ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸と、その使用
ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａに特異的に結合する一定の長さを有する少なくとも１５のヌクレオチドから成る核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的なリガンド、特にこのタンパクを精製、検出するためのリガンドの同定と、その医学分野での使用とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）はビタミンＫ依存性のグリコプロテインであり、その活性形（ＦＶＩＩａ）はカルシウムおよび組織因子の存在下で第Ｘ因子および第ＩＸ因子を活性化して凝集プロセスに関与する。ＦＶＩＩは分子量が約５０ｋＤａである４０６個のアミノ酸残基の単一ペプチド鎖の形で分泌される。
【０００３】
従って、ビタミンＫ依存性のグリコプロテインであるこのＦＶＩＩａは凝固機構、従って血栓の形成に重要な役割を演じている。ＦＶＩＩａには出血を起こしている組織の損害後に放出される組織因子の存在下で、第ＶＩＩＩまたはＩＸ因子が不存在の場合でも、局所的に働くことが可能であるという利点がある。そのため、ＦＶＩＩａは出血によって生じるある種の凝固不調を正すために古くから使われてきた。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子はＦＶＩ１（血友病タイプＡ）または第ＩＸ因子（血友病型Ｂ）を欠失している患者やその他の凝固因子を欠失している患者、例えば遺伝性ＦＶＩＩ欠失患者の血友病治療で使われている。また、ＦＶＩＩはストローク（卒中）の処置でも推薦されている。そのためには注射可能なＦＶＩＩａ濃縮物が必要である。
【０００５】
ＦＶＩＩａ濃縮物を得る最も古い方法は分画して得た血漿タンパクからＦＶＩｌａを精製する方法である。特許文献１（欧州特許第EP 0 346 241号公報）に記載のＦＶＩＩａ−濃縮（enriched）画分の製造方法ではＰＰＳＢ（ＰプロトロンビンまたはＦＩＩ（Ｐ＝プロコンバーチンまたはＦＶＩＩ、Ｓ＝スチュワート因子またはＦＸ、Ｂ＝抗血友病因子ＢまたはＦＩＸ）のプレ溶出液を含む、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａを含む血漿タンパク、その他のタンパク（例えば因子ＩＸ（ＦＩＸ）、Ｘ（ＦＸ）およびＩｌ（ＦＩｌ）の分画副産物を吸着し、溶出して得られる。この方法の欠点は得られるＦＶＩＩが他の凝固因子の痕跡量を含む点にある。
【０００６】
同様に、特許文献２（欧州特許第EP 0 547 932号公報）にはビタミンＫ依存性因子およびＦＶＩＩＩを基本的に含まない高純度ＦＶＩ１ａ濃縮物の製造方法が記載されている。この方法で得られるＦＶＩＩは純度が良いが残渣が血栓形成（thrombogenic）活性を有する。
【０００７】
1980年代にヒト因子ＶＩＩをコードするＤＮＡが単離され（Hagen et al,(1986);Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Apr. 83(8):2412-6）、対応するタンパクがＢＨＫ（ベビー・ハムスター腎臓）哺乳動物細胞で発現された（特許文献３）。
【０００８】
本出願人の特許文献４（フランス特許出願第FR 06 04872号公報）にはトランスジェニック動物でのＦＶＩＩａ製造方法が記載されている。この製造方法を用いるとウィルス、その他の病原による汚染に対して安全なタンパクを得ることができる。この方法はさらに、一次配列がヒト一次配列に同一であるタンパク、すなわち各種アミノ酸間の結合が全く同じタンパクを得ることができる。
【０００９】
しかし、この方法で得られるものは、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの出発源にも関わらず、汚染物質を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの濃縮組成物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第EP 0 346 241号公報
【特許文献２】欧州特許第EP 0 547 932号公報
【特許文献３】欧州特許第EP 0 200 421号公報
【特許文献４】フランス特許出願第FR 06 04872号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ヒト血漿から因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する方法では残留血栓形成（thrombogenic）がないか、実質的にない最終産物を得ることが特に有利である。精製された組換型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを得る方法では望ましくない細胞タンパクを含まないか、実質的に含まない最終生成物を得ることが特に重要である。特に、トランスジェニク哺乳類に由来する体液から精製したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ組成物では、ヒトで免疫原となる可能性のあるトランスジェニク哺乳類が天然に産生する因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含まないか、実質的に含まない最終生成物を得ることが重要である。
この目標を達成するためには上記の因子ＶＩｌ／ＶＩｌａを含むサンプルから、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する効率的かつ特異的な手段が必要であり、その手段は簡単で、再現性がよいことが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明には、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩＮ１Ｉａに特異的に結合する単一鎖の核酸を提供する。
本発明はさらに、構造中に上記定義の少なくとも一つの核酸を含む、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する各種の化合物にも関するものである。
本発明はさらに、上記定義核酸または化合物と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間に形成さる錯体（複合体、コンプレックス）にも関するものである。
本発明はさらに、上記定義の核酸または化合物の複数がグラフトした固体の基質材料からなる、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定するための基質にも関するものである。
【００１３】
本発明のさらに他の対象は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを上記定義の基質と接触させる段階を含む、基質上にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定する方法にある。
本発明のさらに他の対象は、下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法にある：
（ａ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを上記の核酸または基質と接触させてｉ）上記核酸または上記基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体を形成し、
（ｂ）段階（ａ）で形成させた錯体からヒト因子ＩＩ／ＶＩＩａを遊離させて精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収する。
本発明のさらに他の対象は、下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの存在を検出する方法にある：
（ａ）上記定義の核酸または基質と上記サンプルとを接触させ、
（ｂ）（ｉ）上記核酸または基質と（ｉｉ）因子ＶＩｌ／ＶＩｌａとの間の錯体の形成を検出する。
本発明はさらに、上記定義の核酸の医療での予防または治療でき使用にも関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】は本発明の核酸（Mapt２）保持（folding）のモデル計算結果を示す図である。ｍＦｏｌｄコンピュータープログラムを使用し、［図１］に示す構造を得るのに用いたものと同じパラメータすなわち下記条件を使用した：（ｉ）直鎖の配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）保持温度：２５°、（ｉｉｉ）イオン条件：［Ｎａ+］：１５０ｍＭ；［Ｍｇ++］：４ｍＭ、（ｉｖ）修正タイプ：オリゴマ、（ｖ）百分比サブオプティマル（suboptimality）数）：２（ｖｉ）計算保持数の上限：５０、（ｖｉｉ）２つの塩基対間の最大距離：無制限（ｖｉｉｉ）他のパラメータのためのデフォルト値
【００１５】
【図２】は基質に固定したヒト血漿第ＶＩＩ因子に対する本発明の各種核酸（Mapt2、Mapt3およびMapt7）の表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００１６】
【図３】は基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対する各種濃度で使用したヒト血漿第ＶＩＩ因子の表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。各曲線は図の最上部から下に向かって下記を示す：曲線１［ＦｙＩＩ］：５００ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；曲線２［ＦｙＩＩ］：２５０ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；曲線３［ＦｙＩＩ］：１２５ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；曲線４［ＦＶＩＩ］：６２．５ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；下部曲線：それぞれ６２、１２５、２５０および５００ｎＭでの精製免疫グロブリン調整物。
【００１７】
【図４】は（ｉ）基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対する組換え型ヒト因子ＶＩＩの表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線と、（ｉ）で作った固定核酸／ＦＶＩＩ錯体に対する抗ヒトＦＶＩＩ単クローン抗体の結合曲線とを示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００１８】
【図５】は時間的に連続的に注入したヒト血漿第ＶＩＩ因子による本発明の核酸（Mapt2）を固定した基質の飽和曲線。表面プラスモン共振法に従ったテスト。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。最上部の曲線：濃度５００ｎＭの精製ヒトＦＶＩＩで得た信号信号。
【００１９】
【図６】は本発明の核酸（Mapt2）を固定した基質の表面プラスモン共振法に従ったテストでのヒト血漿第ＶＩＩ因子の結合動特性（kinetics）曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２０】
【図７】は基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対する種々起源の第ＶＩＩ因子タンパクの表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２１】
【図８】は基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対するヒト血漿第ＶＩＩ因子およびウサギ組換え型第ＶＩＩ因子の表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２２】
【図９】はＰＥＧスペーサ鎖（このスペーサ鎖自体はビオチン分子に連結）に連結した本発明アプタマ（Mapt2）を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物の構造を示す図。
【００２３】
【図１０】はＳＥＬＥＸタイプのプロセスの実行サイクルの最後に選択された、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する各種アプタマの配列を示す図。［図１０］に示す配列は図の最上部から下に向かってＳＥＱ ＩＤ番号８７〜ＳＥＱ ＩＤ番号１００である。
【００２４】
【図１１】はウサギ乳汁に産生された組換え型ヒト因子ＶＩＩを、抗ヒトＦＶＩＩ核酸アプタマを固定した親和性基質を用いて精製する方法の実行中に得られたクロマトグラフのプロフィルを示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：２５４ナノメートルでの吸光度（ＯＤ）値。
【００２５】
【図１２】は基質に固定したヒト血漿第ＶＩＩ因子に対するテストした本発明の２７の核酸アプタマの表面プラスモン共振法に従った結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２６】
【図１３】はテストした２７のアプタマの各々の安定結合信号の固有値を示す図。Ｘ軸：テストした２７の各アプタマ；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２７】
【図１４】は時間を関数とした２８０ナノメートルでの吸光度測定曲線。
【００２８】
【図１５】はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの画像。レーン1は出発生成物画分、レーン２は溶出画分に対応する。
【００２９】
【図１６】はトランスジェニクウサギの乳汁中に産生させた組換え型ヒト因子ＶＩＩに対する固定したアプタマMapt2の結合曲線を表す図。矢印は各注射時間に対応し、［図１６］の左から右に向かってそれぞれ下記の時間を表す：１：組換え型因子ＶＩＩの注射；２：１Ｍ-ＮａＣｌを含む緩衝液の注射；３：２Ｍ-ＮａＣｌを含む緩衝液の注射；４：３Ｍ-ＮａＣｌを含む緩衝液の注射；５：５０ｍＭのトリス、１０ｍＭ-ＥＤＴＡ緩衝の注射、Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：応答信号（任意の単位（ＲＵ）で表示）。
【００３０】
【図１７】はトランスジェニクウサギの乳汁中に産生させた組換え型ヒト因子ＶＩＩに対する固定したアプタマMapt2の結合曲線を表す図。矢印は各注射時間に対応し、［図１７］の左から右に向かってそれぞれ下記を表す：１：５０％プロピレングリコール；２：１０ｍＭ-ＥＤＴＡ。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、寸法が小さく、安価に合成できる、ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａに特異的に結合することができる新規な手段を提供する。本発明のこの手段は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの検出、凝固不全（疾患）の予防または治療を目的とする医薬品の活性成分としての使用を含めた、上記手段が使われる全ての分野の用途で使用できる。
【００３２】
より詳細には、以下で詳細に説明する共通した多くの構造上の特徴を有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合することができる単一鎖の核酸のファミリーを本発明者は見出した。
【００３３】
以下で詳細に説明するように、本発明のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合することができる単一鎖の核酸、好ましくはＤＮＡ型のの核酸から成り、この核酸はそのヌクレオチド配列によって与えられる一定の構造上の特徴から、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する結合する上記結合特性を核酸に与える空間コンフォメーションを取ることができる。本発明の核酸はこのタイプの分子に対して当業者が一般的に使用している用語であるヌクレオチド「アプタマ（aアプタマ）」とよぶことができる。
【００３４】
血液の凝固経路に関係する各種タンパクの結合可能なすることができる核酸（nucleic）アプタマは従来技術で公知で、Willebrand因子を介して結合するアプタマ（特許文献５）、アルファトロンビンを結合するアプタマ（特許文献２）またはトロンビン（非特許文献１）、第ＩＸ因子／ＩＸａを結合するアプタマ（非特許文献２〜３、特許文献６、７）、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する核酸アプタマ（特許文献６、７）、
【００３５】
【特許文献５】国際特許第ＷＯ２００８／１５０４９５号公報
【特許文献６】欧州特許第ＥＰ１９７２６９３号公報
【非特許文献１】Zhao et aI., 2008, Anal Chem,Vol. 80(19):7586-7593
【非特許文献２】Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95:767-771;
【非特許文献３】Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, Vol. 27:722-727
【特許文献７】国際特許第WO 2002/096926号公報
【特許文献８】米国特許第US 7,312,325号明細書
【００３６】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する核酸アプタマは非特許文献４、５にも記載されている。
【非特許文献４】Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5):841-848;
【非特許文献５】Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17: 1-11
【００３７】
本発明の一つの対象は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸にある。
【００３８】
本明細書ではヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する単一鎖の核酸は「核酸アプタマ」「「アプタマ」「ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合するアプタマ」または『抗−ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ」ともよばれる。
【００３９】
「ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ」という用語は天然起源のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよび組換え型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む。
【００４０】
「ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ」はアミノ酸配列に関係して考慮する。すなわちタンパクがグリコシレート化されているか非グリコシレート化であるかとは独立しており、タンパクがグリコシレート化されている場合、グリコシル化のタイプは考慮しない。
【００４１】
また、以下で詳細に示すように、本発明のヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａに特異的に結合する核酸の実施例では、５'末端から３'末端に下記：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の連続した配列を含む共通した構造上の特徴を有している：（ｉ）長さが約２０個のヌクレオチドの不変な特定ヌクレオチド配列、（ｉｉ）長さが４０〜５０個の可変なヌクレオチド配列、それに続く（ｉｉｉ）長さが約２０個のヌクレオチドの不変な特定ヌクレオチド配列。可変なヌクレオチド配列（ｉｉ）は互いに非常に強いヌクレオチド配列同一性を有することができる。
【００４２】
従って、本発明者は、（ｉ）共通した構造上の特徴と（ｉｉ）共通した機能上の特徴との間の関係の存在を示すことができる、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合可能な核酸アプタマのファミリーを構築した。
【００４３】
構造上の観点からは、本発明のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する上記の核酸または核酸アプタマのファミリーは下記の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］ｘ−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］ｙ−３' （Ｉ）
（ここで、
「ＳＥＱＩＤ番号Ｘ」はＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の核酸から成る群の中から選択される核酸から成り、
「ｘ」は０〜１に等しい整数であり、
「ｙ」は０〜１に等しい整数である）
【００４４】
本発明のいくつかの実施例では、ＳＥＱＩＤ番号Ｘの酸は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４５】
本発明の他の実施例では、ＳＥＱＩＤ番号Ｘの酸は４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドの長さを有する。
【００４６】
本発明の他の実施例では、ＳＥＱＩＤ番号Ｘの酸は４３，４４または４５ヌクレオチドの長さを有するのが好ましい。
【００４７】
既に述べたように、式（Ｉ）の核酸は長さが少なくとも１５のヌクレオチドである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施例では、式（Ｉ）の核酸は長さが少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０または８１ヌクレオチドであり、これは各長さを特定した核酸を含む。
【００４９】
式（Ｉ）のアプタマを得る方法の実施例では連続した選抜段階でヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合す上記核酸のファミリーを構築し、可変配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを構造的にフレーミンクするＳＥＱＩＤ番号１およびＳＥＱＩＤ番号２を５'末端および３'末端に有する核酸アプタマのセットおよびサブセットを連続した各選抜サイクルで単離し、特徴付ける。
【００５０】
本発明の核酸アプタマの主たるファミリーでは可変配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘの全てが互いに少なくとも４０％のヌクレオチド配列同一性を有する。このことは配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘでは、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａへの結合特性を保持するための構造上の制約はこれらの核酸アプタマの５'末端および３'末端に位置した配列に対する構造上制約よりも少ないことを意味している。
【００５１】
整数「ｘ」で、整数「ｙ」が１に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−１）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］−３' （Ｉ−１）
【００５２】
整数「ｘ」が１に等しく、整数「ｙ」が０に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−２）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−２）
【００５３】
整数「ｘ」が０で、整数「ｙ」が０に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−３）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−３）
【００５４】
従って、上記の核酸アプタマは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５番およびＳＥＱＩＤ８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の核酸から成る群の中から選択される核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する核酸を含む。
【００５５】
一般に、第二のヌクレオチドまたは核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有する第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％，５１％，５２％，５３％，５４％，５５％，５６％，５７％，５８％，５９％，６０％，６１％，６２％，６３％，６４％，６５％，６６％，６７％，６８％，６９％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する。
【００５６】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを有する本発明の核酸のいくつかの実施例では、この配列ＳＥＱＩＤ番号ＸがＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の中の少なくとも１つと少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有する配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する核酸から成る群の中から選択される。
【００５７】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを有する本発明の核酸のいくつかの実施例では、この配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが、配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５番およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも１つと少なくとも４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％，５６％，５７％，５８％，５９％，６０％，６１％，６２％，６３％，６４％，６５％，６６％，６７％，６８％，６９％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する核酸からなる群の中から選択される。
【００５８】
上記のことから、本発明は上記定義の式（Ｉ）のシリーズの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する単一鎖の核酸のファミリーを含む。
【００５９】
本発明で２つの核酸間の「百分比同一性」は整列した２つの配列を比較窓を介して最適な方法で比較し決定される。
【００６０】
従って、比較窓中にあるヌクレオチド配列の一部は、２つの配列間で最適なアランメントが得られるように、参照配列（付加または欠失がない）と比較して付加または欠失（例えばギャップ）を有する。
【００６１】
「百分比同一性」の計算方法では、比較した２つの配列で全く同じ核酸塩基が得られた位置の数を求め、２つの核酸塩基間で同一性のある位置の数を比較窓中の位置の全数で割り、得られた結果に１００を掛けることで、２つの配列の百分比ヌクレオチド同一性を求める。
【００６２】
比較用の最適配列アランメントは公知のアルゴリズムを使用したコンピュータで実行できる。
【００６３】
百分比配列同一性はCLUSTAL Wソフトウェア（バージョン１．８２）を使用して決定するのが好ましい。その設定パラメータは以下の通り：
(1)CPU MODE=ClustaIW mp;
(2)ALIGNMENT=「full」;
(3)OUTPUT FORMAT=「aln w/numbers」;
(4)OUTPUT ORDER=「alignment」;
(5)COLOR ALIGNMENT=「no」;
(6)KTUP(word sizw)=「default」;
(7)WINDOW LENGTH=「default」;
(8)SCORE TYPE=「percent」;
(9)TOPDIAG=「default」;
(10)PAIRGAP=「default」;
(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE=「none」;
(12)MATRIX=「default」;
(13)GAP OPEN=「default」;
(14)END GAPS=「default」;
(15)GAP EXTENSION=「default」;
(16)GAP DISTANCES=「default」;
(17)TREE TYPE=「分岐図」
(18)TREE GRAPH DISTANCES=「hide」。
【００６４】
［図１］に示した本発明の核酸の構造をベースにして当業者は配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘの可能な特定配列を有限数のヌクレオチドコレクションの中から簡単に決定することができる。
【００６５】
例えば、本発明の核酸アプタマのいくつかの実施例では、当業者は上記の式（Ｉ）の核酸アプタマの上記構造上の定義を基礎として、例えば、適当な命令セットとメモリーをロードしたデジタルコンピュータを用いて配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘに対して可能な全ての配列を自動的に、簡単に発生させることができる。当業者はそれから必要に応じて上記デジタルコンピュータを用いて、（ｉ）空間構造モデルが［図１］の核酸アプタマと類似または同一な配列と（ｉｉ）［図１］の核酸アプタマの構造とは異なる核酸アプタマのそれとをそれぞれ自動的に決定することができる。
【００６６】
［図１］の核酸アプタマと類似または同じ空間構造を有する核酸アプタマは、この核酸アプタマに関して上記で記載した連続したループとステムとを有するものを含む。
【００６７】
当業者は式（Ｉ）の核酸の空間構造を決定するために、そのヌクレオチド配列の説明を基礎にしてZukerに記載のコンピュータープログラムmFold（登録商標）を用いて構造モデルを作ることができる(2003、Nucleic Acids Research, Vol. 231(13):3406-3413)。これは下記ウエブアドレスからも利用できる：http://mfold.bioinfo.rDi.edu/.）
【００６８】
コンピュータープログラムmFoldは［図１］に示す構造を得るのに用いたパラメータと同じもの、すなわち下記条件を用いるのが好ましい：
（ｉ）直鎖配列のＤＮＡ、
（ｉｉ）フォールディング温度：２５℃
（ｉｉｉ）イオン条件：［Ｎａ+］：１５０ｍＭ；［Ｍｇ++］：４ｍＭ
（ｉｖ）修正タイプ：オリゴマ
（ｖ）百分比サブオプティマル数：２
（ｖｉ）計算保持数の上限：５０
（ｖｉｉ）２つの塩基対間の最大距離：無制限
（ｖｉｉｉ）他のパラメータのためのデフォルト値の使用。
【００６９】
次いで当業者は（ｉ）［図１］のアプタマの構造モデルと（ｉｉ）作成した式（Ｉ）のアプタマの構造モデルとを比較する段階を実行し、構造モデルが［図１］に示すアプタマと類似または同じであるれば、札性した式（Ｉ）のアプタマを選択する。
【００７０】
