バクテリオシン含有乳酸菌培養物の製造法及びそれを用いる食品の保存方法
ワイセラ属等の乳酸菌を培養することによりプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を製造することができ、該培養物を食品に用いることで食品の保存性を高めることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、１）バクテリオシン含有乳酸菌培養物の製造法、２）当該バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を用いる食品の保存方法、及び３）バクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
食品の腐敗や品質の低下等を防止する目的で、食品保存料が種々の食品に添加されている。かかる食品保存料としては、これまでは主に化学的に合成された食品保存料が用いられている。しかしながら、化学的に合成された食品保存料は残留性や毒性等安全面が懸念される場合がある。このような問題を解決するためには、伝統的な食品由来の安全な抗菌性物質の開発が望まれている。
ところで、乳酸菌は、古来より醤油、味噌、漬け物、日本酒等の様々な発酵食品（発酵飲料も含む）の生産に利用されている有用な微生物の１つである。また、乳酸菌は発酵食品の製造過程で用いられていた。これは、乳酸発酵により産生される乳酸によって系のｐＨが低下することで、製造過程及び製品中での雑菌等の生育を阻害し、その結果、製品の腐敗や品質の低下を防ぐことができるからである。また、乳酸菌が生産する抗菌性物質も製品の腐敗や品質の低下防止に有効であることも実証されている。
抗菌性物質の中でも、各種細菌によって生産されるタンパク質性の抗菌性物質はバクテリオシンと称されている。乳酸菌の産出するバクテリオシンの中でもナイシンは、ＧＲＡＳ物質としてＦＤＡに認可され、ＷＨＯやＦＡＯでも安全な抗菌活性物質であることが認められている。尚、ナイシンは現在、世界５０カ国以上で食品保存料として利用されている。
しかし、ナイシンをはじめとする既知のバクテリオシンはプロテアーゼで容易に分解されるという問題がある。すなわち、発酵食品である清酒、醤油及び味噌の製造では、アスペルギルス・オリゼ等が産出するプロテアーゼ等によって、バクテリオシンは容易に分解されるため、充分な抗菌性を保つことができない。例えば、清酒の火入れ前にナイシンを添加する場合（特開平６−３１９５１６）や別のバクテリオシンであるアシドシン８９１２を添加する場合（特開平６−３１９５１６号公報）には、これらのバクテリオシンが原酒中のプロテアーゼ等の酵素で分解されるため、抗菌効果が得られないことが報告されている。尚、現時点では、乳酸菌がプロテアーゼ耐性のバクテリオシンを生産することは、報告されていない。
また、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品は元来原材料に存在する微生物や製造工程中に付着した微生物によって自然発酵することにより、好ましい風味や保存性が付与される。現在、品質の安定化、製造期間の短縮、有害微生物の生育防止等を目的として、スターターカルチャー法が開発されている（乳酸菌の科学と技術、学会出版センター２３９頁、１９９６年）。
例えば、チュング（Ｃｈｕｎｇ）等は、ナイシン溶液に浸漬することによる未調理の食肉の処理、又は予めある種の細菌を接種した生の食肉に及ぼすナイシンの効果を論じている。この報告によると、生肉に用いられたナイシンは極めて短時間に活性が消失する（Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：（６）ｐ１３２９−１３３３（１９８９））。これは、食肉中にあるカテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）等のプロテアーゼによって、ナイシンが分解されたため、抗菌活性が極めて短時間で消失する為と推定されている。
上記のようなナイシンの酵素による分解を防ぐために、食肉を加熱処理した後で、当該加熱処理食肉にナイシン等のランチオニン系バクテリオシンを表面使用する発明も報告されている（特開平６−２２６８５）。しかし、ナイシン添加前に食肉を加熱処理に付す必要があり、利用範囲がやや限定される。
従って、発酵食品、食肉加工食品等の食品において、広範囲に使用できるプロテアーゼ耐性バクテリオシンの提供は食品業界では待望されているのが現状である。
【発明の開示】
上記したように、乳酸菌は、古くから発酵食品を初めとする種々の食品加工に利用されており、安全性の面で心配がない。また、乳酸菌が生産する抗菌性物質は、化学的に合成された物質よりも安全性が高いと考えられる。従って、本発明の課題は、１）プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン含有乳酸菌培養物の製造法、２）当該バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を用いる食品の保存方法、及び３）プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング法の提供である。
本発明者は、上記課題を解決する為に、発酵乳等の発酵食品に存在する乳酸菌を分離して、プロテアーゼ耐性新規バクテリオシン生産能を有する菌株の探索を行った。その結果、同物質を生産する乳酸菌の分離に成功した。また、本菌によって生産されるバクテリオシンは、新規物質であることも確認した。即ち、本発明は以下の通りである。
１．プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを含有する乳酸菌培養物の製造法。
２．乳酸菌がワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属のいずれかに属する前記１記載の製造法。
３．ワイセラ属に属する乳酸菌がワイセラ・エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７、ワイセラ・シバリア ＪＣＭ１２４９５、ワイセラ・コンフューサ ＪＣＭ１０９３、ワイセラ・ヘレニカ ＪＣＭ１０１０３、ワイセラ・カンドレリ ＪＣＭ５８１７、ワイセラ・マイナー ＪＣＭ１１６８、ワイセラ・パラメセンテロイデス ＪＣＭ９８９０、ワイセラ・タイランデンシス ＪＣＭ１０６９４のいずれかである前記２記載の製造法。
４．ペディオコッカス属に属する乳酸菌がペディオコッカス・ペントサセウスである前記２記載の製造法。
５．ラクトバシラス属に属する乳酸菌がラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ペントサスのいずれかである前記２記載の製造法。
６．ロイコノストック属に属する乳酸菌がロイコノストック・シトレウム、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、ロイコノストック・アルジェンティナム、ロイコノストック・カルノサム、ロイコノストック・メセンテロイデスのいずれかである前記２記載の製造方法。
７．前記１乃至６記載の乳酸菌培養物を食品の製造工程で用いることを特徴とする食品の保存方法。
８．食品が発酵食品又は食肉加工品である前記７記載の保存方法。
９．バクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング法において、プロテアーゼ存在下においても抗菌活性を有する乳酸菌培養物をスクリーニングすることを特徴とする乳酸菌のスクリーニング方法。
以下に、本発明を詳細に説明する。
長寿国としても知られているアルメニア国には、昔から、健康によく、病気の時に処方される食品が多数ある。例えば、マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）やナリーン（Ｎａｒｉｎｅ）等の乳酸食品やアプリコットの乾物、赤ワイン、ジェシイン、チィナフ等が上げられる。本発明者は、アルメニア国において食されている発酵乳マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）や、発酵食品の原料である麹等に主に着目して研究を展開した。
本発明において、「プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン」、「プロテアーゼ耐性バクテリオシン」とは、プロテアーゼ存在下、例えばアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ存在下においても抗菌活性を有するバクテリオシンを示し、アミラーゼによってその抗菌活性が低下するという特徴を有するものも含まれる。
「プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン」あるいは「プロテアーゼ耐性バクテリオシン」を含有する乳酸菌培養物とは、具体的には、下記方法において検定菌の増殖阻止円を形成する乳酸菌培養物を指す。
（１）従来の培養方法（あるいは分離した培養方法）にて乳酸菌培養液を調製する。乳酸菌培養液はＮａＯＨを用いてｐＨ５．５−６．０に調整した後、１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心分離し、Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）「Ｄｉｓｍｉｃ−２５ｃｓ」，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．４５μｍにてフィルター濾過したものをサンプルとする。抗菌活性が低い場合は、室温で減圧にて４倍に濃縮を行う。さらに必要ならば、１０倍まで濃縮を行う。
