スクリーニングアッセイ
本発明は図１〜１１に示されるようなドーパミンレセプター相互作用ポリペプチド（ＤＲＩＰ）の相互作用を調節する薬剤、及びそのような薬剤の同定のためのスクリーニング方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１又は複数のドーパミンレセプターと結合するポリペプチドの相互作用を調節する薬剤の同定のためのスクリーニングアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミンのシグナル伝達は、ニューロン間の情報伝達に関する重大なメカニズムを提供する。シナプス間隙を介した神経伝達物質であるドーパミン放出及びポストシナプティックドーパミンレセプターによる取り込みは、シグナルカスケードを誘導し、ヘテロ三量体Ｇ−プロテイン及びセカンドメッセンジャー経路の活性化に関与する（Ｎｅｖｅｓら、２００２）。この工程を制御し損なうことは、パーキンソン病、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、鬱病（双極性障害）及び統合失調症（Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，２００１）及び中毒（例えば、アルコール、ニコチン又はコカイン中毒などの薬剤麻薬中毒）を含む神経精神障害と関連する。他の「ドーパミンを介する障害」には、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、トゥーレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、老年性皮膚萎縮症、シデナム舞踏病、自閉症、ジストニア（ｄｉｓｔｏｎｉａ）、振戦、自閉症、頭部及び脊髄損傷、急性及び慢性痛、癲癇及び癲癇性痙攣、認知症、脳虚血及び神経細胞死）及びアポトーシス、特に神経性アポトーシスとリンクした障害が含まれる。
【０００３】
ドーパミンシグナル伝達は、ドーパミンレセプターの構造及び機能については集中的に研究されてきたが（Ｓｉｂｌｅｙ及びＭｏｎｓａｎａ，１９９２；Ｍｉｓｓａｌｅら、１９９８）、分子レベルではほとんど理解されていない。ドーパミンレセプターはＧプロテイン共役７回膜貫通レセプターであり、細胞外のシグナルを細胞内へ変換する。これらのレセプターは、遺伝的及び薬理学的特性に基づいて、２つのグループに分類される。Ｄ１様レセプター（Ｄ１、Ｄ５）はイントロンが無く、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルの上昇を引き起こすアデニリルシクラーゼを活性化する。Ｄ２様レセプター（Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）はイントロンを有し、アデニリルシクラーゼを阻害する。ｃＡＭＰは、ドーパミン及びｃＡＭＰ制御３２ｋＤリン酸化タンパク質、ＤＡＲＰＰ−３２（Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，２００１）を含む、標的タンパク質を順次リン酸化するプレテインキナーゼを活性化する。ＤＡＲＰＰ−３２は、イオンポンプ、イオンチャンネル及び転写因子（例えば、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質））の制御を含むドーパミンの効果をメディエートするのに必要である。
【０００４】
ドーパミンレセプターは２つの重要な機能ドメイン、細胞内３番目ループ及びＣ末端細胞ドメインを有する。Ｄ１及びＤ５レセプターは短いループと長いＣ末端を有する。Ｄ２、Ｄ３及びＤ４レセプターは、長い細胞内３番目ループと短いＣ末端領域を有する。Ｇプロテイン共役レセプターの細胞内ドメインは、シグナル伝達に重要な役割を担う種々のアクセサリープロテインと相互作用することにより、シグナル伝達複合体を形成する（Ｗｕら、１９９８）。この過程は細胞質のシグナルタンパク質のレセプターへのリクルートに関与し、又は、レセプター自身が他のタンパク質と相互作用するために内在化するダイナミックなプロセスである（Ｌａｍｅｙら，２００２；Ｋａｂｂａｎｉら，２００４）。
【０００５】
「ドーパミン仮説」は、３０年間に及ぶ分子的、臨床的、薬理学的データによって支持され、ドーパミンシグナル伝達と統合失調症分野への貢献が認められた２０００年度のＣａｒｌｓｓｏｎとＧｒｅｅｎｇａｒｄに対するノーベル賞で頂点に達する（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，２００１；Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，２００１）。例えば、死後脳組織におけるレセプター結合研究及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）などの脳のイメージング技術により、前頭前野、帯状回、視床、海馬及び被殻を含む統合失調症に関与することが知られている脳の領域において、Ｄ４の増加とＤ１レセプターの減少が示されている（Ｓｅｅｍａｎら，１９９３；Ｓｉｌｂｅｒｓｗｅｉｇら，１９９５；Ｏｋｕｂｏら，１９９７）。しかしながら、抗精神病薬は、主としてＤ２レセプターなど、ドーパミンレセプターをブロックすることにより作用する（Ａｂｉ−Ｄａｒｇｈａｍら，２０００；Ｓｅｅｍａｎ及びＫａｐｕｒ，２０００）。これに対し、アンフェタミンやコカインなどの薬物は、ドーパミンレベルを増加させるもので、精神病を引き起こす（Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９３）。これらの知見は、ノックアウトマウスの研究によってさらにサポートされる（Ｂａｉｋら，１９９５；Ｇｉｒｏｓら，１９９６）。しかし、詳細に証明された統合失調症におけるドーパミンの役割にもかかわらず、連鎖研究によっては、統合失調症におけるドーパミンの役割に関する決定的な証拠を示すことができなかった（Ｃｏｏｎら，１９９３）。
【０００６】
統合失調症の治療のための現在の薬物は、ドーパミンレセプターをブロックすることにより作用するもので、効果がないか又は主要な副作用に関連するものである。ジプレキサは、３２億ドル売り上げた２００３年度の米国で５番目によく売れた薬剤である。しかし、ジプレキサは短期間で大幅な体重の増加を引き起こし、その結果、最初の数ヶ月で数ｋｇ／月に及ぶ体重増となる。また、統合失調症の治療に使用された薬剤の長期間にわたる副作用も認められた。例えば、典型的な神経安定薬として説明される抗精神病薬は、振戦、パーミンソニズムなどの主要な錐体外路系副作用も引き起こし、延長して使用すると錐体外路性終末欠陥症候群（しばしば下及び顔のみならず指、手、足及び動態にける無意識動作）を引き起こす。
上述の不都合を未然に防ぎ、和らげる薬剤開発のための新しいターゲットが必要である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明はドーパミンレセプターと相互作用するポリペプチドを同定し、その結果、これらのポリペプチドと、おそらく直接的又は間接的に結合する薬剤の同定を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、１又は複数のドーパミンレセプターとポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤同定のためのスクリーニング方法であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として（縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択され；
ｉ）該ポリペプチド及びドーパミンレセプターを含む調製物を生成し；及び
ｉｉ）テストされる少なくとも１つの候補薬剤を添加し；
ｉｉｉ）該ポリペプチドと該ドーパミンレセプターとの相互作用に対する影響の有無、又は該薬剤について測定する段階を含む、スクリーニング方法が提供される。
本発明のより好ましい方法によると、本ポリペプチドは、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示されるアミノ酸配列、又は少なくとも１アミノ酸の付加、置換若しくは欠失によって修飾された変異体によって表される。このようなポリペプチドは本発明の第１の態様において提起されるポリペプチドと同様に、「ドーパミンレセプター相互作用ポリペプチド（ＤＲＩＰｓ）」としてここでは称されるであろう。
【０００９】
ここで用いられるポリペプチドの「変異体（群）」には、参照されるポリペプチド由来のアミノ酸配列と異なるポリペプチドが含まれる。通常、この相違は、参照ポリペプチドと変異体の配列が極めて類似しており、多くの領域において同一であるような範囲内にある。変異体ポリペプチドは、１又は複数の任意に組み合わされる置換、付加、欠失、欠損によりアミノ酸配列が異なる。中でも好ましい変異体は保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドと相違するものである。このような置換は、任意のアミノ酸が類似する特徴を持つ他のアミノ酸により置換されるものである。以下に非限定的に列挙するアミノ酸は保存的置換（類似）が考慮される：ａ）アラニン、セリン及びスレオニン；ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；ｃ）アスパラギン及びグルタミンｄ）アルギニン及びリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン、ｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。
本発明は、さらに、上記核酸配列／分子の変異体に関する。本態様において、変異体は、自然発生的な対立遺伝子の変異体、例えば、上記核酸配列のコード又は非コード領域内の１又は複数の単一ヌクレオチドポリモルフィズム（ＳＮＰｓ）などの自然発生的変異体であってもよい。また、ＳＮＰｓは上記核酸配列近傍の核酸配列内、又はＤＲＩＰＳの特性／機能に影響を与える他の核酸配列内でも生じる。
あるいは、該変異体は非自然的に生じることが知られている変異体でもよい。このようなポリヌクレオチドの非自然発生的変異体は、ポリヌクレオチド、細胞又は生体に適用されるものと含む、突然変異誘発技術によって作製される。
【００１０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄の条件は当該分野においては周知である。例えば、核酸のハイブリッドは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄後も安定である。当該分野において至適なハイブリダイゼーション条件は核酸の配列が既知であれば計算できることは周知である。例えば、ハイブリダイゼーションに供する核酸のＧＣ含量によってハイブリダイゼーション条件が決定される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。特定の相同性を持つ核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシーの条件を計算するための一般的な式は：
Tm = 81.5℃ + 16.6 Log [Na+] + 0.41[ % G + C] -0.63 (%ホルムアミド)。
本発明の第１の態様の核酸分子は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に設定される配列、又は図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に設定される配列と、各々、核酸残基レベルで少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、例えば、９８％又は９９％同一な配列を含んでもよい。
【００１１】
当該分野で知られている「同一性」とは、配列を比較することにより決定される２又はそれ以上のポリペプチド配列、又は２又はそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことである。当該分野において、同一性はポリペプチド又はポリヌクレオチド間の、場合によっては、一連の配列間の一致度によって決定されるような配列関連性の度合いをも意味する。同一性は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ＡＮＤ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、そのタームは当業者にとって周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８））。配列間の同一性を決定するために一般に用いられる方法は、限定はしないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示される方法が含まれる。同一性を決定するための好ましい方法はテストされる配列間に最大の一致度を付与するように設計される。同一性を決定するための方法はコンピュータープログラムで暗号化される。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、限定はしないが、ＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら，Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））。
【００１２】
本発明の第１の態様の核酸配列の相補鎖は、ＤＲＩＰｓをコードする遺伝子（群）の制御においてプローブ又はプライマーとして有用である。それらは欠陥のある又は不完全なＤＲＩＰと関連する疾患を呈する患者の同定及び／又は治療、例えば、ＤＲＩＰｓ中のポリモルフィズムの同定に有用である。このようなポリモルフィズムは研究ツールとして、例えば、ＤＲＩＰの機能解析において、遺伝的危険因子の対象のスクリーニング又は対象中の薬物応答の予測において使用することができる。これらの配列は好ましくは単離される。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９を含む。
【００１３】
ドーパミンレセプターにはＤ１様レセプター（Ｄ１、Ｄ５）及びＤ２様レセプター（Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）が含まれる。本発明の好ましい方法において、ドーパミンレセプターは図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって表される。
ここで用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、通常の意味のおいて、ペプチド結合により結合された複数のアミノ酸残基のことである。ペプチド、タンパク質、オリゴペプチド又はオリゴマーと同じように交換可能に使用され、同じ意味を表す。「ポリペプチド」という用語は、断片、変異体であって、ポリペプチドの選択的スプライシング変異体又はアイソフォーム、類似体及び誘導体を含むことも意味し、該断片、変異体、類似体又は誘導体が参照タンパク質と同じ生物学的活性又は機能を基本的に保持するものである。
ここで用いられる「断片」には任意の連続する１０残基配列、又はより長い、１５、２０、３０、５０又は１００残基配列が含まれる。好ましくは、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の断片はＤＲＩＰ又はその遺伝子と１又は複数の機能的特性が共通する。
該断片は種々の診断、予後診断又は治療方法において使用され、又はスクリーニングなどにおける研究ツールとして有用である。本発明の第１の態様における核酸断片、又はその相補鎖はプライマーシークエンスとして使用される。例えば、図８に示される配列のヌクレオチド６４０〜７６５を含む断片は、ポリセリン領域をコードする繰り返しモチーフに相当し、例えば、ここで開示されるドーパミンメディエート障害の診断又は予後診断に有用である。
【００１４】
本発明の好ましい方法において、ＤＲＩＰは細胞により発現される。本発明の更なる好ましい方法において、ドーパミンレセプターは細胞により発現される。
本発明の好ましい方法において、該細胞はＤＲＩＰ及び／又はドーパミンレセプターをコードする少なくとも１つの核酸分子（群）で形質移入された細胞である。該核酸分子（群）は核酸分子のインビトロ又はインビボでの発現を可能にするベクターの形で提供される。好ましくは、該核酸分子は制御可能である。適当な制御エレメントは、特にプロモーターにおいて、発現ベクターが挿入される宿主細胞に依存して使用されるであろう。
好ましい細胞には、大腸菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞が含まれ、好ましくはＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、ジャーカット又はｃｏｓ細胞系列、サル細胞系列及びそれらの誘導体などのように不死化される。
本発明の好ましい方法において、該細胞は、例えば、神経細胞など、脳の細胞である。
本発明の更なる態様において、該細胞はトランスジェニック動物の一部であり、該動物のゲノムが該ポリペプチド及び／又は該ドーパミンレセプターをコードする核酸分子を含むように修飾されている。
