バイオマーカープロファイルを用いる敗血症またはＳＩＲＳの診断
敗血症の早期予測または診断は、好都合なことに、疾患が初期段階からさらに重症の段階、例えば、高い死亡率と関係がある重症敗血症または敗血症ショックへ急速に進行する前の臨床介入を可能にする。早期予測または診断は、個体のバイオマーカーのプロファイル発現を、敗血症を発生する集団を含む１以上の対照、または参照集団と比較することにより実施する。敗血症の発症を特徴づける個体のバイオマーカープロファイルの特性を認識することにより、臨床医はある単一時点に個体から単離した体液から敗血症発症の診断が可能になる。患者を全期間にわたってモニターする必要が無くなり、好都合なことに、敗血症の重症症候群の発症前に臨床上の介入が可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年11月12日出願の米国仮出願第60/425,322号、および2003年10月17日出願の米国仮出願第60/511,644号の優先権を主張し、これらは両方とも本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、個体における敗血症またはその進行の段階を診断または予測する方法に関する。本発明はまた、全身性炎症反応症候群（SIRS）を診断する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
疾患の症状の早期検出は、典型的に、より効果的な治療処置を可能にし、対応してより好都合な臨床成果をもたらす。しかし、多くの場合、疾患の症状の早期検出には問題が多く；従って、疾患が比較的進んだ後に、診断が可能になる。全身性炎症症状はかかる疾患のクラスの１つである。これらの症状、特に敗血症は、典型的に病原性微生物と宿主の防衛系との間の相互作用から起こり、この相互作用が宿主において過剰のかつ調節不全の炎症反応の誘因となる。全身性炎症反応における宿主の反応は複雑であるため、疾患の病原性を理解するための努力は複雑なものであった（Healy, Annul. Pharmacother. 36:648-54 (2002)の総括を参照）。疾患の病原性の不完全な理解は、次いで、診断バイオマーカーの発見を困難にする。しかし、敗血症は著しく急速に進行して生命を脅かす症状となるので、早期かつ信頼しうる診断が絶対に欠かせない。
【０００４】
敗血症は十分明らかにされた時間経過に従い、全身性炎症反応症候群（SIRS）陰性からSIRS陽性へそして敗血症へ、次いで重症敗血症、敗血症ショック、多臓器不全（MOD）、そして最終的に死へ進行する。敗血症はまた、感染した個体において、個体が続いてSIRSを発生する時にも起こりうる。「SIRS」は通常、次のパラメーターの２つ以上の存在として定義される：38℃を超えるかもしくは36℃未満の体温；毎分90を超える心拍数；毎分20回を超える呼吸数；32mmHg未満のPCO2；および4.0x109細胞/L未満のもしくは12.0x109細胞/Lを超える、または10％を超える未成熟バンド型を有する白血球数。「敗血症」は通常、確認された感染プロセスを伴うSIRSとして定義される。「重症敗血症」は、MOD（多臓器不全）、低血圧、播種性血管内血液凝固（「DIC」）または低灌流異常と関係し、乳酸アシドーシス、乏尿、および精神状態の変化を含む。「敗血症ショック」は通常、敗血症由来の低血圧と定義され、血液蘇生に抵抗してさらなる低灌流異常の存在を伴う。
【０００５】
臨床上、敗血症にとって意味のある病原微生物の存在を特定することは困難であることが示されている。典型的には、患者の血液、痰、尿、創傷分泌物、内置ラインカテーテル表面物などを培養することにより、原因微生物を検出する。しかし、原因微生物はある特定の身体ミクロ環境内においてのみ棲息しうるので、培養した特定の物質が汚染微生物を含有しないかも知れない。検出は、感染部位における微生物数が少ないことによってさらに複雑なものとなる。血液中の病原体数が少ないことは、血液培養により敗血症を診断するのに、ある特定の問題を提示する。ある研究では、例えば、陽性培養物を、敗血症の臨床症状を提示する患者のわずか17％において得ただけであった（Rangel-Fraustoら, JAMA 273:117-23 (1995)）。診断は、非病原性微生物によるサンプルの汚染によってさらに複雑なものとなる。例えば、敗血症に罹った707人の患者の研究において、検出された臨床上意味のある微生物はわずか12.4％であった（Weinsteinら, Clinical Infectious Diseases 24:584-602 (1997)）。
【０００６】
敗血症の初期診断の困難なことは、この疾患に関連する高い罹患率および死亡率に反映している。敗血症は現在米国の死因の第10位に位置し、しかも非冠血管集中治療室（ICU）の入院患者間で特に多く、最も通常の死因になっている。全体の死亡率は35％に達し、米国だけで毎年推定750,000症例が起こっている。米国だけで、敗血症を治療するための年間費用は数10億ドルのオーダーである。
【０００７】
従って、十分早期に敗血症を診断して効果的な介入と予防を可能にする方法に対する必要性が存在する。ほとんどの現存の敗血症スコアリングシステムまたは予測モデルは、既に敗血症とみなされる患者について、死を含む後期段階合併症のリスクを予測するだけである。かかるシステムおよびモデルは、しかし、敗血症それ自体の発生を予測するものでない。特に必要であるのは、SIRSの患者が敗血症を発生し得るかまたはし得ないかを分類する方法である。現在、研究者は、典型的には、正常な（すなわち、非敗血症の）対照グループの患者と対比して、敗血症患者グループにおいて異なるレベルで発現される単一のバイオマーカーを規定しうる。2003年3月26日に出願された米国特許出願第10/400,275号（その全文が本明細書に参照により組み入れられる）は、様々なバイオマーカーの発現レベルの時間依存性変化を分析することにより早期敗血症を指摘する方法を開示している。従って、現在、早期敗血症を診断する最適の方法は、ある期間にわたって複数のバイオマーカーを測定するステップおよびこれらのバイオマーカーの発現をモニターするステップの両方を必要とする。
【０００８】
当技術分野において引き続き緊急に必要なことは、特異性と感度をもって、長期にわたり患者をモニターする必要なしに、敗血症を診断することである。理想的には、正確、迅速、かつ同時に、複数のバイオマーカーを単一時点で測定する技術によって診断を行い、それにより診断に必要な期間の疾患の進行を最小限にとどめることである。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、ある単一時点における生物学的サンプルから得た１以上のバイオマーカーの測定を介して、敗血症の正確、迅速、かつ高感度の予測と診断を可能にする。これは、個体、特に敗血症を発生するリスクがあるか、敗血症を有するか、または敗血症を有すると思われる個体から、単一時点におけるバイオマーカープロファイルを得て、その個体からのバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較することにより実施する。参照バイオマーカープロファイルは、例えば、敗血症を患っているかまたは敗血症の発症もしくは敗血症のある特定の進行段階のいずれかにある個体の集団（「参照集団」）から得ることができる。もしその個体からのバイオマーカープロファイルが参照集団からのバイオマーカープロファイルの特徴を適当に含有すれば、そこでその個体は、参照集団と同じように、敗血症になる機会がより高いか、敗血症を患っているか、または敗血症のある特定の進行段階にあると診断する。参照バイオマーカープロファイルはまた、SIRSを患う個体または感染を患うがSIRSを患ってない個体を含む個体の様々な集団から得ることができる。従って本発明は、臨床医が、とりわけ、SIRSを有しない患者、SIRSを有するが研究の時間枠内で敗血症を恐らく発生しない患者、敗血症を有する患者、または最終的に敗血症になるリスクを有する患者を決定することを可能にする。
【００１０】
本発明の方法は、SIRS患者の敗血症の発症を検出するか予測するのに特に有用であるが、当業者は、本発明の方法が、限定されるものでないが、SIRSを有するかまたは敗血症のいずれかの段階にあると思われる患者を含むいずれの患者に対しても利用しうることを理解しうる。例えば、生物学的サンプルを患者から採取し、サンプル中のバイオマーカーのプロファイルを、個体、例えば、SIRSを有するまたは敗血症のある特定段階にある個体に由来する複数の異なる対照バイオマーカープロファイルと比較することができる。患者のバイオマーカープロファイルをある特定の参照集団由来のプロファイルに対応するとして分類することは、その患者がその参照集団に該当することを予測するものである。本発明の方法から得られる診断に基づき、その後、適当な治療計画（レジメン）を開始することができる。
【００１１】
SIRS、敗血症または敗血症の進行段階を診断または予測する現存の方法は、非特異的な臨床的徴候および症候群に基づいている；従って、得られる診断はしばしば臨床上の効用を限定する。本発明の方法は正確に敗血症の様々な段階を検出するので、これらの方法を利用してこれらの個体を同定し、治療法の研究に適確に登録することができる。敗血症を、単一時点に得た生物学的サンプルにおけるバイオマーカー発現の「スナップショット」から予測または診断できるので、この治療法研究を、重症の臨床症候群が発症する前に開始することができる。生物学的サンプルをそのバイオマーカープロファイルについて試験するので、特定のバイオマーカーの同定は不要である。そうは言うものの、本発明は、敗血症または敗血症の進行のある特定段階を特徴付ける特異的なプロファイルのバイオマーカーを同定する方法を提供する。かかるバイオマーカーはそれ自体、敗血症を予測または診断する上での有用なツールでありうる。
【００１２】
従って、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の発症を予測する方法を提供する。本方法は、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。バイオマーカープロファイルの比較によって、個体における敗血症の発症を少なくとも約60％の正確度で予測することができる。この方法は、敗血症の発症前のいずれの時点において再び繰返してもよい。
【００１３】
本発明はまた、敗血症を有するかまたは有すると思われる個体における敗血症を診断する方法であって、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである上記方法も提供する。バイオマーカープロファイルの比較によって、個体における敗血症を少なくとも約60％の正確度で診断することができる。この方法は、いずれの時点において繰返してもよい。
【００１４】
本発明はさらに、敗血症を有するかまたは敗血症を有すると思われる個体における敗血症の進行（すなわち、段階）を決定する方法を提供する。この方法は、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。バイオマーカープロファイルを比較すると、個体における敗血症の進行を少なくとも約60％の正確度で予測することができる。この方法はまた、いずれの時点において繰返してもよい。
【００１５】
さらに、本発明はSIRSを有するかまたはSIRSを有すると思われる個体におけるSIRSを診断する方法を提供する。この方法は、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。バイオマーカープロファイルを比較すると、個体におけるSIRSを少なくとも約60％の正確度で診断することができる。この方法はまた、いずれの時点において繰返してもよい。
【００１６】
他の実施形態においては、本発明は、とりわけ、決定ルールを適用して個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法を提供する。決定ルールは、(i)個体から単一時点に採取した生物学的サンプルから作製したバイオマーカープロファイルを(ii)参照集団から作製したバイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。決定ルールを適用することにより、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。本方法は、その個体において１回以上別々の単一時点で繰返してもよい。
【００１７】
本発明はさらに、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体から採取した生物学的サンプルからバイオマーカープロファイルを得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである上記方法も提供する。単一のかかる比較が個体をその参照集団のメンバーシップを有するとして分類することができる。バイオマーカープロファイルの比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００１８】
本発明はさらに、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体から採取した生物学的サンプルからバイオマーカープロファイルを得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである上記方法を提供する。参照集団は、正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある特定段階の参照集団、通常技術によりほぼ0〜36時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ36〜60時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ60-84時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団からなる群から選択することができる。単一のかかる比較が個体をその参照集団のメンバーシップを有するとして分類することができ、そしてその比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００１９】
さらに他の実施形態においては、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法を提供する。上記方法は、個体からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルと参照集団からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルとの間の測定可能な少なくとも１種のバイオマーカーの特性を比較するステップを含むものである。この比較に基づいて、個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類する。従って、その比較は個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。一実施形態において、バイオマーカーは、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に示されるバイオマーカーの群から選択される。
【００２０】
さらなる実施形態においては、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体の生物学的サンプルから作製したプロファイル中の１セットのバイオマーカーから少なくとも２種の特性を選択するステップを含むものである上記方法を提供する。これらの特性を、参照集団からの生物学的サンプルから作製したプロファイル中の同じ１セットのバイオマーカーと比較する。単一のかかる比較が個体をその参照集団のメンバーシップを有するとして約60％の正確度で分類することができ、そしてその比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００２１】
本発明はまた、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体の生物学的サンプルに含有される少なくとも２種のバイオマーカーの存在量の変化を決定し、そして個体のサンプル中のこれらのバイオマーカーの存在量を参照集団からの生物学的サンプル中のこれらのバイオマーカーの存在量と比較することを含むものである上記方法も提供する。その比較が個体をその参照集団中のメンバーシップを有するとして分類することができ、そしてその比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００２２】
他の実施形態においては、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定する方法であって、少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量の変化を、敗血症を患うまたは患わない参照集団からの生物学的サンプルに対する少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量の変化と比較して、決定することを含むものである上記方法も提供する。バイオマーカーは、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に示されるバイオマーカーからなる群から選択される。あるいは、少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量を、少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量と比較してもよい。
【００２３】
本発明はさらに、とりわけ、生物学的サンプル中のその存在が敗血症を診断または予測するのに役立つバイオマーカーを単離する方法を提供する。この方法は、個体の集団から参照バイオマーカープロファイルを得るステップおよび敗血症または敗血症の進行段階の１つを予測または診断するするのに役立つ参照バイオマーカープロファイルの特性を同定するステップを含むものである。この方法はさらに、その特性に対応するバイオマーカーを同定するステップおよび次いでバイオマーカーを単離するステップを含むものである。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーを含むものであるキットを提供する。
【００２５】
他の実施形態においては、参照バイオマーカープロファイルは、サンプル中のバイオマーカーを特徴づける少なくとも２種の、好ましくは５、10、または20種以上の特性の組合わせを含んでもよい。この実施形態においては、それらの特性は或る特定の参照集団に或る個体が包含されることを予測するのに寄与しうる。包含を予測する特性の相対的寄与は、少なくともほぼ60％、少なくともほぼ70％、少なくともほぼ80％、少なくともほぼ90％、ほぼ95％、ほぼ96％、ほぼ97％、ほぼ98％、ほぼ99％またはほぼ100％の正確度で、クラス包含を予測するデータ解析アルゴリズムにより決定することができる。一実施形態においては、特性の組合わせによって、通常技術を用いて決定される敗血症の実際の発症に先立つほぼ24、ほぼ48、またはほぼ72時間前に敗血症の発症を予測することができる。
【００２６】
さらに他の実施形態においては、参照バイオマーカープロファイルは少なくとも２種の特性を含んでもよく、その少なくとも１つは対応するバイオマーカーを特徴づけるものであってその特性はある個体が敗血症陽性またはSIRS陽性集団中に包含されることの予測を可能にするものである。この実施形態においては、その特性を、ある個体が敗血症陽性またはSIRS陽性集団に属すると分類することができる確度に直接関係するp値（Wilcoxon符号付順位検定などのノンパラメトリック検定から得られる）に割付ける。他の実施形態においては、その特性は、ある個体を敗血症陽性またはSIRS陽性集団に属するとして、少なくともほぼ60％、ほぼ70％、ほぼ80％、ほぼ90％の正確度で分類する。さらに他の実施形態においては、その特性によって、通常技術を用いて決定される敗血症の実際の発症に先立つほぼ24、ほぼ48、またはほぼ72時間前に、敗血症の発症を予測することができる。
【００２７】
さらに他の実施形態においては、本発明は、捕捉分子が粒子の表面に結合した粒子のアレイであって、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーと特異的に結合することができる上記アレイを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、ある単一時点（「スナップショット」）においてまたは疾患進行の経過期間に個体から得た１以上の生物学的サンプルを利用して、敗血症の迅速、高感度、かつ正確な診断または予測を可能にする。好都合なことに、臨床症候群の発症前に敗血症を診断または予測することができるので、より効果的な治療介入が可能になる。
【００２９】
「全身性炎症反応症候群」または「SIRS」は、様々な重症の臨床発作に対して、24時間以内に次の症状の２つ以上が顕われる臨床反応を意味する：
・38℃（100.4°F）を超えるかもしくは36℃（96.8°F）未満の体温；
・毎分90を超える心拍数；
・毎分20回を超える呼吸数もしくは32mmHg未満のPCO2もしくは機械的な通気(mechanical ventilation)の必要性；ならびに
・12.0x109/Lを超えるかもしくは4.0x109/L未満の、または10％を超える未成熟型バンドを有する白血球数。
【００３０】
これらのSIRSの症状は共通して認識されたSIRSの定義を表わすが、将来、定義の改善があれば改変されるかまたは置換えられうる。本定義は現行の臨床実施を説明するために用いるのであり、本発明の重要な態様を表すものではない。
【００３１】
SIRSの患者は上記のSIRSとして分類される臨床症状を有するが、臨床上、敗血症とみなされない。敗血症を発生するリスクのある個体は、ICU（集中治療室）における患者およびそうでなければ生理学的外傷、例えば火傷または他の傷害を受けている個体を含む。「敗血症」は確認された感染性プロセスと関係があるSIRS陽性症状を意味する。敗血症の臨床上の疑いは、SIRS患者のSIRS陽性症状が感染性プロセスの結果であるという疑いから起こる。本明細書で用いる「敗血症」は、限定されるものでないが、敗血症の発症、重症敗血症、および敗血症の最終段階と関係があるMOD（多臓器不全）を含む敗血症の全ての段階を含む。
【００３２】
「敗血症の発症」は、敗血症の早期段階、すなわち、臨床症状が敗血症の臨床的疑いを十分に支持する段階の前の段階を意味する。本発明の方法は通常技術を用いて敗血症が疑われうる時点の前に敗血症を検出するために利用するので、早期敗血症におけるその患者の病状は敗血症の症状がさらに臨床的に明らかになるときに遡及して確認しうるだけである。患者が敗血症になる正確な機構は本発明の重要な態様でない。本発明の方法は、感染プロセスの起源に依存しないでバイオマーカープロファイルの変化を検出することができる。敗血症が如何に起こるかに関わらず、本発明の方法は、従来使用される判定基準により分類される敗血症またはSIRSを有するかまたは有すると疑われる患者の状態を決定することができる。
【００３３】
「重症敗血症」は臓器不全、低灌流異常、または敗血症が誘発する低血圧に関係する敗血症を意味する。低灌流異常は、限定されるものでないが、乳酸アシドーシス、乏尿、または精神状態の急性変化を含む。「敗血症ショック」は、敗血症が誘発する、十分な静脈内血液負荷に反応しない低血圧および末梢低潅流の症状を意味する。「変換患者（converter patient）」は、患者をモニターしている期間中に、典型的にはICU滞在中に、敗血症の臨床的疑いへ進行するSIRS陽性患者を意味する。「非変換患者（non-converter patient）」は、患者をモニターしている期間中に、典型的にはICU滞在中に、敗血症の臨床的疑いへ進行しないSIRS陽性患者を意味する。
【００３４】
「バイオマーカー」は、実質的にいずれかの生物学的化合物、例えばタンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機または無機化学品、天然高分子、ならびに小分子であって、生物学的サンプル中に存在しかつ生物学的サンプルから単離するかまたは測定することができる上記生物学的化合物である。さらに、バイオマーカーは、無傷の分子全体であってもよいしまたは部分的に機能性であるかまたは、例えば、抗体もしくは他の特異的結合タンパク質により認識することができるその部分であってもよい。バイオマーカーは、バイオマーカーの測定可能な態様が患者の所与の状態、例えば敗血症のある特定段階と関係がある情報を与えるのに役立つと考えられる。かかる測定可能な態様は、例えば、個体からの生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在、不在、または濃度および／またはバイオマーカーのプロファイルの部分としてのその存在を含むことができる。本明細書ではバイオマーカーのかかる測定可能な態様を「特性（feature）」と定義する。特性はまた、例えば、同定されていてもまたは同定されてなくてもよい複数のバイオマーカーの２以上の測定可能な態様の比であってもよい。「バイオマーカープロファイル」は少なくとも２つのかかる特性を含むものであって、それらの特性は同じかまたは異なるクラス、例えば核酸および炭水化物などのバイオマーカーに対応することができる。バイオマーカープロファイルはまた、少なくとも３、４、５、10、20、30種以上の特性を含んでもよい。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは数百種、または数千種の特性を含む。他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、少なくとも１つの内部標準の少なくとも１つの測定可能な態様を含む。
【００３５】
「表現型変化」は、患者の所与の状態と関係があるパラメーターの検出可能な変化である。例えば、表現型変化は、その変化が敗血症または敗血症の発症と関係がある体液中のバイオマーカーの増加または減少を含むことができる。表現型変化はさらに、患者の所与の状態の検出可能な態様の変化であって、バイオマーカーの測定可能な態様の変化でない変化を含むことができる。例えば、表現型変化は、体温、呼吸数、脈拍、血圧、または他の生理学的パラメーターの検出可能な変化を含んでもよい。かかる変化は、当業者に周知の通常技術を用いる臨床的観察および測定を介して決定することができる。本明細書に用いる「通常技術」は、本発明によるバイオマーカープロファイルを得ることなく表現型変化に基づいて、個体を分類する技術である。
【００３６】
「決定ルール」は患者を分類するために用いる方法である。このルールは、当技術分野で知られる１以上のフォームをとることができ、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるHastieら, 「統計学学習の基礎（The Elements of Statistical Learning）」, Springer-Verlag（Springer, New York (2001)）に例示されている。サンプル内の分子の複雑な混合物中のバイオマーカーを分析し、特性をデータセットで作製する。決定ルールを用いてデータセットの特性を処理し、とりわけ、敗血症の発症を予測し、敗血症の進行を決定し、敗血症を診断し、またはSIRSを診断することができる。
【００３７】
決定ルールを適用する場合、完全な分類を必要としない。一実施形態においては、分類を少なくともほぼ90％以上の確度で行ってもよい。他の実施形態においては、確度は少なくともほぼ80％、少なくともほぼ70％、または少なくともほぼ60％である。有用な確度の程度は、本発明の具体的な方法に依存して変化しうる。「確度（certainity）」は、正確に分類した個体の総数を、分類にかけた個体の総数で除したものとして定義される。本明細書に用いる「確度」は「正確度」を意味する。分類はまた、その「感度」により特徴づけることもできる。分類の「感度」は、敗血症を有すると正しく同定された敗血症患者の百分率に関係する。「感度」は当技術分野では、真の陽性を、真の陽性と偽陰性の和によって除した数として定義される。対照的に、方法の「特異性」は、敗血症を有しないと正しく同定された患者の百分率として定義される。すなわち、「特異性」は、真の陰性数を、真の陰性と偽陽性の和によって除した数に関係する。一実施形態においては、感度および／または特異性は少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、または少なくとも60％である。十分な確度で個体を分類するために利用する特性の数は典型的にはほぼ４個である。しかし、求められる確度の程度に依存して、特性の数は多くても少なくてもよいが、全事例において少なくとも１個である。一実施形態においては、個体を分類するために利用する特性の数を最適化して、高い確度で個体を分類できるようにする。
【００３８】
患者における敗血症またはSIRSの「状態を決定する」は、患者のバイオマーカープロファイルを分類して、(1)患者における敗血症またはSIRSの存在を検出すること、(2)患者における敗血症またはSIRSの発症を予測すること、または(3)患者における敗血症またはSIRSの進行を測定することを包含する。敗血症またはSIRSを「診断する」は、患者における敗血症またはSIRSを同定または検出することを意味する。本発明の感度は高く、臨床症状が明らかに観察される前に敗血症を検出するので、敗血症の同定または検出は上記の敗血症の発症の検出を含む。すなわち、「敗血症の発症を予測する」は、患者のバイオマーカープロファイルを、SIRSのある特定段階から敗血症へまたは感染している状態から敗血症へ（すなわち、感染からSIRSを随伴する感染へ）進行しつつある個体由来のプロファイルに対応するとして分類することを意味する。敗血症またはSIRSの「進行を検出する」または「進行を決定する」は、既に診断の済んでいる患者のバイオマーカープロファイルを、敗血症またはSIRSを有するとして分類することを意味する。例えば、診断の済んでいる患者のバイオマーカープロファイルを敗血症を有するとして分類することは、敗血症から重症敗血症またはMODを伴う敗血症への患者の進行を検出または決定することを包含することができる。
【００３９】
本発明によると、敗血症は、個体から得たサンプルからのバイオマーカーのプロファイルを得ることにより診断または予測することができる。本明細書に用いる「得る（obtain）」は「取得する（to come into possession of）」を意味する。本発明は、感染またはさらに敗血症を有する個体であるが、まだ敗血症を有すると診断されていない個体、敗血症を有すると疑われる個体、または敗血症を発生するリスクのある個体において敗血症を予測および診断するのに特に有用である。同じやり方で、本発明を用いて個体におけるSIRSを検出および診断することができる。すなわち、本発明を用いてSIRSの臨床的疑いを確認することができる。本発明を用いてまた、敗血症プロセスの様々な段階、例えば感染、菌血症、敗血症、重症敗血症、敗血症ショックなどを検出することもできる。
【００４０】
個体から得たバイオマーカーのプロファイル、すなわち、試験バイオマーカープロファイルを、参照バイオマーカープロファイルと比較する。参照バイオマーカープロファイルは１つの個体からまたは２以上の個体の集団から作製してもよい。集団は、例えば、３、４、５、10、15、20、30、40、50以上の個体を含むことができる。さらに、本発明の方法により比較する参照バイオマーカープロファイルと個体の（試験）バイオマーカープロファイルは、試験プロファイルと参照プロファイルが異なる時点に採取した生物学的サンプルから作製してお互いに比較するのであれば、同じ個体から作製してもよい。例えば、あるサンプルを研究期間の開始時に個体から得ることができる。次いでそのサンプルから採取した参照バイオマーカープロファイルを、同じ個体からのその後のサンプルから作製したバイオマーカープロファイルと比較することができる。かかる比較を利用して、例えば、経時的に分類を繰返すことにより、個体における敗血症の状態を決定することができる。
【００４１】
参照集団は、SIRSを有しない個体（「SIRS陰性」）から、SIRSを有しないが感染プロセスを患っている個体から、SIRSを患っていて敗血症の存在しない個体（「SIRS陽性」）から、敗血症の発症を患っている個体から、敗血症陽性であって敗血症の進行段階の１つを患っている個体から、または敗血症を発生するリスクを増加する生理学的外傷のある個体から選ぶことができる。さらに参照集団はSIRS陽性であって、その後、続いて通常技術を用いて敗血症を診断してもよい。例えば、参照プロファイルを作製するために利用するSIRS陽性患者の集団を、参照プロファイルを作製する目的で彼らから生物学的サンプルを採取した後、ほぼ24、48、72、96時間以上経って、敗血症について診断することができる。一実施形態においては、SIRS陽性個体の集団を、生物学的サンプルを採取した後、ほぼ0〜36時間、ほぼ36〜60時間、ほぼ60〜84時間、またはほぼ84〜108時間に、通常技術を用いて敗血症を診断する。もしバイオマーカープロファイルが敗血症またはその進行段階の１つを示すものであれば、臨床医は、敗血症の臨床症候が発現する前に治療を始めることができる。治療は、典型的には、患者を試験して感染源を決定することに関わる。感染源を突き止めれば、臨床医は、典型的には感染部位から、好ましくは関係する実験的抗生物質療法を始める前に培養物を得て、そして恐らくさらなる付属の治療対策、例えば膿瘍を排出するかまたは感染したカテーテルを除去するであろう。敗血症の療法はHealy（前掲）に総括されている。
【００４２】
本発明の方法は、個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較することを含むものである。本明細書に用いる「比較」は、個体のバイオマーカープロファイルと参照バイオマーカープロファイルの少なくとも１つの相違を識別するいずれかの方法を含む。従って、比較は、クロマトグラフィスペクトルの視覚検査であってもよいし、また比較はプロファイルの特性に割付けられた値の代数学的または統計学的比較であってもよい。かかる統計学的比較は、限定されるものでないが、決定ルールを適用することを含む。もしバイオマーカープロファイルが少なくとも１つの内部標準を含むものであれば、バイオマーカープロファイル中の相違を識別する比較はまた、これらの内部標準の特性を含むものであって、バイオマーカーの特性を内部標準の特性と関係付けてもよい。比較は、とりわけ、敗血症またはSIRSを獲得する機会を予測することができる；または比較は敗血症またはSIRSの存在または不在を確認することができる；または個体がありうる敗血症の段階を示すことができる。
【００４３】
本発明は、従って、モニタリング期間全体にわたる時間集中的アッセイを実施する必要性ならびにそれぞれのバイオマーカーを同定する必要性がない。本発明は個体を分類するためにモニタリング期間を必要としないが、個体のリスクがなくなるまで、個体の繰返し分類、すなわち繰返しスナップショットを期間全体にわたり取得してもよいことは理解されるであろう。あるいは、個体から得たバイオマーカーのプロファイルを、同じ個体から異なる時点に得た１以上のバイオマーカーのプロファイルと比較することができる。当業者は、分類を繰返す過程で行われたそれぞれの比較が、個体を参照集団のメンバーシップを有するとして分類できることを理解するであろう。
【００４４】
敗血症でない段階からMODの段階までにおける敗血症進行の様々な段階に対応する様々な生理学的症状を有する個体を、特徴的なバイオマーカープロファイルにより識別することができる。本明細書で用いる「個体」は動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトまたは非ヒト霊長類である。用語「個体」、「被験者」および「患者」を本明細書では互換的に使用する。個体は正常であっても、SIRSまたは敗血症を有する疑いがあっても、SIRSまたは敗血症を発生するリスクがあっても、またはSIRSまたは敗血症を有することが確認されていてもよい。敗血症の進行において示唆されている公知のバイオマーカーが多数存在するが、これらのマーカーの全てが初期の前臨床段階に現れるとは限らない。早期段階敗血症を特徴付けるバイオマーカーのサブセットは、事実上、最終的に敗血症の臨床症候群を現わす個体から得たサンプルの遡及的分析によってのみ決定することができる。理論に束縛されることなく、敗血症をもたらす初期の病原体感染ですらバイオマーカー発現の特定の変化に反映される生理学的変化を起しうる。例えば、敗血症のある段階に特徴的なバイオマーカープロファイルが決定されると、個体から得た生物学的サンプルからのバイオマーカーのプロファイルを、この参照プロファイルと比較して、その被験者も敗血症のその特定段階にあるかかどうかを決定することができる。