（２）検定菌としてＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０Ｔ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＪＣＭ２５０４Ｔ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＪＣＭ２２５７、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＩＦＯ１２７０８、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＪＣＭ１４６５Ｔ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＡＭ１３８１、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂ ｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１９４３５、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＪＣＭ５８０４Ｔ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＪＣＭ５８０３Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ１４９１７Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ＪＣＭ１１５７Ｔを用いて、後述するｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄあるいは生菌数測定にて抗菌活性を測定し、最も強く抗菌活性を示す検定菌を選定する。
（３）酵素にはアスペルギルス由来プロテアーゼ（天野エンザイム（株）製「ウマミザイムＧ」等）を用いる。
（４）（１）記載のサンプルに（３）記載の酵素を１０〜１００Ｕｎｉｔ／ｍｌを添加し、３０℃、１ｈｒｓ以上反応する。
（５）（２）の最も強く抗菌活性を示した検定菌を塗抹した、検定菌が増殖可能な培地、例えばＭＲＳ培地等に（４）の酵素処理したサンプルを０．０１ｍｌ滴下し、検定菌の増殖最温度（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓは３７℃、それ以外は３０℃）で２０〜２４時間培養後、検定菌の増殖阻止円を確認する。
本発明で使用されるプロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを生産する乳酸菌は発酵食品等から分離された乳酸菌である。勿論、発酵食品等以外からでも、後述するスクリーニング法を用いて抗菌活性のある乳酸菌をスクリーニングし、使用してもかまわない。即ち、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌であれば何でも使用でき、分離源は特に拘らない。本発明者が検討した結果、乳酸菌の中でも、ワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属等が目的とするプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることを発見した。勿論、上記以外の乳酸菌でも、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌であれば何でも使用できることは言うまでもない。
これらのプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌を培養して得たプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する培養物を、醤油、味噌、魚醤等の各種発酵食品及びハム、ソーセージ等の各種食肉加工食品の製造工程で用いることにより、目的とする食品の腐敗や品質劣化等を防止できる。バクテリオシンを単離して用いてもよいし、又、単離せず培養物そのものを用いてもかまわない。単離等の精製操作は通常、煩雑であるので、培養物をそのまま各種発酵食品の製造工程で添加するのが好ましい。更に、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する培養物を発酵食品、食肉加工食品等の製造工程で１回又は複数回にわけて添加すればよく、添加回数も自由に選択すればよい。
目的とするプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を取得するためには乳酸菌を培養しなければならないが、培養温度、培養時間、培養方法、培地等の培養条件は通常の乳酸菌の培養に使用されるものを用いればよい。また、単離する場合は通常の、ゲルろ過等の分離精製方法を駆使すれば良い。本発明の乳酸菌培養物とは乳酸菌の菌体をそのまま含む乳酸菌を培養した培地又は乳酸菌を培養した培地から乳酸菌を遠心分離等により分離したものを指し、その培地は液体培地でも固体培地でもゲル状の培地でもかまわない。液体培地を用いる場合、乳酸菌培養液と記載される場合があるが、当然、乳酸菌培養液は乳酸菌培養物に含まれる。また、乳酸菌培養液を凍結乾燥、噴霧乾燥などにより乾燥したもの、膜処理、減圧濃縮等により濃縮、ペースト化したもの、抗菌活性画分を限外ろ過、クロマトグラフィ等で分画したものも乳酸菌培養物に含まれる。
プロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を添加する食品は限定されない。従って、いかなる食品にも使用できるが、微生物が生産工程で関与する発酵食品及び食肉加工食品にプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を添加するのが最も好ましい。
発酵食品としては、具体的には醤油、魚醤、酒、味噌、漬物、チーズ等のものを挙げることができる。勿論、これらは一例であり、これ以外のものに使用しても構わない。
尚、発酵食品では、従来、制菌剤として食塩を用いてきたが、近年減塩化のニーズも高まっていること及び減塩及び無塩化によって蛋白質の分解速度を向上できるという利点もあるため、ナイシンのようなバクテリオシンを発酵食品で利用する研究がなされている。しかしながら、製造工程中に存在するプロテアーゼによってナイシンや既知のバクテリオシンは分解されるため、その制菌効果がみられないのが現状である。こうした発酵食品の製造工程にもプロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを含有する乳酸菌培養物は利用できる。
また、食肉加工食品としては、ハム、ソーセージ等を挙げることができる。勿論、これらは一例であり、これ以外のものに使用しても構わない。
プロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を添加して得た発酵食品、食肉加工食品等の食品は保存安定性が著しく優れている。
以下に本発明の重要な点であるプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌のスクリーニング法について、発酵食品マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）からの分離を１例にとって述べる。
発酵食品の１つである発酵乳マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）から採取した試料を乳酸菌の生育できる培地、例えばＭＲＳ培地（表１）やＭ１７培地（表２）に０．５％添加し、３０℃から３７℃で培養する。培養日数は、１日、５日及び１０日とする。培養終了後、０．５％の炭酸カルシウムを含む前述の寒天培地（Ａｇａｒ１．２％）に塗抹培養し、生じたコロニーから乳酸菌を採取する。
採取した乳酸菌は、前述の液体培地及び培養条件で同様に培養する。次に、予めフィルター濾過したアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼであるウマミザイムＧ（天野エンザイム（株）製）を添加したＭＲＳ寒天培地プレートに、これらの乳酸菌を植菌し２４時間培養する。次いで、このプレートに検定菌を混釈したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ培地（表３）を重層し、本プレートを２４時間培養し、検定菌の生育阻止円を形成させる。
尚、プロテアーゼを添加する方法は、寒天培地に混釈する本方法以外の方法を次に挙げる方法を用いても構わない。
１）検定菌とともにプロテアーゼを混釈する方法。２）寒天培地にプロテアーゼを塗布する方法。３）乳酸菌コロニーを培養する際に、プロテアーゼを添加する方法。この際に、プロテアーゼは、培養開始時や培養途中さらには培養終了時に添加してもよい。４）乳酸菌コロニーを培養した後、培養液中の菌体を除菌もしくは死滅させた後プロテアーゼを添加したサンプルの適量を、検定菌を混釈したプレートに滴下し、阻止円の形成を確認する方法。繰り返し述べるが、上記１）から４）方法に限定されるものではない。またプロテアーゼもウマミザイムＧに限定されるものではない。
次に、抗菌スペクトル解析による評価を行う。後述する抗菌活性プレート上に、抗菌活性のみられた乳酸菌の培養液上清を順次希釈しスポットする
ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄを用いて抗菌スペクトルを調べる。
まず、抗菌活性サンプルを調整する。前述の方法で取得した抗菌活性を有する菌株の培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、培養上清を得、さらに上清液をフィルター濾過し、無菌サンプルとした。本サンプルを２倍ずつ希釈し段階的に２１１希釈液を作成した。また活性が低い場合は必要に応じて、室温にて２倍ずつ減圧濃縮し段階的に２−３希釈液を作成した。
次に、抗菌活性プレートに混釈する検定菌の培養を行う。表４に記載した検定菌はＴＳＢＹＥ（表５、表６）もしくはＭＲＳ培地にて培養する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属は振盪培養を行うが、それ以外は静置にて培養する。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓは３７℃、それ以外は３０℃で培養する。
更に、抗菌活性プレートの作成を行う。即ち、ＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ１．２％）１０ｍｌ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ寒天培地（ａｇａｒ１．２％）５ｍｌを、それぞれ別途に１２１℃で１５分殺菌し、５５℃にて保温する。滅菌シャーレに上記殺菌したＭＲＳ寒天培地を撒き、１時間クリーンベンチ内に置いておく。次に、５５℃で保温しておいたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ寒天培地に検定菌培養液５０μｌを添加して混釈し、ＭＲＳプレートに重層する。クリーンベンチ内でプレートの蓋を開けておき（約１５分）表面を乾燥させた。
