プラズモン励起センサ、並びにこれを用いた核酸検出装置および核酸検出方法
【課題】本発明は、金属薄膜表面が撥水処理されているプラズモン励起センサ、並びに、このセンサを用いる高感度な核酸検出装置及び核酸検出方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有しており、本発明の核酸検出装置及び核酸検出方法は、前記プラズモン励起センサ上で前記蛍光修飾プローブと検体中のターゲット核酸との反応により形成される二本鎖の複合体を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルとして検出することを特徴とする。
【解決手段】本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有しており、本発明の核酸検出装置及び核酸検出方法は、前記プラズモン励起センサ上で前記蛍光修飾プローブと検体中のターゲット核酸との反応により形成される二本鎖の複合体を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルとして検出することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の核酸を高感度に検出するプラズモン励起センサに関する。さらに本発明は、当該プラズモン励起センサ上で検体を基板に接触させ、これにより固定化された検体中の核酸をプラズモン蛍光測定を用いて高感度に検出する核酸検出装置および核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
【０００３】
一方、核酸などの生体分子を検出する方法としては、検体中の生体分子と親和性の高い分子をプローブ分子として用い、このプローブ分子が生体分子と反応したときに生じる変化を蛍光の変化などの形で検出する方法が広く用いられている。例えば、検体中の生体分子のうち一重鎖のＤＮＡを検出対象とする核酸分子（以下、「ターゲット核酸」と称することがある。）とする場合、この一重鎖のＤＮＡと相補的な配列を有する別の一重鎖のＤＮＡをプローブ分子として固定したバイオセンサを用い、このバイオセンサに蛍光分子を付した生体分子を接触させてこれらを反応させ、その結果バイオセンサに固定された蛍光分子からの蛍光を検出する方法が広く用いられている。しかし、この方法では、検体中の生体分子に予め蛍光分子を修飾させる必要があることから、蛍光分子の修飾量のばらつきによりデータの再現性が低下するという問題があり、また、しばしば検体中の生体分子を予め増幅させておく必要があることから検査プロセスが煩雑になるという問題がある。
【０００４】
このような問題点を解決するため、近年、プローブ分子としてモレキュラビーコンを用いた方法が研究されている。モレキュラービーコンの基本原理は、米国特許第5,925,517
号明細書（特許文献１）に示されており、モレキュラービーコンとは分子の両末端に蛍光分子と消光分子を有するものと定義されている。このモレキュラビーコンにおいては、通常、蛍光分子と消光分子とが近接しており、蛍光分子の励起エネルギーが消光分子に移動するために蛍光が消光している。ここで、モレキュラビーコンが別の分子と反応すると、ビーコンの立体構造が変化するために蛍光分子と消光分子が離れ、蛍光分子の発光が生じる。このため、モレキュラビーコンをプローブ分子として用いる場合には検体中の生体分子に蛍光分子等を別途付す必要がないので、モレキュラビーコンは溶液中で生体分子を検出する際の試薬として一般的によく用いられ始めている。
【０００５】
生体分子の検出にあたり、このモレキュラビーコンを基板に固定した状態で用いる試みもなされている。しかし、蛍光分子と消光分子を有するモレキュラビーコンを基板に固定した状態で使用すると、モレキュラビーコン分子の分子運動が抑制されるために、蛍光の消光効率が低くなり、かつ蛍光強度が低くなるといった問題がある。そのため、モレキュラビーコンに通常用いられる消光分子の代わりに金ナノ粒子を用いる試みが種々なされてきた。また、検出感度の向上を目的として、蛍光増強を用いる方法も試みられてきた。
【０００６】
これらの試みの中で、特開2007-171158号公報（特許文献２）は、基板表面に金属微粒
子を固定し、さらに一端に蛍光分子を修飾したループ型プローブ分子をこの金属微粒子に
固定した生体分子検出素子を用いて、検出用生体分子を非標識の状態で高感度に検出する方法を紹介している。この生体分子検出素子において、金属微粒子が蛍光増強効果を生じさせるとともに消光分子としての役割をも有している。この生体分子検出素子では、検体中のターゲット核酸との反応前においては、金属微粒子と蛍光分子とが近接しているのでプローブ分子上の蛍光分子が金属消光により消光しているが、反応後では蛍光分子と金属微粒子との距離が増大するので蛍光分子が蛍光を発生する。また、特許文献２には、検体中のターゲット核酸を検出する際に、金属微粒子の局在プラズモン共鳴による電場増強効果を利用して蛍光増強を行っているので、高感度な検出が可能であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,925,517号明細書
【特許文献２】特開2007-171158号公報
【特許文献３】特開2001-335804号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献２に記載の前記生体分子検出素子等、二本鎖ＤＮＡの形成によって蛍光発光を生じさせる従来のバイオセンサーが本来の作用・効果を発揮するためには、プローブ分子とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖ＤＮＡが基板表面に対して直立することが前提となる。ところが、実際には、形成した二本鎖ＤＮＡの一部が基板表面に横倒しになることがある。その場合には、プローブ分子上の蛍光分子が金属微粒子と再び近接することとなり、その結果、その蛍光分子が再び金属消光により消光する。現在までのところ、このような現象は知られていないものの、このような現象が生じると、充分な検出感度を得ることができないという問題点がある。
【０００９】
本発明は、このような問題点を克服するため、金属薄膜表面が撥水処理されているプラズモン励起センサ、並びに、このセンサを用いる高感度な核酸検出装置及び核酸検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いて核酸の検出を行うに当たり、プラズモン励起センサの金属薄膜表面に撥水処理を行うと、この金属薄膜表面に固定したプローブ分子に検体中の検出対象とする核酸分子（以下、「ターゲット核酸」という。）と反応させたときに形成する複合体に基づく蛍光の強度が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有することを特徴とする。
【００１２】
また、上記プラズモン励起センサを備えた核酸検出装置として、本発明の核酸検出装置は、
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサを備えており、
前記プラズモン励起センサ上で前記蛍光修飾プローブと検体中のターゲット核酸との反応により形成される二本鎖の複合体を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルと
して検出する
ことを特徴とする。
【００１３】
そして、上記プラズモン励起センサを用いた核酸検出方法として、本発明の核酸検出方法は、
工程（ａ）：透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに対して、前記透明平面基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれる核酸の量を算出する工程
を含むことを特徴とする。
【００１４】
これらの発明において、表面処理が、炭化フッ素系化合物による撥水処理であることが望ましい。
【００１５】
また、これらの発明において、プローブ分子の一方の末端が前記金属薄膜に固定されており、他方の末端が前記蛍光分子と結合していることが望ましく、特に、プローブ分子が、ループ型の構造を有する核酸であるとさらに望ましい。
【００１６】
また、本発明で用いられる検体については、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であると好ましい。
【００１７】
また、本発明は、前記核酸検出方法に用いられるキットをも提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、金属薄膜表面が撥水処理されているプラズモン励起センサを用いることによって、さらなる蛍光強度の増大及び蛍光シグナルの安定性向上をも図ることができるので、高感度かつ高精度の核酸検出装置及び核酸検出方法を提供することができる。さらに、金属薄膜表面が撥水処理されていることから、プラズモン励起センサを汚れの付着のない状態に保つことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本願発明で用いられるプラズモン励起センサの、ターゲット核酸との反応前（ａ）および反応後（ｂ）における模式図を示す。
【図２】実施例１及び比較例１、２で作製した各プラズモン励起センサにおける蛍光シグナル強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について、図１を参照しながら具体的に説明する。
【００２１】
〔プラズモン励起センサ〕
本発明の第１の態様は、
透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサである。
【００２２】
透明平面基板
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する平面基板として透明平面基板１１が用いられる。本発明において、平面基板として透明平面基板１１を用いるのは、後述する金属薄膜１２への光照射をこの平面基板を通じて行うからである。
【００２３】
本発明で用いられる透明平面基板１１について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明平面基板１１が、ガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよい。
【００２４】
また、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０で
あり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００２５】
なお、ガラス製の透明平面基板１１は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎd〕１．５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎd〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎd〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈
折率〔ｎd〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎd〕１．９０）、並びに（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性
との観点から好ましい。
【００２６】
透明平面基板１１は、その表面に金属薄膜１２を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
【００２７】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００２８】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００２９】
金属薄膜
本発明に係るプラズモン励起センサでは、透明平面基板１１の一方の表面に金属薄膜１２を形成する。ここで、プラズモン励起センサを検体と接触させる前においては、図１（ａ）に示すように、金属薄膜１２は、蛍光分子３２と近接した状態にあるので、蛍光分子３２の励起エネルギーを吸収することにより蛍光分子３２に対して金属消光をもたらす役割を有する。一方、プラズモン励起センサを検体と接触させた後においては、図１（ｂ）に示すように、金属薄膜１２は、蛍光分子３２から離れた状態にあるので、蛍光分子３２に対して金属消光をもたらさない。その代わりに、金属薄膜１２は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を引き起こすことで電場を発生させることにより、蛍光分子３２の発光をもたらし増強させる役割を有する。
【００３０】