いずれにせよ、新たに発生させた式（Ｉ）のアプタマの選択抜がポジティブであることを確認するために当業者は例えば本明細書に記載の説明、特に実施例に記載の特定方法に従ってヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ結合特性を検査することができる。
【００７１】
本発明の核酸アプタマのいくつかの好ましい実施例では、核酸アプタマは式（Ｉ）の核酸と少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、それは式（Ｉ）の核酸と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの１５の連続したヌクレオチドを含むアプタマを含む。
【００７２】
式（Ｉ）の核酸の好ましい実施例では、配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の中の少なくとも１つと少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有し、これには配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも１つと少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する配列が含まれる。
【００７３】
式（Ｉ）の核酸の他の好ましい実施例では、配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される。
【００７４】
式（Ｉ）の核酸の他の好ましい実施例では、配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３、５、６、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２３、２４、２５、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０から成る群の中から選択される。
【００７５】
本発明では、ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａに結合する核酸はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと接触した時にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと錯体を形成することができる単一鎖の核酸から成る。
【００７６】
従って、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと結合した核酸は、核酸なおよびタンパクパートナーをそれぞれ接触させる前段階後に検出可能なヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体を含む。
【００７７】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと結合した核酸が形成する錯体の検出は当業者に公知の方法、例えば実施例に示すBiacore（登録商標）を含む表面プラスモン共振検出技術を用いて簡単に実行できる。また、当業者は実施例に示すようなＥＬＩＳＡ型の従来法によって核酸とヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を簡単に検出することもできる。
【００７８】
実施例に示るように、式（Ｉ）の核酸は任意の種類のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと強い結合能を有している。特に、式（Ｉ）の核酸は天然のヒト因子ＶｌｌＮｌｌａおよび組換え型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する。
【００７９】
いかなる理論に拘束されるものではないが、実施例が示す結果は、本発明の式（Ｉ）の核酸は一定の種類のグリコシル化（glycosylation）を有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する強い能力を有すると考えられる。換言すれば、式（Ｉ）の核酸はヒト・血漿を含む天然由来の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａだけでなく、トランスジェニック動物、好ましくは血漿で天然に産出しされるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａのグリコシル化のタイプとはグリコシル化の種類が異るウサギを含む種々の生物種のトランスジェニク哺乳類で生産した組換え型ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａにも効果的に結合できると考えられる。
【００８０】
本発明でヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに「特異的に」結合する核酸はヒト以外の哺乳類のゲノムによってコードされる因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、例えばウサギ・因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む他のタンパクに結合する能力よりも大きな結合能力をヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対して有する核酸から成る。
【００８１】
本発明では、第１の核酸は第２の核酸よりヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力が大きい。すなわち、結合を検出する上記の方法の任意の一つを使用した時に、同じテスト条件下で、第１の核酸で得られる結合信号の値は第２の核酸で得られるものに比較し統計学的に大きい。例えば、Biacore（登録商標）法を用いた結合検出法では、第１の核酸のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力は第２の核酸のそれより強く、計測単位とは無関係に、第１の核酸の共振信号値は第２の核酸で測定される信号値より統計学的に大きな共振が得られる。２つの別々の「統計学的」な計測値で両者の間に使用した結合検出方法の測定誤差より大きな違いがある。
【００８２】
実施例に示すように、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する本発明の核酸のキャパシティがテストされた。
【００８３】
一般に、式（Ｉ）の核酸はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する解離定数値が最大で５００ｎＭ、多くの場合最大で２００ｎＭである。
【００８４】
式（Ｉ）の核酸はヒト以外の哺乳類由来の任意の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの結合能力よりも大きなヒト因子ＶｌｌＮｌｌａに対する結合能力を有することが示された。特に、式（Ｉ）の核酸は天然または組換え型を含む任意タイプのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する強い能力を有するにもかかわらず、ウサギ因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むヒト以外の哺乳類のゲノムによってコードされる因子ＶＩＩ／ＶＩＩに結合する能力はゼロか、弱い。
【００８５】
式（Ｉ）の核酸のこの有利な特徴は実施例、特に配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが配列ＳＥＱＩＤ番号８５を含む式（Ｉ）の核酸を含む配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸で示されている。そのＰＥＧおよびビオチンとの結合後の構造は［図９］に示してある。
【００８６】
すなわち、配列ＳＥＱＩＤ番号８６の式（Ｉ）の核酸では、Biacoree（登録商標）法に従って測定したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩｌａへの結合能力（解離定数Ｋｄで表す）の値は約１００ｎＭである。さらに、式（Ｉ）のこの核酸はヒト血漿因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよび組換え型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、例えばトランスジェニクウサギで産生したものの両方に結合する能力を有し、その値は同じ程度である。
【００８７】
さらに、式（Ｉ）の核酸とヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体は化学量論である。すなわち、錯体化したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子数に対する式（Ｉ）の核酸の分子数の比はほぼ１：１、特に１：１である。
【００８８】
従って、本発明の他の観点から、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに「特異的に」結合する式（Ｉ）の核酸のキャパシティは、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよび非ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａにたいするそれぞれの解離定数Ｋｄの比として表すこともできる。
【００８９】
本発明の他の特徴から、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する式（Ｉ）の核酸のキャパシティは、下記の条件（Ａ）で表すことができる：
ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ＜０．０１ （Ａ）
（ここで、
「ヒトＫｄ」は式（Ｉ）での核酸のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する解離定数（モル単位表示）であり、
「非ヒトＫｄ」は式（Ｉ）の核酸のヒト以外の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する解離定数で、同じモル単位で表示される。
【００９０】
従って、本発明のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸では、ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ比が０．０１以下であるのが好ましく、さらに好ましくは０．００１以下である。
【００９１】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する本発明の式（Ｉ）の核酸のの特徴から、本発明のアプタマ核酸はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとヒト以外の哺乳類に由来する非ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、例えばウサギ・因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとを区別するのに有利に使用できる。
【００９２】
特に、本発明の式（Ｉ）の核酸は、ヒト以外の哺乳類に由来する因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む材料から出発しか錯体からヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段として遊離に使用することがができる。特に、式（Ｉ）の核酸は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対してトランスジェニクであるウサギからのバイオ液体（ウサギが天然に産生する因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む）の組換え型因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段で使用できる。
【００９３】
実施例に示すように、式（Ｉ）の核酸の他の特徴は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体がこの錯体を金属カチオン−キレート剤と培養することによってヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを遊離する能力にある。特に、式（Ｉ）の核酸と錯体を形成した因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子はＥＤＴＡのような金属カチオン−キレート剤と接触すると錯体からリリースされる。
【００９４】
従って、本発明の他の観点から、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する式（Ｉ）の核酸の結合は、金属カチオン−キレート剤との接触、例えばＥＤＴＡとのに接触によって分離（解離）できる。
【００９５】
本発明の式（Ｉ）の核酸のこの追加の特徴は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段としての上記核酸を使用する上で特に有利である。特に、この種の精製用途では、式（Ｉ）の核酸との錯体として固定されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを金属カチオン−キレート剤と接触させるか培養することで精製した形で簡単に回収でき、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを少なくとも部分的に変成する公知の物質の使用、例えば尿素の使用や酸性条件の使用は不要である。
【００９６】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段としての使用では、本発明の式（Ｉ）の核酸を固体基質に固定（immobilize）するのが好ましい。この固体基質には固体粒子、クロマトグラフィ基質、その他が含まれる。核酸を各種固体基質上に固定する方法は当業者に周知である。
【００９７】
固体基質はアガロースまたはセルロースまたは合成ゲル、例えばアクリルアミド、メタクリレートまたはポリスチレン誘導体のゲルのアフィニティークロマトグラフィカラムまたは表面プラスモン共振に適したチップ、ポリアミドのようなメンブレン、ポリアクリロニトリルまたはポリエステル・メンブレンまたは磁気またはパラマグネティクビーズすることができる。
【００９８】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段として使用する本発明の式（Ｉ）の核酸はその化学構造中にスペーサ手段を含み、さらに必要に応じて固体基質上に固定するための手段を含むのが好ましい。
【００９９】
従って、本発明は下記の式（ＩＩ）を特徴とするヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物にも関するものである：
［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （Ｉｌ）、
（ここで、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと特異的に結合する核酸を表す。
【０１００】
上記化合物はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段の特定実施例を構成する。
【０１０１】
「スペーサ鎖」（式（Ｉｌ）の化合物では［ＳＰＡＣ］）で表示）は公知の任意のタイプにすることができる。このスペーサ鎖の機能は核酸[ＮＵＣＬ］を上記化合物が固定されている固体基質の表面から物理的に離し、
すことにある。核酸［ＮＵＣＬ］が固定される固体基質の表面に対して相対的に動けるようすることにある。このスペーサ鎖は固体基質が式（Ｉ）の核酸にあまり近付きすぎて核酸とそれに接触されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ分子との間の結合が妨げる立体障害を制限または防ぐ役目をする。
【０１０２】
式（ＩＩ）の化合物でのスペーサ鎖は核酸［ＮＵＣＬ］の５'末端または３'末端に結合されるのが好ましい。
【０１０３】
スペーサ鎖はアプタマの一端と固体基質とに結合されるのが好ましい。スペーサとのこの構造はアプタマを固体基質上に直接固定しないという利点がある。スペーサ鎖は非特異性のオリゴヌクレオチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるのが好ましい。スペーサ鎖が非特異性のオリゴヌクレオチドから成る場合、そのオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも５つのヌクレオチド、好ましくは長さが５〜１５のヌクレオチドから成るのが好ましい。
【０１０４】
スペーサ鎖がポリエチレングリコールから成る式（ＩＩ）の化合物の実施例の場合、このスペーサ鎖はＰＥＧ（Ｃ１８）タイプのポリエチレングリコールを含む。
【０１０５】
アプタマを固体基質に直接またはスペーサ鎖に固定する場合、核酸［ＮＵＣＬ］を種々の化学基、例えば核酸を共有結合で固定する基、例えばチオール、アミンまたは固体基質に存在する化学基と反応可能な他の任意の基で化学的に修正することができる。他の実施例では、スペーサ鎖はそれ自身を固体基質に固定することができる。この場合、必要に応じてスペーサを適切な化学基で変成することができる。他の実施例では可動基質上に核酸アプタマを有する化合物を固定させる化合物にスペーサ鎖を結合させる。
【０１０６】
従って、本発明は下記の式（ＩＩＩ）であることを特徴とするヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物に関するものである：
［ＦＩＸ］−［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （ＩＩＩ）
（ここで、
［ＦＩＸ］は基質上に固定するための化合物を表し、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸を表す）
【０１０７】
上記の式（ＩＩＩ）の化合物はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段の実施例を構成する。
式（Ｉｌ）または式（ＩＩＩ）のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段は固体基質に結合された形であるのが好ましい。
式（ＩＩＩ）の化合物で、化合物［ＦＩＸ］は（ｉ）固体基質の表面材料と一つ以上の共有結合を形成することができる化合物および（ｉｉ）弱い非共有結合、例えば水素結合、静電気力またはファンデルワールス力によって固体基質を拘束できる化合物の中から選択される化合物から成る。
【０１０８】
化合物［ＦＩＸ］の第１の種類は二官能性カップリング剤、例えばグルタールアルデヒド、ＳｌＡＢ、その他のＳＭＣＣを含む。
【０１０９】
ＳｌＡＢは下記式（Ｉ）の化合物で、下記文献に記載されている：
【非特許文献６】Hermanson G.T. 1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, pp 239-242
【０１１０】
【０１１１】
化合物ＳｌＡＢは酢酸沃素およびスルホ−ＮＨＳエステル基を有する２つの反応基を有し、それぞれアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する。
【０１１２】
化合物ＳＭＣＣは下記文献に記載されている。
【非特許文献７】Samoszuk M.K. et al. 1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1): 37-46
【０１１３】
【０１１４】
化合物ＳＭＣＣはそれぞれスルホ−ＮＨＳエステル基およびマレイミド基から成る２つの反応基を有し、それぞれアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する。
【０１１５】
化合物［ＦＩＸ］の第２の種類は固体基質に存在すアビジンまたはストレプトアビジン分子に非共有結合で結合可能なビオチンを含む。
【０１１６】
他の実施例では、スペーサ鎖を介して固体基質に固定した後アプタマを変成し、その遊離末端（スペーサに結合されてない末端）を例えば化学的に変成されたヌクレオチドにすることができる（例えば２'−Ｏ−メチルまたは２'−フルオロピリミジン、２'−リボプリン、ホスホアミディテ、逆ヌクレオチドまたは化学基（ＰＥＧ、ポリ陽イオン、コレステロール）。これに限定されるものではない）。これらの変成でアプタマを酵素分解から保護することができる。
【０１１７】
固体基質はアガロースからまたはセルロースまたは合成ゲルから誘導されるゲルから成るアフィニティークロマトグラフィカラム、アクリルアミド、メタクリレートまたはポリスチレン誘導体、表面プラスモン共振に適したチップ、メンブレン、例えばポリアミド、ポリアクリロニトリルまたはポリエステルのメンブレンまたは磁気ビーズまたは正磁気ビーズにすることができる。
【０１１８】
本発明は下記（ｉ）と（ｉｉ）との間の錯体にも関するものである：
（ｉ）式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物から選択される物質、そして、
（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ
【０１１９】
本発明の他の対象は、各々が核酸アプタマから成る（または含む）複数の分子がグラフトされている固体基質材料から成ることを特徴とするヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定化するための基質にある。上記分子は（ａ）式（Ｉ）の核酸、（ｂ）式（ＩＩ）の化合物および（ｃ）式（ＩＩＩ）の化合物である。
【０１２０】
上記基質は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定する必要のある全ての用途で使用でき、これには因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製するための用途と、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを検出するための用途とが含まれる。
【０１２１】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する本発明の核酸アプタマを固定する基質の製造方法は実施例に示してある。本発明実施例では本発明のアプタマをヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａを捕捉するための薬剤として従ってよされ、サンプル中のヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａを精製または検出することができる。
【０１２２】
従って、本発明は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の中から選択される物質を予め固定した固体基質と接触させる段階を含む、基質上にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定する方法にも関するものである。この方法は求められる技術対象に従って式（Ｉ）の核酸の分子と錯体を形成した固定されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子を回収する追加の段階を含むことができる。因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収するこの追加の段階は式（Ｉ）の核酸と因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体を金属カチオン−キレート剤、例えばＥＤＴＡと接触させてる段階から成る。
【０１２３】
従って、本発明の他の対象は、下記（ａ）と（ｂ）の工程から成るヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法にある：
（ａ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａから成っているサンプルを式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物または上記定義の固体基質と接触させて、（ｉ）上記の核酸または基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間に錯体を形成し、
（ｂ）段階（ａ）で形成された錯体からヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを遊離させて、精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収する。
【０１２４】
アプタマが固定された固体基質を使用するアフィニティークロマトグラフィによるタンパク精製方法を実行する際には当業者は下記文献に記載の方法を参照できる。
【非特許文献８】Romig et al. 1999, J Chomatogr B Biomed Sci Apl, Vol. 731(2): 275-284
【０１２５】
段階（ａ）でＭｇＣｌ2濃度が低い緩衝液（バッファー）またはＭｇＣｌ2を含まない緩衝液を使用したきに第ＶＩＩ因子の捕獲条件が改善されることが実施例は示している。
【０１２６】
「ＭｇＣｌ2濃度が低いＭｇＣｌ2濃度が低い」とは最終ＭｇＣｌ2濃度が１ｍＭ以下である緩衝液を意味する。
【０１２７】
ＭｇＣｌ2濃度が１ｍＭ以下である緩衝液はＭｇＣｌ2濃度が０．５ｍＭ以下、０．１ｍＭ以下、０．０５ｍＭ以下および０．０１ｍＭ以下、好ましくは０ｍＭである緩衝液を含む。
【０１２８】
本発明の特定実施例の方法では、段階（ａ）の次で段階（ｂ）の前に段階（ａ'）を有する。この段階（ａ'）は洗浄緩衝液で親和性基質を洗浄する段階から成る。好ましくは段階（ａ'）で親和性基質を洗浄する間にイオン強度を増加させる。すなわち、段階（ａ）で使用した緩衝液のイオン強度と比較してイオン強度を増加させた洗浄緩衝液を使用する。段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液のイオン強度は段階（ａ）で使用するイオン強度より2〜500倍大きいのが好ましい。好ましくは、段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液のイオン強度を段階（ａ）で使用するイオン強度より100〜500倍、好ましくは200〜500倍大きくする。
【０１２９】
本発明実施例では、段階（ａ'）の洗浄で高いイオン強度を有する洗浄緩衝液、特に、高いＮａＣｌ濃度を有する緩衝液を使用することで、親和性基質に対する第ＶＩＩ因子の結合性に影響を及ぼさずに、検出可能な方法で、非特異的に親和性基質に結合している物質を効果的に除去することができることが示されている。
【０１３０】
最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１Ｍである洗浄緩衝液を段階（ａ'）で使用するのが好ましい。
【０１３１】
本発明では最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１Ｍである洗浄緩衝液は最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍまたは少なくとも３Ｍ１Ｍである洗浄緩衝液を含む。
【０１３２】
本発明方法の段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液の最終ＮａＣｌ濃度は最大で３．５Ｍであるのが好ましい。本発明方法の段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液の最終ＮａＣｌ濃度は１．５〜３．５の間、好ましくは２〜３．５間、好ましくは２．５〜３．５の間、例えば３〜３．５の間にするのが有利である。
【０１３３】
本発明実施例ではさらに、段階（ａ'）の。高い疎水性の洗浄緩衝液、特に高濃度のプロピレングリコールを使用することで、親和性基質に対する第ＶＩＩ因子の結合性に影響を及ぼさずに、検出可能な方法で、親和性基質に非特異的に結合した物質を効果的に除去することができるたとが示された。
【０１３４】
従って、段階（ａ'）では少なくとも２０％（ｖ／ｖ）の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液を使用するのが好ましい。
【０１３５】
本発明では、少なくとも２０％の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液は、（洗浄緩衝液の全容積に対する）容積で少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または少なくとも６０％の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液を含む。
【０１３６】
段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液は最大で５０％の最終プロピレングリコール含量を有するのが好ましい。段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液は２０％〜５０％の間、好ましくは３０％〜５０％の間の最終プロピレングリコール含量を有するのが好ましい。
【０１３７】
本発明の特定実施例では、段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液はＮａＣｌとプロピレングリコールとを含む。
【０１３８】
精製法の実施例では、段階（ｂ）を親和性基質を二価のイオン性キレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含む溶出緩衝液と接触させて実行する。
【０１３９】
溶出緩衝液は例えば少なくとも１ｍＭかつ最大で３０ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度を含むことができる。
【０１４０】
「少なくとも１ｍＭ」とは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍＭを含む。
【０１４１】
「最大で３０ｍＭ」は２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４，１３、１２またはｌｌｍＭを含む。
【０１４２】
本発明の核酸アプタマう有する親和性基質と、この親和性基質でヒト因子ＶＩＩを精製する方法は実施例に示してある。
【０１４３】
一般に、本発明のアプタマが固定さる固体基質は、濾過基質、チップ用シリコン基質、メンブレン等用に一般的な構造および組成を有する任意の基質を含む。特に、固体基質は樹脂、アフィニティークロマトグラフィカラム樹脂、ポリマビーズ、磁気ビーズ、その他を含む。特に、固体基質はガラスまたは金属、例えば鋼、金、銀、アルミニウム、銅、珪素、ガラスまたはセラミックをベースにした材料を含む。特に、固体基質はポリマー材料、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリ弗化ビニリデンおよびこれらの組合せを含む。
【０１４４】
固体基質は付着、結合、錯体形成、固定化またはアプタマとの相互作用を容易にする材料で被覆されていてもよい。
【０１４５】
本発明の実施例では、固体基質は表面を金の層、カルボキシメチル化処理した層、デキストラン、ストレプトアビジン、コラーゲン、アビジン、その他の層で被覆されたガラススライドにすることができる。
【０１４６】
本発明のアプタマは付着コーテング、例えば上記の共有結合の生成または非共有結合（例えば水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、その他）による会合反応によって固体基質上に固定できる。
