グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質
ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）とシトクロームとの融合蛋白質が開示される。ＰＱＱＧＤＨとしては、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨを用いることができる。シトクロームとしては、例えば、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘモ蛋白質エタノールデヒドロゲナーゼの電子伝達ドメインを用いることができ
る。本発明の融合蛋白質においては、酸化還元中心のＰＱＱからシトクロームに分子内電子移動が生ずるため、電子メディエータを必要としない直接電子伝達型のグルコースセンサーの製造が可能である。
る。本発明の融合蛋白質においては、酸化還元中心のＰＱＱからシトクロームに分子内電子移動が生ずるため、電子メディエータを必要としない直接電子伝達型のグルコースセンサーの製造が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はグルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質、およびこれを用いるグルコースのアッセイに関する。
【背景技術】
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。また、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっている。ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）はグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。
ＰＱＱＧＤＨをその表面に固定化した酵素電極を用いてグルコースをアッセイするためには、ＰＱＱＧＤＨの酸化還元中心であるＰＱＱから電極に電子を伝達させるために、測定系に電子メディエータを加える必要がある。このため、電子メディエータの安定性や溶解性により電極の特性が制限されたり、夾雑物と電子メディエータとの反応により測定のバックグラウンドが高くなるという欠点がある。さらに電子メディエータはインビボでの使用に適していないため、体内埋込型のグルコースセンサーにおけるＰＱＱＧＤＨの適用が制限されていた。この問題を解決するために、ＰＱＱＧＤＨを電子伝達蛋白質とともに電極上に固定化する方法が提案されている（ＷＯ０２／０７３１８１）。しかし、この方法においては大過剰モルの電子伝達蛋白質を用いる必要があるため、コストが高いという難点があった。したがって、当該技術分野においては、電子メディエータを必要としない“直接電子伝達型”のグルコースセンサー用の素子が求められている。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：Ｊ．Ｏｋｕｄａ，Ｊ．Ｗａｋａｉ，Ｎ．Ｙｕｈａｓｈｉ，Ｋ．Ｓｏｄｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ １８（２００３）６９９−７０４；Ｊ．Ｏｋｕｄａ，Ｊ．Ｗａｋａｉ，Ｋ．Ｓｏｄｅ，Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．３５（２００２）１４６５−１４７８
【発明の開示】
本発明は、電子メディエータを必要としない直接電子伝達型のグルコースセンサーの製造を可能とする改変型ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
本発明は、ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）とシトクロームとの融合蛋白質を提供する。好ましくは、ＰＱＱＧＤＨは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨである。
本発明の融合蛋白質においては、シトクロームは、好ましくはＰＱＱＧＤＨのＣ末端側に融合されている。また好ましくは、シトクロームはシトクロームＣまたはシトクロームＢ５６２である。特に好ましくは、シトクロームは、１分子中にＰＱＱとヘムの両方を有する蛋白質であるキノヘモ蛋白質に由来するものである。また好ましくは、シトクロームは、キノヘモ蛋白質アルコール脱水素酵素に由来するものである。特に好ましくは、シトクロームは、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘモ蛋白質エタノールデヒドロゲナーゼの電子伝達ドメインに由来するものである。
また好ましくは、本発明の融合蛋白質は、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性および電子伝達機能を有する蛋白質
のいずれかである。
別の観点においては、本発明は、本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子、この遺伝子を含むベクターならびに形質転換体を提供する。好ましくは、融合蛋白質をコードする遺伝子は形質転換体の主染色体に組み込まれている。
さらに別の観点においては、本発明は、本発明の融合蛋白質が装着されている酵素電極、ならびにこのような酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。
本発明はまた、試料中のグルコース濃度を測定する方法であって、
試料を上述の酵素電極と接触させ、そして
グルコースの酸化に伴って発生する電子を測定する、
ことを含む方法を提供する。
本発明の融合蛋白質を用いることにより、電子メディエータを必要としない直接電子伝達型のグルコースセンサーを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、融合蛋白質の構造の例を示す。
図２は、図１に示す融合蛋白質をコードする遺伝子の配列を示す。
図３は、電子受容体存在下における本発明のグルコースセンサーによるグルコース濃度の測定の結果を示す。
図４は、電子受容体非存在下における本発明のグルコースセンサーの応答電流を示す。
図５は、電子受容体非存在下における本発明のグルコースセンサーによるグルコース濃度の測定の結果を示す。
図６は、フロー型グルコースセンサーのフローセル部分の構造の一例を示す。
図７は、本発明の融合蛋白質を利用したフローセル型グルコースセンサーの応答電流を示す。
図８は、本発明の融合蛋白質を利用したフローセル型グルコースセンサーの連続運転の結果を示す。
発明の詳細な説明
融合蛋白質の構造
本発明の融合蛋白質は、ＰＱＱＧＤＨとシトクロームとが連結された構造を有しており、必要に応じてこれらの間にリンカー部分が存在していてもよい。
ＰＱＱＧＤＨとは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６）。本発明においては、これらのいずれのＰＱＱＧＤＨも用いることができる。
さらに、ＰＱＱＧＤＨにおいては、アミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。特定の領域のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、グルコースを酸化する酵素活性を維持したまま、酵素の熱安定性や基質に対する親和性を改良しうることが明らかにされている（例えば、特開２０００−３５０５８８、特開２００１−１９７８８８、特開２０００−３１２５８８を参照）。本発明の融合蛋白質においては、これらの改変されたＰＱＱＧＤＨを用いてもよい。