【００１５】
本発明の更なる態様において、ドーパミンレセプターとポリペプチドの相互作用を調節する薬剤であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される薬剤が提供される。
通常、該薬剤はドーパミンレセプターに結合するが、ドーパミンレセプターの天然のリガンドではない。該薬剤は、ＤＲＩＰと図１２〜１６のいずれかに示される１又は複数のドーパミンレセプターとの間の相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストである。
本発明の好ましい方法において、該薬剤は例えばモノクローナル抗体などの抗体又は抗体の活性な結合断片である。抗体断片は一本鎖抗体可変領域断片であってもよい。
【００１６】
抗体又はイムノグロブリン（Ｉｇ）は２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）（低分子量）鎖（κ又はλ）、及び１対の重（Ｈ）鎖（γ、α、μ、δ及びε）からなり、４つ全てがジスルフィド結合によって連結されている。Ｈ及びＬ鎖は、共に抗原の結合に寄与する領域を持ち、Ｉｇ分子毎に高度に可変である。さらに、Ｈ及びＬ鎖は、非可変又は定常な領域を含む。Ｌ鎖は２つのドメインからなる。Ｃ末端ドメインは任意のタイプのＬ鎖間で本質的に同一であり、「定常」（Ｃ）領域と称されている。アミノ末端同メインはＬ鎖毎に異なり、抗体の結合サイト原因となる。その可変性により、「可変」（Ｖ）領域と称される。可変領域は抗原結合ポケットを形成する相補性決定領域又はＣＤＲ’ｓを含む。結合ポケットは、抗原認識に寄与するＨ及びＬ可変領域を含む。いわゆる一本鎖抗体可変領域断片（ｓｃＦｖ’ｓ）と呼ばれる単一の可変領域を調製することは可能である。ハイブリドーマが特定のモノクローナル抗体に関し存在する場合、該ハイブリドーマからＲＴ ＰＣＲを用いて抽出されたｍＲＮＡからｓｃＦｖ’ｓを単離することは当業者の常識の範囲内に十分含まれる。あるいは、ｓｃＦｖ’ｓを発現するクローンを同定するために、ファージディスプレイスクリーニングを行うこともできる。
【００１７】
あるいは、該断片は「ドメイン抗体断片」である。ドメイン抗体は抗体の最小限の部分である（約１３ｋＤａ）。この技術の例が、ＵＳ６２４８５１６，ＵＳ６２９１１５８及びＵＳ６１２７１９７に開示される。
本発明の好ましい実施態様において、該抗体断片は一本鎖抗体可変領域断片である。
本発明のさらに好ましい実施態様において、該抗体又はその結合断片はキメラ抗体である。本発明の選択的な好ましい実施態様において、該抗体又はその結合断片はヒト化抗体である。
キメラ抗体はヒト抗体の不変又は定常領域と共に抗体の可変領域を含むように組換え法により作製される。
ヒト化抗体は、抗体のＣＤＲ’ｓとヒト抗体の定常領域及び可変領域に由来するフレームワーク領域とを結合させる組換え方法によって作製される。
非ヒト動物由来の抗体は外来抗体に対する免疫応答及び血液循環からのその除去を引き起こす。キメラ及びヒト化抗体の双方は、組換体ハイブリッド抗体中の齧歯類（即ち外来の）抗体の量が減少しており、一方、ヒト抗体領域は免疫反応を引き起こさないため、ヒト患者にインジェクトした場合抗原性が減少する。その結果、より減弱な免疫反応となり、抗体のクリアランスが減少する。ヒト疾患の治療において治療上抗体を使用する場合、この点は明らかに望ましいことである。ヒト化抗体はより少ない「外来性」抗体領域を持つように設計されるから、キメラ抗体よりより低い免疫原性になると思われる。
【００１８】
本発明の更なる好ましい方法において、該薬剤は修飾されたペプチドのようなペプチドである。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１２に示される配列のヌクレオチド１７１０〜２０５１でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１２に示される配列のヌクレオチド１３５６〜１５２３でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１３に示される配列のヌクレオチド７９６〜１２８１でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１４に示される配列のヌクレオチド１００５〜１３６４でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１５に示される配列のヌクレオチド６４６〜１０２３でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１６に示される配列のヌクレオチド７７２〜９４８でコードされるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
ＤＲＩＰと１又は複数のドーパミンレセプターとの相互作用を調節するペプチドのアミノ酸配列に対する修飾が、そのターゲット配列に対するペプチドの結合及び／又は安定性を促進し得ることは、当業者において、明らかなことであろう。さらに、ペプチドの修飾は、インビボにおけるペプチドの安定性も増大させ、これにより、ある相互作用を阻害するのに必要なペプチドの有効量を少なくすることができる。この点は、インビボで生じ得る望ましくない副作用を有利に減少させる。修飾には、例として、限定はしないが、アセチル化及びアミド化が含まれる。
本発明の好ましい方法において、該ペプチドはアセチル化されている。好ましくは、該アセチル化は該ペプチドのアミノ末端である。
本発明のさらに好ましい方法において、該ペプチドはアミド化されている。好ましくは、該アミド化は該ペプチドのカルボキシ末端である。
本発明のさらに好ましい方法において、該ペプチドはアセチル化及びアミド化によって修飾される。
あるいは、又は好ましくは、該修飾には組換体又はペプチドの合成型の調製における修飾されたアミノ酸の使用が含まれる。当業者において、修飾されたアミノ酸には、例えば、限定はしないが、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ６−メチルリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリジン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリジン、シクロヘキシアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが含まれる。他の修飾には、Ｃ２，Ｃ３又はＣ４アルキルＲグループをハロ（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシ又はＣ１−Ｃ４アルコキシから選択される１，２又は３置換体によって任意に置換されたアミノ酸が含まれる。
あるいは、ペプチドは、例えば、環化により修飾され得る。環化は当該技術分野において周知である（Ｓｃｏｔｔら Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００１），８：８０１−８１５；Ｇｅｌｌｅｒｍａｎら Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２００１），５７：２７７−２９１；Ｄｕｔｔａら Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２０００），８：３９８−４１２；Ｎｇｏｋａ及びＧｒｏｓｓ Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ（１９９９），１０：３６０−３６３を参照のこと）。
本発明のペプチドの好ましい方法において、本発明のペプチドは環化により修飾される。
【００２０】
本発明の更なる選択的実施態様において、該薬剤はアプタマーである。
核酸は直線上の配列構造と３次元構造を有しており、直線上の配列及びこれらの分子が局在する環境によってもその一部が決定される。従来の治療用分子は、小分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、又は抗体であり、ターゲット分子に結合してアゴニスト又はアンタゴニスト効果を発揮する。核酸分子が治療上の有用性を持つ必須の結合特性のある薬剤を提供する可能性も有することが明らかとなってきた。これらの核酸分子は、典型的にはアプタマーと称される。アプタマーは小さく、通常、安定化された核酸分子であり、ターゲット分子の結合ドメインを含み、本発明においてはスカベンジャーレセプターシステインリッチドメインを含むポリペプチドである。アプタマーを同定するためにスクリーニング方法は、参考文献としてここに記載されるＵＳ５，２７０，１６３中に記載される。アプタマーは典型的には一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド又は修飾オリゴデオキシヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドである。
【００２１】
「修飾される」との用語には、共有結合的に修飾された塩基及び／又は糖を持つヌクレオチドが含まれる。例えば、修飾された核酸には、３’位にヒドロキシ基以外の、また、５’位にリン酸基以外の低分子量有機基が共有結合的に結合された糖を持つ核酸が含まれる。従って、修飾されたヌクレオチドには、２’−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２’−Ｓ−アルキル；２’−Ｓ−アリル；２’−フルオロ−；２’−ハロ又は２；アジド−リボース、炭素環式糖類似体ａ−アノメリック糖；アラビノース、キシロース又はリキソースなどのエピメリック糖、ピラノース糖、フラノース糖及びセドヘプツロースなどの２’置換糖も含まれる。
修飾されたヌクレオチドは当該分野で知られており、例えば、限定はしないが；アルキル化プリン及び／ピリミジン；アシル化プリン及び／又はピリミジン；又は他のヘテロ環などが含まれる。これらのピリミジン及びプリンのクラスは、当該分野において知られており、シュードイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）；Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン；８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン；４−アセチルシトシン，５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６−イソペンチル−アデニン；１−メチルアデニン；１−メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；２，２−ジメチルグアニン；２−メチルアデニン；２−メチルグアニン；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；７−メチルグアニン；５−メチルアミノメチルウラシル；５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル；β−Ｄ−マンノシルケオシン；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メトキシウラシル；２メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；シュードウラシル；２−チオシトシン；５−メチル−２チオウラシル，２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−メチルウラシル；Ｎ−ウラシル−５−オキソ酢酸メチルエステル；ウラシル５−オキソ酢酸；ケオシン；２−チオシトシン；５−プロピルウラシル；５−プロピルシトシン；５−エチルウラシル；５−エチルシトシン；５−ブチルウラシル；５−ペンチルウラシル；５−ペンチルシトシン；及び２，６−ジアミノプリン；メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；１−メチルシトシンが含まれる。
【００２２】
さらなる実施態様において、薬剤は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。好ましくは該ＲＮＡｉ分子は本発明の第１の態様による核酸分子に由来する。より好ましくは該ＲＮＡｉ分子は１０ヌクレオチド塩基（ｎｂ）−１０００ｎｂの長さを持つ。さらにより好ましくは該ＲＮＡｉ分子は１０ｎｂ；２０ｎｂ；３０ｎｂ；４０ｎｂ；５０ｎｂ；６０ｎｂ；７０ｎｂ；８０ｎｂ；９０ｎｂ；又は１００ｎｂの長さを持つ。さらにより好ましくは該ＲＮＡｉ分子は２１ｎｂの長さである。
本発明のアプタマーは従来のホスホジエステル結合ヌクレオチドを用いて合成することができ、また、当該分野で知られる標準的な固相又は液相合成技術を用いて合成することができる。ヌクレオチド間の結合は、代替的な分子結合を用いてもよい。例えば、式 Ｐ（Ｏ）Ｓ，（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ，（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；又はＣＯＮＲ’２において、ＲはＨ（又は塩）又はアルキル（１−１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１−９Ｃ）であって、−Ｏ−又は−Ｓ−を介して隣接するヌクレオチドを結合するものからなる結合グループである。
【００２３】
本発明の方法は、本発明のポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を修飾する（例えば、阻害、低減、ブロック又は促進）薬剤の同定を可能にする。薬剤はここで既述されるものでもよく、又は薬剤は小分子でもよい。例えば、そのような小分子には、限定はしないが、約１０，０００グラム／モル未満の分子量を持つペプチド、ペプチドミメティクス（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約５，０００グラム／モル未満の分子量を持つ有機又は無機化合物、 約１，０００グラム／モル未満の分子量を持つ有機又は無機化合物、 約５００グラム／モル未満の分子量を持つ有機又は無機化合物、及び塩、エステル及びこのような化合物の他の薬学的に許容される形態である。
本発明はさらにＤＲＩＰと相互作用する下流の因子とＤＲＩＰとの相互作用に影響を与える薬剤のスクリーニングアッセイを提供する。例えば、ＤＲＩＰｓとドーパミンシグナル伝達に関与する他のタンパク質、例えば、ＤＡＲＰＰ−２２及びＣＲＥＢとの相互作用は、かかる薬剤により制御される。
【００２４】
本発明はさらに本発明の第１の態様による核酸分子の使用を提供する。例えば、核酸分子は研究上の開始ポイントとして使用することができ、これにより、任意の核酸分子に関連して１又は複数の変化が導入される。この結果、例えば、ＤＲＩＰ結合ドメインなど、どの部分がＤＲＩＰとドーパミンレセプター又は他の結合タンパク質との相互作用に重要であるか決定することができる。
【００２５】
本発明の更なる態様によると、細胞のゲノムが、
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１コピーを含むように修飾され、該細胞が該核酸分子の制御された発現に対し適合している、少なくとも１つの核酸分子で形質移入された細胞が提供される。
核酸分子の発現は上方制御又は下方制御されてもよい。従って、細胞／細胞系列は１又は複数のＤＲＩＰｓを過剰発現しもよく、又はＤＲＩＰｓがノックアウトされている結果１又は複数のＤＲＩＰｓが欠損していてもよい。
本発明の好ましい態様において、該細胞が少なくとも１つの核酸分子で形質移入され、該細胞のゲノムがここに記載される１又は複数のドーパミンレセプターをコードする少なくとも１コピーの核酸分子を含むように修飾される。
本発明の好ましい実施態様において、該細胞は、さらに、該ポリペプチド（群）の活性をモニターするレポーター遺伝子を包含する核酸分子を含む。
本発明の細胞は本発明のスクリーニング方法において有用である。薬剤は当業者に既知の多くの技術、例えば、ここに示される実施例に記載されるＧＳＴプルダウンアッセイ、免疫共沈殿法及び細胞内局在及び同一局在などを用いたスクリーニング方法により同定される。表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）は、チップの表面上での分子相互作用を検出するために使用され、反応キネティクス及び結合親和性に対する定量的なデータを提示する。
【００２６】
好ましい細胞には、大腸菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞が含まれ、好ましくは、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、ジャーカット又はｃｏｓ細胞系列、サル細胞系列及びこれらの誘導体などのように不死化される。
本発明の好ましい方法において、該細胞は脳の細胞であり、例えば、神経細胞である。