上記透明平面基板１１の一方の表面に形成された金属薄膜１２としては、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００３１】
なお、透明平面基板１１としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜１２とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチ
タンの薄膜を形成することが好ましい。
【００３２】
透明平面基板１１上に金属薄膜１２を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜１２を形成することが好ましい。
【００３３】
金属薄膜１２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００３４】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００３５】
金属薄膜１２の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３６】
蛍光分子
本発明において、「蛍光分子」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する分子を意味し、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００３７】
本発明で蛍光分子３２として用いられる蛍光色素は、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００３８】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,
９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,
９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００３９】
これらのファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
また、蛍光分子３２として用いられる蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光分子３２となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００４２】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、蛍光分子３２が金属薄膜１２と近接しているときには金属薄膜１２による蛍光の消光が生じていることが好ましいが、蛍光分子３２が金属薄膜１２から離れているときには金属薄膜１２による蛍光の消光の影響を少なくすることが好ましい。そのため、金属薄膜１２に含まれる金属による吸光が適度に生じる波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜１２として金を用いる場合には、最大蛍光波長が６００〜７００ｎｍの範囲にある蛍光色素を使用することが望ましい。このような蛍光色素として、例えば、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ ６４７などが挙げられ、特にＡｌｅｘａ ６４７を使用することが望ましい。一方、金属薄膜１２として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００〜７００ｎｍの範囲にある蛍光色素を使用することが望ましい。
【００４３】
これらの蛍光色素は１種単独で用いてもよく、また２種以上併用してもよい。
【００４４】
これらの蛍光色素は、プローブ分子３１に共有結合で結合してもよく、水素結合、配位結合、イオン結合などにより結合してもよい。例えば、プローブ分子３１に対して直接または適度の長さのリンカーを介して、活性エステル法などの常法を用いて、カルボキシル基を付与した蛍光色素を結合させることにより、プローブ分子３１に蛍光分子３２を導入して蛍光修飾プローブ２１とすることができる。
【００４５】
蛍光修飾プローブ
本発明では、前記金属薄膜１２を形成後に得られる金属薄膜基板において、金属薄膜１２の、基板１１とは反対側の表面に、図1（ａ）に示すようにプローブ分子３１と消光状
態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１を結合させる。この蛍光修飾プローブ２１は、検体中の検出対象とする核酸（以下、「ターゲット核酸」ともいう。）をプラズモン励起センサに固定させる目的で用いられるものである。ここで、「消光状態」とは、金属薄膜１２などによる金属消光のために、蛍光分子３２からの蛍光の発光が、金属消光の影響を受けていない場合と比較して抑制されている状態をいう。
【００４６】
本発明において、「プローブ分子」とは、検体中に含有されるターゲット核酸３３を特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。本発明の場合、このような「分子」または「分子断片」は、核酸を特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子等である。その具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ただ、本発明においては、ターゲット核酸３３と相補的な配列を有する核酸をプローブ分子３１として用いられることが好ましい。そのようなプローブ分子３１を用いると、ターゲット核酸３３と反応させたときにハイブリダイゼーションが起こり、図1（ｂ）に示すように複合
体２２として剛直且つ安定な二本鎖の核酸が形成するからである。なお、相補的な配列とは、水素結合によって安定な塩基対を形成できる配列を意味し、ＤＮＡを例にとると、Ａに対してはＴ、Ｔに対してはＡ、Ｃに対してはＧ、Ｇに対してはＣがそれぞれ相補的な配列である。
【００４７】
ところで、本発明で用いられる蛍光修飾プローブ２１において、ターゲット核酸３３との反応前には、金属薄膜１２による金属消光のため蛍光分子３２からの蛍光が消光している必要があるので、図１（ａ）に示すように蛍光分子３２が金属薄膜１２に近接するような位置でプローブ分子３１と結合している必要がある。金属消光が生じる距離は、蛍光分子３２の種類や金属薄膜１２を構成する金属の種類などにより変わるものの、一般的には、蛍光分子３２と金属薄膜１２との直線距離が５ｎｍ以下の場合に、金属消光が顕著になる。これに対して、ターゲット核酸３３との反応後には、金属薄膜１２による金属消光の影響を受けることなく蛍光分子３２が蛍光を発光している必要があるので、図１（ｂ）に示すように蛍光分子３２が金属薄膜１２から離れた位置に存在している必要がある。このとき、金属薄膜１２と蛍光分子３２との直線距離が３０〜１００ｎｍの範囲にある場合には、金属薄膜１２による蛍光の増強効果が得られる。したがって、プローブ分子３１の一方の末端が金属薄膜１２に固定されており、他方の末端が蛍光分子３２と結合している場合には、プローブ分子３１の長さが、３０〜１００ｎｍの範囲にあることが好ましい。
【００４８】
これらの点を考慮すると、本願で用いられる蛍光修飾プローブ２１において、プローブ分子３１の一方の末端が金属薄膜１２に固定されており、他方の末端が蛍光分子３２と結合していることが好ましく、プローブ分子３１が、ループ型の構造を有していることがより好ましい。これは、プローブ分子３１がループ型の構造を有していれば、蛍光分子３２からの蛍光を金属薄膜１２により効率よく消光できるからである。より具体的には、プローブ分子３１が、ループ型の構造を有する核酸であることが好ましく、このような核酸が、ターゲット核酸３３と相補的な配列をさらに有しているとさらに好ましい。典型的には、３’末端に蛍光分子３２、５’末端にチオール基を持つループ型の核酸プローブが好適に用いられる。ただし、本発明で用いられるプローブ分子３１は、３’末端に蛍光分子３２を有する核酸プローブに限定されるものではなく、５’末端に蛍光分子３２、３’末端にチオール基を持つループ型の核酸プローブをプローブ分子３１として用いてもよい。
【００４９】
プローブ分子３１としてループ型の構造を有する核酸を用いる場合、その核酸の両末端は、外側から内側に向かって互いに相補的な配列を有している。核酸の両末端が相補的な配列であると、この両末端同士が水素結合を形成するためにループ型の構造を形成しやすいのである。しかし、両末端からの相補的な配列の長さが大きいと、両末端同士が形成する水素結合が強固になるので、ターゲット核酸３３との反応が困難になることがある。そのため、両末端からの相補的な配列の長さが８塩基以下であることが好ましい。一方、両末端からの相補的な配列の長さが０の場合には、ループ型の構造を形成しないものの、蛍光分子３２が金属薄膜１２に吸着するために蛍光の消光が起こる。このようなループ型の構造を有する核酸の配列のうち、前記両末端部分の内側にある配列については、ターゲット核酸３３となる核酸の配列に応じて変えることができる。
【００５０】
蛍光修飾プローブ２１の固定化方法としては、例えば、
(i) ３’末端に蛍光分子３２、５’末端にチオール基を持つループ型の核酸プローブを、リン酸バッファー等の中性付近の水溶液に溶解させ、
(ii) この核酸プローブ溶液を金属薄膜１２にスポッティングし、２５〜４０℃にて２
〜２４時間、充分湿度を保った環境で、反応させ、
(iii) その後、必要に応じて未反応の核酸プローブを洗浄により除去する
方法などが挙げられる。なお、ループ型の核酸プローブとして５’末端に蛍光分子３２、３’末端にチオール基を持つものを使用する場合においても、同様の方法を用いることができる。
【００５１】
撥水処理
本発明においては、前記蛍光修飾プローブ２１を結合させた金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有する。ここで、本発明にいう「接触角」は、静的接触角であり、より具体的には、基板に溶液を滴下したときにこの液滴と基板とのなす角度、言い換えれば、液滴の気−液界面が基板と接する点においてこの気−液界面と基板表面とがなす角度である。一般に、基板の対純水接触角が０度に近いほどその基板の親水性が高く、一方、１８０度に近いほど撥水性が高い。この接触角は、従来公知の種々の方法により測定することができる。
【００５２】
本発明の発明者は、本発明を行う過程において、従来技術に基づく生体分子検出素子においては、プローブ分子３１がターゲット核酸３３と反応することにより形成される二本鎖の核酸が基板に対して横倒しになる現象が発生することを見出した。これは、プローブ分子３１を固定した基板表面の疎水性が不充分であるためであると考えられる。そこで、金属薄膜１２の表面に撥水処理を行うと、プローブ分子３１と金属薄膜１２との間で疎水性相互作用が発生し、この疎水性相互作用によって、プローブ分子３１とターゲット核酸３３とがハイブリダイズすることにより形成される複合体２２である二本鎖の核酸が全て直立するようになると考えられる。その結果、蛍光を発する二本鎖の核酸が増加し、高感度化を図ることができると期待される。
【００５３】
従来技術に基づく生体分子検出素子は、プローブ分子３１を固定する基板表面にガラスを用いることが多いことから、その基板表面の対純水接触角が70度程度である。前記特許文献２に開示されている生体分子検出素子の場合、基板表面に自己組織化単分子膜を形成させていることからその表面の対純水接触角がもう少し大きいと考えられる。ただ、後述する実施例における比較例１に示すように、アルカンチオールで表面処理を行った基板でも対純水接触角が85度程度に留まることを考慮すると、ハイブリダイズにより形成される二本鎖の核酸が基板に対して横倒しになることなく全て直立するには、基板表面の対純水接触角が90度以上であることが望ましい。
【００５４】
一方、基板表面の撥水性が極度に高まると、検体中のターゲット核酸３３がプローブ分子３１に近づきにくくなる可能性がある。これを考慮すると、基板表面の対純水接触角が90〜100度の範囲にあることが好ましい。
【００５５】
本発明において、前記蛍光修飾プローブ２１を結合させた金属薄膜１２の表面の対純粋接触角を上記のような値とする方法としては、具体的には、金属薄膜１２に炭化フッ素系化合物などの撥水性物質からなる撥水処理膜１３を形成させる方法が挙げられる。例えば、金属薄膜１２が金薄膜である場合には、例えば、特開2001-335804号公報（特許文献３
）に記載されているような、パーフルオロアルキル基を末端に有する、チオール、ジスルフィドなどの硫黄含有炭化フッ素系化合物、具体的には、
ＣＦ3−(ＣＦ2)m−(ＣＨ2)n−ＳＨ、
ＣＦ3−(ＣＦ2)p−(ＣＨ2)q−ＳＳ−(ＣＨ2)r−(ＣＦ2)s−ＣＦ3、または、
ＣＦ3−(ＣＦ2)x−(ＣＨ2)y−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ3
