コレステロール合成促進剤及びヒアルロン酸産生促進剤
【課題】天然物由来の物質を有効成分とするコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤の提供。
【解決手段】甘草葉部抽出物、又は下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種。
式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれる。（Ａ）Ｒ１が水素のとき、Ｒ２は水素（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素。
【解決手段】甘草葉部抽出物、又は下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種。
式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれる。（Ａ）Ｒ１が水素のとき、Ｒ２は水素（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール合成促進剤及びヒアルロン酸産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、表皮細胞の角化の過程において３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを基に、コレステロール合成の律速酵素として知られるヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）をはじめとする酵素の働きにより生成される。
【０００３】
コレステロールは、セラミドとともに皮膚最外層を覆う角層細胞間脂質の主成分として存在し、皮膚本来が有する生体と外界とのバリア膜としての機能維持に重要な役割を果たしている。
【０００４】
角層の構造は、レンガとモルタルとに例えられ、約１５層に積層された角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜を形成している。角層細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を細胞内に含有することによって水分を保持する一方、角質細胞間脂質は、セラミド、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分と親水性部分とが交互に繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴としている。
【０００５】
このような構造を有する角層のバリア機能が様々な内的・外的要因により低下すると、経表皮水分蒸散量が増加し、皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等が引き起こされ、いわゆる乾燥肌に陥ってしまう。また、このようなバリア機能障害は、皮膚の炎症を増大させ、外界からの様々な刺激に対する防御機能が低下するという悪循環に陥ってしまう。
【０００６】
これまでの研究等において、加齢又はアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患により、コレステロール、セラミド等の細胞間脂質の減少や組成変化が起こることが報告されており（非特許文献１，２参照）、バリア機能を維持、改善するために、コレステロール、セラミド等の補給が重要であることが広く認識されるようになっている。このような背景から、皮膚内部においてコレステロール合成能を向上させるものとして、ニコチン酸及びニコチン酸誘導体等が知られている（特許文献１参照）。
【０００７】
ヒアルロン酸は、皮膚の水分保持や粘弾性に深く関与する主要な細胞外マトリックスの一つであり、真皮線維芽細胞に加え表皮角化細胞からも合成されることが知られている。また、表皮のヒアルロン酸の機能として、免疫系、分化調整等、皮膚の恒常性維持にも関与していることも知られている。
【０００８】
しかし、生理的老化に伴い皮膚内のヒアルロン酸含量が減少することが知られており、皮膚内のヒアルロン酸含量の減少が、皮膚の乾燥、萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の老化現象に関与している可能性が推察されている（非特許文献３参照）。したがって、表皮ヒアルロン酸の合成促進に関与するヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の発現を促進することで、皮膚の老化を予防・改善することができるものと考えられる。
【０００９】
このような考えに基づき、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）発現促進作用を有するものとして、トコフェリルレチノエート（特許文献２参照）等が知られている。
【特許文献１】特開平１１−２９２７６５号公報
【特許文献２】特開２００６−２９０８７３号公報
【非特許文献１】"J. Invest. Dermatol."，1996，Vol.106，p.1064-1069
【非特許文献２】"J. Clin. Invest."，1994，Vol.95，p.2281-2290
【非特許文献３】「コスメティックステージ」，２００７年，第１巻，第３号，ｐ．４５−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、安全性の高い天然物の中からコレステロール合成促進作用、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１３】
【化１】
式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれるものである。
（Ａ）Ｒ１が水素原子のとき、Ｒ２は水素原子
（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基
（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素原子
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、甘草葉部抽出物、又は上記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有し、安全性に優れたコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について説明する。
〔コレステロール合成促進剤，ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤，ヒアルロン酸産生促進剤，ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤〕
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物、又は下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物（Ａ：ピノセンブリン，Ｂ：６−プレニル−ナリンゲニン，Ｃ：アンゴホロール）のうちの少なくとも１種を有効成分として含有する。
【００１６】
【化２】
式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれるものである。
（Ａ）Ｒ１が水素原子のとき、Ｒ２は水素原子
（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基
（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素原子
【００１７】
なお、本発明において「抽出物」には、甘草の葉部を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１８】
上記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物は、当該フラバノン類化合物を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により合成することができる。
【００１９】
上記フラバノン類化合物を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。上記フラバノン類化合物を含有する植物としては、例えば、甘草が挙げられる。
【００２０】
抽出原料としての甘草には、Glychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza inflata、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza aspera、Glychyrrhiza eurycarpa、Glychyrrhiza pallidiflora、Glychyrrhiza yunnanensis、Glychyrrhiza lepidota、Glychyrrhiza echinata、Glychyrrhiza acanthocarpa等、様々な種類のものがあり、これらのうち、いずれの種類の甘草を抽出原料として使用してもよいが、特にGlychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza inflataを抽出原料として使用することが好ましい。抽出原料として使用し得る甘草の構成部位としては、葉部である。
【００２１】