【０１４７】
本発明で「親和性基質」とは本発明で定義の核酸アプタマが固定された固体材料から作られた基質を意味する。
【０１４８】
本発明の実施例にはアプタマが非共有結合によって固定された固体基質が基されている。
【０１４９】
本発明実施例にはストレプトアビジン分子の層で被覆されたガラススライドと、非共役ビオチン／ストレプトアビジン会合で基質上に固定された、ビオチン分子と共役した本発明のアプタマを有する固体基質が記載されている。
【０１５０】
本発明実施例は、ストレプトアビジン分子の層で被覆されたポリスチレン材料から成る固体基質と、非共役ビオチン／ストレプトアビジン会合で基質上に固定されたビオチン分子に本発明のアプタマが共役結合したものが記載されている。
【０１５１】
本発明実施例では、本発明アプタマは下記文献に記載のようにアフィニティークロマトグラフィ、通電クロマトグラフィおよびキャピラリ電気泳動に適した固体基質に固定することができる。
【非特許文献９】Ravelet et al. 2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1): 1-10
【非特許文献１０】Connor et al. 2006, J Chromatogr A, Vol. 111(2): 115-119
【非特許文献１１】Cho et al. 2004, Electrophoresis, Vol.25(21-22) : 3730-3739
【非特許文献１２】Zhao et al. 2008, Anal Chem, Vol. 80(10): 3915-3920
【０１５２】
長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する式（Ｉ）のアプタマまたは式（Ｉｌ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物はヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａを捕捉するための薬剤として検出または治療および装置で有利に使用できる。
【０１５３】
本発明のさらに他の観点から、本発明は下記（ａ）と（ｂ）の工程から成る、サンプル中のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの存在を検出する方法にも関するものである：
（ａ）（ｉ）式（Ｉ）の核酸または式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物またはこれらの核酸または化合物の分子が固定されている固体基質を（ｉｉ）サンプルと接触し、
（ｂ）（ｉ）式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物または上記基質と（ｉｉ）因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間に形成された錯体を検出する。
【０１５４】
本発明の実施例には、固体基質に予め固定した本発明のアプタマとヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａとを検出する方法の実施例が記載されている。
【０１５５】
本発明の検査方法を実行する場合に使用する固体基質は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法に関して上記した固体基質から選択できる。
【０１５６】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを検出する方法の実行または装置では、当業者は特下記文献に記載の方法を使用できる。
【特許文献９】欧州特許第ＥＰ１９７２６９３号公報
【特許文献１０】国際特許第ＷＯ２００８／０３８６９６号公報
【特許文献１１】国際特許第ＷＯ２００８／０２５８３０号公報
【特許文献１２】国際特許第ＷＯ２００７／０３２２３５９号公報
【０１５７】
本発明実施例では（ｉ）上記核酸または固体基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を検出する段階（ｂ）が、実施例に記載のように、表面プラスモン共振信号を測定して行われる。
【０１５８】
本発明の他の実施例では、ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を検出する段階（ｂ）が、が形成されているであろう錯体をヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａリガンドと接触させ、そのリガンドを検出する。本発明実施例では、酵素（実施例ではワサビペルオキシダーゼ）でラベル化したモノクローナルまたはポリクローナルの抗ヒトＦＶｌｌＮｌＩａ抗体を、ＥＬＩＳＡ型のアッセイで従来から使用されているように、ヒト因子の検出リガンドとして用いる。
【０１５９】
ヒト・因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むまたは含む多能性のあるサンプルはヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む液体試料にすることができ、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとヒト以外の哺乳類からの因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子を含む液体試料を含むのが有利である。上記精製方法または検査方法の実施例では、サンプルは生物学的溶液、例えば体液、細胞、細胞物質、組織、組織材料、器官または全器官から成る。
【０１６０】
精製方法または検査方法の実施例では、前記サンプルは動物由来の液体の生物学的溶液、例えば血液、血液誘導物、哺乳動物乳汁または哺乳類の乳汁誘導物から成る。このサンプルは血漿、血漿凍結賃源物、精製乳汁またはその誘導物から成ることができる。
【０１６１】
精製方法または検査方法の実施例では、前記サンプルはヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ用トランスジェニク動物由来のものである。この溶液は哺乳類の乳汁またはヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ用トランスジェニク哺乳類からの乳汁の誘導物であるのが好ましい。本発明でトランスジェニック動物は（ｉ）ヒトヒト以外の哺乳類、例えばウシ、ヤギ、ウサギ、ブタ、サル、ラットまたはハツカネズミ、（ｉｉ）鳥類、（ｉｉｉ）昆虫、例えば蚊、ハエまたはカイコを含む。本発明の好ましい実施例でのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ用トランスジェニク動物はヒト以外のトランスジェニク哺乳類、好ましくはヒト因子ＶＩＩＮｌＩａ用トランスジェニク雌ウサギ（doe rabbits）。トランスジェニク哺乳類はトランスジェニク哺乳類の乳汁中にトランスジェニクタンパクを発現する特定プロモータの制御下にあるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａをコードする核酸を含む発現カセットをゲノムに挿入して、乳腺中に組換え型因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを生産するのが好ましい。
【０１６２】
トランスジェニック動物の乳汁中にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを生産する方法は下記工程から成ることができる：乳汁中に天然に分泌されるタンパクのプロモータの制御下にあるヒト因子ＶＩＩＮｌＩａをコードする遺伝子（例えばカゼイン・プロモータ、β−カゼイン・プロモータ、ラクトアルブミン・プロモータ、βラクトグロブリン・プロモータまたはＷＡＰプロモータ）を有するＤＮＡ分子をヒト以外の哺乳類の胎児に一体化し、その胎児を同じ生物種の哺乳動物の雌下に置く。胎児から哺乳類が十分に成長すると、哺乳類から乳汁分泌が誘発され、それから乳汁を集める。この乳汁はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む。
【０１６３】
ヒト以外の哺乳動物の雌の乳汁中でタンパクを調製する方法の例は下記文献に記載されている。
【特許文献１３】欧州特許第ＥＰ０の５２７０６３号公報
【０１６４】
この特許の方法で本発明のタンパクを生産することができる。ＷＡＰ（ホエー酸性タンパク）プロモータはＷＡＰ遺伝子のプロモータを含む配列を導入して調整できる。このプラスミドはＷＡＰプロモータの制御下に置かれた異種遺伝子を受けることが可能な状態で調製できる。上記プロモータおよび本発明のタンパクをコードする遺伝子を含むプラスミドを用い、ウサギ胎児の雄の前核へマイクロインジェクションしてトランスジェニクウサギを得ることができる。それから胎児をホルモン調節した雌の輸卵管に移植する。トランスジェンの存在は得られた若いトランスジェニクウサギから抽出したＤＮＡを用してサザン法によって確認される。動物の乳汁濃度は特定の放射性免疫アッセイで評価される。
【０１６５】
ヒト以外の哺乳動物雌の乳汁中でタンパクを調製する方法はかの文献にも記載されている。例えば特許文献１４（トランスジェニクなハツカネズミ）および特許文献１５（トランスジェニク哺乳類のフォンビルブラント因子の生産）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【特許文献１４】米国特許第ＵＳ７，０４５，６７６号明細書
【特許文献１５】欧州特許第ＥＰ１７３９１７０号公報
【０１６６】
本発明の他の態様によって、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸は、例えばＶＩｌ因子／組織因子錯体の形成を抑制することによって因子ＶＩｌａによる因子Ｘの活性化を阻止する必要のある生理的状況下でインビボで使用できる。
【０１６７】
換言すれば、本明細書に定義のアプタマ核酸は医薬品の血液凝固阻止剤活性成分として予防的または治療的に使用できる。
【０１６８】
特に、現在の説明において定義したアプタマ核酸が、予防であるか治療の血液凝固阻止剤活性成分として、特に、静脈血栓症、動脈の血栓症、ポスト−外科の血栓症、冠状動脈バイパス・グラフト鎖（ＣＡＢＧ）と関連がある無秩序、行程、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、腫瘍を含む凝固無秩序の処置のために使われることができる転移、軽いまたは激しい炎症反応、腐敗菌激突、低血圧、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、肺のｅｍｂｏｈｓｍｓ、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、脈管のｒｅｓｔｅ番号ｓｅｓ、プレートレット鉱床、心筋梗塞、脈管形成、そして、血栓症を開発する危険を有する人類または女性のあらゆる病気予防の処置。
【０１６９】
本発明の一つの対象は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドである本明細書で定義したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸と、一種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬品組成物にある。
【０１７０】
医薬品組成物中での本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａアプタマ核酸の量は、患者にこの活性成分の有効量を投与できるように調節される。本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの投与量は医師または薬剤師が容易に決定できる。一般に、投与される活性成分の量は年齢、医学条件および患者の性、病気の程度、病気の進行度に応じて当業者が容易に決定できる。
【０１７１】
一般に、医薬品組成物は抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの量が単位供与量で１ナノグラムから１００ミリグラム、好ましくは１００ナノグラムから１０ミリグラムとなる量である。
【０１７２】
一般に、本発明の医薬品は組成物の全重量に対して０．０１重量％から９９．９重量％までの抗ＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマまたは複数の抗ＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの組合せと、９９．９重量％から０．０１重量％までの賦形剤または賦形剤の組合せとからなる。
【０１７３】
本発明の他の実施例では、医薬品組成物は１種、２種、３種、４種、５種または６種の別々の抗ＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの組合せから成る。
【０１７４】
本発明の医薬品組成物の調製では当業者はレミントンハンドブックを参照することができる。
【０１７５】
本発明の医薬品組成物は非経口、局所投与で予防的または治療で使用できる。従って、本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマは投与に適した形、例えば液体の形に調製されるか、凍結乾燥にすることができる。本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの医薬品組成物は薬学的に許容される賦形剤および／またはビヒクル（好ましくは水溶性）を含むことができる。薬学的に許容される多くの賦形剤および／またはビヒクル、生理学的条件を再生するの必要な薬剤、例えば水、緩衝水、食塩水、グリシン溶液およびこれの誘導体、例えば、緩衝剤およびｐＨ調整剤、界面活性剤、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化カルシウム等使用できるが、これらに限定さるものではない。医薬品組成物は当業者に周知の方法で殺菌できる。一般に、本発明の医薬品組成物を生産するには当業者は下記文献を参照することができる。
【非特許文献１３】European Pharmacopeiaの最新版、例えば2005年1月発行のEuropean Pharmacopeia第５版および2007年6月発行のEuropean Pharmacopeia第６版
【０１７６】
活性成分としてアプタマを含む医薬品組成物の生産のために当業者は下記文献を参照できる。
【特許文献１６】国際特許第ＷＯ２００７／０５８８０１号公報
【特許文献１７】国際特許第ＷＯ２００５／０８４４１２号公報
【特許文献１８】国際特許第ＷＯ２００４／０４７７４２号公報
【特許文献１９】国際特許第ＷＯ２００８／１５０４９５号公報
【０１７７】
本発明の医薬品組成物の実施例では、抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ活性成分を単独で用いるか、一種以上の他の薬学的に活性な分子、例えば一種以上の他の血液凝固阻止剤活性成分と一緒に使用できる。
【０１７８】
本発明はさらに、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドである上記定義のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸の、医薬品としての使用にも関するものである。
【０１７９】
本発明はさらに、長さのが少なくとも１５個のヌクレオチドである上記定義のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸の、凝固不全の治療用医薬品の生産での用にも関するものである。
【０１８０】
本発明はさらに、長さのが少なくとも１５個のヌクレオチドである上記定義のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸のも、凝固不全の治療での使用にも関するものである。
【０１８１】
本発明の他の対象は、上記定義の組成物を凝固不全の予防または治療を必要とする患者に抗ヒトＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ医薬品を投与する段階を有する凝固不全の予防または治療方法にある、
【０１８２】
一般に、本発明定義の抗ヒトＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ剤の一日当たりの投与量は８０ｋｇの体重の患者で１ナノグラムから１０ミリグラムまで、好ましくは１００ナノグラムから１００ミリグラムである。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１８３】
実施例１
基質上に固定したヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａによる本発明アプタマ核酸の捕獲
血漿由来の精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ分子を固定した固体基質を製造した。ＮＨＳ−ＥＤＣで活性化したカルボキシメチルデキストランにヒト第ＶＩＩ因子を固定した。これはＦＶＩＩ／ＶＩＩａ中に存在するフリーなアミンと結合する。すなわち、ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａが２７４３ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり生成物が約１ｐｇ固定されることに対応する）の固定化度で固定した。
【０１８４】
本発明の核酸アプタマ（純度：９９％）（それぞれＭａｐｔ２アプタマ（ＳＥＱＩＤ番号８６）、Ｍａｐｔ３アプタマ（ＳＥＱＩＤ番号４１）およびＭａｐｔ７アプタマ（ＳＥＱＩＤ番号５８）をランニング緩衝液液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）中に希釈して３つのアプタマ・サンプルを得た。
【０１８５】
各サンプルは固定されたヒトＦＶＩＩを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入して、固定したヒトＦＶＩＩアプタマを分離させた。このチップを用いて固定したヒトＦＶＩＩとテストした各アプタマＭａｐｔ２、Ｍａｐｔ３およびＭａｐｔ７との間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したヒトＦＶＩＩへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図２］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
得られた結果はテストした全ての核酸アプタマがヒト血漿第ＶＩＩ因子に大きな親和性で結合したことを示している。
【０１８６】
実施例２
基質に固定した本発明のアプタマ核酸によるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの捕獲
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明核酸アプタマ分子（「Ｍａｐｔ２」）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
次いで、上記アプタマ化合物と接触させて、基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子との間の非共役会合によって上記固体基質を配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定する。
Ｍａｐｔ２アプタマは９８３ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１８７】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が６２、１２５、２５０および５００ｎＭのサンプルを得る。別に、多可免疫グロブリン（TegeIine（登録商標）、ＬＦＢ（フランス）から市販）の調節物をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して多可免疫グロブリンＰ濃度が６２、１２５、２５０および５００ｎＭのサンプルを得る。
【０１８８】
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩＨＰを分離させた。このチップを用いて固定したＦＶｌｌ ＨＰまたは多原子価の免疫グロブリンと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図３］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
この実施例はＭａｐｔ２アプタマは固定したときに大きな親和性でＦＶＩＩ ＨＰに結合することを示してしいる。Ｍａｐｔ２アプタマは多価免疫グロブリンには結合しない。
【０１８９】
実施例３
基質に固定した本発明のアプタマ核酸によるヒト因子ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの捕獲
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４２４．９ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１９０】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が５００ｎＭのサンプルを得る。
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。このチップを用いてＦＶｌｌ ＨＰと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図４］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。
【０１９１】
固定したアプタマに結合した生成物が本当にＦＶＩＩであることを確認するために、注射の順番は（ｉ）５００ｎＭのＦＶＩＩ ＨＰ、（ｉｉ）抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体１μＭ（シグマ社、Ref Clone番号MC1476/E.A.8.1）を同じチップで実行した。注射および解析条件は上記と同一である。アプタマが実際にＦＶＩＩを保持している場合、ＦＶＩＩに対して抗体が結合した結果として抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体の注射でＲＵ信号が増加することが反映されなければならな。コントロールとして抗体単独を注入した。ＲＵ信号が増加し、アプタマがＦＶＩＩを認識することを明らかに示している（図４）。
記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
この実施例の結果は、アプタマは固定したときに、ＦＶＩＩＨＰに特異的に結合することを示し、大きな親和性を有し、観測した信号本当にアプタマ上のＦＶＩＩの保持によるものである。
【０１９２】
実施例４
Ｍａｐｔ２アプタマ／ヒト血漿ＦＶＩＩストイキオメトリ
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは９８３ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１９３】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が１μＭのサンプルを得る。
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で７００秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で３０秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。このチップを用いてＦＶｌｌ ＨＰと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図５］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
【０１９４】
この実施例の結果は、注射時間中にＭａｐｔ２アプタマに結合するヒトＦＶＩＩの量が増加することと、注射時間（７００秒）が終ってもヒトＦＶＩＩ分子によるアプタマのサイトの飽和にはまだ達しないこととを示している。この結果は固体基質の表面に固定されたＭａｐｔ２アプタマ分子の大部分がヒトＦｙ１１と結合できることを示している。
これらの結果は、アプタマがその標的に結合することができるコンフォメーションはこの形のアプタマの大多数に対して十分に安定していることを示し、このコンフォメーションは固定化によって悪く変化したり悪くさらないことを示している。
これらの結果はさらに、Ｍａｐｔ２／ヒトＦＶＩＩ結合ストイキオメトリは約１／１であることを示している。
【０１９５】
Ｍａｐｔ２／ヒトＦＶＩＩ結合の場合、最高信号は下記で得られる：
［ＭＷＦＶＩＩ／ＭＷＭａｐｔ２］＊固定化レベル＊ｓｔｏｉｃｈｉｏ
（ここで、
ＭＷＦＶＩＩはヒトＦＶＩＩの分子量を表し、５０ｋＤａに等しく、
ＭＷＭａｐｔ２はＭａｐｔ２の分子量を表し、２７ｋＤａに等しく、
固定化のレベルはこの例では９８３．３であり、
ｓｔｏｉｃｈｉｏはＭａｐｔ２／ＦＶＩＩストイキオメトリを表し、１に等しい）
上記の式で得られる最高信号値：１８２０ＲＵ
【０１９６】
ヒト因子ＶＩＩの分子を結合したＭａｐｔ２アプタマの百分比は式：測定信号／予想信号から計算される。
（ここで、測定信号は１２４ＲＵに等しく、予想信号は１８２０ＲＵに等しい）
上記の式では、注射の終わりにヒトＦＶＩＩの分子と結合したＭａｐｔ２アプタマ分子の百分比は６２％である。
【０１９７】
実施例５
Ｍａｐｔ２アプタマのヒト血漿ＦＶＩＩに結合するキネティクス
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明核酸アプタマ（Ｍａｐｔ２）の分子がが固定した固体基質を製造する。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４２５ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１９８】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が１２５、２５０（２倍）、５００ｎＭおよび１０００ｍＭのサンプルを得る。
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
ヒト血漿ＦＶＩＩに対する固定したＭａｐｔ２アプタマの結合キネティクス曲線をBiacore（登録商標）の専用モジュール制御Software(バージョン１．２）で計算した。固定したＭａｐｔ２アプタマのヒト・血漿ＦＶＩＩへの結合キネティクス曲線を［図６］に示した。
このＭａｐｔ２アプタマのヒトＦＶＩＩへの結合キネティクスの計算結果から下記が決定できる：
（１）Ｍａｐｔ２の解離定数Ｋｄは９９．９ｎＭである、
（２）Ｍａｐｔ２の会合定数Ｋａ（６．２５×１０3Ｍ-1ｓ-1）は６．２５×１０-4ｓ-1である。
【０１９９】
実施例６
ＥＤＴＡによる組換え型ヒトＦＶｌｌの溶出
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された。
基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
また、ビオチン化抗−ＦＶＩＩポリクローナル抗体分子を固定した固体基質も製造した。
Ｍａｐｔ２アプタマまたは抗ヒトＦＶＩＩポリクローナル抗体を有する固体基質はＥＬＩＳＡアッセイ用９６−ウエルプレートから成る。
【０２００】
抗ヒトＦＶＩＩポリクローナル抗体はワサビ（hrseradish）ペルオキシダーゼでラベル化して視覚化して使用した。アッセイ条件の詳細は以下の通り：
(1) プレート：ビオビンストレプタビディン（Biobind Streptavidin）被覆（Thermo ref：９５０２９２９３）緩衝：
(2) 固定化：５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ-ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ｐＨ＝７．５
(3) Ｃａ2+／Ｍｇ2+洗浄：５０ｍＭトリス、５０ｍＭ-ＮａＣｌ、１０ｍＭ-ＣａＣｌ2、４ｍＭ-ＭｇＣｌ2（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ｐＨ＝７．４
(4) ＥＤＴＡ洗浄：注射水中の１０ｍＭ-ＥＤＴＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
(5) リガンド：Eurogentec社が化学合成で得たＭａｐｔ２、固定化濃度は２００ｎＭ、容積＝１００μｌ、外界温度で1時間
(6) 対照リガンド：ＦＶＩＩアフィニティークロマトグラフィに精製した抗ＦＶＩＩポリクローナル抗体（R&D System Ref：ＢＡＦ２３３８）
固定化濃度 ２００ｎＭ:容積＝１００μｌ、外界温度で1時間
(7)サンプル：ウサギで生産したトランスジェニクなヒトＦＶＩＩ、１％ＢＳＡで安定化、バッチ：４７９１８６。濃度＝１００ｎＭ、堆積容積＝１００μｌ、外界温度で1時間15分
(8) 視覚化抗体：Asserachromから供給のＶＩＩ：Ａｇキット（diagnostica Stago）:サプライヤーの推薦に従って調製。容積＝１００μｌ、外界温度で４５分
(9) 視覚化：1ウエル当たりＯＰＤ＋Ｈ2Ｏ2溶液１００μｌ
(10) 反応停止：Ｈ2Ｓ０4（1ウエル当たり５０μｌ）
(11) 読取：４９２ナノメートル。
４９２ナノメートルでのＯＤで表した結果を［表ｌ］に示す。
【０２０１】
【表１】
【０２０２】
この実施例の結果はヒトＦｙ１１とＭａｐｔ２アプタマとの結合のみがＥＤＴＡで溶出することを示す。
【０２０３】
実施例７
各種のヒト第ＶＩＩ因子へのアプタマの結合
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマの分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４３２６ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。Ｍａｐｔ２を固定した固体基質の一部を「活性セル」とよぶ。同じ方法でこの固体基質の独立した部分にいくつかの核酸分子またはその他を４０６９ＲＵの固定化度で固定した。これを「対照セル」と呼ぶ。
下記の各種ヒト第ＶＩＩ因子を使用した：
（１）Ａｃｓｅｔ精製法に従って得たヒト血漿ＦＶＩＩ、
（２）ウサギで作った組換え型ヒトＦＶＩＩ、
（３）ヤギで作った組換え型ヒトＦＶＩＩ、
（４）組換え型ヒトＦＶＩＩ（Novoseven(登録商標)から市販）
【０２０４】
各サンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定したＭａｐｔ２アプタマを含む同じ活性セル（固体基質）上へ順次注入した。コントロール（対照）にはランニング緩衝液のみを含むブランクを注入した。上記の固定した核酸、その他を含む対照セルに同じサンプルを注入するとバックグラウンドノイズに対応する信号が得られる。この信号を活性セルで得られた信号から引いた。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行した。注射の後、１２０秒間、ランニング緩衝液はチップ上へ同じ流速で注入した。それから溶出緩衝液（１５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で３０秒間注入してＦＶＩＩをアプタマから分離した。このチップを用いてＦＶＩＩと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図７］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。結果は［図７］に示した。
この実施例の結果から、アプタマは固定することによってヒト血漿第ＶＩＩ因子およびウサギおよびヤギを含む種々のトランスジェニック（遺伝子導入実験）動物で作った組換え型ヒト因子ＶＩＩを含む極めて多種のヒト第ＶＩＩ因子に特異的に結合するが示された。
