エゼチミブ製造のための還元方法
ケトレダクターゼを用いたエゼチミブ関連化合物の製造方法、及びエゼチミブの精製方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エゼチミブ又はその誘導体を得るための、エゼチミブ中間体の還元方法に関する。
【０００２】
本願は米国仮出願番号６０／９３３,８３７(２００７年７月７日出願)、米国仮出願番号６０／９７１,５０４(２００７年９月１１日出願)、米国仮出願番号６１／００４,７２５(２００７年１１月２８日出願)、米国仮出願番号６１／００５,３８９(２００７年１２月４日出願)、及び米国仮出願番号６１／０５０,８７５(２００８年５月６日出願)の利益を主張し、当該各仮出願の全内容を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
ヒドロキシ-アルキル置換されたアセチジノンは、アテローム硬化症の治療及び予防において高コレステロール血症剤として有用である。エゼチミブ、すなわち１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３(Ｓ)-ヒドロキシプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンは、腸コレステロールの選択的阻害剤であり、フィロステロールの吸収に関係する。エゼチミブの実験式はＣ24Ｈ21Ｆ2ＮＯ3、その分子量は４０９.４である。エゼチミブはエタノール、メタノール及びアセトンには非常に高い溶解性を有し、水には実質的に不要な、白色の結晶性粉末である。エゼチミブは下記の化学構造を有する：
【化１】
【０００４】
エゼチミブは、メルク／シェリング-プラウ製薬会社(Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ-Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ)より製造され、商標名ゼチア(ＺＥＴＩＡ(商標))で市販されている薬品の活性成分である。ゼチアは、高コレステロール患者において低比重リポタンパク質(ＬＤＬ)コレステロール及び総コレステロールを下げる用途で米国食品医薬品局の認可を受けている。
【０００５】
エゼチミブは、下記スキーム１に示されるように、コーリー(Ｃｏｒｅｙ)試薬の存在下でテトラヒドロフラン中、(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-(３-(４-フルオロフェニル)-３-オキソプロピル)-２-アゼチジノン(「化合物１」)をボランジメチルスルフィド錯体又はボランテトラヒドロフラン錯体を用いて還元し、続いて、ベンジル基を脱保護することにより調製され得る。該方法は、米国特許番号第５,６３１,３６５号(「‘３６５特許」)及び第６,６２７,７５７号に開示され、当該文献は本願明細書に組み入れられる。開始物質である化合物１又はその類似化合物は、例えば‘３６５特許に開示されるような当技術分野において既知の方法により製造され得る。
【化２】
【０００６】
上記の還元方法によって、次の２種の異性体が生成される：(３Ｒ,４Ｒ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｓ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノン(「化合物２ａ」)、及び(３Ｒ,４Ｒ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｒ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノン(「化合物２ｂ」)。化合物２ａは、適切なキラリティーのエゼチミブを生成する所望の異性体である。化合物２ｂは、エゼチミブを形成する最終合成中と同様に還元中においても除去するのが非常に困難な、所望でない異性体である。化合物２ｂは通常、還元工程の間に約８〜１０％の収率で生成されることが報告されている。
【０００７】
‘３６５特許には下記のように、(Ｒ)-(＋)-２-メチル-ＣＢＳ-オキサザボロリジン(「ＣＢＳ」；Ｃｏｒｅｙ-Ｂａｋｓｈｉ-Ｓｈｉｂａｔａ触媒)とボロヒドリド ジメチルスルフィド複合体(「ＢＭＳ」)とを用い、化合物１から化合物２ａへ還元することが記載されている。
【化３】
【０００８】
米国特許第６,１３３,００１号には下記のように、エゼチミブ-ケトンからエゼチミブへの立体選択的な微生物的還元方法が記載されている。
【化４】
【０００９】
国際公開公報ＷＯ２００５／０６６１２０には、(-)-Ｂ-クロロジイソピノカンフェイルボラン(「ＤＩＰ-Ｃｌ」)を用いた、エゼチミブ-ケトンからエゼチミブへのエナンチオ選択的還元が記載されている。
【００１０】
エゼチミブ及びその誘導体の改良された製造方法が望まれていた。
【発明の概要】
【００１１】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化５】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物の製造方法であって、以下の式ＩＩ：
【化６】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を、単離、合成、又は精製された毛とレダクターゼと混合することを含む、前記方法を包含する。好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００１２】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化７】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物の製造方法であって、以下の式ＩＩ：
【化８】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を、ケトレダクターゼ酵素、補因子、及び約４から約９のｐＨを有する緩衝液を混合すうることを含む、前記方法を包含する。
【００１３】
一つの態様においては、本発明は、ＭＩＢＫからエゼチミブを晶出することを含む、ＥＺＴ-ケトンからエゼチミブを精製する方法を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一つの観点においては、本発明は酵素を触媒として用い、かつ任意に水混和性有機溶媒を使用することを含む、以下の式Ｉ：
【化９】
で表される化合物の製造方法に関する。
【００１５】
本明細書中、用語「収率」とは、開始物質の最初の量に対して合成された化合物の百分率をいう。収率は、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積に対する合成された化合物のピークを基に、面積百分率により決定される。収率は通常、反応の間又は直後に測定される。
【００１６】
本明細書中、用語「純度」とは、他の化合物に対するある化合物の百分率をいう。純度は、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積に対する合成された化合物のピークを基に、面積百分率により決定される。純度は通常、精製工程の後に測定される。
【００１７】
本明細書中、用語「ｄ.ｅ.」とは、次のように定義されるジアステレオマー過剰率を意味する：
(エゼチミブのモル分率)-(エゼチミブのＲ,Ｒ,Ｓ-ジアステレオマーのモル分率)。
【数１】
エゼチミブは以下に示すようなＳ,Ｒ,Ｓ立体配置を有する：
【化１０】
Ｒ,Ｒ,Ｓ-ジアステレオマーは、プロピル鎖の第３番目の炭素上のキラル中心について(Ｒ)の立体配置を有する点で異なる。
【００１８】
本明細書中、用語「ＥＺＴ」はエゼチミブ、すなわち１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３(Ｓ)-ヒドロキシプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「ＥＺＴ Ｒ,Ｒ,Ｓ-異性体」は１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-ヒドロキシプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「エゼチミブ-ケトン」又は「ＥＺＴ-ケトン」は、下記のような化学構造：
【化１１】
を有する１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３-オキソプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンを指す。
【００１９】
本明細書中、用語「化合物１」は(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-(３-(４-フルオロフェニル)-３-オキソプロピル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「化合物２ａ」は(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｓ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「化合物２ｂ」は(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｒ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノンを指す。
【００２０】
本明細書中、酵素について用いられている場合、用語「単離された」とは、天然の環境から分離又は取り出された酵素をいう。「単離された」酵素とは、通常の細胞環境から取り出された天然の酵素又は組み換え酵素を示す。単離された酵素は無細胞系にあることが好ましい。単離された酵素は他の物質を除去する労力に応じて、粗酵素でも高度に精製された酵素であってもよい。「単離された」とは、単離された酵素が存在する唯一の酵素であることを意味するものではなく、存在する主たる酵素であることを意味する(少なくとも他の酵素よりも１０〜２０％多い)。本明細書中、酵素について用いられている場合、用語「合成された」とは、酵素が化学合成、組み換え法、又はそれらの組み合わせにより製造された酵素をいう。本明細書中、酵素について用いられている場合、用語「精製された」とは、酵素が本質的に非酵素物質又は他の酵素を含まない(少なくとも純度約９０〜９５％)ことをいう。
【００２１】
本明細書中、用語「デヒドロゲナーゼ」或いは「デヒドロゲナーゼ酵素」とは、一つ以上のプロトンと電子対をアクセプタに移動させることにより基質を酸化させる酵素をいう。デヒドロゲナーゼの例として、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、及び亜リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。グルコースデヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ)には、例えば、ＥＣ(Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ)番号１.１.１.４７及びＣＡＳ(Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ)番号９０２８-５３-９が付与されるものが含まれ、例えばコデクシス社(Ｃｏｄｅｘｉｓ Ｉｎｃ.、前バイオキャタリティックス社(ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ.))からカタログ番号ＧＤＨ-１０２〜ＧＤＨ-１０４として市販されている。ギ酸デヒドロゲナーゼ(ＦＤＨ)には、例えば、ＥＣ番号１.２.１.２.及びＣＡＳ番号９０２８-８５-７が付与されるものが含まれ、例えばコデクシス社からカタログ番号ＦＤＨ-１０１で市販されている。亜リン酸デヒドロゲナーゼ(ＰＤＨ)には、例えば、ＥＣ番号１.２０.１.１.及びＣＡＳ番号９０３１-３５-０が付与されるものが含まれ、例えばコデクシス社からカタログ番号ＰＤＨ-１０１で市販されている。
【００２２】
