スブチリシン変異体を含む組成物及び方法
本発明はバチスル属のスブチリシン変異体を提供する。更に、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物も提供する。幾つかの態様において、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む洗濯洗剤又は非自動（即ち、手洗い用の）食器洗浄組成物を提供する。
選択図なし。
選択図なし。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００８年１１月１１日に提出されたＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｄｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｎ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．６１／１１３，５６１に対して優先権を主張する。該文献を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属スブチリシン変異体を提供する。更に、本発明はセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物も提供する。幾つかの態様において、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む洗濯用又は非自動（即ち、手洗い用）食器洗浄組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
洗浄組成物の酵素及び他の成分の開発において多くの研究及び調査がなされているにもかかわらず、布製品からタンパク質性の汚れを効果的に除去する布製品用の洗浄組成物に対する必要性が存在している。更に、手洗い用食器洗浄製品（即ち、自動食器洗浄ではない）において、効果的な食器洗剤組成物についての必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００４】
本発明はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属スブチリシン変異体を提供する。更に、本発明はセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む洗濯用又は非自動（即ち、手洗い用）食器洗浄組成物を提供する。
【０００５】
本発明は単離されたスブチリシン変異体を提供する。該変異体は配列番号８で定義されるアミノ酸配列を含む成熟形態である。本発明の発明はこの変異体を含む手洗い用洗浄組成物及び該変異体を含む布洗浄組成物を提供する。幾つかの態様において、この洗浄組成物は洗濯洗剤である、幾つかの態様において、この洗浄組成物は手洗い用食器洗剤である。幾つかの態様において、この洗剤は液体であり、他の態様において、この洗剤は粉末、顆粒、又はタブレットである。幾つかの態様において、この組成物はリン酸塩を含まない。幾つかの態様において、この組成物は更に少なくとも１つの漂白剤を含む。幾つかの好適な態様において、手洗い用食器洗浄組成物及び布洗浄組成物は更に少なくとも１つの追加的な酵素を含む。この酵素はヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、メタプロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フォノロオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータグルコシダーゼ、アラビノキシラーナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はこれらの混合物から選択される。
【０００６】
本発明は食器又は洗濯物及び配列番号８で定義されるアミノ酸配列を有するスブチリシン変異体を含む、手洗い用食器洗浄組成物又は布洗浄組成物を提供する工程、並びに食器又は洗濯物をこれらの洗浄組成物に接触させる工程を含む洗浄方法も提供する。該方法は更に、洗浄された食器又は洗濯物をすすぐ工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
本発明はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スブチリシン変異体を提供する。更に、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明はセリンプロテアーゼ変異体を含む洗濯及び他の非自動（即ち、手洗い）食器洗浄組成物を提供する。
【０００８】
特に定義しない限り、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質エンジニアリング、タンパク質及びＤＮＡ配列決定、組換えＤＮＡ分野、工業的な酵素の使用及び開発の分野において、当業者の知識の範囲内である技術を用いて行う。本明細書に記載されている全ての特許、特許出願、文献、及び刊行物は参照により本明細書に援用される。
【０００９】
更に、ここに記載されている標題は本発明を限定するために用いるものではない。本発明は明細書全体を参照することにより理解されなければならない。従って、以下で説明する各種用語の定義は、明細書全体を参照することによりより深く理解される。しかしながら、発明の理解を促進するために以下で多くの用語を説明する。
【００１０】
別途定義しない限り、本明細書で用いる化学的及び技術的用語は本発明の属する技術分野における当業者により通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｋｈａｍ，ＴＨＥ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は本発明で用いる数多くの用語についての辞書であり、当業者はこれを参照することができる。本明細書で定義する方法及び材料と類似の又はこれらに等しいものを本発明の実施にもちいることができるけれども、好適な方法及び材料を本明細書で説明する。従って、以下で定義されている用語は明細書全体を参照することによりより深く理解されるであろう。本明細書において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数について用いる冠詞は、別途定義しない限り、複数も含む。別途定義しない限り、核酸は左から右に向かって、５’末端から３’末端を表し、アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端方向に標記する。当業者が本発明の実施に用いるものにより、本明細書で説明する方法、手順、試薬は変化し得るので、本発明に用いるこれらのものを、開示されている特定のものに限定されることがないことは理解されるであろう。
【００１１】
本明細書に記載の全ての数値の上限値は全てのより低い数値の限定を含み、そのような低い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書における各最小の数値限定はより高い数値限定を含み、そのようなより高い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書に記載の全ての数値範囲はその範囲内のより低い数値範囲を含み、そのようなより狭い数値範囲は本明細書に記載されるものとする。
【００１２】
本明細書において、「相性のよい」の語は洗剤組成物が、本明細書で提供されるプロテアーゼ酵素の酵素活性を、通常の使用条件の間に効果的ではなくなるほどに低減させないことを意味する。特定の洗剤組成物を以下で詳述する。
【００１３】
本明細書において、「効果的な量の酵素」の語は特定の製品において必要とされる酵素活性を達成するために必要とされる酵素の量を意味する。そのような効果的な量は当業者が容易に決定することができ、用いる特定の酵素変異体、洗浄用製品、洗剤組成物の特定の成分、及び組成物生物が液状か又は乾燥物（例えば、顆粒）が必要であるか否か等の多くの因子に基づいている。
【００１４】
本明細書において、「変異プロテアーゼ」についても用いる「改善された性質を有する」の語は、改善された性能及び／又は野生型プロテアーゼの対応してその性能を維持しつつ改善された安定性を有するタンパク質分解酵素を意味する。幾つかの特に好適な態様において、この改善された性質は改善された食器洗浄能力と改善された安定性の組み合わせのほか、改善された食器洗浄能力と改善された安定性からなる群より選択される。
【００１５】
本明細書において、「洗剤安定性」の語は洗剤組成物の安定性を意味する、幾つかの態様において、この安定性は洗剤の使用の間に評価される。他の態様において、この語は貯蔵の間の洗剤組成物の安定性を意味する。
【００１６】
「改善された安定性」の語は、貯蔵の間及び／又は泡の中における変異プロテアーゼのよりよい安定性を意味する。好適な態様において、この変異体プロテアーゼは、食器用洗剤の貯蔵の間及び／又は泡の中において、改善された食器用洗剤中の安定性を有しており、対応する野生型酵素に対して、酸化安定剤、金属イオン封鎖剤、自己消化、界面活性剤、及び高いアルカリ性に対する安定性を有している。
【００１７】
本明細書において、「タンパク質分解に対する安定性」の語は、タンパク質分解に抵抗するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。この語をタンパク質安定性を評価する特定のプロテアーゼの使用に限定することを意図するものではない。
【００１８】
本明細書において「酸化安定性」の語は酸化条件下で機能のするタンパク質の能力を意味する。特に、この語は、Ｈ２Ｏ２、過酸、及び他の酸化物の各種濃度の下で機能するタンパク質の能力を意味する。各種酸化条件下での安定性は当業者に既知の方法により、及び／又は本明細書で説明する方法により評価することができる。酸化安定性が大きく変化したということは、酸化化合物が存在しないときの酵素活性と比較してその酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加したか、又は減少したかにより明らかとなる。
【００１９】
本明細書において「ｐＨ安定性」の語は、特定のｐＨで機能することができるタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素は、それらが機能する明確なｐＨ範囲を有する。中性範囲のｐＨ（即ち、ｐＨ７付近）で機能する酵素に加えて、非常に高い又は非常に低いｐＨ条件下で作用することができる酵素もある。各種ｐＨ条件下での安定性は当業者に既知の方法及び／又は本明細書で説明する方法で評価することができる。ｐＨ安定性が大きく変化したということは、最適ｐＨで酵素活性と比較した場合、酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）していることにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定のｐＨ安定性レベル又はｐＨ範囲に限定することは意図しない。
【００２０】
本明細書において、「熱安定性」の語は特定の温度で機能するタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素はそれらが機能する温度の限界配位を有している。中程度の温度（例えば、室温）で機能する酵素のほかに、非常に高い又は低い温度で機能することができる酵素も存在する。熱安定性は当業者に既知の方法及び本明細書で説明する方法で評価することができる。熱安定性が相当変化したということは所与の温度に曝された変異体の酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）しているこことにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定の熱安定性レベル、又は特定の温度範囲に限定することは意図しない。
【００２１】
本明細書において、「化学安定性」の語はタンパク質の活性に有害な化学薬品に対するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。幾つかの態様において、そのような化学薬品は過酸化水素、過酸、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、キレート剤等を含むがこれらに限定されない。しかしながら、本発明を特定の化学薬品安定性又は特定の安定性の範囲に限定することは意図しない。
【００２２】
本明細書において、「精製された又は単離された」の語はサンプルから不純物を除去することを意味する。例えば、所望の酵素は、他の不純物タンパク質及び溶液又は調製物の中から所望の酵素ではない、他の成分を除去することにより精製される。幾つかの態様において、所望の組換え酵素がバクテリア又は糸状菌宿主細胞内で発現され、これらの所望の組換え酵素は他の宿主細胞の成分を除去して精製される。所望の組換え酵素のパーセンテージはこのサンプル中で増加する。
【００２３】
本明細書において、「所望のタンパク質」の語は、解析、同定、及び／又は修飾されるタンパク質（例えば、酵素又は所望の酵素）を意味する。組換え（例えば、変異）タンパク質のほか自然発生タンパク質も本発明に用いることができる。本明細書において、「タンパク質」の語は、当業者によりタンパク質として認識されているアミノ酸からなる任意の組成物を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は本明細書において互換的に用いられる。ポリペプチドがタンパク質の一部である場合、当業者は文脈上理解することができる。
【００２４】
本明細書において、「発現ベクター」の語は好適な宿主細胞において、ＤＮＡの発現に影響を与える好適な制御配列に作動可能に結合しているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写に影響を及ぼすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、転写及び翻訳の停止を制御する好適なｍＲＮＡリボゾーム結合部位及び配列をコードする配列を含む。このベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に可能性のある遺伝子挿入でもよい。一旦好適な宿主細胞に形質転換されると、ベクターは複製して、独立的に宿主細胞ゲノムの機能を果たす、又は幾つかのケースにおいて、ゲノム自信に取り込まれる。このプラスミドが現在最も一般的なベクターの形態であることから、本明細書において、「プラスミド」、「発現プラスミド」、及び「ベクター」の語は同じ意味に用いる。しかしながら、当業者において、等しい機能を提供する、及び等しい機能である、又は等しい機能となりうる他の発現ベクターの形態も含むことを意図する。
【００２５】
幾つかの好適な態様において、プロテアーゼ遺伝子は適切な発現プラスミドに結合される。クローン化されたプロテアーゼ遺伝子を融合し、宿主細胞を形質転換又は形質変換して、プロテアーゼ遺伝子を発現させる。このプラスミドは、プラスミドの複製に必要なよく知られた要素を含でいるか、又はこのプラスミドは宿主染色体に取り込まれるように設計されているので、宿主細胞内で複製することができる。必要なエレメントは効率的な遺伝子発現（例えば、所望の遺伝子に作動可能に結合しているプロモーター）のために提供される。幾つかの態様において、これらの必要なエレメントは、認識されるならば（すなわち、宿主細胞による転写）遺伝子自身の相同プロモーターとして、及び外来性転写ターミネーターとして供給されるか、あるいはプロテアーゼ遺伝子の内因性転写領域により供給される。幾つかの態様において、抗生物質含有培地中での育成によるプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養を維持することができる抗生物質耐性遺伝子等の遺伝子選択も含む。
【００２６】
幾つかの態様において、他の方法も用いることができるが、以下で説明するカセット変異誘発方法は、本発明のプロテアーゼ変異体を構築するのに用いられる。第一に、タンパク質をコードしている自然発生遺伝子を入手し、全体あるいは一部の配列を決定する。それから、コードされているタンパク質中に１以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を作成するために適した場所をスキャンする。この場所にフランキングしている配列は、発現したときに各種変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールを用いて、遺伝子短断片を置換するための制限部位があるかどうか評価される。そのような制限部位は、好ましくは、遺伝子セグメントの置換を促進するためのタンパク遺伝子内の特徴的な部位である。しかしながら、アミラーゼ遺伝子中にあまり多く存在しない任意の制限部位を用いることもできる。制限消化によって、生成する遺伝子断片は、所望の配列中で再構築することもできる。もし、制限部位が、選択されたポイントから便利な距離（１０から１５ヌクレオチド）に存在しないときは、最終的な構築物中のリーディングフレームまたはアミノ酸のいずれも変化させずに、遺伝子中の核酸配列のヌクレオチドの置換によって、そのような部位を生成することができる。対象とする配列を確認するために、その配列を変化させるための遺伝子の変異は、既知の方法であるＭ１３プライマーを伸長させることによって行うことができる。適切なフランキング領域の位置決め、及び、２の簡便な制限部位配列で必要な変異を発現させるための評価の作業は、遺伝子コードの余剰量（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）、遺伝子の制限酵素マップ、及び、多くの異なる制限酵素を用いた、ルーチン作業で行うことができる。もし、簡便な制限フランキング部位が使用可能であるならば、上記方法は、サイトを含まないフランキング領域の結合にのみ用いる。一旦自然発生ＤＮＡ又は、合成ＤＮＡがクローン化されると、変異位置に隣接している制限部位が同じ起源の制限酵素を用いて消化され、エンド末端に相補的なオリゴヌクレオチドの複数のカセットが、遺伝子の中に結合される。変異誘発はこの方法によって簡素化される、なぜならば、オリゴヌクレオチドの全ては、同じ制限部位を有するように合成することができ、該制限部位をつくるための合成リンカーが必要ないからである。
【００２７】
本明細書で用いている「対応する」とは、タンパク質またはペプチド内に列挙された位置にある各残基、あるいはタンパク質またはペプチド内に列挙された各残基と類似、相同もしくは同等である残基を意味する。本明細書で用いる「対応する領域」の語は、通常、関連タンパク質又は親タンパク質中の類似する位置を言う。
【００２８】
「コードしている核酸分子」、「コードしている核酸配列」、「コードしているＤＮＡ配列」、及び「コードしているＤＮＡ」の語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボブクレオチドの配置又は配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチオドの配置はポリペプチド（タンパク質）に沿ったアミノ酸の配列を決定する。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
本明細書で用いる「野生型」及び「天然の」タンパク質は、自然界において通常見られるタンパク質である。本明細書にて、互換的に用いる、「野生型配列」及び「野生型遺伝子」の語は、宿主細胞内で、天然に、または、自然発生的に生じる配列を言う。いくつかの態様において、野生型配列は、タンパク質工学的手法により利用されるタンパク質の開始点となる所望の配列を言う。この自然発生（すなわち、前駆体）タンパク質をエンコードしている遺伝子は、当該技術分野の当業者に既知の方法に従って得ることができる。この方法は、通常、所望のタンパク質の領域をエンコードする成熟配列を有するラベルプローブの合成、該タンパク質を発現している有機体の遺伝子ライブラリーの作成、及び、対象とする遺伝子に対するライブラリーのスクリーニングを含む。陽性ハイブリダイズクローンはその後、マッピングされ、配列決定される。
【００３０】
本明細書で用いる「組換えＤＮＡ分子」の語は、分子生物学的手法によって、互いに結合されたＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子を言う。「組換えオリゴヌクレオチド」の語は、ポリヌクレオチド配列の制限酵素消化により生成された２つ以上のオリゴヌクレオチドのリゲーション、オリゴヌクレオチドの合成（例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチドの合成）等を含むがこれらに限定されない分子生物学的手法を用いて生成されたオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３１】
本明細書で用いる「等しい残基」の語は、特定のアミノ酸残基を共有するタンパク質を言う。例えば、等しい残基は、Ｘ線結晶化学によって同定される三次構造を有するあるタンパク質（例えばＩＮＦ−β）の三次構造のホモロジーレベルを検出することによって同定される。等しい残基は、前駆体タンパク質の特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が位置合わせ後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものと定義される。位置合わせは、対象とする非水素タンパク質原子の原子座標について最大の重複を生じるように最良のモデルが配向、配置された後に達成される。この最良のモデルは、結晶学及びタンパク質の特徴付け／解析の分野において当業者に知られている方法を用いて検出され、利用できる最高の解像度において回折実験データの最低のＲファクターが得られる結晶学的なモデルである。
【００３２】
本明細書で用いる「調節エレメント」の語は、核酸配列の発現のいくつかの側面を調節する遺伝的エレメントを言う。例えば、プロモーターは、作動可能に結合しているコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。更なる調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニレーションシグナル及びターミネーションシグナルを含む。
【００３３】
本発明で用いる「宿主細胞」の語は、発現ベクター又は所望の遺伝子を含む原核又は真核宿主細胞である。宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換、又は、トランスフェクションされる。そのような形質転換された宿主細胞はタンパク質変異体をコードする複製ベクター又は所望のタンパク質を発現する複製ベクターのいずれかである。このような変異タンパク質のプレ−又はプレプロ型をエンコードするベクターの場合、発現したときに宿主細胞培地の中で選択される。
【００３４】
目的の核酸配列を細胞内へ挿入するという文脈上用いられる「導入する」の語は、形質転換、形質導入、又は、形質感染の意味を有する。形質転換の意味は、プロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈降法、電気穿孔法、及び本技術分野で既知の方法を含む（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；及びＦｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，による寄稿（１９８９） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐａｇｅｓ ５７−７２ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｄ．Ｃ．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ参照のこと）。
【００３５】
「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを言う（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーターとエンハンサーの機能を含んでいる）。エンハンサー／プロモーターは、「内性」または、「外因性」あるいは、「非相同」である。内性エンハンサー／プロモーターは、染色体内で与えられた遺伝子と自然に結合している。外因性（非相同の）エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技術）によって、遺伝子に並列配置されたものである。
【００３６】
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、組み替えられた転写の発現のレベルを高める。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写からイントロンの除去を仲介するものであり、スプライスドナー及びアクセプター部位を含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８９］，ｐｐ．１６．７−１６．８）。通常用いられるスプライスドナー及びアクセプター部位はＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライスジャンクションである。
【００３７】
「安定な形質感染」又は「安定な形質導入」の語は、形質転換させる細胞の遺伝子に、外来ＤＮＡを導入し、組み込むことを言う。「安定した形質感染体」の語は、形質転換される細胞の染色体内へ、安定して組み込まれた外来あるいは外因性のＤＮＡを有する細胞を言う。
【００３８】
本明細書で用いる「選択マーカー」または、「選択遺伝子プロダクト」の語は、選択マーカーが発現されたところで、細胞の抗生物質または薬物体制を確定する酵素活性をエンコードしている遺伝子の使用を言う。
【００３９】
「増幅」及び遺伝子増幅の語は、増幅された遺伝子が生えジメチルにゲノム中に存在しているコピー数よりも多いコピー数で存在するように、特定のＤＮＡ配列が偏って増幅されることを意味する。幾つかの態様において、薬品（例えば、抑制可能な酵素の抑制剤）の存在下で育成することによる細胞の選択はこの薬品の存在下での育成に必要とされる遺伝子産物をコードする内性遺伝子の増幅又はこの遺伝子生成物をコードしている外来（即ち、インプット）配列の増幅のいずれか又は両方となる。
【００４０】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定テンプレートに依存しない複製）と対比される。テンプレート特異性は複製の忠実度（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。テンプレート特異性は「標的「特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて設計されてきた。
【００４１】
本明細書で用いる、「プライマー」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じるまたは合成的に生成されるオリゴヌクレオチドをいい、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が導入される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、及び適した温度及びｐＨで）、合成開始点として作用するものを言う。当該プライマーは好ましくは増幅効率を最大にする１本鎖であるが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは伸長生成物の準備のために用いる前にそのストランドを分離処理する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは誘発剤の存在下、伸長生成物の合成開始のため十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、誘発温度、プライマーの供給源及び使用する方法など多くの因子に左右される。
【００４２】
本明細書で用いる「プローブ」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じる、または合成、組換えまたはＰＣＲ増幅により生成されるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）をいい、別の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるものである。プローブは１本鎖または２本鎖である。プローブは特定遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で使用されるいかなるプローブも任意の「リポーター分子」で標識するので、任意の検出システムにおいて検出可能であり、限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ及び酵素ベースの組織化学的分析）、蛍光、放射性及び発光性システムなどがある。本発明はいかなる特定の検出システムまたは標識にも限定されない。
【００４３】
本明細書で用いる「標的」の語はポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合する核酸領域を言う。従って、「標的」は他の核酸配列から選別された所定の核酸を言う。「断片」は標的配列内の核酸領域として定義される。
【００４４】
本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）の語はここに引用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、及び４，９６５，１８８の方法を言い、クローニングまたは精製することなくゲノムＤＮＡの混合物における標的配列の断片濃度を増加させる方法を含む。標的配列を増幅させるこの方法は当業者によく知られている。
【００４５】
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語はそれぞれ特定ヌクレオチド配列で、またはその近くで２本鎖ＤＮＡを切断する、細菌性酵素をいう。
【００４６】
本明細書において、「洗浄組成物」の語は洗剤製品に用いることができる任意の洗濯洗剤組成物又は食器洗剤組成物を意味する。（別に定義しない限り）この語は、顆粒又は粉末の全ての用途又は「重質」洗剤（例えば、洗濯洗剤）、液体又は粉末のおしゃれ着用洗剤、手洗い用食器洗剤、タブレット、顆粒、液体洗剤を含む形質手洗い用食器洗剤（例えば、高発泡性洗剤）、家庭又は工業用すすぎ用洗剤、液体洗浄殺菌剤（例えば、殺菌ハンドソープ）、洗濯石鹸、マウスウォッシュ、入れ歯洗浄剤、カーシャンプー、バスルームクリーナー、ヒト及び動物用ヘアシャンプー、ヒト及び動物用ヘアリンス、バスゲル、泡状風呂及び金属クリーナー、及び洗浄補助剤（例えば、漂白添加剤、洗剤添加剤、「シミトリスティック」及び他の前処理剤を含む前処理剤）を包含する。
【００４７】