【００４５】
敗血症のある段階から他の段階への、または正常（すなわち、敗血症またはSIRSを有しないことにより特徴づけられる症状）から敗血症またはSIRSへの進行、およびその逆は、バイオマーカープロファイルにおける変化により特徴付けられよう、例えば、ある特定のバイオマーカーはより高いレベルに増加して発現されそして他のバイオマーカーの発現は下方調節されるというようにである。バイオマーカープロファイルにおけるこれらの変化は、その参照集団における、例えば、感染および／または炎症に対する生理学的反応の漸進的確立を反映しうる。当業者は、その参照集団のバイオマーカープロファイルはまた、生理学的反応が静まるとともに変化しうることを理解するであろう。以上述べたように、本発明の利点の１つは、個体を、単一の生物学的サンプルからのバイオマーカープロファイルを用いて、ある特定の集団のメンバーシップを有するとして分類できることである。しかし、ある特定の生理学的反応が確立されるかまたは沈静化するかどうかの決定は、個体の続いての分類によって実施しうることを当業者は理解するであろう。この目的で、本発明は、敗血症またはSIRSに対する生理学的反応が確立されるかまたは沈静化するとともに発現レベルが増加および減少する両方の多数のバイオマーカーを提供する。例えば、ある研究者は、敗血症に対する生理学的反応が確立されるとともに強度が変化することが公知である個体のバイオマーカープロファイルの特性を選択することができる。その後の個体からの生物学的サンプルから得たプロファイル中の同じ特性の比較によって、個体がより重症の敗血症へ進行しているかまたは正常へ進行しているどうかを確立することができる。
【００４６】
バイオマーカーの分子としての同定は本発明にとって本質的でない。実際、本発明は従来同定されているバイオマーカー（例えば、2003年3月26日に出願された米国特許出願第10/400,275号を参照）に限定されるものではない。従って、個体の所与の集団、特に敗血症の早期段階の１つの集団を特徴づける新規のバイオマーカーを同定しうることを予想している。本発明の一実施形態においては、バイオマーカーを同定しかつ単離する。次いでそれを用いて特異的に結合する抗体を産生させることができ、それによって、様々な診断アッセイにおけるバイオマーカー検出を実施することができる。この目的に対して、いずれのイムノアッセイを利用してもよく、またイムノアッセイはバイオマーカー分子と結合することができるいずれの抗体、抗体フラグメントまたは誘導体（例えば、Fab、FvまたはscFvフラグメント）を利用してもよい。かかるイムノアッセイは当技術分野で周知である。もしバイオマーカーがタンパク質であれば、それを配列決定してもよく、それをコードする遺伝子を周知の確立された技術を利用してクローニングしてもよい。
【００４７】
本発明の方法を使って、例えばICUに入院する患者をスクリーニングすることができる。例えば、血液などの生物学的サンプルを入院時に直ぐ採取する。血液内のタンパク質と他の分子の複雑な混合物を、バイオマーカーのプロファイルにとして解析する。この解析は、再現性のあるようにこれらの分子をいくつかの物理または化学特性に基づいて識別する技術または技術の組合わせを使って実施することができる。一実施形態においては、分子をマトリックス上に固定し、次いで分離し、そしてレーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計により識別する。スペクトルがそれぞれの分子またはそのフラグメントの質量／電荷を反映する特徴的な脱着パターンにより作製される。他の実施形態においては、バイオマーカーを細胞抽出物から得た様々なmRNA種から選択し、個体のmRNA種をcDNAアレイとハイブリダイズすることによって、プロファイルを得る。cDNAアレイの診断上の利用は当技術分野で周知である（例えば、Zouら, Oncogene 21: 4855-4862 (2002)を参照）。さらに他の実施形態においては、タンパク質および核酸の分離方法の組合わせを用いて、プロファイルを得ることができる。
【００４８】
本発明はまた、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断するのに有用であるキットを提供する。本発明のキットは少なくとも１種のバイオマーカーを含む。本発明に有用である特定のバイオマーカーは本明細書において説明される。キットのバイオマーカーを用いて本発明によるバイオマーカープロファイルを作製することができる。キットの化合物のクラスの例は、限定されるものでないが、タンパク質、およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機および無機化学品、ならびに天然および合成高分子を含む。バイオマーカーはアレイの一部分であってもよいし、またはバイオマーカーは別々におよび／または個々にパッケージされていてもよい。キットはまた、本発明のバイオマーカープロファイルを作製するのに用いる、少なくとも１つの内部標準を含んでもよい。同様に、内部標準は上記の化合物のいずれのクラスのものであってもよい。また、本発明のキットは、バイオマーカープロファイルを作製する生物学的サンプル中に含まれるバイオマーカーを検出しうるように標識するために用いる試薬を含有してもよい。この目的で、キットは、次のバイオマーカーの表のいずれかに記載されるバイオマーカーのなかの少なくとも２、３、４、５、10、20種以上のバイオマーカーと特異的に結合する抗体またはその機能性フラグメントのセットを含んでもよい。抗体自体を検出しうるように標識してもよい。キットはまた、特異的なバイオマーカー結合成分、例えばアプタマーを含んでもよい。もしバイオマーカーが核酸を含む場合、そのキットは、バイオマーカーとまたはバイオマーカーの相補鎖と２本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドプローブを提供することができる。オリゴヌクレオチドプローブを検出しうるように標識してもよい。
【００４９】
本発明のキットはまた、製薬用賦形剤、希釈剤および／または、バイオマーカーを抗体の産生に用いるときは、アジュバントを含んでもよい。製薬用アジュバントの例は、限定されるものでないが、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含む。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有により保証することができる。等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを含むことも所望される。注射用の製薬剤形の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含有することにより達成することができる。
【００５０】
バイオマーカープロファイルの作製
一実施形態によれば、本発明の方法は、個体から採取した生物学的サンプルからバイオマーカーのプロファイルを得ることを含むものである。生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、唾液、痰、尿、大脳脊髄液、細胞、細胞抽出物、組織サンプル、組織生検、糞便サンプルなどであってよい。参照バイオマーカープロファイルは、例えば、SIRS陰性個体、SIRS陽性個体、敗血症を発症しつつある個体および既に敗血症である個体からなる群から選択される個体の集団から取得することができる。既に敗血症である個体からの参照バイオマーカープロファイルは、敗血症の進行におけるいずれの段階、例えば感染、菌血症、重症敗血症、敗血症ショックまたはMODにおいて取得してもよい。
【００５１】
一実施形態においては、分離法を用いてバイオマーカーのプロファイルを作製し、サンプル内のバイオマーカーのサブセットだけを分析することができる。例えば、サンプル中の分析するバイオマーカーが細胞抽出物のmRNA種からなり、サンプル内の核酸バイオマーカーだけを得るように分画しておいたものでもよいし、またはバイオマーカーがサンプル内のタンパク質の全補体の画分からなり、クロマトグラフィ技術により分画しておいたものでもよい。あるいは、分離法を使わないでバイオマーカーのプロファイルを作製してもよい。例えば、生物学的サンプルを、サンプル中のバイオマーカーと特異的複合体を形成する標識した化合物を用いて問合わせ、特異的複合体の標識強度がバイオマーカーの測定可能な特性であってもよい。かかる特異的複合体を形成するのに好適な化合物は標識した抗体である。一実施形態においては、標識としての増幅可能な核酸とともに抗体を用いて、バイオマーカーを測定する。さらに他の実施形態においては、それぞれ核酸標識の１本鎖とコンジュゲートした２つの抗体がバイオマーカーと相互作用して２つの核酸鎖が増幅可能な核酸を形成すると、核酸標識が増幅可能になる。
【００５２】
他の実施形態においては、バイオマーカーが核酸またはその相補体である場合、バイオマーカープロファイルを核酸のアレイなどのアッセイから誘導することができる。例えば、バイオマーカーはリボ核酸であってもよい。バイオマーカープロファイルはまた、核磁気共鳴、核酸アレイ、ドットブロット、スロットブロット、逆転写増幅およびノーザン分析からなる群から選択される方法を用いて得ることができる。他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルをバイオマーカーに特異的な抗体、またはその機能性フラグメントと反応させることにより免疫学的に検出する。抗体の機能性フラグメントは、完全な抗体が結合する抗原と結合する能力を少なくとも若干保持する抗体の一部分である。限定されるものでないが、scFvフラグメント、FabフラグメントおよびF(ab)2フラグメントを含むフラグメントは、遺伝子組換えにより作製するかまたは酵素により作製することができる。他の実施形態においては、抗体以外の特異的結合分子、例えばアプタマーをバイオマーカーと結合するために用いることができる。さらに他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、感染性薬剤またはその成分の測定可能な態様を含んでもよい。さらに他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、小分子の測定可能な態様を含むものであってもよく、その小分子はタンパク質または核酸の断片を含んでもよいしまたは代謝産物を含んでもよい。
【００５３】
バイオマーカープロファイルは１以上の分離法を用いて作製することができる。例えば、好適な分離法は、質量分析計、例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ESI-MS）、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n（nは１以上の整数である）、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF-MS）、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（SELDI-TOF-MS）、シリコン上の脱離／イオン化（DIOS）、二次イオン質量分析計（SIMS）、四重極飛行時間型（Q-TOF）、大気圧化学イオン化質量分析計（APCI-MS）、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大気圧光イオン化質量分析計（APPI-MS）、APPI-MS/MS、およびAPPI-(MS)nを含むことができる。他の質量分析法は、とりわけ、四重極、フーリエ変換質量分析計（FTMS）およびイオントラップを含んでもよい。他の好適な分離法は、化学抽出分配、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィ、等電点、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）または他のクロマトグラフィ、例えば薄層、気体または液体クロマトグラフィ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含んでもよい。一実施形態においては、生物学的サンプルを分画して後に、分離法を適用してもよい。
【００５４】
バイオマーカープロファイルはまた、バイオマーカー自身の物理的分離を必要としない方法により作製することもできる。例えば、核磁気共鳴（NMR）分析計を用いて分子の複雑な混合物からバイオマーカーのプロファイルを解析することができる。腫瘍を分類するためのNMRの類似した利用は、例えばHagberg, NMR Biomed. 11: 148-56 (1998)に開示されている。さらなる方法は核酸増幅技術を含み、この方法は個体バイオマーカーを物理的に分離することなくバイオマーカーのプロファイルを作製する（例えば、Stordeurら, J. Immunol. Methods 259:55-64 (2002)、およびTanら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:11387-11392 (2002)を参照）。
【００５５】
一実施形態においては、レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計を用いてバイオマーカーのプロファイルを作製し、ここでバイオマーカーは、入射レーザー照射によりイオン化しかつ固定支持体から蒸発させたタンパク質またはタンパク質断片である。次いで、プロファイルを、それぞれのタンパク質に特徴的なその質量対電荷（「m/z」）比に依存する飛行時間によって作製する。様々なレーザー脱離／イオン化技術が当技術分野では公知である（例えば、Guttmanら, Anal. Chem. 73:1252-62 (2001)、およびWeiら, Nature 399:243-46 (1999)を参照）。
【００５６】
レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計は大量の情報を比較的短時間に作製することができる。生物学的サンプルを、サンプル中のバイオマーカーまたはそのサブセットの全てと結合する数種類の支持体の１つにアプライする。細胞溶解物またはサンプルをこれらの表面に、0.5μL程度の小容積で、前精製または分画をせずに、直接アプライする。溶解物またはサンプルを、支持表面上にアプライする前に、濃縮または希釈してもよい。次いで、レーザ脱離／イオン化を用いてサンプルの質量スペクトルを３時間程度の短時間に作製する。
【００５７】
他の実施形態においては、個体の細胞抽出物からの全mRNAをアッセイし、生物学的サンプルから得られる様々なmRNA種をバイオマーカーとして利用する。プロファイルは、例えば、これらのmRNAを、オリゴヌクレオチドまたはcDNAを含んでもよいプローブのアレイと、当技術分野で公知の標準的方法を利用してハイブリダイズすることにより、得ることができる。あるいは、mRNAをゲル電気泳動またはブロット法、例えばドットブロット、スロットブロットまたはノーザン分析にかけてもよく、これらは全て当技術分野で公知である（例えば、Sambrookら, in "Molecular Cloning, 3版.,"Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)を参照）。mRNAプロファイルはまた、逆転写と、次いで得られるDNAの増幅および検出により取得することもでき、これは、例えばStordeurら（前掲）に開示されている。他の実施形態においては、プロファイルは、質量分析計と組合わせた核酸アレイなどの方法の組み合わせを用いることにより得ることができる。
【００５８】
データ解析アルゴリズムの使用
一実施形態においては、個体のバイオマーカープロファイルの参照バイオマーカープロファイルとの比較は、決定ルールを適用することを含む。決定ルールはデータ解析アルゴリズム、例えばコンピューターパターン認識アルゴリズムを含んでもよい。他の好適なアルゴリズムは、限定されるものでないが、ロジスティック回帰または特性値の分布差を検出するノンパラメトリックアルゴリズム（例えば、Wilcoxon符号付順位検定）を含む。決定ルールは、１、２、３、４、５、10、20種以上の特性に基づくものであってもよい。一実施形態においては、決定ルールは数百種以上の特性に基づく。決定ルールの適用はまた、分類ツリーアルゴリズムの使用を含むものであってもよい。例えば、参照バイオマーカープロファイルは少なくとも３つの特性を含み、それらの特性は分類ツリーアルゴリズムにおける予測因子である。データ解析アルゴリズムは集団内のメンバーシップ（またはクラス）を、少なくともほぼ60％、少なくともほぼ70％、少なくともほぼ80％および少なくともほぼ90％の正確度で予測する。
【００５９】
適当なアルゴリズムは当技術分野で公知であり、そのいくつかはHastieら（前掲）に総括されている。かかるアルゴリズムは生物学的物質、例えば血液サンプルからの複雑なスペクトルを分類して、個体を正常であるかまたはある特定の病状の特徴であるバイオマーカー発現レベルを持つかを識別する。かかるアルゴリズムを用いて決定ルール適用の速度と効率を増加しかつ研究偏差を避けることはできるが、当業者は、コンピューターに基づくアルゴリズムが本発明の方法を実行するための必要条件ではないことを理解するであろう。
【００６０】
アルゴリズムは、バイオマーカープロファイルを作製するのに用いた方法に関わりなく、バイオマーカープロファイルの比較に適用することができる。例えば、Harper, 「高分子分析における熱分解とGC（Pyrolysis and GC in Polymer Analysis）」, Dekker, New York (1985)に考察されたガスクロマトグラフィを用いて作製したバイオマーカープロファイルに、好適なアルゴリズムを適用することができる。さらに、Wagnerら, Anal. Chem. 74:1824-35 (2002)は、静的飛行時間二次イオン質量分析計（TOF-SIMS）によって得たスペクトルに基づいて個体を分類する能力を改良するアルゴリズムを開示している。さらに、Brightら, J. Microbiol. Methods 48:127-38 (2002)は、MALDI-TOF-MSスペクトルの分析により、細菌株の間を高い確度（79-89％正しい分類率）で識別する方法を開示している。Dalluge, Fresenius J AnaL Chem. 366:701-11 (2000)は、MALDI-TOF-MSおよび液体クロマトグラフィ-エレクトロスプレイイオン化質量分析計（LC/ESI-MS）を利用する、複雑な生物学的サンプル中のバイオマーカーのプロファイルの分類を考察している。
【００６１】
バイオマーカー
本発明の方法は、敗血症またはSIRSの診断または予測に役立つバイオマーカープロファイルの作製によって実施することができる。プロファイルを作製すれば、本発明を十分実施できるので、プロファイルを構成するバイオマーカーが既知である必要はないしまたは続いて同定する必要はない。
【００６２】
本発明のバイオマーカープロファイルを作製するために利用しうるバイオマーカーは、感染に反応する免疫系の状態の情報を与えることが公知のバイオマーカーを含みうる；しかし、これらのバイオマーカーの全てが等しく情報を与えるとは限らない。これらのバイオマーカーは、ホルモン、自己抗体、可溶性および不溶性レセプター、成長因子、転写因子、宿主からまたは病原体自体からの細胞表面マーカーおよび可溶性マーカー、例えば、コートタンパク質、リポ多糖（内毒素）、リポテイコ酸などを含みうる。他のバイオマーカーは、限定されるものでないが、細胞表面タンパク質、例えばCD64タンパク質；CD11bタンパク質；HLAクラスII分子、例えばHLA-DRタンパク質およびHLA-DQタンパク質；CD54タンパク質；CD71タンパク質；CD86タンパク質；表面結合腫瘍壊死因子レセプター（TNF-R）；パターン認識レセプター、例えばToll様レセプター（TLR）；可溶性マーカー、例えばインターロイキンIL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、およびIL-18；腫瘍壊死因子α（TNF-α）；ネオプテリン；C-反応性タンパク質（CRP）；プロカルシトニン（PCT）；6-ケトFlα；トロンボキサンB2；ロイコトリエンB4、C3、C4、C5、D4およびE4；インターフェロンγ（IFNγ）；インターフェロンα/β（IFNα/β）；リンホトキシンα（LTα）；補体成分（C'）；血小板活性化因子（PAF）；ブラジキニン；一酸化窒素（NO）；顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）；マクロファージ抑制因子（MIF）；インターロイキン-1受容体拮抗薬（IL-1ra）；可溶性腫瘍壊死因子受容体（sTNFr）；可溶性インターロイキン受容体（sIL-1rおよびsIL-2r）；トランスフォーミング成長因子β（TGFβ）；プロスタグランジンE2（PGE2）；顆粒球-コロニー刺激因子（G-CSF）；ならびに他の炎症性メディエーターを含む。（総括は、Oberholzerら, Shock 16:83-96 (2001)、およびVincentら, 「敗血症テキスト（The Sepsis Text）」, Carletら編, Kluwer Academic Publishers (2002)を参照）。通常かつ臨床的に菌血症と関係があるバイオマーカーも、かかるバイオマーカーが通常かつしばしば生物学的サンプル中に出現するのであれば、本発明に有用であるバイオマーカーの候補である。バイオマーカーは、タンパク質もしくは核酸の断片でありうる低分子量の化合物を含んでもよくまたは代謝産物を含んでもよい。代謝産物などの低分子量化合物の存在または濃度は、敗血症および／またはSIRSに関係する表現型の変化を反映しうる。特に、小分子バイオマーカーの濃度の変化は細胞代謝産物の変化に関係しうるのであって、この変化はSIRSおよび／または敗血症に反応するいずれかの生理学的変化、例えば低体温または高熱症、心拍数または呼吸数の増加、組織低酸素血症、代謝性アシドーシスまたはMODの結果として起こる。バイオマーカーはまた、タンパク質バイオマーカーをコードするRNAおよびDNA分子を含みうる。
【００６３】
バイオマーカーはまた、白血球モジュレーション、例えば好中球活性化または単球非活性化に関わる少なくとも１つの分子を含んでもよい。CD64およびCD11bの発現の増加は、好中球および単球活性化のサインとして認識されている（Oberholzerら（前掲）およびVincentら（前掲）の総括を参照）。本発明に有用でありうるこれらのバイオマーカーの中には、マクロファージ溶解産物に関係があるバイオマーカー、ならびにサイトカイン代謝の変化のマーカーがある（Gagnonら, Cell 110:119-31 (2002)；Oberholzerら（前掲）；Vincentら（前掲）を参照）。
【００６４】
バイオマーカーはまた、炎症プロセスに関わることが公知のまたは関わることが見出されているシグナル伝達因子も含みうる。シグナル伝達因子は事象の細胞内カスケードを開始することができ、それらの事象としては受容体結合、受容体活性化、細胞内キナーゼの活性化、転写因子の活性化、遺伝子転写および／または翻訳のレベルの変化、ならびに代謝プロセスの変化などが挙げられる。シグナル伝達分子およびこれらの分子により活性化されるプロセスをまとめて、本発明の目的のために「敗血症経路に関わる生物分子」と定義する。関係する予測性バイオマーカーは敗血症経路に関わる生物分子を含みうる。
【００６５】
従って、本発明の方法は予測性バイオマーカーを同定するための偏りのない（unbiased）手法を利用しうる一方、当業者には、生理学的反応にまたは様々なシグナル伝達経路と関係がある特定のバイオマーカーのグループが特に関心の対象となることは明らかであろう。これに特に該当するのは、生物学的サンプルからのバイオマーカーを、様々なバイオマーカーの量をバイオマーカーとの直接および特異的相互作用を介して測定するために利用しうるアレイ（例えば、抗体アレイまたは核酸アレイ）と接触させる場合である。この場合、アレイの成分の選択は、ある特定の経路が個体における敗血症またはSIRSの状態の決定に関連するという示唆に基づくことができる。ある特定の生物分子が敗血症またはSIRSの予測または診断に関わるという特性を有するという指標から、一致した様式で生理学的に同様に調節される他の生物分子が予測または診断特性を提供しうるという予想が生じうる。しかし、当業者は、かかる予想は、生物学的系が複雑であるために現実的でないことを理解するであろう。例えば、もしある特定のmRNAバイオマーカーの量が予測特性であったとしても、もし他のバイオマーカーの発現が転写後レベルで調節されれば、他のバイオマーカーのmRNA発現における一致した変化は測定できないであろう。さらに、バイオマーカーのmRNA発現レベルは、敗血症に対する生理学的反応に関わるかまたは関わらない多重の収斂する経路の影響を受けうる。
【００６６】
バイオマーカーはいずれの生物学的サンプルから得てもよく、それらは、例示であって限定するものではないが、血液、血漿、唾液、血清、尿、大脳脊髄液、痰、糞便、細胞および細胞抽出物、または他の生物学的液体サンプル、組織サンプル、または宿主もしくは患者からの組織生検サンプルであってもよい。個体から採取される正確な生物学的サンプルは様々でありうるが、サンプリングは最小限に侵襲性であって通常技術により容易に実施しうることが好ましい。
【００６７】
表現型変化の測定はいずれの通常技術により実施してもよい。体温、呼吸数、脈拍、血圧または他の生理学的パラメーターの測定は、臨床における観察および測定を介して実施することができる。バイオマーカー分子の測定値は、例えば、その存在、濃度、発現レベルを示す測定値、またはバイオマーカー分子と関係があるいずれか他の値を含むことができる。バイオマーカー分子の検出の形態は、典型的には、生物学的サンプルからこれらのバイオマーカーのプロファイルを作るために利用する方法に依存する。例えば、2D-PAGEにより分離されたバイオマーカーはクーマシーブルー染色によりまたは銀染色により検出し、これらの方法は当技術分野で十分に確立されている。
【００６８】
有用なバイオマーカーの単離
有用なバイオマーカーとして、未だ同定されてないまたは関連生理学的状態と関係があるバイオマーカーがありうると予想される。本発明の一態様においては、有用なバイオマーカーを、生物学的サンプルからのバイオマーカープロファイルの成分として同定する。かかる同定は、イムノアッセイまたは自動化されたミクロ配列決定法を含む当技術分野で周知の方法により行うことができる。
【００６９】
一旦、有用なバイオマーカーが確認されると、そのバイオマーカーを、多数の周知の単離方法の１つにより単離することができる。従って、本発明は、敗血症を診断または予測するバイオマーカーを単離する方法であって、個体の集団から得た参照バイオマーカープロファイルを得るステップ、敗血症または敗血症進行段階の１つを診断または予測する参照バイオマーカープロファイルの特性を同定するステップ、その特性と対応するバイオマーカーを同定するステップ、およびそのバイオマーカーを単離するステップを含むものである上記方法を提供する。一旦、単離すると、例えば、もしそれがタンパク質であれば、そのバイオマーカーを用いてバイオマーカーと結合する抗体を産生させることができるしまたはもしそれが核酸であれば、それを用いて特異的なオリゴヌクレオチドプローブを開発することができる。
【００７０】
当業者は、有用な特性をさらに特徴付けてそのバイオマーカーの分子構造を決定できることを容易に理解するであろう。生物分子をこのやり方で特徴づける方法は当技術分野で周知であり、高分解質量分析法、赤外分光法、紫外分光法および核磁気共鳴を含む。核酸バイオマーカーのヌクレオチド配列、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列、および炭水化物バイオマーカーの組成および配列を決定する方法も当技術分野では周知である。
【００７１】
本発明のSIRS患者への応用
一実施形態においては、本明細書に記載した方法を用いて、特に敗血症を発生するリスクのあるSIRS患者をスクリーニングする。生物学的サンプルをSIRS陽性患者から採取し、そしてサンプルのバイオマーカーのプロファイルを、最終的に敗血症に進行したSIRS陽性個体からの参照プロファイルと比較する。患者のバイオマーカープロファイルの対応する敗血症に進行したSIRS陽性集団の参照プロファイルへの分類は、SIRS陽性患者が同様に敗血症に進行しうると診断することになる。次いで、治療体制を開始して敗血症の進行に先手を打つかまたは防止することができる。
【００７２】
他の実施形態においては、本明細書に記載の方法を用いて、ある患者がSIRSを有する臨床上の疑いを確認する。この場合、サンプル中のバイオマーカーのプロファイルを、SIRSを有するかまたはSIRSを有しない個体の参照集団と比較する。次いで、患者のバイオマーカープロファイルの対応する一集団または他の集団への分類を用いて、SIRSを有するかまたはSIRSを有しない個体を診断することができる。
【００７３】
実施例
次の実施例は、本発明が包含する実施形態の代表例であり、決して本発明が包含する対象を限定するものではない。
【００７４】
実施例１：定量的液体クロマトグラフィ／エレクトロスプレーイオン化質量分析計（LC/ESI-MS）を用いる、小分子バイオマーカーの同定
1.1. 受領して分析したサンプル
参照バイオマーカープロファイルを患者の２つの集団に対して確立した。第１集団（「SIRSグループ」）は、SIRSを発生しかつ「第１日」に本研究に入ったが、彼らの入院中に敗血症へ進行しなかった20人の患者である。第２集団（「敗血症グループ」）は、同様にSIRSを発生しかつ「第１日」に本研究に入ったが、本研究に入った後、少なくとも数日で敗血症へ進行した20人の患者である。血液サンプルを毎24時間、それぞれの研究グループから採取した。敗血症グループにおける敗血症の臨床上の疑いは、通常技術によって「時点0」に起こった。「時点−24時間」および「時点−48時間」は、敗血症グループにおいて敗血症発症の臨床的疑いに先立つそれぞれほぼ24時間前の時点およびほぼ48時間前の時点を表す。すなわち、敗血症グループからのサンプルは、研究に入った日（第１日）、敗血症の臨床的疑いに先立つほぼ48時間前（時点−48時間）、敗血症の臨床的疑いに先立つほぼ24時間前（時点−24時間）、ならびに敗血症発症の臨床的疑いの日（時点0）に採取したサンプルを含むものである。全部で160件の血液サンプル（20人の敗血症患者からのサンプル80件および20人のSIRS患者からのサンプル80件）を分析した。
【００７５】
1.2. サンプル調製
血漿中では、相当な数の小分子がタンパク質と結合して、パターン作製法により検出される小分子の数を減少しうる。従って、タンパク質と結合しうる小分子を遊離した後、ほとんどのタンパク質を血漿サンプルから除去した。タンパク質を除去する適当な方法は、限定されるものでないが、氷冷メタノール、アセトニトリル（ACN）、ブタノール、またはトリクロロ酢酸（TCA）、または熱変性および酸加水分解を含む。この実施例においては、血漿を氷冷メタノールを用いて抽出した。メタノール抽出が好ましいのは、小分子の最高数の検出を得たからである。各血漿サンプルからの50μLを、100μLの氷冷100％メタノールと混合して、最終容積百分率67％のメタノールを得た。その溶液を60秒間攪拌した。次いでサンプルを4℃にて20分間インキュベートし、そしてタンパク質を12,000rpmにおける遠心分離により10分間沈降させた。上清を取除いて乾燥し、そして50μLの水中に再懸濁した。LC/MS分析の前に、抽出した血漿サンプルに２種の低分子量分子、スルファクロロピリダジンおよびオクタデシルアミンを加えた。これらの分子はイオン強度および滞留時間を正規化する内部標準として役立った。スルファクロロピリダジンはMSにより決定して285.0 Daのm/zを有しかつLCにより決定して44％ACNにて溶出し；オクタデシルアミンは270.3 Daのm/zを有しかつ89％ACNにて溶出する。
【００７６】
1.3. LC/ESI-MS分析
再懸濁した上清の10μLを、2.1x100mm C18 Waters Symmetry LCカラム（粒径＝3.5μm；内孔径＝100Å）上に注入した。次いでカラムを300μL/分で温度25℃にて0.1％ギ酸中のACNの３段階直線勾配を用いて溶出した。t＝0〜0.5分の間、ACN濃度は9.75％〜24％であり；t＝0.5〜20分の間、ACN濃度は24％〜90.5％であり；t＝20〜27分の間、ACN濃度は90.5％〜92.4％であった。本明細書において上述の実験条件を「LC実験条件」と呼ぶ。LC実験条件のもとで、スルファクロロピリダジンは44％ACNで6.4分間の滞留時間にて溶出し、そしてオクタデシルアミンは89％ACNで14.5分間の滞留時間にて溶出した。次いでLCにより分画したサンプルを、直列でLCカラムに接続したAgilent MSD 1100四重極質量分析計（LC/ESI-MS）を用いてESI-MS処理にかけた。質量／電荷比（m/z）100または150〜1000 Daの範囲のイオンに対して、陽イオンモードにてキャピラリー電圧4000Vで質量分析データを得た。LC/ESI-MS分析をそれぞれのサンプルに対して３回実施した。データはそれぞれのイオンのm/z（ダルトン）と滞留時間（分）で（「m/z、滞留時間」で）表すことができて、ここでイオンの滞留時間は、直線ACN勾配の逆相カラムからの溶出に必要な時間である。しかし、ラン毎の滞留時間の僅かな変動を説明するために、データはまた、m/zとイオンがC18カラムから溶出するときのACN百分率（これは実験の可変性による大きく影響を受けないであろうイオンの固有物性を表す）で（「m/z、ACN百分率」で）表現することもできる。溶出時の滞留時間とACN百分率の間の関係は、次式：
0＜t＜0.5に対して、％ACN＝28.5t＋9.75；
0.5＜t＜20に対して、％ACN＝3.4103(t−0.5)＋24；および
20＜t＜27に対して、％ACN＝0.27143(t−20)＋90.5；
によって表現される。
【００７７】
これらのパラメーターに対する値は、それでもなお近似値であって実験の間で僅かに変動しうると理解すべきである；しかし、特に、もしそのサンプルを１以上の内部標準を用いて調製すれば、イオンは再現性があると認識することができる。以下に示したデータにおいて、m/z値は±0.4m/z以内で測定した一方、イオンが溶出するACN百分率は±10％以内で測定した。
【００７８】
1.4. データ解析と結果
数百のスペクトルの特性をそれぞれの血漿サンプルから分析した。類似の特性をスペクトルの間でアラインメントした。アラインメントアルゴリズムの選択は、本発明にとって重要でなく、当業者はこの目的に利用しうる様々なアラインメントアルゴリズムを知っている。全部で4930種の分光特性を分析した。この実施例の目的に対して、用語「特性」は、ある特定のイオンに対応する「ピーク」と互換的に使用する。異なる５個体から得たサンプルの代表的なピークを表１に示す。第１列は、括弧内に、m/zと各イオン溶出時のACN百分率をそれぞれ掲げた。残りの列は、それぞれの患者からの対応するイオンの正規化強度であり、これらは２つの内部標準の強度に対してその強度を正規化することにより決定した。400種を超えるピークが0.1より高い平均正規化強度を有した。
【表１】
【００７９】
様々な手法を用いて、SIRSと敗血症グループの間を識別する決定ルールの情報を与えるイオンを同定することができる。この実施例において選んだ方法は、(1)２つのグループの間の平均イオン強度を比較する方法、および(2)データ解析アルゴリズムを用いて分類ツリーを作製する方法である。
【００８０】
1.4.1. 平均イオン強度の比較
平均イオン強度の比較は、SIRSと敗血症患者の間の個々のイオン強度の差を効果的に強調する。1800を越える正規化イオン強度を、敗血症グループとSIRSグループに対して別々に平均した。敗血症グループまたはSIRSグループのいずれかで0.1より低い平均正規化強度を有するイオンは、両グループからのプロファイル中で0.1より大きい正規化強度を有するこれらのイオンとは分離して分析した。0.1より大きい正規化強度を有するほぼ400種のイオンについて、平均正規化強度の敗血症グループ対SIRSグループの比を決定した。これらのイオンの相対強度比の分布を図３に示す。
【００８１】