シトクロームとは、電子伝達体としての機能を有するヘム蛋白質をいう。とりわけ、蛋白質分子にヘム鉄が一つあるいは複数、共有結合あるいは非共有結合的に結合している蛋白質分子である。種々の生物から、シトクロームｂ、シトクロームｃ等の多くの種類のシトクロームが単離同定されており、これらのいずれも本発明において用いることができる。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２（２），３０９−３１３（１９９１））、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ株（Ｔｏｗｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１４３，１０９−１１１（１９９３））Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｎｕｌｉｕｍ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｍｉａｅ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓ．ｐｈｅｕｍｏｎｉａｅ等の細菌に由来するシトクロームｂ５６２が挙げられる。また、これらのシトクロームから作製されるキメラ蛋白質を用いてもよい。
さらに、電子移動サブユニットまたはヘム含有ドメインを有する酸化還元酵素が知られており、これらの酵素のヘム蛋白質サブユニットまたはヘム蛋白質ドメインも、本発明におけるシトクロームに含まれる。特に、ＰＱＱを補酵素とする蛋白質のうち、蛋白質分子中にＰＱＱ以外にヘム鉄を結合しているシトクロームを有するキノヘモ蛋白質のシトクロームドメインも含まれる。さらにキノヘム蛋白質のうち、アルコール脱水素酵素活性を有するキノヘモアルコール脱水素酵素のシトクロームドメインも含まれる。またそのような酸化還元酵素の例としては、エタノールデヒドロゲナーゼおよびオリゴサッカライドデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
特に好ましくは、Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（ＱＨＥＤＨ）のシトクロームｃドメインを用いることができる。最近ＱＨＥＤＨの３Ｄ構造が明らかにされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２００２，３７２７−３７３２）。ＱＨＥＤＨは２つの異なるドメインから構成される。第１ドメインはＰＱＱ含有触媒ドメインであり、ＰＱＱＧＤＨと類似する８枚羽根のβプロペラ構造から構成される。Ｃ末端領域に位置する第２ドメインはシトクロームｃドメインである。これらのドメインは、ペプチドリンカー領域により分離されている。ＱＨＥＤＨにおいては、酸化還元中心であるＰＱＱから電子受容体であるシトクロームｃを介して、呼吸鎖に電子が伝達される。
また、本発明において用いられるシトクロームは、天然のシトクロームの構造の一部が改変されている改変型シトクロームであってもよい。このような改変型シトクロームは、例えば、天然に生ずるシトクロームの１またはそれ以上のアミノ酸残基を他の天然のまたは天然に存在しないアミノ酸残基で置換することにより、あるいは１またはそれ以上のアミノ酸を欠失させるかまたは付加することにより製造することができる。
リンカー部分とは、融合蛋白質中でＰＱＱＧＤＨとシトクロームとを連結する部分である。リンカー部分は、ＰＱＱＧＤＨとシトクロームとを、ＧＤＨ活性が発揮されかつＰＱＱからシトクロームへの電子の効率的な伝達が可能となるように配置させる機能を有する。リンカー部分の配列としては、天然または合成の任意のアミノ酸配列を用いることができる。例えば、ＰＱＱＧＤＨまたはシトクロームに由来する適当な配列であってもよく、融合蛋白質をコードする遺伝子を構築するために用いたベクターに由来する配列であってもよい。
融合蛋白質の製造方法
本発明の融合蛋白質は、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子配列とシトクロームをコードする遺伝子配列とを、必要に応じてリンカー部分を介して、インフレームとなるよう連結させて、これを組換え的に発現させることにより製造することができる。図１は、本発明の融合蛋白質の一例を、図２はこの融合蛋白質をコードする遺伝子の配列を示す。図中、５’側から３’側に、ＰＱＱＧＤＨをコードする配列、リンカー部分、およびにシトクロームをコードする配列が連結されている。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６に開示されており、Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（ＱＨＥＤＨ）をコードする遺伝子の配列は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２００２，３７２７−３７３２に開示されている。これらの配列を基に、遺伝子操作により融合蛋白質をコードする遺伝子を構築することができる。遺伝子操作のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られている。
このようにして得た融合蛋白質をコードする遺伝子を、遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
融合蛋白質を発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕する。これを超遠心分離し、融合蛋白質を含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した融合蛋白質を培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の融合蛋白質を調製する。
酵素電極
本発明はまた、本発明にしたがう融合蛋白質が固定化された酵素電極を特徴とする。酵素電極とは、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が固定化されている電極である。酵素電極は、酵素の反応特異性を利用して、種々の生理活性物質を特異的に検出するバイオセンサーとして広く用いられている。本発明の融合蛋白質は、酵素電極において被検物質（例えばグルコース）の存在を認識し、その酸化還元反応を触媒し、その結果生じる電子を電極に伝達するよう作用する。
酵素電極を作製するためには、電極上に本発明の融合蛋白質を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどのポリマー中に固定する方法などがあり、これらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の融合蛋白質をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコースセンサー
別の観点においては、本発明は、作用極として上述の本発明の酵素電極を用いることを特徴とするセンサーを提供する。本明細書において用いる場合、センサーとは、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系をいい、通常は、作用極（酵素電極）、対極（白金等）、および参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ等）の３電極を含む。あるいは、慣用の簡易血糖値システムにおいて用いられているような、作用極と対極とから構成される２電極系でもよい。センサーはさらに、緩衝液および被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を含む。センサーは、バッチ型であってもフロー型であってもよい。特にフロー型のセンサーとしては、血糖値を連続で計測できるセンサーであってもよい。すなわち、連続的に供給される血液試料、あるいは同透析試料、あるいは血液中あるいは細胞間質液中に本発明の酵素を固定した二電極系あるいは三電極系を挿入して計測するセンサーであってもよい。このような酵素センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ Ｐ．Ｆ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｓａｏ Ｋａｒｕｂｅ ａｎｄ Ｇｅｒｏｇｅ Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８７に記載されている。