本明細書中、用語「ケトレダクターゼ」、「ケトレダクターゼ酵素」、又は「ＫＲＥＤ」とは、ケトンの還元を触媒してケトンに対応するアルコールを生成する酵素をいう。ケトレダクターゼには、例えば、ＥＣ番号１.１.１.が付与されるものが含まれる。このような酵素にはケトレダクターゼ以外にも多様な命名がされており、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、カルボニルレダクターゼ、ラクターゼデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ、β-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ステロイドデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、アルドレダクターゼ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＮＡＤＰＨ依存性ケトレダクターゼには、ＥＣ番号１.１.１.２及びＣＡＳ番号９０２８-１２-０が付与される。ＮＡＤＨ依存性レダクターゼには、ＥＣ番号１．１．１．１及びＣＡＳ番号９０３１−７２−５が付与されている。ケトレダクターゼは、例えばコデクシス社からカタログ番号ＫＲＥＤ-１００〜ＫＲＥＤ-１７７で市販されている。
【００２３】
本明細書中、用語「補因子」とは注目している反応を触媒する酵素と結合して働く非タンパク質化合物をいう。補因子には、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤＨ)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰ+)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)、及びこれらの誘導体又は類似体などのニコチンアミド補因子が挙げられる。
【００２４】
本明細書中、用語「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し、用語「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチル、用語「ＩＰＡ」はイソプロピルアルコール、用語「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシド、用語「ＭＩＢＫ」はメチルイソブチルケトン、用語「ＤＣＭ」はジクロロメタン、用語「ＭＴＢＥ」はメチル ｔｅｒｔ-ブチルエーテル、用語「ＤＴＴ」はジチオトレイトールを指す。
【００２５】
本明細書中、用語「室温」又は「ＲＴ」とは標準的な実験室の外気温をいい、通常、約１５℃〜約３０℃である。
【００２６】
本明細書中、用語「真空」とは約２ｍｍＨｇから約１０ｍｍｇの圧力をいう。
【００２７】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化１２】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］と
で表される化合物を製造する方法であって、以下の式II：
【化１３】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］と
で表される化合物を、単離され、合成され、又は精製されたケトレダクターゼと混合することを含む前記方法を包含する。好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００２８】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化１４】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を製造する方法であって、以下の式ＩＩ：
【化１５】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を生体触媒及び緩衝液を混ぜ合わせることを含む前記方法を包含する。
【００２９】
好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００３０】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化１６】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］、
で表される化合物を製造する方法であって、以下の式ＩＩ：
【化１７】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］、
で表される化合物を、ケトレダクターゼ酵素、補因子及び約４から約９のｐＨを有する緩衝液と混合することを含む、前記方法を包含する。
【００３１】
ＲがＨである場合、式Ｉで表される化合物はエゼチミブであり、式IIで表される化合物はエゼチミブ-ケトンである。Ｒがヒドロキシル保護基である場合、式IIで表される化合物はエゼチミブを得るためにさらに脱保護され得る。脱保護は‘３６５特許の実施例６に記載の方法のような既知の方法により行うことができる。
【００３２】
当該反応は以下に示すような酵素過程である：
【化１８】
この反応において、ケトレダクターゼは立体選択的にカルボニル基を還元し、同時にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨなどの補因子が酸化される。
【００３３】
好ましくは、ヒドロキシル保護基はベンジル、ｔｅｒｔ-ブチルオキシカルボニル、アシル、及びシリル基からなる群より選択される。適切なシリル保護基の例として、(Ｒa)(Ｒb)(Ｒc)-Ｓｉ- ｛式中、Ｒa、Ｒb及びＲcはＣ1−Ｃ6アルキル、フェニル、ベンジル、アセチル等からなる群よりそれぞれ独立に選択される｝が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
好ましくは、ケトレダクターゼは単離されたものである。ケトレダクターゼは哺乳動物、糸状菌、酵母、細菌などのいかなる宿主からも分離され得る。ＮＡＤＨ依存性ケトレダクターゼの単離、精製、及び特性解析については、例えばＫｏｓｊｅｋらによる“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｈｅｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｄｏｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ,Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ,８６：５５-６２(２００４)”に記載されている。好ましくは、ケトレダクターゼは合成されたものである。ケトレダクターゼは化学的に、又は組み換え法を用いて合成され得る。ケトレダクターゼの化学的生成、及び組み換え体による生成については、例えば欧州特許第０９１８０９０号に記載されている。好ましくは、ケトレダクターゼは大腸菌中において組み換え法を用いて合成される。好ましくは、ケトレダクターゼは精製されたものであり、好ましくは純度が約９０％以上、さらに好ましくは純度が約９５％以上である。ケトレダクターゼは実質的に細胞フリー(ｃｅｌｌ-ｆｒｅｅ)であることが好ましい。
【００３５】
本発明の方法において、好ましくは、ケトレダクターゼはｄ.ｅ.値が約９０％以上のエゼチミブを生産し得るケトレダクターゼである。好ましくは、本発明の方法において、ケトレダクターゼは約５０％以上の収率でエゼチミブを生産し得る。
【００３６】
ケトレダクターゼは、好ましくはＮＡＤＨ依存性ケトレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ依存性ケトレダクターゼからなる群から選択される。好適なケトレダクターゼとして次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるものではない；ａ)カタログ番号ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３のコデクシス社製品、これらの同等品、及びこれらの混合物、ｂ)カタログ番号ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３のコデクシス社製品、これらの同等品、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素。本明細書中、「同等品」とは類似又は同一の酵素活性を有する酵素又は製品をいう。好ましくは、ケトレダクターゼは、カタログ番号ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３のコデクシス社製品、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群から選択される。好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群から選択される。より好ましくは、ケトレダクターゼはＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８、又はこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００３７】
一つの態様においては、本発明の方法は、さらに補因子をケトレダクターゼと混ぜ合わせることを含む。好ましくは、補因子はＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される。ケトレダクターゼがＮＡＤＨ依存性である場合、好ましくは、補因子はＮＡＤＨ、ＮＡＤ+、これらの塩、又はこれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、補因子はＮＡＤＨ、又はその塩である。ケトレダクターゼがＮＡＤＰＨ依存性である場合、好ましくは、補因子はＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ+、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、補因子はＮＡＤＰＨ又はその塩である。
【００３８】
一つの態様においては、本発明の方法は緩衝液中で実施される。好ましくは、緩衝液のｐＨは約４〜約９であり、より好ましくは約４〜約８、さらに好ましくは約５〜約８であり、最も好ましくは約６〜約８又は約５〜約７である。好ましくは、緩衝液は塩の溶液である。好ましくは、塩はリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、及びこれらの混合物からなる群より選択される。任意には、緩衝液はチオールを含み得る。好ましくは、チオールはＤＴＴである。好ましくは、チオールは酵素中のジスルフィド結合を減少させる。
【００３９】
一つの態様においては、本発明の方法は約１０℃〜約５０℃の温度で実施される。好ましくは、該方法は室温で実施され、温度は約２４℃〜２８℃、又は約２５℃から約３５℃である。好ましくは、該方法は約２５℃から約３０℃の温度で実施される。好ましくは、該方法は約３０℃の温度で実施される。
【００４０】
任意には、反応混合物はさらに補因子再生システムを含む。補因子再生システムは基質とデヒドロゲナーゼを含む。基質とデヒドロゲナーゼ間の反応により補因子が再生される。好ましくは、補因子再生システムは、Ｄ-グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸ナトリウム／ギ酸デヒドロゲナーゼ、及び亜リン酸塩／亜リン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される基質／デヒドロゲナーゼの対を含む。好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼはカタログ番号ＧＤＨ-１０２、ＧＤＨ-１０３、ＧＤＨ-１０４のコデクシス社製品、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼはＧＤＨ-１０４中の酵素である。好ましくは、ギ酸デヒドロゲナーゼは、カタログ番号ＦＤＨ-１０１のコデクシス社製品中の主たる酵素である。好ましくは、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、カタログ番号ＰＤＨ-１０１のコデクシス社製品中の主たる酵素である。
【００４１】
