トリプトファン及びニコチンアミドのインビボでのレベルの増大方法
芳香族アミノ酸またはニコチンアミドの前駆物質及びその使用に関する方法を含む、当該芳香族アミノ酸及び組成物の生合成の増大に関する新規な方法である。さらに、抗酸化治療の代わり（surrogate）または予測の判断材料（predictor）として、タンパク質チオールを測定することによって、抗酸化治療の治療効果を観察する方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年７月１１日に出願した米国仮出願第６０／８１９，５２４の優先権を主張する。本願は、２００６年３月１６日に出願した国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９３９４に関連しており、その全体が本願に引用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、芳香族アミノ酸、及び当該芳香族アミノ酸またはニコチンアミドの前駆物質を含有する組成物の生合成の増大方法、並びにその使用方法に関する。さらに、抗酸化治療の代わり（surrogate）または予測の判断材料（predictor）として、血清タンパク質のチオール量を測定することによって、このような抗酸化治療の治療効果を観察する方法が開示されている。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
キャッツクロー（Uncaria tomentosa）（以下、「キャッツクロー」と称する）の治療効果は、広く知られている。アシャニカ族のインディオ（Ashanika Indians）は、感染症, 炎症性疾患や精神状態でさえも制御する助けとするために、水に混ぜたキャッツクロー抽出物を使用している。治療効果を向上させるために、キャッツクローを、フチュフアシ・バーク（huchuhuasi bark）、カプサイチン、ゴボウ、ヒメスイバまたはスリッペリーエルム・バーク（slippery elm bark）のような他の原料と混ぜてもよい。キャッツクロー中の活性原料は、プロアントシアニジン、キノビン酸（quinovic acids）及びそれらのグリコシド、オキシインドール アルカロイド（プテリジン、イソプテリジン、ウンカリン（uncarine）、ミトラフィリン（mitraphylline）、イソミトラフィリン）、Ｎ−オキシド、ライノコフィリン（rhynocophylline）、カルボリンアルカロイド、ヒルスチン（hirustine）、Ｎ−オキシド トリテルペン、ポリフェノール、フィトステロール（スチグマステロール及びカンペステロール）を含む（Senatore, A., et al., Phytochemical and Biological Study of Uncaria tomentos, Boll Soc Ital Biol Sper. 1989; 65 (6):517-20 ))。
【０００４】
本発明者であるＲｏｎａｌｄ Ｗ Ｐｅｒｏ博士は、キャッツクローの熱水抽出物の主要な生理活性成分として、キナ酸のアナログを最初に同定した（Sheng, Y., Akesson, C , Holmgren, K., Bryngelsson, C , Giampapa, V., Pero, R .W., ャッツクローの水抽出物活性原料の活性原料。キナ酸の同定及び効果。Journal of Ethanopharmacology 96(3): 577-584, 2005）。米国特許第６，０３９，９４９号、６，２３８，６７５号及び６，３６１，８０５号明細書は、参照により本願に引用され、高い程度の抗腫瘍、炎症及び免疫促進活性を有する植物種であるキャッツクローの水可溶性抽出物を記載している。当該特許に記載されたキャッツクロー抽出物の調製は、様々な治療上の使用と関連し、Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）として市販されているものを利用できる。Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）は、キャッツクローの１００％生物学的に利用可能な熱水抽出物である。同様の製剤も、ＡＣ−１１（商標）及びＰｒｏｔｅｃｔａｇｅｎ（商標）のような様々な商標名のものを利用可能である。
【０００５】
米国の公開特許出願第２００５−０１７６８２５号は、Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）のインビボでの活性原料として、キナ酸及びキナ酸塩の分離、精製及び同定に関する方法を開示する。この特許出願も、免疫機構と関連した疾患を処置し、炎症反応を阻害し、炎症反応と関連した疾患を処置し、ＤＮＡ修復過程を促進し、抗腫瘍反応を促進し、腫瘍を形成し成長させる反応と関連した疾患を処置するための、キナ酸並びにその塩及びキレート物質の使用を開示する。
【０００６】
他の公知のキナ酸及びそのアナログの医学的な使用は、肌のしわの処置を開示している米国特許第５，６５６，６６５号及び米国特許第５，５８９，５０５号明細書、並びに神経アミダーゼ（neuroamidase）の阻害物質として風邪の処置を開示している米国特許第６，１１１，１３２号及び米国特許第６，２２５，３４１号明細書がある。
【０００７】
胃腸管（GI tract）の微生物相は、安息香酸を介して、キナ酸を馬尿酸まで代謝しうる、機能的なシキミ酸経路を有する（Adamson, R .H., Bridges, J .W., Evans, M .E., Williams, R .T., インビボでのキナ酸の芳香族化における種差と腸バクテリアの役割、Biochem Jour 116:437-433, 1970）。紅茶（black tea）及び緑茶双方の消費により、馬尿酸の尿での排泄量が増加する。キナ酸代謝（すなわち馬尿酸）についての唯一知られた過去に実証された指標は、動物によって大きく変動し、この代謝物質を、キナ酸の信頼できない定量的評価にする。キナ酸は腸内で馬尿酸へと代謝されるが、馬尿酸の主要な代謝源は、肝臓であると考えられている（Krahenbuhl, L., Reichen, J., Talos, C , Krahenb uhl, S., 安息香酸代謝は、長期に亘って肝外胆汁うっ滞（extrahepatic cholestasis）するラットの肝臓のミトコンドリアの機能を反映する。Hepatology 25 (2) : 259-508, 1997）。
【０００８】
上述の通り、高等動物は、一般に芳香族アミノ酸を合成できないことが明らかであり、このようなアミノ酸に対するアミノ酸の必要量を食事に頼らなければならない。したがって、高等動物における芳香族アミノ酸の所望の血清濃度を最適化しうる、新たな治療のアプローチが従来より求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、本願で特許請求される化合物の経口投与に続く、ヒトの抹消循環においてキナ酸上昇がないため、本発明の化合物は、胃腸（ＧＩ）管におけるトリプトファン及びニコチンアミドの生産に対する効果的な合成系の前駆物質であるということを見出した。シキミ酸経路を介した、上昇したトリプトファン及びニコチンアミドのレベルは、抗酸化、セロトニン媒介、ドーパミン媒介及びＮＡＤ媒介の活性のような健康上の利点に関して広範なスペクトルを媒介する。
【００１０】
本発明の一態様は、下記の式を有する芳香族アミノ酸に対する前駆物質に向けられている：
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、Ａは、
【００１３】
【化２】
【００１４】
【化３】
【００１５】
【化４】
【００１６】
【化５】
【００１７】
【化６】
【００１８】
並びにそれらのアニオン類、エステル類よりなる群から選択され、；その際、ＲはＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｘは、塩または水酸化物またはアミンを形成しうる１価、２価、３価のアニオンよりなる群から選択され、「ｎ」は整数または有理数であり、その際、ｌ＜ｎ＝１０である。
【００１９】
好ましい実施形態において、芳香族アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びフェニレフェデリン（phenylephederine）よりなる群から選択される。
【００２０】
本発明の他の態様は、（ａ）治療上効果的な量の、上記化合物(Ｉ)；（ＩＩ）；（ＩＩＩ）；（ＩＶ）及び（Ｖ）；
その際、ＲはＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキル；並びにそれらのアニオン類及びエステル類であり、及び
【００２１】
【化７】
【００２２】
その際、Ａ、Ｘ及びｎは上記と同様に規定される、よりなる群から選択される化合物；並びに、
（ｂ）医学的に許容可能なビヒクル、を含む組成物に向けられている。
【００２３】
更なる態様において、組成物は、治療上効果的な量の主要な抗酸化剤を含む。一実施形態において、主要な抗酸化剤はフラボノイドである。
【００２４】
本発明の他の態様は、以下のステップを含む、芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病状態に対する効果的な抗酸化剤治療の方法を同定するための動物モデルの手法（methodology）に向けられている。
【００２５】
（ａ）マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル及びヒトよりなる群から選択される哺乳類を得ること
（ｂ）（尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル）／（組織または血液中のチオールのレベル）という、当該哺乳類についての基準値の比率を決定すること、
（ｃ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物を前記哺乳類に投与すること、
（ｄ）抗酸化処置のサイクル後の当該哺乳類について、尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル／組織または血液中のレベルという比率に対する値を決定すること、
（ｅ）ステップ（ｂ）及び（ｄ）で得られる値を比較すること、その際、基準値を超える増大は、前記治療方法が効果的であることを示す。
【００２６】
本発明の他の態様は、以下を含む、必要な患者に対する、インビボでの酸化的ストレスを試験する方法に向けられている。
【００２７】
（ａ）芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物で前記患者を処置すること、
（ｂ）当該患者に由来するタンパク質チオールのサンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプル中の前記タンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルを測定すること、
（ｅ）（ｄ）／（ｃ）で表されるステップ（ｄ）で得られたトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルに関連して、ステップ（ｃ）のサンプル中の前記チオールのレベルを分析すること、その際、当該比率の値の増大は、ＤＮＡ修復についての低い酸化的ストレス及びダウンレギュレーションに関する予測の判断材料（predictor）である。
【００２８】
本発明の他の態様は、以下を含む、酸化的ストレスの増大したレベルを特徴とする疾病に対する、患者の感受性を究明する方法に向けられている。
【００２９】
（ａ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物で前記患者を処置すること、
（ｂ）タンパク質チオールのレベルを含む、当該患者に由来する体サンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプルについての前記タンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルを測定すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）におけるトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルに対する、ステップ（ｃ）のサンプル中の前記チオールのレベルを分析すること、その際、当該疾病を患った人々から得られた所定の正規化値（normalized value）（ｄ）／（ｃ）に対し比較的高い値は、当該個体のＤＮＡ修復に関する酸化的ストレス及びダウンレギュレーションについての予測の判断材料（predictor）である。
【００３０】
本発明の他の態様は、芳香族アミノ酸の前駆物質及び医学的に許容可能なビヒクルを投与することを含む、血清の芳香族アミノ酸のレベルの欠如を特徴とする状態を処置する方法に向けられている。本発明の本態様では、用いられた組成物は経口投与が好ましく、様々なタイプの食品、すなわちスナック、肉製品だけでなく飲料とも結合できる。
【００３１】
本発明の他の態様は、芳香族アミノ酸を必要とする個体における芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病を進行させる危険性を決定する方法に向けられており、以下のステップを含む：
（ａ）個体の血清チオールのレベル及び尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたは両方の組み合わせのレベルを得ること
（ｂ）当該個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたは両方の組み合わせ／血清チオールの比率の値を規定すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）の値を、当該疾病に苦しむ人々から得られた同じもの（the same）についての所定の正規化（normalized）レベルに対して比較すること、その際、当該比較は、当該個体における、酸化的ストレスに対する基準値を示す。
【００３２】
本手法はさらに、芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物、並びに／または抗酸化剤を、処置サイクル中、前記個体に投与するステップ（ｄ）、処置サイクルの終了後に、前記個体の血清タンパク質チオールのレベル及び尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿酸、または全てのレベルを得るステップ（ｅ）、並びに当該処置サイクル後の、前記個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたはそれらの組み合わせ／血清タンパク質チオールの比率の値を規定するステップ（ｆ）を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】単一の高用量のキナ酸６０００ｍｇを蒸留水に溶かして経口投与し、その後、１５分間以内で３０ｍｌの血清サンプルを示した回数で収集するという、ファーマコキネティクスを図示する。その主要な代謝物質である馬尿酸と相関のある血清のキナ酸の測定は、原料及び手段の欄（Material and Procedures section）に記載されているように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。取り込みの最長時間を視覚化するために、データは、最大の取り込みのパーセントとして表した：１２．５時間で（４４００μｇ／ｍｌ）、キナ酸＝１００％；７時間で（５５μｇ／ｍｌ）、馬尿酸＝１００％。
【図２】３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で３６日間処置し、その後、さらに８月間何らの処置も行わなかった後の主ＲＰの尿のプロファイルを図示する。尿の馬尿及びキナ酸のレベル（ｍＭ）は、サンプリングの日数で評価した。
【図３】２００６年５月１日〜３１日の期間中、１５００ ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で処置し、その後、さらに８月間何らの処置も行わなかった後の被験者ＨＬの尿のプロファイルを図示する。馬尿及びキナ酸のレベル（ｍＭ）は、サンプリングの日数で評価した。
【図４】１５００または３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で３６日間処置し、その後、さらに３０日間以上続行（followed-up）（処置なし）した後の、被験者ＨＬ及び被験者ＲＰにおける馬尿酸の血清レベルを図示する。かかる期間中の総サンプリングポイント（Total sampling points）は：被験者ＲＰ：ｎ＝１２、被験者ＨＬ：ｎ＝１２、ｐ＜０．０１である。
【図５】馬尿酸、すなわちキナ酸の主要な公知の代謝物質の尿中レベルの、未処置の個体、並びに１５００ｍｇ／日及び３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で３０日間処置し、それから処置後直ぐ、さらに８月間続行した被験者におけるキナ酸の尿中レベルへの依存性を図示する。これらのテータは、処置区（ｎ＝３６）及びコントロール（ｎ＝９）の双方を含む、総サンプル（ｎ＝４５）の直線回帰と統計学的に解析される。ここで、同時に同じ被験者における尿から収集されたキナ酸値に対する馬尿酸値より、ｙ＝０．０１５７ｘ＋０．１８３９、ｒ＝０．６０、ｐ＜０．００１という式が導出された。
【図６】経口投与前の８３日を超える期間中、３０００ｍｇ／日で３６日間、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を被験者ＨＬに関して測定し、その後、未処置で８月間続行した、前記個体の基準（baseline）の血清タンパク質チオールの評価を図示する。
【図７】経口投与前に８３日を超える期間中、１５００ｍｇ／日で３６日間、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を被験者ＨＬに関して測定し、その後、未処置で８月間続行した、前記個体基準の血清タンパク質チオールの評価を図示する。
【図８】Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を３７日間経口投与した後、さらに３２日の乾燥期間をかけて、血清タンパク質のチオールの抗酸化パラメータによって算出した場合の、実験の参加者のインビボでの抗酸化状態を促進させた旨を図示する。Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の用量は共に、ステューデント ｔ−検定（ｐ＜０．００１）によって解析された該当基準値とは統計学的に異なっている。
【図９】Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を３６日間、３０００ｍｇ／日で処置し、その後、さらに未処置で８月間続行した、被験者ＲＰの尿のプロファイルを図示する。尿のトリプトファン及びニコチンアミドのレベル(μＭ）は、サンプリング日数で評価した。
【図１０】Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）を３６日間、１５００ｍｇ／日で処置し、その後、さらに未処置で８月間続行した、被験者ＨＬの尿のプロファイルを図示する。尿のトリプトファン及びニコチンアミドのレベル（μＭ）は、サンプリング日数で評価した。
【図１１】４ｍｇ／ｍｌ Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）または２ｍｇ／ｍｌキナ酸のいずれかで２１日処置した後の血液細胞及び血清トリプトファンに関する、インビボでの動物の研究の評価を図示する。馬尿酸（＜０．０２μｇ／ｍｌ）及びキナ酸（＜２ｍｇ／ｍｌ）のレベルも、同時に決定されるが、キナ酸は、マウスの飲料水中１ｍｇ／ｍｌまたは約５００ｍｇ／ｋｇで投与された場合、ＨＰＬＣの検出限界以下であったことが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、シキミ酸経路中で効果的な量の前記前駆物質を投与することによって、血清及び／または尿及び／または哺乳類の生物組織中の、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンのような芳香族アミノ酸、もしくはビタミン前駆物質であるニコチンアミドのレベルの増大を提供する。哺乳類の体中の血清及び／または生体応答性組織での、トリプトファン及び／またはニコチンアミドの上昇したレベルは、セロトニン、ドーパミン、ＮＡＤを順々に上昇しうるか、または哺乳類の体中のＤＮＡ修復のレベルを促進する。
【００３５】
高等動物では、芳香族アミノ酸は、動物性や植物性のタンパク質のような食生活の源から一般に得られる。本発明者らは、芳香族アミノ酸が経路、すなわちシキミ酸塩（またはシキミ酸）経路として一般に知られている経路を通じて、胃腸の細菌フローラで合成されうることを見出した。例えば、大腸菌のような胃腸の細菌は、エリトロース４−リン酸をシキミ酸塩、コリスミ酸、そして最終的にはフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンまでに変換できる。
【００３６】
一実施形態では、胃腸（ＧＩ）管内の芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、シキミ酸経路を促進して、当該前駆物質を、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンのような芳香族アミノ酸、またはニコチンアミドのような他の必須ビタミンに変換する。ニコチンアミドはトリプトファンを介して合成されるということが以前から報告されている。（Satyanarayana, U , Narasinga, U., Rao, B .S., ラットのトリプトファン−ＮＡＤ経路の幾つかの鍵となる酵素における、食生活の制限の効果。Jour. Nutrition 107 (12): 2213-2218, 1977; Satyanarayana, U., Rao, B .S., トリプトファン−ＮＡＤ経路の幾つかの鍵となる酵素における、食生活上のタンパク質レベルの効果。Brit. Jour. Nutr. 38(1): 39-45, 1977を参照せよ）。芳香族アミノ酸及びビタミンは、セロトニン、ドーパミンにより制御される細胞の過程（cell processes）を媒介し、ＤＮＡ修復において顕著な役割も果たす。例えば、ＮＡＤは、ＤＮＡの修復過程を含む体中、５００を超える生化学的反応において重要な共通の因子である（Okamoto, H., Ishikawa, A., Yoshitake, Y . et al ., ニコチンアミドのカタボライトについてのヒトの尿の排泄における日周変動：ニコチンアミドの代謝に関するストレスの効果。Amer . Jour. Clinical Nutrition 77(2): 406-410, 2003）。
【００３７】
鍵となる生化学的な出来事は、これまで開示されていないが、ヒトのキナ酸のキレート物質２５ｍｇ／ｋｇという効果的な用量で、ＨＰＬＣ法の検出限界で、ヒトの血清中にキナ酸は発見されなかった（１ｍｇ／ｋｇ；すなわち、効果的な用量のわずか４％）。本発明者らは、このように、あらゆる理論によっても決定的でなく、キナ酸自体が直接作用する生理活性原料ではないと確信している。
【００３８】
本願で使用されているように、「キレート物質」という用語は、遊離酸のイオン（例えば、アンモニウムイオンまたは他の医学的に許容可能なイオン）に対する比率を包含し、その際、前記比率における上記で示されたイオンは、総数、例えば、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５及び１：１．６だけでなく、それらの間の値、例えば、１：１．５４（アンモニウムイオンで飽和したキナ酸）ではない。だが、このような状況特に溶液のｐＨに依存して、キレート物質の比率は様々である。本願で論じられているように、ほぼ１：１．５４という比率は好ましいが、本発明のキナ酸のキレート物質の組成物は、１：１．５４というキナ酸のアンモニウムイオンに対する比率を有するものに決して制限されることはない。
【００３９】
自然に発生するポリヒドロキシル化及びポリカルボキシル化した有機酸の、塩及びキレート物質に関する決定を、表１に示している。実験上のモル比率は、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムの水酸化物で、遊離のプロトン化有機酸（Ｈ＋）をｐＨ＝７．５まで中和することから計算した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
遊離酸（Ｈ＋）の形態のキナ酸または（ｉｎ ｓｉｔｕでキナ酸を放出する）キナ酸エステルの加水分解によって得られたキナ酸は、過剰なアンモニアで処置され（例えば１０％のアンモニアで、例えば２時間で)、効果的なインビボとして本願に記載され、特徴付けられているように、キナ酸アンモニウムキレートを発生させる。
【００４２】
本発明は、植物原料中のキナ酸の実質上あらゆる形態をキナ酸のキレート物質、特にキナ酸アンモニウムキレート、及び増大した生物学的効果及び減少した毒性を示す、向上した医学的な組成物についての関連した生産へと変換する過程にも進む。本発明の特に好ましい組成物は、本願に記載される生物学的な活性特性を示す少なくとも１つのキナ酸のキレート物質の相当量または少なくとも効果的な量を含む。
【００４３】
本願で使用されているように、相当量は、キナ酸のキレート物質は、組成物に存在するキナ酸の全ての形態の５％超、好ましくは１５％超、より好ましくは２５％超を示す組成物を意味する。好ましくは、一以上のキナ酸のキレート物質は、前記組成物に存在するキナ酸の主要な形態である。本願で使用されているように、主要な形態は、キナ酸のキレート物質が前記組成物に存在する全ての形態のキナ酸のうち５０％超、好ましくは６０％超、そして最も好ましくは７０％超を示す組成物を意味する。
【００４４】
組成物は、一以上のキナ酸のキレート物質が、前記組成物に存在するキナ酸の実質的に主要な形態であることが好ましい。本願で使用されているように、実質的に主要な形態は、キナ酸のキレート物質が前記組成物に存在するキナ酸の全ての形態のうち、５０％超、好ましくは６０％超、最も好ましくは７０％超を示す組成物に言及している。
【００４５】
組成物は、例えば、キナ酸アンモニウムキレートが、前記組成物に存在する実質的に主要な形態のキナ酸であるか、またはキナ酸アンモニウムキレートが前記組成物に実質的に存在するキナ酸の唯一の形態であることが好ましい。実質的に存在する唯一の形態としてのキナ酸アンモニウムキレートは、本願で使用されているように、キナ酸のキレート物質が前記組成物に存在するキナ酸の全ての形態のうち、９０％超、好ましくは９５％超、そして最も好ましくは９９％超を示す組成物に言及している。組成物は本願に記載されており、例えば、キナ酸アンモニウムキレートは、前記組成物中のキナ酸の実質的に唯一の形態として存在している。
【００４６】
一実施形態の方法では、投与しない（基準の）レベルの少なくとも３０％まで、またはセロトニン、ドーパミン及びＮＡＤの生産を顕著に促進するか、あるいは既存のバックグラウンドのレベルを超えてＤＮＡ修復を促進するレベルまで、キナ酸、シキミ酸及び／またはコリスミ酸塩、それらのキレート物質のような芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、典型的には、哺乳類中の血清のトリプトファン及びニコチンアミドの濃度を増大させうる量で投与される。
【００４７】