本明細書において、「洗浄組成物」及び「洗剤」の語は、固体目的物の洗浄のために、洗浄媒体中で用いることを意図した混合物を意味する。好適な態様において、この語は、皿、カトラリー等（例えば、手洗い食器洗剤）の洗浄に用いる洗剤を意味する。本発明を特定の洗剤又は組成物に限定することは意図しない。即ち、この語は本発明の少なくとも１つのプロテアーゼを含む洗剤に加えて、界面活性剤、移動剤、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、抗酸化剤、及び安定化剤を含む洗剤も含む。
【００４８】
本明細書において、「手洗い用食器洗浄組成物」の語はカトラリーを含む食器を洗浄するための組成物であって、顆粒又は液体形態を含むがこれらに限定されない全ての形態の組成物を意味する。本発明を特定のタイプ又は食器洗浄組成物に限定することは意図しない。即ち、本発明はセラミック、プラスチック、金属、陶器、ガラス、アクリル等を含むがこれらに限定されない任意の物質から作られた食器（例えば、皿、カップ、グラス、ボウル等を含む食器）及びカトラリー（例えば、スプーン、ナイフ、フォーク、給仕用具等を含むカトラリー）に用いることができる。「食器」の語は本明細書において食器及びカトラリーの両方を意味する。
【００４９】
「関連する洗浄条件」の語は、実際に食器洗剤の市場区分における家庭用に用いられている、条件、特に洗浄音素、時間、洗浄器、泡濃度、洗剤及び水の硬度のタイプを意味する。
【００５０】
「改善された洗浄性能」の語は関連する洗浄条件下で食器から汚れを除去する点においてより好適な結果が得られること、又は対応する野生型プロモーターよりも重量ベースでより少ない変異プロテアーゼが同じ結果をだすために必要になることを意味する。
【００５１】
「維持された洗浄性能」の語は変異プロテアーゼ酵素の洗浄性能に示すために用いる。重量ベースで関連する洗浄条件下において対応する野生型プロテアーゼに対して少なくとも８０％の効果を有することを意味する。
【００５２】
プロテアーゼの洗浄性能は適切な条件下で、特定の代表的な汚れを除去する能力により測定される。これらのシステムにおいて、洗剤組成物、泡抑制剤、水の高度、洗浄器、時間、ｐＨ、及び／又は温度等の因子を特定のマーケットセグメント（例えば、食器、布洗浄）における家庭用製品のための条件に限定されるように、制御することができる。本明細書で説明する試験的な製品試験システムはＤＮＡ変異誘発を通じて修飾されたタンパク質分解酵素を用いる家庭用製品の代表的例である。従って、本明細書で提供される方法は大量の異なる酵素の試験及び特定の製品に特に好適な酵素の選択を促進する。このような特定の用途のための「テイラーメイド」酵素は用意に選択することができる。
【００５３】
「洗浄活性」の語は本発明のタンパク質分解、加水分解、洗浄又は他のプロセスの間に優勢である条件下において、プロテアーゼにより達成される洗浄性能を意味する。幾つかの態様において、洗浄性能は汚れを標準的な洗浄条件下に曝した後に、各種クロマトグラフ、分光光度計、又は他の定量可能な方法により決定された、例えば、ミルク又は卵のタンパク質等の酵素に敏感な汚れに関する各種洗浄評価方法により決定することができる。例示的なアッセイは、実施例に記載のもののほかに、ＷＯ９９／３４０１１及びＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６０５，４５８に記載の方法を含むがこれらに限定されない。これらの文献を参照により本明細書に援用する。
【００５４】
プロテアーゼの「洗浄に効果的な量」の語は、特定の洗浄条件において、所望の酵素活性を達成することが出来る前述のプロテアーゼの量を意味する。そのような効果的な量は当業者が容易に決定することができ、用いられるプロテアーゼ、洗浄製品、洗剤組成物、及び液体又は乾燥（例えば、顆粒）組成物のいずれか必要とされるか等の多くの因子に基づいている。
【００５５】
本明細書で用いる「洗浄補助物質」の語は、所望の洗浄用組成物及び特定のタイプの形状のために選択された任意の液体、固形、又は気体物質を意味し、組成物中に用いられるプロテアーゼ酵素と相性の良い物質を意味する。幾つかの態様において、顆粒組成物は「コンパクト」タイプであり、液体組成物は「濃縮」形態である。
【００５６】
本発明で用いられるように、「中洗剤濃度」系は洗浄水に約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分が存在する洗剤を含む。北米の洗剤は、洗浄水に通常約９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、一般的には中洗剤濃度系と見なされる。ブラジルの洗剤は、典型的には洗浄水に約１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。本発明で用いられるように、「低洗剤濃度」系は洗浄水に約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が存在する洗剤を含む。日本の洗剤は、洗浄水に通常約６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、典型的には低洗剤濃度系と見なされる。
【００５７】
本発明で用いられるように、「高洗剤濃度」系は洗浄水に約２０００ｐｐｍより多くの洗剤成分が存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、洗浄水に約３０００−８０００ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、一般的には高洗剤濃度系と見なされる。
【００５８】
本発明で用いられるように、「非織物洗浄組成物」には、食器洗い洗剤組成物、口洗浄組成物、義歯洗浄組成物、およびパーソナル洗浄組成物を含むが、これらに限定されない非織物（ｎｏｎ−ｔｅｘｔｉｌｅ）（例えば、布地）表面洗浄組成物が含まれる。
【００５９】
本明細書において、「殺菌」の語はアイテム表面の微生物を抑制又は殺す他に。表面から汚染物質を除去することも意味する。本発明を特定の表面、アイテム、汚染物質、又は微生物に限定するとこは意図しない。
【００６０】
本明細書において、「スブチリシン」の語は、ＭＥＲＯＰＳ−ペプチドデータベース（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３４Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ， Ｄ２７０−２７２，２００６）に記載のようなＳ８セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバーを意味する。
【００６１】
本発明は天然の又は組み替え技術により生成されたバクテリアセリンプロテアーゼ由来の変異タンパク質分解酵素の生成、スクリーニング、及び選択のための方法及び組成物も提供する。そのような変異体は、例えば、アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の野生型遺伝由来の遺伝子によりコードされたものがある。最も好適な態様において、この株はＰＢ９２である。本発明は、アルカリ性バチルス株ＰＢ９２由来セリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼ由来の修飾プロテアーゼの選択に用いることができる。例えば、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、及びバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が知られており、変異誘発の標的として用いることができる。しかしながら、本発明を特定の態様に限定することは意図しない。オリゴヌクレオチドを利用した部位指定変異誘発又は領域指定ランダム変異誘発を含むがこれらに限定されない任意の好適な変異誘発方法を本発明に用いることができる。
【００６２】
幾つかの好適な態様において、生成及び選択を含む、本発明により提供される変異タンパク質分解酵素を選択する方法は以下の工程を含む：所望のタンパク質分解酵素又はそのフラグメントをコードしているクローンされた遺伝子を変異する工程；得られた変異プロテアーゼ遺伝子を単離する工程；好ましくは好適なベクター上にあるこの変異プロテアーゼ遺伝子を好適な宿主細胞に導入して発現及び生成する工程；生成された変異プロテアーゼを回収する工程；洗剤に適用するために改善された性質を有する変異プロテアーゼを同定する工程。
【００６３】
変異プロテアーゼの生成のために好適な宿主細胞株はプロテアーゼを発現することができる改質転換可能な微生物を含む。特に、実質的に同じ性質を有するプロテアーゼの由来と同じ種又は属の、バチルス株、特にアルカリ性バチルス株、最も好ましくは新規なバチルス株であるＰＢ９２又はこれらの変異体である宿主株が好ましい。バチルススブチリス、バチルスリケニフォルミス、及びバチルスアミロリケファシエンス株が好適な株である。他の好適な宿主株は変異遺伝子で形質転換する前に細胞外タンパク質分解酵素の生成を行わない他の株を含む。特に好適なものは、新規なバチルスＰＢ９２の不完全誘導体等のバチルス株であると定義されたものである。プロテアーゼの発現は選択された宿主有機体で昨日するシグナルの発現を用いて得ることができる。シグナルの発現はプロテアーゼ遺伝子の転写及び翻訳を調節しているＤＮＡの配列を含む。好適なベクターは染選択された宿主株において有意に高いコピー数を複製し、色体取り込みにより、宿主系統内において、プロテアーゼ遺伝子を維持することができるものである。
【００６４】
本発明の変異タンパク質分解酵素は適した発酵条件下における培養、１つ以上の所望の変異タンパク質分解遺伝子、及び生成された酵素の回収により調製することができる。好ましくは、この発現されるプロテアーゼは培地内で、グラム陰性バクテリア宿主株の場合、ペルプラスム種で選択され、それらの回収を促進する。選択のためには、好適なアミノ停止シグナル配列が用いられる。好ましくはこのシグナル配列は、選択された宿主株内で機能するならば、オリジナル遺伝子によりコードされるシグナル配列である。
【００６５】
幾つかの態様において、自然発生又は自然変異的な洗剤プロテアーゼの生成は、この酵素の各種変異体を導入することにより高めることができる。たいていの場合、この変異は保存又は非保存残基の置換であり、これらの欠失又は挿入も用いることができる。
【００６６】
保存置換については、以下の表Ｉを用いる。あるカテゴリーの任意のアミノ酸が同じカテゴリー内の任意のアミノ酸と置換することができる。例示的な保存置換はグリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）で置換することである。一方、例示的な非保存残基は、グリシン（Ｇ）をアスパラギン残（Ｄ）、リジン（Ｋ）、又はフェニルアラニン（Ｆ）で置換することである。
【表１】
【００６７】
更に、極性アミノ酸Ｎ、Ｑを荷電性アミノ酸で置換することができる。本発明の目的のために、特に、活性部位に直接含まれない部位でプロテアーゼのアニオン性質が高くなるような置換を行うことが好ましい。
【００６８】
驚くべきことに、本発明の開発において試験された幾つかの置換は同じ基質において、プロテアーゼの特異活性を低くする結果となったが、関連する天然又は対照酵素に匹敵するか、より高い洗浄性能を示した。幾つかのケースでは、貯蔵安定性が改善された。従って、本発明は、天然又は対照プロテアーゼと比較して改善されたパフォーマンスを有する変異プロテアーゼを提供する。
【００６９】
幾つかの態様において、洗浄組成物においてスブチリシンの安定性及び／又は性能を高めるために、幾つかの置換を組み合わせる。例えば、スブチリシンの洗浄性能に好ましい影響を与える幾つかの置換を１つのスブチリシン変異体中で組み合わせることができる。（例えば、Ｓ１０Ｍ＋Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａを有するＰＢ９２変異体：ＢＰＮナンバリングを使用）
【００７０】
即ち、本発明は洗浄組成物及び／又は洗浄工程に用いる変異体セリンプロテアーゼ提供する。最終的にプロテアーゼポリペプチド鎖中のアミノ酸の欠失又は挿入させて、ＢＰ９２プロテアーゼに相同な変異又は天然プロテアーゼが生成されることにより、アミノ酸配列の位置番号が変更になることは明らかである。しかしながら、ＢＰ９２対照スブチリシン（及びＢＰＮでアラインメントした番号）のアミノ酸位置に相同な位置は本発明の範囲内であることは理解されるべきである。
【００７１】
洗剤組成物
別に定義しない限り、本明細書で提供される全ての成分又は組成物のレベルがこの成分又は組成物生物の活性レベルであり、例えば、市販の原料中に存在質得る溶媒の残渣又は副生成物等の不純物を排除する。全てのパーセンテージ及び割合は別途定義しない限り、重量に基づく。全てのパーセンテージ及び割合は別に定義しない限り、組成物に基づいて計算される。例示的な洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の総重量に対する精製酵素の割合で表され、別に定義しない限りこの洗剤の成分は組成打つの重量に対するパーセンテージで示される。
【００７２】
本明細書において、幾つかの態様において、本発明の洗剤組成物は更に界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、漂白酵素、他の酵素、酵素安定システム、キレート、白化剤、汚れ放出ポリマー、ダイ、移行剤、泡抑制剤、香料、色素、充填剤、塩、ヒドロトロプス、光学活性剤、蛍光剤、コンディショナー、加水分解界面活性剤、保存料、抗酸化剤、縮み抑制剤、しわ抑制剤、殺菌剤、抗菌剤、カラースペックル、シルバーケア、抗黄ばみ及び／又は抗腐食剤、アルカリソース、可溶化剤、担体、プロセス剤、顔料、及びｐＨ抑制剤を含む。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，６１０，６４２、６，６０５，４５８、５，７０５，４６４、５，７１０，１１５、５，６９８，５０４、５，６９５，６７９、５，６８６，０１４、及び５，６４６，１０１参照。これらの文献を参照により本明細書に援用する。）特定の洗剤組成物の例を以下で説明する。洗剤組成物において、洗浄補助剤が本発明の変異プロテアーゼと相性がよくない態様において、２つの成分の組み合わせが好適になるまで、洗浄補助剤と分離されたプロテアーゼ（即ち、他の成分と接触していない）を維持する好適な方法を用いる。そのような分離方法は当業者に知られている任意の方法を含む（例えば、ゲルキャップ、カプセル化、タブレット、物理的分離等）。
【００７３】
本発明のセリンプロテアーゼは各種洗浄組成物の製剤化に有用である。本発明の酵素は顆粒及び液体組成物に用いることができる。本発明の洗浄組成物は、例えば、洗濯用製品、硬表面洗浄、並びに口腔、歯科、ヘア、及び皮膚等の化粧製品に好適に用いることができる。本発明の酵素は顆粒及び液体組成物の両方に用いることができる。
【００７４】
本発明の酵素は洗浄添加製品においても用いられる。本発明の少なくとも１つの酵素を含む洗浄添加製品は、追加的な漂白効果が欲しい場合に、洗浄工程に用いることが好ましい。そのようなものは低温溶解性洗浄製品を含むがこれらに限定されない。この添加製品は、その最も簡単な態様において、本発明により提供される１つ以上のプロテアーゼでもよい。幾つかの態様において、この添加製品は過酸の源を用いて漂白効果を高めることが望ましい場合に洗浄工程に添加するための形態で包装されている。幾つかの態様において、単回投与形態は、ピル、タブレット、ゲルキャップ、又はあらかじめ決められた量の粉末及び／又は液体を含む他の単回投与単位を含む。幾つかの態様において、充填剤及び／又は担体物質を組成物の容量を増やすために用いる。好適な充填剤又は担体物質は各種硫酸塩、カルボン酸塩、ケイ酸塩、並びにタルク、クレイ等を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、液体組成物についての、充填剤及び／又は担体物質は、水及び／又はポリオール及びジオールを含む低分子量１級又は２級アルコールを含む。そのようなアルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールがあるがこれらに限定されない。幾つかの態様において、この組成物はそのような物質を約５％乃至約９０％含む。追加的な態様において、酸性充填剤を用いて組成物のｐＨを下げる。幾つかの代替的な態様において、洗浄添加製品は少なくとも１つの前述の及び／又は以下に述べる補助物質として、少なくとも１つの過酸の源を含む。
【００７５】
本発明の洗浄組成物は本発明において提供されるようなセリンプロテアーゼ酵素の効果的な量を必要とする。幾つかの態様において、酵素の必要とされる量は、本発明のセリンプロテアーゼの１つ以上の添加により達成される。通常、本発明の洗剤組成物は少なくとも０．０００１重量％、約０．０００１乃至約１０、約０．００１乃至約１、又は約０．０１乃至約０．１重量％の本発明により提供される少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む。
【００７６】
幾つかの好適な態様において、本明細書において提供される洗浄組成物は、水性洗浄操作で使用される間に、その洗浄水のｐＨが約５．０乃至約１１．５、あるいは約６．０乃至約１０．５になるように製剤化される。幾つかの好適な態様において、液体製剤は約３．０乃至約９．０のｐＨになるように製剤化される。代替的な態様において、この製剤は約３乃至約５のｐＨを有する。推奨されるレベルへｐＨを調整する技術は緩衝液、アルカリ、酸等を含み、当業者に知られている。
【００７７】
幾つかの特に好適な態様において、少なくとも１つのセリンプロテアーゼが顆粒組成物又は液体に用いられたときに、このセリンプロテアーゼは貯蔵の間に顆粒組成物の他の成分から酵素を保護するために、カプセル化された粒子の形態になっている。更に、カプセル化は洗浄工程の間のせリンプロテアーゼの利用を制御する手段も提供し、セリンプロテアーゼの性能を向上させる。本発明のカプセル化されたセリンプロテアーゼは各種セッティングに用いることができる。このセリンプロテアーゼは当業者に知られている任意の好適なカプセル化材料及び方法を用いてカプセル化することができる。
【００７８】
幾つかの好適な態様において、カプセル化材料は通常セリンプロテアーゼ酵素の少なくとも一部分をカプセル化する。幾つかの態様において、このカプセル化物質は水溶性及び／又は水分散性である。幾つかの追加的な態様において、このカプセル化材料は０℃以上のガラス転移温度を有する。（ガラス転移温度に関しての詳細は例えば、ＷＯ９７／１１１５１、特に６ページ、２５行目、乃至７ページ、２行目参照。）
【００７９】
幾つかの態様において、カプセル化された物質は炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン及びキトサン、セルロース及びセルラース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。カプセル化物質は炭水化物である幾つかの態様において、炭水化物はモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。幾つかの好適な態様において、カプセル化された物質はデンプンである。（幾つかの例示的なデンプンについて、例えば、ＥＰ ０ ９２２ ４９９；及びＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，９７７，２５２、５，３５４，５５９、５，９３５，８２６参照）。
【００８０】
追加的な態様において、カプセル化された物質はプラスチックである。（熱可塑性プラスチック、アクリルニトリル、メタクリルニトリル、ポリアクリルニトリル、ポリメタクリルニトリル、及びこれらの混合物、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（商標）（Ｃａｓｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ＰＭ ６５４５、ＰＭ ６５５０、ＰＭ ７２２０、ＰＭ ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）、及びＱ−ＣＥＬ（商標） （ＰＱ Ｃｏｒｐ．， Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ， ＰＡ）、ＬＵＸＳＩＬ（商標）及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬｌ（商標）（Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｃａｒｌｓｔａｄｔ， ＮＪ ａｎｄ Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ，ＰＡを含むがこれらに限定されない市販のミクロスフェアも用いることができる。）
【００８１】
本発明で記載されるように、本発明の変異プロテアーゼは洗濯に用いられる。これらの利用は様々な環境ストレスに酵素を曝す。本発明のプロテアーゼは様々な環境下でのその安定性のために、現在用いられる多くの酵素に亘って有利である。
【００８２】
実際、洗濯に用いられる酵素が曝される、様々な洗剤製剤、洗濯水量、洗濯水温、および洗濯時間の長さを含む様々な洗濯条件がある。さらに、異なる地理的な地域で用いられる洗剤製剤は洗濯水に存在する関連成分の異なる濃度を有する。例えば、ヨーロッパの洗剤は典型的に洗濯水中に約４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を有するが、日本の洗剤は典型的に洗濯水中に約６６７ｐｐｍの洗剤成分を有する。北アメリカ、特に米国では、洗剤は典型的に洗濯水中に存在する約９７５ｐｐｍの洗剤成分を有する。
【００８３】
低洗剤濃度系は約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。日本の洗剤は、約６６７ｐｐｍの洗濯水中に存在する洗剤成分を有するため、典型的に低洗剤濃度系と見なされる。
【００８４】
中洗剤濃度系は約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、約９７５ｐｐｍの洗濯水中に存在する洗剤成分を有するため、一般的に中洗剤濃度系と見なされる。ブラジルでは典型的に約１５００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有する。
【００８５】
高洗剤濃度系は約２０００ｐｐｍより多くの洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、約４５００〜約５０００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有するため、一般的に高洗剤濃度系と見なされる。
【００８６】
ラテンアメリカの洗剤は一般的に高燐酸泡ビルダー洗剤であり、ラテンアメリカで用いられる洗剤の範囲は、洗濯水中の洗剤成分が１５００ｐｐｍ〜６０００ｐｐｍに及ぶため、中および高洗剤濃度の両方に該当し得る。上述のように、ブラジルでは典型的に約１５００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有する。しかしながら、他のラテンアメリカ諸国に限定されることなく、他の高燐酸泡ビルダー洗剤の地域は洗濯水中に存在する約６０００ｐｐｍ以上の洗剤成分の高洗剤濃度系を有することができる。
【００８７】
前述の観点から、世界中の典型的な洗濯溶液中の洗剤成分の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低洗剤濃度地域」）、例えば日本の約６６７ｐｐｍから、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの間（「中洗剤濃度地域」）、例えば米国の約９７５ｐｐｍおよびブラジルの約１５００ｐｐｍ、約２０００ｐｐｍを超える（「高洗剤濃度地域」）、例えばヨーロッパの約４５００〜約５０００ｐｐｍおよび高燐酸泡ビルダー洗剤地域の約６０００ｐｐｍまで変化する。
【００８８】
典型的な洗濯溶液の濃度は経験的に決められる。例えば米国では、典型的な洗濯機は約６４．４Ｌの容積の洗濯溶液を擁する。したがって、洗濯溶液内の約９７５ｐｐｍの洗剤の濃度を得るためには、６４．４Ｌの洗濯溶液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を加えなければならない。この量は、洗剤に備えられた計量カップを用いて消費者により洗濯水中に量り取られる典型的な量である。
【００８９】
更なる具体例として、異なる地域では異なる洗濯温度が用いられる。日本の洗濯水の温度は典型的にヨーロッパで用いられるものよりも低い。例えば、北アメリカおよび日本の洗濯水の温度は１０〜３０℃の間であり得、一方ヨーロッパの洗濯水の温度は典型的には３０〜６０℃（例えば、約４０℃）である。
【００９０】
更なる具体例として、異なる地域は典型的には異なる水の硬度を有する。水の硬度は通常、粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋という用語で記述される。硬度は水の中のカルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の測定値である。米国のほとんどの水は硬いが、硬度は変動する。中度に硬い（６０−１２０ｐｐｍ）から硬い（１２１−１８１ｐｐｍ）水は６０〜１８１ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ｐｐｍから粒子／米国ガロンへの変換については、１７．１でｐｐｍ＃を除したものが粒子／ガロンに等しい）の硬度の物質である。
【表２】
【００９１】
ヨーロッパの水の硬度は典型的には１０．５（例えば、１０．５〜２０．０）粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（例えば、約１５粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋）である。北アメリカの水の硬度は典型的には日本の水の硬度よりも硬いが、ヨーロッパの水の硬度よりも軟らかい。例えば、北アメリカの水の硬度は３〜１０粒子の間、３〜８粒子、または約６粒子であり得る。日本の水の硬度は典型的には北アメリカの水の硬度より軟らかく、通常４未満であり、例えば３粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋である。
【００９２】
従って、幾つかの態様において、本発明は少なくとも１つの洗浄条件のセットにおいて驚くべき洗浄性能を示す変異プロテアーゼを提供する。（例えば、水温度、水高度、及び／又は洗剤濃度）。幾つかの態様において、本発明の変異プロテアーゼは洗浄性能において他のスブチリシンプロテアーゼに匹敵する。幾つかの態様において、本発明の変異プロテアーゼは近年商業的に使用されているスブチリシンプロテアーゼと比較して高い洗浄性能を示す。従って、本発明のいくつかの好適な態様において、この変異プロテアーゼは高められた酸化安定性、高められた熱安定性、及び／又は高められた洗浄安定性を示す。更に、本発明の変異プロテアーゼは界面活性剤を含まない洗剤組成物中に、単独又はビルダー及び安定剤と組み合わせて用いることができる。
【００９３】
本発明の幾つかの態様において、洗剤組成物は少なくとも１つの本発明の変異プロテアーゼを組成物の重量に基づいて、約０．００００１％乃至約１０％のレベルで含み、他に組成物の重量に基づいて、例えば、約９９．９９９％乃至約９０．０％の補助物質を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗剤組成物は、少なくとも１つの本発明の変異プロテアーゼを組成物の重量に基づいて約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％、含み、他は約９９．９９９９％乃至約９０．０％、約９９．９９９％乃至約９８％、約９９．９９５％乃至約９９．５％の洗浄補助物質を含む。
【００９４】
本明細書において更に説明するように、幾つかの態様において、好適な洗剤組成物は本発明の変異プロテアーゼに加えて、洗浄性能において利益を提供する１つ以上の追加的な酵素又は酵素誘導体を含む。そのような酵素は他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、（例えば、ラッカーゼ）、及び／又はマンナナーゼを含むがこれらに限定されない。
【００９５】
洗浄組成物の製造及び使用
幾つかの好適な態様において、本発明の洗浄組成物は任意の好適な形態に製剤化でき、製剤化のために選択された任意の好適な方法で調製することができる。（幾つかの非限定的な例について、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，８７９，５８４、５，６９１，２９７、５，５７４，００５、５，５６９，６４５、５，５６５，４２２、５，５１６，４４８、５，４８９，３９２、及び５，４８６，３０３参照。）低ｐＨの洗浄組成物が好ましい場合、このような組成物のｐＨはＨＣｌのような酸性物質の添加により調整することができる。
【００９６】
補助物質
本発明の目的には必須ではないが、幾つかの態様において、本明細書に記載の非限定的に列挙されている補助剤は本発明の洗浄組成物に用いるのに好適である。即ち、幾つかの態様において、補助剤は本発明の洗浄組成物に含まれる。幾つかの態様において、補助物質は洗浄性能を補助及び／又は向上させ、洗浄される基質を処理し、及び／又は組成物の審美性を修飾する。（例えば、香料、色素、ダイ等）これらの追加的な化合物の正確な性質及びこれらの含有レベルは組成物の物理的形態及び／又は使用される洗浄組成物の特定の性質に依存している。好適な補助物質は界面活性剤、ビルダー、キレート剤、ダイ移行抑制剤、付着剤、追加的な酵素、及び／又は酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、漂白向上剤、過酸化水素、過酸化水素の源、機能性過酸、ポリマー分散剤、クレイ汚れ除去／再付着防止剤、白化剤、泡抑制剤、ダイ、香料、構造柔軟剤、柔軟剤、担体、ヒドロトロプス、プロセス剤及び／又は顔料を含む。本明細書に記載のものに加えて、追加的な例は当業者に知られている（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５７６，２８２、６，３０６，８１２、及び６，３２６，３４８）。幾つかの態様において、予め決められた補助成分は本発明の洗浄組成物の本発明のプロテアーゼ以外の成分を構成している。
【００９７】
界面活性剤
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの界面活性剤又は界面活性剤システムを含む。この界面活性剤は非イオン性界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、準極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物から選択される。低ｐＨ洗剤組成物の態様において（例えば、組成物のｐＨが約３乃至約５）、この組成物は通常アルキルエトキシル化硫酸塩を含まない。そのような界面活性剤は酸性物質を含む組成物により加水分解される。幾つかの態様において、界面活性剤は約０．１％乃至約６０％の範囲でふくまれ、代替的な態様において、このレベルは約１％乃至約５０％、他の更なる態様において、このレベルは約５％乃至約４０％である。