（m,p,s,xは、それぞれ独立に５〜１３の整数を表し、n,q,r,yは、それぞれ独立に１〜５の整数を表す。）で表される硫黄含有炭化フッ素系化合物が好適に用いられる。このような化合物を撥水性物質として用いると、金−硫黄結合の形成により金薄膜に固定され、自己組織化単分子膜を形成するからである。このような化合物の一例としては、パーフルオロオクチルエチルメルカプタン（ＣＦ3−(ＣＦ2)7−(ＣＨ2)2−ＳＨ）などが挙げられる
。また、このような撥水性物質は、同時にブロッキング剤としての役割も有している。
【００５６】
このような撥水性物質からなる撥水処理膜１３の厚さについては、本発明における蛍光検出の妨げとならない限り特に限定されるものではないが、５ｎｍ以下にすることが好ましい。
【００５７】
撥水処理膜１３を形成させる方法としては、撥水性物質を適当な溶媒に溶解させて金属薄膜１２に付着させ、その後未反応の撥水性物質を洗浄する方法などが挙げられる。ここで、撥水性物質として上記硫黄含有炭化フッ素系化合物を用いる場合、これらの硫黄含有炭化フッ素系化合物は水に溶解しないのでアルコール系溶媒、ケトン系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒等の有機溶媒に溶解させて、金属薄膜１２に塗布等を行い、その後当該有機溶媒を用いて金属薄膜１２を洗浄する等の方法により撥水処理膜１３を形成させることになる。
【００５８】
撥水処理膜１３の形成は、前記蛍光修飾プローブ２１の固定化を行った後に行うことが望ましい。
【００５９】
〔核酸検出装置〕
本発明の第２の態様は、上記第１の態様に示したプラズモン励起センサを備えた核酸検出装置である。具体的には、
透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、該金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサを備えており、
そのセンサ上で前記蛍光修飾プローブ２１と検体中のターゲット核酸３３との反応により形成される二本鎖の複合体２２を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルとして検出する
ことを特徴とする核酸検出装置である。
【００６０】
検体
本発明において、「検体」とは、本発明の核酸検出方法による測定対象となる種々の試料をいう。
【００６１】
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【００６２】
ターゲット核酸
ターゲット核酸３３は、上記プローブ分子３１によって特異的に認識され（または、上記プローブ分子３１を特異的に認識し）結合し得る分子または分子断片としての核酸であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子などが挙げられる。
【００６３】
複合体
本発明において、「複合体」とは、図1（ｂ）に示すように、上記蛍光修飾プローブ２
１とターゲット核酸３３とのハイブリダイゼーションにより形成された複合体２２であり、通常は二本鎖の核酸である。ターゲット核酸３３と蛍光修飾プローブ２１に含まれるプローブ分子３１とが相補的な配列を有する場合には、安定な二本鎖の核酸を形成するので、蛍光分子３２が金属薄膜１２から離れることになり、金属薄膜１２による金属消光の影響を受けなくなる。これに基づき、本発明においては、金属消光の消失により蛍光の発光が生じたことをもって、検体中にターゲット核酸３３が存在すると判断するのである。
【００６４】
したがって、本発明において、形成した複合体２２は、横倒しになることなく直立した状態を維持するので、より高感度な核酸検出が可能となる。
【００６５】
光学系
本発明で用いる光源は、前記金属薄膜１２にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【００６６】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜１２の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光分子３２を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板１１の屈折率、金属薄膜１２の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【００６７】
蛍光分子３２は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【００６８】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤレーザ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜１２に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【００６９】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板１１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
【００７０】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【００７１】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【００７２】
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励
起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【００７３】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００７４】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、蛍光を画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【００７５】
駆動装置
本発明において、上記光学系は「駆動装置」の形で統合されていてもよい。本発明の駆動装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明を実施するためのものである。
【００７６】
「駆動装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【００７７】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５度の角度変更を可能とする。分解能は０．０１度以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【００７８】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
【００７９】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【００８０】
〔核酸検出方法〕
本発明の第３の態様は、上記第１の態様に示したプラズモン励起センサを用いた核酸検出方法であり、上記第２の態様に示した核酸検出装置に対応する核酸検出方法である。具体的には、
工程（ａ）：透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、該金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに対して、前記透明平面基板１１の、前記金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子３２から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるターゲット核酸３３の量を算出する工程
を含むことを特徴とする核酸検出方法である。
【００８１】
＜工程（ａ）＞
本発明の核酸検出方法において、工程（ａ）は、上記第１の態様として示したプラズモン励起センサ、すなわち、透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、該金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程である。
【００８２】
この工程（ａ）において用いられる透明平面基板１１、金属薄膜１２、プローブ分子３１、蛍光分子３２、蛍光修飾プローブ２１、表面処理、プラズモン励起センサ、検体は、上記第１および第２の態様に記載したものと同じ意味である。
【００８３】
接触
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのうち蛍光修飾プローブ２１が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。本発明において、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【００８４】
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。また、この流路として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【００８５】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【００８６】
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、且つプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路構造の全てを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜１２が表面に存在するプラズモン励起センサの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【００８７】
ここで、前記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【００８８】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【００８９】
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、及びその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作成上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
【００９０】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、且つ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
【００９１】
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートの上に、予め送液導入口及び送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサーを併用してもよい。
【００９２】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成してからその表面に蛍光修飾プローブ２１の固定化および撥水処理を行うか、或いは、予め蛍光修飾プローブ２１の固定化および撥水処理を行ってある別途作製した金基板を固定した後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【００９３】
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００９４】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。ただし、検体の種類などに応じて、送液を循環させる温度および時間をこれらの範囲から変えることは差し支えなく、例えば、送液を循環させる時間をより長く（例えば、９０分程度）することを妨げるものではない。
【００９５】
送液中の検体中に含有されるサンプル分子の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【００９６】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
【００９７】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎ
である。
【００９８】
洗浄工程
洗浄工程とは、上記「接触」を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。この洗浄工程は、工程（ａ）に含まれることが好ましい。
