ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システム
ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムは、従来の凍結保護用の結晶取り出し、もしくは内部で成長するタンパク質結晶のその場Ｘ線回折研究を可能にする結晶カードにおける、結晶化条件のナノリットル体積スクリーニングを可能にする。本システムは、結晶化反応混液の調合を結晶化実験の準備と統合させる。本システムは、結晶化相空間を効率的に利用するための結晶化実験における勾配スクリーニング、或いは１つの包括的ハイブリッド結晶化トライアルを実行するためのスパースマトリックスおよび勾配スクリーニングの組み合わせのいずれかを研究者が選択することを可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２００８年６月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／０６１５３６号の利益を請求し、当該仮出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府のライセンスの権利に関する陳述
本発明の主題は、少なくとも部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより授与された、ＮＩＧＭＳ Ｕ５４ ＧＭ０７４９６１によって提供された政府の支援を受けて行われた。
【背景技術】
【０００３】
構造生物学の分野は、スループットおよび効率を向上させる技術を毎年生み出している。かかる進歩は、遺伝子から三次元構造までを３日のうちに発達させることを動機づけた。効率を改善するためには、結晶化スクリーニングと最適化とに十分な材料が、無細胞合成から得られるように、必要なタンパク質量を最小限に抑えることが望ましい。「３日」の構造目標を念頭に置いて、遺伝子から構造へのパイプライン効率を高めるいくつかの技術を開発することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この要約は、以下の詳細な記載にさらに記載される概念から選択したものを平易に紹介するために示される。この要約は、請求される主題の重要な特徴を特定することは意図しておらず、請求される主題の範囲を決定する助けとして用いることも意図していない。
【０００５】
議論される主題の一様態は、ポンピングシステム；および該ポンピングシステムを制御するためにタンパク質結晶化システム上で実行するように構成された複数個のソフトウェア、を備えるタンパク質結晶化のためのシステムを含む。本システムは、ポンピングシステムに連結された１つまたはそれ以上の結晶カードであって、それぞれがミキサー、および貯蔵とタンパク質結晶化検査を容易にするために該ミキサーに連結されたマイクロ流体キャピラリーとを収容するように構成された、結晶カードをさらに含む。
【０００６】
本主題の別の様態は、複数個のソフトウェアで働くポンピングシステムを用いて各水流を独立に制御することによって水流を調節することを備える、勾配スクリーニングのための方法を含む。本方法は、タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すために、タンパク質の結晶化相空間をマッピングすることをさらに備える。
【０００７】
本主題のさらなる様態は、沈殿剤プラグを予め形成すること；およびそれぞれが２つの沈殿剤プラグを互いに分離するプラグ・スペーサーを予め形成することを備えるハイブリッド・スクリーニングのための方法を含む。本方法は、沈殿剤プラグ、プラグ・スペーサー、およびタンパク質の流れを合流させることによって勾配を形成することをさらに備える。本方法は、タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すために、タンパク質の結晶化相空間をマッピングすることをさらに含む。
【０００８】
本主題のさらなる様態は、キャピラリーをもつ結晶カードを受け取ること；表面エネルギーを低減するためにキャピラリーに試薬をコーティングすること；および試薬を除去することを備える方法を含む。
【０００９】
別の様態において、本主題は、ミキサー回路および検査回路を収容するように構成された基板を備える結晶カードを含む。結晶カードは、基板に接合され、基板から剥離されるように構成された層をさらに含む。
【００１０】
前述の様態、および本発明に付随する利点の多くは、添付図面と併せて次の詳細な記載を参照することによってよく理解され、従ってより容易に正しく認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】例となるナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを示すブロック図である。
【図２】ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムの例となるポンピングシステムを示すブロック図である。
【図３Ａ】ポンピングシステムを構成するための例となるユーザインターフェースを示す絵図である。
【図３Ｂ】本システムの結晶カードに流体をプライミングするための例となるユーザインターフェースを示す絵図である。
【図３Ｃ】結晶カードにおけるナノプラグの生成を指定するための例となるユーザインターフェースを示す絵図であって、本主題の一実施形態に従ってナノプラグはサイズが等しく内容物が等しい。
【図３Ｄ】結晶カードにおけるナノプラグの生成を指定するための例となるユーザインターフェースを示す絵図であって、本主題の一実施形態に従ってナノプラグは様々な濃度のタンパク質および沈殿剤を有する。
【図３Ｅ】結晶カードにおけるナノプラグの生成を指定するための例となるユーザインターフェースを示す絵図であって、本主題の別の実施形態に従ってナノプラグは複数の沈殿剤に対して様々なサイズおよび濃度を有する。
【図４Ａ】結晶カードの一実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図４Ｂ】結晶カードの一実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図４Ｃ】結晶カードの一実施形態の上面図を示す絵図である。
【図４Ｄ】結晶カードの一実施形態の側面図を示す絵図である。
【図４Ｅ】結晶カードの一実施形態の底面図を示す絵図である。
【図５Ａ】結晶カードの別の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図５Ｂ】結晶カードの別の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図５Ｃ】結晶カードの別の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図５Ｄ】結晶カードの別の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図５Ｅ】結晶カードの別の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図６Ａ】結晶カードの第３の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図６Ｂ】結晶カードの第３の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図６Ｃ】結晶カードの第３の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図６Ｄ】結晶カードの第３の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図６Ｅ】結晶カードの第３の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図７Ａ】結晶カードの第４の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図７Ｂ】結晶カードの第４の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図７Ｃ】結晶カードの第４の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図７Ｄ】結晶カードの第４の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図７Ｅ】結晶カードの第４の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図８Ａ】結晶カードの第５の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図８Ｂ】結晶カードの第５の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図８Ｃ】結晶カードの実施形態の上面図を示す絵図である。
【図８Ｄ】結晶カードの第５の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図８Ｅ】結晶カードの第５の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図９Ａ】結晶カードの第６の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図９Ｂ】結晶カードの第６の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図９Ｃ】結晶カードの第６の実施形態の立体分解等角図を示す絵図である。
【図９Ｄ】結晶カードの第６の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図９Ｅ】結晶カードの第６の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図９Ｆ】結晶カードの第６の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図１０】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの一実施形態を示す絵図である。
【図１１】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの別の実施形態を示す絵図である。
【図１２】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの第３の実施形態を示す絵図である。
【図１３】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの第４の実施形態を示す絵図である。
【図１４】結晶カードの一実施形態の断面図を示す絵図である。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｅ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｆ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｇ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｈ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｉ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｊ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｋ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｌ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｍ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｎ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｏ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｐ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｑ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｒ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｓ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｔ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｕ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｖ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本主題の様々な実施形態において、ポンプ；該ポンプを制御するように構成されたソフトウェア；ならびにミキサー回路および検査回路を収容する結晶カード、を備えるナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムが記載される。結晶カードは、Ｘ線透過、光学的透明性、成形性、耐薬品性（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ）および表面エネルギーからなる群から選択された１つまたはそれ以上の特性を含む材料を用いて適切に製造される。結晶カードは、該結晶カードからの結晶の採取またはその場Ｘ線回折を可能にする様々な相の巨大分子結晶を収容する。該結晶は、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムによるナノプラグ形成を通じて、結晶カード内で成長が進む。ナノプラグは、水溶液流に非混和性の生物学的に不活性なキャリア流体、例えばフッ化炭素溶液、を混合することによって形成される。ナノプラグ結晶化実験を構成するために、例えば標的分子、緩衝剤、および沈殿剤溶液からなる水溶液流がミキサー回路で混合される。ナノプラグは、結晶化のためにインキュベーションおよびモニタリングが行われる。タンパク質結晶の核発生および成長に関する科学的疑問の解明および新規構造の溶液における結晶生成を目指して、ナノプラグ結晶化実験を然るべく用いることができる。
【００１３】
ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムは、２つのスクリーニング様式：勾配モードおよびハイブリッドモードを容易にする。本明細書では、用語勾配モードは、分子の様々な結晶化相を提供する任意の適切なスクリーニング方法を含む。勾配モードは、特定分子の結晶化相空間を明らかにするために、結晶学者が結晶カードを精細にスキャンすることを可能にする。ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムに用いられる各水溶液流は、ポンプを用いてソフトウェアにより独立に制御でき、それ故に個々の流れの流量を変化させることにより、一連のナノプラグにわたって所望の粒度の濃度勾配が然るべく形成される。沈殿剤の流れの流量が減少するときに、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムは、流量の合計が一定のままであるように緩衝剤の流れの流量を増加させる。沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すために、勾配モードを用いてタンパク質のような特定分子の結晶化相空間をマッピングすることができる。
【００１４】
勾配モードの機能強化として、ハイブリッドモードは、勾配とスパースマトリックス・スクリーニングとを１つの結晶カード上で組み合わせる。予め形成された様々な結晶化剤のカートリッジを作り出すことによって、ナノプラグ中の分子結晶に関するスパースマトリックス・スクリーニングを実現することができる。本明細書において、用語ハイブリッドモードは、予め形成されたカートリッジを含む任意の適切なスクリーニング方法を含めて、ハイブリッド・スクリーニングを含む。ハイブリッドモードは、ナノプラグ・スペーサー（気泡）によって分離された沈殿剤ナノプラグを予め形成し、それらを分子流と合流させたときに濃度勾配を形成することにより、スパースマトリックス・スクリーニングの概念を拡張させる。勾配モードと同様に、ハイブリッドモードは、予め形成された沈殿剤ナノプラグおよび緩衝剤の流れの間で流量変化を連係させることによって勾配を発生させる。スパースマトリックスおよび勾配スクリーニングを１つの結晶カード上で一緒に行うことによって、ハイブリッドモードでは予め形成された各沈殿剤ナノプラグから２０〜４０の実験が生み出され、結晶化位相空間の広い領域をサンプリングすることが可能になる。
【００１５】
前述および後述のように、用語「ナノプラグ」は、本システムのマイクロ流体チャンネルを満たす、１０〜２０ｎＬの水滴のような、ナノリットル体積サイズの液滴を指す。各ナノプラグが個別の微結晶化実験を備える。前述および後述のように、用語「ミキサー回路」は、結晶カードの検査回路の上流地点で一緒になる、３つの水チャンネルおよび１つのキャリア流体チャンネルを有する回路を含むことを意味する。４つまたは５つの水チャンネルおよび１つのキャリア流体チャンネルをもつミキサーのような、さらなる構成も可能である。水チャンネルは一緒になり、キャリア流体チャンネルと角度９０度で然るべく交差する。本明細書では、用語「マクロ・マイクロ接合部分（ｍａｃｒｏ−ｍｉｃｒｏ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）」は、シリンジおよび結晶カード間の連結を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、シリンジは、テフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）配管のような配管を通じてミキサー回路または検査回路に接続される。他の実施形態において、該配管は、回路の注入口および排出口を該配管と流体的に接続するように構成されたコネクタを用いて、ミキサー回路または検査回路に接続される。前述および後述のように、用語「検査回路」は、流体が一緒になってキャピラリー内を流れる水性ナノプラグを形成する、該キャピラリーまたはチャンネルを指す。検査回路は、結晶形成についてナノプラグを検査するために用いることもできる。さらにまた、検査回路は、本主題の方法によって形成された結晶を貯蔵するためにも用いることができ、それ故に本明細書では貯蔵キャピラリーとも呼ばれる。本明細書では、用語「主チャンネル」は、ミキサーの下流に位置し、水溶液とキャリア流体とが混ざって水性ナノプラグを形成する検査回路の領域を指す。前述および後述のように、用語「分子」は、有機化合物および／または化学物質のような小分子、ならびに巨大分子を含む。用語「生物学的な分子」は、生物学的な起原に由来する、対応する、またはそれをモデルとする分子を指す。この用語は、無細胞合成によるようにインビトロで、および／または組み換えタンパク質のようにインビボで合成もしくは生成された分子；変異タンパク質、および人工タンパク質、天然および人工核酸分子、ならびに天然には発生しない他の生物学的な分子も含む。本明細書では、用語「巨大分子」は、核酸、タンパク質、炭水化物および脂質のような生体高分子を含む。分かりやすくするために、用語「タンパク質」および「タンパク質溶液」は、本明細書では、タンパク質に加えて他のタイプの分子も包含する。
【００１６】
分子の結晶化に役立つナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システム１００が図１に示される。結晶構造が所望される分子を備える調製試料１０２、例えば調製タンパク質試料が水溶液１０４中に提供される。追加の水溶液、例えば緩衝剤溶液および沈殿剤溶液も提供される。緩衝剤溶液は、生物学的な試料１０２を調製するために用いられる緩衝剤を備えることができる。キャリア流体も提供される。キャリア流体は、水溶液と非混和性である。キャリア流体の適切な例は、フッ素系オイル；例えば、ＦＣ−４０（３Ｍ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を含む。水溶液およびキャリア流体１０４は、１つまたはそれ以上のポンプ１０８に接続された１つまたはそれ以上のシリンジ１０６に供給される。ポンプ１０８は、ナノプラグ形成用コンピュータ１１０上で実行されるソフトウェアによって制御される。ナノプラグ形成用コンピュータ１１０上で実行されるソフトウェアは、結晶カード１１２における水溶液およびキャリア流体１０４の流れを調節する。顕微鏡１１４のような拡大デバイスを用いて、結晶カード１１２における水溶液およびキャリア流体の流れが観察される。