【００９８】
ビルダー
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は１つ以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステムを含む。少なくとも１つのビルダーを含む幾つかの態様において、この洗剤は洗剤の重量に基づいて、少なくとも約加えて１％、約３％乃至約６０％、又は約５％乃至約４０％のビルダーを含む。ビルダーはアルカリ金属、リン酸アンモニウム、及びリン酸のアルカノアンモニウム塩、アルカリ金属シリケート、アルカリ土類金属炭素、アルカリ金属炭素、アルミノシリケート、ポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシスクシニル酸、各種アルカリ金属、エチレンジアミントリ酢酸、及びニトリルトリ酢酸等のポリ酢酸のアンモニウム及び置換されたアンモニウム塩、メリト酸、スクシニル酸、クエン酸、オキシジスクシニル酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸等のポリカルボン酸塩、並びにこれらの可溶化塩を含むがこれらに限定されない。即ち、任意の好適なビルダーを本発明の各種態様に用いることができる。
【００９９】
幾つかの態様において、ビルダーはクエン酸塩及びリン酸塩等（例えば、サトリウム三リン酸及びナトリウム三リン酸六水和物、カリウム三リン酸、及び混合されたナトリウム及びカリウム三リン酸等）の水溶性硬イオン複合体（例えば、封鎖ビルダー）を形成する。当業者に知られているものを含む任意の好適なビルダーを本発明に用いることができる（例えば、ＥＰ２１００９４９）。
【０１００】
キレート剤
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つのキレート剤を含む。好適なキレート剤は銅、鉄、及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物を含む。少なくとも１つのキレート剤を用いる態様において、本発明の洗浄組成物はこの洗浄組成物の重量に基づいて、約０．１％乃至約１５％、更には約３．０％乃至約１０％、のキレート剤を含む。
【０１０１】
沈着補助剤
本発明の洗浄組成物は沈着補助剤を含むことができる。好適な沈着補助剤には、ポリエチレングリコール、ポリカルボン酸、ポリテレフタル酸のような防汚ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイトのような粘土、およびこれらの混合物が含まれる。
【０１０２】
再付着防止剤
本明細書において、再付着防止剤が本発明の幾つかの態様に用いられる。幾つかの好適な態様において、非イオン界面活性剤が用いられる。例えば、洗浄組成物の態様において、非イオン界面活性剤は目的物の表面を修飾するために用いられ、特に汚れに関して、膜形成及びスポット形成を避け、輝きを増すために用いられる。これらの非イオン界面活性剤は汚れの再付着を防止するためにも用いる。幾つかの好適な態様において、再付着防止剤は当業者に知られている非イオン界面活性剤である。（例えば、ＥＰ２１００９４９参照。）
【０１０３】
染料転移阻害剤
本発明の洗浄組成物はまた、一つ以上の染料転移阻害剤を含むことができる。好適なポリマー性染料転移阻害剤には、ポリビニルピロリドン・ポリマー、ポリアミン−Ｎ−オキシド・ポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。対象洗浄組成物に存在する場合、前記染料阻害剤は洗浄組成物の重量で約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、またはさらに約０．１％〜約３％のレベルで存在することができる。
【０１０４】
ケイ酸塩
幾つかの態様において、ケイ酸塩を本発明の組成物に含むことができる。幾つかのそのような態様において、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロシリケート）を用いる。幾つかの態様において、ケイ酸は約１％乃至約２０％のレベルで存在する。幾つかの好適な態様において、ケイ酸塩は組成物の重量により約５％乃至約１５％含まれる。
【０１０５】
分散剤
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの分散を含む。好適な水溶性有機物質は、ホモ又はコポリマー酸又はそれらの塩を含むがこれらに限定されない。ポリカルボン酸はお互いに離れた少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含み、炭素原子は２を超えない。
【０１０６】
酵素
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの追加的な酵素を含む。これらの酵素は食器洗浄のための洗浄性能を向上させる。好適な酵素の例はヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、フォスフォオキシダーゼ、リポキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、βグルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、並びにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はセルラーゼ並びにアミラーゼ等の従来用いられている酵素の組み合わせを含む酵素の組み合わせを用いる。
【０１０７】
他の好適なプロテアーゼも本発明に用いることができる。好適なプロテアーゼは動物、野菜、又は微生物のものを含む。幾つかの特定の好適な態様において、微生物プロテアーゼを用いる。幾つかの態様において、化学的又は遺伝的に修飾された変異体が含まれる。幾つかの態様において、このプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリセリンプロテアーゼ又はトリプシン用プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの例としては、スブチリシン、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの（例えば、スブチリシン、レンタス、アミロリケファシエンス、スブチリシンカールスバッド、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、及びスブチリシン１６８）を含む。追加的な例はＵ．Ｓ． Ｐａｔ．Ｎｏｓ．ＲＥ ３４，６０６、５，９５５，３４０、５，７００，６７６、６，３１２，９３６、及び６，４８２，６２に記載の変異プロテアーゼを含む。これらの文献を参照により本明細書に援用する。追加的なプロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、トリ又はウシ由来）及びＷＯ８９／０６２７０に記載のフサリウムプロテアーゼを含むがこれらに限定されない。好適な市販のプロテアーゼ酵素はＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）， ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（ジェネンコー）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、 ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）、及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）、（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）； 及びＢＬＡＰ（商標）（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｔｉｅｎ， Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）がある。各種プロテアーゼはＷＯ９５／２３２２１、ＷＯ ９２／２１７６０、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．２００８／００９０７４７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，８０１，０３９、５，３４０，７３５、５，５００，３６４、５，８５５，６２５、ＵＳ ＲＥ ３４，６０６、５，９５５，３４０、５，７００，６７６、６，３１２，９３６、及び６，４８２，６２８並びに他の特許に記載されている。幾つかの更なる態様において、ＷＯ０７／０４４９９３に記載の天然メタロプロテアーゼを含むがこれらに限定されないメタロプロテアーゼを本発明に用いることができる。
【０１０８】
更に、任意の好適なリパーゼを本発明に用いることができる。好適なリパーゼはバクテリア又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝的に修飾された変異体が本発明に包含される。有用なリパーゼの例としては、ウミコーララングイノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２５８０６８，ＥＰ３０５２１６，及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，９３９，７０２参照）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２３８０２３参照）、カンジダアンタルクチア（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（例えば、カンジダアンタルクチア（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ又はＢ；例えば、ＥＰ２１４ ７６１参照）等のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ、シュードモナスアルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びシュードモナスプレウドアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２１８２７２参照）、シュードモナスセパチア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（例えば、ＥＰ３３１３７６参照）、シュードモナススツゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ（例えば、ＧＢ１，３７２，０３４参照）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ等のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３−２６０［１９９３］］；バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ［例えば、ＪＰ６４／７４４９９２参照］；及びバチルスプミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ［例えば、ＷＯ９１／１６４２２参照］）を含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
更に、ペニシリウムカメンバーチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０３：６１−６７［１９９１］参照）、ゲオトリカムカンジダ（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３−３８８［１９８９］参照）、及びリゾプスデルマー（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０９：１１７−１１３［１９９１］参照）、リゾプスニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６−７１９［１９９２］）、及びリゾプスオリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ等の各種リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）リパーゼを含むがこれらに限定されない多くのクローン化されたリパーゼを本発明に用いることができる。
【０１１０】
シュードモナスメンドシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）（ＷＯ ８８／０９３６７参照）由来クチナーゼ、及びフサリウムソラニピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ）（ＷＯ９０／０９４４６参照）由来クチナーゼを含むがこれらに限定されないクチナーゼ等の他のタイプの脂肪分解酵素も本発明の幾つかの態様に用いることができる。
【０１１１】
追加的な好適なリパーゼはＭ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ジェネンコー）；ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「アマノ」（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）として販売されているものを含む。
【０１１２】
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗剤は、組成物の重量に基づいて、約０．００００１％乃至約１０％、のレベルで追加的なリパーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のレベルでリパーゼを含む。
【０１１３】
アルカリ溶液に用いるのに好適な任意のアミラーゼも本発明の幾つかの態様に用いることができる。好適なアミラーゼはバクテリア又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝的に修飾された変異体も幾つかの態様に含まれる。本発明に用いることができるアミラーゼはバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、ＧＢ １，２９６，８３９参照）由来α−アミラーゼを含むがこれらに限定されない。本発明に用いることができる商業的に利用されているアミラーゼはＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）、及びＭＡＸＡＭＹＬ（商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を含むがこれらに限定されない。
【０１１４】
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗剤は更に組成物の重量に基づいて約０．００００１％乃至約１０％のレベルでアミラーゼを含み、他は組成物の重量に基づいて洗浄補助剤を含む。本発明の他の態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて、約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のレベルでアミラーゼを含む。
【０１１５】
幾つかの更なる態様において、任意の好適なセルラーゼが本発明の洗剤に用いることができる。化学的又は遺伝的に修飾された変異体は幾つかの態様に含まれる。好適なセルラーゼはフミコーラインシソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４３５，３０７参照）を含む。特に、好適なセルラーゼは色の処理に有用なものである（例えば、ＥＰ０４６５２５７参照）。本発明に用いることができる商業的に利用されているセルラーゼはＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王コーポレーション）を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、セルラーゼは成熟野生型セルラーゼ又は変異セルラーゼの一部分又はフラグメントとして取り込まれる。ここにおいてＮ末端の部分は欠失されている（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８７４，２７６参照）。幾つかの態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．００００１％乃至約１０％のレベルで追加的なセルラーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて、約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約５％のレベルでセルラーゼを含む。
【０１１６】
任意の好適なマンナナーゼを本発明の洗剤組成物に用いることができる。好適なマンナナーゼはバクテリア又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝的に修飾された変異体も幾つかの態様に含まれる。各種マンナナーゼが当業者に知られており、本発明に用いることができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５６６，１１４、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６０２，８４２、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４４０，９９１参照。これらの文献を参照により本発明明細書に援用する。）幾つかの態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．００００１％乃至約１０％のレベルで追加的なマンナナーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の態様において、本発明の洗剤は組成物の重量にもとづいて、約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のレベルでマンナナーゼを含む。
【０１１７】
幾つかの態様において、ペルオキダーゼが過酸化水素マンナナーゼそれらのソースと一緒に（例えば、ペルカルボネート、ペルボレート、又はペルスフホネート）と組み合わせて本発明の組成物に用いることができる。幾つかの代替的な態様において、オキシダーゼは酸素と一緒に用いられる。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼの例としては、植物、バクテリア、又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて、約０．００００１％乃至約１０％の追加的なペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを含む。
【０１１８】
幾つかの態様において、ペルヒドロラーゼを含むがこれらに限定されない追加的な酵素を用いることができる。（例えば、ＷＯ０５／０５６７８２参照。）更に、幾つかの特定の好適な態様において、前述の酵素の混合物が本発明に含まれ、特に１つ以上の追加的なプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なとも１つのセルラーゼが含まれる。即ち、各種プロテアーゼ及び１つ以上の追加的な酵素を各種レベルで約１０％までそれぞれ用いることができ、他に洗浄補助剤を含むことができる。洗浄補助剤の特定の選択は、洗浄するアイテム及び食器洗浄器を使用する間の洗浄条件に好適な洗剤組成物の形態を考慮して、当業者が決定することができる。
【０１１９】
酵素安定剤
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗剤組成物に用いる酵素を安定化させる。幾つかの態様において、この酵素安定剤はオリゴサッカライド、ポリサッカライド、及びカルシウム塩等のアルカリ土類金属を含む無機二価金属塩を含む。酵素を安定化するための各種技術を本発明に用いることができる。例えば、幾つかの態様において、本明細書で用いる酵素は組成物中に亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオン、並びに他の金属イオン（例えば、バナジウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）及びアキソバナジウム（ＩＩ））の水溶性ソースを存在させることにより安定化される。それらはイオンを酵素に提供する。塩化物及び硫酸塩も本発明の幾つかの態様に用いることができる。好適なオリゴサッカライソ及びポリサッカライド（例えば、デキストリン）の例は当業者に知られている（例えば、ＷＯ０７／１４５９６４参照）。幾つかの態様において、可逆性プロテアーゼインヒビターも用いることができ、そのようなものとしてホウ酸含有化合物がある（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）。必要に応じてトリペプチドアルデヒドも更に安定化させるために用いることができる。
【０１２０】
漂白剤、漂白活性剤、及び漂白触媒
幾つかの態様において、漂白活性剤及び／又は漂白触媒も本発明の組成物中に存在する。幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は無機及び／又は有機漂白化合物の含む。無機漂白剤は過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過カルボン酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、無機過水和物塩は追加的な保護物無しで結晶性固形物として含まれる。幾つかの他の態様において、塩がコートされる。当業者に知られている任意の好適な塩を本発明に用いることができる（例えば、ＥＰ２１００９４９参照）。
【０１２１】
幾つかの態様において、漂白活性剤が本発明の発明の組成物中に用いられる。漂白活性剤は通常６０℃以下の温度での洗浄中、漂白作用を高めることができる有機過酸前駆体である。本発明に用いるのに好適な漂白活性剤はペルヒドロ化条件下で、好ましくは１乃至約１０の炭素数、特に約２乃至約４の炭素数の脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は任意で置換された過安息香酸を提供する化合物を含む。追加的な漂白活性剤は当業者に知られており、本発明に用いることができる。（例えば、ＥＰ２１００９４９参照。）
【０１２２】
更に、幾つかの態様及び更なる説明において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの漂白触媒を含む。幾つかの態様において、コバルト、銅、マンガン、及び鉄錯体のほかに、マンガントリアザシクロノナエート及び関連する化合物が本発明を本発明に用いることができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，２４６，６１２、５，２２７，０８４、４，８１０４１０、ＷＯ ９９／０６５２１、及びＥＰ２１００９４９参照。）
【０１２３】
触媒金属錯体
幾つかの態様において、本発明の洗剤は１つ以上の触媒金属錯体を含む。幾つかの態様において、金属含有漂白触媒を用いる。幾つかの好適な態様において、金属漂白触媒は定義された歯用は組み合わせ触媒活性の遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンカチオン）、僅かな又は漂白活性を有しない補助的な金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒及び補助的な金属カチオン、特にエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミン三（メチレンリン酸）に対して決まった安定度定数を有する抑制剤を含み、これらの水溶性塩も用いることができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，４３０，２４３参照。）幾つかの態様において、本発明の洗剤はマンガン化合物により洗浄効果が促進される。そのような化合物及びその含有量は当業者に知られている。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，５７６，２８２参照。）追加的な態様において、コバルト漂白触媒が本発明の洗剤に用いることができる。各種コバルト漂白触媒が当業者に知られており（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５９７，９３６及び５，５９５，９６７参照）、既知の方法で調整することができる。
【０１２４】
追加的な態様において、本発明の洗剤はポリ大環状剛性リガンド（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。実施するにあたり、方法を限定するわけではないが、幾つかの態様において、本発明の組成物及び洗浄方法は水溶性洗浄媒体の中に活性ＭＲＬ種は少なくとも百万の１部のオーダーになるように調整される。幾つかの好適な態様において、洗浄溶液中ＭＲＬは約０．００５ｐｐｍ乃至約２５ｐｐｍ、より好ましくは約組み合わせ０．０５ｐｐｍ乃至約１０ｐｐｍ、及び最も好ましくは約組み合わせ０．１ｐｐｍ乃至約５ｐｐｍに調整される。
【０１２５】
本発明に用いる遷移金属漂白活性剤に好適な遷移金属は、マンガン、鉄、及びクロムを含むがこれらに限定されない。好適なＭＲＬは架橋された超剛性リガンドを含むがこれらに限定されない。（例えば、５，１２−インデニル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）好適な遷移金属ＭＲＬは当業者により調整される。（例えば、 ＷＯ ２０００／３２６０１、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２２５，４６４参照。）
【０１２６】
金属処理剤
幾つかの態様において、本発明の洗剤は金属処理剤含む。金属処理剤はアルミニウム、ステンレス、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）を含む金属の変色、腐食、及び／又は酸化を避ける及び／又は減らすために用いる。公的な金属処理剤はＥＰ ２ １００ ９４９、ＷＯ９４／２６８６０、及びＷＯ９４／２６８５９に記載のものを含む。幾つかの態様において、金属処理剤は亜鉛塩である。幾つかの更なる態様において、本発明の洗剤は重量により約０．１％乃至約０．５％の１つ以上の金属処理剤を含む。
【０１２７】
洗剤の製造方法及び使用
本発明の洗剤は任意の好適な形態に製剤化することができ、製造者により選択された任意の好適な方法で調整することができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８７９，５８４、５，６９１，２９７、５，５７４，００５、５，５６９，６４５、５，５６５，４２２、５，５１６，４４８、５，４８９，３９２、５，４８６，３０３、４，５１５，７０５、４，５３７，７０６、４，５１５，７０７、４，５５０，８６２、４，５６１，９９８、４，５９７，８９８、４，９６８，４５１、５，５６５，１４５、５，９２９，０２２、６，２９４，５１４、及び６，３７６，４４５参照。）
【０１２８】
幾つかの態様において、本発明の洗剤は、タブレット、カプセル、小袋、及び複数に区分された小袋を含む単回投与形態で提供される。幾つかの態様において、この単回投与形態は複数に区分された小袋（又はたの単回投与形態）内で成分の放出を制御できるように設計されている。好適な投与単位及成分の放出を制御する製剤は当業者に知られている。（例えば、ＥＰ２１００９４９、ＷＯ０２／１０２９５５、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，７６５，９１６、及び４，９７２，０１７、並びにＷＯ０４／１１１１７８参照。）
【０１２９】
幾つかの好適な態様において、本発明の洗浄組成物は表面及び／又は布を洗浄することに用いることができる。幾つかの態様において、表面及び／又は布の少なくとも一部分は本発明の洗浄組成物の少なくとも１つの形態と、直接又は水に希釈された形態で接触して、その後この表面及び／又は布が任意で洗浄及び／又はすすがれる。本発明の目的のために、「洗浄」の語は手で洗うこと及び機械的撹拌を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、この布は通常の使用条件下で洗濯可能な任意の布を含む。好適な態様において、本発明の洗浄組成物は溶液中約５００ｐｐｍ乃至１５，０００ｐｐｍの濃度で用いられる。幾つかの態様において、洗浄媒体が水である場合、水の温度は通常約５℃乃至約９０℃である。布洗浄のために好適な態様において、水対布の容量比は約１：１乃至約３０：１の範囲である。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、特定の好適な態様及び本発明の特定の態様を示し、更に説明するために提供される。本発明はこれらの特定の態様に限定することは意図しない。
【０１３１】
以下の実施例において、以下の略語を用いる。
