ペプチド
【課題】緑膿菌に対してのみ抗菌性および／または殺菌性を発現する新規な抗菌・殺菌性化合物を提供する。
【解決手段】抗菌・殺菌性化合物は、緑膿菌を用いたファージディスプレイ法にて有効と判定された特定のアミノ酸配列を有するペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物である。
【解決手段】抗菌・殺菌性化合物は、緑膿菌を用いたファージディスプレイ法にて有効と判定された特定のアミノ酸配列を有するペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペプチド、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物及びその製造方法、抗菌もしくは殺菌剤、並びに消毒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、第四アンモニウム塩化合物は、細菌、真菌などの微生物に有効な抗菌効果を有することから、医療産業、繊維産業、家庭などの各種産業分野において微生物制御剤として広く利用されている。第四アンモニウム塩化合物の中でも、塩化ベンザルコニウムは、細菌および真菌に対して広い抗菌スペクトルを有する殺菌消毒剤として重要な化合物である。
【０００３】
しかしながら、これら第四アンモニウム塩化合物は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を問わず、様々の菌種に対して抗菌効果を発揮し、有用な環境微生物を死滅させる致命的な欠点を有している。しかも、これら第四アンモニウム塩化合物は、一部の菌種、特に緑膿菌に対する抗菌効果が低いため、使用濃度を異常に高める必要性があり、その結果、環境中に薬剤耐性菌を誘発する危険性がある。
【０００４】
このような現状から、緑膿菌に対してのみ、抗菌性および／または殺菌性を発現する新規な抗菌・殺菌性化合物の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、緑膿菌に対してのみ抗菌性および／または殺菌性を発現する新規な抗菌・殺菌性化合物を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねて来た。その研究過程において、ファージディスプレイ法により緑膿菌に対して特異的に吸着する新規なペプチドを製造することに成功した。本発明者らは、さらに、該ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にＬ−システインを導入したペプチドを合成し、該ペプチド中システイン残基のチオール基と第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた第四アンモニウム塩−ペプチド化合物が、緑膿菌に対してのみ抗菌性および／または殺菌性を発現する所望の抗菌・殺菌性化合物になり得ることを見い出した。本発明は、このような知見に基づき完成されたものである。
【０００７】
本発明は、下記項１〜１２に示すペプチド、ＤＮＡ、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物及びその製造方法、抗菌もしくは殺菌剤、並びに消毒剤を提供する。
項１．配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１：ＳｅｒＩｌｅＬｅｕＰｒｏＴｙｒＰｒｏＴｙｒ
項２．項１に記載のペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチド。
項３．項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
項４．項１または項２に記載のペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と下記一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【０００８】
【化１】
【０００９】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
項５．項４に記載の化合物が、一般式（２）または（３）
【００１０】
【化２】
【００１１】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、項１または項２に記載のペプチドを示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＺは、上記と同義である。］
で表される化合物である、項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
項６．項４に記載の化合物が、一般式（４）
【００１２】
【化３】
【００１３】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
項７．項４に記載の化合物が、一般式（５）
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
項８．項５に記載の一般式（２）または（３）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法であって、
一般式（１）
【００１６】
【化５】
【００１７】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
で表される第四アンモニウム塩と一般式（６）または（７）
【００１８】
【化６】
【００１９】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、項１または項２に記載のペプチドを示す。］
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
項９．項６に記載の一般式（４）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【００２０】
【化７】
【００２１】
［式中、Ｒ１ａは、項６に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（８）
【００２２】
【化８】
【００２３】
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
項１０．項７に記載の一般式（５）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【００２４】
【化９】
【００２５】
［式中、Ｒ１ａは、項７に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（９）
【００２６】
【化１０】
【００２７】
で表されるシステイン−ペプチド付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
項１１．項４〜項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する抗菌もしくは殺菌剤。
項１２．項４〜項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する消毒剤。
【００２８】
ペプチド
本発明のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有している。該ペプチドは、緑膿菌に対して特異的に吸着する性質を有しており、後記実施例１に示すようにファージディスプレイ法により製造される。
配列番号１に示すアミノ酸配列を有しているペプチドをコードするＤＮＡについては、６９１２通り存在する。すなわち、Ｓｅｒでは６通り（ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴおよびＡＧＣ）、Ｉｌｅでは３通り（ＡＴＴ、ＡＴＣおよびＡＴＡ）、Ｌｅｕでは６通り（ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧ）、Ｐｒｏでは４通り（ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡおよびＣＣＧ）、Ｔｙｒでは２通り（ＴＡＴおよびＴＡＣ）存在することから、６×３×６×４×２×４×２＝６９１２通りのＤＮＡ配列を取ることができる。
【００２９】
本発明のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチドであってもよい。
【００３０】
ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端に付加するアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリンなどが挙げられる。これらアミン酸は、上記ペプチドに１〜５個、好ましくは１〜３個付加しており、付加するアミノ酸の種類は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００３１】
ペプチドにアミン酸を付加するに当たっては、公知のペプチド結合形成の反応条件を適宜採用すればよい。
【００３２】
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、上記ペプチド（配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドまたは該ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチド）のＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた化合物である。
