【課題】ミスフォールディングタンパク質の分解を強化することによって、タンパク質の立体構造に関連する疾病（ＰＣＤ）の治療若しくは予防に有用性を発揮する新規な組成物及び方法の提供。
【解決手段】有効量のオートファジータンパク質分解を強化する化合物を患者（例えばヒト患者）に投与することを含んでなる。一実施形態では、当該化合物は、ラパマイシンの哺乳類の標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログを阻害する。更に他の実施形態において、当該方法は更に１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール、又は７−環をロックした１１−シス−レチナールの異性体を患者に投与することを含んでなる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は、米国仮特許出願第６０／６７５１４３号（２００５年４月２７日に出願）及び第６０／７２３２８８号（２００５年１０月３日に出願）の優先権を主張し、これら各々の全開示内容を本願明細書に参照により援用する。
【０００２】
（連邦の支援により行われた本発明の権利に関する声明）
本発明は国立眼研究所により、承認番号ＥＹＯ１ ６０７０−０１として支援されたものである。したがって、政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、ヒト疾患に関連する変異体タンパク質の分解能を改善するための新規な材料及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質は、生物学的機能を提供するためはそれらの正しい三次元立体構造にフォールディングされなければならない。ポリペプチドの天然の立体構造はそのアミノ酸配列の一次構造としてコードされ、アミノ酸配列の単一の突然変異により、タンパク質のその適当な形態を採る能力が損なわれることさえあり得る。タンパク質が正しくフォールディングされなければ、生物学的及び臨床的効果が得られない。タンパク質凝集及びミスフォールディングは、多くのヒト疾患（例えば常染色体優性色素性網膜炎、アルツハイマー病、α１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、腎生成尿崩症及びプリオン媒介による感染症）の主要な原因となる。他のタンパク質−フォールディング障害（例えば常染色体優性色素性網膜炎、加齢と関連する黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン舞踏病）においては、ミスフォールドタンパク質が細胞障害性を有するため、病理学的な症状となって表れる。
【０００５】
ミスフォールディングタンパク質は、ＥＲにおける品質をコントロールするシステムにより認識され、プロテアソームによる消化の標的とされる。プロテアソーム経路以外の、他タンパク質分解の機構として、オートファジーが存在する。オートファジーは、アミノ酸飢餓などの様々な細胞内及び細胞外からのストレス、ミスフォールディングタンパク質の凝集及び傷害を受けた細胞小器官の蓄積により刺激されうるが、オートファジーは通常非選択的な方式により行われると考えられる。ハンチントン舞踏病に関連する凝集性のポリグルタミン及びポリアラニンで膨張したタンパク質はオートファジーによって分解を受け、またオートファジーの抑制は、ハエ及びマウスのハンチントン舞踏病モデルにおいて、変異体ハンティングトンタンパク質の毒性を減少させた例が報告されている。またオートファジーはＥＲにおける、蓄積タンパク質の除去に貢献することも報告されている。オートファジーを増加させる方法が利用できるならば、それによりミスフォールディングタンパク質の除去を強化し、それらの蓄積と関連した細胞障害性効果を除去することも可能になると考えられる。ミスフォールディングタンパク質の細胞障害性効果を軽減し、ニューロン機能を維持する方法に対する緊急なニーズが存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ミスフォールディングタンパク質の分解を強化することによって、タンパク質の立体構造に関連する疾病（ＰＣＤ）の治療若しくは予防に有用性を発揮する新規な組成物及び方法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの態様では、本発明は広義には、患者のタンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法の提供に関する。当該方法は、有効量のオートファジータンパク質分解を強化する化合物を患者（例えばヒト患者）に投与することを含んでなる。一実施形態では、当該化合物（例えばラパマイシン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＦＴＩ−２７７又はそのアナログ）は、ラパマイシンの哺乳類の標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する。他の実施形態では、ＰＣＤは、α１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びジェイコブ−クロイツフェルト疾患からなる群のうちの１つ以上である。更に別の実施形態では、ＰＣＤは、色素性網膜炎、加齢関連黄斑変性（例えば湿潤性若しくは乾燥性）、緑内障、角膜ジストロフィー、網膜分離症、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、常染色体優位ドルーゼン及びＢｅｓｔの黄斑ジストロフィーから選択される１つ以上の眼性ＰＣＤである。更に他の実施態様では、当該方法は更に１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は７−環をロックした１１−シス−レチナールの異性体を患者（例えばヒト患者）に投与することを含んでなる。別の態様では、本発明は患者（例えばヒト患者）の眼性タンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法の提供に関し、当該方法は、有効量のオートファジータンパク質分解強化化合物を患者に投与することを含んでなる。
【０００８】
別の態様では、本発明は患者（例えばヒト患者）の色素性網膜炎又は黄斑変性の治療若しくは予防方法の提供に関し、当該方法は、患者にオートファジータンパク質分解を強化する化合物を投与することと、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールを投与することを含んでなり、その場合、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール及び当該化合物を同時若しくは各々１４日以内で、患者の色素性網膜炎又は黄斑変性の治療若しくは予防に十分な量を投与する。
【０００９】
別の態様では、本発明はタンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法の提供に関するものであり、当該ＰＣＤはα１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びジェイコブ−クロイツフェルド疾患のうちの１つ以上であり、当該方法は患者のＰＣＤの治療若しくは予防に十分な量のオートファジー強化化合物を患者（例えばヒト患者）に投与することを含んでなる。
【００１０】
一実施形態では、本発明は更に、患者がＰＣＤを有するとして確認するステップを含んでなる。更に別の実施形態では、本発明は細胞におけるミスフォールドタンパク質、オートファジーマーカー又は自食胞のレベル又は発現を測定するステップを含んでなる。
【００１１】
一実施形態では、ＰＣＤは嚢胞性線維症であり、当該方法は更に、抗生物質、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫサプリメント、アルブテロール気管支拡大薬、ドルナーゼ及びイブプロフェンから選択される１つ以上の薬剤を投与することを含んでなる。
【００１２】
更に別の実施形態では、ＰＣＤはハンチントン舞踏病であり、当該方法は更にハロペリドール、フェノチアジン、レセルピン、テトラベナジン、アマンタジン及びコエンザイムＱ１０から選択される１つ以上の薬剤を投与することを含んでなる。
【００１３】
更に別の実施形態では、ＰＣＤはパーキンソン病であり、当該方法は更にレボドパ、アマンタジン、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アポモルヒネ、ベンゼラジド、リスライド、メスレルジン、リスリド、レルゴトリル、メマンチン、メタエルゴリン、ピリベジル、チラミン、チロシン、フェニルアラニン、ブロモクリプチンメシラート、ペルゴリドメシラート、抗ヒスタミン剤、抗うつ薬及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤から選択される１つ以上の薬剤を投与することを含んでなる。
【００１４】
更に別の実施形態では、ＰＣＤはアルツハイマー病であり、当該方法は更にドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン及びタクリンから選択される１つ以上の薬剤を投与することを含んでなる。
【００１５】
更に別の実施形態では、ＰＣＤは腎生成尿崩症であり、当該方法は更にクロロチアジド／ヒドロクロロチアジド、アミロライド及びインドメタシンから選択される１つ以上の薬剤を投与することを含んでなる。
【００１６】
更に別の実施形態では、当該方法は更に、以下から選択される１つ以上の薬剤を投与することを含んでなる。酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルフォンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルヴィン−カロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、ストラムスチンリン酸塩、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン及びビンフルニン。
【００１７】
別の態様では、本発明は細胞（例えば眼細胞、神経単位、上皮細胞）内におけるミスフォールドタンパク質の分解を強化する方法の提供に関するものであり、当該方法は当該細胞を有効量のオートファジー強化化合物と接触させることを含んでなる。
【００１８】
一実施形態では、当該方法は更に、細胞（例えば哺乳類細胞（例えばヒト細胞）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏにおいて）におけるミスフォールドタンパク質、オートファジーマーカー又は自食胞のレベル又は発現を測定するステップを含んでなる。
【００１９】
更に別の実施形態では、当該方法は更に、１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は７−環をロックされた１１−シス−レチナール異性体と眼細胞を接触させることを含んでなる。
【００２０】
更に別の実施形態では、細胞は、凝集体又はフィブリルを形成する変異体タンパク質（例えばオプシン、ミオシリン、リポフスシン、β−Ｈ３タンパク質）を含む。
【００２１】
更に他の態様では、本発明は、薬学的に許容できる賦形剤中にｍＴＯＲ阻害剤又はそのアナログを含有するＰＣＤの治療用の医薬組成物の提供に関する。
【００２２】
更に他の態様では、本発明は、薬学的に許容できる賦形剤中に有効量のオートファジー強化化合物の中を含有する眼性ＰＣＤの治療用の医薬組成物の提供に関する。
【００２３】
更に他の態様では、本発明は、薬学的に許容できる賦形剤中に有効量の１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び有効量のオートファジー阻害剤を含有する色素性網膜炎若しくは加齢に関連する黄斑変性の治療用の医薬組成物の提供に関する。
【００２４】
更に他の態様では、本発明は眼性ＰＣＤの中の治療用のキットであって、有効量の１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び有効量のラパマイシン若しくはそのアナログを含有するキットの提供に関する。
【００２５】
更に他の態様では、本発明は色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性の治療用キットの提供に関し、当該キットは、有効量の１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び有効量のラパマイシン若しくはそのアナログを含有する。
【００２６】
更に他の態様では、本発明はＰＣＤを有する患者（例えばヒト患者）の治療に有用な化合物の同定方法の提供に関し、当該方法は、インビトロでミスフォールドタンパク質を発現させている細胞と候補化合物とを接触させることと、コントロール細胞と比較した試験細胞のオートファジーの増加を測定し、接触させた細胞のオートファジーが増加した場合に、ＰＣＤを有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とすることを含んでなる。
【００２７】
更に他の態様では、本発明は色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性を有する患者（例えばヒト患者）の治療に有用な化合物の同定方法の提供に関し、当該方法は、インビトロでミスフォールドタンパク質を発現する細胞と、１１−シス−レチナール（例えば７−環がロックされた１１−シス−レチナールの異性体）又は９−シス−レチナールと、候補化合物とを接触させ、コントロール細胞と比較した試験細胞のオートファジーの増加を測定し、接触させた細胞のオートファジーが増加した場合に、色素性網膜炎を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とすることを含んでなる。
【００２８】
更に他の態様では、本発明はＰＣＤを有する患者（例えばヒト患者）の治療に有用な化合物の同定方法の提供に関し、当該方法は、インビトロでミスフォールドタンパク質を発現させている細胞と候補化合物とを接触させることと、コントロール細胞との比較において試験細胞のオートファジーの増加を測定し、接触させた細胞のオートファジーが増加した場合に、嚢胞性線維症を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とすることを含んでなる。一実施形態では、ミスフォールドタンパク質は突然変異を有する。他の実施形態では、ミスフォールドタンパク質はオプシン（例えばＰ２３Ｈ突然変異を含むオプシン）である。
【００２９】
更に別の実施形態では、オートファジーの増加は、タンパク質の濃度をモニターすること、オートファジーマーカーの発現をモニターすること、又は自食胞の数をモニターすることによって測定できる。
【００３０】
更に他の態様では、本発明は患者（例えばヒト患者）のタンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法の提供に関し、当該方法はラパマイシン又はＦＴＩ−２７７の生物学的活性を強化する有効量の化合物を投与することを含んでなる。一実施形態では、化合物はラパマイシン又はそのアナログと組み合わせて投与するか、又はＦＴＩ−２７７又はそのアナログと組み合わせて投与する。
【００３１】
更に別の実施形態では、ＰＣＤはα１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びジェイコブ−クロイツフェルト疾患のうちの１つ以上から選択される。
【００３２】
他の実施形態では、ＰＣＤは、色素性網膜炎、加齢に関連する黄斑変性、緑内障、角膜ジストロフィー、網膜精神分裂症患者、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、常染色体優位なドルーゼン及びＢｅｓｔの黄斑ジストロフィーから選択される１つ以上の眼性ＰＣＤである。他の実施形態では、当該方法は更に１１−シス−レチナール（９−シス−レチナール）、又は７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体を患者に投与することを含んでなる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、患者（例えばヒト患者）の色素性網膜炎の治療若しくは予防方法の提供に関し、当該方法は、患者にラパマイシン又はＦＴＩ−２７７と、ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７生物学的活性を強化する化合物を投与することを含んでなる。一実施形態では、当該方法は更に、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールを投与することを含んでなり、その場合、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール及び当該化合物を同時若しくは各々１４日以内で、患者の色素性網膜炎の治療若しくは予防に十分な量を投与する。
【００３４】
更に他の態様では、本発明は、患者（例えばヒト患者）のタンパク質形態障害（ＰＣＤ）を治療若しくは予防する方法の提供に関し、当該方法は、ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７又はそのアナログを、ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７の生物学的活性を強化する化合物と組み合わせて投与することを含んでなり、その場合、ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７、及び当該化合物の有効量を各々投与し、患者のＰＣＤを治療若しくは予防する。
【００３５】
更に他の態様では、本発明は、細胞中のミスフォールドタンパク質の分解を促進する方法の提供に関し、当該方法は、細胞（例えば眼細胞、神経細胞、上皮細胞）と、ラパマイシン、ＦＴＩ−２７７若しくはそのアナログの有効量、及びラパマイシン若しくはＦＴＩ−２７７の生物学的活性を強化する化合物とを接触させることを含んでなり、その場合、ラパマイシン若しくはＦＴＩ−２７７、及び当該化合物を、タンパク質の分解を促進させるのに十分な量で各々投与する。一実施形態では、当該方法は更に１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体と、細胞とを接触させることを含んでなる。
【００３６】
更に他の態様では、本発明は、眼性ＰＣＤの治療用の医薬組成物の提供に関し、当該組成物は薬学的に許容できる賦形剤中にラパマイシン、ＦＴＩ−２７７若しくはそのアナログ、及びラパマイシン若しくはＦＴＩ−２７７の生物学的活性を強化する化合物を含んでなり、その場合、ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７、及び当該化合物は患者（例えばヒト患者）のＰＣＤの治療若しくは予防に十分な量で各々存在する。
【００３７】
更に他の態様では、本発明は、ＰＣＤを有する患者（例えばヒト患者）の治療に有用な化合物を同定する方法の提供に関し、当該方法は、インビトロでミスフォールドタンパク質を発現する細胞を、オートファジーエンハンサーの有無において、候補化合物と接触させることと、コントロール細胞との比較において細胞のオートファジーの増加を測定し、接触させた細胞のオートファジーが増加した場合に、ＰＣＤを有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とすることを含んでなる。
【００３８】
更に他の態様では、本発明は、色素性網膜炎を有する患者（例えばヒト患者）の治療に有用な化合物を同定する方法の提供に関し、当該方法は、インビトロでミスフォールドオプシンタンパク質を発現する細胞を、１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、ラパマイシン若しくはＦＴＩ−２７７、並びに候補化合物と接触させ、コントロール細胞との比較において細胞のオートファジーの増加を測定し、接触させた細胞のオートファジーが増加した場合に、色素性網膜炎を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とすることを含んでなる。
【００３９】
更に他の態様では、本発明は、嚢胞性線維症を有する患者（例えばヒト患者）の治療に有用な化合物を同定する方法の提供に関し、当該方法は、インビトロでミスフォールドＣＦＴＲタンパク質を発現する細胞を、候補化合物及びラパマイシン若しくはＦＴＩ−２７７と接触させ、コントロール細胞との比較において細胞のオートファジーの増加を測定し、接触させた細胞のオートファジーが増加した場合に、嚢胞性線維症を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とすることを含んでなる。
【００４０】
上記のいずれかの態様における各種実施形態では、ＰＣＤは、α１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びジェイコブ−クロイツフェルド疾患のうちの１つ以上から選択される。
【００４１】
他の実施形態では、ＰＣＤは、色素性網膜炎、加齢に関連する黄斑変性（湿潤型若しくは乾燥型）、緑内障、角膜ジストロフィー、網膜精神分裂症患者、Ｓｔａｒｇａｒｄｔの疾患、常染色体優位なドルーゼン及びＢｅｓｔの黄斑ジストロフィーから選択される１つ以上の眼性ＰＣＤである。
【００４２】
上記のいずれかの態様における別の実施形態では、化合物は、ラパマイシンの哺乳類の標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳におけるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）の富化を阻害する。
【００４３】
上記のいずれかの態様における好ましい一実施形態では、眼性ＰＣＤは、色素性網膜炎又は黄斑変性（例えば加齢に関連する黄斑変性（乾燥型若しくは湿潤型）である。
【００４４】
上記のいずれかの態様における更に別実施形態では、当該方法は更に１１−シス−レチナール（９−シス−レチナール）、又は７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体を患者（例えば哺乳類（例えばヒト））に投与することを含んでなる。
【００４５】
上記のいずれかの態様における好ましい実施態様では、当該患者は、タンパク質フォールディングに影響を及ぼす突然変異（例えば突然変異はオプシンＰ２３Ｈ突然変異、又はＣＦＴＲΔＦ５０８突然変異など）を有する。
【００４６】
上記の態様における他の実施形態では、当該分解ミスフォールドタンパク質に対して選択的である。
【００４７】
上記のいずれかの態様における更に他の実施形態では、本発明の方法に有用な化合物は、ラパマイシン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＦＴＩ−２７７又はかかる化合物のアナログである。
【００４８】
更に他の実施例において、当該方法は更に、１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール、又は７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体を患者に投与することを含んでなる。
【００４９】
更に別の実施形態では、当該化合物は、ラパマイシンの哺乳類の標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する。
【００５０】
上記のいずれかの態様における中の各種実施形態では、患者（例えばヒト又は獣医患者）は、タンパク質フォールディングに影響を及ぼす突然変異（例えばオプシンＰ２３Ｈ突然変異）を含んでなる。