本発明の１つの好ましいフロー型センサーのフローセル部分の概略を図６に示す。フローセル１には所定の流速でサンプルを流すための流路が設けられており、適当な緩衝液で希釈した被検物質はサンプル入口２０からセルに入り、サンプル出口２２から出てサンプルドレインに導かれる。フローセル１には作用極１０、対極１２、および参照極１４が装着されており、作用極１０として本発明の酵素電極を用いる。作用極１０にはポテンシオスタット（図示せず）により一定の電圧が印加されている。図６では２本の作用極を用いているが、作用極は１本でもよい。
グルコースのアッセイ
本発明のグルコースセンサーを用いるグルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。センサーの恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明の融合蛋白質を固定化した酵素電極を用い、対極としては例えば白金電極を、参照電極としては例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる。作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−３４００９２号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
発現ベクターの構築
ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子（停止コドンを含まない）およびＱＨＥＤＨの電子伝達ドメインは、５’末端に制限酵素認識部位を有するプライマーを用いて、それぞれＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＬＭＤ７９．４１、およびＣ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＡＴＣＣ１５６６７のゲノムからＰＣＲ法により増幅した。用いたプライマーは以下のとおりである：
ｇｄｈＢ；センス
アンチセンス
ｑｈｅｄｈｃｙｔｃドメイン；センス
アンチセンス
これらのＰＣＲ産物を発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）のマルチクローニングサイトに挿入して、発現ベクターｐＧＢＥＴを調製した。このようにして、ＰＱＱＧＤＨのＣ末端側にリンカー領域を介してＱＨＥＤＨのシトクロームｃドメインが連結された融合遺伝子を構築した（図２）。ＰＱＱＧＤＨをコードする配列は大文字で、シトクロームをコードする配列は小文字で示されており、制限酵素認識部位には二重下線が、リンカー領域には下線が施されている。ＰＱＱＧＤＨとシトクロームｃドメインとの間のリンカー領域は、ＱＨＥＤＨの天然の構造に由来する２４アミノ酸残基から構成される。
ヘム含有シトクロームｃをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させるためには，ｃｃｍ遺伝子の発現が必須であるため、Ｋｍプロモータの制御下にシトクロームｃの成熟に必要なｃｃｍ遺伝子を有するプラスミドｐＥＣ８６（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｌｉｎｄａ Ｔｏｅｎｙ−Ｍｅｙｅｒ，ＥＴＨ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより贈与）を用いて、ｃｃｍが構成的に発現されるようにした。
ｐＧＢＥＴをｐＥＣ８６とともにＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αを形質転換した。融合蛋白質発現ベクターとｃｃｍ発現ベクターの両方を有する形質転換体はピンク色を呈し、成熟シトクロームｃが細胞内で産生されていることが示唆された。
融合蛋白質の発現および精製
形質転換体をＭＭＩ培地で半好気条件下で３０℃で１０時間培養し、菌体を回収して、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁した。これをフレンチプレスで破壊し（１１０ＭＰａ）、超遠心分離（１６０，５００×ｇ，１．５ｈ，４℃）し、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。得られた上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＳカチオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、５−１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の勾配を用いて酵素を溶出した。
精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６５ｋＤａに１本のバンドを示し、これは融合蛋白質について予測された分子量と一致した。さらにこのバンドは、ヘム染色により染色された。
精製融合蛋白質のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルは、波長４１１ｎｍの酸化型シトクロームｃのピークを示した。還元剤であるヒドロ亜硫酸ナトリウムを加えると、融合蛋白質が還元されて、還元型シトクロームｃに典型的な４１６ｎｍ，５２２ｎｍおよび５５１ｎｍのピークを示した。このことから、融合蛋白質はヘムを有しており、シトクロームｃとして機能することが確認された。
次に、ＰＱＱとシトクロームｃドメインとの間の分子内電子伝達を調べるために、酸化型の融合蛋白質にグルコースを加えた。電子受容体非存在下でグルコース２０ｍＭを添加すると、時間とともにシトクロームｃのスペクトルが酸化型から還元型に変化した。この結果は、融合蛋白質がＧＤＨ活性を有しており、かつ、グルコースの酸化に伴って酸化還元中心であるＰＱＱからシトクロームｃに分子内電子移動が生じたことを示す。
酵素活性の測定
酵素活性の測定は１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中において０．０６ｍＭＤＣＩＰおよび０．６ｍＭＰＭＳを用いて行った。１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素の活性を１ユニットと定義した。表１に精製酵素の動力学的パラメータを示す。
本発明の融合蛋白質は約３０００Ｕ／ｍｇ蛋白質のＧＤＨ活性を有しており、これは野生型ＰＱＱＧＤＨの活性の約７０％に相当する。また、融合蛋白質のグルコースに対するＫｍ値および基質特異性は、野生型（Ｂｉｏｃａｔａｌ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ．２０，（２００２），４０５−４１２）のものとほとんど同じであった。
電子受容体存在下におけるグルコース濃度の計測
本発明の融合蛋白質２５０Ｕ（約１００μｇ）あるいは野性型のＰＱＱＧＤＨ３５０Ｕを、グラッシーカーボン電極上にグルタルアルデヒド蒸気にさらすことで固定した。１ｍＭＣａＣｌ２を含む２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に電極を浸し、電子受容体として１０ｍＭのフェリシアン化カリウムを用いて、印加電圧＋４００ｍＶ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）にてグルコースに対する応答を測定した。結果を図３に示す。図中、「ＱＨ−ＧＤＨ」は本実施例で作製した融合蛋白質を、「ＧＢ ＷＴ」は野生型ＰＰＱＧＤＨを示す。