【００３３】
一般式（１）において、Ｒ１で示される炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基，イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基などを挙げることができる。これらの中でも、炭素数６〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基が好ましく、その中でも炭素数が偶数のものがより好ましい。具体的には、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基及びｎ−オクタデシル基が好ましく、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基およびｎ−デシル基が特に好ましい。
【００３４】
Ｒ２で示される炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、ブチレン基、イソブチレン基などを挙げることができる。これらの中でも、メチレン基が好ましい。
【００３５】
Ｒ３、ＹおよびＺで示されるハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、沃素原子などが挙げられる。好ましいハロゲン原子は、塩素原子および臭素原子である。
【００３６】
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５で示される低級アルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基などの炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。
【００３７】
Ｒ３で示される低級アルコキシ基としては、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基などの炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。
【００３８】
Ｒ４及びＲ５で示される置換もしくは無置換のフェニル基としては、具体的には、フェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−メチルフェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−エチルフェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−イソプロピルフェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基などの低級アルキル基（炭素数１〜６のアルキル基）などの置換基を有していてもよいフェニル基が挙げられる。
【００３９】
一般式（１）において、Ｙ−Ｒ２−基は、ピリジン環上のどの位置に置換していてもよいが、好ましい置換位置はピリジン環の３または４位であり、より好ましい置換位置はピリジン環の４位である。
【００４０】
一般式（１）において、Ｒ３は、水素原子であるのが好ましい。
【００４１】
一般式（１）で表される第四アンモニウム塩の中でも、一般式（１ａ）で表される第四アンモニウム塩が好ましい。
【００４２】
【化１１】
【００４３】
［式中、Ｒ１ａ、Ｙ及びＺは前記に同じ。］
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、上記した本発明のペプチドとＬ−システインとを反応させ、該ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にＬ−システイン残基を導入し、次いで該Ｌ−システイン残基のチオール基と一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを反応させることにより製造される。
【００４４】
本発明のペプチドとＬ−システインとの反応には、公知のペプチド結合形成の反応条件を適宜採用することができる。
【００４５】
このようにして製造される本発明のペプチド−システイン付加物は、例えば、下記一般式（５）または（６）で表すことができる。
【００４６】
【化１２】
【００４７】
［式中、Ｄ、Ｅ及びＸは前記に同じ。］
本発明の好ましいペプチド−システイン付加物は、例えば、下記一般式（８）、（９）で表すことができる。
【００４８】
【化１３】
【００４９】
【化１４】
【００５０】
ペプチド−システイン付加物と一般式（１）で表される第四アンモニウム塩との反応は、例えば、以下に示すように、イミダゾールの存在下、適当な溶媒中にて行われる。
【００５１】
溶媒としては、ペプチド−システイン付加物が溶解されるものであれば公知の溶媒を広く使用することができる。溶媒は、例えば、水；メタノール、エタノールなどの低級アルコール類；水と低級アルコールとの混合溶媒が好ましい。溶媒は、必要に応じ、２種類以上を併用してもよい。溶媒の使用量は、ペプチド−システイン付加物の濃度が、通常０．００１〜１．０Ｍ、好ましくは０．０１〜０．１Ｍとなるように使用される。
【００５２】
イミダゾールは、ペプチド−システイン付加物１モルに対して、通常１〜６モル、好ましく２〜５モル使用される。
【００５３】
また、ペプチド−システイン付加物は、一般式（１）で表される第四アンモニウム塩１モルに対して、通常０．１〜１．５モル、好ましく０．８〜１．２モル使用される。
【００５４】
この反応は、通常４〜２０℃の温度下で行われ、一般に１〜３時間で終了する。該反応の反応雰囲気は、特に制限されるものではない。
【００５５】
上記反応終了後、得られる反応生成物を公知の単離、精製手段に従って、単離及び精製することにより、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造することができる。
【００５６】
例えば、上記反応終了後、得られる反応生成物を凍結乾燥することにより、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を粗結晶の形態で得ることができる。
【００５７】
また、得られる粗結晶の精製には、高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。例えば、Ｃ１８逆相カラムを用い高速液体クロマトグラフにより分取した本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を含む溶出液を、エバポレーターにより濃縮し、凍結乾燥を行うことにより、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の結晶を高純度で製造することができる。
【００５８】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、緑膿菌に対してのみ優れた抗菌性、殺菌性を有する。この特性を生かして、従来の様々な菌種に有効である抗菌剤、殺菌剤、消毒剤などと異なり、緑膿菌のみに抗菌性、殺菌性を発揮する抗菌もしくは殺菌剤または消毒剤として使用できる。
【００５９】
抗菌もしくは殺菌剤または消毒剤
本発明の抗菌もしくは殺菌剤および消毒剤は、有効成分が本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物である以外は、これらの薬剤に含まれる他の成分、それらの配合量は公知の抗菌もしくは殺菌剤および消毒剤と同じである。
【００６０】
本発明の抗菌もしくは殺菌剤および消毒剤中の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の含有量は、通常０．０１〜５０重量％程度、好ましくは０．１〜１重量％程度である。
【発明の効果】
【００６１】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、緑膿菌に対して特異的に吸着し、その菌種のみに対し高い抗菌性、殺菌性を発現する。
【００６２】
本発明のペプチドは、このような第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造するための中間体として極めて有用である。
【００６３】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、特異的に緑膿菌に対してのみ吸着する特性を有しているため、低い薬剤使用濃度において、有効な抗菌効果を発揮することができ、その結果、薬剤の大量使用による薬剤耐性菌の出現を防止することができる。
【００６４】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物中の第四アンモニウム塩は、単独では抗菌性が極めて低いため、仮に第四アンモニウム残基が遊離したとしても、一般細菌に対して殆ど抗菌性を発現しない。従って、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を含有する抗菌もしくは殺菌剤は、環境微生物に対して非常に優しい抗菌もしくは殺菌剤であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、実施例２の(2.3)で得られた第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図２】図２は、実施例２の(2.4)で得られた第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下に実施例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。