一つの態様においては、本発明の方法は、さらに溶媒を添加することを含む。好ましくは、溶媒は有機溶媒である。有機溶媒は、水混和性であることが好ましい。好ましくは、水混和性有機溶媒はアルコール類及びＤＭＳＯからなる群より選択される。アルコール類は、好ましくはＣ1−Ｃ4アルコール、さらに好ましくはメタノール又はＩＰＡである。本発明の方法において用いられる好適な溶媒は大部分が水であるため、より環境にやさしい反応ですむ点で、従来文献で用いられる有機溶媒と比べて優れている。
【００４２】
好ましくは、該方法は以下の工程からなる：
(ａ)式IIで表される化合物を溶媒に溶解する工程、及び
(ｂ)(ａ)で得られた溶液を、補因子及びケトレダクターゼを含む緩衝液と混ぜ合わせる工程。
好ましくは、得られた混合物は、式Ｉで表される化合物を得るために十分な時間撹拌される。撹拌は、好ましくは約２５℃〜約３５℃、又は約２５℃〜約４０℃、さらに好ましくは約２４℃〜約２８℃、約２５℃〜約３０℃、又は約３０℃で行われる。
撹拌は、好ましくは約０.５時間以上、約１.５時間以上、又は約２.５時間以上行われる。撹拌は約５０時間以下であることが好ましい。好ましくは、撹拌は約３時間〜約４０時間、より好ましくは約６時間〜約２４時間、又は約６時間〜約１６時間行われる。
【００４３】
任意には、水非混和性有機溶媒が前記混合物に添加され、該添加は前記撹拌の後に行うのが好ましい。水非混和性有機溶媒の添加後、任意には、前記反応混合物は有機相と水相とに分離される。任意には、式Ｉで表される化合物は有機相を蒸散させることにより回収される。水非混和性有機溶媒の例としては、Ｃ2-8のエーテル、ＥｔＯＡｃなどのＣ3-8のエステル、ＭＩＢＫなどのＣ4-8のケトン、及びＤＣＭなどのハロゲン化炭化水素などが挙げられるが、これらに限定するものではない。好ましくは、水非混和性有機溶媒はＥｔＯＡｃ、ＭＴＢＥ、ジエチルエーテル、及びこれらの混合物からなる群より選択される。好ましくは、水非混和性有機溶媒はＥｔＯＡｃである。
【００４４】
任意には、前記反応混合物は、好ましくは撹拌後に、固体生成物を回収するために濾過される。任意には、該固体生成物は式Ｉで表される化合物を得るためにさらに精製され得る。
【００４５】
任意には、生成物を分離後、酵素、補因子、及び／又はデヒドロゲナーゼを再利用するために、水相は補因子再生システム中で処理され得る。任意には、水相のｐＨは所望のｐＨを得るために調整することができる。任意には、水相は有機溶媒の残留を除去するために蒸散させる。任意には、本発明の方法において水相は再利用される。
【００４６】
好ましくは、上述の方法はエゼチミブに対する高い立体選択性を有する。得られるエゼチミブのｄ.ｅ.値は好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９８％以上、又は約９９％以上であり、最も好ましくは約９９％以上である。
【００４７】
好ましくは、上述の方法は高い収率を有する。式Ｉで表される化合物の収率は好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、又は約７０％以上、約８０％以上であり、最も好ましくは約８５％以上である。
【００４８】
一つの態様においては、本発明はＭＩＢＫからエゼチミブを結晶化することを含むＥＺＴ-ケトンからエゼチミブを精製する方法を包含する。好ましくは、該方法は以下の：
(ａ)エゼチミブとＥＺＴ-ケトンを含む試料をＭＩＢＫに溶解する工程、
(ｂ)工程(ａ)の溶液を冷却する工程、及び
(ｃ)エゼチミブを回収する工程
を含む。
【００４９】
好ましくは、工程(ａ)は加熱しながら行われる。好ましくは、加熱は約５０℃〜およそ還流温度まで、より好ましくは、およそ還流温度まで行われる。任意には、冷却はおよそ室温以下までであり、好ましくは約１０℃まで行われる。任意には、冷却工程後、スラリーが得られる。任意には、エゼチミブは前記スラリーを濾過し、任意に乾燥することによって回収される。乾燥は、好ましくは約４０℃〜約５０℃、好ましくは真空下で行われる。
【００５０】
好ましくは、得られるエゼチミブの純度は約９８％以上、より好ましくは約９９％以上である。
【００５１】
本発明について特定の好適な態様及び例示のための実施例を参照して記載したが、当業者には、本明細書に開示される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明を変更することが理解されるであろう。実施例は、本発明の理解を助けるために示されるもので、本発明の範囲を何ら制限する意図はなく、また制限すると解釈されるべきでもない。特に断らない限り、上記に記載される特定の態様のいずれかの組み合わせは、本発明と矛盾せず、本発明に包含される。
【実施例】
【００５２】
エゼチミブの不純物プロフィール測定のためのＨＰＬＣ法
カラム及びパッキング：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ（商標）、Ｃ８、１５０*４.６ｍｍ、３μｍ、２５２０３-１５４６３０
緩衝液： ０.０５％ ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)
溶離液Ａ： ５１：４９ メタノール：緩衝液
溶離液Ｂ： ７５：２５ アセトニトリル：溶離液Ａ
時間 溶離液Ａ（％） 溶離液Ｂ（％）
勾配： ０ １００ ０
１８ １００ ０
３５ ０ １００
３５．１ １００ ０
平衡時間： ７分
試料容量： ５μＬ
流速： １．５ｍｌ／分
検出器： ２３５ｎｍ
カラム温度： ３０℃
オートサンプラー温度： １０℃
希釈剤： メタノール
【表１】
【００５３】
実施例１ ＫＲＥＤ-１２８を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１２８(５ｍｇ、コデクシス社製、ロット番号：０９０３０５ＣＬ、製造年：２００５)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼを含む、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中１０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で４０時間撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：７１.５５％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００５４】
実施例２ ＫＲＥＤ-１３３を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１３３(５ｍｇ、コデクシス社製、ロット番号：１１３００６ＭＭ、製造年：２００６)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中１０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で４０時間撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：１７.６％、ｄ.ｅ.：９９.３％)。
【００５５】
実施例３ ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.３ｍＭ ＮＡＤ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：５７.１１％、ｄ.ｅ.：９０.７％)。
【００５６】
実施例４ ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.３ｍＭ ＮＡＤ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：１６.６％、ｄ.ｅ.：９８.５％)。
【００５７】
実施例５ ＫＲＥＤ-１１６を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１１６(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：５７.９７％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００５８】
実施例６ ＫＲＥＤ-１１８を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１１８(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相は蒸散させた(収率：８７.５９％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００５９】
実施例７ ＫＲＥＤ-１１９を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１１９(５ｍｇ、コデクシス社製、ロット番号：１００４０７ＷＷ、製造年：２００７)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相を蒸散させ、残留物中のＥＺＴを分析にかけた(収率：８３.１９％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００６０】
実施例８ ＫＲＥＤ-１２０を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１２０(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相を蒸散させ、残留物中のＥＺＴを分析にかけた(収率：３７.４１％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００６１】
実施例９ ＫＲＥＤ-１２８を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
１０ｍｇのＥＺＴ-ケトンを０.２５ｍｌのメタノールに溶解した溶液を、以下の溶液に添加した：５ｍｇ ＫＲＥＤ-１２８(コデクシス社製、ロット番号：０９０３０５ＣＬ、製造年：２００５)、３６ｍｇ(４０ｍＭ) Ｄ-グルコース、４ｍｇ(１ｍＭ) ＮＡＤＰ+、２.５ｍｇ グルコースデヒドロゲナーゼを含む５ｍｌのリン酸緩衝液(ｐＨ７)。得られた乳白色の混合液を、３５℃において１.５時間撹拌した。混合液を濾過し、濾過された物質を分析にかけた(収率：８９.２６％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００６２】
実施例１０ ＫＲＥＤ-１１９を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
６００ｍｇのＥＺＴ-ケトンを４ｍｌのＩＰＡに溶かした溶液を、８００ｍｇ(０.２５Ｍ) Ｄ-グルコース、４０ｍｇ グルコースデヒドゲナーゼ、１６ｍｇ(１ｍＭ) ＮＡＤＰ+、及び２０ｍｇ ＫＲＥＤ-１１９(コデクシス社製、ロット番号：１００４０７ＷＷ、製造年：２００７)を含む、２０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６)に添加した。得られた乳白色の混合液を室温で２.５時間撹拌した(変換率が７４.４％になるまで、反応をＨＰＬＣによってモニターした)。混合液を濾過し、０.５９ｇの湿潤生産物を得た(収率：６５.４３％*)。
* 変換率(％)が７４.４％より低いのは、おそらく反応が可逆的なためであろう。
【００６３】
実施例１１ エゼチミブの精製
２ｇのエゼチミブとＥＺＴ-ケトンの混合物(エゼチミブの純度８２％；ＥＺＴ-ケトンの含有量：１５.８％)を還流温度において、５ｍｌのＭＩＢＫに溶解した。溶液を室温まで冷却し、一晩撹拌した。得られたスラリーを濾過し、乾燥して０.９ｇの白色生成物を得た(エゼチミブの純度９９％)。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エゼチミブ又はその誘導体を得るための、エゼチミブ中間体の還元方法に関する。
【０００２】
本願は米国仮出願番号６０／９３３,８３７(２００７年７月７日出願)、米国仮出願番号６０／９７１,５０４(２００７年９月１１日出願)、米国仮出願番号６１／００４,７２５(２００７年１１月２８日出願)、米国仮出願番号６１／００５,３８９(２００７年１２月４日出願)、及び米国仮出願番号６１／０５０,８７５(２００８年５月６日出願)の利益を主張し、当該各仮出願の全内容を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
