スプライソソーム媒介ＲＮＡトランス−スプライシングにおける使用のための方法及び組成物
【課題】本発明の分子及び方法は、選択された細胞のサブセット中で、トランス−スプライスされた分子のインビボでの製造のための手段を提供する。
【解決手段】本発明の前−トランス−スプライシング分子は、前−トランス−スプライシング分子と特定の標的細胞において唯一発現される、前−ｍＲＮＡとの間のトランス−スプライシング反応のための基質である。インビボでのトランス−スプライシング反応は、ｍＲＮＡとして機能的な又は、ターゲット細胞において発現されるべきタンパクをコードする。ｍＲＮＡの発現生成物は、細胞又は宿主生物に対して治療上の価値を持つタンパクであるか、特定の細胞の死を誘発する毒素か、またはそのような細胞に通常存在しないタンパクである。本発明はさらに、エキソンタグ方法を用いて前−ｍＲＮＡのエキソン／イントロンの境界を同定するための、遺伝子操作されたＰＴＭｓを提供する。本発明のＰＴＭｓは、特定の細胞タイプにおいて発現されるタンパクの精製及び同定に用いることができる、ペプチドアフィニティ精製タグをコードするキメラＲＮＡの製造を生じる。
【解決手段】本発明の前−トランス−スプライシング分子は、前−トランス−スプライシング分子と特定の標的細胞において唯一発現される、前−ｍＲＮＡとの間のトランス−スプライシング反応のための基質である。インビボでのトランス−スプライシング反応は、ｍＲＮＡとして機能的な又は、ターゲット細胞において発現されるべきタンパクをコードする。ｍＲＮＡの発現生成物は、細胞又は宿主生物に対して治療上の価値を持つタンパクであるか、特定の細胞の死を誘発する毒素か、またはそのような細胞に通常存在しないタンパクである。本発明はさらに、エキソンタグ方法を用いて前−ｍＲＮＡのエキソン／イントロンの境界を同定するための、遺伝子操作されたＰＴＭｓを提供する。本発明のＰＴＭｓは、特定の細胞タイプにおいて発現されるタンパクの精製及び同定に用いることができる、ペプチドアフィニティ精製タグをコードするキメラＲＮＡの製造を生じる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．序論）
本発明は、標的を定めたスプライセオソーム（spliceosomal）トランス−スプライシング（trans-splicing）により新規核酸分子を創造するための方法および組成物を提供する。本発明による組成物は、天然標的メッセンジャーＲＮＡ先駆体（標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）（target pre-trans-mRNA） と相互作用し、また新規キメラＲＮＡ分子（キメラＲＮＡ）の創造を生じさせるトランス−スプライシング反応を媒介するようにデザインされているトランス−スプライシング分子先駆体（pre-trans-splicing molecules）（ＰＴＭ）を含有する。本発明によるＰＴＭは一般に、それ自体がＲＮＡの翻訳の抑制などの機能を果たすことができ、または細胞における誘導蛋白質または不活性蛋白質を相補する蛋白質をコードする、または特定の細胞を殺滅するトキシンをコードする新規キメラＲＮＡが生成されるように操作される。一般に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、特定の細胞種内で発現されることから、標的として選択され、これにより新規キメラＲＮＡの発現を、選択された細胞種に標的を定めるための手段が提供される。
【０００２】
本発明はまた、エキソン標識法（exon tagging method）を用いるＰｒｅ−ｍＲＮＡ分子のエキソン／イントロン境界を特定するために遺伝子操作されているＰＴＭに関する。さらにまた、このＰＴＭは特定の細胞種で発現される蛋白質の精製および同定に用いることができるペプチド親和性精製標識をコードするキメラＲＮＡの生成が得られるようにデザインすることができる。本発明の方法は、本発明によるＰＴＭを、当該ＰＴＭの蛋白質が天然Ｐｒｅ−ｍＲＮＡの蛋白質にトランス−スプライシングされ、新規キメラＲＮＡ分子が形成される条件下に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡと接触させることを包含する。本発明による方法および組成物は、細胞遺伝子調節、遺伝子修復および増殖性疾病、例えば癌の処置用、もしくは遺伝病、自己免疫性疾病または感染性疾病の処置用の自殺的遺伝子治療（suicide gene thrapy）に使用することができる。本発明による方法および組成物はまた、イントロン−エキソン境界のマップ作成およびいずれか指定の細胞で発現された新規蛋白質の同定に使用することができる。
【０００３】
（２．発明の背景）
染色体中のＤＮＡ配列は、コード領域（エキソン）を含有し、および一般にまた、非コード領域（イントロン）を含有するＰｒｅ−ｍＲＮＡに転写される。イントロンは、スプライシングと称される正確な方法でＰｒｅ−ｍＲＮＡから分離される［ChowらによるCell 12:1〜8(1977)；およびＢｅｒｇｅｒらによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,74:3171〜3175(1977)］。スプライシングは、数個の小型核を有するリボ核蛋白質粒子（ｓｎＲＮＰ）とスプライセオソームとして知られている酵素複合体を形成するように組み立てられる、かなり多くの蛋白質因子との配位相互反応として生じる［MooreらによるThe RNA wORLD,R.F.Gestiand and J.F.Athns eds(ColdSpring Harbor Laboratory Press,(Cold Spring Harbor,N.Y.)(1993);KramerらによるAnnu.Rev.Biochem.,65:367〜404(1996);StaleyおよびGuthrieによるCell,92:315〜326(1998)］。
【０００４】
Ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングは２段階メカニズムにより進行する。第一段階において、５’スプライシング部位が分裂され、「遊離」５’エキソンおよび投げ縄型中間体が生成される（Moore,M.J.およびP.A.SharpによるNature,365:364〜368(1993)）。第二段階において、この５’エキソンは、投げ縄型生成物としてのイントロンの放出を伴い５’エキソンにリゲートされる。これらの段階は、小型核を有するリボ核蛋白質とスプライセオソームと称される蛋白質との複合体により触媒される。
【０００５】
このスプライシング反応部位は、５’および３’スプライシング部位の周囲の共通配列を定めている。５’スプライシング部位共通配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵである（ここで、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリンおよび／＝スプライシング部位である）。３’スプライシング領域は、３個の分離した配列要素からなる；分岐点または分枝部位；ポリピリミジン配列および３’スプライシング共通配列（ＹＡＧ）。これらの要素は、３’スプライシング領域を粗く定めており、３’スプライシング部位のイントロン上流の１００ヌクレオチドを包含することができる。哺乳動物の分枝点共通配列は、ＹＮＹＵＲＡＣである（ここで、Ｎ＝いずれかのヌクレオチド、Ｙ＝ピリミジンである）。下線を付けたＡは、分枝形成部位である（ＢＰＡ＝分枝点アデノシン）。３’スプライシング共通配列は、ＹＡＧ／Ｇである。この分枝点とスプライシング部位との間には、通常、ポリピリミジン配列が見出され、この配列は分枝点有効利用および３’スプライシング部位認識にとって、哺乳動物系で重要である（Roscigno,R.F.らによるBiol.Chem.,268:11222〜11229(1993)）。この分枝点およびポリピリミジン配列から下流の第一ＹＡＧトリヌクレオチドは、最も慣用の３’スプライシング部位である（Smith,C.W.らによるNature,342:243〜247(1989)）。
【０００６】
大部分の場合、このスプライシング反応は、同一Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子内で生じ、これはシス−スプライシング（cis-splicing）と称される。２個の独立して転写されるＰｒｅ−ｍＲＮＡ間のスプライシングは、トランス−スプライシング（trans-splicing）と称される。トランス−スプライシングは、最初に、トリパノソームで見出され（Sutton & BoothroydによるCell,47:527(1986);MurphyらによるCell,47:517(1986)）、引き続いてネマトイド類で（Krause & HirshによるCell,49:753(1987)）、扁虫類で（flatworms）（RajkovieらによるNat'l.Acad.Sci.USA,87:8879(1990);DevisらによるJ.Biol.Chem.,270:21813(1995)）および植物ミトコンドリアで（MalekらによるProc.Nat'l.Acad.Sci.USA,94:553(1997)）で見出されている。寄生虫トリパノソーマ ブルセイ（Trypanosoma brucei）では、全部のｍＲＮＡが、トランス−スプライシングにより、それらの５’末端でスプライシングリーダー（ＳＬ）ＲＮＡを獲得する。カエノルハブジチス エレガンス（Caenorhabditis elegans）では、５’リーダー配列はまた、数個の遺伝子にトランス−スプライシングされる。このメカニズムは、かなりの相違する転写体に単一の共通配列を付加するものと認識される。
【０００７】
慣用のシス−スプライシングとほとんど同一であるトランス−スプライシングのメカニズムは、２個のホスホリル転移反応を経て進行する。最初に、“Ｙ”型分枝中間体（これは、シス−スプライシングにおける投げ縄型中間体に等しい）を生成する２’−５’ホスホジエステル結合の形成が生じる。第二反応、すなわちエキソン リゲーションは、慣用のシス−スプライシングと同様に進行する。さらに、トランス−スプライシングを触媒するｓｎＲＮＡの若干と３’スプライシング部位とは、シス−スプライシングに包含されるそれらの対向部分と近似している。
【０００８】
トランス−スプライシングはまた、相違するプロセスに関連することもある。すなわち、第一のｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロンが第二のｐｒｅ−ｍＲＮＡと相互反応する場合、２つの共通のｐｒｅ−ｍＲＮＡ間のスプライシング部位の組換えを増強させる。このタイプのトランス−スプライシングは形質転換したマウスの固有定常領域に結合しているヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写体を説明するものと仮定されている（ShimizuらによるProc.Nat'l.Acad.Sci.USA,86:8020(1989)）。さらにまた、c-myb pre-RNAのトランス−スプライシングが証明され（Vellard,M.らによるProc.Nat'l.Acad.Sci.89:251〜2515）、さらに最近になって、相互にトランス−スプライシングされたクローン形成したＳＶ４０からのＲＮＡ転写体が、培養された細胞および核抽出物で検出された（EueらによるEMBO.J.14:3226(1995)）。しかしながら、哺乳動物ｐｒｅ−ｍＲＮＡの天然で生じるトランス−スプライシングは、格別に稀な出来事であると考えられる。トランス−スプライシングの反応メカニズムは、慣用のシス−スプライシングとほとんど同一であると信じられる。これは、２’−５’ホスホジエステル結合の形成を経て進行し、“Ｙ”形状の分枝した中間体を生成させる（この中間体は、シス−スプライシングにおける中間体に等しい）。
【０００９】
インビトロ トランス−スプライシングは、数グルーブによるスプライシングのメカニズムを試験するためのモデルシステムとして使用されている（Konarska & SharpによるCell,46:165〜171(1985);SolnickによるCell,42:157(1985);Chiara & ReedによるNature,375:510(1995);PasmanおよびGarcis-BlancoによるNucleic Acids Res.,24:1638(1996)）。妥当に効果的なトランス−スプライシング（シス−スプライシングされた同族体の３０％）が、相互に塩基対を形成することができるＲＮＡ間で達成された。塩基対により集合しないＲＮＡのスプライシングは、１０のファクターでさらに減少された。基質の中で明白なＲＮＡ−ＲＮＡ相互反応を要しない別のインビトロ トランス−スプライシング反応が、ＣｈａｒａおよびＲｅｅｄにより(1995,Nature,375:510);Bruzik,J.P.およびManiatis,T.により(1992,Nature,360:692);およびBruzik,J.J.およびManiatis,T.により（Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,92:7056〜7059(1995)、見出された。これらの反応は、比較的小さい頻度で生じ、特殊化された要素、例えば下流５’スプライシング部位またはエキソンスプライシング部位などを必要とする。
【００１０】
ｍＲＮＡ先駆体に複数の蛋白質を結合することを包含する（これは次いで、ＲＮＡの正確な切断および接合に作用する）スプライシング方法に加えて、第三のスプライシング法は、イントロンそれ自体（ここでは、触媒性ＲＮＡ分子またはリボザイムと称される）によるＲＮＡの切断および接合を包含する。このリボザイムの分裂活性は、分離した「ハイブリゼーション」領域をリボソーム中にエンジニアリングすることによって、特定のＲＮＡに標的設定される。標的ＲＮＡへのハイブリゼーションによって、リボソームの触媒領域はほとんど分解する。このようなリボソーム活性は、インビボ標的ＲＮＡの不活性化または分解に、例えば異種の異常ＲＮＡの生成を特徴とするヒト疾病の処置に有用であると見做される。アンチセンスＲＮＡの使用はまた、特定のＲＮＡの標的設定および分解にかかわる別のメカニズムとして提供されている。このような場合、標的ＲＮＡにハイブリッド形成することにより、また標的ＲＮＡに結合させることによりデザインされている小型ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡの翻訳を防止し、またはヌクレアーゼの活性化によるＲＮＡの分解を生じさせる。
【００１１】
最近まで、特定の標的遺伝子の修正に標的を定めたトランス−スプライシングを実用する用途は、グループ１リボソームに基づくメカニズムに制限されていた。テトラハイメナ（Tetrahymena）グループ１リボソームを使用することによって、標的を定めたトランス−スプライシングが、イー・コリ（E.Coli）で（Sullengen,B.A.およびCech,T.R.によるNature,341:619〜622(1994)）、マウス繊維芽細胞で（Jones,J.T.によるNature Medicine,2:643〜648(1996)）、ヒト繊維芽細胞で（Phylacton,L.A.によるNature Genetic,18:378〜381）、およびヒトエリスロイド先駆体で（LarnらによるScience,280:1593〜1596）、証明されている。グループ１リボソームを修飾することにより操作される、かなりの標的を定めたＲＮＡトランス−スプライシングの用途が探査されているが、天然哺乳動物のスプライシング機構、すなわちスプライセオソームは、従来技術で報告されていない。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、スプライセオソームが媒介する標的を定めたトランス−スプライシングにより新規核酸分子を創造するための方法および組成物に関する。本発明による組成物は、天然標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子（以下の記載において、Ｐｒｅ−ｍＲＮＡと記す）と相互作用し、また新規キメラＲＮＡ分子（以下の記載において、キメラＲＮＡと記す）の創造を生じさせるスプライセオソームによるトランス−スプライシング反応を媒介するようにデザインされているトランス−スプライシング分子先駆体（以下の記載において、ＰＴＭと記す）を含有する。本発明の方法は、本発明によるＰＴＭを、当該ＰＴＭの蛋白質が天然Ｐｒｅ−ｍＲＮＡの蛋白質にスプライシングされ、新規キメラＲＮＡが形成される条件下に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡと接触させることを包含する。本発明によるＰＴＭは、トランス−スプライシング反応から生じる新規キメラＲＮＡがそれ自体で、ＲＮＡの翻訳の抑制などの機能を果たすことができ、または別様に、キメラＲＮＡが細胞における不完全または不活性蛋白質を相補する蛋白質をコードする、または特定の細胞を殺滅するトキシンをコードすることができるように、遺伝子操作される。
【００１３】
一般に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、特定の細胞種内で発現されることから、標的として選択され、これにより新規キメラＲＮＡの発現を、選択された細胞種に標的を定めるための手段が提供されるように選択する。この標的細胞には、これらに制限されないものとして、ウイルスまたはその他の感染体に感染した細胞、または悪性新生物、または自己免疫疾病または組織拒絶に含まれる免疫系の成分が包含される。本発明のＰＴＭは、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおけるエキソン／イントロン境界を特定するための方法としてｍＲＮＡ分子内のエキソン配列に遺伝子操作することができる。本発明はまた、特定の細胞種で発現される蛋白質の精製および同定に用いることができるペプチド親和性精製標識をコードするように遺伝子操作されるＰＴＭ分子を使用することに関する。本発明の方法および組成物は、遺伝子調節、遺伝子修復および標的設定した細胞死において使用することができる。このような方法および組成物は、これらに制限されないものとして、遺伝病、感染性疾病または自己免疫性疾病を包含する種々の疾病および癌などの増殖性疾病の処置に使用することができる。
【００１４】
本発明は、プレ−トランス−スプライシング分子（ＰＴＭ）を含む組成物と、新規な核酸分子の作製のためのこのような分子の使用とに関する。本発明のＰＴＭはｐｒｅ−ｍＲＮＡに特異的に結合するように設計されたターゲット結合ドメイン、分枝点、ピリミジン・トラクト（pyrimidine tract）及び３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を包含する３’スプライス領域；並びにＲＮＡスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスペーサー領域を含む。さらに、本発明のＰＴＭは、翻訳可能なタンパク質生成物をコードする任意のヌクレオチド配列を含有するように操作することができる。
【００１５】
本発明の方法は、本発明のＰＴＭを天然ｐｒｅ−ｍＲＮＡに、ＰＴＭの一部を天然ｐｒｅ−ｍＲＮＡの一部中にトランス−スプライシングさせるような条件下で接触させて、新規なキメラＲＮＡを形成することを包含する。ターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡは、これが特異的細胞種類内で発現して、選択した細胞種類への新規なＲＮＡの発現をターゲッティングする機構を与えるために、ターゲットとして選択する。得られるキメラＲＮＡは特異的細胞種類に所望の機能を与えることができる、又は特異的細胞種類内で遺伝子産物を産生することができる。特異的細胞は、非限定的に、ウイルス若しくは他の感染性因子によって感染した細胞、良性若しくは悪性の新生細胞、又は自己免疫疾患若しくは組織拒絶に関与する免疫系の構成要素を包含する。ターゲット内因的ｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合するようにＰＴＭの結合ドメインを修飾することによって、特異性が得られる。キメラＲＮＡによってコードされる遺伝子産物は、例えば、治療的若しくはマーカー遺伝子、及び毒素をコードする遺伝子のような、臨床的有用性を有する遺伝子を含めた、任意の遺伝子でありうる。
【００１６】
５．１．プレ−トランス−スプライシング分子の構造
本発明は、ターゲット化（targeted）トランス−スプライシングによる新規なキメラ核酸分子の生成に用いるための組成物を提供する。本発明のＰＴＭは（ｉ）ｐｒｅ−ｍＲＮＡへのＰＴＭの結合をターゲットとする１つ以上のターゲット結合ドメイン、（ｉｉ）分枝点、ピリミジン・トラクト（pyrimidine tract）及び３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を包含する３’スプライス領域；並びに（ｉｉｉ）ＲＮＡスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスペーサー領域を含む。さらに、翻訳可能なタンパク質生成物をコードする任意のヌクレオチド配列を含有するように、ＰＴＭを操作することができる。本発明のさらに他の実施態様では、キメラＲＮＡ分子の翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含有するように、ＰＴＭを操作することができる。例えば、ヌクレオチド配列は翻訳終止コドン、又は二次構造を形成することによって翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含有することができる。或いは、キメラＲＮＡはアンチセンス分子として機能することによって、それが結合するＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【００１７】
ＰＴＭのターゲット結合ドメインは、選択されたｐｒｅ−ｍＲＮＡのターゲット化領域に相補的であり、この領域にアンチ−センス配向する少なくとも１５〜３０（数百まで）ヌクレオチドから成る１つ又は２つの結合ドメインを含有しうる。このことは結合の特異性を与え、核のスプライソソーム処理機構（spliceosome processing machinery）がＰＴＭの一部をｐｒｅ−ｍＲＮＡの一部にトランス−スプライシングすることができるようなスペースにｐｒｅ−ｍＲＮＡをきっちりと固定する。第２ターゲット結合領域を分子の３’末端に配置して、本発明のＰＴＭ中に組み込むことができる。絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。本明細書で述べるような、ｍＲＮＡの一部に“相補的な”配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成することができる充分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズ可能であることは、核酸の相補性度と長さの両方に依存する（例えば、Sambrook等,1989,Molecular Cloning,A Labouratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York参照）。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、それが含有し、まだ安定な二本鎖を形成するＲＮＡとの塩基不適合は多くなる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準方法を用いて、許容されうる不適合度を確認することができる。
【００１８】
ＰＴＭをイントロン−エキソン標識又はペプチドアフィニティ標識に用いるように設計する場合には、ターゲット結合ドメインにランダムなヌクレオチド配列を含有するようにＰＴＭのライブラリーを一般に操作する。ＰＴＭ分子のこのようなライブラリーを作製する目的は、ライブラリーが細胞内に発現した各ＲＮＡ分子に結合することができるＰＴＭ分子群（population of PTM molecules）を含有することである。ランダムＤＮＡフラグメントをＰＴＭ中に挿入して、ランダムターゲット結合ドメインを形成するために用いることができる制限エンドヌクレアーゼ部位を包含するＰＴＭのコーディング領域を含有するように、組換え発現ベクターを遺伝子操作することができる。ターゲット結合ドメインとしてＰＴＭに包含させるべきランダムヌクレオチド配列は、非限定的に、制限酵素によるＤＮＡの部分的消化又はＤＮＡのランダムフラグメントを形成するためのＤＮＡの機械的剪断を包含する、当業者に周知の多様な異なる方法を用いて作製することができる。ランダム結合ドメイン領域を縮退的（degenerate）オリゴヌクレオチド合成によって作製することもできる。縮退的オリゴヌクレオチドは縮退的結合ドメインを有するＰＴＭ分子のライブラリーを生成するためのＰＴＭ分子へのクローニングを容易にするために、各末端に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有するように、縮退的オリゴヌクレオチドを操作することができる。
【００１９】
他の機構によって、例えば三重らせん形成又は、特異的ＲＮＡ結合タンパク質、即ち特異的ターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合したタンパク質を認識するようにＰＴＭが操作されるタンパク質／核酸相互作用によって、結合を達成することもできる。或いは、本発明のＰＴＭを、例えばＲＮＡ分子内のヌクレオチド間の分子内塩基対合に由来するヘアピン構造のような、二次構造を認識するように、設計することもできる。
【００２０】
ＰＴＭ分子はまた、分岐点を含む３’スプライス領域、ピリミジントラクト（tract）及び３’スプライスアクセプターＡＧ部位及び／または５’スプライスドナー部位を含有する。ＲＮＡスプライシングに用いられる５’スプライスドナー部位及び３’スプライス領域に対するコンセンサス配列は、当該分野において周知である（Moore,et al.,1993,The RNA World,Cold Springs Harbor Laboratory Press,p.303-358参照）。加えて、本願発明の実施において、５’スプライスドナー部位及び３’スプライス領域として機能する能力を維持する修飾コンセンサス配列を使用してもよい。手短に言えば、５’スプライス部位コンセンサス配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵ（ここで、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン及び／＝スプライス部位）である。３’スプライス部位は、３つの分離した配列エレメント：分岐点または分岐部位、ポリピリミジントラクト及び３’コンセンサス配列（ＹＡＧ）から成る。哺乳類における分岐点コンセンサス配列は、ＹＮＹＵＲＡＣ（Ｙ＝ピリミジン）である。下線Ａは分枝形成部位である。ポリピリミジントラクトは、分岐点とスプライス部位アクセプターとの間に位置し、異なった分岐点の利用及び３’スプライス部位認識にとって重要である。
【００２１】
ＲＮＡスプライス部位を標的結合ドメインから分離するためのスペーサー領域もＰＴＭに含まれる。スペーサー領域は、標的プレ−ｍＲＮＡに対するトランス−スプライシングを増幅する非スプライスＰＴＭ及び／または配列の如何なる翻訳もブロックするストップコドン等で特徴付けられる。
【００２２】
本願発明の好ましい態様において、「安全装置（safety）」がまた、非特異的トランス−スプライシングを防ぐために、スペーサー、結合ドメイン、またはＰＴＭのどこか他の部分に組み込まれる。これが、ＰＴＭの３’及び／または５’スプライス部位のエレメントを比較的弱い相補性で覆い、非特異的トランス−スプライシングを防ぐＰＴＭの一領域である。ＰＴＭは、ＰＴＭの結合／ターゲッティング部分のハイブリダイゼーションで、３’及び／または５’スプライス部位が覆われておらず、十分に活性があるように設計される。
【００２３】
「安全装置」は、ＰＴＭ分岐点、ピリミジントラクト、及び／または３’スプライス部位（スプライシングエレメント）の一方または両側に弱く結合する１以上の、シス−配列の伸展（stretch）からなるか、またはそのような第２の分離した核酸鎖であるか、もしくはスプライシングの部位自体に結合できるものである。この「安全装置」結合は、スプライシングエレメントが活性となることを防ぐ（つまり、Ｕ２ｓｎＲＮＰまたは他のスプラシシング因子がＰＴＭスプライス部位認識エレメントに付着するのをブロックする）。「安全装置」の結合は、ＰＴＭの標的結合領域の標的プレ−ｍＲＮＡへの結合、即ち、ＰＴＭスプライシングエレメントを露出して活性化する（それらを、標的プレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスするのに有効なものとする）ことによって破壊されてもよい。
【００２４】
細胞死など、またはマーカーとしての失っていた機能または作用を回復するなどの効果を生み出すことのできる翻訳可能な蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、本願発明のＰＴＭに含まれる。例えば、そのヌクレオチド配列は、既知の遺伝子疾患において失われているまたは変化している遺伝子産物をコードするそれら配列を含むものである。または、そのヌクレオチド配列は、細胞を同定するまたは画像化するのに用いられるマーカー蛋白質またはペプチドをコードすることができる。本願発明のまた別の態様において、ＨＩＳタグ（６個の連続するヒスチジン残基）（Janknecht,et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-8976）、Ｃ末端グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith and Johnson,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8703-8707）（Pharmacia）またはFLAG（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys）（Eastman Kodak/IBI,Rochester,NY）などのアフィニティータグをコードするヌクレオチド配列が、アフィニティー精製に有用なＰＴＭ分子に含まれる。このようなヌクレオチド配列を含有するＰＴＭの使用によって、ペプチドアフィニティータグに結合して細胞中に正常に発現されるペプチド配列を含有する融合蛋白質をコードするキメラＲＮＡを産生することになる。アフィニティータグは、細胞で発現されたペプチド配列を迅速に精製し同定する方法を提供する。好ましい態様において、そのヌクレオチド配列は、トキシンまたは、放射線照射もしくは化学療法などのその後の処理に対する細胞の感受性を増幅する機能を提供する他の蛋白質をコードしていてもよい。
【００２５】
さらに好ましい本願発明の態様において、ＰＴＭ分子は、ジフテリアトキシンサブユニットＡ（Greenfield,L.,et al.,1983,Proc．Natl.Acad.Sci.USA 80:6853-6857）をコードするヌクレオチド配列を含有するように設計される。ジフテリアトキシンサブユニットＡは、酵素的トキシン活性を含有し、発現されるかヒト細胞に輸送されると機能して細胞死をもたらす。さらに、多くの他の既知のペプチドトキシンが本願発明に使用されてもよく、限定するわけではないが、リシン（ricin）、シュードモナストキシン、シガ（Shiga）トキシン及びエキソトキシンＡを含む。
【００２６】
ＰＴＭ分子に対して、翻訳可能な蛋白質をコードするヌクレオチドの後か前に、スプライシングを増幅するためのポリアデニル化シグナルまたは５’スプライス配列、付加的な結合領域、「安全装置」−自己相補的領域、付加的なスプライス部位、または分子の安定性を制御して分解を防ぐ保護基などの付加的な特徴を加えることができる。
【００２７】
本願発明のＰＴＭに組み込まれてもよい付加的な特徴として、結合ドメイン及びスプライス部位の間の領域に、非スプライスプレ−ｍＲＮＡ発現を防ぐために、ストップコドンまたは他のエレメントを含む。本願発明の別の態様において、ＰＴＭを、３’標的イントロンまたはエキソンへの結合を促進し、固定の標準（authentic）シス−５’スプライス部位（Ｕ５及び／またはＵ１結合部位）をブロックするための翻訳可能な蛋白質をコードするヌクレオチド配列から下流の第２アンチ−センス結合ドメインを伴って発生させることができる。ＰＴＭはまた、トランス−スプライス産物の発現のための二重のトランス−スプライシング反応を要求するものとして作製されてもよい。このようなＰＴＭは、ＲＮＡ修復に有用となる内部エキソンを置換するのに用いることができる。３’ヘアピン構造、環状化ＲＮＡ、ヌクレオチド塩基修飾、または合成アナローグなどのさらなるエレメントを、核の局在化及びスプライセオゾームの（spliceosomal）編入、並びに細胞内安定性を促進または亢進させるために、ＰＴＭに組み込むことができる。
【００２８】
本願発明のＰＴＭは、標的細胞における新規キメラＲＮＡを産生するように意図された方法において用いることができる。本願発明の方法は、ＲＮＡ分子、またはＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡベクターなどの、当業者によって使用される如何なる形ででもよいＰＴＭを標的細胞に輸送することからなり、当該ＰＴＭはプレ−ｍＲＮＡに結合し、トランス−スプライシング反応を仲介して、プレ−ｍＲＮＡの部分にスプライスされたＰＴＭ分子の部分からなるキメラＲＮＡを形成することになる。
【００２９】
５．２．トランス−スプライシング分子の合成
本願発明の核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはその誘導体もしくは修飾変形種、一本鎖または二本鎖でもよい。核酸によって、ＰＴＭ分子またはＰＴＭ分子をコードする核酸分子が、デオキシリボヌクレオチドからなるのか、リボヌクレオシドからなるのか、及びリン酸ジエステル結合からなるのか、修飾された結合からなるのか示されることになる。核酸という語はまた、具体的には、５つの天然の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基からなる核酸も含む。
【００３０】
