スプライシングバリアント
【課題】細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定する方法を提供する。
【解決手段】トランスクリプトーム解析とプロテオーム解析とを組み合わせることにより、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定する。ｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程を含む。さらにかかる方法により、胃がん細胞の転移性に関与する、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定する。
【解決手段】トランスクリプトーム解析とプロテオーム解析とを組み合わせることにより、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定する。ｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程を含む。さらにかかる方法により、胃がん細胞の転移性に関与する、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スプライシングバリアントや、スプライシングバリアントのスクリーニング方法や、スプライシングバリアントを検出することによる胃がんの判定方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
プレｍＲＮＡの選択的スプライシングは、ヒトゲノム上の限られた数の遺伝子から複雑さを生み出す重要なプロセスであり、多くのヒト遺伝子が選択的スプライシングを受けると予測されている（非特許文献１及び２）。選択的スプライシングは正常細胞における分子プロセスだけでなく、がんにも関連することが明らかになっており（非特許文献３）、その解析が急がれている。
【０００３】
本発明者らは、エクソンアレイを用いた遺伝子発現パターンのスクリーニングにより、大腸がん、特に転移性大腸がんのマーカーや、胃がんのマーカーＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子、ＧＦＲＡ３遺伝子、及びＢＸ５３８２５４遺伝子の新規スプライシングバリアントを同定している（特許文献１）。また、ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規エクソン配列を同定し、これらの新規スプライシングバリアントが、胃がん細胞及び大腸がん細胞に発現することを見いだした（特許文献２）。また、ＤＮＡＪＣ１２、ＵＬＢＰ１、及びＸＡＦ１の新規スプライシングバリアントが高転移性胃がんのマーカーとなりうることや、このＵＬＢＰ１の新規バリアントは胃がん、膵がん、大腸がん、又は乳がんのマーカーとなりうることを開示している（特許文献３）。特許文献４にはＧＳＤＭＢ及びＧＳＤＭＢスプライシングバリアントの発現や変異を指標としたがんの検査方法が、特許文献５にはペリオスチンのスプライシングバリアント（ＰＮ−１）が原発巣の増殖並びに原発巣からの転移をおこす機能を有していることなどが開示されている。
【０００４】
スプライシングバリアントのスクリーニング方法としては、転写配列断片のデータベース及びゲノムデータベスから、既知遺伝子のスプライシングバリアントを網羅的に解析する方法（特許文献６）や、エクソンアレイから得られたエクソン発現データの解析システム及び解析方法を用いた、疾患特異的選択的スプライシング同定法（特許文献７）などが開示されている。しかしながら、従来のスプライシングバリアントのスクリーニング方法はいずれも転写産物の発現情報やゲノム情報に基づいて転写産物のバリエーションに注目したものであり、その産物であるタンパク質が安定に存在するかも定かではないという問題があった。選択的スプライシングバリアントから翻訳されたタンパク質アイソフォームは、タンパク質の構造、ひいてはその機能が変化することから、遺伝子配列の変異を伴わずに細胞機能の変化や疾患を引き起こす可能性が考えられる。したがって、スプライシングバリアントタンパク質が実際に発現しており、そして細胞の性質や疾患に係るスプライシングバリアントを網羅的に解析する方法が望まれていた。
【０００５】
日本の胃がん死亡率の年次推移は、１９６０年代から男女とも大幅な減少傾向にあるが、２００４年にがんで亡くなった人の数では胃がんは男性で第２位、女性で第１位であり、また２０００年の罹患数は死亡数の約２倍であり、治療法や検査法の開発が必要とされていることには変わりがない。また、胃がんでは、早期発見及び手術治療が最も有効で標準的な治療であり、胃がんの転移が胃がん患者の生存率に大きく影響する。したがって、胃がんの判定や胃がんの転移性の判定は、治療法の選択の上でも重要であり、開発が望まれている。
【０００６】
Ｃ型アルドラーゼ（aldolase C, fructose-bisphosphate；ＡＬＤＯＣ）は脳で見いだされ、海馬及びプルキンエ細胞での高い発現が知られる、解糖系におけるフルクトース−１，６−ビスリン酸やフルクトース−１−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセルアルデヒド−３−リン酸又はグリセルアルデヒドへの分解反応を触媒する酵素である。ＡＬＤＯＣ遺伝子については、ＡＬＤＯＣ遺伝子の発現レベルの変化が患者の治療に対する感受性を有することを意味する、がんの治療に対するがん患者の感受性を推定する方法（特許文献８）や、試料中のＡＬＤＯＣ遺伝子又はそれによりコードされたタンパク質の発現レベルを分析する、エポチロンによる病的障害の治療に対する対象の可能性のある反応性を決定する方法（特許文献９）や、ＡＬＤＯＣ遺伝子の低発現を示すか決定する工程を含む、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤に対する悪性細胞または新生物細胞の感受性を評価するための方法（特許文献１０）が開示されているが、ＡＬＤＯＣ遺伝子のスプライシングバリアントについては何ら明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２５２７８７号公報
【特許文献２】特開２００９−２５４３６５号公報
【特許文献３】特開２００９−２５４３６４号公報
【特許文献４】特開２００６−０６１１０８号公報
【特許文献５】再表２００９−００１９４０号公報
【特許文献６】特開２００５−１３５０５３号公報
【特許文献７】特開２００８−０２７２４４号公報
【特許文献８】特表２００９−５２３０１１号公報
【特許文献９】特表２０１０−５３１９８５号公報
【特許文献１０】特表２０１１−５０５８７３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kampa D. et al., Genome Res., 14, 331-342 (2004)
【非特許文献２】Modrek B. et al., Nucl. Acids Res. 29 (13), 2850-2859 (2001)
【非特許文献３】Grosso A. R., EMBO reports 9, 1087-1093 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定する方法を提供することや、細胞の性質や疾患に係る選択的スプライシングバリアントを同定することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、トランスクリプトーム解析とプロテオーム解析とを組み合わせることにより、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は［１］（ａ）性質が異なる２種類の細胞において発現しているｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する工程；（ｂ）前記２種類の細胞において発現しているタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する工程；（ｃ）工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程；（ｄ）前記２種類の細胞間で一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程；（ｅ）二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；（ｆ）工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程；の工程（ａ）〜（ｆ）を備えた、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントのスクリーニング方法や、［２］工程（ａ）においてｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する方法が、エクソンアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイを使用する方法であることを特徴とする前記［１］記載のスクリーニング方法や、［３］工程（ｂ）においてタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する方法が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用する方法であることを特徴とする前記［１］記載のスクリーニング方法や、［４］細胞の性質が、胃がん細胞の転移性であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか記載のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
また、本発明は［５］配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸や、［６］配列番号１〜３のいずれかで示される塩基酸配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸や、［７］配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質や、［８］配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質に関する。
【００１３】
また、本発明は［９］前記［７］又は［８］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体や、［１０］配列番号１５〜２２のいずれかで示される塩基配列からなる、前記［５］又は［６］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーや、［１１］前記［９］記載の抗体、又は前記［１０］記載のプライマーを備えた、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを検出することを特徴とする胃がんの判定用キットや、［１２］（Ａ）試料における前記［５］〜［８］のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量を測定する工程；（Ｂ）工程（Ａ）の発現量がコントロールと比較して高い場合、胃がんと判定する工程；の工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えた、胃がんの判定方法や、［１３］さらに、（Ｃ）試料における前記［５］〜［８］のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量とＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ発現量を比較する工程；（Ｄ）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合、転移性胃がんと評価する工程；の工程（Ｃ）及び（Ｄ）を備えた、前記［１２］記載の判定方法や、［１４］試料が胃組織であることを特徴とする前記［１２］又は［１３］記載の判定方法に関する。
【００１４】
また、本発明は［１５］前記［５］〜［８］のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの核酸又はタンパク質を阻害することを特徴とする胃がん予防・治療剤や、［１６］前記［５］又は［６］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸に対するアンチセンスＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを有効成分とすることを特徴とする前記［１５］記載の胃がん予防・治療剤や、［１７］前記［７］又は［８］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂタンパク質に対する特異的抗体を有効成分とすることを特徴とする前記［１６］記載の胃がん予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントをスクリーニングにより同定することができ、かかる方法で同定された新規のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを提供することや、かかるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを検出することにより胃がん及び／又は胃がんの転移性を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エクソンマイクロアレイ及びｃＤＮＡマイクロアレイを使用したトランスクリプトーム解析、並びにプロテオーム解析の２種の独立したアッセイ系を使用した、スプライシングバリアントのスクリーニング方法の概略を表す図である。
【図２】エクソンマイクロアレイを用いた、ＭＫＮ４５Ｐ細胞（黒丸）及びＭＫＮ４５細胞（白丸）における、ＡＬＤＯＣ、ＰＤＩＡ３、ＬＭＮＡの個別のエクソン及びイントロンに相当するｍＲＮＡ部分領域の発現レベルを解析した結果を示す図である。グラフの横軸はプローブ番号を示し、縦軸は各プローブで検出したｍＲＮＡ発現レベルを示し、グラフ上にプローブ領域との対応する各遺伝子のエクソン構造を示す。また、エクソン構造に付された黒いバーはｃＤＮＡマイクロアレイのプローブの領域を示す。
【図３】ＭＫＮ４５Ｐ細胞及びＭＫＮ４５細胞におけるＡＬＤＯＣ遺伝子及びＴＵＢＡ４Ａ遺伝子のｍＲＮＡ（上段パネル）及びタンパク質（中段パネル）の発現と、その定量結果（平均値±標準偏差）（下段グラフ）を示す。ＡＬＤＯＣタンパク質の発現量はＴＵＢＡ４Ａの発現量で標準化し、ＡＬＤＯＣ遺伝子の発現量はＭＫＮ４５Ｐ細胞におけるＡＬＤＯＣ遺伝子ｍＲＮＡ量を１．０とした発現量比で示す。アスタリスクはｐ＜０．０１（ｔ検定）を表す。
【図４】ＡＬＤＯＣ遺伝子の（ｉ）既知のエクソン構造（アクセッション番号NM_005165）、並びに（ii）スプライシングバリアント４ａ及び（iii）スプライシングバリアント４ｂのエクソン構造を示す図である。新規の選択的スプライシング領域をグレーボックスで表す。ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（配列番号１５及び１６）の位置を黒矢印で、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（配列番号１７〜２０）の位置をグレー矢印で示す。これらのエクソン構造における、ＭＳ／ＭＳ解析で同定されたペプチド断片の位置を黒いバーで表し、またその配列も示す。
【図５】各種胃がん細胞株、胃組織におけるＡＬＤＯＣ遺伝子の（ｉ）既知のエクソン構造、並びに（ii）スプライシングバリアント４ａ及び（iii）スプライシングバリアント４ｂのｍＲＮＡ発現量を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物の電気泳動結果を上側のパネルに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる（ii）スプライシングバリアント４ａ及び（iii）スプライシングバリアント４ｂの発現量の定量結果を下側のグラフに示す。発現レベルは、正常胃組織における各バリアントの発現量を１とした発現量比で表す。
【図６】ＡＬＤＯＣ遺伝子の（ｉ）既知のエクソン構造、（ii）スプライシングバリアント４ａ、（iii）スプライシングバリアント４ｂ、並びにスプライシングバリアント４ｃ及びスプライシングバリアント４ｄのエクソン構造を示す図である。新規の選択的スプライシング領域をグレーボックスで表す。ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーα（配列番号１５）、β（配列番号１６）及びγ（配列番号２２）の位置を黒矢印で示す。プライマーα及びγを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、各サンプルにおけるスプライシングバリアント４ｃ及びスプライシングバリアント４ｄのｍＲＮＡ発現量を調べた結果を下のパネルに示す。Ａ及びＢは正常組織、Ｃは正常組織近接部位、Ｄ〜Ｆはがん組織、Ｇは転移性がん組織のサンプルを、Ｎはテンプレートなしのネガティブコントロールサンプル、ＭはＤＮＡ ladderのマーカーを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において、スプライシングバリアントとは、ゲノムＤＮＡの一次転写産物である不均質核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）から、イントロンを切除し、エクソン配列を連結して最終的なｍＲＮＡ分子を形成するスプライシング過程において、複数のそれぞれ異なるパターンのスプライシングが起こることにより産生される、同じゲノムＤＮＡの一次転写産物由来でありながら塩基配列がそれぞれ異なるｍＲＮＡ、その逆転写物である塩基配列がそれぞれ異なるｃＤＮＡ、及びそれらの翻訳産物であるアミノ酸配列がそれぞれ異なるタンパク質を意味する。本発明において、スプライシングバリアントのｍＲＮＡやｃＤＮＡ、タンパク質と区別するために、従来知られた遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡ、タンパク質を、それぞれ、基本的ｍＲＮＡ、基本的ｃＤＮＡ、基本的タンパク質等と記載することもある。ある遺伝子のスプライスバリアントのｍＲＮＡは、その遺伝子の基本的ｍＲＮＡとは異なるエクソン・イントロン配列構造や、異なる転写開始位置をもつこともある。そのためスプライシングバリアントｍＲＮＡからは、遺伝子の基本的ｃＤＮＡとは異なる塩基配列のｃＤＮＡが逆転写され、基本的タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質が翻訳される。上記スプライシングバリアントｍＲＮＡは、上記スプライシングバリアントタンパク質の製造やスプライシングバリアントｍＲＮＡのアンチセンス鎖からなるスプライシングバリアント検出用プローブの作製に有用であり、上記スプライシングバリアントｃＤＮＡは上記スプライシングバリアントタンパク質の製造やスプライシングバリアント検出用プライマーセットの作製に有用であり、上記スプライシングバリアントタンパク質は、スプライシングバリアント検出用抗体作製用の抗原として有用である。
【００１８】
本発明の細胞の性質に関与するスプライシングバリアントのスクリーニング方法としては、
（ａ）性質が異なる２種類の細胞において発現しているｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差がある遺伝子名を同定する工程；
（ｂ）前記２種類の細胞において発現しているタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程；
（ｄ）前記２種類の細胞間で、一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程；
（ｅ）二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程；
