クロリンの製造方法、及びその医薬としての使用
本発明は、光力学的療法（ＰＤＴ）に反応する過剰増殖性組織、例えば、腫瘍、過剰増殖性血管及び他の疾病又は異常に対するＰＤＴのために設計されたスルホン化クロリン及びスルホン化バクテリオクロリンの製造方法、特性、医薬組成物、及び治療における使用方法を提供する。特に、安定なクロリン及びバクテリオクロリンの大規模で効率的な合成について説明する。その特性は、ＰＤＴのための理想的な光増感剤の特性と一致するように調整されている。他の実施形態において、全身投与による治療の医薬組成物及び方法を提供する。更なる実施形態において、局所投与による治療の医薬組成物及び方法を提供する。さらに、標的組織を標識する方法を提供すると共に、ＭＲＩの蛍光によって、前記組織の画像を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光力学的療法（ＰＤＴ）に反応する過剰増殖性組織、例えば、腫瘍、過剰増殖性血管及び他の疾病又は異常に対するＰＤＴのために設計されたスルホン化クロリン及びスルホン化バクテリオクロリンの製造方法、特性、医薬組成物、及び治療における使用方法に関する。本発明は、特に、安定なクロリン及びバクテリオクロリンを、大規模に化学的に合成することができる新規な方法に関し、無溶媒、無基剤（base）であることを特徴とする。他の実施形態として、医薬組成物、及び全身投与による治療に該医薬組成物を使用する方法が提供される。更なる実施形態において、医薬組成物、及び局所投与による治療に該医薬組成物を使用する方法が提供される。また、過剰増殖性組織、例えば、腫瘍を、光力学的方法又はＭＲＩを用いて検出する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
［I.背景］
［Ｉ．Ａ．最新技術］
種々のテトラピロール大員環、例えば、プルプリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン及びベンゾクロリン等は、生体に投与された際に、過剰増殖性組織に優先的に蓄積する能力、及び光を吸収し、光に反応して活性化状態を形成する能力を示す。これらの大員環は、適切な波長の光を照射されるときに、それらが局在化されている細胞又は他の組織に細胞傷害効果を呈する。さらに、これらの化合物はまた、前記組織から、その位置の検出に用いることができるエネルギー放射を引き起こす。
【０００３】
ＰＤＴにおいて、患者は、腫瘍組織に対していくつかの選択性光傷害を示す光増感剤を投与され（通常、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲）、所定時間後、前記腫瘍領域に可視光線又は近赤外線が照射される（約５０〜２００Ｊ／ｃｍ２）。前記光増感剤は、光を吸収し蛍光を発するか、又は前記組織において電子若しくは水素転移反応によって基質分子と反応する（Ｉ型工程）か、又は前記組織を攻撃する一重項酸素Ｏ２ (１Dｇ)を生成する基底状態の酸素分子にそのエネルギーを移動する（ＩＩ型工程）。Ｉ型工程における主な寄与因子は、電子的に励起された増感剤からの電子転移によって形成されたスーパーオキシド（Ｏ２−）である。細胞にとってＩ型工程よりもＩＩ型光酸素化工程の方が好都合であることが明らかである（非特許文献１，２参照）。しかし、スーパーオキシドが生成される場合におけるＰＤＴ反応の増幅もまた主張されている（非特許文献３参照）。検出の場合には、蛍光発光は、所望の波長の光に暴露されることにより測定される。低いエネルギーは、治療のためにも必要とされる。効果的な治療には、通常、前記組織に一重項酸素を高い生成量で形成する必要があり、これはスーパーオキシド又は他の活性酸素種（reactive oxygen species）の同時形成による相乗効果を有するかもしれない。
【０００４】
ＰＤＴ処理のための最適な増感剤の特性としては、（ｉ）簡易で、効率的で、かつ経済的な合成、（ｉｉ）安定で、純度が高く、長い保存可能期間、（ｉｉｉ）生体適用性のある溶媒又は賦形剤への可溶性、（ｉｖ）「光治療域」（６００〜９００ｎｍ）の高い吸収係数、（ｖ）一重項酸素分子の増感、又は高量子収率でのスーパーオキシド生成、（ｖｉ）暗所毒性が低いか、全く無いこと、（ｖｉｉ）腫瘍組織における選択的集積及び長期的な滞留、（ｖｉｉｉ）全身投与下での低い皮膚光増感、（ｉｘ）制御された光退色、（ｘ）治療後の代謝又は排出の容易さ、を含む。前記増感剤は、細胞毒性種、特に、一重項酸素及び他の活性酸素種、例えば、スーパーオキシドイオンの前駆体にすぎない。一重項酸素及びよくあるようにスーパーオキシドの直接の前駆体は、三重項状態の増感剤である。従って、高い一重項酸素量子収率は、（ｉ）ほぼ一貫した量子収率、（ｉｉ）一重項酸素の電子エネルギー（９４ｋＪ／ｍｏｌ）より少なくとも２０ｋＪ／ｍｏｌ超過した電子エネルギー、（ｉｉｉ）長い寿命（数百μ秒）という、少なくとも３つの増感剤三重項状態特性を必要とする。腫瘍組織内への蓄積及び滞留は、特定のベクターの添加により強化されるが、これらを達成するための前記増感剤に関連する固有特性は、増感剤の親水性／親油性であり、所望の標的に到達するような特性に調整する能力が最も望まれる特性である。
【０００５】
前記光治療域の下限値は、組織中で可視領域の光を吸収する最大の原因であるヘムタンパク質の存在によって決定される。組織内での光の透過率は、５５０ｎｍ以下で急激に低下する。しかしながら、透過率は５５０〜６３０ｎｍで、顕著に増加し、そして透過率は、７００ｎｍで再び倍になる。これは、その後に波長が８００ｎｍに向けて変化するに従って、組織透過性が１０％増加する。前記光治療域の上限値は、水による赤外線放射の吸収、及び酸素への効率的なエネルギー移動のために必要とされるエネルギーによって決定される。実際には、前記増感剤から酸素分子へ移動する拡散律速三重項エネルギーは、前記増感剤の三重項エネルギーである少なくとも１１５ｋＪ／ｍｏｌを必要とする。また、テトラピロール大員環に分裂する一重項−三重項エネルギーは、約４０ｋＪ／ｍｏｌであり（非特許文献４参照）、これは、増感剤が１５０ｋＪ／ｍｏｌより大きい一重項エネルギーを有さなければならないことを必要とする。これらの増感剤は、ストークスシフトが通常小さいことを考慮すると、８００ｎｍ直下（just below）の光を吸収するであろう。結論として、理想的な増感剤は、約７５０ｎｍの波長の光を強く吸収する必要がある。バクテリオクロリンにおけるこの波長の強い吸収は、該バクテリオクロリンをＰＤＴ増感剤に対する理想的な候補とする。光透過性が重要でないときに適用するとすれば、クロリンもまたＰＤＴのための適切な候補である。
【０００６】
ヘマトポルフィリン誘導体であるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）（非特許文献５参照）は、最も広く用いられている光増感剤であり、種々の固形腫瘍の治療に対して認可されている（非特許文献６参照）。ヘマトポルフィリン誘導体（ＨｐＤ）は、ヘマトポルフィリンを氷酢酸及び硫酸と混合し、次に酸性条件下で、加水分解及び沈殿を行うことにより製造される。この方法は、Ｌｉｐｓｏｎらによって、部分的に記述されている（非特許文献７参照）。このようにして製造されたＨｐＤは、ポルフィリンの複合混合物からなる。ＨｐＤはＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を用いたゲルろ過によって、２つの主画分に分割した場合、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）と呼ばれるより分子量の大きな部分は、より効率的なＰＤＴ剤となる（非特許文献8参照）。推奨されるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）のヒトに対する用量は、１〜２ｍｇ／ｋｇ体重である。Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の主成分は、エーテル、エステル及び可能な炭素−炭素結合と結合した二量体及び高次のオリゴマーである（非特許文献９参照）。
【０００７】
Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）は、優れた有効性、水溶性、一重項酸素の妥当な収率及び生産の容易さといった、いくつかの好ましい特性を有している。しかしながら、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）は、（ｉ）エーテル、エステル又は炭素−炭素結合により結合されたポルフィリンの二量体及び高次のオリゴマーの複合混合物であること、（ｉｉ）投与後、４〜６週間の間、患者に皮膚光毒性を示すこと、（ｉｉｉ）赤色領域（６３０ｎｍ）における吸光度が相対的に弱いことに起因して、組織を透過する光の透過の欠如が、ＰＰＤでのＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の現在の臨床的応用を、治療に用いられる光源から４ｍｍ未満の距離に位置する癌組織の破壊に限定すること、といういくつかの不都合な特性もまた有している。従って、より効率的であり、化学的に純粋であり、低毒性であり、光をより劇的に吸収し、かつ赤外線を吸収する増感剤をより局在化する必要性がある。
【０００８】
従来、ポルフィリンのクロリンへの転換に対応するテトラピロール環の一つの化学的還元は、その吸収係数の増加に伴い、赤色よりさらに遠くまで最も長い波長吸収帯を転移させることが知られている。このような特性はＰＤＴ光増感剤の第二世代において研究されており、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）という名称で商品化された５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロキシフェニル）クロリン（ｍ−ＴＨＰＣ）は、この第二世代光増感剤の最も有効なものの一つであることが明らかにされた（非特許文献１０参照）。クロリンのバクテリオクロリンへの転換に対応する、対向するピロール環のさらなる還元は、吸収帯の赤外線領域への転移と、吸収係数の付加的な増加とを導く。しかしながら、バクテリオクロリンは、非常に不安定な化合物であり（非特許文献１０参照）、ＰＤＴ増感剤の研究努力は、クロリンに焦点が置かれている（非特許文献１１参照）ということが、現在まで広く共有されて信じられている。その後、安定なバクテリオクロリンは、実際には合成可能であることが示されている（非特許文献１２参照）。これは、本方法による安定なバクテリオクロリンの合成は不活性な機能性を有するバクテリオクロリンの製造に制限されると主張される論文中で、十分に評価がされていない（非特許文献１３参照）。しかしながら、さらなる機能性を有するバクテリオクロリンが製造されている（特許文献１，２参照）。
【０００９】
ＰＤＴ増感剤としてのバクテリオクロリンの明確な利点、並びにいくつかの自然発生したバクテリオクロリンがインビトロ及びインビボの両方において有効な光増感剤であるという報告（非特許文献１４，１５参照）は、バクテリオクロリンを合成する多くの試みの動機付けとなった。合成バクテリオクロリンは、四酸化オスミウムの隣接ジヒドロキシル化（非特許文献１６参照）、分子内環化（非特許文献１７参照）、ジエノフィルとしてポルフィリンを用いるディールス・アルダー反応（非特許文献１８参照）又はポルフィリンがジエンであるビニルポルフィリンを用いるディールス・アルダー反応（非特許文献１９参照）、１，３−双極性環状付加（非特許文献２０参照）、また、デヒドロジピリンアセタール誘導体の自己縮合によって（非特許文献２１参照）、対応するポルフィリンを誘導体化することで製造される。さらに、バクテリオクロリンを製造するために、Ｗｈｉｔｌｏｃｋによって数十年前に開発された、７，８−１７，１８−ピロリックポルフィリン位置をジイミドで還元することによる古典的な方法がある（非特許文献２２参照）。これは、Ｂｏｎｎｅｔにより用いられた方法であり、Ｆｏｓｃａｎ及び５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロフェニル）バクテリオクロリンを合成する（非特許文献２３）。一方、非常に短期間の集中した研究は、上述した方法に基づく多くの特許を導くバクテリオクロリン誘導体の合成方法を完成した（例えば、特許文献３〜１４参照）。
【００１０】
いくつかの新たに合成されたバクテリオクロリンは、無視できる暗所毒性及び高い腫瘍選択性とを備え、部分的に水溶性であり、７００〜８００ｎｍの範囲における顕著な吸収帯を有している。しかしながら、いくつかの不都合がまだある。即ち、（ｉ）労力を有する精製を含み、複雑で費用のかかる合成方法であること、（ｉｉ）全身投与の場合、結果として有機溶剤に溶解することになり、生体に付加的な化学的負担をかけ、又は賦形剤に結合させることにより処置における費用が高くなるような限られた水溶性であること、（ｉｉｉ）特に、光の存在時に化学的に不安定であること、（ｉｖ）一重項酸素量子収率が低いか又は未知であることである。この第三世代の光増感剤の興味深い典型としては、現在、Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）として知られているパラジウムバクテリオフェオホルビドがあり、これは第ＩＩＩ相臨床研究に承認されている。Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）は、バクテリオクロロフィルから誘導されたものであり、自然発生したバクテリオクロリンの多くは、非常に酸素に敏感であり、結果として、迅速に酸化されて、６６０ｎｍか又はそれ以下で吸収極大を持つクロリンの状態となる。さらに、インビボにおいてバクテリオクロリンを励起するためにレーザが用いられる場合、酸化により、光増感効果を低下させるレーザ光線領域外の光を吸収する新規の発色団を生成するかもしれない。この化合物ファミリーの光化学分解は、ＴＸ−１００／ＰＢＳ中における７７８ｎｍ（１３ｍＷ）の照明で測定され、前記化合物の９０％が、６６０ｎｍでクロリンバンド（chlorin band）の成長に伴い、５分（４Ｊ）で不可逆的に破壊されることが明らかにされた（非特許文献３参照）。
【００１１】
ＰＤＴは、また、皮膚疾患、即ち、光線角化症、細胞癌、ボーエン病（上皮内における扁平上皮細胞癌）、基底細胞癌の治療に対して広範に試験されたが、悪性メラノーマに適用可能な情報はない（非特許文献２４参照）。メラニンは７００ｎｍ以下の波長の組織中への光浸透性を低下させるため、可視光線を用いる場合、メラノーマ組織の高い色素沈着は、ＰＤＴの効率を制限する。また、非腫瘍疾患、例えば、乾癬等に、局所的ＰＤＴを用いることが報告されている。初期の研究では、経皮浸透促進剤を含む液剤中に、ヘマトポルフィリン誘導体（非特許文献２５参照）、及びメソ−テトラフェニルポルフィンスルホン酸四ナトリウム塩（非特許文献２６参照）が用いられた。しかしながら、概して、ＨｐＤ又は他のポルフィリンが、組織を介する拡散を促進することを目的とする賦形剤を含む製剤（例えば、液体、ゲル、クリーム、エマルジョン等）により局所使用される場合、ポルフィリンは、正常な組織液が生じることによって、浸透促進剤の希釈物として維持される傾向がある。このような状況において、ポルフィリンは、もはや組織を介して拡散することができない（又は、たとえ溶液中に残存していても）。それ故、ポルフィリンの局所使用は、しばしば悪性組織に対する特異性の低下に関連し、該使用部位に隣接する正常組織は、ポルフィリンの局所的な集中の結果として、光増感の持続性を発達させる可能性がある。
【００１２】
これらの問題を克服するためには、ポルフィリンを局所使用するよりはむしろ、ポルフィリン自体を光増感剤として使用するのではなく、インビボにおける内因性ポルフィリン、即ちプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の合成を増加させる作用因子として使用することに利点があることが示唆されている（非特許文献２７参照）。５−アミノ−４−オキソペンタン酸、さもなければ５−アミノレブリン酸（又はＡＬＡ）として知られているものは、プロトポルフィリンＩＸの生物学的前駆体であることが知られている。過剰なＡＬＡは、ＰｐＩＸの生物学的な蓄積を引き起こす。前記ＰｐＩＸは、実在の光増感剤である。従って、皮膚腫瘍に局所的にＡＬＡを用いることによって、それから数時間後に該腫瘍を光に暴露し、有益な光治療効果を得ることができるかもしれない（例えば、特許文献３参照）。バシローマ及び扁平上皮細胞癌を覆っている皮膚は、健康な皮膚よりもＡＬＡをより容易に浸透し、かつ、ＰｐＩＸの生合成が皮膚腫瘍に対してより効果的であるので、ＡＬＡの局所使用は、腫瘍中においてＰｐＩＸの産生の選択的促進を引き起こすことが判明した。これは、ＡＬＡ又はその誘導体の皮膚学的な処方の多くに対する根拠となっている。ＡＬＡ又はその誘導体、特に、Ｌｅｖｕｌａｎ（登録商標）及びＭｅｔｖｉｘ（登録商標）は、認可されており、かつ臨床用途に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２００５０１２２１２号明細書
【特許文献２】国際公開第２００６／０５３７０７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／７１６６７１９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／６６２４１８７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／６５６９８４６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００２／６３７６４８３号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第１９９９／５８６４０３５号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第１９９８／５８３１０８８号明細書
【特許文献９】国際公開第９０／１２５７３号
【特許文献１０】国際公開第９４／００１１８号
【特許文献１１】国際公開第９５／３２２０６号
【特許文献１２】国際公開第９６／１３５０４号
【特許文献１３】国際公開第９７／３２８８５号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００６／１９４９６０号明細書
【特許文献１５】米国特許第４５６２０７５号明細書
【特許文献１６】米国特許第４４０５６１６号明細書
【特許文献１７】米国特許第３９８９８１６号明細書
【非特許文献】
【００１４】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、ＡＬＡの使用が技術の顕著な進歩を表す一方、ＡＬＡを用いる光力学的療法は、全く満足のいくものではない。患者は、ＡＬＡ−ＰＤＴにおいて痛みを経験したと繰り返し報告している（非特許文献２８参照）。ＡＬＡは、プロドラッグであり、前記薬物の製造の効率は、対象における生合成によって変化する。非常に限られた量のＰｐＩＸのみを細胞によって生合成することができる。ＰｐＩＸは、製剤処方として不安定となる傾向がある。ＰｐＩＸは、腫瘍又は他の疾患といった、広い範囲の治療を可能にするために、満足のいく効率で全ての腫瘍及び他の組織に浸透することができない。光活性化するための好ましい波長は、約６３５ｎｍであり、１ｃｍ厚のヒト組織のスラブを通過できる入射赤色光（６００〜７００ｎｍ）は、たったの１〜１０％の範囲の間である。そのため、局所使用のために光力学治療薬を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
［Ｉ．Ｂ．発明の要約］
第１の特徴によれば、本発明は、下記式（Ｉ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法を提供する。
【００１７】
前記製造方法は、（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンを、ヒドラジドを用いてクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備える。前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＩ）で表される。
【００１８】
従って、式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（Ｖ）で表されるクロリン誘導体であってもよい。
【００１９】
あるいは、式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（ＶＩ）で表されるバクテリオクロリン誘導体であってもよい。
【００２０】
好ましくは、Ｘ２, Ｘ４, Ｘ６, Ｘ８は、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ）からそれぞれ独立に選択される。
【００２１】
好ましくは、Ｒ５, Ｒ６, Ｒ７, Ｒ８は、Ｈである。
【００２２】
好ましくは、ＹはＨである。
【００２３】
好ましくは、Ｒ１, Ｒ２, Ｒ３, Ｒ４は、−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは、−Ｃｌ，−ＯＨ，−アミノ酸，−ＯＲｎ，−ＮＨＲｎ及び−ＮＲ２ｎからそれぞれ独立に選択され、Ｒｎは、炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である。
【００２４】
さらなる特徴によれば、Ｘ２, Ｘ４, Ｘ６, Ｘ８は、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ）からそれぞれ独立に選択され、
Ｒ５, Ｒ６, Ｒ７, Ｒ８は水素であり、
ＹはＨであり、及び
Ｒ１, Ｒ２, Ｒ３, Ｒ４は、−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは、−Ｃｌ，−ＯＨ，−アミノ酸，−ＯＲｎ，−ＮＨＲｎ及び−ＮＲ２ｎからそれぞれ独立に選択され、Ｒｎは、炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である。
【００２５】
さらなる特徴によれば、本発明は、下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法を提供する。
【００２６】
前記製造方法は、（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンをヒドラジドを用いて、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備える。前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＶ）で表される。
【００２７】
従って、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、下記式（ＶＩＩ）で表されるクロリン誘導体であってもよい。
【００２８】
あるいは、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、下記式（ＶＩＩＩ）で表されるバクテリオクロリン誘導体であってもよい。
【００２９】
さらなる特徴によれば、式（ＩＶ）で表される前記対応する置換ポルフィリンに対して、Ｒ’は−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは−Ｃｌであり、前記製造方法は、さらなる工程を備える。
【００３０】
（ｉｉ）前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に、アミン（Ｈ−ＮＨＲｎ若しくはＨ−ＮＲ２ｎ）、アミノ酸、又はアルコール（Ｈ−ＯＲｎ）（Ｒｎが炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である）を結合し、
クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体（Ｒ’は−ＳＯ２Ｒであり、Ｒはアミノ酸，−ＯＲｎ，−ＮＨＲｎ又は−ＮＲ２ｎであり、Ｒｎは炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である）を提供する。
【００３１】
さらなる特徴によれば、本発明は、
（ａ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体又は、その医薬として許容可能な組成物の誘導体と、
【００３２】
（ｂ）表面浸透促進剤とを備えることを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００３３】
さらなる特徴によれば、本発明は、過剰増殖性組織の検出における下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、またはそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体の使用方法を提供する。
【００３４】
さらなる特徴によれば、本発明は、（ｉ）下記の式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体であって、標的に優先的に結合する誘導体を診断上十分な量で対象に投与する工程と、（ｉｉ）前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が前記標的に結合する十分な時間を与え、前記標的組織と優先的に結合していないクロリン誘導体及びバクテリオクロリン誘導体を非標的組織から洗浄する工程と、（ｉｉｉ）患者体内の式（ＩＩＩ）の化合物を視覚化する工程とを備える、対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法を提供する。
【００３５】
前記視覚化する工程は、患者の身体の少なくとも一部についてＭＲＩ画像を生成することによって達成されてもよい。
【００３６】
または、前記視覚化する工程は、前記化合物が蛍光を発するために十分なエネルギーの光に該化合物を暴露することによって達成されてもよい。
【００３７】
さらなる特徴によれば、本発明は、皮膚癌、又は光線角化症、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、基底細胞癌、乾癬、尋常性座瘡及び酒さから選択される皮膚疾患の治療に用いるための医薬として許容可能な組成物を提供する。前記組成物は、（ｉ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体と、（ｉｉ）かかる式（ＩＩＩ）の化合物の皮内到達又は経皮到達のための医薬として許容可能な担体であって、皮膚に一時的に浸透し、各種の皮膚層を通して該化合物の浸透を促進する皮膚表面浸透促進剤からなる前記担体とを備える。
【００３８】
ここで、
（ａ）前記組成物は、対象に投与される。
（ｂ）クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が、皮膚科的治療の標的の近辺に優先的に位置するのに十分な時間を与えられる。
（ｃ）前記標的は、照射され、前記皮膚癌又は前記皮膚疾患に所望の反応が得られる。
【００３９】
［前記誘導体の製造方法］
好ましくは、前記ヒドラジドは、ｐ−トルエンスルホニルヒドラジド、４−クロロベンゾスルホニルヒドラジド、４，４’−オキシビス（ベンゼンスルホニル）ヒドラジド、ベンゼンスルホニルヒドラジド、４−メトキシベンゼンスルホニルヒドラジド、又は安息香酸ヒドラジドである。
【００４０】
固相反応は、反応物の一つの融点以上の温度を必要とし、それにより他の反応物は、一部が溶解し、又は前記溶解した反応物中に分散する。ヒドラジドとポルフィリン誘導体との間の固相反応のため、該固相反応は、前記ヒドラジドの融点以上の温度で好適に行われる。
【００４１】
好ましくは、前記還元工程は、少なくとも７０℃の温度で行われる。好ましくは、前記還元工程は、少なくとも１００℃の温度で行われる。さらなる特徴によれば、前記還元工程は、７０〜２００℃の範囲の間の温度で行われる。好ましくは、前記還元工程は、少なくとも５分間行われる。
【００４２】
好ましくは、前記還元工程は、真空下又は不活性雰囲気下で行われる。
【００４３】
［医薬組成物］
好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、少なくとも０．０１重量％含む。好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、０．０１〜３０重量％含む。好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、０．０１〜１０重量％含む。好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、０．１〜１重量％含む。
【００４４】
表面浸透促進剤が医薬組成物中に存在する場合、好ましくは、前記組成物は、該表面浸透促進剤を、該組成物の全重量に対し、０．０５〜１０重量％含む。好ましくは、前記組成物は、前記表面浸透促進剤を０．１〜１０重量％含む。好ましくは、このような表面浸透促進剤は、ジメチルスルホキシド及び他のジアルキルスルホキシド、Ｎ−メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、種々のピロリドン誘導体、並びに種々の１−置換アザシクロアルカン−２−オンから選択されてもよい。
【００４５】
好ましくは、グリコールは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール４２５、トリメチレングリコール及びプロピレングリコールモノラウレートから選択されてもよい。
【００４６】
好ましくは、ピロリドン誘導体は、Ｎ−ドデシルピロリジン−３，５−ジオン、Ｎ−ドデシルピロリジン−２−チオン、Ｎ−ドデシル−２−ピロリドン、Ｎ−（２，ヒドロキシエチル）−２−ピロリドン、Ｎ−シクロヘキシル−２−ピロリドン、１−ブチル−３−ドデシル−２−ピロリドン、１，５ジメチル−２−ピロリドン、１−エチル−２−ピロリドン、１−ヘキシル−４−メチルオキシカルボニル−２−ピロリドン、１−ヘキシル−２−ピロリドン、１−（２ヒドロキシエチル）ピロリジノン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、１−ラウリル−４−メチルオキシカルボニル−２−ピロリドン及びＮ−メチル−２−ピロリドンから選択されてもよい。
【００４７】
好ましくは、１−置換アザシクロアルカン−２−オンは、特許文献１５〜１７に開示されたＡｚｏｎｅ（登録商標）について言及される１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オンを含む。
【００４８】
［過剰増殖性組織の検出］
クロリン誘導体及びバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩が、過剰増殖性組織の検出に用いられるときに、好ましい例は、前記過剰増殖性組織は、血管内皮組織、新生血管系組織（新生血管系組織は、目に存在する）、腫瘍の異常血管壁、固形腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、眼腫瘍、消化管腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、非固形腫瘍、造血組織及びリンパ系組織の一つの悪性細胞、血管系における病変、罹患骨髄、及び自己免疫性疾患及び炎症性疾患の一つの病気における異常細胞から選択されてもよい。
【００４９】
［過剰増殖性疾患の治療］
さらなる特徴によれば、本発明は、過剰増殖性疾患の治療に用いる薬剤の製造において、後述するクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を使用する方法を提供する。
【００５０】
クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩が過剰増殖性疾患の治療に用いられるとき、好ましくは、該過剰増殖性疾患は、癌、骨髄腫、乾癬、黄斑変性から選択される。好ましくは、例として、胃癌、腸癌、肺癌、乳癌、子宮癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、非上皮性悪性腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、上顎癌、胆管癌、頭頸部癌、舌癌、脳腫瘍、皮膚癌、悪性甲状腺腫、前立腺癌、結腸直腸癌、耳下腺癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、腎臓癌、白血病及び悪性リンパ細胞腫である。
【００５１】
このような治療は、好ましくは、クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩に、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の吸収帯と一致する波長の光を照射する工程を含む。好ましくは、前記光は、６００〜８００ｎｍの範囲の波長を有する。クロリンが用いられる場合、前記光は、好ましくは、６３０〜６９０ｎｍの範囲の波長を有する。バクテリオクロリンが用いられる場合、前記光は、好ましくは、７２０〜７８０ｎｍの範囲の波長を有する。
【００５２】
好ましい前記光線量は、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの特徴において、好ましい前記光線量は、５０Ｊ／ｃｍ２未満であり、２０Ｊ／ｃｍ２未満であり、１０Ｊ／ｃｍ２未満である。
【００５３】
クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩の好ましい用量は、一日あたり０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩の好ましい用量は、一日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５４】
本発明は、上述の先行技術の観点からなされたものである。特許文献２（特許文献１）に記載された合成方法は、３つのほぼ定量的な工程を備える。（ｉ）フェニル環のクロロスルホン化を経るハロゲン化テトラキスポルフィリンの官能化工程と、（ｉｉ）クロロスルホン酸基と、求核試薬、水、即ちアミン又はアルコールとの反応を経由しての両親媒性化合物を合成する工程と、（ｉｉｉ）無機又は有機の非求核塩基の存在下におけるテトラピロール大員環のヒドラジド誘導体による還元工程とである。しかしながら、特許文献２の図２に示されているように、前記方法によるハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの合成は、類似クロリンの混入と、面倒な分離を必要とする精製とを伴う。本発明の目的は、効率的な、環境に優しく、純粋な大規模合成ができ、安定的、かつ官能基としてフェニル環のオルト位に電子吸引基を持つテトラキスフェニルクロリン及びテトラフェニルバクテリオクロリンを提供することにある。本発明の目的は、また前記クロリン及びバクテリオクロリンの化学的特性、治療特性、これらの分子を用いる治療方法及び医薬組成物、並びにＰＤＴにおけるこれらの有効性の証拠を提供することにある。
【００５５】
ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンは、それをＰＤＴに対する望ましい光増感剤とする上で顕著な特徴を有する。
【００５６】
１）前記フェニル基のオルト位におけるハロゲン原子の存在が、３つの機能を奏する。第１に、制御された「重原子効果」を生じさせることにより、三重項の寿命を犠牲にすることなく増感剤三重項状態の収率を増加させ、そして電子エネルギーを酸素分子に効率的に移動させる能力を有する（非特許文献２９参照）。第２に、電子的効果及び立体効果の両方によって、テトラピロール大員環の還元状態を安定させる。第３に、電荷移動相互作用を通じて酸素分子へのエネルギー移動の速度定数を加速し、一重項酸素、スーパーオキシド及び他の活性酸素種の大きな収量を導く。