【００９９】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、上記「接触」で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【０１００】
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記「接触」における「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
【０１０１】
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【０１０２】
＜工程（ｂ）＞
本発明の核酸検出方法において、工程（ｂ）は、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサについて、透明平面基板１１の、金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光分子３２から発光された蛍光量を測定する工程である。
【０１０３】
この工程（ｂ）において、プリズム、レーザー光などの各光学系は、上記第２の態様に記載したものと同じ意味である。
【０１０４】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるターゲット核酸３３の量を算出する工程である。
【０１０５】
より具体的には、既知濃度のターゲット核酸３３での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のターゲット核酸３３の量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１０６】
この工程（ｃ）において、ターゲット核酸３３は、上記第２の態様に記載したものと同じ意味である。
【０１０７】
アッセイＳ／Ｎ比
工程（ｃ）においては、上記工程（ｂ）の前に測定した“ブランク蛍光シグナル”、上記工程（ｂ）で得られた“測定蛍光シグナル”、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを“初期ノイズ”としたとき、下記式（１ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa／Ｉo｜／Ｉn （１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉaはアッセイ蛍光シグナル、Ｉoはブランク蛍光シグナル、Ｉnは初期ノイズである）。
【０１０８】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、検体中に含まれるターゲット核酸３３の濃度が０の場合における"アッセイノイズシグ
ナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa｜／｜Ｉan｜ （１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉanはアッセイノイズシグナル、Ｉaは上記式（１ａ）の場
合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
【０１０９】
〔キット〕
本発明のキットは、本発明の核酸検出方法に用いられることを特徴とするものであって、本発明の核酸検出方法を実施するにあたり、プローブ分子３１、蛍光分子３２および検体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１１０】
例えば、本発明のキットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対するプローブ分子３１とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１１１】
このような「キット」としては、具体的に、透明平面基板１１の一方の表面に金属薄膜１２を形成した基板；撥水処理剤；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；該基板と検体との反応の際に用いる溶液；および洗浄試薬が挙げられ、本発明の核酸検出方法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「駆動装置」を含めることもできる。
【０１１２】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１１３】
［実施例１］
以下の手順により、撥水性プラズモン励起センサを作製し、そのセンサを用いて接触角およびSPFS検出シグナルの測定を行った。
【０１１４】
(1) プラズモン励起センサの作製
工程Ａ−１：ガラス製透明基板への金薄膜形成
透明平面基板としてSCHOTT AG社製のBK7ガラスを用い、その透明平面基板上に、スパッタ装置を用いてクロム薄膜（厚さ２〜３ｎｍ）及び金薄膜（厚さ４４〜５２ｎｍ）をこの順番に積層させて形成した。
【０１１５】
工程Ａ−２：金属薄膜基板へのプローブDNA固定
プローブDNAの3'末端をチオール修飾し、5'末端を蛍光分子Ａｌｅｘａ ６４７で修飾
したプローブDNA（（株）ニッポンジーン製）をリン酸バッファー pH7.2（シグマ社製）
に溶解し、5μMプローブDNA溶液とした。このプローブDNA溶液を、上記工程Ａ−１で金薄膜を形成した基板に滴下し、約15時間自然乾燥させ、プローブDNAを上記基板に固定した
。
【０１１６】
プローブDNAは、例えば、
ACGCCxxxxxxxxGGCGT
なる配列を有しており、右端と左端の5塩基はループ型プローブのステム部分にあたる。
ここで、「xxxxxxxx」で示される部位にある塩基配列が、検出対象の遺伝子の相補的部分配列となる。
【０１１７】
本実施例１では、「xxxxxxxx」で示される配列として、CTCCATCATCCAACATATCAを有するプローブDNA、すなわち、
ACGCCCTCCATCATCCAACATATCAGGCGT （配列番号1）
なる塩基配列で示されるプローブDNAを用いた。
【０１１８】
その後、プローブDNAを固定した上記基板を洗浄し、プラズモン励起センサ前駆基板と
した。
【０１１９】
工程Ａ−３：プラズモン励起センサの撥水処理
上記工程Ａ−１〜２により作製したプラズモン励起センサ前駆基板に対して、エタノールに溶解した50μM パーフルオロオクチルエチルメルカプタン[ＣＦ3−(ＣＦ2)7−ＣＨ2
ＣＨ2−ＳＨ]（シグマ社製）を滴下した。その後、15時間自然乾燥させ、プラズモン励起センサＡとした。
【０１２０】
(2) 作製したセンサについての接触角測定
上記工程Ａ−１〜３を経て作製したプラズモン励起センサＡに４μlの純水を滴下した
ときの接触角（静的接触角）を、接触角測定装置（FTA社製接触角計、型番：FTA125）を
用いて測定した。
【０１２１】
(3) 作製したセンサを用いた核酸検出
上記工程Ａ−１〜３を経て作製したプラズモン励起センサＡを用いて、SPFSによる核酸検出を行った。
【０１２２】
ターゲット核酸としては、
GAGGTAGGTTGTATAGT （配列番号2）
を（株）ニッポンジーンより購入し、リン酸バッファー pH7.2で100nmol/mlに希釈することによりターゲット核酸原液として調製したものを使用した。
【０１２３】
工程Ｂ−１：試料溶液の作成
100nmol/mlの上記ターゲット核酸原液をHBS-EPランニングバッファー（0.01M HEPES pH
7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA）で希釈し、1nmol/mlの試料溶液を調製した。
【０１２４】
工程Ｂ−２：蛍光シグナルの測定
上記工程Ｂ−１で調製した試料溶液1mlを、プラズモン励起センサＡに流速500μl/min
で送液し、90分間循環させた。この試料溶液の循環中に上記プラズモン励起センサＡに対して、プリズム（シグマ光機（株）製）経由でレーザー光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、発した蛍光シグナルをCCDを用いて測定した。なお、試料溶液を送液させる前の上
記ランニングバッファーのみを送液した場合におけるシグナル値を、アッセイノイズシグナルとした。試料溶液についての蛍光シグナルからアッセイノイズシグナルを差し引いて、検出シグナルを得た。
【０１２５】
［比較例１］
上記工程Ａ−１、２を経て作製したプラズモン励起センサ前駆基板に対して、工程Ａ−３で用いたパーフルオロオクチルエチルメルカプタンの代わりに、疎水性を付与するためにオクタデカンチオール[ＣＨ3−(ＣＨ2)17−ＳＨ]を用いて表面処理を行い、プラズモン励起センサＢとした。
【０１２６】
上記の工程を経たプラズモン励起センサＢについて、純水を滴下したときの接触角を上記接触角測定装置を用いて測定した。
【０１２７】
上記工程を経たプラズモン励起センサＢを用いて、SPFSによる核酸検出を行った。このとき、工程Ｂ−１および工程Ｂ−２については、上記実施例１の場合と同様に行った。
【０１２８】
［比較例２］
上記工程Ａ−１、２を経て作製したプラズモン励起センサ前駆基板に対して、上記工程Ａ−３による疎水処理を施すことなく、純水に対する接触角の測定およびSPFSによる核酸検出を行った。なお、SPFSによる核酸検出において、工程Ｂ−１および工程Ｂ−２を上記実施例１の場合と同様に行った。
【０１２９】
表２に、プラズモン検出センサの撥水処理が接触角に及ぼす影響を示した。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
実施例１、比較例１、２で作製した各プラズモン励起センサについて、純水に対する接触角を比較すると、疎水性処理を行った比較例１では約85度に留まったのに対し、撥水処理を行った実施例１では接触角が90度以上となった。また、実施例１と比較例１および２の蛍光シグナル強度を見ると、図２に示されるように、実施例１では比較例１の1.5倍の
シグナル強度が得られた。従って、この発明において行った撥水性付与のための表面処理がモレキュラービーコンを用いたSPFS検出に有効であり、より高感度な核酸検出を可能とする。
【符号の説明】
【０１３２】
１１・・・透明平面基板
１２・・・金属薄膜
１３・・・撥水処理膜
２１・・・蛍光修飾プローブ
２２・・・複合体
３１・・・プローブ分子
３２・・・蛍光分子
３３・・・ターゲット核酸
【配列表フリーテキスト】
【０１３３】
配列番号1
実施例で用いたプローブＤＮＡ
配列番号2
実施例で用いたターゲットＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の核酸を高感度に検出するプラズモン励起センサに関する。さらに本発明は、当該プラズモン励起センサ上で検体を基板に接触させ、これにより固定化された検体中の核酸をプラズモン蛍光測定を用いて高感度に検出する核酸検出装置および核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
【０００３】
一方、核酸などの生体分子を検出する方法としては、検体中の生体分子と親和性の高い分子をプローブ分子として用い、このプローブ分子が生体分子と反応したときに生じる変化を蛍光の変化などの形で検出する方法が広く用いられている。例えば、検体中の生体分子のうち一重鎖のＤＮＡを検出対象とする核酸分子（以下、「ターゲット核酸」と称することがある。）とする場合、この一重鎖のＤＮＡと相補的な配列を有する別の一重鎖のＤＮＡをプローブ分子として固定したバイオセンサを用い、このバイオセンサに蛍光分子を付した生体分子を接触させてこれらを反応させ、その結果バイオセンサに固定された蛍光分子からの蛍光を検出する方法が広く用いられている。しかし、この方法では、検体中の生体分子に予め蛍光分子を修飾させる必要があることから、蛍光分子の修飾量のばらつきによりデータの再現性が低下するという問題があり、また、しばしば検体中の生体分子を予め増幅させておく必要があることから検査プロセスが煩雑になるという問題がある。
【０００４】
このような問題点を解決するため、近年、プローブ分子としてモレキュラビーコンを用いた方法が研究されている。モレキュラービーコンの基本原理は、米国特許第5,925,517
号明細書（特許文献１）に示されており、モレキュラービーコンとは分子の両末端に蛍光分子と消光分子を有するものと定義されている。このモレキュラビーコンにおいては、通常、蛍光分子と消光分子とが近接しており、蛍光分子の励起エネルギーが消光分子に移動するために蛍光が消光している。ここで、モレキュラビーコンが別の分子と反応すると、ビーコンの立体構造が変化するために蛍光分子と消光分子が離れ、蛍光分子の発光が生じる。このため、モレキュラビーコンをプローブ分子として用いる場合には検体中の生体分子に蛍光分子等を別途付す必要がないので、モレキュラビーコンは溶液中で生体分子を検出する際の試薬として一般的によく用いられ始めている。
【０００５】