本発明の更なる態様によれば、本発明による少なくとも１つの細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。トランスジェニック動物はＤＲＩＰｓ及びその表現型の効果の解析に有用である。本発明の第１の態様において定義されるようにトランスジェニック非ヒト動物における核酸配列の発現は、通常、ポリヌクレオチドをプロモーター及び／又はエンハンサー配列に作用可能に結合させ、宿主動物の胚性幹細胞中に導入することにより達成される。本発明には図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１で表される１又は複数の核酸配列が過剰発現される細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。核酸配列の過剰発現は、配列に制御エレメントを加えて卵母細胞の前核にマイクロインジェクションすることにより達成される（Ｈｏｇａｎら，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｕｒ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８−１２９２）。その後、導入遺伝子コンストラクトは宿主細胞の内在性遺伝子と相同組換えを起こす。所望のポリヌクレオチド配列を含む胚性幹細胞は、通常、マーカー遺伝子の発現をモニターすることにより選択され、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用される。本発明には、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される１又は複数の核酸配列が、例えば、配列に選択マーカーを含む制御エレメントを加えて胚性幹細胞（ＥＳ）中に形質移入により導入されることにより、ノックアウトされる細胞を含むトランスジェニック動物も含まれる。このような「ノックアウト」動物において、本発明の核酸配列の発現が妨げられる。
本発明の更なる好ましい実施態様において、該トランスジェニック動物は例えば、ラット、マウス又はハムスターの齧歯類である。あるいは、トランスジェニック動物はシーエレガンス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ又はアフリカツメガエルである。
【００２７】
本発明の更なる態様において、ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を調節する薬剤の同定におけるドーパミンレセプターの使用が提供される。
本発明の更なる態様において、ポリペプチドとドーパミンシグナル伝達に関与するポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤の同定における該ポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが、ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される場合の該ポリペプチドの使用が提供される。
ドーパミンシグナル伝達に関与するポリペプチドには、例えば、ＤＡＲＰＰ−３２及びＣＲＥＢが含まれる。
【００２８】
本発明の更なる態様は、ポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を調節する薬剤の同定における該ポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが、ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される場合の該ポリペプチドの使用を提供する。
ＤＲＩＰｓはＤＲＩＰ阻害剤又はドーパミンレセプターへのＤＲＩＰの結合の調節など、ドーパミンレセプターの機能を調節する分子の構造に基づくデザインに使用することができる。このような「構造に基づくデザイン」は、「合理的なドラッグデザイン」としても知られている。ＤＲＩＰｓは、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴又はホモロジーモデリングなど、全て周知の方法により３次元的に解析できる。分子モデリングソフトウェアシステムにおけるＤＲＩＰの構造情報の使用も本発明に含まれる。このようなコンピューターを利用したモデリング及びドラッグデザインは化学的配座解析、分子の静電ポテンシャル、タンパク質の折りたたみなどの情報を利用してもよい。本発明の特定の方法には、標的の可能性のある結合サイトに関し、ＤＲＩＰｓの３次元構造を解析し、予想される反応部位を取り込んだ新規分子を合成し、上述のように新規分子をアッセイすることが含まれる。
【００２９】
ドーパミンを介する障害には、パーキンソン病、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、鬱病（双極性障害）及び統合失調症及び中毒（例えば、アルコール、ニコチン又はコカイン中毒などの薬剤麻薬中毒）を含む神経精神障害が含まれる。他の「ドーパミンを介する障害」には、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、トゥーレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、老年性皮膚萎縮症、シデナム舞踏病、自閉症、頭部及び脊髄損傷、急性及び慢性痛、癲癇及び癲癇性痙攣、認知症、ジストニア（ｄｉｓｔｏｎｉａ）、振戦、自閉症、脳虚血及び神経細胞死）及びアポトーシス（特に神経性アポトーシス）とリンクした障害が含まれる。ドーパミンを介する障害には、心臓血管、肺疾又は腎臓の状態が含まれてもよい。調節により、ＤＲＩＰと１又は複数のドーパミンレセプターとの結合を阻害又は促進することが意味される。ドーパミンレセプターとＤＲＩＰとの相互作用は多くの方法で調節される。例えば、遺伝子発現がアンチセンス配列、即ち、本発明の第１の態様による相補配列の使用を通じて阻害される。遺伝子治療により患者に導入される場合、このような配列はＤＲＩＰ遺伝子又はＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳又は転写を阻害する。この方法は、他には影響を与えずＤＲＩＰの特定のスプライシング変異体の機能を調節したい場合に特に有用である。
【００３０】
本発明の第１の態様にかかる核酸配列の導入には、当該分野で知られるものを含む遺伝子治療法を用いてもよい。一般に、核酸配列は、通常、ベクターの形及び好ましくは薬学的に許容される担体の形で患者の標的細胞中に導入される。組換えゲノムを包み込むことができるレトロウィルスベクターシステムなどのウィルスベクターを含む任意の適切な輸送媒体が用いられる。また、他の輸送技術も広く利用可能であり、アデノウィルスベクター、アデノ関連ベクター、レンチウィルスベクター、シュードタイプレトロウィルスベクター及びポックス又はワクシニアウィルスベクターの使用が含まれる。また、リポソームも使用可能であり、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクタミン（登録商標）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）、スーパーフェクト（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びトランスフェクタム（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）などの市販のリポソーム調製品が含まれ。
また、上記定義されるような薬剤も、上記定義される患者におけるドーパミンを介する又はドーパミンに関連する障害の予防又は治療において薬剤としての使用のために提供される。該薬剤には、アンチセンス配列及びＤＲＩＰｓの相互作用を調節することができる任意の他の薬剤が含まれる。また、そのような薬剤は欠陥又は欠損のあるＤＲＩＰによって特徴づけられる障害の治療にも有用である。
【００３１】
本発明は、以下の図に従って、一例としてのみ、ここに記載される。
【実施例】
【００３２】
実施例
材料及び方法
酵母 ２−ハイブリッドスクリーニング
酵母 ２−ハイブリッドシステムはインビボにおけるタンパク質−タンパク質相互作用に関するアッセイに使用され（Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇ，１９８９）、酵母の交配手段に使用する（Ｂｅｎｄｉｘｅｎら，１９９４；Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら，１９９７）。ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）を同定するために、我々は、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＢＤ）と融合させたドーパミンレセプターｃＤＮＡを用いて２−ハイブリッドスクリーニングを行った。ＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４ＡＤ）とヒト脳由来のｃＤＮＡｓ間の融合プラスミドライブラリーについて、酵母レポーター株ｐＪ６９４ａのＧＡＬ４ＢＤ−ＤＲ融合タンパク質との相互作用に関しスクリーニングを行った。
Ｄ１ＤＲのＣ末端は２−ハイブリッドスクリーニングのベイトとして使用した。Ｄ１ＤＲ（Ａｓｎ２３４−ＴＧＡ４４７）の最後の１１４アミノ酸に対するコード配列を、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより増幅した。；
５’−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＧＧＡＡＧＧ−３’、及び
５’−ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧ−３’．
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ（下線を付した配列）で切断し、生じた断片を、酵母 ２−ハイブリッドスクリーニングのためのＤ１ＤＲ−ｐＧＢＴ９を調製するため、Ｇａｌ４ドメインをコードする酵母 ２−ハイブリッド発現ベクターｐＧＢＴ９にサブクローニングした（Ｂａｒｔｅｌら，１９９３）。
【００３３】
ドーパミンレセプター融合体（ＤＲ−ｐＧＢＴ９）を発現するプラスミドを保持している株ＰＪ６９４αを、Ｇａｌ４活性化ドメインとの融合体のライブラリーで形質転換した株ｐＪ６９４ａと交配し、予想される相互作用融合タンパク質を保持する二倍体を、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンを欠き、２ｍＭ ３−アミノトリアゾールを含む選択プレート上で同定した。各セットのプレートで選択される二倍体を他のレポーター遺伝子の発現についてテストした。レポーター遺伝子に対しポジティブな二倍体に由来する異なるｐＡＣＴ２融合タンパク質をｌｅｕＢ６大腸菌株のコンプリメンテーションによりレスキューした。融合遺伝子はオリゴヌクレオチド、５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣ−３’をプライマーとして配列決定を行った。
我々は、個別のスクリーニングにおける６つの異なるベイト（Ｄ１Ｔ、Ｄ１Ｃ、Ｄ２Ｔ、Ｄ３Ｔ、Ｄ４Ｔ、Ｄ５Ｔ）に由来する７つの新規ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰ−１〜ＤＲＩＰ−１１）を同定した（表１）。「ベイト」あたり少なくとも１つの相互作用タンパク質が単離された。従来、ドーパミンシグナル伝達又は統合失調症に関与すると考えられる相互作用タンパク質は存在していなかったが、それらのほぼ全てが本疾患とリンクするゲノム領域にマップされる（表１）。例えば、ＤＲＩＰ−２及びＤＲＩＰ−１１は染色体２ｑに、ＤＲＩＰ−７は５ｑに、ＤＲＩＰ−９はＸｐ１１にマップされる。各レセプター間における配列相同性にも関わらず、各レセプター全てにおいて、ユニークな相互作用タンパク質のセットが同定された。しかし、Ｄ１ＣとＤ３Ｔは同じ相互作用タンパク質であるＤＲＩＰ−４を特定したことから、少なくともＤ１とＤ３は共通のシグナルパスウェイを共有している。
【００３４】
【表１】
以下の表はどのＤＲＩＰｓがどのドーパミンレセプターに対応するかを示す：
【表２】
【表３】
【００３５】
ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰ−１〜ＤＲＩＰ−１１）
ＤＲＩＰ−４はＤ１レセプター（Ｄ１Ｃ）のＣ末端、及びＤ３レセプターの３番目の細胞内ループ（Ｄ３Ｔ）と相互作用し、Ｄ１及びＤ３が関与する共通のシグナルパスウェイの可能性を提起する。我々は、ＤＲＩＰ−４とＤ１及びＤ３との相互作用を、マウス脳溶解物（図２０）及びＨＥＫ２９３細胞（データは示さず）からの免疫沈降によって確認する証拠を得ている。我々は、Ｄ１ＣとＤ３Ｔとのアライメントを行い、これらの配列間における有意な相同性を確認した（図１７）。
我々は、アポトーシス及びパラトーシスを阻害することにおけるＤＲＩＰ−４の役割を確認する実験的証拠を該タンパク質を哺乳類細胞において過剰発現することにより得た。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＤＲＩＰ−４の発現の始まりがマウスの神経系の発生と一致していることを示した（データは示さず）。従って、我々は、ＤＲＩＰ−４が発生における神経細胞死を抑制しないことにより神経回路の変性に関与していると考える。
【００３６】
クローニング
タンパク質−タンパク質間相互作用は、後述のインビボ及びインビトロの方法を用いて、固定組織切片及びフレッシュ組織の哺乳類細胞において、確認／テストされる。
全長ｃＤＮＡコンストラクトは、ｐＧＥＸ（ＧＳＴ）、ｐＣＭＶＴａｇ（ＦＬＡＧ）、ｐＣＤＮＡ３．１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＥＴ３２（Ｈｉｓ）及びｐＥＧＦＰ（ＧＦＰ／ＹＦＰ／ＢＦＰ／ＣＦＰ）シリーズベクターを含む種々の発現ベクター中に、ドーパミンレセプター及び相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）について作製された。
発現
大腸菌中にＧＳＴ融合タンパク質としてドーパミンレセプター及び相互作用タンパク質を発現させた。ＩＰＴＧによる誘導の後、全てのＧＳＴ融合タンパク質の高発現を達成することができ、その溶解性を至適化するために様々な条件をテストした（データは示さず）。
ＧＳＴプルダウンアッセイ
これは、タンパク質−タンパク質相互作用に関するインビトロアッセイであるが、あるタンパク質が３５Ｓメチオニンと共に翻訳され、グルタチオンセファロースに結合されるＧＳＴ融合タンパク質として発現される相互作用タンパク質と一緒にインキュベートされた。結合後、標識されたタンパク質は、ビーズから溶出され、アクリルアミドゲルで電気泳動を行い、オートラジオグラフィーで検出した。ＤＲＩＰ−４に関与する相互作用について、すでに実施されている（図１８）（及び、ＤＲＩＰ−５及びＤＲＩＰ−６［データは示さず］）。さらに、ＤＲＩＰ−５とＤ２間（図１９）、及びＤＲＩＰ−６とＤ１Ｔ間（データは示さず）の相互作用はブロットオーバーレイ実験により確認した。
共免疫沈降
相互作用タンパク質及びこれに対応するＦＬＡＧ又はＭｙｃタグを付したドーパミンレセプターをＨＥＫ２９３細胞中で同時発現させた。Ｍｙｃ抗体による免疫沈降、その後のＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロッティング、及び免疫沈降にＦＬＡＧ抗体を、ウエスタンブロッティングにＭｙｃ抗体を用いた実験を繰り返した結果、相互作用のいくつかを特徴付けすることができた。Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ及び５つのドーパミンレセプターの全てに対する抗体は市販されている。ＤＲＩＰ−４を含む相互作用タンパク質の約半分についても、抗体は市販されている。ラット脳溶解物を使用してインビボにおける相互作用をテストする。ＨＥＫ−２９３で発現されたＤＲＩＰ−４は、Ｘｐｒｅｓｓ及びＦＬＡＧタグを用いて検出することができる（データは示さず）。
【００３７】
免疫蛍光検査による細胞内局在及び共局在
同じ細胞内コンパートメント内における相互作用タンパク質の共局在は、それらの相互作用に関する重要な証拠を提供する。各相互作用タンパク質及びその対応するドーパミンレセプターは、ＨＥＫ２９３細胞及びＰＣ１２などの神経起源の細胞中で共発現される。個々のタンパク質はＭｙｃ、ＦＬＡＧ又は他のタグに対する蛍光標識二次抗体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ又はＦＩＴＣ色素を結合した）を用いて検出することができる。これらのタンパク質は、蛍光又は共焦点顕微鏡の下、ＦＩＴＣ又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ由来のイメージをマージすることで共局在される。この点について、Ｄ１／Ｄ３対ＤＲＩＰ−４の相互作用について既に行っている（データは示さず）。同時に、適当な抗体が利用可能な場合（上述を参照のこと）、同様の実験を凍結及びパラフィン包埋したラット脳切片について免疫組織化学的手法により実施することができる。さらに、ヒト脳検死材料及び組織に対する免疫組織化学的分析を行うことができる。
発現解析
ドーパミンレセプター相互作用タンパク質の発現パターンは、ノザンブロッティング；定量的ＲＴ−ＰＣＲ（異なるマウス組織及びネズミ胚形成の異なるステージに由来するｍＲＮＡを用いて）；ウエスタンブロッティング及び免疫組織化学的手法により解析される。