【００５７】
２）前記フェニル基のメタ位におけるスルホン酸基の存在は、２つの機能を奏する。第１に、前記増感剤の親水性／親油性を調整する調整手段を提供する。なぜならば、強い疎水性増感剤は、おそらく溶解性の低さ及び細胞膜から他の細胞内区画への移動能力の低さに起因して、低い光毒性を有すると思われる。一方、強い親水性染色剤（dyes）は、腫瘍間質に大部分が局所的に集中し、ＰＤＴ効率を低減するかもしれない（非特許文献３０参照）。第２に、前記スルホン酸基、特に、大きく長い置換基が結合されているスルホン酸基は、前記染色剤のバクテリオクロリン主要部の酸化に対する付加的な立体保護を提供する。
【００５８】
３）前記フェニル基のオルト位のハロゲン原子と、メタ位のスルホン酸基の同時存在は、付加的な機能を奏する。分子モデリング及び実験データは、非対称のフェニル環を有する５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィリンのメソ位の単結合の束縛回転が存在するとき、幾何異性体（アトロプ異性体として知られている）は、ポルフィリン平面に関してオルト位又はメタ位の置換基の位置が異なることに起因する（非特許文献３１参照）。前記アトロプ異性体は、顕著に異なる極性、及び最も長い波長吸収帯の吸収係数を有し、該吸収係数は、一桁近く異なる。特に、４つのスルファモイル置換基を前記ポルフィリン平面の同一側面に有するα４異性体は、最も高い吸収係数を有すると共に、前記アトロプ異性体の最も大きい両親媒性をもつ。
【００５９】
ＰＤＴにおいて、スルホン化クロリン及びスルホン化バクテリオクロリンの幅広い使用は、経済的で、かつ環境に優しい合成方法を必要とし、それは、工業的規模で実施することができる。ポルフィリン前駆体及びヒドラジドのみに基づいて、このような化合物を製造する新規な方法を提供することが、本発明の主要な目的である。ヒドラジドは固相状態で添加され、酸素又は塩基の欠如下に、密閉反応器中で溶融温度以上に加熱される。所望の生成物は、しばらく後に得られる。
【００６０】
また、適切な賦形剤を有する前記スルホン化クロリン又はスルホン化バクテリオクロリンの局所投与に用いるＰＤＴの方法を提供することが、本発明の一つの目的である。光増感剤の局所投与のための賦形剤は、溶液、ゲル、クリーム、エマルジョン、軟膏等を含む、異なる形態をとってもよい。典型的には、このような賦形剤の製剤は、少なくとも一つの表面浸透促進剤を含む。５００ドルトンを超える分子量を有する薬剤は、皮膚に十分に浸透しない（非特許文献３２参照）という、この分野における通念（conventional wisdom）に対して、本発明は、皮膚疾患に対して、前記スルホン化クロリン又はスルホン化バクテリオクロリンの効率的な皮内到達（intradermal delivery）のための製剤を提供する。前記スルホン化クロリン又はスルホン化バクテリオクロリン分子は１ｋＤをわずかに超過する分子量に到達する。
【００６１】
本発明は、例えば、腫瘍のような過剰増殖性組織の治療及び検出のための化合物に関し、光力学的方法を用いる。本発明の化合物はまた、次の疾患の治療に有益である。例えば、乾癬、尋常性座瘡及び酒さ等の皮膚疾患、例えば、機能不全性子宮出血等の婦人科疾患、例えば、コンジロームウイルス等の泌尿器系障害、例えば、再狭窄及び動脈硬化性プラーク等の循環器疾患、細菌又はウイルスの光力学的破壊、体毛除去及び化粧、臓器又は組織の移植後の免疫反応の抑制。
【００６２】
最後に、ハロゲン化スルホン化クロリン又はハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンを用いる過剰増殖性組織の診断方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。これらの化合物は前記組織に優先的に蓄積し、ごく微量の化合物を確実に検出するという診断のために必要な付加的な特性を提供する。これらの化合物は、前記組織が大部分を透過させる赤色光領域及び赤外線領域に、非常に明確な吸収帯を有する。これらの化合物の選択励起は、生体分子が発しない波長で明確な蛍光発光を導く。蛍光発光の検出は、非常に鋭敏な装置によって行うことができ、ナノモル以下の量のハロゲン化スルホン化クロリン又はハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンを生体媒質中において測定することができる。光診断及び光治療のための照射源は、制限されないが、所望の波長領域における集約された光線を選択的に適用することができるので、レーザービームであることが好ましい。前記光線は、診断のために前記化合物を蛍光発光させるため、及び治療のために殺細胞効果を発揮させるために、十分な強さを有している必要がある。さらに、フッ素化スルホン化クロリン又はフッ素化スルホン化バクテリオクロリンが用いられるとき、フッ素ＭＲＩ（磁気共鳴画像）は、身体の小さい領域におけるこれらの化合物の蓄積を検出することができ、そして、身体を形成する間隙に形成される代謝産物を追跡することができる。
【００６３】
本発明は、ここで、図面を参照して、限定されない実施例についてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】６００ｎｍ遮断フィルタを有する５００Ｗハロゲンランプのスペクトル密度、及びクロリン（ドットライン）及びバクテリオクロリン（ダッシュライン）の赤外線吸収スペクトル。
【図２】完全に無溶媒及び無基材であることを特徴とする合成経路において、対応するポルフィリンの還元により得られるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの吸収スペクトル。
【図３】完全に無溶媒及び無基材であることを特徴とする合成経路において、対応するポルフィリンの還元により得られるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの吸収スペクトル。
【図４】Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔのアトロプ異性体の極性のより大きい画分（βα３＋α４）の吸収スペクトルであり、赤外領域の吸光度の増加を示す。前記スペクトルから、７４８ｎｍでεｍａｘ＝１５０，０００Ｍ−１ｃｍ−１に到達すると推定された。
【図５】中性水溶液中（実線）、ｐＨ１とした２時間後（ドットライン）、及び中和後（ダッシュライン）におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の吸収スペクトル。前記スペクトルは、ＨＣｌ水溶液及びＮａＯＨ水溶液を滴下して添加することにより生じた希釈効果についての補正が行われた。
【図６】２８．８ｍＷ（１１０Ｊ）での、７４８ｎｍリンクスダイオードレーザによる６５分間の照射前（左図）及び照射後（右図）における、ＰＢＳ：メタノール（３：２）中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの吸収スペクトルであり、制御された光退色について説明する。
【図７】空気飽和エタノール中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐ又はフェナレノンの３５５ｎｍでの励起に続いて、１２７０ｎｍで得た一重項酸素蛍光強度。リン光強度対レーザ強度の強度依存性の傾きにより、増感剤の一重項酸素量子収率を決定した。
【図８】照射下、８０μＭのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ存在下に得られるＥＰＲスペクトル。上図：ＰＢＳ中における４０ｍＭのＢＭＰＯを有するスペクトルは、ヒドロキシルラジカルを有するＢＭＰＯのスピン付加物のスペクトルに対応する。下図：ＤＭＳＯ中における４０ｍＭのＤＭＰＯを有するスペクトルは、スーパーオキシドを有するＤＭＰＯのスピン付加物のスペクトルに対応する。
【図９】［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃ］＝２０μＭの存在下、様々な光線量に対するＳ９１細胞の生存率（％）。細胞内に取り込まれていない光増感剤は、照射前に取り除かれていない。差し込み図：異なる濃度の増感剤におけるＳ９１細胞の細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの暗所における細胞毒性。
【図１０】１２時間の培養後、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ］＝５μＭの存在下、各種の光線量に対するＭＣＦ７細胞の生存率（％）。細胞内に取り込まれていない光増感剤は、照射前に取り除かれた。差し込み図：異なる濃度の増感剤におけるＭＣＦ細胞の細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの暗所での細胞毒性。効果的な光出力は、０．５３ｍＷ／ｃｍ２であった。
【図１１】投薬から２４時間後に照射したときの、前立腺癌細胞株ＰＣ−３中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の光毒性効果。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光を３０秒又は６０秒の間照射され、対応する光線量は、それぞれ３Ｊ／ｃｍ２及び６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１２】投薬から１８時間後に照射したときの、マウス大腸癌細胞株中の各種のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔ濃度に関して対照群と比較した細胞生存率。細胞内に取り込まれていない光増感剤は照射前に取り除かれた。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光で、６０秒間照射され、対応する光線量は、６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１３】１８時間の培養後、ヒト腺癌細胞株における各種のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ濃度に関して対照群と比較した細胞生存率。細胞内に取り込まれていない光増感剤は照射前に取り除かれた。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光で、６０秒間照射され、対応する光線量は、６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１４】１８時間の培養後、ヒト非小肺癌細胞株における各種のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔ濃度に関して対照群と比較した細胞生存率。細胞内に取り込まれていない光増感剤は照射前に取り除かれた。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光で、６０秒間照射され、対応する光線量は、６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１５】３．２６ｎＭ（実線）及び０．２６ｎＭ（ダッシュライン）のヒト血清濃度におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの蛍光発光であり、これらは検出限界を決定するために用いた。また、基線（ダッシュ−ドットライン）及びガウス曲線（ドットライン）については、低い蛍光強度のより正確な決定をするための最も低い濃度をシミュレートするために用いた。
【図１６】ＤＢＡ／２マウスに対する１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の、肝臓、血液及び脳の各質量で除したＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの蛍光発光。
【図１７】ＤＢＡ／２マウスに対する１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの薬物動態及び生体内分布。種々の組織（血液、腫瘍、心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉、皮膚）における蛍光強度は、それらの各質量により正規化された。
【図１８】ＤＢＡ／２マウスに対する１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の、腫瘍及び血液の各質量で除したＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの蛍光発光。
【図１９】ＣＴ２６腫瘍が埋めこまれ、かつＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔで処理されたＢａｌｂ／Ｃマウス中の腫瘍の体積。太線は、４匹の対照マウスにおける平均的な腫瘍の大きさを示す。これらはＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔが投与されているものの、照射がなされていない。エラーバーは、標準偏差である。細線は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ及び７４８ｎｍにおける１３２Ｊ／ｃｍ２のレーザ光で処理された個々の動物を表す。
【図２０】Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔで処理されたＤＢＡ／２マウスに埋め込まれたＳ９１腫瘍の大きさ。７４８ｎｍで２種のレーザ光線量を用いた。
【図２１】ミニブタの背中に局所的に適用した後３時間におけるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの共焦点蛍光。７４４ｎｍでの多光子励起、全てのノイズ除去、６枚の写真によって構成された蛍光平面画像、８００Ｖ＠検出器、ピンホール＝３７９μｍ。前記光増感剤は、角質層及び上皮の５０μｍを通過して拡散した。
【図２２】共焦点顕微鏡法により得られるミニブタの背中において局所的に適用した後３時間でのＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの吸収スペクトル。各種の線は、異なる部位の試料における測定に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
［ＩＩ．詳細な説明］
［ＩＩ．Ａ．定義］
ここで用いられる「過剰増殖性疾患」は、それらの状態の疾患が、基礎病理として、無秩序又は異常細胞増殖によって引き起こされる過剰な細胞増殖を共有することを意味し、制御されていない血管新生を含む。過剰増殖性疾患の例としては、これに限るものではないが、癌、骨髄腫、乾癬、黄斑変性症を含む疾患である。
【００６６】
ここで用いられる「過剰増殖性組織」は、制御不能に増殖する組織を意味し、腫瘍、及び、抑制することができない血管の増殖、例えば、加齢に関連する黄斑変性症において発見される血管の増殖等を含む。
【００６７】
ここで用いられる「腫瘍」は、新生物を意味し、良性腫瘍及び悪性腫瘍の両方を含む。この用語は特に、固形、又は非固形（例えば、白血病等）のいずれか一方となりうる悪性腫瘍を含む。腫瘍の例としては、胃癌、腸癌、肺癌、乳癌、子宮癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、非上皮性悪性腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、上顎癌、胆管癌、頭頸部癌、舌癌、脳腫瘍、皮膚癌、悪性甲状腺腫、前立腺癌、結腸直腸癌、耳下腺癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、腎臓癌、白血病及び悪性リンパ細胞腫である。
【００６８】
ここで用いられる「伝染性病原体」は、侵入してくる微生物又は寄生生物を意味する。ここで用いられる「微生物」は、ウイルス、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、菌類及び類似する微生物を意味し、「寄生生物」は、感染性の、一般的に微細な若しくは非常に小さい多細胞性の無脊椎動物、又は抗体誘導性のクリアランス（clearance）若しくは溶解又は食作用による破壊の影響を受け易い卵又はその幼形を意味する。
【００６９】
ここで用いられる「医薬品」又は「薬物」は、対象に適切に投与することにより、所望の治療上の効果又は予防効果を誘導することができる化学物質又は化学組成物を意味する。このような化学物質又は化学組成物は、光を吸収して、薬物として作用するためか、又は後で薬物として作用する他の化学物質を活性化するためかのいずれか一方に、それを用いる光増感剤を含むが、それに限定するものではない。
【００７０】
ここで用いられる「医薬として許容可能な組成物誘導体」は、生物学的活性基に結合される光増感剤である組成物を意味し、該活性基は、特定の生物環境において結合、蓄積又は排出を選択的に促進する基である。当技術分野で公知な例は、糖、アミノ酸誘導体、オリゴヌクレオチド、又は受容体（ステロイドホルモン、成長因子、神経伝達物質又は抗体）に固有の配位子から誘導された置換基を含む。前記置換基はまた、前記光増感剤の塩を含む。
【００７１】
ここで用いられる「医薬として許容可能な担体」は、タブレット、ピル、カプセル、クリーム、溶液、懸濁液、又はエマルジョンを形成する任意の溶媒、分散剤、添加剤を含む。これらの医薬組成物の成形方法は、当該技術分野で周知である。
【００７２】
ここで用いられる「表面浸透促進剤」は、例えば、皮膚及び他の組織のような障壁を通過する薬物の運搬を増加又は加速することができる化学物質又は組成物を意味し、ジメチルスルホキシド及び他のジアルキルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、種々のピロリドン誘導体、Ａｚｏｎｅ（登録商標）、又は、文献に記載されている他の任意の皮膚浸透補助剤、或いはそれらの混合物を含む。
【００７３】
ここで用いられる「照射」は、電磁スペクトルの全ての周波数に、対象を暴露することを意味する。好ましくは、照射波長は、前記薬物が吸収する光線の波長に一致するように選択される。
【００７４】
ここで用いられる「Ｌｕｚｉｔｉｎ」は、そのフェニル基におけるオルト位に電子吸引性を有するスルホン化テトラキスフェニルクロリン又はスルホン化テトラキスフェニルバクテリオクロリンを意味する。そして、以下に示す頭字語は、特定の化学物質を意味するが、この分子の一覧（portfolio）の例に限定するものではない。
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＣＬ−ｃは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−クロロ−５−スルホニルフェニル）クロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ−ｃは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）クロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−スルホニルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−クロロ−５−スルホニルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２は、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−スルホニルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−フルオロ−３−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−エチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−ヘプチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ２は、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンである。
【００７５】
また、ここで用いられる頭字語は、
「−Ｃｌ２ＰｈＢ」は、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロフェニル）バクテリオクロリンであり、
「−ＢＭＰＯ」は、５−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドであり、
「−ＤＭＰＯ」は、５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドであり、
「−ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドである。
【００７６】
［ＩＩ．Ｂ．前駆体化合物］
５，１０，１５，２０−テトラキス（ハロゲン化フェニル）ポルフィリン及び５，１０，１５，２０−テトラキス（２−シアノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−トリフルオロメチルフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ニトロフェニル）ポルフィリン、並びに５，１０，１５，２０−テトラキス（２−カルボキシメチルフェニル）ポルフィリンは、１２０℃の酢酸／ニトロベンゼンの混合物中において、ピロールを、所望のハロゲン化フェニルアルデヒドと混合するというニトロベンゼン法によって合成された（非特許文献３３参照）。冷却後、純ポルフィリンは、反応媒体から直接晶出する。全ての特性データ（ＮＭＲ，ＦＡＢ及び微量分析）は、従来のポルフィリンと十分に一致した。
【００７７】
前記ポルフィリンのクロロスルホン化は、以前に開発された方法（非特許文献３４，３５参照）に従って行われた。所要のポルフィリン（２００ｍｇ）及びクロロスルホン酸（１０ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を、５０〜２５０℃の温度で１〜３時間撹拌した。この時間の後、ジクロロメタン（２００ｍｌ）をこの溶液に添加した。撹拌しつつ中和されるまで水抽出を継続的に行った。前記ジクロロメタン溶液を、炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させた。溶離剤としてジクロロメタンを用い、シリカゲルを充填したカラムクロマトグラフィーにより精製し、続いて、溶媒を蒸発させて、紫色の結晶として所望のクロロスルホン化ポルフィリンを得た。
【００７８】
上述したクロロスルホン化ポルフィリンの加水分解は、１００ｍｇの所望の化合物を、蒸留水（１２０ｍｌ）で懸濁し、１２時間還流することにより行われた。得られた溶液を、回転蒸発器によって濃縮し、得られた固体を１２０℃で乾燥した。前記スルホン酸ポルフィリン誘導体が定量的収率で得られた。ＮＭＲ，ＦＡＢ及び微量分析によるその特性は、従来のデータ（非特許文献３４，３５参照）と十分に一致した。
【００７９】
［ＩＩ．Ｃ．装置］
吸光スペクトルは、シマヅ社製ＵＶ−２１００分光光度計又は、これとＣａｒｒｙ ５０ バイオ分光光度計（バリアン社製、マルグレーヴ、米国）を用いて測定した。蛍光スペクトルは、スペックスフルオロログ３分光光度計、波長依存システム（ＲＣＡ Ｃ３１０３４光電子増倍管）のための補正、又はパーキンエルマー社製ＬＳ ５０蛍光光度計を用いて測定された。過渡吸収スペクトルは、アプライドフォトフィジックス社製ＬＫＳ ６０ナノ秒レーザーフラッシュ光分解動力学スペクトロメータにより、励起用のスペクトラ・フィジックス社製Ｑｕａｎｔａ Ｒａｙ ＧＣＲ １３０−０１ Ｎｄ／ＹＡＧレーザの第三高調波、ハママツ社製１Ｐ２８光電子増倍管、及びヒューレット・パッカード社製Ｉｎｆｉｎｉｕｍオシロスコープ（１ＧＳ／ｓ）を用いて測定した。閃光光分解測定は、空気存在下、アルゴン飽和溶液中で行った。光音響熱量測定は、前記Ｎｄ／ＹＡＧレーザと同一のものと、２．２５MHｚ Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ変換器（５６７６型）を有する自家製の正面光聴覚細胞と、テクトロニクス社製ＤＳＡ６０１過渡現象記録装置とを用いた（非特許文献３６参照）。室温一重項酸素リン光は、液体窒素室（プロダクツ・フォー・リサーチ社製、ＰＣ１７６ＴＳＣＥ００５型）で１９３Ｋまで冷却され、用いられたアプライドフォトフィジックス社製スペクトロメータを用い、３５５ｎｍで曝気溶液のレーザ励起を行った後に、ハママツ社製Ｒ５５０９−４２光電子増倍管を用いて１２７０ｎｍで測定された（非特許文献３７参照）。１２７０ｎｍでの一重項酸素の放出はまた、ＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザ（コンティナム社製、商品名：ＳｕｒｅｌｉｔｅＩＩ）によって生成された第三高調波（３５５ｎｍ）の５ナノ秒レーザパルスにより試料の励起に続いて、テクトロニクス社製デジタイジングスコープ（ＴＤＳ ５２０Ｂ）に連結された液体窒素によって冷却されたゲルマニウム検出器（ノースコースト社製）を用いて監視された。
【００８０】
元素分析は、フィソン・インスツルメント社製ＥＡ１１０８ ＣＨＮＳ−Ｏ元素分析計により行った。融点は、電熱キャピラリー融点測定器により測定された。１Ｈ−ＮＭＲ，１９Ｆ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚのＢｒｕｃｋｅｒ−Ａｍｘにより記録された。１Ｈ帰属は、２Ｄ ＣＯＳＹ及びＮＯＥＳＹ実験を用いて行われ、一方、１３Ｃ帰属は、２Ｄ ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ実験により行われた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳデータは、窒素レーザ（λ＝３３７ｎｍ）を備えるアプライドバイオシステムズＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ装置（フラミンガム社製、マサチューセッツ州、米国）を用いて獲得された。
【００８１】
少なくとも一つの不対電子を有する種の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルは、ブルカーＥＳＰ３００スペクトロメータ（ＩＢＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて行われた。標準的な装置の設定は、マイクロ波出力１０ｍＷ、振幅変調０．８G、掃引幅６０．０Ｇである。前記ＥＰＲスペクトルは、ハママツ社製ダイオードレーザによるその場照射の下で記録された。その後の設定は、登録されたスペクトルに対して用いられ、高出力（４ｍＷ）、低振幅変調（０．２Ｇ）及び狭走査範囲（６０Ｇ）、かつ、各スペクトルに対して２０走査が記録された。
【００８２】
インビトロ実験における照射は、ハロゲンランプ又はレーザ光源のいずれか一方を用いて行われた。第１の場合、５００Ｗのハロゲンランプが、照射される台から５０ｃｍの距離に配置され、均一な照射を保証した。冷却水フィルタ（ｄ＝３５ｍｍ）及び６００ｎｍ遮断フィルタが、前記ランプと試料との間に配置された。サンプルに届くフルエンス率は、３ｍＷ／ｃｍ２であった。前記ハロゲンランプの発光スペクトルは、分光放射計ＩＬ２０００（商品名：Ｓｐｅｃｔｏｒｏｃｕｂｅ）を用いて記録した（図１）。第２の場合、パイロットＰＣ５００レーザ制御装置（Ｓａｃｈｅｒ Ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ社製、マールブルク、ドイツ国）で作動する３つのリンクス外部空洞ダイオードレーザＴＥＣ５００が用いられた。レーザエネルギーは、７４８ｎｍレーザに対して４０ｍＷで安定であり、６４９ｎｍレーザに対して１０ｍＷで安定であり、そして６３３ｎｍレーザに対して１０ｍＷで安定であった。前記レーザエネルギーは、コヒーレント社製ＬａｓｅｒＣｈｅｃｋにより定期的に測定された。いくつかのインビトロ実験では、レーザ光は、マイクロベンチにおけるコリメータを介して光ファイバーに集中され、細胞へともたらされる。このシステムは、前記７４８ｎｍレーザ光を３０ｍＷに低下させた。
【００８３】
光退色実験におけるバクテリオクロリンの照射には、７４８ｎｍリンクスダイオードレーザを用いた。動物実験のために、７４８ｎｍで１４０ｍＷ出力の特注のハママツ社製ダイオードレーザ（ＬＡ０８７３，Ｓ／Ｎ Ｍ０７０３０１型）が用いられた。このダイオードレーザは、ソーラボ社の５００ｍＡ ＡＣＣ／ＡＰＣレーザダイオード制御装置及び社内製の電子装置により制御された。本実験に用いられたこのレーザエネルギー及び他の高エネルギーレーザは、オフィール社製ＡＮ／２Ｅ型レーザ出力計により定期的に検査された。
【００８４】
前記光増感剤の時間依存性の細胞取り込み及び細胞の生存能力は、ニコン社製ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＳ−１００Ｆ装置を用いる蛍光顕微鏡検査法によって確認された。
【００８５】
皮膚試料の蛍光は、Ｕ−ＭＳＷＧ２蛍光ミラーユニット（励起フィルタ４８０−５５０ｎｍ，発光フィルタ５９０ｎｍ，二色性フィルタ５７０ｎｍ）を用いるオリンパス社製蛍光マイクロスコピー（ＢＭ５１Ｍ型）により分析された。共焦点顕微鏡法は、６３´水（１．２開口数）アポクロマート対物レンズを備えるレイカＴＣＳ ＳＰ５（レイカマイクロシステムズＣＭＳ ＧｍｂＨ製、マンハイム、ドイツ国）倒立顕微鏡（ＤＭＩ６０００）により行われた。共焦点モードに移る前に、ＧＵＶ懸濁液は、光源としてナトリウムランプとＲｈｏｄ−ＤＯＰＥ蛍光を選択するフィルタとを用いて直接観察され、ＧＵＶ形成の収率を評価した。共焦点顕微鏡法における励振源は、Ａｒ＋レーザからの５１４ｎｍ線又はＴｉ−Ｓａレーザからの７４５ｎｍ線のいずれか一方である。前記発光は、５５０〜８００ｎｍに集中された。聴覚−光学調整可能な繊維、及びレイカＴＣＳ ＳＰＣ５システムのビーム分割器の利点を活用した。逆光は「スマートオフセット」と一致するように最小限にされる。これは常に０．５％以下で残存する（通常−０．１％〜０．１％の範囲の間）。ごく僅かな光子が脂質構造の外側で計測される。０．５ｎｍ以下の厚さの共焦点切片は、検流モータステージを用いて得られる。三次元投影は、レイカアプリケーションスート−高度蛍光ソフトウェアを用いて得られる。
【００８６】
［ＩＩ．Ｄ．方法］
［ＩＩ．Ｄ．１．分散係数］
ｎ−オクタノール：水分散係数（ＣＰ）は、従来の文献により記述されているフラスコ振盪法をわずかに修正したものを用いて測定された（非特許文献３５参照）。前記修正は、約５００ｎｍの吸収帯の励起及び赤色／赤外領域における蛍光の集中に関する。
【００８７】
［ＩＩ．Ｄ．２．光化学及び光物理］
光退色実験は、ＰＢＳ、ＰＢＳ：メタノール（５０：５０）及びメタノール溶液中で行われた。この溶液は、キュベット中で、１ｃｍの光路でかつ前記リンクスダイオードレーザを用いて照射される。前記溶液の初期吸収は、約０．８であった。光退色の機構は、前記ハママツ社製ダイオードレーザを８０ｍＷで用い、前記増感剤の照射によって評価した。前記増感剤は、アスコルビン酸又はアジドの存在するＰＢＳ中において照射された。
【００８８】
エタノール中で決定された蛍光量子収率（ΦF）は、トルエン中のＣｌ２ＰｈＢの蛍光量子収率を基準として得られたものである（非特許文献４参照）。基準及び試料溶液の両方の吸収は、５１５．５ｎｍの励起波長では約０．２で一致している。これらの溶液は、蛍光得る前に、１０倍に希釈した。前記蛍光量子収率は、試料対基準の蛍光帯の比率に、前記基準の蛍光量子収率（非特許文献１２によれば、０．０１２）を乗じ、その後、エタノール及びトルエンの屈折率の違いを補正して得られる。
【００８９】
光増感剤の三重項−三重項吸収スペクトル及び三重項寿命（τT）は、上述の一時吸収スペクトル装置において３５５ｎｍで励起されて測定された。ここで、前記溶液は、０．２５〜０．３０の範囲の吸光度を備えていた。
【００９０】
時間分解された光音響熱量測定（ＰＡＣ）は、上述のように設定され、非特許文献４に記載されている方法を用いてなされた。すべての測定は、エタノール中において、光音響の基準としてマンガン５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィリンを用いて行われた。
【００９１】
エタノール中における一重項量子収率は、非特許文献３７によって記載された方法を用い、基準としてフェナレノンを用いて得た。エタノール中においてフェナレノンにより得られた一重項酸素量子収率の文献値は、ΦΔ＝０．９５であった（非特許文献３８参照）。
【００９２】
［ＩＩ．Ｄ．３．電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）］
ＰＢＳ中で光増感剤が照射されることによって生成される活性酸素種、即ち、スーパーオキシドイオン及びヒドロキシラジカルは、種々のスピントラップの付加物を形成する。このような付加物は、ＥＰＲによって同定することができる。これらの測定に用いられる前記ＰＢＳ緩衝液は、過酸化物の分解を触媒する混入物である金属イオンを除去するため、キレート樹脂（Ｃｈｅｌｅｘ１００）により前処理された。２つのスピントラップは、ＢＭＰＯ及びＤＭＰＯを用いた。ＤＭＰＯは、先ず、活性炭／ベンゼンで精製され、その後、ε２２６＝７２００Ｍ-1ｃｍ−１を用いる分光光度法により、１．０Ｍ保存濃度が決定された。ＥＰＲ測定は、ハママツ社製ダイオードレーザを用いるその場照射により、上述のブルカーのスペクトロメータを用い、室温で行った。
【００９３】
［ＩＩ．Ｄ．４．皮膚浸透試験］
皮膚浸透試験を行うための最も優れた動物モデルは、ミニブタである。これは、ミニブタとヒトとの間の皮膚特性の類似の観点からである（非特許文献３９参照）。クリーム、軟膏、ゲル及び溶液という製剤の違いは、ミニブタの皮膚サンプルを通る前記光増感剤の浸透を促進するために用いられる。製剤は、０．１〜１０％の範囲で変量した前記光増感剤、例えば、Ａｚｏｎｅ（登録商標）及びＤＭＳＯのような浸透促進剤、及び種々の賦形剤等を含有する。インビボ試験は、ミニブタの背中に対して行われた。各試験において、前記製剤は、皮膚の約１ｃｍ２領域に、所望の期間、閉鎖包帯下で適用された。一旦前記期間が経過したら、前記製剤は薬さじで取り除かれ、そしてエタノールが浸漬された医療用綿で、該医療用綿中に前記増感剤が全くみられなくなるまで洗浄された。インビボ試験において、前記皮膚試料は外科的に取り除かれ、前記ミニブタはその後殺処分された。
【００９４】
前記皮膚試料の組織固定のための手順の第１工程は、パラホルムアルデヒド（４％水溶液）への少なくとも２４時間の浸漬である。次に、前記試料を、２５％ショ糖液に移動し、少なくとも４８時間浸漬した。この処理の後、前記皮膚サンプルは、前記ショ糖液よりも密度が高くなる。部分試料は、生検パンチを用いて採取され、ドライアイスで冷凍され、その後、組織Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｔｅｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．社製、ズーテルワウデ、オランダ国）と共に、ホルダーに取り付けられ、そして、低温槽（cryostate）中で、２５〜１００ｍｍの範囲の間で選択された厚さに制御されてスライスされた。前記皮膚スライスは、顕微鏡スライドガラス上に集められ、蛍光顕微鏡検査法及び共焦点顕微鏡法により分析されるまで冷凍保存された。他の方法として、前記皮膚試料は、固定剤としてパラホルムアルデヒドを用いるよりも、ドライアイス中に直接冷凍されてもよい。
【００９５】
［ＩＩ．Ｄ．５． インビトロ実験］