上記で作成した抗菌活性含有サンプルを１０μｌずつ滴下し、蓋をして１時間ほど置いて乾燥させ、プレートを各検定菌の培養温度にて２０時間培養し、生育阻止円の形成を調べた。なお、抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）は、以下のように定義した。
抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）＝（阻止円を形成した最大の希釈率）×１０００／１０
このように抗菌スペクトルを解析したサンプルは、プロテアーゼ耐性を有しており、かつ幅広い抗菌スペクトルを示すものであった。
上記の手法で選択した乳酸菌ＡＪ１１０２６３株の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）塩基配列の相同性解析（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｆ．，Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ Ｚ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．）によりワイセラ・コンフューサ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａ）ＡＴＣＣ １０８８１株と９８．２２％の相同性（表７）を示した。なお、相同性評価はＡＴＣＣに寄託されている基準株（ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）を用いた。
基本特性（表８）より乳酸菌の一般性状に一致し、糖質の発酵性（表９）は、ワイセラ・コンフューサの発酵性に類似すると考えられた。しかしながら、Ｌ−アラビノースの発酵性が異なること及び１６ＳｒＤＮＡにおいて１００％のホモロジーを示さなかったことから、公知菌とは明らかに異なる新規な菌株と認め、本菌をワイセラ・エスピー（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．）ＡＪ１１０２６３株と命名した。本菌は、独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明を詳しく説明する。もちろん、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
発酵乳マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）から分離したＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、及びタイプカルチャーから取得したＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８９０、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１４９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１をＭＲＳ液体培地（表１）で前培養及び本培養を行った。Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．は３０℃、それ以外の菌株は３７℃とした。ウマミザイムＧを０Ｕ／ｍｌ（未添加）、２００Ｕ／ｍｌ及び４００Ｕ／ｍｌそれぞれ添加したＭＲＳ寒天培地プレートに先の乳酸菌を植菌し２４時間培養した。
尚、培養は５００ｍｌの坂口フラスコにＭＲＳ培地１００ｍｌを張込み、前培養液１００μｌを植菌し、振盪数１００回／分にて培養した。
次いで、ラクトバチラス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＪＣＭ１１５７株を検定菌として混釈したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ培地を重層した。これらプレートを２４時間培養した結果、検定菌の生育阻止円が形成された（表１０）。この結果から、いずれの株もプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることが確認された。
【実施例２】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤ０４９７（ＮｉｓｉｎＡ生産菌）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）をＭＲＳ液体培地で３０℃にて培養を行った。実施例１と同様にラクトバチラス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＪＣＭ１１５７株を検定菌として抗菌評価を実施した。
また、Ｎｉｓｉｎ生産菌株を用いる代わりにＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製 ＮｉｓｉｎＡ１０００ＩＵ／ｍｌ液１０μｌをＭＲＳ寒天培地プレート上にスポットし、上記抗菌評価を実施した。
プロテアーゼ非存在下では検定菌の生育阻止円が形成されたが、プロテアーゼ存在下ではプロテアーゼ濃度が高くなるほど活性が低下した（表１１）。
【実施例３】
Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤ０４９７（ＮｉｓｉｎＡ生産菌）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ＪＣＭ１１５７株を培養し、培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、培養上清を得た。ウマミザイム２００Ｕ／ｍｌを培養上清に添加し３０℃、２４時間酵素処理した後に、上清液をフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 ＤＩＳＭＩＣ２５ＣＳ，０．４５μｍ）濾過し、無菌サンプルとした。
ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄを用いて抗菌スペクトルを調べた結果、Ｎｉｓｉｎ生産菌培養液やバクテリオシンを生産しない乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ＪＣＭ１１５７に比べ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５はプロテアーゼ処理しても抗菌活性が観られた（表１２）。これより、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５はプロテアーゼ耐性バクテリシンを生産していることが確認された。
【実施例４】
表１３に示したＷｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１４９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＪＣＭ９６９８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ９６９６，ＪＣＭ１１０４５、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）等各種乳酸菌の培養液を実施例３と同様に酵素にて処理した後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＡＭ１３８１を検定菌とし、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄにて抗菌活性を測定した。酵素は実施例３同様アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼであるウマミザイムＧを使用した。また、バチルス・ズブチルス由来のα−アミラーゼ（和光純薬社製）を乳酸菌培養液に１００Ｕｎｉｔ／ｍｌを添加し、３０℃、１ｈｒｓ以上反応させた後、同様にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＡＭ１３８１を検定菌とし、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄにて抗菌活性を測定し、α−アミラーゼによる抗菌活性への影響も調べた。表１３に示したようにＷｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＪＣＭ１２４９５、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓｅ ＪＣＭ１０９３、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｈｅｌｌｅｎｉｃａ ＪＣＭ１０１０３、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｋａｎｄｌｅｒｉ ＪＣＭ５８１７、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＪＣＭ１１６８、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ９８９０、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＪＣＭ１０６９４、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１４９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ＪＣＭ１５５８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＪＣＭ９６９８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ９６９６，ＪＣＭ１１０４５、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ ＪＣＭ１１０５２、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃａｒｎｏｓｕｍ ＪＣＭ９６９５、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ６１２４の培養液はプロテアーゼ処理をしても抗菌活性が観られたことから各株は、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることが確認された。また、これらの培養液はα−アミラーゼ処理により、抗菌活性が低下することも確認された。尚、表１３の残存活性は、抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）＝阻止円を形成した最大の希釈率×１０００／１０×（酵素処理サンプルの阻止円径／コントロールの阻止円径）として算出した。