ドーパミンシグナル伝達におけるＤＲＩＰｓの役割の検討
Ｇプロテイン共役レセプターは、セカンドメッセンジャーの活性化を通じて細胞外シグナルを変換する。Ｄ１を発現する発現するＨＥＫ２９３２株化細胞とＤ３を発現する株化細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルを測定した（データは示さず）。我々が開発したＤＲＩＰｓ又はドーパミンレセプターを過剰発現するＨＥＫ−２９３安定株化細胞を用いて、ドーパミンレセプターアゴニスト及びアンタゴニストの存在下又は非存在下におけるリガンド結合研究を行う予定である。また、全細胞電流を記録するためにこれらの株化細胞及び培養神経細胞も使用する。我々は、Ｄ１を２−３倍、及びＤＲＩＰ−４を約１００倍過剰発現する安定株化細胞を作製した。
統合失調症におけるＤＲＩＰｓの役割の検討
神経の株化細胞中でＤＲＩＰ−６、ＤＲＩＰ−８及びＤＲＩＰ−９を過剰発現させる。これらの細胞培養モデルは、神経突起の成長及び伸長の研究に使用される。さらに、我々はＤＲＩＰｓの過剰発現が神経分化のプログラムを変更するかどうか確かめるため、幹細胞で実施される実験を計画する予定である。何故ならば、これが脳の発達及び統合失調症に重要な影響を持ち得るからである。また、神経細胞の成長及び分化又は幹細胞における細胞死をサポートし、促進し、活性化し又は誘引するＤＲＩＰ−４のような特異的タンパク質の潜在能力を評価することも目的とする。
ＤＲＩＰｓのポリモルフィズムと統合失調症との関連性に関するテストのための遺伝的研究
ドーパミンレセプター相互作用タンパク質との関連解析が、ハプロタイプの決定に役立つ５００の統合失調症の症例及び５００のコントールさらに８０ペアレントプロバンドトリオス（８０ ｐａｒｅｎｔ ｐｒｏｂａｎｄ ｔｒｉｏｓ）を加えたもので構成される十分特徴付けされたスコットランド人起源のＤＮＡサンプルのコレクションを用いて、実施される。ポジティブな関連性は、特異的なハプロタイプを持つ疾患の分離を捜すために、４０の２−３世代の家族においてテストされる。
【００３８】
ドーパミンシグナル伝達におけるＤＲＩＰｓの役割を検討するために使用される動物モデル
動物モデルは疾病の病理生理学に対する有用な見識を提供し得る。特に、マウスモデルは、通常、遺伝学的及び生理学的に十分にヒトと類似しており、インビボにおける遺伝子操作が可能である。遺伝子機能を確かめるために、ここで記述されるようなＤＲＩＰの過剰発現又は不活性化（ノックアウト）は、共に、適切な方法である。過剰発現は遺伝子コンストラクト（対象の遺伝子と適切なプロモーターからなる）を１細胞ステージの胚の雄の前核中にマイクロインジェクトすることにより達成される。遺伝子ノックアウトには２ステージが関与する。最初のステージは、遺伝子を含むゲノム断片（典型的にはＮｅｏなどの薬剤耐性マーカーでディスラプト（分断）されている）がコンストラクトされる。これは多能性胚性幹（ＥＳ）細胞中にトランスフェクトされる。コンストラクトが導入された細胞は、薬剤の毒性を示す分量存在下において細胞を生存させる薬剤耐性を付与するＮｅｏマーカーを選択するために、薬剤Ｇ４１８を添加して選択される。いくつかの細胞において、相同組換えの自然なプロセスにより、内在性の遺伝子をＮｅｏカセットと置換することができる。これらの細胞はＰＣＲ法を用いて選択できる。第二のステージにおいて、「ポジティブ」な細胞、即ち、内在性の野生型遺伝子が、破壊された（変異した）遺伝子のコピーを含むＮｅｏカセットによって置き換えられた細胞がブラストサイトステージのドナー胚にインジェクトされ、引き続き偽妊娠の雌へ導入される。生まれた動物は、野生型と変異型細胞からなるキメラである。繁殖により、生存可能な純粋な変異体を作製することができる。
【００３９】
参考文献
Abi-Dargham, A., Rodenhiser, J., Printz, D., Zea-Ponce, Y., Gil, R., Kegeles, L.S., Weiss, R. et al (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 8104-8109.
Baik, J-H, Picetti, R., Saiardi, A., Thiriet, G., Dierich, A., Depaulis, A., Le Meur, M. and Borrelli, E. (1995) Nature 377, 424-428.
Bartel P.L., Chien C.t., Sternglanz R. and Fields S. (1993). In Cellular interaction in development: A practical approach., D.A. Hartley, ed. (Oxford University Press, Oxford), pp 153-179
Bendixen C., Gangloff S. and Rothstein R. (1994). Nucleic Acids Res 22:1778-1779
Carlsson, A. (2001 Science 294, 1021-1024.
Coon, H., Byerley, W., Holik, J., Hoff, M. et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52, 327-334.
Fields, S and Song, O.(1989) Nature 340, 245-247.
Fromont-Racine M., Rain J.C. and Legrain P. Nat genet (1997) 16:277-282
Giros, B., Jaber, M., Jones, S.R., Wightman, R.M. and Caron, M.G. (1996) Nature 379, 606-612.
Greengard, P. (2001) The neurobiology of slow synaptic transmission. Science 294, 1024-1030.
Kabbani, N., Jeromin, A. and Levenson, R. (2004) Cellular signalling. 16, 497-503.
Lamey, M., Thompson, M., Varghese, G., Chi, H., Sawzdargo, M., George, S.R. and O’Dowd, B.F. (2002) J. Biol. Chem. 277, 9415-9421.
Missale, C., Nash, S.R., Robinson, S.W., Jaber, M. and Caron, M.G. (1998) Physiological Reviews 78, 189-225.
Neves, S.R., Ram, P.T. and Iyengar, R. (2002) Science 296, 1636-1639.
Okubo, Y., Suhara, T., Suzuki, K. et al. (1997) Decreased prefrontal D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature 385, 634-636.
Roberts, G.W., Leigh, P.N., and Weinbereger, D.R. (1993) Neuropsychiatric disorders. Wolfe Publishing.
Seeman, P. and Kapur, S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 7673-7675.
Seeman, P., Guan, H-C. and Van Tol, H.M. (1993) Nature 365, 441-445.
Sibley, D.R. and Monsana, Jr., F.J. (1992) Trends Pharmacol Sci, 13, 61-69.
Silbersweig, D.A., Stern, E., Frith, C. et al (1995) Nature 378, 176-179.
Wu, G., Benovic, J.L., Hildebrandt, J.D. and Lanier, S.M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 7197-7200.
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−３】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−４】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−５】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図３−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図３−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図４−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図４−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図５】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図６】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図７】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図８−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図８−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図８−３】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図９】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１０−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１０−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−３】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−４】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１２−１】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１２−２】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１３−１】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１３−２】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１４】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１５】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１６】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１７】図１７はＤ１のＣ末端ドメインとＤ３の３番目の細胞内ループのアライメントを示す。保存されるドメインを強調表示する。
【図１８】図１８はＧＳＴ−プルダウンアッセイを示す。全長ＤＲＩＰ−４及びそのＮ末端切断型（ＤＲＩＰ４の最初の１００アミノ酸）（Ｄ３Ｔ−２）とＤ１のＣ末端ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｄ１Ｃ）との相互作用をオートラジオグラフィーで検出した。ＤＲＩＰ−４の全長及びＮ末端切断型を転写、翻訳し、固定化ＧＳＴのみ又はＧＳＴ−Ｄ１Ｃとインキュベートした。結合したタンパク質を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、オートラジオグラフィーを行った。
【図１９】図１９はＤＲＩＰ−５の調製及び相互作用を示す。ａ．ＧＳＴ誘導ＤＲＩＰ−５（Ｄ２Ｔ−１−ＧＳＴ）タンパク質のクマジー染色アクリルアミドゲル。Ｂ．ＤＲＩＰ−５（Ｄ２Ｔ−１−ＧＳＴ）対Ｄ２Ｔの相互作用を確認したブロットオーバーレイ。
【図２０】図２０はＤＲＩＰ−４とＤ１及びＤ３とのインビボにおける相互作用を示す。レーン１及び２は関係の無いマウス抗体による免疫沈降を示し、各々、ＧＳＴ及びＩｇＧである（ネガティブコントロール）。レーン３はＤＲＩＰ−４抗体による免疫沈降である。レーン４はマウス脳抽出物である（ポジティブコントロール）。Ｄ１及びＤ３タンパク質は矢印で示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は１又は複数のドーパミンレセプターと結合するポリペプチドの相互作用を調節する薬剤の同定のためのスクリーニングアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミンのシグナル伝達は、ニューロン間の情報伝達に関する重大なメカニズムを提供する。シナプス間隙を介した神経伝達物質であるドーパミン放出及びポストシナプティックドーパミンレセプターによる取り込みは、シグナルカスケードを誘導し、ヘテロ三量体Ｇ−プロテイン及びセカンドメッセンジャー経路の活性化に関与する（Ｎｅｖｅｓら、２００２）。この工程を制御し損なうことは、パーキンソン病、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、鬱病（双極性障害）及び統合失調症（Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，２００１）及び中毒（例えば、アルコール、ニコチン又はコカイン中毒などの薬剤麻薬中毒）を含む神経精神障害と関連する。他の「ドーパミンを介する障害」には、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、トゥーレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、老年性皮膚萎縮症、シデナム舞踏病、自閉症、ジストニア（ｄｉｓｔｏｎｉａ）、振戦、自閉症、頭部及び脊髄損傷、急性及び慢性痛、癲癇及び癲癇性痙攣、認知症、脳虚血及び神経細胞死）及びアポトーシス、特に神経性アポトーシスとリンクした障害が含まれる。
【０００３】
ドーパミンシグナル伝達は、ドーパミンレセプターの構造及び機能については集中的に研究されてきたが（Ｓｉｂｌｅｙ及びＭｏｎｓａｎａ，１９９２；Ｍｉｓｓａｌｅら、１９９８）、分子レベルではほとんど理解されていない。ドーパミンレセプターはＧプロテイン共役７回膜貫通レセプターであり、細胞外のシグナルを細胞内へ変換する。これらのレセプターは、遺伝的及び薬理学的特性に基づいて、２つのグループに分類される。Ｄ１様レセプター（Ｄ１、Ｄ５）はイントロンが無く、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルの上昇を引き起こすアデニリルシクラーゼを活性化する。Ｄ２様レセプター（Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）はイントロンを有し、アデニリルシクラーゼを阻害する。ｃＡＭＰは、ドーパミン及びｃＡＭＰ制御３２ｋＤリン酸化タンパク質、ＤＡＲＰＰ−３２（Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，２００１）を含む、標的タンパク質を順次リン酸化するプレテインキナーゼを活性化する。ＤＡＲＰＰ−３２は、イオンポンプ、イオンチャンネル及び転写因子（例えば、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質））の制御を含むドーパミンの効果をメディエートするのに必要である。
【０００４】
ドーパミンレセプターは２つの重要な機能ドメイン、細胞内３番目ループ及びＣ末端細胞ドメインを有する。Ｄ１及びＤ５レセプターは短いループと長いＣ末端を有する。Ｄ２、Ｄ３及びＤ４レセプターは、長い細胞内３番目ループと短いＣ末端領域を有する。Ｇプロテイン共役レセプターの細胞内ドメインは、シグナル伝達に重要な役割を担う種々のアクセサリープロテインと相互作用することにより、シグナル伝達複合体を形成する（Ｗｕら、１９９８）。この過程は細胞質のシグナルタンパク質のレセプターへのリクルートに関与し、又は、レセプター自身が他のタンパク質と相互作用するために内在化するダイナミックなプロセスである（Ｌａｍｅｙら，２００２；Ｋａｂｂａｎｉら，２００４）。
【０００５】