ここで記述される薬物は、インビトロ研究において評価されている。あるインビトロ研究では、いくつかのフィルタを備えるハロゲンランプによる照射が用いられた。他の場合では、各細胞培養に光を届けるダイオードレーザ照射が用いられた。
【００９６】
［ＩＩ．Ｄ．５．ｉ）ハロゲンランプ照射を用いたインビトロ実験］
ハロゲンランプ照射に用いられた細胞株は、ＭＣＦ７（ヒト乳癌由来）、ＳＫＭＥＬ１８８（ヒトメラノーマ由来）、及びＳ９１／Ｉ３（マウスメラノーマ由来）細胞であった。これらは、細胞毒性実験及び光細胞毒性実験の両方に用いられた。ＭＣＦ７細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２５ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、及び２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されて増殖された。ヒトメラノーマ細胞ＳＫＭＥＬ−１８８は、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたＦ１０培地で増殖された。クラウドマンＳ９１メラノーマ細胞のＩ３分株は、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）で補充されたＲＰＭＩ １６４０培地に培養された。全ての細胞株は、６０ｍｍ直径のペトリ皿において単層に培養され、５％ＣＯ２を含む湿雰囲気中、３７℃で保温された。
【００９７】
細胞毒性：細胞代謝効率及び生存能力は、生体吸収（uptake）と、細胞のシクロソーム酵素による臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の不溶性のホルマザン染料への還元とにより決定される。前記細胞株は、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを備えるＲＰＭＩ培地で増殖された。細胞は、５％のＣＯ２、９５％の空気及び１００％の湿度に維持された。細胞毒性を決定するために、これらの細胞は、９６ウェルプレートにおいて、完全培地中に、１×１０４細胞／ウェルの密度で接種された。２４時間後、前記細胞は、異なる濃度（０．２５から最大５０μＭ）の光増感剤と共に、１８時間、３７℃で保温された。前記細胞は、その後ＰＢＳで２回洗浄され、成長培地中で、３７℃の温度で２４時間保温された。次に、前記培地は、１００μｌの新鮮な培地及び２０μｌのＭＴＴで置き換えられ、前記細胞は、０．５ｍｇ／ｍｌの終濃度のＭＴＴと共に３時間保温された。その後、前記培地は、ＤＭＳＯ−メタノール溶液（１：１）に置き換えられ、ブルーホルマザン結晶が溶解された。前記９６ウェル培養プレートは、０．５分間、室温で振盪され、その後直ちにＥＬＩＳＡリーダ（ＧＥＮｉｏｓ Ｐｌｕｓ、Ｔｅｃａｎ Ｔｒａｄｉｎｇ ＡＧ社製、スイス国）を用いて５６０ｎｍで光学密度が読み取られた。生存している前記細胞は、前記ホルマザン塩の吸光度変化によって表され、生存率は、生存処理細胞数対生存無処理細胞数のパーセント比として与えられる。細胞の数は、検量線の直線回帰から決定された。
【００９８】
時間依存性の細胞生体吸収：ＳＫＭＥＬ−１８８、Ｓ９１、及びＭＣＦ７細胞は、９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルとなるように接種され、ＰＢＳ中の２０μＭ濃度のクロリン光増感剤及びバクテリオクロリン光増感剤に、各種の時間間隔（１０分から１８０分まで）で暴露され、時間依存性の薬物蓄積が精査された。保温期間の終わりに、前記細胞は、ＰＢＳで３回洗浄され、ＰＢＳ中において０．２５％のトリトンＸ−１００の１００μｌで再懸濁された。細胞に随伴された光増感剤の保持は、ＥＬＩＳＡリーダを用い、蓄積された光増感剤を蛍光測定することによって検出された。また、前記光増感剤の生体吸収及び前記細胞の生存能力は、蛍光顕微鏡検査法によって確認された。これらの実験により、ＳＫＭＥＬ−１９９，Ｓ９１及びＭＣＦ７細胞は、２０μＭの光増感剤とともに２時間保温され、続いて、前記細胞はＰＢＳで３回洗浄され、ＰＢＳに再懸濁され、蛍光顕微鏡検査法によって試験された。
【００９９】
細胞光増感：ＳＫＭＥＬ−１８８、Ｓ９１及びＭＣＦ７細胞は、上述のように製造された。細胞毒性試験に基づいて、５μＭの濃度の光増感剤が、光増感試験のために選択された。前記細胞は、３７℃で１２時間保温され、その後、０．５３ｍＷ／ｃｍ２のフルエンス率と、０．１〜０．６４Ｊｃｍ２の線量とで照射された。発明者は、光増感剤が、前記フィルタ処理されたハロゲンランプの利用可能なフルエンス率の約１／５のみを用いることを思い出した。前記ＭＴＴ試験は、２４時間照射を行った。その値は、３回の独立した実験から得て、対照細胞を基準とした生存する細胞の百分率として表した。対照細胞は、光増感剤と共に保温せず、照明を行わないことを除いて、同一の手順により操作した。
【０１００】
［ＩＩ．Ｄ．５．ｉｉ）レーザ照射によるインビトロ実験］
レーザ照射を行う細胞株は、ＨＴ−２９（ヒト大腸癌由来）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌由来）、ＳＷ２（ヒト小細胞肺癌由来）、Ａ−５４９（ヒト非小細胞肺癌由来）、Ｓ９１／Ｉ３（マウスメラノーマ）及びＣＴ２６（マウス大腸癌由来）であった。これらは、細胞毒性実験及び光細胞毒性実験の両方に用いられた。ＰＣ−３，ＳＷ２及びＳ９１／Ｉ３細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマアルドリッチ社製、シュテインハイム、ドイツ国）中で培養され、ＨＴ−２９，Ａ−５４９及びＣＴ２６細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ケンブレックスバイオシステムズ社製、ベルビエ、ベルギー国）で培養された。両方の細胞培養培地には、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ケンプレックスバイオシステムズ社製、ベルビエ、ベルギー国）が補充された。ＣＴ２６細胞に用いられる前記ＤＭＥＭ培地はまた、１０ｍＭのＨＥＰＥＳが補充されている。細胞株は７５ｃｍ２フラスコ（オレンジサイエンティフィック社製、ブレン・ラルー、ベルギー国）において、５％ＣＯ２を含む湿雰囲気中、３７℃で維持された。インビトロ研究のため、細胞は８５〜９０％のコンフルエンスで、トリプシン−ヴェルセン−ＥＤＴＡ溶液と分離され、計数され、所望の密度で、平底９６ウェルプレートに接種された。
【０１０１】
細胞生存能力試験：前記実験の最後に、細胞生存能力は、レザズリン還元試験によって評価された（非特許文献４０参照）。簡単に言えば、レザズリン（シグマアルドリッチ社製、シュテインハイム、ドイツ国）保存溶液（ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．１ｍｇ／ｍｌ）は、ＦＢＳ又は抗体を含まない培地で１０％に希釈され、２００μｌが前記ウェル中の細胞に添加された。プレートは、３〜４時間、３７℃で保温された。各ウェルの吸光度値は、マイクロプレートリーダＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ｅｘ（サーモエレクトロンコーポレーション製、ヴァンター、フィンランド国）を用いて５４０ｎｍ及び６３０ｎｍで測定した。
【０１０２】
細胞毒性：細胞は、平底９６ウェルプレート（オレンジサイエンティフィック社製、ブレン・ラルー、ベルギー国）中の１００μｌの培地に接種され、一晩の間付着された。前記光増感剤は０．０１〜１ｍＭの終濃度となるように（１００μｌの培地に希釈し）細胞に添加された。各濃度のものを、４組作製して試験を行った。暗所中、３７℃の保温期間は、試験される細胞株に対する倍増時間を２回とした。保温後、前記細胞生存能力を評価した。並列制御実験において、細胞は、前記薬剤なしで保温された。細胞毒性は、非処理細胞に対する相対的な細胞死を表すことにより定量した（対照細胞の％）。その結果は、用量反応曲線（前記薬物の濃度の関数としての細胞死の％）としてプロットされ、細胞増殖の５０％が抑制される濃度（ＩＣ５０）の決定がなされた。
【０１０３】
細胞光増感：細胞は、１００μｌの培地を有する透明な平底を備えるＤＢファルコンブラック９６ウェルプレート（ＤＢバイオサイエンス−ラボウェア社製、ニュージャージー州、米国）に接種され、一晩の間付着された。前記薬物は、所望の濃度を得るために、細胞（１００μｌ培地に希釈）に添加された。細胞は、前記薬物とともに、暗所に３７℃で所定の期間保温された。この保温期間は、通常、投薬から照射までの間隔（drug-to-light interval）として言及される。保温後、細胞は２００μｌのＰＢＳで１回洗浄され、細胞内に取り込まれていない薬物を除去し、１００μｌの新鮮な培地が添加された。細胞は、上述した前記リンクスダイオードレーザの７４８ｎｍの光を、１００．７ｍＷ／ｃｍ２の出力で照射された（各ウェルに個別に）。前記照射時間は所望の光線量を得るために選択された。２つの平行対象条件が試験された。即ち、細胞は最も高い用量の薬物と共に暗所で保温し照射を行わないことと、細胞は最も高い光線量となるように照射され薬物を用いないことと、である。前記照射後、１００μｌの新鮮な培地が添加された。細胞生存能力は、前記照射後、約２４時間で評価された。
【０１０４】
［ＩＩ．Ｄ．６．インビボ実験］
本研究において用いられたマウスは、２種類である。暗所毒性、生体内分布及び薬物動態研究には、クラクフのヤギェウォ大学の生化学、生物理学及びバイオテクノロジー学部における動物繁殖生産施設からの体重が２０〜３０ｇの体重のＤＢＡ／２マウスが用いられた。前記マウスは、標準実験用食の自由摂食及び摂水が維持された。実験目的のためのこのような動物の使用は、ヤギェウォ大学実験動物倫理委員会による承認を受けている（決定番号３８４／９９）。このようなマウスはまた、ＰＤＴに用いられた。
【０１０５】
他のマウスは、チャールズリバー研究所（バルセロナ）の動物繁殖生産施設からの２０〜２５ｇの重さのＢａｌｂ／Ｃである。前記マウスは、標準実験用食の自由摂食及び摂水が維持された。実験目的のためのこのような動物の使用は、神経科学及び細胞生物学センター（コインブラ）の委員による承認を受けている。
【０１０６】
本研究において用いられる４種のミニブタは、ＩＭＩＤＲＡ（Instituto Madrileno de Investigacion y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario）−アランフエス（マドリード）から得た。これらのミニブタは全て雌であり、６〜８ヶ月齢で、茶斑を有する白色のものであり、平均体重が５６．８ｋｇ（６６．２ｋｇ，５７．１ｋｇ，４３．５ｋｇ，６０．６ｋｇ）であった。これらのミニブタは、ベールデサンタレンの国立動物学駅で受け取り、１．５ｍ２の個別の箱に収容され、豚用の標準的な餌及び水を自由摂食させ、３週間の順応期間を設けた。本研究では、総局の動物の保護と健康（参照番号：０４２０／０００／０００／２００７）によって得られる許可におけるポルトガル倫理指針に従って行った。食餌は、処置前２４時間は停止した。前記ミニブタの背中を、製剤を適用する２４時間前に剃毛した。光増感剤の局所投与は麻酔下で行った。３０分前に行われた前治療は、アザペロン（Ｓｔｒｅｓｎｉｌ（登録商標）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＥＳＴＥＶＥ社製、スペイン国）２ｍｇ／ｋｇの筋中投与＋アトロピン硫酸塩５０ｍｇの皮下投与を行った。ケタミン（Ｃｌｏｒｋｅｔａｍ（登録商標）、ベトキノール社、仏国）を２０ｍｌ／ｋｇ筋中投与することにより、誘導を行った。前記麻酔は、酸素＋３％イソフルレン（Ｉｓｏｆｌｏ（登録商標）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＥＳＴＥＶＥ社製、スペイン国）を２〜３Ｌ／分で自然換気することを用いて、気管挿管することにより維持された。試料は、上述した麻酔下で３匹のミニブタから回収された。２０×２０×１０（長さ、幅、深さ）の大きさの皮膚の部分試料が外科的切開により得られた。前記皮膚試料の回収後、前記ミニブタは、過剰量のチオペンタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ）＋２０ｍｌの７．５％塩化カリウムを用いて殺処分された。４匹目のミニブタは、続いて、３週間の間、ミニブタ用の標準的な餌及び水を自由摂食させた。３週間後、前記光増感剤の局所投与を麻酔下で再び行った。前記ミニブタは、電気ショックにより意識を失わせ、頸部静脈切開により殺処分された。
【０１０７】
［ＩＩ．Ｅ．化合物の特性］
［ＩＩ．Ｅ．１．物理的特性］
背景の項で言及したように、ＰＤＴに関連する薬物の最も重要な物理的かつ化学的特性は、６００〜８００ｎｍ領域における強い吸収、一重項酸素生成の高い効率、化学的安定性、制御された光退色、及び−２〜５の範囲のオクタノール：水の分散係数である。これらの特性は、光治療ウインドウ（window）における所望の光吸収度、細胞毒性種の効率的な光生成、長期的な皮膚光線過敏のような副作用の低減、及び全身又は経皮性投与経路の容易化を満たす。
【０１０８】
化合物の吸光係数を、１〜２０μＭの範囲でいくつかの濃度で測定し、全ての場合において、ランベルト・ベールの法則に従って観察した。また、赤外光における最大吸収（λｍａｘ）波長は、研究した濃度範囲では変化しない。これは、分子間で凝集が生じず、前記分子は、研究された溶媒において、これらの濃度ではほとんどが単量体として存在していることを示す。表１は、典型的な赤色光及び赤外線に対するモル吸収係数（εｍａｘ）及び最大波長を示す。同表はまた、代表的なＬｕｚｉｔｉｎの蛍光量子収率（ΦＦ）を示す。前記蛍光量子収率は、塩素置換基の存在下で減少するこれらの分子を低減する。これは、このような分子に対して予期される重原子効果の特徴である。
【０１０９】
本実験において測定された前記Ｌｕｚｉｔｉｎの三重項−三重項吸収スペクトルは、クロリン及びバクテリオクロリンに対する従来のデータと十分に一致した。全ての三重項減衰は、明らかに単一指数関数的である。少なくとも３０分間窒素をフラッシングすることで製造される脱気溶液中、前記三重項寿命（τT）は、ミリ秒の範囲であり、酸素の非存在下において、光化学的に非効率的であることを示す。代表値を表１に示す。空気飽和エタノールにおける前記三重項寿命は、２００〜３００ナノ秒に落ち込み、対応するポルフィリンの寿命より顕著に短くなる。このような値は、電荷移動相互作用を介する前記増感剤の三重項状態から酸素分子への拡散律速エネルギー移動と一致する。
【０１１０】
曝気エタノール溶液中において測定された全ての一重項酸素発光は、典型的な一重項酸素寿命（τΔ）を有する単一指数関数的減衰によって非常によく表現される。表１の前記ΦΔ値は、上述した工程により得られ、これらの光増感剤を代表する。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
典型的に、Ｌｕｚｉｔｉｎの蛍光量子収率と一重項酸素量子収率との総和は、０．６〜０．８であり、他の工程のために用いられる吸収される光の２０〜４０％である。これらの工程は、時間依存性の光音響熱量測定（ＰＡＣ）及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）により研究された。ＰＡＣは、電子励起状態の減衰における無放射工程（内部転換、項間交差、化学反応）により放出されるエネルギー量を測定する。ＥＰＲは、前記試料中に存在し、不対電子（フリーラジカル）を有する種の量を測定するものであり、該ＰＡＣは、直接レーザ照射下において、光誘起によりスーパーオキシドイオン及び他の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を測定するために行われた。ＰＡＣによって測定された前記エネルギー放出は、ほぼ単位量子収率であるバクテリオクロリン三重項状態の形成と一致し、１０５〜１２５ｋＪ／ｍｏｌの三重項エネルギーであり、これはハロゲン化バクテリオクロリンにおける文献値と一致する（非特許文献１２参照）。ＤＭＰＯ及びＢＭＰＯの存在下におけるＰＢＳ中のＬｕｚｉｔｉｎに対する照射により得られるＥＰＲスペクトルは、スーパーオキシドイオンの存在と、ヒドロキシルラジカルの存在を示す。これと共に、前記ＥＰＲ及びＰＡＣデータは、７４８ｎｍでのこれら光増感剤の照射によるスーパーオキシドイオンの形成、及びこれに続くＬｕｚｉｔｉｎの光毒性に寄与するヒドロキシルラジカルの形成をもたらし、Ｌｕｚｉｔｉｎの光毒性に寄与することを明確に示している。従って、前記増感剤の光毒性は、それらの一重項酸素量子収率から予想される光毒性よりも高く、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の光毒性より既に５倍高くなっている。
【０１１３】
前記化合物の化学的安定性は、光、空気及びｐＨ変化に該化合物を曝すことにより調べられた。最も顕著な前記化学的安定性の低下は、適切な波長の光を曝気溶液に照射することにより生じた。このような状況の中で、前記化合物の光退色は、一次速度に従い、そして入射するレーザ光のエネルギーに比例する。一般に、光退色率はまた、溶液中に存在する水の量により増加することが知られている。ＰＢＳ：メタノール（５０：５０）中のＦｏｓｃａｎ（登録商標）（ｍ−ＴＨＰＣ）の光交換、及び類似バクテリオクロリン（ｍ−ＴＨＰＢ）の光変換が、Ｂｏｎｎｅｔｔにより報告されている（非特許文献４６参照）。アセトン及びトリトン−Ｘ：ＰＢＳ中のＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光変換が、Ｓｃｈｅｒｚにより報告されている（非特許文献３参照）。Ｌｕｚｉｔｉｎの光安定性と、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）及びＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光安定性とを比較するため、表２に、上述した代表的な薬物の半減期（ｔ１／２）を、１００ｍＷのレーザ出力で正規化したＦｏｓｃａｎ（登録商標）及びＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光安定性と共に示す。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
本実施形態におけるバクテリオクロリンの光退色と、ｍ−ＴＨＰＢ又はＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光変換とは区別される。この区別は、長期に亘るレーザ照射後、本実施形態におけるバクテリオクロリンのほとんどは、検出可能な可視吸収を有さない生成物に変換されることに基づくものであり、これは、適切には光退色として表現することができる。一方、ｍ−ＴＨＰＢ又はＴｏｏｋａｄ（登録商標）へのレーザ照射は、同一のレーザ光を吸収しない、対応するクロリンを大量に生成し、これは、より適切には他の染料への光変換と表現することができる。他の染料への光変換とは対照的に、本実施形態におけるバクテリオクロリンの光退色は、皮膚光線過敏をほとんど誘導しないという理由で、利点を有している。
【０１１６】
［ＩＩ．Ｅ．１．生物学的特性］
Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）は、インビトロにおける暗所毒性及びＰＤＴ有効性に対する重要なベンチマークである。非小細胞肺癌細胞株Ｈ１２９９に関する暗所におけるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の毒性は、いくつかのＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）濃度に対して評価され、ＩＣｄａｒｋ５０＝８．０μｇ／ｍｌに対する細胞生存能力は、５０％に低下した（非特許文献４７参照）。マウスの大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ−２６に関するＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の暗所毒性についての類似の研究によれば、ＩＣｄａｒｋ５０≒２０μｇ／ｍｌ（単量体と仮定すれば３０μＭ）であった（非特許文献４８参照）。ヒト腺癌細胞株（ＨＴ２９）は、ＰＤＴにおいて最も広く研究された細胞株の一つである。ＨＴ２９細胞におけるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の濃度依存性の研究によれば、５Ｊ／ｃｍ２のフィルタ処理されたハロゲン光下における５０％致死濃度、ＩＣ５０＝７．５μｇ／ｍｌであった。９０％致死濃度は、ＩＣ９０＝４０μｇ／ｍｌに上昇した（非特許文献４９参照）。６５０ｎｍの色素レーザが１０Ｊ／ｃｍ２のエネルギーを与えるために用いられる場合、同一の細胞株に対し、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）は、より強い細胞毒性ＩＣ５０＝０．８μｇ／ｍｌを示す。しかしながら、この光線量は、ＩＣ９０＞１０μｇ／ｍｌであるのに対し、暗所毒性に限れば、ＩＣｄａｒｋ５０＝１３μｇ／ｍｌに落ち込む（非特許文献５０参照）。Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）とは対照的に、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）の分子構成は周知であり、モル単位におけるＩＣを表すのに都合がいい。これらの単位において、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）の暗所細胞毒性は、ＩＣｄａｒｋ５０＝１９μＭであり、１０Ｊ／ｃｍ２の光線量に対する毒性は、ＩＣ５０＝１．２μＭである。最後に、Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）は、２５Ｊ／ｃｍ２の照射の下、４８μＭの用量で、ＨＴ２９細胞に５０％死亡率を導くことを言及している点で興味深い（特許文献５）。ＩＣ５０及びＩＣ９０の値は、実験の投与形態、保温時間、光フルエンス及び他の条件に依存するが、上述された値は、当業界における最良実施例の指標となる。
【０１１７】
表３は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）及びＦｏｓｃａｎ（登録商標）の暗所毒性と、Ｌｕｚｉｔｉｎの暗所毒性との比較を示す。上述した方法を用い、以下の実施例において、更に詳細に説明する。ハロゲン化スルホン化クロリンの存在下、フィルタ処理されたハロゲン光下における、ある細胞株の５０％致死及び９０％致死に必要とされる光線量を、表４に示す。また、ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンについて対応する光線量を、表５に示す。表６は、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量の下、細胞の９０％致死に必要な各種のＬｕｚｉｔｉｎの濃度に関する光毒性を示す。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
【表６】
【０１２２】
表４〜６は、Ｌｕｚｉｔｉｎの低い暗所毒性及びＬｕｚｉｔｉｎの非常に高い光毒性を示す。表６には、各種の細胞株の細胞の９０％致死に必要なＬｕｚｉｔｉｎ濃度は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）で必要とされる濃度より最大１００倍低く、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）で必要とされる濃度より最大２０倍低い。６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量（本実験条件では、６０秒間照射した）とすることで、暗所においてはごくわずかな細胞毒性しか示さないＬｕｚｉｔｉｎ濃度で研究されたあらゆる細胞株の細胞の１００％を死滅させることができた。
【０１２３】
［ＩＩ．Ｆ．前記化合物及び組成物の使用方法］
Ｌｕｚｉｔｉｎは、臨床状況に応じて、局所的に、経口、静脈内、皮下、腹腔内、直腸、舌下、鼻、目、耳又は吸入用製剤として投与してもよい。前記製剤処方は、選択された投与経路に適するように構成される。前記製剤は、Ｌｕｚｉｔｉｎの他に（個々に、又は互いに組み合わせて）、医薬として許容可能な担体からなる。Ｌｕｚｉｔｉｎは、対応する塩、エステル、エノールエーテル若しくはエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、酸、塩基、溶媒、水和物、又は製剤に先立つプロドラッグとして誘導体化されてもよい。
【０１２４】
局所投与又は全身投与、またはその両方に続いて、治療領域は、適切な波長の光に暴露される。前記波長は、好ましくは、クロリンに対しては６３０〜６９０ｎｍの範囲、バクテリオクロリンに対しては７２０〜７８０ｎｍの範囲である。最も好ましくは、レーザを用いて暴露させる。身体の様々な領域に照射するための方法は、当技術分野において周知である。投薬から照射までの間隔は、投与の形態に依存し、数分から数日の間としてもよい。光線量は、投与経路、光源及び治療標的に依存する。連続的なレーザ照射の間、２〜２００ｍＷ／ｃｍ２の範囲のレーザ出力で、前記光線量は１０〜２５０Ｊ／ｃｍ２の範囲とすべきである。０．００１〜１０ｍＪ／ｃｍ２の範囲のパルス当たりのエネルギーであるパルスレーザ照射を用いてもよい。前記光線量は、単回又は複数回のセッションに適用してもよい。診断を目的とする場合には、前記光線量は少なくしてもよい。広帯域光源を前記照射に用いる場合、前記光線量は、前記Ｌｕｚｉｔｉｎが吸収するスペクトル領域における光源のエネルギーを維持するために、レーザ照射に関して規定された水準に増加される。
【０１２５】
前記Ｌｕｚｉｔｉｎは、単回投与されてもよく、又は時間間隔毎に、より少量の用量を、複数回に分割して投与してもよい。Ｌｕｚｉｔｉｎは、相乗効果を得るために、他の薬剤と同時に投与されてもよい。前記投薬から照射までの間隔の後に照射される光線量は、単回線量に対して、上述した範囲に入る。治療は、様々な時間間隔で複数回繰り返してもよい。治療の正確な用量及び持続時間は、治療される疾患に依存し、当業界において周知の手順を用いて実験的に決定されてもよいと理解される。
【０１２６】
［ＩＩ．Ｆ．１．全身投与（経口、注射、エアロゾル、経腸）］
経口投与に関連する共通の制限は、胃の中で見られる酸性条件下における前記薬剤の推定消化力である。以下の実施例において示すように、Ｌｕｚｉｔｉｎは、ｐＨ１で３時間の間、比較的安定である。低ｐＨで観察されるスペクトル変化は、ピロール環のプロトン化に起因するが、酸性度が中和されるときに元の状態に回復する。経口投与において頻発に遭遇する他の問題点は、生体利用効率についてである。腸内吸収では、Ｌｕｚｉｔｉｎを、リピンスキーのルールオブファイブを満たすように近づけることができる（非特許文献５１参照）。Ｌｕｚｉｔｉｎは、ｌｏｇKOW＜５であり、４個の水素結合供与体と、１２個の水素結合受容体と、１ｋＤの分子量とを有する。この最後のパラメータのみ、前記ルールの制限を著しく超えている。
【０１２７】
Ｌｕｚｉｔｉｎの物理的化学的特性を考慮すると、固体、半固体及び液体のいずれの投薬形態も考えられる。この点について、種々の薬の剤形及び投与形態における製剤補助剤の観点から最新技術を考慮すべきである。
【０１２８】
全身投与における投薬から照射までの間隔は、投与形態により、好ましくは、数分間から３日間の範囲である。医薬組成物は、一日あたりの用量を、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲のＬｕｚｉｔｉｎ（又はＬｕｚｉｔｉｎの組み合わせ）とすべきある。好ましくは、Ｌｕｚｉｔｉｎの一日あたりの用量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【０１２９】
［ＩＩ．Ｆ．２．局所投与］
局所投与は、液体、ゲル、ヒドロゲル、クリーム軟膏、スプレー又は他の許容可能な皮膚製剤の形態で、一つ又は様々な表面浸透促進剤及び他の添加剤を含む適切な製剤により達成することができる。背景技術で述べたように、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）又は他の大分子量光増感剤において達成された皮膚浸透は、皮膚疾患の効果的なＰＤＴに対しては不十分である。また、Ｌｕｚｉｔｉｎは、優れた皮内到達させるための基準のほとんどを満たすことができない（非特許文献３２参照）。しかしながら、両親媒性及び水素結合能力と、所定の範囲の分子量とを調整する本実施例の化合物の能力は、該化合物の真皮への受動拡散を促進する製剤を得るための作業を容易にする。実施例２１において示されるゲル形態は、製造早さ、及び皮膚への効率的な局所的運搬を示す。
【０１３０】
局所投与における投薬から照射までの好ましい間隔は、１５分から３時間である。前記製剤は、０．０１〜１０％のＬｕｚｉｔｉｎを含むべきである。好ましい実施形態では、前記製剤中の増感剤の割合は、０．１〜１％である。
【０１３１】
局所投与は、目への適用もまた考慮される。目への使用を意図する適用には、０．０１〜１０％の等張液であって、ｐＨ５〜７であって、適切な塩を有するものとして製剤されてもよい。
【実施例】
【０１３２】
［実施例１］電子吸引性置換基を有するバクテリオクロリンの固体状態合成法
本実施例は、無溶媒、かつ無基剤であって、従って、ポルフィリン及びヒドラジド（ともに固体）のみを出発物質として用いて合成することができる広範なバクテリオクロリンについて説明する。
【０１３３】
一つの製造方法として、６０ｍｇ（６．８×１０−５ｍｏｌ）の５，１０，１５，２０−テトラキス（２−トリフルオロメチルフェニル）ポルフィリンと、５００ｍｇ（２．７×１０−３ｍｏｌ）のｐ−トルエンスルホニルヒドラジドとを、両方とも細かい粉末状のものを混合した。これを反応器に添加した。前記反応器を真空にし、Ｎ２雰囲気下密封し、１００℃以上の温度で数分間加熱した。冷却後（室温）、固体を除去し、ｐ−トルエンスルホニルヒドラジドの一部の２５０ｍｇ（１．４×１０−３ｍｏｌ）を、ポルフィリンソーレー帯が完全に消失するまで添加した。バクテリオクロリンを、少量の有機溶媒により抽出した。過剰なヒドラジドを、溶離液としてジクロロメタン／ｎ−ヘキサンを用いて、シリカゲルを用い短いろ過器（カラム長８ｃｍ、カラム内径２．５ｃｍ）により除去した。溶媒蒸発し、ジエチルエーテル／ペンタンからの再結晶の後に、クロリンの混入が５％未満の９０％ＣＦ３ＰｈＢを得た。
【０１３４】
単離精製物のＮＭＲデータは、以下の通りである。
1H NMR: (400,13 MHz, CDCl3) δ, ppm: 7.47-7.45 (m, 4H); 7.26- 7.20 (m, 8H); 7.15-7.12 (m, 4H); 2.42 (s, 4H); 2.37 (s, 4H); -1.27 (s, 2H)。
【０１３５】
［実施例２］ハロゲン化クロリンの固体状態合成法
５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロフェニル−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）クロリン、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ−ｃの一製造方法として、５０ｍｇ（４．７２×１０−５ｍｏｌ）の５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロフェニル−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）ポルフィリンと、１８ｍｇ（９．４４×１０−５ｍｏｌ）のｐ−トルエンスルホニルヒドラジドとを混合した。反応器を真空にし、Ｎ２雰囲気下で密封し、１００℃以上の温度で数分間加熱した。冷却後（室温）、少量の有機溶媒を用いて固体を除去し、過剰なヒドラジドを、酢酸エチル／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルを用いる短いろ過器により除去した。約１０％のバクテリオクロリンが混入したクロリンの混合物を得た。前記クロリン及びバクテリオクロリンの混合物を、ジクロロメタンで溶解し、空気の存在下、５０℃の温度で加熱することにより、対応するクロリンに酸化した。
【０１３６】
ジエチルエーテル／ペンタンからの再結晶により、バクテリオクロリンの混入が１％未満である９０％Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ−ｃを得た。図２に、最終生成物の吸収スペクトルを示す。
【０１３７】
［実施例３］ハロゲン化バクテリオクロリンの固体状態合成法
本実施例は、ハロゲン化両親媒性バクテリオクロリンの無溶媒、ワンポット合成を含む、汚染が無く、簡易で、経済的で、環境に優しい合成方法である。
【０１３８】
適切なポルフィリン（固体）及びｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（固体）を、摩砕し、微細な粉末とし、十分に混合する。次に、前記混合物を反応器に導入し、高真空にする。反応器は、その後密封し、真空下を維持し、又は不活性ガスで繰り返し洗浄する。最後に、反応器を密封した状態で、１〜３４０分の範囲の時間、加熱（７０〜２００℃の範囲の温度）する。いったん反応が完了し、反応器が室温になると、対応するバクテリオクロリンが９０％の収率で得られる。シリカゲルカラムを用いる短いろ過器でろ過した後に、対応するクロリンの混入が５％未満であるバクテリオクロリンを得ることができる。
【０１３９】
本方法を用い、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−エチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリン、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの一製造方法として、５０ｍｇ（３．８×１０−５ｍｏｌ）の５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−スルホエチルフェニル）ポルフィリンと、１８８ｍｇ（１０−３ｍｏｌ）のｐ−トルエンスルホニルヒドラジドとを混合し、エドワードポンプを用いて反応器を真空にして、密封し、その後、反応器を７０℃以上の温度で数分間加熱した。冷却後（室温）、少量のジエチルエーテルを用いて固体を除去し、過剰なヒドラジドを、酢酸エチル／ジエチルエーテルを溶離液とするシリカゲルを用いる短いろ過器（カラム長４ｃｍ、カラム内径２．５ｃｍ）により除去した。溶媒蒸発後、ジエチルエーテル／ペンタンからの再結晶により、結果として固体を得ることができ、９０％の収率でＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔを得た。図３の吸収スペクトルによれば、対応するクロリンの存在が５％未満であることが明らかである。試料中にときどき現れるクロリンの量を補正した前記クロリン及び他のバクテリオクロリンのモル吸収係数を、表１に示す。図３以下のスペクトルと、特許文献１のスペクトル、またコインブラ大学のスペクトルとを比較すると、クロリン混入物が、今般の新合成法によれば、少なくとも１０の因子において減少しており、より効率的で、労力が少なく、環境に優しい方法であることが明らかである。単離精製物のＮＭＲ及びＭＳデータを以下に示す。
1H NMR: (300 MHz, CDCl3) δ, ppm: 8,42 (d, J = 8,55 Hz , 4H, p-H); 7,88 (d, J = 8,55 Hz, 4H, m-H); 7,84- 7,82 (m, 4H, β-H);5,01(m, 4H, N-H); 3,91(s, 8H, β-H); 3,22 (m, 8H, CH2 ); 1,24 (t, 12H, J = 6,73 Hz, CH3 ); -1,29 (s, 2H, NH).