ｐｐｍ（１００万分の１）；Ｍ（モルの）；ｍＭ（ミリモルの）；μＭ（マイクロモルの）；ｎＭ（ナノモルの）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；μｌ及びμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ （秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）；℃（摂氏）；ＱＳ（十分量）；ＮＤ（実施していない）；ＮＡ（適用せず）；ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）；ｗ／ｖ（容量対重量）；ｖ／ｖ（容量対容量）；ｇ（比重）；ＯＤ（光学密度）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（ベースペア）；ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）；ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロイルＬ−フェニル−アラニル−パラニトロアニリド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（２本鎖 ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩化水素）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＢ９２（バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）スブチリシン）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，１０ ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ ７．２］）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＣＲ（ポリメーラゼ連鎖反応）；ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＳＯＣ（２％ バクト−トリプトン，０．５％ バクト酵母抽出液，１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ ｍＭ ＫＣｌ）；テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ；１２ ｇ／ｌ バクトトリプトン，２４ ｇ／ｌ グリセロール，２．３１ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４，及び１２．５４ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４）； ＯＤ２８０ （２８０ｎｍにおける光学密度）；ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学密度）；Ａ４０５（４０５ ｎｍにおける吸光度）；Ｖｍａｘ（酵素触媒反応の初期最大速度）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （トリス［ヒドロキシメチル］アミノエタン−ヒドロクロリド）；ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン三酢酸）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）；ＴＡＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラアセチルエチレンジアミン）；ＰＩ（性能インデックス）；ＳＲ（汚れ除去）；ＭＳ（マススオエクトロコピー）；ＡＡＴＣＣ（米国繊維化学者・色彩技術者協会）；Ａｒｚｂｅｒｇ（Ａｒｚｂｅｒｇ−Ｐｏｒｚｅｌｌａｎ ＧｍｂＨ， Ｓｃｈｉｒｎｄｉｎｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．， Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ， ＮＪ）；ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）；Ｃｏｇｎｉｓ（Ｃｏｇｎｉｓ Ｃｏｒｐ， ＵＳＡ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ， Ｅｓｐｏｏ， Ｆｉｎｌａｎｄ）；Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ， Ｉｎｃ．， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）；Ｈｅｎｋｅｌ（Ｈｅｎｋｅｌ， ＧｍｂＨ， Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＩＫＷ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｖｅｒｂａｎｄ Ｋβｒｐｅｒｆｌｅｇｅ ｕｎｄ Ｗａｓｃｈｍｉｔｔｅｌ，＝Ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ， Ｔｏｉｌｅｔｒｙ， Ｐｅｒｆｕｍｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）；Ｋｏｎｔｒｏｎ（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｚｕｒｉｃｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ （Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ） Ｍｉｅｌｅ（Ｍｉｅｌｅ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ｉｎｓｔｉｒｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘ， Ｃｏｄｅｘ， ＦＲ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）；（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ， Ｂｅｒｋｓ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）；Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ａ ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ ｏｆ ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）；ａｎｄ ｗｆｋ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）
【０１３２】
実施例１
スブチリシン変異体の構築
スブチリシン変異体は既知の融合ＰＣＲにより調製した。（例えば、ＵＳ Ｐｕｂｌｎ． Ｎｏ．２００６／０２５２１５５参照。該文献を参照により本明細書に援用する。）表１−１は融合ＰＣＲで用いたプライマーの配列を提供する。
【表３】
【０１３３】
バチルスクラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢ９変異体（Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａの置換を含む、番号はＢＰＮ番号付けを用いた、以下「ＧＣＩ−Ｐ０４０」と呼ぶ）のＤＮＡテンプレートを用いて、Ｓ１０１Ｍ置換を含むＰＢ９２プロテアーゼ変異体を生成した。（以下ＥＲ１１とする。）ＥＲ１１に等しいアミノ酸配列を有する変異体をバチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）ＧＧ３６変異体（Ｓ８７Ｎ＋Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０の置換を含む；ＢＰＮ番号付けを参照）のＤＮＡテンプレートから生成することもできる。
【０１３４】
ＧＧ３６プロテアーゼ前駆体をコードしている合成遺伝子は合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物から構築された。フラグメントをＢｓｍＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてプラスミド骨格ｐＨＰＬＴ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，０２４，９４３）でクローン化した。ｐＨＰＬＴバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴ（Ｐｌａｔ）並びに複製遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、及びブレオマイシン体制遺伝子（ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍｉｄ， １５： ９３−１０３， １９８６）由来の追加的エレメントを含む。ＧＧ３６プロテアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示すＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を下線で示す。
【化１】
【０１３５】
ＧＣＩ−Ｐ０４０のＤＮＡを初めに以下のようにｐＨＰＬＴ発現ベクターへサブクローンした。簡単に説明すると、２μｌの１０ｍＭ ＳａｃＩ−Ｆｗ及びＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒｖ プライマー、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１０μｌの５ＸＨＦ融合緩衝液、１．５μｌのＤＭＳＯ、１単位Ｐのｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、及び１μｌのＰＢ９２Ｖ変異体０４９テンプレートＤＮＡを添加して最終容量を５０μＬとした。以下のプログラムを用いた：９５℃で３分の変性工程、６５℃で１分のアニーリング工程、及び７２℃で３０秒の延伸工程を３０サイクル行い、次いで７２℃を７分行った。完了後、反応生成物を室温で貯蔵した。増幅された直鎖８５９ｂｐのフラグメントをＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（商標）カタログＮｏ．２８１０６）で精製し、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化して、フラグメントの両端に結合性のある末端を生成した。
【０１３６】
約５０ｎｇのプラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６をＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した。３．９ｋｂのベクター骨格フラグメントを単離し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて結合性末端のクローニングについての仕様書に従って、約５０ｎｇＧＣＩ−Ｐ０４０スブチリシンをコードしている消化された８５９ｂｐフラグメントに結合した。リゲーション混合物を用いてバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（表現型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ］）を形質転換した。キシロース誘発プロモーターの下でｃｏｍＫ遺伝子を発現させてこのバクテリアをコンピテントにした。（例えば、Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２１：７６３−７７５，１９９６参照。）
【０１３７】
ＧＣＩ−Ｐ０４０スブチリシン（配列番号８）をコードしている発現ベクターをＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲ技術を用いて、Ｓ１０１位置（ＢＰＮ番号付け）に変異を生成するためのテンプレートとして引き続き用いた。ＢｇｌＩＩ−Ｆｗを第一反応においてＳ１０１Ｘ−Ｒｖプライマーと結合せて、第一フラグメントを生成した。第二フラグメントは第二反応においてＢｇｌＩＩ−Ｒｖ プライマー及びＳ１０１Ｘ−Ｆｗプライマーを組み合わせて生成した。延伸時間を１分１５秒に増やした以外は、ＰＣＲ条件は前述のものと同様であった。
【０１３８】
２つのＰＣＲ反応からの予測されたサイズのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ精製カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてアガロースゲルから精製した。この２つの所望のフラグメントをＢｇｌＩＩ前方向及び後方向プライマー並びにＰＨＵＳＩＯＮ（商標）ポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ増幅により融合させた。以下のプログラムを用いた。９５℃で３分間の変性、６５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で２分間の延伸、これらを２５サイクル行い、７２℃で７分。完了後、反応生成物を室温で貯蔵する。
【０１３９】
融合ＰＣＲ反応からのＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩＩ制限酵素で消化して生成し、アガロースゲルで精製した。このＤＮＡフラグメントを最終容量４０μｌ中に１μｌＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び８μｌの５ＸＴ４リゲーション緩衝液を含む溶液中で１４℃一晩放置して、ＢｇｌＩＩ消化したｐＨＰＬＴ プラスミド骨格に結合した。
【０１４０】
コンピテントバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ： ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ］）を１０μｌのリゲーション生成物を用いて形質転換して、当業者に知られているようなプロテアーゼ陽性変異体を生成した。（例えば、ＷＯ０２／１４４９０参照。）キシロース誘発プロモーターの下でｃｏｍＫ遺伝子を発現させてこのバクテリアをコンピテントにした。（例えば、Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２１：７６３−７７５，１９９６参照。）
【０１４１】
プロテアーゼ陽性クローンをスキムミルク／アガロースプレート上で選択して、単離して、配列決定した。タンパク質は振とうフラスコ内で酵素の相当量を生成して、特徴付けのための試験に用いた。
【０１４２】
実施例２
バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるスブチリシン変異体の生成
バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体を１０ｍｌのＴＳＢ（トリプトン及びダイズブロス）培地中で３７℃一晩育成してスブチリシン変異体を生成した。一晩培養物の２５０μＬのアリコートを１００ｍｌ振とうフラスコ中にある２５ｍｌのＭＯＰＳベース既成培地に移し、３７℃で６８時間育成した。この既成培地は、ＮＨ４Ｃｌ２、ＦｅＳＯ４、及びＣａＣｌ２が取り除かれ、３ｍＭＫ２ＨＰＯ４を用いている以外は当業者に知られているものである（例えば、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１９：７３６−７４７，１９７４参照。）この培地は、６０ｍＭ尿素、７５ｇ／Ｌグルコース、及び １％ソイトンを補っている。微量元素は１００倍ストックとして調製した。該ストックは１リットル当たり４００ｍｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣＯＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ のＮａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの１ＭＣａＣｌ２、及び１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムを含む。所望のプロテアーゼは培養培地から単離された。
【０１４３】
実施例３
スブチリシンサンプルの精製度を決定するための解析方法
この実施例において、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養物から得られた組換えスブチリシンの精製度を決定するために用いる方法を説明する。ゲル電気泳動及び高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）において、それぞれ単一のバンド及びピークが検出されたときにプロテアーゼは精製されたと考えられる。
【０１４４】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を当業者に既知の手順で行った。（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７：６８０−６８５，１９７０）しかしながら、自動分解を防ぐために、タンパク質サンプルの変性（例えば、１００℃のＳＤＳ含有サンプル緩衝液中で１０分）前に、プロテアーゼ活性を失活させる必要がある。プロテアーゼの失活は１ｍＭＰＭＳＦでプロテアーゼサンプルを３０分インキュベートするか、３０分間氷上で８％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でタンパク質を沈殿させることで達成することができる。タンパク質サンプルはｐＨ７．４５で行われる通常のＰＡＧＥにかけられた。ゲル緩衝液は２０ｍＭヒスチジン及び５０ｍＭの３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなり、ポリアクリルアミドゲルは、２０：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド比を有する。タンパク質サンプルをスラブゲルのトップに置いて、陰極に向かって電気泳動させた。サンプルヒスチジン／ＭＯＰＳ緩衝液はｐＨ６．３に調整して電気泳動（タンク）緩衝液として用いた。電気泳動に続いて（〜１乃至２時間、３５０Ｖ）、このゲルを８％酢酸溶液中に浸してタンパク質を固定した。ついでクマシーブルーＲ２５０でゲルを脱色して、既知の方法で脱色を行いタンパク質のバンドを確認した。
【０１４５】
タンパク質サンプル精製度は、ＭｏｎｏＳカチオン交換カラム、次いでＴＳＫ２０００ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ解析により確認することもできる。前者は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で行い、結合タンパク質の溶出は１０乃至３００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．５の勾配を用いて行う。ゲルろ過カラムは０．２５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５で行う。タンパク質溶出プロファイルは２８０ｎｍでモニターして、所望のタンパク質の位置及びサンプルの精製度をモニターした。
【０１４６】
実施例４
スブチリシン濃度の決定
この実施例において、スブチリシン濃度の決定に用いる方法を説明する。幾つかの実験において、計算された消滅係数（ε［イプシロン］）を用いて２８０ｎｍで消滅測定を行った。活性部位の力価は以下で説明するように、精製されたプロテアーゼ溶液におけるタンパク質濃度を決定するために用いた。
【０１４７】
２８０ｎｍでの消滅係数は酵素１分子当たりのトリプトファン（Ｔｒｐ、ε＝５，６００Ｍ−１．ｃｍ−１）及びチロシン（Ｔｙｒ，ε＝１，３３０Ｍ−１．ｃｍ−１）の数から計算される。ＰＢ９２プロテアーゼでは、分子消滅係数は２６，１００ Ｍ−１．ｃｍ−１（３Ｔｒｐ＋７Ｔｙｒ残基）であり、２８０ｎｍ＝９．７（Ｍｒ＝２６，７２９Ｄａ）で測定されるε １％に等しい。変更された数のトリプトファン及び／又はチロシン残基の数を有する変異体の場合、補正がなされる。
【０１４８】
活性酵素分子の評価は活性部位滴定により得られる。広く用いられているＮ−トランスシナモイルイミダゾール（ｔｒａｎｓｃｉｎｎａｍｏｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）によるアクリル化方法（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ８８：５８９０−５９３１， １９６６）はＰＢ９２プロテアーゼには不適であるため、不可逆性インヒビターＰＭＳＦを変りに用いた。この方法において（２８０ｎｍでの吸光度から）酵素濃度が分かっているプロテアーゼ溶液を０．２５、０．５０、０．７５、１．００、及び１．２５のＰＭＳＦ当量になるように調製し、室温、ｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で１時間反応させた。残余プロテアーゼ活性をスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−アラニル−パラ−ニトロアニライド （ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を基質として分光光度計で測定した。これらの実験において、ＰＭＳＦの精製度（及び濃度）はＮＭＲスペクトロコピーで測定して、ＰＭＳＦのストック溶液はイソプロパノールで調製した。活性部位滴定の結果はＨＰＬＣ法を用いて調べたタンパク質濃度の結果と一致していた。
【０１４９】
実施例５
洗浄性能試験
この実施例において、スブチリシン変異体ＥＲ１１及び商業的に利用されている食器用洗剤に用いられているＧＣＩ−Ｐ０３８対照スブチリシンの洗浄性能を評価するのに好適な方法を説明する。
【０１５０】
本明細書においてＥＲ１１と呼ばれるＳ１０１Ｍ＋Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ（ＢＰＮ番号付け）の置換を含む成熟ＰＢ９２プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を以下に示す。
【化２】
【０１５１】
成熟ＧＣＩ−Ｐ０３７（ＰＢ９２）対照スブチリシンのアミノ酸配列を以下に示す。
【化３】
【０１５２】
成熟ＧＣＩ−Ｐ０３８対照スブチリシンのアミノ酸配列を以下に示す。
【化４】
【０１５３】
マイクロスウォッチアッセイによる布洗浄性能
この実施例において、スブチリシン変異体ＥＲ１１及び商業的に利用されているＧＣＩ−Ｐ０３８対照シブチリシンの洗浄性能を測定するための方法を説明する。
【０１５４】
スブチリシン変異体の汚れ除去性能を市販の洗剤においてマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）スケールで決定した。対照スブチリシンとスブチリシン変異体とサンプルをＭＴＰプレートで。３日間、３７℃／３００ｒｐｍ、９０％湿度で培養した培養ブロスをろ過して得た。用いた装置は、９６ウェルマイクロタイタープレート（カタログＮｏ．９０１７媒体結合フラットボトム）、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｌｕｓ ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）
１ｍｍ振幅（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びシーリングテープ（Ｎｕｎｃ Ｎｏ．２３６３６６）である。試薬は、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０又は５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７緩衝液、中程度の硬度にするためにＣａ：Ｍｇを３：１にした。（ＣａＣｌ２：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）；１ガロン当たり１５０００グレイン（ｇｐｇ）を６ｇｐｇに希釈したもの；１プレート当たり２つのＢＭＩ（血液／ミルク／インク）汚れ見本：ＣＦＴのＥＭＰＡ−１１６ＢＭコットン汚れ見本：予めすすいで穴をあけた見本を１ウェルあたり２つ：熱失活させたＴＩＤＥ（商標）２Ｘ冷水用洗剤（プロテアーゼ活性がないことを確認したもの）。このアッセイにおいて、基質をプロテアーゼが加水分解して顔料及び不溶性の汚れを基質から剥がす。
【表４】
【０１５５】
インキュベーターを１６℃又は３２℃の所望の温度に設定し、１０ｐｐｍまでの酵素濃度の希釈されたマスタープレートから１０μｌのサンプルを採取して、１９０μｌのワーキング洗剤媒体中にあるＢＭＩの２つの汚れ見本のプレートに添加した。この容量を試験するアッセイプレート中で最終濃度が０．５ｐｐｍになるように調整した。この汚れ見本プレート（洗剤及び酵素を含む）をテープで多い、４００ｒｐｍのインキュベーター／シェーカー中に３０分間置いた。インキュベーションの後、１００μｌの上清を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４０５ｎｍ及び／又は６００ｎｍの吸光度をＭＴＰリーダーで測定した。４０５ｎｍの測定は高い値を示すと顔料が除去されていることを示し、６００ｎｍの測定値はだ濁度及び洗浄性能を示す。
【０１５６】
汚れ除去活性の計算
得られた吸光度の値をブランク値（酵素なしの基質）で補正して、加水分解活性の測定値を提供する。各サンプル（変異体）のために、性能インデックス（ＰＩ）を計算した。性能インデックスは変異体の性能（実際の値）及び対照酵素の性能（理論値）を同じタンパク質濃度で比較する。更に、標準酵素のラングミュア方程式のパラメーターを用いて理論値を計算する。１よりおおきい性能インデックス（ＰＩ＞１）は標準（例えば、野性型）と比較して、好ましい変異体であることを示し、１のＰＩ（ＰＩ＝１）は標準と同じ性能の変異体であることを示し、１より小さいＰＩ（ＰＩ＜１）は標準よりも悪い変異体を示す。したがって、ＰＩで特定の環境に用いるのに、好ましいもの、好ましくないものを同定することができる。
【０１５７】
実施例６
液体洗濯洗剤組成物
この実施例において、液体洗濯洗剤組成物のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表５】
【表６】
【０１５８】
実施例７
手洗い用液体食器洗浄組成物
この実施例において、手洗い用液体食器洗浄組成物のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表７】
【０１５９】
実施例８
顆粒及び／又はタブレット洗濯用組成物
この実施例において、顆粒及び／又はタブレット洗濯用組成物のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表８】
【表９】
【０１６０】
実施例９
液体洗濯洗剤
この実施例において、液体洗濯洗剤のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１０】
【表１１】
【０１６１】
実施例１０
高濃度食器洗浄洗剤
この実施例において、高濃度食器洗浄洗剤のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１２】
【表１３】
【０１６２】
実施例１１
タブレット洗剤組成物
この実施例は各種タブレット洗剤製剤を提供する。本発明のタブレット洗剤組成物を標準的な１２ヘッドロータリープレスを用いて１３ＫＮ／ｃｍ２の圧力で顆粒食器洗浄組成物を圧縮して調製した。それぞれの製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１４】
【表１５】
【０１６３】
実施例１２
液体硬表面洗浄洗剤
この実施例において、液体硬表面洗浄洗剤のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１６】
【０１６４】
明細書に記載された全ての特許と刊行物は、発明の属する技術分野の技術者の水準を示す。全ての特許と刊行物は、各個の刊行物が、特定されかつ個別に引用により組み込まれる場合と同程度に引用により本明細書に組み入れられる。本願発明の好ましい実施態様を述べたので、本願発明の技術分野の通常の技術者には、開示された実施例に種々の変更が行われることができることが明らかであろう。そしてそのような変更は本願発明の範囲内にあることを意図している。
【０１６５】
本明細書に説明のため述べられた発明は、本明細書に特定して開示されていないいずれの発明特定事項、限定もない条件で実施できる。使用された用語及び表現は記述のための用語として使用されており、限定のためではなく、かつそのような用語と表現の使用は、明らかにされかつ述べられた特徴と等価なものまたはその一部と等価なものを排除する意図はなく、むしろ、特許を請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。従って、本願発明は好ましい実施態様と任意の特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修飾、変更は本願発明の技術分野の技術者に委ねられ、且つそのような
【０１６６】
本発明は本明細書に広く、属に関して述べられてきた。属の開示の範囲内にあるより狭い範囲の種及び属より下位の分類のそれぞれもまた本発明の一部を形成する。これには、除外されるものが本明細書で特定して記載されていたか否かに拘らず、当該属からいずれかのものを除外する条件または否定的限定（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を付した発明についての属に関する記述が含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本願は２００８年１１月１１日に提出されたＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｄｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｎ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．６１／１１３，５６１に対して優先権を主張する。該文献を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属スブチリシン変異体を提供する。更に、本発明はセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物も提供する。幾つかの態様において、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む洗濯用又は非自動（即ち、手洗い用）食器洗浄組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
洗浄組成物の酵素及び他の成分の開発において多くの研究及び調査がなされているにもかかわらず、布製品からタンパク質性の汚れを効果的に除去する布製品用の洗浄組成物に対する必要性が存在している。更に、手洗い用食器洗浄製品（即ち、自動食器洗浄ではない）において、効果的な食器洗剤組成物についての必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００４】
本発明はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属スブチリシン変異体を提供する。更に、本発明はセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む洗濯用又は非自動（即ち、手洗い用）食器洗浄組成物を提供する。
【０００５】