【００６７】
実施例１
本発明ペプチドの製造
ターゲット微生物として、緑膿菌を用い、ファージディスプレイ法により、緑膿菌に結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下の（１）〜（５）のように行った。
【００６８】
なお、ファージディスプレイ法では、M13ファージの表面のマイナータンパクpIIIにペプチドがランダムに呈示されるライブラリ（呈示されるランダムアミノ酸数が７個のペプチドライブラリ）を、New England Bio Lab 社より購入した。
【００６９】
（１）パニング
ＬＢ培地で一晩培養した緑膿菌を遠心にて集菌し、１００μｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に加え、軽く撹拌し、懸濁した。
【００７０】
得られる懸濁液に、約１０μｌ（２×１０１０ｐｆｕ以上／１０μｌ）のファージ溶液を加えて懸濁し、室温で１０分インキュベートした。遠心により菌体を集菌した後、上澄みを捨て、ＨＥＰＥＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．５）で５回洗浄後、遠心にて再度菌体を集菌し、１００μｌの滅菌水で懸濁して、結合ファージ溶液とした。
【００７１】
（２）ファージ増幅・精製
上記で得られた結合ファージ溶液９０μｌを、５０ｍｌのコニカルチューブに加え、そこに一晩培養した大腸菌（Ｆ＋）１００μｌと終濃度２５μｇ／ｍｌになるようにテトラサイクリンを加えて感染させ、４時間半、３７℃で激しく撹拌し、ファージを増幅させた。
【００７２】
増幅後、上記培地を１５ｍｌ遠沈管に移し変え、遠心（８，０００ｒｐｍ×１０分、４℃）して上澄みを別の１５ｍｌ遠沈管に移し、１．６ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加えて懸濁し、４℃で一晩インキュベートした。その後、遠心（１５，０００ｒｐｍ×５分、４℃）して上澄みを捨て、１ｍｌのＴＢＳを加え、沈殿（ファージ）を溶解した。この溶解液を１．５ｍｌのエッペンチューブに移し、１６０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌを加えて混ぜ、氷中に１時間インキュベートした後、遠心（１０，０００ｒｐｍ×１０分、４℃）して上澄みを捨て、２０μｌのＴＢ＋０．０２％ ＮａＮ３で沈殿（ファージ）を溶解した。更に、遠心（１０，０００ｒｐｍ×２分、４℃）して、上澄みを０．５ｍｌのエッペンチューブに移してファージ精製溶液とした。このファージ精製溶液を用いて、再びパニング、増幅および精製の操作を同様にして３回繰り返して行い、４回目はパニング工程においてファージを溶出するところまで行い、ファージ溶出液を得た。
【００７３】
（３）タイター測定（プラークの形成）
４回目のファージ溶出液をＴＢＳで希釈して１０２〜１０５倍希釈液を調製した。
【００７４】
一方で、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを加えたＬＢプレート培地（プラスチックシャーレに作製）を３７℃で温め、アガローストップをオートクレーブで溶解し、４５℃で固まらないように暖めておいた。
【００７５】
ＬＢ培地でＯＤ６００＝０．５になるまで培養した大腸菌（Ｆ＋）２００μｌに、希釈したファージ溶液を１０μｌ加え撹拌して１〜５分間インキュベートした後、４５℃で保存しておいたアガローストップに加えて撹拌してから、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを加えたＬＢプレート培地に流し込み、約５分間インキュベートした。アガローストップが固まり、余分な水気が飛んだら、フタをして、３７℃で一晩インキュベートした（ファージが存在すれば、青色のプラークが出現する）。
【００７６】
（４）プラークからファージの増幅
出現したプラークを楊枝でつつき、ピッキングした。ピッキングした楊枝は、ＬＢ培地に終濃度２０μｇ／ｍｌになるようにテトラサイクリンを加えた培地２ｍｌに入れ、そこへ一晩培養した大腸菌（Ｆ＋）２０μｌを添加後（試験管）、４時間半激しく振とう培養した。培養後は、上記（２）と同様の操作を行ってシングルファージの精製を行い、８６個のファージを得た。
【００７７】
（５）ペプチド配列確認
今回行ったファージディスプレイ法では、ペプチドはファージのpIIIタンパクのＮ末端に呈示されているため、ファージpIIIgene（シグナル配列部を除く）の5'上流を読めば、ペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。
【００７８】
その結果、得られたペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有していることが明らかになった。
【００７９】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、以下の理化学的性質を有している。
等電点ＩＰ＝５．６５
ｍ／ｚ：８５０．０。
【００８０】
実施例２
(2.1) 式（８）で表されるペプチド−システイン付加物の製造
ペプチド合成は、市販のペプチド合成機を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相合成法により行った。縮合剤は、ヘキサフルオロリン酸塩とした。ペプチド合成機のペプチド合成プログラムに従い、脱保護反応、縮合反応を反復し、樹脂に結合しているＦｍｏｃ−アミノ酸からペプチド鎖を伸長する。具体的には、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドによって、アミノ酸保護基であるＦｍｏｃを切断除去し、ジメチルホルムアミドで洗浄し、次にＦｍｏｃ−アミノ酸を反応させ、ジメチルホルムアミドで洗浄する工程を反復した。伸長反応終了後、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドによりＦｍｏｃ基を切断し、ジメチルホルムアミドで洗浄した。ペプチドは、８２．５％トリフルオロ酢酸溶液（トリフルオロ酢酸：１，２−エタンジチオール：ｍ−クレゾール：チオアニソール：水＝８２．５：２．５：５：５：５）により樹脂から切断され、樹脂をろ過で除き、ジエチルエーテル中に沈殿させた後、遠心分離によりジエチルエーテル層を取り除いた。このジエチルエーテル洗浄工程３回行った。得られたペプチド−システイン付加物は、純水に溶解し、凍結乾燥により結晶化させ、ＨＰＬＣにより精製を行い、純度＞９５％で目的のペプチド−システイン付加物を得た。
等電点ＩＰ＝４．９７
ｍ／ｚ：９５５．５。
【００８１】
(2.2) Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｙ及びＺが臭素原子を示す一般式（１ａ）で表される第四アンモニウム塩の製造
４−ヒドロキシルメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド０．３３１ミリモルに４８％臭化水素水５００μｌを加えて、４時間還流した。反応後、エバポレーターにより減圧濃縮し、クロロホルム−メタノール混合溶媒を溶離液としたシリカゲルオープンカラムにより精製し、Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｙ及びＺが臭素原子を示す一般式（１ａ）で表される第四アンモニウム塩（４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド）９５ｍｇ（収率７７％）を得た。
【００８２】
得られた化合物の分析を行ったところ、得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、基準物質 ＴＭＳ）により、目的化合物が得られていることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，ＴＭＳ）δｐｐｍ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ）、１．２７−１．３２（８Ｈ，ｍ）、１．３６−１．４０（２Ｈ，ｍ）、２．０１（２Ｈ，ｍ）、４．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７）、４．８１（２Ｈ，ｓ）、８．１５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６）、８．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８）。
【００８３】
(2.3) 第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造
(2.1)で製造した式（８）で表されるペプチド−システイン付加物と(2.2)で製造した４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイドとを以下に示すように反応させることにより、Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｚが臭素原子を示す一般式（４）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造した。