この条件においては、野性型ＰＱＱＧＤＨを固定した電極ではきわめて小さな応答しかみられず、特に、グルコース濃度０．２ｍＭ以上では電子受容体との反応が律速段階となり、応答が飽和した。これに対して、本発明の融合蛋白質を固定した電極では、きわめて大きな応答が得られた。すなわち、野性型酵素固定化電極で飽和したグルコース濃度以上においても、応答のグルコース濃度依存性が見られ、血液中のグルコース濃度である５〜１０ｍＭ以上においても良好な応答を示した。このことから、本発明の融合蛋白質は、電子受容体と組み合わせることにより、野性型酵素が電子受容体と組み合わせた応答よりも高い応答が達成できることが示された。
電子受容体非存在下におけるグルコース濃度の計測
次に、電子受容体の非存在下において、融合蛋白質が電極に電子を伝達する能力を、野生型酵素と電子伝達蛋白質との混合物と比較して調べた。５００ユニットのＱＨ−ＧＤＨを含有する２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）をカーボンペースト（０．５ｇグラファイト粉末、０．３ｍｌ液体パラフィン，ＢＡＳ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＵＳＡ）とともに混合し、凍結乾燥した。対照としては、野生型ＰＱＱＧＤＨと等モルのｃｙｔｂ５６２またはｃｙｔｂ５６２と同質量のＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いた。次に、凍結乾燥した混合物をカーボンペースト電極の末端に充填した（直径３ｍｍ，ＢＡＳ Ｉｎｃ．）。電極は、使用するまで２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で４℃で保存した。測定は、１ｍＭＣａＣｌ２を含む２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で２５℃で行った。＋３００ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの電圧を印加して、グルコースの添加に伴う電流値の増加を測定した。
本発明の融合蛋白質を固定化した酵素電極は、グルコースの添加に対する迅速な応答を示し、グルコースを添加してから１０秒以内にセンサーシグナルは定常電流に達した（図４）。図中、矢印はグルコースの添加を示す。一方、対照である野生型ＰＱＱＧＤＨとｃｙｔｂ５６２またはＢＳＡを固定化した電極では、電流の増加は観察されなかった。
グルコースアッセイ
種々の濃度のグルコース溶液を用いて、本発明のセンサーのキャリブレーションカーブを求めた（図５）。図中、「ＱＨ−ＧＤＨ」は本実施例で作製した融合蛋白質を、「ＧＢｗｔ」は対照である野生型ＰＱＱＧＤＨを表す。観察された電流増加は、最小の検出可能な濃度である０．０１ｍＭから５ｍＭまでの濃度範囲で、グルコース濃度に比例していた。さらに、電流応答は酵素量に依存していた。センサーの感度は９．６５μＡＭ−１ｃｍ−２であった。
グルコースの連続計測
本発明の融合蛋白質を装着した酵素電極を用いてグルコースの連続計測を行った。この実験は、近年注目されている連続計測型血糖計測システムへの本融合酵素の応用を目的として行ったものである。本システムの構成は、連続計測型血糖計測システムの構成に順ずる。
計測は図６に示すフローセルを用いて行った。フローセル１にはサンプルを流す流路が設けられており、適当な緩衝液で希釈した被検物質はサンプル入口２０からセルに入り、サンプル出口２２から出てサンプルドレインに導かれる。フローセル１には２本の作用極４０、対極１２、および参照極１４が装着されており、ポテンシオスタット（図示せず）により作用極に一定の電圧が印加されている。７５０Ｕの融合蛋白質をカーボンペーストと混合し、グルタルアルデヒドにより架橋した後、作用極の表面に固定した。フローセルには１ｍＭＣａＣｌ２を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）を連続的に供給した。印加電圧は＋３００ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、流速は０．５ｍｌ／分とした。緩衝溶液に４５０ｍｇ／ｍｌを含むグルコース溶液を一定の混合比で供給することにより、酵素電極が装着されたフローセルへ供給する試料中のグルコース濃度を連続的に変化させ、応答電流を測定した。結果を図７に示す。図示されるように、本発明の融合蛋白質を用いたセンサーにより、センサー内の直接電子移動に基づいて、すなわち電子受容体の添加なしに、グルコース濃度を連続的に計測できることが示された。
次に、この連続グルコース計測システムの長期連続運転について検討した。１ｍＭのグルコースを含む試料を流速０．１ｍｌ／分でフローセルに連続的に供給したところ、安定した応答がみられ、７２時間後においても初期応答値の７０％以上の応答がみられた（図８）。このことから、本発明の融合蛋白質を用いた連続グルコース計測システムは３日間以上、連続的に稼動できることが示された。このような特性は、本融合酵素が、近年注目されている連続計測型血糖計測システムに応用した場合に十分な有効性を有することを示すものである。
産業上の利用性
本発明の融合蛋白質、およびこれを利用した酵素電極ならびにバイオセンサーは、血糖値を測定する直接電子伝達型のグルコースセンサーとして有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【技術分野】
本発明はグルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質、およびこれを用いるグルコースのアッセイに関する。
【背景技術】
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。また、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっている。ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）はグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。
ＰＱＱＧＤＨをその表面に固定化した酵素電極を用いてグルコースをアッセイするためには、ＰＱＱＧＤＨの酸化還元中心であるＰＱＱから電極に電子を伝達させるために、測定系に電子メディエータを加える必要がある。このため、電子メディエータの安定性や溶解性により電極の特性が制限されたり、夾雑物と電子メディエータとの反応により測定のバックグラウンドが高くなるという欠点がある。さらに電子メディエータはインビボでの使用に適していないため、体内埋込型のグルコースセンサーにおけるＰＱＱＧＤＨの適用が制限されていた。この問題を解決するために、ＰＱＱＧＤＨを電子伝達蛋白質とともに電極上に固定化する方法が提案されている（ＷＯ０２／０７３１８１）。しかし、この方法においては大過剰モルの電子伝達蛋白質を用いる必要があるため、コストが高いという難点があった。したがって、当該技術分野においては、電子メディエータを必要としない“直接電子伝達型”のグルコースセンサー用の素子が求められている。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：Ｊ．Ｏｋｕｄａ，Ｊ．Ｗａｋａｉ，Ｎ．Ｙｕｈａｓｈｉ，Ｋ．Ｓｏｄｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ １８（２００３）６９９−７０４；Ｊ．Ｏｋｕｄａ，Ｊ．Ｗａｋａｉ，Ｋ．Ｓｏｄｅ，Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．３５（２００２）１４６５−１４７８
【発明の開示】
