％阻害した。一方、トリグルコシドであるウィタナミドＩ（９）は、１μｇ／ｍｌで８６％の阻害を示した（図４）。このことは、グリコシド単位の数も、これらの化合物の抗酸化活性において重要な役割を果たすことを示していた。
【００３７】
トリプタミン（１４）は、１００μｇ／ｍｌで４０％の阻害を示し、その５−メトキシ誘導体である化合物１５は、脂質過酸化を５０μｇ／ｍＬで、３０％しか阻害しなかった。セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）塩酸塩は、１０μｇ／ｍＬで４４％の阻害を示した。化合物１４から１６では、１μｇ／ｍＬでのウィタナミドと同様の脂質過酸化のほぼ１００％の阻害が、試験化合物濃度を２倍にした際に観察された。５−メトキシトリプタミン（１５）は、トリプタミン（７）よりも高い活性を示し、このことは、５−酸化は、活性を増大させることを示した。セロトニン塩酸塩では、その５−メチル誘導体に比較すると、高い阻害が観察され、このことは、５位の遊離ヒドロキシルは、遊離ラジカル捕捉活性に非常に重要であることを示した。ウィタナミドＡ〜Ｉ（１〜９）は、市販の抗酸化物質と同等以上で、セロトニンよりもかなり良好な優れた脂質過酸化阻害活性を示した（図４）。セロトニン核及びヒドロキシ脂肪酸側鎖が、抗酸化活性に顕著に貢献していた。ウィタナミドの中では、不飽和側鎖を有する化合物が、飽和側鎖よりも活性であった。１５及び１７位にヒドロキシル基を有する化合物２及び４はそれぞれ、その異性体３及び５よりも活性であり、このことは、ヒドロキシル基の位置も、その抗酸化活性において重要な役割を果たすことを示していた。この結果は、Ｆｅ２＋とのウィタナミドのキレート化の可能性を排除する。それというのも、セロトニン、５−メトキシセロトニン及びトリプタミンは、ウィタナミドに比較してかなり高い濃度でしか活性でないためである。
【００３８】
本発明において果実から単離されたウィタノリドはさらに、脂質過酸化を阻害した（図５）。Ｗ．ソムニフェラ種子から単離される主な化合物の１種であるウィタノシドＶ（１２）は、１０ｐｐｍで脂質過酸化の８２．５％の阻害を示した。一方で、ウィタノシドＩＶ（１３）阻害は、１００μｇ／ｍＬで２５％であった。ウィタノリドＶＩ（１１）は、５０ｐｐｍで８６％の脂質過酸化阻害活性を示し、その２３，２４−ジヒドロ誘導体（１０）は、１００ｐｐｍで同様の活性を示した（図５）。化合物１０のラクトン部分の飽和は、そのデヒドロ誘導体１１に比較して、活性を低下させ、このことは、α，β−不飽和δラクトンは、ウィタノリドの脂質過酸化能に関して重要であることを示した。化合物１１及び１３は、１２のヒドロキシル化誘導体であった。１３のＣ−２７での水酸化は、Ｃ−２０での水酸化よりも活性を低下させた。これは、ラクトンのＣ２７ヒドロキシルとカルボニル基との水素結合によると思われる。
【００３９】
ウィタナミドＡ〜Ｃ（１〜３）及びウィタノシドＶ（１２）を、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）酵素を阻害する能力に関して試験した（Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５９ ８４１−８４９（２００３））。これらの化合物は、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２酵素を、１００μｇ／ｍＬで阻害しなかった。これらをさらに、ＭＴＴアッセイを使用して、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、ＳＦ−２６８（中枢神経系；ＣＮＳ）及びＭＣＦ−７（乳房）ヒト腫瘍細胞系に対する抗増殖活性に関して試験したが（Ｔｉａｎ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ ４０ １８０−１８４（２００１））、不活性であった。このことは、これらの化合物が、毒性を殆んど若しくは全く有さないことを証明した。
【００４０】
セロトニンは、人体での多くの生理学的機能を制御する際に重要な役割を果たしている。その放出は、睡眠の開始、疼痛感受性、血圧制御及び気分の制御における決定因子である。セロトニンレベルの低下、体重増加に到る炭水化物及び一定の食品群の過剰消費（Ｌｉｎｎｏｉｌａ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ５３ ４６−５１（１９９２））、抑鬱症状、不眠、攻撃性及び慢性頭痛（Ｗｕｒｔｍａｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４９ ３７−３９（１９９８））を生じさせる。セロトニン前駆体である５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンは、様々なセロトニン関連疾患を治療するために市販薬（ＯＴＣ）として使用されている（Ｂｉｒｄｓａｌｌ，Ｔ．Ｃ．，Ａｌｔｅｒｎ Ｍｅｄ Ｒｅｖ．３ ２７１−２８０及びそこに挙げられている参考文献（１９９８年））。胃でウィタナミドがセロトニンに変化する可能性があり、経口摂取された場合には、その遊離のセロトニンが吸収される可能性がある。したがって、Ｗ．ソムニフェラ種から単離されたウィタナミドは、体内でセロトニンレベルを高める可能性を有し、ヒトでのセロトニン不足に関連する様々な疾患に対処するためのサプリメントとして使用することができる。さらに、２種のトリプタミン類似体（スマトリプタン（ｓｕｍａｔｒｙｐｔａｎ）及びエリトリプタン（ｅｌｉｔｒｙｐｔａｎ））は、偏頭痛関連疾患を治療するために使用されている（Ｎｅｗｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６６ １０２２−１０３７（２００３））。したがって、ウィタナミドは、偏頭痛を治療するための有望な候補物質として考えることができる。ウィタナミドは、有望な抗酸化活性を示したので、これは、アルツハイマー病及びアテローム硬化症を予防するために使用することができる。