MS: (MALDI-TOF), m/z: 1322,0 [M]+。
【０１４０】
［実施例４］ハロゲン化バクテリオクロリンにおけるアトロプ異性体
本実施例は、ハロゲン化され、かつスルホン化されたバクテリオクロリン中に存在し、容易に分離することができる安定なアトロプ異性体について示す。また、赤外領域で、より高い減衰係数を有する極性のより高いアトロプ異性体についても示す。
【０１４１】
第１溶離液として酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（１：１）を用い、最終の溶離液として酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（３：１）を用いると共に、長いカラム（カラム長８ｃｍ、カラム内径２．５ｃｍ）を用いることを除いて、実施例３に記載の方法を用い、２つの画分中の５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−エチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリン，Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの分離を観察した。各画分は、ＴＣＬにおいて２つのスポットを示し、これは、極性のより小さいアトロプ異性体αβαβ＋α２β２の混合物又は極性のより高いアトロプ異性体βα３＋α４の混合物として同定された。図４は、より高い極性を有するアトロプ異性体の混合物の吸収スペクトルを示す。この画分は、７５０ｎｍ帯で、εの強度が５０％増して１５０，０００Ｍ−１ｃｍ−１に到達することを示す。
【０１４２】
［実施例５］ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンのｐＨ安定性
本実施例は、ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの、胃の中でみられる酸性条件であるｐＨ１及び３７℃における安定性を示す。
【０１４３】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２を、中性水溶液に溶解し、３７℃で平衡化したところ、図５に示す吸収スペクトルを得た。水溶液中にＨＣｌを滴下し、ｐＨを１より小さくし、２時間後、ｐＨ１におけるＬｕｚｉｔｉｎ-Ｃｌ２の吸収スペクトルを記録した。その後、ＮａＯＨの水溶液を添加して該溶液を中和し、新たな吸収スペクトルを３時間後に記録した。図５は、ＨＣｌ及びＮａＯＨの水溶液の添加によりなされた希釈に対して補正された吸収スペクトルを示す。低いｐＨで観察されたスペクトル変化は、ピロール環のプロトン化によるものであるが、酸性度が中和されると回復する。これらの条件下において、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の半分近くは、回復し、他の半分は、対応するクロリンへと変換された。
【０１４４】
［実施例６］ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの光安定性
本実施例は、赤外光照射に対するハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの増加された安定性を示す。それは、他のバクテリオクロリン、例えば、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロキシフェニル）バクテリオクロリン等の合成バクテリオクロリン又は、例えば、Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）等の自然発生生成物から誘導されたバクテリオクロリンにおいて見られる不安定性の問題を解決する。
【０１４５】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔを、ＰＢＳ：メタノール（２：３）に溶解し、１ｃｍ石英セルに移動し、その吸収スペクトルを記録した（図６）。前記石英セルを、その後、該石英セルのウインドウと一致するビーム直径を有するように予め非集束させたリンクスダイオードレーザによる７４８ｎｍのビーム中に配置した。これらの条件下において測定されたレーザ出力は、２８．８ｍＷであった。５分ごとに、照射を中断し、新たな吸収スペクトルを記録した。この手順は、６５分間続けられた。光退色は、実験のタイムウインドウ（time window）における一次反応の反応速度論に従う。図６は、照射後の吸収スペクトルもまた示す。７４３ｎｍにおけるバクテリオクロリンピークは、吸光度が１．１２８から０．３３７に低下した一方、クロリンの吸光度は、０．１１４から０．１５１にわずかながら上昇した。これらの波長における化合物のモル吸収係数を考慮すると、前記バクテリオクロリンの７０％は前記照射の間に破壊されている。一方、数％ながらクロリンの形成がなされていることが明らかである。残りの生成物は、可視光線／赤外線領域中においてよく分解されるスペクトルはないが、主要な光崩壊過程は、光退色として説明できる。
【０１４６】
光退色の半減期は、異なるレーザ強度に対して測定され、レーザ出力に比例することが示された。７４８ｎｍにおける１００ｍＷレーザ照射で正規化された他のバクテリオクロリンの半減期を、同一の光強度で正規化されたＦｏｓｃａｎ（登録商標）及びＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光崩壊の文献値と共に、表１に示す。光増感剤のＰＢＳ溶液が、アルゴンで飽和され、溶液中の酸素濃度が低下している場合、３０の因子によってＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃの半減期が増加することが観察された。これは、光退色にＲＯＳが関与していることを示す。
【０１４７】
［実施例７］
一重項酸素の効率的な光生成
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎ、適切な波長の光、及び溶液中の溶存酸素分子の存在下における一重項酸素の効率的な生成について説明する。
【０１４８】
３５５ｎｍにおいて約０．２の吸光度を有するエタノール中におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐの空気飽和溶液は、１ｃｍ石英キュベット中において、Ｎｄ：ＹＡＧレーザパルスによって励起され、一重項酸素発光が、上述した装置及び方法を用い、１２７０ｎｍで続いて起きる。前記一重項酸素リン光の強度を、レーザ強度の関数として観察した。同様の観察を、エタノール中のフェナレンオンに対し、３５５ｎｍにおけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐの吸光度に対応する濃度にして行った。図７は、空気飽和エタノール中において、３５５ｎｍにおけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐ又はフェナレンオン励起の後、１２７０ｎｍで測定した一重項酸素リン光強度のレーザエネルギー依存性を示す。種々のレーザエネルギーを用い、一重項酸素発光のエネルギー依存性の傾き及び前記エタノール中のフェナレンオンに対するΦΔ＝０．９５の値から、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐに対するΦΔ＝０．７８を得た。他のバクテリオクロリンに対する値を、表１に示す。
【０１４９】
一重項酸素生成の量子収率が約７０％であることに関連するバクテリオクロリンの光安定性は、連続照射下におけるバクテリオクロリンの分子が、光退色の前に、大量の電子的に励起された酸素分子を局所的に生成することを示唆する。増感剤によって吸収されるエネルギーの約３０％は、他の工程において失われる。前記他の工程のいくつかは、以下の実施例において同定された。
【０１５０】
［実施例８］
本実施例は、増感剤としてＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを用いる、活性酸素種、即ち、スーパーオキシドイオン及びヒドロキシルラジカルの生成について記載する。
【０１５１】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌによるスーパーオキシドイオン及びヒドロキシルラジカルの光生成を評価するため、３０〜８０μＭのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ及び４０ｍＭのＢＭＰＯの存在下におけるＥＰＲスペクトルを、以下の条件において測定した。
ａ）暗所中における空気飽和水溶液。
ｂ）ハママツ社製ダイオードレーザにより８分間照射された窒素飽和水溶液。
ｃ）ハママツ社製ダイオードレーザにより４分間照射された空気飽和水溶液。
ｄ）ハママツ社製ダイオードレーザにより８分間照射された空気飽和水溶液。
ｅ）ハママツ社製ダイオードレーザにより１６分間照射された空気飽和水溶液。
ｆ）スーパーオキシドジスムターゼ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下、ハママツ社製ダイオードレーザにより１６分間照射された空気飽和水溶液。
ｇ）カタラーゼ（３０μｇ／ｍｌ）の存在下、ハママツ社製ダイオードレーザにより１６分間照射された空気飽和水溶液。
【０１５２】
実験条件（ａ）及び（ｂ）下では、ＲＯＳ−ＢＭＰＯ付加物は、検出されなかった。しかしながら、実験条件（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）下では、ＢＭＰＯ及びヒドロキシラジカルの間で形成されたＢＭＰＯ付加物が検出された（図８）。光の存在は、このような付加物の形成に必要不可欠である。実験条件（ｆ）は、スーパーオキシドイオンの捕捉剤として知られるスーパーオキシドジスムターゼがＢＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル付加物の形成を抑制することを意味する兆候（signal）がなかった。また、実験条件（ｇ）もまた前記兆候がなく、過酸化水素を破壊し、水と酸素分子にするカタラーゼもまたＢＭＰＯ−ヒドロキシラジカル付加物の形成を抑制することが明らかである。これらの結果は、ヒドロキシラジカルは、光増感剤及び酸素分子から直接形成されるのではなく、むしろ二次生成物であることを意味する。スーパーオキシドジスムターゼによって観察された抑制は、スーパーオキシドイオンの形成に対する有力な証拠である。カタラーゼによって観察された抑制は、過酸化水素もまたヒドロキシラジカルの前駆体であることを示唆する。
【０１５３】
同様の実験を、ＤＭＳＯ中におけるＤＭＰＯに対して行った。空気及び光の存在下、ＤＭＰＯ−スーパーオキシド付加物が検出された（図８）。しかしながら、空気若しくは光がない場合、又はスーパーオキシドジスムターゼの存在下では、前記付加物は観察されなかった。
【０１５４】
総合すれば、これらのデータは、スーパーオキシドイオンの形成、後述の過酸化水素の形成、及びその後に続くヒドロキシラジカルの形成を示唆している。これらの全ては、細胞に傷害を与える能力を有する活性酸素種であることを十分に裏付けしている。これらのＲＯＳは、バクテリオクロリンの一重項酸素形成効率の約７０％を補完しており、そして、増感剤によって吸収されたエネルギーの残りの３０％は、失われるのではなく、むしろ一重項酸素に加えて他の細胞毒性種の形成に用いられることを示している。
【０１５５】
［実施例９］標準的なランプ照射下におけるマウスメラノーマ細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、フィルタ処理されたハロゲン光照射下での、マウスメラノーマ細胞に非常に強い毒性を有する濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１５６】
照射前に、培養後の細胞に対し細胞内に取り込まれていない光増感剤を取り除くための洗浄を行わなかったことを除き、上述した物質及び方法によって、Ｓ９１（マウスメラノーマ）細胞株中におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの暗所における細胞毒性、及び光増感活性を測定した。図９における差し込み図は、培養時間１２０分におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの異なる濃度の暗所における細胞毒性を示す。図９は、細胞が［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃ］＝２０μＭの存在下において照射されたときの、異なる光線量（light dose）に対するＳ９１細胞の生存率を示す。培養中の細胞の９０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ９０）、又は培養中の細胞の５０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ５０）を、表３に示す。
【０１５７】
［実施例１０］標準的なランプ照射下におけるマウスメラノーマ細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、フィルタ処理されたハロゲン光照射下での、ヒト乳癌細胞に非常に強い毒性を有する濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１５８】
上述した物質及び方法によって、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの暗所における細胞毒性及び光増感活性を測定した。図１０における差し込み図は、培養時間１２時間におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの異なる濃度の暗所における細胞毒性を示す。図１０は、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ］＝５μＭ及び各種の光線量に対するＭＣＦ７細胞の生存率を示す。培養中の細胞の９０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ９０）、又は培養中の細胞の５０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ５０）を、表４に示す。
【０１５９】
［実施例１１］レーザ照射下におけるヒト前立腺癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２のインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下においてヒト前立腺癌細胞に対して非常に強い毒性を示す濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６０】
上述した物質及び方法によって、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の暗所における細胞毒性を測定した。これらの実験によれば、０．０５ｍＭがＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して、相対的に全く影響を与えない。これを、以下の光毒性研究における基準濃度とする。
【０１６１】
ＰＣ−３細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の光増感活性を、上述した物質及び方法を用いて測定した。図１１は、この光増感剤の各種の濃度に対する、３Ｊ／ｃｍ２及び６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び２４時間の培養時間における生存率を示す。図１１によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２］＝２０μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。
【０１６２】
［実施例１２］レーザ照射下におけるマウス大腸癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下での、マウス大腸癌細胞に対して非常に強い毒性を有する濃度において、その暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６３】
ＣＴ２６（マウス大腸癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの暗所における細胞毒性は、細胞毒性がＩＣ５０の水準に到達する前に、培地中においてこの化合物が沈殿してしまうので、ＩＣ５０に関して測定できなかった。５０μＭの濃度がＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して相対的に全く影響を与えない。
【０１６４】
ＣＴ２６細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの光増感活性を、上述した物質及び方法を用いて測定した。図１２は、この光増感剤の各種の濃度に対する、６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び１８時間の培養時間における生存率を示す。図１２は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔが５μＭの濃度のときに、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることで９０％の細胞を死滅させる（ＬＤ９０＝５μＭ）ことを示している。図１２によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２］＝１０μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。表６は、２８．５ｍＷでの６Ｊ／ｃｍ２のレーザ照射下、様々な他の細胞株においてＬＤ９０に到達するのに必要とされるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔ濃度を示す。
【０１６５】
［実施例１３］レーザ照射下におけるヒト大腸癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下での、ヒト大腸癌細胞に対して非常に強い毒性を有する濃度において、その暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６６】
ＨＴ−２９（ヒト結腸線癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの暗所における細胞毒性は、細胞毒性がＩＣ５０の水準に到達する前に、培地中においてこの化合物が沈殿してしまうので、ＩＣ５０に関して測定できなかった。５０μＭの濃度がＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して相対的に全く影響を与えない。
【０１６７】
ＨＴ−２９細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの光増感活性を、上述した物質及び方法を用いて測定した。図１３は、この光増感剤の各種の濃度に対する、６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び１８時間の培養時間における生存率を示す。図１３は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔが０．５μＭの濃度であるときに、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることで９０％の細胞を死滅させる（ＬＤ９０＝１μＭ）ことを示している。図１３によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ］＝１μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。表６は、２８．５ｍＷでの６Ｊ／ｃｍ２のレーザ照射下、様々な他の細胞株においてＬＤ９０に到達するのに必要とされるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ濃度を示す。
【０１６８】
［実施例１４］レーザ照射下におけるヒト非小細胞肺癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下での、ヒト非小細胞肺癌細胞に非常に強い毒性を有する濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６９】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２ＭｅｔのＡ−５４９（ヒト非小細胞肺癌）細胞株に対する暗所における細胞毒性は、細胞毒性がＩＣ５０の水準に到達する前に、培地中においてこの化合物が沈殿してしまうので、ＩＣ５０に関して、測定することができなかった。５０μＭの濃度がＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔの最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して相対的に全く影響を与えない。
【０１７０】
図１４は、この光増感剤の各種の濃度に対する、６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び１８時間の培養時間における生存率を示す。図１４は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔが０．５μＭの濃度であるときに、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることで９０％の細胞を死滅させる（ＬＤ９０＝０．５μＭ）ことを示している。図１４によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔ］＝０．５μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。表６は、２８．５ｍＷでの６Ｊ／ｃｍ２のレーザ照射下、様々な他の細胞株においてＬＤ９０に到達するのに必要とされるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔ濃度を示す。
【０１７１】
［実施例１５］蛍光検出限界
本実施例は、生物学的試料における極限感度及びＬｕｚｉｔｉｎの検出の選択性を示す。
【０１７２】
エタノールに溶解されたＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔ１％原液のヒト血清への希釈によって製造された異なる濃度の溶液。前記濃度の範囲は、０．２ｎＭ〜１０ｎＭである。前記試料を、励起及び発光のためのスリット４：５：３を用い、上述した蛍光光度計により５１４ｎｍで励起した。図１５に示すように、前記発光は赤外領域において得られた。
【０１７３】
前記検出限界は、以下の式を用いて決定された。
【０１７４】
（式中、Ｓｙ／ｘは、検量線の標準偏差であり、ｂはその傾きである。検出限界は、０．１７ｎＭ（又は０．２ｎｇ／ｇ）であった。
【０１７５】
［実施例１６］暗所におけるインビボ毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、市販の光増感剤を用いるＰＤＴ用に認可された濃度よりも高い濃度であっても、マウスに対して毒性を有さないことを示す。
【０１７６】
前記マウスを、以下の実験群に分割した。
ａ）２ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｂ）５ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｃ）１０ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｄ）１５ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｅ）２０ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｆ）何も投与されていないマウス１０匹、そして、これらのマウスを対照群とした。
【０１７７】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの溶液（０．５ｍｌ）を皮下投与し、該投与されたマウスを３０日間よく観察した。投与後、最初の６日間は、群（ｅ）のマウスは、光に対して過敏であることが明らかであり、群（ｄ）のうち何匹かのマウスは、軽度の過敏であることが明らかであった。動物は、直接に指向される光源から遠ざかることにより過敏性を示す。これらのマウスは、定期的に体重測定されたが、いずれのマウスにも有意な体重変化はみられなかった。３０日後、前記マウスを、モルビタール（Morbital）（バイオウェット社製、ポーランド国）を用いて麻酔をかけ、それらの臓器及び組織試料を摘出し、選択された臓器について、血液形態学的試験と同様に組織学的試験を行った。血液及び組織において、変化は観察されなかった。
【０１７８】
これらの暗所毒性分析において用いた用量は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の使用において推奨される用量より１０倍高く、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）を用いた場合の用量より１００倍高かった。それにもかかわらず、マウスにおいて測定され得る暗所毒性の閾値に、到達しなかった。これにより、ＰＤＴで用いることができるＬｕｚｉｔｉｎの用量は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）又はＦｏｓｃａｎ（登録商標）の用量よりも多いことが明らかである。
【０１７９】
［実施例１７］ＩＰ投与に続くクロリン生体内分布
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、ＩＰ投与後２時間で、血液脳関門を通過することができることを示す。
【０１８０】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃを、腹腔内投与によりＤＢＡ／２マウスにつき１０ｍｇ／ｋｇの用量となるように投与した。組織におけるクロリン分散を、投与後２時間分析した。前記マウスをモルビタール（バイオウェット社製、ポーランド国）を用いて麻酔し、脳を含む臓器のいくつかを摘出し、重さを量り、その後分析まで−３０℃で保存した。前記組織試料中の色素含有量を、蛍光分光計により分析した。前記色素を抽出するため、組織試料を、組織ホモジナイザーＭＰＷ−１２０（メディカルインスツルメンツ社製、ポーランド国）を用い、１００００ｒｐｍの速度で、７ｍｌの氷冷した９０％含水アセトン中において１分間均質化処理した。得られたホモジネートを、２０００×Ｇで１０分間、４℃の温度で遠心分離し、上澄みを回収し、そして沈殿物を９０％含水アセトンで再抽出し、前記色素を完全に回収した。得られた抽出物をプール（pool）し、色素含有量を分析した。前記試料を、４１３ｎｍで励起し、蛍光スペクトルを６００〜８００ｎｍの範囲で記録した。図１６は、各質量により正規化した脳、血液及び肝臓由来試料の蛍光強度を示す。
【０１８１】
ＤＢＡ／２マウスにおける前記増感剤の血液から脳への分散は、ＩＰ投与後２時間で、４：１であった。これは、適切なＬｕｚｉｔｉｎは、顕著な量が血液脳関門を通過可能であるため、脳中における活性光増感剤となり得ることの原理証明である。以下の実施例では、この類の増感剤が腫瘍に蓄積される傾向があり、さらに光増感剤の量を増加して、脳腫瘍の治療に利用することができることを示す。
【０１８２】
［実施例１８］ＩＰ投与に続くバクテリオクロリンの薬物動態
本実施例は、ＬｕｚｉｔｉｎのＩＰ投与後、先ず腫瘍内に蓄積して、その後ゆっくりとした速度で消失することを示す。
【０１８３】
腫瘍モデルは、Ｓ９１クラウドマンメラノーマ細胞であり、前記細胞は、５％ウシ胎児血清及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ培地中で単層培養した。前記細胞を、３７℃の温度で５％ＣＯ２を含む湿潤環境において増殖させた。前記メラノーマ細胞（〜１×１０６）を、０．１ｍｌリン酸緩衝液塩（ＰＢＳ）中に回収し、マウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。前記腫瘍は成長し、前記埋め込み後１０日で視認可能となった。前記マウスを、前記投与後３週間に治療した。
【０１８４】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを、腹腔内投与によりＤＢＡ／２マウスに１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。バクテリオクロリンの組織への分散を、腹腔内投与後、２時間、６時間、１２時間、２４時間、及び４８時間の間隔で分析した。前記マウスを、ケタミン及びキシラジンを用いて麻酔し、該マウスの臓器及び組織試料を摘出し、重さを量り、その後さらに、分析まで−３０℃で保存した。組織試料中の色素含有量を、蛍光分光計により分析した。前記色素を抽出するため、組織試料を、組織ホモジナイザーＭＰＷ−１２０（メディカルインスツルメンツ社製、ポーランド国）を用い、１００００ｒｐｍの速度で、７ｍｌの氷冷したエタノール／ＤＭＳＯ（７５：２５）溶液中において１分間均質化処理した。得られたホモジネートを、２０００×ｇで１０分間、４℃の温度で遠心分離し、上澄みを回収し、そして沈殿物を前記エタノール／ＤＭＳＯ溶液で再抽出し、前記色素を完全に回収した。得られた抽出物をプールし、色素含有量を分析した。前記試料を、５１７ｎｍで励起し、蛍光スペクトルを６００〜８５０ｎｍの範囲で記録した。図１７は、各質量により正規化した腫瘍及びいくつかの臓器由来の試料の蛍光強度を示す。
【０１８５】
前記腫瘍中の光増感剤の顕著な蓄積は、前記腹腔内投与後一日で生じ、筋中より３倍高い濃度に到達する。また、前記皮膚中への蓄積はごくわずかであり、これは暗所毒性研究におけるマウスの光線過敏の欠如を説明するものである。最後に、前記光増感剤は、ほとんどの組織から２４時間以内に消失する。これらの薬物動態はＰＤＴ治療のためのタイムウインドウの選択のために非常に好ましく、そのため副作用が軽減され、治療の効果が最大化される。
【０１８６】
同様の研究を、他のＬｕｚｉｔｉｎについて行った。そして、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔによれば、腫瘍対筋肉の非常に強い選択性が示された（図１８）。
【０１８７】
［実施例１９］Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔを用いたＢａｌｂ／Ｃマウス中のマウス大腸癌のＰＤＴ
本実施例は、適切な波長の光を暴露した際に、Ｌｕｚｉｔｉｎが引き起こす腫瘍退縮／壊死について示す。
【０１８８】
腫瘍モデルは、ＣＴ２６マウス大腸癌細胞であり、前記細胞は５％ウシ胎児血清及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ培地中で単層培養した。前記細胞を、３７℃の温度で５％ＣＯ２を含む湿潤環境において増殖させた。前記メラノーマ細胞（〜１×１０６）を、０．１ｍｌリン酸緩衝液塩（ＰＢＳ）中に溶解し、前記Ｂａｌｂ／Ｃマウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。前記腫瘍は成長し、前記埋め込み後約１週間で直径が５ｍｍに到達した。自然壊死は観察されなかった。治療は、前記腫瘍が各マウスにおいて直径５ｍｍに到達したときを開始とした。前記腫瘍が前記治療を開始する大きさに到達した日に、前記マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ４００中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの用量で腹腔内投与した。投与後２４時間の時点において、４匹のマウスをケタミン及びキシラジンを用いて麻酔し、１００ｍＷ／ｃｍ２のフルエンス率で２２分間（合計フルエンスは１３２Ｊ／ｃｍ２）、上述したハママツ社製７４８ｎｍダイオードレーザにより処置した。他の４匹のマウスは、処置を行わず、対照としての役割とした。マウスを毎日検査し、腫瘍を２直交測定Ｌ及びＷ（垂直方向がＬ）を用いて測定すると共に、その大きさを、式 Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２を用いて算出し、記録した。
【０１８９】
図１９は、レーザ照射後、異なる日に測定された相対的な腫瘍体積を示す。前記処置されたマウスにおける腫瘍の大きさは、対照マウスの平均的な腫瘍の大きさより小さく、一例においては腫瘍が完全に消失していた。
【０１９０】
［実施例２０］Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔを用いるＤＢＡ／２マウスにおけるメラノーマ細胞のＰＤＴ
本実施例は、適切な波長の光を暴露した際に、Ｌｕｚｉｔｉｎが引き起こす腫瘍退縮／壊死について示す。
【０１９１】
腫瘍モデルは、Ｓ９１クラウドマンメラノーマ細胞であり、５％ウシ胎児血清及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ培地中で単層培養した。前記細胞を、３７℃の温度で５％ＣＯ２を含む湿潤環境において増殖させた。前記メラノーマ細胞（〜１×１０６）を、０．１ｍｌリン酸緩衝液塩（ＰＢＳ）中に溶解し、前記ＤＢＡ／２マウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。前記腫瘍は成長し、前記埋め込み後約１週間で直径が５ｍｍに到達した。自然壊死は観察されなかった。治療は、前記腫瘍が各マウスにおいて直径５ｍｍに到達したときを開始とした。前記腫瘍が前記治療を開始する大きさに到達した日に、前記マウスに、ＰＥＧ４００中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔを１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。投与後２４時間で、マウスをケタミン及びキシラジンを用いて麻酔し、プラスチックホルダー中に拘束し、その後、上述したハママツ社製７４８ｎｍダイオードレーザにより異なる光線量で処置した。照射の数分間の間、腫瘍領域は、壊死の明らかな信号を示し、数時間の間に照射された領域の全てに拡大した。マウスを毎日検査し、前記腫瘍の大きさを測定し、記録した。図２０は、レーザ照射後、異なる日に測定された腫瘍体積を示す。ある一回の処置セッションが、長期間に亘って腫瘍退縮を生じさせることが明らかである。
【０１９２】
［実施例２１］局所投与のための製剤
本実施例は、適切な経皮製剤として適用する際に、皮膚を介してＬｕｚｉｔｉｎを素早く拡散することができることを示す。４匹のミニブタを、光増感剤であるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの皮膚への拡散を試験するために用いて、局所投与に対するこの組成物の副作用を評価した。
【０１９３】
前記光増感剤を、先ず、無水エタノール（０．５５６ｍｌ中、５ｍｇ）に溶解し、次に、１．７３７ｍｌのプロピレングリコールを添加し、続いて０．２２ｍｌのＡｚｏｎｅ（登録商標）及び０．３ｍｌの水を添加した。得られた混合物をボルテックスにより十分に混合し、超音波処理することにより可溶化を促進し、その後、水（７６．６５％）、９６％エタノール（１５％）、グリセリン（６％）、トリエタノールアミン（１．３５％）、カーボポール９４０（１％）からなるゲル基剤に添加した。前記混合物をよく混合し、十分に均一化した。この製剤において、光増感剤の終濃度が０．１％であって、かつ、Ａｚｏｎｅ（登録商標）の終濃度が４％となるようにした。
【０１９４】