芳香族アミノ酸は、セロトニン、ドーパミン、ＮＡＤによって制御される細胞過程、並びに潜在的な抗酸化効果を順次与えうるＤＮＡ修復を媒介する。例えば、ＮＡＤは、ＤＮＡ修復を含むがこれに制限されない、５００を超える体中の生化学的反応中の重要な共通の因子である（Okamoto, H., Ishikawa, A., Yoshitake, Y., et al., ニコチンアミドのカタボライトに関するヒトの尿の排泄中の日周変動：ニコチンアミドの代謝におけるストレスの効果。Amer . Jour. Clinical Nutrition 77(2): 406- 410, 2003）。
【００４８】
典型的には、キナ酸、シキミ酸及び／またはコリスミ酸塩のキレート物質を含む芳香族アミノ酸に対する前駆物質が、ヒトに、飲料、カプセル、錠剤の形態で、５００ｍｇ／日から５０００ｍｇ／日まで、または約６．７から６６．７ｍｇ／ｋｇというシステマティックな用量で投与される。好ましい投薬形態は、液状（例えば、飲料）で経口投与されるか、カプセルまたは錠剤、あるいは他の食品または飲料とあらかじめ組み合わせたような製剤として、乾燥形態で経口投与される。
【００４９】
本発明は、さらに、効果的な量のキナ酸のキレート物質、好ましくはキナ酸のアンモニウムイオンに対する約１：１．５４という比率を有するアンモニウムのキレート物質を含む、分離された薬剤組成物の製造方法にも関する。
【００５０】
芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、下記式
【００５１】
【化８】
【００５２】
を有し、その際、Ｘは、塩または水酸化物またはアミンを形成しうる１価、２価、３価のアニオンよりなる群から選択され、「ｎ」は、整数または有理数であり、その際、ｌ＜ｎ＝１０である。Ａは、本願で前から記載しているが、（Ｉ）−（Ｖ）構造、それらのアニオン、エステルを有し、その際、Ｒは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルである。ＲがＨである場合が好ましい。前記基であるＸは、例えば、塩化アンモニウムまたは水酸化アンモニウム、塩化カリウムまたは水酸化カリウム物、塩化マグネシウムまたは水酸化マグネシウム、塩化亜鉛または水酸化亜鉛、塩化カルシウムもしくは水酸化カルシウムまたはそれらの医学的に許容可能な塩でありうる。このような基（ここでは、Ａ−（Ｘ）ｎ）の例は、特に制限されることはないが、例えば、キナ酸アンモニウムキレート、キナ酸カリウムのキレート物質、キナ酸亜鉛塩のキレート物質、キナ酸リチウム塩のキレート物質、キナ酸カルシウムのキレート物質を含む。
【００５３】
他の実施形態では、前記基であるＸは、ヒスチジン塩、リジン塩のようなアミノ酸でありうる。このような基（ここでは、Ａ−（Ｘ）ｎ）の例は、キナ酸のヒスチジン塩／キレート物質及びキナ酸のリジン塩／キレート物質を含む。さらに他の実施形態では、前記基であるＸは、アミノエチルエタノールアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、イソプロパノールアミンのようなアミン、またはＥＤＴＡまたはＤＥＴＡのようなキレート剤でありうる。本分野に熟練した人間に知られている、医学的に許容可能なアミンもしくはアルカノールアミン及び／またはキレート剤は使用できる。
【００５４】
一実施形態では、芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、キナ酸誘導体であり得、前記キナ酸誘導体は(Ｉ)−（Ｖ）構造へと導きうる。他の実施形態では、前記前駆物質は、ラセミ化合物の混合物またはそれらの光学異性体でありうる。
【００５５】
血清チオールは、酸化的ストレス及びＤＮＡ修復のキャパシティーの代わり（surrogate）の評価としてインビボで使用され、Ｐｅｒｏによる米国特許第５，９２５，５７１号で開示されているように、総血清タンパク質のチオールとしてたいていの場合評価される。我々は、８０％硫酸アンモニウムで沈殿した血清チオールの副分画を使用し、かかる評価は、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の抗酸化効果を示す目的としては満足しうるものである（Banne, A., Amiri, A., Pero, R .W., 活発な疾病の診断による、患者での血清チオールの減少レベル。JAAM 6(4): 325-32, 2004; Pero, R .W., Giampapa, V., Vojdani, A., キャッツクローの抽出を促進するＤＮＡ修復の付加の有無による、広範なスペクトルの抗加齢の栄養補助剤についての比較。Anti-aging Med. 5(2): 345-353, 2002; Pero, R .W., Hoppe, C , Sheng, Y., ＤＮＡ修復の代わり（surrogate）の評価としての血清チオールは、哺乳類の寿命に関連する。Jour Anti-aging Med 3(3): 241-249, 2000; Pero, R .W., Amiri, A., Welther, M., Rich, M., 栄養補助剤を増強させるＤＮＡ修復及び免疫の組み合わせに関する、製剤及び医学的評価。 Phytomedicine 12(4): 255, 2005）を参照せよ）。キナ酸のキレート物質は、ＰｅｒｏによるＷＯ２００６／１０１９２２号に記載されており、参照により、全体として本願に引用される。
【００５６】
一実施形態では、尿中ニコチンアミドもしくはトリプトファンまたはそれらの組み合わせ（すなわち、ニコチンアミド＋トリプトファン)のレベルの、血清タンパク質チオールに対する比率を得ることは、このような干渉（例えば、血清チオール／トリプトファンまたはニコチンアミドの比率を減少させる、キナ酸アンモニウムキレート）または疾病状態（すなわち、血清チオール／トリプトファンまたはニコチンアミドの比率の増大）の存在より、当業者に、抗酸化治療及び他の健康上の利益に関する効果を予測させるものである。
【００５７】
本発明者らは、キナ酸は抹消循環に取り入れられないため、キナ酸それ自体がインビボで有利な効果を提供しないということを本願で決定付けている（図１を参照）。むしろ、望ましい臨床活性を与えるのは、シキミ酸経路への前駆物質の形態である（図２〜３を参照）。
【００５８】
本願の発明者らは、キナ酸誘導体、シキミ酸及び／またはコリスミ酸塩を含む芳香族アミノ酸の前駆物質は、トリプトファンまたはニコチンアミドの血清レベルに関する効果によって示されているように、活性を有することを最近になって見出した。本発明者らは、キナ酸のキレート物質は、いかなる理論によっても明らかにはなっていないが、促進した生理活性を示し、芳香族アミノ酸の前駆物質のシキミ酸経路への導入に起因した、トリプトファンの上昇レベルに寄与するものと確信している。有効な効果を媒介する抹消循環中に存在するという直接の証拠が全くないため、キナ酸自体はインビボでの生理活性化合物ではないと信じられている。
【００５９】
芳香族アミノ酸の前駆物質は、特徴的なことに、哺乳類における血清のトリプトファン及びニコチンアミドの濃度を増加させるだけの量、すなわち投与しない（基準の）１０％増のレベル、好ましくは３０％以上増加させる量で投与する。芳香族アミノ酸の前駆物質は、好ましくは、５０００ｍｇ／日まで、好ましくは１０００ｍｇ／日から５０００ｍｇ／日まで、または約１４．２から６６．７ｍｇ／ｋｇまでのシステマティックな用量でヒトに投与され、飲料、カプセル、錠剤、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射で、または皮膚に対し局所的に運ばれる。一実施形態では、（Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）として存在する）キナ酸のキレート物質が投与される。
【００６０】
好ましい用量形態は、液状（例えば、飲料）で経口投与され、または乾燥状でカプセルまたは錠剤として、あるいは食事との組み合わせで経口投与される。
【００６１】
実施形態の方法は、患者において、尿のトリプトファンもしくはニコチンアミドのいずれか、またはそれらの組み合わせ／患者の血清チオールという比率を決定することによって、インビボでの酸化的ストレスのレベルを決定することを含み、これは芳香族アミンの前駆物質の患者への投与後である。
【００６２】
他の実施形態の方法は、処置サイクルの最終後に、個体の血清タンパク質チオールのレベル、及び尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿酸またはその他任意のもののレベルを得ることを含み、及び当該処置サイクル後に、前記個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドもしくはそれらの組み合わせ／血清タンパク質チオールという比率に対する値を規定することを含む。
【００６３】
一実施形態による方法では、基準、及び当該疾病に苦しむ人々についての所定の正規化レベルが、抗酸化治療の効果を証明するのに比較される。抗酸化治療の効果は、少なくとも約２５％の増大、３０％の増大、５０％の増大、７５％の増大、１００％の増大、１５０％の増大、好ましくは約５０％を超える増大によって決定される。
【００６４】
これまで理解されることも開示されることもなかった、重要な生化学的出来事は、ヒトにおける２５ｍｇ／ｋｇという効果的な用量のキナ酸のキレート物質で、ＨＰＬＣ法の検出限界（１ｍｇ／ｋｇ；すなわち、効果的な用量のわずか４％）で、ヒトの血清中にキナ酸は全く発見されなかったということである。だが、キナ酸自体は、直接作用する生理活性原料ではないだろう。
【００６５】
当業者は、本願のキナ酸製剤の経口投与は、ヒトにおけるキナ酸レベルの顕著な上昇の原因ではないと認識するであろう。したがって、当業者は、トリプトファン及びニコチンアミドの生産に対する芳香族アミノ酸の前駆物質の作用のメカニズムは、ＧＩ管の微生物相のシキミ酸経路を介するということを認識するだろう。従来技術は、マウス及びラット中の約２５０ｍｇ／ｋｇのキナ酸が有効な効果を有したということだけをもたらしている。だが、かかる効果は、キナ酸に起因し、トリプトファンまたはニコチンアミドのような他の代謝物質には起因しないということを誤って結論付けたのである（Sheng, Y., Akesson, C , Holmgren, K., Bryngelsson, C , Giampapa, V., Pero, R .W., キャッツクローの水抽出物の活性原料：キナ酸の同定及び効果。Journal of Ethanopharmacology 96(3): 577-584; 2005）。従来技術の教示に反して、本発明者らは、有効な効果は、ヒトにおいて、５００から５０００ｍｇ／日まで、好ましくは １５００から５０００ｍｇ／日まで、または６．７から６６．７ｍｇ／ｋｇまでという用量の範囲にあるということを決定した。
【００６６】
本発明者らは、温血動物（すなわち、ヒトを含む哺乳類）に対する、芳香族アミノ酸の前駆物質の経口投与は、血清及び／または哺乳類の体中の生物学的な反応性組織における、トリプトファン及び／もしくはニコチンアミドレベルのレベルを上昇させるために使用されうることを見出している。医学的効果もキナ酸複合体及びシキミ酸／シキミ酸塩及びコリスミ酸塩、ビタミン、バイオフラボノイド、バイオフェノールのような他の抗酸化剤の混合投与によって達成されうると確信されている。本願発明の方法は、哺乳類の体中の血清、尿及び／または他の生物学的組織における、チロシンやフェニルアラニンのような芳香族アミノ酸のレベルを上昇させるために使用されうる。
【００６７】
トリプトファン及びニコチンアミドのレベルを増大させるための、芳香族酸に対する本願の前駆物質の経口投与に関する他の利点は、補給（supplementation）という本形態が正常な胃腸管の代謝によって調節され、直接のトリプトファンの補給と関連した可能性のある毒性効果を回避することである。
【００６８】
芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、キコナ バーク（chichona bark）を商業的に精製することにより得られうる。というのは、例えばシグマ（Sigma）またはアクロス（Acros）より入手できるからである。本願発明の一以上の特徴は、芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含有するか形成する食品または添加物を対象としているからである。
【００６９】
キナ酸を含有する機能的食品も、このような製品は化学合成されないため、キナ酸にとって優れた源として提供しうる。だが、本願発明の少なくとも一態様では、本願の化合物は、天然の、精製され、分離され、または合成の形態中に、このような食品の製品に対して添加され得、それは当該製品中の望ましい芳香族アミノ酸の前駆物質の含有量を最適化するためである。０．５％より高いレベルのキナ酸の含有量を有し、使用しうる食品源は、以下に制限されることはないが、キャッツクロー、プルーン、キウィ、シーバックソーン（sea buckthorn）、コーヒー、クランベリー、コケモモ、ブルーベリー、ウォートルベリー（wortleberry）、赤／黄 タマリロ、及びスルタナを含みうる。このような源は付加的な化学的改良を何ら要求しないため、より好ましい。キナ酸含有量＜０．５％を有する食品源も、使用可能である。このカテゴリー中、食品添加物であるキナ酸源の食品例は、マルメロ、サンフラワー、ネクタリン、ピーチ、西洋ナシ、プラム、ハチミツ、クロフサスグリ、セイヨウカリン、アプリコット、アスパラガス、マッシュルーム、及びグリーンオリーブである。
【００７０】
通常は、キナ酸のキレート物質のような芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、ヒトにおいて、５００ｍｇ／日から５０００ｍｇ／日または約６．７から６６．７ｍｇ／ｋｇまでというシステマティックな用量で投与され、飲料、カプセル、錠剤、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射で、または皮膚に対し局所的に運ばれる。好ましい用量形態は、液状（例えば飲料）で経口投与され、カプセルもしくは錠剤または食品の製品と組み合わせて乾燥状で経口投与される。
【００７１】
健康上の効果を媒介するトリプトファン及びニコチンアミドを上昇させることにより処置されうる健康上の疾患の例は、セロトニン、ドーパミン及びニコチンアミド／ＮＡＤ受容体により変調されたものを含む。例えば、キャッツクローの水抽出物は、潰瘍性大腸炎（炎症反応）、変形性関節症／関節痛、腫瘍細胞の成長、体重の増量、オゾン病、ＤＮＡの損傷／細胞死、化学的治療が誘導する白血球減少症、及び認知症／アルツハイマー病を阻害し、または制御した。Sandoval-Chacon, M., Thompson, J .H., Zhang, X.J., Liu, X., Mannick, E .E., Sadowicka, H., Charbonet, R .M., Clark, D .A., Miller, M.J., キャッツクローの抗炎症作用：ＮＦ−カッパＢの役割を参照せよ。消化管の薬理学的治療１２: 1279-1289, 1998; Piscoya, J., Rodriguez, Z., Bustamente, S .A., Okuhama, N.N., Miller, M.J., 膝の変形性関節症における凍結乾燥したキャッツクローの効果及び安全性：キャッツクロー（Uncaria guianensis）という種の作用メカニズム。Inflammation Res 50: 442-448, 2001. Castillo and Snow 米国特許第６，３４６，２８０号、２００２年２月発行。キャッツクロー（Uncaria tomentosa）新規の水可溶性抽出物であるＣ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）が補充される、個体中の肺炎球菌のワクチンに対する持続性反応。Phytomedicine 8(4): 267- 274, 2001; Sheng, Y., Bryngelsson, C , Pero, R .W., 促進したＤＮＡ修復、免疫機能及びＣ−ＭＥＤ−１００の減少した毒性、キャッツクロー（Uncaria tomentosa）に由来する新規の水抽出物。Journal of Ethnopharmacology 69:115-126, 2000; Sheng, Y., Li, L., Holmgren, K., Pero, R .W., ボランティア研究における、ヒトにおけるキャッツクロー（Uncaria tomentosa）の水抽出物のＤＮＡ修復促進。Phytomedicine 8(4): 275-282, 2001; Akesson, C , Pero, R .W., Ivars, F., Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）、キャッツクロー（Uncaria tomentosa）の熱水抽出物は、インビボで白血球の生存を持続する。Phytomedicine 10: 25-33, 2003; Akesson, C , Lindgren, H., Pero, R .W., Leanderson, T., Ivars, F., 細胞分裂を阻害するキャッツクロー（Uncaria tomentosa）の抽出物、及び細胞死を誘導しないＮＦ−Ｂ活性、International Immunopharmacology 3 : 1889-1900, 2003。これら文献の全てが、参照により本願に引用される。
【００７２】
さらに、精神医学及び精神変性の疾患、鬱病、憂鬱、及びペラグラ（ビタミンＢ３の欠如）は、トリプトファン及び／もしくはニコチンアミド並びに／またはセロトニンレベルを増大させるのに十分な用量、及びこのような状態の症状を改善するのに十分な用量の芳香族アミノ酸の前駆物質で、首尾よく処置しうる。
【００７３】
なかでも他の原料であるキャッツクローの抽出物の中には、様々な抗酸化剤、すなわち、フラボノイド及びポリフェノール、並びにキナ酸、アジマシリン、アクアミジン（akuammigine）、カンペステロール、カテキン、カルボキシルアルキルエステル、クロロゲン酸、シンコナイン、コリナンテイン、コリノキセイン、ダウコレステロール、エピカテキン、ハーマン、ハーステイン（hirsuteine）、イソプテロポジン、ロガン酸、リアロシド（lyaloside）、ミトラフィリン（mitraphylline）、オレアノール酸、パルミトレイン酸、プロシアニジン、プテロポジンキノブ酸グリコシド（プテロポジンキノブ酸グリコシド（pteropodine quinovic acid glycosides））、リンコフィリン、ルチン、シトステロール、スペシオフィリン（speciophylline）、スティグマステロール、ストリクトシジン、ウンカリン（uncarine）及びバクセン酸を含む他の化合物を含有しうるものもある。
【００７４】
一実施形態では、芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、ケルセチン、ルチン、クリシン、ミリセチン、ゲニステン（genisten）、ヘスペリジン、ナリンギン及びそれらの混合物よりなる群から選択される、二次的な天然の、精製された、分離されたまたは合成の抗酸化剤を含みうる。
【００７５】
一実施形態では、芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、コエンザイムＱ、ピルビン酸塩、コエンザイムＡ、ユビキノール、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、アデニン、アデノシン、ナイアシン、ニコチンアミド、カンペステロール、カテキン、クロロゲン酸、シンコナイン、コリナンテイン、コリノキセイン、ダウコレステロール、エピカテキン、ハーマン、ハーステイン（hirsuteine）、ハーステイン（hirsuteine）、イソプテロポジン、ロガン酸、リアロシド（lyaloside）、ミトラフィリン（mitraphylline）、オレアノール酸、パルミトレイン酸、プロシアニジン、プテロポジンキノブ酸グリコシド（pteropodine quinovic acid glycosides）、リンコフィリン、シトステロール、スペシオフィリン（speciophylline）、スティグマステロール、ストリクトシジン、ウンカリン（uncarine）及びバクセン酸よりなる群から選択される二次的な抗酸化剤も含みうる。
【００７６】
好ましい実施形態では、芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、ニコチンアミド、ナイアシン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、フラボノイド、ケイ皮酸もしくはその誘導体、アスコルビン酸もしくはその誘導体、トコフェラール（tocopheral）もしくはその誘導体、及びビタミンＡもしくはＤまたはそれらの誘導体よりなる群から選択される二次的な抗酸化化合物を含みうる。
【００７７】
芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、任意の治療用原料をさらに含みうる医学的に許容可能なビヒクルをさらに含有しうる。これらの任意の原料は、抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑制薬、気分高揚剤及び抗炎症剤よりなる群から選択される。
【００７８】
一実施形態では、抗腫瘍性製剤は、フッ化ピリミジン、シチジンアナログ、プリン系抗代謝物質、植物のアルカロイド、アルキル化剤、アントラセン誘導体、抗腫瘍の抗生物質、金属複合体、抗アミノリン脂質抗体、抗血管形成剤及び放射線治療剤よりなる群から選択される。
【００７９】
他の実施形態では、前記任意の原料は、スルホンアミド、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、タンパク質合成阻害物質、抗カビ剤、抗ウィルス剤、抗結核剤よりなる群から選択される抗感染剤である。
【００８０】
他の実施形態では、前記任意の原料は、三環系抗うつ薬及びセロトニンの再取り込み阻害物質よりなる群から選択される抗抑制剤である。
【００８１】
さらに他の実施形態では、前記任意の原料は、ステロイド性の抗炎症剤及び非ステロイド性の抗炎症剤よりなる群から選択される抗炎症剤でありうる。
【００８２】
他の実施形態では、分離された薬剤組成物の生産に対する好ましい過程は、約６．９から約７．６までのｐＨに達するのに十分な水溶液中で、実質的に純粋なキナ酸を水酸化アンモニウムと混合し、キナ酸のアンモニウムイオンに対する比率が約１：１．５４である、キナ酸のアンモニウムのキレート物質を生成することを含む、効果的な量のキナ酸のキレート物質を付与することを含むと記載されている。水酸化アンモニウムの溶液は、約１％及び約１０％以上の濃度で、約１５分から約４時間までの時間で、溶液が約７．４から約７．６までのｐＨに達するのに十分な量で、１００ｍｌ当たり約５ｇから約３０ｇのキナ酸を含むキナ酸の水溶液に添加される過程が好ましい。
【００８３】
本願に記載される実施形態の組成物は、例えば、約ｐＨ７から約ｐＨ７．５までの範囲で、水酸化アンモニウムを用いた水性媒体中、約１：１．６のモル比率で、実質的に純粋なＤ−キナ酸をアンモニウムのキレート物質に変換することによって生成される。約ｐＨ７．５が好ましい。だが、本願に記載されたキナ酸アンモニウムキレートは、例えば、ｐＨ６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５及び７．６並びにそれらの間の全てのｐＨの値で生成されてもよい。キナ酸のキレート物質を作る他の方法は、本願で分節された方法の精神及び範囲から逸脱しない限り、本技術分野における通常の知識を有する者によって採用されうる。
【００８４】
実施形態である薬剤または栄養の組成物は、顕著且つ効果的な量のキナ酸のアンモニウムのキレート物質を含む。一実施形態では、アンモニアで処置したキナ酸が、生理的ｐＨで、約１：１．６（実際には１：１．５４）のモル比率で実質的に純粋なアンモニウムのキレート物質を形成できるＱｕｎｉｍａｘ（商標）を使用可能である。好ましくは、Ｑｕｉｎｍａｘ（商標）は、水溶性アンモニアでｐＨ＝７．５まで中和された実質的に純粋なキナ酸である。
【実施例】
【００８５】
原料及び手段
（ａ）サンプルの収集及び調製
１２時間の絶食後のたいていの場合午前中（ａ．ｍ．）に、バキュテナーを用いたベナル（ｖｅｎａｌ）な穿刺（レッドトップ（red top）、１０ｍｌ）により血液サンプルを収集した。１０分間、１５００×ｇでの遠心分離前に、卓上（bench top）での２時間のセッティング後、血液の塊から血清を分離した。本方法で調製された血清は、通常１〜３０日以内の収集で、生化学的解析まで＋４℃で貯蔵した。尿サンプルは、処置及びフォローアップ（８か月の処置後）の期間中、Ａ．Ｍ．に、ランダムに５０ｍｌのサンプルとして収集した。尿を５０００×ｇで１５分間スピンし、１か月以内の収集で解析されるまで、上清を＋４℃で貯蔵した。第１の解析後、全てのサンプルをさらに−２００℃で貯蔵し、長期の反復測定に使用した。
【００８６】
（ｂ）試行の計画
Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の臨床評価に対する試行の計画を、ルンド（Lund）大学で２００６年４月２８日から実行した。ＨＬ及びＲＰとして保護された２人の被験者のＩＤコード（identity code）は、４週連続（３６日間）で、それぞれ１５００ｍｇ／日及び３０００ｍｇ／日のペースでＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）を受けた。血清及び尿のサンプルを、試行期間中繰り返し収集し、その後６週前（基準）、４週間の診療（処置、３６日）及び８月間のドライアウト（dry-out）（処置なし）として、解析のための集団中に統合した。
【００８７】
準拠集団（reference group）は、正常な補給なしの個体との比較で規定した。それは、キナ酸をサプリメントとして全く摂取しなかった９個体からなる；１２〜８６歳の６名の男性及び３名の女性がいた。誰も喫煙しなかったが、９名のうち６名は、評価期間の前及び最中に微量栄養素のサプリメントを摂取していた。この非臨床の薬物動態の調査プログラムは、ヒトに対するヘルシンキ宣言（the Declaration of Helsinki）のガイドラインに従って行われた。さらに、インフォームドコンセントは、本研究への使用目的のみということで血液及び尿のサンプルを得るための個々の許可を含む全ての参加者から得られ、機関の再審査の承認も得られた。
【００８８】
晒されていない（コントロール）及び栄養補給された集団の、キナ酸、馬尿酸、トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルを表３に示す。補給された、及び晒されていないコントロールの双方を含む、各集団に対する尿の平均値を、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の効果及び代謝を評価するために、ｔ−検定の統計で比較した。
【００８９】
さらに、非臨床の薬物動態の評価を含む、この基準をコントロールとする試行もまた、補給前（すなわち基準）の血清サンプルを補給中（４〜５週）までの血清サンプルと比較し、なお、前記血清サンプルは、同じ個体に対し、ドライアウトの値に対して比較された（８月間の処置なし後直ぐに）。個体の血清タンパク質チオールの値の合計は、図７及び８に示されたように、後述のように観察し、評価できる。このような手法では、これらの生化学的パラメータにおける個体間の多様性は、プロトコールから離れてランダムなものとなる。なぜなら、抗酸化試験のパラメータ（血清タンパク質チオール）における個体の多様性は、処置の開始前の個体の基準値における相違を制御することによって、計画から外れたものとなるからである。