【００４１】
ウィタナミド１〜９は、新規のヒドロキシル置換脂肪酸及びグルコース単位を有する新規のセロトニン誘導体である。ウィタナミド１〜９は０．５〜１μｇ／ｍｌで、ＢＨＡ、ＢＨＴ及びＴＢＨＱと同等か、それ以上、脂質抗酸化を阻害し、このことは、これらが、市販の抗酸化物質よりも良好な抗酸化物質であることを示している。Ｗ．コアグレンス（ｃｏａｇｕｌｅｎｃｅ）及びＷ．ソムニフェラの種子は、古代からインドでは、牛乳を濃縮するために使用されていた。これらの化合物が、ヒト腫瘍細胞アッセイにおいて、細胞毒性を示さなかったことは、特記すべき重要な事項である。したがって、Ｗ．ソムニフェラ種子又はウィタナミドは、ヒトが消費するための新規で安全な抗酸化物質を開発するための有望な候補物質である。さらに、化合物１〜９は、Ｗ．ソムニフェラ種子を使用して、アルツハイマー病、パーキンソン病及び心臓血管疾患などの様々な加齢関連疾患を治療するための食品サプリメントを開発する際に大きな役割を果たすと思われる。
【実施例】
【００４２】
実験手順の一般的な事項
ＨＲＦＡＢ及びＦＡＢ（陽イオン方式）質量スペクトルを、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ＣｅｎｔｅｒにあるＪＥＯＬ ＭＸ１１０質量分析計で測定した。旋光性を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ ３４１（Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）で、ＭＥＯＨ中、２０℃で測定した。標準的なパルスシーケンスを使用して、１Ｈ（５０ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）及び２Ｄ ＮＭＲ実験をＩＮＯＶＡ ＶＡＲＩＡＮ ＶＲＸ ５００装置で実施した。化学シフトを、ＣＤ３ＯＤ中で測定し、δ（ｐｐｍ）で表した。ＨＭＢＣをＪ＝８Ｈｚのために最適化した。ＩＲスペクトルをＭａｔｔｓｏｎ Ｇａｌａｘｙ Ｓｅｒｉｅｓ ＦＴＩＲ３００でＷｉｎＦＩＲＳＴソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｏｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）分光計を使用して記録した。単離及び精製のために使用された溶剤は全て、ＡＣＳ級である。ＭＰＬＣのために使用されたシリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（粒度３５〜７０μｍ）であった。ＳｉゲルＰＴＬＣプレート（２０×２０、５００μｍ）をＡｎａｌｔｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）から購入した。再生分取ＨＰＬＣ（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．ＬＣ−２０モデル）を、化合物を分離するためのＪＡＩＧＥＬ−ＯＤＳ−Ｃ１８カラムと共に使用した。陽性対照のブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びｔ−ブチルヒドロキノン９（ＴＢＨＱ）、セロトニン、５−メトキシセロトニン及びトリプタミンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。脂質の１−ステアロイル２−リノレオイルｓｎ−グリセロール３−ホスホコリン（ＳＬＰＣ）をＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。蛍光プローブの３−［ｐ−（６−フェニル）−１，３，５−ヘキサトリエニル］−フェニルプロピオン酸を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入し、Ｒ−及びＳ−メトキシ−（トリフルオロメチル）フェニルアセチル（ＭＴＰＡ）塩化物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。
【００４３】
植物原料
植物ウィタニアソムニフェラを、ミシガン州立大学にあるＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｐｈｙｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの温室で成育した。植物を、１２時間の光周期、７５華氏温度で、ローム性砂及びバクト（ｂａｃｔｏ）ミックスからなる１：１混合物中、６”プラスチック鉢内で成育した。植物に水を与え、２０：２０：２０（Ｎ：Ｐ：Ｋ）を使用して毎日、肥料を与えた。十分に熟した種子を集め、室温で乾燥させ、直ちに抽出した。