前記ミニブタは、上述したように取り扱った。麻酔により沈静化している間、予め設定しておいた領域に、外科手袋を装着した手により前記製剤を塗布した。各塗布は、直径３ｃｍの略円形領域を、前記ゲルの厚みが数ミリメートルとなるように行った。前記塗布した領域を、密閉パッチにより覆った。いくつかのミニブタについて、背中の異なる領域に対して、３時間後に同様の手順を繰り返した。前記ミニブタのうちの１匹において、前記製剤を塗布後６時間で取り除き、該ミニブタの背中をきれいにした後、次の評価を行うために、１０日間生存させた。皮膚試料を上述したように回収した。各試料は、１辺が２ｃｍの略長方形であり、厚さを１ｃｍとした。前記ミニブタ、特に生存しているミニブタは、他の増感剤を含まずに本実施形態の増感剤のみを含む製剤によって引き起こされる副作用の証拠を示さなかった。
【０１９５】
固定化処理後、蛍光顕微鏡検査法によって、及び共焦点顕微鏡法によって評価するために、各試料を切断し、薄片化した。前記試料から得られた画像の代表的な例を図２１に示す。前記ゲルの塗布後３時間以内の画像によれば、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔは全ての上皮を通過して拡散していることが明らかである。Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの蛍光発光は、図２２に示す吸収スペクトルによりさらに確認された。従って、角質層及び上皮を数時間で通過して拡散するＬｕｚｉｔｉｎの局所使用のための組成物を製剤することができ、該組成物は、皮膚疾患のＰＤＴのために非常に好適である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光力学的療法（ＰＤＴ）に反応する過剰増殖性組織、例えば、腫瘍、過剰増殖性血管及び他の疾病又は異常に対するＰＤＴのために設計されたスルホン化クロリン及びスルホン化バクテリオクロリンの製造方法、特性、医薬組成物、及び治療における使用方法に関する。本発明は、特に、安定なクロリン及びバクテリオクロリンを、大規模に化学的に合成することができる新規な方法に関し、無溶媒、無基剤（base）であることを特徴とする。他の実施形態として、医薬組成物、及び全身投与による治療に該医薬組成物を使用する方法が提供される。更なる実施形態において、医薬組成物、及び局所投与による治療に該医薬組成物を使用する方法が提供される。また、過剰増殖性組織、例えば、腫瘍を、光力学的方法又はＭＲＩを用いて検出する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
［I.背景］
［Ｉ．Ａ．最新技術］
種々のテトラピロール大員環、例えば、プルプリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン及びベンゾクロリン等は、生体に投与された際に、過剰増殖性組織に優先的に蓄積する能力、及び光を吸収し、光に反応して活性化状態を形成する能力を示す。これらの大員環は、適切な波長の光を照射されるときに、それらが局在化されている細胞又は他の組織に細胞傷害効果を呈する。さらに、これらの化合物はまた、前記組織から、その位置の検出に用いることができるエネルギー放射を引き起こす。
【０００３】
ＰＤＴにおいて、患者は、腫瘍組織に対していくつかの選択性光傷害を示す光増感剤を投与され（通常、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲）、所定時間後、前記腫瘍領域に可視光線又は近赤外線が照射される（約５０〜２００Ｊ／ｃｍ２）。前記光増感剤は、光を吸収し蛍光を発するか、又は前記組織において電子若しくは水素転移反応によって基質分子と反応する（Ｉ型工程）か、又は前記組織を攻撃する一重項酸素Ｏ２ (１Dｇ)を生成する基底状態の酸素分子にそのエネルギーを移動する（ＩＩ型工程）。Ｉ型工程における主な寄与因子は、電子的に励起された増感剤からの電子転移によって形成されたスーパーオキシド（Ｏ２−）である。細胞にとってＩ型工程よりもＩＩ型光酸素化工程の方が好都合であることが明らかである（非特許文献１，２参照）。しかし、スーパーオキシドが生成される場合におけるＰＤＴ反応の増幅もまた主張されている（非特許文献３参照）。検出の場合には、蛍光発光は、所望の波長の光に暴露されることにより測定される。低いエネルギーは、治療のためにも必要とされる。効果的な治療には、通常、前記組織に一重項酸素を高い生成量で形成する必要があり、これはスーパーオキシド又は他の活性酸素種（reactive oxygen species）の同時形成による相乗効果を有するかもしれない。
【０００４】
ＰＤＴ処理のための最適な増感剤の特性としては、（ｉ）簡易で、効率的で、かつ経済的な合成、（ｉｉ）安定で、純度が高く、長い保存可能期間、（ｉｉｉ）生体適用性のある溶媒又は賦形剤への可溶性、（ｉｖ）「光治療域」（６００〜９００ｎｍ）の高い吸収係数、（ｖ）一重項酸素分子の増感、又は高量子収率でのスーパーオキシド生成、（ｖｉ）暗所毒性が低いか、全く無いこと、（ｖｉｉ）腫瘍組織における選択的集積及び長期的な滞留、（ｖｉｉｉ）全身投与下での低い皮膚光増感、（ｉｘ）制御された光退色、（ｘ）治療後の代謝又は排出の容易さ、を含む。前記増感剤は、細胞毒性種、特に、一重項酸素及び他の活性酸素種、例えば、スーパーオキシドイオンの前駆体にすぎない。一重項酸素及びよくあるようにスーパーオキシドの直接の前駆体は、三重項状態の増感剤である。従って、高い一重項酸素量子収率は、（ｉ）ほぼ一貫した量子収率、（ｉｉ）一重項酸素の電子エネルギー（９４ｋＪ／ｍｏｌ）より少なくとも２０ｋＪ／ｍｏｌ超過した電子エネルギー、（ｉｉｉ）長い寿命（数百μ秒）という、少なくとも３つの増感剤三重項状態特性を必要とする。腫瘍組織内への蓄積及び滞留は、特定のベクターの添加により強化されるが、これらを達成するための前記増感剤に関連する固有特性は、増感剤の親水性／親油性であり、所望の標的に到達するような特性に調整する能力が最も望まれる特性である。
【０００５】
前記光治療域の下限値は、組織中で可視領域の光を吸収する最大の原因であるヘムタンパク質の存在によって決定される。組織内での光の透過率は、５５０ｎｍ以下で急激に低下する。しかしながら、透過率は５５０〜６３０ｎｍで、顕著に増加し、そして透過率は、７００ｎｍで再び倍になる。これは、その後に波長が８００ｎｍに向けて変化するに従って、組織透過性が１０％増加する。前記光治療域の上限値は、水による赤外線放射の吸収、及び酸素への効率的なエネルギー移動のために必要とされるエネルギーによって決定される。実際には、前記増感剤から酸素分子へ移動する拡散律速三重項エネルギーは、前記増感剤の三重項エネルギーである少なくとも１１５ｋＪ／ｍｏｌを必要とする。また、テトラピロール大員環に分裂する一重項−三重項エネルギーは、約４０ｋＪ／ｍｏｌであり（非特許文献４参照）、これは、増感剤が１５０ｋＪ／ｍｏｌより大きい一重項エネルギーを有さなければならないことを必要とする。これらの増感剤は、ストークスシフトが通常小さいことを考慮すると、８００ｎｍ直下（just below）の光を吸収するであろう。結論として、理想的な増感剤は、約７５０ｎｍの波長の光を強く吸収する必要がある。バクテリオクロリンにおけるこの波長の強い吸収は、該バクテリオクロリンをＰＤＴ増感剤に対する理想的な候補とする。光透過性が重要でないときに適用するとすれば、クロリンもまたＰＤＴのための適切な候補である。
【０００６】
ヘマトポルフィリン誘導体であるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）（非特許文献５参照）は、最も広く用いられている光増感剤であり、種々の固形腫瘍の治療に対して認可されている（非特許文献６参照）。ヘマトポルフィリン誘導体（ＨｐＤ）は、ヘマトポルフィリンを氷酢酸及び硫酸と混合し、次に酸性条件下で、加水分解及び沈殿を行うことにより製造される。この方法は、Ｌｉｐｓｏｎらによって、部分的に記述されている（非特許文献７参照）。このようにして製造されたＨｐＤは、ポルフィリンの複合混合物からなる。ＨｐＤはＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を用いたゲルろ過によって、２つの主画分に分割した場合、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）と呼ばれるより分子量の大きな部分は、より効率的なＰＤＴ剤となる（非特許文献8参照）。推奨されるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）のヒトに対する用量は、１〜２ｍｇ／ｋｇ体重である。Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の主成分は、エーテル、エステル及び可能な炭素−炭素結合と結合した二量体及び高次のオリゴマーである（非特許文献９参照）。
【０００７】
Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）は、優れた有効性、水溶性、一重項酸素の妥当な収率及び生産の容易さといった、いくつかの好ましい特性を有している。しかしながら、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）は、（ｉ）エーテル、エステル又は炭素−炭素結合により結合されたポルフィリンの二量体及び高次のオリゴマーの複合混合物であること、（ｉｉ）投与後、４〜６週間の間、患者に皮膚光毒性を示すこと、（ｉｉｉ）赤色領域（６３０ｎｍ）における吸光度が相対的に弱いことに起因して、組織を透過する光の透過の欠如が、ＰＰＤでのＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の現在の臨床的応用を、治療に用いられる光源から４ｍｍ未満の距離に位置する癌組織の破壊に限定すること、といういくつかの不都合な特性もまた有している。従って、より効率的であり、化学的に純粋であり、低毒性であり、光をより劇的に吸収し、かつ赤外線を吸収する増感剤をより局在化する必要性がある。
【０００８】
従来、ポルフィリンのクロリンへの転換に対応するテトラピロール環の一つの化学的還元は、その吸収係数の増加に伴い、赤色よりさらに遠くまで最も長い波長吸収帯を転移させることが知られている。このような特性はＰＤＴ光増感剤の第二世代において研究されており、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）という名称で商品化された５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロキシフェニル）クロリン（ｍ−ＴＨＰＣ）は、この第二世代光増感剤の最も有効なものの一つであることが明らかにされた（非特許文献１０参照）。クロリンのバクテリオクロリンへの転換に対応する、対向するピロール環のさらなる還元は、吸収帯の赤外線領域への転移と、吸収係数の付加的な増加とを導く。しかしながら、バクテリオクロリンは、非常に不安定な化合物であり（非特許文献１０参照）、ＰＤＴ増感剤の研究努力は、クロリンに焦点が置かれている（非特許文献１１参照）ということが、現在まで広く共有されて信じられている。その後、安定なバクテリオクロリンは、実際には合成可能であることが示されている（非特許文献１２参照）。これは、本方法による安定なバクテリオクロリンの合成は不活性な機能性を有するバクテリオクロリンの製造に制限されると主張される論文中で、十分に評価がされていない（非特許文献１３参照）。しかしながら、さらなる機能性を有するバクテリオクロリンが製造されている（特許文献１，２参照）。
【０００９】
ＰＤＴ増感剤としてのバクテリオクロリンの明確な利点、並びにいくつかの自然発生したバクテリオクロリンがインビトロ及びインビボの両方において有効な光増感剤であるという報告（非特許文献１４，１５参照）は、バクテリオクロリンを合成する多くの試みの動機付けとなった。合成バクテリオクロリンは、四酸化オスミウムの隣接ジヒドロキシル化（非特許文献１６参照）、分子内環化（非特許文献１７参照）、ジエノフィルとしてポルフィリンを用いるディールス・アルダー反応（非特許文献１８参照）又はポルフィリンがジエンであるビニルポルフィリンを用いるディールス・アルダー反応（非特許文献１９参照）、１，３−双極性環状付加（非特許文献２０参照）、また、デヒドロジピリンアセタール誘導体の自己縮合によって（非特許文献２１参照）、対応するポルフィリンを誘導体化することで製造される。さらに、バクテリオクロリンを製造するために、Ｗｈｉｔｌｏｃｋによって数十年前に開発された、７，８−１７，１８−ピロリックポルフィリン位置をジイミドで還元することによる古典的な方法がある（非特許文献２２参照）。これは、Ｂｏｎｎｅｔにより用いられた方法であり、Ｆｏｓｃａｎ及び５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロフェニル）バクテリオクロリンを合成する（非特許文献２３）。一方、非常に短期間の集中した研究は、上述した方法に基づく多くの特許を導くバクテリオクロリン誘導体の合成方法を完成した（例えば、特許文献３〜１４参照）。
【００１０】
いくつかの新たに合成されたバクテリオクロリンは、無視できる暗所毒性及び高い腫瘍選択性とを備え、部分的に水溶性であり、７００〜８００ｎｍの範囲における顕著な吸収帯を有している。しかしながら、いくつかの不都合がまだある。即ち、（ｉ）労力を有する精製を含み、複雑で費用のかかる合成方法であること、（ｉｉ）全身投与の場合、結果として有機溶剤に溶解することになり、生体に付加的な化学的負担をかけ、又は賦形剤に結合させることにより処置における費用が高くなるような限られた水溶性であること、（ｉｉｉ）特に、光の存在時に化学的に不安定であること、（ｉｖ）一重項酸素量子収率が低いか又は未知であることである。この第三世代の光増感剤の興味深い典型としては、現在、Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）として知られているパラジウムバクテリオフェオホルビドがあり、これは第ＩＩＩ相臨床研究に承認されている。Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）は、バクテリオクロロフィルから誘導されたものであり、自然発生したバクテリオクロリンの多くは、非常に酸素に敏感であり、結果として、迅速に酸化されて、６６０ｎｍか又はそれ以下で吸収極大を持つクロリンの状態となる。さらに、インビボにおいてバクテリオクロリンを励起するためにレーザが用いられる場合、酸化により、光増感効果を低下させるレーザ光線領域外の光を吸収する新規の発色団を生成するかもしれない。この化合物ファミリーの光化学分解は、ＴＸ−１００／ＰＢＳ中における７７８ｎｍ（１３ｍＷ）の照明で測定され、前記化合物の９０％が、６６０ｎｍでクロリンバンド（chlorin band）の成長に伴い、５分（４Ｊ）で不可逆的に破壊されることが明らかにされた（非特許文献３参照）。
【００１１】
ＰＤＴは、また、皮膚疾患、即ち、光線角化症、細胞癌、ボーエン病（上皮内における扁平上皮細胞癌）、基底細胞癌の治療に対して広範に試験されたが、悪性メラノーマに適用可能な情報はない（非特許文献２４参照）。メラニンは７００ｎｍ以下の波長の組織中への光浸透性を低下させるため、可視光線を用いる場合、メラノーマ組織の高い色素沈着は、ＰＤＴの効率を制限する。また、非腫瘍疾患、例えば、乾癬等に、局所的ＰＤＴを用いることが報告されている。初期の研究では、経皮浸透促進剤を含む液剤中に、ヘマトポルフィリン誘導体（非特許文献２５参照）、及びメソ−テトラフェニルポルフィンスルホン酸四ナトリウム塩（非特許文献２６参照）が用いられた。しかしながら、概して、ＨｐＤ又は他のポルフィリンが、組織を介する拡散を促進することを目的とする賦形剤を含む製剤（例えば、液体、ゲル、クリーム、エマルジョン等）により局所使用される場合、ポルフィリンは、正常な組織液が生じることによって、浸透促進剤の希釈物として維持される傾向がある。このような状況において、ポルフィリンは、もはや組織を介して拡散することができない（又は、たとえ溶液中に残存していても）。それ故、ポルフィリンの局所使用は、しばしば悪性組織に対する特異性の低下に関連し、該使用部位に隣接する正常組織は、ポルフィリンの局所的な集中の結果として、光増感の持続性を発達させる可能性がある。
【００１２】
これらの問題を克服するためには、ポルフィリンを局所使用するよりはむしろ、ポルフィリン自体を光増感剤として使用するのではなく、インビボにおける内因性ポルフィリン、即ちプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の合成を増加させる作用因子として使用することに利点があることが示唆されている（非特許文献２７参照）。５−アミノ−４−オキソペンタン酸、さもなければ５−アミノレブリン酸（又はＡＬＡ）として知られているものは、プロトポルフィリンＩＸの生物学的前駆体であることが知られている。過剰なＡＬＡは、ＰｐＩＸの生物学的な蓄積を引き起こす。前記ＰｐＩＸは、実在の光増感剤である。従って、皮膚腫瘍に局所的にＡＬＡを用いることによって、それから数時間後に該腫瘍を光に暴露し、有益な光治療効果を得ることができるかもしれない（例えば、特許文献３参照）。バシローマ及び扁平上皮細胞癌を覆っている皮膚は、健康な皮膚よりもＡＬＡをより容易に浸透し、かつ、ＰｐＩＸの生合成が皮膚腫瘍に対してより効果的であるので、ＡＬＡの局所使用は、腫瘍中においてＰｐＩＸの産生の選択的促進を引き起こすことが判明した。これは、ＡＬＡ又はその誘導体の皮膚学的な処方の多くに対する根拠となっている。ＡＬＡ又はその誘導体、特に、Ｌｅｖｕｌａｎ（登録商標）及びＭｅｔｖｉｘ（登録商標）は、認可されており、かつ臨床用途に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２００５０１２２１２号明細書
【特許文献２】国際公開第２００６／０５３７０７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／７１６６７１９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／６６２４１８７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／６５６９８４６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００２／６３７６４８３号明細書
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【特許文献８】米国特許出願公開第１９９８／５８３１０８８号明細書
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【特許文献１１】国際公開第９５／３２２０６号
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【非特許文献】
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【非特許文献５０】H. Rezzoug, L. Bezdetnaya, O. A'amar, J.L. Merlin, F. Guillemin, Lasers Med. Sci. 13 (1998) 119.
【非特許文献５１】C.A. Lipinski, F. Lombardo, B.W. Dominy, P.J. Feeney, Adv. Drug Del. Rev. 46 (2001) 3.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、ＡＬＡの使用が技術の顕著な進歩を表す一方、ＡＬＡを用いる光力学的療法は、全く満足のいくものではない。患者は、ＡＬＡ−ＰＤＴにおいて痛みを経験したと繰り返し報告している（非特許文献２８参照）。ＡＬＡは、プロドラッグであり、前記薬物の製造の効率は、対象における生合成によって変化する。非常に限られた量のＰｐＩＸのみを細胞によって生合成することができる。ＰｐＩＸは、製剤処方として不安定となる傾向がある。ＰｐＩＸは、腫瘍又は他の疾患といった、広い範囲の治療を可能にするために、満足のいく効率で全ての腫瘍及び他の組織に浸透することができない。光活性化するための好ましい波長は、約６３５ｎｍであり、１ｃｍ厚のヒト組織のスラブを通過できる入射赤色光（６００〜７００ｎｍ）は、たったの１〜１０％の範囲の間である。そのため、局所使用のために光力学治療薬を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
［Ｉ．Ｂ．発明の要約］
第１の特徴によれば、本発明は、下記式（Ｉ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法を提供する。
【００１７】
前記製造方法は、（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンを、ヒドラジドを用いてクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備える。前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＩ）で表される。
【００１８】
従って、式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（Ｖ）で表されるクロリン誘導体であってもよい。
【００１９】
あるいは、式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（ＶＩ）で表されるバクテリオクロリン誘導体であってもよい。
【００２０】
好ましくは、Ｘ２, Ｘ４, Ｘ６, Ｘ８は、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ）からそれぞれ独立に選択される。
【００２１】
好ましくは、Ｒ５, Ｒ６, Ｒ７, Ｒ８は、Ｈである。
【００２２】
好ましくは、ＹはＨである。
【００２３】
好ましくは、Ｒ１, Ｒ２, Ｒ３, Ｒ４は、−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは、−Ｃｌ，−ＯＨ，−アミノ酸，−ＯＲｎ，−ＮＨＲｎ及び−ＮＲ２ｎからそれぞれ独立に選択され、Ｒｎは、炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である。
【００２４】
さらなる特徴によれば、Ｘ２, Ｘ４, Ｘ６, Ｘ８は、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ）からそれぞれ独立に選択され、
Ｒ５, Ｒ６, Ｒ７, Ｒ８は水素であり、
ＹはＨであり、及び
Ｒ１, Ｒ２, Ｒ３, Ｒ４は、−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは、−Ｃｌ，−ＯＨ，−アミノ酸，−ＯＲｎ，−ＮＨＲｎ及び−ＮＲ２ｎからそれぞれ独立に選択され、Ｒｎは、炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である。
【００２５】
さらなる特徴によれば、本発明は、下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法を提供する。
【００２６】
前記製造方法は、（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンをヒドラジドを用いて、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備える。前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＶ）で表される。
【００２７】
従って、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、下記式（ＶＩＩ）で表されるクロリン誘導体であってもよい。
【００２８】
あるいは、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、下記式（ＶＩＩＩ）で表されるバクテリオクロリン誘導体であってもよい。
【００２９】
さらなる特徴によれば、式（ＩＶ）で表される前記対応する置換ポルフィリンに対して、Ｒ’は−ＳＯ２Ｒであり、Ｒは−Ｃｌであり、前記製造方法は、さらなる工程を備える。
【００３０】
（ｉｉ）前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に、アミン（Ｈ−ＮＨＲｎ若しくはＨ−ＮＲ２ｎ）、アミノ酸、又はアルコール（Ｈ−ＯＲｎ）（Ｒｎが炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である）を結合し、
クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体（Ｒ’は−ＳＯ２Ｒであり、Ｒはアミノ酸，−ＯＲｎ，−ＮＨＲｎ又は−ＮＲ２ｎであり、Ｒｎは炭素原子の数が１〜１２のアルキル基である）を提供する。
【００３１】
さらなる特徴によれば、本発明は、
（ａ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体又は、その医薬として許容可能な組成物の誘導体と、
【００３２】
（ｂ）表面浸透促進剤とを備えることを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００３３】
さらなる特徴によれば、本発明は、過剰増殖性組織の検出における下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、またはそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体の使用方法を提供する。
【００３４】
さらなる特徴によれば、本発明は、（ｉ）下記の式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体であって、標的に優先的に結合する誘導体を診断上十分な量で対象に投与する工程と、（ｉｉ）前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が前記標的に結合する十分な時間を与え、前記標的組織と優先的に結合していないクロリン誘導体及びバクテリオクロリン誘導体を非標的組織から洗浄する工程と、（ｉｉｉ）患者体内の式（ＩＩＩ）の化合物を視覚化する工程とを備える、対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法を提供する。
【００３５】
前記視覚化する工程は、患者の身体の少なくとも一部についてＭＲＩ画像を生成することによって達成されてもよい。
【００３６】
または、前記視覚化する工程は、前記化合物が蛍光を発するために十分なエネルギーの光に該化合物を暴露することによって達成されてもよい。
【００３７】
さらなる特徴によれば、本発明は、皮膚癌、又は光線角化症、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、基底細胞癌、乾癬、尋常性座瘡及び酒さから選択される皮膚疾患の治療に用いるための医薬として許容可能な組成物を提供する。前記組成物は、（ｉ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体と、（ｉｉ）かかる式（ＩＩＩ）の化合物の皮内到達又は経皮到達のための医薬として許容可能な担体であって、皮膚に一時的に浸透し、各種の皮膚層を通して該化合物の浸透を促進する皮膚表面浸透促進剤からなる前記担体とを備える。
【００３８】
ここで、
（ａ）前記組成物は、対象に投与される。
（ｂ）クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が、皮膚科的治療の標的の近辺に優先的に位置するのに十分な時間を与えられる。
（ｃ）前記標的は、照射され、前記皮膚癌又は前記皮膚疾患に所望の反応が得られる。
【００３９】
［前記誘導体の製造方法］
好ましくは、前記ヒドラジドは、ｐ−トルエンスルホニルヒドラジド、４−クロロベンゾスルホニルヒドラジド、４，４’−オキシビス（ベンゼンスルホニル）ヒドラジド、ベンゼンスルホニルヒドラジド、４−メトキシベンゼンスルホニルヒドラジド、又は安息香酸ヒドラジドである。
【００４０】
固相反応は、反応物の一つの融点以上の温度を必要とし、それにより他の反応物は、一部が溶解し、又は前記溶解した反応物中に分散する。ヒドラジドとポルフィリン誘導体との間の固相反応のため、該固相反応は、前記ヒドラジドの融点以上の温度で好適に行われる。
【００４１】
好ましくは、前記還元工程は、少なくとも７０℃の温度で行われる。好ましくは、前記還元工程は、少なくとも１００℃の温度で行われる。さらなる特徴によれば、前記還元工程は、７０〜２００℃の範囲の間の温度で行われる。好ましくは、前記還元工程は、少なくとも５分間行われる。
【００４２】
好ましくは、前記還元工程は、真空下又は不活性雰囲気下で行われる。
【００４３】
［医薬組成物］
好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、少なくとも０．０１重量％含む。好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、０．０１〜３０重量％含む。好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、０．０１〜１０重量％含む。好ましくは、前記医薬組成物は、前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を、該組成物の全重量に対し、０．１〜１重量％含む。
【００４４】
表面浸透促進剤が医薬組成物中に存在する場合、好ましくは、前記組成物は、該表面浸透促進剤を、該組成物の全重量に対し、０．０５〜１０重量％含む。好ましくは、前記組成物は、前記表面浸透促進剤を０．１〜１０重量％含む。好ましくは、このような表面浸透促進剤は、ジメチルスルホキシド及び他のジアルキルスルホキシド、Ｎ−メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、種々のピロリドン誘導体、並びに種々の１−置換アザシクロアルカン−２−オンから選択されてもよい。
【００４５】
好ましくは、グリコールは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール４２５、トリメチレングリコール及びプロピレングリコールモノラウレートから選択されてもよい。
【００４６】
好ましくは、ピロリドン誘導体は、Ｎ−ドデシルピロリジン−３，５−ジオン、Ｎ−ドデシルピロリジン−２−チオン、Ｎ−ドデシル−２−ピロリドン、Ｎ−（２，ヒドロキシエチル）−２−ピロリドン、Ｎ−シクロヘキシル−２−ピロリドン、１−ブチル−３−ドデシル−２−ピロリドン、１，５ジメチル−２−ピロリドン、１−エチル−２−ピロリドン、１−ヘキシル−４−メチルオキシカルボニル−２−ピロリドン、１−ヘキシル−２−ピロリドン、１−（２ヒドロキシエチル）ピロリジノン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、１−ラウリル−４−メチルオキシカルボニル−２−ピロリドン及びＮ−メチル−２−ピロリドンから選択されてもよい。
【００４７】
好ましくは、１−置換アザシクロアルカン−２−オンは、特許文献１５〜１７に開示されたＡｚｏｎｅ（登録商標）について言及される１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オンを含む。
【００４８】
［過剰増殖性組織の検出］
クロリン誘導体及びバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩が、過剰増殖性組織の検出に用いられるときに、好ましい例は、前記過剰増殖性組織は、血管内皮組織、新生血管系組織（新生血管系組織は、目に存在する）、腫瘍の異常血管壁、固形腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、眼腫瘍、消化管腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、非固形腫瘍、造血組織及びリンパ系組織の一つの悪性細胞、血管系における病変、罹患骨髄、及び自己免疫性疾患及び炎症性疾患の一つの病気における異常細胞から選択されてもよい。
【００４９】
［過剰増殖性疾患の治療］
さらなる特徴によれば、本発明は、過剰増殖性疾患の治療に用いる薬剤の製造において、後述するクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩を使用する方法を提供する。
【００５０】
クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩が過剰増殖性疾患の治療に用いられるとき、好ましくは、該過剰増殖性疾患は、癌、骨髄腫、乾癬、黄斑変性から選択される。好ましくは、例として、胃癌、腸癌、肺癌、乳癌、子宮癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、非上皮性悪性腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、上顎癌、胆管癌、頭頸部癌、舌癌、脳腫瘍、皮膚癌、悪性甲状腺腫、前立腺癌、結腸直腸癌、耳下腺癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、腎臓癌、白血病及び悪性リンパ細胞腫である。
【００５１】
このような治療は、好ましくは、クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩に、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の吸収帯と一致する波長の光を照射する工程を含む。好ましくは、前記光は、６００〜８００ｎｍの範囲の波長を有する。クロリンが用いられる場合、前記光は、好ましくは、６３０〜６９０ｎｍの範囲の波長を有する。バクテリオクロリンが用いられる場合、前記光は、好ましくは、７２０〜７８０ｎｍの範囲の波長を有する。
【００５２】
好ましい前記光線量は、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの特徴において、好ましい前記光線量は、５０Ｊ／ｃｍ２未満であり、２０Ｊ／ｃｍ２未満であり、１０Ｊ／ｃｍ２未満である。
【００５３】
クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩の好ましい用量は、一日あたり０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。クロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な塩の好ましい用量は、一日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５４】
本発明は、上述の先行技術の観点からなされたものである。特許文献２（特許文献１）に記載された合成方法は、３つのほぼ定量的な工程を備える。（ｉ）フェニル環のクロロスルホン化を経るハロゲン化テトラキスポルフィリンの官能化工程と、（ｉｉ）クロロスルホン酸基と、求核試薬、水、即ちアミン又はアルコールとの反応を経由しての両親媒性化合物を合成する工程と、（ｉｉｉ）無機又は有機の非求核塩基の存在下におけるテトラピロール大員環のヒドラジド誘導体による還元工程とである。しかしながら、特許文献２の図２に示されているように、前記方法によるハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの合成は、類似クロリンの混入と、面倒な分離を必要とする精製とを伴う。本発明の目的は、効率的な、環境に優しく、純粋な大規模合成ができ、安定的、かつ官能基としてフェニル環のオルト位に電子吸引基を持つテトラキスフェニルクロリン及びテトラフェニルバクテリオクロリンを提供することにある。本発明の目的は、また前記クロリン及びバクテリオクロリンの化学的特性、治療特性、これらの分子を用いる治療方法及び医薬組成物、並びにＰＤＴにおけるこれらの有効性の証拠を提供することにある。
【００５５】
ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンは、それをＰＤＴに対する望ましい光増感剤とする上で顕著な特徴を有する。