の工程（ａ）〜（ｆ）を備えた方法であれば特に制限されず、使用する細胞を適宜変更することで、様々な細胞の性質に関与するスプライシングバリアントや、細胞の種類や疾患のマーカーとなるスプライシングバリアントを同定することができる。本発明において「細胞の性質」とは、複数の細胞の特徴を比較することによって見いだすことができる特徴であればよく、細胞の形態的、物理的、生物学的な特徴を挙げることができる。細胞の形態的特長としては、細胞の形や大きさ等を挙げることができ、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡等の光学顕微鏡や走査型電子顕微鏡などを利用した観察により見いだすことができ、このとき細胞に適宜固定や染色等の処理を施してから観察することができる。また細胞の物理的な性質としては、細胞の大きさ、体積、質量、弾力性、細胞膜の透過性等の物理的な特徴を挙げることができる。また、細胞の物理的な性質は、例えば圧力、応力、引力、温度、浸透圧、塩濃度、光、湿度等の外部の物理的刺激に対する細胞の耐性や応答性とすることもでき、かかる耐性や応答性などは、物理的刺激の有無による、細胞の物理的な特徴の変化や、生存率、成長率、代謝の速度や効率、適当な細胞シグナル経路の活性化などの変化を調べることにより評価することができる。細胞の生物学的特長としては、細胞の増殖速度や走向性や移動性、増殖因子などサイトカイン刺激に対する応答性、免疫応答性、細菌やウイルスの感染に対する応答性、遺伝子発現やタンパク質発現などを挙げることができ、これらは、免疫染色法やレポーターアッセイ法等、細胞生物学、分子生物学、遺伝学等の分野の常法によって調べることができる。また、細胞の性質としては疾患等により引き起こされた、正常細胞とは異なる細胞の特徴、例えば正常細胞と疾患細胞、正常細胞とがん細胞を比較することにより見いだされる特徴を挙げることができ、かかる疾患としては細菌やウイルスの感染による外因性のものや、内因性のものを挙げることができる。また、例えば、胃がん細胞の転移性という細胞の性質に着目した場合は、胃がん細胞ＭＫＮ４５及び転移性の胃がん細胞ＭＫＮ４５Ｐを使用することにより、胃がんの転移性に関与するスプライシングバリアントをスクリーニングすることができ、同様にして、２種類の細胞の種類や性質等の差異に関与するスプライシングバリアントをスクリーニングすることができる。ここで、細胞とは、細胞株でも、初代培養細胞でも、生体の体液から採取された細胞でも、生体の組織等から採取された細胞等でもよく、その由来としてはヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリ、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス、魚等を挙げることができ、好ましくはヒト由来の細胞を挙げることができる。また、ヒト由来の性質が異なる２種類の細胞や、物理的、化学的又は生物的に異なる環境にさらされた２種類の細胞や、ヒトから採取された疾患組織由来の細胞及び正常組織由来の細胞や、健常人から採取された細胞及び患者から採取された細胞などを例示することができる。的確に２種類の細胞の性質等の差異に関するスプライシングバリアントを同定するためには、これら２種類の細胞のバックグラウンドや、目的の性質以外の性質は似ていることが好ましい。
【００１９】
また、本発明のスクリーニング方法の工程（ａ）は、ｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差がある遺伝子名を同定することができる方法を用いた工程である限りは特に制限されず、ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡを増幅してシークエンシグを行うことによりｍＲＮＡを検出し、発現量を調べ、データベースを参照して遺伝子名の同定を行うこともできるが、多量のサンプルを短時間で扱うことができる、ＤＮＡアレイを使用する方法が好ましい。また、ＳＯＬＥＸＡ、ＳＯＬｉＤ、４５４ ＧＳ ＦＬＸ、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ、ＳＭＲＴ及びＩＯＮ ＰＧＭなどの次世代シーケンサーを用いても構わない。ＤＮＡアレイとしては、遺伝子の各エクソンやイントロンの発現パターン変化を見いだすのに優れているエクソンアレイや、発現量を比較的正確に反映することができる、ｃＤＮＡマイクロアレイを挙げることができ、好ましくはエクソンアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイを使用する方法、さらに好ましくはエクソンアレイ及びｃＤＮＡマイクロアレイを併用する方法を例示することができる。ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた解析により、精度よく２種類の細胞における発現量の差を有意に調べることができ、発現量における有意差としては、発現量の差が好ましくは１．２倍以上、更に好ましくは１．５倍以上、最も好ましくは２倍以上を挙げることができる。ｃＤＮＡマイクロアレイによって２種類の細胞間の発現量における有意差が確認された遺伝子に絞ってエクソンアレイ解析を行うことで、スクリーニングの確実性を上げることができる。また、さらに必要に応じてｍＲＮＡやそのエクソンの発現量の定量解析を、定量ＰＣＲ法などの他の方法と組み合わせて行うこともできる。ｍＲＮＡの調製方法やＤＮＡアレイのアッセイ条件、検出方法、データの解析方法等は適宜選択することができ、前記エクソンアレイやｃＤＮＡマイクロアレイは市販品を入手し（例えば、Affymetrix社製やAgilent社製）、手引きに従って解析を行うことができる。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法の工程（ｂ）は、タンパク質を検出し、その遺伝子名を同定することができる方法を用いた工程であれば特に制限されず、質量分析計を用いて細胞から抽出したタンパク質を解析し、タンパク質を同定する方法を好適に例示することができる。かかる質量分析計としては特に制限されず、イオン源としてＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などを使用することができ、分析部として磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用することも、試料を質量分析計へ導入する前に液体クロマトグラフ（ＬＣ）やＨＰＬＣの工程を経ることもでき、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができ、中でもＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用する方法を好適に例示することができる。
【００２１】
上記工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程（ｃ）の次工程である、本発明のスクリーニング方法の工程（ｄ）は、前記２種類の細胞間で、一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程であれば特に制限されず、ここで部分領域とは、一次候補遺伝子の塩基配列を複数個に分割することにより得られる領域であり、ゲノム上の各エクソン及び各イントロンを各部分領域とすることもできる。一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量の測定は、リアルタイムＰＣＲや定量ＰＣＲ及び次世代シーケンサーで行うこともでき、好ましくはエクソンアレイ解析によって行う例を挙げることができる。基本的ｍＲＮＡ以外にスプライシングバリアントｍＲＮＡが発現している場合には、遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量は一定せずそれぞれ異なると考えられ、特に、２種類の細胞間で発現量に有意差がある部分領域が一部存在する場合には、基本的ｍＲＮＡの他、前記２種類の細胞間で発現量に差があるスプライシングバリアントｍＲＮＡが発現していることを示唆する。
【００２２】
また、本発明のスクリーニング方法の工程（ｅ）は、細胞において発現している二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行う工程であれば特に制限されず、二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングは常法で行うことができ、サンガー法の原理による、蛍光標識ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使用するシークエンシング方法を例示することができる。シークエンシングのリアクション反応は、細胞から抽出したｍＲＮＡ自体をテンプレートとすることも、かかるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡをテンプレートとすることもでき、２種類の細胞の一方、又は好ましくは両方から抽出したサンプルにおける、二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行うことができる。また、シークエンシングに使用するプライマーは、二次候補遺伝子のゲノム塩基配列や、ゲノム上の二次候補遺伝子近傍領域の塩基配列や、二次候補遺伝子の基本的ｍＲＮＡや基本的ｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、適宜設計することができる。シークエンシングにより、基本的ｍＲＮＡの塩基配列と異なる塩基配列であるスプライシングバリアントの塩基配列を同定することができ、かかる塩基配列を、ＤＤＢＪ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）及びＥｎＳｅｍｂｌ（http://www.ensembl.org/）などの適当なデータベースに参照することにより、既知のスプライシングバリアントであるか、新規のスプライシングバリアントであるか、または予測されているスプライシングバリアントであるか調べることができる。さらに、前記２細胞におけるスプライシングバリアントの発現量を調べ、これらの発現量に有意差がある場合、かかるスプライシングバリアントを、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントとして同定することができる。スプライシングバリアントの発現量の測定方法は特に制限されず、ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法などを挙げることができる。これらのＰＣＲ法で使用するプライマーはスプライシングバリアントの塩基配列から適宜設計することができ、スプライシングバリアントのみを増幅するよう設計されたプライマーや、スプライシングバリアントｍＲＮＡをテンプレートとして増幅されるＰＣＲ増幅産物が、基本的ｍＲＮＡをテンプレートとして増幅されるＰＣＲ増幅産物のサイズと異なるよう設計されたプライマーであることが好ましい。
【００２３】
また、本発明のスクリーニング方法の工程（ｆ）は、工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程であればよく、スプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質が、細胞において実際に発現していることを確認できればよい。また、工程（ｂ）とは別に、同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質が細胞において実際に発現していることを確認してもよく、同定したスプライシングバリアントの塩基配列から予想されるスプライシングバリアントタンパク質を特異的に認識することができる抗体がある場合は、かかる抗体を用いて細胞可溶化液をウェスタンブロッティングで解析して、細胞におけるスプライシングバリアントタンパク質の発現を確認することもできる。しかしながら、特異的な抗体を入手することができないことが多いことや、取得したデータの有効利用や作業効率の観点から、工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部が、工程（ｂ）において検出されたタンパク質に含まれることを確認する方法が好ましく、以下の質量分析法を使用した方法を好適に例示することができる。すなわち、工程（ｂ）において、細胞から抽出したタンパク質を質量分析計で解析し、得られたピークリストファイルを、例えばＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion search（www.matrixscience.com）やX! Tandem（www.thegpm.org）ソフトウェアを用いて入手可能な適当なデータセットで解析し、発現しているタンパク質の部分配列とその遺伝子名を同定する。そして、工程（ｆ）においては工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列を含む、自作のデータセットを用いて、ＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion searchなどで、工程（ｂ）における質量分析計を用いた解析で取得した全ピークリストファイルを再検索することにより、ピークリストファイルにおけるスプライシングバリアントタンパク質由来のペプチドのピークを同定し、スプライシングバリアントタンパク質が発現していることを確認することができる。
【００２４】
本発明のスプライシングバリアント核酸としては、前記本発明のスクリーニング方法によって同定されたＡＬＤＯＣ（aldolase C, fructose-bisphosphate；アクセッション番号NM_005165）のスプライシングバリアント核酸を挙げることができ、具体的には配列番号１に示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ核酸や、配列番号２に示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸や、配列番号３に示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｄ核酸の、一部又は全部を挙げることができ、これらの塩基酸配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を挙げることができる。また、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａの塩基配列としては、配列番号１に示される塩基配列における塩基番号２８８番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されたＧ２８８Ａや、塩基番号１２７番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換されたＴ１２７Ｃなどの一塩基多型（ＳＮＰ）を含む塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ核酸も例示することができる。また、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの塩基配列としては、配列番号２に示される塩基配列におけるＡ４６９Ｇ、Ａ９３１Ｇ、Ｔ４５８Ｃ、Ａ８４１ＣなどのＳＮＰを含む塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸を例示することができる。これらの核酸は、ＤＮＡだけでなく、ＤＮＡ塩基配列のチミンがウラシルである、ＲＮＡであってもよく、ＰＣＲ法等を用いてクローニングして得ることも、人工的に化学合成して作製することができ、メチル化などの修飾や蛍光物質などの標識物質や安定同位体などにより標識されていてもよい。
【００２５】
本発明のスプライシングバリアントタンパク質としては、前記スプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができ、具体的には配列番号４〜１４で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を含むスプライシングバリアントタンパク質を例示することができ、前記アミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質であってもよい。これら本発明のスプライシングバリアントタンパク質は、スプライシングバリアントの塩基配列ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで大腸菌や細胞を形質転換し、タンパク質を発現させる遺伝子工学的手法や、人工化学合成の手法により作製することができ、糖化、リン酸化等の修飾を受けてもよく、また蛍光物質などの標識物質や安定同位体により標識されていてもよく、ヒスチジンタグやＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグなどのタグが融合したタンパク質であってもよい。
【００２６】
本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ、及び／又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｃタンパク質を特異的に検出することができる抗体であればよく、前記スプライシングバリアントタンパク質の一部又は全部は抗原として用いることができる。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出するためには、基本的なＡＬＤＯＣタンパク質とは異なるアミノ酸配列である部分を抗原として使用することが好ましく、また他に適宜クライテリアを設けて抗原とするＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質の領域を選択することができる。かかる抗原は、スプライシングバリアントタンパク質の抗原領域の塩基配列からなるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで大腸菌や細胞を形質転換し、抗原タンパク質を発現させることにより得ることができ、ＧＳＴなどのタグを付加したタンパク質とすることもできる。抗原タンパク質はアフィニティーカラムや塩析などの常法で精製することもでき、かかる抗原をマウスやウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の実験動物に１〜複数回、１〜１０日ごとに注射して免疫することにより、実験動物体内でＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質に対する抗体を産生させることができる。かかる抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体として、免疫した動物の血中あるいは、かかる動物由来の抗体産生ハイブリドーマの培養上清等から回収することができる。
【００２７】
本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーとしては、前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸とハイブリダイズし、ＰＣＲ反応において反応産物を得ることができる限り特に制限されず、基本的ｍＲＮＡやｃＤＮＡをテンプレートとして得られる増幅産物とスプライシングバリアントｍＲＮＡやｃＤＮＡをテンプレートとして得られる増幅産物のサイズが異なることが好ましく、あるいは基本的及びスプライシングバリアントｍＲＮＡやｃＤＮＡが混在するサンプルを用いても、スプライシングバリアントをテンプレートとした増幅産物のみが得られることが好ましい。具体的には、配列番号１５〜２２で示される塩基配列からなる、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーを例示することができる。これらのプライマーは、ＰＣＲ反応が損なわれない限り一部の塩基が置換、削除又は任意の塩基が挿入、付加されていてもよい。また、本発明のプライマーは標識物質により適宜標識されていてもよく、標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体や、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーは、胃がんの判定用キットとして提供することもできる。本発明の胃がんの判定用キットとしては、本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体や本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーを備えたキットであれば特に制限されず、他にＰＣＲ酵素、バッファーや洗浄液、検出用試薬、コントロール用サンプルや反応用容器等を備えていてもよい。
【００２８】
本発明の胃がんの判定方法としては、
（Ａ）試料におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量を測定する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の発現量がコントロールと比較して高い場合、胃がんと判定する工程；
の工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えていれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。また、実施の一形態として工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えた胃がんの診断のためのデータを収集する方法を例示することもできる。工程（Ａ）において測定するスプライシングバリアントは、本発明のスプライシングバリアント核酸や、本発明のスプライシングバリアントタンパク質を挙げることができる。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂのいずれか一方でも、両方でもよく、また測定対象はスプライシングバリアントのｍＲＮＡでもタンパク質でも、その両方でもよい。本発明の胃がんの判定方法は、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）に加え、