【００５１】
更に他の実施形態では、当該分解ミスフォールドタンパク質に対して選択的である。他の実施態様では、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール及び当該化合物は各々２４時間以内、３日以内若しくは５日以内に投与される。
【００５２】
上記のいずれかの態様の他の実施形態では、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール及び化合物は同時に投与される。
【００５３】
他の実施形態では、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール及び当該化合物は眼に、例えば眼内投与される。更に別の実施形態では、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール、及び当該化合物は、その長期放出を提供する組成物（例えば微小球体、ナノ球体又はナノエマルジョン）に各々添加される。
【００５４】
更に別の実施形態では、長期放出は薬剤輸送手段を介して行われる。更に別の実施形態では、当該方法は更にビタミンＡサプリメントを投与することを含んでなる。
【００５５】
上記のいずれかの態様における更に他の実施形態では、オートファジーの増加は、タンパク質の濃度をモニターすること、オートファジーマーカーの発現をモニターすること、又は自食胞の数をモニターすることによって測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
定義
「哺乳類におけるラパマイシンの標的（ｍＴＯＲ）」とは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｐ４２３４５に対する少なくとも８５％又は９５％の同一性を有するポリペプチド配列を意味する。
【００５７】
「ｍＴＯＲを阻害」とは、ｍＴＯＲと関連する少なくとも１つの生物学的活性が少なくとも１０％減少することを意味する。典型的な「ｍＴＯＲの生物学的活性」としては、ｍＴＯＲキナーゼ活性、細胞のオートファジーの誘導、細胞周期進行の調節、ＤＮＡ組換え及びＤＮＡ損傷の検出が挙げられる。ｍＴＯＲ及びＳ６キナーゼのリン酸化を阻害する化合物もまた、ｍＴＯＲの生物学的活性を阻害する。
【００５８】
「脳内で富化されるＲａｓホモログ（ｒｈｅｂ）」とは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿００５６０５に対する少なくとも８５％又は９５％の同一性を有するポリペプチド配列を意味する。
【００５９】
「ｒｈｅｂを阻害」をは、ｍＴＯＲと関連する少なくとも１つの生物学的活性が少なくとも１０％減少することを意味する。典型的な「ｒｈｅｂ生物学的活性」としては、オートファジーの誘導、ｍＴＯＲのリン酸化、グアニンヌクレオチド結合活性及びＧＴＰアーゼ活性が挙げられる。
【００６０】
「タンパク質高次構造的な疾患」とは、病態がミスフォールドタンパク質の存在に関連する疾患又は障害を意味する。一実施形態では、ミスフォールドタンパク質が細胞、組織又は器官の中の通常の生物学的活性を妨げるときに、タンパク質高次構造的な疾患が生じる。
【００６１】
「ラパマイシンの生物学的活性」とは、オートファジーの強化、ｍＴＯＲ抑制、Ｔリンパ球増殖の抑制、リンホカイン分泌の抑制、イースト細胞増殖の抑制、タンパク質分解の強化、又は細胞若しくは生物体にラパマイシンを投与することによる他のあらゆる効果を指す。
【００６２】
「オートファジータンパク質分解」とは、オートファジーによって実質的に生じる分解のことを意味する。
【００６３】
「アナログ」とは、対象化合物と構造的な関連性を有し、実質的に対象化合物と同じ機能を有する化合物を意味する。対象化合物の誘導体又は代謝物質をアナログと称する場合もある。
【００６４】
「強化する」の用語は、最低１０％、１５％、２５％、５０％、７５％又は１００％の明確な変化を意味する。
【００６５】
「ミスフォールディングタンパク質」とは、参照タンパク質と比較してその三次構造に影響を及ぼすほどの変異を有するタンパク質を意味する。典型的なミスフォールディングタンパク質としては、オプシンの変異形態（例えばＰ２３Ｈオプシン）、すなわちオプシン参照配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００５３９及びＮＰ＿０００５３０）と比較し変異した配列有する形態、並びにヒトＣＦＴＲ（例えばΔＦ５０８突然変異）、すなわちＣＦＴＲ参照配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＡＡ３５６８０、ＮＰ＿０００４８３、Ｐ１３５６９）と比較し変異した配列を有する形態の変異形態が挙げられる。
【００６６】
「微小球体」という用語は、生理活性物質が取り込まれている実質的に球面のコロイド構造を意味する。微小球体は、一般に約０．５μＭ〜約５００μＭの範囲の粒子径分布を有する。直径１ミクロン以下の構造である場合、「ナノ球体」という対応する用語を用いることもある。
【００６７】
「ナノエマルジョン」とは、小さい脂質構造を含有する水中油型分散体を意味する。一例として、ナノエマルジョンは約０．５〜５ミクロンの平均粒子径の液滴を有する油相を含んでなる。
【００６８】
「減少する」という用語は、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の負の変化を意味する。「選択的な分解」とは、優先してミスフォールディングタンパク質を分解させ、正しくフォールディングされたタンパク質は実質的に影響を受けないことを意味する。多くの実施形態では、４５％未満、３５％、２５％、１５％、１０％又は５％の正しくフォールディングされたタンパク質が分解する。
【００６９】
本発明の用語「治療する」、「治療」、「処置すること」などの用語は、障害及び／又はそれに関連する症状を軽減若しくは改善することを意味する。いうまでもなく、障害又は症状を治療するということは、障害、条件又はそれに関連する徴候が必ずしも完全に除去される必要はないが、もちろん完全に除去されてもよい。本発明の用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」は、障害又は症状を有しないが、当該障害又は症状に罹るおそれのある患者における罹患率を低下させることを指す。
【００７０】
本発明は、インビボにおけるミスフォールディングタンパク質の分解の強化に有用である組成物及び方法に関する。本発明は広義には、本発明（例えばラパマイシン、ＦＴＩ−２７７、並びにそのアナログ及び異型）の化合物が変異体タンパク質の分解を強化するという発見に基づく。好適なことに、変異体タンパク質は特異的に分解する一方で、その野生型はそのレベルがほとんど不変である。ミスフォールディングタンパク質は通常の細胞機能を妨害し、細胞毒性を生じさせることもあり、更にヒトタンパク質形態障害（ＰＣＤ）に結果としてなる。ＰＣＤとしては、α１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びプリオン関連の障害（例えばジェイコブ−クロイツフェルト疾患）が挙げられる。組成物及び本発明の方法は特に眼性ＰＣＤ（色素性網膜炎、加齢に関連する黄斑変性（乾湿形）緑内障、角膜ジストロフィー、網膜精神分裂症患者、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、常染色体優位ドルーゼン、Ｂｅｓｔ黄斑ジストロフィー及び角膜ジストロフィーなど）の予防又は治療に有用である。本発明の組成物は、ＰＣＤの治療、影響を受けた細胞死の遅延、ＰＣＤによって生じる兆候の緩和、又はＰＣＤの発症の防止に使用できる。
【００７１】
オートファジーエンハンサー
オートファジーは、細胞質の細胞成分を分解するための、進化的に保存された機構であって、飢餓細胞における細胞生存メカニズムとして機能する。オートファジーの間、細胞質の要素は細胞膜により封入され自食胞を形成し、最終的にはリソソームと融合しその内容物を分解させる。
【００７２】
ＰＣＤの治療には、オートファジーエンハンサーを独立に用いてもよく、又は１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体と組み合わせて用いてもよい。オートファジーエンハンサーのラパマイシンは、特に嚢胞性線維症及びミスフォールディングタンパク質又はタンパク質凝集に関連する他の障害の治療、並びに色素性網膜炎及び他の眼性疾患の治療に有用である。本発明の方法において有用なオートファジーエンハンサーとしては、ラパマイシン、ＦＴＩ−２７７及びその塩類若しくはアナログが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７３】
ラパマイシン
ラパマイシン（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）、シロリムス、ワイエス）は、Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓが産生する環状ラクトンである。ラパマイシンは、Ｔリンパ球活性化及び増殖を阻害する免疫抑制剤である。ラパマイシンは、哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）（細胞周期の進行に必要とされるキナーゼ）に結合し、阻害する。ｍＴＯＲキナーゼ活性の抑制は、Ｔリンパ球増殖及びリンホカイン分泌をブロックする。
【００７４】
ラパマイシンの構造的及び機能的アナログとしては、モノ−及びジアクリル化されたラパマイシン誘導体（米国特許第４３１６８８５号）、ラパマイシン水溶性プロドラッグ（米国特許第４６５０８０３号）、カルボン酸エステル類（国際公開第９２／０５１７９号）、カルバメート（米国特許第５１１８６７８号）、アミドエステル類（米国特許第５１１８６７８号）、ビオチンエステル類（米国特許第５５０４０９１号）、フッ化エステル類（米国特許第５１００８８３号）、アセタール（米国特許第５１５１４１３号）、シリルエーテル（米国特許第５１２０８４２号）、二環式誘導体（米国特許第５１２０７２５号）、ラパマイシン二量体（米国特許第５１２０７２７号）、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル及びＯ−アルキニル誘導体（米国特許第５２５８３８９号）、及びｄｅｕｔｅｒａｔｅｄされたラパマイシン（米国特許第６５０３９２１号）が挙げられる。他のラパマイシンのアナログとしては、ＣＣＩ−７７９（Ｗｙｅｔｈ Ａｙｅｒｓｔ社製）、タクロリムス、ピメクロリムス、ＡＰ２０８４０（Ａｒｉａｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ社製）、ＡＰ２３８４１（Ａｒｉａｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）、ＡＢＴ−５７８（アボットラボラトリーズ社製）、ＳＡＲ９４３（３２−デオキソラパマイシン、Ｅｙｎｏｔｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１０９（３）：４６１−７（２００３）及びエベロリムス（ＳＤＺ ＲＡＤ）が挙げられる。エベロリムス（４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン（ＣＥＲＴＩＣＡＮ、ノバルティス））はラパマイシンに構造的に類似する免疫抑制マクロライドである。その他のラパマイシンアナログは、米国特許番号５２０２３３２号及び第５１６９８５１号に記載されている。ラパマイシンは現在液体及び錠剤による経口投与に利用されている。ＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）液は１ｍｇ／ｍＬのラパマイシンを含有し、投与前に水又はオレンジジュースで希釈する。１又は２ｍｇのラパマイシンを含有する錠剤も市販されている。ラパマイシンは好ましくは一日一回服用する。経口投与の後、急速かつ完全に吸収される。通常は、患者へのラパマイシンの投与量は患者の症状に従って変化が、標準的な推奨される投与量を幾つか以下に記す。ラパマイシンの初回投与量は６ｍｇである。続く維持投与量は典型的には２ｍｇ／日である。あるいは、３ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ又は２５ｍｇの初回投与量、並びに１ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ又は１０ｍｇ／日の維持投与量で実施してもよい。体重４０ｋｇ未満の患者において、ラパマイシン投与量は通常体表面積に基づいて調整され、通常は３ｍｇ／ｍ^２／日の初回投与量及び１ｍｇ／ｍ^２／日の維持投与量が採用される。
【００７５】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤はファルネシル化を阻害し、それはタンパク質の翻訳後修飾であって、修飾タンパク質の疎水性を増加させ、細胞膜表面への局所化を促進する。細胞膜へのこの局在化は通常、ファルネシル化タンパク質の通常の機能に必要である。ファルネシルアクセプター部分は、目標タンパク質のカルボキシ末端に存在する４つのアミノ酸配列として、様々なタンパク質において同定されている。この４つのアミノ酸配列は−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｘとして同定され、式中、「Ｃ」はシステイン残基であり、「Ａ」は任意の脂肪族アミノ酸であり、「Ｘ」はあらゆるアミノ酸を指す。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩｓ）（例えばＦＴＩ−２７７）は、Ｒａｓ及び他のファルネシル化されたタンパク質（例えばＲｈｅｂ）の翻訳後脂質修飾を阻害する。下で更に詳細に記載するように、ＦＴＩ−２７７はｍＴＯＲを不活性化することによって細胞のオートファジーを誘発する、典型的なファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である。ｍＴＯＲは、アミノ酸に応答して、ＡＫＴ／ＰＫＢの下流の目標として、オートファジーを負に制御する。この発見に一部基づき、ファルネシルトランスフェラーゼを阻害する他の薬剤も本発明の方法において有用である。
【００７６】
本発明の方法で有用なファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、従来技術において周知であり、例えば米国特許第７０２２７０４号、第６９３６４３１号、第６８００６３６号、第６７９０６３３号、第６７４０６６１号、第６７３７４１０号、第６５７６６３９号、第６５２８５２３号、第６４９８１５２号、第６４４０９７４号、第６４３２９５９号、第６４１０５４１号、第６３９９６１５号、第６３７２７４７号、第６３６２１８８号などに記載されている。他の実施形態として、３−メルカプトピロリジン ＦＴＩｓが、例えば米国特許第６９４６４６８号に記載されている。５置換されたテトラロン ＦＴＩｓが、例えば米国特許第６９４３１８３号に記載されている。二環式阻害剤が、米国特許第６５２８５３５号に記載されている。また、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤としてのトリアゾールが、例えば米国特許出願公開第２００５／０２３４１１７号に記載されている。本発明の方法で有用な他の典型的なＦＴＩｓは、米国特許出願公開第２００６／００７９５３０号、第２００５／０１４８６０９号、２００５／００５９６７２号及び２００５／００２０５１６号、並びに以下の科学雑誌：Ｓａｎｔｕｃｃｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １０：３８４−３８７（２００３）、Ｍｅｇｎｉｎ−Ｃｈａｎｅｔら、ＢＭＣ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２：２、２００２、ＢＭＳ−２１４６６２、及びアッペルスら、（Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１０：５６５−５７８（２００５）に記載されている。典型的なファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、Ｒ１１５７７７、ＧＧＴＩ−２１６６、ＢＭＳ−２１４６６４（Ｓａｎｔｕｃｃｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １０：３８４−３８７、２００３）、ＲＰＲ−１３０４０１（Ｍｅｇｎｉｎ−Ｃｈａｎｅｔら、ＢＭＣ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２：２、２００２）、ＢＭＳ−２１４６６２（ブリストル−マイヤーズスクイブ、プリンストン、ＮＪ）、Ｌ７７８１２３（メルク社、ホワイトハウスステーション、ＮＪ）、チピファルニブ（実験名、Ｒ１１５７７７、ザルネストラ（商標）、Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌ．Ｐ．、ブリッジウォーター、ＮＪ）、ロナファルニブ（実験名、ＳＣＨ６６３３６、Ｓａｒａｓａｒ（商標）、シェーリング−Ｐｌｏｕｇｈ社、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、ＦＴＩ−２７７（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ）、及びＬ７４４８３２（バイオモルインターナショナルＬ．Ｐ．、プリマスミーティング、ＰＡ）などが挙げられる。
【００７７】
ＦＴＩｓの臨床投与量は通常、一日当たり１００μｇ〜１０，０００ｍｇの間である。公知技術のいかなる方法によって投与してもよい。特にチピファニブは２１日間、１日２回、１５０、２００、３００、４００、５００及び６００ｍｇの投与量で経口投与する。ロナファニブは１日２回、１００、２００、３００及び４００ｍｇの投与量で、持続的な計画において経口投与する。ＢＭＳ−２１４６６２は通常、１００ｍｇ／ｍ^２、２００ｍｇ／ｍ^２において３週に１回１時間の注入、２７５ｍｇ／ｍ^２及び３００ｍｇ／ｍ^２において２４時間の注入により投与する。あるいは、ＢＭＳ−２１４６６２は週間スケジュールにおいて３００ｍｇ／ｍ^２、及び週間スケジュールにおいて１０２ｍｇ／ｍ^２で投与する。８１ｍｇ／ｍ^２のＢＭＳ−２１４６６２の連日投与は、本発明の方法においても有用である。ＦＴＩｓを投与する他の形式は従来技術において周知であり、例えばアッペルスらの文献（Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１０：５６５−５７８（２００５）に記載されている。
【００７８】
眼性タンパク質高次構造に起因する障害
本発明の組成物はまた、特に実質的に全ての眼性のタンパク質高次構造的な障害（ＰＣＤ）の治療に有用である。かかる障害は、眼内のタンパク質凝集体又はフィブリルとしてのミスフォールディングタンパク質の蓄積を特徴とする。本発明の組成物は正しくフォールディングされたタンパク質濃度に影響を及ぼさずに、選択的なミスフォールディングタンパク質の分解を強化する。色素性網膜炎は、オプシン（例えばＰ２３Ｈオプシン）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００５３９及びＮＰ＿０００５３０）のミスフォールディング、並びに、炭酸脱水酵素ＩＶ（ＣＡ４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００７１７及びＮＰ＿０００７０８）（レベロら、４月２７日Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４、１０１（１７）：６６１７−２２）の突然変異を伴う典型的な眼性ＰＣＤである。ＣＡ４は、ヒトの眼内の脈絡毛細管において高発現するグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーされたタンパク質である。Ｒ１４Ｗ突然変異はＣＡ４タンパク質のミスフォールディングをもたらし、この突然変異を有する患者は常染色体優性色素性網膜炎を患う。ＣＡ４ポリペプチド変異体の形態の分解を強化する本発明の組成物は、ＣＡ４ポリペプチドの突然変異と関連した常染色体優性色素性網膜炎の治療に有用である。
【００７９】
Ｘリンク若年性網膜分離（ＲＳ）は他の眼性ＰＣＤである。ＲＳは男性の少年期の黄斑変性の主な原因である。ＲＳ１（ＮＭ＿０００３３０、ＮＰ＿０００３２１）の突然変異又は網膜分離は、Ｘリンク網膜分離（男性の一般の、開始前半黄斑変性）の原因となり、網膜の内側層の分裂及び視野の重大な損失をもたらす。ＲＳ１の突然変異は、タンパク質フォールディング（３月１８日、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５、２８０（１１）：１０７２１−３０）を崩壊させる。ＲＳ１の変異体形の分解を強化する本発明の組成物は、網膜分離の治療に有用である。
【００８０】
緑内障は、ミオシリンの突然変異と関連する眼性ＰＣＤである。ミオシリンは多くのヒト器官（目を含む）において、偏在して発現する未知の機能の分泌型糖タンパク質である。この突然変異により、ミオシリンタンパク質が緑内障の１つの形態として形成され、世界的な失明の主要な原因となる。変異体ミオシリンは、不溶性の凝集体（Ａｒｏｃａ−Ａｇｕｉｌａｒら、６月３日、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５、２８０（２２）：２１０４３−５１、 ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭＪ３００２６１及びＮＰ＿０００２５２）として、トランスフェクション細胞の細胞質網状構造に蓄積する。ミオシリンの変異体の形態の分解を強化する本発明の組成物は、ミオシリン関連緑内障の治療に有用である。
【００８１】
Ｓｔａｒｇａｒｄｔ様黄斑変性は、ＥＬＯ ＶＬ４の突然変異と関連する眼性ＰＣＤである。ＥＬＯ ＶＬ４（長鎖脂肪酸４の伸長）はＥＬＯファミリータンパク質のメンバーであって、非常に長い鎖長の脂肪酸の生合成に関連するものである。ＥＬＯ ＶＬ４の突然変異は、常染色体優性Ｓｔａｒｇａｒｄｔ様黄斑変性（ＳＴＧＤ３／ａｄＭＤ）患者において同定されている。ＥＬＯＶＬ４変異体タンパク質は、トランスフェクション細胞中で、顕著に凝集体として蓄積する（Ｇｒａｙｓｏｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｌ２１、Ｅｐｕｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０２２７２６及びＮＰ＿０７３５６３）。変異形態ＥＬＯ ＶＬ４の低下を強化する本発明の組成物は、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ様黄斑変性の治療に有用である。
【００８２】
Ｍａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ（ｍＬ）及びＤｏｙｎｅハネコムレチナールジストロフィー（ＤＨＲＤ）は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の下に蓄積するドルーゼンとして公知の黄色沈着物によって特徴づけられる２つの常染色体優性ＰＣＤｓに関連する。ＥＦＥＭＰ１は網膜ドルーゼン形成において一定の役割を果たし、黄斑変性の病因に関連する（Ｓｔｏｎｅら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｊｕｎ；２２（２）：１９９−２０２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿００４１０５及びＮＰ＿００４０９６）。変異体ＥＦＥＭＰ１は細胞中でミスフォールディングされ、保持される。変異体形ＥＦＥＭＰ１の分解を強化する本発明の組成物は、常染色体優位なドルーゼンの治療に有用である。