本願発明のＲＮＡ及びＤＮＡ分子を、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の合成のための、当該分野において既知の如何なる方法によって作製してもよい。例えば、核酸は、市販の試薬及び合成機を用いて、当該分野において周知の方法によって化学合成してもよい（e.e.,Gait,1985,Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press,Oxford,England参照）。または、ＲＮＡ分子は、そのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のイン・ビトロ及びイン・ビボ転写によって発生させることができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ広範囲のベクターに組み込むことができる。ＲＮＡを、高収率で、ＳＰＳ６５（Promega Corporation,Madison,WI）などのプラスミドを用いるイン・ビトロ転写を経て産生してもよい。加えて、Ｑ−β増幅などのＲＮＡ増幅法が、ＲＮＡを産生するために利用される。
【００３１】
核酸分子は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、細胞への輸送等を改善するために修飾することができる。例えば、全体の荷電を減少させるためのＰＴＭの修飾は、分子の細胞内取込みを増幅させる。加えて、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を減じるように修飾することができる。核酸分子は、ペプチド（例えば、イン・ビボでの宿主細胞レセプターを標的とする）、または細胞膜を通過する輸送を亢進する薬剤（例えば、Letsinger et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．86:6553-6556;Lemaitre et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652；国際公開Ｎｏ．ＷＯ８９／１０１３４，１９８８年４月２５日公開等参照）、ハイブリダイゼーションを引き金とする切断剤（hybridization-triggered cleavage agent）（例えば、Krol et al.,1988,BioTechniques 6:958-976参照）またはインターカレーション剤（例えば、Zon,1988,Pharm.Res.5:539-549参照）などの他の付加的な基を含んでいてもよい。この端に、核酸分子は、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションを引き金とするクロス−リンク剤（hybridization triggered cross-linking agent）、輸送剤（transport agent）、ハイブリダイゼーションを引き金とする切断剤等に結合していてもよい。ＤＮＡ分子に対する種々の他の周知の修飾を、細胞内の安定性及び半減期を増大する方法として導入することができる。成し得る修飾として、限定するわけではないが、リボ−またはデオキシ−ヌクレオチドの配列を分子の５’及び／または３’端に隣接させる付加も含まれる。増大した安定性が望まれる環境下では、２’−Ｏ−メチル化などの修飾ヌクレオシド間（internucleoside）結合を有する核酸が好ましい。修飾ヌクレオシド間結合を含有する核酸は、当該分野において周知の試薬及び方法を用いて合成してもよい（Uhlmann et al.,1990,Chem.Rev.90:543-584;Schneider et al.,1990,Tetrahedron Lett.31:335及びここに引用される参考文献参照）。
【００３２】
核酸は、当該分野において周知の如何なる適当な方法によって、精製されてもよい。例えば、核酸は、逆相クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって精製することができる。もちろん、当業者は、精製法が部分的に、精製されるべき核酸の大きさに依存することを認識するであろう。
【００３３】
ＰＴＭをコードする核酸分子が利用される場合、当該分野で既知のクローニング技術が、核酸分子の発現ベクターへのクローニングに用いられてもよい。使用され得る組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に知られている方法が、Ausubel et al.(eds.),1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY;及びKriegler,1990,Gene Transfer and Expression,Alaboratory Manual,Stockton Press,NYに記載されている。
【００３４】
主体のＰＴＭをコードするＤＮＡは、大規模でのＤＮＡの複製を提供し、ＰＴＭの転写を導く必要なエレメントをも含有する、種々の宿主ベクター系に組換え操作によって組込まれるてもよい。患者の標的細胞を形質移入するような構築の使用によって、内部的に発現されたプレ−ｍＲＮＡ標的と相補塩基対を形成し、それによって複合核酸分子間のトランス−スプライシング反応を亢進するのに十分な量の転写が起こることになる。例えば、ベクターは、細胞によって取り込まれ、ＰＴＭ分子の転写を導くように、イン・ビボで導入される。このようなベクターは、それが転写されて所望のＲＮＡを産生する限り、エピゾームに残るか、染色体として組み込まれる。このようなベクターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。
【００３５】
対象とするＰＴＭをコードするベクターは、哺乳動物細胞で複製及び発現に用いられるプラスミド、ウイルス又は当業界において知られた他のものである。ＰＴＭをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞において作用する当業界において知られたいずれのプロモーターによっても制御できる。そのようなプロモーターは誘導可能であり、また構築可能である。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、例えばＳＶ４０初期プロモーター領域（Benoist,C.and Chambon,P.1981,Nature 290:304-310）、ロウスザルコーマウイルスの３’ロング末端リピート（Yamamoto te al.,1980,Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al.,1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:14411445）、メタロチアネン遺伝子の調節配列（Brinster et al.,1981,Nature296:39-42）、ウイルスＣＭＶプロモーター、ヒト絨毛性ゴナトロピンーβープロモーター（Iiollenberg et al.,1994,Mol.Cell.Endocrinology 106:111-119）などが挙げられる。いずれのタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターも、組織部位に直接導入できる組換えＤＮＡ構築物を調製するのに用いることができる。あるいは、望ましいターゲット細胞に選択的に感染するウイルスベクターを用いることもできる。
【００３６】
ペプチドアフィニィティー精製タッグをコードするＰＴＭの使用のためには、ランダムターゲット結合部位を含むヌクレオチド配列をＰＴＭに挿入し、選択的哺乳動物発現ベクターシステムにクローン化するのが好ましい。これらに限定されるものではないが、ｔｋ欠損細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの発現選択系、ｈｇｐｒｔ欠損細胞におけるヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの選択発現系及びａｐｒｔ欠損細胞におけるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの発現選択系などの多くの選択系を用いることができる。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロホレートトランスフェラーゼ（dhfr）、ミコフエノール酸に対して耐性を付与するキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、アミノグリコシドＧ−４１８に対して耐性を付与するネオマイシン（neo）、ヒグロマイシンに対して耐性を付与するヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（hygro）などの抗代謝耐性を選択に利用することもできる。本発明の好ましい態様においては、細胞培養物を、唯一のベクターが存在するような細胞に対して低い比率のベクターで、あるいは一つの細胞において限られた数のベクターで形質転換される。本発明の実施に用いられるベクターとしては、レトロウイルス又はアデノウイルス関連ウイルスなどのウイルス発現ベクターなどの原核発現ベクターが挙げられる。
【００３７】
５．３． トランスースプライシング分子の使用及び投与
５．３．１． 遺伝子調節、遺伝子修復及びターゲット細胞死のためのＰＴＭの使用
本発明の組成物及び方法は、遺伝子調節、遺伝子修復、ターゲット細胞死などの各種に適用できる。トランスースプライシングは、毒性を有する蛋白を細胞に導入するのに用いることができる。更に、ＰＴＭをウイルスｍＲＮＡに結合しウイルスｍＲＮＡの機能を破壊するように、あるいはウイルスｍＲＮＡを発現する細胞を破壊するように工夫することができる。本発明の他の態様では、有害なｍＲＮＡ転写物にストップコドンを設けて転写物の発現を減少させるようにＰＴＭを工夫することもできる。
末端が欠失した又は点変異を含む転写物を修復するためにターゲットトランスースプライシングを用いることができる。本発明のＰＴＭは、特定の変異の上流または下流あるいは未熟３’の上流のターゲット転写物を解裂し、変異を含む転写物の部分を機能的配列に置換するトランス−スプライシングにより変異転写物を修正するようにデザインされている。
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、最も一般的な致命的なヒトの遺伝病である。遺伝子及び分子分析により、嚢胞性繊維症関連遺伝子が単離されその蛋白生産物が推定されている（Kerem,B.S.et al.,1989,Science 245:1073-1080;Riordan et al.,1989,Science 245:1066-１０７３;Rommans, et al.,1989,Science245:1059-1065）。ＣＦ関連遺伝子の蛋白生産物は、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）と呼ばれている。本発明の特定の態様では、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡにおける欠損を修正して、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーターをコードするＤＮＡが発現され機能的塩素イオンチャンネルが患者のエアウエイ表皮細胞に生じるように、ＰＴＭを用いる事が出来る。
【００３８】
最も一般的な嚢胞性繊維症変異は、ＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位のフェニルアラニンをコードするエクソン１０の３つのヌクレオチドの欠失であることが集団の調査によって明かになった。図１５に示されているように、トランス−スプライシング反応により、ＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位の欠失を修正することができた。遺伝子欠損の修正に用いたＰＴＭは、ＣＦＴＲ ＢＤイントロン９配列、スペーサー配列、分岐点、ポリピリジン区域、３’スプライス部位及び野性型ＣＦＴＲ ＢＤエクソン１０配列を含んでいた（図１３）。トランス−スプライシング反応を利用したＣＦＴＲをコードする変異ＤＮＡの修正に成功したことは、一般的な遺伝子欠損の修正にＰＴＭが適用できることを支持している。
リポソームへのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、組成物を発現できる組換え細胞、レセプター仲介エンドサイトーシス（Wu and Wu,1987,J.Bol.Chem.262:4429-4432）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築、ＤＮＡのインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシクム仲介トランスフェクションなどの各種のデリバリーシステムが知られており、これらは、本発明の組成物を細胞へ導入するのに用いられる。
本発明の組成物及び方法は、特定のタイプの細胞の除去又は変異が効果的な癌、及び他の重篤な疾患、自己免疫疾患および他の病原性症状などの治療に有効である。更に、本発明の組成物及び方法は、遺伝的な遺伝子疾患を有する個人の細胞に機能的で生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を提供して、欠失した又は変異した遺伝子生産物の発現により正常な表現型を形成するのに用いることが出来る。
【００３９】
本発明の好ましい態様においては、ＰＴＭをコードする配列を含む核酸は、遺伝子デリバリーによって投与され宿主細胞に投与されてＰＴＭ機能を促進する。この態様では、ＰＴＭ産生を促進することによって、核酸が効果を仲介する。当業界において利用できる宿主細胞への遺伝子デリバリー法はいかなるものも本発明により利用できる。遺伝子デリバリー法の一般的な概要については、Strauss,M and Barranger,J.A.,1997,Concepts in Gene Therapy,by Walter de Gruyter & Co.,Berlin;Goldspiel et al.,1993,Clinical Pharmacy12:488-505;Wu and Wu,1991,Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol Toxicol,33:573-596;Mulligan,1993,Science 260;926-932;及びMorgan and Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217;1993,TIBTECH 11(5):155-215などが参照される。具体的方法を以下に記載する。
【００４０】
宿主細胞への核酸のデリバリーは、宿主を核酸又は核酸を保持するベクターに直接的に曝すことにより、あるいは宿主細胞を最初にin vitroで核酸で形質転換し、次いで宿主に移植する間接的方法により行われる。これら２つの方法は、in vivo又はex vivo遺伝子デリバリーとして公知である。
特定の態様では、核酸はin vivoで直接的に投与されて発現してＰＴＭを産生する。これは、当業界で公知の各種の方法、例えば、核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築してそれを分子内物となるように投与する方法、欠損又は変性レトロウイルス又は他のベクター（U.S.P.No.4,980,286）を用いた感染法、裸のベクターとして直接投与による方法、マイクロ粒子の射突による方法（ジーンガン：Biolistic,Dupont）、脂質又は細胞表面レセプター又はトランスフェクション試薬での皮膜による方法、リポゾームへのカプセル化による方法、マイクロ粒子又はマイクロカプセルによる方法、核に進入することが知られているペプチに核酸を結合させて投与する方法（Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432）などにより、行うことができる。
特定の態様では、ＰＴＭを含むウイルスベクターを用いることができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの導入に必要でないレトロウイルス配列を削除したレトロウイルスベクター（Milier et al.,1993,Meth.Enzymol.217:581-599）を利用することが出来る。あるいは、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターを、細胞又は組織への遺伝子デリバリーに用いることができる（アデノウイルスに基づく遺伝子デリバリーの総説としてKozarsky and Wilson,1993,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503）。
【００４１】
細胞への遺伝子デリバリーの他のアプローチとしては、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション又はウイルスインフェクションなどによる組織培養中の細胞への遺伝子導入などが挙げられる。通常、導入法は、細胞への選択マーカーの導入を含むものである。細胞は次いで選択条件下に置かれ、導入遺伝子を取りこみ発現する細胞を単離する。得られる組換え細胞は、当業界に公知の各種方法により宿主へデリバリーされる。好ましい態様では、遺伝子デリバリーに用いられる細胞は、宿主細胞中で自己複製するものである。
また本発明は、薬学的に許容できる担体と共に、有効量のＰＴＭ又はＰＴＭをコードする核酸を含む薬学的組成物が提供される。特定の態様では、薬学的に許容できるとは、連邦政府又は国家の規則代理人によって許可されるもの、U.S.Pharmacopedia又は他の一般的に動物用に特にヒト用に認められた薬局方に記載されたものを意味する。担体とは、薬物と一緒に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビークルなどを意味する。適当な担体の例は、E.W.MartinのRemington's Pharmaceutical Scienceに記載されている。
【００４２】
特定の態様では、本発明の薬学的組成物は、（１）内因性蛋白又は機能のレベルがないあるいは低い（正常又は望ましいものに比べて）病気又は障害、例えば蛋白を欠いているあるいは遺伝子的に欠陥を有し生物学的に不活性または非反応性又は抑制されている宿主、又は（２）in vitro又はin vivoアッセイによりＰＴＭの有用性により特定の蛋白の機能が抑制されていることが判明した病気又は障害などに投与される。ＰＴＭ仲介トランス−スプライシング反応により得られるキメラｍＲＮＡによりコードされる蛋白の活性は、宿主組織サンプルをバイオプシサンプルなどから得てin vitroでｍＲＮＡ又は蛋白レベル、発現したキメラｍＲＮＡの活性及び／又は構造をアッセイすることにより容易に検出できる。多くの標準的方法、例えば、キメラｍＲＮＡによってコードされる蛋白を検出し及び／又は視覚化するイムノアッセイ（ウエスタンブロット、免疫沈降それに続くドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル、電気泳動、イムノサイトケミストリー）
及び／又はキメラｍＲＮＡの存在を検出及び／又は視覚化することによるキメラｍＲＮＡの形成を検出するアッセイなどが挙げられる。
【００４３】
また本発明は、薬学的に許容できる担体と共に、有効量のＰＴＭ又はＰＴＭをコードする核酸を含む薬学的組成物が提供される。特定の態様では、薬学的に許容できるとは、連邦政府又は国家の規則代理人によって許可されるもの、U.S.Pharmacopedia又は他の一般的に動物用に特にヒト用に認められた薬局方に記載されたものを意味する。担体とは、薬物と一緒投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビークルなどを意味する。適当な担体の例は、E.W.MartinのRemington's Pharmaceutical Scienceに記載されている。特定の態様では、本発明の薬学的組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与するのが望ましい。これは例えば、手術中の局所注入、手術後の包帯と共に局所適用、注射、カテーテル、坐剤、シアラスチックな膜又はファイバーなどのポーラス又は非ポーラス物質などによる移植等により投与される。放出制御ポリマー、ヒドロゲルなどのマトリックス、ナノ粒子などの他の薬物放出制御デリバリーシステムを利用することもできる。
ＰＴＭは、ターゲット細胞で望ましい効果を生み出すような効果的な量で投与される。ＰＴＭの効果的な投与は、生物学的活性半減期、バイオアベイラビリテー、毒性などのパラメーターを考慮した公知の手法により決定される。本発明の組成物の有効な量は、治療する病気及び障害の本質に依存し、標準的な臨床技術により決定できる。更に最適投与量を同定するために、in vitroアッセイを任意に用いることができる。
【００４４】
本発明はまた医薬パック又はキットであって、一又は二以上の本発明の医薬組成物の成分を満たした一又は二以上の容器を含み、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を制限する政府官庁により処方された形態の警告であって、その警告が、ヒト投与用の製造、使用又は販売の官庁による許可を反映するもの、を任意に付しても良い。
【００４５】
５．３．２．エキソンのタギングのためのＰＴＭ分子の使用
現在のヒト及び他の生物のゲノムの配列決定及び特徴決定の努力の点から、そのような特徴決定を容易にする方法に対するニーズが存在する。現在入手されるゲノムマッピング及び配列決定により得られる情報の大部分は、ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの逆転写により作られる相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーから誘導される。不幸にも、この工程は、イントロン配列及びエキソン／イントロン境界の位置に関する情報のロスを生じる。
【００４６】
本発明は、プレ−ｍＲＮＡ中のエキソン−イントロン境界のマッピングのための方法であって、（ｉ）プレ−トランス−スプライシング分子の部分がターゲットプレ−ｍＲＮＡの部分へとトランス−スプライスされる条件下で、ランダムターゲット結合ドメインを含むプレ−トランス−スプライシング分子をプレ−ｍＲＮＡ分子に接触させ、キメラｍＲＮＡを形成すること、（ｉｉ）該キメラｍＲＮＡ分子を増幅すること、（ｉｉｉ）増幅した分子を選択的に精製すること、及び（ｉｖ）増幅した分子のヌクレオチド配列を決定し、それによりイントロン−エキソン境界を同定すること、
を含む、上記方法を包含する。
【００４７】
本発明の一の態様において、ＰＴＭｓをプレ−ｍＲＮＡ分子中のエキソン−イントロン境界の場所を突き止めるために用いることができる。イントロン−エキソン境界のマッピングにおいて使用するＰＴＭｓは、上記５．１節で既述したものに類似する構造を有する。特に、ＰＴＭｓは（ｉ）多くのプレ−ｍＲＮＡに結合するように設計されたターゲット結合ドメイン、（ｉｉ）ブランチポイント、ピリミジン域、及び３’スプライス受容体部位を含む３’スプライス領域、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスぺーサー部位、並びに（ｉｖ）プレ−ｍＲＮＡ上にトランス−スプライスされるタグ領域、を含む。イントロン−エキソンマッピングの目的のためには、ＰＴＭｓはランダムヌクレオチド配列を含むターゲット結合ドメインを含むように遺伝子操作される。ランダムヌクレオチド配列は、核の機構を処理するスプライソソームが、ＰＴＭの部分（タグ又はマーカー領域）をプレ−ｍＲＮＡの部分へとトランス−スプライスすることができるように、プレ−ｍＲＮＡに結合し、固定することができるヌクレオチド配列を少なくとも１５〜３０、最大では数百まで、含む。短いターゲット結合ドメインを含む、またはイノシンを含むＰＴＭｓは、よりストリンジェントでない条件下で、プレ−ｍＲＮＡ分子に結合する。更に、強いブランチポイント配列及びピリミジン域は、ＰＴＭトランス−スプライシングの非−特異性を増す働きをする。
【００４８】
ＰＴＭ分子中のターゲット結合ドメインとして使用するランダムヌクレオチド配列は、種々の異なる方法により作られ、その中には、制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化、又はＤＮＡの機械的切断が含まれるが、これらに限定されない。そのようなランダムヌクレオチド配列の使用は、細胞中で発現される各ターゲットプレ−ｍＲＮＡにつて、異なる結合活性を有するＰＴＭ分子の巨大な並びを作成するようデザインされる。オリゴヌクレオチドのランダム化されたライブラリーは、プラスミドベクター中への遺伝子操作されたＰＴＭ分子へとクローニングするための、各末端上の適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて合成される。ランダム化したオリゴヌクレオチドがリゲートされ、発現されると、ＰＴＭｓのランダム化された結合ライブラリーが作成される。
【００４９】
本発明の特定の態様において、ランダムヌクレオチド配列を含むターゲット結合ドメインを含むＰＴＭ分子をコードする発現ライブラリー当業者にとって周知の種々の方法を用いて作成される。理想的には、ライブラリーは細胞中で発現される各ターゲットプレ−ｍＲＮＡと相互作用することができるＰＴＭ分子を含むのに十分なほど複雑である。
【００５０】
例により、図９はイントロン−エキソン境界のマッピングに用いられるＰＴＭｓの二つの形態を図式的に表す。左側のＰＴＭはプレ−ｍＲＮＡ３’スプライス部位への非−特異的なトランス−スプライシングをすることができ、一方、右側のＰＴＭはプレ−ｍＲＮＡ５’スプライス部位へのトランス−スプライシングをすることができる。ＰＴＭとターゲットプレ−ｍＲＮＡとの間のトランス−スプライシングは、真正のエキソンの３’又は５’上に特定のヌクレオチド配列「タグ」を有するキメラｍＲＮＡ分子を与える。
【００５１】
選択的な精製に続いて、次にＰＴＭのタグヌクレオチド配列で始まり、タグされたエキソンの配列へと進行する、プライマーを用いたＤＮＡ配列決定反応をおこなう。タグヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに直接続く配列は、エキソン境界を表す。イントロン−エキソンタグの同定のため、本発明のトランス−スプライシング反応は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、当業者に周知の方法を用いて行われ得る。
【００５２】
５．３．３細胞中で発現されるタンパクの同定のためのＰＴＭ分子の使用
本発明の他の態様において、ＰＴＭ媒介トランス−スプライシング反応は、細胞中に発現される未だ検出されていない、未知のタンパクの同定に用いることができる。この方法は、なかんずく、タンパクのサイズの小ささ、タンパクの低濃度により、または二次元電気泳動において、他のタンパクと類似する移動パターンを示すことによる検出の失敗により、二次元の電気泳動、又は他の方法により検出することができないタンパク質の同定に特に有用である。
【００５３】
本発明は、細胞中に発現するタンパクの同定方法であって、（ｉ）プレ−トランス−スプライシング分子の部分がターゲットプレ−ｍＲＮＡの部分へとトランス−スプライスされる条件下で、ランダムターゲット結合ドメインとペプチドタグをコードするヌクレオチド配列を含むプレ−トランス−スプライシング分子をプレ−ｍＲＮＡ分子に接触させ、融合ポリペプチドをコードするキメラｍＲＮＡを形成すること又はそれをゲル電気泳動により分離すること、（ｉｉ）該融合ポリペプチドをアフィニティー精製すること、及び（ｉｉｉ）融合タンパクのアミノ酸配列を決定することを含む、上記方法に関する。
【００５４】
細胞中に発現されるタンパクの同定のためには、本発明のＰＴＭｓは（ｉ）ランダム化されたヌクレオチド配列を含むターゲット結合ドメイン、（ｉｉ）ブランチポイント、ピリミジン域、及び３’スプライス受容体部位、並びに／又は５’スプライスドナー部位を含む３’スプライス領域、（ｉｉｉ）ＰＴＭスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスぺーサー部位、並びに（ｉｖ）マーカー又はペプチドアフィニティ精製タグをコードするヌクレオチド配列、を含むように、遺伝子操作される。そのようなペプチドタグには、ＨＩＳタグ（６ヒスチジン連続残基）（Janknechtら、１９９１年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8972-8976）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith,D.B.及びJohnson,K.s.1988,Gene67:31）（Pharmacia）又はＦＬＡＧ（Kodak/IBJ）タグ（Nisson.J.ら、J.Mol.Recognit.、1996,5,585-594）が包含されるが、これらに限定されない。そのようなＰＴＭｓを用いたトランス−スプライシングは、マーカー又はペプチドアフィニティ精製タグに繋がった、細胞中において通常発現されるタンパク配列を含む、キメラｍＲＮＡ分子の生成を与える。そのような方法の所望のゴールは、細胞中で合成される全てのタンパクがマーカー又はペプチドアフィニティタグを受けとり、それにより細胞中に発現する各タンパクを同定するための方法を提供することである。
【００５５】
本発明の特定の態様において、ランダムヌクレオチド配列を含む異なるターゲット結合ドメインを有するＰＴＭｓをコードするＰＴＭ発現ライブラリーが作成される。所望のゴールは、細胞中で発現される各プレ−ｍＲＮＡに結合することができるＰＴＭを作るのに十分複雑なＰＴＭ発現ライブラリーを作製することである。好ましい態様において、ライブラリーは、哺乳類の発現ベクター中へクローニングされ、それにより、一つ又は、多くとも数個のベクターがいずれか一つの細胞中に存在することになる。
【００５６】
キメラタンパクの発現を同定するため、宿主細胞をＰＴＭライブラリーで形質転換し、植え付け、一のＰＴＭを含む個々のコロニーが成長し、精製されるようにする。単一のコロニーを選択し、適当な培地中に増殖させ、標識したキメラタンパクのエキソン（複数でも良い）断片を、例えば、アフィニティー精製タグを用いて他の細胞タンパクから分離する。例えば、アフィニティークロマトグラフィーは、ＦＬＡＧタグなど、ペプチドタグに特異的に結合する抗体の使用を含む。代替的に、ＨＩＳタグを用いる時には、融合タンパクは、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸アガロースカラムを用いて精製され、それにより、イミダゾール含有緩衝液により溶出される結合したペプチドの選択的溶出が可能となる。ＧＳＴタグを用いる時、融合タンパクはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアガロースビーズを用いて精製される。融合タンパクは、次に遊離グルタチオンの存在下に溶出される。
【００５７】
キメラタンパクの精製後、分析を行い、融合タンパクのアミノ酸配列を決定する。融合タンパクのアミノ酸配列は、当業者にとって周知の方法、例えば、エドマン分解とそれに次ぐ、ＨＰＬＣを用いたアミノ酸分析、質量分析、またはアミノ酸アナライザーション、を用いて決定される。同定した後、ペプチド配列を例えばＧｅｎｅＢａｎｋ等のタンパクデータベース中に入手可能な配列と比較する。もし部分的なペプチド配列が既知であれば、更なる分析は行わない。もし部分的なタンパク配列が未知であれば、完全なタンパク配列を決定するため、当該タンパクのより完全な配列決定を行うことができる。融合タンパクは、全長タンパクの一部分しか含まないので、全長タンパクをコードする核酸が慣用の方法により単離される。例えば、部分的なタンパク配列のオリゴヌクレオチドプライマーが、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするためのプローブ又はＰＣＲプライマーとして使用するために生成される。
【００５８】
６．例：トランス−スプライシング分子の製造
以下の節は、ＰＴＭｓの製造及びそのような分子がトランス−スプライシング反応を媒介することができ、キメラｍＲＮＡ分子の製造をなし得ることの例証を説明する。
【００５９】
６．１ 材料及び方法
６．１．１． プレ−ｍＲＮＡ分子の構築
野生型のジフテリア毒素サブユニットＡ（ＤＴ−Ａ、野生型寄託番号Ｋ０１７２２）及びＤＴ−Ａ変異体（ＣＲＭ１９７、酵素活性なし）を含むプラスミドをVirginia Johnson博士、Food and Drug Administration、Bethesda、Marylandから得た（Uchidaら、1973、J.Biol.Chem.248:3838）。インビトロ実験のため、ＤＴ−Ａをプライマー：ＤＴ−１Ｆ
及びＤＴ−２Ｒ
を用いて増幅し、ＰｓｔＩ及びHindIIIにより切断し、PstI及びHindIII消化したｐＢＳ（−）ベクター（Stratagene,La Jolla、CA）中へクローニングした。得られたクローンｐＤＴＡを個々のＰＴＭｓを構築するのに用いた。（１）ｐＰＴＭ＋：ターゲットした構築物。ＩＮ３−１
及びＩＮ２−４
プライマーをEcoRI及びPstI消化ｐＤＴＡ中へインサートすることにより作製。（２）ｐＰＴＭ＋Ｓｐ：ｐＰＴＭ＋と同様に、但し、ＢＤとＢＰとの間に３０ｂｐのスぺーサーを有する。
ｐＰＴＭ＋をＸｈｏｌで消化し、オリゴヌクレオチド中、スぺーサーＳ
及びスペーサーＡＳ
をリゲートすることにより作製。インビボ研究のため、ｐｃＰＴＭ＋ＳｐのＥｃｏＲＩ及びHindIII断片を哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）中にＣＭＶプロモーターの制御下でクローンした。また、コドン１４のメチオニンをイソロイシンに代え、翻訳の誘発を防止した。得られたプラスミドをｐｃＰＴＭ＋Ｓｐと指定した。（３）ｐＰＴＭ＋ＣＲＭ：ｐＰＴＭ＋Ｓｐと同様に、ただし、野生型ＤＴ−ＡをＣＲＭ変異体ＤＴ−Ａ（T.Uchidaら、1973、J.Biol.Chem.248:3838）。これは、プライマーＤＴ−１Ｆ及びＤＴ−２Ｒを用いたＤＴ−Ａ変異体（Ｇ５２Ｅにおける変異）のＰＣＲ増幅により作製された。インビボ研究のためには、ＰＴＭ＋ＣＲＭのEcoRI HindIII断片を、ｐｃ３．１ＤＮＡ中へクローンし、ｐｃＰＴＭ＋ＡＲＭとした。（４）ＰＴＭ−：非ターゲット構築。ＰＴＭ＋のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩによる消化、結合ドメインの除去のためゲル精製し、次にオリゴヌクレオチド
のリゲートにより作製。（５）ＰＴＭ−Ｓｐ、ＰＴＭ−と同一のバージョン、但し、ＰｓｔＩ部位に３０ｂｐのスペーサー配列を有する点を除く。同様に、スプライス変異体［Ｐｙ（−）ＡＧ（−）及びＢＰ（−）Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］及び安全変異体（safety variants）［PTM+SF-Py1,PTM+SF-Py2,PTM+SFBP3及びPTM+SFBP3-Py1］を、特定の配列の挿入、欠失（表１参照）のいずれかにより作製した。