ヒドロキシ-アルキル置換されたアセチジノンは、アテローム硬化症の治療及び予防において高コレステロール血症剤として有用である。エゼチミブ、すなわち１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３(Ｓ)-ヒドロキシプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンは、腸コレステロールの選択的阻害剤であり、フィロステロールの吸収に関係する。エゼチミブの実験式はＣ24Ｈ21Ｆ2ＮＯ3、その分子量は４０９.４である。エゼチミブはエタノール、メタノール及びアセトンには非常に高い溶解性を有し、水には実質的に不要な、白色の結晶性粉末である。エゼチミブは下記の化学構造を有する：
【化１】
【０００４】
エゼチミブは、メルク／シェリング-プラウ製薬会社(Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ-Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ)より製造され、商標名ゼチア(ＺＥＴＩＡ(商標))で市販されている薬品の活性成分である。ゼチアは、高コレステロール患者において低比重リポタンパク質(ＬＤＬ)コレステロール及び総コレステロールを下げる用途で米国食品医薬品局の認可を受けている。
【０００５】
エゼチミブは、下記スキーム１に示されるように、コーリー(Ｃｏｒｅｙ)試薬の存在下でテトラヒドロフラン中、(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-(３-(４-フルオロフェニル)-３-オキソプロピル)-２-アゼチジノン(「化合物１」)をボランジメチルスルフィド錯体又はボランテトラヒドロフラン錯体を用いて還元し、続いて、ベンジル基を脱保護することにより調製され得る。該方法は、米国特許番号第５,６３１,３６５号(「‘３６５特許」)及び第６,６２７,７５７号に開示され、当該文献は本願明細書に組み入れられる。開始物質である化合物１又はその類似化合物は、例えば‘３６５特許に開示されるような当技術分野において既知の方法により製造され得る。
【化２】
【０００６】
上記の還元方法によって、次の２種の異性体が生成される：(３Ｒ,４Ｒ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｓ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノン(「化合物２ａ」)、及び(３Ｒ,４Ｒ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｒ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノン(「化合物２ｂ」)。化合物２ａは、適切なキラリティーのエゼチミブを生成する所望の異性体である。化合物２ｂは、エゼチミブを形成する最終合成中と同様に還元中においても除去するのが非常に困難な、所望でない異性体である。化合物２ｂは通常、還元工程の間に約８〜１０％の収率で生成されることが報告されている。
【０００７】
‘３６５特許には下記のように、(Ｒ)-(＋)-２-メチル-ＣＢＳ-オキサザボロリジン(「ＣＢＳ」；Ｃｏｒｅｙ-Ｂａｋｓｈｉ-Ｓｈｉｂａｔａ触媒)とボロヒドリド ジメチルスルフィド複合体(「ＢＭＳ」)とを用い、化合物１から化合物２ａへ還元することが記載されている。
【化３】
【０００８】
米国特許第６,１３３,００１号には下記のように、エゼチミブ-ケトンからエゼチミブへの立体選択的な微生物的還元方法が記載されている。
【化４】
【０００９】
国際公開公報ＷＯ２００５／０６６１２０には、(-)-Ｂ-クロロジイソピノカンフェイルボラン(「ＤＩＰ-Ｃｌ」)を用いた、エゼチミブ-ケトンからエゼチミブへのエナンチオ選択的還元が記載されている。
【００１０】
エゼチミブ及びその誘導体の改良された製造方法が望まれていた。
【発明の概要】
【００１１】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化５】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物の製造方法であって、以下の式ＩＩ：
【化６】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を、単離、合成、又は精製された毛とレダクターゼと混合することを含む、前記方法を包含する。好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００１２】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化７】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物の製造方法であって、以下の式ＩＩ：
【化８】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を、ケトレダクターゼ酵素、補因子、及び約４から約９のｐＨを有する緩衝液を混合すうることを含む、前記方法を包含する。
【００１３】
一つの態様においては、本発明は、ＭＩＢＫからエゼチミブを晶出することを含む、ＥＺＴ-ケトンからエゼチミブを精製する方法を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一つの観点においては、本発明は酵素を触媒として用い、かつ任意に水混和性有機溶媒を使用することを含む、以下の式Ｉ：
【化９】
で表される化合物の製造方法に関する。
【００１５】
本明細書中、用語「収率」とは、開始物質の最初の量に対して合成された化合物の百分率をいう。収率は、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積に対する合成された化合物のピークを基に、面積百分率により決定される。収率は通常、反応の間又は直後に測定される。
【００１６】
本明細書中、用語「純度」とは、他の化合物に対するある化合物の百分率をいう。純度は、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積に対する合成された化合物のピークを基に、面積百分率により決定される。純度は通常、精製工程の後に測定される。
【００１７】
本明細書中、用語「ｄ.ｅ.」とは、次のように定義されるジアステレオマー過剰率を意味する：
(エゼチミブのモル分率)-(エゼチミブのＲ,Ｒ,Ｓ-ジアステレオマーのモル分率)。
【数１】
エゼチミブは以下に示すようなＳ,Ｒ,Ｓ立体配置を有する：
【化１０】
Ｒ,Ｒ,Ｓ-ジアステレオマーは、プロピル鎖の第３番目の炭素上のキラル中心について(Ｒ)の立体配置を有する点で異なる。
【００１８】
本明細書中、用語「ＥＺＴ」はエゼチミブ、すなわち１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３(Ｓ)-ヒドロキシプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「ＥＺＴ Ｒ,Ｒ,Ｓ-異性体」は１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-ヒドロキシプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「エゼチミブ-ケトン」又は「ＥＺＴ-ケトン」は、下記のような化学構造：
【化１１】
を有する１-(４-フルオロフェニル)-３(Ｒ)-［３-(４-フルオロフェニル)-３-オキソプロピル］-４(Ｓ)-(４-ヒドロキシフェニル)-２-アゼチジノンを指す。
【００１９】
本明細書中、用語「化合物１」は(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-(３-(４-フルオロフェニル)-３-オキソプロピル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「化合物２ａ」は(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｓ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノンを指す。本明細書中、用語「化合物２ｂ」は(３Ｒ,４Ｓ)-４-((４-ベンジルオキシ)フェニル)-１-(４-フルオロフェニル)-３-((Ｒ)-３-(４-フルオロフェニル)-３-ヒドロキシプロピル)-２-アゼチジノンを指す。
【００２０】
本明細書中、酵素について用いられている場合、用語「単離された」とは、天然の環境から分離又は取り出された酵素をいう。「単離された」酵素とは、通常の細胞環境から取り出された天然の酵素又は組み換え酵素を示す。単離された酵素は無細胞系にあることが好ましい。単離された酵素は他の物質を除去する労力に応じて、粗酵素でも高度に精製された酵素であってもよい。「単離された」とは、単離された酵素が存在する唯一の酵素であることを意味するものではなく、存在する主たる酵素であることを意味する(少なくとも他の酵素よりも１０〜２０％多い)。本明細書中、酵素について用いられている場合、用語「合成された」とは、酵素が化学合成、組み換え法、又はそれらの組み合わせにより製造された酵素をいう。本明細書中、酵素について用いられている場合、用語「精製された」とは、酵素が本質的に非酵素物質又は他の酵素を含まない(少なくとも純度約９０〜９５％)ことをいう。
【００２１】
本明細書中、用語「デヒドロゲナーゼ」或いは「デヒドロゲナーゼ酵素」とは、一つ以上のプロトンと電子対をアクセプタに移動させることにより基質を酸化させる酵素をいう。デヒドロゲナーゼの例として、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、及び亜リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。グルコースデヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ)には、例えば、ＥＣ(Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ)番号１.１.１.４７及びＣＡＳ(Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ)番号９０２８-５３-９が付与されるものが含まれ、例えばコデクシス社(Ｃｏｄｅｘｉｓ Ｉｎｃ.、前バイオキャタリティックス社(ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ.))からカタログ番号ＧＤＨ-１０２〜ＧＤＨ-１０４として市販されている。ギ酸デヒドロゲナーゼ(ＦＤＨ)には、例えば、ＥＣ番号１.２.１.２.及びＣＡＳ番号９０２８-８５-７が付与されるものが含まれ、例えばコデクシス社からカタログ番号ＦＤＨ-１０１で市販されている。亜リン酸デヒドロゲナーゼ(ＰＤＨ)には、例えば、ＥＣ番号１.２０.１.１.及びＣＡＳ番号９０３１-３５-０が付与されるものが含まれ、例えばコデクシス社からカタログ番号ＰＤＨ-１０１で市販されている。
【００２２】
本明細書中、用語「ケトレダクターゼ」、「ケトレダクターゼ酵素」、又は「ＫＲＥＤ」とは、ケトンの還元を触媒してケトンに対応するアルコールを生成する酵素をいう。ケトレダクターゼには、例えば、ＥＣ番号１.１.１.が付与されるものが含まれる。このような酵素にはケトレダクターゼ以外にも多様な命名がされており、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、カルボニルレダクターゼ、ラクターゼデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ、β-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ステロイドデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、アルドレダクターゼ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＮＡＤＰＨ依存性ケトレダクターゼには、ＥＣ番号１.１.１.２及びＣＡＳ番号９０２８-１２-０が付与される。ＮＡＤＨ依存性レダクターゼには、ＥＣ番号１．１．１．１及びＣＡＳ番号９０３１−７２−５が付与されている。ケトレダクターゼは、例えばコデクシス社からカタログ番号ＫＲＥＤ-１００〜ＫＲＥＤ-１７７で市販されている。