（Ｃ）試料におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量とＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ発現量を比較する工程；
（Ｄ）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合、転移性胃がんと評価する工程；
の工程（Ｃ）及び（Ｄ）を加えて転移性胃がんの判定方法とすることもできる。かかる転移性胃がんの判定方法は、工程（Ａ）〜（Ｄ）を備えた転移性胃がんの判定方法であれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。工程（Ｃ）において比較するスプライシングバリアントとしては、本発明のスプライシングバリアント核酸や、本発明のスプライシングバリアントタンパク質を挙げることができ、測定対象はｍＲＮＡでもタンパク質でも、その両方でもよい。また、実施の一形態として工程（Ａ）〜（Ｄ）を備えた転移性胃がんの診断のためのデータを収集する方法を例示することもでき、胃がん治療法の選択に利用可能なデータを提供することができる。
【００２９】
本発明の胃がんの判定方法において、スプライシングバリアントタンパク質を測定する方法としては、質量分析法を用いることも、前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法や、免疫染色法や、ウエスタンブロット法等を用いることも、前記胃がんの判定用キットを用いることもできる。また、スプライシングバリアント核酸を測定する方法としては、適宜設計したプライマーやプローブや、前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーを用いて、ＲＮＡ−ＦＩＳＨ法や、ＲＴ−ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により検出することも、市販のエクソンアレイやｃＤＮＡマイクロアレイを用いて検出することもでき、前記胃がんの判定用キットを用いることもできる。また、工程（Ｂ）のコントロールのＡＬＤＯＣスプライシングバリアントの発現量としては、試料と同条件にて測定された正常サンプルにおけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントの発現量であることが好ましく、試料と同時に測定された発現量でも、試料と別途測定され、判断基準とされたコントロール発現量でもよい。また、「発現量がコントロールと比較して高い場合」としては、試料中のスプライシングバリアントの発現量が、コントロールの２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上を例示することができる。工程（Ｄ）の「ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合」としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量が、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａの２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上を例示することができる。
【００３０】
本発明おける試料としては、被検者から採取された生体試料であればよく、すなわち組織、細胞、血液、便などであっても、これらの試料由来の培養細胞などであってもよく、また、被検者から手術等により切除した胃組織などを挙げることができ、これらは適宜防カビ剤や防腐剤の添加、ホルマリン処理などの保存処理を施されていてもよい。あるいは手術等により切除したリンパ節組織や、生検などによりリンパ節から採取された複数のリンパ節細胞用いることにより、原発巣からこのリンパ節組織にがん細胞が転移しているか否かを判定することもできる。
【００３１】
本発明の胃がん予防・治療剤としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び／又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの、核酸及び／又はタンパク質を阻害するものであれば特に制限されず、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｃやＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｄの核酸又はタンパク質も合わせて阻害してもよく、またこれらのスプライシングバリアントの核酸及びタンパク質を同時に又は順次阻害してもよい。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を阻害する方法としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントのｍＲＮＡと相補的な配列からなる、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡや、ｓｉ（short interfering）ＲＮＡ及びｍｉ（micro）ＲＮＡを使用する方法挙げることができ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡがターゲットとする配列の選択、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの設計等は常法により行うことができ、またこれらは適宜標識物質などで標識されていてもよい。また、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を阻害する方法としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質に対する特異的抗体を使用する方法を挙げることができ、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質とその特異的抗体が結合することにより、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質と他のタンパク質などの因子との相互作用が阻害され、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質の機能を阻害することができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
〔スクリーニング〕
ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５及び、その分化株である高転移ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５Ｐの間の、転移に関与する選択的スプライシングのバリエーションを調べるために、トランスクリプトーム解析及びプロテオーム解析の２種の独立したアッセイ系を使用したスクリーニングを行った（図１）。
（細胞及びtotal ＲＮＡ）
実施例において使用した細胞は次の通りである。ＭＫＮ４５、ＡＺ−５２１、ＫＡＴＯIII、ＭＫＮ７４細胞はＪＣＲＢバンク（Japanese Collection of Research Bioresources）より、ＳＮＵ１、ＳＮＵ１６、Ｈｓ７４６Ｔ細胞はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より、ＡＧＳ細胞は大日本住友製薬株式会社より購入した。ＭＫＮ４５Ｐ、ＡＺ−Ｐ７ａ細胞株はYonemura Yutaka博士及びEndo Yoshio博士より提供された。これらの細胞株は、１０％ＦＢＳ、グルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕｎｉｔ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）にて、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【００３４】
１．トランスクリプトーム解析
エクソンマイクロアレイHuman Exon 1.0 ST array及びｃＤＮＡマイクロアレイWhole Human Genome Oligo Microarrayを用いてＭＫＮ４５及びＭＫＮ４５Ｐにおいて発現している転写産物を以下に示す方法で調べ、両アレイにおいてそれぞれの基準を満たした、転移に関与するスプライシングバリアントに関する１０８３遺伝子を抽出した。
（ｃＤＮＡマイクロアレイ）
RNeasy Plus Mini Kit（キアゲン社製）を用いて、ＭＫＮ４５Ｐ及びＭＫＮ４５細胞からtotal ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ濃度をNanoDrop spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific社製）で測定し、精製度はAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社製）で確認した。ｍＲＮＡ発現プロファイリング解析のために、５００ｎｇのtotal ＲＮＡをQuick Amp Labeling Kit（Agilent Technologies社製）で増幅し蛍光標識した。蛍光標識されたサンプルをWhole Human Genome amicroarrays（４×４４Ｋ、Agilent Technology社製）にハイブリダイズさせ、マイクロアレイスライドを洗浄後、ＤＮＡ Microarray Scanner（Agilent Technologies社製）でスキャンし画像を読み取った。スキャン画像はAgilent Feature Extraction software（Agilent Technologies社製）を用いて解析し、データ解析はGeneSpring GX software（Agilent Technologies社製）で行った。全サンプルは、コントロールサンプルの中央値で標準化した。標準化したデータはｔ検定で調べた。補正なしのＰ値が０．０５未満かつ、ＭＫＮ４５細胞と比較してＭＫＤ４５Ｐ細胞において２倍以上ｍＲＮＡ発現が増加することが、転移に関与した遺伝子発現に有意なものとした。その結果、予測転写物を含む、１５３３遺伝子がこの判断基準に合致した。
【００３５】
（エクソンマイクロアレイ）
ＭＫＮ４５Ｐ及びＭＫＮ４５細胞から抽出したtotal ＲＮＡはさらにIVT cRNA Cleanup Kit（Affymetrix社製）を用いて精製し、精製度はAgilent 2100 Bioanalyzerで確認した。精製したtotal ＲＮＡはGeneChip（登録商標） Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay（Affymetrix社製）で増幅し標識した。標識されたサンプルをHuman Exon 1.0 ST Array（Affymetrix社製）に１６時間ハイブリダイズさせた後、GeneChip（登録商標） Scanner 3000 7G（Affymetrix社製）でスキャンした。エクソンパターンを解析するため、エクソンマクロアレイの生データをPartek Genomics Suite Software（Partek社製）を用いて解析した。プローブセット標準化はＲＭＡ（Robust Multi-Chip Average）を用いて行い、これにはバックグラウンド補正、quantile normalization、log2-transformationや、median polish probe set summarizationも含まれる。全プローブセットがスプライシングパターン解析に用いられた。各エクソン、個別遺伝子の発現レベルは、Partek社製ソフトウェアのＡｌｔ−Ｓｐｌｉｃｅ ＡＮＯＶＡ（Alternative splice analysis of variance）を用いて解析した。補正なしのＰ値が０．０５未満であることが、選択的スプライシング現象に有意なものとした。スプライシングインデックス（ＳＩ）を全プローブセットに対して計算した（ＳＩ＝ｌｏｇ２（プローブセット強度／転写発現レベル））結果、予測転写物を含む、２６４４９遺伝子がこの判断基準に合致した。
【００３６】
２．プロテオーム解析
ＨＰＬＣシステムを使用したタンパク質分画によって、プロテオーム解析を以下に示す方法で行った。分画されたタンパク質はトリプシン処理し、information-based acquisition技術（Ito, S., et al., J. Chromatogr. A2004, 1051, 19-23）を利用したnano-flow ＬＣ−ＥＳＩ linear ion trap-ＴＯＦ質量分析計で解析した。その結果、２４０タンパク質をＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞のそれぞれ、又は両細胞から同定した。
（タンパク質抽出及び消化）
ＭＫＮ４５Ｐ及びＭＫＮ４５細胞はTrypsin-ＥＤＴＡ（インビトロジェン社製）を用いて回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。上清を除去した後、細胞ペレットはlysis buffer（７．５Ｍ urea、２．５Ｍ thiourea、１２．５％ glycerol、５０ｍＭ Tris、２．５％ n-octyl-β-D-glucoside、６．２５ｍＭ ＴＣＥＰ、１．２５ｍＭ protease inhibotor）を用いて４℃で６０分間インキュベートし、lysateを作製した。lysateを１５，０００ｇで３０分間遠心操作を行い、上清を回収しタンパク質抽出液とした。このタンパク質抽出液中のタンパク質濃度はBradfordタンパク質アッセイにより調べた。タンパク質抽出液を脱塩した後、250mm×4.6mm Intrada WP-RP（３μｍ粒子と３０ｎｍ穴サイズ、Imtakt社製）を使用したAgilent 1200 HPLC system（Agilent technologies社製）を用いて分画した。５００μｌのタンパク質抽出液（４０μｌ／ｍｌ）を移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）／移動相Ｂ（０．０８％ＴＦＡ／アセトニトリル）グラジエントにロードした。移動相Ｂのグラジエントプロフィールは次の通りである；０．７５ｍｌ／分により３０分間で０−１００％、５分間で１００％。タンパク質抽出液の分画のために、溶出過程をモニターし、０．２５分ごとに溶出液を９６wellプレート（Nunc社製）に回収した。タンパク質抽出液は２回ロードし（２×５００μｌ）、溶出液を９６wellプレート（Nunc社製）に回収した。回収した分画はSpeedVac（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて濃縮し、５０ｍＭ ammonium bicarbonateに溶解した。最後に、トリプシン消化を最終濃度８．３μｇ／ｍｌにて３７℃で１８時間行った。
【００３７】
（質量分析法による解析）
トリプシン消化物をZipTipμ-C18（Millipore社製）で脱塩し、SpeedVacを用いて濃縮した後、０．１％ formic acidに溶解し１０〜１２μｌとした。各サンプルはNano-flow ＬＣ−ＥＳＩ ＬＩＴ−ＴＯＦ mass spectrometer（NanoFrontier L、Hitachi Hith-Technologies社製）を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析した。溶解した消化物は、0.05mm×150mm Monolith Trap C18-50-150（Hitachi Hith-Technologies社製）を介して0.05mm×150mm MonoCap for Fast-flow（GL science社製）に注入し、ペプチドを溶媒Ａ（０．１％formic acid及び２％acetonitrile／水）／溶媒Ｂ（０．１％formic acid及び２％水／acetonitrile）グラジエントを用いて分画した。溶媒Ｂのグラジエントプロフィールは次の通りである；２００ｎｌ／分により１２０分間で２−４０％、１０分間で９５％。各分画のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、duplicateで行った。上記の実験は、２度繰り返し行った。
【００３８】
（データ解析）
ＬＣ−ＥＳＩ生データはNanoFrontier L Data Processing（Hitachi Hith-Technologies社製）によってさまざまなピークリストファイルに変換した。タンパク質を同定するために、このピークリストファイルをＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion search（www.matrixscience.com）及びX! Tandem（www.thegpm.org）ソフトウェアに供した。ペプチド配列アノテーションには、以下のパラメーターと共にSwissProt database of Homo sapiens (human)を使用した：酵素、トリプシン又はなし（自作のデータセットを使用したときのみ）；最大誤切断数、１；peptide tolerance、０．２Ｄａ；ＭＳ／ＭＳ tolerance、０．２Ｄａ；可変修飾、メチオニン酸化；ペプチド電荷、（１＋、２＋及び３＋）。信頼性レベル９５％以下のＭＡＳＣＯＴ閾値スコアで、かつ同定されたペプチド数が２より少ない同定されたタンパク質は全てScaffold software（Proteome Software社製）によってタンパク質リストから除外された。ＭＫＮ４５Ｐ細胞及びＭＫＮ４５細胞において同定されたタンパク質のリストを表１〜表５に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
以上の結果のうち、トランスクリプトーム解析で抽出された１０８３遺伝子の中で、プロテオーム解析によりタンパク質の存在が確認された遺伝子は、ＡＬＤＯＣ（ALDOC_HUMAN、Fructose-bisphosphate aldolase C、アクセッション番号P09972）、ＰＤＩＡ３（PDIA3_HUMAN、Protein disulfide-isomerase A3 precursor、アクセッション番号P30101）、ＬＭＮＡ（LMNA_HUMAN、Lamin-A/C、アクセッション番号P02545）であった。すなわち、ＡＬＤＯＣ（aldolase C, fructose-bisphosphate）、ＰＤＩＡ３（protein disulfide isomerase family A,member 3）、ＬＭＮＡ（lamin A/C）を一次候補遺伝子として同定した（表６）。
【００４５】
【表６】
【００４６】
〔一次候補遺伝子のスプライシングパターン解析〕
これら３つの一次候補遺伝子（ＡＬＤＯＣ、ＰＤＩＡ３、ＬＭＮＡ）の選択的スプライシングパターンを評価するために、個別のエクソン及びイントロンに相当する局所的な発現レベルのシグナルをthe Partek Genomics Suite software（Partek社製）を用いて可視化した（図２）。Exon 1.0 ST Arrayのプローブセットは、既知のエクソン・イントロンだけでなく、アブイニシオ遺伝子予測により予測される転写産物をコードすると予測される遺伝子領域をもカバーする。そのため、このマイクロアレイを用いて、知られていない選択的スプライシングを調べることができる。ＡＬＤＯＣについては、ＭＫＮ４５細胞よりもＭＫＮ４５Ｐ細胞において、エクソン８及び９をカバーするプローブ番号５−７やエクソン３、５及び６をカバーするプローブ番号９−１１の領域の発現レベルが高かった。ＰＤＩＡ３においては、同様に、ＭＫＮ４５Ｐ細胞におけるプローブ番号１２によりエクソン１３の領域の高発現が検出された。その一方で、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子の各エクソン領域の発現レベルに顕著な違いは見られなかった。これらの結果はＡＬＤＯＣ及びＰＤＩＡ３遺伝子に新規のスプライシングバリアントが存在することを示唆する。なお、ＡＬＤＯＣのプローブ番号５領域及びＬＭＮＡのプローブ番号３３及び３５領域は、使用したｃＤＮＡマクロアレイでも同じ領域にプローブが位置している（図２中、黒いバーで示す）。
【００４７】
〔ＡＬＤＯＣ遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベルの検証〕