【００６０】
【００６１】
太字のヌクレオチドは正常なＢＰ、ＰＰＴ及び３’スプライス部位と比較した突然変異を表す。
【００６２】
枝分かれ部位Ａには下線を引いてある。イタリック体のヌクレオチドはＰＴＭ中のＢＰ配列をマスクするために安全ＢＤ中に導入されたミスマッチを表す。
【００６３】
ダブルトランス−スプライシングＰＴＭ構築体（DS-PTM）もまた、ＰＴＭ＋ＳＦの毒素コード配列の３’端に、５’スプライス部位と、βＨＣＧプレｍＲＮＡの第二イントロンに相補的な第二の標的結合ドメインを付加して作った（図Ａ）。
【００６４】
６．１．２． βＨＣＧ６標的プレｍＲＮＡ
インビトロ標的プレｍＲＮＡを作成するために、βＨＣＧ遺伝子６（受託番号Ｘ００２６６）のＳａｃｌ断片をｐＢＳ（−）にクローニングした。これによりヌクレオチド４６０−１２６５（これは５’非翻訳領域、開始コドン、エクソン１、イントロン１、エクソン２及びイントロン２のほとんどを含む）から８０５ｂｐ挿入体を作成した。インビボ研究のために、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１断片を哺乳類発現ベクター（ｐｃ３．１ＤＮＡ）の中にクローニングしてβＨＣＧ６を作成した。
【００６５】
６．１．３ ｍＲＮＡ調製
インビトロスプライシング実験のために、βＨＣＧ６、β−グロビンプレｍＲＮＡ及び様々なＰＴＭｍＲＮＡをＴ７ｍＲＮＡポリメラーゼ（Pasman & Garcia-Blanco,1996,Nucleic Acids Res.24:1638）を用いて、ＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドＤＮＡのインビトロ転写によってそれぞれ合成した。合成されたｍＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により精製し、生成物を切り取って溶出した。
【００６６】
６．１．４ インビトロスプライシング
ＰＴＭ及び標的プレｍＲＮＡを９８℃に加熱してアニーリングし、次いで３０−３４℃にゆっくりと冷やした。各反応液は１２．５μｌの最終体積中に、４μｌのアニールされたｍＲＮＡ複合体（１００ｎｇの標的と２００ｎｇのＰＴＭ）、１Ｘスプライスバッファー（２メモランダムＭｇＣｌ2、１メモランダムＡＴＰ、５メモランダムのリン酸クレアチニン及び４０メモランダムのＫＣｌ）、及び４μｌのＨｅＬａスプライス核抽出物（Promega）を含んでいた。反応液を３０℃で指示された時間インキュベートし、反応を等量の高濃度塩バッファー（７Ｍ尿素、５％ＳＤＳ、１００メモランダムＬｉＣｌ、１０メモランダムＥＤＴＡ及び１０メモランダムトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５）の添加により止めた。核酸をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４９：１）による抽出、次いでエタノール沈殿により精製した。
【００６７】
６．１．５ 逆転写ＰＣＲ反応
ＲＴ−ＰＣＲ分析をＥＺ−ＲＴ ＰＣＲキット（パーキンエルマー、Foster City、カリフォルニア）を用いて行った。各反応液は５０μｌ反応体積中に、１０ｎｇのシス若しくはトランススプライストｍＲＮＡ又は１−２μｇの全ｍＲＮＡ、０．１μｌの各３’及び５’特異的プライマー、０．３メモランダムの各ｄＮＴＰ、１Ｘ ＥＺバッファー（５０メモランダム ビシン、１１５メモランダム 酢酸カリウム、４％グリセロール、ｐＨ８．２）、２．５メモランダム 酢酸マグネシウム、及び５ＵのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。逆転写を６０℃で４５分間行い、次いで得られたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を以下のように行った。１サイクルの９４℃、３０秒間の初期変性、及び２５サイクルの９４℃、１８秒間の変性及び６０℃、４０秒間のアニーリングと伸張、次いで７０℃で７分の最終伸張。反応生成物をアガロースゲルで電気泳動により分離した。
【００６８】
実験に使用したプライマーは以下のとおりであった。
【００６９】
６．１．６ 細胞増殖、トランスフェクション及びｍＲＮＡ単離
ヒト肺がん細胞系Ｈ１２９９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−５８０３）を１０％ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ培地で３７℃、５％ＣＯ2環境で増殖させた。細胞を、ｐｃＳｐ＋ＣＲＭ（ＣＲＭは非機能性毒素）、ＰＴＭを発現するベクター又はリポフェクタミン試薬（Life Technologies,Gaithersburg,MD）を用いたベクター単独（pcDNA3.1）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２週間後にネオマイシン抵抗性（neor）コロニー形成について検定のスコア付けをした。４つのｎｅｏrコロニーを選択し、継続したｎｅｏ選択下で拡張した。全細胞ｍＲＮＡをＲＮＡエクソール（BioChain Institute,Inc.,San Leandro,CA）を用いて単離し、ＲＴ−ＰＣＲのために使用した。
【００７０】
６．１．７ ヌードマウスの腫瘍におけるトランススプライシング
１１匹のヌードマウスを、１ｘ１０７Ｈ１２９９ヒト肺腫瘍細胞で背側の腹側部皮下スペースの両側に注射した（但し、Ｂ１０、Ｂ１１及びＢ１２は一つの腫瘍を持っていた）（第１日目）。第１４日目にマウスに適量の麻酔薬を投与し、いくつかの配向でのエレクトロポレーションで又はエレクトロポレーションなしで、ｐｃβＨＣＧ６又はｐｃＰＴＭ＋Ｓｐとともに若しくはそれなしで、１００μｇのｐｃＳｐ＋ＣＲＭを含む全量１００μｌの生理食塩水を注射した。右側の腫瘍に注射した溶液には針の跡を印すためにインディアインクも含ませた。４８時間後に動物を殺し、腫瘍を切り取り、ただちに−８０℃で凍結した。分析のため、１０ｍｇの各腫瘍をホモジェネートし、ｍＲＮＡをDynabeadsmRNAダイレクトキット（Dynal）を用いて、製造者の指示書に従って単離した。精製したｍＲＮＡ（１０μｌ全体積のうちの２μｌ）を先述のようにβＨＣＧ−Ｆ及びＤＴ−５Ｒプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＴに付した。すべての試料をＤ−３Ｒ、入れ子のＤＴ−Ａプライマー及びビオチン化したβＨＣＧ−Ｆを用いて再増幅し、生成物を２％アガロースゲル上で電気泳動により分析した。バンドを形成した試料をＭ２８０ Streptavidin Dynabeadsを用いて一本鎖ＤＮＡへと処理し、毒素特異的プライマー（ＤＴ−３Ｒ）を用いて配列決定した。
【００７１】
６．２ 結果
６．２．１ ＰＴＭの合成
１８ｎｔ標的結合ドメイン（βＨＣＧ６イントロン１に相補的）、３０ヌクレオチドスペーサー領域、分岐点（ＢＰ）配列、ポリピリミジン領域（tract）（PPT）及びジフテリア毒素サブユニットＡ（DT-A）をコードするエキソンのすぐ上流の３’スプライス部位のＡＧジヌクレオチド（Uchida et al.,1973,J.Biol.Chem.248:3838）を含む、原型のトランススプライシングｍＲＮＡ分子、ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（図１Ａ）を構築した。その後ＤＴ−Ａエキソンを修飾してコドン１４の翻訳開始部位を除去した。ＰＴＭ構築体をトランススプライシングを発現すべく最大活性を示すように設計した。それゆえ、それらは強力な３’スプライスエレメントを含んでいた（酵母ＢＰ及び哺乳類ＰＰＴ）（Moore et al.,1993,In The mRNA World,R.F.Gesteland and J.F.Atkins,eds.(Cold Spring Harbor,New York,Cold Spring Harbor Laboratory Press）。βＨＣＧ６プレｍＲＮＡ（Talmadge et al.,1984,Nucleic Acids Res.12:8415）を、この遺伝子がほとんどの腫瘍細胞において発現されるのでモデル標的として選ばれた。それは、下垂体腺及び性腺におけるいくつかの例外はあるが正常な成人細胞では発現されない。（Acevedo et al.,1992,Cancer76:1467;Hoon et al.,1996,Int J.Cancer 69:369;Bellet et al.,1997,Cancer Res.57:516）。図１Ｃに示すように、ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐは従来のワトソンクリック塩基対を、βＨＣＧ６イントロン１の３’末端を持ったその結合ドメインにより形成し、標的のイントロニック３’スプライスシグナルをマスクする。この特徴は標的とＰＴＭの間のトランススプライシングを容易にするよう設計される。
【００７２】
ＨｅＬａ核抽出物を確立されたスプライシング手法に沿って用い（Pasman & Garcia-Blanco,1996,Nucleic Acids Res.24:1638）、ＰＴＭ構築体がβＨＣＧ６プレｍＲＮＡ標的に侵入し得るかどうかをテストした。インビトロトランススプライシングの生成物をキメラｍＲＮＡ分子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより検出した。成功したトランススプライシング反応の予想される生成物はβＨＣＧ６の第一エクソンと、そのすぐ後に続くＤＴ−ＡをコードするｐｃＰＴＭ＋Ｓｐから寄与するエキソンを含むキメラｍＲＮＡである（図１Ｃ）。このようなキメラｍＲＮＡはプライマーβＨＣＧ−Ｆ（βＨＣＧ６エキソン１に特異的）及びＤＴ−３Ｒ（ＤＴ−Ａ、図２、レーン１−２に特異的）を用いるＲＴ−ＰＣＴにより容易に検出された。時間ゼロにおいてすなわちＡＴＰの不存在下においては、４６６ｂｐ生成物は観察されなかった。このことはこの反応がＡＴＰと時間の両方に依存性であるということを示していた。
【００７３】
ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐの標的結合ドメインはβＨＣＧ６イントロン１プレｍＲＮＡに相補的な１８ヌクレオチドを含んでおり、効率的なトランススプライシングを示した（図２、レーン１−２）。トランススプライシング効率は、非相補的な１８ヌクレオチド「非結合ドメイン」を含む非標的ＰＴＭ−Ｓｐを用いて少なくとも８分の１に減少した（図２、レーン３−４）。結合ドメインとＢＰの間のスペーサーがある場合とない場合のＰＴＭｍＲＮＡのトランススプライシング効率も比較した。この実験はスペーサーの付加によりトランススプライシングの効率が有意に増大することを示した（図２Ｂ、レーン２＋５）。効率的なトランススプライシングに要求されるスプライシングファクターを採用することを容易にするために、３’スプライス部位と、ドメイン／標的相互作用により生じた二重鎖第二構造との間にいくつかのスペースが必要となり得る。
【００７４】
トランススプライシング特異性についてのＰＴＭ長の効果を調べるために、より短いＰＴＭをＡｃｃＩ切断ＰＴＭプラスミドから合成した（図１参照）。これはＤＴ−Ａコード領域の３’末端から４７９ｎｔを除去した。図２Ｂは標的とされた短いＰＴＭ（＋）（レーン１０−１２）のトランススプライシング能力を、標的とされない短いＰＴＭ（−）（レーン１４−１７）と比較して示す（レーン１４−１７）。短いＰＴＭ＋は、その片方の非標的の短いＰＴＭ（図２Ｂ、レーン１７）よりも、実質的により多くのトランススプライスされた生成物を生じた（図２Ｂ、レーン１２）。これらの実験はより長いＰＴＭの方がトランススプライシングを非特異的に仲介する能力が高いであろうことを示している。
【００７５】
６．２．２． ＰＴＭスプライセオソーム仲介トランススプライシングの正確性
ｐｃＰＴＭ＋ＳｐとβＨＣＧ６標的の間のトランススプライシングが正確であることを確認するために、ＲＴ−ＰＣＴ増幅生成物を５’ビオチニル化βＨＣＧ−Ｆ及び非ビオチニル化ＤＴ−３Ｒプライマーを用いて生成した。この生成物は一本鎖ＤＮＡに変えて、Ｍｉｔｃｈｅｌ及びＭｅｒｒｉｌ（1989,Anal.Biochem.178:239）の方法を用いて、プライマーＤＴ−３Ｒ（ＤＴ−Ａ特異的逆プライマー）で直接配列決定した。トランススプライシングは予想されたスプライス部位（図３）の間で正確に起こり、従来のプレｍＲＮＡがスプライシングの間遺伝子工学ＰＴＭ構築体により侵入され得ること、さらにこの反応が正確であることを確認した。
【００７６】
さらに、ダブルスプラシングＰＴＭ（ＤＳ−ＰＴＭ）の選択的トランススプライシングが観察された（図８Ｂ）。ＤＳ−ＰＴＭは３’又は５’スプライス部位のいずれかに貢献することによりトランススプライシングを生じることができる。さらに，３’部位と５’部位の両方において同時にダブルトランススプライシングを行うことができ、それによりエキソン置換を可能にするＤＳ−ＰＴＭを構築することができる。図８Ｂはこの構築体において５’スプライス部位が標的βＨＣＧプレｍＲＮＡ：ＤＳ−ＰＴＭの１：１濃度でより活性であることを示している。１：６の比では５’スプライス部位はより活性である。
【００７７】
６．２．３ ３’スプライス部位はＰＴＭトランススプライシングにとって本質的である
一般に、３’スプライス部位は三つの要素を含んでいる。１）アクセプター部位の５’に位置するＢＰ配列、２）短いピリミジン残基からなるＰＰＴ、及び３）イントロン−エキソン境界におけるＹＡＧトリヌクレオチドスプライス部位アクセプター（Senapathy et al.,1990,Cell 91:875;Moore et al.,1993）。これらの配列要素の一つの削除又は変更はスプライシングを減少させるか、あるいはなくしてしまうことが知られている（Aebi et al.,1986;Reed & Maniatis 1988,Genes Dev.2:1268;Reed,1989,Genes Dev.3:2113;Roscigno et al.,1993,J.Bio.Chem.268:11222;Coolidge et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:888）。標的トランススプライシングにおけるこれらの保存された要素の役割は実験的に処理された。一つのケース［（ＢＰ（−）Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］では、すべての三つの要素（ＢＰ、ＰＰＴ及びＡＧジヌクレオチド）をランダムな配列で置き換えた。ＰＰＴ及び３’スプライス部位アクセプターが突然変異を受けランダム配列で置き換わっている第二のスプライシング突然変異体［（Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］が構築された。いずれの構築体もインビトロではトランススプライシングを支持することはできなかった（図２Ａ、レーン５−８）。これは、従来のシススプライシングの場合と同様に、ＰＴＭトランススプライシングプロセスもまた３’スプライス部位において機能的なＢＰ、ＰＰＴ及びＡＧアクセプターを要するということを示唆するものである。
【００７８】
６．２．４．特異性を増大させるための”安全な”スプライス部位の発生：
結合領域の封入によりまたはＰＴＭを短縮することにより達成される標的特異性の水準を改良するために、数種のＰＴＭ構造の標的結合領域は（”安全なＰＴＭ”と称される）３’スプライス部位をマスクするための分子内茎部を造るために修飾された。安全な茎部はＰＴＭ３’スプライス部位またはこれに隣接する配列の領域と部分的に塩基対にし、それにより標的獲得のまえにＰＴＭ３’スプライス部位へのスプライシング複合体成分の接近を遮断する、結合領域の部分により形成される（図４Ａ、ＰＴＭ＋ＳＦ）。ＰＴＭ結合領域およびβＨＣＧ６の遊離部分間の塩基対は、安全な茎部を巻戻してＵ２ＡＦのようなスプライシングファクターをＰＴＭ３’スプライス部位に結合させそしてトランススプライシングを開始させるのを可能にする（図４Ｂ）。
【００７９】
この概念は、ＰＴＭ＋ＳＦ（安全）またはｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（線状）のいずれかそして標的（βＨＣＧ６）および非標的（β−グロビン）ｐｒｅ−ｍＲＮＡの両方を含有するスプライシング反応において試験された。スプライシングされた生成物は次に、ＲＴ−ＰＣＲおよびゲル電気泳動により分析された。βＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３Ｒプライマーを用いて、特異性１９６ｂｐトランススプライシングされたバンドはβＨＣＧ標的そして線状ＰＴＭ（ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ、図５、レーン２）または安全ＰＴＭ（ＰＴＭ−ＳＦ、図５、レーン８）のいずれかを含有する反応において示された。線状ＰＴＭ（図５、レーン２）と安全ＰＴＭ（図５、レーン８）との間での標的化トランスプライシングの比較は安全ＰＴＭが線状ＰＴＭより効率が低くトランススプライシングしたことを示した。
【００８０】
非標的化反応はβ−グロブリン−Ｆ（β−グロブリンのエキソン１に特異性）およびＤＴ−３Ｒプライマーを用いて増幅された。β−グロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡを用いて非特性ＰＴＭをトランススプライシングすることにより、生成された予期生成物は１８９ｂｐである。線状ＰＴＭとβ−グロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間で非特異性トランススプライシングは明らかであった（図５、レーン５）。対照的に、安全ＰＴＭの使用により非特異性トランススプライシングは実質的に排除された（図５、レーン１１）。このことは、線状ＰＴＭがスプライシング複合体媒介トランススプライシングの概念を明らかにするための最大活性のためにデザインされたので、予期されなかった。その有力な３’スプライス部位と組み合わされた線状ＰＴＭの開いた構造はスプライシング因子の結合を促進する。いったん結合されたならばこれらのスプライシング因子は、トリパノソーマにおけるトランススプライシングに類似の方法で、任意の５’スプライス部位とともにトランススライシングを潜在的に開始することが出来る。安全茎は標的獲得のまえに、Ｕ２ＡＦのようなスプライシング因子がＰＴＭに結合するのを防止するようにデザインされた。この結果は、結合領域の遊離部分とβＨＣＧ６との間の塩茎対が（ｍＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用により）安全茎部を巻戻し、５’スプライス部位をあらわし、スプライシング因子の漸増およびトランススプライシングの開始を可能にするモデルと一致している。β−グロビンとβＨＣＧ６ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間でトランススプライシングは検出されなかった（図５、レーン３、６、９および１２）。
【００８１】
６．２．５ 安全ＰＴＭおよび変異体のインビトロトランススプライシング：
トランススプライシングにおける３’スプライス部位の役割をより良く理解するために、ＰＰＴがプリンとの置換により弱められそして（または）ＢＰが塩基置換により修飾されているかのいずれかである一連の安全ＰＴＭが構成された（表１参照）。安全（ＰＴＭ＋ＳＦ）のインビトロトランススプライシング効率が３種の安全変異体比較され、それはトランススプライシングに対する減少した能力を示した。最も大きな効果に変異体２（ＰＴＭ＋ＳＦＰｙ２）を用いて観察され、これはトランススプライシング不能であった（図４Ｃ、レーン５〜６）。トランススプラインシングのこの阻止は弱められたＰＰＴおよび（または）安全茎部のより高いＴｍに起因している可能性がある。対照的に、ＢＰ配列における変異（ＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３）はトランススプライシングに顕著に影響しなかった。このことは、導入された修飾が哺乳動物の分岐点コンセンサス範囲ＹＮＹＵＲＡＣ（但し、Ｙ＝ピリミジン、Ｒ＝プリンおよびＮ＝任意のヌクレオチド）内であったので驚くべきことではない（Ｍｏｏｒｅ等、１９９３）。この発見は、分枝点配列がスプライシング効率に影響することなしに除去されることが出来ることを示している。ＰＰＴにおける変化（ＰＴＭ＋ＳＦ−Ｐｙｌ）はトランススプライシングにおける水準を減少させた（レーン３〜４）。同様に、ＢＰおよびＰＰＴの両方が変化されたＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３−Ｐｙｌであった場合に、それらはトランススプライシングにおいてさらに減少を生じさせた（図４Ｃ、レーン９〜１０）。これらの安全な変異体のトランススプライシング効率の順序はＰＴＭ＋ＳＦ＞ＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３＞ＰＴＭ＋ＳＦＰｙｌ＞ＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３−Ｐｙｌ＞ＰＴＭ＋ＳＦＰｙ２である。これらの結果はＰＰＴおよびＢＰの両方が有効なインビトロトランススプライシングのために重要であることを確認する（Roscigno等のＪ．Biol.Chem.268：11222（1993））。
【００８２】
６．２．６． シス スプライシングとトランススプライシングとの間の競合：
ＰＴＭの濃度を増大させることによるｐｒｅ−ｍＲＮＡシス スプライシングを遮断することが可能であるかどうかを調べるために、トランススプライシングに対する反応を駆動するために実験を行なった。それらのスプライシング反応は、一定量のβＨＣＧ６ｐｒｅ−ｍＲＮＡ標的および種々の濃度のトランススプライシングＰＴＭを用いて行なわれた。シススプライシングはβＨＣＧ−Ｆ（エキソン１）およびβＨＣＧ−Ｒ２（エキソン２）に対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより監視された。これは予期された１２５ｂＰシススプライシングされた生成物および４７８ｂＰスプライシングされていない生成物を増幅させた（図６Ａ）。プライマーβＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３Ｒがトランススプライシングされた生成物を検出するために用いられた（図６Ｂ）。ＰＴＭの低い濃度で、シススプライシング（図６Ａ、レーン１〜４）は、トランススプライシング（図６Ｂ、レーン１〜４）よりも優勢であった。シススプライシングは標的よりも１．５倍大きいＰＴＭ濃度で約５０％減少された。標的の３倍の濃度にＰＴＭｍＲＮＡ濃度を増大させると、９０％よりも大きくシススプライシングを阻止し（図６Ａ、レーン７〜９）、同時にトランススプライシングされた生成物を増大させている（図６Ｂ、レーン６〜１０）。競合ＰＴ−ＰＣＲは１つの反応においてすべての３種のプライマー（βＨＣＧ−Ｆ、ＨＣＧ−Ｒ２およびＤＴ−３Ｒ）を包含させることによりシススプライシングされた生成物およびトランススプライシングされた生成物の両方を同時に増幅させるために行なわれた。この実験は図６において見られる結果と同様な結果を示し、インビトロ条件下に、ＰＴＭは標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡシススプライシングを有効に遮断しそしてそれを特別に設計されたトランススプライシングされたキメラｍＲＮＡの生産に置き換えることを示している。
【００８３】
６．２．７ 組織培養中のトランス−スプライシング
細胞培養モデルにおけるトランス−スプライシングのメカニズムを例証するため、ヒト肺ガン細胞株Ｈ１２９９（βＨＣＧ６陽性）をＳＰ−ＣＲＭ（非機能的なジフテリア毒素）を発現するベクター又はベクター単独（pcDNA3.1）でトランスフェクトし、ネオマイシン（neomycin）の存在下で成長させた。四つのネオマイシン耐性のコロニーを１４日後に個々に回収し、続いてのネオマイシンの存在下に拡張した。ｍＲＮＡ全体を欠くコロニーから単離し、プライマーβＨＣＧ−Ｆ及びＤＴ−３Ｒを用いたＲＴ−ＰＣＲにより分析した。これにより、四つの選択したコロニーのうち三つから、予想される１９６ｂｐのトランス−スプライスした生成物が得られた（図７Ａ、第２，３，及び４レーン）。増幅したクローン番号２からの生成物を直接配列決定し、ＰＴＭ誘導のトランス−スプライシングが、ヒト細胞において、内因的に発現されたβＨＣＧ６ターゲットエキソン１及びＤＴ−Ａの第一ヌクレオチドの、予想されたスプライス部位で正確に生じたことを確認した（図７Ｂ）。
【００８４】
６．２．８ インビボモデルにおけるトランス−スプライシング
インビボにおけるトランス−スプライシングのメカニズムを例証するため、以下の実験をアシミック（athymic）（ヌード）マウスにおいて行った。１０7のＨ１２９９細胞を背側の側腹部の皮下空間中に注射して、腫瘍を発生させた。１４日目に、ＰＴＭ発現プラスミドを腫瘍へ注射した。大部分の腫瘍を次に、電気穿孔に付し、プラスミドの送達を容易にした（以下の表２参照）。４８時間後、腫瘍を除去し、ポリＡ−ｍＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。１９のＰＴＭ処理腫瘍のうち８つにおいて、トランス−スプライシングが検出された。二つの試料が、一回のＲＴ−ＰＣＲのラウンドで、ｍＲＮＡから、予想されたトランス−スプライスされた生成物（４６６ｂｐ）を製造した。次に、６つの更なる腫瘍が、ネストしたプライマーのセットを用いた第二のＰＣＲの増幅によりトランス−スプライスについて陽性であり、予想された１９６ｂｐの生成物を製造した（表２）。各陽性のサンプルを配列決定し、βＨＣＧ６エキソン１が予想されたスプライス部位において、ＤＴ−Ａのコード配列（野生型又はＣＲＭ変異体）に正確にトランス−スプライスされることを例証した。陽性試料の６つが、人工的にターゲット前−ｍＲＮＡの濃度を増やした、プラスミドｐｃＰＴＭ＋ＣＲＭ及びｐｃＨＣＧ６の共トランスフェクション（cotransfection）を受けた処理グループ由来であった。これは、トランス−スプライスされる現象を検出する可能性を高めるために行われた。他の二つの陽性腫瘍は、ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（野生型ＤＴ−Ａ）のみを受けたグループ由来であった。これらの腫瘍は、βＨＣＧ６発現プラスミドによりトランスフェクトされず、再度、６．２．７節で述べた組織培養モデルと同様に、トランス−スプライシングが、腫瘍細胞により製造される、ＰＴＭと内因的なβＨＣＧ６前−ｍＲＮＡとの間で起こったことを例証した。
【００８５】
【００８６】
７．例 ＬａｃＺトランス−スプライシングモデル
特異的プレｍＲＮＡ標的とＰＴＭの間のスプライソソーム介在標的トランス−スプライシングの機構の普遍性を明白にし、評価するために、酵素β−ガラクトシダーゼに基づいた単純なモデルシステムを開発した。以下の節においては、特異標的とＰＴＭの間のスプライソソーム介在標的トランス−スプライシングの成功例を明らかにする結果を記載する。
【００８７】
７．１． 材料と方法
７．１．１． プライマー配列
以下のプライマーｌａｃＺモデルシステムをテストするために使用された：
【００８８】
７．１．２． ｌａｃＺプレｍＲＮＡ標的分子の構築
ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡ（ｐｃ３．１、ｌａｃＴ１）を、以下のＰＣＲ産物のクローニングによって構築した：（ｉ）ｌａｃＺの５’フラグメント、次いで（ｉｉ）βＨＣＧ６イントロン１：（ｉｉｉ）およびｌａｃＺの３’フラグメント。ｌａｃＺ遺伝子の５’および３’断片を、以下のプライマーを使用して、テンプイレートｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Invitrogen,SanDiego,CA）からＰＣＲ増幅した：５’ｌａｃ−１Ｆおよび５’ｌａｃ１Ｒ（５’断片用）、および３’ｌａｃ−１Ｆおよび３’ｌａｃ−１Ｒ（３’断片用）。増幅したｌａｃＺ５’断片は開始コドンを含む１７８８ｂｐ長であり、増幅した３’断片は１３８５ｂｐ長で、分枝点、ポリピリミジントラクトおよびβＨＣＧ６イントロン１、に加えて、天然の５’および３’スプライス部位を有している。βＨＣＧ６イントロン１は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された：ＨＣＧ−Ｉｎ１ＦおよびＨＣＧ−Ｉｎ１Ｒ。
【００８９】
ｌａｃＺ標的２は、３’スプライス部位の後にフレーム４コドン中に２つの停止コドン（ＴＡＡＴＡＡ）を含有している他は、ｌａｃＺ１と同じバージョンである。これは、以下のプライマーを用いて、３’断片（ｌａｃＺ）のＰＣＲ増幅によって創製された：ｌａｃ−Ｓｔｏｐおよび３’ｌａｃ１ＲおよびｌａｃＺ標的１中の機能的３’断片の置換。
【００９０】
７.１.３． ｐｃ３.１ＰＴＭおよびｐｃ３．１ＰＴＭ２の構築
プレ−トランス−スプライシング分子、ｐｃ３．１ＰＴＭ１は、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＴＭ＋Ｓｐを消化し、ＤＴ−ＡトキシンをコードするＤＮＡ断片を、ｌａｃＺの機能的３’末端をコードするＤＮＡ断片で置換することによって創製した。この断片を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅することによって産生した：３’ｌａｃ１Ｆおよび３’ｌａｃ１Ｒ。細胞培養実験のために、ＨＣＧイントロン１に対する結果領域、３０ｂｐスペーサー、酵母分枝点（ＴＡＣＴＡＡＣ）、および強いポリピリミジントラクトと次いでクローン化したｌａｃＺを含有するｐｃ３．１ＰＴＭ２の、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。
【００９１】
プレ−トランス−スプライシング分子、ｐｃ３．１ＰＴＭ２は、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＰＴＭ＋Ｓｐを消化し、そしてＤＴ−ＡトキシンをコードするＤＮＡ断片をβＨＣＧ６エキソン２で置換することによって創製された。βＨＣＧ６エキソン２は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって産生された：ＨＣＧ−Ｅｘ２ＦおよびＨＣＧ−Ｅｘ２Ｒ。細胞培養実験のために、ＨＣＧイントロン１に対する結果領域、３０ｂｐスペーサー、酵母分岐点（ＴＡＣＴＡＡＣ）、および強いポリピリミジントラクトと次いでクローン化したβＨＣＧ６エキソン２を含有するｐｃ３．１ＰＴＭ２の、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用した。
【００９２】
７．１．４．ｌａｃＺスプライス標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭＳを２９３細胞への同時トランスフェクション
ヒト胚腎細胞（２９３Ｔ）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ倍地で３７℃、５％ＣＯ2にて増殖させた。細胞を、製造元の指示書に従ってLipofectaminePlus[LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)]を用いて、ｐｃ３.１ＬａｃＴ１およびｐｃ３．１ＰＴＭ２またはｐｃ３．１ＬａｃＴ２およびｐｃ３．１ＰＴＭで同時トランスフェクトした。２４時間の後トランスフェクションで、細胞は収穫された；総ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを標的用およびＰＴＭ用特異性プライマーを用いて実行した。β−ガラクトシダーゼ活性は、β−ｇａｌ染色キット（Invitrogen,SanDiego,CA）を使用して、細胞を染色することによりモニターされた。
【００９３】
７．２．結果
７．２．１．ｌａｃＺスプライス標的は、効率よくシス・スプライスして、機能的β−ガラクトシダーゼを産生する
スプライス標的プレｍＲＮＡのシス・スプライス効率の性能を比較するため、ｐｃ３．１ｌａｃＴ１を、LipofectaminePlus試薬[LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)]を使用して、次いで総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。シス・スプライスしたＲＴ−ＰＣＲの配列解析は、スプライシングは正確であり、予測されたスプライス部位に正確に起こったことを示した（図１２Ｂ）。更に、標的プレｍＲＮＡ分子の正確なシス・スプライシングは、β−ガラクトシダーゼ、即ちｘ−ｇａｌの、加水分解を触媒し、顕微鏡下で、可視化することができる青色を産生する活性β−ガラクトシダーゼをコードすることのできるｍＲＮＡの生成をもたらす。標的プレｍＲＮＡの正確なシス・スプライシングは、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を成功裏に検出することにより、更に確認された。
【００９４】
機能的３’ｌａｃ断片（ＰＴＭ１）のトランス・スプライシングによる欠損ｌａｃＺ標的２プレｍＲＮＡの修復は、β−ガラクトシダーゼが酵素活性の染色により測定した。この目的のために、２９３Ｔ細胞をｌａｃＺ標的２プレｍＲＮＡ（欠損３’断片を含有）およびＰＴＭ１（機能的３’ｌａｃＺ活性を含有）の同時トランスフェクションを行った。２４時間後トランスフェクショクン細胞のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性をアッセイした。効果的なＰＴＭ１のｌａｃＺ標的２プレｍＲＮＡへのトランス・スプライシングは、機能的β−ガラクトシダーゼ活性の産生をもたらした。図１１Ｂ−Ｅに明らかに示したように、ＰＴＭ１のｌａｃＺ標的２へのトランス・スプライシングは、対照と比較して、５％ないし１０％のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の回復をもたらした。
【００９５】
７.２．２． ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡをＰＴＭ２の間の標的トランス・スプライシング