【００５６】
１）前記フェニル基のオルト位におけるハロゲン原子の存在が、３つの機能を奏する。第１に、制御された「重原子効果」を生じさせることにより、三重項の寿命を犠牲にすることなく増感剤三重項状態の収率を増加させ、そして電子エネルギーを酸素分子に効率的に移動させる能力を有する（非特許文献２９参照）。第２に、電子的効果及び立体効果の両方によって、テトラピロール大員環の還元状態を安定させる。第３に、電荷移動相互作用を通じて酸素分子へのエネルギー移動の速度定数を加速し、一重項酸素、スーパーオキシド及び他の活性酸素種の大きな収量を導く。
【００５７】
２）前記フェニル基のメタ位におけるスルホン酸基の存在は、２つの機能を奏する。第１に、前記増感剤の親水性／親油性を調整する調整手段を提供する。なぜならば、強い疎水性増感剤は、おそらく溶解性の低さ及び細胞膜から他の細胞内区画への移動能力の低さに起因して、低い光毒性を有すると思われる。一方、強い親水性染色剤（dyes）は、腫瘍間質に大部分が局所的に集中し、ＰＤＴ効率を低減するかもしれない（非特許文献３０参照）。第２に、前記スルホン酸基、特に、大きく長い置換基が結合されているスルホン酸基は、前記染色剤のバクテリオクロリン主要部の酸化に対する付加的な立体保護を提供する。
【００５８】
３）前記フェニル基のオルト位のハロゲン原子と、メタ位のスルホン酸基の同時存在は、付加的な機能を奏する。分子モデリング及び実験データは、非対称のフェニル環を有する５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィリンのメソ位の単結合の束縛回転が存在するとき、幾何異性体（アトロプ異性体として知られている）は、ポルフィリン平面に関してオルト位又はメタ位の置換基の位置が異なることに起因する（非特許文献３１参照）。前記アトロプ異性体は、顕著に異なる極性、及び最も長い波長吸収帯の吸収係数を有し、該吸収係数は、一桁近く異なる。特に、４つのスルファモイル置換基を前記ポルフィリン平面の同一側面に有するα４異性体は、最も高い吸収係数を有すると共に、前記アトロプ異性体の最も大きい両親媒性をもつ。
【００５９】
ＰＤＴにおいて、スルホン化クロリン及びスルホン化バクテリオクロリンの幅広い使用は、経済的で、かつ環境に優しい合成方法を必要とし、それは、工業的規模で実施することができる。ポルフィリン前駆体及びヒドラジドのみに基づいて、このような化合物を製造する新規な方法を提供することが、本発明の主要な目的である。ヒドラジドは固相状態で添加され、酸素又は塩基の欠如下に、密閉反応器中で溶融温度以上に加熱される。所望の生成物は、しばらく後に得られる。
【００６０】
また、適切な賦形剤を有する前記スルホン化クロリン又はスルホン化バクテリオクロリンの局所投与に用いるＰＤＴの方法を提供することが、本発明の一つの目的である。光増感剤の局所投与のための賦形剤は、溶液、ゲル、クリーム、エマルジョン、軟膏等を含む、異なる形態をとってもよい。典型的には、このような賦形剤の製剤は、少なくとも一つの表面浸透促進剤を含む。５００ドルトンを超える分子量を有する薬剤は、皮膚に十分に浸透しない（非特許文献３２参照）という、この分野における通念（conventional wisdom）に対して、本発明は、皮膚疾患に対して、前記スルホン化クロリン又はスルホン化バクテリオクロリンの効率的な皮内到達（intradermal delivery）のための製剤を提供する。前記スルホン化クロリン又はスルホン化バクテリオクロリン分子は１ｋＤをわずかに超過する分子量に到達する。
【００６１】
本発明は、例えば、腫瘍のような過剰増殖性組織の治療及び検出のための化合物に関し、光力学的方法を用いる。本発明の化合物はまた、次の疾患の治療に有益である。例えば、乾癬、尋常性座瘡及び酒さ等の皮膚疾患、例えば、機能不全性子宮出血等の婦人科疾患、例えば、コンジロームウイルス等の泌尿器系障害、例えば、再狭窄及び動脈硬化性プラーク等の循環器疾患、細菌又はウイルスの光力学的破壊、体毛除去及び化粧、臓器又は組織の移植後の免疫反応の抑制。
【００６２】
最後に、ハロゲン化スルホン化クロリン又はハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンを用いる過剰増殖性組織の診断方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。これらの化合物は前記組織に優先的に蓄積し、ごく微量の化合物を確実に検出するという診断のために必要な付加的な特性を提供する。これらの化合物は、前記組織が大部分を透過させる赤色光領域及び赤外線領域に、非常に明確な吸収帯を有する。これらの化合物の選択励起は、生体分子が発しない波長で明確な蛍光発光を導く。蛍光発光の検出は、非常に鋭敏な装置によって行うことができ、ナノモル以下の量のハロゲン化スルホン化クロリン又はハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンを生体媒質中において測定することができる。光診断及び光治療のための照射源は、制限されないが、所望の波長領域における集約された光線を選択的に適用することができるので、レーザービームであることが好ましい。前記光線は、診断のために前記化合物を蛍光発光させるため、及び治療のために殺細胞効果を発揮させるために、十分な強さを有している必要がある。さらに、フッ素化スルホン化クロリン又はフッ素化スルホン化バクテリオクロリンが用いられるとき、フッ素ＭＲＩ（磁気共鳴画像）は、身体の小さい領域におけるこれらの化合物の蓄積を検出することができ、そして、身体を形成する間隙に形成される代謝産物を追跡することができる。
【００６３】
本発明は、ここで、図面を参照して、限定されない実施例についてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】６００ｎｍ遮断フィルタを有する５００Ｗハロゲンランプのスペクトル密度、及びクロリン（ドットライン）及びバクテリオクロリン（ダッシュライン）の赤外線吸収スペクトル。
【図２】完全に無溶媒及び無基材であることを特徴とする合成経路において、対応するポルフィリンの還元により得られるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの吸収スペクトル。
【図３】完全に無溶媒及び無基材であることを特徴とする合成経路において、対応するポルフィリンの還元により得られるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの吸収スペクトル。
【図４】Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔのアトロプ異性体の極性のより大きい画分（βα３＋α４）の吸収スペクトルであり、赤外領域の吸光度の増加を示す。前記スペクトルから、７４８ｎｍでεｍａｘ＝１５０，０００Ｍ−１ｃｍ−１に到達すると推定された。
【図５】中性水溶液中（実線）、ｐＨ１とした２時間後（ドットライン）、及び中和後（ダッシュライン）におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の吸収スペクトル。前記スペクトルは、ＨＣｌ水溶液及びＮａＯＨ水溶液を滴下して添加することにより生じた希釈効果についての補正が行われた。
【図６】２８．８ｍＷ（１１０Ｊ）での、７４８ｎｍリンクスダイオードレーザによる６５分間の照射前（左図）及び照射後（右図）における、ＰＢＳ：メタノール（３：２）中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの吸収スペクトルであり、制御された光退色について説明する。
【図７】空気飽和エタノール中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐ又はフェナレノンの３５５ｎｍでの励起に続いて、１２７０ｎｍで得た一重項酸素蛍光強度。リン光強度対レーザ強度の強度依存性の傾きにより、増感剤の一重項酸素量子収率を決定した。
【図８】照射下、８０μＭのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ存在下に得られるＥＰＲスペクトル。上図：ＰＢＳ中における４０ｍＭのＢＭＰＯを有するスペクトルは、ヒドロキシルラジカルを有するＢＭＰＯのスピン付加物のスペクトルに対応する。下図：ＤＭＳＯ中における４０ｍＭのＤＭＰＯを有するスペクトルは、スーパーオキシドを有するＤＭＰＯのスピン付加物のスペクトルに対応する。
【図９】［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃ］＝２０μＭの存在下、様々な光線量に対するＳ９１細胞の生存率（％）。細胞内に取り込まれていない光増感剤は、照射前に取り除かれていない。差し込み図：異なる濃度の増感剤におけるＳ９１細胞の細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの暗所における細胞毒性。
【図１０】１２時間の培養後、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ］＝５μＭの存在下、各種の光線量に対するＭＣＦ７細胞の生存率（％）。細胞内に取り込まれていない光増感剤は、照射前に取り除かれた。差し込み図：異なる濃度の増感剤におけるＭＣＦ細胞の細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの暗所での細胞毒性。効果的な光出力は、０．５３ｍＷ／ｃｍ２であった。
【図１１】投薬から２４時間後に照射したときの、前立腺癌細胞株ＰＣ−３中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の光毒性効果。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光を３０秒又は６０秒の間照射され、対応する光線量は、それぞれ３Ｊ／ｃｍ２及び６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１２】投薬から１８時間後に照射したときの、マウス大腸癌細胞株中の各種のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔ濃度に関して対照群と比較した細胞生存率。細胞内に取り込まれていない光増感剤は照射前に取り除かれた。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光で、６０秒間照射され、対応する光線量は、６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１３】１８時間の培養後、ヒト腺癌細胞株における各種のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ濃度に関して対照群と比較した細胞生存率。細胞内に取り込まれていない光増感剤は照射前に取り除かれた。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光で、６０秒間照射され、対応する光線量は、６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１４】１８時間の培養後、ヒト非小肺癌細胞株における各種のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔ濃度に関して対照群と比較した細胞生存率。細胞内に取り込まれていない光増感剤は照射前に取り除かれた。培地中の細胞は、７４８ｎｍのレーザ光で、６０秒間照射され、対応する光線量は、６Ｊ／ｃｍ２とされた。
【図１５】３．２６ｎＭ（実線）及び０．２６ｎＭ（ダッシュライン）のヒト血清濃度におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの蛍光発光であり、これらは検出限界を決定するために用いた。また、基線（ダッシュ−ドットライン）及びガウス曲線（ドットライン）については、低い蛍光強度のより正確な決定をするための最も低い濃度をシミュレートするために用いた。
【図１６】ＤＢＡ／２マウスに対する１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の、肝臓、血液及び脳の各質量で除したＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの蛍光発光。
【図１７】ＤＢＡ／２マウスに対する１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの薬物動態及び生体内分布。種々の組織（血液、腫瘍、心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉、皮膚）における蛍光強度は、それらの各質量により正規化された。
【図１８】ＤＢＡ／２マウスに対する１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の、腫瘍及び血液の各質量で除したＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの蛍光発光。
【図１９】ＣＴ２６腫瘍が埋めこまれ、かつＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔで処理されたＢａｌｂ／Ｃマウス中の腫瘍の体積。太線は、４匹の対照マウスにおける平均的な腫瘍の大きさを示す。これらはＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔが投与されているものの、照射がなされていない。エラーバーは、標準偏差である。細線は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ及び７４８ｎｍにおける１３２Ｊ／ｃｍ２のレーザ光で処理された個々の動物を表す。
【図２０】Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔで処理されたＤＢＡ／２マウスに埋め込まれたＳ９１腫瘍の大きさ。７４８ｎｍで２種のレーザ光線量を用いた。
【図２１】ミニブタの背中に局所的に適用した後３時間におけるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの共焦点蛍光。７４４ｎｍでの多光子励起、全てのノイズ除去、６枚の写真によって構成された蛍光平面画像、８００Ｖ＠検出器、ピンホール＝３７９μｍ。前記光増感剤は、角質層及び上皮の５０μｍを通過して拡散した。
【図２２】共焦点顕微鏡法により得られるミニブタの背中において局所的に適用した後３時間でのＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの吸収スペクトル。各種の線は、異なる部位の試料における測定に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
［ＩＩ．詳細な説明］
［ＩＩ．Ａ．定義］
ここで用いられる「過剰増殖性疾患」は、それらの状態の疾患が、基礎病理として、無秩序又は異常細胞増殖によって引き起こされる過剰な細胞増殖を共有することを意味し、制御されていない血管新生を含む。過剰増殖性疾患の例としては、これに限るものではないが、癌、骨髄腫、乾癬、黄斑変性症を含む疾患である。
【００６６】
ここで用いられる「過剰増殖性組織」は、制御不能に増殖する組織を意味し、腫瘍、及び、抑制することができない血管の増殖、例えば、加齢に関連する黄斑変性症において発見される血管の増殖等を含む。
【００６７】
ここで用いられる「腫瘍」は、新生物を意味し、良性腫瘍及び悪性腫瘍の両方を含む。この用語は特に、固形、又は非固形（例えば、白血病等）のいずれか一方となりうる悪性腫瘍を含む。腫瘍の例としては、胃癌、腸癌、肺癌、乳癌、子宮癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、非上皮性悪性腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、上顎癌、胆管癌、頭頸部癌、舌癌、脳腫瘍、皮膚癌、悪性甲状腺腫、前立腺癌、結腸直腸癌、耳下腺癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、腎臓癌、白血病及び悪性リンパ細胞腫である。
【００６８】
ここで用いられる「伝染性病原体」は、侵入してくる微生物又は寄生生物を意味する。ここで用いられる「微生物」は、ウイルス、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、菌類及び類似する微生物を意味し、「寄生生物」は、感染性の、一般的に微細な若しくは非常に小さい多細胞性の無脊椎動物、又は抗体誘導性のクリアランス（clearance）若しくは溶解又は食作用による破壊の影響を受け易い卵又はその幼形を意味する。
【００６９】
ここで用いられる「医薬品」又は「薬物」は、対象に適切に投与することにより、所望の治療上の効果又は予防効果を誘導することができる化学物質又は化学組成物を意味する。このような化学物質又は化学組成物は、光を吸収して、薬物として作用するためか、又は後で薬物として作用する他の化学物質を活性化するためかのいずれか一方に、それを用いる光増感剤を含むが、それに限定するものではない。
【００７０】
ここで用いられる「医薬として許容可能な組成物誘導体」は、生物学的活性基に結合される光増感剤である組成物を意味し、該活性基は、特定の生物環境において結合、蓄積又は排出を選択的に促進する基である。当技術分野で公知な例は、糖、アミノ酸誘導体、オリゴヌクレオチド、又は受容体（ステロイドホルモン、成長因子、神経伝達物質又は抗体）に固有の配位子から誘導された置換基を含む。前記置換基はまた、前記光増感剤の塩を含む。
【００７１】
ここで用いられる「医薬として許容可能な担体」は、タブレット、ピル、カプセル、クリーム、溶液、懸濁液、又はエマルジョンを形成する任意の溶媒、分散剤、添加剤を含む。これらの医薬組成物の成形方法は、当該技術分野で周知である。
【００７２】
ここで用いられる「表面浸透促進剤」は、例えば、皮膚及び他の組織のような障壁を通過する薬物の運搬を増加又は加速することができる化学物質又は組成物を意味し、ジメチルスルホキシド及び他のジアルキルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、種々のピロリドン誘導体、Ａｚｏｎｅ（登録商標）、又は、文献に記載されている他の任意の皮膚浸透補助剤、或いはそれらの混合物を含む。
【００７３】
ここで用いられる「照射」は、電磁スペクトルの全ての周波数に、対象を暴露することを意味する。好ましくは、照射波長は、前記薬物が吸収する光線の波長に一致するように選択される。
【００７４】
ここで用いられる「Ｌｕｚｉｔｉｎ」は、そのフェニル基におけるオルト位に電子吸引性を有するスルホン化テトラキスフェニルクロリン又はスルホン化テトラキスフェニルバクテリオクロリンを意味する。そして、以下に示す頭字語は、特定の化学物質を意味するが、この分子の一覧（portfolio）の例に限定するものではない。
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＣＬ−ｃは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−クロロ−５−スルホニルフェニル）クロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ−ｃは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）クロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−スルホニルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−クロロ−５−スルホニルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２は、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−スルホニルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−フルオロ−３−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−エチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐは、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−ヘプチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンであり、
−Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ２は、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロ−５−Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリンである。
【００７５】
また、ここで用いられる頭字語は、
「−Ｃｌ２ＰｈＢ」は、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロフェニル）バクテリオクロリンであり、
「−ＢＭＰＯ」は、５−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドであり、
「−ＤＭＰＯ」は、５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドであり、
「−ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドである。
【００７６】
［ＩＩ．Ｂ．前駆体化合物］
５，１０，１５，２０−テトラキス（ハロゲン化フェニル）ポルフィリン及び５，１０，１５，２０−テトラキス（２−シアノフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−トリフルオロメチルフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ニトロフェニル）ポルフィリン、並びに５，１０，１５，２０−テトラキス（２−カルボキシメチルフェニル）ポルフィリンは、１２０℃の酢酸／ニトロベンゼンの混合物中において、ピロールを、所望のハロゲン化フェニルアルデヒドと混合するというニトロベンゼン法によって合成された（非特許文献３３参照）。冷却後、純ポルフィリンは、反応媒体から直接晶出する。全ての特性データ（ＮＭＲ，ＦＡＢ及び微量分析）は、従来のポルフィリンと十分に一致した。
【００７７】
前記ポルフィリンのクロロスルホン化は、以前に開発された方法（非特許文献３４，３５参照）に従って行われた。所要のポルフィリン（２００ｍｇ）及びクロロスルホン酸（１０ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を、５０〜２５０℃の温度で１〜３時間撹拌した。この時間の後、ジクロロメタン（２００ｍｌ）をこの溶液に添加した。撹拌しつつ中和されるまで水抽出を継続的に行った。前記ジクロロメタン溶液を、炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させた。溶離剤としてジクロロメタンを用い、シリカゲルを充填したカラムクロマトグラフィーにより精製し、続いて、溶媒を蒸発させて、紫色の結晶として所望のクロロスルホン化ポルフィリンを得た。
【００７８】
上述したクロロスルホン化ポルフィリンの加水分解は、１００ｍｇの所望の化合物を、蒸留水（１２０ｍｌ）で懸濁し、１２時間還流することにより行われた。得られた溶液を、回転蒸発器によって濃縮し、得られた固体を１２０℃で乾燥した。前記スルホン酸ポルフィリン誘導体が定量的収率で得られた。ＮＭＲ，ＦＡＢ及び微量分析によるその特性は、従来のデータ（非特許文献３４，３５参照）と十分に一致した。
【００７９】
［ＩＩ．Ｃ．装置］
吸光スペクトルは、シマヅ社製ＵＶ−２１００分光光度計又は、これとＣａｒｒｙ ５０ バイオ分光光度計（バリアン社製、マルグレーヴ、米国）を用いて測定した。蛍光スペクトルは、スペックスフルオロログ３分光光度計、波長依存システム（ＲＣＡ Ｃ３１０３４光電子増倍管）のための補正、又はパーキンエルマー社製ＬＳ ５０蛍光光度計を用いて測定された。過渡吸収スペクトルは、アプライドフォトフィジックス社製ＬＫＳ ６０ナノ秒レーザーフラッシュ光分解動力学スペクトロメータにより、励起用のスペクトラ・フィジックス社製Ｑｕａｎｔａ Ｒａｙ ＧＣＲ １３０−０１ Ｎｄ／ＹＡＧレーザの第三高調波、ハママツ社製１Ｐ２８光電子増倍管、及びヒューレット・パッカード社製Ｉｎｆｉｎｉｕｍオシロスコープ（１ＧＳ／ｓ）を用いて測定した。閃光光分解測定は、空気存在下、アルゴン飽和溶液中で行った。光音響熱量測定は、前記Ｎｄ／ＹＡＧレーザと同一のものと、２．２５MHｚ Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ変換器（５６７６型）を有する自家製の正面光聴覚細胞と、テクトロニクス社製ＤＳＡ６０１過渡現象記録装置とを用いた（非特許文献３６参照）。室温一重項酸素リン光は、液体窒素室（プロダクツ・フォー・リサーチ社製、ＰＣ１７６ＴＳＣＥ００５型）で１９３Ｋまで冷却され、用いられたアプライドフォトフィジックス社製スペクトロメータを用い、３５５ｎｍで曝気溶液のレーザ励起を行った後に、ハママツ社製Ｒ５５０９−４２光電子増倍管を用いて１２７０ｎｍで測定された（非特許文献３７参照）。１２７０ｎｍでの一重項酸素の放出はまた、ＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザ（コンティナム社製、商品名：ＳｕｒｅｌｉｔｅＩＩ）によって生成された第三高調波（３５５ｎｍ）の５ナノ秒レーザパルスにより試料の励起に続いて、テクトロニクス社製デジタイジングスコープ（ＴＤＳ ５２０Ｂ）に連結された液体窒素によって冷却されたゲルマニウム検出器（ノースコースト社製）を用いて監視された。
【００８０】
元素分析は、フィソン・インスツルメント社製ＥＡ１１０８ ＣＨＮＳ−Ｏ元素分析計により行った。融点は、電熱キャピラリー融点測定器により測定された。１Ｈ−ＮＭＲ，１９Ｆ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚのＢｒｕｃｋｅｒ−Ａｍｘにより記録された。１Ｈ帰属は、２Ｄ ＣＯＳＹ及びＮＯＥＳＹ実験を用いて行われ、一方、１３Ｃ帰属は、２Ｄ ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ実験により行われた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳデータは、窒素レーザ（λ＝３３７ｎｍ）を備えるアプライドバイオシステムズＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ装置（フラミンガム社製、マサチューセッツ州、米国）を用いて獲得された。
【００８１】
少なくとも一つの不対電子を有する種の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルは、ブルカーＥＳＰ３００スペクトロメータ（ＩＢＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて行われた。標準的な装置の設定は、マイクロ波出力１０ｍＷ、振幅変調０．８G、掃引幅６０．０Ｇである。前記ＥＰＲスペクトルは、ハママツ社製ダイオードレーザによるその場照射の下で記録された。その後の設定は、登録されたスペクトルに対して用いられ、高出力（４ｍＷ）、低振幅変調（０．２Ｇ）及び狭走査範囲（６０Ｇ）、かつ、各スペクトルに対して２０走査が記録された。
【００８２】
インビトロ実験における照射は、ハロゲンランプ又はレーザ光源のいずれか一方を用いて行われた。第１の場合、５００Ｗのハロゲンランプが、照射される台から５０ｃｍの距離に配置され、均一な照射を保証した。冷却水フィルタ（ｄ＝３５ｍｍ）及び６００ｎｍ遮断フィルタが、前記ランプと試料との間に配置された。サンプルに届くフルエンス率は、３ｍＷ／ｃｍ２であった。前記ハロゲンランプの発光スペクトルは、分光放射計ＩＬ２０００（商品名：Ｓｐｅｃｔｏｒｏｃｕｂｅ）を用いて記録した（図１）。第２の場合、パイロットＰＣ５００レーザ制御装置（Ｓａｃｈｅｒ Ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ社製、マールブルク、ドイツ国）で作動する３つのリンクス外部空洞ダイオードレーザＴＥＣ５００が用いられた。レーザエネルギーは、７４８ｎｍレーザに対して４０ｍＷで安定であり、６４９ｎｍレーザに対して１０ｍＷで安定であり、そして６３３ｎｍレーザに対して１０ｍＷで安定であった。前記レーザエネルギーは、コヒーレント社製ＬａｓｅｒＣｈｅｃｋにより定期的に測定された。いくつかのインビトロ実験では、レーザ光は、マイクロベンチにおけるコリメータを介して光ファイバーに集中され、細胞へともたらされる。このシステムは、前記７４８ｎｍレーザ光を３０ｍＷに低下させた。
【００８３】
光退色実験におけるバクテリオクロリンの照射には、７４８ｎｍリンクスダイオードレーザを用いた。動物実験のために、７４８ｎｍで１４０ｍＷ出力の特注のハママツ社製ダイオードレーザ（ＬＡ０８７３，Ｓ／Ｎ Ｍ０７０３０１型）が用いられた。このダイオードレーザは、ソーラボ社の５００ｍＡ ＡＣＣ／ＡＰＣレーザダイオード制御装置及び社内製の電子装置により制御された。本実験に用いられたこのレーザエネルギー及び他の高エネルギーレーザは、オフィール社製ＡＮ／２Ｅ型レーザ出力計により定期的に検査された。
【００８４】
前記光増感剤の時間依存性の細胞取り込み及び細胞の生存能力は、ニコン社製ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＳ−１００Ｆ装置を用いる蛍光顕微鏡検査法によって確認された。
【００８５】
皮膚試料の蛍光は、Ｕ−ＭＳＷＧ２蛍光ミラーユニット（励起フィルタ４８０−５５０ｎｍ，発光フィルタ５９０ｎｍ，二色性フィルタ５７０ｎｍ）を用いるオリンパス社製蛍光マイクロスコピー（ＢＭ５１Ｍ型）により分析された。共焦点顕微鏡法は、６３´水（１．２開口数）アポクロマート対物レンズを備えるレイカＴＣＳ ＳＰ５（レイカマイクロシステムズＣＭＳ ＧｍｂＨ製、マンハイム、ドイツ国）倒立顕微鏡（ＤＭＩ６０００）により行われた。共焦点モードに移る前に、ＧＵＶ懸濁液は、光源としてナトリウムランプとＲｈｏｄ−ＤＯＰＥ蛍光を選択するフィルタとを用いて直接観察され、ＧＵＶ形成の収率を評価した。共焦点顕微鏡法における励振源は、Ａｒ＋レーザからの５１４ｎｍ線又はＴｉ−Ｓａレーザからの７４５ｎｍ線のいずれか一方である。前記発光は、５５０〜８００ｎｍに集中された。聴覚−光学調整可能な繊維、及びレイカＴＣＳ ＳＰＣ５システムのビーム分割器の利点を活用した。逆光は「スマートオフセット」と一致するように最小限にされる。これは常に０．５％以下で残存する（通常−０．１％〜０．１％の範囲の間）。ごく僅かな光子が脂質構造の外側で計測される。０．５ｎｍ以下の厚さの共焦点切片は、検流モータステージを用いて得られる。三次元投影は、レイカアプリケーションスート−高度蛍光ソフトウェアを用いて得られる。
【００８６】
［ＩＩ．Ｄ．方法］
［ＩＩ．Ｄ．１．分散係数］
ｎ−オクタノール：水分散係数（ＣＰ）は、従来の文献により記述されているフラスコ振盪法をわずかに修正したものを用いて測定された（非特許文献３５参照）。前記修正は、約５００ｎｍの吸収帯の励起及び赤色／赤外領域における蛍光の集中に関する。
【００８７】
［ＩＩ．Ｄ．２．光化学及び光物理］
光退色実験は、ＰＢＳ、ＰＢＳ：メタノール（５０：５０）及びメタノール溶液中で行われた。この溶液は、キュベット中で、１ｃｍの光路でかつ前記リンクスダイオードレーザを用いて照射される。前記溶液の初期吸収は、約０．８であった。光退色の機構は、前記ハママツ社製ダイオードレーザを８０ｍＷで用い、前記増感剤の照射によって評価した。前記増感剤は、アスコルビン酸又はアジドの存在するＰＢＳ中において照射された。
【００８８】
エタノール中で決定された蛍光量子収率（ΦF）は、トルエン中のＣｌ２ＰｈＢの蛍光量子収率を基準として得られたものである（非特許文献４参照）。基準及び試料溶液の両方の吸収は、５１５．５ｎｍの励起波長では約０．２で一致している。これらの溶液は、蛍光得る前に、１０倍に希釈した。前記蛍光量子収率は、試料対基準の蛍光帯の比率に、前記基準の蛍光量子収率（非特許文献１２によれば、０．０１２）を乗じ、その後、エタノール及びトルエンの屈折率の違いを補正して得られる。
【００８９】
光増感剤の三重項−三重項吸収スペクトル及び三重項寿命（τT）は、上述の一時吸収スペクトル装置において３５５ｎｍで励起されて測定された。ここで、前記溶液は、０．２５〜０．３０の範囲の吸光度を備えていた。
【００９０】
時間分解された光音響熱量測定（ＰＡＣ）は、上述のように設定され、非特許文献４に記載されている方法を用いてなされた。すべての測定は、エタノール中において、光音響の基準としてマンガン５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィリンを用いて行われた。
【００９１】
エタノール中における一重項量子収率は、非特許文献３７によって記載された方法を用い、基準としてフェナレノンを用いて得た。エタノール中においてフェナレノンにより得られた一重項酸素量子収率の文献値は、ΦΔ＝０．９５であった（非特許文献３８参照）。
【００９２】
［ＩＩ．Ｄ．３．電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）］
ＰＢＳ中で光増感剤が照射されることによって生成される活性酸素種、即ち、スーパーオキシドイオン及びヒドロキシラジカルは、種々のスピントラップの付加物を形成する。このような付加物は、ＥＰＲによって同定することができる。これらの測定に用いられる前記ＰＢＳ緩衝液は、過酸化物の分解を触媒する混入物である金属イオンを除去するため、キレート樹脂（Ｃｈｅｌｅｘ１００）により前処理された。２つのスピントラップは、ＢＭＰＯ及びＤＭＰＯを用いた。ＤＭＰＯは、先ず、活性炭／ベンゼンで精製され、その後、ε２２６＝７２００Ｍ-1ｃｍ−１を用いる分光光度法により、１．０Ｍ保存濃度が決定された。ＥＰＲ測定は、ハママツ社製ダイオードレーザを用いるその場照射により、上述のブルカーのスペクトロメータを用い、室温で行った。
【００９３】
［ＩＩ．Ｄ．４．皮膚浸透試験］
皮膚浸透試験を行うための最も優れた動物モデルは、ミニブタである。これは、ミニブタとヒトとの間の皮膚特性の類似の観点からである（非特許文献３９参照）。クリーム、軟膏、ゲル及び溶液という製剤の違いは、ミニブタの皮膚サンプルを通る前記光増感剤の浸透を促進するために用いられる。製剤は、０．１〜１０％の範囲で変量した前記光増感剤、例えば、Ａｚｏｎｅ（登録商標）及びＤＭＳＯのような浸透促進剤、及び種々の賦形剤等を含有する。インビボ試験は、ミニブタの背中に対して行われた。各試験において、前記製剤は、皮膚の約１ｃｍ２領域に、所望の期間、閉鎖包帯下で適用された。一旦前記期間が経過したら、前記製剤は薬さじで取り除かれ、そしてエタノールが浸漬された医療用綿で、該医療用綿中に前記増感剤が全くみられなくなるまで洗浄された。インビボ試験において、前記皮膚試料は外科的に取り除かれ、前記ミニブタはその後殺処分された。
【００９４】
前記皮膚試料の組織固定のための手順の第１工程は、パラホルムアルデヒド（４％水溶液）への少なくとも２４時間の浸漬である。次に、前記試料を、２５％ショ糖液に移動し、少なくとも４８時間浸漬した。この処理の後、前記皮膚サンプルは、前記ショ糖液よりも密度が高くなる。部分試料は、生検パンチを用いて採取され、ドライアイスで冷凍され、その後、組織Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｔｅｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．社製、ズーテルワウデ、オランダ国）と共に、ホルダーに取り付けられ、そして、低温槽（cryostate）中で、２５〜１００ｍｍの範囲の間で選択された厚さに制御されてスライスされた。前記皮膚スライスは、顕微鏡スライドガラス上に集められ、蛍光顕微鏡検査法及び共焦点顕微鏡法により分析されるまで冷凍保存された。他の方法として、前記皮膚試料は、固定剤としてパラホルムアルデヒドを用いるよりも、ドライアイス中に直接冷凍されてもよい。