【００２３】
本明細書中、用語「補因子」とは注目している反応を触媒する酵素と結合して働く非タンパク質化合物をいう。補因子には、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤＨ)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰ+)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)、及びこれらの誘導体又は類似体などのニコチンアミド補因子が挙げられる。
【００２４】
本明細書中、用語「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し、用語「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチル、用語「ＩＰＡ」はイソプロピルアルコール、用語「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシド、用語「ＭＩＢＫ」はメチルイソブチルケトン、用語「ＤＣＭ」はジクロロメタン、用語「ＭＴＢＥ」はメチル ｔｅｒｔ-ブチルエーテル、用語「ＤＴＴ」はジチオトレイトールを指す。
【００２５】
本明細書中、用語「室温」又は「ＲＴ」とは標準的な実験室の外気温をいい、通常、約１５℃〜約３０℃である。
【００２６】
本明細書中、用語「真空」とは約２ｍｍＨｇから約１０ｍｍｇの圧力をいう。
【００２７】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化１２】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］と
で表される化合物を製造する方法であって、以下の式II：
【化１３】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］と
で表される化合物を、単離され、合成され、又は精製されたケトレダクターゼと混合することを含む前記方法を包含する。好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００２８】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化１４】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を製造する方法であって、以下の式ＩＩ：
【化１５】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を生体触媒及び緩衝液を混ぜ合わせることを含む前記方法を包含する。
【００２９】
好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００３０】
一つの態様においては、本発明は、以下の式Ｉ：
【化１６】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］、
で表される化合物を製造する方法であって、以下の式ＩＩ：
【化１７】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］、
で表される化合物を、ケトレダクターゼ酵素、補因子及び約４から約９のｐＨを有する緩衝液と混合することを含む、前記方法を包含する。
【００３１】
ＲがＨである場合、式Ｉで表される化合物はエゼチミブであり、式IIで表される化合物はエゼチミブ-ケトンである。Ｒがヒドロキシル保護基である場合、式IIで表される化合物はエゼチミブを得るためにさらに脱保護され得る。脱保護は‘３６５特許の実施例６に記載の方法のような既知の方法により行うことができる。
【００３２】
当該反応は以下に示すような酵素過程である：
【化１８】
この反応において、ケトレダクターゼは立体選択的にカルボニル基を還元し、同時にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨなどの補因子が酸化される。
【００３３】
好ましくは、ヒドロキシル保護基はベンジル、ｔｅｒｔ-ブチルオキシカルボニル、アシル、及びシリル基からなる群より選択される。適切なシリル保護基の例として、(Ｒa)(Ｒb)(Ｒc)-Ｓｉ- ｛式中、Ｒa、Ｒb及びＲcはＣ1−Ｃ6アルキル、フェニル、ベンジル、アセチル等からなる群よりそれぞれ独立に選択される｝が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
好ましくは、ケトレダクターゼは単離されたものである。ケトレダクターゼは哺乳動物、糸状菌、酵母、細菌などのいかなる宿主からも分離され得る。ＮＡＤＨ依存性ケトレダクターゼの単離、精製、及び特性解析については、例えばＫｏｓｊｅｋらによる“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｈｅｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｄｏｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ,Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ,８６：５５-６２(２００４)”に記載されている。好ましくは、ケトレダクターゼは合成されたものである。ケトレダクターゼは化学的に、又は組み換え法を用いて合成され得る。ケトレダクターゼの化学的生成、及び組み換え体による生成については、例えば欧州特許第０９１８０９０号に記載されている。好ましくは、ケトレダクターゼは大腸菌中において組み換え法を用いて合成される。好ましくは、ケトレダクターゼは精製されたものであり、好ましくは純度が約９０％以上、さらに好ましくは純度が約９５％以上である。ケトレダクターゼは実質的に細胞フリー(ｃｅｌｌ-ｆｒｅｅ)であることが好ましい。
【００３５】
本発明の方法において、好ましくは、ケトレダクターゼはｄ.ｅ.値が約９０％以上のエゼチミブを生産し得るケトレダクターゼである。好ましくは、本発明の方法において、ケトレダクターゼは約５０％以上の収率でエゼチミブを生産し得る。
【００３６】
ケトレダクターゼは、好ましくはＮＡＤＨ依存性ケトレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ依存性ケトレダクターゼからなる群から選択される。好適なケトレダクターゼとして次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるものではない；ａ)カタログ番号ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３のコデクシス社製品、これらの同等品、及びこれらの混合物、ｂ)カタログ番号ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３のコデクシス社製品、これらの同等品、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素。本明細書中、「同等品」とは類似又は同一の酵素活性を有する酵素又は製品をいう。好ましくは、ケトレダクターゼは、カタログ番号ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３のコデクシス社製品、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群から選択される。好ましくは、ケトレダクターゼは、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群から選択される。より好ましくは、ケトレダクターゼはＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８、又はこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。
【００３７】
一つの態様においては、本発明の方法は、さらに補因子をケトレダクターゼと混ぜ合わせることを含む。好ましくは、補因子はＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される。ケトレダクターゼがＮＡＤＨ依存性である場合、好ましくは、補因子はＮＡＤＨ、ＮＡＤ+、これらの塩、又はこれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、補因子はＮＡＤＨ、又はその塩である。ケトレダクターゼがＮＡＤＰＨ依存性である場合、好ましくは、補因子はＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ+、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、補因子はＮＡＤＰＨ又はその塩である。
【００３８】
一つの態様においては、本発明の方法は緩衝液中で実施される。好ましくは、緩衝液のｐＨは約４〜約９であり、より好ましくは約４〜約８、さらに好ましくは約５〜約８であり、最も好ましくは約６〜約８又は約５〜約７である。好ましくは、緩衝液は塩の溶液である。好ましくは、塩はリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、及びこれらの混合物からなる群より選択される。任意には、緩衝液はチオールを含み得る。好ましくは、チオールはＤＴＴである。好ましくは、チオールは酵素中のジスルフィド結合を減少させる。
【００３９】
一つの態様においては、本発明の方法は約１０℃〜約５０℃の温度で実施される。好ましくは、該方法は室温で実施され、温度は約２４℃〜２８℃、又は約２５℃から約３５℃である。好ましくは、該方法は約２５℃から約３０℃の温度で実施される。好ましくは、該方法は約３０℃の温度で実施される。
【００４０】
任意には、反応混合物はさらに補因子再生システムを含む。補因子再生システムは基質とデヒドロゲナーゼを含む。基質とデヒドロゲナーゼ間の反応により補因子が再生される。好ましくは、補因子再生システムは、Ｄ-グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸ナトリウム／ギ酸デヒドロゲナーゼ、及び亜リン酸塩／亜リン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される基質／デヒドロゲナーゼの対を含む。好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼはカタログ番号ＧＤＨ-１０２、ＧＤＨ-１０３、ＧＤＨ-１０４のコデクシス社製品、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される。好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼはＧＤＨ-１０４中の酵素である。好ましくは、ギ酸デヒドロゲナーゼは、カタログ番号ＦＤＨ-１０１のコデクシス社製品中の主たる酵素である。好ましくは、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、カタログ番号ＰＤＨ-１０１のコデクシス社製品中の主たる酵素である。
【００４１】
一つの態様においては、本発明の方法は、さらに溶媒を添加することを含む。好ましくは、溶媒は有機溶媒である。有機溶媒は、水混和性であることが好ましい。好ましくは、水混和性有機溶媒はアルコール類及びＤＭＳＯからなる群より選択される。アルコール類は、好ましくはＣ1−Ｃ4アルコール、さらに好ましくはメタノール又はＩＰＡである。本発明の方法において用いられる好適な溶媒は大部分が水であるため、より環境にやさしい反応ですむ点で、従来文献で用いられる有機溶媒と比べて優れている。
【００４２】
好ましくは、該方法は以下の工程からなる：
(ａ)式IIで表される化合物を溶媒に溶解する工程、及び
(ｂ)(ａ)で得られた溶液を、補因子及びケトレダクターゼを含む緩衝液と混ぜ合わせる工程。
好ましくは、得られた混合物は、式Ｉで表される化合物を得るために十分な時間撹拌される。撹拌は、好ましくは約２５℃〜約３５℃、又は約２５℃〜約４０℃、さらに好ましくは約２４℃〜約２８℃、約２５℃〜約３０℃、又は約３０℃で行われる。
撹拌は、好ましくは約０.５時間以上、約１.５時間以上、又は約２.５時間以上行われる。撹拌は約５０時間以下であることが好ましい。好ましくは、撹拌は約３時間〜約４０時間、より好ましくは約６時間〜約２４時間、又は約６時間〜約１６時間行われる。