【０２０５】
実施例８
ヒト因子ＶＩＩへのアプタマの特異的結合
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４３２６ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
Ｍａｐｔ２を固定した固体基質の一部を「活性セル」とよぶ。同じ方法でこの固体基質の独立した部分にいくつかの核酸分子またはその他を４０６９ＲＵの固定化度で固定した。これを「対照セル」と呼ぶ。
下記の各種ヒト第ＶＩＩ因子を使用した：
（１）Acset精製法に従って得たヒト・血漿ＦＶＩＩ、
（２）アメリカのDiagnostica社から市販の組換え型ウサギＦＶＩＩ(ref 4O7RAB、バッチ番号：080818）
【０２０６】
各サンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定したＭａｐｔ２アプタマを含む同じ活性セル（固体基質）上へ順次注入した。コントロール（対照）にはランニング緩衝液のみを含むブランクを注入した。上記の固定した核酸、その他を含む対照セルに同じサンプルを注入するとバックグラウンドノイズに対応する信号が得られる。この信号を活性セルで得られた信号から引いた。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行した。注射の後、１２０秒間、ランニング緩衝液はチップ上へ同じ流速で注入した。それから溶出緩衝液（１５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で３０秒間注入してヒト・ウサギＦＶＩＩをアプタマから分離した。このチップを用いてＦＶＩＩと固定したアプタとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図８］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
この実施例の結果から、上記アプタマは固定するとヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａに極めて特異的に結合し、ウサギＦＶＩＩ／ＶＩＩａには結合しないことが示された。
【０２０７】
実施例９
親和性基質の製造方法
ストレプトアビジン（streptavidin）(streptavidin−agarose-Novagen、登録商標)を表面にグラフトしたマトリックスから成る固体基質材料から親和性基質を調製した。
１ｍｌ容積のゲルをカラム（i.d.11mm）から成る容器に入れた。貯蔵溶剤を除去するためにゲルを精製水で洗浄した。ゲルの特徴は以下の通り：
（１）ビオチン吸着能：≧８５ナノモル／１ｍｌゲル
（２）機能テスト：ＡＴで３０分間のコースでビオチン標識化したトロンビンのキャプチャー＞９９％、
（３その他のテスト：プロテアーゼ無し、エンド／エクソヌクレアーゼ無し、にRNase無し
（３）防腐剤：１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５＋ＮａＮ3 0.02
【０２０８】
充填カラム（ゲル・ベッド高さ＝１ｃｍ）の出口に２５４ｎｍのＵＶフィルターと記録装置とを備えた吸光度検出器を接続した。
配列ＳＥＱＩＤ番号８６のビオチン標識化した抗ヒトＦＶＩＩ核酸アプタマを精製水中に０．５ｍｇ／０．１８７ｍｌの最終濃度（すなわち最終モル濃度＝０．１ｍＭ）で可溶化した。核酸アプタマ溶液を標準サイクルに従って９５℃で活性化して固体基質材料上にアプタマを固定化した。
核酸アプタマ溶液を４．８ｍｌの精製水で、次に１．５ｍｌのＭｅ++緩衝液（５×濃度）で予備希釈した。
吸光度検出器を１ＡＵＦＳ（吸光度単位フルスケール）に合わせ、２５４ｎｍでこの溶液のＯＤを０．５７５Ｕ254で記録した。
ビオチン標識化した核酸アプタマ溶液は予備パックしたストレプトアビジン−アダロースゲル上へ注入し、ペリスタル型ポンプで２．５ｍｌ／分の流速で再循環させた（すなわちゲル（入口／出口 Ｉ／Ｏ）上での接触時間＝２４秒）。上記条件での２５４ｎｍでのＯＤは直ちに０．０５ＡＵ254（すなわち理論的なカップリング値の９１％）に到達した。すなわち１ミリリットルのゲル当たり０．４５５ｍｇの核酸アプタマで安定する。
４ｍＭ−ＭｇＣｌ2＋１０ｍＭ−ＣａＣｌ2緩衝液で洗浄し、次いで２Ｍ−ＮａＣｌで洗浄して固体基質材料上にグラフトしたストレプトアビジン分子に特異的に結合していない核酸アプタマを除去した。
【０２０９】
実施例１０
組換え型ヒト因子ＶＩＩの精製方法
上記のアプタマ親和性基質を下記文献に記載の方法で調製した精製されたＦＶｌｌ／ＦＶｌｌａを使用してテストした。
【特許文献２０】国際特許第Ｗ０２００８／０９９０７７号公報
【０２１０】
被精製サンプルの製造
出発材料の生物物質は組換え型ヒトＦＶＩＩを含むトランスジェニクウサギ乳汁である。発現カセットはβ−カゼイン遺伝子プロモータの制御下にあるヒトＦＶＩＩトランスジーンから成る。簡単に言うと、１４０ミリリットルの乳汁を出生後の日４〜日１２の間の初乳汁分泌を２匹のウサギから集め、集めた乳汁のアミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ（生物学的に活性化されたＦＶＩＩ）の平均タイター値は９２８ｌＵ／ｍｌである。乳汁は−８０℃の温度で保存した。
テスト時にはウサギ乳汁を水浴中で３７℃の温度で解凍し、クエン酸ナトリウム溶液で希釈してｐＨ７．５での最終クエン酸塩濃度を６２ｇ／ｌにした。このクエン酸ナトリウム処理で燐酸カルシウム（phosphocalcic）カゼインミセルを不安定できる。乳汁のリピドリッチなタンパク溶液は一連の濾過器（それぞれ（ｉ）１５〜０．５μｍ気孔率閾値の深型濾過器と（ｉ）０．２μｍメンブランフィルタ）で精製する。
【０２１１】
１９８ｌＵ／ｍＩのＦＶＩＩタイター（すなわち３６ｍｇのトランスジェニクＦｙＩＩ）を有する濾過後の溶液の容積３６０ｍｌを１６ｍｌ容積のMEP-HyperCelクロマトグラフィ・ゲル（Pall BioSepra）で予備精製した。この捕獲ゲルを用いることでカゼインを含む乳タンパクの９５％を除去でき、しかも、ＦＶＩＩの初期量の６０％を保持できる。
上記段階の終わりに得られた１７．５ｍｇの低純度ＦＶＩＩ（〜５％）は容積２０ｍｌのQ-sepharoseＸＬ（登録商標）（GE Healthcare）を使用したイオン交換クロマトグラフィで精製する。ヒトＦＶＩＩは、７８ｍｌ容積の５ｍＭ−塩化カルシウムを含む緩衝液で溶出する。アミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ濃度は３３７ｌＵ／ｍｌすなわち０．１７ｍｇのＦＶＩＩ／ｍｌで、２８０ｎｍ、ε1%＝１３でＯＤで測定した全タンパクは０．１８ｍｇ／ｍｌ、と見積もられる。従って、ＦＶＩＩ純度は９４％。
【０２１２】
ウサギ乳汁由来の残留タンパクをこの段階でＦＶＩＩから分離するのは、構造上類似性、例えばＧＬＡ−ｄｏｍａｉｎまたはＥＧＦｄｏｍａｉｎタンパクのため、あるいは物理化学的な類似性（イオン電荷および／または分子寸法が類似）のため、難しい。従来方法では直交法（ヒドロキシアパタイトゲルとサイズ排除クロマトグラフィ分離の組合せ）によって純度を９９．９５％まで改良できる。
しかし、人間で繰り返して注射する場合には、遺伝子組換えタンパクで許容される外来タンパクに対する負荷は５０ｐｐｍを超えてはならない。すなわち純度＞９９．９９５％でなければならない。この純度はアフィニティーマトリックスでの精製だけで達成できるように見える。
【０２１３】
本発明の親和性基質での組換え型ヒトＦＶＩＩの精製段階
上記段階の終わりに得られた精製されたヒトＦＶＩＩ溶液の６ｍｌの容積（ＦＶＩＩの１．１ｍｇ）を用いて本発明の親和性基質で高純度の組換え型ヒトＦＶＩＩに精製する段階を行う。上記段階で得られたＦＶＩＩ溶液う４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、ｐＨ７．５に予備調節し、アプタマ−アガロースゲル（親和性基質）上にペリスタル型ポンプで０．１ｍｌ／分の流速で注入する（すなわち、親和性基質との接触時間１０分）（Ｉ／Ｏ）。
注射後、ゲルを５０ｍＭトリス＋５０ｍＭ−ＮａＣｌ＋４ｍＭＭｇＣｌ2＋１０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７．５緩衝液で洗浄する。１０ｍｌの非吸着溶液を回収する。ＦＶＩＩは５０ｍＭトリス＋１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液で溶出させる。溶出ピークの収集はＯＤプロフィルに従って実行する。モル計算から親和性基質に固定された核酸アプタマの量は１７ナノモルで、これはＦＶＩＩ分子とのモル−モル相互作用で、ＦＶＩＩの０．９ｍｇの親和性基質の絶対キャパシティに対応する。
【０２１４】
［図１１］は２５４ｎｍでの吸光度値（ＯＤ）を連続モニターしたウサギ乳汁中に産生された組換え型ヒトＦＶＩＩのクロマトグラフィ・プロフィルを示す。この［図１１］で注射（１）後の吸収曲線の屈曲（２）は組換え型ヒトＦＶＩＩと親和性基質の飽和開始を示す。時間（３）で組換え型ヒトＦＶＩＩの注射を停止する。［図１］の直線状時間のスケールを示すと、注射開始時間（１）と注射終了時間（２）との間の持続時間は１０分である。親和性基質は上記凝固タンパクで飽和し続け、（ｉ）親和性基質の抗ＦＶＩＩ核酸アプタマと（ｉｉ）被精製組成物中に最初に含まれていた組換え型ヒトＦＶＩＩ分子との間に錯体が形成される。被精製組成物をカラムに送り、カラムを緩衝液で洗浄する（洗浄段階６）。その後、時間（４）で１０ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度から成る緩衝液を注入して溶出段階を実行する。吸収ピークは核酸アプタマ／組換え型ＦＶＩＩ錯体から組換え型ヒトＦＶＩＩが開放されたことを示している。組換え型ヒトＦＶＩＩの分子は迅速にリリースされ、従って、少容積である点に注意されたい。従って、本発明の親和性基質によって組換え型ヒトＦＶＩＩタンパクの高濃度の溶出溶液が得られる。時間（５）で５０ｍＭトリス緩衝液を用いて親和性基質を再生させる段階を実行する。（７）で見られる吸光度ピークは再生段階で親和性基質から開放された物質に対応する。
【０２１５】
親和性基質の動的結合能
下記の［表２］に示すテスト結果は０．４５〜０．４９ｍｇ／ｍｌの親和性マトリックスすなわちバイオアベイラブル（bioavailable）なリガンドの５０〜５５％の動的結合能を示す。ＥＤＴＡで約５％の動的溶出が計算される。
【０２１６】
【表２】
【０２１７】
親和性基質の特異的分離能
親和性基質の特異性をウサギ乳タンパクに特異的なＥＬＩＳＡアッセイで評価した。結果は［表３］に示した。
【０２１８】
【表３】
【０２１９】
［表３］の結果は、トランスジェニクなヒトＦＶＩＩの純度を９８．３％〜９９．９５％とすると、アプタマ−アガロースによる除去の平均値２ｌｏｇ10が得られることを示す。これはヒトＦＶＩＩに対するアプタマの特異性を示し、残利希有ウサギ乳タンパクとの相互作用はほとんどないことを示す。
溶出前に２Ｍ−ＮａＣｌおよび／またはプロピレングリコールまたは５０％エチレングリコール溶液で中間洗浄すると結果はより良くなる（これらの条件ではＦＶＩＩは溶出されない）。
実施例１０の結果は、アプタマ−アガロースゲル上での親和性基質がリガンド１ｍｇ当たり少なくとも１ｍｇのＦＶＩＩの動的結合能の優れた特徴を有することを示し、溶出収率は少なくとも７５％である。また、純度の明らかな改良（〜９９．９５％）、残留ウサギ乳タンパクＲＭＰの除去２ｌｏｇ10からも特異性は確認できる。最適化していない２つのテストで最終レベルは約５００ｐｐｍになる。
【０２２０】
実施例１１
基質に固定したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａによる本発明アプタマ核酸の捕獲
血漿由来の精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ分子を固定した固体基質を製造した。
ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ中に存在するフリーのアミンを結合するＮＨＳ−ＥＤＣで活性化したしカルボキシメチルデキストランにヒト第ＶＩＩ因子を固定した。すなわち、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを２５２５ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定した。
本発明の一連の２７の核酸アプタマ（純度：９９％）（アプタマに従って４３〜６６の長さを有するヌクレオチド）をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、５０で希釈するた‖ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５）して３つのアプタマサンプルを得る。
テストされる各アプタマをランニング緩衝液に最終濃度１μＭで注入した。各サンプルは固定されたヒトＦＶＩＩを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。このチップを用いてＦＶＩＩとテストしたすアプタとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図Ｅｌ］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。結果は［図１２］［図１３］に示した。
【０２２１】
［図１２］は表面プラスモン共振法に従ったテストでの基質に固定したヒト・血漿第ＶＩＩ因子に対する本発明の一連の２７の核酸アプタマの結合曲線を示す。Ｘ軸：時間（秒）；Ｙ軸：共振信号（任意単位）。
［図１３］はテストした２７のアプタマの各々の安定結合の信号値を示す。Ｘ軸：テストした２７のアプタマ；Ｙ軸：共振信号（任意単位）。
ヒト因子ＶＩＩに対する親和性の差によるアプタマの４つグループが観測される。Ｍａｐｔ２「コア配列」は低親和性グループに属する。ファミリー２の１つの代表は他より高い親和性を有する。このアプタマをＭａｐｔ２．２と呼び、下記の「コア配列」を有する：
５'ＣＣＧＣＡＣＧＣＴＡＣＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＣＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＣ３' （ＳＥＱＩＤ番号３３）
しかし、得られた結果はテストした全ての核酸アプタマがヒト・血漿第ＶＩＩ因子に有意な親和性を有することを示している。
【０２２２】
実施例１２
ヒト血漿第ＶＩＩ因子の精製方法
Ａ．材料と方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
「Ｍａｐｔ−２コア」アプタマを固定した親和性ゲル材料を、アプタマとビオチンとの間にスペーサ鎖無しに、ビオチンに直接結合した。アプタマは５'−末端ビオチンでストレプトアビジンゲル（供給元Nivagen）に固定した。理論リガンド濃度は０．４ｍｇ／ｍｌ：ＸＫ１６カラム（ＧＥ）にパックした容積１ｍｌ。
使用したアプタマは配列ＳＥＱＩＤ番号２０のアプタマである。この出発生成物は第ＶＩＩ因子の切詰め不純物および劣化第ＶＩＩ因子の形の不純物を含む。劣化第ＶＩＩ因子はガンマ−カルボキシル化で変性された第ＶＩＩ因子の形を含む。
【０２２３】
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化：０．０５０Ｍ−トリス−ＨＣｌ、０．０１０Ｍ ＣａＣｌ2、０．０５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５、
溶出： ０．０２０Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０１０Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、
９８％まで精製した２４０μｇのヒト・血漿ＦＶＩＩを平衡化緩衝液中に流速０．５ｍｌ／分で注入した。保持されなかったピークの検出後、２カラム容積の溶出緩衝液を注入した。タンパクのピークは２８０ｎｍ波長で吸光度値を測定して検出した。
【０２２４】
Ｂ．結果
結果は［図１４］および［図１５］に示す。
［図１４］は時間を関数とする２８０ｎｍで測定した吸光度曲線。［図１４］のピーク番号１はカラムに保持されなかった出発生成物の分画に対応する。ピーク番号２は溶出分画に対応する。
出発生成物および溶出生成物硝酸銀染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析して不純物が除去されたことを視覚化した。［図１５］はこのゲルを表す。レーン番号１は出発生成物分画に対応し、レーン番号２は溶出分画に対応する。出発生成物の純度にもかかわらず、溶出画分は汚染物または劣化物を含まない点に注意されたい。
［図１４］および［図１５］の結果は配列ＳＥＱＩＤ番号２０のアプタマはヒトＦＶＩＩに結合でき、ＥＤＴＡの存在下で特異的に溶出できることを示している。
【０２２５】
実施例１３
アプタマのウサギＦＶＩＩへの結合の非存在
Ａ．材料と方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフ基質
５'−末端にスペーサ鎖を介して配列ＳＥＱＩＤ番号８６のアプタマを固定したストレプトアビジンゲル（供給元Nivagen）に固定した。理論リガンド濃度は０．３５ｍｇ／ｍｌ：容積１ｍｌ。使用したアプタマは配列ＳＥＱＩＤ番号８６のアプタマである。
Ａ．２ 出発生成物
ウサギ・血漿から精製して得たウサギＦＶＩＩがリッチなヒドロキシアパタイト溶出液、接触時間１０分、流速０．５ｍｌ／分。
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化：０．０５０Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０１０Ｍ ＣａＣｌ2、０．０５ｍＭ ＭｇＳＯ3、ｐＨ７．５、
溶出：０．０５０Ｍトリス−ＨＣｌ ０．０１０Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５
３６μｇを１０分間の接触時間でゲルに注入する。溶出は２ｍｌの溶出緩衝液を注入して実行した。タンパクのピークは２８０ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出した。
【０２２６】
Ａ．４ タンパクおよび第ＶＩＩ因子に関する画分の分析プロトコル
各画分はそのアミド分解活性をStagoキット（因子ＶＩＩａ StatClotキット）を使用して発色アッセイによって分析した（供給元の推薦に従った）。アミド分解活性を各画分に含まれるＦＶＩＩのμｇに換算した。
Ｂ．結果
結果は［表４］に示す。
【０２２７】
【表４】
【０２２８】
［表４］の結果は配列ＳＥＱＩＤ番号８６のＭａｐｔ−２アプタマが固定した親和性ゲルにはウサギ第ＶＩＩ因子は保持されないことを示している。
【０２２９】
実施例１４
Biacore（ＮａＣｌ耐性）上でのアプタマとヒト因子ＶＩＩとの相互作用のプロトコルの特定実施例
Ａ．材料と方法
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは３７７２ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
トランスジェニクなウサギ乳汁から得た精製したトランスジェニクヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰＴＧ、純度：９８％）をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して２００ｍＭのＦＶＩＩ濃度のサンプルを得た。
【０２３０】
サンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定したＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上へ注入した。次いで、ＮａＣｌ濃度を増大させた緩衝液を固体基質上に注入した（１Ｍ−Ｎａｌから３Ｍ−ＮａＣｌき濃度を３シリーズ注入）。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行した。注射の後、１２０秒間、ランニング緩衝液はチップ上へ同じ流速で注入した。３つの緩衝液の３シリーズの注入後、溶出緩衝液（１０ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒間注入してＦＶＩＩ ＨＰＴＧをアプタマからから分離した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
トランスジェニクなヒトＦＶＩＩに対する固定したＭａｐｔ２アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）の専用モジュール制御ソフトウェア（バージョン１．２）で計算した。
ヒトＦＶＩＩに対するＭａｐｔ２アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩに対するＭａｐｔ２アプタマの結合はＮａＣｌを含む緩衝液の注入によって有害な程度には変更されないということが分かる。
Ｂ．結果
結果は［図１６］に示してある。
【０２３１】
実施例１５
Biacore（プロピレングリコール耐性）上でのヒト因子ＶＩＩとアプタマとの相互作用のためのプロトコルの特定実施例
Ａ．材料と方法
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは５３１９ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０２３２】
トランスジェニクウサギ乳汁から得た精製したトランスジェニクヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰＴＧ、純度：９８％）をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して２００ｍＭのＦＶＩＩ濃度のサンプルを得た。このサンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用で固定したＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上へ注入した。次に、５０％のプロピレングリコールを含む緩衝液を固体基質上へ注入した。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行された。５０％プロピレングリコールを含む緩衝液を注入後、溶出緩衝液（１０ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒間で注入して、ＦＶＩＩ ＨＰＴＧをアプタマから除去した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
トランスジェニクヒトＦＶＩＩに対する固定したＭａｐｔ２アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）の専用モジュール制御ソフトウェア（バージョン１．２）で計算した。
このヒトＦＶＩＩに対するＭａｐｔ２アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩへのＭａｐｔ２アプタマの結合はプロピレングリコールを含む緩衝液注入によって有害な程度に変化しないことが分かる。
【０２３３】
Ｂ．結果
結果は［図１７］に示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的なリガンド、特にこのタンパクを精製、検出するためのリガンドの同定と、その医学分野での使用とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）はビタミンＫ依存性のグリコプロテインであり、その活性形（ＦＶＩＩａ）はカルシウムおよび組織因子の存在下で第Ｘ因子および第ＩＸ因子を活性化して凝集プロセスに関与する。ＦＶＩＩは分子量が約５０ｋＤａである４０６個のアミノ酸残基の単一ペプチド鎖の形で分泌される。
【０００３】
従って、ビタミンＫ依存性のグリコプロテインであるこのＦＶＩＩａは凝固機構、従って血栓の形成に重要な役割を演じている。ＦＶＩＩａには出血を起こしている組織の損害後に放出される組織因子の存在下で、第ＶＩＩＩまたはＩＸ因子が不存在の場合でも、局所的に働くことが可能であるという利点がある。そのため、ＦＶＩＩａは出血によって生じるある種の凝固不調を正すために古くから使われてきた。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子はＦＶＩ１（血友病タイプＡ）または第ＩＸ因子（血友病型Ｂ）を欠失している患者やその他の凝固因子を欠失している患者、例えば遺伝性ＦＶＩＩ欠失患者の血友病治療で使われている。また、ＦＶＩＩはストローク（卒中）の処置でも推薦されている。そのためには注射可能なＦＶＩＩａ濃縮物が必要である。
【０００５】
ＦＶＩＩａ濃縮物を得る最も古い方法は分画して得た血漿タンパクからＦＶＩｌａを精製する方法である。特許文献１（欧州特許第EP 0 346 241号公報）に記載のＦＶＩＩａ−濃縮（enriched）画分の製造方法ではＰＰＳＢ（ＰプロトロンビンまたはＦＩＩ（Ｐ＝プロコンバーチンまたはＦＶＩＩ、Ｓ＝スチュワート因子またはＦＸ、Ｂ＝抗血友病因子ＢまたはＦＩＸ）のプレ溶出液を含む、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａを含む血漿タンパク、その他のタンパク（例えば因子ＩＸ（ＦＩＸ）、Ｘ（ＦＸ）およびＩｌ（ＦＩｌ）の分画副産物を吸着し、溶出して得られる。この方法の欠点は得られるＦＶＩＩが他の凝固因子の痕跡量を含む点にある。
【０００６】
同様に、特許文献２（欧州特許第EP 0 547 932号公報）にはビタミンＫ依存性因子およびＦＶＩＩＩを基本的に含まない高純度ＦＶＩ１ａ濃縮物の製造方法が記載されている。この方法で得られるＦＶＩＩは純度が良いが残渣が血栓形成（thrombogenic）活性を有する。
【０００７】
1980年代にヒト因子ＶＩＩをコードするＤＮＡが単離され（Hagen et al,(1986);Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Apr. 83(8):2412-6）、対応するタンパクがＢＨＫ（ベビー・ハムスター腎臓）哺乳動物細胞で発現された（特許文献３）。
【０００８】
本出願人の特許文献４（フランス特許出願第FR 06 04872号公報）にはトランスジェニック動物でのＦＶＩＩａ製造方法が記載されている。この製造方法を用いるとウィルス、その他の病原による汚染に対して安全なタンパクを得ることができる。この方法はさらに、一次配列がヒト一次配列に同一であるタンパク、すなわち各種アミノ酸間の結合が全く同じタンパクを得ることができる。
【０００９】
しかし、この方法で得られるものは、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの出発源にも関わらず、汚染物質を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの濃縮組成物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第EP 0 346 241号公報
【特許文献２】欧州特許第EP 0 547 932号公報
【特許文献３】欧州特許第EP 0 200 421号公報
【特許文献４】フランス特許出願第FR 06 04872号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ヒト血漿から因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する方法では残留血栓形成（thrombogenic）がないか、実質的にない最終産物を得ることが特に有利である。精製された組換型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを得る方法では望ましくない細胞タンパクを含まないか、実質的に含まない最終生成物を得ることが特に重要である。特に、トランスジェニク哺乳類に由来する体液から精製したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ組成物では、ヒトで免疫原となる可能性のあるトランスジェニク哺乳類が天然に産生する因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含まないか、実質的に含まない最終生成物を得ることが重要である。
この目標を達成するためには上記の因子ＶＩｌ／ＶＩｌａを含むサンプルから、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する効率的かつ特異的な手段が必要であり、その手段は簡単で、再現性がよいことが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明には、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩＮ１Ｉａに特異的に結合する単一鎖の核酸を提供する。
本発明はさらに、構造中に上記定義の少なくとも一つの核酸を含む、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する各種の化合物にも関するものである。
本発明はさらに、上記定義核酸または化合物と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間に形成さる錯体（複合体、コンプレックス）にも関するものである。
本発明はさらに、上記定義の核酸または化合物の複数がグラフトした固体の基質材料からなる、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定するための基質にも関するものである。
【００１３】
本発明のさらに他の対象は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを上記定義の基質と接触させる段階を含む、基質上にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定する方法にある。
本発明のさらに他の対象は、下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法にある：
（ａ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを上記の核酸または基質と接触させてｉ）上記核酸または上記基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体を形成し、
（ｂ）段階（ａ）で形成させた錯体からヒト因子ＩＩ／ＶＩＩａを遊離させて精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収する。
本発明のさらに他の対象は、下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの存在を検出する方法にある：
（ａ）上記定義の核酸または基質と上記サンプルとを接触させ、
（ｂ）（ｉ）上記核酸または基質と（ｉｉ）因子ＶＩｌ／ＶＩｌａとの間の錯体の形成を検出する。
本発明はさらに、上記定義の核酸の医療での予防または治療でき使用にも関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】は本発明の核酸（Mapt２）保持（folding）のモデル計算結果を示す図である。ｍＦｏｌｄコンピュータープログラムを使用し、［図１］に示す構造を得るのに用いたものと同じパラメータすなわち下記条件を使用した：（ｉ）直鎖の配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）保持温度：２５°、（ｉｉｉ）イオン条件：［Ｎａ+］：１５０ｍＭ；［Ｍｇ++］：４ｍＭ、（ｉｖ）修正タイプ：オリゴマ、（ｖ）百分比サブオプティマル（suboptimality）数）：２（ｖｉ）計算保持数の上限：５０、（ｖｉｉ）２つの塩基対間の最大距離：無制限（ｖｉｉｉ）他のパラメータのためのデフォルト値