【００９０】
【表２】
【００９１】
（ｃ）血清タンパク質チオールの、インビボでの抗酸化指標としての評価
下記の詳細な説明は、ＤＮＡ修復のキャパシティーを評価するために過去に使用された、血清タンパク質チオールのインビボでのレベルの評価を標準化（正規化）するために計画された。血液サンプルを収集し、血清を分離する場合、血清タンパク質チオールのレベルは、既存のインビボでの酸化環境と順次、平衡状態になるタンパク質構造中に存在する、チオールとジスルフィドとの間の濃度の評価である。このように、血清タンパク質チオール解析は、ＤＮＡ修復により順次調節される個体の抗酸化状態に関するインビボでの評価である。
【００９２】
（ｄ）タンパク質チオールの定量的測定に対する標準的なチオール感受性曲線の証明
比色分析剤である５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）の原液を、９．５ｍｇ／ｍｌの固体状ＤＴＮＢ、０．１ＭのＫ２ＨＰＯ４及び１７．５ｍＭｂのＥＤＴＡを用いて調製した。ｐＨを７．５に調節し、その後望ましい量まで希釈した。実際に使用できるＤＴＮＢ溶液は、ＤＴＮＢ原液を生理食塩水と１：５０で希釈することにより調製した。Ｌ−システインの溶液を調製し、標準曲線を所望のものとなるように０−１００μＭの範囲で構築した。原液を要求通りに希釈し、吸光度を９６穴の平底のマイクロタイタープレートを用いて測定した。２００μｌの実際に使用できるＤＴＮＢ溶液を伴う５０μｌのＬ−システイン溶液をウェル（穴）ごとに配置させた。濃度当たり２または３の複製を製作した。
【００９３】
ＤＴＮＢのブランク（５０μｌの生理食塩水＋２００μｌのＤＴＮＢ）を製作した。吸光度の値は、マイクロタイタープレートのスキャナ分光光度計を用いて４１２ｎｍで測定した。全ての濃度の平均を計算し、ＤＴＮＢのブランクを全ての値から差し引いた。標準的なシステイン溶液との比較による、濃度（ｘ−軸)対吸光度（ｙ−軸）のプロットを用いて、システイン濃度を決定した。
【００９４】
（ｅ）血清タンパク質チオールの測定
飽和した硫酸アンモニウム溶液を調製した。全てのサンプルに対して２００μｌの血清を用いて、血清を８００μｌの飽和した硫酸アンモニウムで沈殿させた。１．５ｍｌのバイアル中、１２，０００Ｇで１５分間、室温でサンプルを遠心分離した。バイアルの底が固体のペレットを含有する場合に、前記底を乱すことなくその上清を捨てた（約８００μｌ）。その後、ペレットを６００μｌの生理食塩水中で再懸濁した。透明な９６穴の平底のマイクロタイタープレートを解析に使用した。１の複製を下記のように調製した：（ｉ）１ウェル中、２００μlの実際に使用できるＤＴＮＢを伴う、５０μｌという一定分量の血清、及び（ｉｉ）別の１ウェル中、２００μｌの生理食塩水を伴う５０μｌの一定分量を配置させることによる、血清のバックグラウンド。これを全てのサンプルに対して３回繰り返した。ＤＴＮＢのブランクを作り（５０μｌの実際に使用できるＤＴＮＢ＋２００μｌの生理食塩水）、生理食塩水のブランク（２５０μｌの生理食塩水）も３つの複製において作った。前記ウェル中の泡を確実に避けつつ、マイクロタイタープレートのスキャナセットにおける、４１２ｎｍでの吸光度を測定した。
【００９５】
（ｆ）システインの標準曲線からの血清タンパク質チオールの評価
平均は、ＤＴＮＢのブランク及び生理食塩水のブランクを計算した。全ての複製に対して、ＤＴＮＢのブランクを全てのサンプル値から差し引いた（補正後サンプル）。また、生理食塩水のブランクを全ての血清値から差し引いた（補正後血清）。計算を示した、下記の表２に示された例を参照せよ。
【００９６】
その後、補正された血清値を補正されたサンプル値から差し引いた。この値は、４１０ｎｍでの吸光度として表された、最終の血清チオール値であった。与えられた例に示されているように、この平均値は全ての複製に対して計算され、表２で与えられる。
【００９７】
【表３】
【００９８】
表２に示された平均値は、該当するシステインのモル濃度の決定に対する標準曲線中に取り入れられた。このように、値は、システインのモル当量として表される血清チオールのモル濃度である。血清を沈殿させ、遠心分離でスピンさせた後、ペレットを６００μｌの生理食塩水中で再懸濁した。ペレットの量の増加に伴い、最終量は８００μｌとなった；２００μｌの純粋な血清を始めに分離した。これは、このように４倍希釈であった。サンプルの血清はその後、ウエルに配置され、５倍に希釈された（２５０μｌ中５０μｌ）。
【００９９】
同時に、これは２０倍希釈（４×５＝２０）であった。このように、標準曲線から読み取れるチオール値は、２０倍されるべきである。さらに、我々のデータを文書化され登録されたデータと比較できるようにするために、０．７２２という係数でかけることが必要となる。これは、過去に使用された係数に起因した。チオールは、ここではｎｍｏｌｅｓ／０．７２ｍｌで測定された。
【０１００】
ｇ）高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）の通常条件
馬尿酸、キナ酸、ニコチンアミド及びトリプトファンのＨＰＬＣ解析は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒの、ＵＶ検出器７８５Ａを備えた２００ＬＣポンプを用いて行われた。ＨＰＬＣで評価される各化合物の同定も、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）解析で独立に確かめられた。カラムは、Ｃ１８ １５０×４．６ｍｍもしくはＣ１８ ８０×４．６ｍｍのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｂｒｏｗｎｌｅｅ（Pecosphere part 第０２５８−０１９６もしくは０２５８−０１６６）のいずれか、または、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ１８ ３０×４．６ｍｍのＢｒｏｗｎｌｅｅ ｐｒｅｃｏｌｕｍｎと併せて、である。１５００〜５０００ｐｓｉで１ｍｌ／分、カラムを通って移動相を送り出した。ＵＶ検出器を、検出されている化合物に応じて２００ｎｍ〜２３０ｎｍの波長でセットした。
【０１０１】
２０μｌの注入ループを、全ての実験で使用した。データを蓄積し、ＰＥ Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ ４（Ｓ２７０−００５２）を用いて再処理した。Ｃ１８カラムを、下記の一連の溶剤：アセトニトリル：メタノール（３０：７０、ｖ／ｖ／）、１００％メタノール、メタノール：水（５０：５０）、メタノール：０．２％ＴＦＡ、及び１００％ ０．２％ＴＦＡを用いて、１ｍｌ／分、３０分の洗浄で再生した。あらゆるケースにおいて、定量評価は、分析グレードの純度の商業上利用可能な標準化合物を用いて、ピーク高さの計算に基づいた。全てのＨＰＬＣ解析に適用されるこれらの通常条件は、本研究で実行した。
【０１０２】
（ｈ）血清中のキナ酸を定量化するためのＨＰＬＣサンプル及び標準曲線の条件
０．２及び３０ｍｌの血清サンプルを血液から収集し、エタノールまたはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）のいずれかを用いて沈殿させた。洗浄（clean-up）後、上清を乾燥し（エタノール沈殿した）、または直接使用した。蒸留水に溶解したキナ酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて、標準曲線を調製し、方程式ｙ＝６０１２．８ｘ−２４６９８に従った；０〜２５ｍｇ／ｍｌの間の溶液２０μｌ注入を用いた。
【０１０３】
（ｉ）単一の高用量のキナ酸の時間の研究
６５歳の見かけでは健康なボランティアが、１５分超の時間中３００ｍｌの水で溶解した６ｇｍのキナ酸アンモニウムキレート（Ｑｕｉｎｍａｘ（商標））を飲用した。サンプルを収集し、その後、約４０ｍｌの末梢の血液（４−ｒｅｄ ｔｏｐｐｅｄ バキュテナー）は室温で凝固させ、血清サンプルを遠心分離で調製した。血清のサンプリング点は、０．７時間、１．７時間、２．７時間、３．７時間、１０．５時間、１２．５時間、２２時間、２８時間及び４４時間であった。３０ｍｌの血清サンプルを５０％エタノールで沈殿させ、気流の下で乾燥させ、同時にキナ酸及び馬尿酸のＨＰＬＣ解析を行うために、１ｍｌのメタノールで再溶解した。データより、３０ｍｌの血清にキナ酸が存在するということが分かった。この実験で使用されたカラムは、Ｃ１８ １５０×４．６ｍｍであった。前記移動相は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であった。ＵＶ検出器は２２０ｎｍでセットされ、キナ酸は２．２６分間の保持で溶出し、馬尿酸は８．３分間であった。本方法の感度は、約１／３０＝０．０３３ｍｇのキナ酸／ｍｌの血清であった。
【０１０４】
（ｊ）１日当たり１５００ｍｇ及び３０００ｍｇの反復した用量の、６週超の期間、血清で分析されたキナ酸
２名のヒトのボランティアである被験者ＨＬ（２０歳）及び被験者ＲＰ（６５歳）が、１日当たり１５００ｍｇまたは１日当たり３０００ｍｇの日用量を摂取し、並びに５月８日、５月１５日、５月１８日、５月２３日、５月２９日及び６月１日に血清サンプルを採取した。
【０１０５】
これらのサンプルは、２Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いた沈殿後に、２００μｌの血清中で、キナ酸の含有量をそれぞれ分析した。これらの実験に使用されたカラムは、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍであった。移動相は、０．２％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：メタノールが８５：１５であった。ＵＶ検出器は２１５ｎｍでセットされ、キナ酸が１．４０〜１．５分の保持時間で溶出した。この方法の検出感度は、約１ｍｇのキナ酸／ｍｌ血清、または本研究において本願で使用されているように、２１〜４２ｍｇ／ｋｇではなく、ヒトにおいて、７０ｍｇ／ｋｇという検出可能な用量であった。このように、４〜５週の期間中、反復した日々の投与後に、血清中のキナ酸レベルが蓄積するならば、このプロトコールは評価できる。
【０１０６】
（ｋ）血清中の馬尿酸のＨＰＬＣ解析
血清サンプルを＋４℃で貯蔵し、１か月以内の採取で解析した。血清サンプル（２００μｌ）は、２ＭのＴＣＡ（２５ＭのＴＣＡの場合、２５μｌ）で沈殿させることにより、解析のための調製を行った。ＴＣＡの上清のＨＰＬＣへの２０μｌ注入は、３６日間のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の補給及び３０日のフォローアップ（処置なし）の間、採取された血清サンプルに関してなされた。血清は、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍを用いたＨＰＬＣ及び０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：メタノールが７５：２５の移動相によって解析された。
【０１０７】
ＵＶ検出器は２２８ｎｍでセットされ、馬尿酸は４．０〜４．２５分の保持時間で溶出した。標準曲線は、蒸留水で溶解された様々な濃度の馬尿酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて調製した。０〜０．１５ｍｇ／ｍｌの間の溶液の２０μｌを注入した後、プロット前にμＭに変換し、方程式ｙ＝５１１ｘ＋６６１６によって表された。この標準曲線は、血清中の馬尿酸のレベルを検出し定量化するのに十分であった。それは、ＨＰＬＣによるキナ酸１ｍｇ／ｍｌと比較した、約０．０１ｍｇ／ｍｌである増大した感度のためである。
【０１０８】
（ｌ）ＨＰＬＣ解析に対する尿サンプルの予備的な洗浄（clean-up）
尿サンプルは、１０分間激しく振盪させながら、水性の尿：９５％エタノール：酢酸エチルを１：２：４ ｖ／ｖ／ｖで混合した。酢酸エチルの層は、室温下、重力で分離し、その後、それはピペットで除去され、気流で脱気され、真空フード中で乾燥した。この手法で、１〜２ｍｌの尿を、水またはエタノール０．２ｍｌ中に戻した。これは、５〜１０倍の（サンプルの）濃度を示した。代謝物質の抽出というこの方法を用いた回収は：キナ酸＝５３％、馬尿酸＝５３％、ニコチンアミド＝５４％、及びトリプトファン＝６６％であった。
【０１０９】
（ｍ）尿中のキナ酸及びニコチンアミドのＨＰＬＣによる同時検出
尿サンプルをエタノール及び酢酸エチルで、１：２：４ ｖ／ｖ／ｖに希釈し、その後、酢酸エチル画分を乾燥し、０．２ｍｌの水で可溶化し、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍに直接、２０μｌの注入を伴うＨＰＬＣ解析を用いた。移動相は８：８：８４（ｖ／ｖ／ｖ）の比率で、０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：メタノール：アセトニトリル（７０：３０）：水であった。ＵＶ検出器は２１５ｎｍでセットされ、キナ酸は０．９７〜１．０５分の保持で溶出し、ニコチンアミドは２．６〜２．９分であった。尿中の検出限界は、キナ酸で約１．５ｍｇ／ｍｌであり、ニコチンアミドで０．０１５ ｍｇ／ｍｌであった。０〜１７．５ｍｇ／ｍｌの間のキナ酸で、用量反応は、ｙ＝５３．５２ｘ＋３３．５５と表され、０〜０．２ｍｇ／ｍｌの間のニコチンアミドで、用量反応はｙ＝４７４８ｘ−０．１１７４という線形回帰直線を与えた。
【０１１０】
（ｎ）尿中のトリプトファン及び馬尿のＨＰＬＣによる同時検出
尿サンプルをエタノール及び酢酸エチルで、１：２：４ ｖ／ｖ／ｖとなるように希釈し、その後、酢酸エチル画分を乾燥し、０．２ｍｌの水で可溶化し、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍに直接、２０μｌ注入を伴うＨＰＬＣ解析を用いた。移動相は、０．２％ＴＦＡ：３０％メタノールが７０：３０ ｖ／ｖであった。ＵＶ検出器を２２５ｎｍにセットした。トリプトファンは５．２〜５．４分後に溶出し、馬尿酸は３．１〜３．４分後に溶出した。尿中のトリプトファン及び馬尿酸の検出限界は、それぞれ０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌであった。０〜０．０６ｍｇ／ｍｌの範囲内の用量で、トリプトファンはｙ＝３５５７ｘ＋３．３４５という線形回帰を生じ、０〜０．１５ｍｇ／ｍｌという用量範囲は、馬尿酸に対して、ｙ＝４５９２ｘ−７２．４６という類似の直線関係を与えた。
【０１１１】
例１：ヒトの被験者におけるキナ酸代謝の特性解析
６０００ｍｇという単一の高用量を被験者に経口で投与し、その後、３０ｍｌの血清サンプルを投与（exposure）後０．７〜４４時間で取られた全血サンプルから調製した。血清サンプルがエタノールで沈殿し、１ｍｌの水で再溶解すると、これは、各血液サンプル中に存在するキナ酸の３０倍増の濃度を可能にし、前記方法を、少量のキナ酸でさえ極めて微妙な差を検知できるようにした。そのデータを図１に示す。
【０１１２】
（ｉ）キナ酸の馬尿酸への最大限の変換と殆ど同時に、１０．５時間後のキナ酸の血清中への最大限の取り込み（約７時間後のシステマティックな循環における、すなわち血清における）が観察された。経口投与された４．４ｍｇ／ｍｌの６０００ｍｇだけが、血液の流れに蓄積した。総用量である６０００ｍｇのうち４．４ｍｇのみが、血清中に取り込まれた（すなわち０．０７３％）。これは、キナ酸の９９．９％が、４４時間の期間内に排出されるか、または代謝されたことを示唆している。
【０１１３】
図１中のデータは、１５００ｍｇまたは３０００ｍｇのいずれかのキナ酸のキレート物質（Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標））の、６週間という日々の投与及びフォローアップ後に、血清を分析することによって確認され、拡張された。血液サンプルが取られ、血清は、反復したＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の経口投与後に、１０日目から３７日目までで６倍に調製され、これらのサンプルはその後、キナ酸で解析された。被験者がいかに長期間、日々のキナ酸のキレート物質の用量で処置されたにもかかわらず、血液の血清サンプル中にはキナ酸は発見されなかった。結論として、２７という反復したＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の用量（３７日−１０日＝２７日）後でさえ前記方法の実証された感度によって解析された場合、反復した日々の投与後でも、キナ酸は血液の流れを蓄積しなかった（すなわち、それぞれ４０，５００ｍｇまたは８１，０００ｍｇに等しいキナ酸の総用量)。
【０１１４】
（ｉｉ）キナ酸の９９．９％は血清中で発見されなかったので、尿中に排出されたか、またはおそらく他の化合物に代謝されたかが疑問となった。（３６日及び８か月のフォローアップ（すなわち処置なし）中、）３０００ｍｇ／日または１５００ｍｇ／日でＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の日々の経口の処置を連続４〜５週間採取した尿サンプルは、キナ酸について解析された（表３、図２〜３）。全体の評価期間に対する尿中のキナ酸の平均レベルは、それぞれ約１８４ｍＭ±１０３（ｎ＝１９）及び６５±４９ｍＭ（ｎ＝１７）であると分かった。これらの平均値の標準偏差は、時間と共に尿のキナ酸の大きな変動を示す。それらが、９か月後も依然として上昇し、身体的補給基地からの代謝移動を反映しているにもかかわらず、である。１日当たり１．５リットルまで生産された多量の尿を用いて、１日の尿中のキナ酸当たり、３０００ｍｇ／日の経口用量後の約１８４ｍＭ、または（１日当たり５３，０３９ｍｇ／１．５リットルの総尿量まで変換する）１８４ｍｍｏｌｅ／リットルの検出が得られた。
【０１１５】
尿中の６５ｍＭのキナ酸を生じた、１５００ｍｇ／日という経口用量に対する似た計算は、１日当たり１８，７３７ｍｇ／１．５リットルの総尿量を与えた。これらのデータを表３に要約し、投与された総用量５６％及び４０％は、９か月の評価期間後に代謝されないキナ酸として排出されるという解析を支持するものである。
【０１１６】
キナ酸は、ドライアウト（dryout）の期間（すなわち、処置後の８か月間）中、尿中で検出されうるので、キナ酸は反復した投薬からＧＩ管中に蓄積しうるということは理路整然としていた。さもなければ、経口補給後に、８か月のフォローアップ（処置なし）に対する尿中へ排出することなどどうして分かるのだろうか（表３、図２〜３参照）。３０００ｍｇ／日または１５００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）のいずれかの経口投与前またはその後すぐの、尿中で発見されるキナ酸の代謝物質のレベルを表３に提供する。
【０１１７】
これは、キナ酸または必須アミノ酸またはビタミンのいずれかのさらなる補給を欠く場合でさえ、芳香族アミノ酸の持続的生産を可能にする、まさに好ましい栄養学的意義を強く示唆するものである。
【０１１８】
例２：ヒトの被験者におけるキナ酸代謝としての馬尿酸の特性解析
４月２８日から６月１日までの経口投与期間中１５００ｍｇ／日及び３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の経口用量後の馬尿酸源として、２００６年６月２日から２００７年１月２０日までの追加的なドライアウト（dryout）の期間（８か月間処置なし）からは、含まれたサンプルと併せて、経口投与後の馬尿酸源として、キナ酸も評価された。
【０１１９】
ヒトを含む動物は、５％から７０％の間の用量のキナ酸を、１〜８日以内に、安息香酸及びその後は馬尿酸まで代謝できるということがよく知られている。このように、馬尿酸は、キナ酸投与（exposure）に由来すると特徴付けられる、過去に知られた代謝物質にすぎない。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
ここで、我々は、馬尿酸尿の存在を、尿と血清の両方について分析している。尿中、馬尿酸のｍＭが見出された（表３、図２〜３）。例えば、尿は、３４１２ｍｇの馬尿酸／１．５リットルを示した、１２．７ｍＭ以下の馬尿酸を生じた。キナ酸アンモニウムキレート／７０ｋｇの人間としての、日々の総用量である３０００ｍｇのＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は、４３ｍｇ／ｋｇに等しいか、または約４３ｍｇ／リットル＝６４．５ｍｇ／１．５リットルに等しい。ヒトの体の総水量は、０．７リットル／ｋｇであると評価された（Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は、水及び尿中に等しく分配されると仮定した場合）；その後、３０００ｍｇが溶解した、０．７リットル×７０ｋｇ リットル＝４９リットルは、３０００ｍｇ／４９リットル＝９１．８ｍｇ／１．５リットルに等しく、これは、キナ酸が完全に吸収されて排出されないならば、存在したはずの量である。
【０１２２】
このように、これらの計算は、９１．８ ｍｇ／１．５ リットルで除される６４．５ｍｇ／１．５リットルまたはおよそわずか７０．３％の日々投与された用量のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（すなわち、３０００ｍｇ／ｍｌのキナ酸）が日々、馬尿酸として尿中へと排出され、残る２９．７％のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）が馬尿酸としてシステマティックな循環中へと吸収されるか、または他の化合物までさらに代謝されたということをサポートする。
【０１２３】
だが、わずかｍＭ量の馬尿が尿中に見出された−＜２０μＭという極めて低いレベルの馬尿酸が血清中に見出されたに過ぎない（図４を参照せよ）。馬尿酸は、この用量範囲内では血清中でほとんど検出不可能であり、このように、このような結果は、キナ酸のシステマティックな分配へのわずかな吸収、及びそこでの馬尿酸への変換と相関があるということに当業者は注目しうる。さらに、少なくとも血清濃度（すなわち、＜０．０２ｍＭ、図４）及び３０００ｍｇ／日というＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）投与後の馬尿酸の尿レベルにおける相違（０．４９〜１２．７ｍＭ、図２、表３及びテキスト計算）は、少なくともキナ酸が他の化合物まで代謝され、馬尿酸として排出されないことを証明するものである。
【０１２４】
これらの低レベルであっても、処置に対する用量反応が観察された血清の馬尿酸でさえ、これらは、この原料について見られるＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の処置に対する用量反応であった（図４）。血清及び尿についてのこれらのデータを考慮すると、キナ酸／馬尿酸のレベルは、システマティックな循環中でキナ酸がほとんど見出されないということを示しており（投与された用量が＜０．１％、図１及びテキスト計算を参照せよ）、キナ酸がまさにシステマティックな取り込み代謝を受けるということを血清及び尿の両方が証明するとしても、馬尿酸は検出されうるが、投与量の約７０．３％が変化しないまま尿中に排出される（図２及びテキスト計算を参照せよ）。
【０１２５】
尿中で行方が不明である残り２９．７％のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）のうち、わずか痕跡量のみが血清中に馬尿酸として同定され、このように、血清中でのキナ酸及び馬尿酸の薬物動態のデータに匹敵している（表３及び図１〜４も参照せよ）。わずか痕跡量のみであるキナ酸または馬尿酸のいずれかが血清中に見出されたので、潜在的には、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の日々の投与用量のうち、たった２９．７％が、システマティックな循環またはＧＩ管中の他の化合物へと変換しうる。
【０１２６】
この薬物動態の解析は、過去に文書化されたキナ酸の有効な効果は、キナ酸自体に起因しているというよりもむしろ、シキミ酸経路に活性のある前駆物質の化合物に起因しているということを示唆している。
【０１２７】
例３：尿中のキナ酸の相当するレベルにおける、尿中の馬尿酸レベルの依存性
本研究では、キナ酸、馬尿酸、トリプトファン及びニコチンアミドに対する尿の値の基準値は、同様に、１２〜８６歳の年齢の間（ｎ＝９）という広範に亘る準拠集団で決せられた。キナ酸及び馬尿酸に対するデータは、図２〜３に存在する個体のキナ酸で処置された尿の値を伴う、表３に要約された。キナ酸及び馬尿酸の尿のレベルの間でコントロール（晒されていない）及び反復的に抽出されたＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸）で処置された個体（ｎ＝４５）についての、全体の抽出された人間の集団に基づく、真にかなり顕著な直線状の相関性があった（ｐ＜０．００１）。このことは、馬尿酸は主に着色性の果物及び野菜中のキナ酸と関連した食生活上の因子によって影響を受けており、ベンゼンまたはトルエンのような環境的な毒性のある芳香族の投与（exposure）を反映していなかったという強い証拠と捉えられた。
【０１２８】
例４：個体の抗酸化状態に関するインビボでの評価としての血清タンパク質チオールの解析
ここで報告されたキナ酸及び馬尿酸についての薬物動態のデータの後、明らかなことに、過去に使用されたキナ酸の経口用量は、キナ酸自体によっては直接的に何らの効果媒介にも関与しなかった；すなわち、それはシステマティックな循環中では検出できないためであり、キナ酸用量の約４０〜６０％は、たとえ９か月（表４及びテキスト計算）を超えていたとしても、代謝されずに尿中に排出された。初期の報告は、（ｉ）ドキソルビシンの科学的な治療の処置からの回復及び（ｉｉ）細胞死及び細胞生存のない成長の捕捉を含む、様々な臨床の評価項目（ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）に対して評価されたが、我々は、これらの出来事が共に酸化還元（酸化／還元）のバランス及びＤＮＡ修復に非常に依存するということを示している。結果として、ここでは、我々は、抗酸化の有効な効果という指標として、血清タンパク質チオールの状態を使用している。
【０１２９】
１か月の処置 及び８か月のフォローアップ（処置なし）を含む、ヒトにおける９か月という期間を超える、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の代謝の運命は、表４に与えられている。
【０１３０】
血清タンパク質チオールのデータは、図６〜８において要約的に示されている。まず、図６〜７は、６月２日〜８月３１日という短期のドライアウトの期間、及びさらに長期のドライアウトの期間（２００６年９月〜２００７年１月２０日）の双方を含む診療後の値から、（基準の）血清チオール前の値を識別する、個体データの点を示す。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
明らかなことに、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の補給は、処置及びフォローアップの期間と通じて上昇したままでさえある、タンパク質に存在している、減少したチオール（−ＳＨ）の顕著な増大と関連していた。これは、酸化還元バランスが酸化状態から移行したという直接の証拠であると考えられてきた。血清タンパク質は、シグナル伝達タンパク質を含有するため、これは、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）を伴った補給中、及び驚くべきことに少なくとも９か月の評価期間中、インビボで生じる抗酸化状態の主要な移行についての強力な証拠であった。