甘草葉部抽出物は、抽出原料としての甘草の葉部を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、甘草の葉部の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２２】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、酸性化、アルカリ化、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、有機酸酸性水、アンモニアアルカリ水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２４】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２５】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合するのが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合するのが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合するのが好ましい。
【００２６】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２７】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物から上記フラバノン類化合物を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、甘草葉部抽出物を濃縮し、液―液分配抽出、イオン交換樹脂、多孔性樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにかけることにより粗精製し、さらに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、必要に応じて結晶化することにより、上記フラバノン類化合物を単離・精製することができる。
【００２８】
以上のようにして得られる甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物は、コレステロール合成促進作用、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有しているため、それらの作用を利用してコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用することができる。
【００２９】
なお、本発明においては、上記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちのいずれか１種を上記有効成分として用いてもよいし、それらのうちの２種以上のフラバノン類化合物を混合して上記有効成分として用いてもよい。また、甘草葉部抽出物と上記フラバノン類化合物のうちの少なくとも１種とを混合して上記有効成分として用いてもよい。上記フラバノン類化合物のうちの２種以上を混合して上記有効成分として用いる場合、又は甘草葉部抽出物と上記フラバノン類化合物のうちの少なくとも１種とを混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００３０】
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物のみからなるものであってもよいし、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物を製剤化したものであってもよい。
【００３１】
甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を使用することができる。また、上記甘草抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３２】
なお、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じて、コレステロール合成促進作用、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として使用することができる。
【００３３】
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３４】
また、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３５】
本発明のコレステロール合成促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するコレステロール合成促進作用を通じて、表皮におけるコレステロールの合成を促進し、角層のバリア機能障害に起因する皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を予防・改善することができる。ただし、本発明のコレステロール合成促進剤は、これらの用途以外にもコレステロール合成促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３６】
本発明のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、表皮におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡの発現を促進することができるため、これにより表皮におけるコレステロールの合成を促進し、角層のバリア機能障害に起因する皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を予防・改善することができる。ただし、本発明のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３７】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するヒアルロン酸産生促進作用を通じて、表皮ヒアルロン酸の産生を促進することができ、これにより皮膚の乾燥、萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の老化現象を予防・改善することができる。ただし、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、これらの用途以外にもヒアルロン酸産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３８】
本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、表皮ヒアルロン酸の合成促進に関与するヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の発現を促進することができ、これにより皮膚の乾燥、萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の老化現象を予防・改善することができる。ただし、本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３９】
なお、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４０】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４１】
〔製造例１〕甘草葉部抽出物の製造
甘草（Glycyrrhiza glabra）の乾燥葉の粗砕物５００ｇを抽出溶媒としての７０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝３：７）１４Ｌに投入し、ゆるく攪拌しながら３時間、７０℃に保ち、熱時濾過した。得られた濾液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥させ、甘草葉部抽出物１４６．４ｇを得た（試料１）。
【００４２】
〔製造例２〕フラバノン類化合物の製造
上記製造例１にて得られた甘草葉部抽出物１００ｇを、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填したカラムクロマトグラフィーにて精製した。カラムからの溶出液として、水、２５容量％エタノール水溶液（水とエタノールとの容量比＝３：１）、８０容量％エタノール水溶液（水とエタノールとの容量比＝１：４）及びアセトンを用い、それぞれの画分を得た。
【００４３】
このようにして得られた８０容量％エタノール水溶液画分３０．０ｇを、順相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーに付し、下記構造式（２）で表されるピノセンブリン１９６ｍｇ（試料２）、下記構造式（３）で表される６−プレニル−ナリンゲニン２０１ｍｇ（試料３）、及び下記構造式（４）で表されるアンゴホロール１２４ｍｇ（試料４）を得た。
【００４４】
【化３】
【００４５】
【化４】
【００４６】
【化５】
【００４７】
〔試験例１〕ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
製造例１にて得られた甘草葉部抽出物（試料１）及び製造例２にて得られたフラバノン類化合物（試料２〜４）について、以下のようにしてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００４８】
（１）一本鎖ＤＮＡの調製
ヒト正常新生児表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、３５ｍｍＤｉｓｈ（Falcon社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養終了後、試料（試料１〜４，試料濃度は下記表１を参照）添加培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養終了後、常法により総ＲＮＡを調製した。また、試料を添加しない以外は上記と同様にして細胞を培養し、総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡの調製は、下記の方法により行った。
【００４９】
細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（ISOGEN，ニッポンジーン社製）に溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加した後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮した。