トランス・スプライシングをアッセイするため、ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭ２を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションに次いで、総ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。ＰＣＲ反応には、以下のプライマーを使用した：ｌａｃＺ−ＴＲ１（ｌａｃＺ５’エキソン特異的）およびＨＣＧＲ２（βＨＣＧＲエキソン２特異的）。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、予測された１９５ｂｐトランス・スプライス産物（図１１、レーン２および３）を産生し、ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭ２の間の効率的なトランス・スプライシングを明らかにした。レーン１は、ＰＲＭ２を含まない、対照を示す。
【００９６】
トランス・スプライシングの効率を、β−ガラクトシダーゼ活性を染色して測定した。トランス・スプライシングをアッセイするために、２９３Ｔ細胞をｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭ２で同時トランスフェクションした。２４時間後トランスフェクションで、細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。もし、標的プレｍＲＮＡをＰＴＭの間に効果的なトランス・スプライシングが起これば、ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡの５’断片からなるキメラｍＲＮＡが産生され、そして、活性β−ガラクトシダーゼをコードすることのできない、βＨＣＧ６エキソン２が生じる。同時トランスフェクション実験の結果は、ｌａｃＺ標的１へのＰＴＭ２のトランス・スプライシングは、対照に比較して、β−ガラクトシダーゼ活性の１０−１５％の減少をもたらした。
【００９７】
ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡとＰＴＭ２の間のトランス・スプライシングが正確であることを更に確認するため、ＲＴ−ＰＣＲを５’ビオチン化ｌａｃＺ−ＴＲ１および非ビオチン化ＨＣＧＲ２プライマーを使用して行った。一本鎖のＤＮＡを単離し、ＨＣＧＲ２プライマー（ＨＣＧエキソン２特異的プライマー）を用いて直接配列決定した。スプライス部位の配列によって証明されるように、トランス・スプライシングはスプライス部位の間に予測されたように正確に起こっており（図１２Ａおよび１２Ｂ）、通常のプレｍＲＮＡが、スプライシング中に操作したＰＴＭにより浸食されており、そして更に、この反応が正しいことを確認した。
【００９８】
８．実施例：嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質の修正
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、世界で最も普通の遺伝性疾患の一つである。ＣＦに関連する遺伝子は、単離され、そのタンパク質産物が推定された（kerem,B.S.et al.1989,Science,245:1073-1080;Riordan et al.,1989,Scienece,245:1066-1073;Rommans,et al.,1989,Science,245:1059-1065）。ＣＦ関連遺伝子のタンパク質産物は、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）と称されている。全ての突然変異アレルのおよそ〜７０％を数える、突然変異起因性の最も普通の疾病は、位置５０８（△Ｆ５０８）のフェニルアラニンをコードするエキソン１０における３つのヌクレオチドの欠損である。以下の節では、スプライソソーム介在トランス・スプライシングを使用した嚢胞性繊維症遺伝子の成功した修復を記載し、モデルシステムの修復ＣＦＴＲの実行可能性を明らかにする。
【００９９】
８.１． 材料および方法
８．１．１． プレトランススプライシング分子
ＣＦＴＲプレ・トランス・スプライシング・分子（ＰＴＭ）は、ＣＦＴＲイントロン９（３’末端、−１３から−３１）に相補性の２３ヌクレオチド結合領域、３０ヌクレオチドスペーサー領域（スプライソソーム成分の効率的な結合を許容する）、分岐点（ＢＰ）配列、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）およびＣＦＴＲエキソン１０をコードする配列の直上流の３’スプライス部位にあるＡＧジヌクレオチド（Ｆ５０８を含む野生型配列）からなる。この最初のＰＴＭは、トランススプライシングを明らかにするために最大活性を表すよう設計された：それゆえ、ＰＴＭはＵＡＣＵＡＡＣの酵母コンセンサスＢＰ配列および大きなＰＰＴを含む。１８ヌクレオチドＨＩＳタグ（６ヒスタミンコドン）は、特異的増幅およびトランス・スプライシング産物の単離、および内部ＣＦＴＲを有さないことを許容する野生型エキソン１０コード配列の後に含まれる。２フラグメントを産生するに使用されるオリゴヌクレオチドは、ユニークな制限部位を含み、（それぞれ、ＡｐａＩおよびＰｓｔＩ、およびＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ）哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に増幅したＤＮＡを直接クローニングすることができる。
【０１００】
８．１．２． 標的ＣＦＴＲプレｍＲＮＡミニ遺伝子
ＣＦＴＲミニ遺伝子標的は、図１３に示され、ＣＦＴＲエキソン９；イントロン９の機能的５’および３’領域（それぞれ、各末端から２６０および２６５ヌクレオチド）；エキソン１０[△Ｆ５０８]；およびイントロン１０の５’領域（９０ヌクレオチド）からなる。更に、図１６に示したように、ＣＦＴＲエキソン９−１０および１０−２４を含むミニ標的遺伝子は、嚢胞性繊維症突然変異の修正のためのトランス・スプライシング介在スプライソソームの使用をテストするために使用することができる。図１７は、嚢胞性繊維症突然変異の修正のために使用することができる二重スプライシングＰＴＭを示す。示したように、二重スプライシングＰＴＭは、ＣＦＴＲ・ＢＤイントロン９、スペーサー、分岐点、ポリピリミジントラクト、３’スプライス部位、ＣＦＴＲエキソン１０、スペーサー、分岐点、ポリミリミジントラクト、５’スプライス部位およびＣＦＴＲ・ＢＤエキソン１０を含有する。
【０１０１】
８．１．３． オリゴヌクレオチド
以下のオリゴヌクレオチドは、ＣＦＴＲ・ＰＴＭを創製するために使用される。
【０１０２】
以下のヌクレオチドは、ＣＦＴＲターゲット前−ｍＲＮＡミニ遺伝子（エキソン９＋ミニ−イントロン９＋エキソン１０＋５’末端イントロン１０）を作製するために用いられた。
【０１０３】
以下のオリゴヌクレオチドは、トランス−スプライスされた生成物を検出するために用いられた：
【０１０４】
８．２ 結果
ＰＴＭ及びターゲットプレ−ｍＲＮＡを２９３胎児性腎細胞中に、リポフェクタミン（lipofectamine）（Life Technologies,Gaithersburg,MD）を用いて共トランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後２４時間で回収し、ＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応において、ＰＴＭ及びターゲット特異性のプライマーを用いて、その中でターゲットプレ−ｍＲＮＡの変異体エキソン１０がＰＴＭの野生型エキソン１０（図１４）と置き換わっている、トランス−スプライスした生成物を検出した。トランス−スプライスした生成物の配列分析により、三つのヌクレオチド欠失の回復、及びスプライシングが正確であり、予想されたスプライス部位に生じること（図１５）が確認され、初めて嚢胞性線維症遺伝子ＣＦＴＲのＲＮＡ修復を例証した。
【０１０５】
本発明は、本明細書中に記載の特定の態様による範囲内に限定されない。つまり、本明細書中に記載の改変加えて、本発明の種々の改変が、前記説明及び添付の図面より、当業者にとって明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものと意図される。本明細書中に引用した種々の文献について、その開示は引用により全体として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】トランス−スプライシングＲＮＡ先駆体のモデル。
【図１Ｂ】モデルＰＴＭ構築物および標的を定めたトランス−スプライシング戦略。第一世代ＰＴＭ（ＰＴＭ＋ＳｐおよびＰＴＭ−Ｓｐ）の図解図。ＢＤ、結合ドメイン；ＮＢＤ、非結合ドメイン；ＢＰ、分枝点；ＰＰＴ、ピリミジン配列；ｓｓ、スプライシング部位；ＤＴ−Ａ、ジフテリアトキシンサブユニットＡ。ＰＴＭ内の特異な制限部位は、一字で示されている；E.coli,EcoRI;X,Xhil;K,Kpnl;P,Pstl;A,Accl;B,BamHおよび異種（Hetrologous），ＨｉｎｄＩＩＩ。
【図１Ｃ】βＨＣＧ６標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対する慣用のWatson Crick塩基対を経るＰＴＭ−Ｓｐの結合および提案されたシス−スプライシングおよびトランス−スプライシングメカニズムを示す図解図。
【図２Ａ】種々のＰＴＭ構築物のβＨＣＧ６標的中へのインビトロ トランス−スプライシング効率。標的を定めた結合ドメインおよび活性スプライシング部位は、ＰＴＭトランス−スプライシング活性と関連している。十分の長さの標的を定めた（ｐｃ−ＰＴＭ＋Ｓｐ）、標的が定められていない（ＰＴＭ−Ｓｐ）およびスプライシング変異体［Ｐｙ（−）ＡＧ（−）およびＢＰ（−）Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］ＰＴＭ ＲＮＡを、βＨＣＧ６標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡを含有するスプライシング反応に付加した。この生成物は、プライマーβＨＣＧ−Ｆ（標的βＨＣＧ６エキソン１に対して特異性）およびＤＴ−５Ｒ（ＤＴ−Ａに対する相補体）を用いて増幅され、次いで１．５％アガロースゲルにおける電気泳動により分析して、ＲＴ−ＰＣＲであった。
【図２Ｂ】種々のＰＴＭ構築物のインビトロ トランス−スプライシング効率。結合ドメインとスプライシング部位との間に空間を有する十分の長さのＰＴＭ、標的結合ドメイン（短いＰＴＭ＋）または標的が定められていない結合ドメイン（ＰＴＭ−）を包含する短いＰＴＭおよびスペーサー領域を有していないＰＴＭを、βＨＣＧ６標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡを含有するスプライシング反応に付加した。この生成物は、プライマーβＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３を用いて増幅されたＲＴ−ＰＣＲであった。短いＰＴＭを含有する反応の場合、可逆性ＰＣＲプライマーは、ＤＴ−４であった。これは、ＤＴ−３の結合部位がＰＴＭから分離されることによる。
【図３】ＰＴＭと標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間のインビトロ トランス−スプライシング生成物を示すヌクレオチド配列。図２（レーン２）からの４６６ｂｐのトランス−スプライシングされたＲＴ−ＰＣＲ生成物を、５’ビオチン標識したせ前進プライマー（βＨＣＧ−Ｆ）および組み重ねられた（nested）非標識可逆性プライマー（ＤＴ−３Ｒ）を用いて再増幅した。一重鎖ＤＮＡは、精製し、次いでトキシン特異性ＤＴ−３Ｒプライマーを用いて直接に配列決定した。矢印は、標的βＨＣＧ６エキソンＩの最後のヌクレオチドとＤＴ−Ａをコードする最初のヌクレオチドとの間のスプライシング接合を示す。
【図４Ａ】ＢＰおよびＰＰＴがスプライシング因子から遮蔽されるように、ＰＴＭ分子内基対ステムを示す、「安全」（safety）ＰＴＭおよびその変種の図解図。下線を引いた配列は、βＨＣＧ６イントロンＩ相補標的−結合ドメインを示す。イタリック体文字の配列は、ＢＰに対して同族である標的ミスマッチを示している。
【図４Ｂ】標的に結合した際の飽和ＰＴＭを示す開放形態の図解図。
【図４Ｃ】インビトロ トランス−スプライシング反応は、安全ＰＴＭまたは安全ＰＴＭ変種を、βＨＣＧ６標的とともにインキュベートすることによって行った。スプライシング反応は、βＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３Ｒプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより増幅させた；生成物は、２．０％アガロースゲルで分析した。
【図５】標的を定めたトランス−スプライシングの特異性は、ＰＴＭ中に安全ＰＴＭを包含させることによって増強される。βＨＣＧ６ｐｒｅ−ｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）およびβ−グロブリンｐｒｅ−ｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）を、ＰＴＭ＋ＳＦ（安全）またはｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（線状）ＲＮＡ（５００ｎｇ）とともにアニーリングした。インビトロ トランス−スプライシング反応およびＲＴ−ＰＣＲ分析は、試験方法について記載されているとおり行い、また生成物は、２．０％アガロースゲルで分離した。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたプライマーは、指定されているとおりである。
【図６】上昇するＰＴＭ濃度の存在下で、シス−スプライシングは阻害され、トランス−スプライシングによって取って代わられる。一定量のβＨＣＧ６ターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）の存在下でＰＴＭ（pcPTM+Sp）ＲＮＡ濃度を上昇させながら（５２〜３００ｎｇ）、in vitroスプライシングを行った。シス−スプライスト（cis-spliced）及びアン−スプライスト（un-spliced）生成物のＲＴ−ＰＣＲはプライマーβＨＣＧ−Ｆ（エキソン１特異的）とβＨＣＧ−Ｒ２（エキソン２特異的−パネルＡ）を用いた；プライマーβＨＣＧ−ＦとＤＴ−３ＲはＲＴ−ＰＣＲトランス−スプライスト生成物（パネルＢ）に用いた。反応生成物を１．５％及び２．０％アガロースゲル上でそれぞれ分析した。パネルＡでは、レーン９は３００ｎｇのＰＴＭの存在下での６０分時点を表し、これはパネルＢのレーン１０に相当する。
【図７Ａ】ＰＴＭは培養ヒト癌細胞においてトランス−スプライシングすることができる。ｐｃＳｐ＋ＣＲＭ（非毒性変異体ＤＴ−Ａを発現する）をトランスフェクトされた４拡大ネオマイシン耐性Ｈ１２９９肺癌コロニーの各々から、総ＲＮＡを単離した。１μｇの総ＲＮＡと、５’ビオチニル化βＨＣＧ−Ｆ及び非ビオチニル化ＤＴ−３Ｒプライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。一本鎖ＤＮＡを精製して、配列決定した。
【図７Ｂ】内因性βＨＣＧ６ターゲットとＣＲＭ１９７変異体毒素との間のトランス−スプライスト生成物のヌクレオチド配列（センス鎖）を示す。２つの矢印はスプライス部位の位置を示す。
【図８Ａ】二重スプライシング治療前ｍＲＮＡの概略図。
【図８Ｂ】二重スプライシングＰＴＭの選択的トランス−スプライシング。ＰＴＭ濃度を変えることによって、ＰＴＭをターゲットの５’又は３’スプライス部位にトランス−スプライシングすることができる。
【図９】エキソン標識（tagging）のためのＰＴＭ分子の使用の概略図。２例のＰＴＭを示す。左側のＰＴＭはターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡ３’スプライス部位に非特異的にトランス−スプライシングすることができる。他方の右側ＰＴＭはターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡ５’スプライス部位に非特異的にトランス−スプライシングするように設計される。ＰＴＭ仲介トランス−スプライシング反応は、信頼すべき（authentic）エキソンの５’又は３’側のいずれかへの特異的タグを含むキメラＲＮＡの生成を生じる。
【図１０Ａ】ｌａｃＺノックアウトモデルに用いるための構築体の概略図。ターゲットｌａｃＺｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ｌａｃＺの５’フラグメントと、それに続くβＨＣＧ６イントロン１とｌａｃＺの３’フラグメントを含有する（ターゲット１）。このモデル系に用いるためのＰＴＭ分子は、ｐＰＴＭ＋ＳＰをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩとによって消化させ、ＤＴ−Ａ毒素をβＨＣＧ６エキソン２（ｐｃ３．１ＰＴＭ２）と代えることによって作製された。
【図１０Ｂ】スプライソソーム仲介ＲＮＡトランス−スプライシング（ＳＭａＲＴ）によるβ−Ｇａｌ活性の修復の概略図。
【図１０Ｃ】ｌａｃＺノックアウトモデル（pc3.1 lacZT2）に用いるための構築体の概略図。ｌａｃＺターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡは、３’スプライス部位後のフレーム４コドン中に２終止コドン（TAA TAA）を含有することを除いて、ノックアウト実験に用いたターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡと同じである。このモデル系に用いるためのＰＴＭ分子は、ｐＰＴＭ＋ＳＰをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩとによって消化させ、ＤＴ−Ａ毒素をｌａｃＺの機能的３’フラグメントと代えることによって作製された。
【図１１Ａ】ｌａｃＺノックアウトモデルを用いた場合のシス−及びトランス−スプライシングの実証。ｌａｃＺスプライスターゲット１ｐｒｅ−ｍＲＮＡとＰＴＭ２を２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトした。次に、総ＲＮＡを単離し、適当な特異的プライマーを用いて、シス−スプライスト生成物とトランス−スプライスト生成物に関してＰＣＲによって分析した。増幅したＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で分離させた。
【図１１Ｂ】β−ガラクトシダーゼ活性に関する分析。２９３細胞をｌａｃＺターゲット２ＤＮＡのみ（パネルＢ）又はｌａｃＺターゲット２ＤＮＡとＰＴＭ１（パネルＣ）によってトランスフェクトした。
【図１１Ｃ】β−ガラクトシダーゼ活性に関する分析。２９３細胞をｌａｃＺターゲット２ＤＮＡのみ（パネルＢ）又はｌａｃＺターゲット２ＤＮＡとＰＴＭ１（パネルＣ）によってトランスフェクトした。
【図１２Ａ】正確なトランス−スプライシングを実証するトランス−スプライスト分子のヌクレオチド配列。
【図１２Ｂ】シス−スプライスト生成物とトランス−スプライスト生成物のヌクレオチド配列。これらのヌクレオチド配列は異なるスプライシング反応の各々に関して予想された配列であった。
【図１３】嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）遺伝子の修復に関する遺伝子修復モデル。
【図１４】外因的に供給されたＣＦＴＲミニ−遺伝子ターゲットとＰＴＭとの間のトランス−スプライシングのＲＴ−ＰＣＲ実証。プラスミドを２９３胚腎臓細胞中へ同時トランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いたプライマー対は各レーン上方にリストする。各レーン中の下位帯（４７１ｂｐ）はトランス−スプライスト生成物を表す。レーン１の下位帯（４７１ｂｐ）を２％Ｓｅａｋｅｍアガロースゲルから精製して、この帯のＤＮＡ配列を決定した。
【図１５Ａ】トランス−スプライスト生成物（図１４に示したレーン１、下位帯）のＤＮＡ配列。このＤＮＡ配列はＦ５０８コドン（ＴＴＴ）の存在を実証し、エキソン９配列はエキソン１０配列及びＨｉｓタグ配列に隣接する。
【図１５Ｂ】トランス−スプライスト生成物（図１４に示したレーン１、下位帯）のＤＮＡ配列。このＤＮＡ配列はＦ５０８コドン（ＴＴＴ）の存在を実証し、エキソン９配列はエキソン１０配列及びＨｉｓタグ配列に隣接する。
【図１６】エキソン１０にＦ５０８欠失を有する外因的供給ＣＦＴＲターゲット分子の修復の概略図。
【図１７】二重スプライシングＰＴＭを用いたエキソン１０侵襲による内因的ＣＦＴＲ転写体の修復。二重スプライシングＰＴＭの使用は、非常に短いＰＴＭ分子によるΔ５０８突然変異の修復を可能にする。
【技術分野】
【０００１】
（１．序論）
本発明は、標的を定めたスプライセオソーム（spliceosomal）トランス−スプライシング（trans-splicing）により新規核酸分子を創造するための方法および組成物を提供する。本発明による組成物は、天然標的メッセンジャーＲＮＡ先駆体（標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）（target pre-trans-mRNA） と相互作用し、また新規キメラＲＮＡ分子（キメラＲＮＡ）の創造を生じさせるトランス−スプライシング反応を媒介するようにデザインされているトランス−スプライシング分子先駆体（pre-trans-splicing molecules）（ＰＴＭ）を含有する。本発明によるＰＴＭは一般に、それ自体がＲＮＡの翻訳の抑制などの機能を果たすことができ、または細胞における誘導蛋白質または不活性蛋白質を相補する蛋白質をコードする、または特定の細胞を殺滅するトキシンをコードする新規キメラＲＮＡが生成されるように操作される。一般に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、特定の細胞種内で発現されることから、標的として選択され、これにより新規キメラＲＮＡの発現を、選択された細胞種に標的を定めるための手段が提供される。
【０００２】
本発明はまた、エキソン標識法（exon tagging method）を用いるＰｒｅ−ｍＲＮＡ分子のエキソン／イントロン境界を特定するために遺伝子操作されているＰＴＭに関する。さらにまた、このＰＴＭは特定の細胞種で発現される蛋白質の精製および同定に用いることができるペプチド親和性精製標識をコードするキメラＲＮＡの生成が得られるようにデザインすることができる。本発明の方法は、本発明によるＰＴＭを、当該ＰＴＭの蛋白質が天然Ｐｒｅ−ｍＲＮＡの蛋白質にトランス−スプライシングされ、新規キメラＲＮＡ分子が形成される条件下に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡと接触させることを包含する。本発明による方法および組成物は、細胞遺伝子調節、遺伝子修復および増殖性疾病、例えば癌の処置用、もしくは遺伝病、自己免疫性疾病または感染性疾病の処置用の自殺的遺伝子治療（suicide gene thrapy）に使用することができる。本発明による方法および組成物はまた、イントロン−エキソン境界のマップ作成およびいずれか指定の細胞で発現された新規蛋白質の同定に使用することができる。
【０００３】
（２．発明の背景）
染色体中のＤＮＡ配列は、コード領域（エキソン）を含有し、および一般にまた、非コード領域（イントロン）を含有するＰｒｅ−ｍＲＮＡに転写される。イントロンは、スプライシングと称される正確な方法でＰｒｅ−ｍＲＮＡから分離される［ChowらによるCell 12:1〜8(1977)；およびＢｅｒｇｅｒらによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,74:3171〜3175(1977)］。スプライシングは、数個の小型核を有するリボ核蛋白質粒子（ｓｎＲＮＰ）とスプライセオソームとして知られている酵素複合体を形成するように組み立てられる、かなり多くの蛋白質因子との配位相互反応として生じる［MooreらによるThe RNA wORLD,R.F.Gestiand and J.F.Athns eds(ColdSpring Harbor Laboratory Press,(Cold Spring Harbor,N.Y.)(1993);KramerらによるAnnu.Rev.Biochem.,65:367〜404(1996);StaleyおよびGuthrieによるCell,92:315〜326(1998)］。
【０００４】
Ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングは２段階メカニズムにより進行する。第一段階において、５’スプライシング部位が分裂され、「遊離」５’エキソンおよび投げ縄型中間体が生成される（Moore,M.J.およびP.A.SharpによるNature,365:364〜368(1993)）。第二段階において、この５’エキソンは、投げ縄型生成物としてのイントロンの放出を伴い５’エキソンにリゲートされる。これらの段階は、小型核を有するリボ核蛋白質とスプライセオソームと称される蛋白質との複合体により触媒される。
【０００５】
このスプライシング反応部位は、５’および３’スプライシング部位の周囲の共通配列を定めている。５’スプライシング部位共通配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵである（ここで、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリンおよび／＝スプライシング部位である）。３’スプライシング領域は、３個の分離した配列要素からなる；分岐点または分枝部位；ポリピリミジン配列および３’スプライシング共通配列（ＹＡＧ）。これらの要素は、３’スプライシング領域を粗く定めており、３’スプライシング部位のイントロン上流の１００ヌクレオチドを包含することができる。哺乳動物の分枝点共通配列は、ＹＮＹＵＲＡＣである（ここで、Ｎ＝いずれかのヌクレオチド、Ｙ＝ピリミジンである）。下線を付けたＡは、分枝形成部位である（ＢＰＡ＝分枝点アデノシン）。３’スプライシング共通配列は、ＹＡＧ／Ｇである。この分枝点とスプライシング部位との間には、通常、ポリピリミジン配列が見出され、この配列は分枝点有効利用および３’スプライシング部位認識にとって、哺乳動物系で重要である（Roscigno,R.F.らによるBiol.Chem.,268:11222〜11229(1993)）。この分枝点およびポリピリミジン配列から下流の第一ＹＡＧトリヌクレオチドは、最も慣用の３’スプライシング部位である（Smith,C.W.らによるNature,342:243〜247(1989)）。
【０００６】
大部分の場合、このスプライシング反応は、同一Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子内で生じ、これはシス−スプライシング（cis-splicing）と称される。２個の独立して転写されるＰｒｅ−ｍＲＮＡ間のスプライシングは、トランス−スプライシング（trans-splicing）と称される。トランス−スプライシングは、最初に、トリパノソームで見出され（Sutton & BoothroydによるCell,47:527(1986);MurphyらによるCell,47:517(1986)）、引き続いてネマトイド類で（Krause & HirshによるCell,49:753(1987)）、扁虫類で（flatworms）（RajkovieらによるNat'l.Acad.Sci.USA,87:8879(1990);DevisらによるJ.Biol.Chem.,270:21813(1995)）および植物ミトコンドリアで（MalekらによるProc.Nat'l.Acad.Sci.USA,94:553(1997)）で見出されている。寄生虫トリパノソーマ ブルセイ（Trypanosoma brucei）では、全部のｍＲＮＡが、トランス−スプライシングにより、それらの５’末端でスプライシングリーダー（ＳＬ）ＲＮＡを獲得する。カエノルハブジチス エレガンス（Caenorhabditis elegans）では、５’リーダー配列はまた、数個の遺伝子にトランス−スプライシングされる。このメカニズムは、かなりの相違する転写体に単一の共通配列を付加するものと認識される。
【０００７】
慣用のシス−スプライシングとほとんど同一であるトランス−スプライシングのメカニズムは、２個のホスホリル転移反応を経て進行する。最初に、“Ｙ”型分枝中間体（これは、シス−スプライシングにおける投げ縄型中間体に等しい）を生成する２’−５’ホスホジエステル結合の形成が生じる。第二反応、すなわちエキソン リゲーションは、慣用のシス−スプライシングと同様に進行する。さらに、トランス−スプライシングを触媒するｓｎＲＮＡの若干と３’スプライシング部位とは、シス−スプライシングに包含されるそれらの対向部分と近似している。
【０００８】
トランス−スプライシングはまた、相違するプロセスに関連することもある。すなわち、第一のｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロンが第二のｐｒｅ−ｍＲＮＡと相互反応する場合、２つの共通のｐｒｅ−ｍＲＮＡ間のスプライシング部位の組換えを増強させる。このタイプのトランス−スプライシングは形質転換したマウスの固有定常領域に結合しているヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写体を説明するものと仮定されている（ShimizuらによるProc.Nat'l.Acad.Sci.USA,86:8020(1989)）。さらにまた、c-myb pre-RNAのトランス−スプライシングが証明され（Vellard,M.らによるProc.Nat'l.Acad.Sci.89:251〜2515）、さらに最近になって、相互にトランス−スプライシングされたクローン形成したＳＶ４０からのＲＮＡ転写体が、培養された細胞および核抽出物で検出された（EueらによるEMBO.J.14:3226(1995)）。しかしながら、哺乳動物ｐｒｅ−ｍＲＮＡの天然で生じるトランス−スプライシングは、格別に稀な出来事であると考えられる。トランス−スプライシングの反応メカニズムは、慣用のシス−スプライシングとほとんど同一であると信じられる。これは、２’−５’ホスホジエステル結合の形成を経て進行し、“Ｙ”形状の分枝した中間体を生成させる（この中間体は、シス−スプライシングにおける中間体に等しい）。
【０００９】
インビトロ トランス−スプライシングは、数グルーブによるスプライシングのメカニズムを試験するためのモデルシステムとして使用されている（Konarska & SharpによるCell,46:165〜171(1985);SolnickによるCell,42:157(1985);Chiara & ReedによるNature,375:510(1995);PasmanおよびGarcis-BlancoによるNucleic Acids Res.,24:1638(1996)）。妥当に効果的なトランス−スプライシング（シス−スプライシングされた同族体の３０％）が、相互に塩基対を形成することができるＲＮＡ間で達成された。塩基対により集合しないＲＮＡのスプライシングは、１０のファクターでさらに減少された。基質の中で明白なＲＮＡ−ＲＮＡ相互反応を要しない別のインビトロ トランス−スプライシング反応が、ＣｈａｒａおよびＲｅｅｄにより(1995,Nature,375:510);Bruzik,J.P.およびManiatis,T.により(1992,Nature,360:692);およびBruzik,J.J.およびManiatis,T.により（Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,92:7056〜7059(1995)、見出された。これらの反応は、比較的小さい頻度で生じ、特殊化された要素、例えば下流５’スプライシング部位またはエキソンスプライシング部位などを必要とする。
【００１０】
ｍＲＮＡ先駆体に複数の蛋白質を結合することを包含する（これは次いで、ＲＮＡの正確な切断および接合に作用する）スプライシング方法に加えて、第三のスプライシング法は、イントロンそれ自体（ここでは、触媒性ＲＮＡ分子またはリボザイムと称される）によるＲＮＡの切断および接合を包含する。このリボザイムの分裂活性は、分離した「ハイブリゼーション」領域をリボソーム中にエンジニアリングすることによって、特定のＲＮＡに標的設定される。標的ＲＮＡへのハイブリゼーションによって、リボソームの触媒領域はほとんど分解する。このようなリボソーム活性は、インビボ標的ＲＮＡの不活性化または分解に、例えば異種の異常ＲＮＡの生成を特徴とするヒト疾病の処置に有用であると見做される。アンチセンスＲＮＡの使用はまた、特定のＲＮＡの標的設定および分解にかかわる別のメカニズムとして提供されている。このような場合、標的ＲＮＡにハイブリッド形成することにより、また標的ＲＮＡに結合させることによりデザインされている小型ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡの翻訳を防止し、またはヌクレアーゼの活性化によるＲＮＡの分解を生じさせる。
【００１１】
最近まで、特定の標的遺伝子の修正に標的を定めたトランス−スプライシングを実用する用途は、グループ１リボソームに基づくメカニズムに制限されていた。テトラハイメナ（Tetrahymena）グループ１リボソームを使用することによって、標的を定めたトランス−スプライシングが、イー・コリ（E.Coli）で（Sullengen,B.A.およびCech,T.R.によるNature,341:619〜622(1994)）、マウス繊維芽細胞で（Jones,J.T.によるNature Medicine,2:643〜648(1996)）、ヒト繊維芽細胞で（Phylacton,L.A.によるNature Genetic,18:378〜381）、およびヒトエリスロイド先駆体で（LarnらによるScience,280:1593〜1596）、証明されている。グループ１リボソームを修飾することにより操作される、かなりの標的を定めたＲＮＡトランス−スプライシングの用途が探査されているが、天然哺乳動物のスプライシング機構、すなわちスプライセオソームは、従来技術で報告されていない。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、スプライセオソームが媒介する標的を定めたトランス−スプライシングにより新規核酸分子を創造するための方法および組成物に関する。本発明による組成物は、天然標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子（以下の記載において、Ｐｒｅ−ｍＲＮＡと記す）と相互作用し、また新規キメラＲＮＡ分子（以下の記載において、キメラＲＮＡと記す）の創造を生じさせるスプライセオソームによるトランス−スプライシング反応を媒介するようにデザインされているトランス−スプライシング分子先駆体（以下の記載において、ＰＴＭと記す）を含有する。本発明の方法は、本発明によるＰＴＭを、当該ＰＴＭの蛋白質が天然Ｐｒｅ−ｍＲＮＡの蛋白質にスプライシングされ、新規キメラＲＮＡが形成される条件下に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡと接触させることを包含する。本発明によるＰＴＭは、トランス−スプライシング反応から生じる新規キメラＲＮＡがそれ自体で、ＲＮＡの翻訳の抑制などの機能を果たすことができ、または別様に、キメラＲＮＡが細胞における不完全または不活性蛋白質を相補する蛋白質をコードする、または特定の細胞を殺滅するトキシンをコードすることができるように、遺伝子操作される。