「ドーパミン仮説」は、３０年間に及ぶ分子的、臨床的、薬理学的データによって支持され、ドーパミンシグナル伝達と統合失調症分野への貢献が認められた２０００年度のＣａｒｌｓｓｏｎとＧｒｅｅｎｇａｒｄに対するノーベル賞で頂点に達する（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，２００１；Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，２００１）。例えば、死後脳組織におけるレセプター結合研究及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）などの脳のイメージング技術により、前頭前野、帯状回、視床、海馬及び被殻を含む統合失調症に関与することが知られている脳の領域において、Ｄ４の増加とＤ１レセプターの減少が示されている（Ｓｅｅｍａｎら，１９９３；Ｓｉｌｂｅｒｓｗｅｉｇら，１９９５；Ｏｋｕｂｏら，１９９７）。しかしながら、抗精神病薬は、主としてＤ２レセプターなど、ドーパミンレセプターをブロックすることにより作用する（Ａｂｉ−Ｄａｒｇｈａｍら，２０００；Ｓｅｅｍａｎ及びＫａｐｕｒ，２０００）。これに対し、アンフェタミンやコカインなどの薬物は、ドーパミンレベルを増加させるもので、精神病を引き起こす（Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９３）。これらの知見は、ノックアウトマウスの研究によってさらにサポートされる（Ｂａｉｋら，１９９５；Ｇｉｒｏｓら，１９９６）。しかし、詳細に証明された統合失調症におけるドーパミンの役割にもかかわらず、連鎖研究によっては、統合失調症におけるドーパミンの役割に関する決定的な証拠を示すことができなかった（Ｃｏｏｎら，１９９３）。
【０００６】
統合失調症の治療のための現在の薬物は、ドーパミンレセプターをブロックすることにより作用するもので、効果がないか又は主要な副作用に関連するものである。ジプレキサは、３２億ドル売り上げた２００３年度の米国で５番目によく売れた薬剤である。しかし、ジプレキサは短期間で大幅な体重の増加を引き起こし、その結果、最初の数ヶ月で数ｋｇ／月に及ぶ体重増となる。また、統合失調症の治療に使用された薬剤の長期間にわたる副作用も認められた。例えば、典型的な神経安定薬として説明される抗精神病薬は、振戦、パーミンソニズムなどの主要な錐体外路系副作用も引き起こし、延長して使用すると錐体外路性終末欠陥症候群（しばしば下及び顔のみならず指、手、足及び動態にける無意識動作）を引き起こす。
上述の不都合を未然に防ぎ、和らげる薬剤開発のための新しいターゲットが必要である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明はドーパミンレセプターと相互作用するポリペプチドを同定し、その結果、これらのポリペプチドと、おそらく直接的又は間接的に結合する薬剤の同定を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、１又は複数のドーパミンレセプターとポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤同定のためのスクリーニング方法であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として（縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択され；
ｉ）該ポリペプチド及びドーパミンレセプターを含む調製物を生成し；及び
ｉｉ）テストされる少なくとも１つの候補薬剤を添加し；
ｉｉｉ）該ポリペプチドと該ドーパミンレセプターとの相互作用に対する影響の有無、又は該薬剤について測定する段階を含む、スクリーニング方法が提供される。
本発明のより好ましい方法によると、本ポリペプチドは、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示されるアミノ酸配列、又は少なくとも１アミノ酸の付加、置換若しくは欠失によって修飾された変異体によって表される。このようなポリペプチドは本発明の第１の態様において提起されるポリペプチドと同様に、「ドーパミンレセプター相互作用ポリペプチド（ＤＲＩＰｓ）」としてここでは称されるであろう。
【０００９】
ここで用いられるポリペプチドの「変異体（群）」には、参照されるポリペプチド由来のアミノ酸配列と異なるポリペプチドが含まれる。通常、この相違は、参照ポリペプチドと変異体の配列が極めて類似しており、多くの領域において同一であるような範囲内にある。変異体ポリペプチドは、１又は複数の任意に組み合わされる置換、付加、欠失、欠損によりアミノ酸配列が異なる。中でも好ましい変異体は保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドと相違するものである。このような置換は、任意のアミノ酸が類似する特徴を持つ他のアミノ酸により置換されるものである。以下に非限定的に列挙するアミノ酸は保存的置換（類似）が考慮される：ａ）アラニン、セリン及びスレオニン；ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；ｃ）アスパラギン及びグルタミンｄ）アルギニン及びリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン、ｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。
本発明は、さらに、上記核酸配列／分子の変異体に関する。本態様において、変異体は、自然発生的な対立遺伝子の変異体、例えば、上記核酸配列のコード又は非コード領域内の１又は複数の単一ヌクレオチドポリモルフィズム（ＳＮＰｓ）などの自然発生的変異体であってもよい。また、ＳＮＰｓは上記核酸配列近傍の核酸配列内、又はＤＲＩＰＳの特性／機能に影響を与える他の核酸配列内でも生じる。
あるいは、該変異体は非自然的に生じることが知られている変異体でもよい。このようなポリヌクレオチドの非自然発生的変異体は、ポリヌクレオチド、細胞又は生体に適用されるものと含む、突然変異誘発技術によって作製される。
【００１０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄の条件は当該分野においては周知である。例えば、核酸のハイブリッドは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄後も安定である。当該分野において至適なハイブリダイゼーション条件は核酸の配列が既知であれば計算できることは周知である。例えば、ハイブリダイゼーションに供する核酸のＧＣ含量によってハイブリダイゼーション条件が決定される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。特定の相同性を持つ核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシーの条件を計算するための一般的な式は：
Tm = 81.5℃ + 16.6 Log [Na+] + 0.41[ % G + C] -0.63 (%ホルムアミド)。
本発明の第１の態様の核酸分子は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に設定される配列、又は図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に設定される配列と、各々、核酸残基レベルで少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、例えば、９８％又は９９％同一な配列を含んでもよい。
【００１１】
当該分野で知られている「同一性」とは、配列を比較することにより決定される２又はそれ以上のポリペプチド配列、又は２又はそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことである。当該分野において、同一性はポリペプチド又はポリヌクレオチド間の、場合によっては、一連の配列間の一致度によって決定されるような配列関連性の度合いをも意味する。同一性は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ＡＮＤ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、そのタームは当業者にとって周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８））。配列間の同一性を決定するために一般に用いられる方法は、限定はしないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示される方法が含まれる。同一性を決定するための好ましい方法はテストされる配列間に最大の一致度を付与するように設計される。同一性を決定するための方法はコンピュータープログラムで暗号化される。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、限定はしないが、ＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら，Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））。
【００１２】
本発明の第１の態様の核酸配列の相補鎖は、ＤＲＩＰｓをコードする遺伝子（群）の制御においてプローブ又はプライマーとして有用である。それらは欠陥のある又は不完全なＤＲＩＰと関連する疾患を呈する患者の同定及び／又は治療、例えば、ＤＲＩＰｓ中のポリモルフィズムの同定に有用である。このようなポリモルフィズムは研究ツールとして、例えば、ＤＲＩＰの機能解析において、遺伝的危険因子の対象のスクリーニング又は対象中の薬物応答の予測において使用することができる。これらの配列は好ましくは単離される。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１を含む。
本発明の更なる好ましい方法において、核酸配列は図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９を含む。
【００１３】
ドーパミンレセプターにはＤ１様レセプター（Ｄ１、Ｄ５）及びＤ２様レセプター（Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）が含まれる。本発明の好ましい方法において、ドーパミンレセプターは図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって表される。
ここで用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、通常の意味のおいて、ペプチド結合により結合された複数のアミノ酸残基のことである。ペプチド、タンパク質、オリゴペプチド又はオリゴマーと同じように交換可能に使用され、同じ意味を表す。「ポリペプチド」という用語は、断片、変異体であって、ポリペプチドの選択的スプライシング変異体又はアイソフォーム、類似体及び誘導体を含むことも意味し、該断片、変異体、類似体又は誘導体が参照タンパク質と同じ生物学的活性又は機能を基本的に保持するものである。
ここで用いられる「断片」には任意の連続する１０残基配列、又はより長い、１５、２０、３０、５０又は１００残基配列が含まれる。好ましくは、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の断片はＤＲＩＰ又はその遺伝子と１又は複数の機能的特性が共通する。
該断片は種々の診断、予後診断又は治療方法において使用され、又はスクリーニングなどにおける研究ツールとして有用である。本発明の第１の態様における核酸断片、又はその相補鎖はプライマーシークエンスとして使用される。例えば、図８に示される配列のヌクレオチド６４０〜７６５を含む断片は、ポリセリン領域をコードする繰り返しモチーフに相当し、例えば、ここで開示されるドーパミンメディエート障害の診断又は予後診断に有用である。
【００１４】
本発明の好ましい方法において、ＤＲＩＰは細胞により発現される。本発明の更なる好ましい方法において、ドーパミンレセプターは細胞により発現される。
本発明の好ましい方法において、該細胞はＤＲＩＰ及び／又はドーパミンレセプターをコードする少なくとも１つの核酸分子（群）で形質移入された細胞である。該核酸分子（群）は核酸分子のインビトロ又はインビボでの発現を可能にするベクターの形で提供される。好ましくは、該核酸分子は制御可能である。適当な制御エレメントは、特にプロモーターにおいて、発現ベクターが挿入される宿主細胞に依存して使用されるであろう。
好ましい細胞には、大腸菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞が含まれ、好ましくはＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、ジャーカット又はｃｏｓ細胞系列、サル細胞系列及びそれらの誘導体などのように不死化される。
本発明の好ましい方法において、該細胞は、例えば、神経細胞など、脳の細胞である。
本発明の更なる態様において、該細胞はトランスジェニック動物の一部であり、該動物のゲノムが該ポリペプチド及び／又は該ドーパミンレセプターをコードする核酸分子を含むように修飾されている。
【００１５】
本発明の更なる態様において、ドーパミンレセプターとポリペプチドの相互作用を調節する薬剤であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される薬剤が提供される。
通常、該薬剤はドーパミンレセプターに結合するが、ドーパミンレセプターの天然のリガンドではない。該薬剤は、ＤＲＩＰと図１２〜１６のいずれかに示される１又は複数のドーパミンレセプターとの間の相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストである。
本発明の好ましい方法において、該薬剤は例えばモノクローナル抗体などの抗体又は抗体の活性な結合断片である。抗体断片は一本鎖抗体可変領域断片であってもよい。
【００１６】
抗体又はイムノグロブリン（Ｉｇ）は２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）（低分子量）鎖（κ又はλ）、及び１対の重（Ｈ）鎖（γ、α、μ、δ及びε）からなり、４つ全てがジスルフィド結合によって連結されている。Ｈ及びＬ鎖は、共に抗原の結合に寄与する領域を持ち、Ｉｇ分子毎に高度に可変である。さらに、Ｈ及びＬ鎖は、非可変又は定常な領域を含む。Ｌ鎖は２つのドメインからなる。Ｃ末端ドメインは任意のタイプのＬ鎖間で本質的に同一であり、「定常」（Ｃ）領域と称されている。アミノ末端同メインはＬ鎖毎に異なり、抗体の結合サイト原因となる。その可変性により、「可変」（Ｖ）領域と称される。可変領域は抗原結合ポケットを形成する相補性決定領域又はＣＤＲ’ｓを含む。結合ポケットは、抗原認識に寄与するＨ及びＬ可変領域を含む。いわゆる一本鎖抗体可変領域断片（ｓｃＦｖ’ｓ）と呼ばれる単一の可変領域を調製することは可能である。ハイブリドーマが特定のモノクローナル抗体に関し存在する場合、該ハイブリドーマからＲＴ ＰＣＲを用いて抽出されたｍＲＮＡからｓｃＦｖ’ｓを単離することは当業者の常識の範囲内に十分含まれる。あるいは、ｓｃＦｖ’ｓを発現するクローンを同定するために、ファージディスプレイスクリーニングを行うこともできる。
【００１７】
あるいは、該断片は「ドメイン抗体断片」である。ドメイン抗体は抗体の最小限の部分である（約１３ｋＤａ）。この技術の例が、ＵＳ６２４８５１６，ＵＳ６２９１１５８及びＵＳ６１２７１９７に開示される。
本発明の好ましい実施態様において、該抗体断片は一本鎖抗体可変領域断片である。
本発明のさらに好ましい実施態様において、該抗体又はその結合断片はキメラ抗体である。本発明の選択的な好ましい実施態様において、該抗体又はその結合断片はヒト化抗体である。
キメラ抗体はヒト抗体の不変又は定常領域と共に抗体の可変領域を含むように組換え法により作製される。
ヒト化抗体は、抗体のＣＤＲ’ｓとヒト抗体の定常領域及び可変領域に由来するフレームワーク領域とを結合させる組換え方法によって作製される。
非ヒト動物由来の抗体は外来抗体に対する免疫応答及び血液循環からのその除去を引き起こす。キメラ及びヒト化抗体の双方は、組換体ハイブリッド抗体中の齧歯類（即ち外来の）抗体の量が減少しており、一方、ヒト抗体領域は免疫反応を引き起こさないため、ヒト患者にインジェクトした場合抗原性が減少する。その結果、より減弱な免疫反応となり、抗体のクリアランスが減少する。ヒト疾患の治療において治療上抗体を使用する場合、この点は明らかに望ましいことである。ヒト化抗体はより少ない「外来性」抗体領域を持つように設計されるから、キメラ抗体よりより低い免疫原性になると思われる。
【００１８】
本発明の更なる好ましい方法において、該薬剤は修飾されたペプチドのようなペプチドである。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１２に示される配列のヌクレオチド１７１０〜２０５１でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１２に示される配列のヌクレオチド１３５６〜１５２３でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１３に示される配列のヌクレオチド７９６〜１２８１でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１４に示される配列のヌクレオチド１００５〜１３６４でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１５に示される配列のヌクレオチド６４６〜１０２３でコードされるアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい方法において、ペプチドは、図１６に示される配列のヌクレオチド７７２〜９４８でコードされるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