【００５０】
濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（TaKaRa ExScriptTM RT reagent Kit，RR035A，タカラバイオ社製）を用いてＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００５１】
（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＭＧＣＲ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-CTTGCTTGCCGAGCCTAATGA-3'
アンチセンスプライマー：5'-AGAGCGTTCGTGGGTCCATC-3'
【００５２】
また、内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'
アンチセンスプライマー：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'
【００５３】
試料添加及び試料無添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基に調製した一本鎖ＤＮＡ、及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Real Time PCR System Smart Cycler II，Cepheid社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（SYBR Premix Ex TaqTM，RR041A，タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１０００００」とし、以降１０倍希釈を繰り返して濃度値「１０００００」、「１００００」、「１０００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温の後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【００５４】
（３）解析
各サイクルのサイバーグリーン色素の発光量から、ＨＭＧＣＲ及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては、増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＨＭＧＣＲの発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。この算出結果から、下記式に基づいてＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００５５】
ＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
表１に示すように、甘草葉部抽出物（試料１）、ピノセンブリン（試料２）、６−プレニル−ナリンゲニン（試料３）及びアンゴホロール（試料４）は、いずれも優れたＨＭＧＣＲｍＲＮＡの発現を促進する作用を有することが確認された。
【００５８】
〔試験例２〕ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
製造例１にて得られた甘草葉部抽出物（試料１）及び製造例２にて得られたフラバノン類化合物（試料２〜４）について、以下のようにしてヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００５９】
（１）一本鎖ＤＮＡの調製
ヒト正常新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を３５ｍｍＤｉｓｈ（Falcon社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養終了後、試料（試料１〜４，試料濃度は下記表２を参照）添加培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養終了後、常法により総ＲＮＡを調製した。また、試料を添加しない以外は上記と同様にして細胞を培養し、総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡの調製は、下記の方法により行った。
【００６０】
細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（ISOGEN，ニッポンジーン社製）に溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加した後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮した。
【００６１】
濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（TaKaRa ExScriptTM RT reagent Kit，RR035A，タカラバイオ社製）を用いてＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００６２】
（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＡＳ３遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-TCGGCGATTCGGTGGACTA-3'
アンチセンスプライマー：5'-CCTCCAGGACTCGAAGCATCTC-3'
【００６３】
また、内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'
アンチセンスプライマー：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'
【００６４】
試料添加及び試料無添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基に調製した一本鎖ＤＮＡ、及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Real Time PCR System Smart Cycler II，Cepheid社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（SYBR Premix Ex TaqTM，RR041A，タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１０００００」とし、以降１０倍希釈を繰り返して濃度値「１０００００」、「１００００」、「１０００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温の後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【００６５】
（３）解析
各サイクルのサイバーグリーン色素の発光量から、ＨＡＳ３及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては、増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＨＡＳ３の発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。この算出結果から、下記式に基づいてＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００６６】
ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表２に示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
表２に示すように、甘草葉部抽出物（試料１）、ピノセンブリン（試料２）、６−プレニル−ナリンゲニン（試料３）及びアンゴホロール（試料４）は、いずれも優れたＨＡＳ３ｍＲＮＡの発現を促進する作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚の老化の予防又は改善に大きく貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール合成促進剤及びヒアルロン酸産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、表皮細胞の角化の過程において３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを基に、コレステロール合成の律速酵素として知られるヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）をはじめとする酵素の働きにより生成される。
【０００３】
コレステロールは、セラミドとともに皮膚最外層を覆う角層細胞間脂質の主成分として存在し、皮膚本来が有する生体と外界とのバリア膜としての機能維持に重要な役割を果たしている。
【０００４】
角層の構造は、レンガとモルタルとに例えられ、約１５層に積層された角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜を形成している。角層細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を細胞内に含有することによって水分を保持する一方、角質細胞間脂質は、セラミド、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分と親水性部分とが交互に繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴としている。
【０００５】