【００８３】
最高の黄斑ジストロフィーはＶＭＤ２（ｈＢＥＳＴ１）の突然変異によって生じる常染色体優位なＰＣＤであり、それはベストロフィンをコードする（Ｇｏｍｅｚら、ＤＮＡ Ｓｅｑ．２００１ Ｄｅｃ；１２（５−６）：４３１−５）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ：ＮＭ＿００４１８３及びＮＰ＿００４１７４）。ベストロフィンの突然変異によって、おそらくタンパク質ミスフォールディングが生じる。正しくフォールディングされたベストロフィンの変異体形の分解を強化する本発明の組成物は、Ｂｅｓｔの黄斑ジストロフィーの治療に有用である。
【００８４】
５ｑ３１リンク角膜ジストロフィーは、角膜のタンパク質沈着物の年齢依存的な累積によって特徴づけられる常染色体優位なＰＣＤｓであり、視覚障害をもたらす。ＢＩＧＨＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＮＭ＿０００３５８）（またＴＧＦＢＩ（トランスフォーミング成長因子β誘導）とも呼ばれる）における突然変異は、この全症状群の原因となる。Ａｒｇ−１２４及び他の残基の置換は、コードされたタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０００３４９）の異なる凝集経路を介した角膜特異的な堆積をもたらし、角膜組織のタンパク質のターンオーバーの変化をもたらす。正しくフォールディングされたＴＧＦＢＩタンパク質の変異体の形態の分解を強化する本発明の組成物は、５ｑ３１リンク角膜ジストロフィーの治療に有用である。
【００８５】
治療法
本発明は、選択的にミスフォールドタンパク質の分解を強化することによる、ＰＣＤ疾患及び／又は障害若しくは症状（例えば細胞毒性）の治療方法の提供に関する。当該方法は、患者（例えば哺乳類、例えばヒト）に本願明細書に記載の化合物（ラパマイシンのようなｍＴＯＲ阻害剤、ＦＴＩ−２７７のようなファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）を含有する医薬組成物の治療的有効量を投与することを含んでなる。ゆえに、一実施形態は、タンパク質形態疾患又は障害又はその兆候に罹患するか又は罹患しやすい患者の治療方法に関する。当該方法は、本願明細書の化合物の治療的な量を哺乳類に投与し、疾患又は障害を治療するのに十分な条件下で疾患又は障害又はその兆候を治療することを含んでなる。
【００８６】
本発明の方法は、本願明細書に記載の化合物又はかかる効果を生じさせる本願明細書に記載の組成物を、患者（かかる治療が必要と診断された患者を含む）に有効量を投与することを含む。患者かかる治療を必要とするか否かを診断することは、患者又は健康管理専門家の判断に基づいて行ってもよく、それは主観的（例えば意見）若しくは客観的（例えば試験又は診断法によって測定可能）であってもよい。
【００８７】
本発明（予防治療を含む）の治療法は、それを必要とする哺乳類（例えば動物若しくはヒト、特にヒト）患者に、本願明細書の化合物の治療的有効量を投与することを含んでなる。かかる治療を、疾患又は障害又はその兆候に罹患するか又は罹患しやすい患者（特にヒト）に施すのが好適である。「罹患しやすい」患者の決定は、診断試験又は患者又は医師の意見（例えば遺伝子検査、酵素又はタンパク質標識、マーカー（本明細書で定義される）、家族歴など）によって、客観的若しくは主観的な判定によって行ってもよい。本発明の化合物を、タンパク質フォールディング（ミスフォールディングを含む）が関連しうる他のいかなる障害の治療に用いてもよい。一実施形態では、本発明は治療経過をモニターする方法を提供する。当該方法は、タンパク質フォールディング（ミスフォールディングを含む）に関連する疾患、障害又はその兆候に罹患するか又は罹患しやすい患者における臨床マーカー（例えば本願明細書に化合物により調節され、本願明細書に詳述されるいかなる目標、タンパク質又はそのインジケータなど）、又は臨床的数値（例えばスクリーン、アッセイ）を測定することを含んでなり、当該患者に治療的有効量の本発明の化合物を投与し、当該疾患又はその兆候を治療することを特徴とする。当該方法で測定されるマーカーのレベルを、適切なコントロール、又は他の罹患患者のマーカーによる周知のレベルと比較して、患者の疾患状況を決定することができる。好ましい実施態様において、患者のマーカーの第２のレベルは第１のレベルの測定より後の時点で測定され、２つのレベルを比較して疾患の原因又は治療の有効性をモニターできる。好ましい具体的実施態様では、患者における治療前のマーカーのレベルは、本発明によって治療を開始する前に測定される、この処理前のマーカーのレベルは、治療開始後の患者のマーカーのレベルと比較し、処理の有効性を決定することができる
【００８８】
医薬組成物
本発明は薬学的に許容できる担体と共に化合物を含有する医薬剤を特徴とし、当該化合物はミスフォールドタンパク質を選択的に分解させる。かかる調製物は治療及び予防用途に用いられる。一実施形態では、当該医薬組成物は、ミスフォールドタンパク質の分解を強化する化合物と、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールとの組み合わせを含有する。１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール並びに当該化合物は、一緒に投与してもよく、又は別々に投与してもよい。本発明の化合物は、医薬組成物の一部として投与してもよい。組成物は無菌でなければならず、患者への投与に適する単位重量若しくは単位体積当たりのポリペプチドの治療的有効量を含有する必要がある。本発明の組成物及び組合せは製薬パックの一部であってもよく、化合物の各々は個々の投与量で存在する。
【００８９】
本願明細書に記載されている式の化合物を含んでなる本発明の化合物は、その薬学的に許容できる誘導体又はプロドラッグも包含されると定義される。「薬学的に許容できる誘導体又はプロドラッグ」とは、本発明の化合物のあらゆる薬学的に許容できる塩、エステル、エステルの塩又は他の誘導体であって、患者への投与の際、本発明の化合物を（直接又は間接的に）提供することができるもの意味する。特に好適な誘導体及びプロドラッグは、かかる化合物が哺乳類に（例えば、経口投与の化合物を血液により直ちに吸収させることによって）投与されるときに本発明の化合物の生物学的利用能を増加させるもの、又は、親化合物と比較し、生物学的区画（例えば脳又はリンパ系）への親化合物の送達を強化するものを指す。好ましいプロドラッグには、水溶性又は腸膜による能動輸送を強化する基が本願明細書に記載の式の構造中に追加された誘導体が包含される。例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８，３１，３１８−３２２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５、ｐｐ１−９２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎ．Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７，３０，４５１−４５４；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ．：Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１９９１、ｐｐ１１３−１９１；Ｄｉｇｅｎｉｓ，Ｇ．Ａ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９７５，２８，８６−１１２；Ｆｒｉｉｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；２ｅｄ．；Ｏｖｅｒｓｅａｓ Ｐｕｂｌ．：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９６、ｐｐ３５１−３８５；Ｐｉｔｍａｎ，Ｉ．Ｈ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９８１，１，１８９−２１４；Ｓｉｎｋｕｌａ，Ａ．Ａ．；Ｙａｌｋｏｗｓｋｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９７５，６４，１８１−２１０；Ｖｅｒｂｉｓｃａｒ，Ａ．Ｊ．；Ａｂｏｏｄ，Ｌ．Ｇ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７０，１３，１１７６−１１７９；Ｓｔｅｌｌａ，Ｖ．Ｊ．；Ｈｉｍｍｅｌｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８０，２３，１２７５−１２８２；Ｂｏｄｏｒ，Ｎ．；Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７，２２，３０３−３１３を参照。
【００９０】
本発明の化合物は、選択的な生物学的特性を強化するために適当な機能を追加する修飾を行ってもよい。かかる修飾は従来技術において周知で、目的の生物学的区画（例えば血液、リンパ系、神経システム）への生物学的浸透の増加、経口投与の有効性の増加、可溶性の増加による注射投与への適合、代謝の変調による放出速度の調整を可能にするものが挙げられる。
【００９１】
本発明の化合物の薬学的に許容できる塩類は、薬学的に許容できる無機及び有機の酸及び塩基に由来するものが包含される。好適な酸性塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゾアート、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンファ酸塩、アンファスルホン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸エステル、グルコヘプタノエート、グリコール酸塩、ヘミスルフェート、ヘプタノン酸塩、ヘキサノン酸塩、塩酸塩、ハイドロ臭化物、ヨウ化水素塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカノン酸塩などが挙げられる。他の酸（例えば蓚酸）でそれ自身薬学的に許容できるものでない場合であっても、本発明の化合物及びその薬学的に許容できる酸性付加塩を得る際の中間体として、有用な塩類の調製に使用することができる。適当な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウム及びＮ−（アルキル）^４＋塩類が挙げられる。本発明にはまた、本願明細書に開示される化合物のいかなる塩基性窒素含有基の第４級形態が包含される。水若しくは油に可溶性若しくは分散可能な生成物を、かかる第４級化によって得ることができる。
【００９２】
予防若しくは治療的な投与に使用される本発明の医薬組成物は無菌である必要がある。無菌性はγ線照射、除菌膜（例えば０．２μｍ膜）による濾過によって容易に得られ、又は当業者に公知の他の適切な手段で無菌処理を行ってもよい。治療的なポリペプチド組成物は、一般に無菌のアクセスポート（例えば皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグ又はバイアル）を有する容器に充填される。これらの組成物は通常、水溶液として、又は再調製のための凍結乾燥製剤として、単回投与又は複数回投与用の容器（例えば密閉されたアンプル又はバイアル）中に保存される。
【００９３】
化合物は任意に、薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせてもよい。本明細書中で使用される用語「薬学的に許容できる賦形剤」とは、ヒトへの投与に適する１つ以上の適合性を有する固体若しくは液体の充填材、希釈剤又は封入用物質を意味する。用語「担体」は有機若しくは無機の、天然若しくは合成された成分であって、それを活性成分と組み合わせることによって投与を容易にする成分を意味する。医薬成分を本発明の分子と共に混合してもよいが、各々が相互に反応し、所望の薬効を実質的に弱めることのない態様で混合するのが好ましい。賦形剤は、好ましくは例えば等張性及び化学安定性を増強する物質を添加物として微量含有させる。かかる材料は、採用された投与量及び濃度で受容者に対する中毒性を有さず、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、及び他の有機酸若しくはそれらの塩類などのバッファー、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）、重炭酸塩、炭酸塩、並びに他の有機塩基及びそれらの塩類、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（例えば約１０未満の残基）ポリペプチド（例えばポリアルギニン、ポリリシン、ポリグルタミン酸塩及びポリアスパラギン酸塩、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧｓ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ））、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン又はアルギニン）、単糖類、二糖類及び他の炭水化物（セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、蔗糖、デキストラン）、硫化炭水化物誘導体（ヘパリン、コンドロイチン硫酸又はデキストラン硫酸）、多価金属イオン（例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン及びマンガンイオンなどの二価金属イオン）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸、ＥＤＴＡなど）、糖アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）、反イオン（例えばナトリウム又はアンモニウム）、及び／又は非イオン系界面活性剤（例えばポリソルベート又はポロキサマー）。安定化剤、抗菌物質、不活性ガス、流体及び栄養を含む補充液（すなわちリンゲルのブドウ糖）、電解質補充液などの他の添加剤を、通常使用される量で含有させてもよい。上記の通り組成物を有効量で投与してもよい。有効量は、投与様式、治療対象となる具体的な症状及び所望の結果に依存する。更に症状のステージ、患者の年齢及び体調、複合治療の性質（もしあらば）、並びに医師に周知の各種の要因に依存しうる。治療的用途の場合、医学的に望ましい結果を提供するのに十分な量で用いられる。
【００９４】
タンパク質形態疾患又は障害を有する患者の場合、有効量とは、細胞内の正しくフォールディングされたタンパク質のレベルを上昇させるのに十分な量である。ミスフォールドタンパク質に関連する患者又は障害を有する疾患の場合、有効量とは、病理と関係している症状を安定化、遅延又は軽減させるのに十分な量である。通常、本発明の化合物の投与量は、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１日あたり約１０００ｍｇ／ｋｇである。約５０〜約２０００ｍｇ／ｋｇの投与量が適切であると考えられる。特定の投与形態（例えば静脈内投与）の場合、低用量でなされる。初回投与量で患者の反応が不十分である場合、患者に許容される程度まで、高用量（又は異なる局所的な投与経路による高い効果を有する投与量）を使用してもよい。１日当たりの多回投与量は、本発明の組成物の適当な全身レベルを提供するために考察される。様々な投与経路を利用できる。本発明の方法は、一般的に、医学的に許容できるいかなる投与様式を使用して実施してもよく、それは臨床的に容認できない副作用を引き起こすことのない活性化合物の有効レベルを提供するいかなる形式をも意味する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は眼内に投与される。他の投与様式としては、経口、直腸、局所、眼内、バッカル、膣内、脳室内、気管内、鼻腔内、経皮、インプラント内若しくはインプラント上又は非経口経路が挙げられる。「非経口」という用語には、皮下、クモ膜下腔内、静脈、腹膜内、筋肉内又は注入が包含される。本発明の組成物を含有する組成物は、生理的流体、例えば硝子体内ユーモアに添加してもよい。ＣＮＳ投与の場合、手術又は注入による破壊を有する血液脳バリアにおける治療薬の転送を促進し、一過的に粘着力接触を溶く薬をＣＮＳ脈管構造内皮細胞と接触させ、化合物のかかる細胞間の移動を容易にするなど、様々な技術を利用できる。予防治療の場合、投与計画と同様に患者への便宜上の理由から、経口投与が好ましい。
【００９５】
患者の投与による副作用が生じない限り、本発明の中の医薬組成物は要望通り１つ以上の添加されたタンパク質（血漿タンパク質、プロテアーゼ及び他の生物学的材料など）を更に任意に含有させてもよい。適切なタンパク質又は生物学的材料は公知で、当業者が利用できる任意の精製方法によって、ヒト又は哺乳類の血漿から得られる。例えば、組換え組織培養の上澄、抽出液又は溶解物、ウイルス、イースト、バクテリア等（標準的な組み換えＤＮＡ技術に従って、ヒト又は哺乳類の血漿タンパク質を発現する遺伝子を導入されたもの）、又は流体（例えば血液、牛乳、リンパ、尿等）又は標準的なトランスジェニック技術に従ってヒト血漿タンパク質を発現する遺伝子を導入されたトランスジェニック動物が挙げられる。
【００９６】
本発明の中の医薬組成物は、製剤のｐＨを例えば約５．０〜約８．０の範囲で、生理的ｐＨを反映する所定レベルに維持するために、１つ以上のｐＨ緩衝化合物を含有させてもよい。水溶液製剤において使用するｐＨ緩衝化合物は、アミノ酸若しくはアミノ酸の混合物（例えばヒスチジン若しくはアミノ酸の混合物（例えばヒスチジン及びグリシン））であってもよい。あるいは、ｐＨ緩衝化合物は、例えば製剤のｐＨを約５．０〜約８．０などの所定レベルで維持し、カルシウムイオンをキレート化しない薬剤が好ましい。かかるｐＨ緩衝化合物例としては、限定されないがイミダゾール及び酢酸イオンが挙げられる。製剤のｐＨを所定レベルに維持するために、ｐＨ緩衝化合物を適切な量で添加させてもよい。
【００９７】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の浸透圧調整剤（すなわち受容者個人の血流及び血球が許容できるレベルに製剤の浸透特性（例えばオスモル濃度及び／又は浸透圧）を調節する化合物）を含有させてもよい。浸透圧調整剤はカルシウムイオンをキレート化しない物質であってもよい。浸透圧調整剤は、製剤の浸透特性を調節する公知又は当業者が利用できるいかなる化合物であってもよい。当業者は、本発明の製剤用に用いる浸透圧調整剤の適合性を経験的に決定してもよい。適切なタイプの浸透圧調整剤の例としては、限定されないが、塩（例えば塩化ナトリウム及びナトリウム酢酸塩）、糖（例えば蔗糖、ブドウ糖及びマンニトール）、アミノ酸（例えばグリシン）、及びこれらの物質の１つ以上及び／又は物質のタイプの混合物が挙げられる。１つ以上の浸透圧調整剤は、製剤の浸透特性を調節するのに十分ないかなる濃度で添加してもよい。
【００９８】
本発明の化合物を含有する組成物として、多価金属イオン（例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はマンガンイオン）を含有させてもよい。組成物を安定化させ、受容者個人に悪影響を与えないいかなる多価金属イオンを使用してもよい。当業者であれば、これらの２つの基準に基づいて経験的に適切な金属イオンを決定でき、またかかる金属イオンの適切な供給源は公知で、無機及び有機塩が挙げられる。
【００９９】
本発明の中の医薬組成物は、水を含まない液体製剤であってもよい。含まれる１つ以上の活性薬剤に安定性がもたらされるならば、いかなる適切な非水性液体を使用してもよい。好ましい非水性の液体は、親水性液体である。適切な非水性液体の例としては、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＭＳ）、エチレングリコール（例えばエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール）、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）２００、ＰＥＧ３００及びＰＥＧ４００、及びプロピレングリコール、例えばジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）４２５、ＰＰＧ７２５、ＰＰＧ１０００、ＰＰＧ２０００、ＰＰＧ３０００及びＰＰＧ４０００が挙げられる。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、水性／非水性液体製剤の混合物でもあってもよい。使用される水性／非水性液体製剤の混合物は、含まれる化合物に安定性を提供するものであれば、いかなる適切な非水性液体製剤（例えば上記のそれら）を、いかなる水性液体製剤（例えば上記のそれら）に添加して用いてもよい。好ましくは、かかる製剤の非水性液体は親水性液体である。適切な非水性液体の例としては、グリセロール、ＤＭＳＯ、ＰＭＳ、エチレン、グリコール（例えばＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００及びＰＥＧ４００）、及びプロピレングリコール（例えばＰＰＧ４２５、ＰＰＧ７２５、ＰＰＧ１０００、ＰＰＧ２０００、ＰＰＧ３０００及びＰＰＧ４０００）が挙げられる。
【０１０１】
適切な安定な製剤は、凍結状態若しくは非凍結状態での活性薬剤の保存を可能にする。安定な液体製剤は、組成物の特性に応じて、−７０℃以下の温度で保存でき、また０℃のより高い温度でも保存でき、又は約０．１℃〜４２℃の温度で保存することもできる。タンパク質及びポリペプチドは、ｐＨ、温度及び治療有効性に影響を及ぼすことがありえる多数の他の因子の変化に影響されることは当業者に一般に公知である。
【０１０２】
他の輸送システムとしては、放出調節、遅延放出又は徐放性輸送システムが挙げられる。かかるシステムは本発明の組成物の繰り返し投与を回避でき、患者及び医師の便宜を増加させる。徐放性輸送システムの多くのタイプが利用でき、当業者に公知である。例えばポリマーベースシステム（例えばポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号、欧州特許番号５８４８１）、ポリ（ラクチド−グリコリド）コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリＤ−（−）−３、−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸（Ｓｉｄｍａｎ、Ｋ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６）の中の共重合体、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）又はエチレン酢酸ビニルなどのポリヒドロキシ酪酸、を含む（Ｌａｎｇｅｒ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：２６７−２７７、Ｌａｎｇｅｒ、Ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５及びポリ無水物が挙げられる。持続性組成物の他の例としては、成形された物品（例えばフィルム又はマイクロカプセル）の形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。輸送システムは非ポリマーシステムであってもよく、例えば、コレステロール、コレステロールエステルのようなステロール及び脂肪酸又は中性脂肪（脂質モノ、ジ及びトリグリセリドなど）、ヒドロゲル放出システム（例えば生体再吸収性ヒドロゲル（すなわちキチン質ヒドロゲル又はキトサンヒドロゲル）の生物学的誘導体））、ｓｙｌａｓｔｉｃなシステム、ペプチドベースのシステム、ワックスコーティング、従来の結合剤及び添加剤を使用した圧縮錠剤、部分的に融合したインプラントなどが挙げられる。具体例としては、限定されないが、（ａ）米国特許第４４５２７７５号、第４６６７０１４号、第４７４８０３４号及び第５２３９６６０号に記載のような、マトリックス中に薬剤が含有される形の浸食システム、及び（ｂ）米国特許第３８３２２５３号及び第３８５４４８０号に記載のような、活性成分がポリマーから制御された速度で浸透する拡散システムなどが挙げられる。