ＤＲＩＰと１又は複数のドーパミンレセプターとの相互作用を調節するペプチドのアミノ酸配列に対する修飾が、そのターゲット配列に対するペプチドの結合及び／又は安定性を促進し得ることは、当業者において、明らかなことであろう。さらに、ペプチドの修飾は、インビボにおけるペプチドの安定性も増大させ、これにより、ある相互作用を阻害するのに必要なペプチドの有効量を少なくすることができる。この点は、インビボで生じ得る望ましくない副作用を有利に減少させる。修飾には、例として、限定はしないが、アセチル化及びアミド化が含まれる。
本発明の好ましい方法において、該ペプチドはアセチル化されている。好ましくは、該アセチル化は該ペプチドのアミノ末端である。
本発明のさらに好ましい方法において、該ペプチドはアミド化されている。好ましくは、該アミド化は該ペプチドのカルボキシ末端である。
本発明のさらに好ましい方法において、該ペプチドはアセチル化及びアミド化によって修飾される。
あるいは、又は好ましくは、該修飾には組換体又はペプチドの合成型の調製における修飾されたアミノ酸の使用が含まれる。当業者において、修飾されたアミノ酸には、例えば、限定はしないが、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ６−メチルリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリジン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリジン、シクロヘキシアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが含まれる。他の修飾には、Ｃ２，Ｃ３又はＣ４アルキルＲグループをハロ（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシ又はＣ１−Ｃ４アルコキシから選択される１，２又は３置換体によって任意に置換されたアミノ酸が含まれる。
あるいは、ペプチドは、例えば、環化により修飾され得る。環化は当該技術分野において周知である（Ｓｃｏｔｔら Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００１），８：８０１−８１５；Ｇｅｌｌｅｒｍａｎら Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２００１），５７：２７７−２９１；Ｄｕｔｔａら Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ（２０００），８：３９８−４１２；Ｎｇｏｋａ及びＧｒｏｓｓ Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ（１９９９），１０：３６０−３６３を参照のこと）。
本発明のペプチドの好ましい方法において、本発明のペプチドは環化により修飾される。
【００２０】
本発明の更なる選択的実施態様において、該薬剤はアプタマーである。
核酸は直線上の配列構造と３次元構造を有しており、直線上の配列及びこれらの分子が局在する環境によってもその一部が決定される。従来の治療用分子は、小分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、又は抗体であり、ターゲット分子に結合してアゴニスト又はアンタゴニスト効果を発揮する。核酸分子が治療上の有用性を持つ必須の結合特性のある薬剤を提供する可能性も有することが明らかとなってきた。これらの核酸分子は、典型的にはアプタマーと称される。アプタマーは小さく、通常、安定化された核酸分子であり、ターゲット分子の結合ドメインを含み、本発明においてはスカベンジャーレセプターシステインリッチドメインを含むポリペプチドである。アプタマーを同定するためにスクリーニング方法は、参考文献としてここに記載されるＵＳ５，２７０，１６３中に記載される。アプタマーは典型的には一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド又は修飾オリゴデオキシヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドである。
【００２１】
「修飾される」との用語には、共有結合的に修飾された塩基及び／又は糖を持つヌクレオチドが含まれる。例えば、修飾された核酸には、３’位にヒドロキシ基以外の、また、５’位にリン酸基以外の低分子量有機基が共有結合的に結合された糖を持つ核酸が含まれる。従って、修飾されたヌクレオチドには、２’−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２’−Ｓ−アルキル；２’−Ｓ−アリル；２’−フルオロ−；２’−ハロ又は２；アジド−リボース、炭素環式糖類似体ａ−アノメリック糖；アラビノース、キシロース又はリキソースなどのエピメリック糖、ピラノース糖、フラノース糖及びセドヘプツロースなどの２’置換糖も含まれる。
修飾されたヌクレオチドは当該分野で知られており、例えば、限定はしないが；アルキル化プリン及び／ピリミジン；アシル化プリン及び／又はピリミジン；又は他のヘテロ環などが含まれる。これらのピリミジン及びプリンのクラスは、当該分野において知られており、シュードイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）；Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン；８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン；４−アセチルシトシン，５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６−イソペンチル−アデニン；１−メチルアデニン；１−メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；２，２−ジメチルグアニン；２−メチルアデニン；２−メチルグアニン；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；７−メチルグアニン；５−メチルアミノメチルウラシル；５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル；β−Ｄ−マンノシルケオシン；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メトキシウラシル；２メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；シュードウラシル；２−チオシトシン；５−メチル−２チオウラシル，２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−メチルウラシル；Ｎ−ウラシル−５−オキソ酢酸メチルエステル；ウラシル５−オキソ酢酸；ケオシン；２−チオシトシン；５−プロピルウラシル；５−プロピルシトシン；５−エチルウラシル；５−エチルシトシン；５−ブチルウラシル；５−ペンチルウラシル；５−ペンチルシトシン；及び２，６−ジアミノプリン；メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；１−メチルシトシンが含まれる。
【００２２】
さらなる実施態様において、薬剤は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。好ましくは該ＲＮＡｉ分子は本発明の第１の態様による核酸分子に由来する。より好ましくは該ＲＮＡｉ分子は１０ヌクレオチド塩基（ｎｂ）−１０００ｎｂの長さを持つ。さらにより好ましくは該ＲＮＡｉ分子は１０ｎｂ；２０ｎｂ；３０ｎｂ；４０ｎｂ；５０ｎｂ；６０ｎｂ；７０ｎｂ；８０ｎｂ；９０ｎｂ；又は１００ｎｂの長さを持つ。さらにより好ましくは該ＲＮＡｉ分子は２１ｎｂの長さである。
本発明のアプタマーは従来のホスホジエステル結合ヌクレオチドを用いて合成することができ、また、当該分野で知られる標準的な固相又は液相合成技術を用いて合成することができる。ヌクレオチド間の結合は、代替的な分子結合を用いてもよい。例えば、式 Ｐ（Ｏ）Ｓ，（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ，（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；又はＣＯＮＲ’２において、ＲはＨ（又は塩）又はアルキル（１−１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１−９Ｃ）であって、−Ｏ−又は−Ｓ−を介して隣接するヌクレオチドを結合するものからなる結合グループである。
【００２３】
本発明の方法は、本発明のポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を修飾する（例えば、阻害、低減、ブロック又は促進）薬剤の同定を可能にする。薬剤はここで既述されるものでもよく、又は薬剤は小分子でもよい。例えば、そのような小分子には、限定はしないが、約１０，０００グラム／モル未満の分子量を持つペプチド、ペプチドミメティクス（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約５，０００グラム／モル未満の分子量を持つ有機又は無機化合物、 約１，０００グラム／モル未満の分子量を持つ有機又は無機化合物、 約５００グラム／モル未満の分子量を持つ有機又は無機化合物、及び塩、エステル及びこのような化合物の他の薬学的に許容される形態である。
本発明はさらにＤＲＩＰと相互作用する下流の因子とＤＲＩＰとの相互作用に影響を与える薬剤のスクリーニングアッセイを提供する。例えば、ＤＲＩＰｓとドーパミンシグナル伝達に関与する他のタンパク質、例えば、ＤＡＲＰＰ−２２及びＣＲＥＢとの相互作用は、かかる薬剤により制御される。
【００２４】
本発明はさらに本発明の第１の態様による核酸分子の使用を提供する。例えば、核酸分子は研究上の開始ポイントとして使用することができ、これにより、任意の核酸分子に関連して１又は複数の変化が導入される。この結果、例えば、ＤＲＩＰ結合ドメインなど、どの部分がＤＲＩＰとドーパミンレセプター又は他の結合タンパク質との相互作用に重要であるか決定することができる。
【００２５】
本発明の更なる態様によると、細胞のゲノムが、
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１コピーを含むように修飾され、該細胞が該核酸分子の制御された発現に対し適合している、少なくとも１つの核酸分子で形質移入された細胞が提供される。
核酸分子の発現は上方制御又は下方制御されてもよい。従って、細胞／細胞系列は１又は複数のＤＲＩＰｓを過剰発現しもよく、又はＤＲＩＰｓがノックアウトされている結果１又は複数のＤＲＩＰｓが欠損していてもよい。
本発明の好ましい態様において、該細胞が少なくとも１つの核酸分子で形質移入され、該細胞のゲノムがここに記載される１又は複数のドーパミンレセプターをコードする少なくとも１コピーの核酸分子を含むように修飾される。
本発明の好ましい実施態様において、該細胞は、さらに、該ポリペプチド（群）の活性をモニターするレポーター遺伝子を包含する核酸分子を含む。
本発明の細胞は本発明のスクリーニング方法において有用である。薬剤は当業者に既知の多くの技術、例えば、ここに示される実施例に記載されるＧＳＴプルダウンアッセイ、免疫共沈殿法及び細胞内局在及び同一局在などを用いたスクリーニング方法により同定される。表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）は、チップの表面上での分子相互作用を検出するために使用され、反応キネティクス及び結合親和性に対する定量的なデータを提示する。
【００２６】
好ましい細胞には、大腸菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞が含まれ、好ましくは、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、ジャーカット又はｃｏｓ細胞系列、サル細胞系列及びこれらの誘導体などのように不死化される。
本発明の好ましい方法において、該細胞は脳の細胞であり、例えば、神経細胞である。
本発明の更なる態様によれば、本発明による少なくとも１つの細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。トランスジェニック動物はＤＲＩＰｓ及びその表現型の効果の解析に有用である。本発明の第１の態様において定義されるようにトランスジェニック非ヒト動物における核酸配列の発現は、通常、ポリヌクレオチドをプロモーター及び／又はエンハンサー配列に作用可能に結合させ、宿主動物の胚性幹細胞中に導入することにより達成される。本発明には図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１で表される１又は複数の核酸配列が過剰発現される細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。核酸配列の過剰発現は、配列に制御エレメントを加えて卵母細胞の前核にマイクロインジェクションすることにより達成される（Ｈｏｇａｎら，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｕｒ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８−１２９２）。その後、導入遺伝子コンストラクトは宿主細胞の内在性遺伝子と相同組換えを起こす。所望のポリヌクレオチド配列を含む胚性幹細胞は、通常、マーカー遺伝子の発現をモニターすることにより選択され、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用される。本発明には、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される１又は複数の核酸配列が、例えば、配列に選択マーカーを含む制御エレメントを加えて胚性幹細胞（ＥＳ）中に形質移入により導入されることにより、ノックアウトされる細胞を含むトランスジェニック動物も含まれる。このような「ノックアウト」動物において、本発明の核酸配列の発現が妨げられる。
本発明の更なる好ましい実施態様において、該トランスジェニック動物は例えば、ラット、マウス又はハムスターの齧歯類である。あるいは、トランスジェニック動物はシーエレガンス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ又はアフリカツメガエルである。
【００２７】
本発明の更なる態様において、ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を調節する薬剤の同定におけるドーパミンレセプターの使用が提供される。
本発明の更なる態様において、ポリペプチドとドーパミンシグナル伝達に関与するポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤の同定における該ポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが、ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される場合の該ポリペプチドの使用が提供される。
ドーパミンシグナル伝達に関与するポリペプチドには、例えば、ＤＡＲＰＰ−３２及びＣＲＥＢが含まれる。
【００２８】
本発明の更なる態様は、ポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を調節する薬剤の同定における該ポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが、ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される場合の該ポリペプチドの使用を提供する。
ＤＲＩＰｓはＤＲＩＰ阻害剤又はドーパミンレセプターへのＤＲＩＰの結合の調節など、ドーパミンレセプターの機能を調節する分子の構造に基づくデザインに使用することができる。このような「構造に基づくデザイン」は、「合理的なドラッグデザイン」としても知られている。ＤＲＩＰｓは、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴又はホモロジーモデリングなど、全て周知の方法により３次元的に解析できる。分子モデリングソフトウェアシステムにおけるＤＲＩＰの構造情報の使用も本発明に含まれる。このようなコンピューターを利用したモデリング及びドラッグデザインは化学的配座解析、分子の静電ポテンシャル、タンパク質の折りたたみなどの情報を利用してもよい。本発明の特定の方法には、標的の可能性のある結合サイトに関し、ＤＲＩＰｓの３次元構造を解析し、予想される反応部位を取り込んだ新規分子を合成し、上述のように新規分子をアッセイすることが含まれる。