生体分子の検出にあたり、このモレキュラビーコンを基板に固定した状態で用いる試みもなされている。しかし、蛍光分子と消光分子を有するモレキュラビーコンを基板に固定した状態で使用すると、モレキュラビーコン分子の分子運動が抑制されるために、蛍光の消光効率が低くなり、かつ蛍光強度が低くなるといった問題がある。そのため、モレキュラビーコンに通常用いられる消光分子の代わりに金ナノ粒子を用いる試みが種々なされてきた。また、検出感度の向上を目的として、蛍光増強を用いる方法も試みられてきた。
【０００６】
これらの試みの中で、特開2007-171158号公報（特許文献２）は、基板表面に金属微粒
子を固定し、さらに一端に蛍光分子を修飾したループ型プローブ分子をこの金属微粒子に
固定した生体分子検出素子を用いて、検出用生体分子を非標識の状態で高感度に検出する方法を紹介している。この生体分子検出素子において、金属微粒子が蛍光増強効果を生じさせるとともに消光分子としての役割をも有している。この生体分子検出素子では、検体中のターゲット核酸との反応前においては、金属微粒子と蛍光分子とが近接しているのでプローブ分子上の蛍光分子が金属消光により消光しているが、反応後では蛍光分子と金属微粒子との距離が増大するので蛍光分子が蛍光を発生する。また、特許文献２には、検体中のターゲット核酸を検出する際に、金属微粒子の局在プラズモン共鳴による電場増強効果を利用して蛍光増強を行っているので、高感度な検出が可能であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,925,517号明細書
【特許文献２】特開2007-171158号公報
【特許文献３】特開2001-335804号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献２に記載の前記生体分子検出素子等、二本鎖ＤＮＡの形成によって蛍光発光を生じさせる従来のバイオセンサーが本来の作用・効果を発揮するためには、プローブ分子とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖ＤＮＡが基板表面に対して直立することが前提となる。ところが、実際には、形成した二本鎖ＤＮＡの一部が基板表面に横倒しになることがある。その場合には、プローブ分子上の蛍光分子が金属微粒子と再び近接することとなり、その結果、その蛍光分子が再び金属消光により消光する。現在までのところ、このような現象は知られていないものの、このような現象が生じると、充分な検出感度を得ることができないという問題点がある。
【０００９】
本発明は、このような問題点を克服するため、金属薄膜表面が撥水処理されているプラズモン励起センサ、並びに、このセンサを用いる高感度な核酸検出装置及び核酸検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いて核酸の検出を行うに当たり、プラズモン励起センサの金属薄膜表面に撥水処理を行うと、この金属薄膜表面に固定したプローブ分子に検体中の検出対象とする核酸分子（以下、「ターゲット核酸」という。）と反応させたときに形成する複合体に基づく蛍光の強度が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有することを特徴とする。
【００１２】
また、上記プラズモン励起センサを備えた核酸検出装置として、本発明の核酸検出装置は、
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサを備えており、
前記プラズモン励起センサ上で前記蛍光修飾プローブと検体中のターゲット核酸との反応により形成される二本鎖の複合体を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルと
して検出する
ことを特徴とする。
【００１３】
そして、上記プラズモン励起センサを用いた核酸検出方法として、本発明の核酸検出方法は、
工程（ａ）：透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに対して、前記透明平面基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれる核酸の量を算出する工程
を含むことを特徴とする。
【００１４】
これらの発明において、表面処理が、炭化フッ素系化合物による撥水処理であることが望ましい。
【００１５】
また、これらの発明において、プローブ分子の一方の末端が前記金属薄膜に固定されており、他方の末端が前記蛍光分子と結合していることが望ましく、特に、プローブ分子が、ループ型の構造を有する核酸であるとさらに望ましい。
【００１６】
また、本発明で用いられる検体については、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であると好ましい。
【００１７】
また、本発明は、前記核酸検出方法に用いられるキットをも提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、金属薄膜表面が撥水処理されているプラズモン励起センサを用いることによって、さらなる蛍光強度の増大及び蛍光シグナルの安定性向上をも図ることができるので、高感度かつ高精度の核酸検出装置及び核酸検出方法を提供することができる。さらに、金属薄膜表面が撥水処理されていることから、プラズモン励起センサを汚れの付着のない状態に保つことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本願発明で用いられるプラズモン励起センサの、ターゲット核酸との反応前（ａ）および反応後（ｂ）における模式図を示す。
【図２】実施例１及び比較例１、２で作製した各プラズモン励起センサにおける蛍光シグナル強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について、図１を参照しながら具体的に説明する。
【００２１】
〔プラズモン励起センサ〕
本発明の第１の態様は、
透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサである。
【００２２】
透明平面基板
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する平面基板として透明平面基板１１が用いられる。本発明において、平面基板として透明平面基板１１を用いるのは、後述する金属薄膜１２への光照射をこの平面基板を通じて行うからである。
【００２３】
本発明で用いられる透明平面基板１１について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明平面基板１１が、ガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよい。
【００２４】
また、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０で
あり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００２５】
なお、ガラス製の透明平面基板１１は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎd〕１．５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎd〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎd〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈
折率〔ｎd〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎd〕１．９０）、並びに（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性
との観点から好ましい。
【００２６】
透明平面基板１１は、その表面に金属薄膜１２を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
【００２７】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００２８】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００２９】
金属薄膜
本発明に係るプラズモン励起センサでは、透明平面基板１１の一方の表面に金属薄膜１２を形成する。ここで、プラズモン励起センサを検体と接触させる前においては、図１（ａ）に示すように、金属薄膜１２は、蛍光分子３２と近接した状態にあるので、蛍光分子３２の励起エネルギーを吸収することにより蛍光分子３２に対して金属消光をもたらす役割を有する。一方、プラズモン励起センサを検体と接触させた後においては、図１（ｂ）に示すように、金属薄膜１２は、蛍光分子３２から離れた状態にあるので、蛍光分子３２に対して金属消光をもたらさない。その代わりに、金属薄膜１２は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を引き起こすことで電場を発生させることにより、蛍光分子３２の発光をもたらし増強させる役割を有する。
【００３０】
上記透明平面基板１１の一方の表面に形成された金属薄膜１２としては、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００３１】
なお、透明平面基板１１としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜１２とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチ
タンの薄膜を形成することが好ましい。
【００３２】
透明平面基板１１上に金属薄膜１２を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜１２を形成することが好ましい。
【００３３】
金属薄膜１２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００３４】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００３５】
金属薄膜１２の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３６】
蛍光分子
本発明において、「蛍光分子」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する分子を意味し、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００３７】
本発明で蛍光分子３２として用いられる蛍光色素は、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００３８】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,
９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,
９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００３９】
これらのファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
また、蛍光分子３２として用いられる蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光分子３２となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００４２】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、蛍光分子３２が金属薄膜１２と近接しているときには金属薄膜１２による蛍光の消光が生じていることが好ましいが、蛍光分子３２が金属薄膜１２から離れているときには金属薄膜１２による蛍光の消光の影響を少なくすることが好ましい。そのため、金属薄膜１２に含まれる金属による吸光が適度に生じる波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜１２として金を用いる場合には、最大蛍光波長が６００〜７００ｎｍの範囲にある蛍光色素を使用することが望ましい。このような蛍光色素として、例えば、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ ６４７などが挙げられ、特にＡｌｅｘａ ６４７を使用することが望ましい。一方、金属薄膜１２として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００〜７００ｎｍの範囲にある蛍光色素を使用することが望ましい。