このような構造を有する角層のバリア機能が様々な内的・外的要因により低下すると、経表皮水分蒸散量が増加し、皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等が引き起こされ、いわゆる乾燥肌に陥ってしまう。また、このようなバリア機能障害は、皮膚の炎症を増大させ、外界からの様々な刺激に対する防御機能が低下するという悪循環に陥ってしまう。
【０００６】
これまでの研究等において、加齢又はアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患により、コレステロール、セラミド等の細胞間脂質の減少や組成変化が起こることが報告されており（非特許文献１，２参照）、バリア機能を維持、改善するために、コレステロール、セラミド等の補給が重要であることが広く認識されるようになっている。このような背景から、皮膚内部においてコレステロール合成能を向上させるものとして、ニコチン酸及びニコチン酸誘導体等が知られている（特許文献１参照）。
【０００７】
ヒアルロン酸は、皮膚の水分保持や粘弾性に深く関与する主要な細胞外マトリックスの一つであり、真皮線維芽細胞に加え表皮角化細胞からも合成されることが知られている。また、表皮のヒアルロン酸の機能として、免疫系、分化調整等、皮膚の恒常性維持にも関与していることも知られている。
【０００８】
しかし、生理的老化に伴い皮膚内のヒアルロン酸含量が減少することが知られており、皮膚内のヒアルロン酸含量の減少が、皮膚の乾燥、萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の老化現象に関与している可能性が推察されている（非特許文献３参照）。したがって、表皮ヒアルロン酸の合成促進に関与するヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の発現を促進することで、皮膚の老化を予防・改善することができるものと考えられる。
【０００９】
このような考えに基づき、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）発現促進作用を有するものとして、トコフェリルレチノエート（特許文献２参照）等が知られている。
【特許文献１】特開平１１−２９２７６５号公報
【特許文献２】特開２００６−２９０８７３号公報
【非特許文献１】"J. Invest. Dermatol."，1996，Vol.106，p.1064-1069
【非特許文献２】"J. Clin. Invest."，1994，Vol.95，p.2281-2290
【非特許文献３】「コスメティックステージ」，２００７年，第１巻，第３号，ｐ．４５−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、安全性の高い天然物の中からコレステロール合成促進作用、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１３】
【化１】
式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれるものである。
（Ａ）Ｒ１が水素原子のとき、Ｒ２は水素原子
（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基
（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素原子
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、甘草葉部抽出物、又は上記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有し、安全性に優れたコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について説明する。
〔コレステロール合成促進剤，ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤，ヒアルロン酸産生促進剤，ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤〕
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物、又は下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物（Ａ：ピノセンブリン，Ｂ：６−プレニル−ナリンゲニン，Ｃ：アンゴホロール）のうちの少なくとも１種を有効成分として含有する。
【００１６】
【化２】
式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれるものである。
（Ａ）Ｒ１が水素原子のとき、Ｒ２は水素原子
（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基
（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素原子
【００１７】
なお、本発明において「抽出物」には、甘草の葉部を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１８】
上記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物は、当該フラバノン類化合物を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により合成することができる。
【００１９】
上記フラバノン類化合物を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。上記フラバノン類化合物を含有する植物としては、例えば、甘草が挙げられる。
【００２０】
抽出原料としての甘草には、Glychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza inflata、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza aspera、Glychyrrhiza eurycarpa、Glychyrrhiza pallidiflora、Glychyrrhiza yunnanensis、Glychyrrhiza lepidota、Glychyrrhiza echinata、Glychyrrhiza acanthocarpa等、様々な種類のものがあり、これらのうち、いずれの種類の甘草を抽出原料として使用してもよいが、特にGlychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza inflataを抽出原料として使用することが好ましい。抽出原料として使用し得る甘草の構成部位としては、葉部である。
【００２１】
甘草葉部抽出物は、抽出原料としての甘草の葉部を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、甘草の葉部の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２２】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、酸性化、アルカリ化、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、有機酸酸性水、アンモニアアルカリ水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２４】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２５】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合するのが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合するのが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合するのが好ましい。
【００２６】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２７】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物から上記フラバノン類化合物を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、甘草葉部抽出物を濃縮し、液―液分配抽出、イオン交換樹脂、多孔性樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにかけることにより粗精製し、さらに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、必要に応じて結晶化することにより、上記フラバノン類化合物を単離・精製することができる。
【００２８】
以上のようにして得られる甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物は、コレステロール合成促進作用、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有しているため、それらの作用を利用してコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用することができる。
【００２９】
なお、本発明においては、上記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちのいずれか１種を上記有効成分として用いてもよいし、それらのうちの２種以上のフラバノン類化合物を混合して上記有効成分として用いてもよい。また、甘草葉部抽出物と上記フラバノン類化合物のうちの少なくとも１種とを混合して上記有効成分として用いてもよい。上記フラバノン類化合物のうちの２種以上を混合して上記有効成分として用いる場合、又は甘草葉部抽出物と上記フラバノン類化合物のうちの少なくとも１種とを混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００３０】