本発明は、電子メディエータを必要としない直接電子伝達型のグルコースセンサーの製造を可能とする改変型ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
本発明は、ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）とシトクロームとの融合蛋白質を提供する。好ましくは、ＰＱＱＧＤＨは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨである。
本発明の融合蛋白質においては、シトクロームは、好ましくはＰＱＱＧＤＨのＣ末端側に融合されている。また好ましくは、シトクロームはシトクロームＣまたはシトクロームＢ５６２である。特に好ましくは、シトクロームは、１分子中にＰＱＱとヘムの両方を有する蛋白質であるキノヘモ蛋白質に由来するものである。また好ましくは、シトクロームは、キノヘモ蛋白質アルコール脱水素酵素に由来するものである。特に好ましくは、シトクロームは、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘモ蛋白質エタノールデヒドロゲナーゼの電子伝達ドメインに由来するものである。
また好ましくは、本発明の融合蛋白質は、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性および電子伝達機能を有する蛋白質
のいずれかである。
別の観点においては、本発明は、本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子、この遺伝子を含むベクターならびに形質転換体を提供する。好ましくは、融合蛋白質をコードする遺伝子は形質転換体の主染色体に組み込まれている。
さらに別の観点においては、本発明は、本発明の融合蛋白質が装着されている酵素電極、ならびにこのような酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。
本発明はまた、試料中のグルコース濃度を測定する方法であって、
試料を上述の酵素電極と接触させ、そして
グルコースの酸化に伴って発生する電子を測定する、
ことを含む方法を提供する。
本発明の融合蛋白質を用いることにより、電子メディエータを必要としない直接電子伝達型のグルコースセンサーを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、融合蛋白質の構造の例を示す。
図２は、図１に示す融合蛋白質をコードする遺伝子の配列を示す。
図３は、電子受容体存在下における本発明のグルコースセンサーによるグルコース濃度の測定の結果を示す。
図４は、電子受容体非存在下における本発明のグルコースセンサーの応答電流を示す。
図５は、電子受容体非存在下における本発明のグルコースセンサーによるグルコース濃度の測定の結果を示す。
図６は、フロー型グルコースセンサーのフローセル部分の構造の一例を示す。
図７は、本発明の融合蛋白質を利用したフローセル型グルコースセンサーの応答電流を示す。
図８は、本発明の融合蛋白質を利用したフローセル型グルコースセンサーの連続運転の結果を示す。
発明の詳細な説明
融合蛋白質の構造
本発明の融合蛋白質は、ＰＱＱＧＤＨとシトクロームとが連結された構造を有しており、必要に応じてこれらの間にリンカー部分が存在していてもよい。
ＰＱＱＧＤＨとは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６）。本発明においては、これらのいずれのＰＱＱＧＤＨも用いることができる。
さらに、ＰＱＱＧＤＨにおいては、アミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。特定の領域のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、グルコースを酸化する酵素活性を維持したまま、酵素の熱安定性や基質に対する親和性を改良しうることが明らかにされている（例えば、特開２０００−３５０５８８、特開２００１−１９７８８８、特開２０００−３１２５８８を参照）。本発明の融合蛋白質においては、これらの改変されたＰＱＱＧＤＨを用いてもよい。
シトクロームとは、電子伝達体としての機能を有するヘム蛋白質をいう。とりわけ、蛋白質分子にヘム鉄が一つあるいは複数、共有結合あるいは非共有結合的に結合している蛋白質分子である。種々の生物から、シトクロームｂ、シトクロームｃ等の多くの種類のシトクロームが単離同定されており、これらのいずれも本発明において用いることができる。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２（２），３０９−３１３（１９９１））、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ株（Ｔｏｗｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１４３，１０９−１１１（１９９３））Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｎｕｌｉｕｍ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｍｉａｅ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓ．ｐｈｅｕｍｏｎｉａｅ等の細菌に由来するシトクロームｂ５６２が挙げられる。また、これらのシトクロームから作製されるキメラ蛋白質を用いてもよい。
さらに、電子移動サブユニットまたはヘム含有ドメインを有する酸化還元酵素が知られており、これらの酵素のヘム蛋白質サブユニットまたはヘム蛋白質ドメインも、本発明におけるシトクロームに含まれる。特に、ＰＱＱを補酵素とする蛋白質のうち、蛋白質分子中にＰＱＱ以外にヘム鉄を結合しているシトクロームを有するキノヘモ蛋白質のシトクロームドメインも含まれる。さらにキノヘム蛋白質のうち、アルコール脱水素酵素活性を有するキノヘモアルコール脱水素酵素のシトクロームドメインも含まれる。またそのような酸化還元酵素の例としては、エタノールデヒドロゲナーゼおよびオリゴサッカライドデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
特に好ましくは、Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（ＱＨＥＤＨ）のシトクロームｃドメインを用いることができる。最近ＱＨＥＤＨの３Ｄ構造が明らかにされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２００２，３７２７−３７３２）。ＱＨＥＤＨは２つの異なるドメインから構成される。第１ドメインはＰＱＱ含有触媒ドメインであり、ＰＱＱＧＤＨと類似する８枚羽根のβプロペラ構造から構成される。Ｃ末端領域に位置する第２ドメインはシトクロームｃドメインである。これらのドメインは、ペプチドリンカー領域により分離されている。ＱＨＥＤＨにおいては、酸化還元中心であるＰＱＱから電子受容体であるシトクロームｃを介して、呼吸鎖に電子が伝達される。
また、本発明において用いられるシトクロームは、天然のシトクロームの構造の一部が改変されている改変型シトクロームであってもよい。このような改変型シトクロームは、例えば、天然に生ずるシトクロームの１またはそれ以上のアミノ酸残基を他の天然のまたは天然に存在しないアミノ酸残基で置換することにより、あるいは１またはそれ以上のアミノ酸を欠失させるかまたは付加することにより製造することができる。
リンカー部分とは、融合蛋白質中でＰＱＱＧＤＨとシトクロームとを連結する部分である。リンカー部分は、ＰＱＱＧＤＨとシトクロームとを、ＧＤＨ活性が発揮されかつＰＱＱからシトクロームへの電子の効率的な伝達が可能となるように配置させる機能を有する。リンカー部分の配列としては、天然または合成の任意のアミノ酸配列を用いることができる。例えば、ＰＱＱＧＤＨまたはシトクロームに由来する適当な配列であってもよく、融合蛋白質をコードする遺伝子を構築するために用いたベクターに由来する配列であってもよい。