【００１７】
結晶カードを通る様々な流体の流れを調節するのに役立つポンピングシステム２００が図２に示される。ポンプ１ ２０２は、シリンジ１ ２０４およびシリンジ２ ２０８を制御する。シリンジ１ ２０４に緩衝剤２０６のような水溶液が負荷される。シリンジ２は、沈殿剤試薬２１０のような水溶液で満たされる。ポンプ２ ２１２は、シリンジ３ ２１４およびシリンジ４ ２１８を制御する。シリンジ３ ２１４は、キャリア流体２１６のような非混和性流体で満たされる。シリンジ４ ２１８は、注目されるタンパク質２２０のような分子を含んだ水溶液で満たされる。適切なポンプは、Ｈａｒｖａｒｄ Ｔｗｉｎ ３３シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む。いくつかの実施形態において、該シリンジポンプは、より良好な精度を提供するために製造者によって改良された。適切なシリンジは、１８００シリーズＨａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓ ＴｉｇｈｔシリンジのようなＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを含む。適切なシリンジ容積は、１０μｌから１００μｌの範囲である。ポンピングシステム２００は、ナノプラグ形成用コンピュータ１１０上で実行されるソフトウェアによって制御される。
【００１８】
適切なソフトウェアがポンピングシステム１０８を制御するために提供される。図３Ａ〜３Ｅは、ポンピングシステム２００を制御する様々なモードを表示する、システムのソフトウェアの代表的なユーザインターフェースを示す。図３Ａは、ソフトウェアの構成モードの代表的なユーザインターフェース３００を示す。図３Ｂは、ソフトウェアの主要モードの代表的なユーザインターフェース３０２を示す。図３Ｃは、ソフトウェアの一定モードの代表的なユーザインターフェース３０４を示す。図３Ｄは、ソフトウェアの勾配モードの代表的なユーザインターフェース３０６を示す。図３Ｅは、システムのソフトウェアのハイブリッドモードの代表的なユーザインターフェース３０８を示す。
【００１９】
本明細書に開示される主題の結晶カードを次に参照して、結晶カードの一実施形態の代表的な例が図４Ａ〜４Ｅに示される。結晶カード４００は、標準的な顕微鏡スライドとほぼ同じサイズであるように構成され、長さが約７６．２０ｍｍ、幅が約２５．４０ｍｍ（または約３インチ長×約１インチ幅）である。結晶カード４００は、厚さが約１．０から１．５ｍｍである。該結晶カードは、射出成形によって透明ポリカーボネートから製造される（Ｓｉｌｏａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。
【００２０】
図４Ａおよび４Ｂに示される実施形態を次に参照して、結晶カード４００は、上面４０２、および上面４０２に平行な下面４１４を有する。結晶カード４００は、ミキサー回路４０４、ならびに貯蔵および検査回路４０６を収容するように構成された基板を備える。ミキサー回路４０４は、４つのマイクロ流体チャンネル４２１、４２２、４２４、および４２６で構成される。図４Ｃを参照。チャンネル４２１、４２２、および４２４は一緒になり、角度９０度でチャンネル４２６と交差する。各チャンネルは、注入口４１０を備える。図４Ｅを参照。検査回路４０６は、ミキサー４０４のすぐ下流に位置し、排出口４１２で終わる長いマイクロ流体キャピラリー・チャンネルを備える。マイクロ流体キャピラリー４０６の長さは、約６７ｃｍである。マイクロ流体キャピラリー・チャンネル４０６は検査回路とも呼ばれ、本カードで生成された結晶は、その場Ｘ線回折解析に供するか、または凍結のために採取されるまでチャンネル４０６中に貯蔵することができる。マイクロ流体チャンネル４２１、４２２、４２４、４２６、およびキャピラリー・チャンネル４０６は、断面が実質的に正方形であり、約２００マイクロメータ（μｍ）×２００μｍの内径を有する。しかしながら、他のチャンネル構成も可能である。
【００２１】
図４Ｄを次に参照して、結晶カード４００は、基板に熱的に接合され、基板から剥離されるように構成された層４２０をさらに備える。剥離可能な層４２０は、基板表面４１４に熱的に接合される。他の実施形態において、剥離可能な層４２０は、基板に化学的に結合されてもよい。剥離可能な層４２０は、厚さが約０．１０から０．１４ｍｍである。剥離可能な層４２０は、剥離可能な層４２０の除去が検査回路チャンネル４０６の内部空間を暴露するように然るべく構成される。結晶カード４００は、該結晶カードにシリンジを接続するマクロ・マイクロ接合部分をさらに備える。一実施形態において、マクロ・マイクロ接合部分は、一端では注入口４１０および排出口４１２に接続され、他端ではフレキシブル・シリコン配管でできたスリップフィット・コネクタ４３２に接続された（例えば、ＰＥＥＫ（商標）ポリマーでできた）硬質プラスチック配管４３０の断面を含む。スリップフィット・コネクタ４３２は、テフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）配管（示されていない）を受けるように構成される。該配管の他端は、本システムのシリンジに接続される。テフロン（登録商標）配管は、内径が３６０μｍ、外径が７６０μｍ（ＩＤ／ＯＤ ３６０／７６０）である一方で、コネクタ４３２の内径は７６０μｍであり、その結果としてテフロン（登録商標）配管がコネクタ４３２に挿入されたときに気体および流体漏れのないシールが形成される。
【００２２】
動作中に、チャンネル４２１は、注目されるタンパク質溶液に用いられる緩衝剤のような、水溶液で満たされた配管に接続される。チャンネル４２２は、沈殿剤溶液で満たされた配管に接続される。本明細書では、用語沈殿剤は、用語クリスタラント（ｃｒｙｓｔａｌｌａｎｔ）と同義であると理解される。チャンネル４２４は、注目される標的分子を含む溶液で満たされた配管に接続される。一実施形態において、生物学的な標的分子はタンパク質である。チャンネル４２６は、キャリア流体で満たされた配管に接続される。キャリア流体の適切な例は、フッ素系オイル、またはＦＣ−４０のようなフッ化炭素を含むが、他にも可能ではある。キャリア流体は、水性流体に対して非混和性であり、検査回路マイクロチャンネルの壁を選択的に濡らす。その結果、混合された水溶液部分がチャンネル幅にわたるナノプラグに分割される。一実施形態において、水性ナノプラグは、体積が約１０〜２０ｎＬである。
【００２３】
図５Ａ〜５Ｅを次に参照して、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例が示される。異なった図面間で同様の要素は、同様の参照番号をもち、図面番号に対応して最上位の数字が１だけ増加する。簡潔にするために、異なった図面間で同様の要素は、さらには記載されない。図５Ａ〜５Ｅに示される実施形態において、注入口５１０は、結晶カード５００の上面５０２に位置する浅い円筒状のくぼみ５０８中に位置する。円筒状のくぼみ５０８は、注入口５１０および排出口５１２に配管を接続するコネクタ（示されていない）を取り付けるように構成される。結晶カード５００の寸法が図５Ｅに示される。結晶カード５００は、長さが７６．２ｍｍで幅が２５．４ｍｍである。注入口５１０は、４．５ｍｍの間隔をあけて配置される。検査回路５０６の平行チャンネルは、２．０ｍｍの間隔をあけて配置される。しかしながら、当業者に理解されるように他の適切な構成も可能である。
【００２４】
図６Ａ〜６Ｅを次に参照して、結晶カードの第３の実施形態の代表的な例が示される。簡潔にするために、前出の図面に記載された同様の要素は、ここでは記載されない。図６Ａ〜６Ｅに示された実施形態において、注入口６１０および排出口６１２は、表面６０２に接続され、そこから外に延びる円筒状の突起６０８より下に配置される。突起６０８は、注入口６１０および排出口６１２に配管を接続するコネクタ（示されていない）を取り付けるように構成される。本題からそれるが、図４〜６に示される実施形態において例示された結晶カードは、射出成形（Ｓｉｌｏａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により透明ポリカーボネート・プラスチックから製造される。
【００２５】
次に図７〜９に戻って、結晶カードの第２のタイプの代表的な実施形態が記載される。図形７Ａ〜７Ｅは、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例を示す。簡潔にするために、前出の図面に記載された同様の要素は、ここでは記載されない。図７Ａ〜７Ｅに示された実施形態において、結晶カード７００の上面７０２は、２列のポート７０８をさらに備える。該ポートは、ポート７０８より下に位置する注入口７１０および排出口７１２に配管を接続するのに適したプラスチック・コネクタ（示されていない）を受けるように構成される。表面７０２は２８のポート７０８を備える。しかしながら、結晶カード７００の設計に依存して、様々なポート数が可能である。ポート７０８は、結晶カード７００の表面７０２より上に約２．５ｍｍ延びる。注入口７１０および排出口７１２に位置を合わせて、これらと流体的に接続されるようにポート７０８底の中心部に然るべく穴が開けられる。該ポートの中心部は、約４．５ｍｍ間隔である。ポート７０８底に開けられた穴は、直径が約０．２ｍｍ（２００μｍ）である。当然のことながら、すべてのポートが回路チャンネルに接続されるわけではなく、注入口７１０および排出口７１２に配管を接続すべき所望のポートだけに穴を開ける必要がある。他の実施形態において、剥離可能な層７２０が底面７１４に接合される前に、レーザを用いて該層に穴が開けられる。レーザドリル穴は、注入口７１０および排出口７１２と流体的に接続するように構成される。特別に設計された結晶カード・ホールダ（示されていない）を用いて、レーザドリル穴に配管が接続される。
【００２６】
図７Ａ〜７Ｅをなおも参照して、結晶カードは、２つに分かれた非対称なマイクロ流体チャンネル回路７０６Ａおよび７０６Ｂをさらに備える。７０６Ａでは検査回路は長さが約２７０ｍｍである。７０６Ｂでは検査回路は長さが約３０６ｍｍである。７０６Ａおよび７０６Ｂの両回路において、排出口７１２は、注入口７１０からの回路およびミキサー回路７０４Ａ、７０４Ｂとは反対側に位置する。図７Ａ〜Ｅに示される実施形態は、ミキサー回路７０４Ａ、７０４Ｂからなる２つに分かれた構成を備える。図１０により詳細に示されるように、ミキサー回路７０４Ａは、水チャンネルおよびキャリア流体チャンネル間に長さがおよそ０．２０ｍｍの短いネック領域を備える。図１１により詳細に示されるように、ミキサー回路７０４Ｂは、水チャンネルおよびキャリア流体チャンネル間にネック領域がない。結晶カードにおける水性ナノプラグ形成には、ミキサー回路７０４Ａが適することがわかった。
【００２７】
図８Ａ〜８Ｅを参照して、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例が示される。簡潔にするために、前述の要素と同様の要素は、ここでさらには記載されない。結晶カード８００は、２つに分かれた対称なマイクロ流体チャンネル回路８０６を備える。この実施形態において、排出口８１２は、ミキサー８０４および注入口８１０と回路８０６の同じ側に位置する。
【００２８】
図９Ａ〜９Ｅを次に参照して、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例が示される。簡潔にするために、前述の要素と同様の要素は、ここでさらには記載されない。結晶カード９００は、１つのミキサー回路９０４および長い検査回路９０６を備える単一のマイクロ流体回路を備える。検査回路９０６は、長さが約６６５ｍｍである。図９Ｃは、結晶カード９００の分解立体図を示す。ポート９０８を備える部分９３０は、マイクロ流体回路チャンネルを備える部分９４０に接合される。剥離可能な層９２０は、部分９４０の底面９１４に熱的に接合される。しかしながら、他の実施形態において、剥離可能な層９２０は、基板表面９１４に化学的に結合されてもよい。剥離可能な層９２０は、剥離可能な層９２０の除去が検査回路チャンネル９０６の内部空間を暴露するように然るべく構成される。本題からそれるが、図７〜９に示される実施形態において説明された結晶カードは、透明環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）または同等のプラスチックから製造される（ＴｈｉｎＸＸＳ Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００２９】
次に図１０〜１３に戻って、ミキサー回路の代表的な例がここで記載される。図１０は、図７に示されるミキサー７０４Ａに対応するミキサー回路の一実施形態の代表的な例を示す。ミキサー回路１０００は、３つの水チャンネル１０２１、１０２２および１０２４を備える。該水チャンネルは、ネック領域１００７によってキャリア流体チャンネル１０２６から分離される。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つのチャンネル１０２１、１０２２、１０２４が一緒になり、キャリア流体を含んだチャンネル１０２６と角度９０度で交差するように方向が向けられる。ミキサー１０００は、検査回路１００６の一部分をさらに備える。図１０をなおも参照して、ミキサー１０００の寸法が次に記載される。ネック領域１００７は、長さが約０．２ｍｍである。チャンネル１０２１は、直径が約０．２ｍｍである。チャンネル１０２２、１０２４は、直径が約０．１４１ｍｍである。チャンネル１００６、１０２６は、直径が約０．２ｍｍである。しかしながら、ミキサー回路のための他の適切な寸法も可能である。
【００３０】
図１１は、図７に示されたミキサー回路７０４Ｂに対応するミキサー回路の別の実施形態の代表的な例を示す。ミキサー回路１１００は、３つの水チャンネル１１２１、１１２２および１１２４を備える。水溶液チャンネルは、ネック領域なしでキャリア流体チャンネル１１０６に直接に接続される。ミキサー回路は、検査回路１１２６に流れ込む。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つのチャンネルが一緒になりキャリア流体を含んだチャンネルと角度９０度で交差するように方向が向けられる。チャンネル１１２１の直径は、約０．２ｍｍである。チャンネル１１２２、１１２４の直径は、約０．１４１ｍｍである。水チャンネルおよびキャリア流体チャンネル１１２６間の合流点領域の直径は、約０．２８５ｍｍである。しかしながら、ミキサーのための他の適切な寸法も可能である。
【００３１】
図１２を次に参照して、図７に記載されたミキサー回路７０４Ａの別図が示される。ミキサー回路１２００は、短いネック領域によってキャリア流体チャンネル１２２６に接続された３つの水チャンネル１２２１、１２２２および１２２４を備える。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つチャンネルが一緒になりキャリア流体を含んだチャンネルと角度９０度で交差するように方向が向けられる。各チャンネルは、注入口１２１０を有する。ミキサー回路１２０４の下流において、溶液は、検査回路１２０６の一部分に流れ込む。図１２をなおも参照して、ミキサー回路１２００の寸法が次に記載される。注入口１２１０は、チャンネル１２０６、１２２６から約４．４ｍｍに位置する。水チャンネル１２２１、１２２２、１２２４は、注入口から約２．９ｍｍで直角に曲がる。直角な曲がりは、内径Ｒ０．３００および外径Ｒ０．５００をもつ。チャンネル１２０６と平行に面内に配置されたチャンネルの部分１２２１、１２２２、１２２４は、チャンネル１２０６から約１．３００ｍｍにある。水チャンネル１２２１、１２２２、１２２４は、ネック領域の上流で互いに接続する前に４５度曲がる。チャンネル１２０６の内径は、約０．２００ｍｍ（２００μｍ）である。チャンネル１２０６の平行部分は、約１．２ｍｍ間隔である。しかしながら、他の適切な寸法も可能である。
【００３２】
図１３は、図８および９に示されたミキサー回路８０４および９０４に対応するミキサーの別の実施形態の代表的な例を示す。ミキサー回路１３００は、水チャンネル１３２１、１３２２、および１３２４を備える。水チャンネルは、キャリア流体チャンネル１３０６および検査回路１３２６から短いネック領域によって分離される。該ネック領域の直径は、約０．２００ｍｍである。しかしながら、他の適切な寸法も可能である。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つチャンネルが一緒になりキャリア流体を含んだチャンネルと角度９０度で交差するように方向が向けられる。ミキサー回路の下流において、溶液は検査回路１３２６に流れ込む。
【００３３】
図１４は、図９に示された実施形態と同様の結晶カードの断面の代表的な例を示す。結晶カード１４００は、３つの層１４２０、１４３０および１４４０から成っている。層１４３０は、図７〜９に示されるようなポートを備える。層１４３０は、厚さが約０．４ｍｍである。層１４４０は、マイクロ流体チャンネル回路を備え、端部での厚さが約１．５ｍｍである。層１４２０は、結晶カード１４００の底面に貼り付けられた剥離可能な層を備え、厚さが約０．１４ｍｍである。
【００３４】
図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化させるための方法５０００を示す。スタート・ブロックから、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＡ」）および出口ターミナル（「ターミナルＢ」）間で定義された方法ステップの一組５００２へ進む。方法ステップの一組５００２は、結晶カードの準備、および結晶カードのポンプへの接続について記載する。
【００３５】
ターミナルＡ（図１５Ｂ）から、方法５０００は、結晶カードが射出成形によってポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはプラスチックのような適切な材料から製造される、方法ステップの一組５００８へ進む。本方法は、次に起動ポイントへ戻る。方法５０００は、次に継続ターミナル（「ターミナルＡ２」）によって定義された方法ステップの一組５０１０へ進む。方法ステップの一組５０１０は、表面エネルギーを低減するために、結晶カードのマイクロキャピラリー表面を処理する。
【００３６】
ターミナルＡ２（図１５Ｃ）から、方法５０００は、結晶カードがプラスチックから製造されたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０１４へ進む。もしテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ４」）へ進む。もし決定ブロック５０１４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、プラスチックがポリカーボネートであるかどうか判断するために他のテストを行う別の決定ブロック５０１６へ進む。もし決定ブロック５０１６におけるテストへの答えがＮＯであれば、方法５０００は、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ５」）へ進む。もし決定ブロック５０１６のテストへの答えがＹＥＳであれば、方法５０００は、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ６」）へ進む。
【００３７】
ターミナルＡ４（図１５Ｄ）から、方法５０００は、結晶カードがＰＤＭＳから製造されたとして本方法がこれを処理するブロック５０１８へ進む。本方法は、マイクロキャピラリー表面が全フッ素置換シラン溶液により室温で２時間処理されるブロック５０２０へ進む。本方法は、次に全フッ素置換シラン溶液が真空により除去されるブロック５０２２へ進む。ブロック５０２４において、結晶カードのマイクロキャピラリー表面は、５〜１０ｐｓｉの圧力下にある空気のような気体を用いて１時間乾燥される。本方法は、次にターミナルＡ２のステップが起動したポイントに戻り、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ３」）へ進む。ブロック５０１２を参照。