【０１３３】
結論として、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は強力な抗酸化剤であったが、変換する抗酸化効果を媒介しうる他の化合物へ変換されることにより、前代謝物質としてのこれらの効果の原因となるに違いない。その論理は単に、３６日間及び更に処置のない８か月のフォローアップ期間という、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の反復的な投薬の後でさえ、血清中でのキナ酸のシステマティックな蓄積がなかったため、８か月間もさらなる補給が無かった場合に、キナ酸自体がどのくらい血清チオールを上昇させることができるかというものであった（図６〜７参照）。
【０１３４】
図８は、おそらく遺伝的及び環境学的な要因のために、次から次へと個体が変化した、個体の基準の血清チオールをさらに分類化する。だが、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）が経口投与された場合、バックグラウンドレベル（すなわち、基準のチオール状態）とは独立した、血清のチオールレベルにおける個体内の増大があった。
【０１３５】
結果として、結局のところ、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）についての抗酸化の有効な効果は、明白に存在しており、だが、キナ酸自体ではなくそれが誘導した他の代謝が原因となっていなかった。
【０１３６】
例５：微生物／植物のシキミ酸経路と関連した代謝物質についての尿の解析
キナ酸は、経口で投与される場合、尿サンプル中の馬尿酸として同定されるため、少なくともキナ酸を馬尿酸まで代謝できる腸内の微生物相が十分に証明されているが、キナ酸が腹腔内注入で投される場合、馬尿酸への変換は全くなかった。
【０１３７】
ヒトのＧＩ管中に存在している機能的なシキミ酸経路についての馬尿酸の証拠にもかかわらず、キナ酸は、シキミ酸塩からコリスミ酸塩への、トリプトファンへの、そしてニコチンアミドへの代謝経路に従って生成した化合物の増大した生産にはなりえないということを実証する、報告された研究はこれまでのところ全くない。初めて、我々は，トリプトファン及びニコチンアミドの尿レベルがＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）のような芳香族アミノ酸の前駆物質への投与（exposure）により誘導されたということを実証した。
【０１３８】
ＧＩ管は、最も重要な体の中の器官の機構の一つであり、細胞成長及び健康上の維持に対する適切な栄養を維持するのに必要なタンパク質、脂肪及び糖類の破壊及び再合成に関与する。主要な栄養源の中には、体で合成されないものもあるが、シグナル伝達（例えば、セロトニンやドーパミンを介して）及び構築タンパク質（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に多く必要とされるのが、芳香族アミノ酸であるトリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンである。それらは全て、ニコチンアミド及びＮＡＤといった主要なエネルギー源とともに、シキミ酸経路で生産される。
【０１３９】
表３及び図９〜１０に示されたデータ解析は、トリプトファン及びニコチンアミドの尿レベルを２名の被験者、すなわち３３日間（すなわち処置期間）連続で１５００ｍｇ／日を受ける者と３０００ｍｇ／を受けるもう一方の者において測定した場合、コントロール（ｕｎｅｘｐｏｓｅｄ）と比較すると、双方の用量は尿のトリプトファン及びニコチンアミドについての顕著に上昇したレベルを有したことを示している。サンプルが８か月後のフォローアップの解析に含まれた場合でさえ、トリプトファン及びニコチンアミドの尿中レベルは依然として上昇したままであった。尿中のトリプトファン及びニコチンアミドは、体の残り部分におけるこれらの栄養の状態に関する良く知られた強力な指標であり、そのため、結局のところ、キナ酸の補給は、ＧＩ管中の馬尿酸の合成を増大させるだけでなく、トリプトファン及びニコチンアミドの合成も増大させる。
【０１４０】
さらに、トリプトファン及びニコチンアミドは共に、８か月のフォローアップ期間を通じて尿中で上昇し続け、同期間中に増大した血清チオールによって証拠付けられたように、抗酸化のシステマティックな効果を媒介する際の、それらの関与に対するサポートであった(図６〜８を参照）。
【０１４１】
例７：血清チオールに関連したトリプトファン、ニコチンアミドの解析
血清チオールによって見積もられた、トリプトファン／ニコチンアミド及びシステマティックな抗酸化レベルの間の関係をより良く実証しようとするために、我々は、さらに、マイクロモルレベルの血清チオールに関連した、尿中のトリプトファンまたはニコチンアミドのモル比率を分析することを考慮した。表５は、血清中の増大したマイクロモルレベルのチオール（システマティックな循環への取り込み）と比較した、トリプトファンまたはニコチンアミドの尿（排泄）中での増大したレベルの比率を明白に示しており、キナ酸の経口補給に対する強力な用量反応があった。
【０１４２】
顕著に、これらの比率は、（キナ酸アンモニウムキレート）消費と関連した個体の抗酸化状態の代謝コントロールを評価した。理論的には、用量補給の相違は、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は、１日当たり３０００ｍｇ／１日当たり１５００ｍｇ＝２．０の比率；トリプトファンとして表５より実験的に計算されたのは、１．９４／０．８１＝２．４の比率であった；ニコチンアミドとして表３より実験的に計算されたのは、４．２９／２．３２＝１．８５の比率であった。
【０１４３】
ニコチンアミド及びトリプトファンの血清タンパク質チオール代謝に対する関係を表５に与える。データは、図６〜８及び表３から計算されている。少なくとも３０％という有利な増大が好ましい。
【０１４４】
【表６】
【０１４５】
例８．キヌレインで測定した場合のインドールジアミンのオキシゲナーゼの活性
トリプトファン合成が一旦シキミ酸経路によって刺激されると、インドールジアミンオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を介したキヌレイン及び／またはヒドロキシトリプトファン−セロトニン及び／またはキノリン−ドーパミンもしくはニコチンアミド−ＮＡＤ（エネルギー）への異化代謝によって、さらに変更される。インビボでのキナ酸の投与（exposure）によるＩＤＯ活性の阻害は、免疫抑制活性の減少を助ける。
【０１４６】
ＩＤＯ活性は、高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により、２００μｌという一定分量の２ＭのＴＣＡで沈殿した血清中、トリプトファンのキヌレインに対するモル比率の決定によって計算された。前記ＨＰＬＣの方法は、装置がＨＰ１１００シリーズで、カラムがＸＴＥＲＲＡ ＭＳＣ１８（３．５ｃｍ長、４．６ｍｍ×５０ ｍｍ)である点以外はあらゆる詳細について既に発行されている（Laich, A , Neurauter, G , Widner, B , Fuchs, D .トリプトファン及びキュレニン（kyurenine）のＨＰＬＣによる同時測定に対するより迅速な方法。Clinical Chemistry 48 (3) : 579-580, 2002）。
【０１４７】
キナ酸の効果は、さらにシキミ酸経路の最終生成物に関して特徴があった。したがって、キナ酸の補給が、トリプトファン及びキヌレインの同時検出を通じたＩＤＯ活性に対して解析された。トリプトファン／キヌレインの高比率は、免疫抑制である （Bauer, TM, Jiga, LP, Chuang, J-J, Randazzo, M , Opelz, G , Terness, P．インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの免疫抑制の役割に関する研究：トリプトファンの代謝物質が、インビトロ及びインビボでの、ラットの同種異系のＴ細胞の反応を抑制する。Transplant International 18 (2005) 95- 100, 2004）。トリプトファンのレベルは、キヌレインの代謝により減少するよりもむしろ上昇するため、キナ酸はＩＤＯ活性を阻害する。これらのデータは、キナ酸自体がキナ酸活性の効果的な形態ではないことを示唆している。
【０１４８】
例９：動物の研究
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、２１日間オートクレーブした水道水で溶かした４ｍｇ／ｍｌのＣ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）または２ｍｇ／ｍｌのキナ酸を給餌した。その動物を犠牲にし、脾臓が除去され、血液が採取された。細胞サンプルはＳｙｓｍｅｘ ＫＸ−２１Ｎ（Sysmx Corporation、神戸、日本）で分析され、血漿／血清サンプルはキナ酸及びトリプトファンに対するＨＰＬＣによる化学的解析で調製された。
【０１４９】
表６を見れば分かるように、マウスの血清のトリプトファンレベルと同等程度に、増大した芳香族酸を有する前駆物質の２１日間の補給後、様々なリンパ球がマウスの抹消の血液サンプルに大切である。
【０１５０】
図１１は、２１日間の処置後の血液細胞及び血清トリプトファンについてのインビボでの評価を示し、馬尿酸（＜０．０２μｇ／ｍｌ）及びキナ酸（＜２ｍｇ／ｍｌ）のレベルも同時に測定されたが、マウスの飲料１ｍｇ／ｍｌないし約５００ｍｇ／ｋｇで、キナ酸が投与されると、ＨＰＬＣ検出を下回るものであることが分かった。キナ酸の投与は、マウスにおいてインビボで測定された血清トリプトファンレベルを増大させることとなったが、キナ酸は全く検出不可能であり、ただ使用は依然として免疫刺激反応の原因であったのは、表６及び図１１より明らかである。
【０１５１】
完全な説明を行ってきた本願で示されているように、キナ酸のキレート物質は芳香族アミノ酸のインビボでの生産を促進する。下記の表７は、ヒトを含む動物において治療の値を有すると既に知られている、経口投与したＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）のトリプトファン用量との直接的な薬物動態の比較を与える。このような比較は、芳香族アミノ酸の前駆物質が経口で使用される場合、芳香族アミノ酸レベルの予期せぬ増大をもたらす。
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
【表８】
【０１５４】
即時の開示で引用された、全ての特許及び非特許文献は、全ての文献がそれぞれ参照により引用されるかのように、同じ効果で参照による開示で引用される。
【０１５５】
本発明は、本願でこれらの実施形態は、本発明の原理及び用途の例証をほとんどしていない。膨大な改変が例示した実施形態に対してなされてもよく、下記のクレームによって規定されたような本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて他の修正は考案されうるということが理解できるはずである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年７月１１日に出願した米国仮出願第６０／８１９，５２４の優先権を主張する。本願は、２００６年３月１６日に出願した国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９３９４に関連しており、その全体が本願に引用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、芳香族アミノ酸、及び当該芳香族アミノ酸またはニコチンアミドの前駆物質を含有する組成物の生合成の増大方法、並びにその使用方法に関する。さらに、抗酸化治療の代わり（surrogate）または予測の判断材料（predictor）として、血清タンパク質のチオール量を測定することによって、このような抗酸化治療の治療効果を観察する方法が開示されている。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
キャッツクロー（Uncaria tomentosa）（以下、「キャッツクロー」と称する）の治療効果は、広く知られている。アシャニカ族のインディオ（Ashanika Indians）は、感染症, 炎症性疾患や精神状態でさえも制御する助けとするために、水に混ぜたキャッツクロー抽出物を使用している。治療効果を向上させるために、キャッツクローを、フチュフアシ・バーク（huchuhuasi bark）、カプサイチン、ゴボウ、ヒメスイバまたはスリッペリーエルム・バーク（slippery elm bark）のような他の原料と混ぜてもよい。キャッツクロー中の活性原料は、プロアントシアニジン、キノビン酸（quinovic acids）及びそれらのグリコシド、オキシインドール アルカロイド（プテリジン、イソプテリジン、ウンカリン（uncarine）、ミトラフィリン（mitraphylline）、イソミトラフィリン）、Ｎ−オキシド、ライノコフィリン（rhynocophylline）、カルボリンアルカロイド、ヒルスチン（hirustine）、Ｎ−オキシド トリテルペン、ポリフェノール、フィトステロール（スチグマステロール及びカンペステロール）を含む（Senatore, A., et al., Phytochemical and Biological Study of Uncaria tomentos, Boll Soc Ital Biol Sper. 1989; 65 (6):517-20 ))。
【０００４】
本発明者であるＲｏｎａｌｄ Ｗ Ｐｅｒｏ博士は、キャッツクローの熱水抽出物の主要な生理活性成分として、キナ酸のアナログを最初に同定した（Sheng, Y., Akesson, C , Holmgren, K., Bryngelsson, C , Giampapa, V., Pero, R .W., ャッツクローの水抽出物活性原料の活性原料。キナ酸の同定及び効果。Journal of Ethanopharmacology 96(3): 577-584, 2005）。米国特許第６，０３９，９４９号、６，２３８，６７５号及び６，３６１，８０５号明細書は、参照により本願に引用され、高い程度の抗腫瘍、炎症及び免疫促進活性を有する植物種であるキャッツクローの水可溶性抽出物を記載している。当該特許に記載されたキャッツクロー抽出物の調製は、様々な治療上の使用と関連し、Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）として市販されているものを利用できる。Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）は、キャッツクローの１００％生物学的に利用可能な熱水抽出物である。同様の製剤も、ＡＣ−１１（商標）及びＰｒｏｔｅｃｔａｇｅｎ（商標）のような様々な商標名のものを利用可能である。
【０００５】
米国の公開特許出願第２００５−０１７６８２５号は、Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）のインビボでの活性原料として、キナ酸及びキナ酸塩の分離、精製及び同定に関する方法を開示する。この特許出願も、免疫機構と関連した疾患を処置し、炎症反応を阻害し、炎症反応と関連した疾患を処置し、ＤＮＡ修復過程を促進し、抗腫瘍反応を促進し、腫瘍を形成し成長させる反応と関連した疾患を処置するための、キナ酸並びにその塩及びキレート物質の使用を開示する。
【０００６】
他の公知のキナ酸及びそのアナログの医学的な使用は、肌のしわの処置を開示している米国特許第５，６５６，６６５号及び米国特許第５，５８９，５０５号明細書、並びに神経アミダーゼ（neuroamidase）の阻害物質として風邪の処置を開示している米国特許第６，１１１，１３２号及び米国特許第６，２２５，３４１号明細書がある。
【０００７】
胃腸管（GI tract）の微生物相は、安息香酸を介して、キナ酸を馬尿酸まで代謝しうる、機能的なシキミ酸経路を有する（Adamson, R .H., Bridges, J .W., Evans, M .E., Williams, R .T., インビボでのキナ酸の芳香族化における種差と腸バクテリアの役割、Biochem Jour 116:437-433, 1970）。紅茶（black tea）及び緑茶双方の消費により、馬尿酸の尿での排泄量が増加する。キナ酸代謝（すなわち馬尿酸）についての唯一知られた過去に実証された指標は、動物によって大きく変動し、この代謝物質を、キナ酸の信頼できない定量的評価にする。キナ酸は腸内で馬尿酸へと代謝されるが、馬尿酸の主要な代謝源は、肝臓であると考えられている（Krahenbuhl, L., Reichen, J., Talos, C , Krahenb uhl, S., 安息香酸代謝は、長期に亘って肝外胆汁うっ滞（extrahepatic cholestasis）するラットの肝臓のミトコンドリアの機能を反映する。Hepatology 25 (2) : 259-508, 1997）。
【０００８】
上述の通り、高等動物は、一般に芳香族アミノ酸を合成できないことが明らかであり、このようなアミノ酸に対するアミノ酸の必要量を食事に頼らなければならない。したがって、高等動物における芳香族アミノ酸の所望の血清濃度を最適化しうる、新たな治療のアプローチが従来より求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、本願で特許請求される化合物の経口投与に続く、ヒトの抹消循環においてキナ酸上昇がないため、本発明の化合物は、胃腸（ＧＩ）管におけるトリプトファン及びニコチンアミドの生産に対する効果的な合成系の前駆物質であるということを見出した。シキミ酸経路を介した、上昇したトリプトファン及びニコチンアミドのレベルは、抗酸化、セロトニン媒介、ドーパミン媒介及びＮＡＤ媒介の活性のような健康上の利点に関して広範なスペクトルを媒介する。
【００１０】
本発明の一態様は、下記の式を有する芳香族アミノ酸に対する前駆物質に向けられている：
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、Ａは、
【００１３】
【化２】
【００１４】
【化３】
【００１５】
【化４】
【００１６】
【化５】
【００１７】
【化６】
【００１８】
並びにそれらのアニオン類、エステル類よりなる群から選択され、；その際、ＲはＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルであり、Ｘは、塩または水酸化物またはアミンを形成しうる１価、２価、３価のアニオンよりなる群から選択され、「ｎ」は整数または有理数であり、その際、ｌ＜ｎ＝１０である。
【００１９】
好ましい実施形態において、芳香族アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びフェニレフェデリン（phenylephederine）よりなる群から選択される。
【００２０】
本発明の他の態様は、（ａ）治療上効果的な量の、上記化合物(Ｉ)；（ＩＩ）；（ＩＩＩ）；（ＩＶ）及び（Ｖ）；
その際、ＲはＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキル；並びにそれらのアニオン類及びエステル類であり、及び
【００２１】
【化７】
【００２２】
その際、Ａ、Ｘ及びｎは上記と同様に規定される、よりなる群から選択される化合物；並びに、
（ｂ）医学的に許容可能なビヒクル、を含む組成物に向けられている。
【００２３】
更なる態様において、組成物は、治療上効果的な量の主要な抗酸化剤を含む。一実施形態において、主要な抗酸化剤はフラボノイドである。
【００２４】
本発明の他の態様は、以下のステップを含む、芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病状態に対する効果的な抗酸化剤治療の方法を同定するための動物モデルの手法（methodology）に向けられている。
【００２５】
（ａ）マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル及びヒトよりなる群から選択される哺乳類を得ること
（ｂ）（尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル）／（組織または血液中のチオールのレベル）という、当該哺乳類についての基準値の比率を決定すること、
（ｃ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物を前記哺乳類に投与すること、
（ｄ）抗酸化処置のサイクル後の当該哺乳類について、尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル／組織または血液中のレベルという比率に対する値を決定すること、
（ｅ）ステップ（ｂ）及び（ｄ）で得られる値を比較すること、その際、基準値を超える増大は、前記治療方法が効果的であることを示す。
【００２６】
本発明の他の態様は、以下を含む、必要な患者に対する、インビボでの酸化的ストレスを試験する方法に向けられている。
【００２７】
（ａ）芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物で前記患者を処置すること、
（ｂ）当該患者に由来するタンパク質チオールのサンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプル中の前記タンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルを測定すること、
（ｅ）（ｄ）／（ｃ）で表されるステップ（ｄ）で得られたトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルに関連して、ステップ（ｃ）のサンプル中の前記チオールのレベルを分析すること、その際、当該比率の値の増大は、ＤＮＡ修復についての低い酸化的ストレス及びダウンレギュレーションに関する予測の判断材料（predictor）である。
【００２８】
本発明の他の態様は、以下を含む、酸化的ストレスの増大したレベルを特徴とする疾病に対する、患者の感受性を究明する方法に向けられている。
【００２９】
（ａ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物で前記患者を処置すること、
（ｂ）タンパク質チオールのレベルを含む、当該患者に由来する体サンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプルについての前記タンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルを測定すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）におけるトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中レベルに対する、ステップ（ｃ）のサンプル中の前記チオールのレベルを分析すること、その際、当該疾病を患った人々から得られた所定の正規化値（normalized value）（ｄ）／（ｃ）に対し比較的高い値は、当該個体のＤＮＡ修復に関する酸化的ストレス及びダウンレギュレーションについての予測の判断材料（predictor）である。
【００３０】
本発明の他の態様は、芳香族アミノ酸の前駆物質及び医学的に許容可能なビヒクルを投与することを含む、血清の芳香族アミノ酸のレベルの欠如を特徴とする状態を処置する方法に向けられている。本発明の本態様では、用いられた組成物は経口投与が好ましく、様々なタイプの食品、すなわちスナック、肉製品だけでなく飲料とも結合できる。
【００３１】
本発明の他の態様は、芳香族アミノ酸を必要とする個体における芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病を進行させる危険性を決定する方法に向けられており、以下のステップを含む：
（ａ）個体の血清チオールのレベル及び尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたは両方の組み合わせのレベルを得ること
（ｂ）当該個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたは両方の組み合わせ／血清チオールの比率の値を規定すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）の値を、当該疾病に苦しむ人々から得られた同じもの（the same）についての所定の正規化（normalized）レベルに対して比較すること、その際、当該比較は、当該個体における、酸化的ストレスに対する基準値を示す。
【００３２】
本手法はさらに、芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物、並びに／または抗酸化剤を、処置サイクル中、前記個体に投与するステップ（ｄ）、処置サイクルの終了後に、前記個体の血清タンパク質チオールのレベル及び尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿酸、または全てのレベルを得るステップ（ｅ）、並びに当該処置サイクル後の、前記個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたはそれらの組み合わせ／血清タンパク質チオールの比率の値を規定するステップ（ｆ）を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】単一の高用量のキナ酸６０００ｍｇを蒸留水に溶かして経口投与し、その後、１５分間以内で３０ｍｌの血清サンプルを示した回数で収集するという、ファーマコキネティクスを図示する。その主要な代謝物質である馬尿酸と相関のある血清のキナ酸の測定は、原料及び手段の欄（Material and Procedures section）に記載されているように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。取り込みの最長時間を視覚化するために、データは、最大の取り込みのパーセントとして表した：１２．５時間で（４４００μｇ／ｍｌ）、キナ酸＝１００％；７時間で（５５μｇ／ｍｌ）、馬尿酸＝１００％。
【図２】３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で３６日間処置し、その後、さらに８月間何らの処置も行わなかった後の主ＲＰの尿のプロファイルを図示する。尿の馬尿及びキナ酸のレベル（ｍＭ）は、サンプリングの日数で評価した。
【図３】２００６年５月１日〜３１日の期間中、１５００ ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で処置し、その後、さらに８月間何らの処置も行わなかった後の被験者ＨＬの尿のプロファイルを図示する。馬尿及びキナ酸のレベル（ｍＭ）は、サンプリングの日数で評価した。
【図４】１５００または３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で３６日間処置し、その後、さらに３０日間以上続行（followed-up）（処置なし）した後の、被験者ＨＬ及び被験者ＲＰにおける馬尿酸の血清レベルを図示する。かかる期間中の総サンプリングポイント（Total sampling points）は：被験者ＲＰ：ｎ＝１２、被験者ＨＬ：ｎ＝１２、ｐ＜０．０１である。