【００１３】
一般に、標的Ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、特定の細胞種内で発現されることから、標的として選択され、これにより新規キメラＲＮＡの発現を、選択された細胞種に標的を定めるための手段が提供されるように選択する。この標的細胞には、これらに制限されないものとして、ウイルスまたはその他の感染体に感染した細胞、または悪性新生物、または自己免疫疾病または組織拒絶に含まれる免疫系の成分が包含される。本発明のＰＴＭは、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおけるエキソン／イントロン境界を特定するための方法としてｍＲＮＡ分子内のエキソン配列に遺伝子操作することができる。本発明はまた、特定の細胞種で発現される蛋白質の精製および同定に用いることができるペプチド親和性精製標識をコードするように遺伝子操作されるＰＴＭ分子を使用することに関する。本発明の方法および組成物は、遺伝子調節、遺伝子修復および標的設定した細胞死において使用することができる。このような方法および組成物は、これらに制限されないものとして、遺伝病、感染性疾病または自己免疫性疾病を包含する種々の疾病および癌などの増殖性疾病の処置に使用することができる。
【００１４】
本発明は、プレ−トランス−スプライシング分子（ＰＴＭ）を含む組成物と、新規な核酸分子の作製のためのこのような分子の使用とに関する。本発明のＰＴＭはｐｒｅ−ｍＲＮＡに特異的に結合するように設計されたターゲット結合ドメイン、分枝点、ピリミジン・トラクト（pyrimidine tract）及び３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を包含する３’スプライス領域；並びにＲＮＡスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスペーサー領域を含む。さらに、本発明のＰＴＭは、翻訳可能なタンパク質生成物をコードする任意のヌクレオチド配列を含有するように操作することができる。
【００１５】
本発明の方法は、本発明のＰＴＭを天然ｐｒｅ−ｍＲＮＡに、ＰＴＭの一部を天然ｐｒｅ−ｍＲＮＡの一部中にトランス−スプライシングさせるような条件下で接触させて、新規なキメラＲＮＡを形成することを包含する。ターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡは、これが特異的細胞種類内で発現して、選択した細胞種類への新規なＲＮＡの発現をターゲッティングする機構を与えるために、ターゲットとして選択する。得られるキメラＲＮＡは特異的細胞種類に所望の機能を与えることができる、又は特異的細胞種類内で遺伝子産物を産生することができる。特異的細胞は、非限定的に、ウイルス若しくは他の感染性因子によって感染した細胞、良性若しくは悪性の新生細胞、又は自己免疫疾患若しくは組織拒絶に関与する免疫系の構成要素を包含する。ターゲット内因的ｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合するようにＰＴＭの結合ドメインを修飾することによって、特異性が得られる。キメラＲＮＡによってコードされる遺伝子産物は、例えば、治療的若しくはマーカー遺伝子、及び毒素をコードする遺伝子のような、臨床的有用性を有する遺伝子を含めた、任意の遺伝子でありうる。
【００１６】
５．１．プレ−トランス−スプライシング分子の構造
本発明は、ターゲット化（targeted）トランス−スプライシングによる新規なキメラ核酸分子の生成に用いるための組成物を提供する。本発明のＰＴＭは（ｉ）ｐｒｅ−ｍＲＮＡへのＰＴＭの結合をターゲットとする１つ以上のターゲット結合ドメイン、（ｉｉ）分枝点、ピリミジン・トラクト（pyrimidine tract）及び３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を包含する３’スプライス領域；並びに（ｉｉｉ）ＲＮＡスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスペーサー領域を含む。さらに、翻訳可能なタンパク質生成物をコードする任意のヌクレオチド配列を含有するように、ＰＴＭを操作することができる。本発明のさらに他の実施態様では、キメラＲＮＡ分子の翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含有するように、ＰＴＭを操作することができる。例えば、ヌクレオチド配列は翻訳終止コドン、又は二次構造を形成することによって翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含有することができる。或いは、キメラＲＮＡはアンチセンス分子として機能することによって、それが結合するＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【００１７】
ＰＴＭのターゲット結合ドメインは、選択されたｐｒｅ−ｍＲＮＡのターゲット化領域に相補的であり、この領域にアンチ−センス配向する少なくとも１５〜３０（数百まで）ヌクレオチドから成る１つ又は２つの結合ドメインを含有しうる。このことは結合の特異性を与え、核のスプライソソーム処理機構（spliceosome processing machinery）がＰＴＭの一部をｐｒｅ−ｍＲＮＡの一部にトランス−スプライシングすることができるようなスペースにｐｒｅ−ｍＲＮＡをきっちりと固定する。第２ターゲット結合領域を分子の３’末端に配置して、本発明のＰＴＭ中に組み込むことができる。絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。本明細書で述べるような、ｍＲＮＡの一部に“相補的な”配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成することができる充分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズ可能であることは、核酸の相補性度と長さの両方に依存する（例えば、Sambrook等,1989,Molecular Cloning,A Labouratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York参照）。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、それが含有し、まだ安定な二本鎖を形成するＲＮＡとの塩基不適合は多くなる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準方法を用いて、許容されうる不適合度を確認することができる。
【００１８】
ＰＴＭをイントロン−エキソン標識又はペプチドアフィニティ標識に用いるように設計する場合には、ターゲット結合ドメインにランダムなヌクレオチド配列を含有するようにＰＴＭのライブラリーを一般に操作する。ＰＴＭ分子のこのようなライブラリーを作製する目的は、ライブラリーが細胞内に発現した各ＲＮＡ分子に結合することができるＰＴＭ分子群（population of PTM molecules）を含有することである。ランダムＤＮＡフラグメントをＰＴＭ中に挿入して、ランダムターゲット結合ドメインを形成するために用いることができる制限エンドヌクレアーゼ部位を包含するＰＴＭのコーディング領域を含有するように、組換え発現ベクターを遺伝子操作することができる。ターゲット結合ドメインとしてＰＴＭに包含させるべきランダムヌクレオチド配列は、非限定的に、制限酵素によるＤＮＡの部分的消化又はＤＮＡのランダムフラグメントを形成するためのＤＮＡの機械的剪断を包含する、当業者に周知の多様な異なる方法を用いて作製することができる。ランダム結合ドメイン領域を縮退的（degenerate）オリゴヌクレオチド合成によって作製することもできる。縮退的オリゴヌクレオチドは縮退的結合ドメインを有するＰＴＭ分子のライブラリーを生成するためのＰＴＭ分子へのクローニングを容易にするために、各末端に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有するように、縮退的オリゴヌクレオチドを操作することができる。
【００１９】
他の機構によって、例えば三重らせん形成又は、特異的ＲＮＡ結合タンパク質、即ち特異的ターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合したタンパク質を認識するようにＰＴＭが操作されるタンパク質／核酸相互作用によって、結合を達成することもできる。或いは、本発明のＰＴＭを、例えばＲＮＡ分子内のヌクレオチド間の分子内塩基対合に由来するヘアピン構造のような、二次構造を認識するように、設計することもできる。
【００２０】
ＰＴＭ分子はまた、分岐点を含む３’スプライス領域、ピリミジントラクト（tract）及び３’スプライスアクセプターＡＧ部位及び／または５’スプライスドナー部位を含有する。ＲＮＡスプライシングに用いられる５’スプライスドナー部位及び３’スプライス領域に対するコンセンサス配列は、当該分野において周知である（Moore,et al.,1993,The RNA World,Cold Springs Harbor Laboratory Press,p.303-358参照）。加えて、本願発明の実施において、５’スプライスドナー部位及び３’スプライス領域として機能する能力を維持する修飾コンセンサス配列を使用してもよい。手短に言えば、５’スプライス部位コンセンサス配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵ（ここで、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン及び／＝スプライス部位）である。３’スプライス部位は、３つの分離した配列エレメント：分岐点または分岐部位、ポリピリミジントラクト及び３’コンセンサス配列（ＹＡＧ）から成る。哺乳類における分岐点コンセンサス配列は、ＹＮＹＵＲＡＣ（Ｙ＝ピリミジン）である。下線Ａは分枝形成部位である。ポリピリミジントラクトは、分岐点とスプライス部位アクセプターとの間に位置し、異なった分岐点の利用及び３’スプライス部位認識にとって重要である。
【００２１】
ＲＮＡスプライス部位を標的結合ドメインから分離するためのスペーサー領域もＰＴＭに含まれる。スペーサー領域は、標的プレ−ｍＲＮＡに対するトランス−スプライシングを増幅する非スプライスＰＴＭ及び／または配列の如何なる翻訳もブロックするストップコドン等で特徴付けられる。
【００２２】
本願発明の好ましい態様において、「安全装置（safety）」がまた、非特異的トランス−スプライシングを防ぐために、スペーサー、結合ドメイン、またはＰＴＭのどこか他の部分に組み込まれる。これが、ＰＴＭの３’及び／または５’スプライス部位のエレメントを比較的弱い相補性で覆い、非特異的トランス−スプライシングを防ぐＰＴＭの一領域である。ＰＴＭは、ＰＴＭの結合／ターゲッティング部分のハイブリダイゼーションで、３’及び／または５’スプライス部位が覆われておらず、十分に活性があるように設計される。
【００２３】
「安全装置」は、ＰＴＭ分岐点、ピリミジントラクト、及び／または３’スプライス部位（スプライシングエレメント）の一方または両側に弱く結合する１以上の、シス−配列の伸展（stretch）からなるか、またはそのような第２の分離した核酸鎖であるか、もしくはスプライシングの部位自体に結合できるものである。この「安全装置」結合は、スプライシングエレメントが活性となることを防ぐ（つまり、Ｕ２ｓｎＲＮＰまたは他のスプラシシング因子がＰＴＭスプライス部位認識エレメントに付着するのをブロックする）。「安全装置」の結合は、ＰＴＭの標的結合領域の標的プレ−ｍＲＮＡへの結合、即ち、ＰＴＭスプライシングエレメントを露出して活性化する（それらを、標的プレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスするのに有効なものとする）ことによって破壊されてもよい。
【００２４】
細胞死など、またはマーカーとしての失っていた機能または作用を回復するなどの効果を生み出すことのできる翻訳可能な蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、本願発明のＰＴＭに含まれる。例えば、そのヌクレオチド配列は、既知の遺伝子疾患において失われているまたは変化している遺伝子産物をコードするそれら配列を含むものである。または、そのヌクレオチド配列は、細胞を同定するまたは画像化するのに用いられるマーカー蛋白質またはペプチドをコードすることができる。本願発明のまた別の態様において、ＨＩＳタグ（６個の連続するヒスチジン残基）（Janknecht,et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-8976）、Ｃ末端グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith and Johnson,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8703-8707）（Pharmacia）またはFLAG（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys）（Eastman Kodak/IBI,Rochester,NY）などのアフィニティータグをコードするヌクレオチド配列が、アフィニティー精製に有用なＰＴＭ分子に含まれる。このようなヌクレオチド配列を含有するＰＴＭの使用によって、ペプチドアフィニティータグに結合して細胞中に正常に発現されるペプチド配列を含有する融合蛋白質をコードするキメラＲＮＡを産生することになる。アフィニティータグは、細胞で発現されたペプチド配列を迅速に精製し同定する方法を提供する。好ましい態様において、そのヌクレオチド配列は、トキシンまたは、放射線照射もしくは化学療法などのその後の処理に対する細胞の感受性を増幅する機能を提供する他の蛋白質をコードしていてもよい。
【００２５】
さらに好ましい本願発明の態様において、ＰＴＭ分子は、ジフテリアトキシンサブユニットＡ（Greenfield,L.,et al.,1983,Proc．Natl.Acad.Sci.USA 80:6853-6857）をコードするヌクレオチド配列を含有するように設計される。ジフテリアトキシンサブユニットＡは、酵素的トキシン活性を含有し、発現されるかヒト細胞に輸送されると機能して細胞死をもたらす。さらに、多くの他の既知のペプチドトキシンが本願発明に使用されてもよく、限定するわけではないが、リシン（ricin）、シュードモナストキシン、シガ（Shiga）トキシン及びエキソトキシンＡを含む。
【００２６】
ＰＴＭ分子に対して、翻訳可能な蛋白質をコードするヌクレオチドの後か前に、スプライシングを増幅するためのポリアデニル化シグナルまたは５’スプライス配列、付加的な結合領域、「安全装置」−自己相補的領域、付加的なスプライス部位、または分子の安定性を制御して分解を防ぐ保護基などの付加的な特徴を加えることができる。
【００２７】
本願発明のＰＴＭに組み込まれてもよい付加的な特徴として、結合ドメイン及びスプライス部位の間の領域に、非スプライスプレ−ｍＲＮＡ発現を防ぐために、ストップコドンまたは他のエレメントを含む。本願発明の別の態様において、ＰＴＭを、３’標的イントロンまたはエキソンへの結合を促進し、固定の標準（authentic）シス−５’スプライス部位（Ｕ５及び／またはＵ１結合部位）をブロックするための翻訳可能な蛋白質をコードするヌクレオチド配列から下流の第２アンチ−センス結合ドメインを伴って発生させることができる。ＰＴＭはまた、トランス−スプライス産物の発現のための二重のトランス−スプライシング反応を要求するものとして作製されてもよい。このようなＰＴＭは、ＲＮＡ修復に有用となる内部エキソンを置換するのに用いることができる。３’ヘアピン構造、環状化ＲＮＡ、ヌクレオチド塩基修飾、または合成アナローグなどのさらなるエレメントを、核の局在化及びスプライセオゾームの（spliceosomal）編入、並びに細胞内安定性を促進または亢進させるために、ＰＴＭに組み込むことができる。
【００２８】
本願発明のＰＴＭは、標的細胞における新規キメラＲＮＡを産生するように意図された方法において用いることができる。本願発明の方法は、ＲＮＡ分子、またはＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡベクターなどの、当業者によって使用される如何なる形ででもよいＰＴＭを標的細胞に輸送することからなり、当該ＰＴＭはプレ−ｍＲＮＡに結合し、トランス−スプライシング反応を仲介して、プレ−ｍＲＮＡの部分にスプライスされたＰＴＭ分子の部分からなるキメラＲＮＡを形成することになる。
【００２９】
５．２．トランス−スプライシング分子の合成
本願発明の核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはその誘導体もしくは修飾変形種、一本鎖または二本鎖でもよい。核酸によって、ＰＴＭ分子またはＰＴＭ分子をコードする核酸分子が、デオキシリボヌクレオチドからなるのか、リボヌクレオシドからなるのか、及びリン酸ジエステル結合からなるのか、修飾された結合からなるのか示されることになる。核酸という語はまた、具体的には、５つの天然の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基からなる核酸も含む。
【００３０】
本願発明のＲＮＡ及びＤＮＡ分子を、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の合成のための、当該分野において既知の如何なる方法によって作製してもよい。例えば、核酸は、市販の試薬及び合成機を用いて、当該分野において周知の方法によって化学合成してもよい（e.e.,Gait,1985,Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press,Oxford,England参照）。または、ＲＮＡ分子は、そのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のイン・ビトロ及びイン・ビボ転写によって発生させることができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ広範囲のベクターに組み込むことができる。ＲＮＡを、高収率で、ＳＰＳ６５（Promega Corporation,Madison,WI）などのプラスミドを用いるイン・ビトロ転写を経て産生してもよい。加えて、Ｑ−β増幅などのＲＮＡ増幅法が、ＲＮＡを産生するために利用される。
【００３１】
核酸分子は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、細胞への輸送等を改善するために修飾することができる。例えば、全体の荷電を減少させるためのＰＴＭの修飾は、分子の細胞内取込みを増幅させる。加えて、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を減じるように修飾することができる。核酸分子は、ペプチド（例えば、イン・ビボでの宿主細胞レセプターを標的とする）、または細胞膜を通過する輸送を亢進する薬剤（例えば、Letsinger et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．86:6553-6556;Lemaitre et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652；国際公開Ｎｏ．ＷＯ８９／１０１３４，１９８８年４月２５日公開等参照）、ハイブリダイゼーションを引き金とする切断剤（hybridization-triggered cleavage agent）（例えば、Krol et al.,1988,BioTechniques 6:958-976参照）またはインターカレーション剤（例えば、Zon,1988,Pharm.Res.5:539-549参照）などの他の付加的な基を含んでいてもよい。この端に、核酸分子は、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションを引き金とするクロス−リンク剤（hybridization triggered cross-linking agent）、輸送剤（transport agent）、ハイブリダイゼーションを引き金とする切断剤等に結合していてもよい。ＤＮＡ分子に対する種々の他の周知の修飾を、細胞内の安定性及び半減期を増大する方法として導入することができる。成し得る修飾として、限定するわけではないが、リボ−またはデオキシ−ヌクレオチドの配列を分子の５’及び／または３’端に隣接させる付加も含まれる。増大した安定性が望まれる環境下では、２’−Ｏ−メチル化などの修飾ヌクレオシド間（internucleoside）結合を有する核酸が好ましい。修飾ヌクレオシド間結合を含有する核酸は、当該分野において周知の試薬及び方法を用いて合成してもよい（Uhlmann et al.,1990,Chem.Rev.90:543-584;Schneider et al.,1990,Tetrahedron Lett.31:335及びここに引用される参考文献参照）。
【００３２】
核酸は、当該分野において周知の如何なる適当な方法によって、精製されてもよい。例えば、核酸は、逆相クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって精製することができる。もちろん、当業者は、精製法が部分的に、精製されるべき核酸の大きさに依存することを認識するであろう。
【００３３】
ＰＴＭをコードする核酸分子が利用される場合、当該分野で既知のクローニング技術が、核酸分子の発現ベクターへのクローニングに用いられてもよい。使用され得る組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に知られている方法が、Ausubel et al.(eds.),1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY;及びKriegler,1990,Gene Transfer and Expression,Alaboratory Manual,Stockton Press,NYに記載されている。
【００３４】
主体のＰＴＭをコードするＤＮＡは、大規模でのＤＮＡの複製を提供し、ＰＴＭの転写を導く必要なエレメントをも含有する、種々の宿主ベクター系に組換え操作によって組込まれるてもよい。患者の標的細胞を形質移入するような構築の使用によって、内部的に発現されたプレ−ｍＲＮＡ標的と相補塩基対を形成し、それによって複合核酸分子間のトランス−スプライシング反応を亢進するのに十分な量の転写が起こることになる。例えば、ベクターは、細胞によって取り込まれ、ＰＴＭ分子の転写を導くように、イン・ビボで導入される。このようなベクターは、それが転写されて所望のＲＮＡを産生する限り、エピゾームに残るか、染色体として組み込まれる。このようなベクターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。
【００３５】
対象とするＰＴＭをコードするベクターは、哺乳動物細胞で複製及び発現に用いられるプラスミド、ウイルス又は当業界において知られた他のものである。ＰＴＭをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞において作用する当業界において知られたいずれのプロモーターによっても制御できる。そのようなプロモーターは誘導可能であり、また構築可能である。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、例えばＳＶ４０初期プロモーター領域（Benoist,C.and Chambon,P.1981,Nature 290:304-310）、ロウスザルコーマウイルスの３’ロング末端リピート（Yamamoto te al.,1980,Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al.,1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:14411445）、メタロチアネン遺伝子の調節配列（Brinster et al.,1981,Nature296:39-42）、ウイルスＣＭＶプロモーター、ヒト絨毛性ゴナトロピンーβープロモーター（Iiollenberg et al.,1994,Mol.Cell.Endocrinology 106:111-119）などが挙げられる。いずれのタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターも、組織部位に直接導入できる組換えＤＮＡ構築物を調製するのに用いることができる。あるいは、望ましいターゲット細胞に選択的に感染するウイルスベクターを用いることもできる。
【００３６】
ペプチドアフィニィティー精製タッグをコードするＰＴＭの使用のためには、ランダムターゲット結合部位を含むヌクレオチド配列をＰＴＭに挿入し、選択的哺乳動物発現ベクターシステムにクローン化するのが好ましい。これらに限定されるものではないが、ｔｋ欠損細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの発現選択系、ｈｇｐｒｔ欠損細胞におけるヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの選択発現系及びａｐｒｔ欠損細胞におけるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの発現選択系などの多くの選択系を用いることができる。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロホレートトランスフェラーゼ（dhfr）、ミコフエノール酸に対して耐性を付与するキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、アミノグリコシドＧ−４１８に対して耐性を付与するネオマイシン（neo）、ヒグロマイシンに対して耐性を付与するヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（hygro）などの抗代謝耐性を選択に利用することもできる。本発明の好ましい態様においては、細胞培養物を、唯一のベクターが存在するような細胞に対して低い比率のベクターで、あるいは一つの細胞において限られた数のベクターで形質転換される。本発明の実施に用いられるベクターとしては、レトロウイルス又はアデノウイルス関連ウイルスなどのウイルス発現ベクターなどの原核発現ベクターが挙げられる。
【００３７】
５．３． トランスースプライシング分子の使用及び投与
５．３．１． 遺伝子調節、遺伝子修復及びターゲット細胞死のためのＰＴＭの使用
本発明の組成物及び方法は、遺伝子調節、遺伝子修復、ターゲット細胞死などの各種に適用できる。トランスースプライシングは、毒性を有する蛋白を細胞に導入するのに用いることができる。更に、ＰＴＭをウイルスｍＲＮＡに結合しウイルスｍＲＮＡの機能を破壊するように、あるいはウイルスｍＲＮＡを発現する細胞を破壊するように工夫することができる。本発明の他の態様では、有害なｍＲＮＡ転写物にストップコドンを設けて転写物の発現を減少させるようにＰＴＭを工夫することもできる。
末端が欠失した又は点変異を含む転写物を修復するためにターゲットトランスースプライシングを用いることができる。本発明のＰＴＭは、特定の変異の上流または下流あるいは未熟３’の上流のターゲット転写物を解裂し、変異を含む転写物の部分を機能的配列に置換するトランス−スプライシングにより変異転写物を修正するようにデザインされている。
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、最も一般的な致命的なヒトの遺伝病である。遺伝子及び分子分析により、嚢胞性繊維症関連遺伝子が単離されその蛋白生産物が推定されている（Kerem,B.S.et al.,1989,Science 245:1073-1080;Riordan et al.,1989,Science 245:1066-１０７３;Rommans, et al.,1989,Science245:1059-1065）。ＣＦ関連遺伝子の蛋白生産物は、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）と呼ばれている。本発明の特定の態様では、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡにおける欠損を修正して、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーターをコードするＤＮＡが発現され機能的塩素イオンチャンネルが患者のエアウエイ表皮細胞に生じるように、ＰＴＭを用いる事が出来る。
【００３８】
最も一般的な嚢胞性繊維症変異は、ＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位のフェニルアラニンをコードするエクソン１０の３つのヌクレオチドの欠失であることが集団の調査によって明かになった。図１５に示されているように、トランス−スプライシング反応により、ＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位の欠失を修正することができた。遺伝子欠損の修正に用いたＰＴＭは、ＣＦＴＲ ＢＤイントロン９配列、スペーサー配列、分岐点、ポリピリジン区域、３’スプライス部位及び野性型ＣＦＴＲ ＢＤエクソン１０配列を含んでいた（図１３）。トランス−スプライシング反応を利用したＣＦＴＲをコードする変異ＤＮＡの修正に成功したことは、一般的な遺伝子欠損の修正にＰＴＭが適用できることを支持している。
リポソームへのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、組成物を発現できる組換え細胞、レセプター仲介エンドサイトーシス（Wu and Wu,1987,J.Bol.Chem.262:4429-4432）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築、ＤＮＡのインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシクム仲介トランスフェクションなどの各種のデリバリーシステムが知られており、これらは、本発明の組成物を細胞へ導入するのに用いられる。
本発明の組成物及び方法は、特定のタイプの細胞の除去又は変異が効果的な癌、及び他の重篤な疾患、自己免疫疾患および他の病原性症状などの治療に有効である。更に、本発明の組成物及び方法は、遺伝的な遺伝子疾患を有する個人の細胞に機能的で生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を提供して、欠失した又は変異した遺伝子生産物の発現により正常な表現型を形成するのに用いることが出来る。
【００３９】
本発明の好ましい態様においては、ＰＴＭをコードする配列を含む核酸は、遺伝子デリバリーによって投与され宿主細胞に投与されてＰＴＭ機能を促進する。この態様では、ＰＴＭ産生を促進することによって、核酸が効果を仲介する。当業界において利用できる宿主細胞への遺伝子デリバリー法はいかなるものも本発明により利用できる。遺伝子デリバリー法の一般的な概要については、Strauss,M and Barranger,J.A.,1997,Concepts in Gene Therapy,by Walter de Gruyter & Co.,Berlin;Goldspiel et al.,1993,Clinical Pharmacy12:488-505;Wu and Wu,1991,Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol Toxicol,33:573-596;Mulligan,1993,Science 260;926-932;及びMorgan and Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217;1993,TIBTECH 11(5):155-215などが参照される。具体的方法を以下に記載する。
【００４０】
宿主細胞への核酸のデリバリーは、宿主を核酸又は核酸を保持するベクターに直接的に曝すことにより、あるいは宿主細胞を最初にin vitroで核酸で形質転換し、次いで宿主に移植する間接的方法により行われる。これら２つの方法は、in vivo又はex vivo遺伝子デリバリーとして公知である。
特定の態様では、核酸はin vivoで直接的に投与されて発現してＰＴＭを産生する。これは、当業界で公知の各種の方法、例えば、核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築してそれを分子内物となるように投与する方法、欠損又は変性レトロウイルス又は他のベクター（U.S.P.No.4,980,286）を用いた感染法、裸のベクターとして直接投与による方法、マイクロ粒子の射突による方法（ジーンガン：Biolistic,Dupont）、脂質又は細胞表面レセプター又はトランスフェクション試薬での皮膜による方法、リポゾームへのカプセル化による方法、マイクロ粒子又はマイクロカプセルによる方法、核に進入することが知られているペプチに核酸を結合させて投与する方法（Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432）などにより、行うことができる。
特定の態様では、ＰＴＭを含むウイルスベクターを用いることができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの導入に必要でないレトロウイルス配列を削除したレトロウイルスベクター（Milier et al.,1993,Meth.Enzymol.217:581-599）を利用することが出来る。あるいは、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターを、細胞又は組織への遺伝子デリバリーに用いることができる（アデノウイルスに基づく遺伝子デリバリーの総説としてKozarsky and Wilson,1993,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503）。