【００４４】
抽出及び単離
Ｗ．ソムニフェラの乾燥させ、粉砕した果実（１００ｇ）をｎ−ヘキサン（３×５００ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（３×５００ｍＬ）、ＭｅＯＨ（５×５００ｍＬ）及びアンモニアＭｅＯＨ（３×５００ｍＬ）で順次抽出した。減圧下に溶剤を蒸発させ、ｎ−ヘキサン（８ｇ）、ＥｔＯＡｃ（２ｇ）、ＭｅＯＨ（８ｇ）及びアンモニアＭｅＯＨ（２ｇ）の粗製抽出物を得た。ＭｅＯＨ抽出物（７ｇ）をｎ−ヘキサン（５×１５０ｍｌ）を用いて脱脂し（１．５ｇ）、７０％のＣＨＣｌ３から８０％のＭｅＯＨへの勾配条件下に、シリカゲル中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）により分画した。７０％ＣＨＣｌ３溶離液を、それぞれ４０ｍｌの１０個のフラクションにおいて収集し、ＴＬＣ上で同様に、貯留して、濃縮すると、フラクションＩ（３００ｍｇ）が得られた。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１：１）溶離から得られた同様のフラクション（８個のフラクション、それぞれ５０ｍＬ）を合わせて、濃縮すると、フラクションＩＩ（１００ｍｇ）が得られた。ＣＨＣｌ３ＭｅＯＨ（４０：６０）溶離液から、１５個のフラクション（それぞれ５０ｍＬ）が得られ、これらは同様に、貯留し、蒸発させると、フラクションＩＩＩ（２ｇ）が得られた。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（３０：７０溶離）からの６種の同様のフラクション（それぞれ４５ｍＬ）の濃縮により、フラクションＩＶ（１．８ｇ）が得られた。８０％ＭｅＯＨ溶離液を貯留し、蒸発させると、Ｖ（２００ｍｇ）が得られた。
【００４５】
ＴＬＣにより示されたように、フラクションＩ及びＩＩは主に、脂肪酸を含有した。ＪＡＩＧＥＬ−ＯＤＳ−Ｃ１８カラム及び移動相として３ｍＬ／分のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏを使用する分取ＨＰＬＣにより、フラクションＩＩＩ（１．８ｇ）を精製した。集められたフラクションは、Ａ（１５〜３０分、５００ｍｇ）、Ｂ（３１〜４１分、２００ｍｇ）、Ｃ（４２〜５６分、５００ｍｇ）、Ｄ（５８〜７０分、２００ｍｇ）及びＥ（７１〜９５分、５０ｍｇ）であった。ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（６２．５：３７．５、ｖ／ｖ）を使用する分取ＨＰＬＣにより、フラクションＣをさらに精製し、純粋な化合物１（８１．９５分、６２ｍｇ）、２（９２．０分、７１ｍｇ）及びフラクション（１０４分、３５ｍｇ）を得た。ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）を使用する分取ＨＰＬＣにより、化合物１及び２を再び精製して、純粋な化合物１（３５分、５０ｍｇ）及び２（３８．０、７０ｍｇ）を得た。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）を使用する分取ＴＬＣで、１０４分でのフラクションをさらに精製して、同じ移動相で３回展開すると、純粋な化合物３（Ｒｆ＝０．５、１２ｍｇ）が得られた。ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（７６：２４、ｖ／ｖ）を使用するＨＰＬＣにより、フラクションＤを精製すると、純粋な化合物１２（６７．３分、１５０ｍｇ）が得られた。ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（７５：２５）を使用するＨＰＬＣにより、フラクションＥを精製すると、３種のフラクションＦ（７１分、１４ｍｇ）、Ｇ（１０１分、５ｍｇ）、Ｈ（１１２分、４．０ｍｇ）が得られた。
【００４６】
分取ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、４：１）で、フラクションＧを精製すると、化合物４（Ｒｆ＝０．６、２．５ｍｇ）が得られた。移動相でＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（５：１）を使用するＰＴＬＣで、フラクションＦ及びＨを精製すると、５（Ｒｆ＝０．６５、８ｍｇ）及び６（Ｒｆ＝０．５８、３．０ｍｇ）が得られた。フラクションＩＩを、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（３４：６６、ｖ／ｖ）を使用するＨＰＬＣに掛けると、５種のフラクションｆｒ．１（３７．０分、３８．１ｍｇ）、ｆｒ．２（４５〜７０分、６８．８ｍｇ）、ｆｒ．３（８４．４分、１９．８ｍｇ）及びｆｒ．４（９４．９分、１１．４ｍｇ）が得られた。
【００４７】