【００８４】
ペプチド−システイン付加物（８）０．０２４９ミリモルを、氷浴で冷却し、撹拌しながら水２．４ｍｌに溶解させた。次に、４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド（１ａ）０．０２５３ミリモルを加え、最後にイミダゾール０．１１１ミリモルを加え、氷浴中で撹拌しながら１時間反応させた。反応後、液体窒素で水溶液形態の反応混合物を凍結し、凍結乾燥し、粗結晶４０．０ｍｇを得た。
【００８５】
得られた粗結晶を高速液体クロマトグラフにて精製を行った。具体的には、プレカラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８、１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｍｍ）およびＣ１８逆相カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃ１８、１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。すなわち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で０％から１００％への濃度勾配を設ける）、２ｍｌ／分の流速で上記カラムを用いて２７分間分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器を用いて２５４ｎｍで検出し、記録チャート上にピークとして示される。得られた化合物（保持時間１８．９５分）の分析を行ったところ、収率６５％、純度＞９３％であった。
【００８６】
また、溶離した化合物の質量をＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ質量分析装置（Applied Biosystems，ＵＳＡ）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。さらに、得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、基準物質 ＴＭＳ）により、１−オクチルピリジニウム塩に特徴的なピリジニウム骨格のプロトンピーク（８．０７ｐｐｍ，８．８６ｐｐｍ）、ならびにｎ−オクチル基由来のメチレンプロトンピーク（１．３７ｐｐｍ−１．５４ｐｐｍ）を検出し、１−オクチルピリジニウム塩がペプチド鎖に結合していることを確認した。その結果、目的とする第四アンモニウム塩−ペプチド化合物が製造されていることを確認した。
ｍ／ｚ：１１５８．６
得られた本発明化合物１である第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を図１に示す。
【００８７】
(2.4) 第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造
(2.1)と同様の手法で製造した式（９）で表されるペプチド−システイン付加物と(2.2)で製造した４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイドとを以下に示すように反応させることにより、Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｚが臭素原子を示す一般式（５）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造した。
【００８８】
システイン−ペプチド付加物（９）０．０３１３ミリモルを、氷浴で冷却し、撹拌しながら水５．０ｍｌ溶解させた。次に、４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド（１ａ）０．０３４４ミリモルを加え、最後にイミダゾール０．１２８ミリモルを加え、氷浴中で撹拌しながら１．５時間反応させた。反応後、液体窒素で水溶液形態の反応混合物を凍結し、凍結乾燥し、粗結晶５５．３ｍｇを得た。
【００８９】
得られた粗結晶を高速液体クロマトグラフにて精製を行った。具体的には、プレカラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃ１８、２０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ）およびＣ１８逆相カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃ１８、２０ｍｍＩ．Ｄ．×２００ｍｍ）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。すなわち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で０％から１００％への濃度勾配を設ける）、８ｍｌ／分の流速で上記カラムを用いて４５分間分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器を用いて２５４ｎｍで検出し、記録チャート上にピークとして示される。得られた化合物（保持時間２４−２６分）の分析を行ったところ、収率６３％、純度＞９８％であった。
【００９０】
また、溶離した化合物の質量をＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ質量分析装置（Applied Biosystems，ＵＳＡ）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。さらに、得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、基準物質 ＴＭＳ）により、１−オクチルピリジニウム塩に特徴的なピリジニウム骨格のプロトンピーク（８．１３ｐｐｍ−８．１５ｐｐｍ，８．９０ｐｐｍ−８．９４ｐｐｍ）、ならびにｎ−オクチル基由来のメチレンプロトンピーク（１．２９ｐｐｍ−１．３８ｐｐｍ）を検出し、１−オクチルピリジニウム塩がペプチド鎖に結合していることを確認した。その結果、目的とする第四アンモニウム塩−ペプチド化合物が製造されていることを確認した。
ｍ／ｚ：１１５８．６
得られた本発明化合物２である第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を図２に示す。
【００９１】
実施例３
実施例２の(2.3)で得られた第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物１）について、下記に記載のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を９６穴（ｗｅｌｌ）マイクロプレートを用いた無菌水希釈法により求め、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145に対する特異的殺菌性能を検討した。
【００９２】
また、実施例２の(2.2)の原料である第四アンモニウム塩（４−ヒドロキシルメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド、比較化合物Ａ）および(2.1)のペプチド（比較化合物Ｂ）についても、上記と同じようにグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を求めた。
【００９３】
供試菌
・グラム陰性菌
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Klebsiella pneumoniae ATCC 4352
Escherichia coli NBRC 12713
Proteus mirabilis NBRC 3849
Serratia marcescens ATCC 13880
・グラム陰性菌
Kocuria rhizophila NBRC 12708
Staphylococcus aureus NBRC 12732
Staphylococcus aureus COL 1(MRSA)
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定
この測定は、無菌フード（エアテック社製、クリーンベンチ）内で行い、特に記載のない限り、微生物は氷冷下に保った。細菌をＬ−ｂｒｏｔｈ（トリプトン１．０％（Ｗ／Ｖ）、酵母抽出物０．５％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ７．０〜７．２）５ｍｌ中で、３７℃、１８時間前培養した。この前培養菌体を遠心分離機（株式会社佐久間製作所製、ＭＯＤＥＬ ５０Ａ−７）で冷却遠心分離（０℃、６５００ｒｐｍ×１０分）により集菌し、生理食塩水で洗菌後、無菌水で希釈し、分光光度計（株式会社島津製作所製、型名：ＵＶ−１７００）を用いて、菌懸濁液濃度が１×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ（ＯＤ６６０＝０．００００１）となるように調製した。殺菌試験については、８０％のエチルアルコールを用いて調製した薬剤溶液を、無菌水で５０倍希釈した後、２倍の１０段階希釈した。各薬剤溶液２５μｌに上記の菌懸濁液２５μｌを接種し、３７℃、１時間薬剤接触した後、試料液２０μｌを分取し、ＮＢ培地２００μｌ中に接種した。このＮＢ判定培地を３７℃で２４時間培養し、増殖の有無を肉眼で判定し、増殖の認められない最小薬剤濃度を最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration、ＭＢＣ）とした。本発明化合物１および比較化合物Ａについては上記試験を３回以上行った。