【０１０３】
本発明の方法及び組成物に使用可能な輸送システムの他のタイプは、コロイド分散体システムである。コロイド分散体システムとしては、油中水型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームなどの脂質ベースのシステムが挙げられる。リポソームは人工膜容器であり、インビボ若しくはインビトロでの輸送媒体として有用である。大きな単一ラメラ小胞（ＬＵＶ）（０．２〜４．０μｍのサイズで調節可能）は水性の内部に高分子をカプセル化でき、生物学的に活性な形態で細胞に輸送できる（Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．，及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７−８０）。リポソームを特異的なリガンド（例えば単クローン抗体、糖、糖脂質又はタンパク質）と結合させ、特定の組織を標的とするリポソームとすることができる。例えば、リポソームはＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）としてギブコＢＲＬから市販され、それはカチオン脂質（例えば臭化（ＤＤＡＢ）Ｎ−［１−（２、３ジオールエチルオキシ）−プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）及びジメチルジオクタデシルアンモニウム）から形成される。リポソームの調製方法は公知技術で、例えばドイツ共和国特許第３２１８１２１号、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）、Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）、欧州特許第５２３２２号、第３６６７６号、第８８０４６号、第１４３９４９号、第１４２６４１号、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４４８５０４５号及び第４５４４５４５号、及び欧州特許第１０２３２４号などの多くの刊行物に記載されている。リポソームはまた、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｇ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３：２３５−２４１でレビューされている。
【０１０４】
担体の他のタイプは、哺乳類の受容者へのインプラントに適する生物学的適合性の微粒子又はインプラント材である。この方法に従って有用である典型的なバイオ浸食するようなインプラントは、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号（国際公開第９５／２４９２９号、「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ」）に記載されている。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号では、適当なプロモータ制御下の外生遺伝子を含有する、生物学的適合性、好ましくは生分解性の重合マトリックスを記載している。重合マトリックスは、患者の外生遺伝子又は遺伝子産物の徐放性を提供するために用いることができる。
【０１０５】
高分子マトリックスは、好ましくは微小球体などの微粒子（薬剤が固体高分子マトリックスの全体にわたって分散）又はマイクロカプセル（薬剤が重合シェルの中心において保存される）の形である。例えば、薬剤を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは米国特許第５０７５１０９号に記載されている。薬剤を含有する高分子マトリックスの他の形としては、フィルム、コーティング、ゲル、インプラント及びステントが挙げられる。高分子マトリックス手段のサイズ及び組成は、マトリックスが導入される組織の好ましい放出動力学となるような態様で選択される。高分子マトリックスの寸法は更に、採用する輸送方法に従って選択される。好ましくは、エアゾールを使用する場合、高分子マトリックス及び組成物は界面活性剤担体中に含有される。高分子マトリックス組成物は、好ましい分解速度を有する態様で選択され、バイオ接着剤としての、輸送効率を更に増加させる材料から形成される。あるいは、分解しないが、拡散による長期間にわたる放出が得られる態様でマトリックス組成物を選択してもよい。輸送システムは局所的、部位特異的輸送に適している生物学的適合性の微小球体であってもよい。かかる微小球体は、Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５２：９６−１０１、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ、Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：４１０−４１４において開示される、。
【０１０６】
生分解性、及び生分解可能な重合マトリックスを用いて、本発明の組成物を患者に輸送してもよい。かかるポリマーは、天然若しくは合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、所望の放出時間に基づいて通常、２、３時間のオーダーから１年のオーダーまでで選択される。通常は、２、３時間から３〜１２ヵ月の間の放出時間が最も望ましい。ポリマーは任意に、その重量に対して最高約９０％の水を吸収できるヒドロゲルの形であり、更に、任意に多価イオン又は他のポリマーと架橋する。
【０１０７】
生分解可能な輸送システムの形成に使用できる典型的な合成ポリマーとしては、ポリアミド類、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、酸化ポリアルキレン、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル及びメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースアセテートブチレート、フタル酸酢酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（ブチルメタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（ヘキシルメタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（ラウリルメタクリル酸塩）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリル酸塩）、ポリ（イソブチルアクリル酸塩）、ポリ（オクタデシルアクリル酸塩）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレンテレフタル酸塩）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、及び乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（ブチル酸）、ポリ（吉草酸）及びポリ（ラクチド−コカプロラクトン）、及び、アルギン酸塩及びその他多糖類（デキストラン及びセルロース）、コラーゲン、その化学誘導体（置換、化学基（例えばアルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化）の付加、及び当業者に耕地の他の修飾による）、アルブミン及び他の親水性タンパク質、ゼイン及びプロラミン及び疎水性タンパク質、それらの共重合体及び混合物などの天然ポリマーが挙げられる。通常これらの材料は、酵素による加水分解、インビボでの水への曝露、表面浸食又はバルク浸食のいずれかによって分解する。
【０１０８】
肺上皮への輸送方法
一実施形態では、例えば嚢胞性線維症の治療の場合、直接肺上皮に本発明の化合物を投与することは望ましく、望ましい投与経路は肺エアゾールである。肺輸送を目的とする薬は、水性製剤として、ハロゲン化炭化水素推進体の懸濁液又は溶液として、又は乾燥粉として投与できる。水性製剤は油圧若しくは超音波原子化を使用した液体ネビュライザによってエアロゾル化する必要があり、推進体に基づくシステムでは適切なメーターで測られた加圧投与吸入器を必要とし、乾燥粉では効果的に薬物を分散させることができる乾燥粉吸入装置を必要とする。水性及び他の非加圧液体システムの場合、様々なネビュライザ（小容量ネビュライザなど）を使用し、製剤をエアロゾル化できる。圧縮器駆動ネビュライザはジェット技術を採用し、圧縮空気を使用して液体エアゾールを生成させる。超音波ネビュライザはピエゾ電気結晶の振動の形としての機械的エネルギーに依存し、呼吸できる液滴を生成させる。推進用被駆動吸入器は、各動作の際、秤量された薬物投与量を放出する。薬物は懸濁液又は適切な推進体中の成分溶液として処方される。乾燥粉吸入器は通常、薬投与量を分配するために装置内に吸引した空気のバーストを利用する。例えば、かかる装置は米国特許第４８０７８１４号及び第５７８５０４９号に記載されている。肺への薬物輸送は、口腔及び咽喉へのエアゾール吸入によりなされる。約２〜約５ミクロンの直径を有する粒子は、上部から中部の肺領域（気道経由）に到達するのには十分小さいが、肺胞に到達するにはサイズが大きい。更に小さい粒子（すなわち約０．５〜約２ミクロン）により肺胞領域に到達できる。また約０．５ミクロンより小さい直径を有する粒子を肺胞領域に堆積させてもよいが、非常に小さい粒子は吐かれることがありうる。エアゾール輸送システムの調製方法は当業者に周知である。米国特許第４５１２３４１号、第４５６６４５２号、第４７４６０６７号、第５００８０４８号、第６７９６３０３号及び米国特許出願公開第２００２／０１０２２９４号を参照。当業者であれば、過度の実験を行うことなしに、肺エアゾールを調製する際の様々なパラメータ及び条件を直ちに調節できる。
【０１０９】
眼輸送方法
本発明の組成物（例えばオートファジーエンハンサー、ｍＴＯＲ阻害剤（例えばラパマイシン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ−２７７など）））は、特に眼性タンパク質形態疾患（例えば緑内障、色素性網膜炎、加齢に関連する黄斑変性、緑内障、角膜ジストロフィー、網膜精神分裂症患者、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、常染色体優位ドルーゼン及びＢｅｓｔ黄斑ジストロフィー）の治療に適している。
【０１１０】
１つの方法において、本発明の組成物は、目の硝子体への直接のインプラントに適する眼科用装置により投与される。本発明の組成物を、例えば米国特許第５６７２６５９号及び第５５９５７６０号記載の徐放性組成物において提供してもよい。かかる装置により、有害な局所及び全身性の副作用の危険性を伴うことなく、目の治療に様々な組成物の制御徐放が提供される。現在の眼への輸送方法の課題は、インプラント期間を延長するために、そのサイズを最小化すると共に、眼内装置又はインプラントに含まれる薬剤の量を最大にすることである。米国特許５３７８４７５号、第６３７５９７２号及び第６７５６０５８号、並びに米国特許出願公開第２００５／００９６２９０号及び第２００５／０１２６９４４８号を参照。かかるインプラントは、生分解可能及び／又は生物学的適合性のインプラントであってもよく、又は生分解性でないインプラントであってもよい。生分解可能な眼インプラントは、例えば米国特許出願公開第２００５／００４８０９９号に記載されている。インプラントは活性薬剤浸透性であっても浸透性でなくともよく、目の眼房、例えば前眼房又は後眼房に挿入してもよく、又は強膜、トランス脈絡膜空間又は無血管の硝子体領域外部にインプラントしてもよい。あるいは、本発明の組成物の貯蔵材として機能するコンタクトレンズを、薬物輸送に使用してもよい。好ましい実施態様において、インプラントを例えば強膜などの無血管領域に設け、それにより例えば目の中の眼内空間及び黄斑などの所望の部位への薬剤の強膜経由の拡散を行わせる。更にまた、強膜経由の拡散を行う部位は、好ましくは黄斑に近接する部位である。組成物の輸送のためのインプラントの例としては、米国特許第３４１６５３０号、第３８２８７７７号、第４０１４３３５号、第４３００５５７号、第４３２７７２５号、第４８５３２２４号、第４９４６４５０号、第４９９７６５２号、第５１４７６４７号、第５１６４１８８号、第５１７８６３５号、第５３００１１４号、第５３２２６９１号、第５４０３９０１号、第５４４３５０５号、第５４６６４６６号、第５４７６５１１号、第５５１６５２２号、第５６３２９８４号、第５６７９６６６号、第５７１０１６５号、第５７２５４９３号、第５７４３２７４号、第５７６６２４２号、第５７６６６１９号、第５７７０５９２号、第５７７３０１９号、第５８２４０７２号、第５８２４０７３号、第５８３０１７３号、第５８３６９３５号、第５８６９０７９号、第５９０２５９８号、第５９０４１４４号、第５９１６５８４号、第６００１３８６号、第６０７４６６１号、第６１１０４８５号、第６１２６６８７号、第６１４６３６６号、第６２５１０９０号及び第６２９９８９５号、並びに国際公開第０１／３０３２３号及び第０１／２８４７４号において記載されている装置が挙げられるが、これらに限定されるものではない（いずれも全開示内容が本願明細書に援用される）。
【０１１１】
例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：徐放性薬剤輸送システムであって、所望の局所的若しくは全身の生理的若しくは薬理学的効果を得るのに有効な量の薬剤を含む内側貯蔵部を含んでなるシステム。薬品を通過させないインナーチューブ。第１および第２の端部を有し、少なくとも一部の内側貯蔵部を被覆する前記インナーチューブ。自身の重量を保持できる態様でサイズを設定され、材料を選択された前記インナーチューブ。インナーチューブ第１端部に設けられる非浸透性部材。インナーチューブ第１端部を通って貯蔵部から薬剤が通過するのを防止する前記非浸透性部材。インナーチューブ第２端部に設けられる浸透性部材。インナーチューブ第２端部を通って貯蔵部から薬剤が拡散する浸透性部材。目の部位に本発明の化合物を投与する方法。目の硝子体に本発明の化合物輸送する徐放性手段、又は本発明の化合物を目の部位に投与する移植可能な徐放性装置をインプラントする処理を含んでなる前記方法。徐放性薬剤輸送手段であって、ａ）診断効果又は所望の局所的若しくは全身性の生理的若しくは薬理学的効果を得るのに効果的な、少なくとも１つの第１薬剤の治療上有効量を含有する薬剤コアと、ｂ）薬剤コアを保持して内部区画を画定する、薬剤を基本的に通過させない少なくとも１つのユニタリーカップであって、ユニタリーカップの開いた頂端部の少なくとも若干の部分の周辺に、少なくとも１つの中断された溝を有する開いた頂端部を含んでなるユニタリーカップと、ｃ）薬剤を浸透させる浸透性プラグであって、当該浸透性プラグがユニタリーカップの開いた頂端部に設けられ、当該溝が当該浸透性プラグと相互作用してその位置に保持し、開いた頂端部を閉口させ、当該薬剤コアから、浸透性プラグを通して薬剤を透過させ、ユニタリーカップの開いた頂端部から放出させる浸透性プラグと、ｄ）診断効果又は所望の局所的若しくは全身性の生理的若しくは薬理学的効果を得るのに効果的な、少なくとも１つの治療上有効量の第２薬剤、又は、徐放性薬剤輸送手段であって、所望の可溶性及びポリマーコーティング層を有する有効量の薬剤を含有する内核、薬品が浸透するポリマー層を含んでなり、ポリマーコーティング層が完全に内核を被覆する前記徐放性薬剤輸送手段。
【０１１２】
他の眼への輸送方法は、眼への、好ましくは網膜色素上皮細胞及び／又はブルッフ膜を本発明の化合物の標的とする、リポソームの使用が挙げられる。例えば、化合物は上記のリポソーム法と組合せてもよく、この化合物／リポソーム複合体は所望の眼組織又は細胞に化合物を輸送するために静脈注射により眼性ＰＣＤ患者に注射される。網膜色素上皮細胞又はブルッフ膜の付近に直接リポソーム複合体を注入することにより、眼性ＰＣＤの若干の形態に対する、複合体のターゲティングが可能となる。具体的な実施態様では、当該化合物は眼内での遅延輸送（例えばＶＩＴＲＡＳＥＲＴ又はＥＮＶＩＳＩＯＮ）を介して投与される。具体的な実施態様では、当該化合物を、後部結膜下注入によって輸送する。他の具体的な実施態様では、本発明の組成物を含有するミクロエマルジョン粒子は、ブルッフ膜、網膜色素上皮細胞又はその両方からの脂質取り込みを通じて眼組織に輸送される。ナノ粒子は、血清半減期が長い、封入された薬剤の効能を高めることが知られているコロイド担体システムである。ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡｓ）ナノ粒子は、現在臨床的に開発されているポリマー性コロイド薬剤輸送システムであり、Ｓｔｅｌｌａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２０００．８９：ｐ．１４５２−１４６４；Ｂｒｉｇｇｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２００１．２１４：ｐ．３７−４２；Ｃａｌｖｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２００１．１８：ｐ．１１５７−１１６６及びＬｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２００１．２４：ｐ．６６２−６６５に記載されている。生分解可能なポリ（ヒドロキシル酸）、例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）とポリ（ラクチックコグリコリド）（ＰＬＧＡ）の共重合体が生物学的若しくは医学的用途で広範囲に用いられ、臨床応用におけるＦＤＡ認可を受けている。更に、ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子は、（ｉ）封入される薬剤が、全担体システムの相当に高重量フラクション（ローディング）を含んでなること、（ｉｉ）薬剤の量が、カプセル化プロセスの第一段階において使用したうちの相当に高いレベルで最終担体に組み込まれる（高い取り込み効率）こと、（ｉｉｉ）担体が凍結乾燥可能で、溶液中で凝集を起こさずに再構成される能力を有すること、（ｉｖ）担体が生分解可能であること、（ｖ）担体システムが小型であること、（ｖｉ）担体が粒子の安定性を強化することなど、多くの望ましい担体としての機能を有する。
【０１１３】
ナノ粒子は、公知技術のいかなる生分解可能なシェルを使用して完全に合成される。一実施形態では、ポリマー、例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）又はポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が用いられる。かかるポリマーは、生物学的適合性及び生分解性を有し、望ましくはナノ粒子の光化学物質有効性及び循環寿命を増加させるために修飾される。一実施形態では、ポリマーの末端のカルボン酸基（ＣＯＯＨ）を修飾し、粒子の負電荷を増加させ、それにより負に荷電した核酸アプタマーとの相互作用を制限する。ナノ粒子はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によっても修飾され、同様に循環の際の粒子の半減期及び安定性を増加させる。あるいは、ＣＯＯＨ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルに変換させ、アミン修飾アプタマーとの共有結合コンジュゲーションを行わせてもよい。
【０１１４】
本発明の組成物及び方法に有用な生物学的適合性のポリマーとしては、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、酸化ポリアルキレン、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びその共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル及びメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（エチルメタクリル酸）、ポリ（ブチルメタクリル酸）ポリ（イソブチルメタクリル酸）、ポリ（ヘキシルメタクリル酸）、ポリ（イソデシルメタクリル酸）、ポリ（ラウリルメタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（メチルアクリレート）ポリ（イソプロピルアクリル酸）、ポリ（イソブチルアクリル酸）、ポリ（オクタデシルアクリル酸）、ポリエチレン、ポリプロピレンポリ（エチレングリコール）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレンテレフタル酸）ポリビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニルポリスチレン、ポリビニルピロリドン、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（エチルメタクリル酸）、ポリ（ブチルメタクリル酸）、ポリ（イソブチルメタクリル酸）、ポリ（ヘキシルメタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（ラウリルメタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリル酸）、ポリ（イソブチルアクリル酸）、ポリ（オクタデシルアクリル酸）及びこれらのいずれかの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、本発明のナノ粒子はＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーを含有する。
【０１１５】
本発明の組成物は、局所的に輸送されてもよい。局所輸送の場合、眼輸送において承認されるいかなる薬学的に許容できる賦形剤中に組成物を添加してもよい。好ましくは、組成物は目への点眼の形で輸送される。若干の用途では、組成物の輸送は、角膜を経由して目の内部に化合物を拡散させることにより行う。
【０１１６】
当業者であれば、眼性ＰＣＤの治療に本発明の化合物を使用する場合の最高の治療計画を容易に決定できると認識する。これは実験を行う程のことではなく、むしろ最適化の問題であり、医療現場において日常的に行われることである。ヌードマウスのインビボ試験により、投与量及び輸送療法を最適化するための治療開始の時期が明らかにされる。注入の頻度は、マウスによる試験の結果を踏まえ、最初は週一度である。しかしながら、この頻度は、特定の患者の最初の臨床試験及びニーズを踏まえて、毎日〜２週間に一度〜１ヶ月に一度の頻度で適宜調節できる。
【０１１７】