【００４３】
これらの蛍光色素は１種単独で用いてもよく、また２種以上併用してもよい。
【００４４】
これらの蛍光色素は、プローブ分子３１に共有結合で結合してもよく、水素結合、配位結合、イオン結合などにより結合してもよい。例えば、プローブ分子３１に対して直接または適度の長さのリンカーを介して、活性エステル法などの常法を用いて、カルボキシル基を付与した蛍光色素を結合させることにより、プローブ分子３１に蛍光分子３２を導入して蛍光修飾プローブ２１とすることができる。
【００４５】
蛍光修飾プローブ
本発明では、前記金属薄膜１２を形成後に得られる金属薄膜基板において、金属薄膜１２の、基板１１とは反対側の表面に、図1（ａ）に示すようにプローブ分子３１と消光状
態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１を結合させる。この蛍光修飾プローブ２１は、検体中の検出対象とする核酸（以下、「ターゲット核酸」ともいう。）をプラズモン励起センサに固定させる目的で用いられるものである。ここで、「消光状態」とは、金属薄膜１２などによる金属消光のために、蛍光分子３２からの蛍光の発光が、金属消光の影響を受けていない場合と比較して抑制されている状態をいう。
【００４６】
本発明において、「プローブ分子」とは、検体中に含有されるターゲット核酸３３を特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。本発明の場合、このような「分子」または「分子断片」は、核酸を特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子等である。その具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ただ、本発明においては、ターゲット核酸３３と相補的な配列を有する核酸をプローブ分子３１として用いられることが好ましい。そのようなプローブ分子３１を用いると、ターゲット核酸３３と反応させたときにハイブリダイゼーションが起こり、図1（ｂ）に示すように複合
体２２として剛直且つ安定な二本鎖の核酸が形成するからである。なお、相補的な配列とは、水素結合によって安定な塩基対を形成できる配列を意味し、ＤＮＡを例にとると、Ａに対してはＴ、Ｔに対してはＡ、Ｃに対してはＧ、Ｇに対してはＣがそれぞれ相補的な配列である。
【００４７】
ところで、本発明で用いられる蛍光修飾プローブ２１において、ターゲット核酸３３との反応前には、金属薄膜１２による金属消光のため蛍光分子３２からの蛍光が消光している必要があるので、図１（ａ）に示すように蛍光分子３２が金属薄膜１２に近接するような位置でプローブ分子３１と結合している必要がある。金属消光が生じる距離は、蛍光分子３２の種類や金属薄膜１２を構成する金属の種類などにより変わるものの、一般的には、蛍光分子３２と金属薄膜１２との直線距離が５ｎｍ以下の場合に、金属消光が顕著になる。これに対して、ターゲット核酸３３との反応後には、金属薄膜１２による金属消光の影響を受けることなく蛍光分子３２が蛍光を発光している必要があるので、図１（ｂ）に示すように蛍光分子３２が金属薄膜１２から離れた位置に存在している必要がある。このとき、金属薄膜１２と蛍光分子３２との直線距離が３０〜１００ｎｍの範囲にある場合には、金属薄膜１２による蛍光の増強効果が得られる。したがって、プローブ分子３１の一方の末端が金属薄膜１２に固定されており、他方の末端が蛍光分子３２と結合している場合には、プローブ分子３１の長さが、３０〜１００ｎｍの範囲にあることが好ましい。
【００４８】
これらの点を考慮すると、本願で用いられる蛍光修飾プローブ２１において、プローブ分子３１の一方の末端が金属薄膜１２に固定されており、他方の末端が蛍光分子３２と結合していることが好ましく、プローブ分子３１が、ループ型の構造を有していることがより好ましい。これは、プローブ分子３１がループ型の構造を有していれば、蛍光分子３２からの蛍光を金属薄膜１２により効率よく消光できるからである。より具体的には、プローブ分子３１が、ループ型の構造を有する核酸であることが好ましく、このような核酸が、ターゲット核酸３３と相補的な配列をさらに有しているとさらに好ましい。典型的には、３’末端に蛍光分子３２、５’末端にチオール基を持つループ型の核酸プローブが好適に用いられる。ただし、本発明で用いられるプローブ分子３１は、３’末端に蛍光分子３２を有する核酸プローブに限定されるものではなく、５’末端に蛍光分子３２、３’末端にチオール基を持つループ型の核酸プローブをプローブ分子３１として用いてもよい。
【００４９】
プローブ分子３１としてループ型の構造を有する核酸を用いる場合、その核酸の両末端は、外側から内側に向かって互いに相補的な配列を有している。核酸の両末端が相補的な配列であると、この両末端同士が水素結合を形成するためにループ型の構造を形成しやすいのである。しかし、両末端からの相補的な配列の長さが大きいと、両末端同士が形成する水素結合が強固になるので、ターゲット核酸３３との反応が困難になることがある。そのため、両末端からの相補的な配列の長さが８塩基以下であることが好ましい。一方、両末端からの相補的な配列の長さが０の場合には、ループ型の構造を形成しないものの、蛍光分子３２が金属薄膜１２に吸着するために蛍光の消光が起こる。このようなループ型の構造を有する核酸の配列のうち、前記両末端部分の内側にある配列については、ターゲット核酸３３となる核酸の配列に応じて変えることができる。
【００５０】
蛍光修飾プローブ２１の固定化方法としては、例えば、
(i) ３’末端に蛍光分子３２、５’末端にチオール基を持つループ型の核酸プローブを、リン酸バッファー等の中性付近の水溶液に溶解させ、
(ii) この核酸プローブ溶液を金属薄膜１２にスポッティングし、２５〜４０℃にて２
〜２４時間、充分湿度を保った環境で、反応させ、
(iii) その後、必要に応じて未反応の核酸プローブを洗浄により除去する
方法などが挙げられる。なお、ループ型の核酸プローブとして５’末端に蛍光分子３２、３’末端にチオール基を持つものを使用する場合においても、同様の方法を用いることができる。
【００５１】
撥水処理
本発明においては、前記蛍光修飾プローブ２１を結合させた金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有する。ここで、本発明にいう「接触角」は、静的接触角であり、より具体的には、基板に溶液を滴下したときにこの液滴と基板とのなす角度、言い換えれば、液滴の気−液界面が基板と接する点においてこの気−液界面と基板表面とがなす角度である。一般に、基板の対純水接触角が０度に近いほどその基板の親水性が高く、一方、１８０度に近いほど撥水性が高い。この接触角は、従来公知の種々の方法により測定することができる。
【００５２】
本発明の発明者は、本発明を行う過程において、従来技術に基づく生体分子検出素子においては、プローブ分子３１がターゲット核酸３３と反応することにより形成される二本鎖の核酸が基板に対して横倒しになる現象が発生することを見出した。これは、プローブ分子３１を固定した基板表面の疎水性が不充分であるためであると考えられる。そこで、金属薄膜１２の表面に撥水処理を行うと、プローブ分子３１と金属薄膜１２との間で疎水性相互作用が発生し、この疎水性相互作用によって、プローブ分子３１とターゲット核酸３３とがハイブリダイズすることにより形成される複合体２２である二本鎖の核酸が全て直立するようになると考えられる。その結果、蛍光を発する二本鎖の核酸が増加し、高感度化を図ることができると期待される。
【００５３】
従来技術に基づく生体分子検出素子は、プローブ分子３１を固定する基板表面にガラスを用いることが多いことから、その基板表面の対純水接触角が70度程度である。前記特許文献２に開示されている生体分子検出素子の場合、基板表面に自己組織化単分子膜を形成させていることからその表面の対純水接触角がもう少し大きいと考えられる。ただ、後述する実施例における比較例１に示すように、アルカンチオールで表面処理を行った基板でも対純水接触角が85度程度に留まることを考慮すると、ハイブリダイズにより形成される二本鎖の核酸が基板に対して横倒しになることなく全て直立するには、基板表面の対純水接触角が90度以上であることが望ましい。
【００５４】
一方、基板表面の撥水性が極度に高まると、検体中のターゲット核酸３３がプローブ分子３１に近づきにくくなる可能性がある。これを考慮すると、基板表面の対純水接触角が90〜100度の範囲にあることが好ましい。
【００５５】
本発明において、前記蛍光修飾プローブ２１を結合させた金属薄膜１２の表面の対純粋接触角を上記のような値とする方法としては、具体的には、金属薄膜１２に炭化フッ素系化合物などの撥水性物質からなる撥水処理膜１３を形成させる方法が挙げられる。例えば、金属薄膜１２が金薄膜である場合には、例えば、特開2001-335804号公報（特許文献３
）に記載されているような、パーフルオロアルキル基を末端に有する、チオール、ジスルフィドなどの硫黄含有炭化フッ素系化合物、具体的には、
ＣＦ3−(ＣＦ2)m−(ＣＨ2)n−ＳＨ、
ＣＦ3−(ＣＦ2)p−(ＣＨ2)q−ＳＳ−(ＣＨ2)r−(ＣＦ2)s−ＣＦ3、または、
ＣＦ3−(ＣＦ2)x−(ＣＨ2)y−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ3
（m,p,s,xは、それぞれ独立に５〜１３の整数を表し、n,q,r,yは、それぞれ独立に１〜５の整数を表す。）で表される硫黄含有炭化フッ素系化合物が好適に用いられる。このような化合物を撥水性物質として用いると、金−硫黄結合の形成により金薄膜に固定され、自己組織化単分子膜を形成するからである。このような化合物の一例としては、パーフルオロオクチルエチルメルカプタン（ＣＦ3−(ＣＦ2)7−(ＣＨ2)2−ＳＨ）などが挙げられる
。また、このような撥水性物質は、同時にブロッキング剤としての役割も有している。
【００５６】
このような撥水性物質からなる撥水処理膜１３の厚さについては、本発明における蛍光検出の妨げとならない限り特に限定されるものではないが、５ｎｍ以下にすることが好ましい。
【００５７】
撥水処理膜１３を形成させる方法としては、撥水性物質を適当な溶媒に溶解させて金属薄膜１２に付着させ、その後未反応の撥水性物質を洗浄する方法などが挙げられる。ここで、撥水性物質として上記硫黄含有炭化フッ素系化合物を用いる場合、これらの硫黄含有炭化フッ素系化合物は水に溶解しないのでアルコール系溶媒、ケトン系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒等の有機溶媒に溶解させて、金属薄膜１２に塗布等を行い、その後当該有機溶媒を用いて金属薄膜１２を洗浄する等の方法により撥水処理膜１３を形成させることになる。
【００５８】
撥水処理膜１３の形成は、前記蛍光修飾プローブ２１の固定化を行った後に行うことが望ましい。
【００５９】
〔核酸検出装置〕
本発明の第２の態様は、上記第１の態様に示したプラズモン励起センサを備えた核酸検出装置である。具体的には、
透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、該金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサを備えており、
そのセンサ上で前記蛍光修飾プローブ２１と検体中のターゲット核酸３３との反応により形成される二本鎖の複合体２２を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルとして検出する
ことを特徴とする核酸検出装置である。
【００６０】
検体
本発明において、「検体」とは、本発明の核酸検出方法による測定対象となる種々の試料をいう。
【００６１】
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【００６２】
ターゲット核酸
ターゲット核酸３３は、上記プローブ分子３１によって特異的に認識され（または、上記プローブ分子３１を特異的に認識し）結合し得る分子または分子断片としての核酸であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子などが挙げられる。
【００６３】
複合体
本発明において、「複合体」とは、図1（ｂ）に示すように、上記蛍光修飾プローブ２
１とターゲット核酸３３とのハイブリダイゼーションにより形成された複合体２２であり、通常は二本鎖の核酸である。ターゲット核酸３３と蛍光修飾プローブ２１に含まれるプローブ分子３１とが相補的な配列を有する場合には、安定な二本鎖の核酸を形成するので、蛍光分子３２が金属薄膜１２から離れることになり、金属薄膜１２による金属消光の影響を受けなくなる。これに基づき、本発明においては、金属消光の消失により蛍光の発光が生じたことをもって、検体中にターゲット核酸３３が存在すると判断するのである。
【００６４】
したがって、本発明において、形成した複合体２２は、横倒しになることなく直立した状態を維持するので、より高感度な核酸検出が可能となる。