【実施例５】
三角フラスコ（２００ｍｌ容）６本にそれぞれ大豆（１０ｇ）及び純水（１０ｍｌ）を添加し１２０℃、３０分間オートクレーブ殺菌した。冷却した後、麹菌（醤油用１紫１号菌）０．０４ｇを添加し、３０℃で２日間静置培養した。各々の麹は、サンプル１に殺菌済みの純水４０ｍｌ、サンプル２に最終濃度が１８％になるようにした食塩水４０ｍｌ、サンプル３にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）培養上清液４０ｍｌ、サンプル４にＷｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）培養上清液４０ｍｌ、サンプル５にＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｓｅｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５培養上清液４０ｍｌ、サンプル６にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１培養上清液４０ｍｌを加え、フィルター濾過した６Ｎ塩酸及び６ＮＮａＯＨを用いてｐＨ６．５〜７．０とした。
さらにＴＳＢＹＥ培地にて３０℃で２０時間振盪培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１を２００μＬ植菌し、よく混ぜて３０℃にて培養した。培養１日、２日、７日目に培養液を採取し、ＧＡＭ寒天培地（日水製薬（株）社製ＧＡＭブイヨン”ＮＩＳＳＵＩ”）にて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１の生菌数を測定した。純水添加区では、汚染菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１が１０８以上存在し、食塩１８％条件区では汚染されなかった。他方、無塩でナイシン上清液を添加した場合、分解１日目よりナイシンが麹菌由来のプロテアーゼで分解される為に１０８以上汚染され、抗菌効果がみられなかった。
しかしながら、Ｗｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｓｅｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１の培養上清液を用いた場合には、分解初日より７日まで汚染菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１はみられなった（表１４）。
【実施例６】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）及びＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）をＭＲＳ培地にて培養した培養液を、ＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調製し、さらにｐＨ調製した培養液を遠心分離して菌体をのぞいた培養上清液を作成した。ｐＨ５．５に調製した乳酸菌体を含む培養液及び、除菌培養上清液を下記の実験に用いた。
ファルコン社製無菌チューブ６本（５０ｍｌ）に黒毛和牛の挽肉５ｇを加え、サンプル１に生理食塩水、サンプル２に１８％食塩水、サンプル３にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４培養上清液、サンプル４にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４培養液、サンプル５にＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６培養上清液、サンプル６にＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６培養液をそれぞれ５ｍｌずつ入れた。さらにＴＳＢＹＥ培地にて３７℃で２４時間静置培養したＬｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０を１０６ｃｆｕ／ｍｌとなるように添加し、室温にて静置熟成させた。保存熟成１日、７日目に熟成液を採取し、Ｏｘｏｉｄ社製のＬｉｓｉｔｅｒｉａ選択培地にて、Ｌｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０の生菌数を測定した。表１５に示したように生理食塩水では汚染菌Ｌｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０が１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上存在し、１８％食塩水でも１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上存在した。またナイシン乳酸菌培養液及び上清液を用いた場合も、ナイシンが、肉由来のプロテアーゼ（カテプシン）で分解されるため、１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上汚染された。しかしながら、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）の培養液及び上清液を用いた場合には、熟成１日より７日目まで汚染菌Ｌｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０を１０３ｃｆｕ／ｍｌに低減できた。
また、抗菌スペクトルを調べた結果、エンテロコッカス・ファセウムの他に、食中毒の原因となるリステリア及び醤油や味噌の製造過程で有害なバチルス・ズブチリスに対しても生育阻害効果があることが判明した。
ｐＨ及び温度の安定性も調べた。新規バクテリオシンは、ｐＨ２〜４でも約５０％の活性を維持し、ｐＨ２〜１１という広い範囲で抗菌活性は安定で、特にｐＨ４〜６付近において強い抗菌活性を有していた。また１００℃で１０分間加熱した後も約５０％の活性を維持することから、熱安定性に優れていることが判明した。
【産業上の利用可能性】
ワイセラ・エスピー（Ｗｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等の乳酸菌による生産されるプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を発酵食品や食肉加工食品等の製造工程で添加することにより、極めて優れた食品の保存方法を提供することができる。
【技術分野】
本発明は、１）バクテリオシン含有乳酸菌培養物の製造法、２）当該バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を用いる食品の保存方法、及び３）バクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
食品の腐敗や品質の低下等を防止する目的で、食品保存料が種々の食品に添加されている。かかる食品保存料としては、これまでは主に化学的に合成された食品保存料が用いられている。しかしながら、化学的に合成された食品保存料は残留性や毒性等安全面が懸念される場合がある。このような問題を解決するためには、伝統的な食品由来の安全な抗菌性物質の開発が望まれている。
ところで、乳酸菌は、古来より醤油、味噌、漬け物、日本酒等の様々な発酵食品（発酵飲料も含む）の生産に利用されている有用な微生物の１つである。また、乳酸菌は発酵食品の製造過程で用いられていた。これは、乳酸発酵により産生される乳酸によって系のｐＨが低下することで、製造過程及び製品中での雑菌等の生育を阻害し、その結果、製品の腐敗や品質の低下を防ぐことができるからである。また、乳酸菌が生産する抗菌性物質も製品の腐敗や品質の低下防止に有効であることも実証されている。
抗菌性物質の中でも、各種細菌によって生産されるタンパク質性の抗菌性物質はバクテリオシンと称されている。乳酸菌の産出するバクテリオシンの中でもナイシンは、ＧＲＡＳ物質としてＦＤＡに認可され、ＷＨＯやＦＡＯでも安全な抗菌活性物質であることが認められている。尚、ナイシンは現在、世界５０カ国以上で食品保存料として利用されている。
しかし、ナイシンをはじめとする既知のバクテリオシンはプロテアーゼで容易に分解されるという問題がある。すなわち、発酵食品である清酒、醤油及び味噌の製造では、アスペルギルス・オリゼ等が産出するプロテアーゼ等によって、バクテリオシンは容易に分解されるため、充分な抗菌性を保つことができない。例えば、清酒の火入れ前にナイシンを添加する場合（特開平６−３１９５１６）や別のバクテリオシンであるアシドシン８９１２を添加する場合（特開平６−３１９５１６号公報）には、これらのバクテリオシンが原酒中のプロテアーゼ等の酵素で分解されるため、抗菌効果が得られないことが報告されている。尚、現時点では、乳酸菌がプロテアーゼ耐性のバクテリオシンを生産することは、報告されていない。
また、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品は元来原材料に存在する微生物や製造工程中に付着した微生物によって自然発酵することにより、好ましい風味や保存性が付与される。現在、品質の安定化、製造期間の短縮、有害微生物の生育防止等を目的として、スターターカルチャー法が開発されている（乳酸菌の科学と技術、学会出版センター２３９頁、１９９６年）。