以上の結果より、ＡＬＤＯＣ及びＰＤＩＡ３遺伝子のタンパク質及びｍＲＮＡの存在、スプライシングパターンの変化が明らかになった。ＡＬＤＯＣ遺伝子はＭＫＮ４５Ｐにおいて高く発現すること、またそのスプライシングパターンがＰＤＩＡ３と比較して変化が大きかった。そのため、ＡＬＤＯＣ遺伝子を二次候補遺伝子として選択し、以降ＡＬＤＯＣ遺伝子に着目し、そのｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＴ及びリアルタイムＰＣＲによって、またそのコードされたＡＬＤＯＣタンパク質をイムノブロッティングにより検証した。
【００４８】
（ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ、シークエンシング解析）
前記の方法で採取し精製したtotal ＲＮＡをThermoScript Reverse transcriptase（インビトロジェン社製）及びoligo(dT)20プライマーを用いて、ThermoScript RT-PCR System（インビトロジェン社製）の手順により逆転写反応を行った。ＲＴ−ＰＣＲ解析には、LA Taq polymerase（タカラバイオ社製）を用いて、ＰＣＲサイクル（９５℃３０秒間、６０℃３０秒間、６８度２分間）を３５サイクル行い、ｃＤＮＡを合成した。使用したプライマーを表７に示す。ＡＬＤＯＣ遺伝子は１３１７塩基対が増幅される、エクソン１及びエクソン９に位置するコーディング領域のプライマー（配列番号２１及び２２）を用いて増幅し、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントについてはエクソン１ａ及びエクソン５に位置する特異的プライマー（配列番号１５及び１６）用いた。コントロールとして、ＴＵＢＡ４Ａ（Tubulin α4a）を用いた（プライマー；5'-CCGGGCAGTTTTTGTGGAT-3'、5'-GGGCCATTTCGGATCTCAT-3'）。ＰＣＲ産物は、１−２％アガロースゲルを用いた電気泳動とSYBR Safe（インビトロジェン社製）により解析した。ＤＮＡシークエンシングには、ウルトラバイオレットにより可視化されたバンドを単離し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）で精製し、この精製したサンプルを、TOPO TA Cloning Kit for Sequencing（インビトロジェン社製）を用いてpCR 2.1-TOPO vector（インビトロジェン社製）にクローニングした。Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）及びABI 3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いてポジティブ形質転換体のシークエンスを確認した。リアルタイムＰＣＲは、ABI PRISM 7900HT Fast Real Time PCR Systems（Applied Biosystems社製）を用いてSYBR Green dye技術によって行った。合成したｃＤＮＡにおけるターゲットフラグメントは表７に示す特異的プライマー、配列番号１７〜２０、２３及び２４を用いてを用いて、以下のプロトコールで行った：９５℃で１５秒間preheatingした後、ＰＣＲサイクル（９５℃１秒間及び６０℃３０秒間、９５℃１５秒間融解、６０℃１５秒間、９５℃１５秒間）を４０サイクル。
【００４９】
【表７】
【００５０】
（イムノブロッティング）
前記プロテオーム解析の方法で定量したライセートを、常法により１２％ポリアクリルゲルにより一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０μｇのライセートタンパク質／well）を行い、ＰＶＤＦ膜（Millipore社製）へ電圧により転写した。この転写物は抗ＡＬＤＯＣヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）又は抗ＴＵＢＡ４Ａウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）の一次抗体と反応させ、それぞれＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識抗ヤギＩｇＧ二次抗体又はＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Jackson Laboratories社製）と反応させた。ECL Plus Western Blotting Detection System（GE Healthcare社製）及びFUJIFILM Luminescent Image Analyzer LAS3000（フジフイルム社製）で可視化した。相対的なタンパク質の発現レベルは、ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）を用いて測定した。
【００５１】
イムノブロッティングの結果から、ＡＬＤＯＣ遺伝子の理論上の発現タンパク質分子量（４０ｋＤａ）のシグナルが確認され、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞においてタンパク質発現量に顕著な違いがないことが確認された。リアルタイムＰＣＲの結果からは、ＭＫＮ４５細胞と比べて、ＭＫＮ４５Ｐ細胞においてＡＬＤＯＣ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は著しく高いことがわかった（図３）。
【００５２】
〔ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ａ及び４ｂの同定〕
ＡＬＤＯＣ遺伝子の予想された選択的スプライシング現象を、ＤＮＡシークエンシグ及び、ＲＴ−ＰＣＲ解析により上記の方法で検証した。ＭＫＮ４５Ｐ細胞において２種の新規スプライシングバリアント、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂを同定した。ＥｎＳｅｍｂｌｅ及びHavana models（http://www.ensembl.org/）により、ＡＬＤＯＣ遺伝子はＡＬＤＯＣ−００４と名づけられたスプライシングバリアントを産生することが予測されていたが、これらＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂとは異なっており、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂは新規のスプライシングバリアントであった。なお、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞においてＡＬＤＯＣ−００４の発現は認められなかった。バリアント４ａは５エクソンからなり、最初のエクソン（エクソン１ａ）は既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物（アクセッション番号NP_005165）におけるイントロン由来であり、エクソン２−４は基本的ＡＬＤＯＣ遺伝子ｍＲＮＡと同じであり、５番目のエクソン（エクソン５ａ）は基本的ＡＬＤＯＣ遺伝子ｍＲＮＡ（アクセッション番号NP_005165）のエクソン５の一部であった。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂのエクソン１ａ及びエクソン２の間のイントロン領域（エクソン１ａ−ｅｘｔ）を含んでいた（図４）。
【００５３】
スプライシングバリアントから翻訳されたタンパク質アイソフォームのペプチド断片を見いだすために、同定されたスプライシングバリアント配列を含む、自作のデータセットを用いて、ＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion searchで全ピークリストファイルを再検索した。自作のデータセットは、６つの読み枠を検索することにより、既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物の配列の一部を含むアミノ酸配列をＡＬＤＯＣバリアントのアミノ酸配列として同定し、新規ＡＬＤＯＣバリアントのアミノ酸配列を含むデータセットとしてデザインした。自作データセットを用いたタンパク質検索のパラメーターは前記ＭＳ／ＭＳ解析と同様である。この自作データセットを使用し、正しくない読み枠から作成されたシュードシークエンスを除くために、既知のＡＬＤＯＣシーケンスと同じ読み枠から作成されたペプチド配列のみを許容した。その結果、バリアント４ｂのエクソン１ａ−ｅｘｔ由来のペプチド断片（ＧＬＭＰＲＴＡＡＬ）をＭＫＮ４５Ｐ細胞において同定した（図４）。また、エクソン４及びエクソン５由来のペプチド断片（ＶＤＫＧＶＶＰＬＡＧＴＤＧＥＴＴＴＱＧＬＤＧＬＳＥＲ及びＧＶＶＰＬＡＧＴＤＧＥＴＴＴＱＧＬＤＧＬＳＥＲ）をＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞において同定した。さらに、既知の転写産物及びバリアント４ｂのエクソン４−５の一部に相当するペプチド断片が、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞において同定された。３つのペプチド断片が同定されたことにより、バリアント４ｂタンパク質の存在が強く示唆される。protein-protein BLAST検索によっても、利用可能なデータベースにおいて、同定されたペプチドを含む１ａ−ｅｘｔペプチド配列と高い相同性の配列は見出されなかった。
【００５４】
〔胃細胞におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び４ｂの発現〕
ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントとがんの転移との関係を明らかにするために、他の胃がん細胞株（ＡＧＳ，ＡＺ−５２１，ＡＺ−Ｐ７ａ，ＳＮＵ１，ＳＮＵ１６，ＫＡＴＯIII，ＭＫＮ７４，Ｈｓ７４６Ｔ）並びに、ヒトの胃の正常組織及びがん組織における、（ｉ）既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物（アクセッション番号NM_005165）、（ii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ、（iii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現レベルを調べた。ＫＡＴＯIII、ＭＫＮ７４、及びＨｓ７４６Ｔは転移性組織由来の細胞株である。ＳＮＵ１及びＳＮＵ１６は未分化がんから樹立された細胞株であり、転移活性に関与するＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）が過剰発現していることが知られている。またヒトの胃の正常組織及びがん組織のtotal ＲＮＡはClontech社より購入し、かかる胃がん組織は、７７歳コーカサス人女性から単離された腺がんであり、リンパ節への転移が確認されたものである。上記（ｉ）〜（iii）のＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を図５上パネルに示す。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、正常胃組織における各スプライシングバリアントの発現量を１とした、各細胞及び組織における各スプライシングバリアントの発現量比を図５下のグラフに示す。標準偏差はトリプリケートのデータから算出した。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲの結果より、（ｉ）既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物（アクセッション番号NM_005165）及び（iii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂは全ての胃がん細胞株、胃がん組織、胃正常組織において発現しているが、（ii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａは細胞株及び組織において比較的発現量が低かった。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び４ｂを定量するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、（iii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現レベルは１０細胞株中７細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ，ＡＧＳ，ＳＮＵ１，ＳＮＵ１６，ＫＡＴＯIII，ＭＫＮ７４，Ｈｓ７４６Ｔ）並びに、胃がん組織及び胃正常組織において特に高い発現が見られた。それに対し、（ii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａは１０細胞株中６細胞株（ＡＧＳ，ＡＺ−５２１，ＳＮＵ１，ＳＮＵ１６，ＫＡＴＯIII，ＭＫＮ７４）及び胃がん組織において高い発現が見られた。中でも、ＳＮＵ１、ＳＮＵ１６及び胃がん組織におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び４ｂの発現量は、正常組織と比較して２０倍以上であった。
【００５６】
〔ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｃ及び４ｄの同定〕
胃の正常組織（Ａ：Clontech社製）、正常組織（Ｂ：Biochain社製）、Adjacent normal tissue（Ｃ：Biochain社製）、がん組織（Ｄ：Clontech社製）、がん組織（Ｅ：Biochain社製）、がん組織（Ｆ：Biochain社製）、転移性がん組織（Ｇ：Biochain社製）のtotal ＲＮＡをテンプレートとし、プライマーα（配列番号１５）及びプライマーγ（配列番号２２）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｎはテンプレートなしのネガティブコントロールサンプル、ＭはＤＮＡマーカーである。結果を図６に示す。ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｃ及び４ｄの発現が確認されたが、ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｃの増幅は、ゲノムをテンプレートとした、ゲノム由来の増幅産物と考えられる。ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｄは、Ｎ末端側、エクソン１ａからエクソン５ａの一部はＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｂと共通するものの、Ｃ末端側にエクソン６〜９を含む構造と考えられる。スプライシングバリアント４ｄはスプライシングバリアント４ａや４ｂとは異なり、胃がん組織や転移性胃がん組織において高い発現は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、遺伝子解析の分野や、スプライシングバリアントのスクリーニングの分野や、疾患に関するスプライシングバリアントをスクリーニングする医療・研究の分野に好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スプライシングバリアントや、スプライシングバリアントのスクリーニング方法や、スプライシングバリアントを検出することによる胃がんの判定方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
プレｍＲＮＡの選択的スプライシングは、ヒトゲノム上の限られた数の遺伝子から複雑さを生み出す重要なプロセスであり、多くのヒト遺伝子が選択的スプライシングを受けると予測されている（非特許文献１及び２）。選択的スプライシングは正常細胞における分子プロセスだけでなく、がんにも関連することが明らかになっており（非特許文献３）、その解析が急がれている。
【０００３】
本発明者らは、エクソンアレイを用いた遺伝子発現パターンのスクリーニングにより、大腸がん、特に転移性大腸がんのマーカーや、胃がんのマーカーＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子、ＧＦＲＡ３遺伝子、及びＢＸ５３８２５４遺伝子の新規スプライシングバリアントを同定している（特許文献１）。また、ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規エクソン配列を同定し、これらの新規スプライシングバリアントが、胃がん細胞及び大腸がん細胞に発現することを見いだした（特許文献２）。また、ＤＮＡＪＣ１２、ＵＬＢＰ１、及びＸＡＦ１の新規スプライシングバリアントが高転移性胃がんのマーカーとなりうることや、このＵＬＢＰ１の新規バリアントは胃がん、膵がん、大腸がん、又は乳がんのマーカーとなりうることを開示している（特許文献３）。特許文献４にはＧＳＤＭＢ及びＧＳＤＭＢスプライシングバリアントの発現や変異を指標としたがんの検査方法が、特許文献５にはペリオスチンのスプライシングバリアント（ＰＮ−１）が原発巣の増殖並びに原発巣からの転移をおこす機能を有していることなどが開示されている。
【０００４】
スプライシングバリアントのスクリーニング方法としては、転写配列断片のデータベース及びゲノムデータベスから、既知遺伝子のスプライシングバリアントを網羅的に解析する方法（特許文献６）や、エクソンアレイから得られたエクソン発現データの解析システム及び解析方法を用いた、疾患特異的選択的スプライシング同定法（特許文献７）などが開示されている。しかしながら、従来のスプライシングバリアントのスクリーニング方法はいずれも転写産物の発現情報やゲノム情報に基づいて転写産物のバリエーションに注目したものであり、その産物であるタンパク質が安定に存在するかも定かではないという問題があった。選択的スプライシングバリアントから翻訳されたタンパク質アイソフォームは、タンパク質の構造、ひいてはその機能が変化することから、遺伝子配列の変異を伴わずに細胞機能の変化や疾患を引き起こす可能性が考えられる。したがって、スプライシングバリアントタンパク質が実際に発現しており、そして細胞の性質や疾患に係るスプライシングバリアントを網羅的に解析する方法が望まれていた。
【０００５】
日本の胃がん死亡率の年次推移は、１９６０年代から男女とも大幅な減少傾向にあるが、２００４年にがんで亡くなった人の数では胃がんは男性で第２位、女性で第１位であり、また２０００年の罹患数は死亡数の約２倍であり、治療法や検査法の開発が必要とされていることには変わりがない。また、胃がんでは、早期発見及び手術治療が最も有効で標準的な治療であり、胃がんの転移が胃がん患者の生存率に大きく影響する。したがって、胃がんの判定や胃がんの転移性の判定は、治療法の選択の上でも重要であり、開発が望まれている。
【０００６】
Ｃ型アルドラーゼ（aldolase C, fructose-bisphosphate；ＡＬＤＯＣ）は脳で見いだされ、海馬及びプルキンエ細胞での高い発現が知られる、解糖系におけるフルクトース−１，６−ビスリン酸やフルクトース−１−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセルアルデヒド−３−リン酸又はグリセルアルデヒドへの分解反応を触媒する酵素である。ＡＬＤＯＣ遺伝子については、ＡＬＤＯＣ遺伝子の発現レベルの変化が患者の治療に対する感受性を有することを意味する、がんの治療に対するがん患者の感受性を推定する方法（特許文献８）や、試料中のＡＬＤＯＣ遺伝子又はそれによりコードされたタンパク質の発現レベルを分析する、エポチロンによる病的障害の治療に対する対象の可能性のある反応性を決定する方法（特許文献９）や、ＡＬＤＯＣ遺伝子の低発現を示すか決定する工程を含む、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤に対する悪性細胞または新生物細胞の感受性を評価するための方法（特許文献１０）が開示されているが、ＡＬＤＯＣ遺伝子のスプライシングバリアントについては何ら明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２５２７８７号公報
【特許文献２】特開２００９−２５４３６５号公報
【特許文献３】特開２００９−２５４３６４号公報
【特許文献４】特開２００６−０６１１０８号公報
【特許文献５】再表２００９−００１９４０号公報
【特許文献６】特開２００５−１３５０５３号公報
【特許文献７】特開２００８−０２７２４４号公報
【特許文献８】特表２００９−５２３０１１号公報
【特許文献９】特表２０１０−５３１９８５号公報
【特許文献１０】特表２０１１−５０５８７３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kampa D. et al., Genome Res., 14, 331-342 (2004)
【非特許文献２】Modrek B. et al., Nucl. Acids Res. 29 (13), 2850-2859 (2001)