【００１５】
【図２】は基質に固定したヒト血漿第ＶＩＩ因子に対する本発明の各種核酸（Mapt2、Mapt3およびMapt7）の表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００１６】
【図３】は基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対する各種濃度で使用したヒト血漿第ＶＩＩ因子の表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。各曲線は図の最上部から下に向かって下記を示す：曲線１［ＦｙＩＩ］：５００ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；曲線２［ＦｙＩＩ］：２５０ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；曲線３［ＦｙＩＩ］：１２５ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；曲線４［ＦＶＩＩ］：６２．５ｎＭ濃度での精製ヒト血漿ＦＶＩＩ；下部曲線：それぞれ６２、１２５、２５０および５００ｎＭでの精製免疫グロブリン調整物。
【００１７】
【図４】は（ｉ）基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対する組換え型ヒト因子ＶＩＩの表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線と、（ｉ）で作った固定核酸／ＦＶＩＩ錯体に対する抗ヒトＦＶＩＩ単クローン抗体の結合曲線とを示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００１８】
【図５】は時間的に連続的に注入したヒト血漿第ＶＩＩ因子による本発明の核酸（Mapt2）を固定した基質の飽和曲線。表面プラスモン共振法に従ったテスト。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。最上部の曲線：濃度５００ｎＭの精製ヒトＦＶＩＩで得た信号信号。
【００１９】
【図６】は本発明の核酸（Mapt2）を固定した基質の表面プラスモン共振法に従ったテストでのヒト血漿第ＶＩＩ因子の結合動特性（kinetics）曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２０】
【図７】は基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対する種々起源の第ＶＩＩ因子タンパクの表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２１】
【図８】は基質に固定した本発明の核酸（Mapt2）に対するヒト血漿第ＶＩＩ因子およびウサギ組換え型第ＶＩＩ因子の表面プラスモン共振法に従ったテストでの結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２２】
【図９】はＰＥＧスペーサ鎖（このスペーサ鎖自体はビオチン分子に連結）に連結した本発明アプタマ（Mapt2）を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物の構造を示す図。
【００２３】
【図１０】はＳＥＬＥＸタイプのプロセスの実行サイクルの最後に選択された、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する各種アプタマの配列を示す図。［図１０］に示す配列は図の最上部から下に向かってＳＥＱ ＩＤ番号８７〜ＳＥＱ ＩＤ番号１００である。
【００２４】
【図１１】はウサギ乳汁に産生された組換え型ヒト因子ＶＩＩを、抗ヒトＦＶＩＩ核酸アプタマを固定した親和性基質を用いて精製する方法の実行中に得られたクロマトグラフのプロフィルを示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：２５４ナノメートルでの吸光度（ＯＤ）値。
【００２５】
【図１２】は基質に固定したヒト血漿第ＶＩＩ因子に対するテストした本発明の２７の核酸アプタマの表面プラスモン共振法に従った結合曲線を示す図。Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２６】
【図１３】はテストした２７のアプタマの各々の安定結合信号の固有値を示す図。Ｘ軸：テストした２７の各アプタマ；Ｙ軸：共振信号（任意の共振単位で表示）。
【００２７】
【図１４】は時間を関数とした２８０ナノメートルでの吸光度測定曲線。
【００２８】
【図１５】はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルの画像。レーン1は出発生成物画分、レーン２は溶出画分に対応する。
【００２９】
【図１６】はトランスジェニクウサギの乳汁中に産生させた組換え型ヒト因子ＶＩＩに対する固定したアプタマMapt2の結合曲線を表す図。矢印は各注射時間に対応し、［図１６］の左から右に向かってそれぞれ下記の時間を表す：１：組換え型因子ＶＩＩの注射；２：１Ｍ-ＮａＣｌを含む緩衝液の注射；３：２Ｍ-ＮａＣｌを含む緩衝液の注射；４：３Ｍ-ＮａＣｌを含む緩衝液の注射；５：５０ｍＭのトリス、１０ｍＭ-ＥＤＴＡ緩衝の注射、Ｘ軸：時間（秒で表示）；Ｙ軸：応答信号（任意の単位（ＲＵ）で表示）。
【００３０】
【図１７】はトランスジェニクウサギの乳汁中に産生させた組換え型ヒト因子ＶＩＩに対する固定したアプタマMapt2の結合曲線を表す図。矢印は各注射時間に対応し、［図１７］の左から右に向かってそれぞれ下記を表す：１：５０％プロピレングリコール；２：１０ｍＭ-ＥＤＴＡ。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、寸法が小さく、安価に合成できる、ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａに特異的に結合することができる新規な手段を提供する。本発明のこの手段は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの検出、凝固不全（疾患）の予防または治療を目的とする医薬品の活性成分としての使用を含めた、上記手段が使われる全ての分野の用途で使用できる。
【００３２】
より詳細には、以下で詳細に説明する共通した多くの構造上の特徴を有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合することができる単一鎖の核酸のファミリーを本発明者は見出した。
【００３３】
以下で詳細に説明するように、本発明のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合することができる単一鎖の核酸、好ましくはＤＮＡ型のの核酸から成り、この核酸はそのヌクレオチド配列によって与えられる一定の構造上の特徴から、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する結合する上記結合特性を核酸に与える空間コンフォメーションを取ることができる。本発明の核酸はこのタイプの分子に対して当業者が一般的に使用している用語であるヌクレオチド「アプタマ（aアプタマ）」とよぶことができる。
【００３４】
血液の凝固経路に関係する各種タンパクの結合可能なすることができる核酸（nucleic）アプタマは従来技術で公知で、Willebrand因子を介して結合するアプタマ（特許文献５）、アルファトロンビンを結合するアプタマ（特許文献２）またはトロンビン（非特許文献１）、第ＩＸ因子／ＩＸａを結合するアプタマ（非特許文献２〜３、特許文献６、７）、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する核酸アプタマ（特許文献６、７）、
【００３５】
【特許文献５】国際特許第ＷＯ２００８／１５０４９５号公報
【特許文献６】欧州特許第ＥＰ１９７２６９３号公報
【非特許文献１】Zhao et aI., 2008, Anal Chem,Vol. 80(19):7586-7593
【非特許文献２】Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95:767-771;
【非特許文献３】Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, Vol. 27:722-727
【特許文献７】国際特許第WO 2002/096926号公報
【特許文献８】米国特許第US 7,312,325号明細書
【００３６】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する核酸アプタマは非特許文献４、５にも記載されている。
【非特許文献４】Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5):841-848;
【非特許文献５】Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17: 1-11
【００３７】
本発明の一つの対象は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸にある。
【００３８】
本明細書ではヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する単一鎖の核酸は「核酸アプタマ」「「アプタマ」「ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合するアプタマ」または『抗−ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ」ともよばれる。
【００３９】
「ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ」という用語は天然起源のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよび組換え型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む。
【００４０】
「ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ」はアミノ酸配列に関係して考慮する。すなわちタンパクがグリコシレート化されているか非グリコシレート化であるかとは独立しており、タンパクがグリコシレート化されている場合、グリコシル化のタイプは考慮しない。
【００４１】
また、以下で詳細に示すように、本発明のヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａに特異的に結合する核酸の実施例では、５'末端から３'末端に下記：（ｉ）〜（ｉｉｉ）の連続した配列を含む共通した構造上の特徴を有している：（ｉ）長さが約２０個のヌクレオチドの不変な特定ヌクレオチド配列、（ｉｉ）長さが４０〜５０個の可変なヌクレオチド配列、それに続く（ｉｉｉ）長さが約２０個のヌクレオチドの不変な特定ヌクレオチド配列。可変なヌクレオチド配列（ｉｉ）は互いに非常に強いヌクレオチド配列同一性を有することができる。
【００４２】
従って、本発明者は、（ｉ）共通した構造上の特徴と（ｉｉ）共通した機能上の特徴との間の関係の存在を示すことができる、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合可能な核酸アプタマのファミリーを構築した。
【００４３】
構造上の観点からは、本発明のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する上記の核酸または核酸アプタマのファミリーは下記の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］ｘ−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］ｙ−３' （Ｉ）
（ここで、
「ＳＥＱＩＤ番号Ｘ」はＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の核酸から成る群の中から選択される核酸から成り、
「ｘ」は０〜１に等しい整数であり、
「ｙ」は０〜１に等しい整数である）
【００４４】
本発明のいくつかの実施例では、ＳＥＱＩＤ番号Ｘの酸は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４５】
本発明の他の実施例では、ＳＥＱＩＤ番号Ｘの酸は４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドの長さを有する。
【００４６】
本発明の他の実施例では、ＳＥＱＩＤ番号Ｘの酸は４３，４４または４５ヌクレオチドの長さを有するのが好ましい。
【００４７】
既に述べたように、式（Ｉ）の核酸は長さが少なくとも１５のヌクレオチドである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施例では、式（Ｉ）の核酸は長さが少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０または８１ヌクレオチドであり、これは各長さを特定した核酸を含む。
【００４９】
式（Ｉ）のアプタマを得る方法の実施例では連続した選抜段階でヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合す上記核酸のファミリーを構築し、可変配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを構造的にフレーミンクするＳＥＱＩＤ番号１およびＳＥＱＩＤ番号２を５'末端および３'末端に有する核酸アプタマのセットおよびサブセットを連続した各選抜サイクルで単離し、特徴付ける。
【００５０】
本発明の核酸アプタマの主たるファミリーでは可変配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘの全てが互いに少なくとも４０％のヌクレオチド配列同一性を有する。このことは配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘでは、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａへの結合特性を保持するための構造上の制約はこれらの核酸アプタマの５'末端および３'末端に位置した配列に対する構造上制約よりも少ないことを意味している。
【００５１】
整数「ｘ」で、整数「ｙ」が１に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−１）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］−３' （Ｉ−１）
【００５２】
整数「ｘ」が１に等しく、整数「ｙ」が０に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−２）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−２）
【００５３】
整数「ｘ」が０で、整数「ｙ」が０に等しい場合、本発明の核酸アプタマは下記の式（Ｉ−３）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成る核酸を含む：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−３' （Ｉ−３）
【００５４】
従って、上記の核酸アプタマは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５番およびＳＥＱＩＤ８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の核酸から成る群の中から選択される核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する核酸を含む。
【００５５】
一般に、第二のヌクレオチドまたは核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有する第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％，５１％，５２％，５３％，５４％，５５％，５６％，５７％，５８％，５９％，６０％，６１％，６２％，６３％，６４％，６５％，６６％，６７％，６８％，６９％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する。
【００５６】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを有する本発明の核酸のいくつかの実施例では、この配列ＳＥＱＩＤ番号ＸがＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の中の少なくとも１つと少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有する配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する核酸から成る群の中から選択される。
【００５７】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘを有する本発明の核酸のいくつかの実施例では、この配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが、配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５番およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも１つと少なくとも４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％，５６％，５７％，５８％，５９％，６０％，６１％，６２％，６３％，６４％，６５％，６６％，６７％，６８％，６９％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する核酸からなる群の中から選択される。
【００５８】
上記のことから、本発明は上記定義の式（Ｉ）のシリーズの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する単一鎖の核酸のファミリーを含む。
【００５９】
本発明で２つの核酸間の「百分比同一性」は整列した２つの配列を比較窓を介して最適な方法で比較し決定される。
【００６０】
従って、比較窓中にあるヌクレオチド配列の一部は、２つの配列間で最適なアランメントが得られるように、参照配列（付加または欠失がない）と比較して付加または欠失（例えばギャップ）を有する。
【００６１】
「百分比同一性」の計算方法では、比較した２つの配列で全く同じ核酸塩基が得られた位置の数を求め、２つの核酸塩基間で同一性のある位置の数を比較窓中の位置の全数で割り、得られた結果に１００を掛けることで、２つの配列の百分比ヌクレオチド同一性を求める。
【００６２】
比較用の最適配列アランメントは公知のアルゴリズムを使用したコンピュータで実行できる。
【００６３】
百分比配列同一性はCLUSTAL Wソフトウェア（バージョン１．８２）を使用して決定するのが好ましい。その設定パラメータは以下の通り：
(1)CPU MODE=ClustaIW mp;
(2)ALIGNMENT=「full」;
(3)OUTPUT FORMAT=「aln w/numbers」;
(4)OUTPUT ORDER=「alignment」;
(5)COLOR ALIGNMENT=「no」;
(6)KTUP(word sizw)=「default」;
(7)WINDOW LENGTH=「default」;
(8)SCORE TYPE=「percent」;
(9)TOPDIAG=「default」;
(10)PAIRGAP=「default」;
(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE=「none」;
(12)MATRIX=「default」;
(13)GAP OPEN=「default」;
(14)END GAPS=「default」;
(15)GAP EXTENSION=「default」;
(16)GAP DISTANCES=「default」;
(17)TREE TYPE=「分岐図」
(18)TREE GRAPH DISTANCES=「hide」。
【００６４】
［図１］に示した本発明の核酸の構造をベースにして当業者は配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘの可能な特定配列を有限数のヌクレオチドコレクションの中から簡単に決定することができる。
【００６５】
例えば、本発明の核酸アプタマのいくつかの実施例では、当業者は上記の式（Ｉ）の核酸アプタマの上記構造上の定義を基礎として、例えば、適当な命令セットとメモリーをロードしたデジタルコンピュータを用いて配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘに対して可能な全ての配列を自動的に、簡単に発生させることができる。当業者はそれから必要に応じて上記デジタルコンピュータを用いて、（ｉ）空間構造モデルが［図１］の核酸アプタマと類似または同一な配列と（ｉｉ）［図１］の核酸アプタマの構造とは異なる核酸アプタマのそれとをそれぞれ自動的に決定することができる。
【００６６】
［図１］の核酸アプタマと類似または同じ空間構造を有する核酸アプタマは、この核酸アプタマに関して上記で記載した連続したループとステムとを有するものを含む。
【００６７】
当業者は式（Ｉ）の核酸の空間構造を決定するために、そのヌクレオチド配列の説明を基礎にしてZukerに記載のコンピュータープログラムmFold（登録商標）を用いて構造モデルを作ることができる(2003、Nucleic Acids Research, Vol. 231(13):3406-3413)。これは下記ウエブアドレスからも利用できる：http://mfold.bioinfo.rDi.edu/.）
【００６８】
コンピュータープログラムmFoldは［図１］に示す構造を得るのに用いたパラメータと同じもの、すなわち下記条件を用いるのが好ましい：
（ｉ）直鎖配列のＤＮＡ、
（ｉｉ）フォールディング温度：２５℃
（ｉｉｉ）イオン条件：［Ｎａ+］：１５０ｍＭ；［Ｍｇ++］：４ｍＭ
（ｉｖ）修正タイプ：オリゴマ
（ｖ）百分比サブオプティマル数：２
（ｖｉ）計算保持数の上限：５０
（ｖｉｉ）２つの塩基対間の最大距離：無制限
（ｖｉｉｉ）他のパラメータのためのデフォルト値の使用。
【００６９】
次いで当業者は（ｉ）［図１］のアプタマの構造モデルと（ｉｉ）作成した式（Ｉ）のアプタマの構造モデルとを比較する段階を実行し、構造モデルが［図１］に示すアプタマと類似または同じであるれば、札性した式（Ｉ）のアプタマを選択する。
【００７０】
いずれにせよ、新たに発生させた式（Ｉ）のアプタマの選択抜がポジティブであることを確認するために当業者は例えば本明細書に記載の説明、特に実施例に記載の特定方法に従ってヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ結合特性を検査することができる。
【００７１】
本発明の核酸アプタマのいくつかの好ましい実施例では、核酸アプタマは式（Ｉ）の核酸と少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、それは式（Ｉ）の核酸と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの１５の連続したヌクレオチドを含むアプタマを含む。
【００７２】
式（Ｉ）の核酸の好ましい実施例では、配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の中の少なくとも１つと少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有し、これには配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも１つと少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または１００％のヌクレオチド同一性を有する配列が含まれる。
【００７３】
式（Ｉ）の核酸の他の好ましい実施例では、配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される。
【００７４】
式（Ｉ）の核酸の他の好ましい実施例では、配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘは配列ＳＥＱＩＤ番号３、５、６、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２３、２４、２５、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０から成る群の中から選択される。
【００７５】
本発明では、ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａに結合する核酸はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと接触した時にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと錯体を形成することができる単一鎖の核酸から成る。
【００７６】
従って、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと結合した核酸は、核酸なおよびタンパクパートナーをそれぞれ接触させる前段階後に検出可能なヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体を含む。
【００７７】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと結合した核酸が形成する錯体の検出は当業者に公知の方法、例えば実施例に示すBiacore（登録商標）を含む表面プラスモン共振検出技術を用いて簡単に実行できる。また、当業者は実施例に示すようなＥＬＩＳＡ型の従来法によって核酸とヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を簡単に検出することもできる。
【００７８】
実施例に示るように、式（Ｉ）の核酸は任意の種類のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと強い結合能を有している。特に、式（Ｉ）の核酸は天然のヒト因子ＶｌｌＮｌｌａおよび組換え型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する。
【００７９】
いかなる理論に拘束されるものではないが、実施例が示す結果は、本発明の式（Ｉ）の核酸は一定の種類のグリコシル化（glycosylation）を有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する強い能力を有すると考えられる。換言すれば、式（Ｉ）の核酸はヒト・血漿を含む天然由来の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａだけでなく、トランスジェニック動物、好ましくは血漿で天然に産出しされるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａのグリコシル化のタイプとはグリコシル化の種類が異るウサギを含む種々の生物種のトランスジェニク哺乳類で生産した組換え型ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａにも効果的に結合できると考えられる。
【００８０】
本発明でヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに「特異的に」結合する核酸はヒト以外の哺乳類のゲノムによってコードされる因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、例えばウサギ・因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む他のタンパクに結合する能力よりも大きな結合能力をヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対して有する核酸から成る。
【００８１】
本発明では、第１の核酸は第２の核酸よりヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力が大きい。すなわち、結合を検出する上記の方法の任意の一つを使用した時に、同じテスト条件下で、第１の核酸で得られる結合信号の値は第２の核酸で得られるものに比較し統計学的に大きい。例えば、Biacore（登録商標）法を用いた結合検出法では、第１の核酸のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する能力は第２の核酸のそれより強く、計測単位とは無関係に、第１の核酸の共振信号値は第２の核酸で測定される信号値より統計学的に大きな共振が得られる。２つの別々の「統計学的」な計測値で両者の間に使用した結合検出方法の測定誤差より大きな違いがある。
【００８２】
実施例に示すように、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する本発明の核酸のキャパシティがテストされた。
【００８３】
一般に、式（Ｉ）の核酸はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する解離定数値が最大で５００ｎＭ、多くの場合最大で２００ｎＭである。
【００８４】
式（Ｉ）の核酸はヒト以外の哺乳類由来の任意の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの結合能力よりも大きなヒト因子ＶｌｌＮｌｌａに対する結合能力を有することが示された。特に、式（Ｉ）の核酸は天然または組換え型を含む任意タイプのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに結合する強い能力を有するにもかかわらず、ウサギ因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むヒト以外の哺乳類のゲノムによってコードされる因子ＶＩＩ／ＶＩＩに結合する能力はゼロか、弱い。
【００８５】
式（Ｉ）の核酸のこの有利な特徴は実施例、特に配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが配列ＳＥＱＩＤ番号８５を含む式（Ｉ）の核酸を含む配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸で示されている。そのＰＥＧおよびビオチンとの結合後の構造は［図９］に示してある。
【００８６】
すなわち、配列ＳＥＱＩＤ番号８６の式（Ｉ）の核酸では、Biacoree（登録商標）法に従って測定したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩｌａへの結合能力（解離定数Ｋｄで表す）の値は約１００ｎＭである。さらに、式（Ｉ）のこの核酸はヒト血漿因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよび組換え型ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、例えばトランスジェニクウサギで産生したものの両方に結合する能力を有し、その値は同じ程度である。
【００８７】
さらに、式（Ｉ）の核酸とヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体は化学量論である。すなわち、錯体化したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子数に対する式（Ｉ）の核酸の分子数の比はほぼ１：１、特に１：１である。
【００８８】