【００４３】
任意には、水非混和性有機溶媒が前記混合物に添加され、該添加は前記撹拌の後に行うのが好ましい。水非混和性有機溶媒の添加後、任意には、前記反応混合物は有機相と水相とに分離される。任意には、式Ｉで表される化合物は有機相を蒸散させることにより回収される。水非混和性有機溶媒の例としては、Ｃ2-8のエーテル、ＥｔＯＡｃなどのＣ3-8のエステル、ＭＩＢＫなどのＣ4-8のケトン、及びＤＣＭなどのハロゲン化炭化水素などが挙げられるが、これらに限定するものではない。好ましくは、水非混和性有機溶媒はＥｔＯＡｃ、ＭＴＢＥ、ジエチルエーテル、及びこれらの混合物からなる群より選択される。好ましくは、水非混和性有機溶媒はＥｔＯＡｃである。
【００４４】
任意には、前記反応混合物は、好ましくは撹拌後に、固体生成物を回収するために濾過される。任意には、該固体生成物は式Ｉで表される化合物を得るためにさらに精製され得る。
【００４５】
任意には、生成物を分離後、酵素、補因子、及び／又はデヒドロゲナーゼを再利用するために、水相は補因子再生システム中で処理され得る。任意には、水相のｐＨは所望のｐＨを得るために調整することができる。任意には、水相は有機溶媒の残留を除去するために蒸散させる。任意には、本発明の方法において水相は再利用される。
【００４６】
好ましくは、上述の方法はエゼチミブに対する高い立体選択性を有する。得られるエゼチミブのｄ.ｅ.値は好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９８％以上、又は約９９％以上であり、最も好ましくは約９９％以上である。
【００４７】
好ましくは、上述の方法は高い収率を有する。式Ｉで表される化合物の収率は好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、又は約７０％以上、約８０％以上であり、最も好ましくは約８５％以上である。
【００４８】
一つの態様においては、本発明はＭＩＢＫからエゼチミブを結晶化することを含むＥＺＴ-ケトンからエゼチミブを精製する方法を包含する。好ましくは、該方法は以下の：
(ａ)エゼチミブとＥＺＴ-ケトンを含む試料をＭＩＢＫに溶解する工程、
(ｂ)工程(ａ)の溶液を冷却する工程、及び
(ｃ)エゼチミブを回収する工程
を含む。
【００４９】
好ましくは、工程(ａ)は加熱しながら行われる。好ましくは、加熱は約５０℃〜およそ還流温度まで、より好ましくは、およそ還流温度まで行われる。任意には、冷却はおよそ室温以下までであり、好ましくは約１０℃まで行われる。任意には、冷却工程後、スラリーが得られる。任意には、エゼチミブは前記スラリーを濾過し、任意に乾燥することによって回収される。乾燥は、好ましくは約４０℃〜約５０℃、好ましくは真空下で行われる。
【００５０】
好ましくは、得られるエゼチミブの純度は約９８％以上、より好ましくは約９９％以上である。
【００５１】
本発明について特定の好適な態様及び例示のための実施例を参照して記載したが、当業者には、本明細書に開示される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明を変更することが理解されるであろう。実施例は、本発明の理解を助けるために示されるもので、本発明の範囲を何ら制限する意図はなく、また制限すると解釈されるべきでもない。特に断らない限り、上記に記載される特定の態様のいずれかの組み合わせは、本発明と矛盾せず、本発明に包含される。
【実施例】
【００５２】
エゼチミブの不純物プロフィール測定のためのＨＰＬＣ法
カラム及びパッキング：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ（商標）、Ｃ８、１５０*４.６ｍｍ、３μｍ、２５２０３-１５４６３０
緩衝液： ０.０５％ ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)
溶離液Ａ： ５１：４９ メタノール：緩衝液
溶離液Ｂ： ７５：２５ アセトニトリル：溶離液Ａ
時間 溶離液Ａ（％） 溶離液Ｂ（％）
勾配： ０ １００ ０
１８ １００ ０
３５ ０ １００
３５．１ １００ ０
平衡時間： ７分
試料容量： ５μＬ
流速： １．５ｍｌ／分
検出器： ２３５ｎｍ
カラム温度： ３０℃
オートサンプラー温度： １０℃
希釈剤： メタノール
【表１】
【００５３】
実施例１ ＫＲＥＤ-１２８を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１２８(５ｍｇ、コデクシス社製、ロット番号：０９０３０５ＣＬ、製造年：２００５)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼを含む、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中１０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で４０時間撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：７１.５５％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００５４】
実施例２ ＫＲＥＤ-１３３を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１３３(５ｍｇ、コデクシス社製、ロット番号：１１３００６ＭＭ、製造年：２００６)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中１０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で４０時間撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：１７.６％、ｄ.ｅ.：９９.３％)。
【００５５】
実施例３ ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.３ｍＭ ＮＡＤ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：５７.１１％、ｄ.ｅ.：９０.７％)。
【００５６】
実施例４ ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.３ｍＭ ＮＡＤ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：１６.６％、ｄ.ｅ.：９８.５％)。
【００５７】
実施例５ ＫＲＥＤ-１１６を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１１６(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相中のＥＺＴを分析にかけた(収率：５７.９７％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００５８】
実施例６ ＫＲＥＤ-１１８を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１１８(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相は蒸散させた(収率：８７.５９％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００５９】
実施例７ ＫＲＥＤ-１１９を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１１９(５ｍｇ、コデクシス社製、ロット番号：１００４０７ＷＷ、製造年：２００７)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相を蒸散させ、残留物中のＥＺＴを分析にかけた(収率：８３.１９％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００６０】
実施例８ ＫＲＥＤ-１２０を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
ＫＲＥＤ-１２０(５ｍｇ、コデクシス社製)を５ｍｌの緩衝液(２５０ｍＭ リン酸カルシウム、０.５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、１.１ｍＭ ＮＡＤＰ+、８０ｍＭ Ｄ-グルコース、１０Ｕ／ｍｌ グルコースデヒドロゲナーゼ含有、ｐＨ７.０)中に溶解し、ＥＺＴ-ケトンを溶解したメタノール溶液(０.２５ｍｌ中２０ｍｇ)を添加した。混合液を３０℃で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで測定した。ＥｔＯＡｃ(５ｍｌ)を添加し、液相分離させた。有機相を蒸散させ、残留物中のＥＺＴを分析にかけた(収率：３７.４１％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００６１】
実施例９ ＫＲＥＤ-１２８を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
１０ｍｇのＥＺＴ-ケトンを０.２５ｍｌのメタノールに溶解した溶液を、以下の溶液に添加した：５ｍｇ ＫＲＥＤ-１２８(コデクシス社製、ロット番号：０９０３０５ＣＬ、製造年：２００５)、３６ｍｇ(４０ｍＭ) Ｄ-グルコース、４ｍｇ(１ｍＭ) ＮＡＤＰ+、２.５ｍｇ グルコースデヒドロゲナーゼを含む５ｍｌのリン酸緩衝液(ｐＨ７)。得られた乳白色の混合液を、３５℃において１.５時間撹拌した。混合液を濾過し、濾過された物質を分析にかけた(収率：８９.２６％、ｄ.ｅ.：９９.９％)。
【００６２】
実施例１０ ＫＲＥＤ-１１９を用いたＥＺＴ-ケトンの還元
６００ｍｇのＥＺＴ-ケトンを４ｍｌのＩＰＡに溶かした溶液を、８００ｍｇ(０.２５Ｍ) Ｄ-グルコース、４０ｍｇ グルコースデヒドゲナーゼ、１６ｍｇ(１ｍＭ) ＮＡＤＰ+、及び２０ｍｇ ＫＲＥＤ-１１９(コデクシス社製、ロット番号：１００４０７ＷＷ、製造年：２００７)を含む、２０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６)に添加した。得られた乳白色の混合液を室温で２.５時間撹拌した(変換率が７４.４％になるまで、反応をＨＰＬＣによってモニターした)。混合液を濾過し、０.５９ｇの湿潤生産物を得た(収率：６５.４３％*)。
* 変換率(％)が７４.４％より低いのは、おそらく反応が可逆的なためであろう。
【００６３】
実施例１１ エゼチミブの精製
２ｇのエゼチミブとＥＺＴ-ケトンの混合物(エゼチミブの純度８２％；ＥＺＴ-ケトンの含有量：１５.８％)を還流温度において、５ｍｌのＭＩＢＫに溶解した。溶液を室温まで冷却し、一晩撹拌した。得られたスラリーを濾過し、乾燥して０.９ｇの白色生成物を得た(エゼチミブの純度９９％)。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ：
【化１】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物の製造方法であって、以下の式ＩＩ：
【化２】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を、単離され、合成され、又は精製されたケトレダクターゼと混合することを含む、前記製造方法。
【請求項２】
前記ケトレダクターゼが単離されたケトレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケトレダクターゼが合成されたケトレダクターゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ケトレダクターゼが精製されたケトレダクターゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｒが水素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒがヒドロキシル保護基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒがベンジル基、ｔｅｒｔ-ブチルオキシカルボニル基、アシル基、又はシリル基からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記シリル基が(Ｒa)(Ｒb)(Ｒc)-Ｓｉ-｛式中、Ｒa、Ｒb及びＲcはＣ1〜Ｃ6アルキル基、アセチル基又はベンジル基からなる群よりそれぞれ独立に選択される｝である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ケトレダクターゼが、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ケトレダクターゼが、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ケトレダクターゼが、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