【００３８】
ターミナルＡ５から（図１５Ｅ）、方法５０００は、結晶カードが環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）を備えるプラスチックまたは同等のプラスチックで作られたとして本方法がこれを処理するブロック５０２６へ進む。ブロック５０２８では、該プラスチックの表面エネルギー（疎水性）を低減するために、マイクロキャピラリー表面が室温において２時間試薬で処理される。表面エネルギーを低減するのに適した試薬は、フッ素化共重合体溶液を含むが他の試薬も可能である。適切なフッ素化共重合体溶液は、Ｃｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡ（Ｃｙｔｏｎｉｘ社，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような、フルオロ溶媒中の２％フッ素化共重合体溶液を含む。Ｃｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡは、ポリカーボネートへの付着用に製造されたもので、表面エネルギーを６〜１０ダイン／ｃｍに低減する。フッ素化共重合体溶液を結晶カードにつけるために、排出口からＣｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡ溶液が満たされる。ブロック５０３０では、フッ素化共重合体溶液が真空によって除去される。ブロック５０３２では、マイクロキャピラリー表面が、５〜１０ｐｓｉの圧力下にある空気のような気体を用いて１時間乾燥される。方法５０００は、次に結晶カードが１時間、６０℃に加熱されるブロック５０３４へ進む。本方法は、次にターミナルＡ２のステップの起動ポイントに戻る。ターミナルＡ３におけるブロック５０１２を参照。
【００３９】
ターミナルＡ６（図１５Ｆ）から、方法５０００は、結晶カードが氷上で予冷されるブロック５０３６へ進む。ブロック５０３８において、マイクロキャピラリー表面は、Ｃｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡのようなフッ素化共重合体溶液を用いて氷上で２時間処理される。ポリカーボネート結晶カードの注入口は、より高い温度で５０２ＡＦＡ溶液を用いてインキュベーションされた場合に割れやすい可能性がある。本方法は、次にターミナルＡ５へ進み、ブロック５０３０へ飛んでブロック５０３０、５０３２、および５０３４でのステップを行う。本方法は、次にターミナルＡ２のステップが起動したポイントへ戻る。ブロック５０１２におけるターミナルＡ３を参照。ブロック５０１２における方法ステップの一組は、結晶カードをポンプに連結する。
【００４０】
ターミナルＡ３（図１５Ｇ）から、方法５０００は、シリンジ１に緩衝剤または水溶液が満たされるブロック５０４０へ進む。ブロック５０４２では、シリンジ２に沈殿剤溶液が満たされる。ブロック５０４４では、シリンジ３にキャリア流体が満たされる。適切なキャリア流体の代表的な例は、フッ素化炭素溶液を含む。フッ化炭素流体の適切な例は、ＦＣ−４０を含む。ＦＣ−４０は、膜タンパク質の可溶化に用いられる洗剤に対して高い表面張力をもつ。表面張力は、ナノプラグ形成および結晶化を可能にする。代表的な実施形態において、キャリア流体は、水性流体に対して非混和性のフッ素系オイルである。水性ナノプラグが形成されるときに、該キャリア流体はそれらを取り囲んで分離し、本方法の間に結晶カード中を前進させる。ブロック５０４６では、注目されるタンパク質を然るべき緩衝剤中に含んだタンパク質溶液がシリンジ４に満たされる。ブロック５０４８では、テフロン（登録商標）配管のような適切な配管が各シリンジのニードルに取り付けられる。ブロック５０５０では、シリンジ１および２がポンプ１に取り付けられ、シリンジ３および４がポンプ２に取り付けられる。ブロック５０５２では、該配管が、マクロ・マイクロ接合部分を経て結晶カードに接続される。マクロ・マイクロ接合部分に適した接続は、上述の通りである。本方法は、次に出口ターミナルＢへ進む。
【００４１】
ターミナルＢから、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ」）および出口ターミナル（「ターミナルＤ」）間で定義された方法ステップの一組５００４へ進む。方法ステップの一組５００４は、結晶を得るために結晶カード中の流体の流れを調節するインストラクションを受ける。ターミナルＣ（図１５Ｈ）から、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ１」）で定義された方法ステップの一組５０５４へ進む。方法ステップ５０５４の一組はポンプを構成する。
【００４２】
ターミナルＣ１（図１５Ｉ）から、方法５０００は、本システムが制御するシリンジポンプ・モデルのタイプに関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０６０へ進む。適切なポンプは、より良好な精度を提供するために製造者によって改良されたＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｔｗｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ Ｍｏｄｅｌ ３３（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む。図２に示されるように、各シリンジポンプは２つのシリンジを制御する。ブロック５０６２において、本方法は、ポンプシステムの制御に用いるコンピュータのシリアル通信ポートに関するインストラクションを受ける。該通信ポートは、各シリンジポンプが同時にインストラクションを受けるように構成される。その結果として時間遅延が防がれ、溶液が同時に結晶カード中を流れることが可能になる。本方法は、ポンプに接続される各シリンジの容積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０６４へ進む。ブロック５０６６において、本方法は、ポンプに接続される各シリンジの直径を決定する。本方法は、次に進んでターミナルＣ１のステップが起動したポイントに戻る。
【００４３】
ブロック５０５４から、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ２」）で定義された方法ステップの一組５０５６へ進む。該方法ステップの一組は、流体を結晶カードのミキサー回路にプライミングする。ターミナルＣ２（図１５Ｊ）から、方法５０００は、結晶カードのミキサー中に流体を分注するためにどのシリンジを用いるかに関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０６８へ進む。ブロック５０７０において、本方法は、各シリンジからの流量に関するインストラクションを受ける。ブロック５０７２において、本方法は、シリンジが分注する流体の体積に関するインストラクションを受ける。ブロック５０７４において、本方法は、ミキサー回路上流の流体チャンネルから流体を分注するか、または吸引する。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ４」）へ続く。
【００４４】
ターミナルＣ４（図１５Ｋ）から、方法５０００は、シリンジが水性流体を分注しているかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０７６へ進む。もし決定ブロック５０７６におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ５」）へ進む。もし決定ブロック５０７６におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、ブロック５０７８へ進む。本方法は、水性流体が検査回路に入る前にミキサー回路で該流体を停止させるインストラクションを受ける。本方法は、次にターミナルＣ２へと続き、上記に示されたプロセス・ステップを次のシリンジに対して繰返す。ターミナルＣ５（図１５Ｋ）から、方法５０００は、ミキサー回路の下流かつ検査回路のわずかに内部でキャリア流体を停止させるインストラクションを本方法が受けるブロック５０８０へ進む。本方法は、次に進んでターミナルＣ２のステップが起動したポイントへ戻る。
【００４５】
本題からそれるが、水溶液およびキャリア流体を結晶カードのミキサーにプライミングするための例示的プロセスが詳細に記載される。初めに、プライミング中の観察のために、空の結晶カードのミキサー回路が顕微鏡ステージ上に置かれる。本方法は、シリンジ１から溶液、例えば緩衝液をミキサーに分注するインストラクションを受ける。流体チャンネルの合流点のすぐ上流のミキサー領域に溶液が到達したことをユーザが観察するまで、緩衝液が、シリンジ１に接続された流体チャンネルに分注される。本方法は、次に溶液の分注を停止するインストラクションを受ける。試薬を吸引するインストラクションを本方法に与えることによって溶液をチャンネルから除去することもできる。水溶液は、結晶カードの検査回路に入るのを控えることが適切である。水溶液を分注するシリンジ；例えば、シリンジ４（タンパク質溶液）およびシリンジ２（沈殿剤溶液）に接続された３つの流体チャンネルのそれぞれに対して本方法が繰返される。次にキャリア流体が、シリンジ３に接続された第４の流体チャンネルに分注される。キャリア流体は、ミキサーの合流点を通過して結晶カードの検査回路（第５のチャンネル）にわずかに入るまで第４の流体チャンネルに分注される。本方法は、次にキャリア流体の分注を停止するインストラクションを受ける。
【００４６】
ブロック５０５６から戻って、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ３」）で定義された方法ステップの一組５０５８へ進む。本方法ステップの一組は、結晶カードの検査回路で水性ナノプラグを生成するインストラクションを受ける。ターミナルＣ３（図１５Ｌ）から、方法５０００は、どのナノプラグ形成プロトコールを行うかに関するインストラクションをブロック５０８２で受ける。本方法は、受けたインストラクションが一定モードを実行するためだったかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０８４へ次に進む。もしブロック５０８４におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ６）へ進む。もし決定ブロック５０８４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、各シリンジに対する流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０８６へ進む。本方法は、次にミキサー回路を通過する流体の全体積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０８８へ進む。ブロック５０９０において、本方法は、各ナノプラグが然るべくサイズが等しく、同様のタンパク質および沈殿剤濃度をもつ水性ナノプラグを結晶カードの検査回路内に生成する。本方法は、次に進んで起動ポイントへ戻る。ブロック５０５８から、本方法は出口ターミナルＤへ進む。
【００４７】
ターミナルＣ６（図１５Ｍ）から、方法５０００は、勾配モードを行うインストラクションを本方法が受けたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０９２へ進む。もしブロック５０９２におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ７」）へ進む。もし決定ブロック５０９２におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、可変流シリンジに対する最大流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０９４へ進む。一実施形態において、可変流量シリンジは、緩衝液および沈殿剤を含む。別の実施形態において、シリンジ１および２は、可変流量シリンジである。しかしながら、本方法は、任意のシリンジを可変流量シリンジに指定することができる。一実施形態において、可変流量シリンジを合わせた流量は、最大流量に等しい。例えば、一実施形態において、本方法は、シリンジ１の流量が２μｌ／分に等しいインストラクションを提供し、その一方でシリンジ２の流量が０（ゼロ）μｌ／分に等しいインストラクションを提供する。この実施形態において、最大流量は２μｌ／分（２＋０μｌ／分）に等しい。本方法は、次にキャリア流体を制御するシリンジに対する一定流量に関するインストラクションを本法が受けるブロック５０９６へ進む。一実施形態において、シリンジ３がキャリア流体を制御する。一実施形態において、キャリア流体の流量は、水溶液（緩衝剤、沈殿剤およびタンパク質溶液）の総流量に等しい。別の実施形態において、キャリア流体に対する流量は、水性流体の総流量より小さいか、または大きいように選択することができる。キャリア流体速度が小さいほど、ナノプラグ間のキャリア流体を備える部分は小さく、より大きい水性ナノプラグが生成される。キャリア流体速度が大きいほど、ナノプラグ間のキャリア流体部分は大きく、より小さい水性ナノプラグが生成される。本方法は、次にタンパク質溶液を制御するシリンジに対する一定流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０９８へ進む。一実施形態において、シリンジ４がキャリア流体を制御する。一実施形態において、タンパク質の流量は、他の水溶液（緩衝剤および沈殿剤）の流量の合計に等しい。タンパク質溶液の流量を変化させると、各ナノプラグにおけるタンパク質対結晶化条件の比率は変化する。本方法は、次に本方法の１回の繰返しまたはサイクルの間に分注する水の全体積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０００へ進む。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ８」）へ進む。
【００４８】
ターミナルＣ８（図１５Ｎ）から、方法５０００は、検査回路に分注する各水性ナノプラグの体積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６００２へ進む。ブロック６００４において、本方法は、行う繰返しまたはサイクルの総数（すなわち、勾配スクリーニング・ステップが繰返される回数）に関するインストラクションを受ける。一実施形態において、もし本方法がゼロ回の繰返しを実行するインストラクションを受ければ、ブロック６０００で選択した水の全体積が分注されたときにポンプが停止する。別の実施形態において、もし本方法が１回またはそれ以上の繰返しを実行するインストラクションを受ければ、上述のプロセス・ステップが所望の回数繰返されたときにポンプが停止する。ブロック６００６において、本方法は、緩衝剤および沈殿剤溶液の流量の合計がブロック５０９４で選択した最大流量に等しいように、緩衝剤および沈殿剤溶液の流量を互いに変化させる。例えば、一実施形態において、本方法は、ブロック５０９４で最大流量が２μｌ／分に等しいようにシリンジ１の流量が２μｌ／分に等しいインストラクションを提供し、かつシリンジ２の流量が０μｌ／分に等しいインストラクションを提供する。本方法がスタートしたときに、シリンジ１からの流量は、２μｌ／分で始まって０μｌ／分にランプダウンし、一方でシリンジ２からの流量は、同時に０μｌ／分から２μｌ／分にランプアップする。ブロック６００８において、本方法は、各液滴のサイズは等しいが各液滴におけるタンパク質および沈殿剤濃度が異なる、一連の水性ナノプラグを検査回路内に生成する。ブロック６０１０において、本方法は、所望数の繰返しまたはサイクルを行った後に終了する。本方法は、次に出口ターミナルＤへ本方法が進むブロック５０５８へ戻る。
【００４９】
ターミナルＣ７（図１５Ｏ）から、方法５０００は、ハイブリッドモードを行うインストラクションを本方法が受けたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック６０１２へ進む。もしブロック６０１２におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ９」）へ進む。もしブロック６０１２におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、沈殿剤カートリッジが準備されたかどうか判断するためにテストを行う別の決定ブロック６０１４へ進む。もし決定ブロック６０１４におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１０」）へ進む。もしブロック６０１４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、また別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１１」）へ進む。
【００５０】
ターミナルＣ９（図１５Ｐ）から、方法５０００は、脈動モードを行うインストラクションを本方法が受けたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック６０１６へ進む。もし決定ブロック６０１６におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、上記に示されたステップが繰返されるターミナルＣ３へ戻る。もし決定ブロック６０１６におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、拍動モードを行うことに関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０１８へ進む。本方法は、次にブロック５０５８へ戻る。ブロック５０５８から、本方法はターミナルＤへ出る。
【００５１】
ターミナルＣ１０（図１５Ｑ）から、方法５０００は、キャリア流体を含んだテフロン（登録商標）配管のような配管にシリンジを接続するブロック６０２０へ進む。本方法は、次に該シリンジをシリンジポンプに接続するブロック６０２２へ進む。ブロック６０２４において、本方法は、規定体積、例えば、約４０ｎＬを入れるインストラクションを受け、約４０ｎＬの気泡を該配管に吸引する。ブロック６０２６において、本方法は、規定体積、例えば、約１２０ｎＬの沈殿剤溶液を該配管に吸引する。ブロック６０２８において、本方法は、適切な数の沈殿剤が該配管中に負荷されるまで上記の２ステップを繰返す。例えば、適切な数の沈殿剤は、１〜２４またはそれ以上に及ぶことができる。ブロック６０３０において、本方法は、キャリア流体、約１μｌ、を該配管の開口先端中に吸引する。ブロック６０３２では、該配管を結晶カードの沈殿剤注入口に接続する。本方法は、次に継続ターミナルＣ１１へ進む。
【００５２】
ターミナルＣ１１（図１５Ｒ）において、方法５０００は、緩衝剤溶液（シリンジ１）の初めの流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０３４へ進む。ブロック６０３６において、本方法は、緩衝剤溶液の流量変化（ステップサイズ）に関するインストラクションを受ける。ステップサイズは、本方法の各ランプアップまたはランプダウンに適用される流量変化である。ブロック６０３８において、本方法は、沈殿剤カートリッジ（シリンジ２）の初めの流量に関するインストラクションを受ける。ブロック６０４０において、本方法は、沈殿剤溶液の流量変化（ステップサイズ）を計算する。一実施形態において、緩衝剤に対するステップサイズは、沈殿剤に対するステップサイズに等しい。ブロック６０４２において、本方法は、総流量を決定するために緩衝剤および沈殿剤の流量を合計する。ブロック６０４４において、本方法は、キャリア流体（シリンジ３）に対する初めの流量に関するインストラクションを受ける。ブロック６０４６において、本方法は、キャリア流体の流量変化（ステップサイズ）に関するインストラクションを受ける。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１２」）へ進む。
【００５３】