【図５】馬尿酸、すなわちキナ酸の主要な公知の代謝物質の尿中レベルの、未処置の個体、並びに１５００ｍｇ／日及び３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）で３０日間処置し、それから処置後直ぐ、さらに８月間続行した被験者におけるキナ酸の尿中レベルへの依存性を図示する。これらのテータは、処置区（ｎ＝３６）及びコントロール（ｎ＝９）の双方を含む、総サンプル（ｎ＝４５）の直線回帰と統計学的に解析される。ここで、同時に同じ被験者における尿から収集されたキナ酸値に対する馬尿酸値より、ｙ＝０．０１５７ｘ＋０．１８３９、ｒ＝０．６０、ｐ＜０．００１という式が導出された。
【図６】経口投与前の８３日を超える期間中、３０００ｍｇ／日で３６日間、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を被験者ＨＬに関して測定し、その後、未処置で８月間続行した、前記個体の基準（baseline）の血清タンパク質チオールの評価を図示する。
【図７】経口投与前に８３日を超える期間中、１５００ｍｇ／日で３６日間、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を被験者ＨＬに関して測定し、その後、未処置で８月間続行した、前記個体基準の血清タンパク質チオールの評価を図示する。
【図８】Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を３７日間経口投与した後、さらに３２日の乾燥期間をかけて、血清タンパク質のチオールの抗酸化パラメータによって算出した場合の、実験の参加者のインビボでの抗酸化状態を促進させた旨を図示する。Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の用量は共に、ステューデント ｔ−検定（ｐ＜０．００１）によって解析された該当基準値とは統計学的に異なっている。
【図９】Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）を３６日間、３０００ｍｇ／日で処置し、その後、さらに未処置で８月間続行した、被験者ＲＰの尿のプロファイルを図示する。尿のトリプトファン及びニコチンアミドのレベル(μＭ）は、サンプリング日数で評価した。
【図１０】Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）を３６日間、１５００ｍｇ／日で処置し、その後、さらに未処置で８月間続行した、被験者ＨＬの尿のプロファイルを図示する。尿のトリプトファン及びニコチンアミドのレベル（μＭ）は、サンプリング日数で評価した。
【図１１】４ｍｇ／ｍｌ Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）または２ｍｇ／ｍｌキナ酸のいずれかで２１日処置した後の血液細胞及び血清トリプトファンに関する、インビボでの動物の研究の評価を図示する。馬尿酸（＜０．０２μｇ／ｍｌ）及びキナ酸（＜２ｍｇ／ｍｌ）のレベルも、同時に決定されるが、キナ酸は、マウスの飲料水中１ｍｇ／ｍｌまたは約５００ｍｇ／ｋｇで投与された場合、ＨＰＬＣの検出限界以下であったことが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、シキミ酸経路中で効果的な量の前記前駆物質を投与することによって、血清及び／または尿及び／または哺乳類の生物組織中の、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンのような芳香族アミノ酸、もしくはビタミン前駆物質であるニコチンアミドのレベルの増大を提供する。哺乳類の体中の血清及び／または生体応答性組織での、トリプトファン及び／またはニコチンアミドの上昇したレベルは、セロトニン、ドーパミン、ＮＡＤを順々に上昇しうるか、または哺乳類の体中のＤＮＡ修復のレベルを促進する。
【００３５】
高等動物では、芳香族アミノ酸は、動物性や植物性のタンパク質のような食生活の源から一般に得られる。本発明者らは、芳香族アミノ酸が経路、すなわちシキミ酸塩（またはシキミ酸）経路として一般に知られている経路を通じて、胃腸の細菌フローラで合成されうることを見出した。例えば、大腸菌のような胃腸の細菌は、エリトロース４−リン酸をシキミ酸塩、コリスミ酸、そして最終的にはフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンまでに変換できる。
【００３６】
一実施形態では、胃腸（ＧＩ）管内の芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、シキミ酸経路を促進して、当該前駆物質を、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンのような芳香族アミノ酸、またはニコチンアミドのような他の必須ビタミンに変換する。ニコチンアミドはトリプトファンを介して合成されるということが以前から報告されている。（Satyanarayana, U , Narasinga, U., Rao, B .S., ラットのトリプトファン−ＮＡＤ経路の幾つかの鍵となる酵素における、食生活の制限の効果。Jour. Nutrition 107 (12): 2213-2218, 1977; Satyanarayana, U., Rao, B .S., トリプトファン−ＮＡＤ経路の幾つかの鍵となる酵素における、食生活上のタンパク質レベルの効果。Brit. Jour. Nutr. 38(1): 39-45, 1977を参照せよ）。芳香族アミノ酸及びビタミンは、セロトニン、ドーパミンにより制御される細胞の過程（cell processes）を媒介し、ＤＮＡ修復において顕著な役割も果たす。例えば、ＮＡＤは、ＤＮＡの修復過程を含む体中、５００を超える生化学的反応において重要な共通の因子である（Okamoto, H., Ishikawa, A., Yoshitake, Y . et al ., ニコチンアミドのカタボライトについてのヒトの尿の排泄における日周変動：ニコチンアミドの代謝に関するストレスの効果。Amer . Jour. Clinical Nutrition 77(2): 406-410, 2003）。
【００３７】
鍵となる生化学的な出来事は、これまで開示されていないが、ヒトのキナ酸のキレート物質２５ｍｇ／ｋｇという効果的な用量で、ＨＰＬＣ法の検出限界で、ヒトの血清中にキナ酸は発見されなかった（１ｍｇ／ｋｇ；すなわち、効果的な用量のわずか４％）。本発明者らは、このように、あらゆる理論によっても決定的でなく、キナ酸自体が直接作用する生理活性原料ではないと確信している。
【００３８】
本願で使用されているように、「キレート物質」という用語は、遊離酸のイオン（例えば、アンモニウムイオンまたは他の医学的に許容可能なイオン）に対する比率を包含し、その際、前記比率における上記で示されたイオンは、総数、例えば、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５及び１：１．６だけでなく、それらの間の値、例えば、１：１．５４（アンモニウムイオンで飽和したキナ酸）ではない。だが、このような状況特に溶液のｐＨに依存して、キレート物質の比率は様々である。本願で論じられているように、ほぼ１：１．５４という比率は好ましいが、本発明のキナ酸のキレート物質の組成物は、１：１．５４というキナ酸のアンモニウムイオンに対する比率を有するものに決して制限されることはない。
【００３９】
自然に発生するポリヒドロキシル化及びポリカルボキシル化した有機酸の、塩及びキレート物質に関する決定を、表１に示している。実験上のモル比率は、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムの水酸化物で、遊離のプロトン化有機酸（Ｈ＋）をｐＨ＝７．５まで中和することから計算した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
遊離酸（Ｈ＋）の形態のキナ酸または（ｉｎ ｓｉｔｕでキナ酸を放出する）キナ酸エステルの加水分解によって得られたキナ酸は、過剰なアンモニアで処置され（例えば１０％のアンモニアで、例えば２時間で)、効果的なインビボとして本願に記載され、特徴付けられているように、キナ酸アンモニウムキレートを発生させる。
【００４２】
本発明は、植物原料中のキナ酸の実質上あらゆる形態をキナ酸のキレート物質、特にキナ酸アンモニウムキレート、及び増大した生物学的効果及び減少した毒性を示す、向上した医学的な組成物についての関連した生産へと変換する過程にも進む。本発明の特に好ましい組成物は、本願に記載される生物学的な活性特性を示す少なくとも１つのキナ酸のキレート物質の相当量または少なくとも効果的な量を含む。
【００４３】
本願で使用されているように、相当量は、キナ酸のキレート物質は、組成物に存在するキナ酸の全ての形態の５％超、好ましくは１５％超、より好ましくは２５％超を示す組成物を意味する。好ましくは、一以上のキナ酸のキレート物質は、前記組成物に存在するキナ酸の主要な形態である。本願で使用されているように、主要な形態は、キナ酸のキレート物質が前記組成物に存在する全ての形態のキナ酸のうち５０％超、好ましくは６０％超、そして最も好ましくは７０％超を示す組成物を意味する。
【００４４】
組成物は、一以上のキナ酸のキレート物質が、前記組成物に存在するキナ酸の実質的に主要な形態であることが好ましい。本願で使用されているように、実質的に主要な形態は、キナ酸のキレート物質が前記組成物に存在するキナ酸の全ての形態のうち、５０％超、好ましくは６０％超、最も好ましくは７０％超を示す組成物に言及している。
【００４５】
組成物は、例えば、キナ酸アンモニウムキレートが、前記組成物に存在する実質的に主要な形態のキナ酸であるか、またはキナ酸アンモニウムキレートが前記組成物に実質的に存在するキナ酸の唯一の形態であることが好ましい。実質的に存在する唯一の形態としてのキナ酸アンモニウムキレートは、本願で使用されているように、キナ酸のキレート物質が前記組成物に存在するキナ酸の全ての形態のうち、９０％超、好ましくは９５％超、そして最も好ましくは９９％超を示す組成物に言及している。組成物は本願に記載されており、例えば、キナ酸アンモニウムキレートは、前記組成物中のキナ酸の実質的に唯一の形態として存在している。
【００４６】
一実施形態の方法では、投与しない（基準の）レベルの少なくとも３０％まで、またはセロトニン、ドーパミン及びＮＡＤの生産を顕著に促進するか、あるいは既存のバックグラウンドのレベルを超えてＤＮＡ修復を促進するレベルまで、キナ酸、シキミ酸及び／またはコリスミ酸塩、それらのキレート物質のような芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、典型的には、哺乳類中の血清のトリプトファン及びニコチンアミドの濃度を増大させうる量で投与される。
【００４７】
芳香族アミノ酸は、セロトニン、ドーパミン、ＮＡＤによって制御される細胞過程、並びに潜在的な抗酸化効果を順次与えうるＤＮＡ修復を媒介する。例えば、ＮＡＤは、ＤＮＡ修復を含むがこれに制限されない、５００を超える体中の生化学的反応中の重要な共通の因子である（Okamoto, H., Ishikawa, A., Yoshitake, Y., et al., ニコチンアミドのカタボライトに関するヒトの尿の排泄中の日周変動：ニコチンアミドの代謝におけるストレスの効果。Amer . Jour. Clinical Nutrition 77(2): 406- 410, 2003）。
【００４８】
典型的には、キナ酸、シキミ酸及び／またはコリスミ酸塩のキレート物質を含む芳香族アミノ酸に対する前駆物質が、ヒトに、飲料、カプセル、錠剤の形態で、５００ｍｇ／日から５０００ｍｇ／日まで、または約６．７から６６．７ｍｇ／ｋｇというシステマティックな用量で投与される。好ましい投薬形態は、液状（例えば、飲料）で経口投与されるか、カプセルまたは錠剤、あるいは他の食品または飲料とあらかじめ組み合わせたような製剤として、乾燥形態で経口投与される。
【００４９】
本発明は、さらに、効果的な量のキナ酸のキレート物質、好ましくはキナ酸のアンモニウムイオンに対する約１：１．５４という比率を有するアンモニウムのキレート物質を含む、分離された薬剤組成物の製造方法にも関する。
【００５０】
芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、下記式
【００５１】
【化８】
【００５２】
を有し、その際、Ｘは、塩または水酸化物またはアミンを形成しうる１価、２価、３価のアニオンよりなる群から選択され、「ｎ」は、整数または有理数であり、その際、ｌ＜ｎ＝１０である。Ａは、本願で前から記載しているが、（Ｉ）−（Ｖ）構造、それらのアニオン、エステルを有し、その際、Ｒは、ＨまたはＣ１−Ｃ３のアルキルである。ＲがＨである場合が好ましい。前記基であるＸは、例えば、塩化アンモニウムまたは水酸化アンモニウム、塩化カリウムまたは水酸化カリウム物、塩化マグネシウムまたは水酸化マグネシウム、塩化亜鉛または水酸化亜鉛、塩化カルシウムもしくは水酸化カルシウムまたはそれらの医学的に許容可能な塩でありうる。このような基（ここでは、Ａ−（Ｘ）ｎ）の例は、特に制限されることはないが、例えば、キナ酸アンモニウムキレート、キナ酸カリウムのキレート物質、キナ酸亜鉛塩のキレート物質、キナ酸リチウム塩のキレート物質、キナ酸カルシウムのキレート物質を含む。
【００５３】
他の実施形態では、前記基であるＸは、ヒスチジン塩、リジン塩のようなアミノ酸でありうる。このような基（ここでは、Ａ−（Ｘ）ｎ）の例は、キナ酸のヒスチジン塩／キレート物質及びキナ酸のリジン塩／キレート物質を含む。さらに他の実施形態では、前記基であるＸは、アミノエチルエタノールアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、イソプロパノールアミンのようなアミン、またはＥＤＴＡまたはＤＥＴＡのようなキレート剤でありうる。本分野に熟練した人間に知られている、医学的に許容可能なアミンもしくはアルカノールアミン及び／またはキレート剤は使用できる。
【００５４】
一実施形態では、芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、キナ酸誘導体であり得、前記キナ酸誘導体は(Ｉ)−（Ｖ）構造へと導きうる。他の実施形態では、前記前駆物質は、ラセミ化合物の混合物またはそれらの光学異性体でありうる。
【００５５】
血清チオールは、酸化的ストレス及びＤＮＡ修復のキャパシティーの代わり（surrogate）の評価としてインビボで使用され、Ｐｅｒｏによる米国特許第５，９２５，５７１号で開示されているように、総血清タンパク質のチオールとしてたいていの場合評価される。我々は、８０％硫酸アンモニウムで沈殿した血清チオールの副分画を使用し、かかる評価は、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の抗酸化効果を示す目的としては満足しうるものである（Banne, A., Amiri, A., Pero, R .W., 活発な疾病の診断による、患者での血清チオールの減少レベル。JAAM 6(4): 325-32, 2004; Pero, R .W., Giampapa, V., Vojdani, A., キャッツクローの抽出を促進するＤＮＡ修復の付加の有無による、広範なスペクトルの抗加齢の栄養補助剤についての比較。Anti-aging Med. 5(2): 345-353, 2002; Pero, R .W., Hoppe, C , Sheng, Y., ＤＮＡ修復の代わり（surrogate）の評価としての血清チオールは、哺乳類の寿命に関連する。Jour Anti-aging Med 3(3): 241-249, 2000; Pero, R .W., Amiri, A., Welther, M., Rich, M., 栄養補助剤を増強させるＤＮＡ修復及び免疫の組み合わせに関する、製剤及び医学的評価。 Phytomedicine 12(4): 255, 2005）を参照せよ）。キナ酸のキレート物質は、ＰｅｒｏによるＷＯ２００６／１０１９２２号に記載されており、参照により、全体として本願に引用される。
【００５６】
一実施形態では、尿中ニコチンアミドもしくはトリプトファンまたはそれらの組み合わせ（すなわち、ニコチンアミド＋トリプトファン)のレベルの、血清タンパク質チオールに対する比率を得ることは、このような干渉（例えば、血清チオール／トリプトファンまたはニコチンアミドの比率を減少させる、キナ酸アンモニウムキレート）または疾病状態（すなわち、血清チオール／トリプトファンまたはニコチンアミドの比率の増大）の存在より、当業者に、抗酸化治療及び他の健康上の利益に関する効果を予測させるものである。
【００５７】
本発明者らは、キナ酸は抹消循環に取り入れられないため、キナ酸それ自体がインビボで有利な効果を提供しないということを本願で決定付けている（図１を参照）。むしろ、望ましい臨床活性を与えるのは、シキミ酸経路への前駆物質の形態である（図２〜３を参照）。
【００５８】
本願の発明者らは、キナ酸誘導体、シキミ酸及び／またはコリスミ酸塩を含む芳香族アミノ酸の前駆物質は、トリプトファンまたはニコチンアミドの血清レベルに関する効果によって示されているように、活性を有することを最近になって見出した。本発明者らは、キナ酸のキレート物質は、いかなる理論によっても明らかにはなっていないが、促進した生理活性を示し、芳香族アミノ酸の前駆物質のシキミ酸経路への導入に起因した、トリプトファンの上昇レベルに寄与するものと確信している。有効な効果を媒介する抹消循環中に存在するという直接の証拠が全くないため、キナ酸自体はインビボでの生理活性化合物ではないと信じられている。
【００５９】
芳香族アミノ酸の前駆物質は、特徴的なことに、哺乳類における血清のトリプトファン及びニコチンアミドの濃度を増加させるだけの量、すなわち投与しない（基準の）１０％増のレベル、好ましくは３０％以上増加させる量で投与する。芳香族アミノ酸の前駆物質は、好ましくは、５０００ｍｇ／日まで、好ましくは１０００ｍｇ／日から５０００ｍｇ／日まで、または約１４．２から６６．７ｍｇ／ｋｇまでのシステマティックな用量でヒトに投与され、飲料、カプセル、錠剤、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射で、または皮膚に対し局所的に運ばれる。一実施形態では、（Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）として存在する）キナ酸のキレート物質が投与される。
【００６０】
好ましい用量形態は、液状（例えば、飲料）で経口投与され、または乾燥状でカプセルまたは錠剤として、あるいは食事との組み合わせで経口投与される。
【００６１】
実施形態の方法は、患者において、尿のトリプトファンもしくはニコチンアミドのいずれか、またはそれらの組み合わせ／患者の血清チオールという比率を決定することによって、インビボでの酸化的ストレスのレベルを決定することを含み、これは芳香族アミンの前駆物質の患者への投与後である。
【００６２】
他の実施形態の方法は、処置サイクルの最終後に、個体の血清タンパク質チオールのレベル、及び尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿酸またはその他任意のもののレベルを得ることを含み、及び当該処置サイクル後に、前記個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドもしくはそれらの組み合わせ／血清タンパク質チオールという比率に対する値を規定することを含む。
【００６３】
一実施形態による方法では、基準、及び当該疾病に苦しむ人々についての所定の正規化レベルが、抗酸化治療の効果を証明するのに比較される。抗酸化治療の効果は、少なくとも約２５％の増大、３０％の増大、５０％の増大、７５％の増大、１００％の増大、１５０％の増大、好ましくは約５０％を超える増大によって決定される。
【００６４】
これまで理解されることも開示されることもなかった、重要な生化学的出来事は、ヒトにおける２５ｍｇ／ｋｇという効果的な用量のキナ酸のキレート物質で、ＨＰＬＣ法の検出限界（１ｍｇ／ｋｇ；すなわち、効果的な用量のわずか４％）で、ヒトの血清中にキナ酸は全く発見されなかったということである。だが、キナ酸自体は、直接作用する生理活性原料ではないだろう。
【００６５】
当業者は、本願のキナ酸製剤の経口投与は、ヒトにおけるキナ酸レベルの顕著な上昇の原因ではないと認識するであろう。したがって、当業者は、トリプトファン及びニコチンアミドの生産に対する芳香族アミノ酸の前駆物質の作用のメカニズムは、ＧＩ管の微生物相のシキミ酸経路を介するということを認識するだろう。従来技術は、マウス及びラット中の約２５０ｍｇ／ｋｇのキナ酸が有効な効果を有したということだけをもたらしている。だが、かかる効果は、キナ酸に起因し、トリプトファンまたはニコチンアミドのような他の代謝物質には起因しないということを誤って結論付けたのである（Sheng, Y., Akesson, C , Holmgren, K., Bryngelsson, C , Giampapa, V., Pero, R .W., キャッツクローの水抽出物の活性原料：キナ酸の同定及び効果。Journal of Ethanopharmacology 96(3): 577-584; 2005）。従来技術の教示に反して、本発明者らは、有効な効果は、ヒトにおいて、５００から５０００ｍｇ／日まで、好ましくは １５００から５０００ｍｇ／日まで、または６．７から６６．７ｍｇ／ｋｇまでという用量の範囲にあるということを決定した。
【００６６】
本発明者らは、温血動物（すなわち、ヒトを含む哺乳類）に対する、芳香族アミノ酸の前駆物質の経口投与は、血清及び／または哺乳類の体中の生物学的な反応性組織における、トリプトファン及び／もしくはニコチンアミドレベルのレベルを上昇させるために使用されうることを見出している。医学的効果もキナ酸複合体及びシキミ酸／シキミ酸塩及びコリスミ酸塩、ビタミン、バイオフラボノイド、バイオフェノールのような他の抗酸化剤の混合投与によって達成されうると確信されている。本願発明の方法は、哺乳類の体中の血清、尿及び／または他の生物学的組織における、チロシンやフェニルアラニンのような芳香族アミノ酸のレベルを上昇させるために使用されうる。
【００６７】
トリプトファン及びニコチンアミドのレベルを増大させるための、芳香族酸に対する本願の前駆物質の経口投与に関する他の利点は、補給（supplementation）という本形態が正常な胃腸管の代謝によって調節され、直接のトリプトファンの補給と関連した可能性のある毒性効果を回避することである。
【００６８】
芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、キコナ バーク（chichona bark）を商業的に精製することにより得られうる。というのは、例えばシグマ（Sigma）またはアクロス（Acros）より入手できるからである。本願発明の一以上の特徴は、芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含有するか形成する食品または添加物を対象としているからである。
【００６９】
キナ酸を含有する機能的食品も、このような製品は化学合成されないため、キナ酸にとって優れた源として提供しうる。だが、本願発明の少なくとも一態様では、本願の化合物は、天然の、精製され、分離され、または合成の形態中に、このような食品の製品に対して添加され得、それは当該製品中の望ましい芳香族アミノ酸の前駆物質の含有量を最適化するためである。０．５％より高いレベルのキナ酸の含有量を有し、使用しうる食品源は、以下に制限されることはないが、キャッツクロー、プルーン、キウィ、シーバックソーン（sea buckthorn）、コーヒー、クランベリー、コケモモ、ブルーベリー、ウォートルベリー（wortleberry）、赤／黄 タマリロ、及びスルタナを含みうる。このような源は付加的な化学的改良を何ら要求しないため、より好ましい。キナ酸含有量＜０．５％を有する食品源も、使用可能である。このカテゴリー中、食品添加物であるキナ酸源の食品例は、マルメロ、サンフラワー、ネクタリン、ピーチ、西洋ナシ、プラム、ハチミツ、クロフサスグリ、セイヨウカリン、アプリコット、アスパラガス、マッシュルーム、及びグリーンオリーブである。
【００７０】
通常は、キナ酸のキレート物質のような芳香族アミノ酸に対する前駆物質は、ヒトにおいて、５００ｍｇ／日から５０００ｍｇ／日または約６．７から６６．７ｍｇ／ｋｇまでというシステマティックな用量で投与され、飲料、カプセル、錠剤、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射で、または皮膚に対し局所的に運ばれる。好ましい用量形態は、液状（例えば飲料）で経口投与され、カプセルもしくは錠剤または食品の製品と組み合わせて乾燥状で経口投与される。
【００７１】
健康上の効果を媒介するトリプトファン及びニコチンアミドを上昇させることにより処置されうる健康上の疾患の例は、セロトニン、ドーパミン及びニコチンアミド／ＮＡＤ受容体により変調されたものを含む。例えば、キャッツクローの水抽出物は、潰瘍性大腸炎（炎症反応）、変形性関節症／関節痛、腫瘍細胞の成長、体重の増量、オゾン病、ＤＮＡの損傷／細胞死、化学的治療が誘導する白血球減少症、及び認知症／アルツハイマー病を阻害し、または制御した。Sandoval-Chacon, M., Thompson, J .H., Zhang, X.J., Liu, X., Mannick, E .E., Sadowicka, H., Charbonet, R .M., Clark, D .A., Miller, M.J., キャッツクローの抗炎症作用：ＮＦ−カッパＢの役割を参照せよ。消化管の薬理学的治療１２: 1279-1289, 1998; Piscoya, J., Rodriguez, Z., Bustamente, S .A., Okuhama, N.N., Miller, M.J., 膝の変形性関節症における凍結乾燥したキャッツクローの効果及び安全性：キャッツクロー（Uncaria guianensis）という種の作用メカニズム。Inflammation Res 50: 442-448, 2001. Castillo and Snow 米国特許第６，３４６，２８０号、２００２年２月発行。キャッツクロー（Uncaria tomentosa）新規の水可溶性抽出物であるＣ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）が補充される、個体中の肺炎球菌のワクチンに対する持続性反応。Phytomedicine 8(4): 267- 274, 2001; Sheng, Y., Bryngelsson, C , Pero, R .W., 促進したＤＮＡ修復、免疫機能及びＣ−ＭＥＤ−１００の減少した毒性、キャッツクロー（Uncaria tomentosa）に由来する新規の水抽出物。Journal of Ethnopharmacology 69:115-126, 2000; Sheng, Y., Li, L., Holmgren, K., Pero, R .W., ボランティア研究における、ヒトにおけるキャッツクロー（Uncaria tomentosa）の水抽出物のＤＮＡ修復促進。Phytomedicine 8(4): 275-282, 2001; Akesson, C , Pero, R .W., Ivars, F., Ｃ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）、キャッツクロー（Uncaria tomentosa）の熱水抽出物は、インビボで白血球の生存を持続する。Phytomedicine 10: 25-33, 2003; Akesson, C , Lindgren, H., Pero, R .W., Leanderson, T., Ivars, F., 細胞分裂を阻害するキャッツクロー（Uncaria tomentosa）の抽出物、及び細胞死を誘導しないＮＦ−Ｂ活性、International Immunopharmacology 3 : 1889-1900, 2003。これら文献の全てが、参照により本願に引用される。