【００４１】
細胞への遺伝子デリバリーの他のアプローチとしては、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション又はウイルスインフェクションなどによる組織培養中の細胞への遺伝子導入などが挙げられる。通常、導入法は、細胞への選択マーカーの導入を含むものである。細胞は次いで選択条件下に置かれ、導入遺伝子を取りこみ発現する細胞を単離する。得られる組換え細胞は、当業界に公知の各種方法により宿主へデリバリーされる。好ましい態様では、遺伝子デリバリーに用いられる細胞は、宿主細胞中で自己複製するものである。
また本発明は、薬学的に許容できる担体と共に、有効量のＰＴＭ又はＰＴＭをコードする核酸を含む薬学的組成物が提供される。特定の態様では、薬学的に許容できるとは、連邦政府又は国家の規則代理人によって許可されるもの、U.S.Pharmacopedia又は他の一般的に動物用に特にヒト用に認められた薬局方に記載されたものを意味する。担体とは、薬物と一緒に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビークルなどを意味する。適当な担体の例は、E.W.MartinのRemington's Pharmaceutical Scienceに記載されている。
【００４２】
特定の態様では、本発明の薬学的組成物は、（１）内因性蛋白又は機能のレベルがないあるいは低い（正常又は望ましいものに比べて）病気又は障害、例えば蛋白を欠いているあるいは遺伝子的に欠陥を有し生物学的に不活性または非反応性又は抑制されている宿主、又は（２）in vitro又はin vivoアッセイによりＰＴＭの有用性により特定の蛋白の機能が抑制されていることが判明した病気又は障害などに投与される。ＰＴＭ仲介トランス−スプライシング反応により得られるキメラｍＲＮＡによりコードされる蛋白の活性は、宿主組織サンプルをバイオプシサンプルなどから得てin vitroでｍＲＮＡ又は蛋白レベル、発現したキメラｍＲＮＡの活性及び／又は構造をアッセイすることにより容易に検出できる。多くの標準的方法、例えば、キメラｍＲＮＡによってコードされる蛋白を検出し及び／又は視覚化するイムノアッセイ（ウエスタンブロット、免疫沈降それに続くドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル、電気泳動、イムノサイトケミストリー）
及び／又はキメラｍＲＮＡの存在を検出及び／又は視覚化することによるキメラｍＲＮＡの形成を検出するアッセイなどが挙げられる。
【００４３】
また本発明は、薬学的に許容できる担体と共に、有効量のＰＴＭ又はＰＴＭをコードする核酸を含む薬学的組成物が提供される。特定の態様では、薬学的に許容できるとは、連邦政府又は国家の規則代理人によって許可されるもの、U.S.Pharmacopedia又は他の一般的に動物用に特にヒト用に認められた薬局方に記載されたものを意味する。担体とは、薬物と一緒投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビークルなどを意味する。適当な担体の例は、E.W.MartinのRemington's Pharmaceutical Scienceに記載されている。特定の態様では、本発明の薬学的組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与するのが望ましい。これは例えば、手術中の局所注入、手術後の包帯と共に局所適用、注射、カテーテル、坐剤、シアラスチックな膜又はファイバーなどのポーラス又は非ポーラス物質などによる移植等により投与される。放出制御ポリマー、ヒドロゲルなどのマトリックス、ナノ粒子などの他の薬物放出制御デリバリーシステムを利用することもできる。
ＰＴＭは、ターゲット細胞で望ましい効果を生み出すような効果的な量で投与される。ＰＴＭの効果的な投与は、生物学的活性半減期、バイオアベイラビリテー、毒性などのパラメーターを考慮した公知の手法により決定される。本発明の組成物の有効な量は、治療する病気及び障害の本質に依存し、標準的な臨床技術により決定できる。更に最適投与量を同定するために、in vitroアッセイを任意に用いることができる。
【００４４】
本発明はまた医薬パック又はキットであって、一又は二以上の本発明の医薬組成物の成分を満たした一又は二以上の容器を含み、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を制限する政府官庁により処方された形態の警告であって、その警告が、ヒト投与用の製造、使用又は販売の官庁による許可を反映するもの、を任意に付しても良い。
【００４５】
５．３．２．エキソンのタギングのためのＰＴＭ分子の使用
現在のヒト及び他の生物のゲノムの配列決定及び特徴決定の努力の点から、そのような特徴決定を容易にする方法に対するニーズが存在する。現在入手されるゲノムマッピング及び配列決定により得られる情報の大部分は、ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの逆転写により作られる相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーから誘導される。不幸にも、この工程は、イントロン配列及びエキソン／イントロン境界の位置に関する情報のロスを生じる。
【００４６】
本発明は、プレ−ｍＲＮＡ中のエキソン−イントロン境界のマッピングのための方法であって、（ｉ）プレ−トランス−スプライシング分子の部分がターゲットプレ−ｍＲＮＡの部分へとトランス−スプライスされる条件下で、ランダムターゲット結合ドメインを含むプレ−トランス−スプライシング分子をプレ−ｍＲＮＡ分子に接触させ、キメラｍＲＮＡを形成すること、（ｉｉ）該キメラｍＲＮＡ分子を増幅すること、（ｉｉｉ）増幅した分子を選択的に精製すること、及び（ｉｖ）増幅した分子のヌクレオチド配列を決定し、それによりイントロン−エキソン境界を同定すること、
を含む、上記方法を包含する。
【００４７】
本発明の一の態様において、ＰＴＭｓをプレ−ｍＲＮＡ分子中のエキソン−イントロン境界の場所を突き止めるために用いることができる。イントロン−エキソン境界のマッピングにおいて使用するＰＴＭｓは、上記５．１節で既述したものに類似する構造を有する。特に、ＰＴＭｓは（ｉ）多くのプレ−ｍＲＮＡに結合するように設計されたターゲット結合ドメイン、（ｉｉ）ブランチポイント、ピリミジン域、及び３’スプライス受容体部位を含む３’スプライス領域、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスぺーサー部位、並びに（ｉｖ）プレ−ｍＲＮＡ上にトランス−スプライスされるタグ領域、を含む。イントロン−エキソンマッピングの目的のためには、ＰＴＭｓはランダムヌクレオチド配列を含むターゲット結合ドメインを含むように遺伝子操作される。ランダムヌクレオチド配列は、核の機構を処理するスプライソソームが、ＰＴＭの部分（タグ又はマーカー領域）をプレ−ｍＲＮＡの部分へとトランス−スプライスすることができるように、プレ−ｍＲＮＡに結合し、固定することができるヌクレオチド配列を少なくとも１５〜３０、最大では数百まで、含む。短いターゲット結合ドメインを含む、またはイノシンを含むＰＴＭｓは、よりストリンジェントでない条件下で、プレ−ｍＲＮＡ分子に結合する。更に、強いブランチポイント配列及びピリミジン域は、ＰＴＭトランス−スプライシングの非−特異性を増す働きをする。
【００４８】
ＰＴＭ分子中のターゲット結合ドメインとして使用するランダムヌクレオチド配列は、種々の異なる方法により作られ、その中には、制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化、又はＤＮＡの機械的切断が含まれるが、これらに限定されない。そのようなランダムヌクレオチド配列の使用は、細胞中で発現される各ターゲットプレ−ｍＲＮＡにつて、異なる結合活性を有するＰＴＭ分子の巨大な並びを作成するようデザインされる。オリゴヌクレオチドのランダム化されたライブラリーは、プラスミドベクター中への遺伝子操作されたＰＴＭ分子へとクローニングするための、各末端上の適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて合成される。ランダム化したオリゴヌクレオチドがリゲートされ、発現されると、ＰＴＭｓのランダム化された結合ライブラリーが作成される。
【００４９】
本発明の特定の態様において、ランダムヌクレオチド配列を含むターゲット結合ドメインを含むＰＴＭ分子をコードする発現ライブラリー当業者にとって周知の種々の方法を用いて作成される。理想的には、ライブラリーは細胞中で発現される各ターゲットプレ−ｍＲＮＡと相互作用することができるＰＴＭ分子を含むのに十分なほど複雑である。
【００５０】
例により、図９はイントロン−エキソン境界のマッピングに用いられるＰＴＭｓの二つの形態を図式的に表す。左側のＰＴＭはプレ−ｍＲＮＡ３’スプライス部位への非−特異的なトランス−スプライシングをすることができ、一方、右側のＰＴＭはプレ−ｍＲＮＡ５’スプライス部位へのトランス−スプライシングをすることができる。ＰＴＭとターゲットプレ−ｍＲＮＡとの間のトランス−スプライシングは、真正のエキソンの３’又は５’上に特定のヌクレオチド配列「タグ」を有するキメラｍＲＮＡ分子を与える。
【００５１】
選択的な精製に続いて、次にＰＴＭのタグヌクレオチド配列で始まり、タグされたエキソンの配列へと進行する、プライマーを用いたＤＮＡ配列決定反応をおこなう。タグヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに直接続く配列は、エキソン境界を表す。イントロン−エキソンタグの同定のため、本発明のトランス−スプライシング反応は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、当業者に周知の方法を用いて行われ得る。
【００５２】
５．３．３細胞中で発現されるタンパクの同定のためのＰＴＭ分子の使用
本発明の他の態様において、ＰＴＭ媒介トランス−スプライシング反応は、細胞中に発現される未だ検出されていない、未知のタンパクの同定に用いることができる。この方法は、なかんずく、タンパクのサイズの小ささ、タンパクの低濃度により、または二次元電気泳動において、他のタンパクと類似する移動パターンを示すことによる検出の失敗により、二次元の電気泳動、又は他の方法により検出することができないタンパク質の同定に特に有用である。
【００５３】
本発明は、細胞中に発現するタンパクの同定方法であって、（ｉ）プレ−トランス−スプライシング分子の部分がターゲットプレ−ｍＲＮＡの部分へとトランス−スプライスされる条件下で、ランダムターゲット結合ドメインとペプチドタグをコードするヌクレオチド配列を含むプレ−トランス−スプライシング分子をプレ−ｍＲＮＡ分子に接触させ、融合ポリペプチドをコードするキメラｍＲＮＡを形成すること又はそれをゲル電気泳動により分離すること、（ｉｉ）該融合ポリペプチドをアフィニティー精製すること、及び（ｉｉｉ）融合タンパクのアミノ酸配列を決定することを含む、上記方法に関する。
【００５４】
細胞中に発現されるタンパクの同定のためには、本発明のＰＴＭｓは（ｉ）ランダム化されたヌクレオチド配列を含むターゲット結合ドメイン、（ｉｉ）ブランチポイント、ピリミジン域、及び３’スプライス受容体部位、並びに／又は５’スプライスドナー部位を含む３’スプライス領域、（ｉｉｉ）ＰＴＭスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスぺーサー部位、並びに（ｉｖ）マーカー又はペプチドアフィニティ精製タグをコードするヌクレオチド配列、を含むように、遺伝子操作される。そのようなペプチドタグには、ＨＩＳタグ（６ヒスチジン連続残基）（Janknechtら、１９９１年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8972-8976）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith,D.B.及びJohnson,K.s.1988,Gene67:31）（Pharmacia）又はＦＬＡＧ（Kodak/IBJ）タグ（Nisson.J.ら、J.Mol.Recognit.、1996,5,585-594）が包含されるが、これらに限定されない。そのようなＰＴＭｓを用いたトランス−スプライシングは、マーカー又はペプチドアフィニティ精製タグに繋がった、細胞中において通常発現されるタンパク配列を含む、キメラｍＲＮＡ分子の生成を与える。そのような方法の所望のゴールは、細胞中で合成される全てのタンパクがマーカー又はペプチドアフィニティタグを受けとり、それにより細胞中に発現する各タンパクを同定するための方法を提供することである。
【００５５】
本発明の特定の態様において、ランダムヌクレオチド配列を含む異なるターゲット結合ドメインを有するＰＴＭｓをコードするＰＴＭ発現ライブラリーが作成される。所望のゴールは、細胞中で発現される各プレ−ｍＲＮＡに結合することができるＰＴＭを作るのに十分複雑なＰＴＭ発現ライブラリーを作製することである。好ましい態様において、ライブラリーは、哺乳類の発現ベクター中へクローニングされ、それにより、一つ又は、多くとも数個のベクターがいずれか一つの細胞中に存在することになる。
【００５６】
キメラタンパクの発現を同定するため、宿主細胞をＰＴＭライブラリーで形質転換し、植え付け、一のＰＴＭを含む個々のコロニーが成長し、精製されるようにする。単一のコロニーを選択し、適当な培地中に増殖させ、標識したキメラタンパクのエキソン（複数でも良い）断片を、例えば、アフィニティー精製タグを用いて他の細胞タンパクから分離する。例えば、アフィニティークロマトグラフィーは、ＦＬＡＧタグなど、ペプチドタグに特異的に結合する抗体の使用を含む。代替的に、ＨＩＳタグを用いる時には、融合タンパクは、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸アガロースカラムを用いて精製され、それにより、イミダゾール含有緩衝液により溶出される結合したペプチドの選択的溶出が可能となる。ＧＳＴタグを用いる時、融合タンパクはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアガロースビーズを用いて精製される。融合タンパクは、次に遊離グルタチオンの存在下に溶出される。
【００５７】
キメラタンパクの精製後、分析を行い、融合タンパクのアミノ酸配列を決定する。融合タンパクのアミノ酸配列は、当業者にとって周知の方法、例えば、エドマン分解とそれに次ぐ、ＨＰＬＣを用いたアミノ酸分析、質量分析、またはアミノ酸アナライザーション、を用いて決定される。同定した後、ペプチド配列を例えばＧｅｎｅＢａｎｋ等のタンパクデータベース中に入手可能な配列と比較する。もし部分的なペプチド配列が既知であれば、更なる分析は行わない。もし部分的なタンパク配列が未知であれば、完全なタンパク配列を決定するため、当該タンパクのより完全な配列決定を行うことができる。融合タンパクは、全長タンパクの一部分しか含まないので、全長タンパクをコードする核酸が慣用の方法により単離される。例えば、部分的なタンパク配列のオリゴヌクレオチドプライマーが、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするためのプローブ又はＰＣＲプライマーとして使用するために生成される。
【００５８】
６．例：トランス−スプライシング分子の製造
以下の節は、ＰＴＭｓの製造及びそのような分子がトランス−スプライシング反応を媒介することができ、キメラｍＲＮＡ分子の製造をなし得ることの例証を説明する。
【００５９】
６．１ 材料及び方法
６．１．１． プレ−ｍＲＮＡ分子の構築
野生型のジフテリア毒素サブユニットＡ（ＤＴ−Ａ、野生型寄託番号Ｋ０１７２２）及びＤＴ−Ａ変異体（ＣＲＭ１９７、酵素活性なし）を含むプラスミドをVirginia Johnson博士、Food and Drug Administration、Bethesda、Marylandから得た（Uchidaら、1973、J.Biol.Chem.248:3838）。インビトロ実験のため、ＤＴ−Ａをプライマー：ＤＴ−１Ｆ
及びＤＴ−２Ｒ
を用いて増幅し、ＰｓｔＩ及びHindIIIにより切断し、PstI及びHindIII消化したｐＢＳ（−）ベクター（Stratagene,La Jolla、CA）中へクローニングした。得られたクローンｐＤＴＡを個々のＰＴＭｓを構築するのに用いた。（１）ｐＰＴＭ＋：ターゲットした構築物。ＩＮ３−１
及びＩＮ２−４
プライマーをEcoRI及びPstI消化ｐＤＴＡ中へインサートすることにより作製。（２）ｐＰＴＭ＋Ｓｐ：ｐＰＴＭ＋と同様に、但し、ＢＤとＢＰとの間に３０ｂｐのスぺーサーを有する。
ｐＰＴＭ＋をＸｈｏｌで消化し、オリゴヌクレオチド中、スぺーサーＳ
及びスペーサーＡＳ
をリゲートすることにより作製。インビボ研究のため、ｐｃＰＴＭ＋ＳｐのＥｃｏＲＩ及びHindIII断片を哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）中にＣＭＶプロモーターの制御下でクローンした。また、コドン１４のメチオニンをイソロイシンに代え、翻訳の誘発を防止した。得られたプラスミドをｐｃＰＴＭ＋Ｓｐと指定した。（３）ｐＰＴＭ＋ＣＲＭ：ｐＰＴＭ＋Ｓｐと同様に、ただし、野生型ＤＴ−ＡをＣＲＭ変異体ＤＴ−Ａ（T.Uchidaら、1973、J.Biol.Chem.248:3838）。これは、プライマーＤＴ−１Ｆ及びＤＴ−２Ｒを用いたＤＴ−Ａ変異体（Ｇ５２Ｅにおける変異）のＰＣＲ増幅により作製された。インビボ研究のためには、ＰＴＭ＋ＣＲＭのEcoRI HindIII断片を、ｐｃ３．１ＤＮＡ中へクローンし、ｐｃＰＴＭ＋ＡＲＭとした。（４）ＰＴＭ−：非ターゲット構築。ＰＴＭ＋のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩによる消化、結合ドメインの除去のためゲル精製し、次にオリゴヌクレオチド
のリゲートにより作製。（５）ＰＴＭ−Ｓｐ、ＰＴＭ−と同一のバージョン、但し、ＰｓｔＩ部位に３０ｂｐのスペーサー配列を有する点を除く。同様に、スプライス変異体［Ｐｙ（−）ＡＧ（−）及びＢＰ（−）Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］及び安全変異体（safety variants）［PTM+SF-Py1,PTM+SF-Py2,PTM+SFBP3及びPTM+SFBP3-Py1］を、特定の配列の挿入、欠失（表１参照）のいずれかにより作製した。
【００６０】
【００６１】
太字のヌクレオチドは正常なＢＰ、ＰＰＴ及び３’スプライス部位と比較した突然変異を表す。
【００６２】
枝分かれ部位Ａには下線を引いてある。イタリック体のヌクレオチドはＰＴＭ中のＢＰ配列をマスクするために安全ＢＤ中に導入されたミスマッチを表す。
【００６３】
ダブルトランス−スプライシングＰＴＭ構築体（DS-PTM）もまた、ＰＴＭ＋ＳＦの毒素コード配列の３’端に、５’スプライス部位と、βＨＣＧプレｍＲＮＡの第二イントロンに相補的な第二の標的結合ドメインを付加して作った（図Ａ）。
【００６４】
６．１．２． βＨＣＧ６標的プレｍＲＮＡ
インビトロ標的プレｍＲＮＡを作成するために、βＨＣＧ遺伝子６（受託番号Ｘ００２６６）のＳａｃｌ断片をｐＢＳ（−）にクローニングした。これによりヌクレオチド４６０−１２６５（これは５’非翻訳領域、開始コドン、エクソン１、イントロン１、エクソン２及びイントロン２のほとんどを含む）から８０５ｂｐ挿入体を作成した。インビボ研究のために、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１断片を哺乳類発現ベクター（ｐｃ３．１ＤＮＡ）の中にクローニングしてβＨＣＧ６を作成した。
【００６５】
６．１．３ ｍＲＮＡ調製
インビトロスプライシング実験のために、βＨＣＧ６、β−グロビンプレｍＲＮＡ及び様々なＰＴＭｍＲＮＡをＴ７ｍＲＮＡポリメラーゼ（Pasman & Garcia-Blanco,1996,Nucleic Acids Res.24:1638）を用いて、ＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドＤＮＡのインビトロ転写によってそれぞれ合成した。合成されたｍＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により精製し、生成物を切り取って溶出した。
【００６６】
６．１．４ インビトロスプライシング
ＰＴＭ及び標的プレｍＲＮＡを９８℃に加熱してアニーリングし、次いで３０−３４℃にゆっくりと冷やした。各反応液は１２．５μｌの最終体積中に、４μｌのアニールされたｍＲＮＡ複合体（１００ｎｇの標的と２００ｎｇのＰＴＭ）、１Ｘスプライスバッファー（２メモランダムＭｇＣｌ2、１メモランダムＡＴＰ、５メモランダムのリン酸クレアチニン及び４０メモランダムのＫＣｌ）、及び４μｌのＨｅＬａスプライス核抽出物（Promega）を含んでいた。反応液を３０℃で指示された時間インキュベートし、反応を等量の高濃度塩バッファー（７Ｍ尿素、５％ＳＤＳ、１００メモランダムＬｉＣｌ、１０メモランダムＥＤＴＡ及び１０メモランダムトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５）の添加により止めた。核酸をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４９：１）による抽出、次いでエタノール沈殿により精製した。
【００６７】
６．１．５ 逆転写ＰＣＲ反応
ＲＴ−ＰＣＲ分析をＥＺ−ＲＴ ＰＣＲキット（パーキンエルマー、Foster City、カリフォルニア）を用いて行った。各反応液は５０μｌ反応体積中に、１０ｎｇのシス若しくはトランススプライストｍＲＮＡ又は１−２μｇの全ｍＲＮＡ、０．１μｌの各３’及び５’特異的プライマー、０．３メモランダムの各ｄＮＴＰ、１Ｘ ＥＺバッファー（５０メモランダム ビシン、１１５メモランダム 酢酸カリウム、４％グリセロール、ｐＨ８．２）、２．５メモランダム 酢酸マグネシウム、及び５ＵのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。逆転写を６０℃で４５分間行い、次いで得られたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を以下のように行った。１サイクルの９４℃、３０秒間の初期変性、及び２５サイクルの９４℃、１８秒間の変性及び６０℃、４０秒間のアニーリングと伸張、次いで７０℃で７分の最終伸張。反応生成物をアガロースゲルで電気泳動により分離した。
【００６８】
実験に使用したプライマーは以下のとおりであった。
【００６９】
６．１．６ 細胞増殖、トランスフェクション及びｍＲＮＡ単離
ヒト肺がん細胞系Ｈ１２９９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−５８０３）を１０％ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ培地で３７℃、５％ＣＯ2環境で増殖させた。細胞を、ｐｃＳｐ＋ＣＲＭ（ＣＲＭは非機能性毒素）、ＰＴＭを発現するベクター又はリポフェクタミン試薬（Life Technologies,Gaithersburg,MD）を用いたベクター単独（pcDNA3.1）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２週間後にネオマイシン抵抗性（neor）コロニー形成について検定のスコア付けをした。４つのｎｅｏrコロニーを選択し、継続したｎｅｏ選択下で拡張した。全細胞ｍＲＮＡをＲＮＡエクソール（BioChain Institute,Inc.,San Leandro,CA）を用いて単離し、ＲＴ−ＰＣＲのために使用した。
【００７０】
６．１．７ ヌードマウスの腫瘍におけるトランススプライシング
１１匹のヌードマウスを、１ｘ１０７Ｈ１２９９ヒト肺腫瘍細胞で背側の腹側部皮下スペースの両側に注射した（但し、Ｂ１０、Ｂ１１及びＢ１２は一つの腫瘍を持っていた）（第１日目）。第１４日目にマウスに適量の麻酔薬を投与し、いくつかの配向でのエレクトロポレーションで又はエレクトロポレーションなしで、ｐｃβＨＣＧ６又はｐｃＰＴＭ＋Ｓｐとともに若しくはそれなしで、１００μｇのｐｃＳｐ＋ＣＲＭを含む全量１００μｌの生理食塩水を注射した。右側の腫瘍に注射した溶液には針の跡を印すためにインディアインクも含ませた。４８時間後に動物を殺し、腫瘍を切り取り、ただちに−８０℃で凍結した。分析のため、１０ｍｇの各腫瘍をホモジェネートし、ｍＲＮＡをDynabeadsmRNAダイレクトキット（Dynal）を用いて、製造者の指示書に従って単離した。精製したｍＲＮＡ（１０μｌ全体積のうちの２μｌ）を先述のようにβＨＣＧ−Ｆ及びＤＴ−５Ｒプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＴに付した。すべての試料をＤ−３Ｒ、入れ子のＤＴ−Ａプライマー及びビオチン化したβＨＣＧ−Ｆを用いて再増幅し、生成物を２％アガロースゲル上で電気泳動により分析した。バンドを形成した試料をＭ２８０ Streptavidin Dynabeadsを用いて一本鎖ＤＮＡへと処理し、毒素特異的プライマー（ＤＴ−３Ｒ）を用いて配列決定した。
【００７１】
６．２ 結果
６．２．１ ＰＴＭの合成
１８ｎｔ標的結合ドメイン（βＨＣＧ６イントロン１に相補的）、３０ヌクレオチドスペーサー領域、分岐点（ＢＰ）配列、ポリピリミジン領域（tract）（PPT）及びジフテリア毒素サブユニットＡ（DT-A）をコードするエキソンのすぐ上流の３’スプライス部位のＡＧジヌクレオチド（Uchida et al.,1973,J.Biol.Chem.248:3838）を含む、原型のトランススプライシングｍＲＮＡ分子、ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（図１Ａ）を構築した。その後ＤＴ−Ａエキソンを修飾してコドン１４の翻訳開始部位を除去した。ＰＴＭ構築体をトランススプライシングを発現すべく最大活性を示すように設計した。それゆえ、それらは強力な３’スプライスエレメントを含んでいた（酵母ＢＰ及び哺乳類ＰＰＴ）（Moore et al.,1993,In The mRNA World,R.F.Gesteland and J.F.Atkins,eds.(Cold Spring Harbor,New York,Cold Spring Harbor Laboratory Press）。βＨＣＧ６プレｍＲＮＡ（Talmadge et al.,1984,Nucleic Acids Res.12:8415）を、この遺伝子がほとんどの腫瘍細胞において発現されるのでモデル標的として選ばれた。それは、下垂体腺及び性腺におけるいくつかの例外はあるが正常な成人細胞では発現されない。（Acevedo et al.,1992,Cancer76:1467;Hoon et al.,1996,Int J.Cancer 69:369;Bellet et al.,1997,Cancer Res.57:516）。図１Ｃに示すように、ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐは従来のワトソンクリック塩基対を、βＨＣＧ６イントロン１の３’末端を持ったその結合ドメインにより形成し、標的のイントロニック３’スプライスシグナルをマスクする。この特徴は標的とＰＴＭの間のトランススプライシングを容易にするよう設計される。
【００７２】
ＨｅＬａ核抽出物を確立されたスプライシング手法に沿って用い（Pasman & Garcia-Blanco,1996,Nucleic Acids Res.24:1638）、ＰＴＭ構築体がβＨＣＧ６プレｍＲＮＡ標的に侵入し得るかどうかをテストした。インビトロトランススプライシングの生成物をキメラｍＲＮＡ分子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより検出した。成功したトランススプライシング反応の予想される生成物はβＨＣＧ６の第一エクソンと、そのすぐ後に続くＤＴ−ＡをコードするｐｃＰＴＭ＋Ｓｐから寄与するエキソンを含むキメラｍＲＮＡである（図１Ｃ）。このようなキメラｍＲＮＡはプライマーβＨＣＧ−Ｆ（βＨＣＧ６エキソン１に特異的）及びＤＴ−３Ｒ（ＤＴ−Ａ、図２、レーン１−２に特異的）を用いるＲＴ−ＰＣＴにより容易に検出された。時間ゼロにおいてすなわちＡＴＰの不存在下においては、４６６ｂｐ生成物は観察されなかった。このことはこの反応がＡＴＰと時間の両方に依存性であるということを示していた。
【００７３】
ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐの標的結合ドメインはβＨＣＧ６イントロン１プレｍＲＮＡに相補的な１８ヌクレオチドを含んでおり、効率的なトランススプライシングを示した（図２、レーン１−２）。トランススプライシング効率は、非相補的な１８ヌクレオチド「非結合ドメイン」を含む非標的ＰＴＭ−Ｓｐを用いて少なくとも８分の１に減少した（図２、レーン３−４）。結合ドメインとＢＰの間のスペーサーがある場合とない場合のＰＴＭｍＲＮＡのトランススプライシング効率も比較した。この実験はスペーサーの付加によりトランススプライシングの効率が有意に増大することを示した（図２Ｂ、レーン２＋５）。効率的なトランススプライシングに要求されるスプライシングファクターを採用することを容易にするために、３’スプライス部位と、ドメイン／標的相互作用により生じた二重鎖第二構造との間にいくつかのスペースが必要となり得る。
【００７４】
トランススプライシング特異性についてのＰＴＭ長の効果を調べるために、より短いＰＴＭをＡｃｃＩ切断ＰＴＭプラスミドから合成した（図１参照）。これはＤＴ−Ａコード領域の３’末端から４７９ｎｔを除去した。図２Ｂは標的とされた短いＰＴＭ（＋）（レーン１０−１２）のトランススプライシング能力を、標的とされない短いＰＴＭ（−）（レーン１４−１７）と比較して示す（レーン１４−１７）。短いＰＴＭ＋は、その片方の非標的の短いＰＴＭ（図２Ｂ、レーン１７）よりも、実質的により多くのトランススプライスされた生成物を生じた（図２Ｂ、レーン１２）。これらの実験はより長いＰＴＭの方がトランススプライシングを非特異的に仲介する能力が高いであろうことを示している。
【００７５】
６．２．２． ＰＴＭスプライセオソーム仲介トランススプライシングの正確性
ｐｃＰＴＭ＋ＳｐとβＨＣＧ６標的の間のトランススプライシングが正確であることを確認するために、ＲＴ−ＰＣＴ増幅生成物を５’ビオチニル化βＨＣＧ−Ｆ及び非ビオチニル化ＤＴ−３Ｒプライマーを用いて生成した。この生成物は一本鎖ＤＮＡに変えて、Ｍｉｔｃｈｅｌ及びＭｅｒｒｉｌ（1989,Anal.Biochem.178:239）の方法を用いて、プライマーＤＴ−３Ｒ（ＤＴ−Ａ特異的逆プライマー）で直接配列決定した。トランススプライシングは予想されたスプライス部位（図３）の間で正確に起こり、従来のプレｍＲＮＡがスプライシングの間遺伝子工学ＰＴＭ構築体により侵入され得ること、さらにこの反応が正確であることを確認した。
【００７６】
さらに、ダブルスプラシングＰＴＭ（ＤＳ−ＰＴＭ）の選択的トランススプライシングが観察された（図８Ｂ）。ＤＳ−ＰＴＭは３’又は５’スプライス部位のいずれかに貢献することによりトランススプライシングを生じることができる。さらに，３’部位と５’部位の両方において同時にダブルトランススプライシングを行うことができ、それによりエキソン置換を可能にするＤＳ−ＰＴＭを構築することができる。図８Ｂはこの構築体において５’スプライス部位が標的βＨＣＧプレｍＲＮＡ：ＤＳ−ＰＴＭの１：１濃度でより活性であることを示している。１：６の比では５’スプライス部位はより活性である。
【００７７】
６．２．３ ３’スプライス部位はＰＴＭトランススプライシングにとって本質的である
一般に、３’スプライス部位は三つの要素を含んでいる。１）アクセプター部位の５’に位置するＢＰ配列、２）短いピリミジン残基からなるＰＰＴ、及び３）イントロン−エキソン境界におけるＹＡＧトリヌクレオチドスプライス部位アクセプター（Senapathy et al.,1990,Cell 91:875;Moore et al.,1993）。これらの配列要素の一つの削除又は変更はスプライシングを減少させるか、あるいはなくしてしまうことが知られている（Aebi et al.,1986;Reed & Maniatis 1988,Genes Dev.2:1268;Reed,1989,Genes Dev.3:2113;Roscigno et al.,1993,J.Bio.Chem.268:11222;Coolidge et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:888）。標的トランススプライシングにおけるこれらの保存された要素の役割は実験的に処理された。一つのケース［（ＢＰ（−）Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］では、すべての三つの要素（ＢＰ、ＰＰＴ及びＡＧジヌクレオチド）をランダムな配列で置き換えた。ＰＰＴ及び３’スプライス部位アクセプターが突然変異を受けランダム配列で置き換わっている第二のスプライシング突然変異体［（Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］が構築された。いずれの構築体もインビトロではトランススプライシングを支持することはできなかった（図２Ａ、レーン５−８）。これは、従来のシススプライシングの場合と同様に、ＰＴＭトランススプライシングプロセスもまた３’スプライス部位において機能的なＢＰ、ＰＰＴ及びＡＧアクセプターを要するということを示唆するものである。
【００７８】
６．２．４．特異性を増大させるための”安全な”スプライス部位の発生：
結合領域の封入によりまたはＰＴＭを短縮することにより達成される標的特異性の水準を改良するために、数種のＰＴＭ構造の標的結合領域は（”安全なＰＴＭ”と称される）３’スプライス部位をマスクするための分子内茎部を造るために修飾された。安全な茎部はＰＴＭ３’スプライス部位またはこれに隣接する配列の領域と部分的に塩基対にし、それにより標的獲得のまえにＰＴＭ３’スプライス部位へのスプライシング複合体成分の接近を遮断する、結合領域の部分により形成される（図４Ａ、ＰＴＭ＋ＳＦ）。ＰＴＭ結合領域およびβＨＣＧ６の遊離部分間の塩基対は、安全な茎部を巻戻してＵ２ＡＦのようなスプライシングファクターをＰＴＭ３’スプライス部位に結合させそしてトランススプライシングを開始させるのを可能にする（図４Ｂ）。
【００７９】