【００９５】
［ＩＩ．Ｄ．５． インビトロ実験］
ここで記述される薬物は、インビトロ研究において評価されている。あるインビトロ研究では、いくつかのフィルタを備えるハロゲンランプによる照射が用いられた。他の場合では、各細胞培養に光を届けるダイオードレーザ照射が用いられた。
【００９６】
［ＩＩ．Ｄ．５．ｉ）ハロゲンランプ照射を用いたインビトロ実験］
ハロゲンランプ照射に用いられた細胞株は、ＭＣＦ７（ヒト乳癌由来）、ＳＫＭＥＬ１８８（ヒトメラノーマ由来）、及びＳ９１／Ｉ３（マウスメラノーマ由来）細胞であった。これらは、細胞毒性実験及び光細胞毒性実験の両方に用いられた。ＭＣＦ７細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２５ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、及び２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されて増殖された。ヒトメラノーマ細胞ＳＫＭＥＬ−１８８は、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたＦ１０培地で増殖された。クラウドマンＳ９１メラノーマ細胞のＩ３分株は、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）で補充されたＲＰＭＩ １６４０培地に培養された。全ての細胞株は、６０ｍｍ直径のペトリ皿において単層に培養され、５％ＣＯ２を含む湿雰囲気中、３７℃で保温された。
【００９７】
細胞毒性：細胞代謝効率及び生存能力は、生体吸収（uptake）と、細胞のシクロソーム酵素による臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の不溶性のホルマザン染料への還元とにより決定される。前記細胞株は、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを備えるＲＰＭＩ培地で増殖された。細胞は、５％のＣＯ２、９５％の空気及び１００％の湿度に維持された。細胞毒性を決定するために、これらの細胞は、９６ウェルプレートにおいて、完全培地中に、１×１０４細胞／ウェルの密度で接種された。２４時間後、前記細胞は、異なる濃度（０．２５から最大５０μＭ）の光増感剤と共に、１８時間、３７℃で保温された。前記細胞は、その後ＰＢＳで２回洗浄され、成長培地中で、３７℃の温度で２４時間保温された。次に、前記培地は、１００μｌの新鮮な培地及び２０μｌのＭＴＴで置き換えられ、前記細胞は、０．５ｍｇ／ｍｌの終濃度のＭＴＴと共に３時間保温された。その後、前記培地は、ＤＭＳＯ−メタノール溶液（１：１）に置き換えられ、ブルーホルマザン結晶が溶解された。前記９６ウェル培養プレートは、０．５分間、室温で振盪され、その後直ちにＥＬＩＳＡリーダ（ＧＥＮｉｏｓ Ｐｌｕｓ、Ｔｅｃａｎ Ｔｒａｄｉｎｇ ＡＧ社製、スイス国）を用いて５６０ｎｍで光学密度が読み取られた。生存している前記細胞は、前記ホルマザン塩の吸光度変化によって表され、生存率は、生存処理細胞数対生存無処理細胞数のパーセント比として与えられる。細胞の数は、検量線の直線回帰から決定された。
【００９８】
時間依存性の細胞生体吸収：ＳＫＭＥＬ−１８８、Ｓ９１、及びＭＣＦ７細胞は、９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルとなるように接種され、ＰＢＳ中の２０μＭ濃度のクロリン光増感剤及びバクテリオクロリン光増感剤に、各種の時間間隔（１０分から１８０分まで）で暴露され、時間依存性の薬物蓄積が精査された。保温期間の終わりに、前記細胞は、ＰＢＳで３回洗浄され、ＰＢＳ中において０．２５％のトリトンＸ−１００の１００μｌで再懸濁された。細胞に随伴された光増感剤の保持は、ＥＬＩＳＡリーダを用い、蓄積された光増感剤を蛍光測定することによって検出された。また、前記光増感剤の生体吸収及び前記細胞の生存能力は、蛍光顕微鏡検査法によって確認された。これらの実験により、ＳＫＭＥＬ−１９９，Ｓ９１及びＭＣＦ７細胞は、２０μＭの光増感剤とともに２時間保温され、続いて、前記細胞はＰＢＳで３回洗浄され、ＰＢＳに再懸濁され、蛍光顕微鏡検査法によって試験された。
【００９９】
細胞光増感：ＳＫＭＥＬ−１８８、Ｓ９１及びＭＣＦ７細胞は、上述のように製造された。細胞毒性試験に基づいて、５μＭの濃度の光増感剤が、光増感試験のために選択された。前記細胞は、３７℃で１２時間保温され、その後、０．５３ｍＷ／ｃｍ２のフルエンス率と、０．１〜０．６４Ｊｃｍ２の線量とで照射された。発明者は、光増感剤が、前記フィルタ処理されたハロゲンランプの利用可能なフルエンス率の約１／５のみを用いることを思い出した。前記ＭＴＴ試験は、２４時間照射を行った。その値は、３回の独立した実験から得て、対照細胞を基準とした生存する細胞の百分率として表した。対照細胞は、光増感剤と共に保温せず、照明を行わないことを除いて、同一の手順により操作した。
【０１００】
［ＩＩ．Ｄ．５．ｉｉ）レーザ照射によるインビトロ実験］
レーザ照射を行う細胞株は、ＨＴ−２９（ヒト大腸癌由来）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌由来）、ＳＷ２（ヒト小細胞肺癌由来）、Ａ−５４９（ヒト非小細胞肺癌由来）、Ｓ９１／Ｉ３（マウスメラノーマ）及びＣＴ２６（マウス大腸癌由来）であった。これらは、細胞毒性実験及び光細胞毒性実験の両方に用いられた。ＰＣ−３，ＳＷ２及びＳ９１／Ｉ３細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマアルドリッチ社製、シュテインハイム、ドイツ国）中で培養され、ＨＴ−２９，Ａ−５４９及びＣＴ２６細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ケンブレックスバイオシステムズ社製、ベルビエ、ベルギー国）で培養された。両方の細胞培養培地には、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ケンプレックスバイオシステムズ社製、ベルビエ、ベルギー国）が補充された。ＣＴ２６細胞に用いられる前記ＤＭＥＭ培地はまた、１０ｍＭのＨＥＰＥＳが補充されている。細胞株は７５ｃｍ２フラスコ（オレンジサイエンティフィック社製、ブレン・ラルー、ベルギー国）において、５％ＣＯ２を含む湿雰囲気中、３７℃で維持された。インビトロ研究のため、細胞は８５〜９０％のコンフルエンスで、トリプシン−ヴェルセン−ＥＤＴＡ溶液と分離され、計数され、所望の密度で、平底９６ウェルプレートに接種された。
【０１０１】
細胞生存能力試験：前記実験の最後に、細胞生存能力は、レザズリン還元試験によって評価された（非特許文献４０参照）。簡単に言えば、レザズリン（シグマアルドリッチ社製、シュテインハイム、ドイツ国）保存溶液（ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．１ｍｇ／ｍｌ）は、ＦＢＳ又は抗体を含まない培地で１０％に希釈され、２００μｌが前記ウェル中の細胞に添加された。プレートは、３〜４時間、３７℃で保温された。各ウェルの吸光度値は、マイクロプレートリーダＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ｅｘ（サーモエレクトロンコーポレーション製、ヴァンター、フィンランド国）を用いて５４０ｎｍ及び６３０ｎｍで測定した。
【０１０２】
細胞毒性：細胞は、平底９６ウェルプレート（オレンジサイエンティフィック社製、ブレン・ラルー、ベルギー国）中の１００μｌの培地に接種され、一晩の間付着された。前記光増感剤は０．０１〜１ｍＭの終濃度となるように（１００μｌの培地に希釈し）細胞に添加された。各濃度のものを、４組作製して試験を行った。暗所中、３７℃の保温期間は、試験される細胞株に対する倍増時間を２回とした。保温後、前記細胞生存能力を評価した。並列制御実験において、細胞は、前記薬剤なしで保温された。細胞毒性は、非処理細胞に対する相対的な細胞死を表すことにより定量した（対照細胞の％）。その結果は、用量反応曲線（前記薬物の濃度の関数としての細胞死の％）としてプロットされ、細胞増殖の５０％が抑制される濃度（ＩＣ５０）の決定がなされた。
【０１０３】
細胞光増感：細胞は、１００μｌの培地を有する透明な平底を備えるＤＢファルコンブラック９６ウェルプレート（ＤＢバイオサイエンス−ラボウェア社製、ニュージャージー州、米国）に接種され、一晩の間付着された。前記薬物は、所望の濃度を得るために、細胞（１００μｌ培地に希釈）に添加された。細胞は、前記薬物とともに、暗所に３７℃で所定の期間保温された。この保温期間は、通常、投薬から照射までの間隔（drug-to-light interval）として言及される。保温後、細胞は２００μｌのＰＢＳで１回洗浄され、細胞内に取り込まれていない薬物を除去し、１００μｌの新鮮な培地が添加された。細胞は、上述した前記リンクスダイオードレーザの７４８ｎｍの光を、１００．７ｍＷ／ｃｍ２の出力で照射された（各ウェルに個別に）。前記照射時間は所望の光線量を得るために選択された。２つの平行対象条件が試験された。即ち、細胞は最も高い用量の薬物と共に暗所で保温し照射を行わないことと、細胞は最も高い光線量となるように照射され薬物を用いないことと、である。前記照射後、１００μｌの新鮮な培地が添加された。細胞生存能力は、前記照射後、約２４時間で評価された。
【０１０４】
［ＩＩ．Ｄ．６．インビボ実験］
本研究において用いられたマウスは、２種類である。暗所毒性、生体内分布及び薬物動態研究には、クラクフのヤギェウォ大学の生化学、生物理学及びバイオテクノロジー学部における動物繁殖生産施設からの体重が２０〜３０ｇの体重のＤＢＡ／２マウスが用いられた。前記マウスは、標準実験用食の自由摂食及び摂水が維持された。実験目的のためのこのような動物の使用は、ヤギェウォ大学実験動物倫理委員会による承認を受けている（決定番号３８４／９９）。このようなマウスはまた、ＰＤＴに用いられた。
【０１０５】
他のマウスは、チャールズリバー研究所（バルセロナ）の動物繁殖生産施設からの２０〜２５ｇの重さのＢａｌｂ／Ｃである。前記マウスは、標準実験用食の自由摂食及び摂水が維持された。実験目的のためのこのような動物の使用は、神経科学及び細胞生物学センター（コインブラ）の委員による承認を受けている。
【０１０６】
本研究において用いられる４種のミニブタは、ＩＭＩＤＲＡ（Instituto Madrileno de Investigacion y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario）−アランフエス（マドリード）から得た。これらのミニブタは全て雌であり、６〜８ヶ月齢で、茶斑を有する白色のものであり、平均体重が５６．８ｋｇ（６６．２ｋｇ，５７．１ｋｇ，４３．５ｋｇ，６０．６ｋｇ）であった。これらのミニブタは、ベールデサンタレンの国立動物学駅で受け取り、１．５ｍ２の個別の箱に収容され、豚用の標準的な餌及び水を自由摂食させ、３週間の順応期間を設けた。本研究では、総局の動物の保護と健康（参照番号：０４２０／０００／０００／２００７）によって得られる許可におけるポルトガル倫理指針に従って行った。食餌は、処置前２４時間は停止した。前記ミニブタの背中を、製剤を適用する２４時間前に剃毛した。光増感剤の局所投与は麻酔下で行った。３０分前に行われた前治療は、アザペロン（Ｓｔｒｅｓｎｉｌ（登録商標）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＥＳＴＥＶＥ社製、スペイン国）２ｍｇ／ｋｇの筋中投与＋アトロピン硫酸塩５０ｍｇの皮下投与を行った。ケタミン（Ｃｌｏｒｋｅｔａｍ（登録商標）、ベトキノール社、仏国）を２０ｍｌ／ｋｇ筋中投与することにより、誘導を行った。前記麻酔は、酸素＋３％イソフルレン（Ｉｓｏｆｌｏ（登録商標）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＥＳＴＥＶＥ社製、スペイン国）を２〜３Ｌ／分で自然換気することを用いて、気管挿管することにより維持された。試料は、上述した麻酔下で３匹のミニブタから回収された。２０×２０×１０（長さ、幅、深さ）の大きさの皮膚の部分試料が外科的切開により得られた。前記皮膚試料の回収後、前記ミニブタは、過剰量のチオペンタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ）＋２０ｍｌの７．５％塩化カリウムを用いて殺処分された。４匹目のミニブタは、続いて、３週間の間、ミニブタ用の標準的な餌及び水を自由摂食させた。３週間後、前記光増感剤の局所投与を麻酔下で再び行った。前記ミニブタは、電気ショックにより意識を失わせ、頸部静脈切開により殺処分された。
【０１０７】
［ＩＩ．Ｅ．化合物の特性］
［ＩＩ．Ｅ．１．物理的特性］
背景の項で言及したように、ＰＤＴに関連する薬物の最も重要な物理的かつ化学的特性は、６００〜８００ｎｍ領域における強い吸収、一重項酸素生成の高い効率、化学的安定性、制御された光退色、及び−２〜５の範囲のオクタノール：水の分散係数である。これらの特性は、光治療ウインドウ（window）における所望の光吸収度、細胞毒性種の効率的な光生成、長期的な皮膚光線過敏のような副作用の低減、及び全身又は経皮性投与経路の容易化を満たす。
【０１０８】
化合物の吸光係数を、１〜２０μＭの範囲でいくつかの濃度で測定し、全ての場合において、ランベルト・ベールの法則に従って観察した。また、赤外光における最大吸収（λｍａｘ）波長は、研究した濃度範囲では変化しない。これは、分子間で凝集が生じず、前記分子は、研究された溶媒において、これらの濃度ではほとんどが単量体として存在していることを示す。表１は、典型的な赤色光及び赤外線に対するモル吸収係数（εｍａｘ）及び最大波長を示す。同表はまた、代表的なＬｕｚｉｔｉｎの蛍光量子収率（ΦＦ）を示す。前記蛍光量子収率は、塩素置換基の存在下で減少するこれらの分子を低減する。これは、このような分子に対して予期される重原子効果の特徴である。
【０１０９】
本実験において測定された前記Ｌｕｚｉｔｉｎの三重項−三重項吸収スペクトルは、クロリン及びバクテリオクロリンに対する従来のデータと十分に一致した。全ての三重項減衰は、明らかに単一指数関数的である。少なくとも３０分間窒素をフラッシングすることで製造される脱気溶液中、前記三重項寿命（τT）は、ミリ秒の範囲であり、酸素の非存在下において、光化学的に非効率的であることを示す。代表値を表１に示す。空気飽和エタノールにおける前記三重項寿命は、２００〜３００ナノ秒に落ち込み、対応するポルフィリンの寿命より顕著に短くなる。このような値は、電荷移動相互作用を介する前記増感剤の三重項状態から酸素分子への拡散律速エネルギー移動と一致する。
【０１１０】
曝気エタノール溶液中において測定された全ての一重項酸素発光は、典型的な一重項酸素寿命（τΔ）を有する単一指数関数的減衰によって非常によく表現される。表１の前記ΦΔ値は、上述した工程により得られ、これらの光増感剤を代表する。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
典型的に、Ｌｕｚｉｔｉｎの蛍光量子収率と一重項酸素量子収率との総和は、０．６〜０．８であり、他の工程のために用いられる吸収される光の２０〜４０％である。これらの工程は、時間依存性の光音響熱量測定（ＰＡＣ）及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）により研究された。ＰＡＣは、電子励起状態の減衰における無放射工程（内部転換、項間交差、化学反応）により放出されるエネルギー量を測定する。ＥＰＲは、前記試料中に存在し、不対電子（フリーラジカル）を有する種の量を測定するものであり、該ＰＡＣは、直接レーザ照射下において、光誘起によりスーパーオキシドイオン及び他の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を測定するために行われた。ＰＡＣによって測定された前記エネルギー放出は、ほぼ単位量子収率であるバクテリオクロリン三重項状態の形成と一致し、１０５〜１２５ｋＪ／ｍｏｌの三重項エネルギーであり、これはハロゲン化バクテリオクロリンにおける文献値と一致する（非特許文献１２参照）。ＤＭＰＯ及びＢＭＰＯの存在下におけるＰＢＳ中のＬｕｚｉｔｉｎに対する照射により得られるＥＰＲスペクトルは、スーパーオキシドイオンの存在と、ヒドロキシルラジカルの存在を示す。これと共に、前記ＥＰＲ及びＰＡＣデータは、７４８ｎｍでのこれら光増感剤の照射によるスーパーオキシドイオンの形成、及びこれに続くＬｕｚｉｔｉｎの光毒性に寄与するヒドロキシルラジカルの形成をもたらし、Ｌｕｚｉｔｉｎの光毒性に寄与することを明確に示している。従って、前記増感剤の光毒性は、それらの一重項酸素量子収率から予想される光毒性よりも高く、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の光毒性より既に５倍高くなっている。
【０１１３】
前記化合物の化学的安定性は、光、空気及びｐＨ変化に該化合物を曝すことにより調べられた。最も顕著な前記化学的安定性の低下は、適切な波長の光を曝気溶液に照射することにより生じた。このような状況の中で、前記化合物の光退色は、一次速度に従い、そして入射するレーザ光のエネルギーに比例する。一般に、光退色率はまた、溶液中に存在する水の量により増加することが知られている。ＰＢＳ：メタノール（５０：５０）中のＦｏｓｃａｎ（登録商標）（ｍ−ＴＨＰＣ）の光交換、及び類似バクテリオクロリン（ｍ−ＴＨＰＢ）の光変換が、Ｂｏｎｎｅｔｔにより報告されている（非特許文献４６参照）。アセトン及びトリトン−Ｘ：ＰＢＳ中のＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光変換が、Ｓｃｈｅｒｚにより報告されている（非特許文献３参照）。Ｌｕｚｉｔｉｎの光安定性と、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）及びＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光安定性とを比較するため、表２に、上述した代表的な薬物の半減期（ｔ１／２）を、１００ｍＷのレーザ出力で正規化したＦｏｓｃａｎ（登録商標）及びＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光安定性と共に示す。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
本実施形態におけるバクテリオクロリンの光退色と、ｍ−ＴＨＰＢ又はＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光変換とは区別される。この区別は、長期に亘るレーザ照射後、本実施形態におけるバクテリオクロリンのほとんどは、検出可能な可視吸収を有さない生成物に変換されることに基づくものであり、これは、適切には光退色として表現することができる。一方、ｍ−ＴＨＰＢ又はＴｏｏｋａｄ（登録商標）へのレーザ照射は、同一のレーザ光を吸収しない、対応するクロリンを大量に生成し、これは、より適切には他の染料への光変換と表現することができる。他の染料への光変換とは対照的に、本実施形態におけるバクテリオクロリンの光退色は、皮膚光線過敏をほとんど誘導しないという理由で、利点を有している。
【０１１６】
［ＩＩ．Ｅ．１．生物学的特性］
Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）は、インビトロにおける暗所毒性及びＰＤＴ有効性に対する重要なベンチマークである。非小細胞肺癌細胞株Ｈ１２９９に関する暗所におけるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の毒性は、いくつかのＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）濃度に対して評価され、ＩＣｄａｒｋ５０＝８．０μｇ／ｍｌに対する細胞生存能力は、５０％に低下した（非特許文献４７参照）。マウスの大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ−２６に関するＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の暗所毒性についての類似の研究によれば、ＩＣｄａｒｋ５０≒２０μｇ／ｍｌ（単量体と仮定すれば３０μＭ）であった（非特許文献４８参照）。ヒト腺癌細胞株（ＨＴ２９）は、ＰＤＴにおいて最も広く研究された細胞株の一つである。ＨＴ２９細胞におけるＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の濃度依存性の研究によれば、５Ｊ／ｃｍ２のフィルタ処理されたハロゲン光下における５０％致死濃度、ＩＣ５０＝７．５μｇ／ｍｌであった。９０％致死濃度は、ＩＣ９０＝４０μｇ／ｍｌに上昇した（非特許文献４９参照）。６５０ｎｍの色素レーザが１０Ｊ／ｃｍ２のエネルギーを与えるために用いられる場合、同一の細胞株に対し、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）は、より強い細胞毒性ＩＣ５０＝０．８μｇ／ｍｌを示す。しかしながら、この光線量は、ＩＣ９０＞１０μｇ／ｍｌであるのに対し、暗所毒性に限れば、ＩＣｄａｒｋ５０＝１３μｇ／ｍｌに落ち込む（非特許文献５０参照）。Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）とは対照的に、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）の分子構成は周知であり、モル単位におけるＩＣを表すのに都合がいい。これらの単位において、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）の暗所細胞毒性は、ＩＣｄａｒｋ５０＝１９μＭであり、１０Ｊ／ｃｍ２の光線量に対する毒性は、ＩＣ５０＝１．２μＭである。最後に、Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）は、２５Ｊ／ｃｍ２の照射の下、４８μＭの用量で、ＨＴ２９細胞に５０％死亡率を導くことを言及している点で興味深い（特許文献５）。ＩＣ５０及びＩＣ９０の値は、実験の投与形態、保温時間、光フルエンス及び他の条件に依存するが、上述された値は、当業界における最良実施例の指標となる。
【０１１７】
表３は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）及びＦｏｓｃａｎ（登録商標）の暗所毒性と、Ｌｕｚｉｔｉｎの暗所毒性との比較を示す。上述した方法を用い、以下の実施例において、更に詳細に説明する。ハロゲン化スルホン化クロリンの存在下、フィルタ処理されたハロゲン光下における、ある細胞株の５０％致死及び９０％致死に必要とされる光線量を、表４に示す。また、ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンについて対応する光線量を、表５に示す。表６は、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量の下、細胞の９０％致死に必要な各種のＬｕｚｉｔｉｎの濃度に関する光毒性を示す。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
【表６】
【０１２２】
表４〜６は、Ｌｕｚｉｔｉｎの低い暗所毒性及びＬｕｚｉｔｉｎの非常に高い光毒性を示す。表６には、各種の細胞株の細胞の９０％致死に必要なＬｕｚｉｔｉｎ濃度は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）で必要とされる濃度より最大１００倍低く、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）で必要とされる濃度より最大２０倍低い。６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量（本実験条件では、６０秒間照射した）とすることで、暗所においてはごくわずかな細胞毒性しか示さないＬｕｚｉｔｉｎ濃度で研究されたあらゆる細胞株の細胞の１００％を死滅させることができた。
【０１２３】
［ＩＩ．Ｆ．前記化合物及び組成物の使用方法］
Ｌｕｚｉｔｉｎは、臨床状況に応じて、局所的に、経口、静脈内、皮下、腹腔内、直腸、舌下、鼻、目、耳又は吸入用製剤として投与してもよい。前記製剤処方は、選択された投与経路に適するように構成される。前記製剤は、Ｌｕｚｉｔｉｎの他に（個々に、又は互いに組み合わせて）、医薬として許容可能な担体からなる。Ｌｕｚｉｔｉｎは、対応する塩、エステル、エノールエーテル若しくはエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、酸、塩基、溶媒、水和物、又は製剤に先立つプロドラッグとして誘導体化されてもよい。
【０１２４】
局所投与又は全身投与、またはその両方に続いて、治療領域は、適切な波長の光に暴露される。前記波長は、好ましくは、クロリンに対しては６３０〜６９０ｎｍの範囲、バクテリオクロリンに対しては７２０〜７８０ｎｍの範囲である。最も好ましくは、レーザを用いて暴露させる。身体の様々な領域に照射するための方法は、当技術分野において周知である。投薬から照射までの間隔は、投与の形態に依存し、数分から数日の間としてもよい。光線量は、投与経路、光源及び治療標的に依存する。連続的なレーザ照射の間、２〜２００ｍＷ／ｃｍ２の範囲のレーザ出力で、前記光線量は１０〜２５０Ｊ／ｃｍ２の範囲とすべきである。０．００１〜１０ｍＪ／ｃｍ２の範囲のパルス当たりのエネルギーであるパルスレーザ照射を用いてもよい。前記光線量は、単回又は複数回のセッションに適用してもよい。診断を目的とする場合には、前記光線量は少なくしてもよい。広帯域光源を前記照射に用いる場合、前記光線量は、前記Ｌｕｚｉｔｉｎが吸収するスペクトル領域における光源のエネルギーを維持するために、レーザ照射に関して規定された水準に増加される。
【０１２５】
前記Ｌｕｚｉｔｉｎは、単回投与されてもよく、又は時間間隔毎に、より少量の用量を、複数回に分割して投与してもよい。Ｌｕｚｉｔｉｎは、相乗効果を得るために、他の薬剤と同時に投与されてもよい。前記投薬から照射までの間隔の後に照射される光線量は、単回線量に対して、上述した範囲に入る。治療は、様々な時間間隔で複数回繰り返してもよい。治療の正確な用量及び持続時間は、治療される疾患に依存し、当業界において周知の手順を用いて実験的に決定されてもよいと理解される。
【０１２６】
［ＩＩ．Ｆ．１．全身投与（経口、注射、エアロゾル、経腸）］
経口投与に関連する共通の制限は、胃の中で見られる酸性条件下における前記薬剤の推定消化力である。以下の実施例において示すように、Ｌｕｚｉｔｉｎは、ｐＨ１で３時間の間、比較的安定である。低ｐＨで観察されるスペクトル変化は、ピロール環のプロトン化に起因するが、酸性度が中和されるときに元の状態に回復する。経口投与において頻発に遭遇する他の問題点は、生体利用効率についてである。腸内吸収では、Ｌｕｚｉｔｉｎを、リピンスキーのルールオブファイブを満たすように近づけることができる（非特許文献５１参照）。Ｌｕｚｉｔｉｎは、ｌｏｇKOW＜５であり、４個の水素結合供与体と、１２個の水素結合受容体と、１ｋＤの分子量とを有する。この最後のパラメータのみ、前記ルールの制限を著しく超えている。
【０１２７】
Ｌｕｚｉｔｉｎの物理的化学的特性を考慮すると、固体、半固体及び液体のいずれの投薬形態も考えられる。この点について、種々の薬の剤形及び投与形態における製剤補助剤の観点から最新技術を考慮すべきである。
【０１２８】
全身投与における投薬から照射までの間隔は、投与形態により、好ましくは、数分間から３日間の範囲である。医薬組成物は、一日あたりの用量を、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲のＬｕｚｉｔｉｎ（又はＬｕｚｉｔｉｎの組み合わせ）とすべきある。好ましくは、Ｌｕｚｉｔｉｎの一日あたりの用量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【０１２９】
［ＩＩ．Ｆ．２．局所投与］
局所投与は、液体、ゲル、ヒドロゲル、クリーム軟膏、スプレー又は他の許容可能な皮膚製剤の形態で、一つ又は様々な表面浸透促進剤及び他の添加剤を含む適切な製剤により達成することができる。背景技術で述べたように、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）又は他の大分子量光増感剤において達成された皮膚浸透は、皮膚疾患の効果的なＰＤＴに対しては不十分である。また、Ｌｕｚｉｔｉｎは、優れた皮内到達させるための基準のほとんどを満たすことができない（非特許文献３２参照）。しかしながら、両親媒性及び水素結合能力と、所定の範囲の分子量とを調整する本実施例の化合物の能力は、該化合物の真皮への受動拡散を促進する製剤を得るための作業を容易にする。実施例２１において示されるゲル形態は、製造早さ、及び皮膚への効率的な局所的運搬を示す。
【０１３０】
局所投与における投薬から照射までの好ましい間隔は、１５分から３時間である。前記製剤は、０．０１〜１０％のＬｕｚｉｔｉｎを含むべきである。好ましい実施形態では、前記製剤中の増感剤の割合は、０．１〜１％である。
【０１３１】
局所投与は、目への適用もまた考慮される。目への使用を意図する適用には、０．０１〜１０％の等張液であって、ｐＨ５〜７であって、適切な塩を有するものとして製剤されてもよい。
【実施例】
【０１３２】
［実施例１］電子吸引性置換基を有するバクテリオクロリンの固体状態合成法
本実施例は、無溶媒、かつ無基剤であって、従って、ポルフィリン及びヒドラジド（ともに固体）のみを出発物質として用いて合成することができる広範なバクテリオクロリンについて説明する。
【０１３３】
一つの製造方法として、６０ｍｇ（６．８×１０−５ｍｏｌ）の５，１０，１５，２０−テトラキス（２−トリフルオロメチルフェニル）ポルフィリンと、５００ｍｇ（２．７×１０−３ｍｏｌ）のｐ−トルエンスルホニルヒドラジドとを、両方とも細かい粉末状のものを混合した。これを反応器に添加した。前記反応器を真空にし、Ｎ２雰囲気下密封し、１００℃以上の温度で数分間加熱した。冷却後（室温）、固体を除去し、ｐ−トルエンスルホニルヒドラジドの一部の２５０ｍｇ（１．４×１０−３ｍｏｌ）を、ポルフィリンソーレー帯が完全に消失するまで添加した。バクテリオクロリンを、少量の有機溶媒により抽出した。過剰なヒドラジドを、溶離液としてジクロロメタン／ｎ−ヘキサンを用いて、シリカゲルを用い短いろ過器（カラム長８ｃｍ、カラム内径２．５ｃｍ）により除去した。溶媒蒸発し、ジエチルエーテル／ペンタンからの再結晶の後に、クロリンの混入が５％未満の９０％ＣＦ３ＰｈＢを得た。
【０１３４】
単離精製物のＮＭＲデータは、以下の通りである。
1H NMR: (400,13 MHz, CDCl3) δ, ppm: 7.47-7.45 (m, 4H); 7.26- 7.20 (m, 8H); 7.15-7.12 (m, 4H); 2.42 (s, 4H); 2.37 (s, 4H); -1.27 (s, 2H)。
【０１３５】
［実施例２］ハロゲン化クロリンの固体状態合成法
５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロフェニル−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）クロリン、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ−ｃの一製造方法として、５０ｍｇ（４．７２×１０−５ｍｏｌ）の５，１０，１５，２０−テトラキス（２−フルオロフェニル−５−Ｎ−メチルスルファモイルフェニル）ポルフィリンと、１８ｍｇ（９．４４×１０−５ｍｏｌ）のｐ−トルエンスルホニルヒドラジドとを混合した。反応器を真空にし、Ｎ２雰囲気下で密封し、１００℃以上の温度で数分間加熱した。冷却後（室温）、少量の有機溶媒を用いて固体を除去し、過剰なヒドラジドを、酢酸エチル／ヘキサンを溶離液とするシリカゲルを用いる短いろ過器により除去した。約１０％のバクテリオクロリンが混入したクロリンの混合物を得た。前記クロリン及びバクテリオクロリンの混合物を、ジクロロメタンで溶解し、空気の存在下、５０℃の温度で加熱することにより、対応するクロリンに酸化した。
【０１３６】
ジエチルエーテル／ペンタンからの再結晶により、バクテリオクロリンの混入が１％未満である９０％Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ−ｃを得た。図２に、最終生成物の吸収スペクトルを示す。
【０１３７】
［実施例３］ハロゲン化バクテリオクロリンの固体状態合成法
本実施例は、ハロゲン化両親媒性バクテリオクロリンの無溶媒、ワンポット合成を含む、汚染が無く、簡易で、経済的で、環境に優しい合成方法である。
【０１３８】
適切なポルフィリン（固体）及びｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（固体）を、摩砕し、微細な粉末とし、十分に混合する。次に、前記混合物を反応器に導入し、高真空にする。反応器は、その後密封し、真空下を維持し、又は不活性ガスで繰り返し洗浄する。最後に、反応器を密封した状態で、１〜３４０分の範囲の時間、加熱（７０〜２００℃の範囲の温度）する。いったん反応が完了し、反応器が室温になると、対応するバクテリオクロリンが９０％の収率で得られる。シリカゲルカラムを用いる短いろ過器でろ過した後に、対応するクロリンの混入が５％未満であるバクテリオクロリンを得ることができる。
【０１３９】
本方法を用い、５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−エチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリン、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの一製造方法として、５０ｍｇ（３．８×１０−５ｍｏｌ）の５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−スルホエチルフェニル）ポルフィリンと、１８８ｍｇ（１０−３ｍｏｌ）のｐ−トルエンスルホニルヒドラジドとを混合し、エドワードポンプを用いて反応器を真空にして、密封し、その後、反応器を７０℃以上の温度で数分間加熱した。冷却後（室温）、少量のジエチルエーテルを用いて固体を除去し、過剰なヒドラジドを、酢酸エチル／ジエチルエーテルを溶離液とするシリカゲルを用いる短いろ過器（カラム長４ｃｍ、カラム内径２．５ｃｍ）により除去した。溶媒蒸発後、ジエチルエーテル／ペンタンからの再結晶により、結果として固体を得ることができ、９０％の収率でＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔを得た。図３の吸収スペクトルによれば、対応するクロリンの存在が５％未満であることが明らかである。試料中にときどき現れるクロリンの量を補正した前記クロリン及び他のバクテリオクロリンのモル吸収係数を、表１に示す。図３以下のスペクトルと、特許文献１のスペクトル、またコインブラ大学のスペクトルとを比較すると、クロリン混入物が、今般の新合成法によれば、少なくとも１０の因子において減少しており、より効率的で、労力が少なく、環境に優しい方法であることが明らかである。単離精製物のＮＭＲ及びＭＳデータを以下に示す。
1H NMR: (300 MHz, CDCl3) δ, ppm: 8,42 (d, J = 8,55 Hz , 4H, p-H); 7,88 (d, J = 8,55 Hz, 4H, m-H); 7,84- 7,82 (m, 4H, β-H);5,01(m, 4H, N-H); 3,91(s, 8H, β-H); 3,22 (m, 8H, CH2 ); 1,24 (t, 12H, J = 6,73 Hz, CH3 ); -1,29 (s, 2H, NH).