【非特許文献３】Grosso A. R., EMBO reports 9, 1087-1093 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定する方法を提供することや、細胞の性質や疾患に係る選択的スプライシングバリアントを同定することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、トランスクリプトーム解析とプロテオーム解析とを組み合わせることにより、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントを同定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は［１］（ａ）性質が異なる２種類の細胞において発現しているｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する工程；（ｂ）前記２種類の細胞において発現しているタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する工程；（ｃ）工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程；（ｄ）前記２種類の細胞間で一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程；（ｅ）二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；（ｆ）工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程；の工程（ａ）〜（ｆ）を備えた、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントのスクリーニング方法や、［２］工程（ａ）においてｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する方法が、エクソンアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイを使用する方法であることを特徴とする前記［１］記載のスクリーニング方法や、［３］工程（ｂ）においてタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する方法が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用する方法であることを特徴とする前記［１］記載のスクリーニング方法や、［４］細胞の性質が、胃がん細胞の転移性であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか記載のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
また、本発明は［５］配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸や、［６］配列番号１〜３のいずれかで示される塩基酸配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸や、［７］配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質や、［８］配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質に関する。
【００１３】
また、本発明は［９］前記［７］又は［８］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体や、［１０］配列番号１５〜２２のいずれかで示される塩基配列からなる、前記［５］又は［６］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーや、［１１］前記［９］記載の抗体、又は前記［１０］記載のプライマーを備えた、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを検出することを特徴とする胃がんの判定用キットや、［１２］（Ａ）試料における前記［５］〜［８］のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量を測定する工程；（Ｂ）工程（Ａ）の発現量がコントロールと比較して高い場合、胃がんと判定する工程；の工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えた、胃がんの判定方法や、［１３］さらに、（Ｃ）試料における前記［５］〜［８］のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量とＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ発現量を比較する工程；（Ｄ）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合、転移性胃がんと評価する工程；の工程（Ｃ）及び（Ｄ）を備えた、前記［１２］記載の判定方法や、［１４］試料が胃組織であることを特徴とする前記［１２］又は［１３］記載の判定方法に関する。
【００１４】
また、本発明は［１５］前記［５］〜［８］のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの核酸又はタンパク質を阻害することを特徴とする胃がん予防・治療剤や、［１６］前記［５］又は［６］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸に対するアンチセンスＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを有効成分とすることを特徴とする前記［１５］記載の胃がん予防・治療剤や、［１７］前記［７］又は［８］に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂタンパク質に対する特異的抗体を有効成分とすることを特徴とする前記［１６］記載の胃がん予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞の性質や疾患に係る、実際に発現している選択的スプライシングバリアントをスクリーニングにより同定することができ、かかる方法で同定された新規のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを提供することや、かかるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを検出することにより胃がん及び／又は胃がんの転移性を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エクソンマイクロアレイ及びｃＤＮＡマイクロアレイを使用したトランスクリプトーム解析、並びにプロテオーム解析の２種の独立したアッセイ系を使用した、スプライシングバリアントのスクリーニング方法の概略を表す図である。
【図２】エクソンマイクロアレイを用いた、ＭＫＮ４５Ｐ細胞（黒丸）及びＭＫＮ４５細胞（白丸）における、ＡＬＤＯＣ、ＰＤＩＡ３、ＬＭＮＡの個別のエクソン及びイントロンに相当するｍＲＮＡ部分領域の発現レベルを解析した結果を示す図である。グラフの横軸はプローブ番号を示し、縦軸は各プローブで検出したｍＲＮＡ発現レベルを示し、グラフ上にプローブ領域との対応する各遺伝子のエクソン構造を示す。また、エクソン構造に付された黒いバーはｃＤＮＡマイクロアレイのプローブの領域を示す。
【図３】ＭＫＮ４５Ｐ細胞及びＭＫＮ４５細胞におけるＡＬＤＯＣ遺伝子及びＴＵＢＡ４Ａ遺伝子のｍＲＮＡ（上段パネル）及びタンパク質（中段パネル）の発現と、その定量結果（平均値±標準偏差）（下段グラフ）を示す。ＡＬＤＯＣタンパク質の発現量はＴＵＢＡ４Ａの発現量で標準化し、ＡＬＤＯＣ遺伝子の発現量はＭＫＮ４５Ｐ細胞におけるＡＬＤＯＣ遺伝子ｍＲＮＡ量を１．０とした発現量比で示す。アスタリスクはｐ＜０．０１（ｔ検定）を表す。
【図４】ＡＬＤＯＣ遺伝子の（ｉ）既知のエクソン構造（アクセッション番号NM_005165）、並びに（ii）スプライシングバリアント４ａ及び（iii）スプライシングバリアント４ｂのエクソン構造を示す図である。新規の選択的スプライシング領域をグレーボックスで表す。ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（配列番号１５及び１６）の位置を黒矢印で、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（配列番号１７〜２０）の位置をグレー矢印で示す。これらのエクソン構造における、ＭＳ／ＭＳ解析で同定されたペプチド断片の位置を黒いバーで表し、またその配列も示す。
【図５】各種胃がん細胞株、胃組織におけるＡＬＤＯＣ遺伝子の（ｉ）既知のエクソン構造、並びに（ii）スプライシングバリアント４ａ及び（iii）スプライシングバリアント４ｂのｍＲＮＡ発現量を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物の電気泳動結果を上側のパネルに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる（ii）スプライシングバリアント４ａ及び（iii）スプライシングバリアント４ｂの発現量の定量結果を下側のグラフに示す。発現レベルは、正常胃組織における各バリアントの発現量を１とした発現量比で表す。
【図６】ＡＬＤＯＣ遺伝子の（ｉ）既知のエクソン構造、（ii）スプライシングバリアント４ａ、（iii）スプライシングバリアント４ｂ、並びにスプライシングバリアント４ｃ及びスプライシングバリアント４ｄのエクソン構造を示す図である。新規の選択的スプライシング領域をグレーボックスで表す。ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーα（配列番号１５）、β（配列番号１６）及びγ（配列番号２２）の位置を黒矢印で示す。プライマーα及びγを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、各サンプルにおけるスプライシングバリアント４ｃ及びスプライシングバリアント４ｄのｍＲＮＡ発現量を調べた結果を下のパネルに示す。Ａ及びＢは正常組織、Ｃは正常組織近接部位、Ｄ〜Ｆはがん組織、Ｇは転移性がん組織のサンプルを、Ｎはテンプレートなしのネガティブコントロールサンプル、ＭはＤＮＡ ladderのマーカーを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において、スプライシングバリアントとは、ゲノムＤＮＡの一次転写産物である不均質核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）から、イントロンを切除し、エクソン配列を連結して最終的なｍＲＮＡ分子を形成するスプライシング過程において、複数のそれぞれ異なるパターンのスプライシングが起こることにより産生される、同じゲノムＤＮＡの一次転写産物由来でありながら塩基配列がそれぞれ異なるｍＲＮＡ、その逆転写物である塩基配列がそれぞれ異なるｃＤＮＡ、及びそれらの翻訳産物であるアミノ酸配列がそれぞれ異なるタンパク質を意味する。本発明において、スプライシングバリアントのｍＲＮＡやｃＤＮＡ、タンパク質と区別するために、従来知られた遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡ、タンパク質を、それぞれ、基本的ｍＲＮＡ、基本的ｃＤＮＡ、基本的タンパク質等と記載することもある。ある遺伝子のスプライスバリアントのｍＲＮＡは、その遺伝子の基本的ｍＲＮＡとは異なるエクソン・イントロン配列構造や、異なる転写開始位置をもつこともある。そのためスプライシングバリアントｍＲＮＡからは、遺伝子の基本的ｃＤＮＡとは異なる塩基配列のｃＤＮＡが逆転写され、基本的タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質が翻訳される。上記スプライシングバリアントｍＲＮＡは、上記スプライシングバリアントタンパク質の製造やスプライシングバリアントｍＲＮＡのアンチセンス鎖からなるスプライシングバリアント検出用プローブの作製に有用であり、上記スプライシングバリアントｃＤＮＡは上記スプライシングバリアントタンパク質の製造やスプライシングバリアント検出用プライマーセットの作製に有用であり、上記スプライシングバリアントタンパク質は、スプライシングバリアント検出用抗体作製用の抗原として有用である。
【００１８】
本発明の細胞の性質に関与するスプライシングバリアントのスクリーニング方法としては、
（ａ）性質が異なる２種類の細胞において発現しているｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差がある遺伝子名を同定する工程；
（ｂ）前記２種類の細胞において発現しているタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程；
（ｄ）前記２種類の細胞間で、一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程；
（ｅ）二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程；
の工程（ａ）〜（ｆ）を備えた方法であれば特に制限されず、使用する細胞を適宜変更することで、様々な細胞の性質に関与するスプライシングバリアントや、細胞の種類や疾患のマーカーとなるスプライシングバリアントを同定することができる。本発明において「細胞の性質」とは、複数の細胞の特徴を比較することによって見いだすことができる特徴であればよく、細胞の形態的、物理的、生物学的な特徴を挙げることができる。細胞の形態的特長としては、細胞の形や大きさ等を挙げることができ、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡等の光学顕微鏡や走査型電子顕微鏡などを利用した観察により見いだすことができ、このとき細胞に適宜固定や染色等の処理を施してから観察することができる。また細胞の物理的な性質としては、細胞の大きさ、体積、質量、弾力性、細胞膜の透過性等の物理的な特徴を挙げることができる。また、細胞の物理的な性質は、例えば圧力、応力、引力、温度、浸透圧、塩濃度、光、湿度等の外部の物理的刺激に対する細胞の耐性や応答性とすることもでき、かかる耐性や応答性などは、物理的刺激の有無による、細胞の物理的な特徴の変化や、生存率、成長率、代謝の速度や効率、適当な細胞シグナル経路の活性化などの変化を調べることにより評価することができる。細胞の生物学的特長としては、細胞の増殖速度や走向性や移動性、増殖因子などサイトカイン刺激に対する応答性、免疫応答性、細菌やウイルスの感染に対する応答性、遺伝子発現やタンパク質発現などを挙げることができ、これらは、免疫染色法やレポーターアッセイ法等、細胞生物学、分子生物学、遺伝学等の分野の常法によって調べることができる。また、細胞の性質としては疾患等により引き起こされた、正常細胞とは異なる細胞の特徴、例えば正常細胞と疾患細胞、正常細胞とがん細胞を比較することにより見いだされる特徴を挙げることができ、かかる疾患としては細菌やウイルスの感染による外因性のものや、内因性のものを挙げることができる。また、例えば、胃がん細胞の転移性という細胞の性質に着目した場合は、胃がん細胞ＭＫＮ４５及び転移性の胃がん細胞ＭＫＮ４５Ｐを使用することにより、胃がんの転移性に関与するスプライシングバリアントをスクリーニングすることができ、同様にして、２種類の細胞の種類や性質等の差異に関与するスプライシングバリアントをスクリーニングすることができる。ここで、細胞とは、細胞株でも、初代培養細胞でも、生体の体液から採取された細胞でも、生体の組織等から採取された細胞等でもよく、その由来としてはヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリ、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス、魚等を挙げることができ、好ましくはヒト由来の細胞を挙げることができる。また、ヒト由来の性質が異なる２種類の細胞や、物理的、化学的又は生物的に異なる環境にさらされた２種類の細胞や、ヒトから採取された疾患組織由来の細胞及び正常組織由来の細胞や、健常人から採取された細胞及び患者から採取された細胞などを例示することができる。的確に２種類の細胞の性質等の差異に関するスプライシングバリアントを同定するためには、これら２種類の細胞のバックグラウンドや、目的の性質以外の性質は似ていることが好ましい。
【００１９】
また、本発明のスクリーニング方法の工程（ａ）は、ｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差がある遺伝子名を同定することができる方法を用いた工程である限りは特に制限されず、ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡを増幅してシークエンシグを行うことによりｍＲＮＡを検出し、発現量を調べ、データベースを参照して遺伝子名の同定を行うこともできるが、多量のサンプルを短時間で扱うことができる、ＤＮＡアレイを使用する方法が好ましい。また、ＳＯＬＥＸＡ、ＳＯＬｉＤ、４５４ ＧＳ ＦＬＸ、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ、ＳＭＲＴ及びＩＯＮ ＰＧＭなどの次世代シーケンサーを用いても構わない。ＤＮＡアレイとしては、遺伝子の各エクソンやイントロンの発現パターン変化を見いだすのに優れているエクソンアレイや、発現量を比較的正確に反映することができる、ｃＤＮＡマイクロアレイを挙げることができ、好ましくはエクソンアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイを使用する方法、さらに好ましくはエクソンアレイ及びｃＤＮＡマイクロアレイを併用する方法を例示することができる。ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた解析により、精度よく２種類の細胞における発現量の差を有意に調べることができ、発現量における有意差としては、発現量の差が好ましくは１．２倍以上、更に好ましくは１．５倍以上、最も好ましくは２倍以上を挙げることができる。ｃＤＮＡマイクロアレイによって２種類の細胞間の発現量における有意差が確認された遺伝子に絞ってエクソンアレイ解析を行うことで、スクリーニングの確実性を上げることができる。また、さらに必要に応じてｍＲＮＡやそのエクソンの発現量の定量解析を、定量ＰＣＲ法などの他の方法と組み合わせて行うこともできる。ｍＲＮＡの調製方法やＤＮＡアレイのアッセイ条件、検出方法、データの解析方法等は適宜選択することができ、前記エクソンアレイやｃＤＮＡマイクロアレイは市販品を入手し（例えば、Affymetrix社製やAgilent社製）、手引きに従って解析を行うことができる。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法の工程（ｂ）は、タンパク質を検出し、その遺伝子名を同定することができる方法を用いた工程であれば特に制限されず、質量分析計を用いて細胞から抽出したタンパク質を解析し、タンパク質を同定する方法を好適に例示することができる。かかる質量分析計としては特に制限されず、イオン源としてＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などを使用することができ、分析部として磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用することも、試料を質量分析計へ導入する前に液体クロマトグラフ（ＬＣ）やＨＰＬＣの工程を経ることもでき、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができ、中でもＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用する方法を好適に例示することができる。
【００２１】
上記工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程（ｃ）の次工程である、本発明のスクリーニング方法の工程（ｄ）は、前記２種類の細胞間で、一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程であれば特に制限されず、ここで部分領域とは、一次候補遺伝子の塩基配列を複数個に分割することにより得られる領域であり、ゲノム上の各エクソン及び各イントロンを各部分領域とすることもできる。一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量の測定は、リアルタイムＰＣＲや定量ＰＣＲ及び次世代シーケンサーで行うこともでき、好ましくはエクソンアレイ解析によって行う例を挙げることができる。基本的ｍＲＮＡ以外にスプライシングバリアントｍＲＮＡが発現している場合には、遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量は一定せずそれぞれ異なると考えられ、特に、２種類の細胞間で発現量に有意差がある部分領域が一部存在する場合には、基本的ｍＲＮＡの他、前記２種類の細胞間で発現量に差があるスプライシングバリアントｍＲＮＡが発現していることを示唆する。