【００６５】
光学系
本発明で用いる光源は、前記金属薄膜１２にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【００６６】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜１２の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光分子３２を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板１１の屈折率、金属薄膜１２の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【００６７】
蛍光分子３２は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【００６８】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤレーザ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜１２に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【００６９】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板１１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
【００７０】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【００７１】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【００７２】
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励
起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【００７３】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００７４】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、蛍光を画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【００７５】
駆動装置
本発明において、上記光学系は「駆動装置」の形で統合されていてもよい。本発明の駆動装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明を実施するためのものである。
【００７６】
「駆動装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【００７７】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５度の角度変更を可能とする。分解能は０．０１度以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【００７８】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
【００７９】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【００８０】
〔核酸検出方法〕
本発明の第３の態様は、上記第１の態様に示したプラズモン励起センサを用いた核酸検出方法であり、上記第２の態様に示した核酸検出装置に対応する核酸検出方法である。具体的には、
工程（ａ）：透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、該金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに対して、前記透明平面基板１１の、前記金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子３２から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるターゲット核酸３３の量を算出する工程
を含むことを特徴とする核酸検出方法である。
【００８１】
＜工程（ａ）＞
本発明の核酸検出方法において、工程（ａ）は、上記第１の態様として示したプラズモン励起センサ、すなわち、透明平面基板１１の表面に金属薄膜１２が形成され、該金属薄膜１２の表面に、プローブ分子３１と消光状態の蛍光分子３２とからなる蛍光修飾プローブ２１が配列され、該金属薄膜１２の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程である。
【００８２】
この工程（ａ）において用いられる透明平面基板１１、金属薄膜１２、プローブ分子３１、蛍光分子３２、蛍光修飾プローブ２１、表面処理、プラズモン励起センサ、検体は、上記第１および第２の態様に記載したものと同じ意味である。
【００８３】
接触
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのうち蛍光修飾プローブ２１が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。本発明において、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【００８４】
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。また、この流路として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【００８５】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【００８６】
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、且つプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路構造の全てを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜１２が表面に存在するプラズモン励起センサの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【００８７】
ここで、前記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【００８８】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【００８９】
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、及びその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作成上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
【００９０】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、且つ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
【００９１】
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートの上に、予め送液導入口及び送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサーを併用してもよい。
【００９２】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成してからその表面に蛍光修飾プローブ２１の固定化および撥水処理を行うか、或いは、予め蛍光修飾プローブ２１の固定化および撥水処理を行ってある別途作製した金基板を固定した後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【００９３】
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００９４】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。ただし、検体の種類などに応じて、送液を循環させる温度および時間をこれらの範囲から変えることは差し支えなく、例えば、送液を循環させる時間をより長く（例えば、９０分程度）することを妨げるものではない。
【００９５】
送液中の検体中に含有されるサンプル分子の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【００９６】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
【００９７】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎ
である。
【００９８】
洗浄工程
洗浄工程とは、上記「接触」を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。この洗浄工程は、工程（ａ）に含まれることが好ましい。
【００９９】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、上記「接触」で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【０１００】
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記「接触」における「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
【０１０１】
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【０１０２】
＜工程（ｂ）＞
本発明の核酸検出方法において、工程（ｂ）は、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサについて、透明平面基板１１の、金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光分子３２から発光された蛍光量を測定する工程である。
【０１０３】
この工程（ｂ）において、プリズム、レーザー光などの各光学系は、上記第２の態様に記載したものと同じ意味である。
【０１０４】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるターゲット核酸３３の量を算出する工程である。
【０１０５】
より具体的には、既知濃度のターゲット核酸３３での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のターゲット核酸３３の量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１０６】
この工程（ｃ）において、ターゲット核酸３３は、上記第２の態様に記載したものと同じ意味である。
【０１０７】
アッセイＳ／Ｎ比
工程（ｃ）においては、上記工程（ｂ）の前に測定した“ブランク蛍光シグナル”、上記工程（ｂ）で得られた“測定蛍光シグナル”、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを“初期ノイズ”としたとき、下記式（１ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa／Ｉo｜／Ｉn （１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉaはアッセイ蛍光シグナル、Ｉoはブランク蛍光シグナル、Ｉnは初期ノイズである）。
【０１０８】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、検体中に含まれるターゲット核酸３３の濃度が０の場合における"アッセイノイズシグ
ナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa｜／｜Ｉan｜ （１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉanはアッセイノイズシグナル、Ｉaは上記式（１ａ）の場
合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
【０１０９】
〔キット〕
本発明のキットは、本発明の核酸検出方法に用いられることを特徴とするものであって、本発明の核酸検出方法を実施するにあたり、プローブ分子３１、蛍光分子３２および検体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１１０】