補因子をケトレダクターゼと混合することをさらに含み、ここで当該補因子がＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記補因子がＮＡＤＨ又はその塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記補因子がＮＡＤＰＨ又はその塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が約４から約９のｐＨを有する緩衝液中で行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記緩衝液が約４から約８のｐＨを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記緩衝液が約６から約８のｐＨを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝液がリン酸カリウム及び硫酸マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩の溶液である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝液がジチオトレイトールを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が約１０℃から約５０℃の温度で行われる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が約２５℃から約３５℃の温度で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が約２５℃から約３０℃の温度で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
反応混合物がさらに補因子再生システムを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記補因子再生システムが、Ｄ-グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸ナトリウム／ギ酸デヒドロゲナーゼ、及び亜リン酸塩／亜リン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される基質／デヒドロゲナーゼの対を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質／デヒドロゲナーゼの対がＤ-グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ＧＤＨ-１０２、ＧＤＨ-１０３、ＧＤＨ-１０４、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記グルコースデヒドロゲナーゼがＧＤＨ-１０４中の酵素である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記基質／デヒドロゲナーゼの対がギ酸ナトリウム／ギ酸デヒドロゲナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼがＦＤＨ-１０１中の主たる酵素である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記基質／デヒドロゲナーゼの対が亜リン酸ナトリウム／亜リン酸デヒドロゲナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記亜リン酸デヒドロゲナーゼがＰＤＨ-１０１中の主たる酵素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
溶媒を添加することをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶媒が水混和性有機溶媒である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記溶媒がアルコールとジメチルスルホキシドとからなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルコールがＣ1-4アルコールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルコールがメタノール又はイソプロピルアルコールである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の方法であって、以下の：
(ａ)式IIで表される化合物を溶媒に溶解する工程と
(ｂ)(ａ)の溶液と補因子とケトレダクターゼを含む緩衝液とを混合する工程
を含む、前記方法。
【請求項３８】
前記反応混合液が約３時間から約４０時間撹拌される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記反応混合液が約１４時間から約２４時間撹拌される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記反応混合液が約２５℃から約３５℃の温度で撹拌される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記反応溶液を濾過して生成物を回収する工程をさらに含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
水非混和性有機溶媒が前記反応混合液に添加される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記水非混和性有機溶媒が撹拌後に前記反応混合液に添加される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記反応混合液が、水非混和性有機溶媒の添加後に有機相と水相中とに分離される、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記水混和性有機溶媒が、Ｃ2-8エーテル、Ｃ3-8エステル、Ｃ4-8ケトン、ハロゲン化炭化水素、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機相を蒸散させて生成物を回収する工程をさらに含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
式Ｉで表される化合物の収率が約５０％以上である、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記収率が約６０％以上である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記収率が約７０％以上である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記収率が約８０％以上である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記収率が約８５％以上である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
式Ｉで表される化合物がエゼチミブである、請求項１〜５及び請求項９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９０％以上である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９８％以上である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９９％以上である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９９.９％以上である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１〜５６のいずれかの方法により製造されるエゼチミブ。
【請求項５８】
メチルイソブチルケトンからエゼチミブを晶出することを含む、ＥＺＴ-ケトンからエゼチミブを精製する方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、以下の：
(ａ)エゼチミブとＥＺＴ-ケトンを含む試料をメチルイソブチルケトンに溶解する工程；
(ｂ)(ａ)の工程で得られた溶液を冷却する工程；及び
(ｃ)エゼチミブを回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項６０】
工程(ａ)を加熱しながら行う、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
約５０℃からおよそ還流温度まで加熱される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
およそ還流温度まで加熱される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
およそ室温又はそれ以下まで冷却される、請求項５９〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
約１０℃まで冷却される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
冷却工程後にスラリーを得、濾過により前記スラリーからエゼチミブを回収する、請求項５９〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
得られるエゼチミブの純度が約９８％以上である、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
得られるエゼチミブの純度が約９９％以上である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の方法により得られるエゼチミブ。
【請求項１】
以下の式Ｉ：
【化１】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物の製造方法であって、以下の式ＩＩ：
【化２】
［式中、ＲはＨ又はヒドロキシル保護基］
で表される化合物を、単離され、合成され、又は精製されたケトレダクターゼと混合することを含む、前記製造方法。
【請求項２】
前記ケトレダクターゼが単離されたケトレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケトレダクターゼが合成されたケトレダクターゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ケトレダクターゼが精製されたケトレダクターゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｒが水素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒがヒドロキシル保護基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒがベンジル基、ｔｅｒｔ-ブチルオキシカルボニル基、アシル基、又はシリル基からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記シリル基が(Ｒa)(Ｒb)(Ｒc)-Ｓｉ-｛式中、Ｒa、Ｒb及びＲcはＣ1〜Ｃ6アルキル基、アセチル基又はベンジル基からなる群よりそれぞれ独立に選択される｝である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ケトレダクターゼが、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０７、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２０、ＫＲＥＤ-１２８、ＫＲＥＤ-１３３及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ケトレダクターゼが、ＫＲＥＤ-ＮＡＤＨ-１０５、ＫＲＥＤ-１１６、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ケトレダクターゼが、ＫＲＥＤ-１１８、ＫＲＥＤ-１１９、ＫＲＥＤ-１２８及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