ターミナルＣ１２（図１５Ｓ）から、方法５０００は、タンパク質溶液（シリンジ４）の一定流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０４８へ進む。本方法は、次に各沈殿剤に対するランプアップ・ステップ数（流れの変化速度）に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０５０へ進む。ブロック６０５２において、本方法は、本方法の各繰返しまたはサイクルに対して、ランプダウン・ステップ数がランプアップ・ステップ数に等しいように設定する。ブロック６０５４において、本方法は、行う繰返しまたはサイクル数に関するインストラクションを受ける。一実施形態において、１回の繰返しまたはサイクルは、沈殿剤カートリッジに負荷された単一の沈殿剤に対応する。ブロック６０５６において、本方法は、各ランプ・ステップの継続時間に関するインストラクションを受ける。例えば、一実施形態において、各ランプ・ステップの持続時間は１．５秒である。ブロック６０５８において、本方法は、合計が初めの流量に等しいように、緩衝剤および沈殿の流量を互いに変化させる。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１３」）へ進む。
【００５４】
ターミナルＣ１３（図１５Ｔ）から、方法５０００は、キャリア流体の流量を本方法が変化させるブロック６０６０へ進む。本方法は、次に各液滴が等量のタンパク質および様々な量の沈殿剤および緩衝液をもつ検査回路中で本方法が一連のナノプラグを生成するブロック６０６２へ進む。一実施形態において、本方法は、各サイクルに対して様々な量の沈殿剤を一定量のタンパク質とともに提供する。表１は、ハイブリッドモードに関する上述の方法の一実施形態を示す。本方法は、次にターミナルＤへ進む。
【００５５】
【表１】
ブロック５００４におけるターミナルＤから、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＥ」）および出口ターミナル（「ターミナルＦ」）間で定義された方法ステップの一組５００６へ進む。方法ステップの一組５００６は、結晶カードから得られた結晶に関する回折実験を行う。ターミナルＥ（図１５Ｕ）から、方法５０００は、回折の前に結晶カードの検査回路から結晶を採取したかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック６０６４へ進む。もしブロック６０６４におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＥ１」）へ進む。もしブロック６０６４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、剥離可能な層を結晶カードの底面から除去するブロック６０６６へ進む。一実施形態において、剥離可能な層は、マイクロ流体チャンネルを含んだ結晶カードのプラスチック部分に接合されている。該接合は、マイクロ流体回路から流体が漏れ出すのを防ぐには十分強いが、手作業で剥がれるように十分弱く設計される。一実施形態において、該接合は熱接合である。別の実施形態において、該接合は化学結合である。剥離可能な層の除去は、結晶カードのマイクロ流体チャンネル内部を暴露し、水性ナノプラグにアクセスすることを可能にする。別の実施形態では、剥離可能な層が除去された後に、結晶を含んだ水性ナノプラグは結晶カードのマイクロ流体チャンネル中に保持される。ブロック６０６８では、検査回路中に形成された結晶がクライオループを用いて結晶カードから採取される。一実施形態において、クライオループは、ナイロンのクライオループである。ブロック６０７０では、結晶が凍結され、回折データが得られる。本方法は、次に本方法が実行を終了する出口ターミナルＦへ進む。
【００５６】
ターミナルＥ１（図１５Ｖ）から、方法５０００は、結晶を含んだ結晶カードをＸ線源のゴニオメータに搭載するブロック６０７２へ進む。ブロック６０７４において、本方法は、検査回路内の元の位置にある結晶から回折データを得る。本方法は、次にブロック５００６、さらに終了ターミナルＦへ進む。本方法は、次に実行を終了する。
【００５７】
メチオニン−Ｒ−スルホキシド還元酵素の結晶を生成するために、本主題における様々な実施形態の勾配スクリーニングと組み合わせて、上述の結晶採収ステップを用いることができる。結晶カードからクライオループで結晶が取り出され、その後回折実験のために凍結された。例として、１．７Åデータセットが、アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅにあるＳＢＣ−ＣＡＴビームライン１９ＢＭで収集され、続いて構造が解明されて精緻化された。最終的な座標と構造因子とがＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託された（受入番号３ＣＸＫ）。
【００５８】
本主題の様々な実施形態の結晶カードは、その場回折にも適する。その場回折は、凍結保護プロセスによって結晶が変化する前に、結晶学者がその品質を評価することを可能にする。強固な結晶では、完全な回折データを得ることが可能である。本結晶カードは、室温での回折データ収集用にＸ線源のゴニオメータに搭載するのに十分なＸ線透過性をもつ。例えば、結晶カードによるＸ線吸込を分析するために簡単なテストが行われた。ＡＰＳリング電流で規格化したイオンチャンバーのビーム電流（Ｉ／Ｉ０）が、０．９７９２６１Ａ（１２．６６０９９ｋｅＶ）の波長に対して結晶カードの挿入あり、およびなしで測定された。結晶カードなしのＩ／Ｉ０は１．９１６７１Ｅ−６と測定され、結晶カードありのＩ／Ｉ０は１．５５１１Ｅ−６と測定された。この結果、結晶カードによるＸ線吸光度は１９％ということになる。さらにまた、本結晶カードは、ＸおよびＹ軸に沿って平行移動でき、複数の結晶からデータを収集して完全なデータセットに一体化することができる。この技術を実証するために、リゾチーム結晶を含んだ結晶カードが、アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅにあるＮＥ−ＣＡＴビームライン２４ＩＤ−Ｃのゴニオメータ・ヘッドに搭載された。データは、結晶カード中の３つの結晶から室温で収集された。結晶学的データは、付録Ａに提示される。
【００５９】
構造決定に関して、データセットは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ：メチオニン−Ｒ−スルホキシド還元酵素はビームライン１９ＢＭ、１００Ｋ；およびリゾチームはビームライン２４−ＩＤＣ、室温で収集された。データは、ＨＫＬ２０００を用いて積分およびスケーリングされた。リゾチーム構造に対してｍｏｓｆｌｍパッケージを用い、３つのデータセットのそれぞれに対して別々に強度が積分された。Ｍｏｌｒｅｐ、ならびに探索モデルとしてそれぞれＰＤＢエントリーの１ＩＥＥおよび３ＣＥＺを用い、分子置換によってリゾソームおよびメチオニン−Ｒ−スルホキシド還元酵素の構造が解明された。構造は、Ｒｅｆｍａｃ５を用いて精緻化され、Ｃｏｏｔを用いてモデル構築が行われた。
【００６０】
説明に役立つ実施形態が図示ならびに記載されたが、当然のことながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々にそれらを変更することができる。
【００６１】
付録Ａ
【００６２】
【表２】
独占的な所有権または特権が請求される本発明の実施形態が、以下のように明示される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２００８年６月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／０６１５３６号の利益を請求し、当該仮出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府のライセンスの権利に関する陳述
本発明の主題は、少なくとも部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより授与された、ＮＩＧＭＳ Ｕ５４ ＧＭ０７４９６１によって提供された政府の支援を受けて行われた。
【背景技術】
【０００３】
構造生物学の分野は、スループットおよび効率を向上させる技術を毎年生み出している。かかる進歩は、遺伝子から三次元構造までを３日のうちに発達させることを動機づけた。効率を改善するためには、結晶化スクリーニングと最適化とに十分な材料が、無細胞合成から得られるように、必要なタンパク質量を最小限に抑えることが望ましい。「３日」の構造目標を念頭に置いて、遺伝子から構造へのパイプライン効率を高めるいくつかの技術を開発することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この要約は、以下の詳細な記載にさらに記載される概念から選択したものを平易に紹介するために示される。この要約は、請求される主題の重要な特徴を特定することは意図しておらず、請求される主題の範囲を決定する助けとして用いることも意図していない。
【０００５】
議論される主題の一様態は、ポンピングシステム；および該ポンピングシステムを制御するためにタンパク質結晶化システム上で実行するように構成された複数個のソフトウェア、を備えるタンパク質結晶化のためのシステムを含む。本システムは、ポンピングシステムに連結された１つまたはそれ以上の結晶カードであって、それぞれがミキサー、および貯蔵とタンパク質結晶化検査を容易にするために該ミキサーに連結されたマイクロ流体キャピラリーとを収容するように構成された、結晶カードをさらに含む。
【０００６】
本主題の別の様態は、複数個のソフトウェアで働くポンピングシステムを用いて各水流を独立に制御することによって水流を調節することを備える、勾配スクリーニングのための方法を含む。本方法は、タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すために、タンパク質の結晶化相空間をマッピングすることをさらに備える。
【０００７】
本主題のさらなる様態は、沈殿剤プラグを予め形成すること；およびそれぞれが２つの沈殿剤プラグを互いに分離するプラグ・スペーサーを予め形成することを備えるハイブリッド・スクリーニングのための方法を含む。本方法は、沈殿剤プラグ、プラグ・スペーサー、およびタンパク質の流れを合流させることによって勾配を形成することをさらに備える。本方法は、タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すために、タンパク質の結晶化相空間をマッピングすることをさらに含む。
【０００８】
本主題のさらなる様態は、キャピラリーをもつ結晶カードを受け取ること；表面エネルギーを低減するためにキャピラリーに試薬をコーティングすること；および試薬を除去することを備える方法を含む。
【０００９】
別の様態において、本主題は、ミキサー回路および検査回路を収容するように構成された基板を備える結晶カードを含む。結晶カードは、基板に接合され、基板から剥離されるように構成された層をさらに含む。
【００１０】
前述の様態、および本発明に付随する利点の多くは、添付図面と併せて次の詳細な記載を参照することによってよく理解され、従ってより容易に正しく認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】例となるナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを示すブロック図である。
【図２】ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムの例となるポンピングシステムを示すブロック図である。
【図３Ａ】ポンピングシステムを構成するための例となるユーザインターフェースを示す絵図である。
【図３Ｂ】本システムの結晶カードに流体をプライミングするための例となるユーザインターフェースを示す絵図である。
【図３Ｃ】結晶カードにおけるナノプラグの生成を指定するための例となるユーザインターフェースを示す絵図であって、本主題の一実施形態に従ってナノプラグはサイズが等しく内容物が等しい。
【図３Ｄ】結晶カードにおけるナノプラグの生成を指定するための例となるユーザインターフェースを示す絵図であって、本主題の一実施形態に従ってナノプラグは様々な濃度のタンパク質および沈殿剤を有する。
【図３Ｅ】結晶カードにおけるナノプラグの生成を指定するための例となるユーザインターフェースを示す絵図であって、本主題の別の実施形態に従ってナノプラグは複数の沈殿剤に対して様々なサイズおよび濃度を有する。
【図４Ａ】結晶カードの一実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図４Ｂ】結晶カードの一実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図４Ｃ】結晶カードの一実施形態の上面図を示す絵図である。
【図４Ｄ】結晶カードの一実施形態の側面図を示す絵図である。
【図４Ｅ】結晶カードの一実施形態の底面図を示す絵図である。
【図５Ａ】結晶カードの別の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図５Ｂ】結晶カードの別の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図５Ｃ】結晶カードの別の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図５Ｄ】結晶カードの別の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図５Ｅ】結晶カードの別の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図６Ａ】結晶カードの第３の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図６Ｂ】結晶カードの第３の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図６Ｃ】結晶カードの第３の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図６Ｄ】結晶カードの第３の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図６Ｅ】結晶カードの第３の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図７Ａ】結晶カードの第４の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図７Ｂ】結晶カードの第４の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図７Ｃ】結晶カードの第４の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図７Ｄ】結晶カードの第４の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図７Ｅ】結晶カードの第４の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図８Ａ】結晶カードの第５の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図８Ｂ】結晶カードの第５の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図８Ｃ】結晶カードの実施形態の上面図を示す絵図である。
【図８Ｄ】結晶カードの第５の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図８Ｅ】結晶カードの第５の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図９Ａ】結晶カードの第６の実施形態の上面等角図を示す絵図である。
【図９Ｂ】結晶カードの第６の実施形態の底面等角図を示す絵図である。
【図９Ｃ】結晶カードの第６の実施形態の立体分解等角図を示す絵図である。
【図９Ｄ】結晶カードの第６の実施形態の上面図を示す絵図である。
【図９Ｅ】結晶カードの第６の実施形態の側面図を示す絵図である。
【図９Ｆ】結晶カードの第６の実施形態の底面図を示す絵図である。
【図１０】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの一実施形態を示す絵図である。
【図１１】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの別の実施形態を示す絵図である。
【図１２】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの第３の実施形態を示す絵図である。
【図１３】結晶カードの一実施形態の３プラス１ミキサーの第４の実施形態を示す絵図である。
【図１４】結晶カードの一実施形態の断面図を示す絵図である。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｅ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｆ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｇ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｈ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｉ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｊ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｋ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｌ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｍ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｎ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｏ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｐ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｑ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｒ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｓ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｔ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｕ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【図１５Ｖ】図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化するための例となる方法を示すプロセス図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本主題の様々な実施形態において、ポンプ；該ポンプを制御するように構成されたソフトウェア；ならびにミキサー回路および検査回路を収容する結晶カード、を備えるナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムが記載される。結晶カードは、Ｘ線透過、光学的透明性、成形性、耐薬品性（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ）および表面エネルギーからなる群から選択された１つまたはそれ以上の特性を含む材料を用いて適切に製造される。結晶カードは、該結晶カードからの結晶の採取またはその場Ｘ線回折を可能にする様々な相の巨大分子結晶を収容する。該結晶は、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムによるナノプラグ形成を通じて、結晶カード内で成長が進む。ナノプラグは、水溶液流に非混和性の生物学的に不活性なキャリア流体、例えばフッ化炭素溶液、を混合することによって形成される。ナノプラグ結晶化実験を構成するために、例えば標的分子、緩衝剤、および沈殿剤溶液からなる水溶液流がミキサー回路で混合される。ナノプラグは、結晶化のためにインキュベーションおよびモニタリングが行われる。タンパク質結晶の核発生および成長に関する科学的疑問の解明および新規構造の溶液における結晶生成を目指して、ナノプラグ結晶化実験を然るべく用いることができる。
【００１３】
ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムは、２つのスクリーニング様式：勾配モードおよびハイブリッドモードを容易にする。本明細書では、用語勾配モードは、分子の様々な結晶化相を提供する任意の適切なスクリーニング方法を含む。勾配モードは、特定分子の結晶化相空間を明らかにするために、結晶学者が結晶カードを精細にスキャンすることを可能にする。ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムに用いられる各水溶液流は、ポンプを用いてソフトウェアにより独立に制御でき、それ故に個々の流れの流量を変化させることにより、一連のナノプラグにわたって所望の粒度の濃度勾配が然るべく形成される。沈殿剤の流れの流量が減少するときに、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムは、流量の合計が一定のままであるように緩衝剤の流れの流量を増加させる。沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すために、勾配モードを用いてタンパク質のような特定分子の結晶化相空間をマッピングすることができる。
【００１４】
勾配モードの機能強化として、ハイブリッドモードは、勾配とスパースマトリックス・スクリーニングとを１つの結晶カード上で組み合わせる。予め形成された様々な結晶化剤のカートリッジを作り出すことによって、ナノプラグ中の分子結晶に関するスパースマトリックス・スクリーニングを実現することができる。本明細書において、用語ハイブリッドモードは、予め形成されたカートリッジを含む任意の適切なスクリーニング方法を含めて、ハイブリッド・スクリーニングを含む。ハイブリッドモードは、ナノプラグ・スペーサー（気泡）によって分離された沈殿剤ナノプラグを予め形成し、それらを分子流と合流させたときに濃度勾配を形成することにより、スパースマトリックス・スクリーニングの概念を拡張させる。勾配モードと同様に、ハイブリッドモードは、予め形成された沈殿剤ナノプラグおよび緩衝剤の流れの間で流量変化を連係させることによって勾配を発生させる。スパースマトリックスおよび勾配スクリーニングを１つの結晶カード上で一緒に行うことによって、ハイブリッドモードでは予め形成された各沈殿剤ナノプラグから２０〜４０の実験が生み出され、結晶化位相空間の広い領域をサンプリングすることが可能になる。
【００１５】
前述および後述のように、用語「ナノプラグ」は、本システムのマイクロ流体チャンネルを満たす、１０〜２０ｎＬの水滴のような、ナノリットル体積サイズの液滴を指す。各ナノプラグが個別の微結晶化実験を備える。前述および後述のように、用語「ミキサー回路」は、結晶カードの検査回路の上流地点で一緒になる、３つの水チャンネルおよび１つのキャリア流体チャンネルを有する回路を含むことを意味する。４つまたは５つの水チャンネルおよび１つのキャリア流体チャンネルをもつミキサーのような、さらなる構成も可能である。水チャンネルは一緒になり、キャリア流体チャンネルと角度９０度で然るべく交差する。本明細書では、用語「マクロ・マイクロ接合部分（ｍａｃｒｏ−ｍｉｃｒｏ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）」は、シリンジおよび結晶カード間の連結を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、シリンジは、テフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）配管のような配管を通じてミキサー回路または検査回路に接続される。他の実施形態において、該配管は、回路の注入口および排出口を該配管と流体的に接続するように構成されたコネクタを用いて、ミキサー回路または検査回路に接続される。前述および後述のように、用語「検査回路」は、流体が一緒になってキャピラリー内を流れる水性ナノプラグを形成する、該キャピラリーまたはチャンネルを指す。検査回路は、結晶形成についてナノプラグを検査するために用いることもできる。さらにまた、検査回路は、本主題の方法によって形成された結晶を貯蔵するためにも用いることができ、それ故に本明細書では貯蔵キャピラリーとも呼ばれる。本明細書では、用語「主チャンネル」は、ミキサーの下流に位置し、水溶液とキャリア流体とが混ざって水性ナノプラグを形成する検査回路の領域を指す。前述および後述のように、用語「分子」は、有機化合物および／または化学物質のような小分子、ならびに巨大分子を含む。用語「生物学的な分子」は、生物学的な起原に由来する、対応する、またはそれをモデルとする分子を指す。この用語は、無細胞合成によるようにインビトロで、および／または組み換えタンパク質のようにインビボで合成もしくは生成された分子；変異タンパク質、および人工タンパク質、天然および人工核酸分子、ならびに天然には発生しない他の生物学的な分子も含む。本明細書では、用語「巨大分子」は、核酸、タンパク質、炭水化物および脂質のような生体高分子を含む。分かりやすくするために、用語「タンパク質」および「タンパク質溶液」は、本明細書では、タンパク質に加えて他のタイプの分子も包含する。
【００１６】
分子の結晶化に役立つナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システム１００が図１に示される。結晶構造が所望される分子を備える調製試料１０２、例えば調製タンパク質試料が水溶液１０４中に提供される。追加の水溶液、例えば緩衝剤溶液および沈殿剤溶液も提供される。緩衝剤溶液は、生物学的な試料１０２を調製するために用いられる緩衝剤を備えることができる。キャリア流体も提供される。キャリア流体は、水溶液と非混和性である。キャリア流体の適切な例は、フッ素系オイル；例えば、ＦＣ−４０（３Ｍ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を含む。水溶液およびキャリア流体１０４は、１つまたはそれ以上のポンプ１０８に接続された１つまたはそれ以上のシリンジ１０６に供給される。ポンプ１０８は、ナノプラグ形成用コンピュータ１１０上で実行されるソフトウェアによって制御される。ナノプラグ形成用コンピュータ１１０上で実行されるソフトウェアは、結晶カード１１２における水溶液およびキャリア流体１０４の流れを調節する。顕微鏡１１４のような拡大デバイスを用いて、結晶カード１１２における水溶液およびキャリア流体の流れが観察される。
【００１７】
結晶カードを通る様々な流体の流れを調節するのに役立つポンピングシステム２００が図２に示される。ポンプ１ ２０２は、シリンジ１ ２０４およびシリンジ２ ２０８を制御する。シリンジ１ ２０４に緩衝剤２０６のような水溶液が負荷される。シリンジ２は、沈殿剤試薬２１０のような水溶液で満たされる。ポンプ２ ２１２は、シリンジ３ ２１４およびシリンジ４ ２１８を制御する。シリンジ３ ２１４は、キャリア流体２１６のような非混和性流体で満たされる。シリンジ４ ２１８は、注目されるタンパク質２２０のような分子を含んだ水溶液で満たされる。適切なポンプは、Ｈａｒｖａｒｄ Ｔｗｉｎ ３３シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む。いくつかの実施形態において、該シリンジポンプは、より良好な精度を提供するために製造者によって改良された。適切なシリンジは、１８００シリーズＨａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓ ＴｉｇｈｔシリンジのようなＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを含む。適切なシリンジ容積は、１０μｌから１００μｌの範囲である。ポンピングシステム２００は、ナノプラグ形成用コンピュータ１１０上で実行されるソフトウェアによって制御される。
【００１８】
適切なソフトウェアがポンピングシステム１０８を制御するために提供される。図３Ａ〜３Ｅは、ポンピングシステム２００を制御する様々なモードを表示する、システムのソフトウェアの代表的なユーザインターフェースを示す。図３Ａは、ソフトウェアの構成モードの代表的なユーザインターフェース３００を示す。図３Ｂは、ソフトウェアの主要モードの代表的なユーザインターフェース３０２を示す。図３Ｃは、ソフトウェアの一定モードの代表的なユーザインターフェース３０４を示す。図３Ｄは、ソフトウェアの勾配モードの代表的なユーザインターフェース３０６を示す。図３Ｅは、システムのソフトウェアのハイブリッドモードの代表的なユーザインターフェース３０８を示す。
【００１９】
本明細書に開示される主題の結晶カードを次に参照して、結晶カードの一実施形態の代表的な例が図４Ａ〜４Ｅに示される。結晶カード４００は、標準的な顕微鏡スライドとほぼ同じサイズであるように構成され、長さが約７６．２０ｍｍ、幅が約２５．４０ｍｍ（または約３インチ長×約１インチ幅）である。結晶カード４００は、厚さが約１．０から１．５ｍｍである。該結晶カードは、射出成形によって透明ポリカーボネートから製造される（Ｓｉｌｏａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。
【００２０】
図４Ａおよび４Ｂに示される実施形態を次に参照して、結晶カード４００は、上面４０２、および上面４０２に平行な下面４１４を有する。結晶カード４００は、ミキサー回路４０４、ならびに貯蔵および検査回路４０６を収容するように構成された基板を備える。ミキサー回路４０４は、４つのマイクロ流体チャンネル４２１、４２２、４２４、および４２６で構成される。図４Ｃを参照。チャンネル４２１、４２２、および４２４は一緒になり、角度９０度でチャンネル４２６と交差する。各チャンネルは、注入口４１０を備える。図４Ｅを参照。検査回路４０６は、ミキサー４０４のすぐ下流に位置し、排出口４１２で終わる長いマイクロ流体キャピラリー・チャンネルを備える。マイクロ流体キャピラリー４０６の長さは、約６７ｃｍである。マイクロ流体キャピラリー・チャンネル４０６は検査回路とも呼ばれ、本カードで生成された結晶は、その場Ｘ線回折解析に供するか、または凍結のために採取されるまでチャンネル４０６中に貯蔵することができる。マイクロ流体チャンネル４２１、４２２、４２４、４２６、およびキャピラリー・チャンネル４０６は、断面が実質的に正方形であり、約２００マイクロメータ（μｍ）×２００μｍの内径を有する。しかしながら、他のチャンネル構成も可能である。
【００２１】
図４Ｄを次に参照して、結晶カード４００は、基板に熱的に接合され、基板から剥離されるように構成された層４２０をさらに備える。剥離可能な層４２０は、基板表面４１４に熱的に接合される。他の実施形態において、剥離可能な層４２０は、基板に化学的に結合されてもよい。剥離可能な層４２０は、厚さが約０．１０から０．１４ｍｍである。剥離可能な層４２０は、剥離可能な層４２０の除去が検査回路チャンネル４０６の内部空間を暴露するように然るべく構成される。結晶カード４００は、該結晶カードにシリンジを接続するマクロ・マイクロ接合部分をさらに備える。一実施形態において、マクロ・マイクロ接合部分は、一端では注入口４１０および排出口４１２に接続され、他端ではフレキシブル・シリコン配管でできたスリップフィット・コネクタ４３２に接続された（例えば、ＰＥＥＫ（商標）ポリマーでできた）硬質プラスチック配管４３０の断面を含む。スリップフィット・コネクタ４３２は、テフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）配管（示されていない）を受けるように構成される。該配管の他端は、本システムのシリンジに接続される。テフロン（登録商標）配管は、内径が３６０μｍ、外径が７６０μｍ（ＩＤ／ＯＤ ３６０／７６０）である一方で、コネクタ４３２の内径は７６０μｍであり、その結果としてテフロン（登録商標）配管がコネクタ４３２に挿入されたときに気体および流体漏れのないシールが形成される。
【００２２】
動作中に、チャンネル４２１は、注目されるタンパク質溶液に用いられる緩衝剤のような、水溶液で満たされた配管に接続される。チャンネル４２２は、沈殿剤溶液で満たされた配管に接続される。本明細書では、用語沈殿剤は、用語クリスタラント（ｃｒｙｓｔａｌｌａｎｔ）と同義であると理解される。チャンネル４２４は、注目される標的分子を含む溶液で満たされた配管に接続される。一実施形態において、生物学的な標的分子はタンパク質である。チャンネル４２６は、キャリア流体で満たされた配管に接続される。キャリア流体の適切な例は、フッ素系オイル、またはＦＣ−４０のようなフッ化炭素を含むが、他にも可能ではある。キャリア流体は、水性流体に対して非混和性であり、検査回路マイクロチャンネルの壁を選択的に濡らす。その結果、混合された水溶液部分がチャンネル幅にわたるナノプラグに分割される。一実施形態において、水性ナノプラグは、体積が約１０〜２０ｎＬである。
【００２３】
図５Ａ〜５Ｅを次に参照して、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例が示される。異なった図面間で同様の要素は、同様の参照番号をもち、図面番号に対応して最上位の数字が１だけ増加する。簡潔にするために、異なった図面間で同様の要素は、さらには記載されない。図５Ａ〜５Ｅに示される実施形態において、注入口５１０は、結晶カード５００の上面５０２に位置する浅い円筒状のくぼみ５０８中に位置する。円筒状のくぼみ５０８は、注入口５１０および排出口５１２に配管を接続するコネクタ（示されていない）を取り付けるように構成される。結晶カード５００の寸法が図５Ｅに示される。結晶カード５００は、長さが７６．２ｍｍで幅が２５．４ｍｍである。注入口５１０は、４．５ｍｍの間隔をあけて配置される。検査回路５０６の平行チャンネルは、２．０ｍｍの間隔をあけて配置される。しかしながら、当業者に理解されるように他の適切な構成も可能である。
【００２４】
図６Ａ〜６Ｅを次に参照して、結晶カードの第３の実施形態の代表的な例が示される。簡潔にするために、前出の図面に記載された同様の要素は、ここでは記載されない。図６Ａ〜６Ｅに示された実施形態において、注入口６１０および排出口６１２は、表面６０２に接続され、そこから外に延びる円筒状の突起６０８より下に配置される。突起６０８は、注入口６１０および排出口６１２に配管を接続するコネクタ（示されていない）を取り付けるように構成される。本題からそれるが、図４〜６に示される実施形態において例示された結晶カードは、射出成形（Ｓｉｌｏａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により透明ポリカーボネート・プラスチックから製造される。
【００２５】
次に図７〜９に戻って、結晶カードの第２のタイプの代表的な実施形態が記載される。図形７Ａ〜７Ｅは、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例を示す。簡潔にするために、前出の図面に記載された同様の要素は、ここでは記載されない。図７Ａ〜７Ｅに示された実施形態において、結晶カード７００の上面７０２は、２列のポート７０８をさらに備える。該ポートは、ポート７０８より下に位置する注入口７１０および排出口７１２に配管を接続するのに適したプラスチック・コネクタ（示されていない）を受けるように構成される。表面７０２は２８のポート７０８を備える。しかしながら、結晶カード７００の設計に依存して、様々なポート数が可能である。ポート７０８は、結晶カード７００の表面７０２より上に約２．５ｍｍ延びる。注入口７１０および排出口７１２に位置を合わせて、これらと流体的に接続されるようにポート７０８底の中心部に然るべく穴が開けられる。該ポートの中心部は、約４．５ｍｍ間隔である。ポート７０８底に開けられた穴は、直径が約０．２ｍｍ（２００μｍ）である。当然のことながら、すべてのポートが回路チャンネルに接続されるわけではなく、注入口７１０および排出口７１２に配管を接続すべき所望のポートだけに穴を開ける必要がある。他の実施形態において、剥離可能な層７２０が底面７１４に接合される前に、レーザを用いて該層に穴が開けられる。レーザドリル穴は、注入口７１０および排出口７１２と流体的に接続するように構成される。特別に設計された結晶カード・ホールダ（示されていない）を用いて、レーザドリル穴に配管が接続される。
【００２６】
図７Ａ〜７Ｅをなおも参照して、結晶カードは、２つに分かれた非対称なマイクロ流体チャンネル回路７０６Ａおよび７０６Ｂをさらに備える。７０６Ａでは検査回路は長さが約２７０ｍｍである。７０６Ｂでは検査回路は長さが約３０６ｍｍである。７０６Ａおよび７０６Ｂの両回路において、排出口７１２は、注入口７１０からの回路およびミキサー回路７０４Ａ、７０４Ｂとは反対側に位置する。図７Ａ〜Ｅに示される実施形態は、ミキサー回路７０４Ａ、７０４Ｂからなる２つに分かれた構成を備える。図１０により詳細に示されるように、ミキサー回路７０４Ａは、水チャンネルおよびキャリア流体チャンネル間に長さがおよそ０．２０ｍｍの短いネック領域を備える。図１１により詳細に示されるように、ミキサー回路７０４Ｂは、水チャンネルおよびキャリア流体チャンネル間にネック領域がない。結晶カードにおける水性ナノプラグ形成には、ミキサー回路７０４Ａが適することがわかった。
【００２７】
図８Ａ〜８Ｅを参照して、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例が示される。簡潔にするために、前述の要素と同様の要素は、ここでさらには記載されない。結晶カード８００は、２つに分かれた対称なマイクロ流体チャンネル回路８０６を備える。この実施形態において、排出口８１２は、ミキサー８０４および注入口８１０と回路８０６の同じ側に位置する。
【００２８】
図９Ａ〜９Ｅを次に参照して、本主題の結晶カードに関する別の実施形態の代表的な例が示される。簡潔にするために、前述の要素と同様の要素は、ここでさらには記載されない。結晶カード９００は、１つのミキサー回路９０４および長い検査回路９０６を備える単一のマイクロ流体回路を備える。検査回路９０６は、長さが約６６５ｍｍである。図９Ｃは、結晶カード９００の分解立体図を示す。ポート９０８を備える部分９３０は、マイクロ流体回路チャンネルを備える部分９４０に接合される。剥離可能な層９２０は、部分９４０の底面９１４に熱的に接合される。しかしながら、他の実施形態において、剥離可能な層９２０は、基板表面９１４に化学的に結合されてもよい。剥離可能な層９２０は、剥離可能な層９２０の除去が検査回路チャンネル９０６の内部空間を暴露するように然るべく構成される。本題からそれるが、図７〜９に示される実施形態において説明された結晶カードは、透明環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）または同等のプラスチックから製造される（ＴｈｉｎＸＸＳ Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００２９】
次に図１０〜１３に戻って、ミキサー回路の代表的な例がここで記載される。図１０は、図７に示されるミキサー７０４Ａに対応するミキサー回路の一実施形態の代表的な例を示す。ミキサー回路１０００は、３つの水チャンネル１０２１、１０２２および１０２４を備える。該水チャンネルは、ネック領域１００７によってキャリア流体チャンネル１０２６から分離される。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つのチャンネル１０２１、１０２２、１０２４が一緒になり、キャリア流体を含んだチャンネル１０２６と角度９０度で交差するように方向が向けられる。ミキサー１０００は、検査回路１００６の一部分をさらに備える。図１０をなおも参照して、ミキサー１０００の寸法が次に記載される。ネック領域１００７は、長さが約０．２ｍｍである。チャンネル１０２１は、直径が約０．２ｍｍである。チャンネル１０２２、１０２４は、直径が約０．１４１ｍｍである。チャンネル１００６、１０２６は、直径が約０．２ｍｍである。しかしながら、ミキサー回路のための他の適切な寸法も可能である。
【００３０】
図１１は、図７に示されたミキサー回路７０４Ｂに対応するミキサー回路の別の実施形態の代表的な例を示す。ミキサー回路１１００は、３つの水チャンネル１１２１、１１２２および１１２４を備える。水溶液チャンネルは、ネック領域なしでキャリア流体チャンネル１１０６に直接に接続される。ミキサー回路は、検査回路１１２６に流れ込む。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つのチャンネルが一緒になりキャリア流体を含んだチャンネルと角度９０度で交差するように方向が向けられる。チャンネル１１２１の直径は、約０．２ｍｍである。チャンネル１１２２、１１２４の直径は、約０．１４１ｍｍである。水チャンネルおよびキャリア流体チャンネル１１２６間の合流点領域の直径は、約０．２８５ｍｍである。しかしながら、ミキサーのための他の適切な寸法も可能である。