本発明は単離されたスブチリシン変異体を提供する。該変異体は配列番号８で定義されるアミノ酸配列を含む成熟形態である。本発明の発明はこの変異体を含む手洗い用洗浄組成物及び該変異体を含む布洗浄組成物を提供する。幾つかの態様において、この洗浄組成物は洗濯洗剤である、幾つかの態様において、この洗浄組成物は手洗い用食器洗剤である。幾つかの態様において、この洗剤は液体であり、他の態様において、この洗剤は粉末、顆粒、又はタブレットである。幾つかの態様において、この組成物はリン酸塩を含まない。幾つかの態様において、この組成物は更に少なくとも１つの漂白剤を含む。幾つかの好適な態様において、手洗い用食器洗浄組成物及び布洗浄組成物は更に少なくとも１つの追加的な酵素を含む。この酵素はヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、メタプロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フォノロオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータグルコシダーゼ、アラビノキシラーナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はこれらの混合物から選択される。
【０００６】
本発明は食器又は洗濯物及び配列番号８で定義されるアミノ酸配列を有するスブチリシン変異体を含む、手洗い用食器洗浄組成物又は布洗浄組成物を提供する工程、並びに食器又は洗濯物をこれらの洗浄組成物に接触させる工程を含む洗浄方法も提供する。該方法は更に、洗浄された食器又は洗濯物をすすぐ工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
本発明はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スブチリシン変異体を提供する。更に、本発明はこのセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供する。幾つかの態様において、本発明はセリンプロテアーゼ変異体を含む洗濯及び他の非自動（即ち、手洗い）食器洗浄組成物を提供する。
【０００８】
特に定義しない限り、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質エンジニアリング、タンパク質及びＤＮＡ配列決定、組換えＤＮＡ分野、工業的な酵素の使用及び開発の分野において、当業者の知識の範囲内である技術を用いて行う。本明細書に記載されている全ての特許、特許出願、文献、及び刊行物は参照により本明細書に援用される。
【０００９】
更に、ここに記載されている標題は本発明を限定するために用いるものではない。本発明は明細書全体を参照することにより理解されなければならない。従って、以下で説明する各種用語の定義は、明細書全体を参照することによりより深く理解される。しかしながら、発明の理解を促進するために以下で多くの用語を説明する。
【００１０】
別途定義しない限り、本明細書で用いる化学的及び技術的用語は本発明の属する技術分野における当業者により通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｋｈａｍ，ＴＨＥ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は本発明で用いる数多くの用語についての辞書であり、当業者はこれを参照することができる。本明細書で定義する方法及び材料と類似の又はこれらに等しいものを本発明の実施にもちいることができるけれども、好適な方法及び材料を本明細書で説明する。従って、以下で定義されている用語は明細書全体を参照することによりより深く理解されるであろう。本明細書において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数について用いる冠詞は、別途定義しない限り、複数も含む。別途定義しない限り、核酸は左から右に向かって、５’末端から３’末端を表し、アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端方向に標記する。当業者が本発明の実施に用いるものにより、本明細書で説明する方法、手順、試薬は変化し得るので、本発明に用いるこれらのものを、開示されている特定のものに限定されることがないことは理解されるであろう。
【００１１】
本明細書に記載の全ての数値の上限値は全てのより低い数値の限定を含み、そのような低い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書における各最小の数値限定はより高い数値限定を含み、そのようなより高い数値限定は本明細書に記載されているものとする。本明細書に記載の全ての数値範囲はその範囲内のより低い数値範囲を含み、そのようなより狭い数値範囲は本明細書に記載されるものとする。
【００１２】
本明細書において、「相性のよい」の語は洗剤組成物が、本明細書で提供されるプロテアーゼ酵素の酵素活性を、通常の使用条件の間に効果的ではなくなるほどに低減させないことを意味する。特定の洗剤組成物を以下で詳述する。
【００１３】
本明細書において、「効果的な量の酵素」の語は特定の製品において必要とされる酵素活性を達成するために必要とされる酵素の量を意味する。そのような効果的な量は当業者が容易に決定することができ、用いる特定の酵素変異体、洗浄用製品、洗剤組成物の特定の成分、及び組成物生物が液状か又は乾燥物（例えば、顆粒）が必要であるか否か等の多くの因子に基づいている。
【００１４】
本明細書において、「変異プロテアーゼ」についても用いる「改善された性質を有する」の語は、改善された性能及び／又は野生型プロテアーゼの対応してその性能を維持しつつ改善された安定性を有するタンパク質分解酵素を意味する。幾つかの特に好適な態様において、この改善された性質は改善された食器洗浄能力と改善された安定性の組み合わせのほか、改善された食器洗浄能力と改善された安定性からなる群より選択される。
【００１５】
本明細書において、「洗剤安定性」の語は洗剤組成物の安定性を意味する、幾つかの態様において、この安定性は洗剤の使用の間に評価される。他の態様において、この語は貯蔵の間の洗剤組成物の安定性を意味する。
【００１６】
「改善された安定性」の語は、貯蔵の間及び／又は泡の中における変異プロテアーゼのよりよい安定性を意味する。好適な態様において、この変異体プロテアーゼは、食器用洗剤の貯蔵の間及び／又は泡の中において、改善された食器用洗剤中の安定性を有しており、対応する野生型酵素に対して、酸化安定剤、金属イオン封鎖剤、自己消化、界面活性剤、及び高いアルカリ性に対する安定性を有している。
【００１７】
本明細書において、「タンパク質分解に対する安定性」の語は、タンパク質分解に抵抗するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。この語をタンパク質安定性を評価する特定のプロテアーゼの使用に限定することを意図するものではない。
【００１８】
本明細書において「酸化安定性」の語は酸化条件下で機能のするタンパク質の能力を意味する。特に、この語は、Ｈ２Ｏ２、過酸、及び他の酸化物の各種濃度の下で機能するタンパク質の能力を意味する。各種酸化条件下での安定性は当業者に既知の方法により、及び／又は本明細書で説明する方法により評価することができる。酸化安定性が大きく変化したということは、酸化化合物が存在しないときの酵素活性と比較してその酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加したか、又は減少したかにより明らかとなる。
【００１９】
本明細書において「ｐＨ安定性」の語は、特定のｐＨで機能することができるタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素は、それらが機能する明確なｐＨ範囲を有する。中性範囲のｐＨ（即ち、ｐＨ７付近）で機能する酵素に加えて、非常に高い又は非常に低いｐＨ条件下で作用することができる酵素もある。各種ｐＨ条件下での安定性は当業者に既知の方法及び／又は本明細書で説明する方法で評価することができる。ｐＨ安定性が大きく変化したということは、最適ｐＨで酵素活性と比較した場合、酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）していることにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定のｐＨ安定性レベル又はｐＨ範囲に限定することは意図しない。
【００２０】
本明細書において、「熱安定性」の語は特定の温度で機能するタンパク質の能力を意味する。通常、大部分の酵素はそれらが機能する温度の限界配位を有している。中程度の温度（例えば、室温）で機能する酵素のほかに、非常に高い又は低い温度で機能することができる酵素も存在する。熱安定性は当業者に既知の方法及び本明細書で説明する方法で評価することができる。熱安定性が相当変化したということは所与の温度に曝された変異体の酵素活性の半減期が少なくとも５％以上増加又は減少（大部分の態様において、増加することが好ましい）しているこことにより裏付けられる。しかしながら、本発明を特定の熱安定性レベル、又は特定の温度範囲に限定することは意図しない。
【００２１】
本明細書において、「化学安定性」の語はタンパク質の活性に有害な化学薬品に対するタンパク質（例えば、酵素）の能力を意味する。幾つかの態様において、そのような化学薬品は過酸化水素、過酸、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、キレート剤等を含むがこれらに限定されない。しかしながら、本発明を特定の化学薬品安定性又は特定の安定性の範囲に限定することは意図しない。
【００２２】
本明細書において、「精製された又は単離された」の語はサンプルから不純物を除去することを意味する。例えば、所望の酵素は、他の不純物タンパク質及び溶液又は調製物の中から所望の酵素ではない、他の成分を除去することにより精製される。幾つかの態様において、所望の組換え酵素がバクテリア又は糸状菌宿主細胞内で発現され、これらの所望の組換え酵素は他の宿主細胞の成分を除去して精製される。所望の組換え酵素のパーセンテージはこのサンプル中で増加する。
【００２３】
本明細書において、「所望のタンパク質」の語は、解析、同定、及び／又は修飾されるタンパク質（例えば、酵素又は所望の酵素）を意味する。組換え（例えば、変異）タンパク質のほか自然発生タンパク質も本発明に用いることができる。本明細書において、「タンパク質」の語は、当業者によりタンパク質として認識されているアミノ酸からなる任意の組成物を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は本明細書において互換的に用いられる。ポリペプチドがタンパク質の一部である場合、当業者は文脈上理解することができる。
【００２４】
本明細書において、「発現ベクター」の語は好適な宿主細胞において、ＤＮＡの発現に影響を与える好適な制御配列に作動可能に結合しているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写に影響を及ぼすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、転写及び翻訳の停止を制御する好適なｍＲＮＡリボゾーム結合部位及び配列をコードする配列を含む。このベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に可能性のある遺伝子挿入でもよい。一旦好適な宿主細胞に形質転換されると、ベクターは複製して、独立的に宿主細胞ゲノムの機能を果たす、又は幾つかのケースにおいて、ゲノム自信に取り込まれる。このプラスミドが現在最も一般的なベクターの形態であることから、本明細書において、「プラスミド」、「発現プラスミド」、及び「ベクター」の語は同じ意味に用いる。しかしながら、当業者において、等しい機能を提供する、及び等しい機能である、又は等しい機能となりうる他の発現ベクターの形態も含むことを意図する。
【００２５】
幾つかの好適な態様において、プロテアーゼ遺伝子は適切な発現プラスミドに結合される。クローン化されたプロテアーゼ遺伝子を融合し、宿主細胞を形質転換又は形質変換して、プロテアーゼ遺伝子を発現させる。このプラスミドは、プラスミドの複製に必要なよく知られた要素を含でいるか、又はこのプラスミドは宿主染色体に取り込まれるように設計されているので、宿主細胞内で複製することができる。必要なエレメントは効率的な遺伝子発現（例えば、所望の遺伝子に作動可能に結合しているプロモーター）のために提供される。幾つかの態様において、これらの必要なエレメントは、認識されるならば（すなわち、宿主細胞による転写）遺伝子自身の相同プロモーターとして、及び外来性転写ターミネーターとして供給されるか、あるいはプロテアーゼ遺伝子の内因性転写領域により供給される。幾つかの態様において、抗生物質含有培地中での育成によるプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養を維持することができる抗生物質耐性遺伝子等の遺伝子選択も含む。
【００２６】
幾つかの態様において、他の方法も用いることができるが、以下で説明するカセット変異誘発方法は、本発明のプロテアーゼ変異体を構築するのに用いられる。第一に、タンパク質をコードしている自然発生遺伝子を入手し、全体あるいは一部の配列を決定する。それから、コードされているタンパク質中に１以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を作成するために適した場所をスキャンする。この場所にフランキングしている配列は、発現したときに各種変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールを用いて、遺伝子短断片を置換するための制限部位があるかどうか評価される。そのような制限部位は、好ましくは、遺伝子セグメントの置換を促進するためのタンパク遺伝子内の特徴的な部位である。しかしながら、アミラーゼ遺伝子中にあまり多く存在しない任意の制限部位を用いることもできる。制限消化によって、生成する遺伝子断片は、所望の配列中で再構築することもできる。もし、制限部位が、選択されたポイントから便利な距離（１０から１５ヌクレオチド）に存在しないときは、最終的な構築物中のリーディングフレームまたはアミノ酸のいずれも変化させずに、遺伝子中の核酸配列のヌクレオチドの置換によって、そのような部位を生成することができる。対象とする配列を確認するために、その配列を変化させるための遺伝子の変異は、既知の方法であるＭ１３プライマーを伸長させることによって行うことができる。適切なフランキング領域の位置決め、及び、２の簡便な制限部位配列で必要な変異を発現させるための評価の作業は、遺伝子コードの余剰量（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）、遺伝子の制限酵素マップ、及び、多くの異なる制限酵素を用いた、ルーチン作業で行うことができる。もし、簡便な制限フランキング部位が使用可能であるならば、上記方法は、サイトを含まないフランキング領域の結合にのみ用いる。一旦自然発生ＤＮＡ又は、合成ＤＮＡがクローン化されると、変異位置に隣接している制限部位が同じ起源の制限酵素を用いて消化され、エンド末端に相補的なオリゴヌクレオチドの複数のカセットが、遺伝子の中に結合される。変異誘発はこの方法によって簡素化される、なぜならば、オリゴヌクレオチドの全ては、同じ制限部位を有するように合成することができ、該制限部位をつくるための合成リンカーが必要ないからである。
【００２７】
本明細書で用いている「対応する」とは、タンパク質またはペプチド内に列挙された位置にある各残基、あるいはタンパク質またはペプチド内に列挙された各残基と類似、相同もしくは同等である残基を意味する。本明細書で用いる「対応する領域」の語は、通常、関連タンパク質又は親タンパク質中の類似する位置を言う。
【００２８】
「コードしている核酸分子」、「コードしている核酸配列」、「コードしているＤＮＡ配列」、及び「コードしているＤＮＡ」の語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボブクレオチドの配置又は配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチオドの配置はポリペプチド（タンパク質）に沿ったアミノ酸の配列を決定する。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
本明細書で用いる「野生型」及び「天然の」タンパク質は、自然界において通常見られるタンパク質である。本明細書にて、互換的に用いる、「野生型配列」及び「野生型遺伝子」の語は、宿主細胞内で、天然に、または、自然発生的に生じる配列を言う。いくつかの態様において、野生型配列は、タンパク質工学的手法により利用されるタンパク質の開始点となる所望の配列を言う。この自然発生（すなわち、前駆体）タンパク質をエンコードしている遺伝子は、当該技術分野の当業者に既知の方法に従って得ることができる。この方法は、通常、所望のタンパク質の領域をエンコードする成熟配列を有するラベルプローブの合成、該タンパク質を発現している有機体の遺伝子ライブラリーの作成、及び、対象とする遺伝子に対するライブラリーのスクリーニングを含む。陽性ハイブリダイズクローンはその後、マッピングされ、配列決定される。
【００３０】
本明細書で用いる「組換えＤＮＡ分子」の語は、分子生物学的手法によって、互いに結合されたＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子を言う。「組換えオリゴヌクレオチド」の語は、ポリヌクレオチド配列の制限酵素消化により生成された２つ以上のオリゴヌクレオチドのリゲーション、オリゴヌクレオチドの合成（例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチドの合成）等を含むがこれらに限定されない分子生物学的手法を用いて生成されたオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３１】
本明細書で用いる「等しい残基」の語は、特定のアミノ酸残基を共有するタンパク質を言う。例えば、等しい残基は、Ｘ線結晶化学によって同定される三次構造を有するあるタンパク質（例えばＩＮＦ−β）の三次構造のホモロジーレベルを検出することによって同定される。等しい残基は、前駆体タンパク質の特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が位置合わせ後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものと定義される。位置合わせは、対象とする非水素タンパク質原子の原子座標について最大の重複を生じるように最良のモデルが配向、配置された後に達成される。この最良のモデルは、結晶学及びタンパク質の特徴付け／解析の分野において当業者に知られている方法を用いて検出され、利用できる最高の解像度において回折実験データの最低のＲファクターが得られる結晶学的なモデルである。
【００３２】
本明細書で用いる「調節エレメント」の語は、核酸配列の発現のいくつかの側面を調節する遺伝的エレメントを言う。例えば、プロモーターは、作動可能に結合しているコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。更なる調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニレーションシグナル及びターミネーションシグナルを含む。
【００３３】
本発明で用いる「宿主細胞」の語は、発現ベクター又は所望の遺伝子を含む原核又は真核宿主細胞である。宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換、又は、トランスフェクションされる。そのような形質転換された宿主細胞はタンパク質変異体をコードする複製ベクター又は所望のタンパク質を発現する複製ベクターのいずれかである。このような変異タンパク質のプレ−又はプレプロ型をエンコードするベクターの場合、発現したときに宿主細胞培地の中で選択される。
【００３４】
目的の核酸配列を細胞内へ挿入するという文脈上用いられる「導入する」の語は、形質転換、形質導入、又は、形質感染の意味を有する。形質転換の意味は、プロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈降法、電気穿孔法、及び本技術分野で既知の方法を含む（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；及びＦｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，による寄稿（１９８９） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐａｇｅｓ ５７−７２ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｄ．Ｃ．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ参照のこと）。
【００３５】
「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを言う（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーターとエンハンサーの機能を含んでいる）。エンハンサー／プロモーターは、「内性」または、「外因性」あるいは、「非相同」である。内性エンハンサー／プロモーターは、染色体内で与えられた遺伝子と自然に結合している。外因性（非相同の）エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技術）によって、遺伝子に並列配置されたものである。
【００３６】
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、組み替えられた転写の発現のレベルを高める。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写からイントロンの除去を仲介するものであり、スプライスドナー及びアクセプター部位を含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８９］，ｐｐ．１６．７−１６．８）。通常用いられるスプライスドナー及びアクセプター部位はＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライスジャンクションである。
【００３７】
「安定な形質感染」又は「安定な形質導入」の語は、形質転換させる細胞の遺伝子に、外来ＤＮＡを導入し、組み込むことを言う。「安定した形質感染体」の語は、形質転換される細胞の染色体内へ、安定して組み込まれた外来あるいは外因性のＤＮＡを有する細胞を言う。
【００３８】
本明細書で用いる「選択マーカー」または、「選択遺伝子プロダクト」の語は、選択マーカーが発現されたところで、細胞の抗生物質または薬物体制を確定する酵素活性をエンコードしている遺伝子の使用を言う。
【００３９】
「増幅」及び遺伝子増幅の語は、増幅された遺伝子が生えジメチルにゲノム中に存在しているコピー数よりも多いコピー数で存在するように、特定のＤＮＡ配列が偏って増幅されることを意味する。幾つかの態様において、薬品（例えば、抑制可能な酵素の抑制剤）の存在下で育成することによる細胞の選択はこの薬品の存在下での育成に必要とされる遺伝子産物をコードする内性遺伝子の増幅又はこの遺伝子生成物をコードしている外来（即ち、インプット）配列の増幅のいずれか又は両方となる。
【００４０】
「増幅」はテンプレート特異性に関する核酸複製の特殊なケースである。これは非特異性テンプレート複製（すなわち、テンプレート依存性であるが特定テンプレートに依存しない複製）と対比される。テンプレート特異性は複製の忠実度（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。テンプレート特異性は「標的「特異性に関して説明されることが多い。標的配列は、それらがその他の核酸から選別するために探されるという意味において「標的」である。増幅技術はこの選別を第一に考えて設計されてきた。
【００４１】
本明細書で用いる、「プライマー」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じるまたは合成的に生成されるオリゴヌクレオチドをいい、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が導入される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、及び適した温度及びｐＨで）、合成開始点として作用するものを言う。当該プライマーは好ましくは増幅効率を最大にする１本鎖であるが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは伸長生成物の準備のために用いる前にそのストランドを分離処理する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは誘発剤の存在下、伸長生成物の合成開始のため十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、誘発温度、プライマーの供給源及び使用する方法など多くの因子に左右される。
【００４２】
本明細書で用いる「プローブ」の語は、精製制限消化などにおいて自然に生じる、または合成、組換えまたはＰＣＲ増幅により生成されるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）をいい、別の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるものである。プローブは１本鎖または２本鎖である。プローブは特定遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で使用されるいかなるプローブも任意の「リポーター分子」で標識するので、任意の検出システムにおいて検出可能であり、限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ及び酵素ベースの組織化学的分析）、蛍光、放射性及び発光性システムなどがある。本発明はいかなる特定の検出システムまたは標識にも限定されない。
【００４３】
本明細書で用いる「標的」の語はポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合する核酸領域を言う。従って、「標的」は他の核酸配列から選別された所定の核酸を言う。「断片」は標的配列内の核酸領域として定義される。
【００４４】
本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）の語はここに引用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、及び４，９６５，１８８の方法を言い、クローニングまたは精製することなくゲノムＤＮＡの混合物における標的配列の断片濃度を増加させる方法を含む。標的配列を増幅させるこの方法は当業者によく知られている。
【００４５】
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語はそれぞれ特定ヌクレオチド配列で、またはその近くで２本鎖ＤＮＡを切断する、細菌性酵素をいう。
【００４６】
本明細書において、「洗浄組成物」の語は洗剤製品に用いることができる任意の洗濯洗剤組成物又は食器洗剤組成物を意味する。（別に定義しない限り）この語は、顆粒又は粉末の全ての用途又は「重質」洗剤（例えば、洗濯洗剤）、液体又は粉末のおしゃれ着用洗剤、手洗い用食器洗剤、タブレット、顆粒、液体洗剤を含む形質手洗い用食器洗剤（例えば、高発泡性洗剤）、家庭又は工業用すすぎ用洗剤、液体洗浄殺菌剤（例えば、殺菌ハンドソープ）、洗濯石鹸、マウスウォッシュ、入れ歯洗浄剤、カーシャンプー、バスルームクリーナー、ヒト及び動物用ヘアシャンプー、ヒト及び動物用ヘアリンス、バスゲル、泡状風呂及び金属クリーナー、及び洗浄補助剤（例えば、漂白添加剤、洗剤添加剤、「シミトリスティック」及び他の前処理剤を含む前処理剤）を包含する。
【００４７】
本明細書において、「洗浄組成物」及び「洗剤」の語は、固体目的物の洗浄のために、洗浄媒体中で用いることを意図した混合物を意味する。好適な態様において、この語は、皿、カトラリー等（例えば、手洗い食器洗剤）の洗浄に用いる洗剤を意味する。本発明を特定の洗剤又は組成物に限定することは意図しない。即ち、この語は本発明の少なくとも１つのプロテアーゼを含む洗剤に加えて、界面活性剤、移動剤、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、抗酸化剤、及び安定化剤を含む洗剤も含む。
【００４８】
本明細書において、「手洗い用食器洗浄組成物」の語はカトラリーを含む食器を洗浄するための組成物であって、顆粒又は液体形態を含むがこれらに限定されない全ての形態の組成物を意味する。本発明を特定のタイプ又は食器洗浄組成物に限定することは意図しない。即ち、本発明はセラミック、プラスチック、金属、陶器、ガラス、アクリル等を含むがこれらに限定されない任意の物質から作られた食器（例えば、皿、カップ、グラス、ボウル等を含む食器）及びカトラリー（例えば、スプーン、ナイフ、フォーク、給仕用具等を含むカトラリー）に用いることができる。「食器」の語は本明細書において食器及びカトラリーの両方を意味する。
【００４９】
「関連する洗浄条件」の語は、実際に食器洗剤の市場区分における家庭用に用いられている、条件、特に洗浄音素、時間、洗浄器、泡濃度、洗剤及び水の硬度のタイプを意味する。
【００５０】
「改善された洗浄性能」の語は関連する洗浄条件下で食器から汚れを除去する点においてより好適な結果が得られること、又は対応する野生型プロモーターよりも重量ベースでより少ない変異プロテアーゼが同じ結果をだすために必要になることを意味する。
【００５１】
「維持された洗浄性能」の語は変異プロテアーゼ酵素の洗浄性能に示すために用いる。重量ベースで関連する洗浄条件下において対応する野生型プロテアーゼに対して少なくとも８０％の効果を有することを意味する。
【００５２】
プロテアーゼの洗浄性能は適切な条件下で、特定の代表的な汚れを除去する能力により測定される。これらのシステムにおいて、洗剤組成物、泡抑制剤、水の高度、洗浄器、時間、ｐＨ、及び／又は温度等の因子を特定のマーケットセグメント（例えば、食器、布洗浄）における家庭用製品のための条件に限定されるように、制御することができる。本明細書で説明する試験的な製品試験システムはＤＮＡ変異誘発を通じて修飾されたタンパク質分解酵素を用いる家庭用製品の代表的例である。従って、本明細書で提供される方法は大量の異なる酵素の試験及び特定の製品に特に好適な酵素の選択を促進する。このような特定の用途のための「テイラーメイド」酵素は用意に選択することができる。
【００５３】
「洗浄活性」の語は本発明のタンパク質分解、加水分解、洗浄又は他のプロセスの間に優勢である条件下において、プロテアーゼにより達成される洗浄性能を意味する。幾つかの態様において、洗浄性能は汚れを標準的な洗浄条件下に曝した後に、各種クロマトグラフ、分光光度計、又は他の定量可能な方法により決定された、例えば、ミルク又は卵のタンパク質等の酵素に敏感な汚れに関する各種洗浄評価方法により決定することができる。例示的なアッセイは、実施例に記載のもののほかに、ＷＯ９９／３４０１１及びＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６０５，４５８に記載の方法を含むがこれらに限定されない。これらの文献を参照により本明細書に援用する。
【００５４】