本発明の組成物（オートファジーエンハンサー、ｍＴＯＲ阻害剤（例えばラパマイシン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＦＴＩ−２７７）））のヒトへの投与量は、マウスで使用する化合物量から推定することにより容易に決定できる。すなわち当業者であれば、動物モデルと比較してヒトの投与量を適宜修正することは公知技術であり、ルーチンワークであると認識する。具体的な実施態様では、投薬量は約１ｍｇ化合物／Ｋｇ体重〜約５０００ｍｇ化合物／Ｋｇ体重の間、又は約５ｍｇ／Ｋｇ体重〜約４０００ｍｇ／Ｋｇ体重、又は約１０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約３０００ｍｇ／Ｋｇ体重、又は約５０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約２０００ｍｇ／Ｋｇ体重、又は約１００ｍｇ／Ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／Ｋｇ体重、又は約１５０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／Ｋｇ体重などの範囲で調節できる。他の実施態様では、この投与量は例えば１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｍｇ／Ｋｇ体重であってもよい。他の実施態様では、高い投与量を使用することもあり、かかる投与量としては約５ｍｇ化合物／Ｋｇ体重〜２０ｍｇ化合物／Ｋｇ体重の範囲であってもよい。他の実施態様では、投与量は８、１０、１２、１４、１６若しくは１８ｍｇ／Ｋｇ体重であってもよい。ラパマイシンが使用される場合、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ又は２５ｍｇ／日の投与量を採用してもよい。もちろん、この投与量は上方若しくは下方へ調整でき、特定の患者の最初の臨床試験の結果及びニーズに応じて、適宜治療プロトコルに従って行うことができる。
【０１１８】
スクリーニングアッセイ
本願明細書に述べられるように、ミスフォールディングタンパク質によって細胞の通常の生物学的機能が妨げられ、ＰＣＤが生じる。多くの場合、タンパク質凝集体中のミスフォールディングタンパク質の蓄積は細胞傷害及び細胞毒性を生じさせる。有用な化合物はかかるタンパク質の分解を強化し、それにより細胞毒性を改善する。多くの方法を利用し、かかる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを行ってもよい。１つの方法としては、野生型タンパク質形態をとれない変異体タンパク質を細胞で発現（インヴィトロ又はインビボ）させ、細胞と候補化合物を接触させ、オートファジーに対する化合物の効果を、従来技術において公知若しくは本願明細書に記載されている任意の方法を使用してアッセイすることにより行う。オートファジー強化化合物は、任意の標準的方法（例えば免疫測定法）を使用して、ミスフォールドタンパク質のレベルの減少を測定することにより、細胞毒性の減少を測定することにより、自食胞の存在下でオートファジーマーカー（例えば非リン酸化されたｍＴＯＲ又はＳ６キナーゼ）の中のレベルの増加を測定することにより同定される。化合物と接触しなかったコントロール細胞と比較して、接触させた細胞に存在するミスフォールディングタンパク質の量を減少させる化合物は、本発明の方法において有用であるとみなされる。ミスフォールドタンパク質の量の減少は、例えば、細胞内タンパク質凝集の減少、細胞毒性の減少、又は前記タンパク質のレベルの減少を測定することによってアッセイすることができる。好ましくは、ミスフォールドタンパク質は選択的に分解される。関連する方法においで、当該スクリーンはラパマイシン、ＦＴＩ−２７７、１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又はそのアナログ若しくは誘導体の存在下で実施する。有用な化合物は、少なくとも１０％、１５％又は２０％、又は好ましくは２５％、５０％若しくは７５％、又は最も好ましくは少なくとも１００％、２００％、３００％又は４００％の割合でミスフォールディングタンパク質の量を減少させる。
【０１１９】
必要に応じて、同定された化合物の有効性をＰＣＤを有する動物モデル（例えば色素性網膜炎、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌（例えばｐ５３突然変異関連の癌）及びプリオン関連の障害（例えばジェイコブ−クロイツフェルト疾患）の動物モデル）を用いてアッセイしてもよい。
【０１２０】
ラパマイシン活性のエンハンサーのスクリーニング
本発明はＰＣＤの治療のためのオートファジー強化方法に関する。ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７の生物学的活性を強化する化合物は、ミスフォールディングタンパク質の分解を強化すると考えられる。したがって、ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７の生物学的効果を強化するとして同定された化合物は本発明の方法に有用である。一実施形態では、ラパマイシンの生物学的活性を強化する小分子は、酵母細胞の小分子標的の識別ストラテジーを使用して確認される。ラパマイシンは、野生型酵母細胞の成長を阻害する。酵母細胞増殖に対する抑制効果を強化する化合物は、ルーチン的な手法（例えば遺伝子の化学修飾スクリーニング）を使用して確認できる。かかるスクリーニング法は従来技術において公知であり、Ｈｕａｎｇら、ＰＮＡＳ １０１：１６５９４−１６５９９，２００４記載されている。ラパマイシン処理は栄養飢餓反応の状態を誘導し、しばしば成長抑制をもたらす。遺伝子の化学修飾を使用して、酵母菌サッカロミセスセレビジエのラパマイシン効果を増強（例えば少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％又は９５％増加）する、小分子ラパマイシンエンハンサー（ＳＭＥＲｓ）をスクリーニングする。ビオチン化されたＳＭＥＲｓを有するプロテオームチップを徹底的に解析することにより、ラパマイシンの細胞内での活性を修飾する推定の細胞内目標タンパク質が同定される。一実施形態では、ラパマイシンを候補化合物の有無において酵母細胞の培養培地に添加する。酵母細胞を培養液中に維持し、酵母細胞の増殖を監視する（例えば吸光度を使用）。ラパマイシンとの組合せで酵母細胞増殖を減少させる化合物をＳＭＥＲと同定する。かかる化合物は、オートファジー強化においてそれ単独で、又はラパマイシンと組み合わせるのが有用であると考えられる。必要に応じて、オートファジーへのＳＭＥＲの効果を、本願明細書（例えばオートファジーマーカーの増加、オートファジー小嚢の増加、ミスフォールドタンパク質の分解強化）に記載されているか又は従来技術において公知の任意の方法を使用してアッセイしてもよい。
【０１２１】
試験化合物及び抽出
一般に、ミスフォールディングタンパク質の量を減少させ、又はかかるタンパク質の細胞における選択的な分解を増加させることを可能にする化合物は、天然若しくは合成（又は半合成）抽出物の大規模なライブラリー、又は公知技術の方法による化学ライブラリーから同定する。創薬及び医薬開発の分野における当業者であれば、試験抽出物若しくは化合物の正確な供給源は、本発明の１つ以上のスクリーニング方法においてそれ程重要ではないと理解する。したがって、実質的に全ての化学抽出物又は化合物を、本願明細書に記載の方法を使用してスクリーニングできる。かかる抽出物又は化合物の例としては、植物、菌類、原核生物若しくは動物細胞からの抽出物、培養液及び合成化合物質、並びに既存の化合物の修飾物が挙げられるが、これらに限定されない。多くの方法を利用して、いかなる数の化合物のランダム若しくは誘導された合成物（例えば半合成又は完全合成）を生成でき、それには糖質、脂質、ペプチド及び核酸ベースの化合物が挙げられるがこれに限定されない。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（メリマック、Ｎ．Ｈ．）及びＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン）から市販されている。あるいは、細菌、菌類、植物及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが多くの供給源から市販されており、例えばＢｉｏｔｉｃｓ社（サセックス、英国）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ、英国）、Ｈａｒｂｅｒ Ｂｒａｎｃｈ Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（フィートピアス、Ｆｌａ）及びＰｈａｒｍａＭａｒ ＵＳＡ（ケンブリッジ、マサチューセッツ）が挙げられる。更に、標準的な抽出及び分画法によって、天然及び合成的に生成されたライブラリーを、必要に応じて、従来技術において公知の方法に従って作成してもよい。更に、必要に応じていかなるライブラリー又は化合物も、標準的な化学的、物理的、生化学方法を使用して直ちに修飾できる。
【０１２２】
更に、創薬若しくは医薬開発の当業者であれば、容易に既知物質同定方法（例えば、分類学上の同定、生物学的同定及び化学的同定、又はそれらのあらゆる組み合わせ）、又はミスフォールドタンパク質の修正においてそれらの活性が公知の同定物又は既知の材料の繰り返しの除去方法を、必要に応じて使用する必要がある
【０１２３】
粗抽出物がミスフォールドタンパク質の形態を修正することがわかれば、陽性のリード抽出物を更に分画することにより、観察された効果をもたらす化学成分を単離することが必要となる。すなわち、抽出、分画及び精製プロセスの課題は、粗抽出物中における化学物質の慎重な解析及び同定であり、それにより正しくフォールディングされたタンパク質の収率が上昇する。かかる不均一な抽出物の分画及び精製方法は、従来技術において周知である。必要に応じて、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集に関連するいかなる病理の治療に有用な薬剤であると示される化合物を、公知技術の方法に従って化学的に修飾してもよい。
【０１２４】
併用療法
ＰＣＤ（色素性網膜炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びプリオン関連の障害（例えばジェイコブ−クロイツフェルト疾患））の治療に有用な本発明の組成物は、必要に応じて、公知のいかなる標準的な治療方法との組合せで投与されてもよい。色素性網膜炎の場合、標準的な治療方法としてはビタミンＡサプリメントの使用が挙げられる。パーキンソン病の場合、標準的な治療としては、レボドパ／カルビドパ、アマンタジン、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アポモルヒネ、ベンセラジド、リスライド、メルレルジン、リスリド、レルゴトリル、メマンチン、メタエルゴリン、ピジベジル、チラミン、チロシン、フェニルアラニン、ブロモクリプチンメシラート、ペルゴリドメシラートなどのドーパミン受容体アゴニストの１つ以上の投与が挙げられ、他の標準的治療方法としては、抗ヒスタミン剤、抗うつ薬、ドーパミンアゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害薬の使用が挙げられる。ハンチントン舞踏病の場合、標準的治療方法としてはハロペリドール、フェノチアジン、レセルピン、テトラベナジン、アマンタジン及びコエンザイムＱ１０のうちの１つ以上の投与が挙げられる。アルツハイマー病の場合、標準的治療方法としては、ドネペジル（アリセプト）、トリバスチグミン（エクセロン）、ガランタミン（ラザジン）及びタクリン（コグネックス）のうちの１つ以上の投与が挙げられる。腎生成尿崩症の場合、標準的な治療方法としては、クロロチアジド／ヒドロクロロチアジド、アミロライド及びインドメタシンのうちの１つ以上の投与が挙げられる。嚢胞性線維症の場合、標準的な治療方法としては、粘液溶解剤（例えばドルナーゼα）、気管支拡張剤（例えばアルブテロール）及び感染症治療用の抗生物質のうちの１つ以上の投与が挙げられる。癌の場合、標準的治療方法としては、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルフォンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルヴィン−カロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、ストラムスチンリン酸塩、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン及びビンフルニンのうちの１つ以上の投与が挙げられる。
【０１２５】
キット
本発明は、ＰＣＤ若しくはその徴候の治療若しくは予防用のキットを提供する。一実施形態では、当該キットは、ラパマイシン又はそのアナログの有効量を含有する製薬パックを含んでなる。他の実施態様では、当該キットはラパマイシン及び１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールを含んでなる。他の実施形態では、当該キットはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＦＴＩ−２７７）の有効量を含んでなる。好ましくは、組成物は単位用量形態で調製される。幾つかの実施形態では、当該キットは、治療的もしくは予防的な組成物を含有させる無菌容器を含んでなり、かかる容器は、従来技術において公知のボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック又は他の適切な容器の形態であってもよい。かかる容器は、薬剤の保持に適するプラスチック、ガラス、ラミネートペーパー、金属箔又は他の材料で作製してもよい。
【０１２６】
必要に応じて、本発明の組成物又はそれらの組み合わせと、ＰＣＤに罹患若しくは罹患するおそれのある患者にそれらを投与する際の説明書とを併せて包含させてもよい。説明書には通常、ＰＣＤの治療若しくは予防用の化合物の使用に関する情報が記載されている。他の実施態様では、説明書には、少なくとも化合物又は化合物の組合せの説明、ＰＣＤ又はその徴候の治療のための投与計画及び投与方法、注意事項、警告事項、指示、禁止事項、過剰投与に関する情報、逆作用、動物における薬理学、臨床研究結果、及び／又は参照のうちの１つ以上が記載されている。説明書は、容器（存在する場合）に、又は容器に貼り付けるラベルに直接印刷してもよく、又はシート、パンフレット、カード又はフォルダとして容器に梱包してもよい。
【０１２７】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。当業者に理解されるように、下で提供される具体的な構成は多様に変化させることもできるが、それらは化合物又はその組み合わせによる重要な特性を維持しつつ、上記の発明と整合する態様であることが条件となる。
【実施例】
【０１２８】
色素性網膜炎（ＲＰ）は、ｒｏｄ光受容体を死に至らしめる遺伝性網膜障害の異質なグループを含むＰＣＤである。光受容体の死因は、色素性網膜炎に罹患する患者の周辺視野の連続的な損失であるため、夜盲及びそれに続くトンネル視に至る。常染色体優性色素性網膜炎（ＡＤＲＰ）患者の２０〜２５％にはロドプシン遺伝子の突然変異があり、最も一般的な突然変異がＰ２３Ｈである。Ｐ２３Ｈ突然変異は、１１−シス−レチナールとの結合ができないミスフォールドオプシンタンパク質をもたらす。ミスフォールドＰ２３Ｈタンパク質は細胞中で保持され、凝集体を形成する（Ｓａｌｉｂａら、２００２．ＪＣＳ １１５：２９０７−２９１８；Ｉｌｌｉｎｇら、２００２．ＪＢＣ ２７７：３４１５０−３４１６０）。この凝集の挙動により、タンパク質高次構造的な障害（ＰＣＤ）として、Ｐ２３Ｈを含む若干のＲＰ突然変異が分類される。
【０１２９】
嚢胞性線維症の膜内外コンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子の欠陥は嚢胞性線維症を引き起こし、それもまた他のＰＣＤである。嚢胞性線維症は白人において最も一般的な致死遺伝病であり、米国には約３００００人の嚢胞性線維症患者が存在する。ＣＦＴＲはＣｌ⁻チャネルを形成し、それは多くの器官（腸、膵臓、肺、汗腺及び腎臓など）の上皮Ｃｌ⁻輸送システムにおける必須の構成要素である。腸のＣＦ分泌腺において、ＣＦは側底膜上のＮａ^＋−Ｋ^＋−２ＣＦによる共同輸送により細胞内に取り込まれ、頂側膜上のＣＦＴＲを通って放出され、水がそれに続いて浸透する。ＣＦＴＲをコードする遺伝子の欠陥によるそのＣＦ輸送能力低下、又は細胞表面での発現レベルの低下により、嚢胞性線維症が生じる。塩化物イオン輸送のこの欠陥は、気道分泌物の不適切なクリアランス、及び細菌感染に対する感染性の増加に至る。嚢胞性線維症はマルチシステムの障害であるが、呼吸不全が主要な死因として依然として存在する。
【０１３０】
以下の実施例は、変異体オプシン又はＣＦＴＲタンパク質の分解を特異的に強化する化合物の同定のための、変異体タンパク質の使用を例示するが、本発明はこれらに限定されない。細胞におけるミスフォールディングオプシン又はミスフォールディングＣＦＴＲの選択的分解（例えばオートファジー分解）を強化するのに有用であると同定された化合物は、色素性網膜炎又は嚢胞性線維症の治療にそれぞれ有用である。かかる化合物はあらゆるミスフォールディングタンパク質の分解も強化すると考えられ、通常、実質的に全てのタンパク質高次構造的な障害の治療に有用であると考えられる。以下の実験の実施に有用な方法はＮｏｏｒｗｅｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７９：１６２７８−１６２８４（２００４）に記載され、全開示内容が本願明細書に援用される。
【０１３１】
実施例１：ミスフォールディングタンパク質の分解のオートファジー誘導結果
Ｐ２３Ｈ若しくは野生型オプシンを発現するＨＥＫ２９３テトラサイクリン誘導可能な安定細胞株を使用して、アミノ酸飢餓又はラパマイシン曝露によりマクロオートファジーを誘導した。図１Ａは、オートファジーを、アミノ酸飢餓のみ（レーン４〜６）、又はラパマイシン添加（レーン７〜９）、アミノ酸飢餓とラパマイシン曝露の組合せ（レーン１０〜１２）により誘発された野生型オプシンの、イムノブロットによる分解プロフィールを示す。図１Ｂのグラフは、野生型オプシンの比較量を時間経過で比較した実験結果であり、野生型オプシンのレベルがオートファジー誘導後の１２時間にわたり基本的に不変であったことを証明するものである。対照的に、オートファジーがこれらの方法（図１Ｃ）のいずれかによって細胞において誘発されるとき、Ｐ２３Ｈオプシンの量は急速に減少した。Ｐ２３Ｈオプシン（図１Ｄ）の分解プロフィールは、オートファジーがアミノ酸飢餓により誘発されるとき、３３％のミスフォールディングオプシンが１２時間（図１Ｄ、正方形）以内に分解したことを示す。オートファジーがラパマイシンにより誘発されるとき、４６％のタンパク質が６時間の処理（図１Ｄ、三角形）で分解した。アミノ酸飢餓とラパマイシン処理（図１Ｄ、円）を組み合わせたとき、分解は更に強化され、ほぼ５２％のミスフォールディングオプシンは２時間以内に分解し、８１％が１２時間後に分解した。
【０１３２】
実施例２：オートファジーはミスフォールディングタンパク質を特異的に分解する
この効果がプロテアソームの抑制により調節されるか否か、又はオートファジーのみにより媒介されるか否かを解析するため、オートファジーが誘発された細胞において、プロテアソーム阻害剤又はオートファジー阻害剤の存在下でＰ２３Ｈ分解が生じるか否かを解析した。３−メチルアデニン、オートファジー阻害剤及びＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）を、オートファジー誘導時に細胞培養培地に添加した。図１Ｆは、アミノ酸飢餓細胞において３−ＭＡがＰ２３Ｈの分解を阻害することを示す。図１Ｇは、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２がＰ２３Ｈオプシン分解（図１Ｄ）に影響を及ぼさなかったことを示す。これらの試験は、オートファジーがミスフォールディングされたＰ２３Ｈオプシンを特異的に分解することを示す。
【０１３３】
実施例３：ラパマイシンはミスフォールディングタンパク質のオートファジーを強化する
過去の試験では、１１−シスレチナールはＰ２３Ｈオプシンのフォールディング及び安定化を補助する薬理学的シャペロンとして機能することが示されている。１１−シスレチナールの投与により、大部分のＰ２３Ｈタンパク質プールが細胞表面に至り、１１−シス−レチナールと結合してロドプシンを形成する。１１−シスレチナールをオートファジー誘発時に投与した場合、Ｐ２３Ｈ分解のレベルは変化しなかった（図１Ｅ、レーン４−６）。にもかかわらず、眼性ＰＣＤの治療のための、ラパマイシンとの組合せによる１１−シス−レチナールの投与が臨床効果を強化するということは、１１−シス−レチナールが正しくフォールディングされたタンパク質の濃度を上昇さ、ラパマイシンがあらゆる残留ミスフォールディングタンパク質の分解を強化するためであると考えられる。
【０１３４】
培地中のロドプシン濃度は、アミノ酸補充の有無にかかわらず同様であった（図１Ｅ、レーン１−３、レーン４−６）。アミノ酸飢餓の間、１１−シスレチナールで処理した細胞のＰ２３Ｈタンパク質の分解プロフィールを、野生型オプシン発現細胞又は１１−シスレチナールに曝露しなかったＰ２３Ｈオプシン発現細胞の分解プロフィールと比較した。１１−シス−レチナールの存在下でのＰ２３Ｈタンパク質分解は、野生型オプシン発現細胞又は１１−シスレチナール非存在下のＰ２３Ｈタンパク質発現細胞と比較し、中間の分解プロフィールを示した。
【０１３５】
興味深いことに、ラパマイシンのみによる処理は、それのみか、又は細胞へのアミノ酸飢餓との組合せで投与したかに関わらず、Ｐ２３Ｈロドプシンの急速な分解を誘発した（図１Ｅ、レーン７−９、１０−１２）。１１−シスレチナールの存在下で、Ｐ２３Ｈの分解プロフィールは、通常の条件下で培養した細胞（図１Ｆ、ダイヤモンド）、又はアミノ酸飢餓培地の場合と同様であった（図１Ｆ、正方形）。ラパマイシンが１１−シス−レチナール非存在下で投与した場合、分解の強化が観察された（図１Ｆ、三角形）。Ｐ２３Ｈタンパク質の約３３％が１２時間以内に分解した。ラパマイシンをアミノ酸飢餓細胞に投与した場合、ロドプシン分解の更なる強化は観察されなかった。事実、アミノ酸飢餓細胞に対するラパマイシンの投与は、ラパマイシン処理のみの場合の効果と類似していた。ほぼ３１％のＰ２３Ｈタンパク質が１２時間以内に分解した（図１Ｆ、円）。すなわち、ラパマイシンにより選択的に誘発されるオートファジーは、１１−シスレチナールの存在下でＰ２３Ｈタンパク質分解を強化した。
【０１３６】
実施例４：オートファジー誘導はｍＴＯＲリン酸化特性の変化を誘発する
ｍＴＯＲは哺乳類のラパマイシン標的であり、オートファジー細胞においてｍＴＯＲレベルは特徴的に減少する。オートファジーが上記の方法により誘発されることを確認するために、アミノ酸飢餓細胞及びラパマイシン曝露細胞におけるｍＴＯＲリン酸化を解析した。予想通り、リン酸化ｍＴＯＲの量の減少が、アミノ酸飢餓細胞及びラパマイシン曝露細胞に対するオートファジー誘導の後で観察された。オートファジー誘導は、１１−シス−レチナール投与された細胞と同様に、野生型又はＰ２３Ｈオプシンを発現する細胞において観察された。このリン酸化の増加はｍＴＯＲに特異的であった。その理由は、フォールディングしないタンパク質への応答（ＵＰＲ）によって上方制御されるシャペロンであるＢｉｐ及びカルネキシン、及び熱ショックへの応答（ＨＳＲ）によって上方制御される細胞質シャペロンＨｓｐ７０の細胞レベルが、オートファジー条件下で不変であったためである。これらのシャペロンの量は、アミノ酸飢餓又はラパマイシン処理により誘発されるオートファジー後の一定時間において維持された（図１Ｈ、１Ｉ）。
【０１３７】