【００３１】
図１２を次に参照して、図７に記載されたミキサー回路７０４Ａの別図が示される。ミキサー回路１２００は、短いネック領域によってキャリア流体チャンネル１２２６に接続された３つの水チャンネル１２２１、１２２２および１２２４を備える。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つチャンネルが一緒になりキャリア流体を含んだチャンネルと角度９０度で交差するように方向が向けられる。各チャンネルは、注入口１２１０を有する。ミキサー回路１２０４の下流において、溶液は、検査回路１２０６の一部分に流れ込む。図１２をなおも参照して、ミキサー回路１２００の寸法が次に記載される。注入口１２１０は、チャンネル１２０６、１２２６から約４．４ｍｍに位置する。水チャンネル１２２１、１２２２、１２２４は、注入口から約２．９ｍｍで直角に曲がる。直角な曲がりは、内径Ｒ０．３００および外径Ｒ０．５００をもつ。チャンネル１２０６と平行に面内に配置されたチャンネルの部分１２２１、１２２２、１２２４は、チャンネル１２０６から約１．３００ｍｍにある。水チャンネル１２２１、１２２２、１２２４は、ネック領域の上流で互いに接続する前に４５度曲がる。チャンネル１２０６の内径は、約０．２００ｍｍ（２００μｍ）である。チャンネル１２０６の平行部分は、約１．２ｍｍ間隔である。しかしながら、他の適切な寸法も可能である。
【００３２】
図１３は、図８および９に示されたミキサー回路８０４および９０４に対応するミキサーの別の実施形態の代表的な例を示す。ミキサー回路１３００は、水チャンネル１３２１、１３２２、および１３２４を備える。水チャンネルは、キャリア流体チャンネル１３０６および検査回路１３２６から短いネック領域によって分離される。該ネック領域の直径は、約０．２００ｍｍである。しかしながら、他の適切な寸法も可能である。該チャンネルは、水溶液を含んだ３つチャンネルが一緒になりキャリア流体を含んだチャンネルと角度９０度で交差するように方向が向けられる。ミキサー回路の下流において、溶液は検査回路１３２６に流れ込む。
【００３３】
図１４は、図９に示された実施形態と同様の結晶カードの断面の代表的な例を示す。結晶カード１４００は、３つの層１４２０、１４３０および１４４０から成っている。層１４３０は、図７〜９に示されるようなポートを備える。層１４３０は、厚さが約０．４ｍｍである。層１４４０は、マイクロ流体チャンネル回路を備え、端部での厚さが約１．５ｍｍである。層１４２０は、結晶カード１４００の底面に貼り付けられた剥離可能な層を備え、厚さが約０．１４ｍｍである。
【００３４】
図１５Ａ〜１５Ｖは、ナノ体積マイクロキャピラリー結晶化システムを用いて分子を結晶化させるための方法５０００を示す。スタート・ブロックから、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＡ」）および出口ターミナル（「ターミナルＢ」）間で定義された方法ステップの一組５００２へ進む。方法ステップの一組５００２は、結晶カードの準備、および結晶カードのポンプへの接続について記載する。
【００３５】
ターミナルＡ（図１５Ｂ）から、方法５０００は、結晶カードが射出成形によってポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはプラスチックのような適切な材料から製造される、方法ステップの一組５００８へ進む。本方法は、次に起動ポイントへ戻る。方法５０００は、次に継続ターミナル（「ターミナルＡ２」）によって定義された方法ステップの一組５０１０へ進む。方法ステップの一組５０１０は、表面エネルギーを低減するために、結晶カードのマイクロキャピラリー表面を処理する。
【００３６】
ターミナルＡ２（図１５Ｃ）から、方法５０００は、結晶カードがプラスチックから製造されたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０１４へ進む。もしテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ４」）へ進む。もし決定ブロック５０１４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、プラスチックがポリカーボネートであるかどうか判断するために他のテストを行う別の決定ブロック５０１６へ進む。もし決定ブロック５０１６におけるテストへの答えがＮＯであれば、方法５０００は、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ５」）へ進む。もし決定ブロック５０１６のテストへの答えがＹＥＳであれば、方法５０００は、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ６」）へ進む。
【００３７】
ターミナルＡ４（図１５Ｄ）から、方法５０００は、結晶カードがＰＤＭＳから製造されたとして本方法がこれを処理するブロック５０１８へ進む。本方法は、マイクロキャピラリー表面が全フッ素置換シラン溶液により室温で２時間処理されるブロック５０２０へ進む。本方法は、次に全フッ素置換シラン溶液が真空により除去されるブロック５０２２へ進む。ブロック５０２４において、結晶カードのマイクロキャピラリー表面は、５〜１０ｐｓｉの圧力下にある空気のような気体を用いて１時間乾燥される。本方法は、次にターミナルＡ２のステップが起動したポイントに戻り、別の継続ターミナル（「ターミナルＡ３」）へ進む。ブロック５０１２を参照。
【００３８】
ターミナルＡ５から（図１５Ｅ）、方法５０００は、結晶カードが環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）を備えるプラスチックまたは同等のプラスチックで作られたとして本方法がこれを処理するブロック５０２６へ進む。ブロック５０２８では、該プラスチックの表面エネルギー（疎水性）を低減するために、マイクロキャピラリー表面が室温において２時間試薬で処理される。表面エネルギーを低減するのに適した試薬は、フッ素化共重合体溶液を含むが他の試薬も可能である。適切なフッ素化共重合体溶液は、Ｃｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡ（Ｃｙｔｏｎｉｘ社，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような、フルオロ溶媒中の２％フッ素化共重合体溶液を含む。Ｃｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡは、ポリカーボネートへの付着用に製造されたもので、表面エネルギーを６〜１０ダイン／ｃｍに低減する。フッ素化共重合体溶液を結晶カードにつけるために、排出口からＣｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡ溶液が満たされる。ブロック５０３０では、フッ素化共重合体溶液が真空によって除去される。ブロック５０３２では、マイクロキャピラリー表面が、５〜１０ｐｓｉの圧力下にある空気のような気体を用いて１時間乾燥される。方法５０００は、次に結晶カードが１時間、６０℃に加熱されるブロック５０３４へ進む。本方法は、次にターミナルＡ２のステップの起動ポイントに戻る。ターミナルＡ３におけるブロック５０１２を参照。
【００３９】
ターミナルＡ６（図１５Ｆ）から、方法５０００は、結晶カードが氷上で予冷されるブロック５０３６へ進む。ブロック５０３８において、マイクロキャピラリー表面は、Ｃｙｔｏｎｉｘ ＰＦＣ ５０２ＡＦＡのようなフッ素化共重合体溶液を用いて氷上で２時間処理される。ポリカーボネート結晶カードの注入口は、より高い温度で５０２ＡＦＡ溶液を用いてインキュベーションされた場合に割れやすい可能性がある。本方法は、次にターミナルＡ５へ進み、ブロック５０３０へ飛んでブロック５０３０、５０３２、および５０３４でのステップを行う。本方法は、次にターミナルＡ２のステップが起動したポイントへ戻る。ブロック５０１２におけるターミナルＡ３を参照。ブロック５０１２における方法ステップの一組は、結晶カードをポンプに連結する。
【００４０】
ターミナルＡ３（図１５Ｇ）から、方法５０００は、シリンジ１に緩衝剤または水溶液が満たされるブロック５０４０へ進む。ブロック５０４２では、シリンジ２に沈殿剤溶液が満たされる。ブロック５０４４では、シリンジ３にキャリア流体が満たされる。適切なキャリア流体の代表的な例は、フッ素化炭素溶液を含む。フッ化炭素流体の適切な例は、ＦＣ−４０を含む。ＦＣ−４０は、膜タンパク質の可溶化に用いられる洗剤に対して高い表面張力をもつ。表面張力は、ナノプラグ形成および結晶化を可能にする。代表的な実施形態において、キャリア流体は、水性流体に対して非混和性のフッ素系オイルである。水性ナノプラグが形成されるときに、該キャリア流体はそれらを取り囲んで分離し、本方法の間に結晶カード中を前進させる。ブロック５０４６では、注目されるタンパク質を然るべき緩衝剤中に含んだタンパク質溶液がシリンジ４に満たされる。ブロック５０４８では、テフロン（登録商標）配管のような適切な配管が各シリンジのニードルに取り付けられる。ブロック５０５０では、シリンジ１および２がポンプ１に取り付けられ、シリンジ３および４がポンプ２に取り付けられる。ブロック５０５２では、該配管が、マクロ・マイクロ接合部分を経て結晶カードに接続される。マクロ・マイクロ接合部分に適した接続は、上述の通りである。本方法は、次に出口ターミナルＢへ進む。
【００４１】
ターミナルＢから、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ」）および出口ターミナル（「ターミナルＤ」）間で定義された方法ステップの一組５００４へ進む。方法ステップの一組５００４は、結晶を得るために結晶カード中の流体の流れを調節するインストラクションを受ける。ターミナルＣ（図１５Ｈ）から、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ１」）で定義された方法ステップの一組５０５４へ進む。方法ステップ５０５４の一組はポンプを構成する。
【００４２】
ターミナルＣ１（図１５Ｉ）から、方法５０００は、本システムが制御するシリンジポンプ・モデルのタイプに関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０６０へ進む。適切なポンプは、より良好な精度を提供するために製造者によって改良されたＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｔｗｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ Ｍｏｄｅｌ ３３（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む。図２に示されるように、各シリンジポンプは２つのシリンジを制御する。ブロック５０６２において、本方法は、ポンプシステムの制御に用いるコンピュータのシリアル通信ポートに関するインストラクションを受ける。該通信ポートは、各シリンジポンプが同時にインストラクションを受けるように構成される。その結果として時間遅延が防がれ、溶液が同時に結晶カード中を流れることが可能になる。本方法は、ポンプに接続される各シリンジの容積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０６４へ進む。ブロック５０６６において、本方法は、ポンプに接続される各シリンジの直径を決定する。本方法は、次に進んでターミナルＣ１のステップが起動したポイントに戻る。
【００４３】
ブロック５０５４から、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ２」）で定義された方法ステップの一組５０５６へ進む。該方法ステップの一組は、流体を結晶カードのミキサー回路にプライミングする。ターミナルＣ２（図１５Ｊ）から、方法５０００は、結晶カードのミキサー中に流体を分注するためにどのシリンジを用いるかに関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０６８へ進む。ブロック５０７０において、本方法は、各シリンジからの流量に関するインストラクションを受ける。ブロック５０７２において、本方法は、シリンジが分注する流体の体積に関するインストラクションを受ける。ブロック５０７４において、本方法は、ミキサー回路上流の流体チャンネルから流体を分注するか、または吸引する。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ４」）へ続く。
【００４４】
ターミナルＣ４（図１５Ｋ）から、方法５０００は、シリンジが水性流体を分注しているかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０７６へ進む。もし決定ブロック５０７６におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ５」）へ進む。もし決定ブロック５０７６におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、ブロック５０７８へ進む。本方法は、水性流体が検査回路に入る前にミキサー回路で該流体を停止させるインストラクションを受ける。本方法は、次にターミナルＣ２へと続き、上記に示されたプロセス・ステップを次のシリンジに対して繰返す。ターミナルＣ５（図１５Ｋ）から、方法５０００は、ミキサー回路の下流かつ検査回路のわずかに内部でキャリア流体を停止させるインストラクションを本方法が受けるブロック５０８０へ進む。本方法は、次に進んでターミナルＣ２のステップが起動したポイントへ戻る。
【００４５】
本題からそれるが、水溶液およびキャリア流体を結晶カードのミキサーにプライミングするための例示的プロセスが詳細に記載される。初めに、プライミング中の観察のために、空の結晶カードのミキサー回路が顕微鏡ステージ上に置かれる。本方法は、シリンジ１から溶液、例えば緩衝液をミキサーに分注するインストラクションを受ける。流体チャンネルの合流点のすぐ上流のミキサー領域に溶液が到達したことをユーザが観察するまで、緩衝液が、シリンジ１に接続された流体チャンネルに分注される。本方法は、次に溶液の分注を停止するインストラクションを受ける。試薬を吸引するインストラクションを本方法に与えることによって溶液をチャンネルから除去することもできる。水溶液は、結晶カードの検査回路に入るのを控えることが適切である。水溶液を分注するシリンジ；例えば、シリンジ４（タンパク質溶液）およびシリンジ２（沈殿剤溶液）に接続された３つの流体チャンネルのそれぞれに対して本方法が繰返される。次にキャリア流体が、シリンジ３に接続された第４の流体チャンネルに分注される。キャリア流体は、ミキサーの合流点を通過して結晶カードの検査回路（第５のチャンネル）にわずかに入るまで第４の流体チャンネルに分注される。本方法は、次にキャリア流体の分注を停止するインストラクションを受ける。
【００４６】
ブロック５０５６から戻って、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＣ３」）で定義された方法ステップの一組５０５８へ進む。本方法ステップの一組は、結晶カードの検査回路で水性ナノプラグを生成するインストラクションを受ける。ターミナルＣ３（図１５Ｌ）から、方法５０００は、どのナノプラグ形成プロトコールを行うかに関するインストラクションをブロック５０８２で受ける。本方法は、受けたインストラクションが一定モードを実行するためだったかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０８４へ次に進む。もしブロック５０８４におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ６）へ進む。もし決定ブロック５０８４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、各シリンジに対する流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０８６へ進む。本方法は、次にミキサー回路を通過する流体の全体積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０８８へ進む。ブロック５０９０において、本方法は、各ナノプラグが然るべくサイズが等しく、同様のタンパク質および沈殿剤濃度をもつ水性ナノプラグを結晶カードの検査回路内に生成する。本方法は、次に進んで起動ポイントへ戻る。ブロック５０５８から、本方法は出口ターミナルＤへ進む。
【００４７】
ターミナルＣ６（図１５Ｍ）から、方法５０００は、勾配モードを行うインストラクションを本方法が受けたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック５０９２へ進む。もしブロック５０９２におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ７」）へ進む。もし決定ブロック５０９２におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、可変流シリンジに対する最大流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０９４へ進む。一実施形態において、可変流量シリンジは、緩衝液および沈殿剤を含む。別の実施形態において、シリンジ１および２は、可変流量シリンジである。しかしながら、本方法は、任意のシリンジを可変流量シリンジに指定することができる。一実施形態において、可変流量シリンジを合わせた流量は、最大流量に等しい。例えば、一実施形態において、本方法は、シリンジ１の流量が２μｌ／分に等しいインストラクションを提供し、その一方でシリンジ２の流量が０（ゼロ）μｌ／分に等しいインストラクションを提供する。この実施形態において、最大流量は２μｌ／分（２＋０μｌ／分）に等しい。本方法は、次にキャリア流体を制御するシリンジに対する一定流量に関するインストラクションを本法が受けるブロック５０９６へ進む。一実施形態において、シリンジ３がキャリア流体を制御する。一実施形態において、キャリア流体の流量は、水溶液（緩衝剤、沈殿剤およびタンパク質溶液）の総流量に等しい。別の実施形態において、キャリア流体に対する流量は、水性流体の総流量より小さいか、または大きいように選択することができる。キャリア流体速度が小さいほど、ナノプラグ間のキャリア流体を備える部分は小さく、より大きい水性ナノプラグが生成される。キャリア流体速度が大きいほど、ナノプラグ間のキャリア流体部分は大きく、より小さい水性ナノプラグが生成される。本方法は、次にタンパク質溶液を制御するシリンジに対する一定流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック５０９８へ進む。一実施形態において、シリンジ４がキャリア流体を制御する。一実施形態において、タンパク質の流量は、他の水溶液（緩衝剤および沈殿剤）の流量の合計に等しい。タンパク質溶液の流量を変化させると、各ナノプラグにおけるタンパク質対結晶化条件の比率は変化する。本方法は、次に本方法の１回の繰返しまたはサイクルの間に分注する水の全体積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０００へ進む。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ８」）へ進む。
【００４８】