移動相（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、１：１、ｖ／ｖ）を使用する分取ＴＬＣにより、ｆｒ．１を精製すると、純粋なウィタノリド１３（Ｒｆ＝０．４０、７．０ｍｇ）が得られた。ＰＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７５：２５、ｖ／ｖ）によりｆｒ．４を繰り返し精製すると、純粋な化合物８（Ｒｆ＝０．７２、２ｍｇ）が得られた。同様に、ＰＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７０：３０、ｖ／ｖ）によりｆｒ．３を精製すると、化合物７（Ｒｆ＝０．６１、１．０ｍｇ）及び９（Ｒｆ＝０．８、０．７ｍｇ）が得られた。ＰＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、１：１、ｖ／ｖ）によるｆｒ．２の精製により、Ｒｆ＝０．５（２５．０ｍｇ）のバンドが得られ、移動相としてＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（３３：６７）を使用する分取ＨＰＬＣによりさらに精製すると、ウィタノリド１０（６２．４分、６．０ｍｇ）及び１１（７０．８分、４．０ｍｇ）が得られた。
【００４８】
ウィタナミドＡ（１）非晶質粉末
【化２３】
【００４９】
ウィタナミドＢ（２）非晶質粉末
【化２４】
【００５０】
ウィタナミドＣ（３）非晶質粉末
【化２５】
【００５１】
ウィタナミドＤ（４）非晶質粉末
【化２６】
【００５２】
ウィタナミドＥ（５）非晶質粉末
【化２７】
【００５３】
ウィタナミドＦ（６）非晶質粉末
【化２８】
【００５４】
ウィタナミドＧ（７）非晶質粉末
【化２９】
【００５５】
ウィタナミドＨ（８）非晶質粉末
【化３０】
【００５６】
ウィタナミドＩ（９）非晶質粉末
【化３１】
【００５７】
２３，２４−ジヒドロウィタノリドＶＩ（１０）無色、非晶質粉末
【化３２】
【００５８】
化合物１１〜１３
化合物１１〜１３の構造を、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲデータにより明らかにし、スペクトルデータと刊行結果とを比較することにより、その同定を行った（Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５９ ８４１−８４９（２００３）及びＭａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９ １４９９−１５０７（２００１）。
【００５９】
化合物１のＲ−及びＳ−ＭＴＰＡエステルの調製
化合物１（１．５ｍｇ）及びＲ−（−）のメトキシトリフルオロフェニルアセチル塩化物（Ｒ−ＭＴＰＡ）を含むピリジン中の混合物をジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）と共に（５時間）室温で攪拌した。溶剤を蒸発させ、得られた残留物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）を使用するＰＴＬＣで精製すると、Ｒ−ＭＴＰＡエステル（１．０ｍｇ）が得られた。同様に、化合物１（１．２ｍｇ）を、Ｓ−（＋）−メトキシトリフルオロフェニルアセチル塩化物で処理し、生じた生成物を精製すると、Ｓ−ＭＴＰＡエステル（０．９ｍｇ）が得られた。
【００６０】
抗酸化アッセイ
公表されている手順（Ａｒｏｒａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４ １３５５−１３６３（１９９８））に従い、大きな単膜ベシクル（リポソーム懸濁液）を使用して、化合物１〜１６を脂質過酸化の阻害に関して試験した。リン脂質１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＬＰＣ）及び蛍光試料［３−［ｐ−（６−フェニル）−１，３，５−ヘキサトリエニルフェニルプロピオン酸（ＤＰＨ−ＰＡ）とを混合することにより、リポソーム懸濁液を調製した。最終アッセイ容量は２ｍＬであり、ＨＥＰＥＳ（１００μＬ）、１ＭのＮａＣｌ（２００μＬ）、Ｎ２−スパージされた水（１．６４ｍｌ）、試験試料又はＤＭＳＯ（２０μＬ）及びリポソーム懸濁液（２０μＬ）から構成された。ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．５ｍＭ）２０μｌを加えることにより、過酸化を開始した。Ｔｕｒｎｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０ Ｄｉｇｉｔａｌ蛍光測定器を使用して、０、１、３分及び３分ごとに２１分まで、蛍光を監視した。一定期間にわたる（２１分）蛍光強度の低下は、過酸化速度を示した。脂質過酸化のパーセンテージを、ＤＭＳＯ溶剤対照に対して算出した。試料のストック溶液を１００μｇ／ｍｌで調製し、アッセイのためにさらに希釈した。
【００６１】
薬剤組成物
薬剤組成物において、ウィタナミド又はウィタノリドは、１ミリリットル又は１グラム当たり１から１０００マイクログラムの用量で阻害性を有する。好ましい一実施形態では、患者を治療するために、１種又は複数のウィタナミド又はウィタノリドを薬学的に許容できる担体中に阻害用量を含有させて患者に与えられる。このように、慣用の混合、顆粒化、コーティング、懸濁及びカプセル封入法などの当技術分野でよく知られている方法により、ウィタナミド又はウィタノリドを薬学的担体物質と共に処理して、経口又は直腸投与のための慣用の製剤にする。したがって、１種又は複数のアントラキノンと固体薬学的担体とを組合せ；任意に、生じた混合物を顆粒化し；この混合物又は顆粒物を望ましい場合には、及び／又は任意に適切な助剤を加えた後に処理して、錠剤又は糖衣剤核の形態にすることにより、経口投与のためのウィタノリド又はウィタナミド製剤を得ることができる。