【００９４】
結果を表１に示す。
【００９５】
【表１】
【００９６】
表１から、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物１）は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145）に対してのみ優れた抗菌性、殺菌性を有し、他の菌種に対しては抗菌効果が低いことが明らかである。また、未結合の第四アンモニウム塩（比較化合物Ａ）単独では低い抗菌力であったのに対し、ペプチド（比較化合物Ｂ）に結合させたことによって著しく抗菌性が上昇したことから、ペプチドの緑膿菌吸着特異性が十分に発揮され、第四アンモニウム塩の菌種特異性が付与されていることが明らかになった。
【００９７】
実施例４
実施例２の(2.4)で得られた第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物２）について、下記に記載のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を９６穴（ｗｅｌｌ）マイクロプレートを用いた無菌水希釈法により求め、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145に対する特異的殺菌性能を検討した。
【００９８】
また、実施例２の(2.2)の原料である第四アンモニウム塩（４−ヒドロキシルメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド、比較化合物Ａ）についても、上記と同じようにグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を求めた。
【００９９】
供試菌
・グラム陰性菌
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Klebsiella pneumoniae ATCC 4352
Escherichia coli NBRC 12713
Serratia marcescens ATCC 13880
・グラム陰性菌
Kocuria rhizophila NBRC 12708
Staphylococcus aureus NBRC 12732
Staphylococcus aureus COL 1(MRSA)
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定
この測定は、実施例３と同様に行い、本発明化合物２および比較化合物Ａについては上記試験を３回以上行った。
【０１００】
結果を表２に示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
表２から、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物２）は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145）に対してのみ優れた抗菌性、殺菌性を有し、他の菌種に対しては抗菌効果が低いことが明らかである。また、未結合の第四アンモニウム塩（比較化合物Ａ）単独では低い抗菌力であったのに対し、ペプチドに結合させたことによって著しく抗菌性が上昇したことから、ペプチドの緑膿菌吸着特異性が十分に発揮され、第四アンモニウム塩の菌種特異性が付与されていることが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペプチド、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物及びその製造方法、抗菌もしくは殺菌剤、並びに消毒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、第四アンモニウム塩化合物は、細菌、真菌などの微生物に有効な抗菌効果を有することから、医療産業、繊維産業、家庭などの各種産業分野において微生物制御剤として広く利用されている。第四アンモニウム塩化合物の中でも、塩化ベンザルコニウムは、細菌および真菌に対して広い抗菌スペクトルを有する殺菌消毒剤として重要な化合物である。
【０００３】
しかしながら、これら第四アンモニウム塩化合物は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を問わず、様々の菌種に対して抗菌効果を発揮し、有用な環境微生物を死滅させる致命的な欠点を有している。しかも、これら第四アンモニウム塩化合物は、一部の菌種、特に緑膿菌に対する抗菌効果が低いため、使用濃度を異常に高める必要性があり、その結果、環境中に薬剤耐性菌を誘発する危険性がある。
【０００４】
このような現状から、緑膿菌に対してのみ、抗菌性および／または殺菌性を発現する新規な抗菌・殺菌性化合物の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、緑膿菌に対してのみ抗菌性および／または殺菌性を発現する新規な抗菌・殺菌性化合物を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねて来た。その研究過程において、ファージディスプレイ法により緑膿菌に対して特異的に吸着する新規なペプチドを製造することに成功した。本発明者らは、さらに、該ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にＬ−システインを導入したペプチドを合成し、該ペプチド中システイン残基のチオール基と第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた第四アンモニウム塩−ペプチド化合物が、緑膿菌に対してのみ抗菌性および／または殺菌性を発現する所望の抗菌・殺菌性化合物になり得ることを見い出した。本発明は、このような知見に基づき完成されたものである。
【０００７】
本発明は、下記項１〜１２に示すペプチド、ＤＮＡ、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物及びその製造方法、抗菌もしくは殺菌剤、並びに消毒剤を提供する。
項１．配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１：ＳｅｒＩｌｅＬｅｕＰｒｏＴｙｒＰｒｏＴｙｒ
項２．項１に記載のペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチド。
項３．項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
項４．項１または項２に記載のペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と下記一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【０００８】
【化１】
【０００９】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
項５．項４に記載の化合物が、一般式（２）または（３）
【００１０】
【化２】
【００１１】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、項１または項２に記載のペプチドを示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＺは、上記と同義である。］
で表される化合物である、項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
項６．項４に記載の化合物が、一般式（４）
【００１２】
【化３】
【００１３】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
項７．項４に記載の化合物が、一般式（５）
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
項８．項５に記載の一般式（２）または（３）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法であって、
一般式（１）
【００１６】
【化５】
【００１７】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
で表される第四アンモニウム塩と一般式（６）または（７）
【００１８】
【化６】
【００１９】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、項１または項２に記載のペプチドを示す。］
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
項９．項６に記載の一般式（４）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【００２０】
【化７】
【００２１】
［式中、Ｒ１ａは、項６に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（８）
【００２２】
【化８】
【００２３】
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
項１０．項７に記載の一般式（５）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【００２４】