ターミナルＣ８（図１５Ｎ）から、方法５０００は、検査回路に分注する各水性ナノプラグの体積に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６００２へ進む。ブロック６００４において、本方法は、行う繰返しまたはサイクルの総数（すなわち、勾配スクリーニング・ステップが繰返される回数）に関するインストラクションを受ける。一実施形態において、もし本方法がゼロ回の繰返しを実行するインストラクションを受ければ、ブロック６０００で選択した水の全体積が分注されたときにポンプが停止する。別の実施形態において、もし本方法が１回またはそれ以上の繰返しを実行するインストラクションを受ければ、上述のプロセス・ステップが所望の回数繰返されたときにポンプが停止する。ブロック６００６において、本方法は、緩衝剤および沈殿剤溶液の流量の合計がブロック５０９４で選択した最大流量に等しいように、緩衝剤および沈殿剤溶液の流量を互いに変化させる。例えば、一実施形態において、本方法は、ブロック５０９４で最大流量が２μｌ／分に等しいようにシリンジ１の流量が２μｌ／分に等しいインストラクションを提供し、かつシリンジ２の流量が０μｌ／分に等しいインストラクションを提供する。本方法がスタートしたときに、シリンジ１からの流量は、２μｌ／分で始まって０μｌ／分にランプダウンし、一方でシリンジ２からの流量は、同時に０μｌ／分から２μｌ／分にランプアップする。ブロック６００８において、本方法は、各液滴のサイズは等しいが各液滴におけるタンパク質および沈殿剤濃度が異なる、一連の水性ナノプラグを検査回路内に生成する。ブロック６０１０において、本方法は、所望数の繰返しまたはサイクルを行った後に終了する。本方法は、次に出口ターミナルＤへ本方法が進むブロック５０５８へ戻る。
【００４９】
ターミナルＣ７（図１５Ｏ）から、方法５０００は、ハイブリッドモードを行うインストラクションを本方法が受けたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック６０１２へ進む。もしブロック６０１２におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ９」）へ進む。もしブロック６０１２におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、沈殿剤カートリッジが準備されたかどうか判断するためにテストを行う別の決定ブロック６０１４へ進む。もし決定ブロック６０１４におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１０」）へ進む。もしブロック６０１４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、また別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１１」）へ進む。
【００５０】
ターミナルＣ９（図１５Ｐ）から、方法５０００は、脈動モードを行うインストラクションを本方法が受けたかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック６０１６へ進む。もし決定ブロック６０１６におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、上記に示されたステップが繰返されるターミナルＣ３へ戻る。もし決定ブロック６０１６におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、拍動モードを行うことに関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０１８へ進む。本方法は、次にブロック５０５８へ戻る。ブロック５０５８から、本方法はターミナルＤへ出る。
【００５１】
ターミナルＣ１０（図１５Ｑ）から、方法５０００は、キャリア流体を含んだテフロン（登録商標）配管のような配管にシリンジを接続するブロック６０２０へ進む。本方法は、次に該シリンジをシリンジポンプに接続するブロック６０２２へ進む。ブロック６０２４において、本方法は、規定体積、例えば、約４０ｎＬを入れるインストラクションを受け、約４０ｎＬの気泡を該配管に吸引する。ブロック６０２６において、本方法は、規定体積、例えば、約１２０ｎＬの沈殿剤溶液を該配管に吸引する。ブロック６０２８において、本方法は、適切な数の沈殿剤が該配管中に負荷されるまで上記の２ステップを繰返す。例えば、適切な数の沈殿剤は、１〜２４またはそれ以上に及ぶことができる。ブロック６０３０において、本方法は、キャリア流体、約１μｌ、を該配管の開口先端中に吸引する。ブロック６０３２では、該配管を結晶カードの沈殿剤注入口に接続する。本方法は、次に継続ターミナルＣ１１へ進む。
【００５２】
ターミナルＣ１１（図１５Ｒ）において、方法５０００は、緩衝剤溶液（シリンジ１）の初めの流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０３４へ進む。ブロック６０３６において、本方法は、緩衝剤溶液の流量変化（ステップサイズ）に関するインストラクションを受ける。ステップサイズは、本方法の各ランプアップまたはランプダウンに適用される流量変化である。ブロック６０３８において、本方法は、沈殿剤カートリッジ（シリンジ２）の初めの流量に関するインストラクションを受ける。ブロック６０４０において、本方法は、沈殿剤溶液の流量変化（ステップサイズ）を計算する。一実施形態において、緩衝剤に対するステップサイズは、沈殿剤に対するステップサイズに等しい。ブロック６０４２において、本方法は、総流量を決定するために緩衝剤および沈殿剤の流量を合計する。ブロック６０４４において、本方法は、キャリア流体（シリンジ３）に対する初めの流量に関するインストラクションを受ける。ブロック６０４６において、本方法は、キャリア流体の流量変化（ステップサイズ）に関するインストラクションを受ける。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１２」）へ進む。
【００５３】
ターミナルＣ１２（図１５Ｓ）から、方法５０００は、タンパク質溶液（シリンジ４）の一定流量に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０４８へ進む。本方法は、次に各沈殿剤に対するランプアップ・ステップ数（流れの変化速度）に関するインストラクションを本方法が受けるブロック６０５０へ進む。ブロック６０５２において、本方法は、本方法の各繰返しまたはサイクルに対して、ランプダウン・ステップ数がランプアップ・ステップ数に等しいように設定する。ブロック６０５４において、本方法は、行う繰返しまたはサイクル数に関するインストラクションを受ける。一実施形態において、１回の繰返しまたはサイクルは、沈殿剤カートリッジに負荷された単一の沈殿剤に対応する。ブロック６０５６において、本方法は、各ランプ・ステップの継続時間に関するインストラクションを受ける。例えば、一実施形態において、各ランプ・ステップの持続時間は１．５秒である。ブロック６０５８において、本方法は、合計が初めの流量に等しいように、緩衝剤および沈殿の流量を互いに変化させる。本方法は、次に別の継続ターミナル（「ターミナルＣ１３」）へ進む。
【００５４】
ターミナルＣ１３（図１５Ｔ）から、方法５０００は、キャリア流体の流量を本方法が変化させるブロック６０６０へ進む。本方法は、次に各液滴が等量のタンパク質および様々な量の沈殿剤および緩衝液をもつ検査回路中で本方法が一連のナノプラグを生成するブロック６０６２へ進む。一実施形態において、本方法は、各サイクルに対して様々な量の沈殿剤を一定量のタンパク質とともに提供する。表１は、ハイブリッドモードに関する上述の方法の一実施形態を示す。本方法は、次にターミナルＤへ進む。
【００５５】
【表１】
ブロック５００４におけるターミナルＤから、方法５０００は、継続ターミナル（「ターミナルＥ」）および出口ターミナル（「ターミナルＦ」）間で定義された方法ステップの一組５００６へ進む。方法ステップの一組５００６は、結晶カードから得られた結晶に関する回折実験を行う。ターミナルＥ（図１５Ｕ）から、方法５０００は、回折の前に結晶カードの検査回路から結晶を採取したかどうか判断するためにテストを行う決定ブロック６０６４へ進む。もしブロック６０６４におけるテストへの答えがＮＯであれば、本方法は、別の継続ターミナル（「ターミナルＥ１」）へ進む。もしブロック６０６４におけるテストへの答えがＹＥＳであれば、本方法は、剥離可能な層を結晶カードの底面から除去するブロック６０６６へ進む。一実施形態において、剥離可能な層は、マイクロ流体チャンネルを含んだ結晶カードのプラスチック部分に接合されている。該接合は、マイクロ流体回路から流体が漏れ出すのを防ぐには十分強いが、手作業で剥がれるように十分弱く設計される。一実施形態において、該接合は熱接合である。別の実施形態において、該接合は化学結合である。剥離可能な層の除去は、結晶カードのマイクロ流体チャンネル内部を暴露し、水性ナノプラグにアクセスすることを可能にする。別の実施形態では、剥離可能な層が除去された後に、結晶を含んだ水性ナノプラグは結晶カードのマイクロ流体チャンネル中に保持される。ブロック６０６８では、検査回路中に形成された結晶がクライオループを用いて結晶カードから採取される。一実施形態において、クライオループは、ナイロンのクライオループである。ブロック６０７０では、結晶が凍結され、回折データが得られる。本方法は、次に本方法が実行を終了する出口ターミナルＦへ進む。
【００５６】
ターミナルＥ１（図１５Ｖ）から、方法５０００は、結晶を含んだ結晶カードをＸ線源のゴニオメータに搭載するブロック６０７２へ進む。ブロック６０７４において、本方法は、検査回路内の元の位置にある結晶から回折データを得る。本方法は、次にブロック５００６、さらに終了ターミナルＦへ進む。本方法は、次に実行を終了する。
【００５７】
メチオニン−Ｒ−スルホキシド還元酵素の結晶を生成するために、本主題における様々な実施形態の勾配スクリーニングと組み合わせて、上述の結晶採収ステップを用いることができる。結晶カードからクライオループで結晶が取り出され、その後回折実験のために凍結された。例として、１．７Åデータセットが、アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅにあるＳＢＣ−ＣＡＴビームライン１９ＢＭで収集され、続いて構造が解明されて精緻化された。最終的な座標と構造因子とがＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託された（受入番号３ＣＸＫ）。
【００５８】
本主題の様々な実施形態の結晶カードは、その場回折にも適する。その場回折は、凍結保護プロセスによって結晶が変化する前に、結晶学者がその品質を評価することを可能にする。強固な結晶では、完全な回折データを得ることが可能である。本結晶カードは、室温での回折データ収集用にＸ線源のゴニオメータに搭載するのに十分なＸ線透過性をもつ。例えば、結晶カードによるＸ線吸込を分析するために簡単なテストが行われた。ＡＰＳリング電流で規格化したイオンチャンバーのビーム電流（Ｉ／Ｉ０）が、０．９７９２６１Ａ（１２．６６０９９ｋｅＶ）の波長に対して結晶カードの挿入あり、およびなしで測定された。結晶カードなしのＩ／Ｉ０は１．９１６７１Ｅ−６と測定され、結晶カードありのＩ／Ｉ０は１．５５１１Ｅ−６と測定された。この結果、結晶カードによるＸ線吸光度は１９％ということになる。さらにまた、本結晶カードは、ＸおよびＹ軸に沿って平行移動でき、複数の結晶からデータを収集して完全なデータセットに一体化することができる。この技術を実証するために、リゾチーム結晶を含んだ結晶カードが、アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅにあるＮＥ−ＣＡＴビームライン２４ＩＤ−Ｃのゴニオメータ・ヘッドに搭載された。データは、結晶カード中の３つの結晶から室温で収集された。結晶学的データは、付録Ａに提示される。
【００５９】
構造決定に関して、データセットは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ：メチオニン−Ｒ−スルホキシド還元酵素はビームライン１９ＢＭ、１００Ｋ；およびリゾチームはビームライン２４−ＩＤＣ、室温で収集された。データは、ＨＫＬ２０００を用いて積分およびスケーリングされた。リゾチーム構造に対してｍｏｓｆｌｍパッケージを用い、３つのデータセットのそれぞれに対して別々に強度が積分された。Ｍｏｌｒｅｐ、ならびに探索モデルとしてそれぞれＰＤＢエントリーの１ＩＥＥおよび３ＣＥＺを用い、分子置換によってリゾソームおよびメチオニン−Ｒ−スルホキシド還元酵素の構造が解明された。構造は、Ｒｅｆｍａｃ５を用いて精緻化され、Ｃｏｏｔを用いてモデル構築が行われた。
【００６０】
説明に役立つ実施形態が図示ならびに記載されたが、当然のことながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々にそれらを変更することができる。
【００６１】
付録Ａ
【００６２】
【表２】
独占的な所有権または特権が請求される本発明の実施形態が、以下のように明示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポンピングシステム；
前記ポンピングシステムを制御するためにタンパク質結晶化システム上で実行するように構成された複数個のソフトウェア；ならびに
前記ポンピングシステムに連結された１つまたはそれ以上の結晶カードであって、それぞれがミキサーと貯蔵およびタンパク質結晶化検査を容易にするために前記ミキサーに連結されたマイクロ流体キャピラリーとを収容するように構成された結晶カード
を備える、前記タンパク質結晶化システム。
【請求項２】
前記ポンピングシステムは、シリンジポンピングシステムまたは圧力ポンピングシステムを含み、前記シリンジポンピングシステムは、第２、第３、および第４のマイクロ流体チャンネルを通って前記１つまたはそれ以上の結晶カード中に運ばれる水溶液と、第５のマイクロ流体チャンネル中に運ばれるフルオラス溶液とを調節するための４チャンネル・シリンジポンプを含む、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項３】
前記複数個のソフトウェアは、水溶液の流れの粒子勾配を発生させるために、前記４チャンネル・シリンジポンプの各ポンプの制御、ならびに第２、第３、第４、および第５のマイクロ流体チャンネルの各チャンネルの制御を容易にする、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項４】
前記１つまたはそれ以上の結晶カードは、Ｘ線透過性、光学的透明性、モーダブル、耐薬品性、適切な表面エネルギー、および以上に列挙された特性の２つまたはそれ以上の組み合わせからなる群から選択された特性を有する材料から形成される、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項５】
前記ミキサーは、水性プラグが形成される第２、第３、第４、および第５のマイクロ流体チャンネルの合流点を含み、前記第２、第３、第４、および第５のマイクロ流体チャンネルは、およそ２００×２００マイクロメートルであるマイクロ流体チャンネルから形成される、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項６】
前記合流点は、およそ１０ナノリットルから２０ナノリットルの範囲にある水性プラグの形成を支援する疎水性表面を規定し、前記マイクロ流体キャピラリーは、前記水性プラグを前記合流点から移送する、請求項５に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項７】
前記１つまたはそれ以上の結晶カードは、精細な勾配スクリーニング用に構成されたプラスチックから形成され、或いはハイブリッド・スクリーニングおよび膜タンパク質用に構成されたＰＤＭＳ／テフロン（登録商標）から形成される、請求項２のタンパク質結晶化システム。
【請求項８】
前記タンパク質結晶化システムは、前記ポンピングシステムに連結されたニードルをもつシリンジをさらに備え、前記シリンジの前記ニードルと前記１つまたはそれ以上の結晶カードとの間のマクロ・マイクロ接合部分として機能を果たすように構成された遠位端および近位端を有する配管をなおさらに備え、各配管は、約３６０マイクロメートルの内径および約７６０マイクロメートルの外径をもち、配管の前記遠位端は、ニードル上へスライドするように構成され、前記配管の前記近位端は、前記１つまたはそれ以上の結晶カードに連結するように構成された、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項９】
複数個のソフトウェアで働くポンピングシステムを用いて各水流を独立に制御することによって水流を調節すること；および
タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すためにタンパク質の結晶化相空間をマッピングすること
を備える、勾配スクリーニングのための方法。
【請求項１０】
前記調節する行為は、各水流の流量を変化させることにより、一連の水性プラグにわたって濃度勾配を形成することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記調節する行為は、タンパク質、結晶化剤、フッ化炭素、沈殿剤、リガンド、タンパク質パートナー、ＤＮＡ複合体、緩衝剤および凍結保護物質から選択された水流を調節することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記調節する行為は、沈殿剤の水流の流量が減少したときに、流量の合計が一定のままであるように緩衝剤の水流の流量を増加させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
沈殿剤プラグを予め形成すること；
それぞれが２つの沈殿剤プラグを互いに分離するプラグ・スペーサーを予め形成すること；
沈殿剤プラグ、プラグ・スペーサー、およびタンパク質の流れを合流させることによって勾配を形成すること；ならびに
タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すためにタンパク質の結晶化相空間をマッピングすること
を備える、ハイブリッド・スクリーニングのための方法。
【請求項１４】
プラグ・スペーサーを予め形成することは、気泡を用いて予め形成することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
勾配を形成することは、前記沈殿剤プラグ、プラグ・スペーサーから形成された流れと緩衝剤の流れとの間で流量変化を連係させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
各沈殿剤プラグは、約１００ナノリットルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
キャピラリーをもつ結晶カードを受け取ること；
表面エネルギーを低減するためにキャピラリーに試薬をコーティングすること；および
前記試薬を除去すること
を備える方法。
【請求項１８】
前記結晶カードを氷上で所定の時間数インキュベーションすることをさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記キャピラリーは内面を含み、キャピラリーにコーティングする行為は、表面エネルギーをセンチメートル当たり約６〜１０ダインに低減するために前記キャピラリーの前記内面にコーティングすることを含む、請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記フッ素化共重合体溶液は、フルオロ溶媒中に２パーセントのフッ素化共重合体溶液を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記フルオロ溶媒を除去することは、前記結晶カードを真空処理することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
５ｐｓｉで約１時間実行される、前記結晶カードを通して強制的に清浄な乾燥空気を送る行為をさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
摂氏約６０度で約１時間実行される、前記結晶カードをベーキングする行為をさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
結晶カードの基板に接合された薄層を剥離させること；
前記基板上に収容されたマイクロ流体回路からクライオループにより結晶を採取すること；
前記結晶を凍結させること；および
回折データを得るために前記結晶に関する回折実験を行うこと
をさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
マイクロ流体回路をもつ結晶カードをゴニオメータに搭載すること；
前記結晶カードにＸ線を照射すること；および
回折データを収集すること
をさらに備える、請求項１７の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流体回路によって貯蔵された複数の結晶から前記回折データを収集するために、ｘおよびｙ軸に沿って前記結晶カードを平行移動させることをさらに備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ミキサー回路および検査回路を収容するように構成された基板；ならびに