オートファジーがミスフォールディングタンパク質の一般的な分解機構であるか否かを解析するため、変異型の嚢胞性線維症の膜内外コンダクタンス調節装置（ＣＦＴＲ）タンパク質のオートファジー分解を解析した。ＣＦＴＲは、上皮細胞の頂端膜で発現するｃＡＭＰ活性化型塩素イオンチャネルである。ＣＦＴＲはＰ２３Ｈオプシンと同様に多領域にわたる膜タンパク質である。かかる多領域タンパク質は多くのαへリックス膜貫通部分を有する。ＣＦＴＲの突然変異により、それが機能する原形質膜における、その形成、プロセシング及び配置に影響が及ぶ。
【０１３８】
野生型ＣＦＴＲ（図２Ａ）及び変異体ＣＦＴＲΔＦ５０８（図２Ｃ）タンパク質を、ＢＨＫ安定細胞系において発現させた。オートファジーは、アミノ酸飢餓、ラパマイシン処理又はラパマイシン処理及びアミノ酸飢餓の組合せを用いて、野生型又は変異体ＣＦＴＲタンパク質発現細胞において誘発させた（図２Ａ）。オートファジー誘導が野生型ＣＦＴＲタンパク質濃度（図２Ｂ）に影響を及ぼさない一方で、ΔＦ５０８タンパク質（図２Ｄ）は、アミノ酸飢餓、ラパマイシン処理又はその両方（図２Ｃ）によって、オートファジー誘導に応答して急速な分解を受けた。分解プロフィールではアミノ酸飢餓が１２時間（図２Ｄ、三角形）以内にΔＦ５０８タンパク質の約３４％を分解することを示し、その一方で、ラパマイシン処理では５０％のタンパク質が１２時間（図２Ｄ、正方形）後に分解された。アミノ酸飢餓がラパマイシン処理と組み合わされるときに分解がより顕著であった。変異体タンパク質の中の約７５％が６時間以内に分解し、８０％が処理の１２時間後に分解した（図２Ｄ、円）。これらの観察から、オートファジーが選択的にミスフォールディングΔＦ５０８タンパク質を分解することが示唆される。ｍＴＯＲリン酸化は、野生型若しくは変異型ＣＦＴＲタンパク質発現細胞のオートファジー誘導後に減少した。シャペロンであるＢｉｐ、カルネキシン及びｈｓｐ７０のレベルの違いは観察されなかった。図２Ｅ及び２ＦはｍＴＯＲ脱リン酸化（図２Ｅ）、並びにラパマイシンの有無による、通常の培地又はアミノ酸飢餓培地で培養した細胞中のカルネキシン、カルレティキュリン、Ｈｓｐ７０又はＢｉｐタンパク質発現を示すイムノブロットである。
【０１３９】
実施例５：オートファジー誘導後にミスフォールディングタンパク質と共局在化するオートファジーマーカー
オートファジー誘導は、電子顕微鏡検査を使用して細胞の自食胞（ＡＶｓ）の存在を確認することによってモニターできる。通常の培地においてＰ２３Ｈ細胞は若干のＡＶｓを含むが、細胞をアミノ酸飢餓培地でインキュベートした場合、かかる自食胞の数が著しく増加する（図５）。
【０１４０】
ミスフォールディングタンパク質が自食胞マーカーと共局在化するか否かを解析するため、野生型オプシン発現細胞（図３Ａ）若しくは変異体Ｐ２３Ｈオプシン（図３Ｂ）発現細胞を、Ａｔｇ７、ＬＣ３及びＬａｍｐ１オートファジーマーカーに関して染色した。細胞を、オートファジー誘導後にオプシン特異的、及び自食胞マーカー特異的な抗体とインキュベートした。野生型タンパク質は、いかなる自食胞マーカー（図３Ａ）とも共局在化しなかった。野生型オプシンタンパク質は細胞膜に存在し、その一方でＰ２３Ｈは細胞内凝集体を形成した。同じオートファジーマーカーを、野生型（図４Ａ）又は変異型ΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパク質（図４Ｂ）発現ＢＨＫ細胞において解析した。これらの細胞において、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパク質は目視できる程の凝集体が形成されなかった。野生型ＣＦＴＲタンパク質は細胞内と同様に細胞膜でも観察され（図４Ａ）、その一方でΔＦ５０８はＥＲ（図４Ｂ）において保持された。図５Ａ〜５Ｃは、Ｐ２３Ｈ凝集、リソソーム及びオートファジー細胞を示す電子顕微鏡写真である。
【０１４１】
Ａｔｇ７による免疫蛍光染色による斑点状の染色が示され、両方の変異体タンパク質が共局在化していることを示す。Ｐ２３ＨによるＡｔｇ７の共局在化を図３Ｂに示し、ΔＦ５０８による共局在化を図４Ｂに示す。Ａｔｇ８染色によっても、両方の変異体タンパク質による共局在化が示された。Ａｔｇ８では特徴的な斑状の染色が示され、Ｐ２３Ｈミスフォールディングタンパク質凝集体との共局在化を示すものである（図３Ｂ）。Ａｔｇ８染色はまた、ＥＲにおけるΔＦ５０８タンパク質の保持を示す（図４Ｂ）。これらの観察は更に、変異型多領域タンパク質（例えばＰ３２Ｈ及びΔＦ５０８）の分解におけるオートファジーの役割を裏付ける。
【０１４２】
要約すると、オートファジー経路は、野生型タンパク質にはごくわずかな影響しか及ぼさないが、ミスフォールディングした多領域タンパク質（例えばＰ２３Ｈ及びΔＦ５０８）を特異的に分解する。この結果は変異体タンパク質の発現に用いが細胞系の選択には無関係であったが、その理由としては、野生型及び変異型オプシンタンパク質はヒト胚腎臓細胞系において発現されるが、野生型及び変異型ＣＦＴＲタンパク質は乳児ハムスター腎臓細胞系において発現されることが挙げられる。
【０１４３】
電子顕微鏡検査を使用して自食胞を観察した。二重膜自食胞数の増加が、Ｐ２３Ｈオプシン発現細胞において観察された。オートファジー誘導後に、これらの細胞中にＰ２３Ｈオプシンの大型の凝集体又は小型の散乱した凝集体が含まれていた。暗い酸性ホスファターゼ染色されたリソソームが、ＡＶ及び凝集体に関連して観察された。１つの特定の理論に拘束されないが、これは、ミスフォールディングオプシン分解に対するリソソーム経路の役割を示唆するものと考えられる。自食胞マーカーは、ミスフォールディングＰ２３Ｈオプシン及びΔＦ５０８タンパク質と共局在化する。Ａｔｇ７は、ＡＶｓの形成に必要な、Ｅ１ユビキチン活性化酵素に類似するタンパク質をコードする、鍵となるオートファジー遺伝子である。Ａｔｇ７は、Ａｔｇ８（微小管関連タンパク質軽鎖３）の脂質へのコンジュゲートを促進し、ＡＶｓの膜を分離させ、それらの形成を促進する。Ａｔｇ８は初期及び後期の自食胞の膜に存在する。Ｐ２３Ｈ及びΔＦ５０８タンパク質と共局在化するＡｔｇ７及びＡｔｇ８の別々の染色により、ミスフォールディングタンパク質の分解におけるＡＶｓの役割が示唆される。
【０１４４】
実施例６：ラパマイシン処理は、色素性網膜炎の網膜機能を強化する
Ｐ２３Ｈ突然変異を有する変異型マウスオプシンを発現するトランスジェニックマウスは、色素性網膜炎患者において観察される病態生理学的変化に類似する急速な漸進性の光受容体の分解を受ける。Ｐ２３Ｈ異型の変異体マウスによるインビボ試験では、ラパマイシン処理により３ヵ月（図６）にわたり網膜機能がレスキューされることが示された。
【０１４５】
実施例７：ラパマイシンは黄斑変性の網膜機能を強化する
リポフスシン成分として網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）に蓄積するビスレチノイドフルオロフォアは、劣性Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患（黄斑変性の初期の形態）におけるＲＰＥ細胞の損失の原因となると考えられ、加齢に関連する黄斑変性の病因に関係するとも考えられている。黄斑変性のマウスモデルにおけるインビボ試験は、ラパマイシン処理が、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患に関連する１つの不完全なＡＢＣＲ遺伝子のコピーを有するＡｂｃｒ異型の変異体マウスの網膜機能をレスキューすることを示す（図７）。ＡＢＣＲ遺伝子は端タンパク質（ＲｍＰ）（ディスク状の光受容器外側部分の端において発現するＡＴＰ結合カセット輸送体）をコードする。
【０１４６】
実施例８：ＦＴＩ２７７はＰ２３Ｈロドプシンの急速な分解を誘発した
ファネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤のＦＴＩ２７７、メチル｛Ｎ−［２−フェニル−４−Ｎ［２（Ｒ）−アミノ−３−メルカプトプロピルアミノ］ベンゾイル］｝−メチオニン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）による処理により、ラパマイシンと同様のＰ２３Ｈロドプシンの急速な分解が誘導された（図８）。ラパマイシンと同様に、ＦＴＩ２７７がオートファジーを強化し、ＦＴＩ２７７がタンパク質形態疾患の治療に有用であることが示唆される。
【０１４７】
実施例９：ＦＴＩ−２７７はＰ２３Ｈオプシンの分解を刺激する
変異体オプシンのレベルに対するＦＴＩ−２７７の効果を試験するため、Ｐ２３Ｈオプシン発現ＨＥＫ２９３細胞を、異なる濃度のＦＴＩ−２７７（１、５、１０及び５０μＭ）でインキュベートした。５０μＭのＰ２３Ｈオプシンの時間経過に伴う分解が観察された。ＦＴＩ−２７７の効果は、１０μＭ（図９Ａ）では検出されなかった。ラパマイシンと比較し、７０％のＰ２３Ｈオプシンがラパマイシン処理の１２時間後に分解し、その一方で、ＦＴＩ−２７７では同じ時間の経過において、Ｐ２３Ｈオプシンの５０％の分解が観察された（図９Ｂ）。
【０１４８】
実施例１０：ＦＴＩ−２７７はＵＰＲ／ＨＳＲを誘発しない
ＦＴＩ−２７７処理後の、カルネキシン及びカルレティキュリン、未フォールディングタンパク質への応答（ＵＰＲ）と関連するＥＲシャペロンのレベル、又は熱ショック反応（ＨＳＲ）と関連する細胞質シャペロンであるＨｓｐ７０及びＨｓｐ９０のレベルを解析した。ＦＴＩ−２７７は２つの反応のどちらのレベルにも影響を及ぼさず、Ｐ２３ＨオプシンのＦＴＩ−２７７誘発された分解がＵＰＲ及びＨＳＲとは無関係であることが示唆された（図１０）。
【０１４９】
実施例１１：ＦＴＩ−２７７処理はｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋシグナリングをブロックする
ＦＴＩ−２７７はｍＴｏｒ及びＳ６キナーゼのリン酸化を効果的に阻害し、この薬剤がＲｈｅｂ活性を抑制することが予想された（図１１Ａ、Ｂ）。リン酸化されたｍＴＯＲ及びＳ６キナーゼが、アミノ酸及び血清を供給した細胞において観察された。ラパマイシン処理と同様に、ＦＴＩ−２７７はｍＴＯＲの脱リン酸化を誘発し、それはアミノ酸及び血清飢餓（図１１Ａ）との組合せで更に強化された。同様に、Ｓ６キナーゼのリン酸化は、ＦＴＩ−２７７又はラパマイシン（図１１Ｂ）で処理した細胞において激減した。対照的に、ＨＥＫ２９３細胞のＡｋｔリン酸化の刺激はＦＴＩ−２７７処理による影響を受けず、Ｂａｓｓｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，３１１０１−３１１０８（２００５）と同様の、ＭＡＰＫのわずかなリン酸化の増加が観察されたにもかかわらず、Ｒａｓ活性が影響を受けないことを示唆するものであった。
【０１５０】
実施例１２：ＦＴＩ−２７７処理後の、Ｐ２３ＨオプシンのＡｔｇ７及びＡｔｇ８との共局在化
ラパマイシンにより誘発されたＰ２３Ｈオプシンの分解がオートファジーにより媒介された場合には、ＦＴＩ−２７７分解も同様にオートファジーにより媒介されることが示唆される。Ｐ２３Ｈオプシン凝集と、周知の自食胞マーカー、Ａｔｇ７及びＡｔｇ８との関係を、免疫蛍光顕微鏡検査により解析した。これらのマーカーは通常、完全培地（図１２Ａ及び１２Ｂ）で培養した無処理細胞ではＰ２３Ｈオプシンと共に共局在化しない。ＦＴＩ−２７７処理によるＰ２３Ｈオプシンと両方のマーカーの共局在化の劇的な増加が観察された（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。Ｐ２３Ｈオプシン凝集に関連するＡｔｇ７及びＡｔｇ８の局在化を、共焦顕微鏡検査によりより詳細に観察した（図１２Ｃ）。Ａｔｇ７のドットは、Ｐ２３Ｈオプシン凝集と共にクラスターを形成し、またＰ２３Ｈオプシンと共局在化している。同様に、Ｐ２３Ｈオプシン凝集とのＡｔｇ８ドットの共局在化が若干強化され、一方、残りのドットは凝集体の周辺に存在した。凝集体の周辺におけるＡｔｇ７及びＡｔｇ８タンパク質の存在は、Ｐ２３Ｈオプシンの分解におけるオートファジーの役割を裏付けるものである。
【０１５１】
実施例１３：ＦＴＩ−２７７によるオートファジーの誘導
これらの結果は、ＦＴＩ−２７７がオートファジーを活性化させることを示す。そこで、ＦＴＩ−２７７に対するオートファジー応答を、リソトラッカー（ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ）を使用して細胞のリソソーム自食胞の数及びサイズを観察し、解析した。ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７（図１３Ａ）で細胞を処理したときのリソソーム数及びサイズ変化を観察した。次に、電子顕微鏡検査を利用し、Ｐ２３Ｈオプシンを発現する、無処理及びＦＴＩ−２７７処理されたＨＥＫ２９３細胞のオートファジー応答を評価した。リソトラッカーで観察されるように、ＦＴＩ−２７７処理された細胞には、リソソーム酸性ホスファターゼを含有する多くの大型の自食胞が存在した（図１３Ｂ）。更に、これらの自食胞は多くの細胞質凝集体を取り込む途中であるように見えた（図１３Ｂ）。形態を定量化した後、ＦＴＩ−２７７処理された細胞において、無処置の細胞と比較してＡＶｓの数が４〜６倍増加していた（図１３Ｃ）。これらのデータは、ＦＴＩ−２７７がＨＥＫ２９３細胞のオートファジー応答を促進することを示唆する。
【０１５２】
ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＨｕＨ７肝癌細胞（オートファジーマーカー）に対するＦＴＩ−２７７の効果も解析した。Ｆｅｄ細胞において、ＧＦＰ−ＬＣ３は細胞質全体にわたって広く観察された。これらの細胞をＦＴＩ−２７７で処理したとき、多数の構造へのＧＦＰ−ＬＣ３局所化は、その自食胞の凝集及びオートファジーの開始と一致した（図１４）。これらの試験は、ＦＴＩ−２７７で処理した細胞においてオートファジーが劇的に上方制御されることを証明する。Ｐ２３Ｈオプシンを発現するＨＥＫ２９３細胞におけるオートファジーの誘導を、オートファジーをブロックするＰＩ３−キナーゼ阻害剤、３−メチルアデニン（３ＭＡ）を使用して解析した。ＦＴＩ−２７７の存在下での３ＭＡ処理によりオプシンの分解がブロックされた。細胞をＦＴＩ−２７７のみで処理した場合は、この効果は観察されなかった（図１５Ａ）。Ｐ２３Ｈオプシン分解がオートファジーであることを更に裏付けるために、プロテアソーム阻害剤 ＭＧ１３２を使用した。Ｐ２３Ｈオプシン分解はＦＴＩ−２７７のみと同様に、ＦＴＩ−２７７及びＭＧ１３２の存在下で類似の動力学を示し、この経路におけるプロテアソームの分解の役割が制限されたことを示唆する（図１５Ｂ）。
【０１５３】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩｓ）を、Ｒａｓ腫瘍性タンパク質の活性をブロックする態様に設計した。Ｒａｓの活性は、ファルネシル化（ファルネシルイソプレノイド膜アンカーをタンパク質に結合させる翻訳後修飾）に依存する。ファルネシルトランスフェラーゼは、さまざまなタンパク質基質のシステイン残基上へのファルネシル二リン酸からの１５−カーボンイソプレニル脂質の転移を触媒する。
【０１５４】
ファルネシルトランスフェラーゼは、基質のカルボキシル端末ＣＡＡＸボックスを認識する。Ｒｈｅｂはグアニンヌクレオチド結合タンパク質であり、ＧＴＰアーゼでもある。Ｒｈｅｂタンパク質は、ＧＴＰの認識及び加水分解に関係する短いＧ１−Ｇ５ボックス配列を有する（Ｂｏｕｒｎｅら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８，１２５−１３２）。また、Ｒｈｅｂタンパク質はファネシル化に必要とされるＣＡＡＸ（ＣＳＶＭ）モティーフを末端に有する。哺乳動物細胞において、Ｓ６Ｋを活性化させるＲｈｅｂの能力が確認されている。この機能はファルネシル化に依存する。なぜなら、ＣＡＡＸのモティーフを欠くＲｈｅｂ変異体はＳ６Ｋを活性化させることができないからである（Ｃａｓｔｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３２４９３−３２４９６，２００３；Ｔｅｅら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３，１２５９−１２６８，２００３）。更に、ＦＴＩｓ（ＦＴＩ−２７７など）はＲｈｅｂの完全なプレニル化ブロックすることが確認されている（Ｂａｓｓｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，３１１０１−３１１０８，２００５）。Ｒｈｅｂはゲラニルゲラニル化を受けない。ＦＴＩｓの他の標的が、Ｒｈｅｂ以外にも存在する。試験では、ファルネシル化が阻害されるときにそれらがゲラニルゲラニル化を受けるため、Ｋ−Ｒａｓ４Ｂなどのタンパク質がＦＴＩｓに対する抵抗性を有することが示されている。これらの試験は、Ｒｈｅｂが、ファルネシル化の対象となる他のタンパク質よりも、ＦＴＩｓの特異的な標的であることを示唆する。更に、Ａｋｔリン酸化はＦＴＩ−２７７に影響を受けず、ＦＴＩ−２７７がＲａｓ活性に影響を及ぼさないことを示唆するものである。Ｒｈｅｂは、インシュリン／ＴＯＲ／Ｓ６Ｋシグナリング経路の構成要素である（Ｃａｓｔｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、３９９２１−３９９３０、２００３；Ｔａｂａｎｃａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、３９９２１−３９９３０、２００３；Ｔｅｅら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３、１２５９−１２６８ ２４、２００３；Ｉｎｏｋｉら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７、１８２９−１８３４、２００３；Ｇａｒａｍｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １１、１４５７−１４６６、２００３）。本願明細書に記載のように、Ｒｈｅｂの阻害と整合したＦＴＩ−２７７によるｍＴＯＲ及びＳ６Ｋの脱リン酸化が観察された。細胞においてラパマイシンによるオートファジーが誘発されるとき、同様のｍＴＯＲ及びＳ６Ｋのリン酸化の減少が観察された。ｍＴＯＲを阻害する以外にも、これらの結果は、細胞においてオートファジーがＦＴＩ−２７７処理により誘発されうることを示し、それによりｍＴＯＲの上流における更なるＲｈｅｂがブロックされる（図１６）。
【０１５５】
５０μＭのＦＴＩ−２７７によるＰ２３Ｈオプシン発現細胞の処理により、ラパマイシン処理と同様に変異体オプシンの分解が誘発された。自食胞マーカーＡｔｇ７及びＡｔｇ８に対する抗体を使用した免疫蛍光試験により、これらの細胞のオートファジーの誘導が確認された。Ａｔｇ７は、ＡＶｓの形成に必要な、Ｅ１ユビキチン活性化酵素に類似するタンパク質をコードする、鍵となるオートファジー遺伝子である（Ｔａｎｉｄａら、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１７０１−１７０６。Ａｔｇ７は、Ａｔｇ８（微小管関連タンパク質軽鎖３）の脂質へのコンジュゲートを促進し、ＡＶｓの膜を分離させ、それらの形成を促進する（Ｏｈｓｕｍｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２，２１１−２１６，２００１；Ｋａｂｅｙａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｄ．１１７，２８０５−２８１２，２００４）。両方のマーカーは、Ｐ２３Ｈオプシンと共局在化した。更に、ＦＴＩ−２７７で処理したとき、電子顕微鏡検査を使用して超微細構造試験を行った結果、細胞のＡＶｓの発現増加が観察された。若干の顕微鏡写真において、細胞質の凝集体を取り込むＡＶｓも観察された。更に、形態分析により、ＦＴＩ−２７７処理した細胞のＡＶｓの６倍の増加が観察され、すなわちこれらの細胞のオートファジーが確実に誘導されていることが示唆された。
【０１５６】
要約すると、これらのデータは、オートファジー経路が、ラパマイシンによるｍＴＯＲのブロックのみならず、小分子ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＦＴＩ−２７７）を使用した、ｍＴＯＲの上流における構成要素の調節によっても刺激されうることを示唆する。他のＦＴＩｓと同様に、ＦＴＩ−２７７はＲｈｅｂのファルネシル化を減少させ、それによりこのＧタンパク質を不活性化する。これらの試験結果は、様々なタンパク質高次構造的な障害（ＰＣＤｓ）の治療のためのＦＴＩｓの使用可能性を示唆するものである。なぜなら、オートファジーは変異型、凝集タンパク質の分解に関係しており、それらのタンパク質はパーキンソン病（Ｃｕｅｒｖｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１２９２−１２９５，２００４）、ハンチントン舞踏病（Ｒａｖｉｋｕｍａｒら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６，５８５−５９５，２００４）などの様々な神経変性疾患に関係するからである。細胞培養及びマウスモデルにおいて、ハンチントン舞踏病（Ｒａｖｉｋｕｍａｒら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６，５８５−５９５，２００４）及び常染色体優性色素性網膜炎（ＡＤＲＰ）へのオートファジー刺激により、凝集体の蓄積が低下する。また、現在おこなわれている癌の臨床試験（第二相及びＩＩＩ）へのＦＴＩｓの使用により、ヒト及び試験動物に対してこの化合物は毒性を有さないことが保証される。ＦＴＩ薬は、特にオートファジーによるタンパク質凝集体の除去を強化する際の、ラパマイシンに変わる治療手段ともなりうる。
【０１５７】
上記の実験は、以下の材料及び方法を使用して実施した。
【０１５８】
哺乳動物細胞の培養
野生型及びＰ２３Ｈオプシンは、ＨＥＫ２９３テトラサイクリン誘導可能な安定細胞系において発現させた。細胞は、熱で不活性化したウシ胎児血清（シグマ）１０％、抗生物質−抗真菌物質含有溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）、ブラスチシジン（Ｃａｙｌａ、トゥールーズ、フランス）、ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）を含有する高濃度グルコースダルベッコ修飾イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）中で、５．０％のＣＯ_２の存在下、３７℃で培養した。細胞のオプシン合成は、テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の添加により誘導した。安定してＣ末端ＨＡエピトープ（ＣＦＴＲ−ＨＡ）を有する野生型及びΔＦ５０８ ＣＦＴＲ異型を発現する乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系を使用した（Ｓｈａｒｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４１６４（６）：９２３−３３）。細胞はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、ＣＡ）１：１培地で、５．０％のＣＯ_２の存在下、３７℃で１０％のＦＢＳを添加して培養した。
【０１５９】