【００７２】
さらに、精神医学及び精神変性の疾患、鬱病、憂鬱、及びペラグラ（ビタミンＢ３の欠如）は、トリプトファン及び／もしくはニコチンアミド並びに／またはセロトニンレベルを増大させるのに十分な用量、及びこのような状態の症状を改善するのに十分な用量の芳香族アミノ酸の前駆物質で、首尾よく処置しうる。
【００７３】
なかでも他の原料であるキャッツクローの抽出物の中には、様々な抗酸化剤、すなわち、フラボノイド及びポリフェノール、並びにキナ酸、アジマシリン、アクアミジン（akuammigine）、カンペステロール、カテキン、カルボキシルアルキルエステル、クロロゲン酸、シンコナイン、コリナンテイン、コリノキセイン、ダウコレステロール、エピカテキン、ハーマン、ハーステイン（hirsuteine）、イソプテロポジン、ロガン酸、リアロシド（lyaloside）、ミトラフィリン（mitraphylline）、オレアノール酸、パルミトレイン酸、プロシアニジン、プテロポジンキノブ酸グリコシド（プテロポジンキノブ酸グリコシド（pteropodine quinovic acid glycosides））、リンコフィリン、ルチン、シトステロール、スペシオフィリン（speciophylline）、スティグマステロール、ストリクトシジン、ウンカリン（uncarine）及びバクセン酸を含む他の化合物を含有しうるものもある。
【００７４】
一実施形態では、芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、ケルセチン、ルチン、クリシン、ミリセチン、ゲニステン（genisten）、ヘスペリジン、ナリンギン及びそれらの混合物よりなる群から選択される、二次的な天然の、精製された、分離されたまたは合成の抗酸化剤を含みうる。
【００７５】
一実施形態では、芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、コエンザイムＱ、ピルビン酸塩、コエンザイムＡ、ユビキノール、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、アデニン、アデノシン、ナイアシン、ニコチンアミド、カンペステロール、カテキン、クロロゲン酸、シンコナイン、コリナンテイン、コリノキセイン、ダウコレステロール、エピカテキン、ハーマン、ハーステイン（hirsuteine）、ハーステイン（hirsuteine）、イソプテロポジン、ロガン酸、リアロシド（lyaloside）、ミトラフィリン（mitraphylline）、オレアノール酸、パルミトレイン酸、プロシアニジン、プテロポジンキノブ酸グリコシド（pteropodine quinovic acid glycosides）、リンコフィリン、シトステロール、スペシオフィリン（speciophylline）、スティグマステロール、ストリクトシジン、ウンカリン（uncarine）及びバクセン酸よりなる群から選択される二次的な抗酸化剤も含みうる。
【００７６】
好ましい実施形態では、芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、ニコチンアミド、ナイアシン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、フラボノイド、ケイ皮酸もしくはその誘導体、アスコルビン酸もしくはその誘導体、トコフェラール（tocopheral）もしくはその誘導体、及びビタミンＡもしくはＤまたはそれらの誘導体よりなる群から選択される二次的な抗酸化化合物を含みうる。
【００７７】
芳香族アミノ酸に前駆物質を含有する製剤は、任意の治療用原料をさらに含みうる医学的に許容可能なビヒクルをさらに含有しうる。これらの任意の原料は、抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑制薬、気分高揚剤及び抗炎症剤よりなる群から選択される。
【００７８】
一実施形態では、抗腫瘍性製剤は、フッ化ピリミジン、シチジンアナログ、プリン系抗代謝物質、植物のアルカロイド、アルキル化剤、アントラセン誘導体、抗腫瘍の抗生物質、金属複合体、抗アミノリン脂質抗体、抗血管形成剤及び放射線治療剤よりなる群から選択される。
【００７９】
他の実施形態では、前記任意の原料は、スルホンアミド、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、タンパク質合成阻害物質、抗カビ剤、抗ウィルス剤、抗結核剤よりなる群から選択される抗感染剤である。
【００８０】
他の実施形態では、前記任意の原料は、三環系抗うつ薬及びセロトニンの再取り込み阻害物質よりなる群から選択される抗抑制剤である。
【００８１】
さらに他の実施形態では、前記任意の原料は、ステロイド性の抗炎症剤及び非ステロイド性の抗炎症剤よりなる群から選択される抗炎症剤でありうる。
【００８２】
他の実施形態では、分離された薬剤組成物の生産に対する好ましい過程は、約６．９から約７．６までのｐＨに達するのに十分な水溶液中で、実質的に純粋なキナ酸を水酸化アンモニウムと混合し、キナ酸のアンモニウムイオンに対する比率が約１：１．５４である、キナ酸のアンモニウムのキレート物質を生成することを含む、効果的な量のキナ酸のキレート物質を付与することを含むと記載されている。水酸化アンモニウムの溶液は、約１％及び約１０％以上の濃度で、約１５分から約４時間までの時間で、溶液が約７．４から約７．６までのｐＨに達するのに十分な量で、１００ｍｌ当たり約５ｇから約３０ｇのキナ酸を含むキナ酸の水溶液に添加される過程が好ましい。
【００８３】
本願に記載される実施形態の組成物は、例えば、約ｐＨ７から約ｐＨ７．５までの範囲で、水酸化アンモニウムを用いた水性媒体中、約１：１．６のモル比率で、実質的に純粋なＤ−キナ酸をアンモニウムのキレート物質に変換することによって生成される。約ｐＨ７．５が好ましい。だが、本願に記載されたキナ酸アンモニウムキレートは、例えば、ｐＨ６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５及び７．６並びにそれらの間の全てのｐＨの値で生成されてもよい。キナ酸のキレート物質を作る他の方法は、本願で分節された方法の精神及び範囲から逸脱しない限り、本技術分野における通常の知識を有する者によって採用されうる。
【００８４】
実施形態である薬剤または栄養の組成物は、顕著且つ効果的な量のキナ酸のアンモニウムのキレート物質を含む。一実施形態では、アンモニアで処置したキナ酸が、生理的ｐＨで、約１：１．６（実際には１：１．５４）のモル比率で実質的に純粋なアンモニウムのキレート物質を形成できるＱｕｎｉｍａｘ（商標）を使用可能である。好ましくは、Ｑｕｉｎｍａｘ（商標）は、水溶性アンモニアでｐＨ＝７．５まで中和された実質的に純粋なキナ酸である。
【実施例】
【００８５】
原料及び手段
（ａ）サンプルの収集及び調製
１２時間の絶食後のたいていの場合午前中（ａ．ｍ．）に、バキュテナーを用いたベナル（ｖｅｎａｌ）な穿刺（レッドトップ（red top）、１０ｍｌ）により血液サンプルを収集した。１０分間、１５００×ｇでの遠心分離前に、卓上（bench top）での２時間のセッティング後、血液の塊から血清を分離した。本方法で調製された血清は、通常１〜３０日以内の収集で、生化学的解析まで＋４℃で貯蔵した。尿サンプルは、処置及びフォローアップ（８か月の処置後）の期間中、Ａ．Ｍ．に、ランダムに５０ｍｌのサンプルとして収集した。尿を５０００×ｇで１５分間スピンし、１か月以内の収集で解析されるまで、上清を＋４℃で貯蔵した。第１の解析後、全てのサンプルをさらに−２００℃で貯蔵し、長期の反復測定に使用した。
【００８６】
（ｂ）試行の計画
Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の臨床評価に対する試行の計画を、ルンド（Lund）大学で２００６年４月２８日から実行した。ＨＬ及びＲＰとして保護された２人の被験者のＩＤコード（identity code）は、４週連続（３６日間）で、それぞれ１５００ｍｇ／日及び３０００ｍｇ／日のペースでＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）を受けた。血清及び尿のサンプルを、試行期間中繰り返し収集し、その後６週前（基準）、４週間の診療（処置、３６日）及び８月間のドライアウト（dry-out）（処置なし）として、解析のための集団中に統合した。
【００８７】
準拠集団（reference group）は、正常な補給なしの個体との比較で規定した。それは、キナ酸をサプリメントとして全く摂取しなかった９個体からなる；１２〜８６歳の６名の男性及び３名の女性がいた。誰も喫煙しなかったが、９名のうち６名は、評価期間の前及び最中に微量栄養素のサプリメントを摂取していた。この非臨床の薬物動態の調査プログラムは、ヒトに対するヘルシンキ宣言（the Declaration of Helsinki）のガイドラインに従って行われた。さらに、インフォームドコンセントは、本研究への使用目的のみということで血液及び尿のサンプルを得るための個々の許可を含む全ての参加者から得られ、機関の再審査の承認も得られた。
【００８８】
晒されていない（コントロール）及び栄養補給された集団の、キナ酸、馬尿酸、トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルを表３に示す。補給された、及び晒されていないコントロールの双方を含む、各集団に対する尿の平均値を、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の効果及び代謝を評価するために、ｔ−検定の統計で比較した。
【００８９】
さらに、非臨床の薬物動態の評価を含む、この基準をコントロールとする試行もまた、補給前（すなわち基準）の血清サンプルを補給中（４〜５週）までの血清サンプルと比較し、なお、前記血清サンプルは、同じ個体に対し、ドライアウトの値に対して比較された（８月間の処置なし後直ぐに）。個体の血清タンパク質チオールの値の合計は、図７及び８に示されたように、後述のように観察し、評価できる。このような手法では、これらの生化学的パラメータにおける個体間の多様性は、プロトコールから離れてランダムなものとなる。なぜなら、抗酸化試験のパラメータ（血清タンパク質チオール）における個体の多様性は、処置の開始前の個体の基準値における相違を制御することによって、計画から外れたものとなるからである。
【００９０】
【表２】
【００９１】
（ｃ）血清タンパク質チオールの、インビボでの抗酸化指標としての評価
下記の詳細な説明は、ＤＮＡ修復のキャパシティーを評価するために過去に使用された、血清タンパク質チオールのインビボでのレベルの評価を標準化（正規化）するために計画された。血液サンプルを収集し、血清を分離する場合、血清タンパク質チオールのレベルは、既存のインビボでの酸化環境と順次、平衡状態になるタンパク質構造中に存在する、チオールとジスルフィドとの間の濃度の評価である。このように、血清タンパク質チオール解析は、ＤＮＡ修復により順次調節される個体の抗酸化状態に関するインビボでの評価である。
【００９２】
（ｄ）タンパク質チオールの定量的測定に対する標準的なチオール感受性曲線の証明
比色分析剤である５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）の原液を、９．５ｍｇ／ｍｌの固体状ＤＴＮＢ、０．１ＭのＫ２ＨＰＯ４及び１７．５ｍＭｂのＥＤＴＡを用いて調製した。ｐＨを７．５に調節し、その後望ましい量まで希釈した。実際に使用できるＤＴＮＢ溶液は、ＤＴＮＢ原液を生理食塩水と１：５０で希釈することにより調製した。Ｌ−システインの溶液を調製し、標準曲線を所望のものとなるように０−１００μＭの範囲で構築した。原液を要求通りに希釈し、吸光度を９６穴の平底のマイクロタイタープレートを用いて測定した。２００μｌの実際に使用できるＤＴＮＢ溶液を伴う５０μｌのＬ−システイン溶液をウェル（穴）ごとに配置させた。濃度当たり２または３の複製を製作した。
【００９３】
ＤＴＮＢのブランク（５０μｌの生理食塩水＋２００μｌのＤＴＮＢ）を製作した。吸光度の値は、マイクロタイタープレートのスキャナ分光光度計を用いて４１２ｎｍで測定した。全ての濃度の平均を計算し、ＤＴＮＢのブランクを全ての値から差し引いた。標準的なシステイン溶液との比較による、濃度（ｘ−軸)対吸光度（ｙ−軸）のプロットを用いて、システイン濃度を決定した。
【００９４】
（ｅ）血清タンパク質チオールの測定
飽和した硫酸アンモニウム溶液を調製した。全てのサンプルに対して２００μｌの血清を用いて、血清を８００μｌの飽和した硫酸アンモニウムで沈殿させた。１．５ｍｌのバイアル中、１２，０００Ｇで１５分間、室温でサンプルを遠心分離した。バイアルの底が固体のペレットを含有する場合に、前記底を乱すことなくその上清を捨てた（約８００μｌ）。その後、ペレットを６００μｌの生理食塩水中で再懸濁した。透明な９６穴の平底のマイクロタイタープレートを解析に使用した。１の複製を下記のように調製した：（ｉ）１ウェル中、２００μlの実際に使用できるＤＴＮＢを伴う、５０μｌという一定分量の血清、及び（ｉｉ）別の１ウェル中、２００μｌの生理食塩水を伴う５０μｌの一定分量を配置させることによる、血清のバックグラウンド。これを全てのサンプルに対して３回繰り返した。ＤＴＮＢのブランクを作り（５０μｌの実際に使用できるＤＴＮＢ＋２００μｌの生理食塩水）、生理食塩水のブランク（２５０μｌの生理食塩水）も３つの複製において作った。前記ウェル中の泡を確実に避けつつ、マイクロタイタープレートのスキャナセットにおける、４１２ｎｍでの吸光度を測定した。
【００９５】
（ｆ）システインの標準曲線からの血清タンパク質チオールの評価
平均は、ＤＴＮＢのブランク及び生理食塩水のブランクを計算した。全ての複製に対して、ＤＴＮＢのブランクを全てのサンプル値から差し引いた（補正後サンプル）。また、生理食塩水のブランクを全ての血清値から差し引いた（補正後血清）。計算を示した、下記の表２に示された例を参照せよ。
【００９６】
その後、補正された血清値を補正されたサンプル値から差し引いた。この値は、４１０ｎｍでの吸光度として表された、最終の血清チオール値であった。与えられた例に示されているように、この平均値は全ての複製に対して計算され、表２で与えられる。
【００９７】
【表３】
【００９８】
表２に示された平均値は、該当するシステインのモル濃度の決定に対する標準曲線中に取り入れられた。このように、値は、システインのモル当量として表される血清チオールのモル濃度である。血清を沈殿させ、遠心分離でスピンさせた後、ペレットを６００μｌの生理食塩水中で再懸濁した。ペレットの量の増加に伴い、最終量は８００μｌとなった；２００μｌの純粋な血清を始めに分離した。これは、このように４倍希釈であった。サンプルの血清はその後、ウエルに配置され、５倍に希釈された（２５０μｌ中５０μｌ）。
【００９９】
同時に、これは２０倍希釈（４×５＝２０）であった。このように、標準曲線から読み取れるチオール値は、２０倍されるべきである。さらに、我々のデータを文書化され登録されたデータと比較できるようにするために、０．７２２という係数でかけることが必要となる。これは、過去に使用された係数に起因した。チオールは、ここではｎｍｏｌｅｓ／０．７２ｍｌで測定された。
【０１００】
ｇ）高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）の通常条件
馬尿酸、キナ酸、ニコチンアミド及びトリプトファンのＨＰＬＣ解析は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒの、ＵＶ検出器７８５Ａを備えた２００ＬＣポンプを用いて行われた。ＨＰＬＣで評価される各化合物の同定も、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）解析で独立に確かめられた。カラムは、Ｃ１８ １５０×４．６ｍｍもしくはＣ１８ ８０×４．６ｍｍのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｂｒｏｗｎｌｅｅ（Pecosphere part 第０２５８−０１９６もしくは０２５８−０１６６）のいずれか、または、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ１８ ３０×４．６ｍｍのＢｒｏｗｎｌｅｅ ｐｒｅｃｏｌｕｍｎと併せて、である。１５００〜５０００ｐｓｉで１ｍｌ／分、カラムを通って移動相を送り出した。ＵＶ検出器を、検出されている化合物に応じて２００ｎｍ〜２３０ｎｍの波長でセットした。
【０１０１】
２０μｌの注入ループを、全ての実験で使用した。データを蓄積し、ＰＥ Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ ４（Ｓ２７０−００５２）を用いて再処理した。Ｃ１８カラムを、下記の一連の溶剤：アセトニトリル：メタノール（３０：７０、ｖ／ｖ／）、１００％メタノール、メタノール：水（５０：５０）、メタノール：０．２％ＴＦＡ、及び１００％ ０．２％ＴＦＡを用いて、１ｍｌ／分、３０分の洗浄で再生した。あらゆるケースにおいて、定量評価は、分析グレードの純度の商業上利用可能な標準化合物を用いて、ピーク高さの計算に基づいた。全てのＨＰＬＣ解析に適用されるこれらの通常条件は、本研究で実行した。
【０１０２】
（ｈ）血清中のキナ酸を定量化するためのＨＰＬＣサンプル及び標準曲線の条件
０．２及び３０ｍｌの血清サンプルを血液から収集し、エタノールまたはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）のいずれかを用いて沈殿させた。洗浄（clean-up）後、上清を乾燥し（エタノール沈殿した）、または直接使用した。蒸留水に溶解したキナ酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて、標準曲線を調製し、方程式ｙ＝６０１２．８ｘ−２４６９８に従った；０〜２５ｍｇ／ｍｌの間の溶液２０μｌ注入を用いた。
【０１０３】
（ｉ）単一の高用量のキナ酸の時間の研究
６５歳の見かけでは健康なボランティアが、１５分超の時間中３００ｍｌの水で溶解した６ｇｍのキナ酸アンモニウムキレート（Ｑｕｉｎｍａｘ（商標））を飲用した。サンプルを収集し、その後、約４０ｍｌの末梢の血液（４−ｒｅｄ ｔｏｐｐｅｄ バキュテナー）は室温で凝固させ、血清サンプルを遠心分離で調製した。血清のサンプリング点は、０．７時間、１．７時間、２．７時間、３．７時間、１０．５時間、１２．５時間、２２時間、２８時間及び４４時間であった。３０ｍｌの血清サンプルを５０％エタノールで沈殿させ、気流の下で乾燥させ、同時にキナ酸及び馬尿酸のＨＰＬＣ解析を行うために、１ｍｌのメタノールで再溶解した。データより、３０ｍｌの血清にキナ酸が存在するということが分かった。この実験で使用されたカラムは、Ｃ１８ １５０×４．６ｍｍであった。前記移動相は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であった。ＵＶ検出器は２２０ｎｍでセットされ、キナ酸は２．２６分間の保持で溶出し、馬尿酸は８．３分間であった。本方法の感度は、約１／３０＝０．０３３ｍｇのキナ酸／ｍｌの血清であった。
【０１０４】
（ｊ）１日当たり１５００ｍｇ及び３０００ｍｇの反復した用量の、６週超の期間、血清で分析されたキナ酸
２名のヒトのボランティアである被験者ＨＬ（２０歳）及び被験者ＲＰ（６５歳）が、１日当たり１５００ｍｇまたは１日当たり３０００ｍｇの日用量を摂取し、並びに５月８日、５月１５日、５月１８日、５月２３日、５月２９日及び６月１日に血清サンプルを採取した。
【０１０５】
これらのサンプルは、２Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いた沈殿後に、２００μｌの血清中で、キナ酸の含有量をそれぞれ分析した。これらの実験に使用されたカラムは、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍであった。移動相は、０．２％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：メタノールが８５：１５であった。ＵＶ検出器は２１５ｎｍでセットされ、キナ酸が１．４０〜１．５分の保持時間で溶出した。この方法の検出感度は、約１ｍｇのキナ酸／ｍｌ血清、または本研究において本願で使用されているように、２１〜４２ｍｇ／ｋｇではなく、ヒトにおいて、７０ｍｇ／ｋｇという検出可能な用量であった。このように、４〜５週の期間中、反復した日々の投与後に、血清中のキナ酸レベルが蓄積するならば、このプロトコールは評価できる。
【０１０６】
（ｋ）血清中の馬尿酸のＨＰＬＣ解析
血清サンプルを＋４℃で貯蔵し、１か月以内の採取で解析した。血清サンプル（２００μｌ）は、２ＭのＴＣＡ（２５ＭのＴＣＡの場合、２５μｌ）で沈殿させることにより、解析のための調製を行った。ＴＣＡの上清のＨＰＬＣへの２０μｌ注入は、３６日間のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の補給及び３０日のフォローアップ（処置なし）の間、採取された血清サンプルに関してなされた。血清は、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍを用いたＨＰＬＣ及び０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：メタノールが７５：２５の移動相によって解析された。
【０１０７】
ＵＶ検出器は２２８ｎｍでセットされ、馬尿酸は４．０〜４．２５分の保持時間で溶出した。標準曲線は、蒸留水で溶解された様々な濃度の馬尿酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて調製した。０〜０．１５ｍｇ／ｍｌの間の溶液の２０μｌを注入した後、プロット前にμＭに変換し、方程式ｙ＝５１１ｘ＋６６１６によって表された。この標準曲線は、血清中の馬尿酸のレベルを検出し定量化するのに十分であった。それは、ＨＰＬＣによるキナ酸１ｍｇ／ｍｌと比較した、約０．０１ｍｇ／ｍｌである増大した感度のためである。
【０１０８】
（ｌ）ＨＰＬＣ解析に対する尿サンプルの予備的な洗浄（clean-up）
尿サンプルは、１０分間激しく振盪させながら、水性の尿：９５％エタノール：酢酸エチルを１：２：４ ｖ／ｖ／ｖで混合した。酢酸エチルの層は、室温下、重力で分離し、その後、それはピペットで除去され、気流で脱気され、真空フード中で乾燥した。この手法で、１〜２ｍｌの尿を、水またはエタノール０．２ｍｌ中に戻した。これは、５〜１０倍の（サンプルの）濃度を示した。代謝物質の抽出というこの方法を用いた回収は：キナ酸＝５３％、馬尿酸＝５３％、ニコチンアミド＝５４％、及びトリプトファン＝６６％であった。
【０１０９】
（ｍ）尿中のキナ酸及びニコチンアミドのＨＰＬＣによる同時検出
尿サンプルをエタノール及び酢酸エチルで、１：２：４ ｖ／ｖ／ｖに希釈し、その後、酢酸エチル画分を乾燥し、０．２ｍｌの水で可溶化し、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍに直接、２０μｌの注入を伴うＨＰＬＣ解析を用いた。移動相は８：８：８４（ｖ／ｖ／ｖ）の比率で、０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：メタノール：アセトニトリル（７０：３０）：水であった。ＵＶ検出器は２１５ｎｍでセットされ、キナ酸は０．９７〜１．０５分の保持で溶出し、ニコチンアミドは２．６〜２．９分であった。尿中の検出限界は、キナ酸で約１．５ｍｇ／ｍｌであり、ニコチンアミドで０．０１５ ｍｇ／ｍｌであった。０〜１７．５ｍｇ／ｍｌの間のキナ酸で、用量反応は、ｙ＝５３．５２ｘ＋３３．５５と表され、０〜０．２ｍｇ／ｍｌの間のニコチンアミドで、用量反応はｙ＝４７４８ｘ−０．１１７４という線形回帰直線を与えた。
【０１１０】
（ｎ）尿中のトリプトファン及び馬尿のＨＰＬＣによる同時検出
尿サンプルをエタノール及び酢酸エチルで、１：２：４ ｖ／ｖ／ｖとなるように希釈し、その後、酢酸エチル画分を乾燥し、０．２ｍｌの水で可溶化し、Ｃ１８ ８０×４．６ｍｍに直接、２０μｌ注入を伴うＨＰＬＣ解析を用いた。移動相は、０．２％ＴＦＡ：３０％メタノールが７０：３０ ｖ／ｖであった。ＵＶ検出器を２２５ｎｍにセットした。トリプトファンは５．２〜５．４分後に溶出し、馬尿酸は３．１〜３．４分後に溶出した。尿中のトリプトファン及び馬尿酸の検出限界は、それぞれ０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌであった。０〜０．０６ｍｇ／ｍｌの範囲内の用量で、トリプトファンはｙ＝３５５７ｘ＋３．３４５という線形回帰を生じ、０〜０．１５ｍｇ／ｍｌという用量範囲は、馬尿酸に対して、ｙ＝４５９２ｘ−７２．４６という類似の直線関係を与えた。
【０１１１】
例１：ヒトの被験者におけるキナ酸代謝の特性解析
６０００ｍｇという単一の高用量を被験者に経口で投与し、その後、３０ｍｌの血清サンプルを投与（exposure）後０．７〜４４時間で取られた全血サンプルから調製した。血清サンプルがエタノールで沈殿し、１ｍｌの水で再溶解すると、これは、各血液サンプル中に存在するキナ酸の３０倍増の濃度を可能にし、前記方法を、少量のキナ酸でさえ極めて微妙な差を検知できるようにした。そのデータを図１に示す。
【０１１２】
（ｉ）キナ酸の馬尿酸への最大限の変換と殆ど同時に、１０．５時間後のキナ酸の血清中への最大限の取り込み（約７時間後のシステマティックな循環における、すなわち血清における）が観察された。経口投与された４．４ｍｇ／ｍｌの６０００ｍｇだけが、血液の流れに蓄積した。総用量である６０００ｍｇのうち４．４ｍｇのみが、血清中に取り込まれた（すなわち０．０７３％）。これは、キナ酸の９９．９％が、４４時間の期間内に排出されるか、または代謝されたことを示唆している。
【０１１３】
図１中のデータは、１５００ｍｇまたは３０００ｍｇのいずれかのキナ酸のキレート物質（Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標））の、６週間という日々の投与及びフォローアップ後に、血清を分析することによって確認され、拡張された。血液サンプルが取られ、血清は、反復したＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の経口投与後に、１０日目から３７日目までで６倍に調製され、これらのサンプルはその後、キナ酸で解析された。被験者がいかに長期間、日々のキナ酸のキレート物質の用量で処置されたにもかかわらず、血液の血清サンプル中にはキナ酸は発見されなかった。結論として、２７という反復したＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の用量（３７日−１０日＝２７日）後でさえ前記方法の実証された感度によって解析された場合、反復した日々の投与後でも、キナ酸は血液の流れを蓄積しなかった（すなわち、それぞれ４０，５００ｍｇまたは８１，０００ｍｇに等しいキナ酸の総用量)。
【０１１４】