例えば、チュング（Ｃｈｕｎｇ）等は、ナイシン溶液に浸漬することによる未調理の食肉の処理、又は予めある種の細菌を接種した生の食肉に及ぼすナイシンの効果を論じている。この報告によると、生肉に用いられたナイシンは極めて短時間に活性が消失する（Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：（６）ｐ１３２９−１３３３（１９８９））。これは、食肉中にあるカテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）等のプロテアーゼによって、ナイシンが分解されたため、抗菌活性が極めて短時間で消失する為と推定されている。
上記のようなナイシンの酵素による分解を防ぐために、食肉を加熱処理した後で、当該加熱処理食肉にナイシン等のランチオニン系バクテリオシンを表面使用する発明も報告されている（特開平６−２２６８５）。しかし、ナイシン添加前に食肉を加熱処理に付す必要があり、利用範囲がやや限定される。
従って、発酵食品、食肉加工食品等の食品において、広範囲に使用できるプロテアーゼ耐性バクテリオシンの提供は食品業界では待望されているのが現状である。
【発明の開示】
上記したように、乳酸菌は、古くから発酵食品を初めとする種々の食品加工に利用されており、安全性の面で心配がない。また、乳酸菌が生産する抗菌性物質は、化学的に合成された物質よりも安全性が高いと考えられる。従って、本発明の課題は、１）プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン含有乳酸菌培養物の製造法、２）当該バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を用いる食品の保存方法、及び３）プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング法の提供である。
本発明者は、上記課題を解決する為に、発酵乳等の発酵食品に存在する乳酸菌を分離して、プロテアーゼ耐性新規バクテリオシン生産能を有する菌株の探索を行った。その結果、同物質を生産する乳酸菌の分離に成功した。また、本菌によって生産されるバクテリオシンは、新規物質であることも確認した。即ち、本発明は以下の通りである。
１．プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを含有する乳酸菌培養物の製造法。
２．乳酸菌がワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属のいずれかに属する前記１記載の製造法。
３．ワイセラ属に属する乳酸菌がワイセラ・エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７、ワイセラ・シバリア ＪＣＭ１２４９５、ワイセラ・コンフューサ ＪＣＭ１０９３、ワイセラ・ヘレニカ ＪＣＭ１０１０３、ワイセラ・カンドレリ ＪＣＭ５８１７、ワイセラ・マイナー ＪＣＭ１１６８、ワイセラ・パラメセンテロイデス ＪＣＭ９８９０、ワイセラ・タイランデンシス ＪＣＭ１０６９４のいずれかである前記２記載の製造法。
４．ペディオコッカス属に属する乳酸菌がペディオコッカス・ペントサセウスである前記２記載の製造法。
５．ラクトバシラス属に属する乳酸菌がラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ペントサスのいずれかである前記２記載の製造法。
６．ロイコノストック属に属する乳酸菌がロイコノストック・シトレウム、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、ロイコノストック・アルジェンティナム、ロイコノストック・カルノサム、ロイコノストック・メセンテロイデスのいずれかである前記２記載の製造方法。
７．前記１乃至６記載の乳酸菌培養物を食品の製造工程で用いることを特徴とする食品の保存方法。
８．食品が発酵食品又は食肉加工品である前記７記載の保存方法。
９．バクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング法において、プロテアーゼ存在下においても抗菌活性を有する乳酸菌培養物をスクリーニングすることを特徴とする乳酸菌のスクリーニング方法。
以下に、本発明を詳細に説明する。
長寿国としても知られているアルメニア国には、昔から、健康によく、病気の時に処方される食品が多数ある。例えば、マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）やナリーン（Ｎａｒｉｎｅ）等の乳酸食品やアプリコットの乾物、赤ワイン、ジェシイン、チィナフ等が上げられる。本発明者は、アルメニア国において食されている発酵乳マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）や、発酵食品の原料である麹等に主に着目して研究を展開した。
本発明において、「プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン」、「プロテアーゼ耐性バクテリオシン」とは、プロテアーゼ存在下、例えばアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ存在下においても抗菌活性を有するバクテリオシンを示し、アミラーゼによってその抗菌活性が低下するという特徴を有するものも含まれる。
「プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシン」あるいは「プロテアーゼ耐性バクテリオシン」を含有する乳酸菌培養物とは、具体的には、下記方法において検定菌の増殖阻止円を形成する乳酸菌培養物を指す。
（１）従来の培養方法（あるいは分離した培養方法）にて乳酸菌培養液を調製する。乳酸菌培養液はＮａＯＨを用いてｐＨ５．５−６．０に調整した後、１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心分離し、Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）「Ｄｉｓｍｉｃ−２５ｃｓ」，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．４５μｍにてフィルター濾過したものをサンプルとする。抗菌活性が低い場合は、室温で減圧にて４倍に濃縮を行う。さらに必要ならば、１０倍まで濃縮を行う。
（２）検定菌としてＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０Ｔ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＪＣＭ２５０４Ｔ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＪＣＭ２２５７、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＩＦＯ１２７０８、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＪＣＭ１４６５Ｔ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＡＭ１３８１、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂ ｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１９４３５、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＪＣＭ５８０４Ｔ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＪＣＭ５８０３Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ１４９１７Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ＪＣＭ１１５７Ｔを用いて、後述するｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄあるいは生菌数測定にて抗菌活性を測定し、最も強く抗菌活性を示す検定菌を選定する。
（３）酵素にはアスペルギルス由来プロテアーゼ（天野エンザイム（株）製「ウマミザイムＧ」等）を用いる。
（４）（１）記載のサンプルに（３）記載の酵素を１０〜１００Ｕｎｉｔ／ｍｌを添加し、３０℃、１ｈｒｓ以上反応する。
（５）（２）の最も強く抗菌活性を示した検定菌を塗抹した、検定菌が増殖可能な培地、例えばＭＲＳ培地等に（４）の酵素処理したサンプルを０．０１ｍｌ滴下し、検定菌の増殖最温度（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓは３７℃、それ以外は３０℃）で２０〜２４時間培養後、検定菌の増殖阻止円を確認する。
本発明で使用されるプロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを生産する乳酸菌は発酵食品等から分離された乳酸菌である。勿論、発酵食品等以外からでも、後述するスクリーニング法を用いて抗菌活性のある乳酸菌をスクリーニングし、使用してもかまわない。即ち、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌であれば何でも使用でき、分離源は特に拘らない。本発明者が検討した結果、乳酸菌の中でも、ワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属等が目的とするプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることを発見した。勿論、上記以外の乳酸菌でも、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌であれば何でも使用できることは言うまでもない。
これらのプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌を培養して得たプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する培養物を、醤油、味噌、魚醤等の各種発酵食品及びハム、ソーセージ等の各種食肉加工食品の製造工程で用いることにより、目的とする食品の腐敗や品質劣化等を防止できる。バクテリオシンを単離して用いてもよいし、又、単離せず培養物そのものを用いてもかまわない。単離等の精製操作は通常、煩雑であるので、培養物をそのまま各種発酵食品の製造工程で添加するのが好ましい。更に、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する培養物を発酵食品、食肉加工食品等の製造工程で１回又は複数回にわけて添加すればよく、添加回数も自由に選択すればよい。
目的とするプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を取得するためには乳酸菌を培養しなければならないが、培養温度、培養時間、培養方法、培地等の培養条件は通常の乳酸菌の培養に使用されるものを用いればよい。また、単離する場合は通常の、ゲルろ過等の分離精製方法を駆使すれば良い。本発明の乳酸菌培養物とは乳酸菌の菌体をそのまま含む乳酸菌を培養した培地又は乳酸菌を培養した培地から乳酸菌を遠心分離等により分離したものを指し、その培地は液体培地でも固体培地でもゲル状の培地でもかまわない。液体培地を用いる場合、乳酸菌培養液と記載される場合があるが、当然、乳酸菌培養液は乳酸菌培養物に含まれる。また、乳酸菌培養液を凍結乾燥、噴霧乾燥などにより乾燥したもの、膜処理、減圧濃縮等により濃縮、ペースト化したもの、抗菌活性画分を限外ろ過、クロマトグラフィ等で分画したものも乳酸菌培養物に含まれる。
プロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を添加する食品は限定されない。従って、いかなる食品にも使用できるが、微生物が生産工程で関与する発酵食品及び食肉加工食品にプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を添加するのが最も好ましい。
発酵食品としては、具体的には醤油、魚醤、酒、味噌、漬物、チーズ等のものを挙げることができる。勿論、これらは一例であり、これ以外のものに使用しても構わない。
尚、発酵食品では、従来、制菌剤として食塩を用いてきたが、近年減塩化のニーズも高まっていること及び減塩及び無塩化によって蛋白質の分解速度を向上できるという利点もあるため、ナイシンのようなバクテリオシンを発酵食品で利用する研究がなされている。しかしながら、製造工程中に存在するプロテアーゼによってナイシンや既知のバクテリオシンは分解されるため、その制菌効果がみられないのが現状である。こうした発酵食品の製造工程にもプロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを含有する乳酸菌培養物は利用できる。
また、食肉加工食品としては、ハム、ソーセージ等を挙げることができる。勿論、これらは一例であり、これ以外のものに使用しても構わない。
プロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を添加して得た発酵食品、食肉加工食品等の食品は保存安定性が著しく優れている。
以下に本発明の重要な点であるプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌のスクリーニング法について、発酵食品マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）からの分離を１例にとって述べる。
発酵食品の１つである発酵乳マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）から採取した試料を乳酸菌の生育できる培地、例えばＭＲＳ培地（表１）やＭ１７培地（表２）に０．５％添加し、３０℃から３７℃で培養する。培養日数は、１日、５日及び１０日とする。培養終了後、０．５％の炭酸カルシウムを含む前述の寒天培地（Ａｇａｒ１．２％）に塗抹培養し、生じたコロニーから乳酸菌を採取する。
採取した乳酸菌は、前述の液体培地及び培養条件で同様に培養する。次に、予めフィルター濾過したアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼであるウマミザイムＧ（天野エンザイム（株）製）を添加したＭＲＳ寒天培地プレートに、これらの乳酸菌を植菌し２４時間培養する。次いで、このプレートに検定菌を混釈したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ培地（表３）を重層し、本プレートを２４時間培養し、検定菌の生育阻止円を形成させる。
尚、プロテアーゼを添加する方法は、寒天培地に混釈する本方法以外の方法を次に挙げる方法を用いても構わない。
１）検定菌とともにプロテアーゼを混釈する方法。２）寒天培地にプロテアーゼを塗布する方法。３）乳酸菌コロニーを培養する際に、プロテアーゼを添加する方法。この際に、プロテアーゼは、培養開始時や培養途中さらには培養終了時に添加してもよい。４）乳酸菌コロニーを培養した後、培養液中の菌体を除菌もしくは死滅させた後プロテアーゼを添加したサンプルの適量を、検定菌を混釈したプレートに滴下し、阻止円の形成を確認する方法。繰り返し述べるが、上記１）から４）方法に限定されるものではない。またプロテアーゼもウマミザイムＧに限定されるものではない。
次に、抗菌スペクトル解析による評価を行う。後述する抗菌活性プレート上に、抗菌活性のみられた乳酸菌の培養液上清を順次希釈しスポットする
ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄを用いて抗菌スペクトルを調べる。
まず、抗菌活性サンプルを調整する。前述の方法で取得した抗菌活性を有する菌株の培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、培養上清を得、さらに上清液をフィルター濾過し、無菌サンプルとした。本サンプルを２倍ずつ希釈し段階的に２１１希釈液を作成した。また活性が低い場合は必要に応じて、室温にて２倍ずつ減圧濃縮し段階的に２−３希釈液を作成した。
次に、抗菌活性プレートに混釈する検定菌の培養を行う。表４に記載した検定菌はＴＳＢＹＥ（表５、表６）もしくはＭＲＳ培地にて培養する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属は振盪培養を行うが、それ以外は静置にて培養する。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓは３７℃、それ以外は３０℃で培養する。
更に、抗菌活性プレートの作成を行う。即ち、ＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ１．２％）１０ｍｌ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ寒天培地（ａｇａｒ１．２％）５ｍｌを、それぞれ別途に１２１℃で１５分殺菌し、５５℃にて保温する。滅菌シャーレに上記殺菌したＭＲＳ寒天培地を撒き、１時間クリーンベンチ内に置いておく。次に、５５℃で保温しておいたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ寒天培地に検定菌培養液５０μｌを添加して混釈し、ＭＲＳプレートに重層する。クリーンベンチ内でプレートの蓋を開けておき（約１５分）表面を乾燥させた。
上記で作成した抗菌活性含有サンプルを１０μｌずつ滴下し、蓋をして１時間ほど置いて乾燥させ、プレートを各検定菌の培養温度にて２０時間培養し、生育阻止円の形成を調べた。なお、抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）は、以下のように定義した。
抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）＝（阻止円を形成した最大の希釈率）×１０００／１０
このように抗菌スペクトルを解析したサンプルは、プロテアーゼ耐性を有しており、かつ幅広い抗菌スペクトルを示すものであった。
上記の手法で選択した乳酸菌ＡＪ１１０２６３株の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）塩基配列の相同性解析（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｆ．，Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ Ｚ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．）によりワイセラ・コンフューサ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａ）ＡＴＣＣ １０８８１株と９８．２２％の相同性（表７）を示した。なお、相同性評価はＡＴＣＣに寄託されている基準株（ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）を用いた。
基本特性（表８）より乳酸菌の一般性状に一致し、糖質の発酵性（表９）は、ワイセラ・コンフューサの発酵性に類似すると考えられた。しかしながら、Ｌ−アラビノースの発酵性が異なること及び１６ＳｒＤＮＡにおいて１００％のホモロジーを示さなかったことから、公知菌とは明らかに異なる新規な菌株と認め、本菌をワイセラ・エスピー（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．）ＡＪ１１０２６３株と命名した。本菌は、独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明を詳しく説明する。もちろん、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