従って、本発明の他の観点から、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに「特異的に」結合する式（Ｉ）の核酸のキャパシティは、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａおよび非ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａにたいするそれぞれの解離定数Ｋｄの比として表すこともできる。
【００８９】
本発明の他の特徴から、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する式（Ｉ）の核酸のキャパシティは、下記の条件（Ａ）で表すことができる：
ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ＜０．０１ （Ａ）
（ここで、
「ヒトＫｄ」は式（Ｉ）での核酸のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する解離定数（モル単位表示）であり、
「非ヒトＫｄ」は式（Ｉ）の核酸のヒト以外の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する解離定数で、同じモル単位で表示される。
【００９０】
従って、本発明のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸では、ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ比が０．０１以下であるのが好ましく、さらに好ましくは０．００１以下である。
【００９１】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する本発明の式（Ｉ）の核酸のの特徴から、本発明のアプタマ核酸はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとヒト以外の哺乳類に由来する非ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ、例えばウサギ・因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとを区別するのに有利に使用できる。
【００９２】
特に、本発明の式（Ｉ）の核酸は、ヒト以外の哺乳類に由来する因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む材料から出発しか錯体からヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段として遊離に使用することがができる。特に、式（Ｉ）の核酸は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対してトランスジェニクであるウサギからのバイオ液体（ウサギが天然に産生する因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む）の組換え型因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段で使用できる。
【００９３】
実施例に示すように、式（Ｉ）の核酸の他の特徴は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体がこの錯体を金属カチオン−キレート剤と培養することによってヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを遊離する能力にある。特に、式（Ｉ）の核酸と錯体を形成した因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子はＥＤＴＡのような金属カチオン−キレート剤と接触すると錯体からリリースされる。
【００９４】
従って、本発明の他の観点から、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する式（Ｉ）の核酸の結合は、金属カチオン−キレート剤との接触、例えばＥＤＴＡとのに接触によって分離（解離）できる。
【００９５】
本発明の式（Ｉ）の核酸のこの追加の特徴は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段としての上記核酸を使用する上で特に有利である。特に、この種の精製用途では、式（Ｉ）の核酸との錯体として固定されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを金属カチオン−キレート剤と接触させるか培養することで精製した形で簡単に回収でき、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを少なくとも部分的に変成する公知の物質の使用、例えば尿素の使用や酸性条件の使用は不要である。
【００９６】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段としての使用では、本発明の式（Ｉ）の核酸を固体基質に固定（immobilize）するのが好ましい。この固体基質には固体粒子、クロマトグラフィ基質、その他が含まれる。核酸を各種固体基質上に固定する方法は当業者に周知である。
【００９７】
固体基質はアガロースまたはセルロースまたは合成ゲル、例えばアクリルアミド、メタクリレートまたはポリスチレン誘導体のゲルのアフィニティークロマトグラフィカラムまたは表面プラスモン共振に適したチップ、ポリアミドのようなメンブレン、ポリアクリロニトリルまたはポリエステル・メンブレンまたは磁気またはパラマグネティクビーズすることができる。
【００９８】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段として使用する本発明の式（Ｉ）の核酸はその化学構造中にスペーサ手段を含み、さらに必要に応じて固体基質上に固定するための手段を含むのが好ましい。
【００９９】
従って、本発明は下記の式（ＩＩ）を特徴とするヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物にも関するものである：
［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （Ｉｌ）、
（ここで、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと特異的に結合する核酸を表す。
【０１００】
上記化合物はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段の特定実施例を構成する。
【０１０１】
「スペーサ鎖」（式（Ｉｌ）の化合物では［ＳＰＡＣ］）で表示）は公知の任意のタイプにすることができる。このスペーサ鎖の機能は核酸[ＮＵＣＬ］を上記化合物が固定されている固体基質の表面から物理的に離し、
すことにある。核酸［ＮＵＣＬ］が固定される固体基質の表面に対して相対的に動けるようすることにある。このスペーサ鎖は固体基質が式（Ｉ）の核酸にあまり近付きすぎて核酸とそれに接触されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ分子との間の結合が妨げる立体障害を制限または防ぐ役目をする。
【０１０２】
式（ＩＩ）の化合物でのスペーサ鎖は核酸［ＮＵＣＬ］の５'末端または３'末端に結合されるのが好ましい。
【０１０３】
スペーサ鎖はアプタマの一端と固体基質とに結合されるのが好ましい。スペーサとのこの構造はアプタマを固体基質上に直接固定しないという利点がある。スペーサ鎖は非特異性のオリゴヌクレオチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるのが好ましい。スペーサ鎖が非特異性のオリゴヌクレオチドから成る場合、そのオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも５つのヌクレオチド、好ましくは長さが５〜１５のヌクレオチドから成るのが好ましい。
【０１０４】
スペーサ鎖がポリエチレングリコールから成る式（ＩＩ）の化合物の実施例の場合、このスペーサ鎖はＰＥＧ（Ｃ１８）タイプのポリエチレングリコールを含む。
【０１０５】
アプタマを固体基質に直接またはスペーサ鎖に固定する場合、核酸［ＮＵＣＬ］を種々の化学基、例えば核酸を共有結合で固定する基、例えばチオール、アミンまたは固体基質に存在する化学基と反応可能な他の任意の基で化学的に修正することができる。他の実施例では、スペーサ鎖はそれ自身を固体基質に固定することができる。この場合、必要に応じてスペーサを適切な化学基で変成することができる。他の実施例では可動基質上に核酸アプタマを有する化合物を固定させる化合物にスペーサ鎖を結合させる。
【０１０６】
従って、本発明は下記の式（ＩＩＩ）であることを特徴とするヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物に関するものである：
［ＦＩＸ］−［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （ＩＩＩ）
（ここで、
［ＦＩＸ］は基質上に固定するための化合物を表し、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸を表す）
【０１０７】
上記の式（ＩＩＩ）の化合物はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段の実施例を構成する。
式（Ｉｌ）または式（ＩＩＩ）のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製する手段は固体基質に結合された形であるのが好ましい。
式（ＩＩＩ）の化合物で、化合物［ＦＩＸ］は（ｉ）固体基質の表面材料と一つ以上の共有結合を形成することができる化合物および（ｉｉ）弱い非共有結合、例えば水素結合、静電気力またはファンデルワールス力によって固体基質を拘束できる化合物の中から選択される化合物から成る。
【０１０８】
化合物［ＦＩＸ］の第１の種類は二官能性カップリング剤、例えばグルタールアルデヒド、ＳｌＡＢ、その他のＳＭＣＣを含む。
【０１０９】
ＳｌＡＢは下記式（Ｉ）の化合物で、下記文献に記載されている：
【非特許文献６】Hermanson G.T. 1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, pp 239-242
【０１１０】
【０１１１】
化合物ＳｌＡＢは酢酸沃素およびスルホ−ＮＨＳエステル基を有する２つの反応基を有し、それぞれアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する。
【０１１２】
化合物ＳＭＣＣは下記文献に記載されている。
【非特許文献７】Samoszuk M.K. et al. 1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1): 37-46
【０１１３】
【０１１４】
化合物ＳＭＣＣはそれぞれスルホ−ＮＨＳエステル基およびマレイミド基から成る２つの反応基を有し、それぞれアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する。
【０１１５】
化合物［ＦＩＸ］の第２の種類は固体基質に存在すアビジンまたはストレプトアビジン分子に非共有結合で結合可能なビオチンを含む。
【０１１６】
他の実施例では、スペーサ鎖を介して固体基質に固定した後アプタマを変成し、その遊離末端（スペーサに結合されてない末端）を例えば化学的に変成されたヌクレオチドにすることができる（例えば２'−Ｏ−メチルまたは２'−フルオロピリミジン、２'−リボプリン、ホスホアミディテ、逆ヌクレオチドまたは化学基（ＰＥＧ、ポリ陽イオン、コレステロール）。これに限定されるものではない）。これらの変成でアプタマを酵素分解から保護することができる。
【０１１７】
固体基質はアガロースからまたはセルロースまたは合成ゲルから誘導されるゲルから成るアフィニティークロマトグラフィカラム、アクリルアミド、メタクリレートまたはポリスチレン誘導体、表面プラスモン共振に適したチップ、メンブレン、例えばポリアミド、ポリアクリロニトリルまたはポリエステルのメンブレンまたは磁気ビーズまたは正磁気ビーズにすることができる。
【０１１８】
本発明は下記（ｉ）と（ｉｉ）との間の錯体にも関するものである：
（ｉ）式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物から選択される物質、そして、
（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ
【０１１９】
本発明の他の対象は、各々が核酸アプタマから成る（または含む）複数の分子がグラフトされている固体基質材料から成ることを特徴とするヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定化するための基質にある。上記分子は（ａ）式（Ｉ）の核酸、（ｂ）式（ＩＩ）の化合物および（ｃ）式（ＩＩＩ）の化合物である。
【０１２０】
上記基質は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定する必要のある全ての用途で使用でき、これには因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを精製するための用途と、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを検出するための用途とが含まれる。
【０１２１】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する本発明の核酸アプタマを固定する基質の製造方法は実施例に示してある。本発明実施例では本発明のアプタマをヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａを捕捉するための薬剤として従ってよされ、サンプル中のヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａを精製または検出することができる。
【０１２２】
従って、本発明は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の中から選択される物質を予め固定した固体基質と接触させる段階を含む、基質上にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定する方法にも関するものである。この方法は求められる技術対象に従って式（Ｉ）の核酸の分子と錯体を形成した固定されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子を回収する追加の段階を含むことができる。因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収するこの追加の段階は式（Ｉ）の核酸と因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体を金属カチオン−キレート剤、例えばＥＤＴＡと接触させてる段階から成る。
【０１２３】
従って、本発明の他の対象は、下記（ａ）と（ｂ）の工程から成るヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法にある：
（ａ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａから成っているサンプルを式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物または上記定義の固体基質と接触させて、（ｉ）上記の核酸または基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間に錯体を形成し、
（ｂ）段階（ａ）で形成された錯体からヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを遊離させて、精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収する。
【０１２４】
アプタマが固定された固体基質を使用するアフィニティークロマトグラフィによるタンパク精製方法を実行する際には当業者は下記文献に記載の方法を参照できる。
【非特許文献８】Romig et al. 1999, J Chomatogr B Biomed Sci Apl, Vol. 731(2): 275-284
【０１２５】
段階（ａ）でＭｇＣｌ2濃度が低い緩衝液（バッファー）またはＭｇＣｌ2を含まない緩衝液を使用したきに第ＶＩＩ因子の捕獲条件が改善されることが実施例は示している。
【０１２６】
「ＭｇＣｌ2濃度が低いＭｇＣｌ2濃度が低い」とは最終ＭｇＣｌ2濃度が１ｍＭ以下である緩衝液を意味する。
【０１２７】
ＭｇＣｌ2濃度が１ｍＭ以下である緩衝液はＭｇＣｌ2濃度が０．５ｍＭ以下、０．１ｍＭ以下、０．０５ｍＭ以下および０．０１ｍＭ以下、好ましくは０ｍＭである緩衝液を含む。
【０１２８】
本発明の特定実施例の方法では、段階（ａ）の次で段階（ｂ）の前に段階（ａ'）を有する。この段階（ａ'）は洗浄緩衝液で親和性基質を洗浄する段階から成る。好ましくは段階（ａ'）で親和性基質を洗浄する間にイオン強度を増加させる。すなわち、段階（ａ）で使用した緩衝液のイオン強度と比較してイオン強度を増加させた洗浄緩衝液を使用する。段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液のイオン強度は段階（ａ）で使用するイオン強度より2〜500倍大きいのが好ましい。好ましくは、段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液のイオン強度を段階（ａ）で使用するイオン強度より100〜500倍、好ましくは200〜500倍大きくする。
【０１２９】
本発明実施例では、段階（ａ'）の洗浄で高いイオン強度を有する洗浄緩衝液、特に、高いＮａＣｌ濃度を有する緩衝液を使用することで、親和性基質に対する第ＶＩＩ因子の結合性に影響を及ぼさずに、検出可能な方法で、非特異的に親和性基質に結合している物質を効果的に除去することができることが示されている。
【０１３０】
最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１Ｍである洗浄緩衝液を段階（ａ'）で使用するのが好ましい。
【０１３１】
本発明では最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１Ｍである洗浄緩衝液は最終ＮａＣｌ濃度が少なくとも１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍまたは少なくとも３Ｍ１Ｍである洗浄緩衝液を含む。
【０１３２】
本発明方法の段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液の最終ＮａＣｌ濃度は最大で３．５Ｍであるのが好ましい。本発明方法の段階（ａ'）で使用する洗浄緩衝液の最終ＮａＣｌ濃度は１．５〜３．５の間、好ましくは２〜３．５間、好ましくは２．５〜３．５の間、例えば３〜３．５の間にするのが有利である。
【０１３３】
本発明実施例ではさらに、段階（ａ'）の。高い疎水性の洗浄緩衝液、特に高濃度のプロピレングリコールを使用することで、親和性基質に対する第ＶＩＩ因子の結合性に影響を及ぼさずに、検出可能な方法で、親和性基質に非特異的に結合した物質を効果的に除去することができるたとが示された。
【０１３４】
従って、段階（ａ'）では少なくとも２０％（ｖ／ｖ）の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液を使用するのが好ましい。
【０１３５】
本発明では、少なくとも２０％の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液は、（洗浄緩衝液の全容積に対する）容積で少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または少なくとも６０％の最終プロピレングリコール含量を有する洗浄緩衝液を含む。
【０１３６】
段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液は最大で５０％の最終プロピレングリコール含量を有するのが好ましい。段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液は２０％〜５０％の間、好ましくは３０％〜５０％の間の最終プロピレングリコール含量を有するのが好ましい。
【０１３７】
本発明の特定実施例では、段階（ａ’）で使用する洗浄緩衝液はＮａＣｌとプロピレングリコールとを含む。
【０１３８】
精製法の実施例では、段階（ｂ）を親和性基質を二価のイオン性キレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含む溶出緩衝液と接触させて実行する。
【０１３９】
溶出緩衝液は例えば少なくとも１ｍＭかつ最大で３０ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度を含むことができる。
【０１４０】
「少なくとも１ｍＭ」とは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍＭを含む。
【０１４１】
「最大で３０ｍＭ」は２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４，１３、１２またはｌｌｍＭを含む。
【０１４２】
本発明の核酸アプタマう有する親和性基質と、この親和性基質でヒト因子ＶＩＩを精製する方法は実施例に示してある。
【０１４３】
一般に、本発明のアプタマが固定さる固体基質は、濾過基質、チップ用シリコン基質、メンブレン等用に一般的な構造および組成を有する任意の基質を含む。特に、固体基質は樹脂、アフィニティークロマトグラフィカラム樹脂、ポリマビーズ、磁気ビーズ、その他を含む。特に、固体基質はガラスまたは金属、例えば鋼、金、銀、アルミニウム、銅、珪素、ガラスまたはセラミックをベースにした材料を含む。特に、固体基質はポリマー材料、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリ弗化ビニリデンおよびこれらの組合せを含む。
【０１４４】
固体基質は付着、結合、錯体形成、固定化またはアプタマとの相互作用を容易にする材料で被覆されていてもよい。
【０１４５】
本発明の実施例では、固体基質は表面を金の層、カルボキシメチル化処理した層、デキストラン、ストレプトアビジン、コラーゲン、アビジン、その他の層で被覆されたガラススライドにすることができる。
【０１４６】
本発明のアプタマは付着コーテング、例えば上記の共有結合の生成または非共有結合（例えば水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、その他）による会合反応によって固体基質上に固定できる。
【０１４７】
本発明で「親和性基質」とは本発明で定義の核酸アプタマが固定された固体材料から作られた基質を意味する。
【０１４８】
本発明の実施例にはアプタマが非共有結合によって固定された固体基質が基されている。
【０１４９】
本発明実施例にはストレプトアビジン分子の層で被覆されたガラススライドと、非共役ビオチン／ストレプトアビジン会合で基質上に固定された、ビオチン分子と共役した本発明のアプタマを有する固体基質が記載されている。
【０１５０】
本発明実施例は、ストレプトアビジン分子の層で被覆されたポリスチレン材料から成る固体基質と、非共役ビオチン／ストレプトアビジン会合で基質上に固定されたビオチン分子に本発明のアプタマが共役結合したものが記載されている。
【０１５１】
本発明実施例では、本発明アプタマは下記文献に記載のようにアフィニティークロマトグラフィ、通電クロマトグラフィおよびキャピラリ電気泳動に適した固体基質に固定することができる。
【非特許文献９】Ravelet et al. 2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1): 1-10
【非特許文献１０】Connor et al. 2006, J Chromatogr A, Vol. 111(2): 115-119
【非特許文献１１】Cho et al. 2004, Electrophoresis, Vol.25(21-22) : 3730-3739
【非特許文献１２】Zhao et al. 2008, Anal Chem, Vol. 80(10): 3915-3920
【０１５２】
長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する式（Ｉ）のアプタマまたは式（Ｉｌ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物はヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａを捕捉するための薬剤として検出または治療および装置で有利に使用できる。
【０１５３】
本発明のさらに他の観点から、本発明は下記（ａ）と（ｂ）の工程から成る、サンプル中のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの存在を検出する方法にも関するものである：
（ａ）（ｉ）式（Ｉ）の核酸または式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物またはこれらの核酸または化合物の分子が固定されている固体基質を（ｉｉ）サンプルと接触し、
（ｂ）（ｉ）式（Ｉ）の核酸、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物または上記基質と（ｉｉ）因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間に形成された錯体を検出する。
【０１５４】
本発明の実施例には、固体基質に予め固定した本発明のアプタマとヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａとを検出する方法の実施例が記載されている。
【０１５５】
本発明の検査方法を実行する場合に使用する固体基質は、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法に関して上記した固体基質から選択できる。
【０１５６】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを検出する方法の実行または装置では、当業者は特下記文献に記載の方法を使用できる。
【特許文献９】欧州特許第ＥＰ１９７２６９３号公報
【特許文献１０】国際特許第ＷＯ２００８／０３８６９６号公報
【特許文献１１】国際特許第ＷＯ２００８／０２５８３０号公報
【特許文献１２】国際特許第ＷＯ２００７／０３２２３５９号公報
【０１５７】
本発明実施例では（ｉ）上記核酸または固体基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を検出する段階（ｂ）が、実施例に記載のように、表面プラスモン共振信号を測定して行われる。
【０１５８】
本発明の他の実施例では、ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を検出する段階（ｂ）が、が形成されているであろう錯体をヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａリガンドと接触させ、そのリガンドを検出する。本発明実施例では、酵素（実施例ではワサビペルオキシダーゼ）でラベル化したモノクローナルまたはポリクローナルの抗ヒトＦＶｌｌＮｌＩａ抗体を、ＥＬＩＳＡ型のアッセイで従来から使用されているように、ヒト因子の検出リガンドとして用いる。
【０１５９】
ヒト・因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むまたは含む多能性のあるサンプルはヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む液体試料にすることができ、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとヒト以外の哺乳類からの因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの分子を含む液体試料を含むのが有利である。上記精製方法または検査方法の実施例では、サンプルは生物学的溶液、例えば体液、細胞、細胞物質、組織、組織材料、器官または全器官から成る。
【０１６０】
精製方法または検査方法の実施例では、前記サンプルは動物由来の液体の生物学的溶液、例えば血液、血液誘導物、哺乳動物乳汁または哺乳類の乳汁誘導物から成る。このサンプルは血漿、血漿凍結賃源物、精製乳汁またはその誘導物から成ることができる。
【０１６１】
精製方法または検査方法の実施例では、前記サンプルはヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ用トランスジェニク動物由来のものである。この溶液は哺乳類の乳汁またはヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ用トランスジェニク哺乳類からの乳汁の誘導物であるのが好ましい。本発明でトランスジェニック動物は（ｉ）ヒトヒト以外の哺乳類、例えばウシ、ヤギ、ウサギ、ブタ、サル、ラットまたはハツカネズミ、（ｉｉ）鳥類、（ｉｉｉ）昆虫、例えば蚊、ハエまたはカイコを含む。本発明の好ましい実施例でのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ用トランスジェニク動物はヒト以外のトランスジェニク哺乳類、好ましくはヒト因子ＶＩＩＮｌＩａ用トランスジェニク雌ウサギ（doe rabbits）。トランスジェニク哺乳類はトランスジェニク哺乳類の乳汁中にトランスジェニクタンパクを発現する特定プロモータの制御下にあるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａをコードする核酸を含む発現カセットをゲノムに挿入して、乳腺中に組換え型因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを生産するのが好ましい。
【０１６２】
トランスジェニック動物の乳汁中にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを生産する方法は下記工程から成ることができる：乳汁中に天然に分泌されるタンパクのプロモータの制御下にあるヒト因子ＶＩＩＮｌＩａをコードする遺伝子（例えばカゼイン・プロモータ、β−カゼイン・プロモータ、ラクトアルブミン・プロモータ、βラクトグロブリン・プロモータまたはＷＡＰプロモータ）を有するＤＮＡ分子をヒト以外の哺乳類の胎児に一体化し、その胎児を同じ生物種の哺乳動物の雌下に置く。胎児から哺乳類が十分に成長すると、哺乳類から乳汁分泌が誘発され、それから乳汁を集める。この乳汁はヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含む。
【０１６３】
ヒト以外の哺乳動物の雌の乳汁中でタンパクを調製する方法の例は下記文献に記載されている。
【特許文献１３】欧州特許第ＥＰ０の５２７０６３号公報
【０１６４】
この特許の方法で本発明のタンパクを生産することができる。ＷＡＰ（ホエー酸性タンパク）プロモータはＷＡＰ遺伝子のプロモータを含む配列を導入して調整できる。このプラスミドはＷＡＰプロモータの制御下に置かれた異種遺伝子を受けることが可能な状態で調製できる。上記プロモータおよび本発明のタンパクをコードする遺伝子を含むプラスミドを用い、ウサギ胎児の雄の前核へマイクロインジェクションしてトランスジェニクウサギを得ることができる。それから胎児をホルモン調節した雌の輸卵管に移植する。トランスジェンの存在は得られた若いトランスジェニクウサギから抽出したＤＮＡを用してサザン法によって確認される。動物の乳汁濃度は特定の放射性免疫アッセイで評価される。
【０１６５】
ヒト以外の哺乳動物雌の乳汁中でタンパクを調製する方法はかの文献にも記載されている。例えば特許文献１４（トランスジェニクなハツカネズミ）および特許文献１５（トランスジェニク哺乳類のフォンビルブラント因子の生産）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【特許文献１４】米国特許第ＵＳ７，０４５，６７６号明細書