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物のみからなるものであってもよいし、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物を製剤化したものであってもよい。
【００３１】
甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を使用することができる。また、上記甘草抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３２】
なお、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じて、コレステロール合成促進作用、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として使用することができる。
【００３３】
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３４】
また、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又はＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３５】
本発明のコレステロール合成促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するコレステロール合成促進作用を通じて、表皮におけるコレステロールの合成を促進し、角層のバリア機能障害に起因する皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を予防・改善することができる。ただし、本発明のコレステロール合成促進剤は、これらの用途以外にもコレステロール合成促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３６】
本発明のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、表皮におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡの発現を促進することができるため、これにより表皮におけるコレステロールの合成を促進し、角層のバリア機能障害に起因する皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を予防・改善することができる。ただし、本発明のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３７】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するヒアルロン酸産生促進作用を通じて、表皮ヒアルロン酸の産生を促進することができ、これにより皮膚の乾燥、萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の老化現象を予防・改善することができる。ただし、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、これらの用途以外にもヒアルロン酸産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３８】
本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、甘草葉部抽出物又は上記フラバノン類化合物が有するＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、表皮ヒアルロン酸の合成促進に関与するヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の発現を促進することができ、これにより皮膚の乾燥、萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の老化現象を予防・改善することができる。ただし、本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３９】
なお、本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４０】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４１】
〔製造例１〕甘草葉部抽出物の製造
甘草（Glycyrrhiza glabra）の乾燥葉の粗砕物５００ｇを抽出溶媒としての７０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝３：７）１４Ｌに投入し、ゆるく攪拌しながら３時間、７０℃に保ち、熱時濾過した。得られた濾液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥させ、甘草葉部抽出物１４６．４ｇを得た（試料１）。
【００４２】
〔製造例２〕フラバノン類化合物の製造
上記製造例１にて得られた甘草葉部抽出物１００ｇを、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填したカラムクロマトグラフィーにて精製した。カラムからの溶出液として、水、２５容量％エタノール水溶液（水とエタノールとの容量比＝３：１）、８０容量％エタノール水溶液（水とエタノールとの容量比＝１：４）及びアセトンを用い、それぞれの画分を得た。
【００４３】
このようにして得られた８０容量％エタノール水溶液画分３０．０ｇを、順相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーに付し、下記構造式（２）で表されるピノセンブリン１９６ｍｇ（試料２）、下記構造式（３）で表される６−プレニル−ナリンゲニン２０１ｍｇ（試料３）、及び下記構造式（４）で表されるアンゴホロール１２４ｍｇ（試料４）を得た。
【００４４】
【化３】
【００４５】
【化４】
【００４６】
【化５】
【００４７】
〔試験例１〕ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
製造例１にて得られた甘草葉部抽出物（試料１）及び製造例２にて得られたフラバノン類化合物（試料２〜４）について、以下のようにしてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００４８】
（１）一本鎖ＤＮＡの調製
ヒト正常新生児表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、３５ｍｍＤｉｓｈ（Falcon社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養終了後、試料（試料１〜４，試料濃度は下記表１を参照）添加培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養終了後、常法により総ＲＮＡを調製した。また、試料を添加しない以外は上記と同様にして細胞を培養し、総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡの調製は、下記の方法により行った。
【００４９】
細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（ISOGEN，ニッポンジーン社製）に溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加した後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮した。
【００５０】
濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（TaKaRa ExScriptTM RT reagent Kit，RR035A，タカラバイオ社製）を用いてＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００５１】
（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＭＧＣＲ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-CTTGCTTGCCGAGCCTAATGA-3'
アンチセンスプライマー：5'-AGAGCGTTCGTGGGTCCATC-3'
【００５２】
また、内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'
アンチセンスプライマー：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'
【００５３】
試料添加及び試料無添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基に調製した一本鎖ＤＮＡ、及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Real Time PCR System Smart Cycler II，Cepheid社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（SYBR Premix Ex TaqTM，RR041A，タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１０００００」とし、以降１０倍希釈を繰り返して濃度値「１０００００」、「１００００」、「１０００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温の後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【００５４】