プロテアーゼの「洗浄に効果的な量」の語は、特定の洗浄条件において、所望の酵素活性を達成することが出来る前述のプロテアーゼの量を意味する。そのような効果的な量は当業者が容易に決定することができ、用いられるプロテアーゼ、洗浄製品、洗剤組成物、及び液体又は乾燥（例えば、顆粒）組成物のいずれか必要とされるか等の多くの因子に基づいている。
【００５５】
本明細書で用いる「洗浄補助物質」の語は、所望の洗浄用組成物及び特定のタイプの形状のために選択された任意の液体、固形、又は気体物質を意味し、組成物中に用いられるプロテアーゼ酵素と相性の良い物質を意味する。幾つかの態様において、顆粒組成物は「コンパクト」タイプであり、液体組成物は「濃縮」形態である。
【００５６】
本発明で用いられるように、「中洗剤濃度」系は洗浄水に約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分が存在する洗剤を含む。北米の洗剤は、洗浄水に通常約９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、一般的には中洗剤濃度系と見なされる。ブラジルの洗剤は、典型的には洗浄水に約１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。本発明で用いられるように、「低洗剤濃度」系は洗浄水に約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が存在する洗剤を含む。日本の洗剤は、洗浄水に通常約６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、典型的には低洗剤濃度系と見なされる。
【００５７】
本発明で用いられるように、「高洗剤濃度」系は洗浄水に約２０００ｐｐｍより多くの洗剤成分が存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、洗浄水に約３０００−８０００ｐｐｍの洗剤成分が存在するため、一般的には高洗剤濃度系と見なされる。
【００５８】
本発明で用いられるように、「非織物洗浄組成物」には、食器洗い洗剤組成物、口洗浄組成物、義歯洗浄組成物、およびパーソナル洗浄組成物を含むが、これらに限定されない非織物（ｎｏｎ−ｔｅｘｔｉｌｅ）（例えば、布地）表面洗浄組成物が含まれる。
【００５９】
本明細書において、「殺菌」の語はアイテム表面の微生物を抑制又は殺す他に。表面から汚染物質を除去することも意味する。本発明を特定の表面、アイテム、汚染物質、又は微生物に限定するとこは意図しない。
【００６０】
本明細書において、「スブチリシン」の語は、ＭＥＲＯＰＳ−ペプチドデータベース（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３４Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ， Ｄ２７０−２７２，２００６）に記載のようなＳ８セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバーを意味する。
【００６１】
本発明は天然の又は組み替え技術により生成されたバクテリアセリンプロテアーゼ由来の変異タンパク質分解酵素の生成、スクリーニング、及び選択のための方法及び組成物も提供する。そのような変異体は、例えば、アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の野生型遺伝由来の遺伝子によりコードされたものがある。最も好適な態様において、この株はＰＢ９２である。本発明は、アルカリ性バチルス株ＰＢ９２由来セリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼ由来の修飾プロテアーゼの選択に用いることができる。例えば、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、及びバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が知られており、変異誘発の標的として用いることができる。しかしながら、本発明を特定の態様に限定することは意図しない。オリゴヌクレオチドを利用した部位指定変異誘発又は領域指定ランダム変異誘発を含むがこれらに限定されない任意の好適な変異誘発方法を本発明に用いることができる。
【００６２】
幾つかの好適な態様において、生成及び選択を含む、本発明により提供される変異タンパク質分解酵素を選択する方法は以下の工程を含む：所望のタンパク質分解酵素又はそのフラグメントをコードしているクローンされた遺伝子を変異する工程；得られた変異プロテアーゼ遺伝子を単離する工程；好ましくは好適なベクター上にあるこの変異プロテアーゼ遺伝子を好適な宿主細胞に導入して発現及び生成する工程；生成された変異プロテアーゼを回収する工程；洗剤に適用するために改善された性質を有する変異プロテアーゼを同定する工程。
【００６３】
変異プロテアーゼの生成のために好適な宿主細胞株はプロテアーゼを発現することができる改質転換可能な微生物を含む。特に、実質的に同じ性質を有するプロテアーゼの由来と同じ種又は属の、バチルス株、特にアルカリ性バチルス株、最も好ましくは新規なバチルス株であるＰＢ９２又はこれらの変異体である宿主株が好ましい。バチルススブチリス、バチルスリケニフォルミス、及びバチルスアミロリケファシエンス株が好適な株である。他の好適な宿主株は変異遺伝子で形質転換する前に細胞外タンパク質分解酵素の生成を行わない他の株を含む。特に好適なものは、新規なバチルスＰＢ９２の不完全誘導体等のバチルス株であると定義されたものである。プロテアーゼの発現は選択された宿主有機体で昨日するシグナルの発現を用いて得ることができる。シグナルの発現はプロテアーゼ遺伝子の転写及び翻訳を調節しているＤＮＡの配列を含む。好適なベクターは染選択された宿主株において有意に高いコピー数を複製し、色体取り込みにより、宿主系統内において、プロテアーゼ遺伝子を維持することができるものである。
【００６４】
本発明の変異タンパク質分解酵素は適した発酵条件下における培養、１つ以上の所望の変異タンパク質分解遺伝子、及び生成された酵素の回収により調製することができる。好ましくは、この発現されるプロテアーゼは培地内で、グラム陰性バクテリア宿主株の場合、ペルプラスム種で選択され、それらの回収を促進する。選択のためには、好適なアミノ停止シグナル配列が用いられる。好ましくはこのシグナル配列は、選択された宿主株内で機能するならば、オリジナル遺伝子によりコードされるシグナル配列である。
【００６５】
幾つかの態様において、自然発生又は自然変異的な洗剤プロテアーゼの生成は、この酵素の各種変異体を導入することにより高めることができる。たいていの場合、この変異は保存又は非保存残基の置換であり、これらの欠失又は挿入も用いることができる。
【００６６】
保存置換については、以下の表Ｉを用いる。あるカテゴリーの任意のアミノ酸が同じカテゴリー内の任意のアミノ酸と置換することができる。例示的な保存置換はグリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）で置換することである。一方、例示的な非保存残基は、グリシン（Ｇ）をアスパラギン残（Ｄ）、リジン（Ｋ）、又はフェニルアラニン（Ｆ）で置換することである。
【表１】
【００６７】
更に、極性アミノ酸Ｎ、Ｑを荷電性アミノ酸で置換することができる。本発明の目的のために、特に、活性部位に直接含まれない部位でプロテアーゼのアニオン性質が高くなるような置換を行うことが好ましい。
【００６８】
驚くべきことに、本発明の開発において試験された幾つかの置換は同じ基質において、プロテアーゼの特異活性を低くする結果となったが、関連する天然又は対照酵素に匹敵するか、より高い洗浄性能を示した。幾つかのケースでは、貯蔵安定性が改善された。従って、本発明は、天然又は対照プロテアーゼと比較して改善されたパフォーマンスを有する変異プロテアーゼを提供する。
【００６９】
幾つかの態様において、洗浄組成物においてスブチリシンの安定性及び／又は性能を高めるために、幾つかの置換を組み合わせる。例えば、スブチリシンの洗浄性能に好ましい影響を与える幾つかの置換を１つのスブチリシン変異体中で組み合わせることができる。（例えば、Ｓ１０Ｍ＋Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａを有するＰＢ９２変異体：ＢＰＮナンバリングを使用）
【００７０】
即ち、本発明は洗浄組成物及び／又は洗浄工程に用いる変異体セリンプロテアーゼ提供する。最終的にプロテアーゼポリペプチド鎖中のアミノ酸の欠失又は挿入させて、ＢＰ９２プロテアーゼに相同な変異又は天然プロテアーゼが生成されることにより、アミノ酸配列の位置番号が変更になることは明らかである。しかしながら、ＢＰ９２対照スブチリシン（及びＢＰＮでアラインメントした番号）のアミノ酸位置に相同な位置は本発明の範囲内であることは理解されるべきである。
【００７１】
洗剤組成物
別に定義しない限り、本明細書で提供される全ての成分又は組成物のレベルがこの成分又は組成物生物の活性レベルであり、例えば、市販の原料中に存在質得る溶媒の残渣又は副生成物等の不純物を排除する。全てのパーセンテージ及び割合は別途定義しない限り、重量に基づく。全てのパーセンテージ及び割合は別に定義しない限り、組成物に基づいて計算される。例示的な洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の総重量に対する精製酵素の割合で表され、別に定義しない限りこの洗剤の成分は組成打つの重量に対するパーセンテージで示される。
【００７２】
本明細書において、幾つかの態様において、本発明の洗剤組成物は更に界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、漂白酵素、他の酵素、酵素安定システム、キレート、白化剤、汚れ放出ポリマー、ダイ、移行剤、泡抑制剤、香料、色素、充填剤、塩、ヒドロトロプス、光学活性剤、蛍光剤、コンディショナー、加水分解界面活性剤、保存料、抗酸化剤、縮み抑制剤、しわ抑制剤、殺菌剤、抗菌剤、カラースペックル、シルバーケア、抗黄ばみ及び／又は抗腐食剤、アルカリソース、可溶化剤、担体、プロセス剤、顔料、及びｐＨ抑制剤を含む。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，６１０，６４２、６，６０５，４５８、５，７０５，４６４、５，７１０，１１５、５，６９８，５０４、５，６９５，６７９、５，６８６，０１４、及び５，６４６，１０１参照。これらの文献を参照により本明細書に援用する。）特定の洗剤組成物の例を以下で説明する。洗剤組成物において、洗浄補助剤が本発明の変異プロテアーゼと相性がよくない態様において、２つの成分の組み合わせが好適になるまで、洗浄補助剤と分離されたプロテアーゼ（即ち、他の成分と接触していない）を維持する好適な方法を用いる。そのような分離方法は当業者に知られている任意の方法を含む（例えば、ゲルキャップ、カプセル化、タブレット、物理的分離等）。
【００７３】
本発明のセリンプロテアーゼは各種洗浄組成物の製剤化に有用である。本発明の酵素は顆粒及び液体組成物に用いることができる。本発明の洗浄組成物は、例えば、洗濯用製品、硬表面洗浄、並びに口腔、歯科、ヘア、及び皮膚等の化粧製品に好適に用いることができる。本発明の酵素は顆粒及び液体組成物の両方に用いることができる。
【００７４】
本発明の酵素は洗浄添加製品においても用いられる。本発明の少なくとも１つの酵素を含む洗浄添加製品は、追加的な漂白効果が欲しい場合に、洗浄工程に用いることが好ましい。そのようなものは低温溶解性洗浄製品を含むがこれらに限定されない。この添加製品は、その最も簡単な態様において、本発明により提供される１つ以上のプロテアーゼでもよい。幾つかの態様において、この添加製品は過酸の源を用いて漂白効果を高めることが望ましい場合に洗浄工程に添加するための形態で包装されている。幾つかの態様において、単回投与形態は、ピル、タブレット、ゲルキャップ、又はあらかじめ決められた量の粉末及び／又は液体を含む他の単回投与単位を含む。幾つかの態様において、充填剤及び／又は担体物質を組成物の容量を増やすために用いる。好適な充填剤又は担体物質は各種硫酸塩、カルボン酸塩、ケイ酸塩、並びにタルク、クレイ等を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、液体組成物についての、充填剤及び／又は担体物質は、水及び／又はポリオール及びジオールを含む低分子量１級又は２級アルコールを含む。そのようなアルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールがあるがこれらに限定されない。幾つかの態様において、この組成物はそのような物質を約５％乃至約９０％含む。追加的な態様において、酸性充填剤を用いて組成物のｐＨを下げる。幾つかの代替的な態様において、洗浄添加製品は少なくとも１つの前述の及び／又は以下に述べる補助物質として、少なくとも１つの過酸の源を含む。
【００７５】
本発明の洗浄組成物は本発明において提供されるようなセリンプロテアーゼ酵素の効果的な量を必要とする。幾つかの態様において、酵素の必要とされる量は、本発明のセリンプロテアーゼの１つ以上の添加により達成される。通常、本発明の洗剤組成物は少なくとも０．０００１重量％、約０．０００１乃至約１０、約０．００１乃至約１、又は約０．０１乃至約０．１重量％の本発明により提供される少なくとも１つのセリンプロテアーゼを含む。
【００７６】
幾つかの好適な態様において、本明細書において提供される洗浄組成物は、水性洗浄操作で使用される間に、その洗浄水のｐＨが約５．０乃至約１１．５、あるいは約６．０乃至約１０．５になるように製剤化される。幾つかの好適な態様において、液体製剤は約３．０乃至約９．０のｐＨになるように製剤化される。代替的な態様において、この製剤は約３乃至約５のｐＨを有する。推奨されるレベルへｐＨを調整する技術は緩衝液、アルカリ、酸等を含み、当業者に知られている。
【００７７】
幾つかの特に好適な態様において、少なくとも１つのセリンプロテアーゼが顆粒組成物又は液体に用いられたときに、このセリンプロテアーゼは貯蔵の間に顆粒組成物の他の成分から酵素を保護するために、カプセル化された粒子の形態になっている。更に、カプセル化は洗浄工程の間のせリンプロテアーゼの利用を制御する手段も提供し、セリンプロテアーゼの性能を向上させる。本発明のカプセル化されたセリンプロテアーゼは各種セッティングに用いることができる。このセリンプロテアーゼは当業者に知られている任意の好適なカプセル化材料及び方法を用いてカプセル化することができる。
【００７８】
幾つかの好適な態様において、カプセル化材料は通常セリンプロテアーゼ酵素の少なくとも一部分をカプセル化する。幾つかの態様において、このカプセル化物質は水溶性及び／又は水分散性である。幾つかの追加的な態様において、このカプセル化材料は０℃以上のガラス転移温度を有する。（ガラス転移温度に関しての詳細は例えば、ＷＯ９７／１１１５１、特に６ページ、２５行目、乃至７ページ、２行目参照。）
【００７９】
幾つかの態様において、カプセル化された物質は炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン及びキトサン、セルロース及びセルラース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。カプセル化物質は炭水化物である幾つかの態様において、炭水化物はモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。幾つかの好適な態様において、カプセル化された物質はデンプンである。（幾つかの例示的なデンプンについて、例えば、ＥＰ ０ ９２２ ４９９；及びＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，９７７，２５２、５，３５４，５５９、５，９３５，８２６参照）。
【００８０】
追加的な態様において、カプセル化された物質はプラスチックである。（熱可塑性プラスチック、アクリルニトリル、メタクリルニトリル、ポリアクリルニトリル、ポリメタクリルニトリル、及びこれらの混合物、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（商標）（Ｃａｓｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ＰＭ ６５４５、ＰＭ ６５５０、ＰＭ ７２２０、ＰＭ ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）、及びＱ−ＣＥＬ（商標） （ＰＱ Ｃｏｒｐ．， Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ， ＰＡ）、ＬＵＸＳＩＬ（商標）及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬｌ（商標）（Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｃａｒｌｓｔａｄｔ， ＮＪ ａｎｄ Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ，ＰＡを含むがこれらに限定されない市販のミクロスフェアも用いることができる。）
【００８１】
本発明で記載されるように、本発明の変異プロテアーゼは洗濯に用いられる。これらの利用は様々な環境ストレスに酵素を曝す。本発明のプロテアーゼは様々な環境下でのその安定性のために、現在用いられる多くの酵素に亘って有利である。
【００８２】
実際、洗濯に用いられる酵素が曝される、様々な洗剤製剤、洗濯水量、洗濯水温、および洗濯時間の長さを含む様々な洗濯条件がある。さらに、異なる地理的な地域で用いられる洗剤製剤は洗濯水に存在する関連成分の異なる濃度を有する。例えば、ヨーロッパの洗剤は典型的に洗濯水中に約４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を有するが、日本の洗剤は典型的に洗濯水中に約６６７ｐｐｍの洗剤成分を有する。北アメリカ、特に米国では、洗剤は典型的に洗濯水中に存在する約９７５ｐｐｍの洗剤成分を有する。
【００８３】
低洗剤濃度系は約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。日本の洗剤は、約６６７ｐｐｍの洗濯水中に存在する洗剤成分を有するため、典型的に低洗剤濃度系と見なされる。
【００８４】
中洗剤濃度系は約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、約９７５ｐｐｍの洗濯水中に存在する洗剤成分を有するため、一般的に中洗剤濃度系と見なされる。ブラジルでは典型的に約１５００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有する。
【００８５】
高洗剤濃度系は約２０００ｐｐｍより多くの洗剤成分が洗濯水中に存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、約４５００〜約５０００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有するため、一般的に高洗剤濃度系と見なされる。
【００８６】
ラテンアメリカの洗剤は一般的に高燐酸泡ビルダー洗剤であり、ラテンアメリカで用いられる洗剤の範囲は、洗濯水中の洗剤成分が１５００ｐｐｍ〜６０００ｐｐｍに及ぶため、中および高洗剤濃度の両方に該当し得る。上述のように、ブラジルでは典型的に約１５００ｐｐｍの洗濯水中の洗剤成分を有する。しかしながら、他のラテンアメリカ諸国に限定されることなく、他の高燐酸泡ビルダー洗剤の地域は洗濯水中に存在する約６０００ｐｐｍ以上の洗剤成分の高洗剤濃度系を有することができる。
【００８７】
前述の観点から、世界中の典型的な洗濯溶液中の洗剤成分の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低洗剤濃度地域」）、例えば日本の約６６７ｐｐｍから、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの間（「中洗剤濃度地域」）、例えば米国の約９７５ｐｐｍおよびブラジルの約１５００ｐｐｍ、約２０００ｐｐｍを超える（「高洗剤濃度地域」）、例えばヨーロッパの約４５００〜約５０００ｐｐｍおよび高燐酸泡ビルダー洗剤地域の約６０００ｐｐｍまで変化する。
【００８８】
典型的な洗濯溶液の濃度は経験的に決められる。例えば米国では、典型的な洗濯機は約６４．４Ｌの容積の洗濯溶液を擁する。したがって、洗濯溶液内の約９７５ｐｐｍの洗剤の濃度を得るためには、６４．４Ｌの洗濯溶液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を加えなければならない。この量は、洗剤に備えられた計量カップを用いて消費者により洗濯水中に量り取られる典型的な量である。
【００８９】
更なる具体例として、異なる地域では異なる洗濯温度が用いられる。日本の洗濯水の温度は典型的にヨーロッパで用いられるものよりも低い。例えば、北アメリカおよび日本の洗濯水の温度は１０〜３０℃の間であり得、一方ヨーロッパの洗濯水の温度は典型的には３０〜６０℃（例えば、約４０℃）である。
【００９０】
更なる具体例として、異なる地域は典型的には異なる水の硬度を有する。水の硬度は通常、粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋という用語で記述される。硬度は水の中のカルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の測定値である。米国のほとんどの水は硬いが、硬度は変動する。中度に硬い（６０−１２０ｐｐｍ）から硬い（１２１−１８１ｐｐｍ）水は６０〜１８１ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ｐｐｍから粒子／米国ガロンへの変換については、１７．１でｐｐｍ＃を除したものが粒子／ガロンに等しい）の硬度の物質である。
【表２】
【００９１】
ヨーロッパの水の硬度は典型的には１０．５（例えば、１０．５〜２０．０）粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（例えば、約１５粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋）である。北アメリカの水の硬度は典型的には日本の水の硬度よりも硬いが、ヨーロッパの水の硬度よりも軟らかい。例えば、北アメリカの水の硬度は３〜１０粒子の間、３〜８粒子、または約６粒子であり得る。日本の水の硬度は典型的には北アメリカの水の硬度より軟らかく、通常４未満であり、例えば３粒子／ガロン混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋である。
【００９２】
従って、幾つかの態様において、本発明は少なくとも１つの洗浄条件のセットにおいて驚くべき洗浄性能を示す変異プロテアーゼを提供する。（例えば、水温度、水高度、及び／又は洗剤濃度）。幾つかの態様において、本発明の変異プロテアーゼは洗浄性能において他のスブチリシンプロテアーゼに匹敵する。幾つかの態様において、本発明の変異プロテアーゼは近年商業的に使用されているスブチリシンプロテアーゼと比較して高い洗浄性能を示す。従って、本発明のいくつかの好適な態様において、この変異プロテアーゼは高められた酸化安定性、高められた熱安定性、及び／又は高められた洗浄安定性を示す。更に、本発明の変異プロテアーゼは界面活性剤を含まない洗剤組成物中に、単独又はビルダー及び安定剤と組み合わせて用いることができる。
【００９３】
本発明の幾つかの態様において、洗剤組成物は少なくとも１つの本発明の変異プロテアーゼを組成物の重量に基づいて、約０．００００１％乃至約１０％のレベルで含み、他に組成物の重量に基づいて、例えば、約９９．９９９％乃至約９０．０％の補助物質を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗剤組成物は、少なくとも１つの本発明の変異プロテアーゼを組成物の重量に基づいて約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％、含み、他は約９９．９９９９％乃至約９０．０％、約９９．９９９％乃至約９８％、約９９．９９５％乃至約９９．５％の洗浄補助物質を含む。
【００９４】
本明細書において更に説明するように、幾つかの態様において、好適な洗剤組成物は本発明の変異プロテアーゼに加えて、洗浄性能において利益を提供する１つ以上の追加的な酵素又は酵素誘導体を含む。そのような酵素は他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、（例えば、ラッカーゼ）、及び／又はマンナナーゼを含むがこれらに限定されない。
【００９５】
洗浄組成物の製造及び使用
幾つかの好適な態様において、本発明の洗浄組成物は任意の好適な形態に製剤化でき、製剤化のために選択された任意の好適な方法で調製することができる。（幾つかの非限定的な例について、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，８７９，５８４、５，６９１，２９７、５，５７４，００５、５，５６９，６４５、５，５６５，４２２、５，５１６，４４８、５，４８９，３９２、及び５，４８６，３０３参照。）低ｐＨの洗浄組成物が好ましい場合、このような組成物のｐＨはＨＣｌのような酸性物質の添加により調整することができる。
【００９６】
補助物質
本発明の目的には必須ではないが、幾つかの態様において、本明細書に記載の非限定的に列挙されている補助剤は本発明の洗浄組成物に用いるのに好適である。即ち、幾つかの態様において、補助剤は本発明の洗浄組成物に含まれる。幾つかの態様において、補助物質は洗浄性能を補助及び／又は向上させ、洗浄される基質を処理し、及び／又は組成物の審美性を修飾する。（例えば、香料、色素、ダイ等）これらの追加的な化合物の正確な性質及びこれらの含有レベルは組成物の物理的形態及び／又は使用される洗浄組成物の特定の性質に依存している。好適な補助物質は界面活性剤、ビルダー、キレート剤、ダイ移行抑制剤、付着剤、追加的な酵素、及び／又は酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、漂白向上剤、過酸化水素、過酸化水素の源、機能性過酸、ポリマー分散剤、クレイ汚れ除去／再付着防止剤、白化剤、泡抑制剤、ダイ、香料、構造柔軟剤、柔軟剤、担体、ヒドロトロプス、プロセス剤及び／又は顔料を含む。本明細書に記載のものに加えて、追加的な例は当業者に知られている（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５７６，２８２、６，３０６，８１２、及び６，３２６，３４８）。幾つかの態様において、予め決められた補助成分は本発明の洗浄組成物の本発明のプロテアーゼ以外の成分を構成している。
【００９７】
界面活性剤
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの界面活性剤又は界面活性剤システムを含む。この界面活性剤は非イオン性界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、準極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物から選択される。低ｐＨ洗剤組成物の態様において（例えば、組成物のｐＨが約３乃至約５）、この組成物は通常アルキルエトキシル化硫酸塩を含まない。そのような界面活性剤は酸性物質を含む組成物により加水分解される。幾つかの態様において、界面活性剤は約０．１％乃至約６０％の範囲でふくまれ、代替的な態様において、このレベルは約１％乃至約５０％、他の更なる態様において、このレベルは約５％乃至約４０％である。
【００９８】
ビルダー
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は１つ以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステムを含む。少なくとも１つのビルダーを含む幾つかの態様において、この洗剤は洗剤の重量に基づいて、少なくとも約加えて１％、約３％乃至約６０％、又は約５％乃至約４０％のビルダーを含む。ビルダーはアルカリ金属、リン酸アンモニウム、及びリン酸のアルカノアンモニウム塩、アルカリ金属シリケート、アルカリ土類金属炭素、アルカリ金属炭素、アルミノシリケート、ポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシスクシニル酸、各種アルカリ金属、エチレンジアミントリ酢酸、及びニトリルトリ酢酸等のポリ酢酸のアンモニウム及び置換されたアンモニウム塩、メリト酸、スクシニル酸、クエン酸、オキシジスクシニル酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸等のポリカルボン酸塩、並びにこれらの可溶化塩を含むがこれらに限定されない。即ち、任意の好適なビルダーを本発明の各種態様に用いることができる。
【００９９】
幾つかの態様において、ビルダーはクエン酸塩及びリン酸塩等（例えば、サトリウム三リン酸及びナトリウム三リン酸六水和物、カリウム三リン酸、及び混合されたナトリウム及びカリウム三リン酸等）の水溶性硬イオン複合体（例えば、封鎖ビルダー）を形成する。当業者に知られているものを含む任意の好適なビルダーを本発明に用いることができる（例えば、ＥＰ２１００９４９）。
【０１００】
キレート剤
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つのキレート剤を含む。好適なキレート剤は銅、鉄、及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物を含む。少なくとも１つのキレート剤を用いる態様において、本発明の洗浄組成物はこの洗浄組成物の重量に基づいて、約０．１％乃至約１５％、更には約３．０％乃至約１０％、のキレート剤を含む。
【０１０１】
沈着補助剤
本発明の洗浄組成物は沈着補助剤を含むことができる。好適な沈着補助剤には、ポリエチレングリコール、ポリカルボン酸、ポリテレフタル酸のような防汚ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイトのような粘土、およびこれらの混合物が含まれる。
【０１０２】
再付着防止剤
本明細書において、再付着防止剤が本発明の幾つかの態様に用いられる。幾つかの好適な態様において、非イオン界面活性剤が用いられる。例えば、洗浄組成物の態様において、非イオン界面活性剤は目的物の表面を修飾するために用いられ、特に汚れに関して、膜形成及びスポット形成を避け、輝きを増すために用いられる。これらの非イオン界面活性剤は汚れの再付着を防止するためにも用いる。幾つかの好適な態様において、再付着防止剤は当業者に知られている非イオン界面活性剤である。（例えば、ＥＰ２１００９４９参照。）
【０１０３】
染料転移阻害剤
本発明の洗浄組成物はまた、一つ以上の染料転移阻害剤を含むことができる。好適なポリマー性染料転移阻害剤には、ポリビニルピロリドン・ポリマー、ポリアミン−Ｎ−オキシド・ポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。対象洗浄組成物に存在する場合、前記染料阻害剤は洗浄組成物の重量で約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、またはさらに約０．１％〜約３％のレベルで存在することができる。