発酵乳マトゥーン（Ｍａｔｓｏｏｎ）から分離したＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、及びタイプカルチャーから取得したＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８９０、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１４９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１をＭＲＳ液体培地（表１）で前培養及び本培養を行った。Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．は３０℃、それ以外の菌株は３７℃とした。ウマミザイムＧを０Ｕ／ｍｌ（未添加）、２００Ｕ／ｍｌ及び４００Ｕ／ｍｌそれぞれ添加したＭＲＳ寒天培地プレートに先の乳酸菌を植菌し２４時間培養した。
尚、培養は５００ｍｌの坂口フラスコにＭＲＳ培地１００ｍｌを張込み、前培養液１００μｌを植菌し、振盪数１００回／分にて培養した。
次いで、ラクトバチラス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＪＣＭ１１５７株を検定菌として混釈したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＡＯＡＣ培地を重層した。これらプレートを２４時間培養した結果、検定菌の生育阻止円が形成された（表１０）。この結果から、いずれの株もプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることが確認された。
【実施例２】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤ０４９７（ＮｉｓｉｎＡ生産菌）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）をＭＲＳ液体培地で３０℃にて培養を行った。実施例１と同様にラクトバチラス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＪＣＭ１１５７株を検定菌として抗菌評価を実施した。
また、Ｎｉｓｉｎ生産菌株を用いる代わりにＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製 ＮｉｓｉｎＡ１０００ＩＵ／ｍｌ液１０μｌをＭＲＳ寒天培地プレート上にスポットし、上記抗菌評価を実施した。
プロテアーゼ非存在下では検定菌の生育阻止円が形成されたが、プロテアーゼ存在下ではプロテアーゼ濃度が高くなるほど活性が低下した（表１１）。
【実施例３】
Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤ０４９７（ＮｉｓｉｎＡ生産菌）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ＪＣＭ１１５７株を培養し、培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、培養上清を得た。ウマミザイム２００Ｕ／ｍｌを培養上清に添加し３０℃、２４時間酵素処理した後に、上清液をフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 ＤＩＳＭＩＣ２５ＣＳ，０．４５μｍ）濾過し、無菌サンプルとした。
ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄを用いて抗菌スペクトルを調べた結果、Ｎｉｓｉｎ生産菌培養液やバクテリオシンを生産しない乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ＪＣＭ１１５７に比べ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５はプロテアーゼ処理しても抗菌活性が観られた（表１２）。これより、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５はプロテアーゼ耐性バクテリシンを生産していることが確認された。
【実施例４】
表１３に示したＷｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１４９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＪＣＭ９６９８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ９６９６，ＪＣＭ１１０４５、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）等各種乳酸菌の培養液を実施例３と同様に酵素にて処理した後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＡＭ１３８１を検定菌とし、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄにて抗菌活性を測定した。酵素は実施例３同様アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼであるウマミザイムＧを使用した。また、バチルス・ズブチルス由来のα−アミラーゼ（和光純薬社製）を乳酸菌培養液に１００Ｕｎｉｔ／ｍｌを添加し、３０℃、１ｈｒｓ以上反応させた後、同様にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＡＭ１３８１を検定菌とし、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ ｍｅｔｈｏｄにて抗菌活性を測定し、α−アミラーゼによる抗菌活性への影響も調べた。表１３に示したようにＷｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＪＣＭ１２４９５、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓｅ ＪＣＭ１０９３、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｈｅｌｌｅｎｉｃａ ＪＣＭ１０１０３、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｋａｎｄｌｅｒｉ ＪＣＭ５８１７、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＪＣＭ１１６８、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ９８９０、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＪＣＭ１０６９４、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１４９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ＪＣＭ１５５８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＪＣＭ９６９８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ９６９６，ＪＣＭ１１０４５、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ ＪＣＭ１１０５２、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃａｒｎｏｓｕｍ ＪＣＭ９６９５、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＪＣＭ６１２４の培養液はプロテアーゼ処理をしても抗菌活性が観られたことから各株は、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることが確認された。また、これらの培養液はα−アミラーゼ処理により、抗菌活性が低下することも確認された。尚、表１３の残存活性は、抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）＝阻止円を形成した最大の希釈率×１０００／１０×（酵素処理サンプルの阻止円径／コントロールの阻止円径）として算出した。
【実施例５】
三角フラスコ（２００ｍｌ容）６本にそれぞれ大豆（１０ｇ）及び純水（１０ｍｌ）を添加し１２０℃、３０分間オートクレーブ殺菌した。冷却した後、麹菌（醤油用１紫１号菌）０．０４ｇを添加し、３０℃で２日間静置培養した。各々の麹は、サンプル１に殺菌済みの純水４０ｍｌ、サンプル２に最終濃度が１８％になるようにした食塩水４０ｍｌ、サンプル３にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）培養上清液４０ｍｌ、サンプル４にＷｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）培養上清液４０ｍｌ、サンプル５にＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｓｅｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５培養上清液４０ｍｌ、サンプル６にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１培養上清液４０ｍｌを加え、フィルター濾過した６Ｎ塩酸及び６ＮＮａＯＨを用いてｐＨ６．５〜７．０とした。
さらにＴＳＢＹＥ培地にて３０℃で２０時間振盪培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１を２００μＬ植菌し、よく混ぜて３０℃にて培養した。培養１日、２日、７日目に培養液を採取し、ＧＡＭ寒天培地（日水製薬（株）社製ＧＡＭブイヨン”ＮＩＳＳＵＩ”）にて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１の生菌数を測定した。純水添加区では、汚染菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１が１０８以上存在し、食塩１８％条件区では汚染されなかった。他方、無塩でナイシン上清液を添加した場合、分解１日目よりナイシンが麹菌由来のプロテアーゼで分解される為に１０８以上汚染され、抗菌効果がみられなかった。