【００２２】
また、本発明のスクリーニング方法の工程（ｅ）は、細胞において発現している二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行う工程であれば特に制限されず、二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングは常法で行うことができ、サンガー法の原理による、蛍光標識ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使用するシークエンシング方法を例示することができる。シークエンシングのリアクション反応は、細胞から抽出したｍＲＮＡ自体をテンプレートとすることも、かかるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡをテンプレートとすることもでき、２種類の細胞の一方、又は好ましくは両方から抽出したサンプルにおける、二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行うことができる。また、シークエンシングに使用するプライマーは、二次候補遺伝子のゲノム塩基配列や、ゲノム上の二次候補遺伝子近傍領域の塩基配列や、二次候補遺伝子の基本的ｍＲＮＡや基本的ｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、適宜設計することができる。シークエンシングにより、基本的ｍＲＮＡの塩基配列と異なる塩基配列であるスプライシングバリアントの塩基配列を同定することができ、かかる塩基配列を、ＤＤＢＪ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）及びＥｎＳｅｍｂｌ（http://www.ensembl.org/）などの適当なデータベースに参照することにより、既知のスプライシングバリアントであるか、新規のスプライシングバリアントであるか、または予測されているスプライシングバリアントであるか調べることができる。さらに、前記２細胞におけるスプライシングバリアントの発現量を調べ、これらの発現量に有意差がある場合、かかるスプライシングバリアントを、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントとして同定することができる。スプライシングバリアントの発現量の測定方法は特に制限されず、ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法などを挙げることができる。これらのＰＣＲ法で使用するプライマーはスプライシングバリアントの塩基配列から適宜設計することができ、スプライシングバリアントのみを増幅するよう設計されたプライマーや、スプライシングバリアントｍＲＮＡをテンプレートとして増幅されるＰＣＲ増幅産物が、基本的ｍＲＮＡをテンプレートとして増幅されるＰＣＲ増幅産物のサイズと異なるよう設計されたプライマーであることが好ましい。
【００２３】
また、本発明のスクリーニング方法の工程（ｆ）は、工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程であればよく、スプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質が、細胞において実際に発現していることを確認できればよい。また、工程（ｂ）とは別に、同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質が細胞において実際に発現していることを確認してもよく、同定したスプライシングバリアントの塩基配列から予想されるスプライシングバリアントタンパク質を特異的に認識することができる抗体がある場合は、かかる抗体を用いて細胞可溶化液をウェスタンブロッティングで解析して、細胞におけるスプライシングバリアントタンパク質の発現を確認することもできる。しかしながら、特異的な抗体を入手することができないことが多いことや、取得したデータの有効利用や作業効率の観点から、工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部が、工程（ｂ）において検出されたタンパク質に含まれることを確認する方法が好ましく、以下の質量分析法を使用した方法を好適に例示することができる。すなわち、工程（ｂ）において、細胞から抽出したタンパク質を質量分析計で解析し、得られたピークリストファイルを、例えばＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion search（www.matrixscience.com）やX! Tandem（www.thegpm.org）ソフトウェアを用いて入手可能な適当なデータセットで解析し、発現しているタンパク質の部分配列とその遺伝子名を同定する。そして、工程（ｆ）においては工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列を含む、自作のデータセットを用いて、ＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion searchなどで、工程（ｂ）における質量分析計を用いた解析で取得した全ピークリストファイルを再検索することにより、ピークリストファイルにおけるスプライシングバリアントタンパク質由来のペプチドのピークを同定し、スプライシングバリアントタンパク質が発現していることを確認することができる。
【００２４】
本発明のスプライシングバリアント核酸としては、前記本発明のスクリーニング方法によって同定されたＡＬＤＯＣ（aldolase C, fructose-bisphosphate；アクセッション番号NM_005165）のスプライシングバリアント核酸を挙げることができ、具体的には配列番号１に示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ核酸や、配列番号２に示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸や、配列番号３に示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｄ核酸の、一部又は全部を挙げることができ、これらの塩基酸配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を挙げることができる。また、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａの塩基配列としては、配列番号１に示される塩基配列における塩基番号２８８番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されたＧ２８８Ａや、塩基番号１２７番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換されたＴ１２７Ｃなどの一塩基多型（ＳＮＰ）を含む塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ核酸も例示することができる。また、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの塩基配列としては、配列番号２に示される塩基配列におけるＡ４６９Ｇ、Ａ９３１Ｇ、Ｔ４５８Ｃ、Ａ８４１ＣなどのＳＮＰを含む塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸を例示することができる。これらの核酸は、ＤＮＡだけでなく、ＤＮＡ塩基配列のチミンがウラシルである、ＲＮＡであってもよく、ＰＣＲ法等を用いてクローニングして得ることも、人工的に化学合成して作製することができ、メチル化などの修飾や蛍光物質などの標識物質や安定同位体などにより標識されていてもよい。
【００２５】
本発明のスプライシングバリアントタンパク質としては、前記スプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができ、具体的には配列番号４〜１４で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を含むスプライシングバリアントタンパク質を例示することができ、前記アミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質であってもよい。これら本発明のスプライシングバリアントタンパク質は、スプライシングバリアントの塩基配列ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで大腸菌や細胞を形質転換し、タンパク質を発現させる遺伝子工学的手法や、人工化学合成の手法により作製することができ、糖化、リン酸化等の修飾を受けてもよく、また蛍光物質などの標識物質や安定同位体により標識されていてもよく、ヒスチジンタグやＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグなどのタグが融合したタンパク質であってもよい。
【００２６】
本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ、及び／又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｃタンパク質を特異的に検出することができる抗体であればよく、前記スプライシングバリアントタンパク質の一部又は全部は抗原として用いることができる。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出するためには、基本的なＡＬＤＯＣタンパク質とは異なるアミノ酸配列である部分を抗原として使用することが好ましく、また他に適宜クライテリアを設けて抗原とするＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質の領域を選択することができる。かかる抗原は、スプライシングバリアントタンパク質の抗原領域の塩基配列からなるＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで大腸菌や細胞を形質転換し、抗原タンパク質を発現させることにより得ることができ、ＧＳＴなどのタグを付加したタンパク質とすることもできる。抗原タンパク質はアフィニティーカラムや塩析などの常法で精製することもでき、かかる抗原をマウスやウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の実験動物に１〜複数回、１〜１０日ごとに注射して免疫することにより、実験動物体内でＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質に対する抗体を産生させることができる。かかる抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体として、免疫した動物の血中あるいは、かかる動物由来の抗体産生ハイブリドーマの培養上清等から回収することができる。
【００２７】
本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーとしては、前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸とハイブリダイズし、ＰＣＲ反応において反応産物を得ることができる限り特に制限されず、基本的ｍＲＮＡやｃＤＮＡをテンプレートとして得られる増幅産物とスプライシングバリアントｍＲＮＡやｃＤＮＡをテンプレートとして得られる増幅産物のサイズが異なることが好ましく、あるいは基本的及びスプライシングバリアントｍＲＮＡやｃＤＮＡが混在するサンプルを用いても、スプライシングバリアントをテンプレートとした増幅産物のみが得られることが好ましい。具体的には、配列番号１５〜２２で示される塩基配列からなる、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーを例示することができる。これらのプライマーは、ＰＣＲ反応が損なわれない限り一部の塩基が置換、削除又は任意の塩基が挿入、付加されていてもよい。また、本発明のプライマーは標識物質により適宜標識されていてもよく、標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体や、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーは、胃がんの判定用キットとして提供することもできる。本発明の胃がんの判定用キットとしては、本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体や本発明のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーを備えたキットであれば特に制限されず、他にＰＣＲ酵素、バッファーや洗浄液、検出用試薬、コントロール用サンプルや反応用容器等を備えていてもよい。
【００２８】
本発明の胃がんの判定方法としては、
（Ａ）試料におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量を測定する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の発現量がコントロールと比較して高い場合、胃がんと判定する工程；
の工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えていれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。また、実施の一形態として工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えた胃がんの診断のためのデータを収集する方法を例示することもできる。工程（Ａ）において測定するスプライシングバリアントは、本発明のスプライシングバリアント核酸や、本発明のスプライシングバリアントタンパク質を挙げることができる。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂのいずれか一方でも、両方でもよく、また測定対象はスプライシングバリアントのｍＲＮＡでもタンパク質でも、その両方でもよい。本発明の胃がんの判定方法は、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）に加え、
（Ｃ）試料におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量とＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ発現量を比較する工程；
（Ｄ）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合、転移性胃がんと評価する工程；
の工程（Ｃ）及び（Ｄ）を加えて転移性胃がんの判定方法とすることもできる。かかる転移性胃がんの判定方法は、工程（Ａ）〜（Ｄ）を備えた転移性胃がんの判定方法であれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。工程（Ｃ）において比較するスプライシングバリアントとしては、本発明のスプライシングバリアント核酸や、本発明のスプライシングバリアントタンパク質を挙げることができ、測定対象はｍＲＮＡでもタンパク質でも、その両方でもよい。また、実施の一形態として工程（Ａ）〜（Ｄ）を備えた転移性胃がんの診断のためのデータを収集する方法を例示することもでき、胃がん治療法の選択に利用可能なデータを提供することができる。
【００２９】
本発明の胃がんの判定方法において、スプライシングバリアントタンパク質を測定する方法としては、質量分析法を用いることも、前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法や、免疫染色法や、ウエスタンブロット法等を用いることも、前記胃がんの判定用キットを用いることもできる。また、スプライシングバリアント核酸を測定する方法としては、適宜設計したプライマーやプローブや、前記ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマーを用いて、ＲＮＡ−ＦＩＳＨ法や、ＲＴ−ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により検出することも、市販のエクソンアレイやｃＤＮＡマイクロアレイを用いて検出することもでき、前記胃がんの判定用キットを用いることもできる。また、工程（Ｂ）のコントロールのＡＬＤＯＣスプライシングバリアントの発現量としては、試料と同条件にて測定された正常サンプルにおけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントの発現量であることが好ましく、試料と同時に測定された発現量でも、試料と別途測定され、判断基準とされたコントロール発現量でもよい。また、「発現量がコントロールと比較して高い場合」としては、試料中のスプライシングバリアントの発現量が、コントロールの２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上を例示することができる。工程（Ｄ）の「ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合」としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量が、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａの２倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上を例示することができる。
【００３０】
本発明おける試料としては、被検者から採取された生体試料であればよく、すなわち組織、細胞、血液、便などであっても、これらの試料由来の培養細胞などであってもよく、また、被検者から手術等により切除した胃組織などを挙げることができ、これらは適宜防カビ剤や防腐剤の添加、ホルマリン処理などの保存処理を施されていてもよい。あるいは手術等により切除したリンパ節組織や、生検などによりリンパ節から採取された複数のリンパ節細胞用いることにより、原発巣からこのリンパ節組織にがん細胞が転移しているか否かを判定することもできる。
【００３１】
本発明の胃がん予防・治療剤としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び／又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの、核酸及び／又はタンパク質を阻害するものであれば特に制限されず、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｃやＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｄの核酸又はタンパク質も合わせて阻害してもよく、またこれらのスプライシングバリアントの核酸及びタンパク質を同時に又は順次阻害してもよい。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を阻害する方法としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントのｍＲＮＡと相補的な配列からなる、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡや、ｓｉ（short interfering）ＲＮＡ及びｍｉ（micro）ＲＮＡを使用する方法挙げることができ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡがターゲットとする配列の選択、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの設計等は常法により行うことができ、またこれらは適宜標識物質などで標識されていてもよい。また、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を阻害する方法としては、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質に対する特異的抗体を使用する方法を挙げることができ、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質とその特異的抗体が結合することにより、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質と他のタンパク質などの因子との相互作用が阻害され、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質の機能を阻害することができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