【００２９】
ドーパミンを介する障害には、パーキンソン病、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、鬱病（双極性障害）及び統合失調症及び中毒（例えば、アルコール、ニコチン又はコカイン中毒などの薬剤麻薬中毒）を含む神経精神障害が含まれる。他の「ドーパミンを介する障害」には、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、トゥーレット症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、老年性皮膚萎縮症、シデナム舞踏病、自閉症、頭部及び脊髄損傷、急性及び慢性痛、癲癇及び癲癇性痙攣、認知症、ジストニア（ｄｉｓｔｏｎｉａ）、振戦、自閉症、脳虚血及び神経細胞死）及びアポトーシス（特に神経性アポトーシス）とリンクした障害が含まれる。ドーパミンを介する障害には、心臓血管、肺疾又は腎臓の状態が含まれてもよい。調節により、ＤＲＩＰと１又は複数のドーパミンレセプターとの結合を阻害又は促進することが意味される。ドーパミンレセプターとＤＲＩＰとの相互作用は多くの方法で調節される。例えば、遺伝子発現がアンチセンス配列、即ち、本発明の第１の態様による相補配列の使用を通じて阻害される。遺伝子治療により患者に導入される場合、このような配列はＤＲＩＰ遺伝子又はＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳又は転写を阻害する。この方法は、他には影響を与えずＤＲＩＰの特定のスプライシング変異体の機能を調節したい場合に特に有用である。
【００３０】
本発明の第１の態様にかかる核酸配列の導入には、当該分野で知られるものを含む遺伝子治療法を用いてもよい。一般に、核酸配列は、通常、ベクターの形及び好ましくは薬学的に許容される担体の形で患者の標的細胞中に導入される。組換えゲノムを包み込むことができるレトロウィルスベクターシステムなどのウィルスベクターを含む任意の適切な輸送媒体が用いられる。また、他の輸送技術も広く利用可能であり、アデノウィルスベクター、アデノ関連ベクター、レンチウィルスベクター、シュードタイプレトロウィルスベクター及びポックス又はワクシニアウィルスベクターの使用が含まれる。また、リポソームも使用可能であり、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクタミン（登録商標）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）、スーパーフェクト（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びトランスフェクタム（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）などの市販のリポソーム調製品が含まれ。
また、上記定義されるような薬剤も、上記定義される患者におけるドーパミンを介する又はドーパミンに関連する障害の予防又は治療において薬剤としての使用のために提供される。該薬剤には、アンチセンス配列及びＤＲＩＰｓの相互作用を調節することができる任意の他の薬剤が含まれる。また、そのような薬剤は欠陥又は欠損のあるＤＲＩＰによって特徴づけられる障害の治療にも有用である。
【００３１】
本発明は、以下の図に従って、一例としてのみ、ここに記載される。
【実施例】
【００３２】
実施例
材料及び方法
酵母 ２−ハイブリッドスクリーニング
酵母 ２−ハイブリッドシステムはインビボにおけるタンパク質−タンパク質相互作用に関するアッセイに使用され（Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇ，１９８９）、酵母の交配手段に使用する（Ｂｅｎｄｉｘｅｎら，１９９４；Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら，１９９７）。ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）を同定するために、我々は、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＢＤ）と融合させたドーパミンレセプターｃＤＮＡを用いて２−ハイブリッドスクリーニングを行った。ＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４ＡＤ）とヒト脳由来のｃＤＮＡｓ間の融合プラスミドライブラリーについて、酵母レポーター株ｐＪ６９４ａのＧＡＬ４ＢＤ−ＤＲ融合タンパク質との相互作用に関しスクリーニングを行った。
Ｄ１ＤＲのＣ末端は２−ハイブリッドスクリーニングのベイトとして使用した。Ｄ１ＤＲ（Ａｓｎ２３４−ＴＧＡ４４７）の最後の１１４アミノ酸に対するコード配列を、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより増幅した。；
５’−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＧＧＡＡＧＧ−３’、及び
５’−ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧ−３’．
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ（下線を付した配列）で切断し、生じた断片を、酵母 ２−ハイブリッドスクリーニングのためのＤ１ＤＲ−ｐＧＢＴ９を調製するため、Ｇａｌ４ドメインをコードする酵母 ２−ハイブリッド発現ベクターｐＧＢＴ９にサブクローニングした（Ｂａｒｔｅｌら，１９９３）。
【００３３】
ドーパミンレセプター融合体（ＤＲ−ｐＧＢＴ９）を発現するプラスミドを保持している株ＰＪ６９４αを、Ｇａｌ４活性化ドメインとの融合体のライブラリーで形質転換した株ｐＪ６９４ａと交配し、予想される相互作用融合タンパク質を保持する二倍体を、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンを欠き、２ｍＭ ３−アミノトリアゾールを含む選択プレート上で同定した。各セットのプレートで選択される二倍体を他のレポーター遺伝子の発現についてテストした。レポーター遺伝子に対しポジティブな二倍体に由来する異なるｐＡＣＴ２融合タンパク質をｌｅｕＢ６大腸菌株のコンプリメンテーションによりレスキューした。融合遺伝子はオリゴヌクレオチド、５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣ−３’をプライマーとして配列決定を行った。
我々は、個別のスクリーニングにおける６つの異なるベイト（Ｄ１Ｔ、Ｄ１Ｃ、Ｄ２Ｔ、Ｄ３Ｔ、Ｄ４Ｔ、Ｄ５Ｔ）に由来する７つの新規ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰ−１〜ＤＲＩＰ−１１）を同定した（表１）。「ベイト」あたり少なくとも１つの相互作用タンパク質が単離された。従来、ドーパミンシグナル伝達又は統合失調症に関与すると考えられる相互作用タンパク質は存在していなかったが、それらのほぼ全てが本疾患とリンクするゲノム領域にマップされる（表１）。例えば、ＤＲＩＰ−２及びＤＲＩＰ−１１は染色体２ｑに、ＤＲＩＰ−７は５ｑに、ＤＲＩＰ−９はＸｐ１１にマップされる。各レセプター間における配列相同性にも関わらず、各レセプター全てにおいて、ユニークな相互作用タンパク質のセットが同定された。しかし、Ｄ１ＣとＤ３Ｔは同じ相互作用タンパク質であるＤＲＩＰ−４を特定したことから、少なくともＤ１とＤ３は共通のシグナルパスウェイを共有している。
【００３４】
【表１】
以下の表はどのＤＲＩＰｓがどのドーパミンレセプターに対応するかを示す：
【表２】
【表３】
【００３５】
ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰ−１〜ＤＲＩＰ−１１）
ＤＲＩＰ−４はＤ１レセプター（Ｄ１Ｃ）のＣ末端、及びＤ３レセプターの３番目の細胞内ループ（Ｄ３Ｔ）と相互作用し、Ｄ１及びＤ３が関与する共通のシグナルパスウェイの可能性を提起する。我々は、ＤＲＩＰ−４とＤ１及びＤ３との相互作用を、マウス脳溶解物（図２０）及びＨＥＫ２９３細胞（データは示さず）からの免疫沈降によって確認する証拠を得ている。我々は、Ｄ１ＣとＤ３Ｔとのアライメントを行い、これらの配列間における有意な相同性を確認した（図１７）。
我々は、アポトーシス及びパラトーシスを阻害することにおけるＤＲＩＰ−４の役割を確認する実験的証拠を該タンパク質を哺乳類細胞において過剰発現することにより得た。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＤＲＩＰ−４の発現の始まりがマウスの神経系の発生と一致していることを示した（データは示さず）。従って、我々は、ＤＲＩＰ−４が発生における神経細胞死を抑制しないことにより神経回路の変性に関与していると考える。
【００３６】
クローニング
タンパク質−タンパク質間相互作用は、後述のインビボ及びインビトロの方法を用いて、固定組織切片及びフレッシュ組織の哺乳類細胞において、確認／テストされる。
全長ｃＤＮＡコンストラクトは、ｐＧＥＸ（ＧＳＴ）、ｐＣＭＶＴａｇ（ＦＬＡＧ）、ｐＣＤＮＡ３．１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＥＴ３２（Ｈｉｓ）及びｐＥＧＦＰ（ＧＦＰ／ＹＦＰ／ＢＦＰ／ＣＦＰ）シリーズベクターを含む種々の発現ベクター中に、ドーパミンレセプター及び相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）について作製された。
発現
大腸菌中にＧＳＴ融合タンパク質としてドーパミンレセプター及び相互作用タンパク質を発現させた。ＩＰＴＧによる誘導の後、全てのＧＳＴ融合タンパク質の高発現を達成することができ、その溶解性を至適化するために様々な条件をテストした（データは示さず）。
ＧＳＴプルダウンアッセイ
これは、タンパク質−タンパク質相互作用に関するインビトロアッセイであるが、あるタンパク質が３５Ｓメチオニンと共に翻訳され、グルタチオンセファロースに結合されるＧＳＴ融合タンパク質として発現される相互作用タンパク質と一緒にインキュベートされた。結合後、標識されたタンパク質は、ビーズから溶出され、アクリルアミドゲルで電気泳動を行い、オートラジオグラフィーで検出した。ＤＲＩＰ−４に関与する相互作用について、すでに実施されている（図１８）（及び、ＤＲＩＰ−５及びＤＲＩＰ−６［データは示さず］）。さらに、ＤＲＩＰ−５とＤ２間（図１９）、及びＤＲＩＰ−６とＤ１Ｔ間（データは示さず）の相互作用はブロットオーバーレイ実験により確認した。
共免疫沈降
相互作用タンパク質及びこれに対応するＦＬＡＧ又はＭｙｃタグを付したドーパミンレセプターをＨＥＫ２９３細胞中で同時発現させた。Ｍｙｃ抗体による免疫沈降、その後のＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロッティング、及び免疫沈降にＦＬＡＧ抗体を、ウエスタンブロッティングにＭｙｃ抗体を用いた実験を繰り返した結果、相互作用のいくつかを特徴付けすることができた。Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ及び５つのドーパミンレセプターの全てに対する抗体は市販されている。ＤＲＩＰ−４を含む相互作用タンパク質の約半分についても、抗体は市販されている。ラット脳溶解物を使用してインビボにおける相互作用をテストする。ＨＥＫ−２９３で発現されたＤＲＩＰ−４は、Ｘｐｒｅｓｓ及びＦＬＡＧタグを用いて検出することができる（データは示さず）。
【００３７】
免疫蛍光検査による細胞内局在及び共局在
同じ細胞内コンパートメント内における相互作用タンパク質の共局在は、それらの相互作用に関する重要な証拠を提供する。各相互作用タンパク質及びその対応するドーパミンレセプターは、ＨＥＫ２９３細胞及びＰＣ１２などの神経起源の細胞中で共発現される。個々のタンパク質はＭｙｃ、ＦＬＡＧ又は他のタグに対する蛍光標識二次抗体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ又はＦＩＴＣ色素を結合した）を用いて検出することができる。これらのタンパク質は、蛍光又は共焦点顕微鏡の下、ＦＩＴＣ又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ由来のイメージをマージすることで共局在される。この点について、Ｄ１／Ｄ３対ＤＲＩＰ−４の相互作用について既に行っている（データは示さず）。同時に、適当な抗体が利用可能な場合（上述を参照のこと）、同様の実験を凍結及びパラフィン包埋したラット脳切片について免疫組織化学的手法により実施することができる。さらに、ヒト脳検死材料及び組織に対する免疫組織化学的分析を行うことができる。
発現解析
ドーパミンレセプター相互作用タンパク質の発現パターンは、ノザンブロッティング；定量的ＲＴ−ＰＣＲ（異なるマウス組織及びネズミ胚形成の異なるステージに由来するｍＲＮＡを用いて）；ウエスタンブロッティング及び免疫組織化学的手法により解析される。
ドーパミンシグナル伝達におけるＤＲＩＰｓの役割の検討
Ｇプロテイン共役レセプターは、セカンドメッセンジャーの活性化を通じて細胞外シグナルを変換する。Ｄ１を発現する発現するＨＥＫ２９３２株化細胞とＤ３を発現する株化細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルを測定した（データは示さず）。我々が開発したＤＲＩＰｓ又はドーパミンレセプターを過剰発現するＨＥＫ−２９３安定株化細胞を用いて、ドーパミンレセプターアゴニスト及びアンタゴニストの存在下又は非存在下におけるリガンド結合研究を行う予定である。また、全細胞電流を記録するためにこれらの株化細胞及び培養神経細胞も使用する。我々は、Ｄ１を２−３倍、及びＤＲＩＰ−４を約１００倍過剰発現する安定株化細胞を作製した。
統合失調症におけるＤＲＩＰｓの役割の検討
神経の株化細胞中でＤＲＩＰ−６、ＤＲＩＰ−８及びＤＲＩＰ−９を過剰発現させる。これらの細胞培養モデルは、神経突起の成長及び伸長の研究に使用される。さらに、我々はＤＲＩＰｓの過剰発現が神経分化のプログラムを変更するかどうか確かめるため、幹細胞で実施される実験を計画する予定である。何故ならば、これが脳の発達及び統合失調症に重要な影響を持ち得るからである。また、神経細胞の成長及び分化又は幹細胞における細胞死をサポートし、促進し、活性化し又は誘引するＤＲＩＰ−４のような特異的タンパク質の潜在能力を評価することも目的とする。
ＤＲＩＰｓのポリモルフィズムと統合失調症との関連性に関するテストのための遺伝的研究
ドーパミンレセプター相互作用タンパク質との関連解析が、ハプロタイプの決定に役立つ５００の統合失調症の症例及び５００のコントールさらに８０ペアレントプロバンドトリオス（８０ ｐａｒｅｎｔ ｐｒｏｂａｎｄ ｔｒｉｏｓ）を加えたもので構成される十分特徴付けされたスコットランド人起源のＤＮＡサンプルのコレクションを用いて、実施される。ポジティブな関連性は、特異的なハプロタイプを持つ疾患の分離を捜すために、４０の２−３世代の家族においてテストされる。
【００３８】
ドーパミンシグナル伝達におけるＤＲＩＰｓの役割を検討するために使用される動物モデル
動物モデルは疾病の病理生理学に対する有用な見識を提供し得る。特に、マウスモデルは、通常、遺伝学的及び生理学的に十分にヒトと類似しており、インビボにおける遺伝子操作が可能である。遺伝子機能を確かめるために、ここで記述されるようなＤＲＩＰの過剰発現又は不活性化（ノックアウト）は、共に、適切な方法である。過剰発現は遺伝子コンストラクト（対象の遺伝子と適切なプロモーターからなる）を１細胞ステージの胚の雄の前核中にマイクロインジェクトすることにより達成される。遺伝子ノックアウトには２ステージが関与する。最初のステージは、遺伝子を含むゲノム断片（典型的にはＮｅｏなどの薬剤耐性マーカーでディスラプト（分断）されている）がコンストラクトされる。これは多能性胚性幹（ＥＳ）細胞中にトランスフェクトされる。コンストラクトが導入された細胞は、薬剤の毒性を示す分量存在下において細胞を生存させる薬剤耐性を付与するＮｅｏマーカーを選択するために、薬剤Ｇ４１８を添加して選択される。いくつかの細胞において、相同組換えの自然なプロセスにより、内在性の遺伝子をＮｅｏカセットと置換することができる。これらの細胞はＰＣＲ法を用いて選択できる。第二のステージにおいて、「ポジティブ」な細胞、即ち、内在性の野生型遺伝子が、破壊された（変異した）遺伝子のコピーを含むＮｅｏカセットによって置き換えられた細胞がブラストサイトステージのドナー胚にインジェクトされ、引き続き偽妊娠の雌へ導入される。生まれた動物は、野生型と変異型細胞からなるキメラである。繁殖により、生存可能な純粋な変異体を作製することができる。
【００３９】
参考文献
Abi-Dargham, A., Rodenhiser, J., Printz, D., Zea-Ponce, Y., Gil, R., Kegeles, L.S., Weiss, R. et al (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 8104-8109.