ＨｕＨ７肝癌細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入した脂質最適化キット、ＰｅｒＦｅｃｔ ｌｉｐｉｄ（ｐＦｘ−３）を使用して、ｐＧＦＰ−ＬＣ３（Ｏｇａｗａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０７（５７１０）：７２７−７３１，２００５）で安定にトランスフェクションした。ＰＦＸ−３を、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に従い使用した。０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下でコロニーを形成させ、単離し、増幅し、更に蛍光顕微鏡検査及びウエスタンブロット法により、ＧＦＰ−ＬＣ３発現を解析した。
【０１６０】
オートファジーの誘導
細胞をアミノ酸飢餓培地若しくはラパマイシン（５０ｍＭ）処理、又はその両方の条件下でインキュベートすることによりオートファジーを誘発した。オートファジー誘導条件下で、２、６又は１２時間細胞をインキュベートした。所定の時点で細胞を、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤ミックスのタブレット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、マンハイム、ドイツ））の存在下で、１％のｎ−ドデシル−β−マルトース配糖体（ＤＭ）（ａｎａｔｒａｃｅ、Ｍａｕｍｅｅ、ＯＨ）で４℃で１時間溶解させた。４Ｃで３０分間、ベックマン超遠心分離機を使用し、３６，０００回転／分で細胞を遠心分離した。溶解物を回収し、イムノブロッティングを実施した。
【０１６１】
ＳＤＳゲル電気泳動及びイムノブロッティング
細胞可溶化物を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、イモビロン−ＮＣ（ミリポア、ビルリカ、ＭＡ）ニトロセルロース膜に転写した。膜をＰＢＳＴ（０．１％のトリトンＸ−１００（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳ）で１：１希釈された市販のブロッキングバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ、リンカーン、ネブラスカ）にて１時間室温でインキュベートし、示された一次抗体で１時間インキュベーションした。ブロット膜をＰＢＳＴでそれぞれ５分間３回洗浄し、近赤外線染料（ＩＲＤｙｅ８００）とコンジュゲートさせた二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）で１時間インキュベートした。最後に、膜を再度ＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｉｎｆｒａｒｅスキャナ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、リンカーン、ネブラスカ）でスキャンした。イムノブロットの定量化は、Ｌｉｃｏｒソフトウェアを使用して実施した。オプシン、ＨＡ−タグ（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、ｍＴＯＲ、リン酸化ｍＴＯＲ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）、カルネキシン、ｈｓｐ７０（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ、ビクトリア、ＢＣ、ＣＡ）、チューブリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、ミズーリ）、Ｂｉｐ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）、１Ｄ４（ブリティッシュコロンビア大学）、Ａｋｔ、リン酸化Ａｋｔ、Ｓ６Ｋ、リン酸化Ｓ６Ｋ、ＭＡＰＫ及びリンＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ベヴァリー、ＭＡ）を認識する一次抗体を使用した。
【０１６２】
免疫蛍光法
細胞をガラスカバーグラス上で培養し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。５０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌでクエンチした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で１時間、示された一次抗体とインキュベートした。細胞を５回ＰＢＳで洗浄し、１時間二次抗体（ＴＲＩＴＣ及びＦＩＴＣとのコンジュゲート）とインキュベートした。細胞を再度洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄに取り付けた。一次抗体として、ＬＣ３、ＬＡＭＰ−１、Ａｔｇ７（ダン博士）、オプシン、Ａｔｇ７２０、Ａｔｇ８及びＨＡ−タグを認識する抗体を使用した。更に細胞を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡を使用して観察した。
【０１６３】
リソストラッカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）による染色を、３７℃で生細胞にも適用した。共焦イメージングを、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して×６３の倍率で実施した。
【０１６４】
マウスモデル
ａｂｃｒ ＋／−マウス（Ｍａｔａら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１；４２：１６８５−１６９０）を使用した。
【０１６５】
Ｐ２３Ｈオプシンタンパク質を発現するマウス（Ｌｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０，２５８９−２５９７（１９９７））を使用した。
【０１６６】
インビボでのラパマイシン処理
４ヵ月齢となったａｂｃｒ ＋／−マウスを、毎週２０ｍｇ／ｋｇのラパマイシンで処理した。ラパマイシンを腹腔内注射により投与した。
【０１６７】
２１日齢となった異型のＰ２３Ｈトランスジェニックマウスを、週一度ラパマイシンで処理した。
【０１６８】
網電図記録法
ＥＲＧの前にマウスを２４時間暗順応させた。ケタミン及びキシロアジンの混合物を用い、マウスを麻酔した。投与量を重量として測定した。マウスの目をプロパラカインを点眼して麻痺し、Ａｋ−ｄｉｌａｔｅを用いて広げた。更にマウスを装置（ＵＴＡＳ−Ｅ ２０００）に固定し、電極を後肢に挿入し、他の電極を首に挿入し、一対の電極を、各目からのＥＲＧの記録に用いた。ベースライン測定の後、ＥＲＧを２０、１０及び０ｄＢで測定した。毎月ＥＲＧを測定し、Ｂ波の振幅を測定した。
【０１６９】
ＦＴＩ−２７７処理
ＦＴＩ−２７７（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を５０μＭで使用した。テトラサイクリンの洗浄除去後、細胞を０、２、６及び１２時間処理し、更にプロテアーゼ阻害剤（完全プロテアーゼ阻害剤ミックスの錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製））の存在下で、１％／ｉ−ドデシル−Ｐ−マルトシド（ＤＭ）（Ａｎａｔｒａｃｅ社製）を含むリン酸バッファー中で４℃で１時間溶解させた。オートファジーのポジティブコントロールとして、細胞をラパマイシン（５０ｎＭ）で処理し、更にテトラサイクリンを洗浄除去した。溶解物を４℃で１０分間ベックマン超遠心分離機で３６，０００回転／分で遠心分離した。上澄みを回収し、イムノブロッティングを実施した。３−メチルアデニン（３ＭＡ）（オートファジーをブロックする）（１０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（セントルイス、ミズーリ）、及びＭＧ１３２（２５μＭ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（セントルイス、ミズーリ）も使用した。
【０１７０】
電子顕微鏡検査
Ｐ２３Ｈオプシン発現細胞を、２４ウエルプレート中のＡＣＬＡＲシート上で培養した。オプシン産生は４８時間のテトラサイクリンの添加により誘導し、テトラサイクリン除去の後、細胞を６時間ＦＴＩ−２７７で処理した。ＰＢＳによる洗浄後、細胞を２％のパラホルムアルデヒド、２％グルタルアルデヒド／０．１Ｍナトリウムカコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）で４℃にて３０分間固定し、前述したようにＣＭＰアーゼ細胞化学的解析のために処理した。ＡＶｓの形態の定量化は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して１つの条件あたり２０の電子顕微鏡写真を撮影し、Ｔ−検定を行い、０．０５以下のＰ値（２尾の有意水準）を有意とした（星印で示す）。
【０１７１】
他の実施態様
前述の説明から、本願明細書に記載されている本発明を、様々な用途及び条件に適合させるように適宜変更及び修飾を行ってもよいことは自明である。かかる実施態様は添付の特許請求の範囲にも含まれる。
【０１７２】
本願明細書に列記した変更可能な定義に関する、全ての要素の説明には、いかなる１つの部材又は列記した部材のいかなる組合せ（又は部分的な組合せ）としての定義も包含される。本願明細書に記載の実施態様には、いかなる１つの実施態様又はその他のいかなる実施態様若しくはその部分との組合せが包含される。
【０１７３】
本願明細書において記載した全ての特許及び刊行物は、あたかもそれらの特許及び刊行物が具体的及び個別的に参照により援用されると明記された場合と同程度に、参照により本願明細書に援用される。
【０１７４】
参照
Ｓ．Ｍ．Ｎｏｏｒｗｅｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７９：１６２７８−１６２８４（２００４）
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１Ａ〜１Ｉは、オートファジーにより、野生型（ＷＴ）オプシンと比較してミスフォールディングＰ２３Ｈオプシンが選択的に分解されることを示す。図１Ａ、１Ｃ及びＩＥは、ＨＥＫ−２９３細胞を安定に野生型オプシン（図１Ａ）又はＰ２３Ｈオプシン（図１Ｃ）でトランスフェクションし、ラパマイシンで処理又はアミノ酸飢餓でオートファジーを誘発したときの、オプシンタンパク質発現のイムノブロットを示す。図１Ｅは、更に１１−シスレチナールで処理したＰ２３Ｈオプシン発現細胞を示す。時間経過によるオートファジー誘導を示す。図１Ｂ、１Ｄ、及び１Ｅは、１１−シスレチナール（図１Ｆ）によってレスキューされた野生型オプシン（図１Ｂ）、Ｐ２３Ｈオプシン（図１Ｄ）及びＰ２３Ｈオプシンの時間経過による分解プロフィールを示すグラフである。以下の記号は、それぞれ以下の条件を意味する：アミノ酸含有培地（◆）、アミノ酸飢餓培地（■）、ラパマイシン含有培地（▲）及びラパマイシン含有アミノ酸飢餓培地（●）。図１Ｇ、１Ｈ、及び１Ｉはイムノブロットを示す。図１Ｇは、野生型及びＰ２３Ｈ発現細胞のオートファジー誘導の間における、ｍＴＯＲの脱リン酸化を示す。図１Ｈ及び１Ｉは、Ｐ２３Ｈ（図１Ｈ）を発現する細胞、又は１１−シス−レチナール（図１Ｉ）でも処理されたＰ２３Ｈ発現細胞における、オートファジー条件下でのＢｉｐ、カルネキシン及びＨｓｐ７０シャペロンタンパク質の発現を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、オートファジーが野生型よりもΔＦ５０８を優先的に分解することを示す。図２Ａ及び２Ｃは、安定して野生型ＣＦＴＲ（図２Ａ）若しくはΔＦ５０８（図２Ｃ）を発現するＢＨＫ細胞における、アミノ酸飢餓（レーン４−６）、ラパマイシン５０ｍＭ処理（レーン７−９）若しくはその両方（レーン１０−１２）の後の、ＨＡタグ付加ＣＦＴＲの発現を示すイムノブロットである。図２Ｂ及び２Ｄは、野生型ＣＦＴＲ（図２Ｂ）及びΔＦ５０８（図２Ｄ）の時間経過による分解プロフィールを示すグラフである。以下の記号は、それぞれ以下の条件を意味する：アミノ酸含有培地（◆）、アミノ酸飢餓培地（▲）、ラパマイシン含有培地（■）及びラパマイシン含有アミノ酸飢餓培地（●）。図２Ｅは、野生型ＣＦＴＲ及びΔＦ５０８を発現する細胞のオートファジー誘導後の、ｍＴＯＲ脱リン酸化を示すイムノブロットである。図２Ｆは、野生型ＣＦＴＲ又はΔＦ５０８を発現する細胞における、オートファジー条件下でのＢｉｐ、カルネキシン及びＨｓｐ７０シャペロンタンパク質の制御を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、野生型オプシン（図３Ａ）又はＰ２３Ｈオプシン（図３Ｂ）を発現するＨＥＫ−２９３細胞のオートファジーマーカーの免疫蛍光染色を示す顕微鏡写真。染色は、オートファジーマーカーがＰ２３Ｈオプシンのミスフォールドによる凝集により局在化することを示す。通常条件下若しくはアミノ酸性飢餓条件下における、オートファジーマーカー（左パネル）Ａｔｇ７、ＬＣ３及びＬＡＭＰ−１によるオプシン（中央パネル）の共局在化を示す。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、野生型ＣＦＴＲ（図４Ａ）若しくはΔＦ５０８（図４Ｂ）を発現するＢＨＫ細胞におけるオートファジーマーカー及びＣＦＴＲの免疫蛍光染色を示す顕微鏡写真。オートファジーマーカーは、ＥＲに保持されるΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパク質によって共局在化する。通常条件下若しくはアミノ酸性飢餓条件下における、オートファジーマーカー（左パネル）Ａｔｇ７、ＬＣ３及びＬＡＭＰ−１による、ＨＡタグ付きＣＦＴＲ（中央パネル）の中の共局在化を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは３つの細胞の電子顕微鏡写真を示す。図５Ａは、ロドプシンで染色され、イムノゴールド標識した細胞内のＰ２３Ｈの凝集を示す。図５Ｂ及びＣは、オートファジー細胞のリソソーム及び自食胞を示す。
【図６】ラパマイシン処理が色素性網膜炎のＰ２３Ｈマウスモデルにおいて網膜機能を強化することを示す棒グラフである。コントロール−Ｐ２３Ｈ１及びＰ２３Ｈ２は、１コピーのＰ２３Ｈオプシンを発現するトランスジェニックマウスである。Ｒａｐ−Ｐ２３ＨＡ及びＢとは、１コピーのＰ２３Ｈオプシンを発現し、ラパマイシンで処理されたトランスジェニックマウスである。ＷＴ−１、２及び３とは野生型コントロールマウスである。Ｒａｐ−ＷＴＡ及びＢとはラパマイシンに曝露させた野生型コントロールマウスである。各バーは単一のマウスでのＥＲＧアッセイを意味する。
【図７】ラパマイシン処理が黄斑変性のマウスモデルにおいて網膜機能を強化することを示す棒グラフである。各バーは単一のマウスでのＥＲＧアッセイを意味する。
【図８】ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤ＦＴＩ２７７で処理したＰ２３Ｈ発現細胞における、Ｐ２３Ｈタンパク質の分解を示すウエスタンブロットである。チューブリンのウエスタンブロットを、ロード量のコントロールとして示す。用語「Ｆｅｄ」とはアミノ酸及び血清を含有する培地を有する培養組織条件を意味し、用語「Ｆ＋Ｒ」とはＦｅｄ＋ラパマイシン処理を意味し、用語「Ｆ＋ＦＴＩ２７７」とはＦｅｄ＋１０μＭ又は５０μＭ ＦＴＩ２７７処理を示す。チューブリンのウエスタンブロットを、ロード量のコントロールとして示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ＦＴＩ−２７７処理がＰ２３Ｈオプシンの分解をもたらすことを示す。図９Ａは、１２時間の時間経過における、ＦＴＩ−２７７によるＲｈｅｂ抑制に続くＰ２３Ｈオプシンレベルを示すイムノブロットである。Ｐ２３Ｈオプシンを発現する細胞を、１０μＭ（レーン８−１０）若しくは５０μＭ（レーン１１−１３）ＦＴＩ−２７７で処理した。ラパマイシン（レーン５−７）処理をポジティブコントロールとして使用した。アミノ酸及び血清を供給したコントロールも使用した（レーン２−４）。チューブリンをロード量のコントロールとして示す。図９Ｂは、ラパマイシンとＦＴＩ−２７７（５０μＭ）による処理後、２時間、６時間及び１２時間における、Ｐ２３Ｈを発現する細胞中でのオプシンイムノブロットの分解プロフィール（バンドのピクセル強度に基づく）の比較を示すグラフである。
【図１０】カルネキシン、カルレティキュリン、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０レベルを示す一組のイムノブロットである。この試験は、時間依存的な様式による、アンフォールディングタンパク質の反応及び熱ショック反応に対する、ＦＴＩ−２７７処理の効果を分析した結果であり、オートファジーではＵＰＲ及びＨＳＲが除外されることを示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｓ６Ｋ及びｍＴＯＲのＦＴＩ−２７７ブロックリン酸化を示す一組のイムノブロットである。図１１Ａは、Ｓ６Ｋのリン酸化状態が、ラパマイシン及びＦＴＩ−２７７処理後２時間以内に検出されることを示す。図１１Ｂは、ｍＴＯＲのリン酸化状態が１２時間の時間経過における、アミノ酸及び血清飢餓と組み合わせたラパマイシン、ＦＴＩ−２７７及びＦＴＩ−２７７の使用により検出されることを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、自食胞標識のＦＴＩ−２７７処理に続く免疫共局在化を示す一連の顕微鏡写真である。図１２ＡはＡｔｇ７染色を示し、図１２ＢはＡｔｇ８染色を示す。これらの標識を用い、Ｐ２３Ｈオプシン凝集体による共局在化がＦＴＩ−２７７処理に続いて行われることを観察した。アミノ酸を供給し、ラパマイシン処理した細胞をコントロールとして使用した。図１２Ｃは、ＦＴＩ−２７７で処理した細胞の共焦イメージングを示す。共焦イメージングにより、自食胞標識Ａｔｇ７、Ａｔｇ８及びＰ２３Ｈオプシン凝集体との間での明瞭な細胞内局在化が示された。自食胞抗体はＴＲＩＴＣ標識し（左）、オプシンをＦＩＴＣ標識（右）した。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＦＴＩ−２７７処理による細胞のオートファジー反応を示す。図１３Ａは、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを使用して、ＦＴＩ−２７７処理に続く細胞のリソソーム経路の上方制御を観察する標識とすることを示す。図１３Ｂは、ＦＴＩ−２７７による細胞の処理後６時間において実施した、電子顕微鏡写真超微細構造分析を示す。細胞は、オートリソソームと同様にリソソームを視覚化するためにｃＭＰａｓｅを細胞化学的に処理した。図１３Ｃは、ＦＴＩ−２７７処理後２時間及び６時間にて実施した、形態測定分析の結果を示すグラフである。アミノ酸及び血清コントロールと共にＦＴＩ−２７７で処理したときのオートファジー誘導の比較を示す。
【図１４】ＦＴＩ−２７７処理後のＨｕＨ７細胞におけるＧＦＰ−ＬＣ３の過剰発現を示す共焦分析である。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、ＦＴＩ−２７７で誘導されるオートファジーを示す。図１５Ａは、オートファジー阻害剤３ＭＡによる細胞の処理に続いて実施した２つのイムノブロットを示す。３ＭＡは、ＦＴＩ−２７７により誘導されるＰ２３Ｈオプシンの分解を阻害した。アミノ酸及び血清飢餓された細胞（一番上のレーン）を、２４時間のＰ２３Ｈオプシンの蓄積を観察するコントロールとして使用した。同様に、３ＭＡ（軽灰色のバー）の存在下で、ＦＴＩ−２７７処理によりＰ２３Ｈオプシンの分解が阻害された。オプシンの最大蓄積は、ＦＴＩ−２７７処理のみ（暗灰色のバー）と比較して、３ＭＡ処置後１２時間の細胞で観察された。図１５Ｂは、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）で、Ｆｅｄ（軽灰色のバー）及びＦＴＩ−２７７（ダークグレイのバー）処理条件の下で１２時間処理したＰ２３Ｈオプシン発現細胞を示し、ＭＧ１３２が飢餓の間、ミスフォールディングＰ２３Ｈオプシンの分解を阻害しないことを示す。
【図１６】ＦＴＩ−２７７及びラパマイシンによる抑制部位を示す、インシュリン／ＴＯＲ／Ｓ６Ｋ経路のブロック線図である。ＰＢキナーゼの活性化によりＡｋｔのリン酸化がなされる。ＴＳＣ１／２はＲｈｅｂを活性化させるＧＡＰとして機能し、それにより次々にｍＴＯＲをリン酸化する。ｍＴＯＰの抑制により細胞のオートファジーが誘導される。ＦＴＩ−２７７によるＲｈｅｂのポテンシャル抑制は、ラパマイシンによるｍＴＯＲの抑制と同様にオートファジーを誘導する。
【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図１Ｇ】

【図１Ｈ】

【図１Ｉ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のタンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法であって、当該患者にオートファジータンパク質分解を強化する化合物の有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記化合物が哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記化合物がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がＦＴＩ−２７７である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＤが、α１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びジェイコブ−クロイツフェルト疾患からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＣＤが嚢胞性線維症である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＣＤが色素性網膜炎、加齢に関連する黄斑変性、緑内障、角膜ジストロフィー、網膜精神分裂症患者、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、常染色体優位ドルーゼン及びＢｅｓｔ黄斑ジストロフィーからなる群から選択される眼性ＰＣＤである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記眼性ＰＣＤが色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記加齢に関連する黄斑変性が湿潤型又は乾燥型である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
更に患者に１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体を投与することを含んでなる、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
患者の眼性タンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法であって、当該患者にオートファジータンパク質分解を強化する化合物の有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項１３】