この方法を用いて、表２に掲げた23イオンが敗血症の患者からのサンプル中でSIRSの患者より少なくとも３倍高い強度を提示すること（例えば図３を参照、ここでイオン強度比の自然対数はほぼ1.1より大きい）、ならびに敗血症の患者の少なくとも半分にそして一般的にSIRSを有する患者のほぼ３分の１〜４分の１に存在することが観察された。この文脈において、バイオマーカーの「存在」は、ある特定の患者におけるバイオマーカーの平均正規化強度が患者全体で平均した正規化強度の少なくとも25％であったことを意味する。これらのイオン、またはそのサブセットが本発明の方法を実施するために有用である一方、さらなるイオンまたは他のイオンのセットも同様に有用でありうる。
【表２】
【００８２】
【００８３】
これらのバイオマーカーのサブセットは、大多数の敗血症陽性集団中で少なくとも３倍高い強度にて存在した。具体的には、これらのバイオマーカーの少なくとも12種は半分を超える敗血症陽性集団において上昇したレベルで見出され、かつ少なくとも７種のバイオマーカーは敗血症陽性集団の85％において存在し、この事はこれらのマーカーの組合わせが敗血症発症の有用な予測因子を提供しうることを示す。全てのバイオマーカーは、表３に示すように、SIRS陽性集団と対比して上昇したレベルにあった。
【表３】
【００８４】
【００８５】
表４に掲げた２イオンは、SIRS集団において敗血症集団より３倍高い平均正規化強度を有することが観察された（図３を参照、ここでイオン強度比の自然対数は、ほぼ−1.1より低い）。
【表４】
【００８６】
0.1より大きい平均正規化強度を有しかつ少なくとも３倍高い敗血症グループ対SIRSグループの強度を示す32イオンを同定した。これらのイオンを表5Aに掲げる。同様に、0.1より小さい平均正規化強度を有しかつ少なくとも３倍高い敗血症グループ対SIRSグループの強度を示す48イオンを同定した。これらのイオンを表5Bに掲げる（負の滞留時間は、滞留時間が内部標準に対するものである事実を反映する）。
【表５Ａ】
【表５Ｂ】
このように、本発明の参照バイオマーカープロファイルは複数の特性の組合わせを含んでなり、上記特性はエレクトロスプレーイオン化質量分析計によりポジティブモードで測定してほぼ100または150Da〜ほぼ1000Daのm/zを有するイオンの強度でありかつ上記特性はほぼ3:1以上の敗血症陽性参照集団対SIRS陽性参照集団の平均正規化強度比を有するものである。あるいは上記特性はほぼ1:3以下の敗血症陽性参照集団対SIRS陽性参照集団の平均正規化強度比を有するものであってもよい。これらのバイオマーカーは、敗血症の発症に先立つほぼ48時間前に採取した生物学的サンプルから、通常技術により測定して得たバイオマーカープロファイル中に出現するので、敗血症の発症の予測因子であると考えられる。
【００８７】
1.4.2. 特性強度の経時変化
試験したバイオマーカープロファイルは、個体が敗血症の発症へ進行するとともに、一層より高いレベルで発現される特性と一層より低いレベルで発現される特性を提示した。これらの特性に対応するバイオマーカーは個体の感染および／または炎症に対する生物学的反応を特徴づけると考えられる。以上述べた理由により、これらのバイオマーカーは、個体における敗血症またはSIRSの状態を決定するための特に有用な予測因子を提供しうると考えられる。すなわち、ある個体由来の色々な生物学的サンプルから得たプロファイルにおけるこれらの特性の比較は、個体が重症敗血症へ進行しつつあるかどうかまたはSIRSが正常へ進行しつつあるかどうかを確立すると考えられる。
【００８８】
表２に掲げた23イオンのうち、14イオンは時点−48時間集団において最高強度を示し、８イオンは時点−24時間集団において最高強度を示し、そして１イオンは時点0集団において最高強度を示した。敗血症グループからの生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの強度の代表的な経時変化を図4Aに示すとともに、SIRSグループからの生物学的サンプルにおける同じバイオマーカーの強度の代表的な経時変化を図4Bに示す。437.2Daのm/zおよび1.42分の滞留時間を有するこの特定のイオンは、敗血症グループにおいて、通常技術により診断して、これらの患者の敗血症への変換に先立つ48時間前に強度のピークを示す。従って、生物学的サンプル中のこのイオンの相対強度のピークは、その個体におけるほぼ48時間以内の敗血症発症の予測因子として役立つ。
【００８９】
1.4.3. 交差検定（Cross-Validation）
決定ルールが、比較的少数のバイオマーカープロファイルからの多数の特性に基づくとき、選択偏差が決定ルールの情報を与える特性の同定に影響を与えうる（Ambroiseら, Proc. Net'l Acad. Sci. USA 99:6562-66 (2002)を参照）。選択偏差はデータを用いて特性を選択するときに起こりうるので、性能は、選択プロセスにおいて可変性が考慮されなかった選択特性で条件付けして評価される。その結果、分類正確度の過剰評価が起こる。選択基準に対する補償をしないと、分類正確度は決定ルールが無作為入力パラメーターに基づくときですら100％に達しうる（同上）。選択偏差は性能評価プロセスで特性選択を含むことにより避けることができ、その性能評価プロセスは10回交差検定（cross-validation）またはブートストラップ手続き（bootstrap procedure）のいずれのタイプであってもよい（例えばHastieら（前掲）の7.10-7.11、を参照、これは本明細書に参照により組み入れられる）。
【００９０】
本発明の一実施形態においては、モデル性能を10回交差検定により測定する。10回交差検定はデータを無作為に10の排他的グループに分配することにより実施する。それぞれのグループを順に排除して、モデルを残る９グループに適合させる。適合させたモデルを排除したグループに適用し、予測クラスされる確率を作る。単に予測クラスを作製することにより、予測されるクラス確率を実際のクラスメンバーシップと比較することができる。例えば、もし敗血症の確率がおよそ0.5より大きければ、予測クラスは敗血症となる。
【００９１】
デビアンス（deviance）は確率を実際の結果と比較する尺度である。本明細書に用いる「デビアンス」は：
-2{Σln(P(敗血症))（敗血症事例に対する和）＋Σln(P(SIRS))（SIRS事例に対する和）}
［式中、Pは規定したクラスに対するクラス確率である］
として定義される。実クラスに対するクラス確率が高いときは、デビアンスが最小化される。２つのモデルは所与のデータに対して同じ予測をなしうるが、好ましいモデルはより小さい予測デビアンスを有する。10回交差検定における10回の反復のそれぞれに対して、その反復中にモデル適合から外された事例について予測デビアンスを計算する。その結果として10個の不偏デビアンスを得る。典型的には、これらの10個のデビアンスを合計して全データセットについてのモデル性能の総括（すなわち、正確度）を作製する。実際には、異なる10個のモデルを適合させたので、交差検定はある特定モデルの性能を証明しない。どちらかといえば、10個のモデルを共通のモデル化プロセスにより作製し、交差検定はこのプロセスの性能を証明した。このプロセスから生じる第11番目のモデルは恐らく最初の10個のモデルと類似した予測性能を有しうる。10回交差検定の利用によって、100％未満のモデル性能を得るが、10回交差検定後に得た性能は、訓練セット以外のサンプルから得たバイオマーカープロファイルに応用する場合、生理学的に意味のある決定ルールの予測正確度をより厳密に反映すると予想される。
【００９２】
1.4.4. 分類ツリー分析
このデータを分析する１つの手法は、大きいデータセット中のパターンおよび関係を検索する分類ツリーアルゴリズムを利用する手法である。「分類ツリー」は、患者をクラスの１つに正確に配置するように設計した一連の質問を用いて、ある特定の患者を特定のクラス（例えば、敗血症またはSIRS）に分類する再帰的配分（recursive partition）である。それぞれの質問は、患者の症状が所与の予測因子を満たすかどうかを訊ね、それぞれの答えを利用して分類ツリーを下って利用者を手引きし、最後に患者があてはまるクラスを決定することができる。本明細書で用いる「予測因子（predictor）」は、特徴的なm/zとACN中のC18カラムからの溶出プロファイルを有する１つのイオンの特性（この実施例ではイオン強度）の値の範囲である。「状態（condition）」は、個体のバイオマーカープロファイル中の測定された特性の単一の特定値である。この実施例において、「クラス名」は敗血症およびSIRSである。従って、分類ツリー利用者は最初に、個体のバイオマーカープロファイル中の測定された第１イオン強度が第１イオンの予測範囲の所与の範囲内に入るかどうかを訊ねるであろう。第１質問に対する答えは、個体がSIRSまたは敗血症を有するかどうかを決定する手掛かりになりうる。それに対して、第１質問に対する答えはさらに利用者が個体のバイオマーカープロファイルの測定した第２イオン強度が第２イオンの予測範囲の所与の範囲内に入るかどうかを訊ねるように仕向けてもよい。再び、第２質問に対する答えは手掛かりになるかもしれないし、または、最終的に患者分類の決定するまでさらに分類ツリーを下るように仕向けるかもしれない。
【００９３】
敗血症およびSIRS集団から時点0で採取したイオン強度の代表的セットを、分類ツリーアルゴリズムを用いて分析し、そしてその結果を図５に示す。この場合、分析したイオンのセットは、0.1未満の正規化強度をもつイオンのセットを含んだ。分類ツリーにおける第１決定点は、ほぼ448.5ダルトンのm/zおよびほぼ32.4％の溶出時ACNを有するイオンがほぼ0.0414より低い正規化濃度を有するかどうかである。もしその質問に対する答えが「イエス」であれば、次いで左分枝を下って他の質問またはあるクラス名へ進む。この事例では、もし正規化強度がほぼ0.0414より低ければ、次いで「SIRS」のクラス名へ進んで、個体はSIRS陽性であるが敗血症陰性として分類される。もしその答えが「ノー」であれば、次いで右分枝を下って次の決定点へ進み、そのようにして、クラス名に到達するまで進む。この実施例では、３つの決定点を用いて個体のクラス名を予測した。患者をSIRSまたは敗血症陽性として分類するためには単一の決定点を用いてもよいが、他のイオンを用いるさらなる決定点は一般的に分類の正確度を改良した。当業者は、多数の異なる分類ツリーが大きなデータセットから可能であることを理解するであろう。すなわち、例えば、個体をSIRS集団または敗血症集団に属するとして分類するために利用しうるバイオマーカーの多数の組合わせがある。
【００９４】
1.4.5. 多重追加回帰ツリー
多重追加回帰ツリー（MART）を用いる自動、フレキシブルモデル技術を利用して、特性のセットを２つの集団の１つに属するとして分類した。MARTモデルは、全ての予測に適用する定数を規定する初期オフセットを使い、続いて一連の回帰ツリーを用いる。その適合（fitting）は、それぞれのツリーの決定点の数、適合させるツリーの数、およびある特定のツリーがいかに根本的にMARTモデルに影響を与えうるかを規定する「グラニュラリティ定数（granularity constant）」により規定する。それぞれの繰返しに対して、回帰ツリーを適合させて適合判定基準の最も険しい下降方向を求める。その方向に、グラニュラリティ定数により規定した長さを有する１ステップを進める。従って、MARTモデルは「初期オフセット」＋「回帰ツリーが与えるステップ」から構成される。観察値と予測値の間の差を再計算し、そしてサイクルを再び進めて、予測を漸進的に洗練させる。このプロセスを、予め定めたサイクル数またはある停止ルールが作動するまで続ける。
【００９５】
それぞれのツリー中の分岐の数は特に意味のある適合パラメーターである。もしそれぞれのツリーが１つの分岐しか有しなければ、モデルは１つの特性しか見ず、２つの予測因子を組合わせることができない。もしそれぞれのツリーが２つの分岐を有すれば、モデルは特性間の二通りの相互作用に適応させることができる。３つのツリーを用いると、モデルは三通りの相互作用に適応させることができるという具合である。
【００９６】
クラス状態を予測する特性のセットの値を、特性および既知のクラス状態（例えば、敗血症またはSIRS）についてのデータセットを用いて決定した。MARTは、個体特性の分類決定ルールに対する寄与または重要度の尺度を与える。具体的には、ある単一の特性が所与のツリー分岐におけるその選択時に決定ルールに寄与する度合いを測定し、特性の格付けを、最終決定ルールを決定する上でのそれらの重要度により与えることができる。MART分析を同じデータセットについて繰返すと、特に決定ルールを確立するのに重要度の低い特性について、若干異なる特性の格付けを生じうる。従って、本発明に有用である予測特性とその対応するバイオマーカーのセットは、本明細書に記載したものから若干変化しうる。
【００９７】
MART技術の１つの実行例は、R統計プログラミング環境に対するモジュール、または「パッケージ」に見出される（Venablesら, 「Sを用いる現代応用統計学（Modern Applied Statistics with S）」, 第4版. (Springer, 2002)；www.r-project.orgを参照）。この文書に報じられた結果を、Rバージョン1.7.0および1.7.1を用いて計算した。Dr. Greg Ridgewayが記載したMARTを実行するモジュールは「gbm」と呼ばれるもので、自由にダウンロードもできる（www.r-project.orgを参照）。MARTアルゴリズムは10回交差検定に受け入れられる。グラニュラリティパラメーターを0.05にセットし、gbmパッケージの内部停止ルールはそれぞれのマークした反復においてデータ事例の20％を残すことに基づいた。相互作用の程度は１に設定したので、特性間の相互作用は考慮されなかった。gbmパッケージは、それぞれの特性の相対的重要度を、バイオマーカープロファイルの全特性に対して累積すると100％に等しくなる百分率ベースで評価する。一緒になって全重要度の少なくとも90％に当たる最高の重要度をもつ特性群を、潜在的に予測価値を有すると報じた。全てのMARTモデルの適合の停止ルールは、適合および特性選択をモデル化する確率的要素に影響する点を注意すること。従って、同じデータに基づく多重MARTモデリング実施の結果が、特性の僅かに異なる、または場合によってはさらに、完全に異なる特性のセットを選ぶことがありうる。かかる異なるセットは同じ予測情報を運ぶものであり；従って、全てのセットが本発明に有用である。MARTモデルを十分な回数だけ適合させると、バイオマーカープロファイル内の全ての可能な予測特性のセットを作ると考えられる。従って、開示した予測因子のセットは、個体を集団に分類するために利用しうる特性のセットを単に代表するものである。
【００９８】
1.4.6. ロジスティック回帰分析
ロジスティック回帰はさらに、上記のLC/MS分析からのデータストリームを解析する他の手法を与える。「ピーク強度」を、スペクトルの所与のm/z位置に現れるピークの高さによって測定する。所与のm/z位置にピークが不在であるときは、「0」のピーク強度を割付ける。次いで、所与のm/zからのピーク強度の標準偏差（SD）を、組合わせたSIRSと敗血症の集団のスペクトルから得る。もしSIRSと敗血症集団の間でピーク強度の変化がなければ（すなわち、SD＝0であれば）、そのピーク強度はさらに考慮しない。回帰分析の前に、当技術分野で周知の方法を用いてピーク強度をスケール変換（scale）する。スケール変換アルゴリズムは一般的にHastieら（前掲、第11章）に記載されている。
【００９９】
この特性選択方法により時点0のバイオマーカープロファイルから26個の入力パラメーター（すなわち、バイオマーカー）を同定し、表６に掲げた。入力パラメーターを統計的重要度の順に格付けしたが、低い格付けの入力パラメーターでもなお臨床的に価値がありかつ本発明にとって有用でありうる。さらに、当業者は、所与の入力パラメーターの格付け重要度は、もしその参照集団が多少なりとも変われば変わりうることを理解するであろう。
【表６】
【０１００】
この同じロジスティック回帰分析を利用し、時点−48時間に採取したサンプルを使って、敗血症の発症を予測する重要度の順にバイオマーカーを格付けすることができる。特性選択プロセスにより、表７に示した時点−48時間サンプルに対する37個の入力パラメーターを得た。
【表７】
【０１０１】
1.4.7. Wilcoxon符号付順位検定分析
さらに他の方法においては、ノンパラメトリック検定、例えばWilcoxon符号付順位検定を用いて目的の個体バイオマーカーを同定することができる。バイオマーカープロファイル中の特性に、バイオマーカーが個体をある特定参照集団に属するとして分類できる確度を示す「p値」を割付ける。一般的に、予測価値を有するp値はほぼ0.05より低い。低いp値を有するバイオマーカーを用いて、それ自体により個体を分類することができる。あるいは、２種以上のバイオマーカーの組合わせを用いて個体を分類し、これらのバイオマーカーは相対的p値に基づいて選んでもよい。一般的に、より低いp値をもつバイオマーカーが所与のバイオマーカーの組合わせとして好ましい。このやり方で、少なくとも３、４、５、６、10、20または30種以上のバイオマーカーの組合わせを用いて個体を分類することもできる。当業者は、いずれの所与のバイオマーカーの相対的p値も、その参照集団のサイズに依存して変化しうることを理解するであろう。
【０１０２】
Wilcoxon符号付順位検定を用いて、p値を時点0、時点−24時間および時点−48時間に採取した生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルからの特性に割付けた。
【０１０３】
これらのp値を表８、９および10にそれぞれ掲げた。
【表８】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
あるいは、ノンパラメトリック検定（例えば、Wilcoxon符号付順位検定）を用いて、敗血症へ進行しつつある集団における特性の漸進的出現および消滅に基づく特性に対するp値を見出すことができる。この検定の形態においては、所与の特性に対する基線値を、敗血症およびSIRSグループに対する研究に入る時間からのデータ（第１日サンプル）を用いて、最初に測定する。次いで敗血症とSIRSサンプルの特性強度を、例えば、時点−48時間サンプルと比較して、特性強度がその基線値から増加するかまたは減少するかどうかを決定する。最後に、p値を、敗血症集団対SIRS集団における特性強度の基線からの差に割付ける。次の表11〜13に掲げたp値は、これらの基線からの差をp値で測定して得たものである。
【表１１】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【表１２】
【０１１８】
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
実施例２：定量的液体クロマトグラフィ-質量分析計／質量分析計（LC-MS/MS）を用いるタンパク質バイオマーカーの同定
2.1. 受領して分析したサンプル
上記のように、参照バイオマーカープロファイルを、第１集団を表す15患者（「SIRSグループ」）およびSIRSを発生して敗血症へ進行した第２集団を表す15患者（「敗血症グループ」）から得た。血液を患者から第１日、時点0、および時点−48時間に採取した。この場合、患者からの50〜75μL血漿サンプルを４バッチ：すなわちSIRS陽性であった５個体および10個体の２バッチ、ならびに敗血症陽性であった５個体および10個体の２バッチにプールした。それぞれのプールしたバッチからさらに６サンプルを分析した。
【０１２３】
2.2. サンプル調製
血漿サンプルを最初に免疫枯渇させて豊富なタンパク質、特に、一緒にサンプル中のタンパク質のほぼ85％（wt％）を構成するアルブミン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、アンチトリプシン、IgG、およびIgAを除去した。免疫枯渇は、Multiple Affinity Removal System（多重アフィニティ除去システム）カラム（Agilent Technologies, Palo Alto, California）を用いて実施し、製造業者の指示書に従って使用した。上記６タンパク質の少なくとも95％を、血漿サンプルからこのシステムを用いて除去した。例えば、わずかほぼ0.1％のアルブミンしか枯渇したサンプル中に残らなかった。サンプル中に残ったわずか8％と見積られるタンパク質にはIgMおよびα-2マクログロブリンなどのタンパク質が高存在量で残存した。次いで分画した血漿サンプルを変性し、還元し、アルキル化し、そしてトリプシンを用いて、当技術分野で周知の方法を使って消化した。ほぼ2mgの消化したタンパク質をそれぞれのプールしたサンプルから得た。
【０１２４】
2.3. 多次元LC/MS
トリプシン消化後のペプチドを次いでLCカラムを用いて分画し、LC/MS/MS配置で構成したAgilent MSD/トラップESI-イオントラップ質量分析計より分析した。消化したタンパク質の1mgを10μL/分でミクロフローC18逆相（RP1）カラムにアプライした。RP1カラムを直列で強カチオン交換（SCX）分画カラムに、そしてこれを順にC18逆相トラップカラムに結合した。サンプルを0〜10％ACNの第１勾配でRP1カラムにアプライして、ペプチドをRP1カラム上で分画した。ACN勾配に続いて10mM塩バッファー溶出を行い、そしてさらにそのペプチドをSCXカラムと結合する画分と溶出画分に分画し、そして溶出画分はトラップカラム中に固定した。次いで、トラップカラムを、SCXカラムとのその操作しうる接続部から取り外し、他のC18逆相カラム（RP2）との操作しうる接続部に接続した。トラップカラム中に固定された画分をトラップカラムからRP2カラムへ0〜10％ACNの勾配により300nL/分にて溶出した。RP2カラムを、1000〜1500Vのスプレー電圧で操作しているAgilent MSD/トラップESI-イオントラップ質量分析計と操作しうる形で連結した。次いで、このサイクル（RPl-SCX-トラップ-RP2）を繰返して、残りのペプチドを0〜80％の全ACN％範囲および1Mまでの塩濃度を用いて分画しかつ分離した。他の好適なLC/MS/MSの配置構成を用いて、本発明に有用であるバイオマーカープロファイルを作製してもよい。質量スペクトルは200〜2200Daのm/z範囲で作製した。データに依存するスキャンと動的排除を適用してより高い動的範囲を達成した。図６はLC/MSおよびLC/MS/MSを用いて作製した代表的なバイオマーカープロファイルを示す。
【０１２５】
2.4. データ解析と結果
MS/MSモードで分析した全てのサンプルに対してほぼ150,000件のスペクトルを得たが、これはほぼ1.5ギガバイトの情報と等価であった。全体で、ほぼ50ギガバイトの情報を収集した。スペクトルは、Spectrum Mill v 2.7ソフトウエア（著作権、2003 Agilent Technologies, Inc.）を用いて分析した。MS-タグデータベース検索アルゴリズム（Millennium Pharmaceuticals）を用いて、MS/MSスペクトルを、ヒトの非重複（human non-redundant）タンパク質の米国国立生物技術情報センター（National Center for Biotechnology Information；NCBI）データベースと対合した。95％信頼度と等価のカットオフスコアを用いて、対合したペプチドを実証し、次いでこれをアセンブルしてサンプル中に存在するタンパク質を同定した。本方法を用いて検出可能であったタンパク質は血漿中にほぼ1ng/mLの濃度で存在し、ほぼ６のオーダーの量の血漿濃度の動的範囲をカバーする。
【０１２６】
血漿中に検出されたタンパク質の存在量の半定量的評価は、タンパク質に対して「ポジティブ」である質量スペクトルの数を決定することによって得た。ポジティブであるためには、イオン特性はスペクトル中の所与のm/z値において、検出しうるだけノイズより高い強度を有する。一般的に、血漿中でより高いレベルで発現されるタンパク質は、より多くのスペクトル中のポジティブなイオン特性またはイオン特性のセットとして検出可能であろう。このタンパク質濃度の尺度を用いて、様々なタンパク質が、SIRSグループ対敗血症グループで示差的に発現されることは明らかである。「上方調節された」検出タンパク質のうちの様々なタンパク質を図7Aおよび7Bに示したが、ここで上方調節されたタンパク質は敗血症グループにおいてSIRSグループより高いレベルで発現されたものである。図7Aから、タンパク質が発現されるレベルは経時的に、図４に示した#21（437.2Da、1.42分）と同じ様式で変化しうる。例えば、共にセリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビターに構造的に類似しているGenBank受託番号AAH15642およびNP000286を有するタンパク質は、経時的に敗血症陽性集団中で漸進的により高いレベルにて発現される一方、これらはSIRS陽性集団中では比較的一定量だけ発現される。これらのタンパク質の高レベルの出現、そして特に個体における経時的に漸進的なより高い発現は、これらが敗血症発症の予測因子であることを予想させる。敗血症陽性集団において経時的に下方調節された様々なタンパク質を、図8Aおよび8Bに示した。タンパク質のいくつか、例えばGenBank受託番号NP_079216に示される配列を有する無名のタンパク質の発現は、その発現が敗血症患者において減少しても、SIRS患者においては漸進的に増加するか比較的高いレベルに留まる。これらのタンパク質は、SIRSを診断するだけでなく敗血症の発症を予測するのにも特に有用なバイオマーカーでありうることを予想させる。
【０１２７】
実施例３：抗体アレイを利用するバイオマーカーの同定
3.1. 受領して分析したサンプル
参照バイオマーカープロファイルを、SIRSグループおよび敗血症グループに対して確立した。血液サンプルをそれぞれの研究グループから24時間毎に採取した。敗血症グループからのサンプルは、研究に入った日（第１日）、敗血症の臨床的疑いに先立つほぼ48時間前（時点−48時間）、および敗血症の発症の臨床的疑いの日（時点0）に採取したサンプルを含んだ。この実施例において、時点0で分析したSIRSグループと敗血症グループは14個体および11個体をそれぞれ含む一方、時点−48時間で分析したSIRSグループと敗血症グループは10個体および11個体をそれぞれ含んだ。
【０１２８】
3.2. 多重分析
それぞれのサンプル中のバイオマーカーのセットを米国特許第5,981,180号（「'180特許」）を用いて同時にリアルタイムで分析したが、上記特許は本明細書に参照によりその全て、そして特に一般的技法、ビーズ技術、システムハードウエアおよび抗体検出のその教示が組み入れられる。'180特許に記載のイムノアッセイは、本発明の方法に使用することができるイムノアッセイを代表する。さらに、本明細書に使用されるバイオマーカーは、本発明の方法に使用される利用しうるバイオマーカーの範囲を限定することを意味するものでない。この分析のために、色々な微粒子のセットから構成される微粒子のマトリックスを合成した。それぞれの微粒子のセットは、微粒子表面上に固定された数千種の異なる抗体捕捉試薬分子を有し、２種の蛍光染料の様々な量を組込むことによりカラーコードを付した。２種の蛍光染料の比はそれぞれの微粒子のセットに対して異なる発光スペクトルを提供し、様々な微粒子のセットをプールした後のあるセット内の微粒子の同定を可能にした。米国特許第6,268,222号および第6,599,331号もまた、本明細書に参照によりその全て、そして特に多重分析のための微粒子を標識する様々な方法のそれらの教示が組み入れられる。
【０１２９】
標識したビーズのセットをプールし、研究に用いる個体からの血漿サンプルと組合わせた。標識したビーズは、蛍光体標識を励起するレーザービームによってそれぞれの微粒子を問合せるフローデバイスを通して、単一ファイルを通過させることにより同定した。次いで光学検出器がそれぞれのビーズの発光スペクトルを測定してビーズを適当なセットに分類する。それぞれの微粒子のセットに対するそれぞれの抗体捕捉試薬は同定されているので、それぞれの抗体特異性はフローデバイスを通過する個々の微粒子と対合する。米国特許第6,592,822号もまた、本明細書に参照によりその全て、そして特にこの多重分析に利用しうる多重分析診断システムのその教示が組み入れられる。
【０１３０】
所与の微粒子のセットと結合した分析質の量を決定するために、レポーター分子を加え、レポーター分子がそれぞれの分析質と結合した抗体と複合体を形成するようにした。本実施例において、レポーター分子は蛍光体標識した二次抗体であった。レポーター上の蛍光体は異なる励起波長を有する二次レーザーにより励起され、二次抗体上の蛍光体標識が微粒子を標識するために用いた蛍光体から識別されうるようにする。第２の光学検出器は、捕捉抗体が結合した分析質と複合化した二次抗体上の蛍光体標識からの発光を測定して二次抗体の量を決定した。この方法によって、ビーズに捕捉された多重分析質の量を迅速かつリアルタイムに単一反応で測定することができる。
【０１３１】
3.3. データ解析と結果
それぞれのサンプルに対して、162種の異なる抗体と結合した分析質の濃度を測定した。この実施例においては、それぞれの分析質がバイオマーカーであり、そしてサンプル中のそれぞれの濃度がバイオマーカーの特性であってもよい。バイオマーカーを、Rules Based Medicine of Austin（Texas）から市販される下表14に掲げた様々な162種の抗体試薬について分析した。抗体試薬を、(1)血液の循環タンパク質バイオマーカー成分、(2)様々な病原体に関係がある分子と通常結合する循環抗体（示した通り、それぞれのバイオマーカーに関係がある病原体により同定した）、または(3)様々な病状に関係がある自己抗体バイオマーカーのいずれかと特異的に結合するとして分類した。
【表１４】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
様々な手法を用いて、個体をSIRSまたは敗血症グループに分類するための決定ルールに情報を与える特性を同定することができる。選んだ方法はロジスティック回帰とWilcoxon符号付順位検定である。
【０１３６】
3.3.1. ロジスティック回帰を用いるデータの解析
バイオマーカーイムノアッセイからの定量的結果を、ロジスティック回帰を用いて分析した。時点0の集団に対する、SIRSを敗血症から識別するパターンを含むトップ26のバイオマーカーを表15に掲げる。時点−48時間の集団に対する、SIRSを敗血症から識別するパターンを含むトップ14バイオマーカーを表16に掲げる。表15および16のデータは、SIRSと敗血症グループを識別するパターンを含むこれらのバイオマーカーを実証するものである。
【表１５】
【表１６】
【０１３７】
3.3.2. Wilcoxon符号付順位検定を用いるデータの解析
Wilcoxon符号付順位検定を用いて目的の個体タンパク質バイオマーカーを同定することもできる。表14に掲げたバイオマーカーにp値を、所与の時点における敗血症とSIRS集団の比較により、上記の実施例1.3.7、表８〜10と同じやり方で割付けた。この解析に対して、時点0における敗血症とSIRS集団（表17）はそれぞれ23患者および25患者から構成され；時点−24時間における敗血症とSIRS集団（表18）はそれぞれ25患者および22患者から構成され；そして時点−48時間における敗血症とSIRS集団（表19）はそれぞれ25患者および19患者から構成された。
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【０１３８】
さらに、p値を、敗血症へ進行しつつある集団の特性の漸進的出現または消滅に基づいて、実施例1.4.7、表11〜13と同じやり方で割付けた。この解析に対する集団サイズは、時点−48時間における敗血症とSIRS集団がそれぞれ22患者および18患者から構成されたことを除くと、直ぐ上に示したのと同じであった。
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【０１３９】
3.3.3. 多重適合回帰ツリー（MART）を用いるデータの解析
時点0サンプルから得たタンパク質バイオマーカープロファイルからのデータを、実施例1.4.5に記載のMARTを用いて分析した。この分析において、時点0時間の敗血症集団は23患者から構成されかつSIRS集団は25集団から構成された。表14に掲げた全164種のバイオマーカーに対応する特性を分析した。適合させたモデルは24ツリーを含み、モデルは特性間の相互作用を認めなかった。10回交差検定を用いると、モデルはSIRSの25患者うちの17患者および敗血症の23患者のうちの17患者を正しく分類し、74％のモデル感度と68％の特異性を与えた。バイオマーカーを、モデルにより決定した重要度の順で格付けして表23に掲げた。0の特性は全て除いた。「1」のサインを用いて示したマーカーは、敗血症陽性患者において、敗血症が進行するとともに漸進的により高いレベルで発現したのに対して、「-1」のサインを持つバイオマーカーは漸進的により低いレベルで発現した。
【表２３】
【０１４０】
実施例４ SELDI-TOF-MSを用いるバイオマーカーの同定
4.1. サンプル調製と実験設計
SELDI-TOF-MS（SELDI）はさらに、本発明による、個体における敗血症またはSIRSの状態を決定する他の方法を提供する。SELDIは、生物学的サンプルからのバイオマーカー中の予測特性を同定する不偏的（non-biased）方法を可能にする。サンプルをレーザービームによりイオン化し、イオンのm/zを測定する。次いで様々なイオンを含むバイオマーカープロファイルを、上に記載したアルゴリズムのいずれかにより分析することができる。
【０１４１】
WCX2サンプルプラットフォームまたは「チップ」を用いる代表的なSELDI実験を記載する。各チップのタイプは特徴のあるバイオマーカーを吸収する；従って、同じサンプルから、使用する特定のチップのタイプに依存して色々なバイオマーカープロファイルを得ることができる。PPTTM VacutainerTMチューブ（Becton, Dickinson and Company、Franklin Lakes、New Jersey）中に採集した血液から、通常のプロトコルにより血漿（500μL）を調製した。その血漿を100μLアリコートに分割して-80℃にて保存した。WCX-2チップ（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont、California）を、Ciphergenバイオプロセッサーで製造業者プロトコルに従い、Biomek 2000ロボット（Beckman Coulter）を用いて調製した。１つのWCX-2チップは８箇所の結合スポットを有する。チップ上のスポットを、50％アセトニトリルの50μLによって５分間２回、次いで10mMのHClの50μLによって10分間、そして最後に脱イオン水50μLによって５分間、続けて洗浄した。洗浄の後、チップをWCX2バッファー50μLによって５分間２回条件付けして、その後に血漿サンプルを導入した。WCX-2チップ、ならびにH50、IMACおよびSAX2/Q10チップを含む他のチップタイプに対する洗浄バッファーを表24に記載する。
【表２４】
【０１４２】
条件付けしたWCX-2チップ上のそれぞれのスポットに、血漿サンプル10μLおよびWCX-2結合バッファー（20mM酢酸アンモニウムおよび0.1％Triton X-100、pH 6）90μLを加えた。室温にて30分間振とうしながらインキュベートした後に、スポットを２回、WCX-2結合バッファー100μLにより洗浄し、次いで脱イオン水100μLによって洗浄した。次いでチップを乾燥し、２回、マトリックス材料の飽和溶液、例えば50％アセトニトリル、0.5％TFA水溶液中のα-シアノヒドロキシ桂皮酸（99％）（CHCA）またはシナピン酸（SPA）0.75μLを用いてスポットした。次いで血漿タンパク質が結合したチップを、SELDI-TOF-MSにより表25に示した実験条件を用いて読み取った。
【表２５】
【０１４３】
表26〜49は、表25に示した条件下で血漿サンプルについて実施したSELDI実験に対するp値を示す。それぞれの表中で、示したチップのタイプはWCX-2、H50、Q10またはIMACである。それぞれのチップに対して、CHCAマトリックス、高エネルギーにおけるSPAマトリックス（表25参照）、または低エネルギーにおけるSPAマトリックスで実験を実施した。さらに、それぞれのマトリックスに対して、0時間、時点−24時間、および時点−48時間からのサンプルを分析した。掲げたイオンに対して決定したp値は、ノンパラメトリック検定を用いて（この事例ではWilcoxon符号付順位検定であった）決定した。対応する0.05未満のp値をもつイオンだけを掲げた（以下の表における空白欄は、サンプル中のこれらのイオンが0.05未満のp値を有しないことを示す）。最後に、それぞれのサンプルにおいて、p値を敗血症集団対SIRS集団における特性強度の基線からの差に割付け、これを、（実施例1.4.7.（前掲）のように）「基線からの差としての特性に対するp値」の表題を付した下表に掲げた。表に掲げたm/z値はほぼ2％の実験誤差を有する。