（ｉｉ）キナ酸の９９．９％は血清中で発見されなかったので、尿中に排出されたか、またはおそらく他の化合物に代謝されたかが疑問となった。（３６日及び８か月のフォローアップ（すなわち処置なし）中、）３０００ｍｇ／日または１５００ｍｇ／日でＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の日々の経口の処置を連続４〜５週間採取した尿サンプルは、キナ酸について解析された（表３、図２〜３）。全体の評価期間に対する尿中のキナ酸の平均レベルは、それぞれ約１８４ｍＭ±１０３（ｎ＝１９）及び６５±４９ｍＭ（ｎ＝１７）であると分かった。これらの平均値の標準偏差は、時間と共に尿のキナ酸の大きな変動を示す。それらが、９か月後も依然として上昇し、身体的補給基地からの代謝移動を反映しているにもかかわらず、である。１日当たり１．５リットルまで生産された多量の尿を用いて、１日の尿中のキナ酸当たり、３０００ｍｇ／日の経口用量後の約１８４ｍＭ、または（１日当たり５３，０３９ｍｇ／１．５リットルの総尿量まで変換する）１８４ｍｍｏｌｅ／リットルの検出が得られた。
【０１１５】
尿中の６５ｍＭのキナ酸を生じた、１５００ｍｇ／日という経口用量に対する似た計算は、１日当たり１８，７３７ｍｇ／１．５リットルの総尿量を与えた。これらのデータを表３に要約し、投与された総用量５６％及び４０％は、９か月の評価期間後に代謝されないキナ酸として排出されるという解析を支持するものである。
【０１１６】
キナ酸は、ドライアウト（dryout）の期間（すなわち、処置後の８か月間）中、尿中で検出されうるので、キナ酸は反復した投薬からＧＩ管中に蓄積しうるということは理路整然としていた。さもなければ、経口補給後に、８か月のフォローアップ（処置なし）に対する尿中へ排出することなどどうして分かるのだろうか（表３、図２〜３参照）。３０００ｍｇ／日または１５００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）のいずれかの経口投与前またはその後すぐの、尿中で発見されるキナ酸の代謝物質のレベルを表３に提供する。
【０１１７】
これは、キナ酸または必須アミノ酸またはビタミンのいずれかのさらなる補給を欠く場合でさえ、芳香族アミノ酸の持続的生産を可能にする、まさに好ましい栄養学的意義を強く示唆するものである。
【０１１８】
例２：ヒトの被験者におけるキナ酸代謝としての馬尿酸の特性解析
４月２８日から６月１日までの経口投与期間中１５００ｍｇ／日及び３０００ｍｇ／日のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の経口用量後の馬尿酸源として、２００６年６月２日から２００７年１月２０日までの追加的なドライアウト（dryout）の期間（８か月間処置なし）からは、含まれたサンプルと併せて、経口投与後の馬尿酸源として、キナ酸も評価された。
【０１１９】
ヒトを含む動物は、５％から７０％の間の用量のキナ酸を、１〜８日以内に、安息香酸及びその後は馬尿酸まで代謝できるということがよく知られている。このように、馬尿酸は、キナ酸投与（exposure）に由来すると特徴付けられる、過去に知られた代謝物質にすぎない。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
ここで、我々は、馬尿酸尿の存在を、尿と血清の両方について分析している。尿中、馬尿酸のｍＭが見出された（表３、図２〜３）。例えば、尿は、３４１２ｍｇの馬尿酸／１．５リットルを示した、１２．７ｍＭ以下の馬尿酸を生じた。キナ酸アンモニウムキレート／７０ｋｇの人間としての、日々の総用量である３０００ｍｇのＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は、４３ｍｇ／ｋｇに等しいか、または約４３ｍｇ／リットル＝６４．５ｍｇ／１．５リットルに等しい。ヒトの体の総水量は、０．７リットル／ｋｇであると評価された（Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は、水及び尿中に等しく分配されると仮定した場合）；その後、３０００ｍｇが溶解した、０．７リットル×７０ｋｇ リットル＝４９リットルは、３０００ｍｇ／４９リットル＝９１．８ｍｇ／１．５リットルに等しく、これは、キナ酸が完全に吸収されて排出されないならば、存在したはずの量である。
【０１２２】
このように、これらの計算は、９１．８ ｍｇ／１．５ リットルで除される６４．５ｍｇ／１．５リットルまたはおよそわずか７０．３％の日々投与された用量のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（すなわち、３０００ｍｇ／ｍｌのキナ酸）が日々、馬尿酸として尿中へと排出され、残る２９．７％のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）が馬尿酸としてシステマティックな循環中へと吸収されるか、または他の化合物までさらに代謝されたということをサポートする。
【０１２３】
だが、わずかｍＭ量の馬尿が尿中に見出された−＜２０μＭという極めて低いレベルの馬尿酸が血清中に見出されたに過ぎない（図４を参照せよ）。馬尿酸は、この用量範囲内では血清中でほとんど検出不可能であり、このように、このような結果は、キナ酸のシステマティックな分配へのわずかな吸収、及びそこでの馬尿酸への変換と相関があるということに当業者は注目しうる。さらに、少なくとも血清濃度（すなわち、＜０．０２ｍＭ、図４）及び３０００ｍｇ／日というＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）投与後の馬尿酸の尿レベルにおける相違（０．４９〜１２．７ｍＭ、図２、表３及びテキスト計算）は、少なくともキナ酸が他の化合物まで代謝され、馬尿酸として排出されないことを証明するものである。
【０１２４】
これらの低レベルであっても、処置に対する用量反応が観察された血清の馬尿酸でさえ、これらは、この原料について見られるＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の処置に対する用量反応であった（図４）。血清及び尿についてのこれらのデータを考慮すると、キナ酸／馬尿酸のレベルは、システマティックな循環中でキナ酸がほとんど見出されないということを示しており（投与された用量が＜０．１％、図１及びテキスト計算を参照せよ）、キナ酸がまさにシステマティックな取り込み代謝を受けるということを血清及び尿の両方が証明するとしても、馬尿酸は検出されうるが、投与量の約７０．３％が変化しないまま尿中に排出される（図２及びテキスト計算を参照せよ）。
【０１２５】
尿中で行方が不明である残り２９．７％のＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）のうち、わずか痕跡量のみが血清中に馬尿酸として同定され、このように、血清中でのキナ酸及び馬尿酸の薬物動態のデータに匹敵している（表３及び図１〜４も参照せよ）。わずか痕跡量のみであるキナ酸または馬尿酸のいずれかが血清中に見出されたので、潜在的には、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の日々の投与用量のうち、たった２９．７％が、システマティックな循環またはＧＩ管中の他の化合物へと変換しうる。
【０１２６】
この薬物動態の解析は、過去に文書化されたキナ酸の有効な効果は、キナ酸自体に起因しているというよりもむしろ、シキミ酸経路に活性のある前駆物質の化合物に起因しているということを示唆している。
【０１２７】
例３：尿中のキナ酸の相当するレベルにおける、尿中の馬尿酸レベルの依存性
本研究では、キナ酸、馬尿酸、トリプトファン及びニコチンアミドに対する尿の値の基準値は、同様に、１２〜８６歳の年齢の間（ｎ＝９）という広範に亘る準拠集団で決せられた。キナ酸及び馬尿酸に対するデータは、図２〜３に存在する個体のキナ酸で処置された尿の値を伴う、表３に要約された。キナ酸及び馬尿酸の尿のレベルの間でコントロール（晒されていない）及び反復的に抽出されたＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸）で処置された個体（ｎ＝４５）についての、全体の抽出された人間の集団に基づく、真にかなり顕著な直線状の相関性があった（ｐ＜０．００１）。このことは、馬尿酸は主に着色性の果物及び野菜中のキナ酸と関連した食生活上の因子によって影響を受けており、ベンゼンまたはトルエンのような環境的な毒性のある芳香族の投与（exposure）を反映していなかったという強い証拠と捉えられた。
【０１２８】
例４：個体の抗酸化状態に関するインビボでの評価としての血清タンパク質チオールの解析
ここで報告されたキナ酸及び馬尿酸についての薬物動態のデータの後、明らかなことに、過去に使用されたキナ酸の経口用量は、キナ酸自体によっては直接的に何らの効果媒介にも関与しなかった；すなわち、それはシステマティックな循環中では検出できないためであり、キナ酸用量の約４０〜６０％は、たとえ９か月（表４及びテキスト計算）を超えていたとしても、代謝されずに尿中に排出された。初期の報告は、（ｉ）ドキソルビシンの科学的な治療の処置からの回復及び（ｉｉ）細胞死及び細胞生存のない成長の捕捉を含む、様々な臨床の評価項目（ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）に対して評価されたが、我々は、これらの出来事が共に酸化還元（酸化／還元）のバランス及びＤＮＡ修復に非常に依存するということを示している。結果として、ここでは、我々は、抗酸化の有効な効果という指標として、血清タンパク質チオールの状態を使用している。
【０１２９】
１か月の処置 及び８か月のフォローアップ（処置なし）を含む、ヒトにおける９か月という期間を超える、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）の代謝の運命は、表４に与えられている。
【０１３０】
血清タンパク質チオールのデータは、図６〜８において要約的に示されている。まず、図６〜７は、６月２日〜８月３１日という短期のドライアウトの期間、及びさらに長期のドライアウトの期間（２００６年９月〜２００７年１月２０日）の双方を含む診療後の値から、（基準の）血清チオール前の値を識別する、個体データの点を示す。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
明らかなことに、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の補給は、処置及びフォローアップの期間と通じて上昇したままでさえある、タンパク質に存在している、減少したチオール（−ＳＨ）の顕著な増大と関連していた。これは、酸化還元バランスが酸化状態から移行したという直接の証拠であると考えられてきた。血清タンパク質は、シグナル伝達タンパク質を含有するため、これは、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）を伴った補給中、及び驚くべきことに少なくとも９か月の評価期間中、インビボで生じる抗酸化状態の主要な移行についての強力な証拠であった。
【０１３３】
結論として、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は強力な抗酸化剤であったが、変換する抗酸化効果を媒介しうる他の化合物へ変換されることにより、前代謝物質としてのこれらの効果の原因となるに違いない。その論理は単に、３６日間及び更に処置のない８か月のフォローアップ期間という、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）の反復的な投薬の後でさえ、血清中でのキナ酸のシステマティックな蓄積がなかったため、８か月間もさらなる補給が無かった場合に、キナ酸自体がどのくらい血清チオールを上昇させることができるかというものであった（図６〜７参照）。
【０１３４】
図８は、おそらく遺伝的及び環境学的な要因のために、次から次へと個体が変化した、個体の基準の血清チオールをさらに分類化する。だが、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）が経口投与された場合、バックグラウンドレベル（すなわち、基準のチオール状態）とは独立した、血清のチオールレベルにおける個体内の増大があった。
【０１３５】
結果として、結局のところ、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）についての抗酸化の有効な効果は、明白に存在しており、だが、キナ酸自体ではなくそれが誘導した他の代謝が原因となっていなかった。
【０１３６】
例５：微生物／植物のシキミ酸経路と関連した代謝物質についての尿の解析
キナ酸は、経口で投与される場合、尿サンプル中の馬尿酸として同定されるため、少なくともキナ酸を馬尿酸まで代謝できる腸内の微生物相が十分に証明されているが、キナ酸が腹腔内注入で投される場合、馬尿酸への変換は全くなかった。
【０１３７】
ヒトのＧＩ管中に存在している機能的なシキミ酸経路についての馬尿酸の証拠にもかかわらず、キナ酸は、シキミ酸塩からコリスミ酸塩への、トリプトファンへの、そしてニコチンアミドへの代謝経路に従って生成した化合物の増大した生産にはなりえないということを実証する、報告された研究はこれまでのところ全くない。初めて、我々は，トリプトファン及びニコチンアミドの尿レベルがＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）（キナ酸アンモニウムキレート）のような芳香族アミノ酸の前駆物質への投与（exposure）により誘導されたということを実証した。
【０１３８】
ＧＩ管は、最も重要な体の中の器官の機構の一つであり、細胞成長及び健康上の維持に対する適切な栄養を維持するのに必要なタンパク質、脂肪及び糖類の破壊及び再合成に関与する。主要な栄養源の中には、体で合成されないものもあるが、シグナル伝達（例えば、セロトニンやドーパミンを介して）及び構築タンパク質（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に多く必要とされるのが、芳香族アミノ酸であるトリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンである。それらは全て、ニコチンアミド及びＮＡＤといった主要なエネルギー源とともに、シキミ酸経路で生産される。
【０１３９】
表３及び図９〜１０に示されたデータ解析は、トリプトファン及びニコチンアミドの尿レベルを２名の被験者、すなわち３３日間（すなわち処置期間）連続で１５００ｍｇ／日を受ける者と３０００ｍｇ／を受けるもう一方の者において測定した場合、コントロール（ｕｎｅｘｐｏｓｅｄ）と比較すると、双方の用量は尿のトリプトファン及びニコチンアミドについての顕著に上昇したレベルを有したことを示している。サンプルが８か月後のフォローアップの解析に含まれた場合でさえ、トリプトファン及びニコチンアミドの尿中レベルは依然として上昇したままであった。尿中のトリプトファン及びニコチンアミドは、体の残り部分におけるこれらの栄養の状態に関する良く知られた強力な指標であり、そのため、結局のところ、キナ酸の補給は、ＧＩ管中の馬尿酸の合成を増大させるだけでなく、トリプトファン及びニコチンアミドの合成も増大させる。
【０１４０】
さらに、トリプトファン及びニコチンアミドは共に、８か月のフォローアップ期間を通じて尿中で上昇し続け、同期間中に増大した血清チオールによって証拠付けられたように、抗酸化のシステマティックな効果を媒介する際の、それらの関与に対するサポートであった(図６〜８を参照）。
【０１４１】
例７：血清チオールに関連したトリプトファン、ニコチンアミドの解析
血清チオールによって見積もられた、トリプトファン／ニコチンアミド及びシステマティックな抗酸化レベルの間の関係をより良く実証しようとするために、我々は、さらに、マイクロモルレベルの血清チオールに関連した、尿中のトリプトファンまたはニコチンアミドのモル比率を分析することを考慮した。表５は、血清中の増大したマイクロモルレベルのチオール（システマティックな循環への取り込み）と比較した、トリプトファンまたはニコチンアミドの尿（排泄）中での増大したレベルの比率を明白に示しており、キナ酸の経口補給に対する強力な用量反応があった。
【０１４２】
顕著に、これらの比率は、（キナ酸アンモニウムキレート）消費と関連した個体の抗酸化状態の代謝コントロールを評価した。理論的には、用量補給の相違は、Ａｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）は、１日当たり３０００ｍｇ／１日当たり１５００ｍｇ＝２．０の比率；トリプトファンとして表５より実験的に計算されたのは、１．９４／０．８１＝２．４の比率であった；ニコチンアミドとして表３より実験的に計算されたのは、４．２９／２．３２＝１．８５の比率であった。
【０１４３】
ニコチンアミド及びトリプトファンの血清タンパク質チオール代謝に対する関係を表５に与える。データは、図６〜８及び表３から計算されている。少なくとも３０％という有利な増大が好ましい。
【０１４４】
【表６】
【０１４５】
例８．キヌレインで測定した場合のインドールジアミンのオキシゲナーゼの活性
トリプトファン合成が一旦シキミ酸経路によって刺激されると、インドールジアミンオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を介したキヌレイン及び／またはヒドロキシトリプトファン−セロトニン及び／またはキノリン−ドーパミンもしくはニコチンアミド−ＮＡＤ（エネルギー）への異化代謝によって、さらに変更される。インビボでのキナ酸の投与（exposure）によるＩＤＯ活性の阻害は、免疫抑制活性の減少を助ける。
【０１４６】
ＩＤＯ活性は、高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により、２００μｌという一定分量の２ＭのＴＣＡで沈殿した血清中、トリプトファンのキヌレインに対するモル比率の決定によって計算された。前記ＨＰＬＣの方法は、装置がＨＰ１１００シリーズで、カラムがＸＴＥＲＲＡ ＭＳＣ１８（３．５ｃｍ長、４．６ｍｍ×５０ ｍｍ)である点以外はあらゆる詳細について既に発行されている（Laich, A , Neurauter, G , Widner, B , Fuchs, D .トリプトファン及びキュレニン（kyurenine）のＨＰＬＣによる同時測定に対するより迅速な方法。Clinical Chemistry 48 (3) : 579-580, 2002）。
【０１４７】
キナ酸の効果は、さらにシキミ酸経路の最終生成物に関して特徴があった。したがって、キナ酸の補給が、トリプトファン及びキヌレインの同時検出を通じたＩＤＯ活性に対して解析された。トリプトファン／キヌレインの高比率は、免疫抑制である （Bauer, TM, Jiga, LP, Chuang, J-J, Randazzo, M , Opelz, G , Terness, P．インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの免疫抑制の役割に関する研究：トリプトファンの代謝物質が、インビトロ及びインビボでの、ラットの同種異系のＴ細胞の反応を抑制する。Transplant International 18 (2005) 95- 100, 2004）。トリプトファンのレベルは、キヌレインの代謝により減少するよりもむしろ上昇するため、キナ酸はＩＤＯ活性を阻害する。これらのデータは、キナ酸自体がキナ酸活性の効果的な形態ではないことを示唆している。
【０１４８】
例９：動物の研究
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、２１日間オートクレーブした水道水で溶かした４ｍｇ／ｍｌのＣ−Ｍｅｄ−１００（登録商標）または２ｍｇ／ｍｌのキナ酸を給餌した。その動物を犠牲にし、脾臓が除去され、血液が採取された。細胞サンプルはＳｙｓｍｅｘ ＫＸ−２１Ｎ（Sysmx Corporation、神戸、日本）で分析され、血漿／血清サンプルはキナ酸及びトリプトファンに対するＨＰＬＣによる化学的解析で調製された。
【０１４９】
表６を見れば分かるように、マウスの血清のトリプトファンレベルと同等程度に、増大した芳香族酸を有する前駆物質の２１日間の補給後、様々なリンパ球がマウスの抹消の血液サンプルに大切である。
【０１５０】
図１１は、２１日間の処置後の血液細胞及び血清トリプトファンについてのインビボでの評価を示し、馬尿酸（＜０．０２μｇ／ｍｌ）及びキナ酸（＜２ｍｇ／ｍｌ）のレベルも同時に測定されたが、マウスの飲料１ｍｇ／ｍｌないし約５００ｍｇ／ｋｇで、キナ酸が投与されると、ＨＰＬＣ検出を下回るものであることが分かった。キナ酸の投与は、マウスにおいてインビボで測定された血清トリプトファンレベルを増大させることとなったが、キナ酸は全く検出不可能であり、ただ使用は依然として免疫刺激反応の原因であったのは、表６及び図１１より明らかである。
【０１５１】
完全な説明を行ってきた本願で示されているように、キナ酸のキレート物質は芳香族アミノ酸のインビボでの生産を促進する。下記の表７は、ヒトを含む動物において治療の値を有すると既に知られている、経口投与したＡｑｕａ Ｂｉｍｉｎｉ（商標）のトリプトファン用量との直接的な薬物動態の比較を与える。このような比較は、芳香族アミノ酸の前駆物質が経口で使用される場合、芳香族アミノ酸レベルの予期せぬ増大をもたらす。
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
【表８】
【０１５４】
即時の開示で引用された、全ての特許及び非特許文献は、全ての文献がそれぞれ参照により引用されるかのように、同じ効果で参照による開示で引用される。
【０１５５】
本発明は、本願でこれらの実施形態は、本発明の原理及び用途の例証をほとんどしていない。膨大な改変が例示した実施形態に対してなされてもよく、下記のクレームによって規定されたような本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて他の修正は考案されうるということが理解できるはずである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
ここで、Ａは、
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
；及び、
【化６】
並びにそれらのアニオン類、エステル類よりなる群から選択され；その際、ＲはＨ、Ｃ１〜Ｃ３のアルキルであり、
Ｘは、塩または水酸化物またはアミンを形成可能な１価、２価、３価のいずれかのアニオンよりなる群から選択され、
“ｎ”は整数または有理数であり、その際、ｌ＜ｎ＝１０である、
を有する芳香族アミノ酸に対する前駆物質。
【請求項２】
（ａ）
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
ここで、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ３のアルキルである；並びにそれらのアニオン類及びエステル類よりなる群から選択される治療上効果的な量の化合物、並びに
【化１２】
ここで、Ａ、Ｘ及びｎは請求項１で規定されたものと同一であり；並びに、
（ｂ）医学的に許容可能なビヒクルを含む組成物。
【請求項３】
前記組成物は、（ｃ）治療上効果的な量のニコチンアミド、ナイアシン、フラボノイド、ケイ皮酸もしくはその誘導体、アスコルビン酸もしくはその誘導体、トコフェラール（tocopheral）もしくはその誘導体、及びビタミンＡもしくはＤまたはそれらの誘導体よりなる群から選択される主要な（primary）抗酸化剤；並びに（ｄ）抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑
【請求項４】
芳香族アミノ酸に対する前駆物質の治療上効果的な量は、約２５０ｍｇ／日から約５０００ｍｇ／日の範囲内である、請求項２に記載の組成物。
制薬、気分高揚剤、抗炎症剤、免疫モジュレータ及び二次的な抗酸化剤よりなる群から選択される任意の原料をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記芳香族アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びフェニレフェデリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｅｄｅｒｉｎｅ）よりなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
当該主要な（primary）抗酸化剤は、ケルセチン、ルチン、クリシン、ミリセチン、ゲニステン（ｇｅｎｉｓｔｅｎ）、ヘスペリジン、ナリンギン及びそれらの混合物よりなる群から選択されるフラボノイドである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
当該任意の原料は、二次的な抗酸化剤であり、コエンザイムＱ、ピルビン酸塩、コエンザイムＡ、ユビキノール、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、アデニン、アデノシン、ナイアシン、ニコチンアミド、カンペステロール、カテキン、クロロゲン酸、シンコナイン、コリナンテイン、コリノキセイン、ダウコレステロール、エピカテキン、ハーマン、ハーステイン（ｈｉｒｓｕｔｅｉｎｅ）、ハースチン（ｈｉｒｓｕｔｉｎｅ）、イソプテロポジン, ロガン酸、リアロシド（ｌｙａｌｏｓｉｄｅ）、ミトラフィリン（ｍｉｔｒａｐｈｙｌｌｉｎｅ）、オレアノール酸、パルミトレイン酸、プロシアニジン、プテロポジン、キノブ酸グリコシド（ｐｔｅｒｏｐｏｄｉｎｅ、ｑｕｉｎｏｖｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、リンコフィリン、シトステロール、スペシオフィリン（ｓｐｅｃｉｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）、スティグマステロール、ストリクトシジン、ウンカリン（ｕｎｃａｒｉｎｅ）及びバクセン酸よりなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
当該任意の原料が存在し、抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑制薬、気分高揚剤及び抗炎症剤よりなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
当該抗腫瘍性製剤は、フッ化ピリミジン、シチジンアナログ、プリン抗代謝物質、植物のアルカロイド、アルキル化剤、アントラセン誘導体、抗腫瘍の抗生物質、金属複合体、抗アミノリン脂質の抗体、抗血管形成剤及び放射線治療剤よりなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
当該任意の原料は、スルホンアミド、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、タンパク質合成阻害物質、抗カビ剤、抗ウィルス剤、抗抗結核剤よりなる群から選択される抗感染薬である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
当該任意の原料は、三環系抗うつ薬、及びセロトニンの再取り込み阻害物質よりなる群から選択される抗抑制薬である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１２】
当該任意の原料は、ステロイド性の抗炎症剤、及び非ステロイド性の抗炎症剤よりなる群から選択される抗炎症剤である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
当該組成物は、経口投与用のカプセル、錠剤、シロップ、液体、エマルション、エリキシル剤の形態である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
以下のステップ:
（ａ）マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル及びヒトよりなる群から選択される哺乳類を得ること、