Baik, J-H, Picetti, R., Saiardi, A., Thiriet, G., Dierich, A., Depaulis, A., Le Meur, M. and Borrelli, E. (1995) Nature 377, 424-428.
Bartel P.L., Chien C.t., Sternglanz R. and Fields S. (1993). In Cellular interaction in development: A practical approach., D.A. Hartley, ed. (Oxford University Press, Oxford), pp 153-179
Bendixen C., Gangloff S. and Rothstein R. (1994). Nucleic Acids Res 22:1778-1779
Carlsson, A. (2001 Science 294, 1021-1024.
Coon, H., Byerley, W., Holik, J., Hoff, M. et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52, 327-334.
Fields, S and Song, O.(1989) Nature 340, 245-247.
Fromont-Racine M., Rain J.C. and Legrain P. Nat genet (1997) 16:277-282
Giros, B., Jaber, M., Jones, S.R., Wightman, R.M. and Caron, M.G. (1996) Nature 379, 606-612.
Greengard, P. (2001) The neurobiology of slow synaptic transmission. Science 294, 1024-1030.
Kabbani, N., Jeromin, A. and Levenson, R. (2004) Cellular signalling. 16, 497-503.
Lamey, M., Thompson, M., Varghese, G., Chi, H., Sawzdargo, M., George, S.R. and O’Dowd, B.F. (2002) J. Biol. Chem. 277, 9415-9421.
Missale, C., Nash, S.R., Robinson, S.W., Jaber, M. and Caron, M.G. (1998) Physiological Reviews 78, 189-225.
Neves, S.R., Ram, P.T. and Iyengar, R. (2002) Science 296, 1636-1639.
Okubo, Y., Suhara, T., Suzuki, K. et al. (1997) Decreased prefrontal D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature 385, 634-636.
Roberts, G.W., Leigh, P.N., and Weinbereger, D.R. (1993) Neuropsychiatric disorders. Wolfe Publishing.
Seeman, P. and Kapur, S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 7673-7675.
Seeman, P., Guan, H-C. and Van Tol, H.M. (1993) Nature 365, 441-445.
Sibley, D.R. and Monsana, Jr., F.J. (1992) Trends Pharmacol Sci, 13, 61-69.
Silbersweig, D.A., Stern, E., Frith, C. et al (1995) Nature 378, 176-179.
Wu, G., Benovic, J.L., Hildebrandt, J.D. and Lanier, S.M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 7197-7200.
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−３】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−４】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図２−５】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図３−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図３−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図４−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図４−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図５】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図６】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図７】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図８−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図８−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図８−３】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図９】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１０−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１０−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−１】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−２】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−３】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−４】図１−１１は、ドーパミンレセプター相互作用タンパク質（ＤＲＩＰｓ）１−１１の各々のＤＮＡ（全長又は一部）及びアミノ酸配列を示す。図２、３、４及び８（Ａ）は部分ＤＮＡ及びアミノ酸配列を、（Ｂ）は全長ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１２−１】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１２−２】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１３−１】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１３−２】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１４】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１５】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１６】図１２−１６は各々ドーパミンレセプターＤ１−Ｄ５のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【図１７】図１７はＤ１のＣ末端ドメインとＤ３の３番目の細胞内ループのアライメントを示す。保存されるドメインを強調表示する。
【図１８】図１８はＧＳＴ−プルダウンアッセイを示す。全長ＤＲＩＰ−４及びそのＮ末端切断型（ＤＲＩＰ４の最初の１００アミノ酸）（Ｄ３Ｔ−２）とＤ１のＣ末端ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｄ１Ｃ）との相互作用をオートラジオグラフィーで検出した。ＤＲＩＰ−４の全長及びＮ末端切断型を転写、翻訳し、固定化ＧＳＴのみ又はＧＳＴ−Ｄ１Ｃとインキュベートした。結合したタンパク質を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、オートラジオグラフィーを行った。
【図１９】図１９はＤＲＩＰ−５の調製及び相互作用を示す。ａ．ＧＳＴ誘導ＤＲＩＰ−５（Ｄ２Ｔ−１−ＧＳＴ）タンパク質のクマジー染色アクリルアミドゲル。Ｂ．ＤＲＩＰ−５（Ｄ２Ｔ−１−ＧＳＴ）対Ｄ２Ｔの相互作用を確認したブロットオーバーレイ。
【図２０】図２０はＤＲＩＰ−４とＤ１及びＤ３とのインビボにおける相互作用を示す。レーン１及び２は関係の無いマウス抗体による免疫沈降を示し、各々、ＧＳＴ及びＩｇＧである（ネガティブコントロール）。レーン３はＤＲＩＰ−４抗体による免疫沈降である。レーン４はマウス脳抽出物である（ポジティブコントロール）。Ｄ１及びＤ３タンパク質は矢印で示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数のドーパミンレセプターとポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤同定のためのスクリーニング方法であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミンレセプター結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択され；
ｉ）該ポリペプチド及びドーパミンレセプターを含む調製物を生成し；及び
ｉｉ）テストされる少なくとも１つの候補薬剤を添加し；
ｉｉｉ）該ポリペプチドと該ドーパミンレセプターとの相互作用に対する影響の有無、又は該薬剤について測定する段階を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示されるアミノ酸配列、又はその変異体によって表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子が、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示される核酸配列、又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でアニールする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列が、図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸配列が、図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸配列が、図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸配列が、図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸配列が、図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列が、図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドーパミンレセプターが図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドによって表される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ドーパミンレセプターとポリペプチドの相互作用を調節する薬剤であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミンレセプター結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される薬剤。
【請求項１２】
前記薬剤がドーパミンレセプターと結合し、ドーパミンレセプターの天然リガンドではない請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記薬剤が抗体又はモノクローナル抗体の活性な結合断片である請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記抗体断片が一本鎖抗体可変領域断片である請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記抗体又は断片が図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列又はその変異体を含むポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記抗体断片が図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記抗体断片が図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記抗体断片が図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記抗体断片が図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記抗体断片が図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記抗体断片が図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記抗体断片が図１２に示される配列のヌクレオチド１７１０から２０５１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２３】
前記抗体断片が図１２に示される配列のヌクレオチド１３５６から１５２３でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記抗体断片が図１３に示される配列のヌクレオチド７９６から１２８１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２５】
前記抗体断片が図１４に示される配列のヌクレオチド１００５から１３６４でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２６】
前記抗体断片が図１５に示される配列のヌクレオチド６４６から１０２３でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２７】
前記抗体断片が図１６に示される配列のヌクレオチド７７２から９４８でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記抗体断片がキメラ抗体である請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記抗体断片がヒト化抗体である請求項１３に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記薬剤が修飾されたペプチドなどのペプチドである請求項１１に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記ペプチドが図１２に示される配列のヌクレオチド１７１０から２０５１でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記ペプチドが図１２に示される配列のヌクレオチド１３５６から１５２３でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記ペプチドが図１３に示される配列のヌクレオチド７９６から１２８１でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３４】
前記ペプチドが図１４に示される配列のヌクレオチド１００５から１３６４でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３５】
前記ペプチドが図１５に示される配列のヌクレオチド６４６から１０２３でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３６】
前記ペプチドが図１６に示される配列のヌクレオチド７７２から９４８でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３７】
前記薬剤がアプタマーである請求項１１に記載の薬剤。
【請求項３８】
前記薬剤が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である請求項１１に記載の薬剤。
【請求項３９】
細胞のゲノムが、
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１コピーを含むように修飾され、該細胞が該核酸分子の制御された発現に対し適合している、少なくとも１つの核酸分子で形質移入された細胞。
【請求項４０】
前記細胞が少なくとも１つの核酸分子でさらに形質移入され、該細胞のゲノムが１又は複数のドーパミンレセプターをコードする核酸分子の少なくとも１コピーを含むように修飾される、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記細胞が脳の細胞である請求項３９に記載の細胞。
【請求項４２】
前記細胞が神経細胞である請求項３９に記載の細胞。
【請求項４３】
請求項３９に記載される少なくとも１つの細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を調節する薬剤の同定における該ポリペプチドの使用。
【請求項４５】
前記核酸分子が図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示される核酸配列又はその相補鎖とストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下アニールする請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記核酸配列が図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記核酸配列が図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項４８】
前記核酸配列が図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項４９】
前記核酸配列が図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項５０】
前記核酸配列が図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項５１】
前記核酸配列が図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項５２】
前記ドーパミンレセプターが図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって表される請求項４４に記載の使用。
【請求項５３】
図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸葉に列を含むポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドと、
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチド、との相互作用を調節する薬剤の同定におけるその使用。
【請求項１】
１又は複数のドーパミンレセプターとポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤同定のためのスクリーニング方法であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミンレセプター結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択され；
ｉ）該ポリペプチド及びドーパミンレセプターを含む調製物を生成し；及び
ｉｉ）テストされる少なくとも１つの候補薬剤を添加し；
ｉｉｉ）該ポリペプチドと該ドーパミンレセプターとの相互作用に対する影響の有無、又は該薬剤について測定する段階を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示されるアミノ酸配列、又はその変異体によって表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子が、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示される核酸配列、又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でアニールする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列が、図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸配列が、図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸配列が、図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸配列が、図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸配列が、図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列が、図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドーパミンレセプターが図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドによって表される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ドーパミンレセプターとポリペプチドの相互作用を調節する薬剤であって、該ポリペプチドが：
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミンレセプター結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択される薬剤。
【請求項１２】
前記薬剤がドーパミンレセプターと結合し、ドーパミンレセプターの天然リガンドではない請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記薬剤が抗体又はモノクローナル抗体の活性な結合断片である請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記抗体断片が一本鎖抗体可変領域断片である請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記抗体又は断片が図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列又はその変異体を含むポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記抗体断片が図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記抗体断片が図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記抗体断片が図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記抗体断片が図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記抗体断片が図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記抗体断片が図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記抗体断片が図１２に示される配列のヌクレオチド１７１０から２０５１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２３】
前記抗体断片が図１２に示される配列のヌクレオチド１３５６から１５２３でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記抗体断片が図１３に示される配列のヌクレオチド７９６から１２８１でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２５】
前記抗体断片が図１４に示される配列のヌクレオチド１００５から１３６４でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２６】
前記抗体断片が図１５に示される配列のヌクレオチド６４６から１０２３でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２７】
前記抗体断片が図１６に示される配列のヌクレオチド７７２から９４８でコードされるポリペプチドと結合する請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記抗体断片がキメラ抗体である請求項１３に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記抗体断片がヒト化抗体である請求項１３に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記薬剤が修飾されたペプチドなどのペプチドである請求項１１に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記ペプチドが図１２に示される配列のヌクレオチド１７１０から２０５１でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記ペプチドが図１２に示される配列のヌクレオチド１３５６から１５２３でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記ペプチドが図１３に示される配列のヌクレオチド７９６から１２８１でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３４】
前記ペプチドが図１４に示される配列のヌクレオチド１００５から１３６４でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３５】
前記ペプチドが図１５に示される配列のヌクレオチド６４６から１０２３でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３６】
前記ペプチドが図１６に示される配列のヌクレオチド７７２から９４８でコードされるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３７】
前記薬剤がアプタマーである請求項１１に記載の薬剤。
【請求項３８】
前記薬剤が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である請求項１１に記載の薬剤。
【請求項３９】
細胞のゲノムが、
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１コピーを含むように修飾され、該細胞が該核酸分子の制御された発現に対し適合している、少なくとも１つの核酸分子で形質移入された細胞。
【請求項４０】
前記細胞が少なくとも１つの核酸分子でさらに形質移入され、該細胞のゲノムが１又は複数のドーパミンレセプターをコードする核酸分子の少なくとも１コピーを含むように修飾される、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記細胞が脳の細胞である請求項３９に記載の細胞。
【請求項４２】
前記細胞が神経細胞である請求項３９に記載の細胞。
【請求項４３】
請求項３９に記載される少なくとも１つの細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチドとドーパミンレセプターとの相互作用を調節する薬剤の同定における該ポリペプチドの使用。
【請求項４５】
前記核酸分子が図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に示される核酸配列又はその相補鎖とストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下アニールする請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記核酸配列が図１に示される配列のヌクレオチド６４４から１１９１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記核酸配列が図２に示される配列のヌクレオチド１から６０１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項４８】
前記核酸配列が図３に示される配列のヌクレオチド１から５２１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項４９】
前記核酸配列が図４に示される配列のヌクレオチド４１５から９１０を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項５０】
前記核酸配列が図６に示される配列のヌクレオチド１０５８から１６６１を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項５１】
前記核酸配列が図７に示される配列のヌクレオチド６２１から１０６９を含む核酸配列を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項５２】
前記ドーパミンレセプターが図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって表される請求項４４に記載の使用。
【請求項５３】
図１２、１３、１４、１５又は１６に示されるアミノ酸葉に列を含むポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドと、
ｉ）図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によって表される核酸配列、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの断片からなる核酸分子によってコードされる、ポリペプチド、又はそれらの断片若しくは変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、ドーパミン結合活性を持つポリペプチド；及び
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチドからなるグループより選択されるポリペプチド、との相互作用を調節する薬剤の同定におけるその使用。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００８−５１７５９２（Ｐ２００８−５１７５９２Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３７３８４（Ｐ２００７−５３７３８４）
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００４０７１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４３０８１
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０００８５７６９）ユニヴァーシティー オヴ シェフィールド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００４０７１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４３０８１
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０００８５７６９）ユニヴァーシティー オヴ シェフィールド (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]