【表２６】
【０１４４】
【０１４５】
【表２７】
【０１４６】
【表２８】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【表２９】
【０１５１】
【０１５２】
【表３０】
【０１５３】
【表３１】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【表３２】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【表３３】
【０１６１】
【０１６２】
【表３４】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【表３５】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【表３６】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【表３７】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【表３８】
【０１７９】
【０１８０】
【表３９】
【０１８１】
【０１８２】
【表４０】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【表４１】
【０１８８】
【表４２】
【０１８９】
【０１９０】
【表４３】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【表４４】
【０１９５】
【表４５】
【０１９６】
【表４６】
【０１９７】
【表４７】
【０１９８】
【０１９９】
【表４８】
【表４９】
【０２００】
【０２０１】
MART分析を、実施例1.4.5.（前掲）に記載のように、表26〜49に掲げたSELDI分析からのデータについて実施した。表50は、２つの時点0サンプルからの、分類の正確度がほぼ60％に適合するかそれを越えるSELDI実験の結果を示す。
【表５０】
【０２０２】
以上、本発明を、ある特定の代表的実施形態を参照して全て説明したが、当業者であれば、本明細書に説明した本発明の精神または範囲から逸脱することなく、改変と修飾を行いうることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】SIRSの敗血症への進行を説明する。敗血症の症状は、少なくとも３段階からなり、敗血症患者は重症敗血症から敗血症ショックへそして多臓器不全へと進行する。
【図２】敗血症とSIRSの間の関係を示す。Vennダイアグラムに示される様々なセットは、示した症状を有する個体の集団に対応する。
【図３】敗血症陽性集団対SIRS陽性集団に対するイオンほぼ400種の平均正規化ピーク強度の比の自然対数を示す。
【図４Ａ】ESI-質量分析計プロファイルにおいて437.2Daのm/z、およびC18逆相カラム上で1.42分（min）の滞留時間を有するイオンの強度を示す。図4Aは敗血症を発生した個体の様々な集団におけるイオンの存在の変化を示す。敗血症グループにおける臨床上の敗血症の疑いは通常技術により測定すると「時点0」において起こる。「時点−24時間」および「時点−48時間」は、敗血症グループにおける臨床上の敗血症の疑いに先立つほぼ24時間およびほぼ48時間前に採取したサンプルをそれぞれ表す。個体は「第1日」に研究に入った。
【図４Ｂ】ESI-質量分析計プロファイルにおいて437.2Daのm/z、およびC18逆相カラム上で1.42分（min）の滞留時間を有するイオンの強度を示す。図4Bは、時点0において敗血症を発生しなかった個体の集団から採取したサンプル中の同じイオンの存在を示す。
【図５】10人の敗血症患者および10人のSIRS患者における時点0からのデータに当てはめた分類ツリーであり、エレクトロスプレー質量分析計により敗血症をSIRSから区別するのに関わると同定された３つのバイオマーカーを示す。
【図６】血漿サンプルについて得た代表的なLC/MSおよびLC/MS/MSスペクトルを示し、実施例に記載した機器の配置構成を使っている。
【図７Ａ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより高いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【図７Ｂ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより高いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【図８Ａ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより低いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【図８Ｂ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより低いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年11月12日出願の米国仮出願第60/425,322号、および2003年10月17日出願の米国仮出願第60/511,644号の優先権を主張し、これらは両方とも本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、個体における敗血症またはその進行の段階を診断または予測する方法に関する。本発明はまた、全身性炎症反応症候群（SIRS）を診断する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
疾患の症状の早期検出は、典型的に、より効果的な治療処置を可能にし、対応してより好都合な臨床成果をもたらす。しかし、多くの場合、疾患の症状の早期検出には問題が多く；従って、疾患が比較的進んだ後に、診断が可能になる。全身性炎症症状はかかる疾患のクラスの１つである。これらの症状、特に敗血症は、典型的に病原性微生物と宿主の防衛系との間の相互作用から起こり、この相互作用が宿主において過剰のかつ調節不全の炎症反応の誘因となる。全身性炎症反応における宿主の反応は複雑であるため、疾患の病原性を理解するための努力は複雑なものであった（Healy, Annul. Pharmacother. 36:648-54 (2002)の総括を参照）。疾患の病原性の不完全な理解は、次いで、診断バイオマーカーの発見を困難にする。しかし、敗血症は著しく急速に進行して生命を脅かす症状となるので、早期かつ信頼しうる診断が絶対に欠かせない。
【０００４】
敗血症は十分明らかにされた時間経過に従い、全身性炎症反応症候群（SIRS）陰性からSIRS陽性へそして敗血症へ、次いで重症敗血症、敗血症ショック、多臓器不全（MOD）、そして最終的に死へ進行する。敗血症はまた、感染した個体において、個体が続いてSIRSを発生する時にも起こりうる。「SIRS」は通常、次のパラメーターの２つ以上の存在として定義される：38℃を超えるかもしくは36℃未満の体温；毎分90を超える心拍数；毎分20回を超える呼吸数；32mmHg未満のPCO2；および4.0x109細胞/L未満のもしくは12.0x109細胞/Lを超える、または10％を超える未成熟バンド型を有する白血球数。「敗血症」は通常、確認された感染プロセスを伴うSIRSとして定義される。「重症敗血症」は、MOD（多臓器不全）、低血圧、播種性血管内血液凝固（「DIC」）または低灌流異常と関係し、乳酸アシドーシス、乏尿、および精神状態の変化を含む。「敗血症ショック」は通常、敗血症由来の低血圧と定義され、血液蘇生に抵抗してさらなる低灌流異常の存在を伴う。
【０００５】
臨床上、敗血症にとって意味のある病原微生物の存在を特定することは困難であることが示されている。典型的には、患者の血液、痰、尿、創傷分泌物、内置ラインカテーテル表面物などを培養することにより、原因微生物を検出する。しかし、原因微生物はある特定の身体ミクロ環境内においてのみ棲息しうるので、培養した特定の物質が汚染微生物を含有しないかも知れない。検出は、感染部位における微生物数が少ないことによってさらに複雑なものとなる。血液中の病原体数が少ないことは、血液培養により敗血症を診断するのに、ある特定の問題を提示する。ある研究では、例えば、陽性培養物を、敗血症の臨床症状を提示する患者のわずか17％において得ただけであった（Rangel-Fraustoら, JAMA 273:117-23 (1995)）。診断は、非病原性微生物によるサンプルの汚染によってさらに複雑なものとなる。例えば、敗血症に罹った707人の患者の研究において、検出された臨床上意味のある微生物はわずか12.4％であった（Weinsteinら, Clinical Infectious Diseases 24:584-602 (1997)）。
【０００６】
敗血症の初期診断の困難なことは、この疾患に関連する高い罹患率および死亡率に反映している。敗血症は現在米国の死因の第10位に位置し、しかも非冠血管集中治療室（ICU）の入院患者間で特に多く、最も通常の死因になっている。全体の死亡率は35％に達し、米国だけで毎年推定750,000症例が起こっている。米国だけで、敗血症を治療するための年間費用は数10億ドルのオーダーである。
【０００７】
従って、十分早期に敗血症を診断して効果的な介入と予防を可能にする方法に対する必要性が存在する。ほとんどの現存の敗血症スコアリングシステムまたは予測モデルは、既に敗血症とみなされる患者について、死を含む後期段階合併症のリスクを予測するだけである。かかるシステムおよびモデルは、しかし、敗血症それ自体の発生を予測するものでない。特に必要であるのは、SIRSの患者が敗血症を発生し得るかまたはし得ないかを分類する方法である。現在、研究者は、典型的には、正常な（すなわち、非敗血症の）対照グループの患者と対比して、敗血症患者グループにおいて異なるレベルで発現される単一のバイオマーカーを規定しうる。2003年3月26日に出願された米国特許出願第10/400,275号（その全文が本明細書に参照により組み入れられる）は、様々なバイオマーカーの発現レベルの時間依存性変化を分析することにより早期敗血症を指摘する方法を開示している。従って、現在、早期敗血症を診断する最適の方法は、ある期間にわたって複数のバイオマーカーを測定するステップおよびこれらのバイオマーカーの発現をモニターするステップの両方を必要とする。
【０００８】
当技術分野において引き続き緊急に必要なことは、特異性と感度をもって、長期にわたり患者をモニターする必要なしに、敗血症を診断することである。理想的には、正確、迅速、かつ同時に、複数のバイオマーカーを単一時点で測定する技術によって診断を行い、それにより診断に必要な期間の疾患の進行を最小限にとどめることである。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、ある単一時点における生物学的サンプルから得た１以上のバイオマーカーの測定を介して、敗血症の正確、迅速、かつ高感度の予測と診断を可能にする。これは、個体、特に敗血症を発生するリスクがあるか、敗血症を有するか、または敗血症を有すると思われる個体から、単一時点におけるバイオマーカープロファイルを得て、その個体からのバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較することにより実施する。参照バイオマーカープロファイルは、例えば、敗血症を患っているかまたは敗血症の発症もしくは敗血症のある特定の進行段階のいずれかにある個体の集団（「参照集団」）から得ることができる。もしその個体からのバイオマーカープロファイルが参照集団からのバイオマーカープロファイルの特徴を適当に含有すれば、そこでその個体は、参照集団と同じように、敗血症になる機会がより高いか、敗血症を患っているか、または敗血症のある特定の進行段階にあると診断する。参照バイオマーカープロファイルはまた、SIRSを患う個体または感染を患うがSIRSを患ってない個体を含む個体の様々な集団から得ることができる。従って本発明は、臨床医が、とりわけ、SIRSを有しない患者、SIRSを有するが研究の時間枠内で敗血症を恐らく発生しない患者、敗血症を有する患者、または最終的に敗血症になるリスクを有する患者を決定することを可能にする。
【００１０】
本発明の方法は、SIRS患者の敗血症の発症を検出するか予測するのに特に有用であるが、当業者は、本発明の方法が、限定されるものでないが、SIRSを有するかまたは敗血症のいずれかの段階にあると思われる患者を含むいずれの患者に対しても利用しうることを理解しうる。例えば、生物学的サンプルを患者から採取し、サンプル中のバイオマーカーのプロファイルを、個体、例えば、SIRSを有するまたは敗血症のある特定段階にある個体に由来する複数の異なる対照バイオマーカープロファイルと比較することができる。患者のバイオマーカープロファイルをある特定の参照集団由来のプロファイルに対応するとして分類することは、その患者がその参照集団に該当することを予測するものである。本発明の方法から得られる診断に基づき、その後、適当な治療計画（レジメン）を開始することができる。
【００１１】
SIRS、敗血症または敗血症の進行段階を診断または予測する現存の方法は、非特異的な臨床的徴候および症候群に基づいている；従って、得られる診断はしばしば臨床上の効用を限定する。本発明の方法は正確に敗血症の様々な段階を検出するので、これらの方法を利用してこれらの個体を同定し、治療法の研究に適確に登録することができる。敗血症を、単一時点に得た生物学的サンプルにおけるバイオマーカー発現の「スナップショット」から予測または診断できるので、この治療法研究を、重症の臨床症候群が発症する前に開始することができる。生物学的サンプルをそのバイオマーカープロファイルについて試験するので、特定のバイオマーカーの同定は不要である。そうは言うものの、本発明は、敗血症または敗血症の進行のある特定段階を特徴付ける特異的なプロファイルのバイオマーカーを同定する方法を提供する。かかるバイオマーカーはそれ自体、敗血症を予測または診断する上での有用なツールでありうる。
【００１２】
従って、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の発症を予測する方法を提供する。本方法は、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。バイオマーカープロファイルの比較によって、個体における敗血症の発症を少なくとも約60％の正確度で予測することができる。この方法は、敗血症の発症前のいずれの時点において再び繰返してもよい。
【００１３】
本発明はまた、敗血症を有するかまたは有すると思われる個体における敗血症を診断する方法であって、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである上記方法も提供する。バイオマーカープロファイルの比較によって、個体における敗血症を少なくとも約60％の正確度で診断することができる。この方法は、いずれの時点において繰返してもよい。
【００１４】
本発明はさらに、敗血症を有するかまたは敗血症を有すると思われる個体における敗血症の進行（すなわち、段階）を決定する方法を提供する。この方法は、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。バイオマーカープロファイルを比較すると、個体における敗血症の進行を少なくとも約60％の正確度で予測することができる。この方法はまた、いずれの時点において繰返してもよい。
【００１５】
さらに、本発明はSIRSを有するかまたはSIRSを有すると思われる個体におけるSIRSを診断する方法を提供する。この方法は、バイオマーカープロファイルをある単一時点に個体から得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。バイオマーカープロファイルを比較すると、個体におけるSIRSを少なくとも約60％の正確度で診断することができる。この方法はまた、いずれの時点において繰返してもよい。
【００１６】
他の実施形態においては、本発明は、とりわけ、決定ルールを適用して個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法を提供する。決定ルールは、(i)個体から単一時点に採取した生物学的サンプルから作製したバイオマーカープロファイルを(ii)参照集団から作製したバイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである。決定ルールを適用することにより、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。本方法は、その個体において１回以上別々の単一時点で繰返してもよい。
【００１７】
本発明はさらに、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体から採取した生物学的サンプルからバイオマーカープロファイルを得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである上記方法も提供する。単一のかかる比較が個体をその参照集団のメンバーシップを有するとして分類することができる。バイオマーカープロファイルの比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００１８】
本発明はさらに、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体から採取した生物学的サンプルからバイオマーカープロファイルを得るステップ、およびその個体のバイオマーカープロファイルを参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものである上記方法を提供する。参照集団は、正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある特定段階の参照集団、通常技術によりほぼ0〜36時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ36〜60時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ60-84時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団からなる群から選択することができる。単一のかかる比較が個体をその参照集団のメンバーシップを有するとして分類することができ、そしてその比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００１９】
さらに他の実施形態においては、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法を提供する。上記方法は、個体からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルと参照集団からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルとの間の測定可能な少なくとも１種のバイオマーカーの特性を比較するステップを含むものである。この比較に基づいて、個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類する。従って、その比較は個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。一実施形態において、バイオマーカーは、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に示されるバイオマーカーの群から選択される。
【００２０】
さらなる実施形態においては、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体の生物学的サンプルから作製したプロファイル中の１セットのバイオマーカーから少なくとも２種の特性を選択するステップを含むものである上記方法を提供する。これらの特性を、参照集団からの生物学的サンプルから作製したプロファイル中の同じ１セットのバイオマーカーと比較する。単一のかかる比較が個体をその参照集団のメンバーシップを有するとして約60％の正確度で分類することができ、そしてその比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００２１】
本発明はまた、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する方法であって、個体の生物学的サンプルに含有される少なくとも２種のバイオマーカーの存在量の変化を決定し、そして個体のサンプル中のこれらのバイオマーカーの存在量を参照集団からの生物学的サンプル中のこれらのバイオマーカーの存在量と比較することを含むものである上記方法も提供する。その比較が個体をその参照集団中のメンバーシップを有するとして分類することができ、そしてその比較は、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断する。
【００２２】
他の実施形態においては、本発明は、とりわけ、個体における敗血症の状態を決定する方法であって、少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量の変化を、敗血症を患うまたは患わない参照集団からの生物学的サンプルに対する少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量の変化と比較して、決定することを含むものである上記方法も提供する。バイオマーカーは、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に示されるバイオマーカーからなる群から選択される。あるいは、少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量を、少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーの存在量と比較してもよい。
【００２３】
本発明はさらに、とりわけ、生物学的サンプル中のその存在が敗血症を診断または予測するのに役立つバイオマーカーを単離する方法を提供する。この方法は、個体の集団から参照バイオマーカープロファイルを得るステップおよび敗血症または敗血症の進行段階の１つを予測または診断するするのに役立つ参照バイオマーカープロファイルの特性を同定するステップを含むものである。この方法はさらに、その特性に対応するバイオマーカーを同定するステップおよび次いでバイオマーカーを単離するステップを含むものである。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーを含むものであるキットを提供する。
【００２５】
他の実施形態においては、参照バイオマーカープロファイルは、サンプル中のバイオマーカーを特徴づける少なくとも２種の、好ましくは５、10、または20種以上の特性の組合わせを含んでもよい。この実施形態においては、それらの特性は或る特定の参照集団に或る個体が包含されることを予測するのに寄与しうる。包含を予測する特性の相対的寄与は、少なくともほぼ60％、少なくともほぼ70％、少なくともほぼ80％、少なくともほぼ90％、ほぼ95％、ほぼ96％、ほぼ97％、ほぼ98％、ほぼ99％またはほぼ100％の正確度で、クラス包含を予測するデータ解析アルゴリズムにより決定することができる。一実施形態においては、特性の組合わせによって、通常技術を用いて決定される敗血症の実際の発症に先立つほぼ24、ほぼ48、またはほぼ72時間前に敗血症の発症を予測することができる。
【００２６】
さらに他の実施形態においては、参照バイオマーカープロファイルは少なくとも２種の特性を含んでもよく、その少なくとも１つは対応するバイオマーカーを特徴づけるものであってその特性はある個体が敗血症陽性またはSIRS陽性集団中に包含されることの予測を可能にするものである。この実施形態においては、その特性を、ある個体が敗血症陽性またはSIRS陽性集団に属すると分類することができる確度に直接関係するp値（Wilcoxon符号付順位検定などのノンパラメトリック検定から得られる）に割付ける。他の実施形態においては、その特性は、ある個体を敗血症陽性またはSIRS陽性集団に属するとして、少なくともほぼ60％、ほぼ70％、ほぼ80％、ほぼ90％の正確度で分類する。さらに他の実施形態においては、その特性によって、通常技術を用いて決定される敗血症の実際の発症に先立つほぼ24、ほぼ48、またはほぼ72時間前に、敗血症の発症を予測することができる。
【００２７】
さらに他の実施形態においては、本発明は、捕捉分子が粒子の表面に結合した粒子のアレイであって、表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、10または20種のバイオマーカーと特異的に結合することができる上記アレイを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、ある単一時点（「スナップショット」）においてまたは疾患進行の経過期間に個体から得た１以上の生物学的サンプルを利用して、敗血症の迅速、高感度、かつ正確な診断または予測を可能にする。好都合なことに、臨床症候群の発症前に敗血症を診断または予測することができるので、より効果的な治療介入が可能になる。
【００２９】
「全身性炎症反応症候群」または「SIRS」は、様々な重症の臨床発作に対して、24時間以内に次の症状の２つ以上が顕われる臨床反応を意味する：
・38℃（100.4°F）を超えるかもしくは36℃（96.8°F）未満の体温；
・毎分90を超える心拍数；
・毎分20回を超える呼吸数もしくは32mmHg未満のPCO2もしくは機械的な通気(mechanical ventilation)の必要性；ならびに
・12.0x109/Lを超えるかもしくは4.0x109/L未満の、または10％を超える未成熟型バンドを有する白血球数。
【００３０】
これらのSIRSの症状は共通して認識されたSIRSの定義を表わすが、将来、定義の改善があれば改変されるかまたは置換えられうる。本定義は現行の臨床実施を説明するために用いるのであり、本発明の重要な態様を表すものではない。
【００３１】
SIRSの患者は上記のSIRSとして分類される臨床症状を有するが、臨床上、敗血症とみなされない。敗血症を発生するリスクのある個体は、ICU（集中治療室）における患者およびそうでなければ生理学的外傷、例えば火傷または他の傷害を受けている個体を含む。「敗血症」は確認された感染性プロセスと関係があるSIRS陽性症状を意味する。敗血症の臨床上の疑いは、SIRS患者のSIRS陽性症状が感染性プロセスの結果であるという疑いから起こる。本明細書で用いる「敗血症」は、限定されるものでないが、敗血症の発症、重症敗血症、および敗血症の最終段階と関係があるMOD（多臓器不全）を含む敗血症の全ての段階を含む。
【００３２】
「敗血症の発症」は、敗血症の早期段階、すなわち、臨床症状が敗血症の臨床的疑いを十分に支持する段階の前の段階を意味する。本発明の方法は通常技術を用いて敗血症が疑われうる時点の前に敗血症を検出するために利用するので、早期敗血症におけるその患者の病状は敗血症の症状がさらに臨床的に明らかになるときに遡及して確認しうるだけである。患者が敗血症になる正確な機構は本発明の重要な態様でない。本発明の方法は、感染プロセスの起源に依存しないでバイオマーカープロファイルの変化を検出することができる。敗血症が如何に起こるかに関わらず、本発明の方法は、従来使用される判定基準により分類される敗血症またはSIRSを有するかまたは有すると疑われる患者の状態を決定することができる。
【００３３】
「重症敗血症」は臓器不全、低灌流異常、または敗血症が誘発する低血圧に関係する敗血症を意味する。低灌流異常は、限定されるものでないが、乳酸アシドーシス、乏尿、または精神状態の急性変化を含む。「敗血症ショック」は、敗血症が誘発する、十分な静脈内血液負荷に反応しない低血圧および末梢低潅流の症状を意味する。「変換患者（converter patient）」は、患者をモニターしている期間中に、典型的にはICU滞在中に、敗血症の臨床的疑いへ進行するSIRS陽性患者を意味する。「非変換患者（non-converter patient）」は、患者をモニターしている期間中に、典型的にはICU滞在中に、敗血症の臨床的疑いへ進行しないSIRS陽性患者を意味する。
【００３４】
「バイオマーカー」は、実質的にいずれかの生物学的化合物、例えばタンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機または無機化学品、天然高分子、ならびに小分子であって、生物学的サンプル中に存在しかつ生物学的サンプルから単離するかまたは測定することができる上記生物学的化合物である。さらに、バイオマーカーは、無傷の分子全体であってもよいしまたは部分的に機能性であるかまたは、例えば、抗体もしくは他の特異的結合タンパク質により認識することができるその部分であってもよい。バイオマーカーは、バイオマーカーの測定可能な態様が患者の所与の状態、例えば敗血症のある特定段階と関係がある情報を与えるのに役立つと考えられる。かかる測定可能な態様は、例えば、個体からの生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在、不在、または濃度および／またはバイオマーカーのプロファイルの部分としてのその存在を含むことができる。本明細書ではバイオマーカーのかかる測定可能な態様を「特性（feature）」と定義する。特性はまた、例えば、同定されていてもまたは同定されてなくてもよい複数のバイオマーカーの２以上の測定可能な態様の比であってもよい。「バイオマーカープロファイル」は少なくとも２つのかかる特性を含むものであって、それらの特性は同じかまたは異なるクラス、例えば核酸および炭水化物などのバイオマーカーに対応することができる。バイオマーカープロファイルはまた、少なくとも３、４、５、10、20、30種以上の特性を含んでもよい。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは数百種、または数千種の特性を含む。他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、少なくとも１つの内部標準の少なくとも１つの測定可能な態様を含む。
【００３５】
「表現型変化」は、患者の所与の状態と関係があるパラメーターの検出可能な変化である。例えば、表現型変化は、その変化が敗血症または敗血症の発症と関係がある体液中のバイオマーカーの増加または減少を含むことができる。表現型変化はさらに、患者の所与の状態の検出可能な態様の変化であって、バイオマーカーの測定可能な態様の変化でない変化を含むことができる。例えば、表現型変化は、体温、呼吸数、脈拍、血圧、または他の生理学的パラメーターの検出可能な変化を含んでもよい。かかる変化は、当業者に周知の通常技術を用いる臨床的観察および測定を介して決定することができる。本明細書に用いる「通常技術」は、本発明によるバイオマーカープロファイルを得ることなく表現型変化に基づいて、個体を分類する技術である。
【００３６】
「決定ルール」は患者を分類するために用いる方法である。このルールは、当技術分野で知られる１以上のフォームをとることができ、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるHastieら, 「統計学学習の基礎（The Elements of Statistical Learning）」, Springer-Verlag（Springer, New York (2001)）に例示されている。サンプル内の分子の複雑な混合物中のバイオマーカーを分析し、特性をデータセットで作製する。決定ルールを用いてデータセットの特性を処理し、とりわけ、敗血症の発症を予測し、敗血症の進行を決定し、敗血症を診断し、またはSIRSを診断することができる。
【００３７】
決定ルールを適用する場合、完全な分類を必要としない。一実施形態においては、分類を少なくともほぼ90％以上の確度で行ってもよい。他の実施形態においては、確度は少なくともほぼ80％、少なくともほぼ70％、または少なくともほぼ60％である。有用な確度の程度は、本発明の具体的な方法に依存して変化しうる。「確度（certainity）」は、正確に分類した個体の総数を、分類にかけた個体の総数で除したものとして定義される。本明細書に用いる「確度」は「正確度」を意味する。分類はまた、その「感度」により特徴づけることもできる。分類の「感度」は、敗血症を有すると正しく同定された敗血症患者の百分率に関係する。「感度」は当技術分野では、真の陽性を、真の陽性と偽陰性の和によって除した数として定義される。対照的に、方法の「特異性」は、敗血症を有しないと正しく同定された患者の百分率として定義される。すなわち、「特異性」は、真の陰性数を、真の陰性と偽陽性の和によって除した数に関係する。一実施形態においては、感度および／または特異性は少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、または少なくとも60％である。十分な確度で個体を分類するために利用する特性の数は典型的にはほぼ４個である。しかし、求められる確度の程度に依存して、特性の数は多くても少なくてもよいが、全事例において少なくとも１個である。一実施形態においては、個体を分類するために利用する特性の数を最適化して、高い確度で個体を分類できるようにする。
【００３８】
患者における敗血症またはSIRSの「状態を決定する」は、患者のバイオマーカープロファイルを分類して、(1)患者における敗血症またはSIRSの存在を検出すること、(2)患者における敗血症またはSIRSの発症を予測すること、または(3)患者における敗血症またはSIRSの進行を測定することを包含する。敗血症またはSIRSを「診断する」は、患者における敗血症またはSIRSを同定または検出することを意味する。本発明の感度は高く、臨床症状が明らかに観察される前に敗血症を検出するので、敗血症の同定または検出は上記の敗血症の発症の検出を含む。すなわち、「敗血症の発症を予測する」は、患者のバイオマーカープロファイルを、SIRSのある特定段階から敗血症へまたは感染している状態から敗血症へ（すなわち、感染からSIRSを随伴する感染へ）進行しつつある個体由来のプロファイルに対応するとして分類することを意味する。敗血症またはSIRSの「進行を検出する」または「進行を決定する」は、既に診断の済んでいる患者のバイオマーカープロファイルを、敗血症またはSIRSを有するとして分類することを意味する。例えば、診断の済んでいる患者のバイオマーカープロファイルを敗血症を有するとして分類することは、敗血症から重症敗血症またはMODを伴う敗血症への患者の進行を検出または決定することを包含することができる。
【００３９】
本発明によると、敗血症は、個体から得たサンプルからのバイオマーカーのプロファイルを得ることにより診断または予測することができる。本明細書に用いる「得る（obtain）」は「取得する（to come into possession of）」を意味する。本発明は、感染またはさらに敗血症を有する個体であるが、まだ敗血症を有すると診断されていない個体、敗血症を有すると疑われる個体、または敗血症を発生するリスクのある個体において敗血症を予測および診断するのに特に有用である。同じやり方で、本発明を用いて個体におけるSIRSを検出および診断することができる。すなわち、本発明を用いてSIRSの臨床的疑いを確認することができる。本発明を用いてまた、敗血症プロセスの様々な段階、例えば感染、菌血症、敗血症、重症敗血症、敗血症ショックなどを検出することもできる。
【００４０】
個体から得たバイオマーカーのプロファイル、すなわち、試験バイオマーカープロファイルを、参照バイオマーカープロファイルと比較する。参照バイオマーカープロファイルは１つの個体からまたは２以上の個体の集団から作製してもよい。集団は、例えば、３、４、５、10、15、20、30、40、50以上の個体を含むことができる。さらに、本発明の方法により比較する参照バイオマーカープロファイルと個体の（試験）バイオマーカープロファイルは、試験プロファイルと参照プロファイルが異なる時点に採取した生物学的サンプルから作製してお互いに比較するのであれば、同じ個体から作製してもよい。例えば、あるサンプルを研究期間の開始時に個体から得ることができる。次いでそのサンプルから採取した参照バイオマーカープロファイルを、同じ個体からのその後のサンプルから作製したバイオマーカープロファイルと比較することができる。かかる比較を利用して、例えば、経時的に分類を繰返すことにより、個体における敗血症の状態を決定することができる。
【００４１】