この概念は、ＰＴＭ＋ＳＦ（安全）またはｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（線状）のいずれかそして標的（βＨＣＧ６）および非標的（β−グロビン）ｐｒｅ−ｍＲＮＡの両方を含有するスプライシング反応において試験された。スプライシングされた生成物は次に、ＲＴ−ＰＣＲおよびゲル電気泳動により分析された。βＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３Ｒプライマーを用いて、特異性１９６ｂｐトランススプライシングされたバンドはβＨＣＧ標的そして線状ＰＴＭ（ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ、図５、レーン２）または安全ＰＴＭ（ＰＴＭ−ＳＦ、図５、レーン８）のいずれかを含有する反応において示された。線状ＰＴＭ（図５、レーン２）と安全ＰＴＭ（図５、レーン８）との間での標的化トランスプライシングの比較は安全ＰＴＭが線状ＰＴＭより効率が低くトランススプライシングしたことを示した。
【００８０】
非標的化反応はβ−グロブリン−Ｆ（β−グロブリンのエキソン１に特異性）およびＤＴ−３Ｒプライマーを用いて増幅された。β−グロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡを用いて非特性ＰＴＭをトランススプライシングすることにより、生成された予期生成物は１８９ｂｐである。線状ＰＴＭとβ−グロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間で非特異性トランススプライシングは明らかであった（図５、レーン５）。対照的に、安全ＰＴＭの使用により非特異性トランススプライシングは実質的に排除された（図５、レーン１１）。このことは、線状ＰＴＭがスプライシング複合体媒介トランススプライシングの概念を明らかにするための最大活性のためにデザインされたので、予期されなかった。その有力な３’スプライス部位と組み合わされた線状ＰＴＭの開いた構造はスプライシング因子の結合を促進する。いったん結合されたならばこれらのスプライシング因子は、トリパノソーマにおけるトランススプライシングに類似の方法で、任意の５’スプライス部位とともにトランススライシングを潜在的に開始することが出来る。安全茎は標的獲得のまえに、Ｕ２ＡＦのようなスプライシング因子がＰＴＭに結合するのを防止するようにデザインされた。この結果は、結合領域の遊離部分とβＨＣＧ６との間の塩茎対が（ｍＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用により）安全茎部を巻戻し、５’スプライス部位をあらわし、スプライシング因子の漸増およびトランススプライシングの開始を可能にするモデルと一致している。β−グロビンとβＨＣＧ６ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間でトランススプライシングは検出されなかった（図５、レーン３、６、９および１２）。
【００８１】
６．２．５ 安全ＰＴＭおよび変異体のインビトロトランススプライシング：
トランススプライシングにおける３’スプライス部位の役割をより良く理解するために、ＰＰＴがプリンとの置換により弱められそして（または）ＢＰが塩基置換により修飾されているかのいずれかである一連の安全ＰＴＭが構成された（表１参照）。安全（ＰＴＭ＋ＳＦ）のインビトロトランススプライシング効率が３種の安全変異体比較され、それはトランススプライシングに対する減少した能力を示した。最も大きな効果に変異体２（ＰＴＭ＋ＳＦＰｙ２）を用いて観察され、これはトランススプライシング不能であった（図４Ｃ、レーン５〜６）。トランススプラインシングのこの阻止は弱められたＰＰＴおよび（または）安全茎部のより高いＴｍに起因している可能性がある。対照的に、ＢＰ配列における変異（ＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３）はトランススプライシングに顕著に影響しなかった。このことは、導入された修飾が哺乳動物の分岐点コンセンサス範囲ＹＮＹＵＲＡＣ（但し、Ｙ＝ピリミジン、Ｒ＝プリンおよびＮ＝任意のヌクレオチド）内であったので驚くべきことではない（Ｍｏｏｒｅ等、１９９３）。この発見は、分枝点配列がスプライシング効率に影響することなしに除去されることが出来ることを示している。ＰＰＴにおける変化（ＰＴＭ＋ＳＦ−Ｐｙｌ）はトランススプライシングにおける水準を減少させた（レーン３〜４）。同様に、ＢＰおよびＰＰＴの両方が変化されたＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３−Ｐｙｌであった場合に、それらはトランススプライシングにおいてさらに減少を生じさせた（図４Ｃ、レーン９〜１０）。これらの安全な変異体のトランススプライシング効率の順序はＰＴＭ＋ＳＦ＞ＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３＞ＰＴＭ＋ＳＦＰｙｌ＞ＰＴＭ＋ＳＦＢＰ３−Ｐｙｌ＞ＰＴＭ＋ＳＦＰｙ２である。これらの結果はＰＰＴおよびＢＰの両方が有効なインビトロトランススプライシングのために重要であることを確認する（Roscigno等のＪ．Biol.Chem.268：11222（1993））。
【００８２】
６．２．６． シス スプライシングとトランススプライシングとの間の競合：
ＰＴＭの濃度を増大させることによるｐｒｅ−ｍＲＮＡシス スプライシングを遮断することが可能であるかどうかを調べるために、トランススプライシングに対する反応を駆動するために実験を行なった。それらのスプライシング反応は、一定量のβＨＣＧ６ｐｒｅ−ｍＲＮＡ標的および種々の濃度のトランススプライシングＰＴＭを用いて行なわれた。シススプライシングはβＨＣＧ−Ｆ（エキソン１）およびβＨＣＧ−Ｒ２（エキソン２）に対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより監視された。これは予期された１２５ｂＰシススプライシングされた生成物および４７８ｂＰスプライシングされていない生成物を増幅させた（図６Ａ）。プライマーβＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３Ｒがトランススプライシングされた生成物を検出するために用いられた（図６Ｂ）。ＰＴＭの低い濃度で、シススプライシング（図６Ａ、レーン１〜４）は、トランススプライシング（図６Ｂ、レーン１〜４）よりも優勢であった。シススプライシングは標的よりも１．５倍大きいＰＴＭ濃度で約５０％減少された。標的の３倍の濃度にＰＴＭｍＲＮＡ濃度を増大させると、９０％よりも大きくシススプライシングを阻止し（図６Ａ、レーン７〜９）、同時にトランススプライシングされた生成物を増大させている（図６Ｂ、レーン６〜１０）。競合ＰＴ−ＰＣＲは１つの反応においてすべての３種のプライマー（βＨＣＧ−Ｆ、ＨＣＧ−Ｒ２およびＤＴ−３Ｒ）を包含させることによりシススプライシングされた生成物およびトランススプライシングされた生成物の両方を同時に増幅させるために行なわれた。この実験は図６において見られる結果と同様な結果を示し、インビトロ条件下に、ＰＴＭは標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡシススプライシングを有効に遮断しそしてそれを特別に設計されたトランススプライシングされたキメラｍＲＮＡの生産に置き換えることを示している。
【００８３】
６．２．７ 組織培養中のトランス−スプライシング
細胞培養モデルにおけるトランス−スプライシングのメカニズムを例証するため、ヒト肺ガン細胞株Ｈ１２９９（βＨＣＧ６陽性）をＳＰ−ＣＲＭ（非機能的なジフテリア毒素）を発現するベクター又はベクター単独（pcDNA3.1）でトランスフェクトし、ネオマイシン（neomycin）の存在下で成長させた。四つのネオマイシン耐性のコロニーを１４日後に個々に回収し、続いてのネオマイシンの存在下に拡張した。ｍＲＮＡ全体を欠くコロニーから単離し、プライマーβＨＣＧ−Ｆ及びＤＴ−３Ｒを用いたＲＴ−ＰＣＲにより分析した。これにより、四つの選択したコロニーのうち三つから、予想される１９６ｂｐのトランス−スプライスした生成物が得られた（図７Ａ、第２，３，及び４レーン）。増幅したクローン番号２からの生成物を直接配列決定し、ＰＴＭ誘導のトランス−スプライシングが、ヒト細胞において、内因的に発現されたβＨＣＧ６ターゲットエキソン１及びＤＴ−Ａの第一ヌクレオチドの、予想されたスプライス部位で正確に生じたことを確認した（図７Ｂ）。
【００８４】
６．２．８ インビボモデルにおけるトランス−スプライシング
インビボにおけるトランス−スプライシングのメカニズムを例証するため、以下の実験をアシミック（athymic）（ヌード）マウスにおいて行った。１０7のＨ１２９９細胞を背側の側腹部の皮下空間中に注射して、腫瘍を発生させた。１４日目に、ＰＴＭ発現プラスミドを腫瘍へ注射した。大部分の腫瘍を次に、電気穿孔に付し、プラスミドの送達を容易にした（以下の表２参照）。４８時間後、腫瘍を除去し、ポリＡ−ｍＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。１９のＰＴＭ処理腫瘍のうち８つにおいて、トランス−スプライシングが検出された。二つの試料が、一回のＲＴ−ＰＣＲのラウンドで、ｍＲＮＡから、予想されたトランス−スプライスされた生成物（４６６ｂｐ）を製造した。次に、６つの更なる腫瘍が、ネストしたプライマーのセットを用いた第二のＰＣＲの増幅によりトランス−スプライスについて陽性であり、予想された１９６ｂｐの生成物を製造した（表２）。各陽性のサンプルを配列決定し、βＨＣＧ６エキソン１が予想されたスプライス部位において、ＤＴ−Ａのコード配列（野生型又はＣＲＭ変異体）に正確にトランス−スプライスされることを例証した。陽性試料の６つが、人工的にターゲット前−ｍＲＮＡの濃度を増やした、プラスミドｐｃＰＴＭ＋ＣＲＭ及びｐｃＨＣＧ６の共トランスフェクション（cotransfection）を受けた処理グループ由来であった。これは、トランス−スプライスされる現象を検出する可能性を高めるために行われた。他の二つの陽性腫瘍は、ｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（野生型ＤＴ−Ａ）のみを受けたグループ由来であった。これらの腫瘍は、βＨＣＧ６発現プラスミドによりトランスフェクトされず、再度、６．２．７節で述べた組織培養モデルと同様に、トランス−スプライシングが、腫瘍細胞により製造される、ＰＴＭと内因的なβＨＣＧ６前−ｍＲＮＡとの間で起こったことを例証した。
【００８５】
【００８６】
７．例 ＬａｃＺトランス−スプライシングモデル
特異的プレｍＲＮＡ標的とＰＴＭの間のスプライソソーム介在標的トランス−スプライシングの機構の普遍性を明白にし、評価するために、酵素β−ガラクトシダーゼに基づいた単純なモデルシステムを開発した。以下の節においては、特異標的とＰＴＭの間のスプライソソーム介在標的トランス−スプライシングの成功例を明らかにする結果を記載する。
【００８７】
７．１． 材料と方法
７．１．１． プライマー配列
以下のプライマーｌａｃＺモデルシステムをテストするために使用された：
【００８８】
７．１．２． ｌａｃＺプレｍＲＮＡ標的分子の構築
ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡ（ｐｃ３．１、ｌａｃＴ１）を、以下のＰＣＲ産物のクローニングによって構築した：（ｉ）ｌａｃＺの５’フラグメント、次いで（ｉｉ）βＨＣＧ６イントロン１：（ｉｉｉ）およびｌａｃＺの３’フラグメント。ｌａｃＺ遺伝子の５’および３’断片を、以下のプライマーを使用して、テンプイレートｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Invitrogen,SanDiego,CA）からＰＣＲ増幅した：５’ｌａｃ−１Ｆおよび５’ｌａｃ１Ｒ（５’断片用）、および３’ｌａｃ−１Ｆおよび３’ｌａｃ−１Ｒ（３’断片用）。増幅したｌａｃＺ５’断片は開始コドンを含む１７８８ｂｐ長であり、増幅した３’断片は１３８５ｂｐ長で、分枝点、ポリピリミジントラクトおよびβＨＣＧ６イントロン１、に加えて、天然の５’および３’スプライス部位を有している。βＨＣＧ６イントロン１は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された：ＨＣＧ−Ｉｎ１ＦおよびＨＣＧ−Ｉｎ１Ｒ。
【００８９】
ｌａｃＺ標的２は、３’スプライス部位の後にフレーム４コドン中に２つの停止コドン（ＴＡＡＴＡＡ）を含有している他は、ｌａｃＺ１と同じバージョンである。これは、以下のプライマーを用いて、３’断片（ｌａｃＺ）のＰＣＲ増幅によって創製された：ｌａｃ−Ｓｔｏｐおよび３’ｌａｃ１ＲおよびｌａｃＺ標的１中の機能的３’断片の置換。
【００９０】
７.１.３． ｐｃ３.１ＰＴＭおよびｐｃ３．１ＰＴＭ２の構築
プレ−トランス−スプライシング分子、ｐｃ３．１ＰＴＭ１は、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＴＭ＋Ｓｐを消化し、ＤＴ−ＡトキシンをコードするＤＮＡ断片を、ｌａｃＺの機能的３’末端をコードするＤＮＡ断片で置換することによって創製した。この断片を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅することによって産生した：３’ｌａｃ１Ｆおよび３’ｌａｃ１Ｒ。細胞培養実験のために、ＨＣＧイントロン１に対する結果領域、３０ｂｐスペーサー、酵母分枝点（ＴＡＣＴＡＡＣ）、および強いポリピリミジントラクトと次いでクローン化したｌａｃＺを含有するｐｃ３．１ＰＴＭ２の、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。
【００９１】
プレ−トランス−スプライシング分子、ｐｃ３．１ＰＴＭ２は、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＰＴＭ＋Ｓｐを消化し、そしてＤＴ−ＡトキシンをコードするＤＮＡ断片をβＨＣＧ６エキソン２で置換することによって創製された。βＨＣＧ６エキソン２は、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって産生された：ＨＣＧ−Ｅｘ２ＦおよびＨＣＧ−Ｅｘ２Ｒ。細胞培養実験のために、ＨＣＧイントロン１に対する結果領域、３０ｂｐスペーサー、酵母分岐点（ＴＡＣＴＡＡＣ）、および強いポリピリミジントラクトと次いでクローン化したβＨＣＧ６エキソン２を含有するｐｃ３．１ＰＴＭ２の、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用した。
【００９２】
７．１．４．ｌａｃＺスプライス標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭＳを２９３細胞への同時トランスフェクション
ヒト胚腎細胞（２９３Ｔ）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ倍地で３７℃、５％ＣＯ2にて増殖させた。細胞を、製造元の指示書に従ってLipofectaminePlus[LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)]を用いて、ｐｃ３.１ＬａｃＴ１およびｐｃ３．１ＰＴＭ２またはｐｃ３．１ＬａｃＴ２およびｐｃ３．１ＰＴＭで同時トランスフェクトした。２４時間の後トランスフェクションで、細胞は収穫された；総ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを標的用およびＰＴＭ用特異性プライマーを用いて実行した。β−ガラクトシダーゼ活性は、β−ｇａｌ染色キット（Invitrogen,SanDiego,CA）を使用して、細胞を染色することによりモニターされた。
【００９３】
７．２．結果
７．２．１．ｌａｃＺスプライス標的は、効率よくシス・スプライスして、機能的β−ガラクトシダーゼを産生する
スプライス標的プレｍＲＮＡのシス・スプライス効率の性能を比較するため、ｐｃ３．１ｌａｃＴ１を、LipofectaminePlus試薬[LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)]を使用して、次いで総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。シス・スプライスしたＲＴ−ＰＣＲの配列解析は、スプライシングは正確であり、予測されたスプライス部位に正確に起こったことを示した（図１２Ｂ）。更に、標的プレｍＲＮＡ分子の正確なシス・スプライシングは、β−ガラクトシダーゼ、即ちｘ−ｇａｌの、加水分解を触媒し、顕微鏡下で、可視化することができる青色を産生する活性β−ガラクトシダーゼをコードすることのできるｍＲＮＡの生成をもたらす。標的プレｍＲＮＡの正確なシス・スプライシングは、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を成功裏に検出することにより、更に確認された。
【００９４】
機能的３’ｌａｃ断片（ＰＴＭ１）のトランス・スプライシングによる欠損ｌａｃＺ標的２プレｍＲＮＡの修復は、β−ガラクトシダーゼが酵素活性の染色により測定した。この目的のために、２９３Ｔ細胞をｌａｃＺ標的２プレｍＲＮＡ（欠損３’断片を含有）およびＰＴＭ１（機能的３’ｌａｃＺ活性を含有）の同時トランスフェクションを行った。２４時間後トランスフェクショクン細胞のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性をアッセイした。効果的なＰＴＭ１のｌａｃＺ標的２プレｍＲＮＡへのトランス・スプライシングは、機能的β−ガラクトシダーゼ活性の産生をもたらした。図１１Ｂ−Ｅに明らかに示したように、ＰＴＭ１のｌａｃＺ標的２へのトランス・スプライシングは、対照と比較して、５％ないし１０％のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の回復をもたらした。
【００９５】
７.２．２． ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡをＰＴＭ２の間の標的トランス・スプライシング
トランス・スプライシングをアッセイするため、ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭ２を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションに次いで、総ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。ＰＣＲ反応には、以下のプライマーを使用した：ｌａｃＺ−ＴＲ１（ｌａｃＺ５’エキソン特異的）およびＨＣＧＲ２（βＨＣＧＲエキソン２特異的）。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、予測された１９５ｂｐトランス・スプライス産物（図１１、レーン２および３）を産生し、ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭ２の間の効率的なトランス・スプライシングを明らかにした。レーン１は、ＰＲＭ２を含まない、対照を示す。
【００９６】
トランス・スプライシングの効率を、β−ガラクトシダーゼ活性を染色して測定した。トランス・スプライシングをアッセイするために、２９３Ｔ細胞をｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡおよびＰＴＭ２で同時トランスフェクションした。２４時間後トランスフェクションで、細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。もし、標的プレｍＲＮＡをＰＴＭの間に効果的なトランス・スプライシングが起これば、ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡの５’断片からなるキメラｍＲＮＡが産生され、そして、活性β−ガラクトシダーゼをコードすることのできない、βＨＣＧ６エキソン２が生じる。同時トランスフェクション実験の結果は、ｌａｃＺ標的１へのＰＴＭ２のトランス・スプライシングは、対照に比較して、β−ガラクトシダーゼ活性の１０−１５％の減少をもたらした。
【００９７】
ｌａｃＺ標的プレｍＲＮＡとＰＴＭ２の間のトランス・スプライシングが正確であることを更に確認するため、ＲＴ−ＰＣＲを５’ビオチン化ｌａｃＺ−ＴＲ１および非ビオチン化ＨＣＧＲ２プライマーを使用して行った。一本鎖のＤＮＡを単離し、ＨＣＧＲ２プライマー（ＨＣＧエキソン２特異的プライマー）を用いて直接配列決定した。スプライス部位の配列によって証明されるように、トランス・スプライシングはスプライス部位の間に予測されたように正確に起こっており（図１２Ａおよび１２Ｂ）、通常のプレｍＲＮＡが、スプライシング中に操作したＰＴＭにより浸食されており、そして更に、この反応が正しいことを確認した。
【００９８】
８．実施例：嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質の修正
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、世界で最も普通の遺伝性疾患の一つである。ＣＦに関連する遺伝子は、単離され、そのタンパク質産物が推定された（kerem,B.S.et al.1989,Science,245:1073-1080;Riordan et al.,1989,Scienece,245:1066-1073;Rommans,et al.,1989,Science,245:1059-1065）。ＣＦ関連遺伝子のタンパク質産物は、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）と称されている。全ての突然変異アレルのおよそ〜７０％を数える、突然変異起因性の最も普通の疾病は、位置５０８（△Ｆ５０８）のフェニルアラニンをコードするエキソン１０における３つのヌクレオチドの欠損である。以下の節では、スプライソソーム介在トランス・スプライシングを使用した嚢胞性繊維症遺伝子の成功した修復を記載し、モデルシステムの修復ＣＦＴＲの実行可能性を明らかにする。
【００９９】
８.１． 材料および方法
８．１．１． プレトランススプライシング分子
ＣＦＴＲプレ・トランス・スプライシング・分子（ＰＴＭ）は、ＣＦＴＲイントロン９（３’末端、−１３から−３１）に相補性の２３ヌクレオチド結合領域、３０ヌクレオチドスペーサー領域（スプライソソーム成分の効率的な結合を許容する）、分岐点（ＢＰ）配列、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）およびＣＦＴＲエキソン１０をコードする配列の直上流の３’スプライス部位にあるＡＧジヌクレオチド（Ｆ５０８を含む野生型配列）からなる。この最初のＰＴＭは、トランススプライシングを明らかにするために最大活性を表すよう設計された：それゆえ、ＰＴＭはＵＡＣＵＡＡＣの酵母コンセンサスＢＰ配列および大きなＰＰＴを含む。１８ヌクレオチドＨＩＳタグ（６ヒスタミンコドン）は、特異的増幅およびトランス・スプライシング産物の単離、および内部ＣＦＴＲを有さないことを許容する野生型エキソン１０コード配列の後に含まれる。２フラグメントを産生するに使用されるオリゴヌクレオチドは、ユニークな制限部位を含み、（それぞれ、ＡｐａＩおよびＰｓｔＩ、およびＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ）哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に増幅したＤＮＡを直接クローニングすることができる。
【０１００】
８．１．２． 標的ＣＦＴＲプレｍＲＮＡミニ遺伝子
ＣＦＴＲミニ遺伝子標的は、図１３に示され、ＣＦＴＲエキソン９；イントロン９の機能的５’および３’領域（それぞれ、各末端から２６０および２６５ヌクレオチド）；エキソン１０[△Ｆ５０８]；およびイントロン１０の５’領域（９０ヌクレオチド）からなる。更に、図１６に示したように、ＣＦＴＲエキソン９−１０および１０−２４を含むミニ標的遺伝子は、嚢胞性繊維症突然変異の修正のためのトランス・スプライシング介在スプライソソームの使用をテストするために使用することができる。図１７は、嚢胞性繊維症突然変異の修正のために使用することができる二重スプライシングＰＴＭを示す。示したように、二重スプライシングＰＴＭは、ＣＦＴＲ・ＢＤイントロン９、スペーサー、分岐点、ポリピリミジントラクト、３’スプライス部位、ＣＦＴＲエキソン１０、スペーサー、分岐点、ポリミリミジントラクト、５’スプライス部位およびＣＦＴＲ・ＢＤエキソン１０を含有する。
【０１０１】
８．１．３． オリゴヌクレオチド
以下のオリゴヌクレオチドは、ＣＦＴＲ・ＰＴＭを創製するために使用される。
【０１０２】
以下のヌクレオチドは、ＣＦＴＲターゲット前−ｍＲＮＡミニ遺伝子（エキソン９＋ミニ−イントロン９＋エキソン１０＋５’末端イントロン１０）を作製するために用いられた。
【０１０３】
以下のオリゴヌクレオチドは、トランス−スプライスされた生成物を検出するために用いられた：
【０１０４】
８．２ 結果
ＰＴＭ及びターゲットプレ−ｍＲＮＡを２９３胎児性腎細胞中に、リポフェクタミン（lipofectamine）（Life Technologies,Gaithersburg,MD）を用いて共トランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後２４時間で回収し、ＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応において、ＰＴＭ及びターゲット特異性のプライマーを用いて、その中でターゲットプレ−ｍＲＮＡの変異体エキソン１０がＰＴＭの野生型エキソン１０（図１４）と置き換わっている、トランス−スプライスした生成物を検出した。トランス−スプライスした生成物の配列分析により、三つのヌクレオチド欠失の回復、及びスプライシングが正確であり、予想されたスプライス部位に生じること（図１５）が確認され、初めて嚢胞性線維症遺伝子ＣＦＴＲのＲＮＡ修復を例証した。
【０１０５】
本発明は、本明細書中に記載の特定の態様による範囲内に限定されない。つまり、本明細書中に記載の改変加えて、本発明の種々の改変が、前記説明及び添付の図面より、当業者にとって明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものと意図される。本明細書中に引用した種々の文献について、その開示は引用により全体として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】トランス−スプライシングＲＮＡ先駆体のモデル。
【図１Ｂ】モデルＰＴＭ構築物および標的を定めたトランス−スプライシング戦略。第一世代ＰＴＭ（ＰＴＭ＋ＳｐおよびＰＴＭ−Ｓｐ）の図解図。ＢＤ、結合ドメイン；ＮＢＤ、非結合ドメイン；ＢＰ、分枝点；ＰＰＴ、ピリミジン配列；ｓｓ、スプライシング部位；ＤＴ−Ａ、ジフテリアトキシンサブユニットＡ。ＰＴＭ内の特異な制限部位は、一字で示されている；E.coli,EcoRI;X,Xhil;K,Kpnl;P,Pstl;A,Accl;B,BamHおよび異種（Hetrologous），ＨｉｎｄＩＩＩ。
【図１Ｃ】βＨＣＧ６標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対する慣用のWatson Crick塩基対を経るＰＴＭ−Ｓｐの結合および提案されたシス−スプライシングおよびトランス−スプライシングメカニズムを示す図解図。
【図２Ａ】種々のＰＴＭ構築物のβＨＣＧ６標的中へのインビトロ トランス−スプライシング効率。標的を定めた結合ドメインおよび活性スプライシング部位は、ＰＴＭトランス−スプライシング活性と関連している。十分の長さの標的を定めた（ｐｃ−ＰＴＭ＋Ｓｐ）、標的が定められていない（ＰＴＭ−Ｓｐ）およびスプライシング変異体［Ｐｙ（−）ＡＧ（−）およびＢＰ（−）Ｐｙ（−）ＡＧ（−）］ＰＴＭ ＲＮＡを、βＨＣＧ６標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡを含有するスプライシング反応に付加した。この生成物は、プライマーβＨＣＧ−Ｆ（標的βＨＣＧ６エキソン１に対して特異性）およびＤＴ−５Ｒ（ＤＴ−Ａに対する相補体）を用いて増幅され、次いで１．５％アガロースゲルにおける電気泳動により分析して、ＲＴ−ＰＣＲであった。
【図２Ｂ】種々のＰＴＭ構築物のインビトロ トランス−スプライシング効率。結合ドメインとスプライシング部位との間に空間を有する十分の長さのＰＴＭ、標的結合ドメイン（短いＰＴＭ＋）または標的が定められていない結合ドメイン（ＰＴＭ−）を包含する短いＰＴＭおよびスペーサー領域を有していないＰＴＭを、βＨＣＧ６標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡを含有するスプライシング反応に付加した。この生成物は、プライマーβＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３を用いて増幅されたＲＴ−ＰＣＲであった。短いＰＴＭを含有する反応の場合、可逆性ＰＣＲプライマーは、ＤＴ−４であった。これは、ＤＴ−３の結合部位がＰＴＭから分離されることによる。
【図３】ＰＴＭと標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間のインビトロ トランス−スプライシング生成物を示すヌクレオチド配列。図２（レーン２）からの４６６ｂｐのトランス−スプライシングされたＲＴ−ＰＣＲ生成物を、５’ビオチン標識したせ前進プライマー（βＨＣＧ−Ｆ）および組み重ねられた（nested）非標識可逆性プライマー（ＤＴ−３Ｒ）を用いて再増幅した。一重鎖ＤＮＡは、精製し、次いでトキシン特異性ＤＴ−３Ｒプライマーを用いて直接に配列決定した。矢印は、標的βＨＣＧ６エキソンＩの最後のヌクレオチドとＤＴ−Ａをコードする最初のヌクレオチドとの間のスプライシング接合を示す。
【図４Ａ】ＢＰおよびＰＰＴがスプライシング因子から遮蔽されるように、ＰＴＭ分子内基対ステムを示す、「安全」（safety）ＰＴＭおよびその変種の図解図。下線を引いた配列は、βＨＣＧ６イントロンＩ相補標的−結合ドメインを示す。イタリック体文字の配列は、ＢＰに対して同族である標的ミスマッチを示している。
【図４Ｂ】標的に結合した際の飽和ＰＴＭを示す開放形態の図解図。
【図４Ｃ】インビトロ トランス−スプライシング反応は、安全ＰＴＭまたは安全ＰＴＭ変種を、βＨＣＧ６標的とともにインキュベートすることによって行った。スプライシング反応は、βＨＣＧ−ＦおよびＤＴ−３Ｒプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより増幅させた；生成物は、２．０％アガロースゲルで分析した。
【図５】標的を定めたトランス−スプライシングの特異性は、ＰＴＭ中に安全ＰＴＭを包含させることによって増強される。βＨＣＧ６ｐｒｅ−ｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）およびβ−グロブリンｐｒｅ−ｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）を、ＰＴＭ＋ＳＦ（安全）またはｐｃＰＴＭ＋Ｓｐ（線状）ＲＮＡ（５００ｎｇ）とともにアニーリングした。インビトロ トランス−スプライシング反応およびＲＴ−ＰＣＲ分析は、試験方法について記載されているとおり行い、また生成物は、２．０％アガロースゲルで分離した。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたプライマーは、指定されているとおりである。
【図６】上昇するＰＴＭ濃度の存在下で、シス−スプライシングは阻害され、トランス−スプライシングによって取って代わられる。一定量のβＨＣＧ６ターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）の存在下でＰＴＭ（pcPTM+Sp）ＲＮＡ濃度を上昇させながら（５２〜３００ｎｇ）、in vitroスプライシングを行った。シス−スプライスト（cis-spliced）及びアン−スプライスト（un-spliced）生成物のＲＴ−ＰＣＲはプライマーβＨＣＧ−Ｆ（エキソン１特異的）とβＨＣＧ−Ｒ２（エキソン２特異的−パネルＡ）を用いた；プライマーβＨＣＧ−ＦとＤＴ−３ＲはＲＴ−ＰＣＲトランス−スプライスト生成物（パネルＢ）に用いた。反応生成物を１．５％及び２．０％アガロースゲル上でそれぞれ分析した。パネルＡでは、レーン９は３００ｎｇのＰＴＭの存在下での６０分時点を表し、これはパネルＢのレーン１０に相当する。
【図７Ａ】ＰＴＭは培養ヒト癌細胞においてトランス−スプライシングすることができる。ｐｃＳｐ＋ＣＲＭ（非毒性変異体ＤＴ−Ａを発現する）をトランスフェクトされた４拡大ネオマイシン耐性Ｈ１２９９肺癌コロニーの各々から、総ＲＮＡを単離した。１μｇの総ＲＮＡと、５’ビオチニル化βＨＣＧ−Ｆ及び非ビオチニル化ＤＴ−３Ｒプライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。一本鎖ＤＮＡを精製して、配列決定した。
【図７Ｂ】内因性βＨＣＧ６ターゲットとＣＲＭ１９７変異体毒素との間のトランス−スプライスト生成物のヌクレオチド配列（センス鎖）を示す。２つの矢印はスプライス部位の位置を示す。
【図８Ａ】二重スプライシング治療前ｍＲＮＡの概略図。
【図８Ｂ】二重スプライシングＰＴＭの選択的トランス−スプライシング。ＰＴＭ濃度を変えることによって、ＰＴＭをターゲットの５’又は３’スプライス部位にトランス−スプライシングすることができる。
【図９】エキソン標識（tagging）のためのＰＴＭ分子の使用の概略図。２例のＰＴＭを示す。左側のＰＴＭはターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡ３’スプライス部位に非特異的にトランス−スプライシングすることができる。他方の右側ＰＴＭはターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡ５’スプライス部位に非特異的にトランス−スプライシングするように設計される。ＰＴＭ仲介トランス−スプライシング反応は、信頼すべき（authentic）エキソンの５’又は３’側のいずれかへの特異的タグを含むキメラＲＮＡの生成を生じる。
【図１０Ａ】ｌａｃＺノックアウトモデルに用いるための構築体の概略図。ターゲットｌａｃＺｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ｌａｃＺの５’フラグメントと、それに続くβＨＣＧ６イントロン１とｌａｃＺの３’フラグメントを含有する（ターゲット１）。このモデル系に用いるためのＰＴＭ分子は、ｐＰＴＭ＋ＳＰをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩとによって消化させ、ＤＴ−Ａ毒素をβＨＣＧ６エキソン２（ｐｃ３．１ＰＴＭ２）と代えることによって作製された。