【００６２】
固体製剤のための適切な薬学的担体は特に、糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マンニトール又はソルビトール）、セルロース製剤及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム）などの充填剤；さらに、使用する場合にはデンプンペースト（例えば、トウモロコシ、小麦、米又は馬鈴薯デンプン）、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン、一部遊離の官能基を有するポリアクリレート若しくはポリメタクリレートのエステルなどの結合剤；並びに／或いは、必要な場合には、前記のデンプン、さらにカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの発泡剤である。助剤は主に、流量調節剤及び滑剤、例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウムなどのその塩である。糖衣丸核は、任意に胃酸に対して耐性を有する適切なコーティングを備えていて、この際、特に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン及び／又は二酸化チタンを任意に含有する濃縮糖溶液、水性溶剤中のラッカー溶液或いは、胃液に対して耐性を有するコーティングを製造するためには、フタル酸エステル又はトリアセチンなどの適切な軟化剤を有するか、有しない、部分的に遊離な官能基を有するポリアクリレート若しくはポリメタクリレートのエステルの溶液又はフタル酸アセチルセルロース若しくはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース調整物の溶液が使用される。例えば、活性成分の様々な用量を特定又は表示するために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣丸コーティングに加えることもできる。
【００６３】
経口投与することができる１種又は複数のウィタノリド又はウィタナミド製剤はさらに、硬質ゼラチンカプセル、並びに、ゼラチン製の硬質若しくは軟質密封カプセル及び必要な場合には、グリセリン又はソルビトールなどの軟化剤を含有する。硬質ゼラチンカプセルは、１種又は複数のウィタノリドを、顆粒の形態で、例えば、トウモロコシデンプンなどの充填剤、任意に顆粒化された小麦デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム又はコロイドケイ酸などの結合剤又は潤滑剤、及び任意に安定剤との混合物として含有することができる。密封カプセルでは、１種又は複数のウィタノリドは、粉末又は顆粒の形態であるか；好ましくは、適切な溶剤中の懸濁液の形態で存在するので、懸濁液を安定化するために、例えば、モノステアリン酸グリセリンを加えることができる。
【００６４】
経口投与するための他のウィタノリド又はウィタナミド製剤は例えば、通常の方法で調製される水性懸濁液であり、この懸濁液は、１種又は複数の化合物を、懸濁された形態で１回用量に十分な濃度で含有する。水性懸濁液は、最小量の安定剤及び／又は着香物質を含有し、例えば、サッカリンナトリウム又はシロップなどの甘味料は、一定量の糖及び／又はソルビトール又は同様の物質を含有する。さらに、シェーキを調製するためには、例えば、濃縮物又は濃縮懸濁液が適している。このような濃縮物も、１回用量にパッケージングすることができる。
【００６５】
直腸投与のための適切なウィタノリド又はウィタナミド製剤は、例えば、１種又は複数のウィタノリドと座薬ファンデーション物質との混合物からなる座薬である。このような物質は特に好ましくは、天然若しくは合成のトリグリセリド混合物である。さらに、ファウンデーション物質中に１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを含む懸濁液からなるゼラチン直腸カプセルが適している。適切なファウンデーション物質は例えば、高飽和又は、特に好ましくは中飽和脂肪酸の液体トリグリセリドである。
【００６６】
同様に、微細に粉砕された、好ましくは、粒度中央値５μｍ未満を有する１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを、デンプンと、特に好ましくはトウモロコシデンプン又は小麦デンプンと、または例えば、馬鈴薯デンプン又は米デンプンと混合された形態で含有する製剤が、特に好ましい。好ましくは、大量の成分の場合には、必要ならば冷却しながら、プロペラ様の薄刃攪拌装置を備えた高速ミキサー中で、例えば３から１０分間の混合時間で簡単に混合することにより、これを製造する。この混合プロセスでは、粒子のサイズを継続的に低下させながら、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの粒子を均一にデンプン粒子の上に堆積させる。前記の混合物を、慣用の、例えば前記の助剤と共に、固体用量単位に処理する。