【特許文献１５】欧州特許第ＥＰ１７３９１７０号公報
【０１６６】
本発明の他の態様によって、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸は、例えばＶＩｌ因子／組織因子錯体の形成を抑制することによって因子ＶＩｌａによる因子Ｘの活性化を阻止する必要のある生理的状況下でインビボで使用できる。
【０１６７】
換言すれば、本明細書に定義のアプタマ核酸は医薬品の血液凝固阻止剤活性成分として予防的または治療的に使用できる。
【０１６８】
特に、現在の説明において定義したアプタマ核酸が、予防であるか治療の血液凝固阻止剤活性成分として、特に、静脈血栓症、動脈の血栓症、ポスト−外科の血栓症、冠状動脈バイパス・グラフト鎖（ＣＡＢＧ）と関連がある無秩序、行程、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、腫瘍を含む凝固無秩序の処置のために使われることができる転移、軽いまたは激しい炎症反応、腐敗菌激突、低血圧、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、肺のｅｍｂｏｈｓｍｓ、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、脈管のｒｅｓｔｅ番号ｓｅｓ、プレートレット鉱床、心筋梗塞、脈管形成、そして、血栓症を開発する危険を有する人類または女性のあらゆる病気予防の処置。
【０１６９】
本発明の一つの対象は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドである本明細書で定義したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸と、一種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬品組成物にある。
【０１７０】
医薬品組成物中での本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａアプタマ核酸の量は、患者にこの活性成分の有効量を投与できるように調節される。本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの投与量は医師または薬剤師が容易に決定できる。一般に、投与される活性成分の量は年齢、医学条件および患者の性、病気の程度、病気の進行度に応じて当業者が容易に決定できる。
【０１７１】
一般に、医薬品組成物は抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの量が単位供与量で１ナノグラムから１００ミリグラム、好ましくは１００ナノグラムから１０ミリグラムとなる量である。
【０１７２】
一般に、本発明の医薬品は組成物の全重量に対して０．０１重量％から９９．９重量％までの抗ＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマまたは複数の抗ＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの組合せと、９９．９重量％から０．０１重量％までの賦形剤または賦形剤の組合せとからなる。
【０１７３】
本発明の他の実施例では、医薬品組成物は１種、２種、３種、４種、５種または６種の別々の抗ＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの組合せから成る。
【０１７４】
本発明の医薬品組成物の調製では当業者はレミントンハンドブックを参照することができる。
【０１７５】
本発明の医薬品組成物は非経口、局所投与で予防的または治療で使用できる。従って、本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマは投与に適した形、例えば液体の形に調製されるか、凍結乾燥にすることができる。本発明の抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマの医薬品組成物は薬学的に許容される賦形剤および／またはビヒクル（好ましくは水溶性）を含むことができる。薬学的に許容される多くの賦形剤および／またはビヒクル、生理学的条件を再生するの必要な薬剤、例えば水、緩衝水、食塩水、グリシン溶液およびこれの誘導体、例えば、緩衝剤およびｐＨ調整剤、界面活性剤、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化カルシウム等使用できるが、これらに限定さるものではない。医薬品組成物は当業者に周知の方法で殺菌できる。一般に、本発明の医薬品組成物を生産するには当業者は下記文献を参照することができる。
【非特許文献１３】European Pharmacopeiaの最新版、例えば2005年1月発行のEuropean Pharmacopeia第５版および2007年6月発行のEuropean Pharmacopeia第６版
【０１７６】
活性成分としてアプタマを含む医薬品組成物の生産のために当業者は下記文献を参照できる。
【特許文献１６】国際特許第ＷＯ２００７／０５８８０１号公報
【特許文献１７】国際特許第ＷＯ２００５／０８４４１２号公報
【特許文献１８】国際特許第ＷＯ２００４／０４７７４２号公報
【特許文献１９】国際特許第ＷＯ２００８／１５０４９５号公報
【０１７７】
本発明の医薬品組成物の実施例では、抗ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ活性成分を単独で用いるか、一種以上の他の薬学的に活性な分子、例えば一種以上の他の血液凝固阻止剤活性成分と一緒に使用できる。
【０１７８】
本発明はさらに、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドである上記定義のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸の、医薬品としての使用にも関するものである。
【０１７９】
本発明はさらに、長さのが少なくとも１５個のヌクレオチドである上記定義のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸の、凝固不全の治療用医薬品の生産での用にも関するものである。
【０１８０】
本発明はさらに、長さのが少なくとも１５個のヌクレオチドである上記定義のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸のも、凝固不全の治療での使用にも関するものである。
【０１８１】
本発明の他の対象は、上記定義の組成物を凝固不全の予防または治療を必要とする患者に抗ヒトＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ医薬品を投与する段階を有する凝固不全の予防または治療方法にある、
【０１８２】
一般に、本発明定義の抗ヒトＶＩＩ／ＶＩＩａアプタマ剤の一日当たりの投与量は８０ｋｇの体重の患者で１ナノグラムから１０ミリグラムまで、好ましくは１００ナノグラムから１００ミリグラムである。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１８３】
実施例１
基質上に固定したヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａによる本発明アプタマ核酸の捕獲
血漿由来の精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ分子を固定した固体基質を製造した。ＮＨＳ−ＥＤＣで活性化したカルボキシメチルデキストランにヒト第ＶＩＩ因子を固定した。これはＦＶＩＩ／ＶＩＩａ中に存在するフリーなアミンと結合する。すなわち、ヒト因子ＶＩｌ／ＶＩｌａが２７４３ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり生成物が約１ｐｇ固定されることに対応する）の固定化度で固定した。
【０１８４】
本発明の核酸アプタマ（純度：９９％）（それぞれＭａｐｔ２アプタマ（ＳＥＱＩＤ番号８６）、Ｍａｐｔ３アプタマ（ＳＥＱＩＤ番号４１）およびＭａｐｔ７アプタマ（ＳＥＱＩＤ番号５８）をランニング緩衝液液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）中に希釈して３つのアプタマ・サンプルを得た。
【０１８５】
各サンプルは固定されたヒトＦＶＩＩを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入して、固定したヒトＦＶＩＩアプタマを分離させた。このチップを用いて固定したヒトＦＶＩＩとテストした各アプタマＭａｐｔ２、Ｍａｐｔ３およびＭａｐｔ７との間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したヒトＦＶＩＩへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図２］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
得られた結果はテストした全ての核酸アプタマがヒト血漿第ＶＩＩ因子に大きな親和性で結合したことを示している。
【０１８６】
実施例２
基質に固定した本発明のアプタマ核酸によるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの捕獲
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明核酸アプタマ分子（「Ｍａｐｔ２」）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
次いで、上記アプタマ化合物と接触させて、基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子との間の非共役会合によって上記固体基質を配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定する。
Ｍａｐｔ２アプタマは９８３ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１８７】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が６２、１２５、２５０および５００ｎＭのサンプルを得る。別に、多可免疫グロブリン（TegeIine（登録商標）、ＬＦＢ（フランス）から市販）の調節物をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して多可免疫グロブリンＰ濃度が６２、１２５、２５０および５００ｎＭのサンプルを得る。
【０１８８】
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩＨＰを分離させた。このチップを用いて固定したＦＶｌｌ ＨＰまたは多原子価の免疫グロブリンと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図３］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
この実施例はＭａｐｔ２アプタマは固定したときに大きな親和性でＦＶＩＩ ＨＰに結合することを示してしいる。Ｍａｐｔ２アプタマは多価免疫グロブリンには結合しない。
【０１８９】
実施例３
基質に固定した本発明のアプタマ核酸によるヒト因子ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの捕獲
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４２４．９ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１９０】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が５００ｎＭのサンプルを得る。
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で６０秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。このチップを用いてＦＶｌｌ ＨＰと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図４］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。
【０１９１】
固定したアプタマに結合した生成物が本当にＦＶＩＩであることを確認するために、注射の順番は（ｉ）５００ｎＭのＦＶＩＩ ＨＰ、（ｉｉ）抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体１μＭ（シグマ社、Ref Clone番号MC1476/E.A.8.1）を同じチップで実行した。注射および解析条件は上記と同一である。アプタマが実際にＦＶＩＩを保持している場合、ＦＶＩＩに対して抗体が結合した結果として抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体の注射でＲＵ信号が増加することが反映されなければならな。コントロールとして抗体単独を注入した。ＲＵ信号が増加し、アプタマがＦＶＩＩを認識することを明らかに示している（図４）。
記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
この実施例の結果は、アプタマは固定したときに、ＦＶＩＩＨＰに特異的に結合することを示し、大きな親和性を有し、観測した信号本当にアプタマ上のＦＶＩＩの保持によるものである。
【０１９２】
実施例４
Ｍａｐｔ２アプタマ／ヒト血漿ＦＶＩＩストイキオメトリ
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは９８３ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１９３】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が１μＭのサンプルを得る。
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で７００秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で３０秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。このチップを用いてＦＶｌｌ ＨＰと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図５］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
【０１９４】
この実施例の結果は、注射時間中にＭａｐｔ２アプタマに結合するヒトＦＶＩＩの量が増加することと、注射時間（７００秒）が終ってもヒトＦＶＩＩ分子によるアプタマのサイトの飽和にはまだ達しないこととを示している。この結果は固体基質の表面に固定されたＭａｐｔ２アプタマ分子の大部分がヒトＦｙ１１と結合できることを示している。
これらの結果は、アプタマがその標的に結合することができるコンフォメーションはこの形のアプタマの大多数に対して十分に安定していることを示し、このコンフォメーションは固定化によって悪く変化したり悪くさらないことを示している。
これらの結果はさらに、Ｍａｐｔ２／ヒトＦＶＩＩ結合ストイキオメトリは約１／１であることを示している。
【０１９５】
Ｍａｐｔ２／ヒトＦＶＩＩ結合の場合、最高信号は下記で得られる：
［ＭＷＦＶＩＩ／ＭＷＭａｐｔ２］＊固定化レベル＊ｓｔｏｉｃｈｉｏ
（ここで、
ＭＷＦＶＩＩはヒトＦＶＩＩの分子量を表し、５０ｋＤａに等しく、
ＭＷＭａｐｔ２はＭａｐｔ２の分子量を表し、２７ｋＤａに等しく、
固定化のレベルはこの例では９８３．３であり、
ｓｔｏｉｃｈｉｏはＭａｐｔ２／ＦＶＩＩストイキオメトリを表し、１に等しい）
上記の式で得られる最高信号値：１８２０ＲＵ
【０１９６】
ヒト因子ＶＩＩの分子を結合したＭａｐｔ２アプタマの百分比は式：測定信号／予想信号から計算される。
（ここで、測定信号は１２４ＲＵに等しく、予想信号は１８２０ＲＵに等しい）
上記の式では、注射の終わりにヒトＦＶＩＩの分子と結合したＭａｐｔ２アプタマ分子の百分比は６２％である。
【０１９７】
実施例５
Ｍａｐｔ２アプタマのヒト血漿ＦＶＩＩに結合するキネティクス
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明核酸アプタマ（Ｍａｐｔ２）の分子がが固定した固体基質を製造する。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４２５ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０１９８】
血漿から精製したヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰ、純度：９９％）をランニング緩衝液（５０ｍＭ−トリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈してＦＶＩＩ ＨＰ濃度が１２５、２５０（２倍）、５００ｎＭおよび１０００ｍＭのサンプルを得る。
各サンプルはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定されたＭａｐｔ２アプタマを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
ヒト血漿ＦＶＩＩに対する固定したＭａｐｔ２アプタマの結合キネティクス曲線をBiacore（登録商標）の専用モジュール制御Software(バージョン１．２）で計算した。固定したＭａｐｔ２アプタマのヒト・血漿ＦＶＩＩへの結合キネティクス曲線を［図６］に示した。
このＭａｐｔ２アプタマのヒトＦＶＩＩへの結合キネティクスの計算結果から下記が決定できる：
（１）Ｍａｐｔ２の解離定数Ｋｄは９９．９ｎＭである、
（２）Ｍａｐｔ２の会合定数Ｋａ（６．２５×１０3Ｍ-1ｓ-1）は６．２５×１０-4ｓ-1である。
【０１９９】
実施例６
ＥＤＴＡによる組換え型ヒトＦＶｌｌの溶出
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された。
基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
また、ビオチン化抗−ＦＶＩＩポリクローナル抗体分子を固定した固体基質も製造した。
Ｍａｐｔ２アプタマまたは抗ヒトＦＶＩＩポリクローナル抗体を有する固体基質はＥＬＩＳＡアッセイ用９６−ウエルプレートから成る。
【０２００】
抗ヒトＦＶＩＩポリクローナル抗体はワサビ（hrseradish）ペルオキシダーゼでラベル化して視覚化して使用した。アッセイ条件の詳細は以下の通り：
(1) プレート：ビオビンストレプタビディン（Biobind Streptavidin）被覆（Thermo ref：９５０２９２９３）緩衝：
(2) 固定化：５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ-ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ｐＨ＝７．５
(3) Ｃａ2+／Ｍｇ2+洗浄：５０ｍＭトリス、５０ｍＭ-ＮａＣｌ、１０ｍＭ-ＣａＣｌ2、４ｍＭ-ＭｇＣｌ2（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ｐＨ＝７．４
(4) ＥＤＴＡ洗浄：注射水中の１０ｍＭ-ＥＤＴＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
(5) リガンド：Eurogentec社が化学合成で得たＭａｐｔ２、固定化濃度は２００ｎＭ、容積＝１００μｌ、外界温度で1時間
(6) 対照リガンド：ＦＶＩＩアフィニティークロマトグラフィに精製した抗ＦＶＩＩポリクローナル抗体（R&D System Ref：ＢＡＦ２３３８）
固定化濃度 ２００ｎＭ:容積＝１００μｌ、外界温度で1時間
(7)サンプル：ウサギで生産したトランスジェニクなヒトＦＶＩＩ、１％ＢＳＡで安定化、バッチ：４７９１８６。濃度＝１００ｎＭ、堆積容積＝１００μｌ、外界温度で1時間15分
(8) 視覚化抗体：Asserachromから供給のＶＩＩ：Ａｇキット（diagnostica Stago）:サプライヤーの推薦に従って調製。容積＝１００μｌ、外界温度で４５分
(9) 視覚化：1ウエル当たりＯＰＤ＋Ｈ2Ｏ2溶液１００μｌ
(10) 反応停止：Ｈ2Ｓ０4（1ウエル当たり５０μｌ）
(11) 読取：４９２ナノメートル。
４９２ナノメートルでのＯＤで表した結果を［表ｌ］に示す。
【０２０１】
【表１】
【０２０２】
この実施例の結果はヒトＦｙ１１とＭａｐｔ２アプタマとの結合のみがＥＤＴＡで溶出することを示す。
【０２０３】
実施例７
各種のヒト第ＶＩＩ因子へのアプタマの結合
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマの分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４３２６ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。Ｍａｐｔ２を固定した固体基質の一部を「活性セル」とよぶ。同じ方法でこの固体基質の独立した部分にいくつかの核酸分子またはその他を４０６９ＲＵの固定化度で固定した。これを「対照セル」と呼ぶ。
下記の各種ヒト第ＶＩＩ因子を使用した：
（１）Ａｃｓｅｔ精製法に従って得たヒト血漿ＦＶＩＩ、
（２）ウサギで作った組換え型ヒトＦＶＩＩ、
（３）ヤギで作った組換え型ヒトＦＶＩＩ、
（４）組換え型ヒトＦＶＩＩ（Novoseven(登録商標)から市販）
【０２０４】
各サンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定したＭａｐｔ２アプタマを含む同じ活性セル（固体基質）上へ順次注入した。コントロール（対照）にはランニング緩衝液のみを含むブランクを注入した。上記の固定した核酸、その他を含む対照セルに同じサンプルを注入するとバックグラウンドノイズに対応する信号が得られる。この信号を活性セルで得られた信号から引いた。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行した。注射の後、１２０秒間、ランニング緩衝液はチップ上へ同じ流速で注入した。それから溶出緩衝液（１５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で３０秒間注入してＦＶＩＩをアプタマから分離した。このチップを用いてＦＶＩＩと固定したアプタマとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図７］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。結果は［図７］に示した。
この実施例の結果から、アプタマは固定することによってヒト血漿第ＶＩＩ因子およびウサギおよびヤギを含む種々のトランスジェニック（遺伝子導入実験）動物で作った組換え型ヒト因子ＶＩＩを含む極めて多種のヒト第ＶＩＩ因子に特異的に結合するが示された。
【０２０５】
実施例８
ヒト因子ＶＩＩへのアプタマの特異的結合
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。
固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端を化学的に変成してＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖に連結した。それから、アプタマに連結した末端とは反対側のスペーサ鎖の遊離末端にビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子およびアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは４３２６ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
Ｍａｐｔ２を固定した固体基質の一部を「活性セル」とよぶ。同じ方法でこの固体基質の独立した部分にいくつかの核酸分子またはその他を４０６９ＲＵの固定化度で固定した。これを「対照セル」と呼ぶ。
下記の各種ヒト第ＶＩＩ因子を使用した：
（１）Acset精製法に従って得たヒト・血漿ＦＶＩＩ、
（２）アメリカのDiagnostica社から市販の組換え型ウサギＦＶＩＩ(ref 4O7RAB、バッチ番号：080818）
【０２０６】
各サンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定したＭａｐｔ２アプタマを含む同じ活性セル（固体基質）上へ順次注入した。コントロール（対照）にはランニング緩衝液のみを含むブランクを注入した。上記の固定した核酸、その他を含む対照セルに同じサンプルを注入するとバックグラウンドノイズに対応する信号が得られる。この信号を活性セルで得られた信号から引いた。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行した。注射の後、１２０秒間、ランニング緩衝液はチップ上へ同じ流速で注入した。それから溶出緩衝液（１５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で３０秒間注入してヒト・ウサギＦＶＩＩをアプタマから分離した。このチップを用いてＦＶＩＩと固定したアプタとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図８］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
この実施例の結果から、上記アプタマは固定するとヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａに極めて特異的に結合し、ウサギＦＶＩＩ／ＶＩＩａには結合しないことが示された。
【０２０７】
実施例９
親和性基質の製造方法
ストレプトアビジン（streptavidin）(streptavidin−agarose-Novagen、登録商標)を表面にグラフトしたマトリックスから成る固体基質材料から親和性基質を調製した。
１ｍｌ容積のゲルをカラム（i.d.11mm）から成る容器に入れた。貯蔵溶剤を除去するためにゲルを精製水で洗浄した。ゲルの特徴は以下の通り：
（１）ビオチン吸着能：≧８５ナノモル／１ｍｌゲル
（２）機能テスト：ＡＴで３０分間のコースでビオチン標識化したトロンビンのキャプチャー＞９９％、
（３その他のテスト：プロテアーゼ無し、エンド／エクソヌクレアーゼ無し、にRNase無し
（３）防腐剤：１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５＋ＮａＮ3 0.02
【０２０８】
充填カラム（ゲル・ベッド高さ＝１ｃｍ）の出口に２５４ｎｍのＵＶフィルターと記録装置とを備えた吸光度検出器を接続した。
配列ＳＥＱＩＤ番号８６のビオチン標識化した抗ヒトＦＶＩＩ核酸アプタマを精製水中に０．５ｍｇ／０．１８７ｍｌの最終濃度（すなわち最終モル濃度＝０．１ｍＭ）で可溶化した。核酸アプタマ溶液を標準サイクルに従って９５℃で活性化して固体基質材料上にアプタマを固定化した。
核酸アプタマ溶液を４．８ｍｌの精製水で、次に１．５ｍｌのＭｅ++緩衝液（５×濃度）で予備希釈した。
吸光度検出器を１ＡＵＦＳ（吸光度単位フルスケール）に合わせ、２５４ｎｍでこの溶液のＯＤを０．５７５Ｕ254で記録した。
ビオチン標識化した核酸アプタマ溶液は予備パックしたストレプトアビジン−アダロースゲル上へ注入し、ペリスタル型ポンプで２．５ｍｌ／分の流速で再循環させた（すなわちゲル（入口／出口 Ｉ／Ｏ）上での接触時間＝２４秒）。上記条件での２５４ｎｍでのＯＤは直ちに０．０５ＡＵ254（すなわち理論的なカップリング値の９１％）に到達した。すなわち１ミリリットルのゲル当たり０．４５５ｍｇの核酸アプタマで安定する。
４ｍＭ−ＭｇＣｌ2＋１０ｍＭ−ＣａＣｌ2緩衝液で洗浄し、次いで２Ｍ−ＮａＣｌで洗浄して固体基質材料上にグラフトしたストレプトアビジン分子に特異的に結合していない核酸アプタマを除去した。
【０２０９】
実施例１０
組換え型ヒト因子ＶＩＩの精製方法
上記のアプタマ親和性基質を下記文献に記載の方法で調製した精製されたＦＶｌｌ／ＦＶｌｌａを使用してテストした。
【特許文献２０】国際特許第Ｗ０２００８／０９９０７７号公報
【０２１０】
被精製サンプルの製造
出発材料の生物物質は組換え型ヒトＦＶＩＩを含むトランスジェニクウサギ乳汁である。発現カセットはβ−カゼイン遺伝子プロモータの制御下にあるヒトＦＶＩＩトランスジーンから成る。簡単に言うと、１４０ミリリットルの乳汁を出生後の日４〜日１２の間の初乳汁分泌を２匹のウサギから集め、集めた乳汁のアミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ（生物学的に活性化されたＦＶＩＩ）の平均タイター値は９２８ｌＵ／ｍｌである。乳汁は−８０℃の温度で保存した。
テスト時にはウサギ乳汁を水浴中で３７℃の温度で解凍し、クエン酸ナトリウム溶液で希釈してｐＨ７．５での最終クエン酸塩濃度を６２ｇ／ｌにした。このクエン酸ナトリウム処理で燐酸カルシウム（phosphocalcic）カゼインミセルを不安定できる。乳汁のリピドリッチなタンパク溶液は一連の濾過器（それぞれ（ｉ）１５〜０．５μｍ気孔率閾値の深型濾過器と（ｉ）０．２μｍメンブランフィルタ）で精製する。
【０２１１】
１９８ｌＵ／ｍＩのＦＶＩＩタイター（すなわち３６ｍｇのトランスジェニクＦｙＩＩ）を有する濾過後の溶液の容積３６０ｍｌを１６ｍｌ容積のMEP-HyperCelクロマトグラフィ・ゲル（Pall BioSepra）で予備精製した。この捕獲ゲルを用いることでカゼインを含む乳タンパクの９５％を除去でき、しかも、ＦＶＩＩの初期量の６０％を保持できる。
上記段階の終わりに得られた１７．５ｍｇの低純度ＦＶＩＩ（〜５％）は容積２０ｍｌのQ-sepharoseＸＬ（登録商標）（GE Healthcare）を使用したイオン交換クロマトグラフィで精製する。ヒトＦＶＩＩは、７８ｍｌ容積の５ｍＭ−塩化カルシウムを含む緩衝液で溶出する。アミド分解（amidolytic）ＦＶＩＩ濃度は３３７ｌＵ／ｍｌすなわち０．１７ｍｇのＦＶＩＩ／ｍｌで、２８０ｎｍ、ε1%＝１３でＯＤで測定した全タンパクは０．１８ｍｇ／ｍｌ、と見積もられる。従って、ＦＶＩＩ純度は９４％。
【０２１２】
ウサギ乳汁由来の残留タンパクをこの段階でＦＶＩＩから分離するのは、構造上類似性、例えばＧＬＡ−ｄｏｍａｉｎまたはＥＧＦｄｏｍａｉｎタンパクのため、あるいは物理化学的な類似性（イオン電荷および／または分子寸法が類似）のため、難しい。従来方法では直交法（ヒドロキシアパタイトゲルとサイズ排除クロマトグラフィ分離の組合せ）によって純度を９９．９５％まで改良できる。
しかし、人間で繰り返して注射する場合には、遺伝子組換えタンパクで許容される外来タンパクに対する負荷は５０ｐｐｍを超えてはならない。すなわち純度＞９９．９９５％でなければならない。この純度はアフィニティーマトリックスでの精製だけで達成できるように見える。
【０２１３】
本発明の親和性基質での組換え型ヒトＦＶＩＩの精製段階
上記段階の終わりに得られた精製されたヒトＦＶＩＩ溶液の６ｍｌの容積（ＦＶＩＩの１．１ｍｇ）を用いて本発明の親和性基質で高純度の組換え型ヒトＦＶＩＩに精製する段階を行う。上記段階で得られたＦＶＩＩ溶液う４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、ｐＨ７．５に予備調節し、アプタマ−アガロースゲル（親和性基質）上にペリスタル型ポンプで０．１ｍｌ／分の流速で注入する（すなわち、親和性基質との接触時間１０分）（Ｉ／Ｏ）。