参照集団は、SIRSを有しない個体（「SIRS陰性」）から、SIRSを有しないが感染プロセスを患っている個体から、SIRSを患っていて敗血症の存在しない個体（「SIRS陽性」）から、敗血症の発症を患っている個体から、敗血症陽性であって敗血症の進行段階の１つを患っている個体から、または敗血症を発生するリスクを増加する生理学的外傷のある個体から選ぶことができる。さらに参照集団はSIRS陽性であって、その後、続いて通常技術を用いて敗血症を診断してもよい。例えば、参照プロファイルを作製するために利用するSIRS陽性患者の集団を、参照プロファイルを作製する目的で彼らから生物学的サンプルを採取した後、ほぼ24、48、72、96時間以上経って、敗血症について診断することができる。一実施形態においては、SIRS陽性個体の集団を、生物学的サンプルを採取した後、ほぼ0〜36時間、ほぼ36〜60時間、ほぼ60〜84時間、またはほぼ84〜108時間に、通常技術を用いて敗血症を診断する。もしバイオマーカープロファイルが敗血症またはその進行段階の１つを示すものであれば、臨床医は、敗血症の臨床症候が発現する前に治療を始めることができる。治療は、典型的には、患者を試験して感染源を決定することに関わる。感染源を突き止めれば、臨床医は、典型的には感染部位から、好ましくは関係する実験的抗生物質療法を始める前に培養物を得て、そして恐らくさらなる付属の治療対策、例えば膿瘍を排出するかまたは感染したカテーテルを除去するであろう。敗血症の療法はHealy（前掲）に総括されている。
【００４２】
本発明の方法は、個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較することを含むものである。本明細書に用いる「比較」は、個体のバイオマーカープロファイルと参照バイオマーカープロファイルの少なくとも１つの相違を識別するいずれかの方法を含む。従って、比較は、クロマトグラフィスペクトルの視覚検査であってもよいし、また比較はプロファイルの特性に割付けられた値の代数学的または統計学的比較であってもよい。かかる統計学的比較は、限定されるものでないが、決定ルールを適用することを含む。もしバイオマーカープロファイルが少なくとも１つの内部標準を含むものであれば、バイオマーカープロファイル中の相違を識別する比較はまた、これらの内部標準の特性を含むものであって、バイオマーカーの特性を内部標準の特性と関係付けてもよい。比較は、とりわけ、敗血症またはSIRSを獲得する機会を予測することができる；または比較は敗血症またはSIRSの存在または不在を確認することができる；または個体がありうる敗血症の段階を示すことができる。
【００４３】
本発明は、従って、モニタリング期間全体にわたる時間集中的アッセイを実施する必要性ならびにそれぞれのバイオマーカーを同定する必要性がない。本発明は個体を分類するためにモニタリング期間を必要としないが、個体のリスクがなくなるまで、個体の繰返し分類、すなわち繰返しスナップショットを期間全体にわたり取得してもよいことは理解されるであろう。あるいは、個体から得たバイオマーカーのプロファイルを、同じ個体から異なる時点に得た１以上のバイオマーカーのプロファイルと比較することができる。当業者は、分類を繰返す過程で行われたそれぞれの比較が、個体を参照集団のメンバーシップを有するとして分類できることを理解するであろう。
【００４４】
敗血症でない段階からMODの段階までにおける敗血症進行の様々な段階に対応する様々な生理学的症状を有する個体を、特徴的なバイオマーカープロファイルにより識別することができる。本明細書で用いる「個体」は動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトまたは非ヒト霊長類である。用語「個体」、「被験者」および「患者」を本明細書では互換的に使用する。個体は正常であっても、SIRSまたは敗血症を有する疑いがあっても、SIRSまたは敗血症を発生するリスクがあっても、またはSIRSまたは敗血症を有することが確認されていてもよい。敗血症の進行において示唆されている公知のバイオマーカーが多数存在するが、これらのマーカーの全てが初期の前臨床段階に現れるとは限らない。早期段階敗血症を特徴付けるバイオマーカーのサブセットは、事実上、最終的に敗血症の臨床症候群を現わす個体から得たサンプルの遡及的分析によってのみ決定することができる。理論に束縛されることなく、敗血症をもたらす初期の病原体感染ですらバイオマーカー発現の特定の変化に反映される生理学的変化を起しうる。例えば、敗血症のある段階に特徴的なバイオマーカープロファイルが決定されると、個体から得た生物学的サンプルからのバイオマーカーのプロファイルを、この参照プロファイルと比較して、その被験者も敗血症のその特定段階にあるかかどうかを決定することができる。
【００４５】
敗血症のある段階から他の段階への、または正常（すなわち、敗血症またはSIRSを有しないことにより特徴づけられる症状）から敗血症またはSIRSへの進行、およびその逆は、バイオマーカープロファイルにおける変化により特徴付けられよう、例えば、ある特定のバイオマーカーはより高いレベルに増加して発現されそして他のバイオマーカーの発現は下方調節されるというようにである。バイオマーカープロファイルにおけるこれらの変化は、その参照集団における、例えば、感染および／または炎症に対する生理学的反応の漸進的確立を反映しうる。当業者は、その参照集団のバイオマーカープロファイルはまた、生理学的反応が静まるとともに変化しうることを理解するであろう。以上述べたように、本発明の利点の１つは、個体を、単一の生物学的サンプルからのバイオマーカープロファイルを用いて、ある特定の集団のメンバーシップを有するとして分類できることである。しかし、ある特定の生理学的反応が確立されるかまたは沈静化するかどうかの決定は、個体の続いての分類によって実施しうることを当業者は理解するであろう。この目的で、本発明は、敗血症またはSIRSに対する生理学的反応が確立されるかまたは沈静化するとともに発現レベルが増加および減少する両方の多数のバイオマーカーを提供する。例えば、ある研究者は、敗血症に対する生理学的反応が確立されるとともに強度が変化することが公知である個体のバイオマーカープロファイルの特性を選択することができる。その後の個体からの生物学的サンプルから得たプロファイル中の同じ特性の比較によって、個体がより重症の敗血症へ進行しているかまたは正常へ進行しているどうかを確立することができる。
【００４６】
バイオマーカーの分子としての同定は本発明にとって本質的でない。実際、本発明は従来同定されているバイオマーカー（例えば、2003年3月26日に出願された米国特許出願第10/400,275号を参照）に限定されるものではない。従って、個体の所与の集団、特に敗血症の早期段階の１つの集団を特徴づける新規のバイオマーカーを同定しうることを予想している。本発明の一実施形態においては、バイオマーカーを同定しかつ単離する。次いでそれを用いて特異的に結合する抗体を産生させることができ、それによって、様々な診断アッセイにおけるバイオマーカー検出を実施することができる。この目的に対して、いずれのイムノアッセイを利用してもよく、またイムノアッセイはバイオマーカー分子と結合することができるいずれの抗体、抗体フラグメントまたは誘導体（例えば、Fab、FvまたはscFvフラグメント）を利用してもよい。かかるイムノアッセイは当技術分野で周知である。もしバイオマーカーがタンパク質であれば、それを配列決定してもよく、それをコードする遺伝子を周知の確立された技術を利用してクローニングしてもよい。
【００４７】
本発明の方法を使って、例えばICUに入院する患者をスクリーニングすることができる。例えば、血液などの生物学的サンプルを入院時に直ぐ採取する。血液内のタンパク質と他の分子の複雑な混合物を、バイオマーカーのプロファイルにとして解析する。この解析は、再現性のあるようにこれらの分子をいくつかの物理または化学特性に基づいて識別する技術または技術の組合わせを使って実施することができる。一実施形態においては、分子をマトリックス上に固定し、次いで分離し、そしてレーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計により識別する。スペクトルがそれぞれの分子またはそのフラグメントの質量／電荷を反映する特徴的な脱着パターンにより作製される。他の実施形態においては、バイオマーカーを細胞抽出物から得た様々なmRNA種から選択し、個体のmRNA種をcDNAアレイとハイブリダイズすることによって、プロファイルを得る。cDNAアレイの診断上の利用は当技術分野で周知である（例えば、Zouら, Oncogene 21: 4855-4862 (2002)を参照）。さらに他の実施形態においては、タンパク質および核酸の分離方法の組合わせを用いて、プロファイルを得ることができる。
【００４８】
本発明はまた、個体における敗血症の状態を決定するかまたはSIRSを診断するのに有用であるキットを提供する。本発明のキットは少なくとも１種のバイオマーカーを含む。本発明に有用である特定のバイオマーカーは本明細書において説明される。キットのバイオマーカーを用いて本発明によるバイオマーカープロファイルを作製することができる。キットの化合物のクラスの例は、限定されるものでないが、タンパク質、およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機および無機化学品、ならびに天然および合成高分子を含む。バイオマーカーはアレイの一部分であってもよいし、またはバイオマーカーは別々におよび／または個々にパッケージされていてもよい。キットはまた、本発明のバイオマーカープロファイルを作製するのに用いる、少なくとも１つの内部標準を含んでもよい。同様に、内部標準は上記の化合物のいずれのクラスのものであってもよい。また、本発明のキットは、バイオマーカープロファイルを作製する生物学的サンプル中に含まれるバイオマーカーを検出しうるように標識するために用いる試薬を含有してもよい。この目的で、キットは、次のバイオマーカーの表のいずれかに記載されるバイオマーカーのなかの少なくとも２、３、４、５、10、20種以上のバイオマーカーと特異的に結合する抗体またはその機能性フラグメントのセットを含んでもよい。抗体自体を検出しうるように標識してもよい。キットはまた、特異的なバイオマーカー結合成分、例えばアプタマーを含んでもよい。もしバイオマーカーが核酸を含む場合、そのキットは、バイオマーカーとまたはバイオマーカーの相補鎖と２本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドプローブを提供することができる。オリゴヌクレオチドプローブを検出しうるように標識してもよい。
【００４９】
本発明のキットはまた、製薬用賦形剤、希釈剤および／または、バイオマーカーを抗体の産生に用いるときは、アジュバントを含んでもよい。製薬用アジュバントの例は、限定されるものでないが、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含む。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有により保証することができる。等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを含むことも所望される。注射用の製薬剤形の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含有することにより達成することができる。
【００５０】
バイオマーカープロファイルの作製
一実施形態によれば、本発明の方法は、個体から採取した生物学的サンプルからバイオマーカーのプロファイルを得ることを含むものである。生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、唾液、痰、尿、大脳脊髄液、細胞、細胞抽出物、組織サンプル、組織生検、糞便サンプルなどであってよい。参照バイオマーカープロファイルは、例えば、SIRS陰性個体、SIRS陽性個体、敗血症を発症しつつある個体および既に敗血症である個体からなる群から選択される個体の集団から取得することができる。既に敗血症である個体からの参照バイオマーカープロファイルは、敗血症の進行におけるいずれの段階、例えば感染、菌血症、重症敗血症、敗血症ショックまたはMODにおいて取得してもよい。
【００５１】
一実施形態においては、分離法を用いてバイオマーカーのプロファイルを作製し、サンプル内のバイオマーカーのサブセットだけを分析することができる。例えば、サンプル中の分析するバイオマーカーが細胞抽出物のmRNA種からなり、サンプル内の核酸バイオマーカーだけを得るように分画しておいたものでもよいし、またはバイオマーカーがサンプル内のタンパク質の全補体の画分からなり、クロマトグラフィ技術により分画しておいたものでもよい。あるいは、分離法を使わないでバイオマーカーのプロファイルを作製してもよい。例えば、生物学的サンプルを、サンプル中のバイオマーカーと特異的複合体を形成する標識した化合物を用いて問合わせ、特異的複合体の標識強度がバイオマーカーの測定可能な特性であってもよい。かかる特異的複合体を形成するのに好適な化合物は標識した抗体である。一実施形態においては、標識としての増幅可能な核酸とともに抗体を用いて、バイオマーカーを測定する。さらに他の実施形態においては、それぞれ核酸標識の１本鎖とコンジュゲートした２つの抗体がバイオマーカーと相互作用して２つの核酸鎖が増幅可能な核酸を形成すると、核酸標識が増幅可能になる。
【００５２】
他の実施形態においては、バイオマーカーが核酸またはその相補体である場合、バイオマーカープロファイルを核酸のアレイなどのアッセイから誘導することができる。例えば、バイオマーカーはリボ核酸であってもよい。バイオマーカープロファイルはまた、核磁気共鳴、核酸アレイ、ドットブロット、スロットブロット、逆転写増幅およびノーザン分析からなる群から選択される方法を用いて得ることができる。他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルをバイオマーカーに特異的な抗体、またはその機能性フラグメントと反応させることにより免疫学的に検出する。抗体の機能性フラグメントは、完全な抗体が結合する抗原と結合する能力を少なくとも若干保持する抗体の一部分である。限定されるものでないが、scFvフラグメント、FabフラグメントおよびF(ab)2フラグメントを含むフラグメントは、遺伝子組換えにより作製するかまたは酵素により作製することができる。他の実施形態においては、抗体以外の特異的結合分子、例えばアプタマーをバイオマーカーと結合するために用いることができる。さらに他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、感染性薬剤またはその成分の測定可能な態様を含んでもよい。さらに他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、小分子の測定可能な態様を含むものであってもよく、その小分子はタンパク質または核酸の断片を含んでもよいしまたは代謝産物を含んでもよい。
【００５３】
バイオマーカープロファイルは１以上の分離法を用いて作製することができる。例えば、好適な分離法は、質量分析計、例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ESI-MS）、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n（nは１以上の整数である）、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF-MS）、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（SELDI-TOF-MS）、シリコン上の脱離／イオン化（DIOS）、二次イオン質量分析計（SIMS）、四重極飛行時間型（Q-TOF）、大気圧化学イオン化質量分析計（APCI-MS）、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大気圧光イオン化質量分析計（APPI-MS）、APPI-MS/MS、およびAPPI-(MS)nを含むことができる。他の質量分析法は、とりわけ、四重極、フーリエ変換質量分析計（FTMS）およびイオントラップを含んでもよい。他の好適な分離法は、化学抽出分配、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィ、等電点、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）または他のクロマトグラフィ、例えば薄層、気体または液体クロマトグラフィ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含んでもよい。一実施形態においては、生物学的サンプルを分画して後に、分離法を適用してもよい。
【００５４】
バイオマーカープロファイルはまた、バイオマーカー自身の物理的分離を必要としない方法により作製することもできる。例えば、核磁気共鳴（NMR）分析計を用いて分子の複雑な混合物からバイオマーカーのプロファイルを解析することができる。腫瘍を分類するためのNMRの類似した利用は、例えばHagberg, NMR Biomed. 11: 148-56 (1998)に開示されている。さらなる方法は核酸増幅技術を含み、この方法は個体バイオマーカーを物理的に分離することなくバイオマーカーのプロファイルを作製する（例えば、Stordeurら, J. Immunol. Methods 259:55-64 (2002)、およびTanら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:11387-11392 (2002)を参照）。
【００５５】
一実施形態においては、レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計を用いてバイオマーカーのプロファイルを作製し、ここでバイオマーカーは、入射レーザー照射によりイオン化しかつ固定支持体から蒸発させたタンパク質またはタンパク質断片である。次いで、プロファイルを、それぞれのタンパク質に特徴的なその質量対電荷（「m/z」）比に依存する飛行時間によって作製する。様々なレーザー脱離／イオン化技術が当技術分野では公知である（例えば、Guttmanら, Anal. Chem. 73:1252-62 (2001)、およびWeiら, Nature 399:243-46 (1999)を参照）。
【００５６】
レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計は大量の情報を比較的短時間に作製することができる。生物学的サンプルを、サンプル中のバイオマーカーまたはそのサブセットの全てと結合する数種類の支持体の１つにアプライする。細胞溶解物またはサンプルをこれらの表面に、0.5μL程度の小容積で、前精製または分画をせずに、直接アプライする。溶解物またはサンプルを、支持表面上にアプライする前に、濃縮または希釈してもよい。次いで、レーザ脱離／イオン化を用いてサンプルの質量スペクトルを３時間程度の短時間に作製する。
【００５７】
他の実施形態においては、個体の細胞抽出物からの全mRNAをアッセイし、生物学的サンプルから得られる様々なmRNA種をバイオマーカーとして利用する。プロファイルは、例えば、これらのmRNAを、オリゴヌクレオチドまたはcDNAを含んでもよいプローブのアレイと、当技術分野で公知の標準的方法を利用してハイブリダイズすることにより、得ることができる。あるいは、mRNAをゲル電気泳動またはブロット法、例えばドットブロット、スロットブロットまたはノーザン分析にかけてもよく、これらは全て当技術分野で公知である（例えば、Sambrookら, in "Molecular Cloning, 3版.,"Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)を参照）。mRNAプロファイルはまた、逆転写と、次いで得られるDNAの増幅および検出により取得することもでき、これは、例えばStordeurら（前掲）に開示されている。他の実施形態においては、プロファイルは、質量分析計と組合わせた核酸アレイなどの方法の組み合わせを用いることにより得ることができる。
【００５８】
データ解析アルゴリズムの使用
一実施形態においては、個体のバイオマーカープロファイルの参照バイオマーカープロファイルとの比較は、決定ルールを適用することを含む。決定ルールはデータ解析アルゴリズム、例えばコンピューターパターン認識アルゴリズムを含んでもよい。他の好適なアルゴリズムは、限定されるものでないが、ロジスティック回帰または特性値の分布差を検出するノンパラメトリックアルゴリズム（例えば、Wilcoxon符号付順位検定）を含む。決定ルールは、１、２、３、４、５、10、20種以上の特性に基づくものであってもよい。一実施形態においては、決定ルールは数百種以上の特性に基づく。決定ルールの適用はまた、分類ツリーアルゴリズムの使用を含むものであってもよい。例えば、参照バイオマーカープロファイルは少なくとも３つの特性を含み、それらの特性は分類ツリーアルゴリズムにおける予測因子である。データ解析アルゴリズムは集団内のメンバーシップ（またはクラス）を、少なくともほぼ60％、少なくともほぼ70％、少なくともほぼ80％および少なくともほぼ90％の正確度で予測する。
【００５９】
適当なアルゴリズムは当技術分野で公知であり、そのいくつかはHastieら（前掲）に総括されている。かかるアルゴリズムは生物学的物質、例えば血液サンプルからの複雑なスペクトルを分類して、個体を正常であるかまたはある特定の病状の特徴であるバイオマーカー発現レベルを持つかを識別する。かかるアルゴリズムを用いて決定ルール適用の速度と効率を増加しかつ研究偏差を避けることはできるが、当業者は、コンピューターに基づくアルゴリズムが本発明の方法を実行するための必要条件ではないことを理解するであろう。
【００６０】
アルゴリズムは、バイオマーカープロファイルを作製するのに用いた方法に関わりなく、バイオマーカープロファイルの比較に適用することができる。例えば、Harper, 「高分子分析における熱分解とGC（Pyrolysis and GC in Polymer Analysis）」, Dekker, New York (1985)に考察されたガスクロマトグラフィを用いて作製したバイオマーカープロファイルに、好適なアルゴリズムを適用することができる。さらに、Wagnerら, Anal. Chem. 74:1824-35 (2002)は、静的飛行時間二次イオン質量分析計（TOF-SIMS）によって得たスペクトルに基づいて個体を分類する能力を改良するアルゴリズムを開示している。さらに、Brightら, J. Microbiol. Methods 48:127-38 (2002)は、MALDI-TOF-MSスペクトルの分析により、細菌株の間を高い確度（79-89％正しい分類率）で識別する方法を開示している。Dalluge, Fresenius J AnaL Chem. 366:701-11 (2000)は、MALDI-TOF-MSおよび液体クロマトグラフィ-エレクトロスプレイイオン化質量分析計（LC/ESI-MS）を利用する、複雑な生物学的サンプル中のバイオマーカーのプロファイルの分類を考察している。
【００６１】
バイオマーカー
本発明の方法は、敗血症またはSIRSの診断または予測に役立つバイオマーカープロファイルの作製によって実施することができる。プロファイルを作製すれば、本発明を十分実施できるので、プロファイルを構成するバイオマーカーが既知である必要はないしまたは続いて同定する必要はない。
【００６２】
本発明のバイオマーカープロファイルを作製するために利用しうるバイオマーカーは、感染に反応する免疫系の状態の情報を与えることが公知のバイオマーカーを含みうる；しかし、これらのバイオマーカーの全てが等しく情報を与えるとは限らない。これらのバイオマーカーは、ホルモン、自己抗体、可溶性および不溶性レセプター、成長因子、転写因子、宿主からまたは病原体自体からの細胞表面マーカーおよび可溶性マーカー、例えば、コートタンパク質、リポ多糖（内毒素）、リポテイコ酸などを含みうる。他のバイオマーカーは、限定されるものでないが、細胞表面タンパク質、例えばCD64タンパク質；CD11bタンパク質；HLAクラスII分子、例えばHLA-DRタンパク質およびHLA-DQタンパク質；CD54タンパク質；CD71タンパク質；CD86タンパク質；表面結合腫瘍壊死因子レセプター（TNF-R）；パターン認識レセプター、例えばToll様レセプター（TLR）；可溶性マーカー、例えばインターロイキンIL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、およびIL-18；腫瘍壊死因子α（TNF-α）；ネオプテリン；C-反応性タンパク質（CRP）；プロカルシトニン（PCT）；6-ケトFlα；トロンボキサンB2；ロイコトリエンB4、C3、C4、C5、D4およびE4；インターフェロンγ（IFNγ）；インターフェロンα/β（IFNα/β）；リンホトキシンα（LTα）；補体成分（C'）；血小板活性化因子（PAF）；ブラジキニン；一酸化窒素（NO）；顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）；マクロファージ抑制因子（MIF）；インターロイキン-1受容体拮抗薬（IL-1ra）；可溶性腫瘍壊死因子受容体（sTNFr）；可溶性インターロイキン受容体（sIL-1rおよびsIL-2r）；トランスフォーミング成長因子β（TGFβ）；プロスタグランジンE2（PGE2）；顆粒球-コロニー刺激因子（G-CSF）；ならびに他の炎症性メディエーターを含む。（総括は、Oberholzerら, Shock 16:83-96 (2001)、およびVincentら, 「敗血症テキスト（The Sepsis Text）」, Carletら編, Kluwer Academic Publishers (2002)を参照）。通常かつ臨床的に菌血症と関係があるバイオマーカーも、かかるバイオマーカーが通常かつしばしば生物学的サンプル中に出現するのであれば、本発明に有用であるバイオマーカーの候補である。バイオマーカーは、タンパク質もしくは核酸の断片でありうる低分子量の化合物を含んでもよくまたは代謝産物を含んでもよい。代謝産物などの低分子量化合物の存在または濃度は、敗血症および／またはSIRSに関係する表現型の変化を反映しうる。特に、小分子バイオマーカーの濃度の変化は細胞代謝産物の変化に関係しうるのであって、この変化はSIRSおよび／または敗血症に反応するいずれかの生理学的変化、例えば低体温または高熱症、心拍数または呼吸数の増加、組織低酸素血症、代謝性アシドーシスまたはMODの結果として起こる。バイオマーカーはまた、タンパク質バイオマーカーをコードするRNAおよびDNA分子を含みうる。
【００６３】
バイオマーカーはまた、白血球モジュレーション、例えば好中球活性化または単球非活性化に関わる少なくとも１つの分子を含んでもよい。CD64およびCD11bの発現の増加は、好中球および単球活性化のサインとして認識されている（Oberholzerら（前掲）およびVincentら（前掲）の総括を参照）。本発明に有用でありうるこれらのバイオマーカーの中には、マクロファージ溶解産物に関係があるバイオマーカー、ならびにサイトカイン代謝の変化のマーカーがある（Gagnonら, Cell 110:119-31 (2002)；Oberholzerら（前掲）；Vincentら（前掲）を参照）。
【００６４】
バイオマーカーはまた、炎症プロセスに関わることが公知のまたは関わることが見出されているシグナル伝達因子も含みうる。シグナル伝達因子は事象の細胞内カスケードを開始することができ、それらの事象としては受容体結合、受容体活性化、細胞内キナーゼの活性化、転写因子の活性化、遺伝子転写および／または翻訳のレベルの変化、ならびに代謝プロセスの変化などが挙げられる。シグナル伝達分子およびこれらの分子により活性化されるプロセスをまとめて、本発明の目的のために「敗血症経路に関わる生物分子」と定義する。関係する予測性バイオマーカーは敗血症経路に関わる生物分子を含みうる。
【００６５】
従って、本発明の方法は予測性バイオマーカーを同定するための偏りのない（unbiased）手法を利用しうる一方、当業者には、生理学的反応にまたは様々なシグナル伝達経路と関係がある特定のバイオマーカーのグループが特に関心の対象となることは明らかであろう。これに特に該当するのは、生物学的サンプルからのバイオマーカーを、様々なバイオマーカーの量をバイオマーカーとの直接および特異的相互作用を介して測定するために利用しうるアレイ（例えば、抗体アレイまたは核酸アレイ）と接触させる場合である。この場合、アレイの成分の選択は、ある特定の経路が個体における敗血症またはSIRSの状態の決定に関連するという示唆に基づくことができる。ある特定の生物分子が敗血症またはSIRSの予測または診断に関わるという特性を有するという指標から、一致した様式で生理学的に同様に調節される他の生物分子が予測または診断特性を提供しうるという予想が生じうる。しかし、当業者は、かかる予想は、生物学的系が複雑であるために現実的でないことを理解するであろう。例えば、もしある特定のmRNAバイオマーカーの量が予測特性であったとしても、もし他のバイオマーカーの発現が転写後レベルで調節されれば、他のバイオマーカーのmRNA発現における一致した変化は測定できないであろう。さらに、バイオマーカーのmRNA発現レベルは、敗血症に対する生理学的反応に関わるかまたは関わらない多重の収斂する経路の影響を受けうる。
【００６６】
バイオマーカーはいずれの生物学的サンプルから得てもよく、それらは、例示であって限定するものではないが、血液、血漿、唾液、血清、尿、大脳脊髄液、痰、糞便、細胞および細胞抽出物、または他の生物学的液体サンプル、組織サンプル、または宿主もしくは患者からの組織生検サンプルであってもよい。個体から採取される正確な生物学的サンプルは様々でありうるが、サンプリングは最小限に侵襲性であって通常技術により容易に実施しうることが好ましい。
【００６７】
表現型変化の測定はいずれの通常技術により実施してもよい。体温、呼吸数、脈拍、血圧または他の生理学的パラメーターの測定は、臨床における観察および測定を介して実施することができる。バイオマーカー分子の測定値は、例えば、その存在、濃度、発現レベルを示す測定値、またはバイオマーカー分子と関係があるいずれか他の値を含むことができる。バイオマーカー分子の検出の形態は、典型的には、生物学的サンプルからこれらのバイオマーカーのプロファイルを作るために利用する方法に依存する。例えば、2D-PAGEにより分離されたバイオマーカーはクーマシーブルー染色によりまたは銀染色により検出し、これらの方法は当技術分野で十分に確立されている。
【００６８】
有用なバイオマーカーの単離
有用なバイオマーカーとして、未だ同定されてないまたは関連生理学的状態と関係があるバイオマーカーがありうると予想される。本発明の一態様においては、有用なバイオマーカーを、生物学的サンプルからのバイオマーカープロファイルの成分として同定する。かかる同定は、イムノアッセイまたは自動化されたミクロ配列決定法を含む当技術分野で周知の方法により行うことができる。
【００６９】
一旦、有用なバイオマーカーが確認されると、そのバイオマーカーを、多数の周知の単離方法の１つにより単離することができる。従って、本発明は、敗血症を診断または予測するバイオマーカーを単離する方法であって、個体の集団から得た参照バイオマーカープロファイルを得るステップ、敗血症または敗血症進行段階の１つを診断または予測する参照バイオマーカープロファイルの特性を同定するステップ、その特性と対応するバイオマーカーを同定するステップ、およびそのバイオマーカーを単離するステップを含むものである上記方法を提供する。一旦、単離すると、例えば、もしそれがタンパク質であれば、そのバイオマーカーを用いてバイオマーカーと結合する抗体を産生させることができるしまたはもしそれが核酸であれば、それを用いて特異的なオリゴヌクレオチドプローブを開発することができる。
【００７０】
当業者は、有用な特性をさらに特徴付けてそのバイオマーカーの分子構造を決定できることを容易に理解するであろう。生物分子をこのやり方で特徴づける方法は当技術分野で周知であり、高分解質量分析法、赤外分光法、紫外分光法および核磁気共鳴を含む。核酸バイオマーカーのヌクレオチド配列、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列、および炭水化物バイオマーカーの組成および配列を決定する方法も当技術分野では周知である。
【００７１】
本発明のSIRS患者への応用
一実施形態においては、本明細書に記載した方法を用いて、特に敗血症を発生するリスクのあるSIRS患者をスクリーニングする。生物学的サンプルをSIRS陽性患者から採取し、そしてサンプルのバイオマーカーのプロファイルを、最終的に敗血症に進行したSIRS陽性個体からの参照プロファイルと比較する。患者のバイオマーカープロファイルの対応する敗血症に進行したSIRS陽性集団の参照プロファイルへの分類は、SIRS陽性患者が同様に敗血症に進行しうると診断することになる。次いで、治療体制を開始して敗血症の進行に先手を打つかまたは防止することができる。
【００７２】
他の実施形態においては、本明細書に記載の方法を用いて、ある患者がSIRSを有する臨床上の疑いを確認する。この場合、サンプル中のバイオマーカーのプロファイルを、SIRSを有するかまたはSIRSを有しない個体の参照集団と比較する。次いで、患者のバイオマーカープロファイルの対応する一集団または他の集団への分類を用いて、SIRSを有するかまたはSIRSを有しない個体を診断することができる。
【００７３】
実施例
次の実施例は、本発明が包含する実施形態の代表例であり、決して本発明が包含する対象を限定するものではない。
【００７４】
実施例１：定量的液体クロマトグラフィ／エレクトロスプレーイオン化質量分析計（LC/ESI-MS）を用いる、小分子バイオマーカーの同定
1.1. 受領して分析したサンプル
参照バイオマーカープロファイルを患者の２つの集団に対して確立した。第１集団（「SIRSグループ」）は、SIRSを発生しかつ「第１日」に本研究に入ったが、彼らの入院中に敗血症へ進行しなかった20人の患者である。第２集団（「敗血症グループ」）は、同様にSIRSを発生しかつ「第１日」に本研究に入ったが、本研究に入った後、少なくとも数日で敗血症へ進行した20人の患者である。血液サンプルを毎24時間、それぞれの研究グループから採取した。敗血症グループにおける敗血症の臨床上の疑いは、通常技術によって「時点0」に起こった。「時点−24時間」および「時点−48時間」は、敗血症グループにおいて敗血症発症の臨床的疑いに先立つそれぞれほぼ24時間前の時点およびほぼ48時間前の時点を表す。すなわち、敗血症グループからのサンプルは、研究に入った日（第１日）、敗血症の臨床的疑いに先立つほぼ48時間前（時点−48時間）、敗血症の臨床的疑いに先立つほぼ24時間前（時点−24時間）、ならびに敗血症発症の臨床的疑いの日（時点0）に採取したサンプルを含むものである。全部で160件の血液サンプル（20人の敗血症患者からのサンプル80件および20人のSIRS患者からのサンプル80件）を分析した。
【００７５】
1.2. サンプル調製
血漿中では、相当な数の小分子がタンパク質と結合して、パターン作製法により検出される小分子の数を減少しうる。従って、タンパク質と結合しうる小分子を遊離した後、ほとんどのタンパク質を血漿サンプルから除去した。タンパク質を除去する適当な方法は、限定されるものでないが、氷冷メタノール、アセトニトリル（ACN）、ブタノール、またはトリクロロ酢酸（TCA）、または熱変性および酸加水分解を含む。この実施例においては、血漿を氷冷メタノールを用いて抽出した。メタノール抽出が好ましいのは、小分子の最高数の検出を得たからである。各血漿サンプルからの50μLを、100μLの氷冷100％メタノールと混合して、最終容積百分率67％のメタノールを得た。その溶液を60秒間攪拌した。次いでサンプルを4℃にて20分間インキュベートし、そしてタンパク質を12,000rpmにおける遠心分離により10分間沈降させた。上清を取除いて乾燥し、そして50μLの水中に再懸濁した。LC/MS分析の前に、抽出した血漿サンプルに２種の低分子量分子、スルファクロロピリダジンおよびオクタデシルアミンを加えた。これらの分子はイオン強度および滞留時間を正規化する内部標準として役立った。スルファクロロピリダジンはMSにより決定して285.0 Daのm/zを有しかつLCにより決定して44％ACNにて溶出し；オクタデシルアミンは270.3 Daのm/zを有しかつ89％ACNにて溶出する。
【００７６】
1.3. LC/ESI-MS分析