【０１０４】
ケイ酸塩
幾つかの態様において、ケイ酸塩を本発明の組成物に含むことができる。幾つかのそのような態様において、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロシリケート）を用いる。幾つかの態様において、ケイ酸は約１％乃至約２０％のレベルで存在する。幾つかの好適な態様において、ケイ酸塩は組成物の重量により約５％乃至約１５％含まれる。
【０１０５】
分散剤
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの分散を含む。好適な水溶性有機物質は、ホモ又はコポリマー酸又はそれらの塩を含むがこれらに限定されない。ポリカルボン酸はお互いに離れた少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含み、炭素原子は２を超えない。
【０１０６】
酵素
幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの追加的な酵素を含む。これらの酵素は食器洗浄のための洗浄性能を向上させる。好適な酵素の例はヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、フォスフォオキシダーゼ、リポキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、βグルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、並びにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はセルラーゼ並びにアミラーゼ等の従来用いられている酵素の組み合わせを含む酵素の組み合わせを用いる。
【０１０７】
他の好適なプロテアーゼも本発明に用いることができる。好適なプロテアーゼは動物、野菜、又は微生物のものを含む。幾つかの特定の好適な態様において、微生物プロテアーゼを用いる。幾つかの態様において、化学的又は遺伝的に修飾された変異体が含まれる。幾つかの態様において、このプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリセリンプロテアーゼ又はトリプシン用プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの例としては、スブチリシン、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの（例えば、スブチリシン、レンタス、アミロリケファシエンス、スブチリシンカールスバッド、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、及びスブチリシン１６８）を含む。追加的な例はＵ．Ｓ． Ｐａｔ．Ｎｏｓ．ＲＥ ３４，６０６、５，９５５，３４０、５，７００，６７６、６，３１２，９３６、及び６，４８２，６２に記載の変異プロテアーゼを含む。これらの文献を参照により本明細書に援用する。追加的なプロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、トリ又はウシ由来）及びＷＯ８９／０６２７０に記載のフサリウムプロテアーゼを含むがこれらに限定されない。好適な市販のプロテアーゼ酵素はＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）， ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（ジェネンコー）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、 ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）、及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）、（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）； 及びＢＬＡＰ（商標）（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｔｉｅｎ， Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）がある。各種プロテアーゼはＷＯ９５／２３２２１、ＷＯ ９２／２１７６０、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．２００８／００９０７４７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，８０１，０３９、５，３４０，７３５、５，５００，３６４、５，８５５，６２５、ＵＳ ＲＥ ３４，６０６、５，９５５，３４０、５，７００，６７６、６，３１２，９３６、及び６，４８２，６２８並びに他の特許に記載されている。幾つかの更なる態様において、ＷＯ０７／０４４９９３に記載の天然メタロプロテアーゼを含むがこれらに限定されないメタロプロテアーゼを本発明に用いることができる。
【０１０８】
更に、任意の好適なリパーゼを本発明に用いることができる。好適なリパーゼはバクテリア又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝的に修飾された変異体が本発明に包含される。有用なリパーゼの例としては、ウミコーララングイノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２５８０６８，ＥＰ３０５２１６，及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，９３９，７０２参照）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２３８０２３参照）、カンジダアンタルクチア（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（例えば、カンジダアンタルクチア（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ又はＢ；例えば、ＥＰ２１４ ７６１参照）等のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ、シュードモナスアルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びシュードモナスプレウドアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２１８２７２参照）、シュードモナスセパチア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（例えば、ＥＰ３３１３７６参照）、シュードモナススツゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ（例えば、ＧＢ１，３７２，０３４参照）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ等のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３−２６０［１９９３］］；バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ［例えば、ＪＰ６４／７４４９９２参照］；及びバチルスプミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ［例えば、ＷＯ９１／１６４２２参照］）を含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
更に、ペニシリウムカメンバーチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０３：６１−６７［１９９１］参照）、ゲオトリカムカンジダ（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３−３８８［１９８９］参照）、及びリゾプスデルマー（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０９：１１７−１１３［１９９１］参照）、リゾプスニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６−７１９［１９９２］）、及びリゾプスオリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ等の各種リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）リパーゼを含むがこれらに限定されない多くのクローン化されたリパーゼを本発明に用いることができる。
【０１１０】
シュードモナスメンドシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）（ＷＯ ８８／０９３６７参照）由来クチナーゼ、及びフサリウムソラニピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ）（ＷＯ９０／０９４４６参照）由来クチナーゼを含むがこれらに限定されないクチナーゼ等の他のタイプの脂肪分解酵素も本発明の幾つかの態様に用いることができる。
【０１１１】
追加的な好適なリパーゼはＭ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ジェネンコー）；ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「アマノ」（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）として販売されているものを含む。
【０１１２】
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗剤は、組成物の重量に基づいて、約０．００００１％乃至約１０％、のレベルで追加的なリパーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のレベルでリパーゼを含む。
【０１１３】
アルカリ溶液に用いるのに好適な任意のアミラーゼも本発明の幾つかの態様に用いることができる。好適なアミラーゼはバクテリア又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝的に修飾された変異体も幾つかの態様に含まれる。本発明に用いることができるアミラーゼはバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、ＧＢ １，２９６，８３９参照）由来α−アミラーゼを含むがこれらに限定されない。本発明に用いることができる商業的に利用されているアミラーゼはＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）、及びＭＡＸＡＭＹＬ（商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を含むがこれらに限定されない。
【０１１４】
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗剤は更に組成物の重量に基づいて約０．００００１％乃至約１０％のレベルでアミラーゼを含み、他は組成物の重量に基づいて洗浄補助剤を含む。本発明の他の態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて、約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のレベルでアミラーゼを含む。
【０１１５】
幾つかの更なる態様において、任意の好適なセルラーゼが本発明の洗剤に用いることができる。化学的又は遺伝的に修飾された変異体は幾つかの態様に含まれる。好適なセルラーゼはフミコーラインシソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４３５，３０７参照）を含む。特に、好適なセルラーゼは色の処理に有用なものである（例えば、ＥＰ０４６５２５７参照）。本発明に用いることができる商業的に利用されているセルラーゼはＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王コーポレーション）を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、セルラーゼは成熟野生型セルラーゼ又は変異セルラーゼの一部分又はフラグメントとして取り込まれる。ここにおいてＮ末端の部分は欠失されている（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８７４，２７６参照）。幾つかの態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．００００１％乃至約１０％のレベルで追加的なセルラーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて、約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約５％のレベルでセルラーゼを含む。
【０１１６】
任意の好適なマンナナーゼを本発明の洗剤組成物に用いることができる。好適なマンナナーゼはバクテリア又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝的に修飾された変異体も幾つかの態様に含まれる。各種マンナナーゼが当業者に知られており、本発明に用いることができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５６６，１１４、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６０２，８４２、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４４０，９９１参照。これらの文献を参照により本発明明細書に援用する。）幾つかの態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．００００１％乃至約１０％のレベルで追加的なマンナナーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の態様において、本発明の洗剤は組成物の重量にもとづいて、約０．０００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１％乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のレベルでマンナナーゼを含む。
【０１１７】
幾つかの態様において、ペルオキダーゼが過酸化水素マンナナーゼそれらのソースと一緒に（例えば、ペルカルボネート、ペルボレート、又はペルスフホネート）と組み合わせて本発明の組成物に用いることができる。幾つかの代替的な態様において、オキシダーゼは酸素と一緒に用いられる。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼの例としては、植物、バクテリア、又は糸状菌由来のものを含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて、約０．００００１％乃至約１０％の追加的なペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを含み、他に洗浄補助物質を含む。本発明の他の態様において、本発明の洗剤は組成物の重量に基づいて約０．００１％乃至約１０％、約０．００１％乃至約５％、約０．００１乃至約２％、約０．００５％乃至約０．５％のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを含む。
【０１１８】
幾つかの態様において、ペルヒドロラーゼを含むがこれらに限定されない追加的な酵素を用いることができる。（例えば、ＷＯ０５／０５６７８２参照。）更に、幾つかの特定の好適な態様において、前述の酵素の混合物が本発明に含まれ、特に１つ以上の追加的なプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なとも１つのセルラーゼが含まれる。即ち、各種プロテアーゼ及び１つ以上の追加的な酵素を各種レベルで約１０％までそれぞれ用いることができ、他に洗浄補助剤を含むことができる。洗浄補助剤の特定の選択は、洗浄するアイテム及び食器洗浄器を使用する間の洗浄条件に好適な洗剤組成物の形態を考慮して、当業者が決定することができる。
【０１１９】
酵素安定剤
本発明の幾つかの態様において、本発明の洗剤組成物に用いる酵素を安定化させる。幾つかの態様において、この酵素安定剤はオリゴサッカライド、ポリサッカライド、及びカルシウム塩等のアルカリ土類金属を含む無機二価金属塩を含む。酵素を安定化するための各種技術を本発明に用いることができる。例えば、幾つかの態様において、本明細書で用いる酵素は組成物中に亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）、及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオン、並びに他の金属イオン（例えば、バナジウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）及びアキソバナジウム（ＩＩ））の水溶性ソースを存在させることにより安定化される。それらはイオンを酵素に提供する。塩化物及び硫酸塩も本発明の幾つかの態様に用いることができる。好適なオリゴサッカライソ及びポリサッカライド（例えば、デキストリン）の例は当業者に知られている（例えば、ＷＯ０７／１４５９６４参照）。幾つかの態様において、可逆性プロテアーゼインヒビターも用いることができ、そのようなものとしてホウ酸含有化合物がある（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）。必要に応じてトリペプチドアルデヒドも更に安定化させるために用いることができる。
【０１２０】
漂白剤、漂白活性剤、及び漂白触媒
幾つかの態様において、漂白活性剤及び／又は漂白触媒も本発明の組成物中に存在する。幾つかの態様において、本発明の洗浄組成物は無機及び／又は有機漂白化合物の含む。無機漂白剤は過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過カルボン酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、無機過水和物塩は追加的な保護物無しで結晶性固形物として含まれる。幾つかの他の態様において、塩がコートされる。当業者に知られている任意の好適な塩を本発明に用いることができる（例えば、ＥＰ２１００９４９参照）。
【０１２１】
幾つかの態様において、漂白活性剤が本発明の発明の組成物中に用いられる。漂白活性剤は通常６０℃以下の温度での洗浄中、漂白作用を高めることができる有機過酸前駆体である。本発明に用いるのに好適な漂白活性剤はペルヒドロ化条件下で、好ましくは１乃至約１０の炭素数、特に約２乃至約４の炭素数の脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は任意で置換された過安息香酸を提供する化合物を含む。追加的な漂白活性剤は当業者に知られており、本発明に用いることができる。（例えば、ＥＰ２１００９４９参照。）
【０１２２】
更に、幾つかの態様及び更なる説明において、本発明の洗浄組成物は少なくとも１つの漂白触媒を含む。幾つかの態様において、コバルト、銅、マンガン、及び鉄錯体のほかに、マンガントリアザシクロノナエート及び関連する化合物が本発明を本発明に用いることができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，２４６，６１２、５，２２７，０８４、４，８１０４１０、ＷＯ ９９／０６５２１、及びＥＰ２１００９４９参照。）
【０１２３】
触媒金属錯体
幾つかの態様において、本発明の洗剤は１つ以上の触媒金属錯体を含む。幾つかの態様において、金属含有漂白触媒を用いる。幾つかの好適な態様において、金属漂白触媒は定義された歯用は組み合わせ触媒活性の遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンカチオン）、僅かな又は漂白活性を有しない補助的な金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒及び補助的な金属カチオン、特にエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミン三（メチレンリン酸）に対して決まった安定度定数を有する抑制剤を含み、これらの水溶性塩も用いることができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，４３０，２４３参照。）幾つかの態様において、本発明の洗剤はマンガン化合物により洗浄効果が促進される。そのような化合物及びその含有量は当業者に知られている。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，５７６，２８２参照。）追加的な態様において、コバルト漂白触媒が本発明の洗剤に用いることができる。各種コバルト漂白触媒が当業者に知られており（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５９７，９３６及び５，５９５，９６７参照）、既知の方法で調整することができる。
【０１２４】
追加的な態様において、本発明の洗剤はポリ大環状剛性リガンド（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。実施するにあたり、方法を限定するわけではないが、幾つかの態様において、本発明の組成物及び洗浄方法は水溶性洗浄媒体の中に活性ＭＲＬ種は少なくとも百万の１部のオーダーになるように調整される。幾つかの好適な態様において、洗浄溶液中ＭＲＬは約０．００５ｐｐｍ乃至約２５ｐｐｍ、より好ましくは約組み合わせ０．０５ｐｐｍ乃至約１０ｐｐｍ、及び最も好ましくは約組み合わせ０．１ｐｐｍ乃至約５ｐｐｍに調整される。
【０１２５】
本発明に用いる遷移金属漂白活性剤に好適な遷移金属は、マンガン、鉄、及びクロムを含むがこれらに限定されない。好適なＭＲＬは架橋された超剛性リガンドを含むがこれらに限定されない。（例えば、５，１２−インデニル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）好適な遷移金属ＭＲＬは当業者により調整される。（例えば、 ＷＯ ２０００／３２６０１、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２２５，４６４参照。）
【０１２６】
金属処理剤
幾つかの態様において、本発明の洗剤は金属処理剤含む。金属処理剤はアルミニウム、ステンレス、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）を含む金属の変色、腐食、及び／又は酸化を避ける及び／又は減らすために用いる。公的な金属処理剤はＥＰ ２ １００ ９４９、ＷＯ９４／２６８６０、及びＷＯ９４／２６８５９に記載のものを含む。幾つかの態様において、金属処理剤は亜鉛塩である。幾つかの更なる態様において、本発明の洗剤は重量により約０．１％乃至約０．５％の１つ以上の金属処理剤を含む。
【０１２７】
洗剤の製造方法及び使用
本発明の洗剤は任意の好適な形態に製剤化することができ、製造者により選択された任意の好適な方法で調整することができる。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８７９，５８４、５，６９１，２９７、５，５７４，００５、５，５６９，６４５、５，５６５，４２２、５，５１６，４４８、５，４８９，３９２、５，４８６，３０３、４，５１５，７０５、４，５３７，７０６、４，５１５，７０７、４，５５０，８６２、４，５６１，９９８、４，５９７，８９８、４，９６８，４５１、５，５６５，１４５、５，９２９，０２２、６，２９４，５１４、及び６，３７６，４４５参照。）
【０１２８】
幾つかの態様において、本発明の洗剤は、タブレット、カプセル、小袋、及び複数に区分された小袋を含む単回投与形態で提供される。幾つかの態様において、この単回投与形態は複数に区分された小袋（又はたの単回投与形態）内で成分の放出を制御できるように設計されている。好適な投与単位及成分の放出を制御する製剤は当業者に知られている。（例えば、ＥＰ２１００９４９、ＷＯ０２／１０２９５５、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，７６５，９１６、及び４，９７２，０１７、並びにＷＯ０４／１１１１７８参照。）
【０１２９】
幾つかの好適な態様において、本発明の洗浄組成物は表面及び／又は布を洗浄することに用いることができる。幾つかの態様において、表面及び／又は布の少なくとも一部分は本発明の洗浄組成物の少なくとも１つの形態と、直接又は水に希釈された形態で接触して、その後この表面及び／又は布が任意で洗浄及び／又はすすがれる。本発明の目的のために、「洗浄」の語は手で洗うこと及び機械的撹拌を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、この布は通常の使用条件下で洗濯可能な任意の布を含む。好適な態様において、本発明の洗浄組成物は溶液中約５００ｐｐｍ乃至１５，０００ｐｐｍの濃度で用いられる。幾つかの態様において、洗浄媒体が水である場合、水の温度は通常約５℃乃至約９０℃である。布洗浄のために好適な態様において、水対布の容量比は約１：１乃至約３０：１の範囲である。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、特定の好適な態様及び本発明の特定の態様を示し、更に説明するために提供される。本発明はこれらの特定の態様に限定することは意図しない。
【０１３１】
以下の実施例において、以下の略語を用いる。
ｐｐｍ（１００万分の１）；Ｍ（モルの）；ｍＭ（ミリモルの）；μＭ（マイクロモルの）；ｎＭ（ナノモルの）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；μｌ及びμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ （秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）；℃（摂氏）；ＱＳ（十分量）；ＮＤ（実施していない）；ＮＡ（適用せず）；ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）；ｗ／ｖ（容量対重量）；ｖ／ｖ（容量対容量）；ｇ（比重）；ＯＤ（光学密度）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（ベースペア）；ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）；ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロイルＬ−フェニル−アラニル−パラニトロアニリド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（２本鎖 ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩化水素）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＢ９２（バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）スブチリシン）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，１０ ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ ７．２］）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＣＲ（ポリメーラゼ連鎖反応）；ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＳＯＣ（２％ バクト−トリプトン，０．５％ バクト酵母抽出液，１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ ｍＭ ＫＣｌ）；テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ；１２ ｇ／ｌ バクトトリプトン，２４ ｇ／ｌ グリセロール，２．３１ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４，及び１２．５４ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４）； ＯＤ２８０ （２８０ｎｍにおける光学密度）；ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学密度）；Ａ４０５（４０５ ｎｍにおける吸光度）；Ｖｍａｘ（酵素触媒反応の初期最大速度）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （トリス［ヒドロキシメチル］アミノエタン−ヒドロクロリド）；ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン三酢酸）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）；ＴＡＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラアセチルエチレンジアミン）；ＰＩ（性能インデックス）；ＳＲ（汚れ除去）；ＭＳ（マススオエクトロコピー）；ＡＡＴＣＣ（米国繊維化学者・色彩技術者協会）；Ａｒｚｂｅｒｇ（Ａｒｚｂｅｒｇ−Ｐｏｒｚｅｌｌａｎ ＧｍｂＨ， Ｓｃｈｉｒｎｄｉｎｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．， Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ， ＮＪ）；ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）；Ｃｏｇｎｉｓ（Ｃｏｇｎｉｓ Ｃｏｒｐ， ＵＳＡ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ， Ｅｓｐｏｏ， Ｆｉｎｌａｎｄ）；Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ， Ｉｎｃ．， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）；Ｈｅｎｋｅｌ（Ｈｅｎｋｅｌ， ＧｍｂＨ， Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＩＫＷ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｖｅｒｂａｎｄ Ｋβｒｐｅｒｆｌｅｇｅ ｕｎｄ Ｗａｓｃｈｍｉｔｔｅｌ，＝Ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ， Ｔｏｉｌｅｔｒｙ， Ｐｅｒｆｕｍｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）；Ｋｏｎｔｒｏｎ（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｚｕｒｉｃｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ （Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ） Ｍｉｅｌｅ（Ｍｉｅｌｅ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ｉｎｓｔｉｒｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘ， Ｃｏｄｅｘ， ＦＲ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）；（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ， Ｂｅｒｋｓ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）；Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ａ ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ ｏｆ ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）；ａｎｄ ｗｆｋ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）