（ｂ）当該哺乳類の、（尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル）／（組織または血液のチオールレベル）の基準値である比率を決定すること、
（ｃ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物を前記哺乳類に投与すること、
（ｄ）抗酸化剤処置のサイクル後の当該哺乳類の、尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル／組織または血液チオールのレベルの比率の値を決定すること、
（ｅ）ステップ（ｂ）及び（ｄ）で得られる値を比較すること、その際、前記基準値を３０％超えた増大は、前記治療の方法が効果的であることを示すこと、
を含む、芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病状態に対する効果的な抗酸化治療の方法を同定するための動物モデルの手法。
【請求項１５】
前記組織のチオールサンプルは、血漿タンパク質、血液タンパク質、血清タンパク質、または血漿タンパク質、血液タンパク質及び血清タンパク質の３０％〜８０％の飽和硫酸アンモニウムで沈殿した画分よりなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物はヒトの症状に似た疾病を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）及び（ｄ）で得られる値は、当該哺乳類の、尿のトリプトファン、ニコチンアミド、キヌレイン／血清タンパク質のチオールの比率である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物で、必要としている患者を処置すること、
（ｂ）当該患者よりタンパク質チオールのサンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプル中のタンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルを測定すること、
（ｅ）（ｄ）／（ｃ）として表される、ステップ（ｄ）で得られるトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルに関連するステップ（ｃ）のサンプル中のチオールレベルを分析すること、その際、当該比率の値の増大は、低酸化的ストレス及びＤＮＡ修復のダウンレギュレーションについての予測の判断材料（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）であること、
を含む、必要としている患者におけるインビボでの酸化的ストレスを試験する方法。
【請求項１９】
タンパク質チオールのサンプルは、血漿、血液及び血清のサンプルよりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物で、酸化的ストレスの増大したレベルを特徴とする疾病に感受性のある患者を処置すること、
（ｂ）当該患者より、タンパク質チオールのレベルを含む体サンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプル中の前記タンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドのレベルについての尿中のレベルを測定すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られるトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルに対するステップ（ｃ）のサンプル中の前記チオールレベルを分析すること、その際、当該疾病に羅患している人口集団から得られる、所定の正規化値よりも高い値は、酸化的ストレス及びＤＮＡ修復のダウンレギュレーションに対する当該個体の予測の判断材料（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）であること、
を含む、酸化的ストレスの増大したレベルを特徴とする疾病に対する患者の感受性を究明する方法。
【請求項２１】
タンパク質チオールを含む体サンプルは、血漿サンプル、血液サンプル、血清サンプルよりなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２に記載の組成物を投与することを含む、血清の芳香族アミノ酸のレベルの欠如を特徴とする状態を予防的に処置するための方法。
【請求項２３】
前記状態は、全身的な虚弱、低エネルギー、焦点障害及び意識障害の症状を示すことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記状態は、うつ病、心的疾患、アルツハイマー症、認知症、パーキンソン疾病、記憶障害、ＡＤＨＤよりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記状態は、白血球減少症、甲状腺機能低下、充血した目、白内障よりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記状態は、クローン（crohns）疾病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、変形性関節症、全身性湿疹、乾癬、白斑及び受精能の低下よりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
当該組成物は食物と併用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
当該組成物は、血清チオールの状態によって測定される場合に、＞２５％の抗酸化活性の増大となる、アミノ酸の前駆物質の治療量を含有する食物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
以下のステップ：
（ａ）必要としている個体の血清チオールのレベル、及び尿のトリプトファン、ニコチンアミドもしくは組み合わせのレベル、または両方を得ること、
（ｂ）当該個体に対する、血清チオール／尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたは組み合わせの比率についての値を規定すること、
（ｃ）当該疾病に苦しむ人口集団より得られる同じものの所定の正規化レベルに対して、ステップ（ｂ）の値を比較すること、その際、当該比較は当該個体における酸化的ストレスに対する基準値を示すこと、
を含む、必要としている個体における芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病を発展させる危険性を決定するための方法。
【請求項３０】
前記血清チオールは血清タンパク質チオールである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
処置サイクル中、芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物を前記個体に投与するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
以下のステップ：
（ｅ）処置サイクルの終了後に、前記個体の血清タンパク質チオールのレベル、及び尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿酸または全てのレベルを得ること、及び
（ｆ）当該処置サイクル後に、前記個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたはそれらの組み合わせ／血清タンパク質チオールの比率に対する値を規定すること、をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗酸化治療の効果を証明するための当該疾病に苦しむ人口集団についての、基準の及び所定の正規化レベルと、ステップ（ｆ）の値を比較するステップ（ｇ）をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗酸化治療の効果は、ステップ（ｃ）で得られる値において、少なくとも２５％の増大で決する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗酸化治療の効果は、ステップ（ｃ）で得られる値において、少なくとも３０％の増大で決する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）〜（ｇ）は、追加的な処置サイクルに対して反復しうる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物は、二次的な抗酸化化合物及び任意の原料をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記二次的な抗酸化化合物は、ニコチンアミド、ナイアシン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、フラボノイド、ケイ皮酸もしくはその誘導体、アスコルビン酸もしくはその誘導体、トコフェラール（tocopheral）もしくはその誘導体、及びビタミンＡもしくはＤまたはそれらの誘導体；医学的に許容可能なビヒクルよりなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物は、抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑制薬、気分高揚剤、抗炎症剤、免疫 モジュレータ及び二次的な抗酸化剤またはそれらの混合物よりなる群から選択される任意の原料をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾病は、うつ病、全身的な虚弱、全身的な痛み、自己免疫疾患、ガン、糖尿病及び高齢よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
疾病に含まれる前記処置サイクルの範囲は、うつ病、全身的な虚弱、全身的な痛み、自己免疫疾患、ガン、糖尿病及び高齢よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
下記式：
【化１】
ここで、Ａは、
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
；及び、
【化６】
並びにそれらのアニオン類、エステル類よりなる群から選択され；その際、ＲはＨ、Ｃ１〜Ｃ３のアルキルであり、
Ｘは、塩または水酸化物またはアミンを形成可能な１価、２価、３価のいずれかのアニオンよりなる群から選択され、
“ｎ”は整数または有理数であり、その際、ｌ＜ｎ＝１０である、
を有する芳香族アミノ酸に対する前駆物質。
【請求項２】
（ａ）
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
ここで、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ３のアルキルである；並びにそれらのアニオン類及びエステル類よりなる群から選択される治療上効果的な量の化合物、並びに
【化１２】
ここで、Ａ、Ｘ及びｎは請求項１で規定されたものと同一であり；並びに、
（ｂ）医学的に許容可能なビヒクルを含む組成物。
【請求項３】
前記組成物は、（ｃ）治療上効果的な量のニコチンアミド、ナイアシン、フラボノイド、ケイ皮酸もしくはその誘導体、アスコルビン酸もしくはその誘導体、トコフェラール（tocopheral）もしくはその誘導体、及びビタミンＡもしくはＤまたはそれらの誘導体よりなる群から選択される主要な（primary）抗酸化剤；並びに（ｄ）抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑
【請求項４】
芳香族アミノ酸に対する前駆物質の治療上効果的な量は、約２５０ｍｇ／日から約５０００ｍｇ／日の範囲内である、請求項２に記載の組成物。
制薬、気分高揚剤、抗炎症剤、免疫モジュレータ及び二次的な抗酸化剤よりなる群から選択される任意の原料をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記芳香族アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びフェニレフェデリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｅｄｅｒｉｎｅ）よりなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
当該主要な（primary）抗酸化剤は、ケルセチン、ルチン、クリシン、ミリセチン、ゲニステン（ｇｅｎｉｓｔｅｎ）、ヘスペリジン、ナリンギン及びそれらの混合物よりなる群から選択されるフラボノイドである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
当該任意の原料は、二次的な抗酸化剤であり、コエンザイムＱ、ピルビン酸塩、コエンザイムＡ、ユビキノール、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、アデニン、アデノシン、ナイアシン、ニコチンアミド、カンペステロール、カテキン、クロロゲン酸、シンコナイン、コリナンテイン、コリノキセイン、ダウコレステロール、エピカテキン、ハーマン、ハーステイン（ｈｉｒｓｕｔｅｉｎｅ）、ハースチン（ｈｉｒｓｕｔｉｎｅ）、イソプテロポジン, ロガン酸、リアロシド（ｌｙａｌｏｓｉｄｅ）、ミトラフィリン（ｍｉｔｒａｐｈｙｌｌｉｎｅ）、オレアノール酸、パルミトレイン酸、プロシアニジン、プテロポジン、キノブ酸グリコシド（ｐｔｅｒｏｐｏｄｉｎｅ、ｑｕｉｎｏｖｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、リンコフィリン、シトステロール、スペシオフィリン（ｓｐｅｃｉｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）、スティグマステロール、ストリクトシジン、ウンカリン（ｕｎｃａｒｉｎｅ）及びバクセン酸よりなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
当該任意の原料が存在し、抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑制薬、気分高揚剤及び抗炎症剤よりなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
当該抗腫瘍性製剤は、フッ化ピリミジン、シチジンアナログ、プリン抗代謝物質、植物のアルカロイド、アルキル化剤、アントラセン誘導体、抗腫瘍の抗生物質、金属複合体、抗アミノリン脂質の抗体、抗血管形成剤及び放射線治療剤よりなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
当該任意の原料は、スルホンアミド、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、タンパク質合成阻害物質、抗カビ剤、抗ウィルス剤、抗抗結核剤よりなる群から選択される抗感染薬である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
当該任意の原料は、三環系抗うつ薬、及びセロトニンの再取り込み阻害物質よりなる群から選択される抗抑制薬である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１２】
当該任意の原料は、ステロイド性の抗炎症剤、及び非ステロイド性の抗炎症剤よりなる群から選択される抗炎症剤である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
当該組成物は、経口投与用のカプセル、錠剤、シロップ、液体、エマルション、エリキシル剤の形態である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
以下のステップ:
（ａ）マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル及びヒトよりなる群から選択される哺乳類を得ること、
（ｂ）当該哺乳類の、（尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル）／（組織または血液のチオールレベル）の基準値である比率を決定すること、
（ｃ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物を前記哺乳類に投与すること、
（ｄ）抗酸化剤処置のサイクル後の当該哺乳類の、尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿、キヌレインのレベル／組織または血液チオールのレベルの比率の値を決定すること、
（ｅ）ステップ（ｂ）及び（ｄ）で得られる値を比較すること、その際、前記基準値を３０％超えた増大は、前記治療の方法が効果的であることを示すこと、
を含む、芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病状態に対する効果的な抗酸化治療の方法を同定するための動物モデルの手法。
【請求項１５】
前記組織のチオールサンプルは、血漿タンパク質、血液タンパク質、血清タンパク質、または血漿タンパク質、血液タンパク質及び血清タンパク質の３０％〜８０％の飽和硫酸アンモニウムで沈殿した画分よりなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物はヒトの症状に似た疾病を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）及び（ｄ）で得られる値は、当該哺乳類の、尿のトリプトファン、ニコチンアミド、キヌレイン／血清タンパク質のチオールの比率である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物で、必要としている患者を処置すること、
（ｂ）当該患者よりタンパク質チオールのサンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプル中のタンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルを測定すること、
（ｅ）（ｄ）／（ｃ）として表される、ステップ（ｄ）で得られるトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルに関連するステップ（ｃ）のサンプル中のチオールレベルを分析すること、その際、当該比率の値の増大は、低酸化的ストレス及びＤＮＡ修復のダウンレギュレーションについての予測の判断材料（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）であること、
を含む、必要としている患者におけるインビボでの酸化的ストレスを試験する方法。
【請求項１９】
タンパク質チオールのサンプルは、血漿、血液及び血清のサンプルよりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）芳香族アミノ酸の前駆物質を含む組成物で、酸化的ストレスの増大したレベルを特徴とする疾病に感受性のある患者を処置すること、
（ｂ）当該患者より、タンパク質チオールのレベルを含む体サンプルを得ること、
（ｃ）前記サンプル中の前記タンパク質チオールのレベルを決定すること、
（ｄ）トリプトファンまたはニコチンアミドのレベルについての尿中のレベルを測定すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られるトリプトファンまたはニコチンアミドの尿中のレベルに対するステップ（ｃ）のサンプル中の前記チオールレベルを分析すること、その際、当該疾病に羅患している人口集団から得られる、所定の正規化値よりも高い値は、酸化的ストレス及びＤＮＡ修復のダウンレギュレーションに対する当該個体の予測の判断材料（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）であること、
を含む、酸化的ストレスの増大したレベルを特徴とする疾病に対する患者の感受性を究明する方法。
【請求項２１】
タンパク質チオールを含む体サンプルは、血漿サンプル、血液サンプル、血清サンプルよりなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２に記載の組成物を投与することを含む、血清の芳香族アミノ酸のレベルの欠如を特徴とする状態を予防的に処置するための方法。
【請求項２３】
前記状態は、全身的な虚弱、低エネルギー、焦点障害及び意識障害の症状を示すことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記状態は、うつ病、心的疾患、アルツハイマー症、認知症、パーキンソン疾病、記憶障害、ＡＤＨＤよりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記状態は、白血球減少症、甲状腺機能低下、充血した目、白内障よりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記状態は、クローン（crohns）疾病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、変形性関節症、全身性湿疹、乾癬、白斑及び受精能の低下よりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
当該組成物は食物と併用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
当該組成物は、血清チオールの状態によって測定される場合に、＞２５％の抗酸化活性の増大となる、アミノ酸の前駆物質の治療量を含有する食物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
以下のステップ：
（ａ）必要としている個体の血清チオールのレベル、及び尿のトリプトファン、ニコチンアミドもしくは組み合わせのレベル、または両方を得ること、
（ｂ）当該個体に対する、血清チオール／尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたは組み合わせの比率についての値を規定すること、
（ｃ）当該疾病に苦しむ人口集団より得られる同じものの所定の正規化レベルに対して、ステップ（ｂ）の値を比較すること、その際、当該比較は当該個体における酸化的ストレスに対する基準値を示すこと、
を含む、必要としている個体における芳香族アミノ酸の欠如を特徴とする疾病を発展させる危険性を決定するための方法。
【請求項３０】
前記血清チオールは血清タンパク質チオールである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
処置サイクル中、芳香族アミノ酸に対する前駆物質を含む組成物を前記個体に投与するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
以下のステップ：
（ｅ）処置サイクルの終了後に、前記個体の血清タンパク質チオールのレベル、及び尿のトリプトファン、ニコチンアミド、馬尿酸または全てのレベルを得ること、及び
（ｆ）当該処置サイクル後に、前記個体に対する、尿のトリプトファン、ニコチンアミドまたはそれらの組み合わせ／血清タンパク質チオールの比率に対する値を規定すること、をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗酸化治療の効果を証明するための当該疾病に苦しむ人口集団についての、基準の及び所定の正規化レベルと、ステップ（ｆ）の値を比較するステップ（ｇ）をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗酸化治療の効果は、ステップ（ｃ）で得られる値において、少なくとも２５％の増大で決する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗酸化治療の効果は、ステップ（ｃ）で得られる値において、少なくとも３０％の増大で決する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）〜（ｇ）は、追加的な処置サイクルに対して反復しうる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物は、二次的な抗酸化化合物及び任意の原料をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記二次的な抗酸化化合物は、ニコチンアミド、ナイアシン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、フラボノイド、ケイ皮酸もしくはその誘導体、アスコルビン酸もしくはその誘導体、トコフェラール（tocopheral）もしくはその誘導体、及びビタミンＡもしくはＤまたはそれらの誘導体；医学的に許容可能なビヒクルよりなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物は、抗腫瘍性製剤、抗感染薬、抗抑制薬、気分高揚剤、抗炎症剤、免疫 モジュレータ及び二次的な抗酸化剤またはそれらの混合物よりなる群から選択される任意の原料をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾病は、うつ病、全身的な虚弱、全身的な痛み、自己免疫疾患、ガン、糖尿病及び高齢よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
疾病に含まれる前記処置サイクルの範囲は、うつ病、全身的な虚弱、全身的な痛み、自己免疫疾患、ガン、糖尿病及び高齢よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００９−５４４５８７（Ｐ２００９−５４４５８７Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１９６５１（Ｐ２００９−５１９６５１）
【出願日】平成１９年７月１１日（２００７．７．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３２６１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００８８３７
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０９０１３５８５）リンピート トレーディング ６ （ピーティーワイ） リミテッド トレーディング アズ ジェネティック ヘルス エンタープライゼス (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１１日（２００７．７．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３２６１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００８８３７
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０９０１３５８５）リンピート トレーディング ６ （ピーティーワイ） リミテッド トレーディング アズ ジェネティック ヘルス エンタープライゼス (1)
【Ｆターム（参考）】
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