再懸濁した上清の10μLを、2.1x100mm C18 Waters Symmetry LCカラム（粒径＝3.5μm；内孔径＝100Å）上に注入した。次いでカラムを300μL/分で温度25℃にて0.1％ギ酸中のACNの３段階直線勾配を用いて溶出した。t＝0〜0.5分の間、ACN濃度は9.75％〜24％であり；t＝0.5〜20分の間、ACN濃度は24％〜90.5％であり；t＝20〜27分の間、ACN濃度は90.5％〜92.4％であった。本明細書において上述の実験条件を「LC実験条件」と呼ぶ。LC実験条件のもとで、スルファクロロピリダジンは44％ACNで6.4分間の滞留時間にて溶出し、そしてオクタデシルアミンは89％ACNで14.5分間の滞留時間にて溶出した。次いでLCにより分画したサンプルを、直列でLCカラムに接続したAgilent MSD 1100四重極質量分析計（LC/ESI-MS）を用いてESI-MS処理にかけた。質量／電荷比（m/z）100または150〜1000 Daの範囲のイオンに対して、陽イオンモードにてキャピラリー電圧4000Vで質量分析データを得た。LC/ESI-MS分析をそれぞれのサンプルに対して３回実施した。データはそれぞれのイオンのm/z（ダルトン）と滞留時間（分）で（「m/z、滞留時間」で）表すことができて、ここでイオンの滞留時間は、直線ACN勾配の逆相カラムからの溶出に必要な時間である。しかし、ラン毎の滞留時間の僅かな変動を説明するために、データはまた、m/zとイオンがC18カラムから溶出するときのACN百分率（これは実験の可変性による大きく影響を受けないであろうイオンの固有物性を表す）で（「m/z、ACN百分率」で）表現することもできる。溶出時の滞留時間とACN百分率の間の関係は、次式：
0＜t＜0.5に対して、％ACN＝28.5t＋9.75；
0.5＜t＜20に対して、％ACN＝3.4103(t−0.5)＋24；および
20＜t＜27に対して、％ACN＝0.27143(t−20)＋90.5；
によって表現される。
【００７７】
これらのパラメーターに対する値は、それでもなお近似値であって実験の間で僅かに変動しうると理解すべきである；しかし、特に、もしそのサンプルを１以上の内部標準を用いて調製すれば、イオンは再現性があると認識することができる。以下に示したデータにおいて、m/z値は±0.4m/z以内で測定した一方、イオンが溶出するACN百分率は±10％以内で測定した。
【００７８】
1.4. データ解析と結果
数百のスペクトルの特性をそれぞれの血漿サンプルから分析した。類似の特性をスペクトルの間でアラインメントした。アラインメントアルゴリズムの選択は、本発明にとって重要でなく、当業者はこの目的に利用しうる様々なアラインメントアルゴリズムを知っている。全部で4930種の分光特性を分析した。この実施例の目的に対して、用語「特性」は、ある特定のイオンに対応する「ピーク」と互換的に使用する。異なる５個体から得たサンプルの代表的なピークを表１に示す。第１列は、括弧内に、m/zと各イオン溶出時のACN百分率をそれぞれ掲げた。残りの列は、それぞれの患者からの対応するイオンの正規化強度であり、これらは２つの内部標準の強度に対してその強度を正規化することにより決定した。400種を超えるピークが0.1より高い平均正規化強度を有した。
【表１】
【００７９】
様々な手法を用いて、SIRSと敗血症グループの間を識別する決定ルールの情報を与えるイオンを同定することができる。この実施例において選んだ方法は、(1)２つのグループの間の平均イオン強度を比較する方法、および(2)データ解析アルゴリズムを用いて分類ツリーを作製する方法である。
【００８０】
1.4.1. 平均イオン強度の比較
平均イオン強度の比較は、SIRSと敗血症患者の間の個々のイオン強度の差を効果的に強調する。1800を越える正規化イオン強度を、敗血症グループとSIRSグループに対して別々に平均した。敗血症グループまたはSIRSグループのいずれかで0.1より低い平均正規化強度を有するイオンは、両グループからのプロファイル中で0.1より大きい正規化強度を有するこれらのイオンとは分離して分析した。0.1より大きい正規化強度を有するほぼ400種のイオンについて、平均正規化強度の敗血症グループ対SIRSグループの比を決定した。これらのイオンの相対強度比の分布を図３に示す。
【００８１】
この方法を用いて、表２に掲げた23イオンが敗血症の患者からのサンプル中でSIRSの患者より少なくとも３倍高い強度を提示すること（例えば図３を参照、ここでイオン強度比の自然対数はほぼ1.1より大きい）、ならびに敗血症の患者の少なくとも半分にそして一般的にSIRSを有する患者のほぼ３分の１〜４分の１に存在することが観察された。この文脈において、バイオマーカーの「存在」は、ある特定の患者におけるバイオマーカーの平均正規化強度が患者全体で平均した正規化強度の少なくとも25％であったことを意味する。これらのイオン、またはそのサブセットが本発明の方法を実施するために有用である一方、さらなるイオンまたは他のイオンのセットも同様に有用でありうる。
【表２】
【００８２】
【００８３】
これらのバイオマーカーのサブセットは、大多数の敗血症陽性集団中で少なくとも３倍高い強度にて存在した。具体的には、これらのバイオマーカーの少なくとも12種は半分を超える敗血症陽性集団において上昇したレベルで見出され、かつ少なくとも７種のバイオマーカーは敗血症陽性集団の85％において存在し、この事はこれらのマーカーの組合わせが敗血症発症の有用な予測因子を提供しうることを示す。全てのバイオマーカーは、表３に示すように、SIRS陽性集団と対比して上昇したレベルにあった。
【表３】
【００８４】
【００８５】
表４に掲げた２イオンは、SIRS集団において敗血症集団より３倍高い平均正規化強度を有することが観察された（図３を参照、ここでイオン強度比の自然対数は、ほぼ−1.1より低い）。
【表４】
【００８６】
0.1より大きい平均正規化強度を有しかつ少なくとも３倍高い敗血症グループ対SIRSグループの強度を示す32イオンを同定した。これらのイオンを表5Aに掲げる。同様に、0.1より小さい平均正規化強度を有しかつ少なくとも３倍高い敗血症グループ対SIRSグループの強度を示す48イオンを同定した。これらのイオンを表5Bに掲げる（負の滞留時間は、滞留時間が内部標準に対するものである事実を反映する）。
【表５Ａ】
【表５Ｂ】
このように、本発明の参照バイオマーカープロファイルは複数の特性の組合わせを含んでなり、上記特性はエレクトロスプレーイオン化質量分析計によりポジティブモードで測定してほぼ100または150Da〜ほぼ1000Daのm/zを有するイオンの強度でありかつ上記特性はほぼ3:1以上の敗血症陽性参照集団対SIRS陽性参照集団の平均正規化強度比を有するものである。あるいは上記特性はほぼ1:3以下の敗血症陽性参照集団対SIRS陽性参照集団の平均正規化強度比を有するものであってもよい。これらのバイオマーカーは、敗血症の発症に先立つほぼ48時間前に採取した生物学的サンプルから、通常技術により測定して得たバイオマーカープロファイル中に出現するので、敗血症の発症の予測因子であると考えられる。
【００８７】
1.4.2. 特性強度の経時変化
試験したバイオマーカープロファイルは、個体が敗血症の発症へ進行するとともに、一層より高いレベルで発現される特性と一層より低いレベルで発現される特性を提示した。これらの特性に対応するバイオマーカーは個体の感染および／または炎症に対する生物学的反応を特徴づけると考えられる。以上述べた理由により、これらのバイオマーカーは、個体における敗血症またはSIRSの状態を決定するための特に有用な予測因子を提供しうると考えられる。すなわち、ある個体由来の色々な生物学的サンプルから得たプロファイルにおけるこれらの特性の比較は、個体が重症敗血症へ進行しつつあるかどうかまたはSIRSが正常へ進行しつつあるかどうかを確立すると考えられる。
【００８８】
表２に掲げた23イオンのうち、14イオンは時点−48時間集団において最高強度を示し、８イオンは時点−24時間集団において最高強度を示し、そして１イオンは時点0集団において最高強度を示した。敗血症グループからの生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの強度の代表的な経時変化を図4Aに示すとともに、SIRSグループからの生物学的サンプルにおける同じバイオマーカーの強度の代表的な経時変化を図4Bに示す。437.2Daのm/zおよび1.42分の滞留時間を有するこの特定のイオンは、敗血症グループにおいて、通常技術により診断して、これらの患者の敗血症への変換に先立つ48時間前に強度のピークを示す。従って、生物学的サンプル中のこのイオンの相対強度のピークは、その個体におけるほぼ48時間以内の敗血症発症の予測因子として役立つ。
【００８９】
1.4.3. 交差検定（Cross-Validation）
決定ルールが、比較的少数のバイオマーカープロファイルからの多数の特性に基づくとき、選択偏差が決定ルールの情報を与える特性の同定に影響を与えうる（Ambroiseら, Proc. Net'l Acad. Sci. USA 99:6562-66 (2002)を参照）。選択偏差はデータを用いて特性を選択するときに起こりうるので、性能は、選択プロセスにおいて可変性が考慮されなかった選択特性で条件付けして評価される。その結果、分類正確度の過剰評価が起こる。選択基準に対する補償をしないと、分類正確度は決定ルールが無作為入力パラメーターに基づくときですら100％に達しうる（同上）。選択偏差は性能評価プロセスで特性選択を含むことにより避けることができ、その性能評価プロセスは10回交差検定（cross-validation）またはブートストラップ手続き（bootstrap procedure）のいずれのタイプであってもよい（例えばHastieら（前掲）の7.10-7.11、を参照、これは本明細書に参照により組み入れられる）。
【００９０】
本発明の一実施形態においては、モデル性能を10回交差検定により測定する。10回交差検定はデータを無作為に10の排他的グループに分配することにより実施する。それぞれのグループを順に排除して、モデルを残る９グループに適合させる。適合させたモデルを排除したグループに適用し、予測クラスされる確率を作る。単に予測クラスを作製することにより、予測されるクラス確率を実際のクラスメンバーシップと比較することができる。例えば、もし敗血症の確率がおよそ0.5より大きければ、予測クラスは敗血症となる。
【００９１】
デビアンス（deviance）は確率を実際の結果と比較する尺度である。本明細書に用いる「デビアンス」は：
-2{Σln(P(敗血症))（敗血症事例に対する和）＋Σln(P(SIRS))（SIRS事例に対する和）}
［式中、Pは規定したクラスに対するクラス確率である］
として定義される。実クラスに対するクラス確率が高いときは、デビアンスが最小化される。２つのモデルは所与のデータに対して同じ予測をなしうるが、好ましいモデルはより小さい予測デビアンスを有する。10回交差検定における10回の反復のそれぞれに対して、その反復中にモデル適合から外された事例について予測デビアンスを計算する。その結果として10個の不偏デビアンスを得る。典型的には、これらの10個のデビアンスを合計して全データセットについてのモデル性能の総括（すなわち、正確度）を作製する。実際には、異なる10個のモデルを適合させたので、交差検定はある特定モデルの性能を証明しない。どちらかといえば、10個のモデルを共通のモデル化プロセスにより作製し、交差検定はこのプロセスの性能を証明した。このプロセスから生じる第11番目のモデルは恐らく最初の10個のモデルと類似した予測性能を有しうる。10回交差検定の利用によって、100％未満のモデル性能を得るが、10回交差検定後に得た性能は、訓練セット以外のサンプルから得たバイオマーカープロファイルに応用する場合、生理学的に意味のある決定ルールの予測正確度をより厳密に反映すると予想される。
【００９２】
1.4.4. 分類ツリー分析
このデータを分析する１つの手法は、大きいデータセット中のパターンおよび関係を検索する分類ツリーアルゴリズムを利用する手法である。「分類ツリー」は、患者をクラスの１つに正確に配置するように設計した一連の質問を用いて、ある特定の患者を特定のクラス（例えば、敗血症またはSIRS）に分類する再帰的配分（recursive partition）である。それぞれの質問は、患者の症状が所与の予測因子を満たすかどうかを訊ね、それぞれの答えを利用して分類ツリーを下って利用者を手引きし、最後に患者があてはまるクラスを決定することができる。本明細書で用いる「予測因子（predictor）」は、特徴的なm/zとACN中のC18カラムからの溶出プロファイルを有する１つのイオンの特性（この実施例ではイオン強度）の値の範囲である。「状態（condition）」は、個体のバイオマーカープロファイル中の測定された特性の単一の特定値である。この実施例において、「クラス名」は敗血症およびSIRSである。従って、分類ツリー利用者は最初に、個体のバイオマーカープロファイル中の測定された第１イオン強度が第１イオンの予測範囲の所与の範囲内に入るかどうかを訊ねるであろう。第１質問に対する答えは、個体がSIRSまたは敗血症を有するかどうかを決定する手掛かりになりうる。それに対して、第１質問に対する答えはさらに利用者が個体のバイオマーカープロファイルの測定した第２イオン強度が第２イオンの予測範囲の所与の範囲内に入るかどうかを訊ねるように仕向けてもよい。再び、第２質問に対する答えは手掛かりになるかもしれないし、または、最終的に患者分類の決定するまでさらに分類ツリーを下るように仕向けるかもしれない。
【００９３】
敗血症およびSIRS集団から時点0で採取したイオン強度の代表的セットを、分類ツリーアルゴリズムを用いて分析し、そしてその結果を図５に示す。この場合、分析したイオンのセットは、0.1未満の正規化強度をもつイオンのセットを含んだ。分類ツリーにおける第１決定点は、ほぼ448.5ダルトンのm/zおよびほぼ32.4％の溶出時ACNを有するイオンがほぼ0.0414より低い正規化濃度を有するかどうかである。もしその質問に対する答えが「イエス」であれば、次いで左分枝を下って他の質問またはあるクラス名へ進む。この事例では、もし正規化強度がほぼ0.0414より低ければ、次いで「SIRS」のクラス名へ進んで、個体はSIRS陽性であるが敗血症陰性として分類される。もしその答えが「ノー」であれば、次いで右分枝を下って次の決定点へ進み、そのようにして、クラス名に到達するまで進む。この実施例では、３つの決定点を用いて個体のクラス名を予測した。患者をSIRSまたは敗血症陽性として分類するためには単一の決定点を用いてもよいが、他のイオンを用いるさらなる決定点は一般的に分類の正確度を改良した。当業者は、多数の異なる分類ツリーが大きなデータセットから可能であることを理解するであろう。すなわち、例えば、個体をSIRS集団または敗血症集団に属するとして分類するために利用しうるバイオマーカーの多数の組合わせがある。
【００９４】
1.4.5. 多重追加回帰ツリー
多重追加回帰ツリー（MART）を用いる自動、フレキシブルモデル技術を利用して、特性のセットを２つの集団の１つに属するとして分類した。MARTモデルは、全ての予測に適用する定数を規定する初期オフセットを使い、続いて一連の回帰ツリーを用いる。その適合（fitting）は、それぞれのツリーの決定点の数、適合させるツリーの数、およびある特定のツリーがいかに根本的にMARTモデルに影響を与えうるかを規定する「グラニュラリティ定数（granularity constant）」により規定する。それぞれの繰返しに対して、回帰ツリーを適合させて適合判定基準の最も険しい下降方向を求める。その方向に、グラニュラリティ定数により規定した長さを有する１ステップを進める。従って、MARTモデルは「初期オフセット」＋「回帰ツリーが与えるステップ」から構成される。観察値と予測値の間の差を再計算し、そしてサイクルを再び進めて、予測を漸進的に洗練させる。このプロセスを、予め定めたサイクル数またはある停止ルールが作動するまで続ける。
【００９５】
それぞれのツリー中の分岐の数は特に意味のある適合パラメーターである。もしそれぞれのツリーが１つの分岐しか有しなければ、モデルは１つの特性しか見ず、２つの予測因子を組合わせることができない。もしそれぞれのツリーが２つの分岐を有すれば、モデルは特性間の二通りの相互作用に適応させることができる。３つのツリーを用いると、モデルは三通りの相互作用に適応させることができるという具合である。
【００９６】
クラス状態を予測する特性のセットの値を、特性および既知のクラス状態（例えば、敗血症またはSIRS）についてのデータセットを用いて決定した。MARTは、個体特性の分類決定ルールに対する寄与または重要度の尺度を与える。具体的には、ある単一の特性が所与のツリー分岐におけるその選択時に決定ルールに寄与する度合いを測定し、特性の格付けを、最終決定ルールを決定する上でのそれらの重要度により与えることができる。MART分析を同じデータセットについて繰返すと、特に決定ルールを確立するのに重要度の低い特性について、若干異なる特性の格付けを生じうる。従って、本発明に有用である予測特性とその対応するバイオマーカーのセットは、本明細書に記載したものから若干変化しうる。
【００９７】
MART技術の１つの実行例は、R統計プログラミング環境に対するモジュール、または「パッケージ」に見出される（Venablesら, 「Sを用いる現代応用統計学（Modern Applied Statistics with S）」, 第4版. (Springer, 2002)；www.r-project.orgを参照）。この文書に報じられた結果を、Rバージョン1.7.0および1.7.1を用いて計算した。Dr. Greg Ridgewayが記載したMARTを実行するモジュールは「gbm」と呼ばれるもので、自由にダウンロードもできる（www.r-project.orgを参照）。MARTアルゴリズムは10回交差検定に受け入れられる。グラニュラリティパラメーターを0.05にセットし、gbmパッケージの内部停止ルールはそれぞれのマークした反復においてデータ事例の20％を残すことに基づいた。相互作用の程度は１に設定したので、特性間の相互作用は考慮されなかった。gbmパッケージは、それぞれの特性の相対的重要度を、バイオマーカープロファイルの全特性に対して累積すると100％に等しくなる百分率ベースで評価する。一緒になって全重要度の少なくとも90％に当たる最高の重要度をもつ特性群を、潜在的に予測価値を有すると報じた。全てのMARTモデルの適合の停止ルールは、適合および特性選択をモデル化する確率的要素に影響する点を注意すること。従って、同じデータに基づく多重MARTモデリング実施の結果が、特性の僅かに異なる、または場合によってはさらに、完全に異なる特性のセットを選ぶことがありうる。かかる異なるセットは同じ予測情報を運ぶものであり；従って、全てのセットが本発明に有用である。MARTモデルを十分な回数だけ適合させると、バイオマーカープロファイル内の全ての可能な予測特性のセットを作ると考えられる。従って、開示した予測因子のセットは、個体を集団に分類するために利用しうる特性のセットを単に代表するものである。
【００９８】
1.4.6. ロジスティック回帰分析
ロジスティック回帰はさらに、上記のLC/MS分析からのデータストリームを解析する他の手法を与える。「ピーク強度」を、スペクトルの所与のm/z位置に現れるピークの高さによって測定する。所与のm/z位置にピークが不在であるときは、「0」のピーク強度を割付ける。次いで、所与のm/zからのピーク強度の標準偏差（SD）を、組合わせたSIRSと敗血症の集団のスペクトルから得る。もしSIRSと敗血症集団の間でピーク強度の変化がなければ（すなわち、SD＝0であれば）、そのピーク強度はさらに考慮しない。回帰分析の前に、当技術分野で周知の方法を用いてピーク強度をスケール変換（scale）する。スケール変換アルゴリズムは一般的にHastieら（前掲、第11章）に記載されている。
【００９９】
この特性選択方法により時点0のバイオマーカープロファイルから26個の入力パラメーター（すなわち、バイオマーカー）を同定し、表６に掲げた。入力パラメーターを統計的重要度の順に格付けしたが、低い格付けの入力パラメーターでもなお臨床的に価値がありかつ本発明にとって有用でありうる。さらに、当業者は、所与の入力パラメーターの格付け重要度は、もしその参照集団が多少なりとも変われば変わりうることを理解するであろう。
【表６】
【０１００】
この同じロジスティック回帰分析を利用し、時点−48時間に採取したサンプルを使って、敗血症の発症を予測する重要度の順にバイオマーカーを格付けすることができる。特性選択プロセスにより、表７に示した時点−48時間サンプルに対する37個の入力パラメーターを得た。
【表７】
【０１０１】
1.4.7. Wilcoxon符号付順位検定分析
さらに他の方法においては、ノンパラメトリック検定、例えばWilcoxon符号付順位検定を用いて目的の個体バイオマーカーを同定することができる。バイオマーカープロファイル中の特性に、バイオマーカーが個体をある特定参照集団に属するとして分類できる確度を示す「p値」を割付ける。一般的に、予測価値を有するp値はほぼ0.05より低い。低いp値を有するバイオマーカーを用いて、それ自体により個体を分類することができる。あるいは、２種以上のバイオマーカーの組合わせを用いて個体を分類し、これらのバイオマーカーは相対的p値に基づいて選んでもよい。一般的に、より低いp値をもつバイオマーカーが所与のバイオマーカーの組合わせとして好ましい。このやり方で、少なくとも３、４、５、６、10、20または30種以上のバイオマーカーの組合わせを用いて個体を分類することもできる。当業者は、いずれの所与のバイオマーカーの相対的p値も、その参照集団のサイズに依存して変化しうることを理解するであろう。
【０１０２】
Wilcoxon符号付順位検定を用いて、p値を時点0、時点−24時間および時点−48時間に採取した生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルからの特性に割付けた。
【０１０３】
これらのp値を表８、９および10にそれぞれ掲げた。
【表８】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
あるいは、ノンパラメトリック検定（例えば、Wilcoxon符号付順位検定）を用いて、敗血症へ進行しつつある集団における特性の漸進的出現および消滅に基づく特性に対するp値を見出すことができる。この検定の形態においては、所与の特性に対する基線値を、敗血症およびSIRSグループに対する研究に入る時間からのデータ（第１日サンプル）を用いて、最初に測定する。次いで敗血症とSIRSサンプルの特性強度を、例えば、時点−48時間サンプルと比較して、特性強度がその基線値から増加するかまたは減少するかどうかを決定する。最後に、p値を、敗血症集団対SIRS集団における特性強度の基線からの差に割付ける。次の表11〜13に掲げたp値は、これらの基線からの差をp値で測定して得たものである。
【表１１】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【表１２】
【０１１８】
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
実施例２：定量的液体クロマトグラフィ-質量分析計／質量分析計（LC-MS/MS）を用いるタンパク質バイオマーカーの同定
2.1. 受領して分析したサンプル
上記のように、参照バイオマーカープロファイルを、第１集団を表す15患者（「SIRSグループ」）およびSIRSを発生して敗血症へ進行した第２集団を表す15患者（「敗血症グループ」）から得た。血液を患者から第１日、時点0、および時点−48時間に採取した。この場合、患者からの50〜75μL血漿サンプルを４バッチ：すなわちSIRS陽性であった５個体および10個体の２バッチ、ならびに敗血症陽性であった５個体および10個体の２バッチにプールした。それぞれのプールしたバッチからさらに６サンプルを分析した。
【０１２３】
2.2. サンプル調製
血漿サンプルを最初に免疫枯渇させて豊富なタンパク質、特に、一緒にサンプル中のタンパク質のほぼ85％（wt％）を構成するアルブミン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、アンチトリプシン、IgG、およびIgAを除去した。免疫枯渇は、Multiple Affinity Removal System（多重アフィニティ除去システム）カラム（Agilent Technologies, Palo Alto, California）を用いて実施し、製造業者の指示書に従って使用した。上記６タンパク質の少なくとも95％を、血漿サンプルからこのシステムを用いて除去した。例えば、わずかほぼ0.1％のアルブミンしか枯渇したサンプル中に残らなかった。サンプル中に残ったわずか8％と見積られるタンパク質にはIgMおよびα-2マクログロブリンなどのタンパク質が高存在量で残存した。次いで分画した血漿サンプルを変性し、還元し、アルキル化し、そしてトリプシンを用いて、当技術分野で周知の方法を使って消化した。ほぼ2mgの消化したタンパク質をそれぞれのプールしたサンプルから得た。
【０１２４】
2.3. 多次元LC/MS
トリプシン消化後のペプチドを次いでLCカラムを用いて分画し、LC/MS/MS配置で構成したAgilent MSD/トラップESI-イオントラップ質量分析計より分析した。消化したタンパク質の1mgを10μL/分でミクロフローC18逆相（RP1）カラムにアプライした。RP1カラムを直列で強カチオン交換（SCX）分画カラムに、そしてこれを順にC18逆相トラップカラムに結合した。サンプルを0〜10％ACNの第１勾配でRP1カラムにアプライして、ペプチドをRP1カラム上で分画した。ACN勾配に続いて10mM塩バッファー溶出を行い、そしてさらにそのペプチドをSCXカラムと結合する画分と溶出画分に分画し、そして溶出画分はトラップカラム中に固定した。次いで、トラップカラムを、SCXカラムとのその操作しうる接続部から取り外し、他のC18逆相カラム（RP2）との操作しうる接続部に接続した。トラップカラム中に固定された画分をトラップカラムからRP2カラムへ0〜10％ACNの勾配により300nL/分にて溶出した。RP2カラムを、1000〜1500Vのスプレー電圧で操作しているAgilent MSD/トラップESI-イオントラップ質量分析計と操作しうる形で連結した。次いで、このサイクル（RPl-SCX-トラップ-RP2）を繰返して、残りのペプチドを0〜80％の全ACN％範囲および1Mまでの塩濃度を用いて分画しかつ分離した。他の好適なLC/MS/MSの配置構成を用いて、本発明に有用であるバイオマーカープロファイルを作製してもよい。質量スペクトルは200〜2200Daのm/z範囲で作製した。データに依存するスキャンと動的排除を適用してより高い動的範囲を達成した。図６はLC/MSおよびLC/MS/MSを用いて作製した代表的なバイオマーカープロファイルを示す。
【０１２５】
2.4. データ解析と結果
MS/MSモードで分析した全てのサンプルに対してほぼ150,000件のスペクトルを得たが、これはほぼ1.5ギガバイトの情報と等価であった。全体で、ほぼ50ギガバイトの情報を収集した。スペクトルは、Spectrum Mill v 2.7ソフトウエア（著作権、2003 Agilent Technologies, Inc.）を用いて分析した。MS-タグデータベース検索アルゴリズム（Millennium Pharmaceuticals）を用いて、MS/MSスペクトルを、ヒトの非重複（human non-redundant）タンパク質の米国国立生物技術情報センター（National Center for Biotechnology Information；NCBI）データベースと対合した。95％信頼度と等価のカットオフスコアを用いて、対合したペプチドを実証し、次いでこれをアセンブルしてサンプル中に存在するタンパク質を同定した。本方法を用いて検出可能であったタンパク質は血漿中にほぼ1ng/mLの濃度で存在し、ほぼ６のオーダーの量の血漿濃度の動的範囲をカバーする。
【０１２６】
血漿中に検出されたタンパク質の存在量の半定量的評価は、タンパク質に対して「ポジティブ」である質量スペクトルの数を決定することによって得た。ポジティブであるためには、イオン特性はスペクトル中の所与のm/z値において、検出しうるだけノイズより高い強度を有する。一般的に、血漿中でより高いレベルで発現されるタンパク質は、より多くのスペクトル中のポジティブなイオン特性またはイオン特性のセットとして検出可能であろう。このタンパク質濃度の尺度を用いて、様々なタンパク質が、SIRSグループ対敗血症グループで示差的に発現されることは明らかである。「上方調節された」検出タンパク質のうちの様々なタンパク質を図7Aおよび7Bに示したが、ここで上方調節されたタンパク質は敗血症グループにおいてSIRSグループより高いレベルで発現されたものである。図7Aから、タンパク質が発現されるレベルは経時的に、図４に示した#21（437.2Da、1.42分）と同じ様式で変化しうる。例えば、共にセリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビターに構造的に類似しているGenBank受託番号AAH15642およびNP000286を有するタンパク質は、経時的に敗血症陽性集団中で漸進的により高いレベルにて発現される一方、これらはSIRS陽性集団中では比較的一定量だけ発現される。これらのタンパク質の高レベルの出現、そして特に個体における経時的に漸進的なより高い発現は、これらが敗血症発症の予測因子であることを予想させる。敗血症陽性集団において経時的に下方調節された様々なタンパク質を、図8Aおよび8Bに示した。タンパク質のいくつか、例えばGenBank受託番号NP_079216に示される配列を有する無名のタンパク質の発現は、その発現が敗血症患者において減少しても、SIRS患者においては漸進的に増加するか比較的高いレベルに留まる。これらのタンパク質は、SIRSを診断するだけでなく敗血症の発症を予測するのにも特に有用なバイオマーカーでありうることを予想させる。
【０１２７】
実施例３：抗体アレイを利用するバイオマーカーの同定
3.1. 受領して分析したサンプル
参照バイオマーカープロファイルを、SIRSグループおよび敗血症グループに対して確立した。血液サンプルをそれぞれの研究グループから24時間毎に採取した。敗血症グループからのサンプルは、研究に入った日（第１日）、敗血症の臨床的疑いに先立つほぼ48時間前（時点−48時間）、および敗血症の発症の臨床的疑いの日（時点0）に採取したサンプルを含んだ。この実施例において、時点0で分析したSIRSグループと敗血症グループは14個体および11個体をそれぞれ含む一方、時点−48時間で分析したSIRSグループと敗血症グループは10個体および11個体をそれぞれ含んだ。
【０１２８】
3.2. 多重分析
それぞれのサンプル中のバイオマーカーのセットを米国特許第5,981,180号（「'180特許」）を用いて同時にリアルタイムで分析したが、上記特許は本明細書に参照によりその全て、そして特に一般的技法、ビーズ技術、システムハードウエアおよび抗体検出のその教示が組み入れられる。'180特許に記載のイムノアッセイは、本発明の方法に使用することができるイムノアッセイを代表する。さらに、本明細書に使用されるバイオマーカーは、本発明の方法に使用される利用しうるバイオマーカーの範囲を限定することを意味するものでない。この分析のために、色々な微粒子のセットから構成される微粒子のマトリックスを合成した。それぞれの微粒子のセットは、微粒子表面上に固定された数千種の異なる抗体捕捉試薬分子を有し、２種の蛍光染料の様々な量を組込むことによりカラーコードを付した。２種の蛍光染料の比はそれぞれの微粒子のセットに対して異なる発光スペクトルを提供し、様々な微粒子のセットをプールした後のあるセット内の微粒子の同定を可能にした。米国特許第6,268,222号および第6,599,331号もまた、本明細書に参照によりその全て、そして特に多重分析のための微粒子を標識する様々な方法のそれらの教示が組み入れられる。
【０１２９】
標識したビーズのセットをプールし、研究に用いる個体からの血漿サンプルと組合わせた。標識したビーズは、蛍光体標識を励起するレーザービームによってそれぞれの微粒子を問合せるフローデバイスを通して、単一ファイルを通過させることにより同定した。次いで光学検出器がそれぞれのビーズの発光スペクトルを測定してビーズを適当なセットに分類する。それぞれの微粒子のセットに対するそれぞれの抗体捕捉試薬は同定されているので、それぞれの抗体特異性はフローデバイスを通過する個々の微粒子と対合する。米国特許第6,592,822号もまた、本明細書に参照によりその全て、そして特にこの多重分析に利用しうる多重分析診断システムのその教示が組み入れられる。
【０１３０】
所与の微粒子のセットと結合した分析質の量を決定するために、レポーター分子を加え、レポーター分子がそれぞれの分析質と結合した抗体と複合体を形成するようにした。本実施例において、レポーター分子は蛍光体標識した二次抗体であった。レポーター上の蛍光体は異なる励起波長を有する二次レーザーにより励起され、二次抗体上の蛍光体標識が微粒子を標識するために用いた蛍光体から識別されうるようにする。第２の光学検出器は、捕捉抗体が結合した分析質と複合化した二次抗体上の蛍光体標識からの発光を測定して二次抗体の量を決定した。この方法によって、ビーズに捕捉された多重分析質の量を迅速かつリアルタイムに単一反応で測定することができる。
【０１３１】
3.3. データ解析と結果
それぞれのサンプルに対して、162種の異なる抗体と結合した分析質の濃度を測定した。この実施例においては、それぞれの分析質がバイオマーカーであり、そしてサンプル中のそれぞれの濃度がバイオマーカーの特性であってもよい。バイオマーカーを、Rules Based Medicine of Austin（Texas）から市販される下表14に掲げた様々な162種の抗体試薬について分析した。抗体試薬を、(1)血液の循環タンパク質バイオマーカー成分、(2)様々な病原体に関係がある分子と通常結合する循環抗体（示した通り、それぞれのバイオマーカーに関係がある病原体により同定した）、または(3)様々な病状に関係がある自己抗体バイオマーカーのいずれかと特異的に結合するとして分類した。
【表１４】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
様々な手法を用いて、個体をSIRSまたは敗血症グループに分類するための決定ルールに情報を与える特性を同定することができる。選んだ方法はロジスティック回帰とWilcoxon符号付順位検定である。
【０１３６】
3.3.1. ロジスティック回帰を用いるデータの解析
バイオマーカーイムノアッセイからの定量的結果を、ロジスティック回帰を用いて分析した。時点0の集団に対する、SIRSを敗血症から識別するパターンを含むトップ26のバイオマーカーを表15に掲げる。時点−48時間の集団に対する、SIRSを敗血症から識別するパターンを含むトップ14バイオマーカーを表16に掲げる。表15および16のデータは、SIRSと敗血症グループを識別するパターンを含むこれらのバイオマーカーを実証するものである。
【表１５】
【表１６】
【０１３７】
3.3.2. Wilcoxon符号付順位検定を用いるデータの解析
Wilcoxon符号付順位検定を用いて目的の個体タンパク質バイオマーカーを同定することもできる。表14に掲げたバイオマーカーにp値を、所与の時点における敗血症とSIRS集団の比較により、上記の実施例1.3.7、表８〜10と同じやり方で割付けた。この解析に対して、時点0における敗血症とSIRS集団（表17）はそれぞれ23患者および25患者から構成され；時点−24時間における敗血症とSIRS集団（表18）はそれぞれ25患者および22患者から構成され；そして時点−48時間における敗血症とSIRS集団（表19）はそれぞれ25患者および19患者から構成された。
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【０１３８】
さらに、p値を、敗血症へ進行しつつある集団の特性の漸進的出現または消滅に基づいて、実施例1.4.7、表11〜13と同じやり方で割付けた。この解析に対する集団サイズは、時点−48時間における敗血症とSIRS集団がそれぞれ22患者および18患者から構成されたことを除くと、直ぐ上に示したのと同じであった。
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【０１３９】
3.3.3. 多重適合回帰ツリー（MART）を用いるデータの解析