【化９】
【００２５】
［式中、Ｒ１ａは、項７に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（９）
【００２６】
【化１０】
【００２７】
で表されるシステイン−ペプチド付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
項１１．項４〜項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する抗菌もしくは殺菌剤。
項１２．項４〜項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する消毒剤。
【００２８】
ペプチド
本発明のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有している。該ペプチドは、緑膿菌に対して特異的に吸着する性質を有しており、後記実施例１に示すようにファージディスプレイ法により製造される。
配列番号１に示すアミノ酸配列を有しているペプチドをコードするＤＮＡについては、６９１２通り存在する。すなわち、Ｓｅｒでは６通り（ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴおよびＡＧＣ）、Ｉｌｅでは３通り（ＡＴＴ、ＡＴＣおよびＡＴＡ）、Ｌｅｕでは６通り（ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧ）、Ｐｒｏでは４通り（ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡおよびＣＣＧ）、Ｔｙｒでは２通り（ＴＡＴおよびＴＡＣ）存在することから、６×３×６×４×２×４×２＝６９１２通りのＤＮＡ配列を取ることができる。
【００２９】
本発明のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチドであってもよい。
【００３０】
ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端に付加するアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリンなどが挙げられる。これらアミン酸は、上記ペプチドに１〜５個、好ましくは１〜３個付加しており、付加するアミノ酸の種類は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００３１】
ペプチドにアミン酸を付加するに当たっては、公知のペプチド結合形成の反応条件を適宜採用すればよい。
【００３２】
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、上記ペプチド（配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドまたは該ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチド）のＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた化合物である。
【００３３】
一般式（１）において、Ｒ１で示される炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基，イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基などを挙げることができる。これらの中でも、炭素数６〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基が好ましく、その中でも炭素数が偶数のものがより好ましい。具体的には、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基及びｎ−オクタデシル基が好ましく、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基およびｎ−デシル基が特に好ましい。
【００３４】
Ｒ２で示される炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、ブチレン基、イソブチレン基などを挙げることができる。これらの中でも、メチレン基が好ましい。
【００３５】
Ｒ３、ＹおよびＺで示されるハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、沃素原子などが挙げられる。好ましいハロゲン原子は、塩素原子および臭素原子である。
【００３６】
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５で示される低級アルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基などの炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。
【００３７】
Ｒ３で示される低級アルコキシ基としては、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基などの炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。
【００３８】
Ｒ４及びＲ５で示される置換もしくは無置換のフェニル基としては、具体的には、フェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−メチルフェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−エチルフェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−イソプロピルフェニル基、ｏ、ｍまたはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基などの低級アルキル基（炭素数１〜６のアルキル基）などの置換基を有していてもよいフェニル基が挙げられる。
【００３９】
一般式（１）において、Ｙ−Ｒ２−基は、ピリジン環上のどの位置に置換していてもよいが、好ましい置換位置はピリジン環の３または４位であり、より好ましい置換位置はピリジン環の４位である。
【００４０】
一般式（１）において、Ｒ３は、水素原子であるのが好ましい。
【００４１】
一般式（１）で表される第四アンモニウム塩の中でも、一般式（１ａ）で表される第四アンモニウム塩が好ましい。
【００４２】
【化１１】
【００４３】
［式中、Ｒ１ａ、Ｙ及びＺは前記に同じ。］
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、上記した本発明のペプチドとＬ−システインとを反応させ、該ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にＬ−システイン残基を導入し、次いで該Ｌ−システイン残基のチオール基と一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを反応させることにより製造される。
【００４４】
本発明のペプチドとＬ−システインとの反応には、公知のペプチド結合形成の反応条件を適宜採用することができる。
【００４５】
このようにして製造される本発明のペプチド−システイン付加物は、例えば、下記一般式（５）または（６）で表すことができる。
【００４６】
【化１２】
【００４７】
［式中、Ｄ、Ｅ及びＸは前記に同じ。］
本発明の好ましいペプチド−システイン付加物は、例えば、下記一般式（８）、（９）で表すことができる。
【００４８】
【化１３】
【００４９】
【化１４】
【００５０】
ペプチド−システイン付加物と一般式（１）で表される第四アンモニウム塩との反応は、例えば、以下に示すように、イミダゾールの存在下、適当な溶媒中にて行われる。
【００５１】
溶媒としては、ペプチド−システイン付加物が溶解されるものであれば公知の溶媒を広く使用することができる。溶媒は、例えば、水；メタノール、エタノールなどの低級アルコール類；水と低級アルコールとの混合溶媒が好ましい。溶媒は、必要に応じ、２種類以上を併用してもよい。溶媒の使用量は、ペプチド−システイン付加物の濃度が、通常０．００１〜１．０Ｍ、好ましくは０．０１〜０．１Ｍとなるように使用される。
【００５２】
イミダゾールは、ペプチド−システイン付加物１モルに対して、通常１〜６モル、好ましく２〜５モル使用される。
【００５３】
また、ペプチド−システイン付加物は、一般式（１）で表される第四アンモニウム塩１モルに対して、通常０．１〜１．５モル、好ましく０．８〜１．２モル使用される。
【００５４】
この反応は、通常４〜２０℃の温度下で行われ、一般に１〜３時間で終了する。該反応の反応雰囲気は、特に制限されるものではない。
【００５５】
上記反応終了後、得られる反応生成物を公知の単離、精製手段に従って、単離及び精製することにより、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造することができる。
【００５６】
例えば、上記反応終了後、得られる反応生成物を凍結乾燥することにより、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を粗結晶の形態で得ることができる。
【００５７】