しかしながら、Ｗｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｓｅｃｅｕｓ ＪＣＭ５８８５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＪＣＭ１２３１の培養上清液を用いた場合には、分解初日より７日まで汚染菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ ＩＡＭ１３８１はみられなった（表１４）。
【実施例６】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４（ＮｉｓｉｎＺ生産菌）及びＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）をＭＲＳ培地にて培養した培養液を、ＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調製し、さらにｐＨ調製した培養液を遠心分離して菌体をのぞいた培養上清液を作成した。ｐＨ５．５に調製した乳酸菌体を含む培養液及び、除菌培養上清液を下記の実験に用いた。
ファルコン社製無菌チューブ６本（５０ｍｌ）に黒毛和牛の挽肉５ｇを加え、サンプル１に生理食塩水、サンプル２に１８％食塩水、サンプル３にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４培養上清液、サンプル４にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＩＭＢ７０２０５４培養液、サンプル５にＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６培養上清液、サンプル６にＷｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６培養液をそれぞれ５ｍｌずつ入れた。さらにＴＳＢＹＥ培地にて３７℃で２４時間静置培養したＬｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０を１０６ｃｆｕ／ｍｌとなるように添加し、室温にて静置熟成させた。保存熟成１日、７日目に熟成液を採取し、Ｏｘｏｉｄ社製のＬｉｓｉｔｅｒｉａ選択培地にて、Ｌｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０の生菌数を測定した。表１５に示したように生理食塩水では汚染菌Ｌｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０が１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上存在し、１８％食塩水でも１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上存在した。またナイシン乳酸菌培養液及び上清液を用いた場合も、ナイシンが、肉由来のプロテアーゼ（カテプシン）で分解されるため、１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上汚染された。しかしながら、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐ．ＡＪ１１０２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７）の培養液及び上清液を用いた場合には、熟成１日より７日目まで汚染菌Ｌｉｓｉｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ３３０９０を１０３ｃｆｕ／ｍｌに低減できた。
また、抗菌スペクトルを調べた結果、エンテロコッカス・ファセウムの他に、食中毒の原因となるリステリア及び醤油や味噌の製造過程で有害なバチルス・ズブチリスに対しても生育阻害効果があることが判明した。
ｐＨ及び温度の安定性も調べた。新規バクテリオシンは、ｐＨ２〜４でも約５０％の活性を維持し、ｐＨ２〜１１という広い範囲で抗菌活性は安定で、特にｐＨ４〜６付近において強い抗菌活性を有していた。また１００℃で１０分間加熱した後も約５０％の活性を維持することから、熱安定性に優れていることが判明した。
【産業上の利用可能性】
ワイセラ・エスピー（Ｗｅｉｓｅｌｌａ ｓｐ．）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等の乳酸菌による生産されるプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含有する乳酸菌培養物を発酵食品や食肉加工食品等の製造工程で添加することにより、極めて優れた食品の保存方法を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを含有する乳酸菌培養物の製造法。
【請求項２】
乳酸菌がワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属のいずれかに属する請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ワイセラ属に属する乳酸菌がワイセラ・エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７、ワイセラ・シバリア ＪＣＭ１２４９５、ワイセラ・コンフューサ ＪＣＭ１０９３、ワイセラ・ヘレニカ ＪＣＭ１０１０３、ワイセラ・カンドレリ ＪＣＭ５８１７、ワイセラ・マイナー ＪＣＭ１１６８、ワイセラ・パラメセンテロイデス ＪＣＭ９８９０、ワイセラ・タイランデンシス ＪＣＭ１０６９４のいずれかである前記２記載の製造法。
【請求項４】
ペディオコッカス属に属する乳酸菌がペディオコッカス・ペントサセウスである前記２記載の製造法。
【請求項５】
ラクトバシラス属に属する乳酸菌がラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ペントサスのいずれかである前記２記載の製造法。
【請求項６】
ロイコノストック属に属する乳酸菌がロイコノストック・シトレウム、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、ロイコノストック・アルジェンティナム、ロイコノストック・カルノサム、ロイコノストック・メセンテロイデスのいずれかである前記２記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至６記載の乳酸菌培養物を食品の製造工程で用いることを特徴とする食品の保存方法。
【請求項８】
食品が発酵食品又は食肉加工品である請求項７記載の保存方法。
【請求項９】
バクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング法において、プロテアーゼ存在下においても抗菌活性を有する乳酸菌培養物をスクリーニングすることを特徴とする乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項１】
プロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを含有する乳酸菌培養物の製造法。
【請求項２】
乳酸菌がワイセラ属、ペディオコッカス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属のいずれかに属する請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ワイセラ属に属する乳酸菌がワイセラ・エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７７、ワイセラ・シバリア ＪＣＭ１２４９５、ワイセラ・コンフューサ ＪＣＭ１０９３、ワイセラ・ヘレニカ ＪＣＭ１０１０３、ワイセラ・カンドレリ ＪＣＭ５８１７、ワイセラ・マイナー ＪＣＭ１１６８、ワイセラ・パラメセンテロイデス ＪＣＭ９８９０、ワイセラ・タイランデンシス ＪＣＭ１０６９４のいずれかである前記２記載の製造法。
【請求項４】
ペディオコッカス属に属する乳酸菌がペディオコッカス・ペントサセウスである前記２記載の製造法。
【請求項５】
ラクトバシラス属に属する乳酸菌がラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ペントサスのいずれかである前記２記載の製造法。
【請求項６】
ロイコノストック属に属する乳酸菌がロイコノストック・シトレウム、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、ロイコノストック・アルジェンティナム、ロイコノストック・カルノサム、ロイコノストック・メセンテロイデスのいずれかである前記２記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至６記載の乳酸菌培養物を食品の製造工程で用いることを特徴とする食品の保存方法。
【請求項８】
食品が発酵食品又は食肉加工品である請求項７記載の保存方法。
【請求項９】
バクテリオシン生産乳酸菌のスクリーニング法において、プロテアーゼ存在下においても抗菌活性を有する乳酸菌培養物をスクリーニングすることを特徴とする乳酸菌のスクリーニング方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４５０５３
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【発行日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５３７２（Ｐ２００５−５１５３７２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６７８３
【国際出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【発行日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６７８３
【国際出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]