時点0サンプルから得たタンパク質バイオマーカープロファイルからのデータを、実施例1.4.5に記載のMARTを用いて分析した。この分析において、時点0時間の敗血症集団は23患者から構成されかつSIRS集団は25集団から構成された。表14に掲げた全164種のバイオマーカーに対応する特性を分析した。適合させたモデルは24ツリーを含み、モデルは特性間の相互作用を認めなかった。10回交差検定を用いると、モデルはSIRSの25患者うちの17患者および敗血症の23患者のうちの17患者を正しく分類し、74％のモデル感度と68％の特異性を与えた。バイオマーカーを、モデルにより決定した重要度の順で格付けして表23に掲げた。0の特性は全て除いた。「1」のサインを用いて示したマーカーは、敗血症陽性患者において、敗血症が進行するとともに漸進的により高いレベルで発現したのに対して、「-1」のサインを持つバイオマーカーは漸進的により低いレベルで発現した。
【表２３】
【０１４０】
実施例４ SELDI-TOF-MSを用いるバイオマーカーの同定
4.1. サンプル調製と実験設計
SELDI-TOF-MS（SELDI）はさらに、本発明による、個体における敗血症またはSIRSの状態を決定する他の方法を提供する。SELDIは、生物学的サンプルからのバイオマーカー中の予測特性を同定する不偏的（non-biased）方法を可能にする。サンプルをレーザービームによりイオン化し、イオンのm/zを測定する。次いで様々なイオンを含むバイオマーカープロファイルを、上に記載したアルゴリズムのいずれかにより分析することができる。
【０１４１】
WCX2サンプルプラットフォームまたは「チップ」を用いる代表的なSELDI実験を記載する。各チップのタイプは特徴のあるバイオマーカーを吸収する；従って、同じサンプルから、使用する特定のチップのタイプに依存して色々なバイオマーカープロファイルを得ることができる。PPTTM VacutainerTMチューブ（Becton, Dickinson and Company、Franklin Lakes、New Jersey）中に採集した血液から、通常のプロトコルにより血漿（500μL）を調製した。その血漿を100μLアリコートに分割して-80℃にて保存した。WCX-2チップ（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont、California）を、Ciphergenバイオプロセッサーで製造業者プロトコルに従い、Biomek 2000ロボット（Beckman Coulter）を用いて調製した。１つのWCX-2チップは８箇所の結合スポットを有する。チップ上のスポットを、50％アセトニトリルの50μLによって５分間２回、次いで10mMのHClの50μLによって10分間、そして最後に脱イオン水50μLによって５分間、続けて洗浄した。洗浄の後、チップをWCX2バッファー50μLによって５分間２回条件付けして、その後に血漿サンプルを導入した。WCX-2チップ、ならびにH50、IMACおよびSAX2/Q10チップを含む他のチップタイプに対する洗浄バッファーを表24に記載する。
【表２４】
【０１４２】
条件付けしたWCX-2チップ上のそれぞれのスポットに、血漿サンプル10μLおよびWCX-2結合バッファー（20mM酢酸アンモニウムおよび0.1％Triton X-100、pH 6）90μLを加えた。室温にて30分間振とうしながらインキュベートした後に、スポットを２回、WCX-2結合バッファー100μLにより洗浄し、次いで脱イオン水100μLによって洗浄した。次いでチップを乾燥し、２回、マトリックス材料の飽和溶液、例えば50％アセトニトリル、0.5％TFA水溶液中のα-シアノヒドロキシ桂皮酸（99％）（CHCA）またはシナピン酸（SPA）0.75μLを用いてスポットした。次いで血漿タンパク質が結合したチップを、SELDI-TOF-MSにより表25に示した実験条件を用いて読み取った。
【表２５】
【０１４３】
表26〜49は、表25に示した条件下で血漿サンプルについて実施したSELDI実験に対するp値を示す。それぞれの表中で、示したチップのタイプはWCX-2、H50、Q10またはIMACである。それぞれのチップに対して、CHCAマトリックス、高エネルギーにおけるSPAマトリックス（表25参照）、または低エネルギーにおけるSPAマトリックスで実験を実施した。さらに、それぞれのマトリックスに対して、0時間、時点−24時間、および時点−48時間からのサンプルを分析した。掲げたイオンに対して決定したp値は、ノンパラメトリック検定を用いて（この事例ではWilcoxon符号付順位検定であった）決定した。対応する0.05未満のp値をもつイオンだけを掲げた（以下の表における空白欄は、サンプル中のこれらのイオンが0.05未満のp値を有しないことを示す）。最後に、それぞれのサンプルにおいて、p値を敗血症集団対SIRS集団における特性強度の基線からの差に割付け、これを、（実施例1.4.7.（前掲）のように）「基線からの差としての特性に対するp値」の表題を付した下表に掲げた。表に掲げたm/z値はほぼ2％の実験誤差を有する。
【表２６】
【０１４４】
【０１４５】
【表２７】
【０１４６】
【表２８】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【表２９】
【０１５１】
【０１５２】
【表３０】
【０１５３】
【表３１】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【表３２】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【表３３】
【０１６１】
【０１６２】
【表３４】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【表３５】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【表３６】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【表３７】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【表３８】
【０１７９】
【０１８０】
【表３９】
【０１８１】
【０１８２】
【表４０】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【表４１】
【０１８８】
【表４２】
【０１８９】
【０１９０】
【表４３】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【表４４】
【０１９５】
【表４５】
【０１９６】
【表４６】
【０１９７】
【表４７】
【０１９８】
【０１９９】
【表４８】
【表４９】
【０２００】
【０２０１】
MART分析を、実施例1.4.5.（前掲）に記載のように、表26〜49に掲げたSELDI分析からのデータについて実施した。表50は、２つの時点0サンプルからの、分類の正確度がほぼ60％に適合するかそれを越えるSELDI実験の結果を示す。
【表５０】
【０２０２】
以上、本発明を、ある特定の代表的実施形態を参照して全て説明したが、当業者であれば、本明細書に説明した本発明の精神または範囲から逸脱することなく、改変と修飾を行いうることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】SIRSの敗血症への進行を説明する。敗血症の症状は、少なくとも３段階からなり、敗血症患者は重症敗血症から敗血症ショックへそして多臓器不全へと進行する。
【図２】敗血症とSIRSの間の関係を示す。Vennダイアグラムに示される様々なセットは、示した症状を有する個体の集団に対応する。
【図３】敗血症陽性集団対SIRS陽性集団に対するイオンほぼ400種の平均正規化ピーク強度の比の自然対数を示す。
【図４Ａ】ESI-質量分析計プロファイルにおいて437.2Daのm/z、およびC18逆相カラム上で1.42分（min）の滞留時間を有するイオンの強度を示す。図4Aは敗血症を発生した個体の様々な集団におけるイオンの存在の変化を示す。敗血症グループにおける臨床上の敗血症の疑いは通常技術により測定すると「時点0」において起こる。「時点−24時間」および「時点−48時間」は、敗血症グループにおける臨床上の敗血症の疑いに先立つほぼ24時間およびほぼ48時間前に採取したサンプルをそれぞれ表す。個体は「第1日」に研究に入った。
【図４Ｂ】ESI-質量分析計プロファイルにおいて437.2Daのm/z、およびC18逆相カラム上で1.42分（min）の滞留時間を有するイオンの強度を示す。図4Bは、時点0において敗血症を発生しなかった個体の集団から採取したサンプル中の同じイオンの存在を示す。
【図５】10人の敗血症患者および10人のSIRS患者における時点0からのデータに当てはめた分類ツリーであり、エレクトロスプレー質量分析計により敗血症をSIRSから区別するのに関わると同定された３つのバイオマーカーを示す。
【図６】血漿サンプルについて得た代表的なLC/MSおよびLC/MS/MSスペクトルを示し、実施例に記載した機器の配置構成を使っている。
【図７Ａ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより高いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【図７Ｂ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより高いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【図８Ａ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより低いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【図８Ｂ】敗血症へ変換する前の48時間までに、血漿中でより低いレベルに調節されるタンパク質を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)第１のバイオマーカープロファイルを、個体から採取した第１の生物学的サンプルから得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団から得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ；
を含むものであり、ここで１回のかかる比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項２】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)第１のバイオマーカープロファイルを、個体からある単一時点に得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ；
を含むものであり、ここでバイオマーカープロファイルの比較が個体における敗血症の状態を少なくともほぼ60％の正確度で決定するものである上記方法。
【請求項３】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、(i)個体から単一時点に採取した第１の生物学的サンプルから作製した第１のバイオマーカープロファイルを、(ii)参照集団から作製した参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものであり、ここでその比較が、個体における敗血症の状態を決定する決定ルールを適用することを含むものである上記方法。
【請求項４】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)第１のバイオマーカープロファイルを、個体から採取した第１の生物学的サンプルから得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここでその参照集団は正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症進行中のある段階における参照集団、ほぼ0〜36時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、ほぼ36〜60時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、およびほぼ60〜84時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団からなる群から選択され、かつここで１回のかかる比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項５】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、(i)個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイルと(ii)参照集団からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルの間で少なくとも１種のバイオマーカーの測定可能な特徴を比較することを含むものであり、ここでその比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類するものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項６】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)個体の第１の生物学的サンプルから作製した第１のバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのセットから少なくとも２種の特性を選択するステップ；および
(b)それらの特性を参照集団からの生物学的サンプルから作製した参照バイオマーカープロファイル中の同じバイオマーカーのセットと比較するステップ
を含むものであり、ここで単一のかかる比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして少なくともほぼ60％の正確度で分類することができるものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項７】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイル中の少なくとも２種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を決定するステップ、および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイル中の少なくとも２種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイル中のこれらのバイオマーカーの存在量または存在量の変化と比較するステップ
を含むものであり、かつここでその比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較は個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項８】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイルの少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、(i)敗血症に罹ったSIRS陽性参照集団および(ii)敗血症に罹ってないSIRS陽性参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルの少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化と比較して決定するステップを含み、ここでバイオマーカーが表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される上記方法。
【請求項９】
個体の第１のバイオマーカープロファイルが個体からの第１の生物学的サンプル由来であり、かつ参照バイオマーカープロファイルが参照集団から採取した生物学的サンプル由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルが血液、唾液、血清、血漿、尿、糞便、脳脊髄液、細胞、細胞抽出物、組織サンプル、および組織生検からなる群から選択される、請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
(a)個体から採取した第２の生物学的サンプルからの第２のバイオマーカープロファイルを得るステップ；および
(b)個体の第２バイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップをさらに含む請求項１に記載の方法であり、
ここで第２の比較は個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここで第２の比較は個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項１２】
さらに、少なくとも１回はその方法を繰返すステップを含む請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であり、ここで別のバイオマーカープロファイルをその方法を繰返すそれぞれの時点で個体から採取した別の生物学的サンプルから得るものである上記方法。
【請求項１３】
個体からの生物学的サンプルをほぼ24時間離れて採取する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
個体における敗血症の状態を決定するステップが個体における敗血症の発症を予測することを含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
敗血症の発症を、通常技術を用いる個体における敗血症の決定に先立つ少なくともほぼ24時間前に予測する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
敗血症の発症を、通常技術を用いる個体における敗血症の決定に先立つ少なくともほぼ48時間前に予測する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
敗血症の発症を、通常技術を用いる個体における敗血症の決定に先立つ少なくともほぼ96時間前に予測する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
個体における敗血症の状態を決定するステップが個体における敗血症の進行を決定することを含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
個体における敗血症の状態を決定するステップが個体における敗血症の診断を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
その比較が決定ルールを適用することを含むものである、請求項１〜２および請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
決定ルールを適用することはデータ解析アルゴリズムを用いることを含むものである、請求項３または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
データ解析アルゴリズムが分類ツリーの使用を含むものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
データ解析アルゴリズムがノンパラメトリックである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
データ解析アルゴリズムが特性値の分布の差を検出する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ノンパラメトリックアルゴリズムがWilcoxon符号付順位検定の使用を含むものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
データ解析アルゴリズムが多重追加回帰ツリーを含むものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
データ解析アルゴリズムがロジスティック回帰である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
データ解析アルゴリズムが少なくとも２個の入力パラメーターを含むものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
データ解析アルゴリズムが少なくとも５個の入力パラメーターを含むものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
データ解析アルゴリズムが少なくとも１０個の入力パラメーターを含むものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
データ解析アルゴリズムが少なくとも２０個の入力パラメーターを含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
データ解析アルゴリズムが表15〜23および表26〜50のいずれかの表に記載の特性セットの少なくとも２個を入力パラメーターとして使用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ60％の正確度で決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ70％の正確度で決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ80％の正確度で決定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ90％の正確度で決定する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
個体における敗血症の状態の決定を、個体が通常技術を用いて決定される敗血症を有するという臨床的疑いに先立つ少なくともほぼ48時間前に行う、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
決定ルールが10回交差検定に関わる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
参照バイオマーカープロファイルを単一の個体を含む集団から得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
参照バイオマーカープロファイルを少なくとも２つの個体を含む集団から得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
参照バイオマーカープロファイルを少なくとも20の個体を含むものである集団から得る、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
参照バイオマーカープロファイルを、正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある段階における参照集団、ほぼ0〜36時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、ほぼ36〜60時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、およびほぼ60〜84時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団からなる群から選択される集団から得る、請求項１〜３および請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
個体からの第２のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップをさらに含む請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であり、ここで第２のバイオマーカープロファイルは個体から採取した第２の生物学的サンプルから得るものである上記方法。
【請求項４４】
個体からの第２の生物学的サンプルは、第１の生物学的サンプルを個体から採取してからほぼ24時間後に採取する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
第２のバイオマーカープロファイルを第１のバイオマーカープロファイルとは異なる参照バイオマーカープロファイルと比較する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが少なくとも１つの核酸の測定可能な態様を含む、請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
核酸がmRNAである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが少なくとも１つのポリペプチドの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
上記測定可能な態様の測定は、少なくとも１つのポリペプチドを、少なくとも１つのポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその機能性フラグメントと接触させるステップを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
上記抗体またはその機能性フラグメントを検出しうるように標識した、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
標識が増幅可能な核酸である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
その少なくとも１つのポリペプチドは血液中に存在するものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
その少なくとも１つのポリペプチドは細胞表面タンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
その少なくとも１つのポリペプチドは病原体の成分である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
その少なくとも１つのポリペプチドは病原体の成分と結合する抗体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
その少なくとも１つのポリペプチドは自己抗体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
個体から得た生物学的サンプルからのタンパク質を抗体のアレイと接触させるステップを含む請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であり、ここでアレイの抗体は固定されている上記方法。
【請求項５８】
上記生物学的サンプルを上記個体の第１のバイオマーカープロファイルを得る前に分画する、請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの分離法を用いて上記個体の第１のバイオマーカープロファイルを得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも２つの分離法を用いて上記個体の第１のバイオマーカープロファイルを得る、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
上記少なくとも１つの分離法が質量分析計を含むものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
上記質量分析計がエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ESI-MS）、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF-MS）、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（SELDI-TOF-MS）、シリコン上の脱離／イオン化（DIOS）、二次イオン質量分析計（SIMS）、四重極飛行時間型（Q-TOF）、大気圧化学イオン化質量分析計（APCI-MS）、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大気圧光イオン化質量分析計（APPI-MS）、APPI-MS/MS、およびAPPI-(MS)n、四重極質量分析計、フーリエ変換質量分析計（FTMS）およびイオントラップ質量分析計（ここでnは１以上の整数である）からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つの分離法がSELDI-TOF-MSを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つの分離法が化学抽出分配、イオン交換クロマトグラフィ、逆相液体クロマトグラフィ、等電点、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）、薄層クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィまたは液体クロマトグラフィ、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも２つの異なる分離法を用いて上記個体のバイオマーカープロファイルを得る、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが感染作用剤またはその成分の測定可能な態様を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
上記成分がウイルスコートタンパク質、リポ多糖およびリポテイコ酸からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが感染に反応する免疫系の状態の情報を与えるバイオマーカーの測定可能な態様を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルがホルモン、自己抗体、成長因子、転写因子、細胞表面マーカー、および細胞由来の可溶性タンパク質からなる群から選択されるバイオマーカーの測定可能な態様を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが細菌に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルがマクロファージ溶解に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが敗血症経路に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが自己抗体のバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが組織低酸素症、多臓器不全、および代謝性アシドーシスからなる群から選択される生理学的症状に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
個体における敗血症の発症を予測する方法であって、
(a)バイオマーカープロファイル中の少なくとも２種の特性の態様を測定するステップであり、ここでバイオマーカープロファイルは表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーセットのセットから選択される少なくとも２種のバイオマーカーを含む上記ステップ；および
(b)上記の少なくとも２種の特性を参照集団中の同じ少なくとも２種の特性の対応する態様の値と比較するステップ
を含むものであり、ここで１回のかかる比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができ、かつここでその比較は個体における敗血症の発症を決定するものである上記方法。
【請求項７６】
敗血症の発症の上記予測が、敗血症の発症が通常技術により決定される敗血症の発症に先立つほぼ12〜36時間前に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
敗血症の発症の上記予測が、敗血症の発症が通常技術により決定される敗血症の発症に先立つほぼ36〜60時間前に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
敗血症の発症の上記予測が、敗血症の発症が通常技術により決定される敗血症の発症に先立つほぼ60〜84時間前に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体から採取した第１の生物学的サンプルから第１のバイオマーカープロファイルを得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団から得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここで１回のかかる比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較は個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８０】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)バイオマーカープロファイルを単一時点に個体から得るステップ；および
(b)個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここでバイオマーカープロファイルの比較が個体におけるSIRSを少なくともほぼ60％の正確度で診断することができる上記方法。
【請求項８１】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、(i)個体から採取した第１の生物学的サンプルから単一時点において作製した第１のバイオマーカープロファイルを、(ii)参照集団から作製した参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものであり、ここでその比較は個体におけるSIRSの状態を決定する決定ルールを適用することを含むものである上記方法。
【請求項８２】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体から採取した第１の生物学的サンプルから第１のバイオマーカープロファイルを得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここでその参照集団は正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、および感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある段階の参照集団、通常技術によりほぼ0〜36時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ36〜60時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ60-84時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団からなる群から選択され、かつここで１回のかかる比較が個体を参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができ、かつその比較は、個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８３】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、少なくとも１種のバイオマーカーの測定可能な特徴を、(i)個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイルと(ii)参照集団からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルの間で比較するステップを含むものであり、かつここでその比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類し、かつここでその比較は個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８４】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体の第１の生物学的サンプルから作製したバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのセットからの少なくとも２種の特性を選択するステップ；および