例えば、本発明のキットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対するプローブ分子３１とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１１１】
このような「キット」としては、具体的に、透明平面基板１１の一方の表面に金属薄膜１２を形成した基板；撥水処理剤；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；該基板と検体との反応の際に用いる溶液；および洗浄試薬が挙げられ、本発明の核酸検出方法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「駆動装置」を含めることもできる。
【０１１２】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１１３】
［実施例１］
以下の手順により、撥水性プラズモン励起センサを作製し、そのセンサを用いて接触角およびSPFS検出シグナルの測定を行った。
【０１１４】
(1) プラズモン励起センサの作製
工程Ａ−１：ガラス製透明基板への金薄膜形成
透明平面基板としてSCHOTT AG社製のBK7ガラスを用い、その透明平面基板上に、スパッタ装置を用いてクロム薄膜（厚さ２〜３ｎｍ）及び金薄膜（厚さ４４〜５２ｎｍ）をこの順番に積層させて形成した。
【０１１５】
工程Ａ−２：金属薄膜基板へのプローブDNA固定
プローブDNAの3'末端をチオール修飾し、5'末端を蛍光分子Ａｌｅｘａ ６４７で修飾
したプローブDNA（（株）ニッポンジーン製）をリン酸バッファー pH7.2（シグマ社製）
に溶解し、5μMプローブDNA溶液とした。このプローブDNA溶液を、上記工程Ａ−１で金薄膜を形成した基板に滴下し、約15時間自然乾燥させ、プローブDNAを上記基板に固定した
。
【０１１６】
プローブDNAは、例えば、
ACGCCxxxxxxxxGGCGT
なる配列を有しており、右端と左端の5塩基はループ型プローブのステム部分にあたる。
ここで、「xxxxxxxx」で示される部位にある塩基配列が、検出対象の遺伝子の相補的部分配列となる。
【０１１７】
本実施例１では、「xxxxxxxx」で示される配列として、CTCCATCATCCAACATATCAを有するプローブDNA、すなわち、
ACGCCCTCCATCATCCAACATATCAGGCGT （配列番号1）
なる塩基配列で示されるプローブDNAを用いた。
【０１１８】
その後、プローブDNAを固定した上記基板を洗浄し、プラズモン励起センサ前駆基板と
した。
【０１１９】
工程Ａ−３：プラズモン励起センサの撥水処理
上記工程Ａ−１〜２により作製したプラズモン励起センサ前駆基板に対して、エタノールに溶解した50μM パーフルオロオクチルエチルメルカプタン[ＣＦ3−(ＣＦ2)7−ＣＨ2
ＣＨ2−ＳＨ]（シグマ社製）を滴下した。その後、15時間自然乾燥させ、プラズモン励起センサＡとした。
【０１２０】
(2) 作製したセンサについての接触角測定
上記工程Ａ−１〜３を経て作製したプラズモン励起センサＡに４μlの純水を滴下した
ときの接触角（静的接触角）を、接触角測定装置（FTA社製接触角計、型番：FTA125）を
用いて測定した。
【０１２１】
(3) 作製したセンサを用いた核酸検出
上記工程Ａ−１〜３を経て作製したプラズモン励起センサＡを用いて、SPFSによる核酸検出を行った。
【０１２２】
ターゲット核酸としては、
GAGGTAGGTTGTATAGT （配列番号2）
を（株）ニッポンジーンより購入し、リン酸バッファー pH7.2で100nmol/mlに希釈することによりターゲット核酸原液として調製したものを使用した。
【０１２３】
工程Ｂ−１：試料溶液の作成
100nmol/mlの上記ターゲット核酸原液をHBS-EPランニングバッファー（0.01M HEPES pH
7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA）で希釈し、1nmol/mlの試料溶液を調製した。
【０１２４】
工程Ｂ−２：蛍光シグナルの測定
上記工程Ｂ−１で調製した試料溶液1mlを、プラズモン励起センサＡに流速500μl/min
で送液し、90分間循環させた。この試料溶液の循環中に上記プラズモン励起センサＡに対して、プリズム（シグマ光機（株）製）経由でレーザー光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、発した蛍光シグナルをCCDを用いて測定した。なお、試料溶液を送液させる前の上
記ランニングバッファーのみを送液した場合におけるシグナル値を、アッセイノイズシグナルとした。試料溶液についての蛍光シグナルからアッセイノイズシグナルを差し引いて、検出シグナルを得た。
【０１２５】
［比較例１］
上記工程Ａ−１、２を経て作製したプラズモン励起センサ前駆基板に対して、工程Ａ−３で用いたパーフルオロオクチルエチルメルカプタンの代わりに、疎水性を付与するためにオクタデカンチオール[ＣＨ3−(ＣＨ2)17−ＳＨ]を用いて表面処理を行い、プラズモン励起センサＢとした。
【０１２６】
上記の工程を経たプラズモン励起センサＢについて、純水を滴下したときの接触角を上記接触角測定装置を用いて測定した。
【０１２７】
上記工程を経たプラズモン励起センサＢを用いて、SPFSによる核酸検出を行った。このとき、工程Ｂ−１および工程Ｂ−２については、上記実施例１の場合と同様に行った。
【０１２８】
［比較例２］
上記工程Ａ−１、２を経て作製したプラズモン励起センサ前駆基板に対して、上記工程Ａ−３による疎水処理を施すことなく、純水に対する接触角の測定およびSPFSによる核酸検出を行った。なお、SPFSによる核酸検出において、工程Ｂ−１および工程Ｂ−２を上記実施例１の場合と同様に行った。
【０１２９】
表２に、プラズモン検出センサの撥水処理が接触角に及ぼす影響を示した。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
実施例１、比較例１、２で作製した各プラズモン励起センサについて、純水に対する接触角を比較すると、疎水性処理を行った比較例１では約85度に留まったのに対し、撥水処理を行った実施例１では接触角が90度以上となった。また、実施例１と比較例１および２の蛍光シグナル強度を見ると、図２に示されるように、実施例１では比較例１の1.5倍の
シグナル強度が得られた。従って、この発明において行った撥水性付与のための表面処理がモレキュラービーコンを用いたSPFS検出に有効であり、より高感度な核酸検出を可能とする。
【符号の説明】
【０１３２】
１１・・・透明平面基板
１２・・・金属薄膜
１３・・・撥水処理膜
２１・・・蛍光修飾プローブ
２２・・・複合体
３１・・・プローブ分子
３２・・・蛍光分子
３３・・・ターゲット核酸
【配列表フリーテキスト】
【０１３３】
配列番号1
実施例で用いたプローブＤＮＡ
配列番号2
実施例で用いたターゲットＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサ。
【請求項２】
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサを備えており、
前記プラズモン励起センサ上で前記蛍光修飾プローブと検体中のターゲット核酸との反応により形成される二本鎖の複合体を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルとして検出する
ことを特徴とする核酸検出装置。
【請求項３】
前記表面処理が、炭化フッ素系化合物による撥水処理である請求項2に記載の核酸検出
装置。
【請求項４】
前記蛍光修飾プローブにおいて、前記プローブ分子の一方の末端が前記金属薄膜に固定されており、他方の末端が前記蛍光分子と結合している請求項2または3に記載の核酸検出装置。
【請求項５】
前記プローブ分子が、ループ型の構造を有する核酸である請求項2〜4のいずれかに記載の核酸検出装置。
【請求項６】
下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする核酸検出方法：
工程（ａ）：透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに対して、前記透明平面基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるターゲット核酸の量を算出する工程。
【請求項７】
前記表面処理が、炭化フッ素系化合物による撥水処理である請求項6に記載の核酸検出
方法。
【請求項８】
前記蛍光修飾プローブにおいて、前記プローブ分子の一方の末端が前記金属薄膜に固定されており、他方の末端が前記蛍光分子と結合している請求項6または7に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
前記プローブ分子が、ループ型の構造を有する核酸である請求項6〜8のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である請求項6〜9のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１１】
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成された基板、撥水処理剤、検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液、該基板と検体との反応の際に用いる溶液、および洗浄試
薬を含むキット。
【請求項１】
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサ。
【請求項２】
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサを備えており、
前記プラズモン励起センサ上で前記蛍光修飾プローブと検体中のターゲット核酸との反応により形成される二本鎖の複合体を、プラズモン光によって励起された蛍光シグナルとして検出する
ことを特徴とする核酸検出装置。
【請求項３】
前記表面処理が、炭化フッ素系化合物による撥水処理である請求項2に記載の核酸検出
装置。
【請求項４】
前記蛍光修飾プローブにおいて、前記プローブ分子の一方の末端が前記金属薄膜に固定されており、他方の末端が前記蛍光分子と結合している請求項2または3に記載の核酸検出装置。
【請求項５】
前記プローブ分子が、ループ型の構造を有する核酸である請求項2〜4のいずれかに記載の核酸検出装置。
【請求項６】
下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする核酸検出方法：
工程（ａ）：透明平面基板の表面に金属薄膜が形成され、該金属薄膜の表面に、プローブ分子と消光状態の蛍光分子とからなる蛍光修飾プローブが配列され、該金属薄膜の表面が、表面処理によって対純水接触角90度以上の撥水性を有するプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに対して、前記透明平面基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるターゲット核酸の量を算出する工程。
【請求項７】
前記表面処理が、炭化フッ素系化合物による撥水処理である請求項6に記載の核酸検出
方法。
【請求項８】
前記蛍光修飾プローブにおいて、前記プローブ分子の一方の末端が前記金属薄膜に固定されており、他方の末端が前記蛍光分子と結合している請求項6または7に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
前記プローブ分子が、ループ型の構造を有する核酸である請求項6〜8のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である請求項6〜9のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１１】
透明平面基板の表面に金属薄膜が形成された基板、撥水処理剤、検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液、該基板と検体との反応の際に用いる溶液、および洗浄試
薬を含むキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１２８０６０（Ｐ２０１１−１２８０６０Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８７７８４（Ｐ２００９−２８７７８４）
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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