（３）解析
各サイクルのサイバーグリーン色素の発光量から、ＨＭＧＣＲ及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては、増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＨＭＧＣＲの発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。この算出結果から、下記式に基づいてＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００５５】
ＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
表１に示すように、甘草葉部抽出物（試料１）、ピノセンブリン（試料２）、６−プレニル−ナリンゲニン（試料３）及びアンゴホロール（試料４）は、いずれも優れたＨＭＧＣＲｍＲＮＡの発現を促進する作用を有することが確認された。
【００５８】
〔試験例２〕ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
製造例１にて得られた甘草葉部抽出物（試料１）及び製造例２にて得られたフラバノン類化合物（試料２〜４）について、以下のようにしてヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００５９】
（１）一本鎖ＤＮＡの調製
ヒト正常新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を３５ｍｍＤｉｓｈ（Falcon社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養終了後、試料（試料１〜４，試料濃度は下記表２を参照）添加培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養終了後、常法により総ＲＮＡを調製した。また、試料を添加しない以外は上記と同様にして細胞を培養し、総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡの調製は、下記の方法により行った。
【００６０】
細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（ISOGEN，ニッポンジーン社製）に溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加した後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮した。
【００６１】
濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（TaKaRa ExScriptTM RT reagent Kit，RR035A，タカラバイオ社製）を用いてＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００６２】
（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＡＳ３遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-TCGGCGATTCGGTGGACTA-3'
アンチセンスプライマー：5'-CCTCCAGGACTCGAAGCATCTC-3'
【００６３】
また、内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれもタカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'
アンチセンスプライマー：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'
【００６４】
試料添加及び試料無添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基に調製した一本鎖ＤＮＡ、及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Real Time PCR System Smart Cycler II，Cepheid社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（SYBR Premix Ex TaqTM，RR041A，タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１０００００」とし、以降１０倍希釈を繰り返して濃度値「１０００００」、「１００００」、「１０００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温の後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【００６５】
（３）解析
各サイクルのサイバーグリーン色素の発光量から、ＨＡＳ３及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては、増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＨＡＳ３の発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。この算出結果から、下記式に基づいてＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００６６】
ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表２に示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
表２に示すように、甘草葉部抽出物（試料１）、ピノセンブリン（試料２）、６−プレニル−ナリンゲニン（試料３）及びアンゴホロール（試料４）は、いずれも優れたＨＡＳ３ｍＲＮＡの発現を促進する作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のコレステロール合成促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚の老化の予防又は改善に大きく貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするコレステロール合成促進剤。
【請求項２】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項３】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項５】
下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするコレステロール合成促進剤。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれるものである。
（Ａ）Ｒ１が水素原子のとき、Ｒ２は水素原子
（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基
（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素原子）
【請求項６】
請求項５に記載の一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項７】
請求項５に記載の一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項８】
請求項５に記載の一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項１】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするコレステロール合成促進剤。
【請求項２】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項３】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
甘草葉部抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項５】
下記一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするコレステロール合成促進剤。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせから選ばれるものである。
（Ａ）Ｒ１が水素原子のとき、Ｒ２は水素原子
（Ｂ）Ｒ１がヒドロキシ基であるとき、Ｒ２は３−メチル−２−ブテニル基
（Ｃ）Ｒ１がメトキシ基であるとき、Ｒ２は水素原子）
【請求項６】
請求項５に記載の一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項７】
請求項５に記載の一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項８】
請求項５に記載の一般式（１）で表されるフラバノン類化合物のうちの少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤。
【公開番号】特開２０１０−９００３５（Ｐ２０１０−９００３５Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５８８０５（Ｐ２００８−２５８８０５）
【出願日】平成２０年１０月３日（２００８．１０．３）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３日（２００８．１０．３）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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