融合蛋白質の製造方法
本発明の融合蛋白質は、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子配列とシトクロームをコードする遺伝子配列とを、必要に応じてリンカー部分を介して、インフレームとなるよう連結させて、これを組換え的に発現させることにより製造することができる。図１は、本発明の融合蛋白質の一例を、図２はこの融合蛋白質をコードする遺伝子の配列を示す。図中、５’側から３’側に、ＰＱＱＧＤＨをコードする配列、リンカー部分、およびにシトクロームをコードする配列が連結されている。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６に開示されており、Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（ＱＨＥＤＨ）をコードする遺伝子の配列は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２００２，３７２７−３７３２に開示されている。これらの配列を基に、遺伝子操作により融合蛋白質をコードする遺伝子を構築することができる。遺伝子操作のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られている。
このようにして得た融合蛋白質をコードする遺伝子を、遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
融合蛋白質を発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕する。これを超遠心分離し、融合蛋白質を含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した融合蛋白質を培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の融合蛋白質を調製する。
酵素電極
本発明はまた、本発明にしたがう融合蛋白質が固定化された酵素電極を特徴とする。酵素電極とは、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が固定化されている電極である。酵素電極は、酵素の反応特異性を利用して、種々の生理活性物質を特異的に検出するバイオセンサーとして広く用いられている。本発明の融合蛋白質は、酵素電極において被検物質（例えばグルコース）の存在を認識し、その酸化還元反応を触媒し、その結果生じる電子を電極に伝達するよう作用する。
酵素電極を作製するためには、電極上に本発明の融合蛋白質を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどのポリマー中に固定する方法などがあり、これらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の融合蛋白質をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコースセンサー
別の観点においては、本発明は、作用極として上述の本発明の酵素電極を用いることを特徴とするセンサーを提供する。本明細書において用いる場合、センサーとは、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系をいい、通常は、作用極（酵素電極）、対極（白金等）、および参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ等）の３電極を含む。あるいは、慣用の簡易血糖値システムにおいて用いられているような、作用極と対極とから構成される２電極系でもよい。センサーはさらに、緩衝液および被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を含む。センサーは、バッチ型であってもフロー型であってもよい。特にフロー型のセンサーとしては、血糖値を連続で計測できるセンサーであってもよい。すなわち、連続的に供給される血液試料、あるいは同透析試料、あるいは血液中あるいは細胞間質液中に本発明の酵素を固定した二電極系あるいは三電極系を挿入して計測するセンサーであってもよい。このような酵素センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ Ｐ．Ｆ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｓａｏ Ｋａｒｕｂｅ ａｎｄ Ｇｅｒｏｇｅ Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８７に記載されている。
本発明の１つの好ましいフロー型センサーのフローセル部分の概略を図６に示す。フローセル１には所定の流速でサンプルを流すための流路が設けられており、適当な緩衝液で希釈した被検物質はサンプル入口２０からセルに入り、サンプル出口２２から出てサンプルドレインに導かれる。フローセル１には作用極１０、対極１２、および参照極１４が装着されており、作用極１０として本発明の酵素電極を用いる。作用極１０にはポテンシオスタット（図示せず）により一定の電圧が印加されている。図６では２本の作用極を用いているが、作用極は１本でもよい。
グルコースのアッセイ
本発明のグルコースセンサーを用いるグルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。センサーの恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明の融合蛋白質を固定化した酵素電極を用い、対極としては例えば白金電極を、参照電極としては例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる。作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−３４００９２号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
発現ベクターの構築
ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子（停止コドンを含まない）およびＱＨＥＤＨの電子伝達ドメインは、５’末端に制限酵素認識部位を有するプライマーを用いて、それぞれＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＬＭＤ７９．４１、およびＣ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＡＴＣＣ１５６６７のゲノムからＰＣＲ法により増幅した。用いたプライマーは以下のとおりである：
ｇｄｈＢ；センス
アンチセンス
ｑｈｅｄｈｃｙｔｃドメイン；センス
アンチセンス
これらのＰＣＲ産物を発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）のマルチクローニングサイトに挿入して、発現ベクターｐＧＢＥＴを調製した。このようにして、ＰＱＱＧＤＨのＣ末端側にリンカー領域を介してＱＨＥＤＨのシトクロームｃドメインが連結された融合遺伝子を構築した（図２）。ＰＱＱＧＤＨをコードする配列は大文字で、シトクロームをコードする配列は小文字で示されており、制限酵素認識部位には二重下線が、リンカー領域には下線が施されている。ＰＱＱＧＤＨとシトクロームｃドメインとの間のリンカー領域は、ＱＨＥＤＨの天然の構造に由来する２４アミノ酸残基から構成される。