また、得られる粗結晶の精製には、高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。例えば、Ｃ１８逆相カラムを用い高速液体クロマトグラフにより分取した本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を含む溶出液を、エバポレーターにより濃縮し、凍結乾燥を行うことにより、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の結晶を高純度で製造することができる。
【００５８】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、緑膿菌に対してのみ優れた抗菌性、殺菌性を有する。この特性を生かして、従来の様々な菌種に有効である抗菌剤、殺菌剤、消毒剤などと異なり、緑膿菌のみに抗菌性、殺菌性を発揮する抗菌もしくは殺菌剤または消毒剤として使用できる。
【００５９】
抗菌もしくは殺菌剤または消毒剤
本発明の抗菌もしくは殺菌剤および消毒剤は、有効成分が本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物である以外は、これらの薬剤に含まれる他の成分、それらの配合量は公知の抗菌もしくは殺菌剤および消毒剤と同じである。
【００６０】
本発明の抗菌もしくは殺菌剤および消毒剤中の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の含有量は、通常０．０１〜５０重量％程度、好ましくは０．１〜１重量％程度である。
【発明の効果】
【００６１】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、緑膿菌に対して特異的に吸着し、その菌種のみに対し高い抗菌性、殺菌性を発現する。
【００６２】
本発明のペプチドは、このような第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造するための中間体として極めて有用である。
【００６３】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物は、特異的に緑膿菌に対してのみ吸着する特性を有しているため、低い薬剤使用濃度において、有効な抗菌効果を発揮することができ、その結果、薬剤の大量使用による薬剤耐性菌の出現を防止することができる。
【００６４】
本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物中の第四アンモニウム塩は、単独では抗菌性が極めて低いため、仮に第四アンモニウム残基が遊離したとしても、一般細菌に対して殆ど抗菌性を発現しない。従って、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を含有する抗菌もしくは殺菌剤は、環境微生物に対して非常に優しい抗菌もしくは殺菌剤であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、実施例２の(2.3)で得られた第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図２】図２は、実施例２の(2.4)で得られた第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下に実施例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。
【００６７】
実施例１
本発明ペプチドの製造
ターゲット微生物として、緑膿菌を用い、ファージディスプレイ法により、緑膿菌に結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下の（１）〜（５）のように行った。
【００６８】
なお、ファージディスプレイ法では、M13ファージの表面のマイナータンパクpIIIにペプチドがランダムに呈示されるライブラリ（呈示されるランダムアミノ酸数が７個のペプチドライブラリ）を、New England Bio Lab 社より購入した。
【００６９】
（１）パニング
ＬＢ培地で一晩培養した緑膿菌を遠心にて集菌し、１００μｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に加え、軽く撹拌し、懸濁した。
【００７０】
得られる懸濁液に、約１０μｌ（２×１０１０ｐｆｕ以上／１０μｌ）のファージ溶液を加えて懸濁し、室温で１０分インキュベートした。遠心により菌体を集菌した後、上澄みを捨て、ＨＥＰＥＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．５）で５回洗浄後、遠心にて再度菌体を集菌し、１００μｌの滅菌水で懸濁して、結合ファージ溶液とした。
【００７１】
（２）ファージ増幅・精製
上記で得られた結合ファージ溶液９０μｌを、５０ｍｌのコニカルチューブに加え、そこに一晩培養した大腸菌（Ｆ＋）１００μｌと終濃度２５μｇ／ｍｌになるようにテトラサイクリンを加えて感染させ、４時間半、３７℃で激しく撹拌し、ファージを増幅させた。
【００７２】
増幅後、上記培地を１５ｍｌ遠沈管に移し変え、遠心（８，０００ｒｐｍ×１０分、４℃）して上澄みを別の１５ｍｌ遠沈管に移し、１．６ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加えて懸濁し、４℃で一晩インキュベートした。その後、遠心（１５，０００ｒｐｍ×５分、４℃）して上澄みを捨て、１ｍｌのＴＢＳを加え、沈殿（ファージ）を溶解した。この溶解液を１．５ｍｌのエッペンチューブに移し、１６０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌを加えて混ぜ、氷中に１時間インキュベートした後、遠心（１０，０００ｒｐｍ×１０分、４℃）して上澄みを捨て、２０μｌのＴＢ＋０．０２％ ＮａＮ３で沈殿（ファージ）を溶解した。更に、遠心（１０，０００ｒｐｍ×２分、４℃）して、上澄みを０．５ｍｌのエッペンチューブに移してファージ精製溶液とした。このファージ精製溶液を用いて、再びパニング、増幅および精製の操作を同様にして３回繰り返して行い、４回目はパニング工程においてファージを溶出するところまで行い、ファージ溶出液を得た。
【００７３】
（３）タイター測定（プラークの形成）
４回目のファージ溶出液をＴＢＳで希釈して１０２〜１０５倍希釈液を調製した。
【００７４】
一方で、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを加えたＬＢプレート培地（プラスチックシャーレに作製）を３７℃で温め、アガローストップをオートクレーブで溶解し、４５℃で固まらないように暖めておいた。
【００７５】
ＬＢ培地でＯＤ６００＝０．５になるまで培養した大腸菌（Ｆ＋）２００μｌに、希釈したファージ溶液を１０μｌ加え撹拌して１〜５分間インキュベートした後、４５℃で保存しておいたアガローストップに加えて撹拌してから、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを加えたＬＢプレート培地に流し込み、約５分間インキュベートした。アガローストップが固まり、余分な水気が飛んだら、フタをして、３７℃で一晩インキュベートした（ファージが存在すれば、青色のプラークが出現する）。
【００７６】
（４）プラークからファージの増幅
出現したプラークを楊枝でつつき、ピッキングした。ピッキングした楊枝は、ＬＢ培地に終濃度２０μｇ／ｍｌになるようにテトラサイクリンを加えた培地２ｍｌに入れ、そこへ一晩培養した大腸菌（Ｆ＋）２０μｌを添加後（試験管）、４時間半激しく振とう培養した。培養後は、上記（２）と同様の操作を行ってシングルファージの精製を行い、８６個のファージを得た。
【００７７】
（５）ペプチド配列確認
今回行ったファージディスプレイ法では、ペプチドはファージのpIIIタンパクのＮ末端に呈示されているため、ファージpIIIgene（シグナル配列部を除く）の5'上流を読めば、ペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。
【００７８】
その結果、得られたペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有していることが明らかになった。
【００７９】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、以下の理化学的性質を有している。
等電点ＩＰ＝５．６５
ｍ／ｚ：８５０．０。
【００８０】
実施例２
(2.1) 式（８）で表されるペプチド−システイン付加物の製造
ペプチド合成は、市販のペプチド合成機を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相合成法により行った。縮合剤は、ヘキサフルオロリン酸塩とした。ペプチド合成機のペプチド合成プログラムに従い、脱保護反応、縮合反応を反復し、樹脂に結合しているＦｍｏｃ−アミノ酸からペプチド鎖を伸長する。具体的には、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドによって、アミノ酸保護基であるＦｍｏｃを切断除去し、ジメチルホルムアミドで洗浄し、次にＦｍｏｃ−アミノ酸を反応させ、ジメチルホルムアミドで洗浄する工程を反復した。伸長反応終了後、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドによりＦｍｏｃ基を切断し、ジメチルホルムアミドで洗浄した。ペプチドは、８２．５％トリフルオロ酢酸溶液（トリフルオロ酢酸：１，２−エタンジチオール：ｍ−クレゾール：チオアニソール：水＝８２．５：２．５：５：５：５）により樹脂から切断され、樹脂をろ過で除き、ジエチルエーテル中に沈殿させた後、遠心分離によりジエチルエーテル層を取り除いた。このジエチルエーテル洗浄工程３回行った。得られたペプチド−システイン付加物は、純水に溶解し、凍結乾燥により結晶化させ、ＨＰＬＣにより精製を行い、純度＞９５％で目的のペプチド−システイン付加物を得た。