即ち、例えば圧縮して、錠剤又は糖衣丸の形態にするか、カプセルに充填する。しかしながらこれらは、そのままで、又は助剤、例えば、高級脂肪酸とのポリオキシエチレンソルビタンのエステル又は硫酸ラウリルナトリウムなどの薬学的に許容できる湿潤剤及び分散剤及び／又は着香物質を加えた後に、水性懸濁液を調製するための、例えば約５から２０倍量の水を伴う濃縮物として使用することもできる。ウィタノリド又はウィタナミド／デンプン混合物と界面活性物質又は他の助剤とを組み合わせる代わりに、これらの物質を、懸濁液を調製するために使用される水に加えることもできる。１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミド／デンプン混合物及び場合により助剤を含む懸濁液を製造するための濃縮物を、必要ならば気密及び防湿に、１回用量でパッケージングすることもできる。
【００６７】
加えて、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを、患者に腹腔内、鼻腔内、皮下又は静脈内投与することができる。通常、腹腔内、鼻腔内、皮下又は静脈内投与では、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤及び防腐剤などの慣用の添加剤と共に、植物性又は他の同様のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル又はプロピレングリコールなどの水性又は非水性溶剤中に溶解、懸濁又は乳化させることにより、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを与える。好ましくは、１種又は複数のウィタノリドを、温血動物又はヒトでの腹腔内、皮下又は静脈内使用に許容される組成物の形態で提供する。例えば、このような組成物は、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドのための担体として、緩衝リン酸塩溶液などの生理学的に許容される溶液を含有してもよい。好ましくは、溶液は、生理学的ｐＨである。特別な実施形態では、組成物を、直接患者に注入して、静脈内投与により腫瘍に灌流させる。
【００６８】
本発明による製剤は、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドを温血動物又はヒトに投与するために適した濃度で含有し、その濃度は、投与方法に応じて、約０．３％から９５％、好ましくは、約２．５％から９０％である。懸濁液の場合には、濃度は通常、３０％以下であり、好ましくは約２．５％であり；逆に、１種又は複数のアントラキノンを有する錠剤、糖衣丸及びカプセルでは、１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの必要用量の容易な摂取を保証するために、濃度は好ましくは、約０．３％以上である。１種又は複数のウィタノリドを含有する製剤での患者の治療を好ましくは、一定期間にわたって脂質過酸化を実質的に阻害するに十分である１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの用量を１回又は複数回投与することにより実施する。必要ならば、用量を、毎日か、数時間間隔で投与される複数の部分用量に分けて投与することができる。特別な場合には、製剤を、放射線又は化学療法などの１種又は複数の他の療法と共に、又はその後に使用することができる。１種又は複数のウィタノリド及びウィタナミドの投与用量は、治療される患者（温血動物種又はヒト）、治療される患者の全身状態及び治療される疾患のタイプに左右される。
【００６９】
前記の記載は本発明を詳述することを目的としているにすぎず、本発明は、添付の請求項にのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】化合物１で観察される選択ＨＭＢＣ（→）及びＣＯＳＹ（←→）相関を示す化学構造である。
【図２】化合物９の選択ＴＯＣＳＹ（→）相関を示す化学構造である。
【図３】化合物２及び３の重要なＨＭＢＣ（→）及びＣＯＳＹ（←→）相関を示す化学構造である。
【図４】化合物１〜９及び１４〜１６による脂質過酸化の阻害を示すグラフである。３分間隔で２１分間、蛍光強度を監視した。示されている阻害パーセンテージは、２１分目にＤＭＳＯ対照に対して算出した。試験された化合物の濃度は、１〜３、５及び９では１μｇ／ｍＬ；４、６〜８では０．５μｇ／ｍＬ；１５では１００μｇ／ｍＬ；１６では５０μｇ／ｍＬ；１７では１０μｇ／ｍＬであった。市販の抗酸化剤ＢＨＡ、ＢＨＴ及びＴＢＨＱは１μｇ／ｍＬで試験した。表されているデータは、平均±１標準偏差（ｎ＝２）を示している。
【図５】ウィタノリド１０〜１３による脂質過酸化の阻害パーセントを示すグラフである。試験された化合物は、１００μｇ／ｍＬの１０及び１３であり；１２及び１１はそれぞれ、１０及び５０μｇ／ｍＬであった。示されているデータは、平均±１標準偏差（ｎ＝２）を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の単離、精製されたウィタナミド：
【化１】
［上式中、
Ｒは、
【化２】
からなる群から選択される］。
【請求項２】
Ｒは、
【化３】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒは、