ヘム含有シトクロームｃをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させるためには，ｃｃｍ遺伝子の発現が必須であるため、Ｋｍプロモータの制御下にシトクロームｃの成熟に必要なｃｃｍ遺伝子を有するプラスミドｐＥＣ８６（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｌｉｎｄａ Ｔｏｅｎｙ−Ｍｅｙｅｒ，ＥＴＨ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより贈与）を用いて、ｃｃｍが構成的に発現されるようにした。
ｐＧＢＥＴをｐＥＣ８６とともにＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αを形質転換した。融合蛋白質発現ベクターとｃｃｍ発現ベクターの両方を有する形質転換体はピンク色を呈し、成熟シトクロームｃが細胞内で産生されていることが示唆された。
融合蛋白質の発現および精製
形質転換体をＭＭＩ培地で半好気条件下で３０℃で１０時間培養し、菌体を回収して、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁した。これをフレンチプレスで破壊し（１１０ＭＰａ）、超遠心分離（１６０，５００×ｇ，１．５ｈ，４℃）し、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。得られた上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＳカチオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、５−１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の勾配を用いて酵素を溶出した。
精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６５ｋＤａに１本のバンドを示し、これは融合蛋白質について予測された分子量と一致した。さらにこのバンドは、ヘム染色により染色された。
精製融合蛋白質のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルは、波長４１１ｎｍの酸化型シトクロームｃのピークを示した。還元剤であるヒドロ亜硫酸ナトリウムを加えると、融合蛋白質が還元されて、還元型シトクロームｃに典型的な４１６ｎｍ，５２２ｎｍおよび５５１ｎｍのピークを示した。このことから、融合蛋白質はヘムを有しており、シトクロームｃとして機能することが確認された。
次に、ＰＱＱとシトクロームｃドメインとの間の分子内電子伝達を調べるために、酸化型の融合蛋白質にグルコースを加えた。電子受容体非存在下でグルコース２０ｍＭを添加すると、時間とともにシトクロームｃのスペクトルが酸化型から還元型に変化した。この結果は、融合蛋白質がＧＤＨ活性を有しており、かつ、グルコースの酸化に伴って酸化還元中心であるＰＱＱからシトクロームｃに分子内電子移動が生じたことを示す。
酵素活性の測定
酵素活性の測定は１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中において０．０６ｍＭＤＣＩＰおよび０．６ｍＭＰＭＳを用いて行った。１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素の活性を１ユニットと定義した。表１に精製酵素の動力学的パラメータを示す。
本発明の融合蛋白質は約３０００Ｕ／ｍｇ蛋白質のＧＤＨ活性を有しており、これは野生型ＰＱＱＧＤＨの活性の約７０％に相当する。また、融合蛋白質のグルコースに対するＫｍ値および基質特異性は、野生型（Ｂｉｏｃａｔａｌ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ．２０，（２００２），４０５−４１２）のものとほとんど同じであった。
電子受容体存在下におけるグルコース濃度の計測
本発明の融合蛋白質２５０Ｕ（約１００μｇ）あるいは野性型のＰＱＱＧＤＨ３５０Ｕを、グラッシーカーボン電極上にグルタルアルデヒド蒸気にさらすことで固定した。１ｍＭＣａＣｌ２を含む２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に電極を浸し、電子受容体として１０ｍＭのフェリシアン化カリウムを用いて、印加電圧＋４００ｍＶ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）にてグルコースに対する応答を測定した。結果を図３に示す。図中、「ＱＨ−ＧＤＨ」は本実施例で作製した融合蛋白質を、「ＧＢ ＷＴ」は野生型ＰＰＱＧＤＨを示す。
この条件においては、野性型ＰＱＱＧＤＨを固定した電極ではきわめて小さな応答しかみられず、特に、グルコース濃度０．２ｍＭ以上では電子受容体との反応が律速段階となり、応答が飽和した。これに対して、本発明の融合蛋白質を固定した電極では、きわめて大きな応答が得られた。すなわち、野性型酵素固定化電極で飽和したグルコース濃度以上においても、応答のグルコース濃度依存性が見られ、血液中のグルコース濃度である５〜１０ｍＭ以上においても良好な応答を示した。このことから、本発明の融合蛋白質は、電子受容体と組み合わせることにより、野性型酵素が電子受容体と組み合わせた応答よりも高い応答が達成できることが示された。
電子受容体非存在下におけるグルコース濃度の計測
次に、電子受容体の非存在下において、融合蛋白質が電極に電子を伝達する能力を、野生型酵素と電子伝達蛋白質との混合物と比較して調べた。５００ユニットのＱＨ−ＧＤＨを含有する２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）をカーボンペースト（０．５ｇグラファイト粉末、０．３ｍｌ液体パラフィン，ＢＡＳ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＵＳＡ）とともに混合し、凍結乾燥した。対照としては、野生型ＰＱＱＧＤＨと等モルのｃｙｔｂ５６２またはｃｙｔｂ５６２と同質量のＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いた。次に、凍結乾燥した混合物をカーボンペースト電極の末端に充填した（直径３ｍｍ，ＢＡＳ Ｉｎｃ．）。電極は、使用するまで２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で４℃で保存した。測定は、１ｍＭＣａＣｌ２を含む２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で２５℃で行った。＋３００ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの電圧を印加して、グルコースの添加に伴う電流値の増加を測定した。
本発明の融合蛋白質を固定化した酵素電極は、グルコースの添加に対する迅速な応答を示し、グルコースを添加してから１０秒以内にセンサーシグナルは定常電流に達した（図４）。図中、矢印はグルコースの添加を示す。一方、対照である野生型ＰＱＱＧＤＨとｃｙｔｂ５６２またはＢＳＡを固定化した電極では、電流の増加は観察されなかった。
グルコースアッセイ
種々の濃度のグルコース溶液を用いて、本発明のセンサーのキャリブレーションカーブを求めた（図５）。図中、「ＱＨ−ＧＤＨ」は本実施例で作製した融合蛋白質を、「ＧＢｗｔ」は対照である野生型ＰＱＱＧＤＨを表す。観察された電流増加は、最小の検出可能な濃度である０．０１ｍＭから５ｍＭまでの濃度範囲で、グルコース濃度に比例していた。さらに、電流応答は酵素量に依存していた。センサーの感度は９．６５μＡＭ−１ｃｍ−２であった。
グルコースの連続計測
本発明の融合蛋白質を装着した酵素電極を用いてグルコースの連続計測を行った。この実験は、近年注目されている連続計測型血糖計測システムへの本融合酵素の応用を目的として行ったものである。本システムの構成は、連続計測型血糖計測システムの構成に順ずる。