【図１０Ｂ】スプライソソーム仲介ＲＮＡトランス−スプライシング（ＳＭａＲＴ）によるβ−Ｇａｌ活性の修復の概略図。
【図１０Ｃ】ｌａｃＺノックアウトモデル（pc3.1 lacZT2）に用いるための構築体の概略図。ｌａｃＺターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡは、３’スプライス部位後のフレーム４コドン中に２終止コドン（TAA TAA）を含有することを除いて、ノックアウト実験に用いたターゲットｐｒｅ−ｍＲＮＡと同じである。このモデル系に用いるためのＰＴＭ分子は、ｐＰＴＭ＋ＳＰをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩとによって消化させ、ＤＴ−Ａ毒素をｌａｃＺの機能的３’フラグメントと代えることによって作製された。
【図１１Ａ】ｌａｃＺノックアウトモデルを用いた場合のシス−及びトランス−スプライシングの実証。ｌａｃＺスプライスターゲット１ｐｒｅ−ｍＲＮＡとＰＴＭ２を２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトした。次に、総ＲＮＡを単離し、適当な特異的プライマーを用いて、シス−スプライスト生成物とトランス−スプライスト生成物に関してＰＣＲによって分析した。増幅したＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で分離させた。
【図１１Ｂ】β−ガラクトシダーゼ活性に関する分析。２９３細胞をｌａｃＺターゲット２ＤＮＡのみ（パネルＢ）又はｌａｃＺターゲット２ＤＮＡとＰＴＭ１（パネルＣ）によってトランスフェクトした。
【図１１Ｃ】β−ガラクトシダーゼ活性に関する分析。２９３細胞をｌａｃＺターゲット２ＤＮＡのみ（パネルＢ）又はｌａｃＺターゲット２ＤＮＡとＰＴＭ１（パネルＣ）によってトランスフェクトした。
【図１２Ａ】正確なトランス−スプライシングを実証するトランス−スプライスト分子のヌクレオチド配列。
【図１２Ｂ】シス−スプライスト生成物とトランス−スプライスト生成物のヌクレオチド配列。これらのヌクレオチド配列は異なるスプライシング反応の各々に関して予想された配列であった。
【図１３】嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）遺伝子の修復に関する遺伝子修復モデル。
【図１４】外因的に供給されたＣＦＴＲミニ−遺伝子ターゲットとＰＴＭとの間のトランス−スプライシングのＲＴ−ＰＣＲ実証。プラスミドを２９３胚腎臓細胞中へ同時トランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いたプライマー対は各レーン上方にリストする。各レーン中の下位帯（４７１ｂｐ）はトランス−スプライスト生成物を表す。レーン１の下位帯（４７１ｂｐ）を２％Ｓｅａｋｅｍアガロースゲルから精製して、この帯のＤＮＡ配列を決定した。
【図１５Ａ】トランス−スプライスト生成物（図１４に示したレーン１、下位帯）のＤＮＡ配列。このＤＮＡ配列はＦ５０８コドン（ＴＴＴ）の存在を実証し、エキソン９配列はエキソン１０配列及びＨｉｓタグ配列に隣接する。
【図１５Ｂ】トランス−スプライスト生成物（図１４に示したレーン１、下位帯）のＤＮＡ配列。このＤＮＡ配列はＦ５０８コドン（ＴＴＴ）の存在を実証し、エキソン９配列はエキソン１０配列及びＨｉｓタグ配列に隣接する。
【図１６】エキソン１０にＦ５０８欠失を有する外因的供給ＣＦＴＲターゲット分子の修復の概略図。
【図１７】二重スプライシングＰＴＭを用いたエキソン１０侵襲による内因的ＣＦＴＲ転写体の修復。二重スプライシングＰＴＭの使用は、非常に短いＰＴＭ分子によるΔ５０８突然変異の修復を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項２】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）該３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項３】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項４】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
該核酸分子が３’スプライス領域の一又はそれ以上の面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補的な、三重らせん形成の、又はタンパク質−核酸の、相互作用によって介される、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能な嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレーターポリペプチドをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質のエキソン１０をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項１０】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項１１】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項１２】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞中で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む、上記方法。
【請求項１４】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞中で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む、上記方法。
【請求項１５】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞内で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む、
上記方法。
【請求項１６】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】
キメラＲＮＡ分子が翻訳可能なタンパク質をコードする配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該３’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
該細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項１９】
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；
ｄ）該３’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；及び
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、を含み、
該細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項２０】
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；
ｄ）該５’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；及び
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該細胞内の核スプライス成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２２】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２３】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能な嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレーターポリペプチドをコードする、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２４】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質のエキソン１０をコードする、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２５】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２６】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能な嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレーターポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２７】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質のエキソン１０をコードする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２８】
真核発現ベクターであって、該ベクターが
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質プレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項２９】
真核発現ベクターであって、該ベクターが
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質プレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項３０】
真核発現ベクターであって、該ベクターが、
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質プレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項３１】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３２】
生理学的に許容される担体及び請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項３３】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項３４】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項３５】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３６】
該核酸分子が３’スプライス領域の一又はそれ以上の面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３７】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３８】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３９】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項４０】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項４１】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項４２】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４３】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞内で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む、上記方法。
【請求項４４】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞内で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む、
上記方法。
【請求項４５】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
キメラＲＮＡ分子が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項４７】
キメラＲＮＡ分子がヌクレオチド配列タグを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該３’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項４９】
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該５’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項５０】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５１】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５２】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５３】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５４】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５５】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５６】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５７】
真核発現ベクターであって、該ベクターが
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項５８】
真核ベクターであって、該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現する、
上記ベクター。
【請求項５９】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６０】
組換え発現ベクターを含む発現ライブラリーであって、
該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記発現ライブラリー。
【請求項６１】
組換え発現ベクターを含む発現ライブラリーであって、
該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記発現ライブラリー。
【請求項６２】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項６０に記載の発現ライブラリー。
【請求項６３】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへスプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項５８又は５９に記載のベクター。
【請求項６４】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへスプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項５８又は５９に記載のベクター。
【請求項６５】
ａ）ターゲット結合ドメインを含む核酸分子を、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へトランス−スプライスされ、キメラｍＲＮＡを生成する条件下で、接触させ；ここで該ターゲット結合ドメインはターゲットプレ−ｍＲＮＡ分子への結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）該キメラｍＲＮＡ分子を増幅させ；
ｃ）増幅された分子を選択的に精製し；そして、
ｄ）増幅された分子のヌクレオチド配列を決定し、それによりイントロン−エキソン境界を同定すること、
を含むプレ−ｍＲＮＡ分子中のエキソン−イントロン境界をマッピングする方法。
【請求項６６】
ａ）ペプチドタグ又はマーカーをコードする配列及びターゲット結合ドメインを含む核酸分子を、
プレ−ｍＲＮＡ分子と、
該プレ−トランス−スプライシング分子の一部が該ターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされ、キメラｍＲＮＡを生成する条件下で、
接触させ；
ここで該ターゲット結合ドメインはランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）融合ポリペプチドをアフィニティー精製し；そして、
ｃ）融合タンパク質のペプチド配列を決定すること、
を含む、細胞中に発現されるタンパク質を同定する方法。
【請求項６７】
融合ポリペプチドがＨＩＳポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
融合ポリペプチドがＦＬＡＧポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
融合ポリペプチドがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。
【請求項１】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項２】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）該３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項３】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項４】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
該核酸分子が３’スプライス領域の一又はそれ以上の面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補的な、三重らせん形成の、又はタンパク質−核酸の、相互作用によって介される、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能な嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレーターポリペプチドをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質のエキソン１０をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項１０】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項１１】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項１２】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞中で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む、上記方法。
【請求項１４】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞中で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む、上記方法。
【請求項１５】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞内で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）該細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む、
上記方法。
【請求項１６】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】
キメラＲＮＡ分子が翻訳可能なタンパク質をコードする配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該３’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
該細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項１９】
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；
ｄ）該３’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；及び
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、を含み、
該細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項２０】
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータープレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；
ｄ）該５’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；及び
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該細胞内の核スプライス成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２２】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２３】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能な嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレーターポリペプチドをコードする、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２４】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質のエキソン１０をコードする、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２５】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２６】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能な嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレーターポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２７】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質のエキソン１０をコードする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２８】
真核発現ベクターであって、該ベクターが
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質プレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項２９】
真核発現ベクターであって、該ベクターが
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質プレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）３’スプライス受容部位；
ｃ）３’スプライス受容部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項３０】
真核発現ベクターであって、該ベクターが、
ａ）細胞内で発現される嚢胞性線維症膜貫通伝導レギュレータータンパク質プレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合をターゲットとする、一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項３１】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３２】
生理学的に許容される担体及び請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項３３】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項３４】
核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が：
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項３５】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３６】
該核酸分子が３’スプライス領域の一又はそれ以上の面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３７】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３８】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３９】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項４０】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項４１】
組換えベクターを含む細胞であって、該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記細胞。
【請求項４２】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４３】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞内で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む、上記方法。
【請求項４４】
キメラＲＮＡ分子を細胞中で製造する方法であって：
該細胞内で発現されるターゲットプレ−ｍＲＮＡを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされて該細胞内にキメラＲＮＡを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む、
上記方法。
【請求項４５】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
キメラＲＮＡ分子が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項４７】
キメラＲＮＡ分子がヌクレオチド配列タグを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該３’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含み、
細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項４９】
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該５’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列；
ｅ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。
【請求項５０】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５１】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５２】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５３】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。
【請求項５４】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５５】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５６】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５７】
真核発現ベクターであって、該ベクターが
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。
【請求項５８】
真核ベクターであって、該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現する、
上記ベクター。
【請求項５９】
該核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項５７に記載のベクター。
【請求項６０】
組換え発現ベクターを含む発現ライブラリーであって、
該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）ブランチポイント、ピリミジン域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
ｃ）該３’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列；
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記発現ライブラリー。
【請求項６１】
組換え発現ベクターを含む発現ライブラリーであって、
該ベクターが、
ａ）一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン；ここで該ターゲット結合ドメインは該細胞内で発現されるプレ−ｍＲＮＡへの結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）５’スプライス部位；
ｃ）該５’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域；及び
ｄ）ターゲットプレ−ｍＲＮＡへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記発現ライブラリー。
【請求項６２】
核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項６０に記載の発現ライブラリー。
【請求項６３】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへスプライスされるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項５８又は５９に記載のベクター。
【請求項６４】
該ターゲットプレ−ｍＲＮＡへスプライスされるヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項５８又は５９に記載のベクター。
【請求項６５】
ａ）ターゲット結合ドメインを含む核酸分子を、
該核酸分子の一部がターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へトランス−スプライスされ、キメラｍＲＮＡを生成する条件下で、接触させ；ここで該ターゲット結合ドメインはターゲットプレ−ｍＲＮＡ分子への結合をターゲットとするランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）該キメラｍＲＮＡ分子を増幅させ；
ｃ）増幅された分子を選択的に精製し；そして、
ｄ）増幅された分子のヌクレオチド配列を決定し、それによりイントロン−エキソン境界を同定すること、
を含むプレ−ｍＲＮＡ分子中のエキソン−イントロン境界をマッピングする方法。
【請求項６６】
ａ）ペプチドタグ又はマーカーをコードする配列及びターゲット結合ドメインを含む核酸分子を、
プレ−ｍＲＮＡ分子と、
該プレ−トランス−スプライシング分子の一部が該ターゲットプレ−ｍＲＮＡの一部へとトランス−スプライスされ、キメラｍＲＮＡを生成する条件下で、
接触させ；
ここで該ターゲット結合ドメインはランダムヌクレオチド配列である；
ｂ）融合ポリペプチドをアフィニティー精製し；そして、
ｃ）融合タンパク質のペプチド配列を決定すること、
を含む、細胞中に発現されるタンパク質を同定する方法。
【請求項６７】
融合ポリペプチドがＨＩＳポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
融合ポリペプチドがＦＬＡＧポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
融合ポリペプチドがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００７−３１２７８０（Ｐ２００７−３１２７８０Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７７１１５（Ｐ２００７−１７７１１５）
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【分割の表示】特願２０００−５６５１６８（Ｐ２０００−５６５１６８）の分割
【原出願日】平成１１年８月１２日（１９９９．８．１２）
【出願人】（５０１１０８２４５）イントロン ホールディングス、エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【分割の表示】特願２０００−５６５１６８（Ｐ２０００−５６５１６８）の分割
【原出願日】平成１１年８月１２日（１９９９．８．１２）
【出願人】（５０１１０８２４５）イントロン ホールディングス、エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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