【化４】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒは、
【化５】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒは、
【化６】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒは、
【化７】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒは、
【化８】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒは、
【化９】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒは、
【化１０】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
下式の単離、精製された化合物。
【化１１】
【請求項１１】
哺乳動物における疾患をｉｎ ｖｉｖｏで治療する方法であって、単離、精製された下式の化合物
【化１２】
［上式中、
Ｒは、
【化１３】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化１４】
下式の化合物
【化１５】
並びにこれらの混合物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記の治療は、抗酸化活性をもたらすためのものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記の治療は、アルツハイマー病に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の治療は、肥満に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の治療は、偏頭痛に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記の治療は、うつ病に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
その必要のある組成物に酸化をもたらす（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）方法であって、単離、精製された下式の化合物
【化１６】
［上式中、
Ｒは、
【化１７】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化１８】
下式の化合物
【化１９】
並びにこれらの混合物を有効量で、前記組成物に加えることを含む方法。
【請求項１８】
（ａ）抗酸化活性を必要とする組成物と、
（ｂ）抗酸化活性をもたらすに十分な量の
【化２０】
［上式中、
Ｒは、
【化２１】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化２２】
下式の化合物
【化２３】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離、精製された化合物と、
を含む組成物。
【請求項１９】
医薬品として使用するための組成物であって、
（ａ）
【化２４】
［上式中、
Ｒは、
【化２５】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化２６】
下式の化合物
【化２７】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される、単離、精製された化合物と、
（ｂ）薬学的に許容できる担体と
を含む組成物。
【請求項２０】
患者におけるアルツハイマー病、肥満、偏頭痛及びうつ病からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、ウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を含有する組成物を有効量で患者に投与して、うつ病を緩和することを含む方法。
【請求項２１】
ｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物の抗酸化治療法であって、有効量のウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を哺乳動物に投与して、前記哺乳動物の抗酸化治療をもたらすことを含む方法。
【請求項２２】
下式の単離、精製されたウィタノリド。
【化２８】
【請求項１】
下式の単離、精製されたウィタナミド：
【化１】
［上式中、
Ｒは、
【化２】
からなる群から選択される］。
【請求項２】
Ｒは、
【化３】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒは、
【化４】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒは、
【化５】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒは、
【化６】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒは、