計測は図６に示すフローセルを用いて行った。フローセル１にはサンプルを流す流路が設けられており、適当な緩衝液で希釈した被検物質はサンプル入口２０からセルに入り、サンプル出口２２から出てサンプルドレインに導かれる。フローセル１には２本の作用極４０、対極１２、および参照極１４が装着されており、ポテンシオスタット（図示せず）により作用極に一定の電圧が印加されている。７５０Ｕの融合蛋白質をカーボンペーストと混合し、グルタルアルデヒドにより架橋した後、作用極の表面に固定した。フローセルには１ｍＭＣａＣｌ２を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）を連続的に供給した。印加電圧は＋３００ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、流速は０．５ｍｌ／分とした。緩衝溶液に４５０ｍｇ／ｍｌを含むグルコース溶液を一定の混合比で供給することにより、酵素電極が装着されたフローセルへ供給する試料中のグルコース濃度を連続的に変化させ、応答電流を測定した。結果を図７に示す。図示されるように、本発明の融合蛋白質を用いたセンサーにより、センサー内の直接電子移動に基づいて、すなわち電子受容体の添加なしに、グルコース濃度を連続的に計測できることが示された。
次に、この連続グルコース計測システムの長期連続運転について検討した。１ｍＭのグルコースを含む試料を流速０．１ｍｌ／分でフローセルに連続的に供給したところ、安定した応答がみられ、７２時間後においても初期応答値の７０％以上の応答がみられた（図８）。このことから、本発明の融合蛋白質を用いた連続グルコース計測システムは３日間以上、連続的に稼動できることが示された。このような特性は、本融合酵素が、近年注目されている連続計測型血糖計測システムに応用した場合に十分な有効性を有することを示すものである。
産業上の利用性
本発明の融合蛋白質、およびこれを利用した酵素電極ならびにバイオセンサーは、血糖値を測定する直接電子伝達型のグルコースセンサーとして有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）とシトクロームとの融合蛋白質。
【請求項２】
前記ＰＱＱＧＤＨがＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨである、請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記シトクロームが、ＰＱＱＧＤＨのＣ末端側に融合されている、請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記シトクロームが、シトクロームＣまたはシトクロームＢ５６２である、請求項１−３のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項５】
前記シトクロームが、１分子中にＰＱＱとヘムの両方を有する蛋白質であるキノヘモ蛋白質に由来する、請求項１−４のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記シトクロームが、キノヘモ蛋白質アルコール脱水素酵素に由来する、請求項１−５のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項７】
前記シトクロームが、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘモ蛋白質エタノールデヒドロゲナーゼに由来する、請求項１−６のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性および電子伝達機能を有する蛋白質
のいずれかである、請求項１−７のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項９】
請求項１−８のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項１２】
請求項９に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれている形質転換体。
【請求項１３】
請求項１−８のいずれかに記載の融合蛋白質が装着されている酵素電極。
【請求項１４】
試料中のグルコース濃度を測定する方法であって、
試料を請求項１３に記載の酵素電極と接触させ、そして
グルコースの酸化に伴って発生する電子を測定する、
ことを含む方法。
【請求項１５】
作用極として請求項１３記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
【請求項１】
ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）とシトクロームとの融合蛋白質。
【請求項２】
前記ＰＱＱＧＤＨがＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨである、請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記シトクロームが、ＰＱＱＧＤＨのＣ末端側に融合されている、請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記シトクロームが、シトクロームＣまたはシトクロームＢ５６２である、請求項１−３のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項５】
前記シトクロームが、１分子中にＰＱＱとヘムの両方を有する蛋白質であるキノヘモ蛋白質に由来する、請求項１−４のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記シトクロームが、キノヘモ蛋白質アルコール脱水素酵素に由来する、請求項１−５のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項７】
前記シトクロームが、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのキノヘモ蛋白質エタノールデヒドロゲナーゼに由来する、請求項１−６のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性および電子伝達機能を有する蛋白質
のいずれかである、請求項１−７のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項９】
請求項１−８のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項１２】
請求項９に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれている形質転換体。
【請求項１３】
請求項１−８のいずれかに記載の融合蛋白質が装着されている酵素電極。
【請求項１４】
試料中のグルコース濃度を測定する方法であって、
試料を請求項１３に記載の酵素電極と接触させ、そして
グルコースの酸化に伴って発生する電子を測定する、
ことを含む方法。
【請求項１５】
作用極として請求項１３記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０８０７
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４３０８（Ｐ２００５−５１４３０８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４５７５
【国際出願日】平成１６年９月２８日（２００４．９．２８）
【出願人】（５９６１５３３５７）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４５７５
【国際出願日】平成１６年９月２８日（２００４．９．２８）
【出願人】（５９６１５３３５７）
【Ｆターム（参考）】
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