【０１３２】
実施例１
スブチリシン変異体の構築
スブチリシン変異体は既知の融合ＰＣＲにより調製した。（例えば、ＵＳ Ｐｕｂｌｎ． Ｎｏ．２００６／０２５２１５５参照。該文献を参照により本明細書に援用する。）表１−１は融合ＰＣＲで用いたプライマーの配列を提供する。
【表３】
【０１３３】
バチルスクラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）ＰＢ９変異体（Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａの置換を含む、番号はＢＰＮ番号付けを用いた、以下「ＧＣＩ−Ｐ０４０」と呼ぶ）のＤＮＡテンプレートを用いて、Ｓ１０１Ｍ置換を含むＰＢ９２プロテアーゼ変異体を生成した。（以下ＥＲ１１とする。）ＥＲ１１に等しいアミノ酸配列を有する変異体をバチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）ＧＧ３６変異体（Ｓ８７Ｎ＋Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０の置換を含む；ＢＰＮ番号付けを参照）のＤＮＡテンプレートから生成することもできる。
【０１３４】
ＧＧ３６プロテアーゼ前駆体をコードしている合成遺伝子は合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物から構築された。フラグメントをＢｓｍＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてプラスミド骨格ｐＨＰＬＴ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，０２４，９４３）でクローン化した。ｐＨＰＬＴバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴ（Ｐｌａｔ）並びに複製遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、及びブレオマイシン体制遺伝子（ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍｉｄ， １５： ９３−１０３， １９８６）由来の追加的エレメントを含む。ＧＧ３６プロテアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示すＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を下線で示す。
【化１】
【０１３５】
ＧＣＩ−Ｐ０４０のＤＮＡを初めに以下のようにｐＨＰＬＴ発現ベクターへサブクローンした。簡単に説明すると、２μｌの１０ｍＭ ＳａｃＩ−Ｆｗ及びＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒｖ プライマー、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１０μｌの５ＸＨＦ融合緩衝液、１．５μｌのＤＭＳＯ、１単位Ｐのｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、及び１μｌのＰＢ９２Ｖ変異体０４９テンプレートＤＮＡを添加して最終容量を５０μＬとした。以下のプログラムを用いた：９５℃で３分の変性工程、６５℃で１分のアニーリング工程、及び７２℃で３０秒の延伸工程を３０サイクル行い、次いで７２℃を７分行った。完了後、反応生成物を室温で貯蔵した。増幅された直鎖８５９ｂｐのフラグメントをＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（商標）カタログＮｏ．２８１０６）で精製し、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化して、フラグメントの両端に結合性のある末端を生成した。
【０１３６】
約５０ｎｇのプラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６をＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した。３．９ｋｂのベクター骨格フラグメントを単離し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて結合性末端のクローニングについての仕様書に従って、約５０ｎｇＧＣＩ−Ｐ０４０スブチリシンをコードしている消化された８５９ｂｐフラグメントに結合した。リゲーション混合物を用いてバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（表現型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ］）を形質転換した。キシロース誘発プロモーターの下でｃｏｍＫ遺伝子を発現させてこのバクテリアをコンピテントにした。（例えば、Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２１：７６３−７７５，１９９６参照。）
【０１３７】
ＧＣＩ−Ｐ０４０スブチリシン（配列番号８）をコードしている発現ベクターをＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲ技術を用いて、Ｓ１０１位置（ＢＰＮ番号付け）に変異を生成するためのテンプレートとして引き続き用いた。ＢｇｌＩＩ−Ｆｗを第一反応においてＳ１０１Ｘ−Ｒｖプライマーと結合せて、第一フラグメントを生成した。第二フラグメントは第二反応においてＢｇｌＩＩ−Ｒｖ プライマー及びＳ１０１Ｘ−Ｆｗプライマーを組み合わせて生成した。延伸時間を１分１５秒に増やした以外は、ＰＣＲ条件は前述のものと同様であった。
【０１３８】
２つのＰＣＲ反応からの予測されたサイズのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ精製カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてアガロースゲルから精製した。この２つの所望のフラグメントをＢｇｌＩＩ前方向及び後方向プライマー並びにＰＨＵＳＩＯＮ（商標）ポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ増幅により融合させた。以下のプログラムを用いた。９５℃で３分間の変性、６５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で２分間の延伸、これらを２５サイクル行い、７２℃で７分。完了後、反応生成物を室温で貯蔵する。
【０１３９】
融合ＰＣＲ反応からのＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩＩ制限酵素で消化して生成し、アガロースゲルで精製した。このＤＮＡフラグメントを最終容量４０μｌ中に１μｌＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び８μｌの５ＸＴ４リゲーション緩衝液を含む溶液中で１４℃一晩放置して、ＢｇｌＩＩ消化したｐＨＰＬＴ プラスミド骨格に結合した。
【０１４０】
コンピテントバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ： ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ］）を１０μｌのリゲーション生成物を用いて形質転換して、当業者に知られているようなプロテアーゼ陽性変異体を生成した。（例えば、ＷＯ０２／１４４９０参照。）キシロース誘発プロモーターの下でｃｏｍＫ遺伝子を発現させてこのバクテリアをコンピテントにした。（例えば、Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２１：７６３−７７５，１９９６参照。）
【０１４１】
プロテアーゼ陽性クローンをスキムミルク／アガロースプレート上で選択して、単離して、配列決定した。タンパク質は振とうフラスコ内で酵素の相当量を生成して、特徴付けのための試験に用いた。
【０１４２】
実施例２
バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるスブチリシン変異体の生成
バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体を１０ｍｌのＴＳＢ（トリプトン及びダイズブロス）培地中で３７℃一晩育成してスブチリシン変異体を生成した。一晩培養物の２５０μＬのアリコートを１００ｍｌ振とうフラスコ中にある２５ｍｌのＭＯＰＳベース既成培地に移し、３７℃で６８時間育成した。この既成培地は、ＮＨ４Ｃｌ２、ＦｅＳＯ４、及びＣａＣｌ２が取り除かれ、３ｍＭＫ２ＨＰＯ４を用いている以外は当業者に知られているものである（例えば、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１９：７３６−７４７，１９７４参照。）この培地は、６０ｍＭ尿素、７５ｇ／Ｌグルコース、及び １％ソイトンを補っている。微量元素は１００倍ストックとして調製した。該ストックは１リットル当たり４００ｍｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣＯＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ のＮａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの１ＭＣａＣｌ２、及び１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムを含む。所望のプロテアーゼは培養培地から単離された。
【０１４３】
実施例３
スブチリシンサンプルの精製度を決定するための解析方法
この実施例において、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養物から得られた組換えスブチリシンの精製度を決定するために用いる方法を説明する。ゲル電気泳動及び高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）において、それぞれ単一のバンド及びピークが検出されたときにプロテアーゼは精製されたと考えられる。
【０１４４】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を当業者に既知の手順で行った。（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７：６８０−６８５，１９７０）しかしながら、自動分解を防ぐために、タンパク質サンプルの変性（例えば、１００℃のＳＤＳ含有サンプル緩衝液中で１０分）前に、プロテアーゼ活性を失活させる必要がある。プロテアーゼの失活は１ｍＭＰＭＳＦでプロテアーゼサンプルを３０分インキュベートするか、３０分間氷上で８％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でタンパク質を沈殿させることで達成することができる。タンパク質サンプルはｐＨ７．４５で行われる通常のＰＡＧＥにかけられた。ゲル緩衝液は２０ｍＭヒスチジン及び５０ｍＭの３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなり、ポリアクリルアミドゲルは、２０：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド比を有する。タンパク質サンプルをスラブゲルのトップに置いて、陰極に向かって電気泳動させた。サンプルヒスチジン／ＭＯＰＳ緩衝液はｐＨ６．３に調整して電気泳動（タンク）緩衝液として用いた。電気泳動に続いて（〜１乃至２時間、３５０Ｖ）、このゲルを８％酢酸溶液中に浸してタンパク質を固定した。ついでクマシーブルーＲ２５０でゲルを脱色して、既知の方法で脱色を行いタンパク質のバンドを確認した。
【０１４５】
タンパク質サンプル精製度は、ＭｏｎｏＳカチオン交換カラム、次いでＴＳＫ２０００ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ解析により確認することもできる。前者は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で行い、結合タンパク質の溶出は１０乃至３００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．５の勾配を用いて行う。ゲルろ過カラムは０．２５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５で行う。タンパク質溶出プロファイルは２８０ｎｍでモニターして、所望のタンパク質の位置及びサンプルの精製度をモニターした。
【０１４６】
実施例４
スブチリシン濃度の決定
この実施例において、スブチリシン濃度の決定に用いる方法を説明する。幾つかの実験において、計算された消滅係数（ε［イプシロン］）を用いて２８０ｎｍで消滅測定を行った。活性部位の力価は以下で説明するように、精製されたプロテアーゼ溶液におけるタンパク質濃度を決定するために用いた。
【０１４７】
２８０ｎｍでの消滅係数は酵素１分子当たりのトリプトファン（Ｔｒｐ、ε＝５，６００Ｍ−１．ｃｍ−１）及びチロシン（Ｔｙｒ，ε＝１，３３０Ｍ−１．ｃｍ−１）の数から計算される。ＰＢ９２プロテアーゼでは、分子消滅係数は２６，１００ Ｍ−１．ｃｍ−１（３Ｔｒｐ＋７Ｔｙｒ残基）であり、２８０ｎｍ＝９．７（Ｍｒ＝２６，７２９Ｄａ）で測定されるε １％に等しい。変更された数のトリプトファン及び／又はチロシン残基の数を有する変異体の場合、補正がなされる。
【０１４８】
活性酵素分子の評価は活性部位滴定により得られる。広く用いられているＮ−トランスシナモイルイミダゾール（ｔｒａｎｓｃｉｎｎａｍｏｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）によるアクリル化方法（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ８８：５８９０−５９３１， １９６６）はＰＢ９２プロテアーゼには不適であるため、不可逆性インヒビターＰＭＳＦを変りに用いた。この方法において（２８０ｎｍでの吸光度から）酵素濃度が分かっているプロテアーゼ溶液を０．２５、０．５０、０．７５、１．００、及び１．２５のＰＭＳＦ当量になるように調製し、室温、ｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で１時間反応させた。残余プロテアーゼ活性をスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−アラニル−パラ−ニトロアニライド （ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を基質として分光光度計で測定した。これらの実験において、ＰＭＳＦの精製度（及び濃度）はＮＭＲスペクトロコピーで測定して、ＰＭＳＦのストック溶液はイソプロパノールで調製した。活性部位滴定の結果はＨＰＬＣ法を用いて調べたタンパク質濃度の結果と一致していた。
【０１４９】
実施例５
洗浄性能試験
この実施例において、スブチリシン変異体ＥＲ１１及び商業的に利用されている食器用洗剤に用いられているＧＣＩ−Ｐ０３８対照スブチリシンの洗浄性能を評価するのに好適な方法を説明する。
【０１５０】
本明細書においてＥＲ１１と呼ばれるＳ１０１Ｍ＋Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ（ＢＰＮ番号付け）の置換を含む成熟ＰＢ９２プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を以下に示す。
【化２】
【０１５１】
成熟ＧＣＩ−Ｐ０３７（ＰＢ９２）対照スブチリシンのアミノ酸配列を以下に示す。
【化３】
【０１５２】
成熟ＧＣＩ−Ｐ０３８対照スブチリシンのアミノ酸配列を以下に示す。
【化４】
【０１５３】
マイクロスウォッチアッセイによる布洗浄性能
この実施例において、スブチリシン変異体ＥＲ１１及び商業的に利用されているＧＣＩ−Ｐ０３８対照シブチリシンの洗浄性能を測定するための方法を説明する。
【０１５４】
スブチリシン変異体の汚れ除去性能を市販の洗剤においてマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）スケールで決定した。対照スブチリシンとスブチリシン変異体とサンプルをＭＴＰプレートで。３日間、３７℃／３００ｒｐｍ、９０％湿度で培養した培養ブロスをろ過して得た。用いた装置は、９６ウェルマイクロタイタープレート（カタログＮｏ．９０１７媒体結合フラットボトム）、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｌｕｓ ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）
１ｍｍ振幅（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びシーリングテープ（Ｎｕｎｃ Ｎｏ．２３６３６６）である。試薬は、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０又は５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７緩衝液、中程度の硬度にするためにＣａ：Ｍｇを３：１にした。（ＣａＣｌ２：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）；１ガロン当たり１５０００グレイン（ｇｐｇ）を６ｇｐｇに希釈したもの；１プレート当たり２つのＢＭＩ（血液／ミルク／インク）汚れ見本：ＣＦＴのＥＭＰＡ−１１６ＢＭコットン汚れ見本：予めすすいで穴をあけた見本を１ウェルあたり２つ：熱失活させたＴＩＤＥ（商標）２Ｘ冷水用洗剤（プロテアーゼ活性がないことを確認したもの）。このアッセイにおいて、基質をプロテアーゼが加水分解して顔料及び不溶性の汚れを基質から剥がす。
【表４】
【０１５５】
インキュベーターを１６℃又は３２℃の所望の温度に設定し、１０ｐｐｍまでの酵素濃度の希釈されたマスタープレートから１０μｌのサンプルを採取して、１９０μｌのワーキング洗剤媒体中にあるＢＭＩの２つの汚れ見本のプレートに添加した。この容量を試験するアッセイプレート中で最終濃度が０．５ｐｐｍになるように調整した。この汚れ見本プレート（洗剤及び酵素を含む）をテープで多い、４００ｒｐｍのインキュベーター／シェーカー中に３０分間置いた。インキュベーションの後、１００μｌの上清を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４０５ｎｍ及び／又は６００ｎｍの吸光度をＭＴＰリーダーで測定した。４０５ｎｍの測定は高い値を示すと顔料が除去されていることを示し、６００ｎｍの測定値はだ濁度及び洗浄性能を示す。
【０１５６】
汚れ除去活性の計算
得られた吸光度の値をブランク値（酵素なしの基質）で補正して、加水分解活性の測定値を提供する。各サンプル（変異体）のために、性能インデックス（ＰＩ）を計算した。性能インデックスは変異体の性能（実際の値）及び対照酵素の性能（理論値）を同じタンパク質濃度で比較する。更に、標準酵素のラングミュア方程式のパラメーターを用いて理論値を計算する。１よりおおきい性能インデックス（ＰＩ＞１）は標準（例えば、野性型）と比較して、好ましい変異体であることを示し、１のＰＩ（ＰＩ＝１）は標準と同じ性能の変異体であることを示し、１より小さいＰＩ（ＰＩ＜１）は標準よりも悪い変異体を示す。したがって、ＰＩで特定の環境に用いるのに、好ましいもの、好ましくないものを同定することができる。
【０１５７】
実施例６
液体洗濯洗剤組成物
この実施例において、液体洗濯洗剤組成物のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表５】
【表６】
【０１５８】
実施例７
手洗い用液体食器洗浄組成物
この実施例において、手洗い用液体食器洗浄組成物のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表７】
【０１５９】
実施例８
顆粒及び／又はタブレット洗濯用組成物
この実施例において、顆粒及び／又はタブレット洗濯用組成物のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表８】
【表９】
【０１６０】
実施例９
液体洗濯洗剤
この実施例において、液体洗濯洗剤のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１０】
【表１１】
【０１６１】
実施例１０
高濃度食器洗浄洗剤
この実施例において、高濃度食器洗浄洗剤のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１２】
【表１３】
【０１６２】
実施例１１
タブレット洗剤組成物
この実施例は各種タブレット洗剤製剤を提供する。本発明のタブレット洗剤組成物を標準的な１２ヘッドロータリープレスを用いて１３ＫＮ／ｃｍ２の圧力で顆粒食器洗浄組成物を圧縮して調製した。それぞれの製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１４】
【表１５】
【０１６３】
実施例１２
液体硬表面洗浄洗剤
この実施例において、液体硬表面洗浄洗剤のための各種製剤を提供する。本発明の液体洗濯洗剤組成物を以下に示すように調製した。各製剤において、本発明のプロテアーゼ変異体が約０．０００１乃至約１０重量パーセントの濃度で含まれている。幾つかの代替的な態様において、必要に応じてこの製剤を基にして他の濃度を用いることができる。
【表１６】
【０１６４】
明細書に記載された全ての特許と刊行物は、発明の属する技術分野の技術者の水準を示す。全ての特許と刊行物は、各個の刊行物が、特定されかつ個別に引用により組み込まれる場合と同程度に引用により本明細書に組み入れられる。本願発明の好ましい実施態様を述べたので、本願発明の技術分野の通常の技術者には、開示された実施例に種々の変更が行われることができることが明らかであろう。そしてそのような変更は本願発明の範囲内にあることを意図している。
【０１６５】
本明細書に説明のため述べられた発明は、本明細書に特定して開示されていないいずれの発明特定事項、限定もない条件で実施できる。使用された用語及び表現は記述のための用語として使用されており、限定のためではなく、かつそのような用語と表現の使用は、明らかにされかつ述べられた特徴と等価なものまたはその一部と等価なものを排除する意図はなく、むしろ、特許を請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。従って、本願発明は好ましい実施態様と任意の特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修飾、変更は本願発明の技術分野の技術者に委ねられ、且つそのような
【０１６６】
本発明は本明細書に広く、属に関して述べられてきた。属の開示の範囲内にあるより狭い範囲の種及び属より下位の分類のそれぞれもまた本発明の一部を形成する。これには、除外されるものが本明細書で特定して記載されていたか否かに拘らず、当該属からいずれかのものを除外する条件または否定的限定（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を付した発明についての属に関する記述が含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８で定義されるアミノ酸配列を含むスブチリシン変異体を含む洗浄組成物であって、前記洗浄組成物が洗濯洗剤及び手洗い用食器洗剤から選択される、洗浄組成物。
【請求項２】
前記組成物が洗濯洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項３】
前記組成物が手洗い用食器洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項４】
前記組成物が液体洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項５】
前記組成物が、粉末、顆粒、タブレット、又はゲル洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項６】
前記組成物がリン酸塩を含まない、請求項１の洗浄組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの追加的な酵素を更に含む、請求項１の洗浄組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの追加的な酵素が、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェンロキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、βグルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルノニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、並びにこれらの混合物から選択される、請求項７の洗浄組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの漂白剤を更に含む、請求項１の洗浄組成物。
【請求項１０】
洗浄すべき食器又は布並びに配列番号８で定義されるアミノ酸配列を有するスブチリシン変異体を含む布洗浄組成物又は手洗い用食器洗浄組成物を提供する工程、及び前記食器又は布製品又はそれらの表面を前記洗浄組成物に接触させる工程を含む、洗浄方法。
【請求項１１】
前記食器又は布製品をすすぐ工程を更に含む、請求項１０の方法。
【請求項１】
配列番号８で定義されるアミノ酸配列を含むスブチリシン変異体を含む洗浄組成物であって、前記洗浄組成物が洗濯洗剤及び手洗い用食器洗剤から選択される、洗浄組成物。
【請求項２】
前記組成物が洗濯洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項３】
前記組成物が手洗い用食器洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項４】
前記組成物が液体洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項５】
前記組成物が、粉末、顆粒、タブレット、又はゲル洗剤である、請求項１の洗浄組成物。
【請求項６】
前記組成物がリン酸塩を含まない、請求項１の洗浄組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの追加的な酵素を更に含む、請求項１の洗浄組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの追加的な酵素が、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェンロキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、βグルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルノニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、並びにこれらの混合物から選択される、請求項７の洗浄組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの漂白剤を更に含む、請求項１の洗浄組成物。
【請求項１０】
洗浄すべき食器又は布並びに配列番号８で定義されるアミノ酸配列を有するスブチリシン変異体を含む布洗浄組成物又は手洗い用食器洗浄組成物を提供する工程、及び前記食器又は布製品又はそれらの表面を前記洗浄組成物に接触させる工程を含む、洗浄方法。
【請求項１１】
前記食器又は布製品をすすぐ工程を更に含む、請求項１０の方法。
【公表番号】特表２０１２−５０８３１７（Ｐ２０１２−５０８３１７Ａ）
【公表日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６４０７（Ｐ２０１１−５３６４０７）
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３７９７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６６３４
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３７９７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６６３４
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
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