【化７】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒは、
【化８】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒは、
【化９】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒは、
【化１０】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
下式の単離、精製された化合物。
【化１１】
【請求項１１】
哺乳動物における疾患をｉｎ ｖｉｖｏで治療する方法であって、単離、精製された下式の化合物
【化１２】
［上式中、
Ｒは、
【化１３】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化１４】
下式の化合物
【化１５】
並びにこれらの混合物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記の治療は、抗酸化活性をもたらすためのものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記の治療は、アルツハイマー病に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の治療は、肥満に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の治療は、偏頭痛に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記の治療は、うつ病に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
その必要のある組成物に酸化をもたらす（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）方法であって、単離、精製された下式の化合物
【化１６】
［上式中、
Ｒは、
【化１７】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化１８】
下式の化合物
【化１９】
並びにこれらの混合物を有効量で、前記組成物に加えることを含む方法。
【請求項１８】
（ａ）抗酸化活性を必要とする組成物と、
（ｂ）抗酸化活性をもたらすに十分な量の
【化２０】
［上式中、
Ｒは、
【化２１】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化２２】
下式の化合物
【化２３】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される単離、精製された化合物と、
を含む組成物。
【請求項１９】
医薬品として使用するための組成物であって、
（ａ）
【化２４】
［上式中、
Ｒは、
【化２５】
からなる群から選択される］；
下式の化合物
【化２６】
下式の化合物
【化２７】
並びにこれらの混合物からなる群から選択される、単離、精製された化合物と、
（ｂ）薬学的に許容できる担体と
を含む組成物。
【請求項２０】
患者におけるアルツハイマー病、肥満、偏頭痛及びうつ病からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、ウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を含有する組成物を有効量で患者に投与して、うつ病を緩和することを含む方法。
【請求項２１】
ｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物の抗酸化治療法であって、有効量のウィタナミド、ウィタノリド及びこれらの混合物を哺乳動物に投与して、前記哺乳動物の抗酸化治療をもたらすことを含む方法。
【請求項２２】
下式の単離、精製されたウィタノリド。
【化２８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５０５１０９（Ｐ２００７−５０５１０９Ａ）
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６０９８（Ｐ２００６−５２６０９８）
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６８８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３４８４６
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５９４１１４１３４）ミシガン ステイト ユニバーシティー (22)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６８８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３４８４６
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５９４１１４１３４）ミシガン ステイト ユニバーシティー (22)
【Ｆターム（参考）】
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