〔スクリーニング〕
ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５及び、その分化株である高転移ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５Ｐの間の、転移に関与する選択的スプライシングのバリエーションを調べるために、トランスクリプトーム解析及びプロテオーム解析の２種の独立したアッセイ系を使用したスクリーニングを行った（図１）。
（細胞及びtotal ＲＮＡ）
実施例において使用した細胞は次の通りである。ＭＫＮ４５、ＡＺ−５２１、ＫＡＴＯIII、ＭＫＮ７４細胞はＪＣＲＢバンク（Japanese Collection of Research Bioresources）より、ＳＮＵ１、ＳＮＵ１６、Ｈｓ７４６Ｔ細胞はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より、ＡＧＳ細胞は大日本住友製薬株式会社より購入した。ＭＫＮ４５Ｐ、ＡＺ−Ｐ７ａ細胞株はYonemura Yutaka博士及びEndo Yoshio博士より提供された。これらの細胞株は、１０％ＦＢＳ、グルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕｎｉｔ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）にて、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【００３４】
１．トランスクリプトーム解析
エクソンマイクロアレイHuman Exon 1.0 ST array及びｃＤＮＡマイクロアレイWhole Human Genome Oligo Microarrayを用いてＭＫＮ４５及びＭＫＮ４５Ｐにおいて発現している転写産物を以下に示す方法で調べ、両アレイにおいてそれぞれの基準を満たした、転移に関与するスプライシングバリアントに関する１０８３遺伝子を抽出した。
（ｃＤＮＡマイクロアレイ）
RNeasy Plus Mini Kit（キアゲン社製）を用いて、ＭＫＮ４５Ｐ及びＭＫＮ４５細胞からtotal ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ濃度をNanoDrop spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific社製）で測定し、精製度はAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社製）で確認した。ｍＲＮＡ発現プロファイリング解析のために、５００ｎｇのtotal ＲＮＡをQuick Amp Labeling Kit（Agilent Technologies社製）で増幅し蛍光標識した。蛍光標識されたサンプルをWhole Human Genome amicroarrays（４×４４Ｋ、Agilent Technology社製）にハイブリダイズさせ、マイクロアレイスライドを洗浄後、ＤＮＡ Microarray Scanner（Agilent Technologies社製）でスキャンし画像を読み取った。スキャン画像はAgilent Feature Extraction software（Agilent Technologies社製）を用いて解析し、データ解析はGeneSpring GX software（Agilent Technologies社製）で行った。全サンプルは、コントロールサンプルの中央値で標準化した。標準化したデータはｔ検定で調べた。補正なしのＰ値が０．０５未満かつ、ＭＫＮ４５細胞と比較してＭＫＤ４５Ｐ細胞において２倍以上ｍＲＮＡ発現が増加することが、転移に関与した遺伝子発現に有意なものとした。その結果、予測転写物を含む、１５３３遺伝子がこの判断基準に合致した。
【００３５】
（エクソンマイクロアレイ）
ＭＫＮ４５Ｐ及びＭＫＮ４５細胞から抽出したtotal ＲＮＡはさらにIVT cRNA Cleanup Kit（Affymetrix社製）を用いて精製し、精製度はAgilent 2100 Bioanalyzerで確認した。精製したtotal ＲＮＡはGeneChip（登録商標） Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay（Affymetrix社製）で増幅し標識した。標識されたサンプルをHuman Exon 1.0 ST Array（Affymetrix社製）に１６時間ハイブリダイズさせた後、GeneChip（登録商標） Scanner 3000 7G（Affymetrix社製）でスキャンした。エクソンパターンを解析するため、エクソンマクロアレイの生データをPartek Genomics Suite Software（Partek社製）を用いて解析した。プローブセット標準化はＲＭＡ（Robust Multi-Chip Average）を用いて行い、これにはバックグラウンド補正、quantile normalization、log2-transformationや、median polish probe set summarizationも含まれる。全プローブセットがスプライシングパターン解析に用いられた。各エクソン、個別遺伝子の発現レベルは、Partek社製ソフトウェアのＡｌｔ−Ｓｐｌｉｃｅ ＡＮＯＶＡ（Alternative splice analysis of variance）を用いて解析した。補正なしのＰ値が０．０５未満であることが、選択的スプライシング現象に有意なものとした。スプライシングインデックス（ＳＩ）を全プローブセットに対して計算した（ＳＩ＝ｌｏｇ２（プローブセット強度／転写発現レベル））結果、予測転写物を含む、２６４４９遺伝子がこの判断基準に合致した。
【００３６】
２．プロテオーム解析
ＨＰＬＣシステムを使用したタンパク質分画によって、プロテオーム解析を以下に示す方法で行った。分画されたタンパク質はトリプシン処理し、information-based acquisition技術（Ito, S., et al., J. Chromatogr. A2004, 1051, 19-23）を利用したnano-flow ＬＣ−ＥＳＩ linear ion trap-ＴＯＦ質量分析計で解析した。その結果、２４０タンパク質をＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞のそれぞれ、又は両細胞から同定した。
（タンパク質抽出及び消化）
ＭＫＮ４５Ｐ及びＭＫＮ４５細胞はTrypsin-ＥＤＴＡ（インビトロジェン社製）を用いて回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。上清を除去した後、細胞ペレットはlysis buffer（７．５Ｍ urea、２．５Ｍ thiourea、１２．５％ glycerol、５０ｍＭ Tris、２．５％ n-octyl-β-D-glucoside、６．２５ｍＭ ＴＣＥＰ、１．２５ｍＭ protease inhibotor）を用いて４℃で６０分間インキュベートし、lysateを作製した。lysateを１５，０００ｇで３０分間遠心操作を行い、上清を回収しタンパク質抽出液とした。このタンパク質抽出液中のタンパク質濃度はBradfordタンパク質アッセイにより調べた。タンパク質抽出液を脱塩した後、250mm×4.6mm Intrada WP-RP（３μｍ粒子と３０ｎｍ穴サイズ、Imtakt社製）を使用したAgilent 1200 HPLC system（Agilent technologies社製）を用いて分画した。５００μｌのタンパク質抽出液（４０μｌ／ｍｌ）を移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）／移動相Ｂ（０．０８％ＴＦＡ／アセトニトリル）グラジエントにロードした。移動相Ｂのグラジエントプロフィールは次の通りである；０．７５ｍｌ／分により３０分間で０−１００％、５分間で１００％。タンパク質抽出液の分画のために、溶出過程をモニターし、０．２５分ごとに溶出液を９６wellプレート（Nunc社製）に回収した。タンパク質抽出液は２回ロードし（２×５００μｌ）、溶出液を９６wellプレート（Nunc社製）に回収した。回収した分画はSpeedVac（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて濃縮し、５０ｍＭ ammonium bicarbonateに溶解した。最後に、トリプシン消化を最終濃度８．３μｇ／ｍｌにて３７℃で１８時間行った。
【００３７】
（質量分析法による解析）
トリプシン消化物をZipTipμ-C18（Millipore社製）で脱塩し、SpeedVacを用いて濃縮した後、０．１％ formic acidに溶解し１０〜１２μｌとした。各サンプルはNano-flow ＬＣ−ＥＳＩ ＬＩＴ−ＴＯＦ mass spectrometer（NanoFrontier L、Hitachi Hith-Technologies社製）を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析した。溶解した消化物は、0.05mm×150mm Monolith Trap C18-50-150（Hitachi Hith-Technologies社製）を介して0.05mm×150mm MonoCap for Fast-flow（GL science社製）に注入し、ペプチドを溶媒Ａ（０．１％formic acid及び２％acetonitrile／水）／溶媒Ｂ（０．１％formic acid及び２％水／acetonitrile）グラジエントを用いて分画した。溶媒Ｂのグラジエントプロフィールは次の通りである；２００ｎｌ／分により１２０分間で２−４０％、１０分間で９５％。各分画のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、duplicateで行った。上記の実験は、２度繰り返し行った。
【００３８】
（データ解析）
ＬＣ−ＥＳＩ生データはNanoFrontier L Data Processing（Hitachi Hith-Technologies社製）によってさまざまなピークリストファイルに変換した。タンパク質を同定するために、このピークリストファイルをＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion search（www.matrixscience.com）及びX! Tandem（www.thegpm.org）ソフトウェアに供した。ペプチド配列アノテーションには、以下のパラメーターと共にSwissProt database of Homo sapiens (human)を使用した：酵素、トリプシン又はなし（自作のデータセットを使用したときのみ）；最大誤切断数、１；peptide tolerance、０．２Ｄａ；ＭＳ／ＭＳ tolerance、０．２Ｄａ；可変修飾、メチオニン酸化；ペプチド電荷、（１＋、２＋及び３＋）。信頼性レベル９５％以下のＭＡＳＣＯＴ閾値スコアで、かつ同定されたペプチド数が２より少ない同定されたタンパク質は全てScaffold software（Proteome Software社製）によってタンパク質リストから除外された。ＭＫＮ４５Ｐ細胞及びＭＫＮ４５細胞において同定されたタンパク質のリストを表１〜表５に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
以上の結果のうち、トランスクリプトーム解析で抽出された１０８３遺伝子の中で、プロテオーム解析によりタンパク質の存在が確認された遺伝子は、ＡＬＤＯＣ（ALDOC_HUMAN、Fructose-bisphosphate aldolase C、アクセッション番号P09972）、ＰＤＩＡ３（PDIA3_HUMAN、Protein disulfide-isomerase A3 precursor、アクセッション番号P30101）、ＬＭＮＡ（LMNA_HUMAN、Lamin-A/C、アクセッション番号P02545）であった。すなわち、ＡＬＤＯＣ（aldolase C, fructose-bisphosphate）、ＰＤＩＡ３（protein disulfide isomerase family A,member 3）、ＬＭＮＡ（lamin A/C）を一次候補遺伝子として同定した（表６）。
【００４５】
【表６】
【００４６】
〔一次候補遺伝子のスプライシングパターン解析〕
これら３つの一次候補遺伝子（ＡＬＤＯＣ、ＰＤＩＡ３、ＬＭＮＡ）の選択的スプライシングパターンを評価するために、個別のエクソン及びイントロンに相当する局所的な発現レベルのシグナルをthe Partek Genomics Suite software（Partek社製）を用いて可視化した（図２）。Exon 1.0 ST Arrayのプローブセットは、既知のエクソン・イントロンだけでなく、アブイニシオ遺伝子予測により予測される転写産物をコードすると予測される遺伝子領域をもカバーする。そのため、このマイクロアレイを用いて、知られていない選択的スプライシングを調べることができる。ＡＬＤＯＣについては、ＭＫＮ４５細胞よりもＭＫＮ４５Ｐ細胞において、エクソン８及び９をカバーするプローブ番号５−７やエクソン３、５及び６をカバーするプローブ番号９−１１の領域の発現レベルが高かった。ＰＤＩＡ３においては、同様に、ＭＫＮ４５Ｐ細胞におけるプローブ番号１２によりエクソン１３の領域の高発現が検出された。その一方で、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子の各エクソン領域の発現レベルに顕著な違いは見られなかった。これらの結果はＡＬＤＯＣ及びＰＤＩＡ３遺伝子に新規のスプライシングバリアントが存在することを示唆する。なお、ＡＬＤＯＣのプローブ番号５領域及びＬＭＮＡのプローブ番号３３及び３５領域は、使用したｃＤＮＡマクロアレイでも同じ領域にプローブが位置している（図２中、黒いバーで示す）。
【００４７】
〔ＡＬＤＯＣ遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベルの検証〕
以上の結果より、ＡＬＤＯＣ及びＰＤＩＡ３遺伝子のタンパク質及びｍＲＮＡの存在、スプライシングパターンの変化が明らかになった。ＡＬＤＯＣ遺伝子はＭＫＮ４５Ｐにおいて高く発現すること、またそのスプライシングパターンがＰＤＩＡ３と比較して変化が大きかった。そのため、ＡＬＤＯＣ遺伝子を二次候補遺伝子として選択し、以降ＡＬＤＯＣ遺伝子に着目し、そのｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＴ及びリアルタイムＰＣＲによって、またそのコードされたＡＬＤＯＣタンパク質をイムノブロッティングにより検証した。
【００４８】
（ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ、シークエンシング解析）
前記の方法で採取し精製したtotal ＲＮＡをThermoScript Reverse transcriptase（インビトロジェン社製）及びoligo(dT)20プライマーを用いて、ThermoScript RT-PCR System（インビトロジェン社製）の手順により逆転写反応を行った。ＲＴ−ＰＣＲ解析には、LA Taq polymerase（タカラバイオ社製）を用いて、ＰＣＲサイクル（９５℃３０秒間、６０℃３０秒間、６８度２分間）を３５サイクル行い、ｃＤＮＡを合成した。使用したプライマーを表７に示す。ＡＬＤＯＣ遺伝子は１３１７塩基対が増幅される、エクソン１及びエクソン９に位置するコーディング領域のプライマー（配列番号２１及び２２）を用いて増幅し、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントについてはエクソン１ａ及びエクソン５に位置する特異的プライマー（配列番号１５及び１６）用いた。コントロールとして、ＴＵＢＡ４Ａ（Tubulin α4a）を用いた（プライマー；5'-CCGGGCAGTTTTTGTGGAT-3'、5'-GGGCCATTTCGGATCTCAT-3'）。ＰＣＲ産物は、１−２％アガロースゲルを用いた電気泳動とSYBR Safe（インビトロジェン社製）により解析した。ＤＮＡシークエンシングには、ウルトラバイオレットにより可視化されたバンドを単離し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）で精製し、この精製したサンプルを、TOPO TA Cloning Kit for Sequencing（インビトロジェン社製）を用いてpCR 2.1-TOPO vector（インビトロジェン社製）にクローニングした。Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）及びABI 3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いてポジティブ形質転換体のシークエンスを確認した。リアルタイムＰＣＲは、ABI PRISM 7900HT Fast Real Time PCR Systems（Applied Biosystems社製）を用いてSYBR Green dye技術によって行った。合成したｃＤＮＡにおけるターゲットフラグメントは表７に示す特異的プライマー、配列番号１７〜２０、２３及び２４を用いてを用いて、以下のプロトコールで行った：９５℃で１５秒間preheatingした後、ＰＣＲサイクル（９５℃１秒間及び６０℃３０秒間、９５℃１５秒間融解、６０℃１５秒間、９５℃１５秒間）を４０サイクル。
【００４９】
【表７】
【００５０】
（イムノブロッティング）
前記プロテオーム解析の方法で定量したライセートを、常法により１２％ポリアクリルゲルにより一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０μｇのライセートタンパク質／well）を行い、ＰＶＤＦ膜（Millipore社製）へ電圧により転写した。この転写物は抗ＡＬＤＯＣヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）又は抗ＴＵＢＡ４Ａウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）の一次抗体と反応させ、それぞれＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識抗ヤギＩｇＧ二次抗体又はＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Jackson Laboratories社製）と反応させた。ECL Plus Western Blotting Detection System（GE Healthcare社製）及びFUJIFILM Luminescent Image Analyzer LAS3000（フジフイルム社製）で可視化した。相対的なタンパク質の発現レベルは、ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）を用いて測定した。
【００５１】
イムノブロッティングの結果から、ＡＬＤＯＣ遺伝子の理論上の発現タンパク質分子量（４０ｋＤａ）のシグナルが確認され、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞においてタンパク質発現量に顕著な違いがないことが確認された。リアルタイムＰＣＲの結果からは、ＭＫＮ４５細胞と比べて、ＭＫＮ４５Ｐ細胞においてＡＬＤＯＣ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は著しく高いことがわかった（図３）。
【００５２】
〔ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ａ及び４ｂの同定〕
ＡＬＤＯＣ遺伝子の予想された選択的スプライシング現象を、ＤＮＡシークエンシグ及び、ＲＴ−ＰＣＲ解析により上記の方法で検証した。ＭＫＮ４５Ｐ細胞において２種の新規スプライシングバリアント、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂを同定した。ＥｎＳｅｍｂｌｅ及びHavana models（http://www.ensembl.org/）により、ＡＬＤＯＣ遺伝子はＡＬＤＯＣ−００４と名づけられたスプライシングバリアントを産生することが予測されていたが、これらＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂとは異なっており、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂは新規のスプライシングバリアントであった。なお、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞においてＡＬＤＯＣ−００４の発現は認められなかった。バリアント４ａは５エクソンからなり、最初のエクソン（エクソン１ａ）は既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物（アクセッション番号NP_005165）におけるイントロン由来であり、エクソン２−４は基本的ＡＬＤＯＣ遺伝子ｍＲＮＡと同じであり、５番目のエクソン（エクソン５ａ）は基本的ＡＬＤＯＣ遺伝子ｍＲＮＡ（アクセッション番号NP_005165）のエクソン５の一部であった。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及びＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂのエクソン１ａ及びエクソン２の間のイントロン領域（エクソン１ａ−ｅｘｔ）を含んでいた（図４）。