注射後、ゲルを５０ｍＭトリス＋５０ｍＭ−ＮａＣｌ＋４ｍＭＭｇＣｌ2＋１０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７．５緩衝液で洗浄する。１０ｍｌの非吸着溶液を回収する。ＦＶＩＩは５０ｍＭトリス＋１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液で溶出させる。溶出ピークの収集はＯＤプロフィルに従って実行する。モル計算から親和性基質に固定された核酸アプタマの量は１７ナノモルで、これはＦＶＩＩ分子とのモル−モル相互作用で、ＦＶＩＩの０．９ｍｇの親和性基質の絶対キャパシティに対応する。
【０２１４】
［図１１］は２５４ｎｍでの吸光度値（ＯＤ）を連続モニターしたウサギ乳汁中に産生された組換え型ヒトＦＶＩＩのクロマトグラフィ・プロフィルを示す。この［図１１］で注射（１）後の吸収曲線の屈曲（２）は組換え型ヒトＦＶＩＩと親和性基質の飽和開始を示す。時間（３）で組換え型ヒトＦＶＩＩの注射を停止する。［図１］の直線状時間のスケールを示すと、注射開始時間（１）と注射終了時間（２）との間の持続時間は１０分である。親和性基質は上記凝固タンパクで飽和し続け、（ｉ）親和性基質の抗ＦＶＩＩ核酸アプタマと（ｉｉ）被精製組成物中に最初に含まれていた組換え型ヒトＦＶＩＩ分子との間に錯体が形成される。被精製組成物をカラムに送り、カラムを緩衝液で洗浄する（洗浄段階６）。その後、時間（４）で１０ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度から成る緩衝液を注入して溶出段階を実行する。吸収ピークは核酸アプタマ／組換え型ＦＶＩＩ錯体から組換え型ヒトＦＶＩＩが開放されたことを示している。組換え型ヒトＦＶＩＩの分子は迅速にリリースされ、従って、少容積である点に注意されたい。従って、本発明の親和性基質によって組換え型ヒトＦＶＩＩタンパクの高濃度の溶出溶液が得られる。時間（５）で５０ｍＭトリス緩衝液を用いて親和性基質を再生させる段階を実行する。（７）で見られる吸光度ピークは再生段階で親和性基質から開放された物質に対応する。
【０２１５】
親和性基質の動的結合能
下記の［表２］に示すテスト結果は０．４５〜０．４９ｍｇ／ｍｌの親和性マトリックスすなわちバイオアベイラブル（bioavailable）なリガンドの５０〜５５％の動的結合能を示す。ＥＤＴＡで約５％の動的溶出が計算される。
【０２１６】
【表２】
【０２１７】
親和性基質の特異的分離能
親和性基質の特異性をウサギ乳タンパクに特異的なＥＬＩＳＡアッセイで評価した。結果は［表３］に示した。
【０２１８】
【表３】
【０２１９】
［表３］の結果は、トランスジェニクなヒトＦＶＩＩの純度を９８．３％〜９９．９５％とすると、アプタマ−アガロースによる除去の平均値２ｌｏｇ10が得られることを示す。これはヒトＦＶＩＩに対するアプタマの特異性を示し、残利希有ウサギ乳タンパクとの相互作用はほとんどないことを示す。
溶出前に２Ｍ−ＮａＣｌおよび／またはプロピレングリコールまたは５０％エチレングリコール溶液で中間洗浄すると結果はより良くなる（これらの条件ではＦＶＩＩは溶出されない）。
実施例１０の結果は、アプタマ−アガロースゲル上での親和性基質がリガンド１ｍｇ当たり少なくとも１ｍｇのＦＶＩＩの動的結合能の優れた特徴を有することを示し、溶出収率は少なくとも７５％である。また、純度の明らかな改良（〜９９．９５％）、残留ウサギ乳タンパクＲＭＰの除去２ｌｏｇ10からも特異性は確認できる。最適化していない２つのテストで最終レベルは約５００ｐｐｍになる。
【０２２０】
実施例１１
基質に固定したヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａによる本発明アプタマ核酸の捕獲
血漿由来の精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ分子を固定した固体基質を製造した。
ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ中に存在するフリーのアミンを結合するＮＨＳ−ＥＤＣで活性化したしカルボキシメチルデキストランにヒト第ＶＩＩ因子を固定した。すなわち、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを２５２５ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定した。
本発明の一連の２７の核酸アプタマ（純度：９９％）（アプタマに従って４３〜６６の長さを有するヌクレオチド）をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、５０で希釈するた‖ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５）して３つのアプタマサンプルを得る。
テストされる各アプタマをランニング緩衝液に最終濃度１μＭで注入した。各サンプルは固定されたヒトＦＶＩＩを含む同じチップ（固体基質）上に順次注入した。コントロール（対照）はランニング緩衝液液のみを含むブランクを注入して得た。全ての注射は３０μｌ／分の速度で６０秒間で実行した。注射後、１２０秒でランニング緩衝液液をチップ上へ全て同じ速度で注入した。それから溶出緩衝液（５ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒かけて注入してアプタマからＦＶＩＩ ＨＰを分離させた。このチップを用いてＦＶＩＩとテストしたすアプタとの間の相互作用の形成および分断を表面プラスモン共振（ＳＰＲ）によってリアル・タイムで調べた。固定したアプタマへの結合は装置で記録した共振単位（ＲＵ）信号の増加に反映される（［図Ｅｌ］）。その解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。結果は［図１２］［図１３］に示した。
【０２２１】
［図１２］は表面プラスモン共振法に従ったテストでの基質に固定したヒト・血漿第ＶＩＩ因子に対する本発明の一連の２７の核酸アプタマの結合曲線を示す。Ｘ軸：時間（秒）；Ｙ軸：共振信号（任意単位）。
［図１３］はテストした２７のアプタマの各々の安定結合の信号値を示す。Ｘ軸：テストした２７のアプタマ；Ｙ軸：共振信号（任意単位）。
ヒト因子ＶＩＩに対する親和性の差によるアプタマの４つグループが観測される。Ｍａｐｔ２「コア配列」は低親和性グループに属する。ファミリー２の１つの代表は他より高い親和性を有する。このアプタマをＭａｐｔ２．２と呼び、下記の「コア配列」を有する：
５'ＣＣＧＣＡＣＧＣＴＡＣＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＣＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＣ３' （ＳＥＱＩＤ番号３３）
しかし、得られた結果はテストした全ての核酸アプタマがヒト・血漿第ＶＩＩ因子に有意な親和性を有することを示している。
【０２２２】
実施例１２
ヒト血漿第ＶＩＩ因子の精製方法
Ａ．材料と方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフィ基質
「Ｍａｐｔ−２コア」アプタマを固定した親和性ゲル材料を、アプタマとビオチンとの間にスペーサ鎖無しに、ビオチンに直接結合した。アプタマは５'−末端ビオチンでストレプトアビジンゲル（供給元Nivagen）に固定した。理論リガンド濃度は０．４ｍｇ／ｍｌ：ＸＫ１６カラム（ＧＥ）にパックした容積１ｍｌ。
使用したアプタマは配列ＳＥＱＩＤ番号２０のアプタマである。この出発生成物は第ＶＩＩ因子の切詰め不純物および劣化第ＶＩＩ因子の形の不純物を含む。劣化第ＶＩＩ因子はガンマ−カルボキシル化で変性された第ＶＩＩ因子の形を含む。
【０２２３】
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化：０．０５０Ｍ−トリス−ＨＣｌ、０．０１０Ｍ ＣａＣｌ2、０．０５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５、
溶出： ０．０２０Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０１０Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、
９８％まで精製した２４０μｇのヒト・血漿ＦＶＩＩを平衡化緩衝液中に流速０．５ｍｌ／分で注入した。保持されなかったピークの検出後、２カラム容積の溶出緩衝液を注入した。タンパクのピークは２８０ｎｍ波長で吸光度値を測定して検出した。
【０２２４】
Ｂ．結果
結果は［図１４］および［図１５］に示す。
［図１４］は時間を関数とする２８０ｎｍで測定した吸光度曲線。［図１４］のピーク番号１はカラムに保持されなかった出発生成物の分画に対応する。ピーク番号２は溶出分画に対応する。
出発生成物および溶出生成物硝酸銀染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析して不純物が除去されたことを視覚化した。［図１５］はこのゲルを表す。レーン番号１は出発生成物分画に対応し、レーン番号２は溶出分画に対応する。出発生成物の純度にもかかわらず、溶出画分は汚染物または劣化物を含まない点に注意されたい。
［図１４］および［図１５］の結果は配列ＳＥＱＩＤ番号２０のアプタマはヒトＦＶＩＩに結合でき、ＥＤＴＡの存在下で特異的に溶出できることを示している。
【０２２５】
実施例１３
アプタマのウサギＦＶＩＩへの結合の非存在
Ａ．材料と方法
Ａ．１ アフィニティークロマトグラフ基質
５'−末端にスペーサ鎖を介して配列ＳＥＱＩＤ番号８６のアプタマを固定したストレプトアビジンゲル（供給元Nivagen）に固定した。理論リガンド濃度は０．３５ｍｇ／ｍｌ：容積１ｍｌ。使用したアプタマは配列ＳＥＱＩＤ番号８６のアプタマである。
Ａ．２ 出発生成物
ウサギ・血漿から精製して得たウサギＦＶＩＩがリッチなヒドロキシアパタイト溶出液、接触時間１０分、流速０．５ｍｌ／分。
Ａ．３ 精製プロトコル
ゲル平衡化：０．０５０Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０１０Ｍ ＣａＣｌ2、０．０５ｍＭ ＭｇＳＯ3、ｐＨ７．５、
溶出：０．０５０Ｍトリス−ＨＣｌ ０．０１０Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５
３６μｇを１０分間の接触時間でゲルに注入する。溶出は２ｍｌの溶出緩衝液を注入して実行した。タンパクのピークは２８０ｎｍの波長での吸光度値を測定して検出した。
【０２２６】
Ａ．４ タンパクおよび第ＶＩＩ因子に関する画分の分析プロトコル
各画分はそのアミド分解活性をStagoキット（因子ＶＩＩａ StatClotキット）を使用して発色アッセイによって分析した（供給元の推薦に従った）。アミド分解活性を各画分に含まれるＦＶＩＩのμｇに換算した。
Ｂ．結果
結果は［表４］に示す。
【０２２７】
【表４】
【０２２８】
［表４］の結果は配列ＳＥＱＩＤ番号８６のＭａｐｔ−２アプタマが固定した親和性ゲルにはウサギ第ＶＩＩ因子は保持されないことを示している。
【０２２９】
実施例１４
Biacore（ＮａＣｌ耐性）上でのアプタマとヒト因子ＶＩＩとの相互作用のプロトコルの特定実施例
Ａ．材料と方法
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは３７７２ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
トランスジェニクなウサギ乳汁から得た精製したトランスジェニクヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰＴＧ、純度：９８％）をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して２００ｍＭのＦＶＩＩ濃度のサンプルを得た。
【０２３０】
サンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定したＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上へ注入した。次いで、ＮａＣｌ濃度を増大させた緩衝液を固体基質上に注入した（１Ｍ−Ｎａｌから３Ｍ−ＮａＣｌき濃度を３シリーズ注入）。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行した。注射の後、１２０秒間、ランニング緩衝液はチップ上へ同じ流速で注入した。３つの緩衝液の３シリーズの注入後、溶出緩衝液（１０ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒間注入してＦＶＩＩ ＨＰＴＧをアプタマからから分離した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
トランスジェニクなヒトＦＶＩＩに対する固定したＭａｐｔ２アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）の専用モジュール制御ソフトウェア（バージョン１．２）で計算した。
ヒトＦＶＩＩに対するＭａｐｔ２アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩに対するＭａｐｔ２アプタマの結合はＮａＣｌを含む緩衝液の注入によって有害な程度には変更されないということが分かる。
Ｂ．結果
結果は［図１６］に示してある。
【０２３１】
実施例１５
Biacore（プロピレングリコール耐性）上でのヒト因子ＶＩＩとアプタマとの相互作用のためのプロトコルの特定実施例
Ａ．材料と方法
配列ＳＥＱＩＤ番号８６の本発明の核酸アプタマ分子（Ｍａｐｔ２）を固定した固体基質を製造した。固体基質に結合する前にＭａｐｔ２アプタマの５'末端に化学的にＰＥＧ（Ｃ１８）の４つの分子から成るスペーサ鎖を連結した。また、アプタマに連結した末端の反対側のスペーサ鎖の遊離末端にはビオチン分子を連結した。
固定したストレプトアビジン分子を含む固体基質は提供された（Series Ｓ sensor ChipSA.ＧＥ）。
基質のストレプトアビジン分子とアプタマ化合物のビオチン分子間の非共役会合によって配列ＳＥＱＩＤ番号８６の核酸を固定するために上記の固体基質をアプタマ化合物と接触させた。
Ｍａｐｔ２アプタマは５３１９ＲＵ（１ＲＵは単位ｍｍ2当たり固定した生成物が約１ｐｇに対応）の固定化度で固定された。
【０２３２】
トランスジェニクウサギ乳汁から得た精製したトランスジェニクヒトＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ ＨＰＴＧ、純度：９８％）をランニング緩衝液（５０ｍＭトリス、１０ｍＭ−ＣａＣｌ2、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して２００ｍＭのＦＶＩＩ濃度のサンプルを得た。このサンプルをビオチン−ストレプトアビジン相互作用で固定したＭａｐｔ２アプタマを含むチップ（固体基質）上へ注入した。次に、５０％のプロピレングリコールを含む緩衝液を固体基質上へ注入した。全ての注射は３０μｌ／分の流速で６０秒間で実行された。５０％プロピレングリコールを含む緩衝液を注入後、溶出緩衝液（１０ｍＭ−ＥＤＴＡ）を３０μｌ／分の流速で７５秒間で注入して、ＦＶＩＩ ＨＰＴＧをアプタマから除去した。
解析はRPS Biacore T100装置（ＧＥ）で実行した。記録された相互作用のモデリングはBiaevaluationソフトウェア（ＧＥ）を使用して実行した。
トランスジェニクヒトＦＶＩＩに対する固定したＭａｐｔ２アプタマの結合曲線はBiacore（登録商標）の専用モジュール制御ソフトウェア（バージョン１．２）で計算した。
このヒトＦＶＩＩに対するＭａｐｔ２アプタマの結合結果から、ヒトＦＶＩＩへのＭａｐｔ２アプタマの結合はプロピレングリコールを含む緩衝液注入によって有害な程度に変化しないことが分かる。
【０２３３】
Ｂ．結果
結果は［図１７］に示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］ｘ−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］ｙ−３' （Ｉ）
（ここで、
「ＳＥＱＩＤ番号Ｘ」はＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される核酸から成り、
「ｘ」は０または１の整数であり、
「ｙ」は０または１の整数である）
【請求項２】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが、ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも一つと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸から成る群の中から選択される請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが、ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも一つと少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含む請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
ＳＥＱＩＤ番号８６を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
条件（Ａ）によって発現されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する能力を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸：
ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ＜０．０１ （Ａ）
（ここで、
「ヒトＫｄ」は、モル単位で計算される、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの式（Ｉ）の核酸の解離定数、
「非ヒトＫｄ」は、同じモル単位で計算される、非ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの式（Ｉ）の核酸の解離定数）
【請求項７】
最大で５００ｎＭ、好ましくは最大で２００ｎＭのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの解離定数値を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
上記のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの結合が金属カチオン−キレート化剤と接触した時に解離できる請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
下記の式（ＩＩ）で表されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物：
［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （ＩＩ）
（ここで、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は請求項１に記載の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続しヌクレオチドを有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸を表す）
【請求項１０】
下記の式（ＩＩＩ）で表されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物：
［ＦＩＸ］−［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （ＩＩＩ）
（ここで、
［ＦＩＸ］は基質に固定化するための化合物を表し、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は請求項１に記載の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続しヌクレオチドを有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸を表す）
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９〜１０のいずれか一項に記載の化合物と、（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９〜１０のいずれか一項に記載の化合物の複数がグラフトされる固体基質から成る、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定化するための基質。
【請求項１３】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを請求項１２に記載の基質と接触する段階を有する、基質上にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定化する方法。
【請求項１４】
下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法：
（ａ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９または１０の化合物または請求項１２に記載の基質と接触させてｉ）上記核酸または上記化合物または上記基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体を形成し、
（ｂ）段階（ａ）で形成させた錯体からヒト因子ＩＩ／ＶＩＩａを遊離させて精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収する。
【請求項１５】
親和性基質を洗浄用緩衝剤で洗浄する段階（ａ'）を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むサンプル中のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの存在を検出する方法：
（ａ）上記サンプルを請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９または１０に記載の化合物または請求項１２に記載の基質と接触させ、
（ｂ）（ｉ）上記核酸または上記化合物または上記基質と（ｉｉ）上記因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を検出する。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸と、薬学的に許容される少なくとも一種の賦形剤とから成る医薬品組成物。
【請求項１８】
医薬品として使用される請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の凝固疾患を処置するための医薬品製造での使用。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の疾患処置での使用。
【請求項１】
下記の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸：
５'−［ＳＥＱＩＤ番号１］ｘ−［ＳＥＱＩＤ番号Ｘ］−［ＳＥＱＩＤ番号２］ｙ−３' （Ｉ）
（ここで、
「ＳＥＱＩＤ番号Ｘ」はＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される核酸から成り、
「ｘ」は０または１の整数であり、
「ｙ」は０または１の整数である）
【請求項２】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが、ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも一つと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸から成る群の中から選択される請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列ＳＥＱＩＤ番号Ｘが、ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００から成る群の中から選択される請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
ＳＥＱＩＤ番号３〜ＳＥＱＩＤ番号８５およびＳＥＱＩＤ番号８７〜ＳＥＱＩＤ番号１００の少なくとも一つと少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含む請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
ＳＥＱＩＤ番号８６を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
条件（Ａ）によって発現されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する能力を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸：
ヒトＫｄ／非ヒトＫｄ＜０．０１ （Ａ）
（ここで、
「ヒトＫｄ」は、モル単位で計算される、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの式（Ｉ）の核酸の解離定数、
「非ヒトＫｄ」は、同じモル単位で計算される、非ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの式（Ｉ）の核酸の解離定数）
【請求項７】
最大で５００ｎＭ、好ましくは最大で２００ｎＭのヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの解離定数値を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
上記のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの結合が金属カチオン−キレート化剤と接触した時に解離できる請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
下記の式（ＩＩ）で表されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物：
［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （ＩＩ）
（ここで、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は請求項１に記載の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続しヌクレオチドを有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸を表す）
【請求項１０】
下記の式（ＩＩＩ）で表されるヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する化合物：
［ＦＩＸ］−［ＳＰＡＣ］−［ＮＵＣＬ］ （ＩＩＩ）
（ここで、
［ＦＩＸ］は基質に固定化するための化合物を表し、
［ＳＰＡＣ］はスペーサ鎖を表し、
［ＮＵＣＬ］は請求項１に記載の式（Ｉ）の核酸と少なくとも４０％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続しヌクレオチドを有するヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに特異的に結合する核酸を表す）
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９〜１０のいずれか一項に記載の化合物と、（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの錯体。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９〜１０のいずれか一項に記載の化合物の複数がグラフトされる固体基質から成る、ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定化するための基質。
【請求項１３】
ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを請求項１２に記載の基質と接触する段階を有する、基質上にヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを固定化する方法。
【請求項１４】
下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの精製方法：
（ａ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを含むサンプルを請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９または１０の化合物または請求項１２に記載の基質と接触させてｉ）上記核酸または上記化合物または上記基質と（ｉｉ）ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体を形成し、
（ｂ）段階（ａ）で形成させた錯体からヒト因子ＩＩ／ＶＩＩａを遊離させて精製されたヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａを回収する。
【請求項１５】
親和性基質を洗浄用緩衝剤で洗浄する段階（ａ'）を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記の（ａ）と（ｂ）の工程を含むサンプル中のヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａの存在を検出する方法：
（ａ）上記サンプルを請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸または請求項９または１０に記載の化合物または請求項１２に記載の基質と接触させ、
（ｂ）（ｉ）上記核酸または上記化合物または上記基質と（ｉｉ）上記因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの間の錯体の形成を検出する。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸と、薬学的に許容される少なくとも一種の賦形剤とから成る医薬品組成物。
【請求項１８】
医薬品として使用される請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の凝固疾患を処置するための医薬品製造での使用。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の疾患処置での使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１２−５１７８２５（Ｐ２０１２−５１７８２５Ａ）
【公表日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０６３５（Ｐ２０１１−５５０６３５）
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５０２９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４８９９
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０９３４２９３５）エルエフベー ビオテクノロジーズ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５０２９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４８９９
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０９３４２９３５）エルエフベー ビオテクノロジーズ (9)
【Ｆターム（参考）】
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