補因子をケトレダクターゼと混合することをさらに含み、ここで当該補因子がＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記補因子がＮＡＤＨ又はその塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記補因子がＮＡＤＰＨ又はその塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が約４から約９のｐＨを有する緩衝液中で行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記緩衝液が約４から約８のｐＨを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記緩衝液が約６から約８のｐＨを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝液がリン酸カリウム及び硫酸マグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つの塩の溶液である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝液がジチオトレイトールを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が約１０℃から約５０℃の温度で行われる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が約２５℃から約３５℃の温度で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が約２５℃から約３０℃の温度で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
反応混合物がさらに補因子再生システムを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記補因子再生システムが、Ｄ-グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸ナトリウム／ギ酸デヒドロゲナーゼ、及び亜リン酸塩／亜リン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される基質／デヒドロゲナーゼの対を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質／デヒドロゲナーゼの対がＤ-グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ＧＤＨ-１０２、ＧＤＨ-１０３、ＧＤＨ-１０４、及びこれらの混合物中のそれぞれの主たる酵素からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記グルコースデヒドロゲナーゼがＧＤＨ-１０４中の酵素である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記基質／デヒドロゲナーゼの対がギ酸ナトリウム／ギ酸デヒドロゲナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼがＦＤＨ-１０１中の主たる酵素である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記基質／デヒドロゲナーゼの対が亜リン酸ナトリウム／亜リン酸デヒドロゲナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記亜リン酸デヒドロゲナーゼがＰＤＨ-１０１中の主たる酵素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
溶媒を添加することをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶媒が水混和性有機溶媒である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記溶媒がアルコールとジメチルスルホキシドとからなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルコールがＣ1-4アルコールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルコールがメタノール又はイソプロピルアルコールである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の方法であって、以下の：
(ａ)式IIで表される化合物を溶媒に溶解する工程と
(ｂ)(ａ)の溶液と補因子とケトレダクターゼを含む緩衝液とを混合する工程
を含む、前記方法。
【請求項３８】
前記反応混合液が約３時間から約４０時間撹拌される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記反応混合液が約１４時間から約２４時間撹拌される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記反応混合液が約２５℃から約３５℃の温度で撹拌される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記反応溶液を濾過して生成物を回収する工程をさらに含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
水非混和性有機溶媒が前記反応混合液に添加される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記水非混和性有機溶媒が撹拌後に前記反応混合液に添加される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記反応混合液が、水非混和性有機溶媒の添加後に有機相と水相中とに分離される、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記水混和性有機溶媒が、Ｃ2-8エーテル、Ｃ3-8エステル、Ｃ4-8ケトン、ハロゲン化炭化水素、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機相を蒸散させて生成物を回収する工程をさらに含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
式Ｉで表される化合物の収率が約５０％以上である、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記収率が約６０％以上である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記収率が約７０％以上である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記収率が約８０％以上である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記収率が約８５％以上である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
式Ｉで表される化合物がエゼチミブである、請求項１〜５及び請求項９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９０％以上である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９８％以上である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９９％以上である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
エゼチミブのジアステレオマー過剰率が約９９.９％以上である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１〜５６のいずれかの方法により製造されるエゼチミブ。
【請求項５８】
メチルイソブチルケトンからエゼチミブを晶出することを含む、ＥＺＴ-ケトンからエゼチミブを精製する方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、以下の：
(ａ)エゼチミブとＥＺＴ-ケトンを含む試料をメチルイソブチルケトンに溶解する工程；
(ｂ)(ａ)の工程で得られた溶液を冷却する工程；及び
(ｃ)エゼチミブを回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項６０】
工程(ａ)を加熱しながら行う、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
約５０℃からおよそ還流温度まで加熱される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
およそ還流温度まで加熱される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
およそ室温又はそれ以下まで冷却される、請求項５９〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
約１０℃まで冷却される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
冷却工程後にスラリーを得、濾過により前記スラリーからエゼチミブを回収する、請求項５９〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
得られるエゼチミブの純度が約９８％以上である、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
得られるエゼチミブの純度が約９９％以上である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の方法により得られるエゼチミブ。
【公表番号】特表２０１０−５２９１４８（Ｐ２０１０−５２９１４８Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１４２８（Ｐ２０１０−５１１４２８）
【出願日】平成２０年６月９日（２００８．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６３５１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１３２４
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０１０７９７０５）テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド (283)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月９日（２００８．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６３５１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１３２４
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０１０７９７０５）テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド (283)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]