前記基板に接合され、前記基板から剥離されるように構成された層
を備える、結晶カード。
【請求項２８】
前記層は、前記基板に熱的に接合されるか、または前記基板に化学的に結合される、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項２９】
前記基板および前記層は、非晶質ポリマー、環状オレフィン共重合体、熱可塑性ポリマー、およびポリカーボネートからなる群から形成される、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項３０】
前記基板は、約１ミリメートルの厚さを含み、前記層は、約１００から１５０マイクロメートルの範囲の厚さを含む、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項３１】
前記ミキサー回路は、第１、第２、第３、および第４の加数チャンネルを含み、各加数チャンネルは、遠位端および近位端を含み、各加数チャンネルの前記遠位端は、溶液を流体的に受け取るように構成された開口部を規定し、各加数チャンネルの前記近位端は、水性プラグまたはプラグ・スペーサーを流体的に連通するように構成された開口部を規定し、各加数チャンネルは、前記遠位端に連結された第１の部分、および前記近位端に連結された前記第１、第２、および第３の加数チャンネルの第２の部分を有し、各加数チャンネルの前記第１の部分は、別の加数チャンネルと間隔をあけて平行方向に配置され、前記第１および第３の加数チャンネルの前記第２の部分は、それらの近位端が交差するように角度をなし、前記第２および第４の加数チャンネルの前記第２の部分は、前記第２の加数チャンネルの前記近位端が、前記第１および第３の加数チャンネルの前記近位端と交差して頂点を形成するまで並列に延び、前記第４の加数チャンネルの第３の部分は、前記第４の加数チャンネルの前記第２の部分から角度９０度で延び、その近位端は、また別の角度９０度で前記頂点と交差する、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項３２】
各加数チャンネルの前記第１の部分は、別の加数チャンネルの前記第１の部分から約４．５０ミリメートルの間隔をあけて配置される、請求項３１に記載の結晶カード。
【請求項３３】
前記基板は、第１の側面、第２の側面、第３の側面、および第４の側面を含み、前記基板の前記第２の側面は、前記第３の加数チャンネルの前記遠位端から約３．７０ミリメートルの間隔をあけて配置され、前記第１および第３の側面の長さは、およそ２５．４０ミリメートルであり、前記第２および第４の側面の長さは、約７６．２０ミリメートルであり、前記基板の前記第１の側面は、前記加数チャンネルの前記遠位端から約６．００ミリメートルの間隔をあけて配置される、請求項３１に記載の結晶カード。
【請求項３４】
前記基板の前記第２の側面は、前記第３の加数チャンネルの前記遠位端から約３．７０ミリメートルの間隔をあけて配置され、前記基板の前記第１の側面は、前記加数チャンネルの前記遠位端から約６．００ミリメートルの間隔をあけて配置され、前記基板の前記第３の側面は、前記検査回路からおよそ６．００ミリメートルの間隔をあけて配置される、請求項３３に記載の結晶カード。
【請求項３５】
前記検査回路は、加算チャンネル、蛇行部、および流体的に連通するように構成された開口部で終端する尾部チャンネルを含み、前記加算チャンネルは、前記頂点に連結され、かつ前記加数チャンネルが前記第３の加数チャンネルの前記第１の部分と同一直線上にある軸に到達するまで、前記第４の加数チャンネルの前記近位端と同一直線上にある方向に延び、前記加算チャンネルは、そこで９０度曲がって前記検査回路の前記蛇行部に繋がる、請求項３１に記載の結晶カード。
【請求項３６】
前記検査回路の前記蛇行部は、流体連通を容易にするために蛇行チャンネルによって互いに連結された複数の凸な曲がりをもつ複合曲線から形成され、１つの凸な曲がりは、それに続く凸な曲がりと約５３．３１ミリメートルの間隔をあけて配置され、それぞれの凸な曲がりは、約２．００ミリメートルの長さをもつ、請求項３５に記載の結晶カード。
【請求項３７】
前記蛇行部の最後の凸な曲がりは、前記尾部チャンネルに連結される、請求項３６に記載の結晶カード。
【請求項３８】
前記加算チャンネル、前記蛇行部、および前記尾部チャンネルの長さは、合わせて約６７センチメートルであり、前記加算チャンネル、前記蛇行部、および前記尾部チャンネルの断面寸法は、約２００×２００マイクロメートルである、請求項３７に記載の結晶カード。
【請求項３９】
前記基板は、２つのミキサー回路および２つの検査回路を収容するように構成された、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項４０】
前記基板は、上方に突き出た複数の環状ポートを収容し、前記複数の環状ポートのいくつかは、溶液を流体的に受け取るか、または水性プラグまたはプラグ・スペーサーを流体的に連通するように適合される、請求項３９に記載の結晶カード。
【請求項１】
ポンピングシステム；
前記ポンピングシステムを制御するためにタンパク質結晶化システム上で実行するように構成された複数個のソフトウェア；ならびに
前記ポンピングシステムに連結された１つまたはそれ以上の結晶カードであって、それぞれがミキサーと貯蔵およびタンパク質結晶化検査を容易にするために前記ミキサーに連結されたマイクロ流体キャピラリーとを収容するように構成された結晶カード
を備える、前記タンパク質結晶化システム。
【請求項２】
前記ポンピングシステムは、シリンジポンピングシステムまたは圧力ポンピングシステムを含み、前記シリンジポンピングシステムは、第２、第３、および第４のマイクロ流体チャンネルを通って前記１つまたはそれ以上の結晶カード中に運ばれる水溶液と、第５のマイクロ流体チャンネル中に運ばれるフルオラス溶液とを調節するための４チャンネル・シリンジポンプを含む、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項３】
前記複数個のソフトウェアは、水溶液の流れの粒子勾配を発生させるために、前記４チャンネル・シリンジポンプの各ポンプの制御、ならびに第２、第３、第４、および第５のマイクロ流体チャンネルの各チャンネルの制御を容易にする、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項４】
前記１つまたはそれ以上の結晶カードは、Ｘ線透過性、光学的透明性、モーダブル、耐薬品性、適切な表面エネルギー、および以上に列挙された特性の２つまたはそれ以上の組み合わせからなる群から選択された特性を有する材料から形成される、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項５】
前記ミキサーは、水性プラグが形成される第２、第３、第４、および第５のマイクロ流体チャンネルの合流点を含み、前記第２、第３、第４、および第５のマイクロ流体チャンネルは、およそ２００×２００マイクロメートルであるマイクロ流体チャンネルから形成される、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項６】
前記合流点は、およそ１０ナノリットルから２０ナノリットルの範囲にある水性プラグの形成を支援する疎水性表面を規定し、前記マイクロ流体キャピラリーは、前記水性プラグを前記合流点から移送する、請求項５に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項７】
前記１つまたはそれ以上の結晶カードは、精細な勾配スクリーニング用に構成されたプラスチックから形成され、或いはハイブリッド・スクリーニングおよび膜タンパク質用に構成されたＰＤＭＳ／テフロン（登録商標）から形成される、請求項２のタンパク質結晶化システム。
【請求項８】
前記タンパク質結晶化システムは、前記ポンピングシステムに連結されたニードルをもつシリンジをさらに備え、前記シリンジの前記ニードルと前記１つまたはそれ以上の結晶カードとの間のマクロ・マイクロ接合部分として機能を果たすように構成された遠位端および近位端を有する配管をなおさらに備え、各配管は、約３６０マイクロメートルの内径および約７６０マイクロメートルの外径をもち、配管の前記遠位端は、ニードル上へスライドするように構成され、前記配管の前記近位端は、前記１つまたはそれ以上の結晶カードに連結するように構成された、請求項１に記載のタンパク質結晶化システム。
【請求項９】
複数個のソフトウェアで働くポンピングシステムを用いて各水流を独立に制御することによって水流を調節すること；および
タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すためにタンパク質の結晶化相空間をマッピングすること
を備える、勾配スクリーニングのための方法。
【請求項１０】
前記調節する行為は、各水流の流量を変化させることにより、一連の水性プラグにわたって濃度勾配を形成することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記調節する行為は、タンパク質、結晶化剤、フッ化炭素、沈殿剤、リガンド、タンパク質パートナー、ＤＮＡ複合体、緩衝剤および凍結保護物質から選択された水流を調節することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記調節する行為は、沈殿剤の水流の流量が減少したときに、流量の合計が一定のままであるように緩衝剤の水流の流量を増加させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
沈殿剤プラグを予め形成すること；
それぞれが２つの沈殿剤プラグを互いに分離するプラグ・スペーサーを予め形成すること；
沈殿剤プラグ、プラグ・スペーサー、およびタンパク質の流れを合流させることによって勾配を形成すること；ならびに
タンパク質結晶化実験において沈殿から、微結晶へ、単結晶への転移を示すためにタンパク質の結晶化相空間をマッピングすること
を備える、ハイブリッド・スクリーニングのための方法。
【請求項１４】
プラグ・スペーサーを予め形成することは、気泡を用いて予め形成することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
勾配を形成することは、前記沈殿剤プラグ、プラグ・スペーサーから形成された流れと緩衝剤の流れとの間で流量変化を連係させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
各沈殿剤プラグは、約１００ナノリットルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
キャピラリーをもつ結晶カードを受け取ること；
表面エネルギーを低減するためにキャピラリーに試薬をコーティングすること；および
前記試薬を除去すること
を備える方法。
【請求項１８】
前記結晶カードを氷上で所定の時間数インキュベーションすることをさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記キャピラリーは内面を含み、キャピラリーにコーティングする行為は、表面エネルギーをセンチメートル当たり約６〜１０ダインに低減するために前記キャピラリーの前記内面にコーティングすることを含む、請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記フッ素化共重合体溶液は、フルオロ溶媒中に２パーセントのフッ素化共重合体溶液を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記フルオロ溶媒を除去することは、前記結晶カードを真空処理することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
５ｐｓｉで約１時間実行される、前記結晶カードを通して強制的に清浄な乾燥空気を送る行為をさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
摂氏約６０度で約１時間実行される、前記結晶カードをベーキングする行為をさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
結晶カードの基板に接合された薄層を剥離させること；
前記基板上に収容されたマイクロ流体回路からクライオループにより結晶を採取すること；
前記結晶を凍結させること；および
回折データを得るために前記結晶に関する回折実験を行うこと
をさらに備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
マイクロ流体回路をもつ結晶カードをゴニオメータに搭載すること；
前記結晶カードにＸ線を照射すること；および
回折データを収集すること
をさらに備える、請求項１７の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流体回路によって貯蔵された複数の結晶から前記回折データを収集するために、ｘおよびｙ軸に沿って前記結晶カードを平行移動させることをさらに備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ミキサー回路および検査回路を収容するように構成された基板；ならびに
前記基板に接合され、前記基板から剥離されるように構成された層
を備える、結晶カード。
【請求項２８】
前記層は、前記基板に熱的に接合されるか、または前記基板に化学的に結合される、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項２９】
前記基板および前記層は、非晶質ポリマー、環状オレフィン共重合体、熱可塑性ポリマー、およびポリカーボネートからなる群から形成される、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項３０】
前記基板は、約１ミリメートルの厚さを含み、前記層は、約１００から１５０マイクロメートルの範囲の厚さを含む、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項３１】
前記ミキサー回路は、第１、第２、第３、および第４の加数チャンネルを含み、各加数チャンネルは、遠位端および近位端を含み、各加数チャンネルの前記遠位端は、溶液を流体的に受け取るように構成された開口部を規定し、各加数チャンネルの前記近位端は、水性プラグまたはプラグ・スペーサーを流体的に連通するように構成された開口部を規定し、各加数チャンネルは、前記遠位端に連結された第１の部分、および前記近位端に連結された前記第１、第２、および第３の加数チャンネルの第２の部分を有し、各加数チャンネルの前記第１の部分は、別の加数チャンネルと間隔をあけて平行方向に配置され、前記第１および第３の加数チャンネルの前記第２の部分は、それらの近位端が交差するように角度をなし、前記第２および第４の加数チャンネルの前記第２の部分は、前記第２の加数チャンネルの前記近位端が、前記第１および第３の加数チャンネルの前記近位端と交差して頂点を形成するまで並列に延び、前記第４の加数チャンネルの第３の部分は、前記第４の加数チャンネルの前記第２の部分から角度９０度で延び、その近位端は、また別の角度９０度で前記頂点と交差する、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項３２】
各加数チャンネルの前記第１の部分は、別の加数チャンネルの前記第１の部分から約４．５０ミリメートルの間隔をあけて配置される、請求項３１に記載の結晶カード。
【請求項３３】
前記基板は、第１の側面、第２の側面、第３の側面、および第４の側面を含み、前記基板の前記第２の側面は、前記第３の加数チャンネルの前記遠位端から約３．７０ミリメートルの間隔をあけて配置され、前記第１および第３の側面の長さは、およそ２５．４０ミリメートルであり、前記第２および第４の側面の長さは、約７６．２０ミリメートルであり、前記基板の前記第１の側面は、前記加数チャンネルの前記遠位端から約６．００ミリメートルの間隔をあけて配置される、請求項３１に記載の結晶カード。
【請求項３４】
前記基板の前記第２の側面は、前記第３の加数チャンネルの前記遠位端から約３．７０ミリメートルの間隔をあけて配置され、前記基板の前記第１の側面は、前記加数チャンネルの前記遠位端から約６．００ミリメートルの間隔をあけて配置され、前記基板の前記第３の側面は、前記検査回路からおよそ６．００ミリメートルの間隔をあけて配置される、請求項３３に記載の結晶カード。
【請求項３５】
前記検査回路は、加算チャンネル、蛇行部、および流体的に連通するように構成された開口部で終端する尾部チャンネルを含み、前記加算チャンネルは、前記頂点に連結され、かつ前記加数チャンネルが前記第３の加数チャンネルの前記第１の部分と同一直線上にある軸に到達するまで、前記第４の加数チャンネルの前記近位端と同一直線上にある方向に延び、前記加算チャンネルは、そこで９０度曲がって前記検査回路の前記蛇行部に繋がる、請求項３１に記載の結晶カード。
【請求項３６】
前記検査回路の前記蛇行部は、流体連通を容易にするために蛇行チャンネルによって互いに連結された複数の凸な曲がりをもつ複合曲線から形成され、１つの凸な曲がりは、それに続く凸な曲がりと約５３．３１ミリメートルの間隔をあけて配置され、それぞれの凸な曲がりは、約２．００ミリメートルの長さをもつ、請求項３５に記載の結晶カード。
【請求項３７】
前記蛇行部の最後の凸な曲がりは、前記尾部チャンネルに連結される、請求項３６に記載の結晶カード。
【請求項３８】
前記加算チャンネル、前記蛇行部、および前記尾部チャンネルの長さは、合わせて約６７センチメートルであり、前記加算チャンネル、前記蛇行部、および前記尾部チャンネルの断面寸法は、約２００×２００マイクロメートルである、請求項３７に記載の結晶カード。
【請求項３９】
前記基板は、２つのミキサー回路および２つの検査回路を収容するように構成された、請求項２７に記載の結晶カード。
【請求項４０】
前記基板は、上方に突き出た複数の環状ポートを収容し、前記複数の環状ポートのいくつかは、溶液を流体的に受け取るか、または水性プラグまたはプラグ・スペーサーを流体的に連通するように適合される、請求項３９に記載の結晶カード。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１５Ｈ】
【図１５Ｉ】
【図１５Ｊ】
【図１５Ｋ】
【図１５Ｌ】
【図１５Ｍ】
【図１５Ｎ】
【図１５Ｏ】
【図１５Ｐ】
【図１５Ｑ】
【図１５Ｒ】
【図１５Ｓ】
【図１５Ｔ】
【図１５Ｕ】
【図１５Ｖ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１５Ｈ】
【図１５Ｉ】
【図１５Ｊ】
【図１５Ｋ】
【図１５Ｌ】
【図１５Ｍ】
【図１５Ｎ】
【図１５Ｏ】
【図１５Ｐ】
【図１５Ｑ】
【図１５Ｒ】
【図１５Ｓ】
【図１５Ｔ】
【図１５Ｕ】
【図１５Ｖ】
【公表番号】特表２０１１−５２５１６６（Ｐ２０１１−５２５１６６Ａ）
【公表日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３７５３（Ｐ２０１１−５１３７５３）
【出願日】平成２１年６月１５日（２００９．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７４１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２５２０
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０６４２２５９３）エメラルド バイオストラクチャーズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１５日（２００９．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７４１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２５２０
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０６４２２５９３）エメラルド バイオストラクチャーズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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