前記ＰＣＤが色素性網膜炎、加齢に関連する黄斑変性、緑内障、角膜ジストロフィー、網膜精神分裂症患者、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、常染色体優位ドルーゼン及びＢｅｓｔ黄斑ジストロフィーからなる群から選択される眼性ＰＣＤである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記眼性ＰＣＤが色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記加齢に関連する黄斑変性が湿潤型又は乾燥型である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログである、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がＦＴＩ−２７７である、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
更に患者に１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体を投与することを含んでなる、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
患者の色素性網膜炎又は黄斑変性を治療若しくは予防する方法であって、
ａ）患者にオートファジータンパク質分解を強化する化合物を投与することと、
ｂ）１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールを投与することを含んでなり、１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び当該化合物が、同時に又は各々１４日以内に、患者の色素性網膜炎又は黄斑変性を治療若しくは予防するのに十分な量で投与される方法。
【請求項２２】
前記化合物が哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がＦＴＩ−２７７である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
１１−シス−レチナールが７−環をロックされた１１−シス−レチナールの異性体である、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
前記患者がタンパク質フォールディングに影響を及ぼす突然変異を有する、請求項１から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記突然変異がオプシンにおける突然変異である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記オプシンがＰ２３Ｈ突然変異を有する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記分解がミスフォールドタンパク質特異的である、請求項１から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び化合物が各々５日以内に投与される、請求項１から２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び化合物が各々２４時間以内に投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び化合物が同時に投与される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び化合物が眼に投与される、請求項３１から３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記投与が眼内に行われる、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
１１−シス−レチナール若しくは９−シス−レチナール、及び化合物が、それらを長期放出させる組成物に各々添加される、請求項３１から３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が微小球体、ナノ球体又はナノエマルジョンである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記長期放出が薬剤輸送手段を介して行われる、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記方法がビタミンＡサプリメントを投与することを更に含んでなる、請求項３１から３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
患者のタンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法であって、前記患者のＰＣＤの治療若しくは予防に十分な量のオートファジー強化化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項４１】
前記化合物が哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログである、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がＦＴＩ−２７７である、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰＣＤが、α１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びジェイコブ−クロイツフェルト疾患からなる群から選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
ＰＣＤを有する患者を同定するステップを更に含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項４７】
更に細胞内のミスフォールドタンパク質、オートファジーマーカー又は自食胞の発現レベルを測定するステップを含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＣＤが嚢胞性線維症であり、前記方法が更に抗生物質、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫサプリメント、アルブテロール気管支拡大、ドルナーゼ及びイブプロフェンからなる群から選択される薬剤を投与することを含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＣＤがハンチントン舞踏病であり、前記方法が更にハロペリドール、フェノチアジン、レセルピン、テトラベナジン、アマンタジン及びコエンザイムＱ１０からなる群から選択される薬剤を投与することを含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項５０】
前記ＰＣＤがパーキンソン病であり、前記方法が更にレボドパ、アマンタジン、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アポモルヒネ、ベネセラジド、リスライド、メスレルジン、リスリド、レルゴトリル、メマンチン、メタエルゴリン、ピリベジル、チラミン、チロシン、フェニルアラニン、ブロモクリプチンメシラート、ペルゴリドメシラート、抗ヒスタミン剤、抗うつ薬及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤からなる群から選択される薬剤を投与することを含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項５１】
前記ＰＣＤがアルツハイマー病であり、当該方法が更にドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン及びタクリンからなる群から選択される薬剤を投与することを含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項５２】
前記ＰＣＤが腎生成尿崩症であり、前記方法が更にクロロチアジド／ヒドロクロロチアジド、アミロライド及びインドメタシンからなる群から選択される薬剤を投与することを含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項５３】
前記ＰＣＤが癌であり、前記方法が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルフォンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルヴィン−カロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、ストラムスチンリン酸塩、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン及びビンフルニンからなる群から選択される薬剤を投与することを更に含んでなる、請求項４０記載の方法。
【請求項５４】
細胞中におけるミスフォールドタンパク質の分解を強化する方法であって、細胞とオートファジーを強化する有効量の化合物とを接触させることを含んでなる方法。
【請求項５５】
前記化合物が哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログである、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がＦＴＩ−２７７である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
ＰＣＤを有する患者を同定するステップを更に含んでなる、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
更に細胞内のミスフォールドタンパク質、オートファジーマーカー又は自食胞の発現レベルを測定するステップを含んでなる、請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が眼細胞である、請求項５４記載の方法。
【請求項６２】
前記方法が更に、１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は１１−シス−レチナールの７−環をロックされた異性体と眼細胞とを接触させることを含んでなる、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞が上皮細胞である、請求項５４記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が凝集体又はフィブリルを形成する変異体タンパク質を含んでなる、請求項５４記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が変異体オプシンタンパク質を含んでなる、請求項５４記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が変異体ミオシリンタンパク質を含んでなる、請求項５４記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が変異体リポフスシンタンパク質を含んでなる、請求項５４記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が変異体β−Ｈ３タンパク質を含んでなる、請求項５４記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞がインビトロの細胞である、請求項５４記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞がインビボの細胞である、請求項５４記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞が哺乳類の細胞である、請求項５４記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
薬学的に許容できる賦形剤中にｍＴＯＲ阻害剤又はそのアナログを含有する、ＰＣＤの治療用の医薬組成物。
【請求項７４】
薬学的に許容できる賦形剤中にオートファジー強化化合物の有効量を含有する、眼性ＰＣＤの治療用の医薬組成物。
【請求項７５】
前記化合物が哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を阻害するか、又は脳内で富化されたＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）を阻害する、請求項７３又は７４記載の組成物。
【請求項７６】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログである、請求項７３又は７４記載の方法。
【請求項７７】
前記化合物がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項７３又は７４記載の方法。
【請求項７８】
前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がＦＴＩ−２７７である、請求項７３又は７４記載の方法。
【請求項７９】
前記組成物が更に１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールの有効量を含んでなる、請求項７４記載の方法。
【請求項８０】
薬学的に許容できる賦形剤中に１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールの有効量、及びオートファジー阻害剤の有効量を含有する、色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性の治療用の医薬組成物。
【請求項８１】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログである、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記化合物がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がＦＴＩ−２７７である、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールの有効量、及びラパマイシン又はそのアナログの有効量を含有する、眼性ＰＣＤの治療用のキット。
【請求項８５】
１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールの有効量、及びラパマイシン又はそのアナログの有効量を含んでなる、色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性の治療用のキット。
【請求項８６】
ＰＣＤを有する患者の治療に有用な化合物の同定方法であって、
ａ）インビトロでミスフォールドタンパク質を発現する細胞と候補化合物を接触させることと、
ｂ）コントロール細胞と比較して細胞のオートファジーの増加を測定することを含んでなり、接触させた前記細胞のオートファジーの増加を、ＰＣＤを有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とする方法。
【請求項８７】
色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性を有する患者の治療に有用な化合物の同定方法であって、
ａ）インビトロでミスフォールドタンパク質を発現する細胞を、
（ｉ）１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール、及び
（ｉｉ）候補化合物と接触させることと、
ｂ）コントロール細胞と比較して細胞のオートファジーの増加を測定することを含んでなり、接触させた前記細胞のオートファジーの増加を、色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とする方法。
【請求項８８】
１１−シス−レチナールが１１−シス−レチナールの７−環をロックされた異性体である、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
嚢胞性線維症を有する患者の治療に有用な化合物の同定方法であって、
ａ）インビトロでミスフォールドタンパク質を発現する細胞と候補化合物を接触させることと、
ｂ）コントロール細胞と比較して細胞のオートファジーの増加を測定することを含んでなり、接触させた前記細胞のオートファジーの増加を、嚢胞性線維症を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とする方法。
【請求項９０】
前記ミスフォールドタンパク質が突然変異を有する、請求項８６から８９のいずれか１項記載の方法。
【請求項９１】
前記ミスフォールドタンパク質がオプシンである、請求項８６から８９のいずれか１項記載の方法。
【請求項９２】
前記オプシンがＰ２３Ｈ突然変異を含んでなる、請求項８６から８９のいずれか１項記載の方法。
【請求項９３】
前記オートファジーの増加がタンパク質の濃度をモニターすることにより測定される、請求項８６から８９のいずれか１項記載の方法。
【請求項９４】
前記オートファジーの増加がオートファジーマーカーの発現をモニターすることにより測定される、請求項８６から８９のいずれか１項記載の方法。
【請求項９５】
前記オートファジーの増加が自食胞の数をモニターすることにより測定される、請求項８６から８９のいずれか１項記載の方法。
【請求項９６】
患者のタンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法であって、ラパマイシン又はＦＴＩ−２７７の生物学的活性を強化する化合物の有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項９７】
前記化合物がラパマイシン又はそのアナログとの組み合わせで投与される、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
前記化合物がＦＴＩ−２７７又はそのアナログとの組み合わせで投与される、請求項９６記載の方法。
【請求項９９】
前記ＰＣＤが、α１−抗トリプシン欠乏、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎生成尿崩症、癌及びジェイコブ−クロイツフェルト疾患からなる群から選択される、請求項９６記載の方法。
【請求項１００】
前記ＰＣＤが嚢胞性線維症である、請求項９６記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＰＣＤが色素性網膜炎、加齢に関連する黄斑変性、緑内障、角膜ジストロフィー、網膜精神分裂症患者、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患、常染色体優位ドルーゼン及びＢｅｓｔ黄斑ジストロフィーからなる群から選択される眼性ＰＣＤである、請求項９６記載の方法。
【請求項１０２】
前記眼性ＰＣＤが色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性である、請求項９６記載の方法。
【請求項１０３】
前記方法が更に、患者に１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は１１−シス−レチナールの７−環をロックされた異性体を投与することを含んでなる、請求項９６記載の方法。
【請求項１０４】
患者の色素性網膜炎の治療若しくは予防方法であって、
ａ）患者にラパマイシン及びラパマイシンの生物学的活性を強化する化合物を投与することと、
ｂ）１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールを投与することを含んでなり、１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナール、及び当該化合物を、患者の色素性網膜炎を治療若しくは予防するのに十分な量で各々同時又は１４日以内に投与する方法。
【請求項１０５】
患者のタンパク質形態障害（ＰＣＤ）の治療若しくは予防方法であって、当該方法がラパマイシン又はそのアナログを、ラパマイシンの生物学的活性を強化する化合物と組み合わせて投与することを含んでなり、ラパマイシン及び当該化合物が患者のＰＣＤの治療若しくは予防に十分な量で各々投与される方法。
【請求項１０６】
細胞ミスフォールドタンパク質の分解を強化する方法であって、当該細胞と、ラパマイシン又はそのアナログの有効量及びラパマイシンの生物学的活性を強化する化合物とを接触させることを含んでなり、ラパマイシン及び当該化合物がタンパク質の分解を強化するのに十分な量で各々投与される方法。
【請求項１０７】
前記細胞が眼細胞である、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
前記方法が更に、１１−シス−レチナール、９−シス−レチナール又は１１−シス−レチナールの７−環をロックされた異性体と細胞とを接触させることを含んでなる、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０９】
ラパマイシン又はそのアナログ、及びラパマイシンの生物学的活性を強化する化合物を薬学的に許容できる賦形剤中に含有し、ラパマイシン及び当該化合物が患者のＰＣＤの治療又は予防に十分な量で各々存在する、眼性ＰＣＤの治療用の医薬組成物。
【請求項１１０】
ＰＣＤを有する患者の治療に有用な化合物の同定方法であって、
ａ）インビトロでミスフォールドタンパク質を発現する細胞と候補化合物をオートファジーエンハンサーの有無において接触させることと、
ｂ）コントロール細胞と比較して細胞のオートファジーの増加を測定することを含んでなり、接触させた前記細胞のオートファジーの増加を、ＰＣＤを有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とする方法。
【請求項１１１】
色素性網膜炎を有する患者の治療に有用な化合物の同定方法であって、
ａ）インビトロでミスフォールドされたオプシンタンパク質を発現する細胞を
（ｉ）１１−シス−レチナール又は９−シス−レチナールな及びラパマイシン、及び
（ｉｉ）候補化合物と接触させることと、
ｂ）コントロール細胞と比較して細胞のオートファジーの増加を測定することを含んでなり、接触させた前記細胞のオートファジーの増加を、色素性網膜炎又は加齢に関連する黄斑変性を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とする方法。
【請求項１１２】
嚢胞性線維症を有する患者の治療に有用な化合物の同定方法であって、
ａ）インビトロでミスフォールドＣＦＴＲタンパク質を発現する細胞と、候補化合物及びラパマイシンとを接触させることと、
ｂ）コントロール細胞と比較して細胞のオートファジーの増加を測定することを含んでなり、接触させた前記細胞のオートファジーの増加を、嚢胞性線維症を有する患者の治療に有用な化合物であることの指標とする方法。

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１３Ｃ】

【図１４】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６】

【公表番号】特表２００８−５３９２７６（Ｐ２００８−５３９２７６Ａ）
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０９１９４（Ｐ２００８−５０９１９４）
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１６３６８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１６７１６
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５００３６０７６９）ユニバーシティ　オブ　フロリダ　リサーチ　ファウンデーション，インコーポレイティド (16)
【Ｆターム（参考）】