MS: (MALDI-TOF), m/z: 1322,0 [M]+。
【０１４０】
［実施例４］ハロゲン化バクテリオクロリンにおけるアトロプ異性体
本実施例は、ハロゲン化され、かつスルホン化されたバクテリオクロリン中に存在し、容易に分離することができる安定なアトロプ異性体について示す。また、赤外領域で、より高い減衰係数を有する極性のより高いアトロプ異性体についても示す。
【０１４１】
第１溶離液として酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（１：１）を用い、最終の溶離液として酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（３：１）を用いると共に、長いカラム（カラム長８ｃｍ、カラム内径２．５ｃｍ）を用いることを除いて、実施例３に記載の方法を用い、２つの画分中の５，１０，１５，２０−テトラキス（２，６−ジクロロ−３−Ｎ−エチルスルファモイルフェニル）バクテリオクロリン，Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの分離を観察した。各画分は、ＴＣＬにおいて２つのスポットを示し、これは、極性のより小さいアトロプ異性体αβαβ＋α２β２の混合物又は極性のより高いアトロプ異性体βα３＋α４の混合物として同定された。図４は、より高い極性を有するアトロプ異性体の混合物の吸収スペクトルを示す。この画分は、７５０ｎｍ帯で、εの強度が５０％増して１５０，０００Ｍ−１ｃｍ−１に到達することを示す。
【０１４２】
［実施例５］ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンのｐＨ安定性
本実施例は、ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの、胃の中でみられる酸性条件であるｐＨ１及び３７℃における安定性を示す。
【０１４３】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２を、中性水溶液に溶解し、３７℃で平衡化したところ、図５に示す吸収スペクトルを得た。水溶液中にＨＣｌを滴下し、ｐＨを１より小さくし、２時間後、ｐＨ１におけるＬｕｚｉｔｉｎ-Ｃｌ２の吸収スペクトルを記録した。その後、ＮａＯＨの水溶液を添加して該溶液を中和し、新たな吸収スペクトルを３時間後に記録した。図５は、ＨＣｌ及びＮａＯＨの水溶液の添加によりなされた希釈に対して補正された吸収スペクトルを示す。低いｐＨで観察されたスペクトル変化は、ピロール環のプロトン化によるものであるが、酸性度が中和されると回復する。これらの条件下において、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の半分近くは、回復し、他の半分は、対応するクロリンへと変換された。
【０１４４】
［実施例６］ハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの光安定性
本実施例は、赤外光照射に対するハロゲン化スルホン化バクテリオクロリンの増加された安定性を示す。それは、他のバクテリオクロリン、例えば、５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロキシフェニル）バクテリオクロリン等の合成バクテリオクロリン又は、例えば、Ｔｏｏｋａｄ（登録商標）等の自然発生生成物から誘導されたバクテリオクロリンにおいて見られる不安定性の問題を解決する。
【０１４５】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔを、ＰＢＳ：メタノール（２：３）に溶解し、１ｃｍ石英セルに移動し、その吸収スペクトルを記録した（図６）。前記石英セルを、その後、該石英セルのウインドウと一致するビーム直径を有するように予め非集束させたリンクスダイオードレーザによる７４８ｎｍのビーム中に配置した。これらの条件下において測定されたレーザ出力は、２８．８ｍＷであった。５分ごとに、照射を中断し、新たな吸収スペクトルを記録した。この手順は、６５分間続けられた。光退色は、実験のタイムウインドウ（time window）における一次反応の反応速度論に従う。図６は、照射後の吸収スペクトルもまた示す。７４３ｎｍにおけるバクテリオクロリンピークは、吸光度が１．１２８から０．３３７に低下した一方、クロリンの吸光度は、０．１１４から０．１５１にわずかながら上昇した。これらの波長における化合物のモル吸収係数を考慮すると、前記バクテリオクロリンの７０％は前記照射の間に破壊されている。一方、数％ながらクロリンの形成がなされていることが明らかである。残りの生成物は、可視光線／赤外線領域中においてよく分解されるスペクトルはないが、主要な光崩壊過程は、光退色として説明できる。
【０１４６】
光退色の半減期は、異なるレーザ強度に対して測定され、レーザ出力に比例することが示された。７４８ｎｍにおける１００ｍＷレーザ照射で正規化された他のバクテリオクロリンの半減期を、同一の光強度で正規化されたＦｏｓｃａｎ（登録商標）及びＴｏｏｋａｄ（登録商標）の光崩壊の文献値と共に、表１に示す。光増感剤のＰＢＳ溶液が、アルゴンで飽和され、溶液中の酸素濃度が低下している場合、３０の因子によってＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃの半減期が増加することが観察された。これは、光退色にＲＯＳが関与していることを示す。
【０１４７】
［実施例７］
一重項酸素の効率的な光生成
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎ、適切な波長の光、及び溶液中の溶存酸素分子の存在下における一重項酸素の効率的な生成について説明する。
【０１４８】
３５５ｎｍにおいて約０．２の吸光度を有するエタノール中におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐの空気飽和溶液は、１ｃｍ石英キュベット中において、Ｎｄ：ＹＡＧレーザパルスによって励起され、一重項酸素発光が、上述した装置及び方法を用い、１２７０ｎｍで続いて起きる。前記一重項酸素リン光の強度を、レーザ強度の関数として観察した。同様の観察を、エタノール中のフェナレンオンに対し、３５５ｎｍにおけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐの吸光度に対応する濃度にして行った。図７は、空気飽和エタノール中において、３５５ｎｍにおけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐ又はフェナレンオン励起の後、１２７０ｎｍで測定した一重項酸素リン光強度のレーザエネルギー依存性を示す。種々のレーザエネルギーを用い、一重項酸素発光のエネルギー依存性の傾き及び前記エタノール中のフェナレンオンに対するΦΔ＝０．９５の値から、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｈｅｐに対するΦΔ＝０．７８を得た。他のバクテリオクロリンに対する値を、表１に示す。
【０１４９】
一重項酸素生成の量子収率が約７０％であることに関連するバクテリオクロリンの光安定性は、連続照射下におけるバクテリオクロリンの分子が、光退色の前に、大量の電子的に励起された酸素分子を局所的に生成することを示唆する。増感剤によって吸収されるエネルギーの約３０％は、他の工程において失われる。前記他の工程のいくつかは、以下の実施例において同定された。
【０１５０】
［実施例８］
本実施例は、増感剤としてＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを用いる、活性酸素種、即ち、スーパーオキシドイオン及びヒドロキシルラジカルの生成について記載する。
【０１５１】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌによるスーパーオキシドイオン及びヒドロキシルラジカルの光生成を評価するため、３０〜８０μＭのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ及び４０ｍＭのＢＭＰＯの存在下におけるＥＰＲスペクトルを、以下の条件において測定した。
ａ）暗所中における空気飽和水溶液。
ｂ）ハママツ社製ダイオードレーザにより８分間照射された窒素飽和水溶液。
ｃ）ハママツ社製ダイオードレーザにより４分間照射された空気飽和水溶液。
ｄ）ハママツ社製ダイオードレーザにより８分間照射された空気飽和水溶液。
ｅ）ハママツ社製ダイオードレーザにより１６分間照射された空気飽和水溶液。
ｆ）スーパーオキシドジスムターゼ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下、ハママツ社製ダイオードレーザにより１６分間照射された空気飽和水溶液。
ｇ）カタラーゼ（３０μｇ／ｍｌ）の存在下、ハママツ社製ダイオードレーザにより１６分間照射された空気飽和水溶液。
【０１５２】
実験条件（ａ）及び（ｂ）下では、ＲＯＳ−ＢＭＰＯ付加物は、検出されなかった。しかしながら、実験条件（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）下では、ＢＭＰＯ及びヒドロキシラジカルの間で形成されたＢＭＰＯ付加物が検出された（図８）。光の存在は、このような付加物の形成に必要不可欠である。実験条件（ｆ）は、スーパーオキシドイオンの捕捉剤として知られるスーパーオキシドジスムターゼがＢＭＰＯ−ヒドロキシルラジカル付加物の形成を抑制することを意味する兆候（signal）がなかった。また、実験条件（ｇ）もまた前記兆候がなく、過酸化水素を破壊し、水と酸素分子にするカタラーゼもまたＢＭＰＯ−ヒドロキシラジカル付加物の形成を抑制することが明らかである。これらの結果は、ヒドロキシラジカルは、光増感剤及び酸素分子から直接形成されるのではなく、むしろ二次生成物であることを意味する。スーパーオキシドジスムターゼによって観察された抑制は、スーパーオキシドイオンの形成に対する有力な証拠である。カタラーゼによって観察された抑制は、過酸化水素もまたヒドロキシラジカルの前駆体であることを示唆する。
【０１５３】
同様の実験を、ＤＭＳＯ中におけるＤＭＰＯに対して行った。空気及び光の存在下、ＤＭＰＯ−スーパーオキシド付加物が検出された（図８）。しかしながら、空気若しくは光がない場合、又はスーパーオキシドジスムターゼの存在下では、前記付加物は観察されなかった。
【０１５４】
総合すれば、これらのデータは、スーパーオキシドイオンの形成、後述の過酸化水素の形成、及びその後に続くヒドロキシラジカルの形成を示唆している。これらの全ては、細胞に傷害を与える能力を有する活性酸素種であることを十分に裏付けしている。これらのＲＯＳは、バクテリオクロリンの一重項酸素形成効率の約７０％を補完しており、そして、増感剤によって吸収されたエネルギーの残りの３０％は、失われるのではなく、むしろ一重項酸素に加えて他の細胞毒性種の形成に用いられることを示している。
【０１５５】
［実施例９］標準的なランプ照射下におけるマウスメラノーマ細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、フィルタ処理されたハロゲン光照射下での、マウスメラノーマ細胞に非常に強い毒性を有する濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１５６】
照射前に、培養後の細胞に対し細胞内に取り込まれていない光増感剤を取り除くための洗浄を行わなかったことを除き、上述した物質及び方法によって、Ｓ９１（マウスメラノーマ）細胞株中におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの暗所における細胞毒性、及び光増感活性を測定した。図９における差し込み図は、培養時間１２０分におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃの異なる濃度の暗所における細胞毒性を示す。図９は、細胞が［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃ］＝２０μＭの存在下において照射されたときの、異なる光線量（light dose）に対するＳ９１細胞の生存率を示す。培養中の細胞の９０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ９０）、又は培養中の細胞の５０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ５０）を、表３に示す。
【０１５７】
［実施例１０］標準的なランプ照射下におけるマウスメラノーマ細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、フィルタ処理されたハロゲン光照射下での、ヒト乳癌細胞に非常に強い毒性を有する濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１５８】
上述した物質及び方法によって、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの暗所における細胞毒性及び光増感活性を測定した。図１０における差し込み図は、培養時間１２時間におけるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの異なる濃度の暗所における細胞毒性を示す。図１０は、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ］＝５μＭ及び各種の光線量に対するＭＣＦ７細胞の生存率を示す。培養中の細胞の９０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ９０）、又は培養中の細胞の５０％を死滅させるために必要とされる光線量（ＬＤ５０）を、表４に示す。
【０１５９】
［実施例１１］レーザ照射下におけるヒト前立腺癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２のインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下においてヒト前立腺癌細胞に対して非常に強い毒性を示す濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６０】
上述した物質及び方法によって、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の暗所における細胞毒性を測定した。これらの実験によれば、０．０５ｍＭがＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して、相対的に全く影響を与えない。これを、以下の光毒性研究における基準濃度とする。
【０１６１】
ＰＣ−３細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２の光増感活性を、上述した物質及び方法を用いて測定した。図１１は、この光増感剤の各種の濃度に対する、３Ｊ／ｃｍ２及び６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び２４時間の培養時間における生存率を示す。図１１によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２］＝２０μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。
【０１６２】
［実施例１２］レーザ照射下におけるマウス大腸癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下での、マウス大腸癌細胞に対して非常に強い毒性を有する濃度において、その暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６３】
ＣＴ２６（マウス大腸癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの暗所における細胞毒性は、細胞毒性がＩＣ５０の水準に到達する前に、培地中においてこの化合物が沈殿してしまうので、ＩＣ５０に関して測定できなかった。５０μＭの濃度がＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して相対的に全く影響を与えない。
【０１６４】
ＣＴ２６細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔの光増感活性を、上述した物質及び方法を用いて測定した。図１２は、この光増感剤の各種の濃度に対する、６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び１８時間の培養時間における生存率を示す。図１２は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔが５μＭの濃度のときに、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることで９０％の細胞を死滅させる（ＬＤ９０＝５μＭ）ことを示している。図１２によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２］＝１０μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。表６は、２８．５ｍＷでの６Ｊ／ｃｍ２のレーザ照射下、様々な他の細胞株においてＬＤ９０に到達するのに必要とされるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔ濃度を示す。
【０１６５】
［実施例１３］レーザ照射下におけるヒト大腸癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下での、ヒト大腸癌細胞に対して非常に強い毒性を有する濃度において、その暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６６】
ＨＴ−２９（ヒト結腸線癌）細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの暗所における細胞毒性は、細胞毒性がＩＣ５０の水準に到達する前に、培地中においてこの化合物が沈殿してしまうので、ＩＣ５０に関して測定できなかった。５０μＭの濃度がＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して相対的に全く影響を与えない。
【０１６７】
ＨＴ−２９細胞株中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの光増感活性を、上述した物質及び方法を用いて測定した。図１３は、この光増感剤の各種の濃度に対する、６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び１８時間の培養時間における生存率を示す。図１３は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔが０．５μＭの濃度であるときに、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることで９０％の細胞を死滅させる（ＬＤ９０＝１μＭ）ことを示している。図１３によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ］＝１μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。表６は、２８．５ｍＷでの６Ｊ／ｃｍ２のレーザ照射下、様々な他の細胞株においてＬＤ９０に到達するのに必要とされるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔ濃度を示す。
【０１６８】
［実施例１４］レーザ照射下におけるヒト非小細胞肺癌細胞株に関するＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔのインビトロ光毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、レーザ照射下での、ヒト非小細胞肺癌細胞に非常に強い毒性を有する濃度において、暗所毒性はごくわずかであることを示す。
【０１６９】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２ＭｅｔのＡ−５４９（ヒト非小細胞肺癌）細胞株に対する暗所における細胞毒性は、細胞毒性がＩＣ５０の水準に到達する前に、培地中においてこの化合物が沈殿してしまうので、ＩＣ５０に関して、測定することができなかった。５０μＭの濃度がＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔの最も高い濃度である。前記濃度は暗所における試験中の細胞株の生存能力に関して相対的に全く影響を与えない。
【０１７０】
図１４は、この光増感剤の各種の濃度に対する、６Ｊ／ｃｍ２の光線量及び１８時間の培養時間における生存率を示す。図１４は、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔが０．５μＭの濃度であるときに、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることで９０％の細胞を死滅させる（ＬＤ９０＝０．５μＭ）ことを示している。図１４によれば、［Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔ］＝０．５μＭは、６Ｊ／ｃｍ２のレーザ光線量に暴露させることにより１００％の細胞を死滅させることが明らかである。表６は、２８．５ｍＷでの６Ｊ／ｃｍ２のレーザ照射下、様々な他の細胞株においてＬＤ９０に到達するのに必要とされるＬｕｚｉｔｉｎ−Ｆ２Ｍｅｔ濃度を示す。
【０１７１】
［実施例１５］蛍光検出限界
本実施例は、生物学的試料における極限感度及びＬｕｚｉｔｉｎの検出の選択性を示す。
【０１７２】
エタノールに溶解されたＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔ１％原液のヒト血清への希釈によって製造された異なる濃度の溶液。前記濃度の範囲は、０．２ｎＭ〜１０ｎＭである。前記試料を、励起及び発光のためのスリット４：５：３を用い、上述した蛍光光度計により５１４ｎｍで励起した。図１５に示すように、前記発光は赤外領域において得られた。
【０１７３】
前記検出限界は、以下の式を用いて決定された。
【０１７４】
（式中、Ｓｙ／ｘは、検量線の標準偏差であり、ｂはその傾きである。検出限界は、０．１７ｎＭ（又は０．２ｎｇ／ｇ）であった。
【０１７５】
［実施例１６］暗所におけるインビボ毒性
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、市販の光増感剤を用いるＰＤＴ用に認可された濃度よりも高い濃度であっても、マウスに対して毒性を有さないことを示す。
【０１７６】
前記マウスを、以下の実験群に分割した。
ａ）２ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｂ）５ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｃ）１０ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｄ）１５ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｅ）２０ｍｇ／ｋｇのＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを投与されたマウス１０匹。
ｆ）何も投与されていないマウス１０匹、そして、これらのマウスを対照群とした。
【０１７７】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌの溶液（０．５ｍｌ）を皮下投与し、該投与されたマウスを３０日間よく観察した。投与後、最初の６日間は、群（ｅ）のマウスは、光に対して過敏であることが明らかであり、群（ｄ）のうち何匹かのマウスは、軽度の過敏であることが明らかであった。動物は、直接に指向される光源から遠ざかることにより過敏性を示す。これらのマウスは、定期的に体重測定されたが、いずれのマウスにも有意な体重変化はみられなかった。３０日後、前記マウスを、モルビタール（Morbital）（バイオウェット社製、ポーランド国）を用いて麻酔をかけ、それらの臓器及び組織試料を摘出し、選択された臓器について、血液形態学的試験と同様に組織学的試験を行った。血液及び組織において、変化は観察されなかった。
【０１７８】
これらの暗所毒性分析において用いた用量は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）の使用において推奨される用量より１０倍高く、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）を用いた場合の用量より１００倍高かった。それにもかかわらず、マウスにおいて測定され得る暗所毒性の閾値に、到達しなかった。これにより、ＰＤＴで用いることができるＬｕｚｉｔｉｎの用量は、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）又はＦｏｓｃａｎ（登録商標）の用量よりも多いことが明らかである。
【０１７９】
［実施例１７］ＩＰ投与に続くクロリン生体内分布
本実施例は、Ｌｕｚｉｔｉｎが、ＩＰ投与後２時間で、血液脳関門を通過することができることを示す。
【０１８０】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ−ｃを、腹腔内投与によりＤＢＡ／２マウスにつき１０ｍｇ／ｋｇの用量となるように投与した。組織におけるクロリン分散を、投与後２時間分析した。前記マウスをモルビタール（バイオウェット社製、ポーランド国）を用いて麻酔し、脳を含む臓器のいくつかを摘出し、重さを量り、その後分析まで−３０℃で保存した。前記組織試料中の色素含有量を、蛍光分光計により分析した。前記色素を抽出するため、組織試料を、組織ホモジナイザーＭＰＷ−１２０（メディカルインスツルメンツ社製、ポーランド国）を用い、１００００ｒｐｍの速度で、７ｍｌの氷冷した９０％含水アセトン中において１分間均質化処理した。得られたホモジネートを、２０００×Ｇで１０分間、４℃の温度で遠心分離し、上澄みを回収し、そして沈殿物を９０％含水アセトンで再抽出し、前記色素を完全に回収した。得られた抽出物をプール（pool）し、色素含有量を分析した。前記試料を、４１３ｎｍで励起し、蛍光スペクトルを６００〜８００ｎｍの範囲で記録した。図１６は、各質量により正規化した脳、血液及び肝臓由来試料の蛍光強度を示す。
【０１８１】
ＤＢＡ／２マウスにおける前記増感剤の血液から脳への分散は、ＩＰ投与後２時間で、４：１であった。これは、適切なＬｕｚｉｔｉｎは、顕著な量が血液脳関門を通過可能であるため、脳中における活性光増感剤となり得ることの原理証明である。以下の実施例では、この類の増感剤が腫瘍に蓄積される傾向があり、さらに光増感剤の量を増加して、脳腫瘍の治療に利用することができることを示す。
【０１８２】
［実施例１８］ＩＰ投与に続くバクテリオクロリンの薬物動態
本実施例は、ＬｕｚｉｔｉｎのＩＰ投与後、先ず腫瘍内に蓄積して、その後ゆっくりとした速度で消失することを示す。
【０１８３】
腫瘍モデルは、Ｓ９１クラウドマンメラノーマ細胞であり、前記細胞は、５％ウシ胎児血清及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ培地中で単層培養した。前記細胞を、３７℃の温度で５％ＣＯ２を含む湿潤環境において増殖させた。前記メラノーマ細胞（〜１×１０６）を、０．１ｍｌリン酸緩衝液塩（ＰＢＳ）中に回収し、マウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。前記腫瘍は成長し、前記埋め込み後１０日で視認可能となった。前記マウスを、前記投与後３週間に治療した。
【０１８４】
Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌを、腹腔内投与によりＤＢＡ／２マウスに１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。バクテリオクロリンの組織への分散を、腹腔内投与後、２時間、６時間、１２時間、２４時間、及び４８時間の間隔で分析した。前記マウスを、ケタミン及びキシラジンを用いて麻酔し、該マウスの臓器及び組織試料を摘出し、重さを量り、その後さらに、分析まで−３０℃で保存した。組織試料中の色素含有量を、蛍光分光計により分析した。前記色素を抽出するため、組織試料を、組織ホモジナイザーＭＰＷ−１２０（メディカルインスツルメンツ社製、ポーランド国）を用い、１００００ｒｐｍの速度で、７ｍｌの氷冷したエタノール／ＤＭＳＯ（７５：２５）溶液中において１分間均質化処理した。得られたホモジネートを、２０００×ｇで１０分間、４℃の温度で遠心分離し、上澄みを回収し、そして沈殿物を前記エタノール／ＤＭＳＯ溶液で再抽出し、前記色素を完全に回収した。得られた抽出物をプールし、色素含有量を分析した。前記試料を、５１７ｎｍで励起し、蛍光スペクトルを６００〜８５０ｎｍの範囲で記録した。図１７は、各質量により正規化した腫瘍及びいくつかの臓器由来の試料の蛍光強度を示す。
【０１８５】
前記腫瘍中の光増感剤の顕著な蓄積は、前記腹腔内投与後一日で生じ、筋中より３倍高い濃度に到達する。また、前記皮膚中への蓄積はごくわずかであり、これは暗所毒性研究におけるマウスの光線過敏の欠如を説明するものである。最後に、前記光増感剤は、ほとんどの組織から２４時間以内に消失する。これらの薬物動態はＰＤＴ治療のためのタイムウインドウの選択のために非常に好ましく、そのため副作用が軽減され、治療の効果が最大化される。
【０１８６】
同様の研究を、他のＬｕｚｉｔｉｎについて行った。そして、Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔによれば、腫瘍対筋肉の非常に強い選択性が示された（図１８）。
【０１８７】
［実施例１９］Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔを用いたＢａｌｂ／Ｃマウス中のマウス大腸癌のＰＤＴ
本実施例は、適切な波長の光を暴露した際に、Ｌｕｚｉｔｉｎが引き起こす腫瘍退縮／壊死について示す。
【０１８８】
腫瘍モデルは、ＣＴ２６マウス大腸癌細胞であり、前記細胞は５％ウシ胎児血清及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ培地中で単層培養した。前記細胞を、３７℃の温度で５％ＣＯ２を含む湿潤環境において増殖させた。前記メラノーマ細胞（〜１×１０６）を、０．１ｍｌリン酸緩衝液塩（ＰＢＳ）中に溶解し、前記Ｂａｌｂ／Ｃマウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。前記腫瘍は成長し、前記埋め込み後約１週間で直径が５ｍｍに到達した。自然壊死は観察されなかった。治療は、前記腫瘍が各マウスにおいて直径５ｍｍに到達したときを開始とした。前記腫瘍が前記治療を開始する大きさに到達した日に、前記マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ４００中のＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの用量で腹腔内投与した。投与後２４時間の時点において、４匹のマウスをケタミン及びキシラジンを用いて麻酔し、１００ｍＷ／ｃｍ２のフルエンス率で２２分間（合計フルエンスは１３２Ｊ／ｃｍ２）、上述したハママツ社製７４８ｎｍダイオードレーザにより処置した。他の４匹のマウスは、処置を行わず、対照としての役割とした。マウスを毎日検査し、腫瘍を２直交測定Ｌ及びＷ（垂直方向がＬ）を用いて測定すると共に、その大きさを、式 Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２を用いて算出し、記録した。
【０１８９】
図１９は、レーザ照射後、異なる日に測定された相対的な腫瘍体積を示す。前記処置されたマウスにおける腫瘍の大きさは、対照マウスの平均的な腫瘍の大きさより小さく、一例においては腫瘍が完全に消失していた。
【０１９０】
［実施例２０］Ｌｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔを用いるＤＢＡ／２マウスにおけるメラノーマ細胞のＰＤＴ
本実施例は、適切な波長の光を暴露した際に、Ｌｕｚｉｔｉｎが引き起こす腫瘍退縮／壊死について示す。
【０１９１】
腫瘍モデルは、Ｓ９１クラウドマンメラノーマ細胞であり、５％ウシ胎児血清及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ培地中で単層培養した。前記細胞を、３７℃の温度で５％ＣＯ２を含む湿潤環境において増殖させた。前記メラノーマ細胞（〜１×１０６）を、０．１ｍｌリン酸緩衝液塩（ＰＢＳ）中に溶解し、前記ＤＢＡ／２マウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。前記腫瘍は成長し、前記埋め込み後約１週間で直径が５ｍｍに到達した。自然壊死は観察されなかった。治療は、前記腫瘍が各マウスにおいて直径５ｍｍに到達したときを開始とした。前記腫瘍が前記治療を開始する大きさに到達した日に、前記マウスに、ＰＥＧ４００中のＬｕｚｉｔｉｎ−Ｃｌ２Ｅｔを１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。投与後２４時間で、マウスをケタミン及びキシラジンを用いて麻酔し、プラスチックホルダー中に拘束し、その後、上述したハママツ社製７４８ｎｍダイオードレーザにより異なる光線量で処置した。照射の数分間の間、腫瘍領域は、壊死の明らかな信号を示し、数時間の間に照射された領域の全てに拡大した。マウスを毎日検査し、前記腫瘍の大きさを測定し、記録した。図２０は、レーザ照射後、異なる日に測定された腫瘍体積を示す。ある一回の処置セッションが、長期間に亘って腫瘍退縮を生じさせることが明らかである。
【０１９２】
［実施例２１］局所投与のための製剤
本実施例は、適切な経皮製剤として適用する際に、皮膚を介してＬｕｚｉｔｉｎを素早く拡散することができることを示す。４匹のミニブタを、光増感剤であるＬｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの皮膚への拡散を試験するために用いて、局所投与に対するこの組成物の副作用を評価した。
【０１９３】
前記光増感剤を、先ず、無水エタノール（０．５５６ｍｌ中、５ｍｇ）に溶解し、次に、１．７３７ｍｌのプロピレングリコールを添加し、続いて０．２２ｍｌのＡｚｏｎｅ（登録商標）及び０．３ｍｌの水を添加した。得られた混合物をボルテックスにより十分に混合し、超音波処理することにより可溶化を促進し、その後、水（７６．６５％）、９６％エタノール（１５％）、グリセリン（６％）、トリエタノールアミン（１．３５％）、カーボポール９４０（１％）からなるゲル基剤に添加した。前記混合物をよく混合し、十分に均一化した。この製剤において、光増感剤の終濃度が０．１％であって、かつ、Ａｚｏｎｅ（登録商標）の終濃度が４％となるようにした。
【０１９４】
前記ミニブタは、上述したように取り扱った。麻酔により沈静化している間、予め設定しておいた領域に、外科手袋を装着した手により前記製剤を塗布した。各塗布は、直径３ｃｍの略円形領域を、前記ゲルの厚みが数ミリメートルとなるように行った。前記塗布した領域を、密閉パッチにより覆った。いくつかのミニブタについて、背中の異なる領域に対して、３時間後に同様の手順を繰り返した。前記ミニブタのうちの１匹において、前記製剤を塗布後６時間で取り除き、該ミニブタの背中をきれいにした後、次の評価を行うために、１０日間生存させた。皮膚試料を上述したように回収した。各試料は、１辺が２ｃｍの略長方形であり、厚さを１ｃｍとした。前記ミニブタ、特に生存しているミニブタは、他の増感剤を含まずに本実施形態の増感剤のみを含む製剤によって引き起こされる副作用の証拠を示さなかった。
【０１９５】
固定化処理後、蛍光顕微鏡検査法によって、及び共焦点顕微鏡法によって評価するために、各試料を切断し、薄片化した。前記試料から得られた画像の代表的な例を図２１に示す。前記ゲルの塗布後３時間以内の画像によれば、Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔは全ての上皮を通過して拡散していることが明らかである。Ｌｕｚｉｔｉｎ−ＦＭｅｔの蛍光発光は、図２２に示す吸収スペクトルによりさらに確認された。従って、角質層及び上皮を数時間で通過して拡散するＬｕｚｉｔｉｎの局所使用のための組成物を製剤することができ、該組成物は、皮膚疾患のＰＤＴのために非常に好適である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法であって、
前記製造方法は、
（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンをヒドラジドを用いて、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備え、
前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とするクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法。
【請求項２】
下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法であって、
前記製造方法は、
（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンをヒドラジドを用いて、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備え、
前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＶ）で表されることを特徴とするクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
（ａ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体と、
（ｂ）表面浸透促進剤とを備えることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項３記載の医薬組成物において、前記表面浸透促進剤は、ジアルキルスルホキシド、Ｎ−メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、ピロリドン誘導体、及び１−置換アザシクロアルカン−２−オンから選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
過剰増殖性組織の検出における、下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物誘導体の使用方法。
【請求項６】
（ｉ）下記の式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体であって、標的に優先的に結合する誘導体の診断上十分な量を対象に投与する工程と、
（ｉｉ）前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が前記標的に結合する十分な時間を与え、前記標的組織と優先的に結合していないクロリン誘導体及びバクテリオクロリン誘導体を非標的組織から洗浄する工程と、
（ｉｉｉ）患者中の式（ＩＩＩ）の化合物を視覚化する工程とを備えることを特徴とする対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法。
【請求項７】
請求項６記載の対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法において、
前記視覚化する工程は、患者の身体の少なくとも一部についてＭＲＩ画像を生成することによって達成されることを特徴とする対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法。
【請求項８】
請求項６記載の対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法において、
前記視覚化する工程は、前記化合物が蛍光を発するために十分なエネルギーの光に該化合物を暴露することによって達成されることを特徴とする対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法。
【請求項９】
皮膚癌、又は光線角化症、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、基底細胞癌、乾癬、尋常性座瘡及び酒さから選択される皮膚疾患の治療に用いるための医薬として許容可能な組成物であって、
前記組成物は、
（ｉ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体と、
（ｉｉ）かかる式（ＩＩＩ）の化合物の皮内到達又は経皮到達のための医薬として許容可能な担体であって、前記皮膚に一時的に浸透し、各種の皮膚層を通して該化合物の浸透を促進する皮膚表面浸透促進剤からなる前記担体とを備えるものにおいて、
（ａ）前記組成物は、対象に投与され、
（ｂ）クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が、皮膚科的治療の標的の近辺に優先的に位置するのに十分な時間を与えられ、
（ｃ）前記標的は、照射され、前記皮膚癌又は前記皮膚疾患に所望の反応が得られることを特徴とする医薬として許容可能な組成物。
【請求項１０】
請求項９記載の医薬組成物において、前記表面浸透促進剤は、ジアルキルスルホキシド、Ｎ−メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、ピロリドン誘導体、及び１−置換アザシクロアルカン−２−オンから選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法であって、
前記製造方法は、
（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンをヒドラジドを用いて、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備え、
前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とするクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法。
【請求項２】
下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法であって、
前記製造方法は、
（ｉ）無溶媒、かつ選択的に無基材で、対応する置換ポルフィリンをヒドラジドを用いて、クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体に固相還元する工程を備え、
前記対応する置換ポルフィリンは、下記式（ＩＶ）で表されることを特徴とするクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
（ａ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体と、
（ｂ）表面浸透促進剤とを備えることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項３記載の医薬組成物において、前記表面浸透促進剤は、ジアルキルスルホキシド、Ｎ−メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、ピロリドン誘導体、及び１−置換アザシクロアルカン−２−オンから選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
過剰増殖性組織の検出における、下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体若しくはバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物誘導体の使用方法。
【請求項６】
（ｉ）下記の式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体、又はそれらの医薬として許容可能な組成物の誘導体であって、標的に優先的に結合する誘導体の診断上十分な量を対象に投与する工程と、
（ｉｉ）前記クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が前記標的に結合する十分な時間を与え、前記標的組織と優先的に結合していないクロリン誘導体及びバクテリオクロリン誘導体を非標的組織から洗浄する工程と、
（ｉｉｉ）患者中の式（ＩＩＩ）の化合物を視覚化する工程とを備えることを特徴とする対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法。
【請求項７】
請求項６記載の対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法において、
前記視覚化する工程は、患者の身体の少なくとも一部についてＭＲＩ画像を生成することによって達成されることを特徴とする対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法。
【請求項８】
請求項６記載の対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法において、
前記視覚化する工程は、前記化合物が蛍光を発するために十分なエネルギーの光に該化合物を暴露することによって達成されることを特徴とする対象における過剰増殖性組織の存在を検出するための方法。
【請求項９】
皮膚癌、又は光線角化症、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、基底細胞癌、乾癬、尋常性座瘡及び酒さから選択される皮膚疾患の治療に用いるための医薬として許容可能な組成物であって、
前記組成物は、
（ｉ）下記式（ＩＩＩ）で表されるクロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体と、
（ｉｉ）かかる式（ＩＩＩ）の化合物の皮内到達又は経皮到達のための医薬として許容可能な担体であって、前記皮膚に一時的に浸透し、各種の皮膚層を通して該化合物の浸透を促進する皮膚表面浸透促進剤からなる前記担体とを備えるものにおいて、
（ａ）前記組成物は、対象に投与され、
（ｂ）クロリン誘導体又はバクテリオクロリン誘導体が、皮膚科的治療の標的の近辺に優先的に位置するのに十分な時間を与えられ、
（ｃ）前記標的は、照射され、前記皮膚癌又は前記皮膚疾患に所望の反応が得られることを特徴とする医薬として許容可能な組成物。
【請求項１０】
請求項９記載の医薬組成物において、前記表面浸透促進剤は、ジアルキルスルホキシド、Ｎ−メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、グリコール、ピロリドン誘導体、及び１−置換アザシクロアルカン−２−オンから選択されることを特徴とする医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１２−５０６４２５（Ｐ２０１２−５０６４２５Ａ）
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３１３３（Ｐ２０１１−５３３１３３）
【出願日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＰＴ２００９／００００５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４７６１１
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５１１１０２３０９）ウニベルシダージ デ コインブラ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＤＥ ＣＯＩＭＢＲＡ
【出願人】（５１１１０２３１０）ブルーファーマ−インダストリア ファルマセウティカ ソシエダッド アノニマ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＬＵＥＰＨＡＲＭＡ−ＩＮＤＵＳＴＲＩＡ ＦＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ，Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＰＴ２００９／００００５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４７６１１
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５１１１０２３０９）ウニベルシダージ デ コインブラ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＤＥ ＣＯＩＭＢＲＡ
【出願人】（５１１１０２３１０）ブルーファーマ−インダストリア ファルマセウティカ ソシエダッド アノニマ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＬＵＥＰＨＡＲＭＡ−ＩＮＤＵＳＴＲＩＡ ＦＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ，Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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