(b)それらの特性を、参照集団からの生物学的サンプルから作製したバイオマーカープロファイル中の同じバイオマーカーのセットと比較するステップ
を含むものであり、ここで１回のかかる比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして少なくともほぼ60％の正確度で分類することができ、かつここでその比較は個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８５】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体の第１の生物学的サンプルに含まれる少なくとも２種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を決定するステップ、および
(b)個体の生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、参照集団からの生物学的サンプル中のこれらのバイオマーカーの存在量と比較するステップ
を含むものであり、ここでその比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができ、かつここでその比較が個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８６】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、個体からの生物学的サンプルから得た少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、正常な参照集団からの生物学的サンプルから得た少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化と比較して決定するステップを含むものであり、ここでバイオマーカーが表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される上記方法。
【請求項８７】
敗血症を診断または予測するためのバイオマーカープロファイルを作製するのに利用できるバイオマーカーを単離する方法であって、
(a)個体の集団から得たものである参照バイオマーカープロファイルを得るステップ；
(b)敗血症または敗血症の段階の１つを予測または診断する特性であることを特徴とする上記参照バイオマーカープロファイルの特性を同定するステップ；
(c)上記特性に対応するバイオマーカーを同定するステップ；および
(d)上記バイオマーカーを単離するステップ
を含むものである上記方法。
【請求項８８】
個体を参照集団に属するとしてその参照集団との比較に基づいて少なくともほぼ60％の正確度で分類するのに寄与する、少なくとも２種の特性を含むバイオマーカープロファイルであって、ここでその参照集団が正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある段階の参照集団、通常技術によりほぼ0〜36時間後に敗血症を有すると確認したSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ36〜60時間後に敗血症を有すると確認したSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ60-84時間後に敗血症を有すると確認したSIRS陽性参照集団からなる群から選択されるものである上記バイオマーカープロファイル。
【請求項８９】
表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーを含むキット。
【請求項９０】
表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーと特異的に結合する抗体またはその機能性フラグメントのセットを含むキット。
【請求項１】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)第１のバイオマーカープロファイルを、個体から採取した第１の生物学的サンプルから得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団から得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ；
を含むものであり、ここで１回のかかる比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項２】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)第１のバイオマーカープロファイルを、個体からある単一時点に得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ；
を含むものであり、ここでバイオマーカープロファイルの比較が個体における敗血症の状態を少なくともほぼ60％の正確度で決定するものである上記方法。
【請求項３】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、(i)個体から単一時点に採取した第１の生物学的サンプルから作製した第１のバイオマーカープロファイルを、(ii)参照集団から作製した参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものであり、ここでその比較が、個体における敗血症の状態を決定する決定ルールを適用することを含むものである上記方法。
【請求項４】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)第１のバイオマーカープロファイルを、個体から採取した第１の生物学的サンプルから得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここでその参照集団は正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症進行中のある段階における参照集団、ほぼ0〜36時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、ほぼ36〜60時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、およびほぼ60〜84時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団からなる群から選択され、かつここで１回のかかる比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項５】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、(i)個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイルと(ii)参照集団からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルの間で少なくとも１種のバイオマーカーの測定可能な特徴を比較することを含むものであり、ここでその比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類するものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項６】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)個体の第１の生物学的サンプルから作製した第１のバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのセットから少なくとも２種の特性を選択するステップ；および
(b)それらの特性を参照集団からの生物学的サンプルから作製した参照バイオマーカープロファイル中の同じバイオマーカーのセットと比較するステップ
を含むものであり、ここで単一のかかる比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして少なくともほぼ60％の正確度で分類することができるものであり、かつここでその比較が個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項７】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、
(a)個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイル中の少なくとも２種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を決定するステップ、および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイル中の少なくとも２種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイル中のこれらのバイオマーカーの存在量または存在量の変化と比較するステップ
を含むものであり、かつここでその比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較は個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項８】
個体における敗血症の状態を決定する方法であって、個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイルの少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、(i)敗血症に罹ったSIRS陽性参照集団および(ii)敗血症に罹ってないSIRS陽性参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルの少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化と比較して決定するステップを含み、ここでバイオマーカーが表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される上記方法。
【請求項９】
個体の第１のバイオマーカープロファイルが個体からの第１の生物学的サンプル由来であり、かつ参照バイオマーカープロファイルが参照集団から採取した生物学的サンプル由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルが血液、唾液、血清、血漿、尿、糞便、脳脊髄液、細胞、細胞抽出物、組織サンプル、および組織生検からなる群から選択される、請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
(a)個体から採取した第２の生物学的サンプルからの第２のバイオマーカープロファイルを得るステップ；および
(b)個体の第２バイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップをさらに含む請求項１に記載の方法であり、
ここで第２の比較は個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここで第２の比較は個体における敗血症の状態を決定するものである上記方法。
【請求項１２】
さらに、少なくとも１回はその方法を繰返すステップを含む請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であり、ここで別のバイオマーカープロファイルをその方法を繰返すそれぞれの時点で個体から採取した別の生物学的サンプルから得るものである上記方法。
【請求項１３】
個体からの生物学的サンプルをほぼ24時間離れて採取する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
個体における敗血症の状態を決定するステップが個体における敗血症の発症を予測することを含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
敗血症の発症を、通常技術を用いる個体における敗血症の決定に先立つ少なくともほぼ24時間前に予測する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
敗血症の発症を、通常技術を用いる個体における敗血症の決定に先立つ少なくともほぼ48時間前に予測する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
敗血症の発症を、通常技術を用いる個体における敗血症の決定に先立つ少なくともほぼ96時間前に予測する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
個体における敗血症の状態を決定するステップが個体における敗血症の進行を決定することを含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
個体における敗血症の状態を決定するステップが個体における敗血症の診断を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
その比較が決定ルールを適用することを含むものである、請求項１〜２および請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
決定ルールを適用することはデータ解析アルゴリズムを用いることを含むものである、請求項３または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
データ解析アルゴリズムが分類ツリーの使用を含むものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
データ解析アルゴリズムがノンパラメトリックである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
データ解析アルゴリズムが特性値の分布の差を検出する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ノンパラメトリックアルゴリズムがWilcoxon符号付順位検定の使用を含むものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
データ解析アルゴリズムが多重追加回帰ツリーを含むものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
データ解析アルゴリズムがロジスティック回帰である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
データ解析アルゴリズムが少なくとも２個の入力パラメーターを含むものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
データ解析アルゴリズムが少なくとも５個の入力パラメーターを含むものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
データ解析アルゴリズムが少なくとも１０個の入力パラメーターを含むものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
データ解析アルゴリズムが少なくとも２０個の入力パラメーターを含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
データ解析アルゴリズムが表15〜23および表26〜50のいずれかの表に記載の特性セットの少なくとも２個を入力パラメーターとして使用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ60％の正確度で決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ70％の正確度で決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ80％の正確度で決定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
決定ルールが個体における敗血症の状態を少なくともほぼ90％の正確度で決定する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
個体における敗血症の状態の決定を、個体が通常技術を用いて決定される敗血症を有するという臨床的疑いに先立つ少なくともほぼ48時間前に行う、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
決定ルールが10回交差検定に関わる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
参照バイオマーカープロファイルを単一の個体を含む集団から得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
参照バイオマーカープロファイルを少なくとも２つの個体を含む集団から得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
参照バイオマーカープロファイルを少なくとも20の個体を含むものである集団から得る、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
参照バイオマーカープロファイルを、正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある段階における参照集団、ほぼ0〜36時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、ほぼ36〜60時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団、およびほぼ60〜84時間後に通常技術により敗血症を有すると確認されたSIRS陽性参照集団からなる群から選択される集団から得る、請求項１〜３および請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
個体からの第２のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップをさらに含む請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であり、ここで第２のバイオマーカープロファイルは個体から採取した第２の生物学的サンプルから得るものである上記方法。
【請求項４４】
個体からの第２の生物学的サンプルは、第１の生物学的サンプルを個体から採取してからほぼ24時間後に採取する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
第２のバイオマーカープロファイルを第１のバイオマーカープロファイルとは異なる参照バイオマーカープロファイルと比較する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが少なくとも１つの核酸の測定可能な態様を含む、請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
核酸がmRNAである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが少なくとも１つのポリペプチドの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
上記測定可能な態様の測定は、少なくとも１つのポリペプチドを、少なくとも１つのポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその機能性フラグメントと接触させるステップを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
上記抗体またはその機能性フラグメントを検出しうるように標識した、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
標識が増幅可能な核酸である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
その少なくとも１つのポリペプチドは血液中に存在するものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
その少なくとも１つのポリペプチドは細胞表面タンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
その少なくとも１つのポリペプチドは病原体の成分である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
その少なくとも１つのポリペプチドは病原体の成分と結合する抗体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
その少なくとも１つのポリペプチドは自己抗体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
個体から得た生物学的サンプルからのタンパク質を抗体のアレイと接触させるステップを含む請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法であり、ここでアレイの抗体は固定されている上記方法。
【請求項５８】
上記生物学的サンプルを上記個体の第１のバイオマーカープロファイルを得る前に分画する、請求項１および請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの分離法を用いて上記個体の第１のバイオマーカープロファイルを得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも２つの分離法を用いて上記個体の第１のバイオマーカープロファイルを得る、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
上記少なくとも１つの分離法が質量分析計を含むものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
上記質量分析計がエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ESI-MS）、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF-MS）、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（SELDI-TOF-MS）、シリコン上の脱離／イオン化（DIOS）、二次イオン質量分析計（SIMS）、四重極飛行時間型（Q-TOF）、大気圧化学イオン化質量分析計（APCI-MS）、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大気圧光イオン化質量分析計（APPI-MS）、APPI-MS/MS、およびAPPI-(MS)n、四重極質量分析計、フーリエ変換質量分析計（FTMS）およびイオントラップ質量分析計（ここでnは１以上の整数である）からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つの分離法がSELDI-TOF-MSを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つの分離法が化学抽出分配、イオン交換クロマトグラフィ、逆相液体クロマトグラフィ、等電点、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）、薄層クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィまたは液体クロマトグラフィ、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも２つの異なる分離法を用いて上記個体のバイオマーカープロファイルを得る、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが感染作用剤またはその成分の測定可能な態様を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
上記成分がウイルスコートタンパク質、リポ多糖およびリポテイコ酸からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが感染に反応する免疫系の状態の情報を与えるバイオマーカーの測定可能な態様を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルがホルモン、自己抗体、成長因子、転写因子、細胞表面マーカー、および細胞由来の可溶性タンパク質からなる群から選択されるバイオマーカーの測定可能な態様を含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが細菌に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルがマクロファージ溶解に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが敗血症経路に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが自己抗体のバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
上記個体の第１のバイオマーカープロファイルおよび参照バイオマーカープロファイルが組織低酸素症、多臓器不全、および代謝性アシドーシスからなる群から選択される生理学的症状に関連するバイオマーカーの測定可能な態様を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
個体における敗血症の発症を予測する方法であって、
(a)バイオマーカープロファイル中の少なくとも２種の特性の態様を測定するステップであり、ここでバイオマーカープロファイルは表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーセットのセットから選択される少なくとも２種のバイオマーカーを含む上記ステップ；および
(b)上記の少なくとも２種の特性を参照集団中の同じ少なくとも２種の特性の対応する態様の値と比較するステップ
を含むものであり、ここで１回のかかる比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができ、かつここでその比較は個体における敗血症の発症を決定するものである上記方法。
【請求項７６】
敗血症の発症の上記予測が、敗血症の発症が通常技術により決定される敗血症の発症に先立つほぼ12〜36時間前に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
敗血症の発症の上記予測が、敗血症の発症が通常技術により決定される敗血症の発症に先立つほぼ36〜60時間前に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
敗血症の発症の上記予測が、敗血症の発症が通常技術により決定される敗血症の発症に先立つほぼ60〜84時間前に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体から採取した第１の生物学的サンプルから第１のバイオマーカープロファイルを得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団から得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここで１回のかかる比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができるものであり、かつここでその比較は個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８０】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)バイオマーカープロファイルを単一時点に個体から得るステップ；および
(b)個体のバイオマーカープロファイルを参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここでバイオマーカープロファイルの比較が個体におけるSIRSを少なくともほぼ60％の正確度で診断することができる上記方法。
【請求項８１】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、(i)個体から採取した第１の生物学的サンプルから単一時点において作製した第１のバイオマーカープロファイルを、(ii)参照集団から作製した参照バイオマーカープロファイルと比較するステップを含むものであり、ここでその比較は個体におけるSIRSの状態を決定する決定ルールを適用することを含むものである上記方法。
【請求項８２】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体から採取した第１の生物学的サンプルから第１のバイオマーカープロファイルを得るステップ；および
(b)個体の第１のバイオマーカープロファイルを、参照集団からの生物学的サンプルから得た参照バイオマーカープロファイルと比較するステップ
を含むものであり、ここでその参照集団は正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、および感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある段階の参照集団、通常技術によりほぼ0〜36時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ36〜60時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ60-84時間後に敗血症を有すると確認しうるSIRS陽性参照集団からなる群から選択され、かつここで１回のかかる比較が個体を参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができ、かつその比較は、個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８３】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、少なくとも１種のバイオマーカーの測定可能な特徴を、(i)個体からの第１の生物学的サンプルから得た第１のバイオマーカープロファイルと(ii)参照集団からの生物学的サンプルから得たバイオマーカープロファイルの間で比較するステップを含むものであり、かつここでその比較がその個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類し、かつここでその比較は個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８４】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体の第１の生物学的サンプルから作製したバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのセットからの少なくとも２種の特性を選択するステップ；および
(b)それらの特性を、参照集団からの生物学的サンプルから作製したバイオマーカープロファイル中の同じバイオマーカーのセットと比較するステップ
を含むものであり、ここで１回のかかる比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして少なくともほぼ60％の正確度で分類することができ、かつここでその比較は個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８５】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、
(a)個体の第１の生物学的サンプルに含まれる少なくとも２種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を決定するステップ、および
(b)個体の生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、参照集団からの生物学的サンプル中のこれらのバイオマーカーの存在量と比較するステップ
を含むものであり、ここでその比較が個体をその参照集団に属するかまたは属しないとして分類することができ、かつここでその比較が個体におけるSIRSを診断するものである上記方法。
【請求項８６】
個体におけるSIRSを診断する方法であって、個体からの生物学的サンプルから得た少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化を、正常な参照集団からの生物学的サンプルから得た少なくとも１種のバイオマーカーの存在量または存在量の変化と比較して決定するステップを含むものであり、ここでバイオマーカーが表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される上記方法。
【請求項８７】
敗血症を診断または予測するためのバイオマーカープロファイルを作製するのに利用できるバイオマーカーを単離する方法であって、
(a)個体の集団から得たものである参照バイオマーカープロファイルを得るステップ；
(b)敗血症または敗血症の段階の１つを予測または診断する特性であることを特徴とする上記参照バイオマーカープロファイルの特性を同定するステップ；
(c)上記特性に対応するバイオマーカーを同定するステップ；および
(d)上記バイオマーカーを単離するステップ
を含むものである上記方法。
【請求項８８】
個体を参照集団に属するとしてその参照集団との比較に基づいて少なくともほぼ60％の正確度で分類するのに寄与する、少なくとも２種の特性を含むバイオマーカープロファイルであって、ここでその参照集団が正常な参照集団、SIRS陽性参照集団、感染/SIRS陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行のある段階の参照集団、通常技術によりほぼ0〜36時間後に敗血症を有すると確認したSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ36〜60時間後に敗血症を有すると確認したSIRS陽性参照集団、通常技術によりほぼ60-84時間後に敗血症を有すると確認したSIRS陽性参照集団からなる群から選択されるものである上記バイオマーカープロファイル。
【請求項８９】
表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーを含むキット。
【請求項９０】
表15〜23および表26〜50のいずれかの表に掲げられたバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーと特異的に結合する抗体またはその機能性フラグメントのセットを含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２００６−５１５６７０（Ｐ２００６−５１５６７０Ａ）
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５２１０３（Ｐ２００４−５５２１０３）
【出願日】平成１５年１１月１２日（２００３．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６０１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４５５４
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０５１７２８１３）ベクトン，ディッキンソン アンド カンパニー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月１２日（２００３．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６０１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４５５４
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０５１７２８１３）ベクトン，ディッキンソン アンド カンパニー (5)
【Ｆターム（参考）】
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