【００５３】
スプライシングバリアントから翻訳されたタンパク質アイソフォームのペプチド断片を見いだすために、同定されたスプライシングバリアント配列を含む、自作のデータセットを用いて、ＭＡＳＣＯＴ ＭＳ／ＭＳ ion searchで全ピークリストファイルを再検索した。自作のデータセットは、６つの読み枠を検索することにより、既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物の配列の一部を含むアミノ酸配列をＡＬＤＯＣバリアントのアミノ酸配列として同定し、新規ＡＬＤＯＣバリアントのアミノ酸配列を含むデータセットとしてデザインした。自作データセットを用いたタンパク質検索のパラメーターは前記ＭＳ／ＭＳ解析と同様である。この自作データセットを使用し、正しくない読み枠から作成されたシュードシークエンスを除くために、既知のＡＬＤＯＣシーケンスと同じ読み枠から作成されたペプチド配列のみを許容した。その結果、バリアント４ｂのエクソン１ａ−ｅｘｔ由来のペプチド断片（ＧＬＭＰＲＴＡＡＬ）をＭＫＮ４５Ｐ細胞において同定した（図４）。また、エクソン４及びエクソン５由来のペプチド断片（ＶＤＫＧＶＶＰＬＡＧＴＤＧＥＴＴＴＱＧＬＤＧＬＳＥＲ及びＧＶＶＰＬＡＧＴＤＧＥＴＴＴＱＧＬＤＧＬＳＥＲ）をＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞において同定した。さらに、既知の転写産物及びバリアント４ｂのエクソン４−５の一部に相当するペプチド断片が、ＭＫＮ４５細胞及びＭＫＮ４５Ｐ細胞において同定された。３つのペプチド断片が同定されたことにより、バリアント４ｂタンパク質の存在が強く示唆される。protein-protein BLAST検索によっても、利用可能なデータベースにおいて、同定されたペプチドを含む１ａ−ｅｘｔペプチド配列と高い相同性の配列は見出されなかった。
【００５４】
〔胃細胞におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び４ｂの発現〕
ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントとがんの転移との関係を明らかにするために、他の胃がん細胞株（ＡＧＳ，ＡＺ−５２１，ＡＺ−Ｐ７ａ，ＳＮＵ１，ＳＮＵ１６，ＫＡＴＯIII，ＭＫＮ７４，Ｈｓ７４６Ｔ）並びに、ヒトの胃の正常組織及びがん組織における、（ｉ）既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物（アクセッション番号NM_005165）、（ii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ、（iii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現レベルを調べた。ＫＡＴＯIII、ＭＫＮ７４、及びＨｓ７４６Ｔは転移性組織由来の細胞株である。ＳＮＵ１及びＳＮＵ１６は未分化がんから樹立された細胞株であり、転移活性に関与するＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）が過剰発現していることが知られている。またヒトの胃の正常組織及びがん組織のtotal ＲＮＡはClontech社より購入し、かかる胃がん組織は、７７歳コーカサス人女性から単離された腺がんであり、リンパ節への転移が確認されたものである。上記（ｉ）〜（iii）のＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を図５上パネルに示す。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、正常胃組織における各スプライシングバリアントの発現量を１とした、各細胞及び組織における各スプライシングバリアントの発現量比を図５下のグラフに示す。標準偏差はトリプリケートのデータから算出した。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲの結果より、（ｉ）既知のＡＬＤＯＣ遺伝子転写産物（アクセッション番号NM_005165）及び（iii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂは全ての胃がん細胞株、胃がん組織、胃正常組織において発現しているが、（ii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａは細胞株及び組織において比較的発現量が低かった。ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び４ｂを定量するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、（iii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現レベルは１０細胞株中７細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ，ＡＧＳ，ＳＮＵ１，ＳＮＵ１６，ＫＡＴＯIII，ＭＫＮ７４，Ｈｓ７４６Ｔ）並びに、胃がん組織及び胃正常組織において特に高い発現が見られた。それに対し、（ii）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａは１０細胞株中６細胞株（ＡＧＳ，ＡＺ−５２１，ＳＮＵ１，ＳＮＵ１６，ＫＡＴＯIII，ＭＫＮ７４）及び胃がん組織において高い発現が見られた。中でも、ＳＮＵ１、ＳＮＵ１６及び胃がん組織におけるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ及び４ｂの発現量は、正常組織と比較して２０倍以上であった。
【００５６】
〔ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｃ及び４ｄの同定〕
胃の正常組織（Ａ：Clontech社製）、正常組織（Ｂ：Biochain社製）、Adjacent normal tissue（Ｃ：Biochain社製）、がん組織（Ｄ：Clontech社製）、がん組織（Ｅ：Biochain社製）、がん組織（Ｆ：Biochain社製）、転移性がん組織（Ｇ：Biochain社製）のtotal ＲＮＡをテンプレートとし、プライマーα（配列番号１５）及びプライマーγ（配列番号２２）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｎはテンプレートなしのネガティブコントロールサンプル、ＭはＤＮＡマーカーである。結果を図６に示す。ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｃ及び４ｄの発現が確認されたが、ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｃの増幅は、ゲノムをテンプレートとした、ゲノム由来の増幅産物と考えられる。ＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｄは、Ｎ末端側、エクソン１ａからエクソン５ａの一部はＡＬＤＯＣ遺伝子の選択的スプライシングバリアント４ｂと共通するものの、Ｃ末端側にエクソン６〜９を含む構造と考えられる。スプライシングバリアント４ｄはスプライシングバリアント４ａや４ｂとは異なり、胃がん組織や転移性胃がん組織において高い発現は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、遺伝子解析の分野や、スプライシングバリアントのスクリーニングの分野や、疾患に関するスプライシングバリアントをスクリーニングする医療・研究の分野に好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｆ）を備えた、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントのスクリーニング方法。
（ａ）性質が異なる２種類の細胞において発現しているｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する工程；
（ｂ）前記２種類の細胞において発現しているタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程；
（ｄ）前記２種類の細胞間で一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程；
（ｅ）二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程；
【請求項２】
工程（ａ）においてｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する方法が、エクソンアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイを使用する方法であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
工程（ｂ）においてタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する方法が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用する方法であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞の性質が、胃がん細胞の転移性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸。
【請求項６】
配列番号１〜３のいずれかで示される塩基酸配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸。
【請求項７】
配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質。
【請求項８】
配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体。
【請求項１０】
配列番号１５〜２２のいずれかで示される塩基配列からなる、請求項５又は６に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマー。
【請求項１１】
請求項９記載の抗体、又は請求項１０記載のプライマーを備えた、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを検出することを特徴とする胃がんの判定用キット。
【請求項１２】
以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えた、胃がんの判定方法。
（Ａ）試料における請求項５〜８のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量を測定する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の発現量がコントロールと比較して高い場合、胃がんと判定する工程；
【請求項１３】
さらに、以下の工程（Ｃ）及び（Ｄ）を備えた、請求項１２記載の判定方法。
（Ｃ）試料における請求項５〜８のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量とＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ発現量を比較する工程；
（Ｄ）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合、転移性胃がんと評価する工程；
【請求項１４】
試料が胃組織であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の判定方法。
【請求項１５】
請求項５〜８のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの核酸又はタンパク質を阻害することを特徴とする胃がん予防・治療剤。
【請求項１６】
請求項５又は６に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸に対するアンチセンスＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを有効成分とすることを特徴とする請求項１５記載の胃がん予防・治療剤。
【請求項１７】
請求項７又は８に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂタンパク質に対する特異的抗体を有効成分とすることを特徴とする請求項１６記載の胃がん予防・治療剤。
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｆ）を備えた、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントのスクリーニング方法。
（ａ）性質が異なる２種類の細胞において発現しているｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する工程；
（ｂ）前記２種類の細胞において発現しているタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で同定され、かつ工程（ｂ）で同定された遺伝子を、一次候補遺伝子として選択する工程；
（ｄ）前記２種類の細胞間で一次候補遺伝子の部分領域のｍＲＮＡ発現量を比較し、一部の部分領域の発現量に有意差がある遺伝子を、二次候補遺伝子として選択する工程；
（ｅ）二次候補遺伝子のｍＲＮＡのシークエンシングを行い、細胞の性質に関与するスプライシングバリアントの塩基配列を同定する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で同定したスプライシングバリアントの塩基配列を翻訳して得られたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、工程（ｂ）において検出されたタンパク質を、スプライシングバリアントタンパク質として同定する工程；
【請求項２】
工程（ａ）においてｍＲＮＡを検出し、２種類の細胞間で発現量に有意差があるｍＲＮＡの遺伝子名を同定する方法が、エクソンアレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイを使用する方法であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
工程（ｂ）においてタンパク質を検出し、その遺伝子名を同定する方法が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用する方法であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞の性質が、胃がん細胞の転移性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸。
【請求項６】
配列番号１〜３のいずれかで示される塩基酸配列と９０％以上の配列相同性を有する塩基酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸。
【請求項７】
配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質。
【請求項８】
配列番号４〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアントタンパク質を特異的に検出する抗体。
【請求項１０】
配列番号１５〜２２のいずれかで示される塩基配列からなる、請求項５又は６に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント核酸を検出するためのプライマー。
【請求項１１】
請求項９記載の抗体、又は請求項１０記載のプライマーを備えた、ＡＬＤＯＣスプライシングバリアントを検出することを特徴とする胃がんの判定用キット。
【請求項１２】
以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を備えた、胃がんの判定方法。
（Ａ）試料における請求項５〜８のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量を測定する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の発現量がコントロールと比較して高い場合、胃がんと判定する工程；
【請求項１３】
さらに、以下の工程（Ｃ）及び（Ｄ）を備えた、請求項１２記載の判定方法。
（Ｃ）試料における請求項５〜８のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量とＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ発現量を比較する工程；
（Ｄ）ＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの発現量がＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ発現量より高い場合、転移性胃がんと評価する工程；
【請求項１４】
試料が胃組織であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の判定方法。
【請求項１５】
請求項５〜８のいずれかに記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂの核酸又はタンパク質を阻害することを特徴とする胃がん予防・治療剤。
【請求項１６】
請求項５又は６に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂ核酸に対するアンチセンスＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを有効成分とすることを特徴とする請求項１５記載の胃がん予防・治療剤。
【請求項１７】
請求項７又は８に記載のＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ａ又はＡＬＤＯＣスプライシングバリアント４ｂタンパク質に対する特異的抗体を有効成分とすることを特徴とする請求項１６記載の胃がん予防・治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
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【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−３９１１１（Ｐ２０１３−３９１１１Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７９７８８（Ｐ２０１１−１７９７８８）
【出願日】平成２３年８月１９日（２０１１．８．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１１年４月１日、ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ｐｍｉｃ．２０１１０００１６／ａｂｓｔｒａｃｔにてオンライン公開 〔刊行物等〕 ２０１１年５月５日、ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ，Ｖｏｌｕｍｅ １１，Ｉｓｓｕｅ １１，Ｎｏ．１１ Ｊｕｎｅ ２０１１、２２７５〜２２８２ページに掲載
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１９日（２０１１．８．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１１年４月１日、ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ｐｍｉｃ．２０１１０００１６／ａｂｓｔｒａｃｔにてオンライン公開 〔刊行物等〕 ２０１１年５月５日、ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ，Ｖｏｌｕｍｅ １１，Ｉｓｓｕｅ １１，Ｎｏ．１１ Ｊｕｎｅ ２０１１、２２７５〜２２８２ページに掲載
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
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