等電点ＩＰ＝４．９７
ｍ／ｚ：９５５．５。
【００８１】
(2.2) Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｙ及びＺが臭素原子を示す一般式（１ａ）で表される第四アンモニウム塩の製造
４−ヒドロキシルメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド０．３３１ミリモルに４８％臭化水素水５００μｌを加えて、４時間還流した。反応後、エバポレーターにより減圧濃縮し、クロロホルム−メタノール混合溶媒を溶離液としたシリカゲルオープンカラムにより精製し、Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｙ及びＺが臭素原子を示す一般式（１ａ）で表される第四アンモニウム塩（４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド）９５ｍｇ（収率７７％）を得た。
【００８２】
得られた化合物の分析を行ったところ、得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、基準物質 ＴＭＳ）により、目的化合物が得られていることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，ＴＭＳ）δｐｐｍ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ）、１．２７−１．３２（８Ｈ，ｍ）、１．３６−１．４０（２Ｈ，ｍ）、２．０１（２Ｈ，ｍ）、４．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７）、４．８１（２Ｈ，ｓ）、８．１５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６）、８．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８）。
【００８３】
(2.3) 第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造
(2.1)で製造した式（８）で表されるペプチド−システイン付加物と(2.2)で製造した４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイドとを以下に示すように反応させることにより、Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｚが臭素原子を示す一般式（４）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造した。
【００８４】
ペプチド−システイン付加物（８）０．０２４９ミリモルを、氷浴で冷却し、撹拌しながら水２．４ｍｌに溶解させた。次に、４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド（１ａ）０．０２５３ミリモルを加え、最後にイミダゾール０．１１１ミリモルを加え、氷浴中で撹拌しながら１時間反応させた。反応後、液体窒素で水溶液形態の反応混合物を凍結し、凍結乾燥し、粗結晶４０．０ｍｇを得た。
【００８５】
得られた粗結晶を高速液体クロマトグラフにて精製を行った。具体的には、プレカラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８、１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｍｍ）およびＣ１８逆相カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃ１８、１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。すなわち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で０％から１００％への濃度勾配を設ける）、２ｍｌ／分の流速で上記カラムを用いて２７分間分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器を用いて２５４ｎｍで検出し、記録チャート上にピークとして示される。得られた化合物（保持時間１８．９５分）の分析を行ったところ、収率６５％、純度＞９３％であった。
【００８６】
また、溶離した化合物の質量をＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ質量分析装置（Applied Biosystems，ＵＳＡ）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。さらに、得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、基準物質 ＴＭＳ）により、１−オクチルピリジニウム塩に特徴的なピリジニウム骨格のプロトンピーク（８．０７ｐｐｍ，８．８６ｐｐｍ）、ならびにｎ−オクチル基由来のメチレンプロトンピーク（１．３７ｐｐｍ−１．５４ｐｐｍ）を検出し、１−オクチルピリジニウム塩がペプチド鎖に結合していることを確認した。その結果、目的とする第四アンモニウム塩−ペプチド化合物が製造されていることを確認した。
ｍ／ｚ：１１５８．６
得られた本発明化合物１である第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を図１に示す。
【００８７】
(2.4) 第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造
(2.1)と同様の手法で製造した式（９）で表されるペプチド−システイン付加物と(2.2)で製造した４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイドとを以下に示すように反応させることにより、Ｒ１ａがｎ−オクチル基、Ｚが臭素原子を示す一般式（５）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造した。
【００８８】
システイン−ペプチド付加物（９）０．０３１３ミリモルを、氷浴で冷却し、撹拌しながら水５．０ｍｌ溶解させた。次に、４−ブロモメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド（１ａ）０．０３４４ミリモルを加え、最後にイミダゾール０．１２８ミリモルを加え、氷浴中で撹拌しながら１．５時間反応させた。反応後、液体窒素で水溶液形態の反応混合物を凍結し、凍結乾燥し、粗結晶５５．３ｍｇを得た。
【００８９】
得られた粗結晶を高速液体クロマトグラフにて精製を行った。具体的には、プレカラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃ１８、２０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ）およびＣ１８逆相カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製品、製品名Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃ１８、２０ｍｍＩ．Ｄ．×２００ｍｍ）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。すなわち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で０％から１００％への濃度勾配を設ける）、８ｍｌ／分の流速で上記カラムを用いて４５分間分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器を用いて２５４ｎｍで検出し、記録チャート上にピークとして示される。得られた化合物（保持時間２４−２６分）の分析を行ったところ、収率６３％、純度＞９８％であった。
【００９０】
また、溶離した化合物の質量をＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ質量分析装置（Applied Biosystems，ＵＳＡ）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。さらに、得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、基準物質 ＴＭＳ）により、１−オクチルピリジニウム塩に特徴的なピリジニウム骨格のプロトンピーク（８．１３ｐｐｍ−８．１５ｐｐｍ，８．９０ｐｐｍ−８．９４ｐｐｍ）、ならびにｎ−オクチル基由来のメチレンプロトンピーク（１．２９ｐｐｍ−１．３８ｐｐｍ）を検出し、１−オクチルピリジニウム塩がペプチド鎖に結合していることを確認した。その結果、目的とする第四アンモニウム塩−ペプチド化合物が製造されていることを確認した。
ｍ／ｚ：１１５８．６
得られた本発明化合物２である第四級アンモニウム塩−ペプチド化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を図２に示す。
【００９１】
実施例３
実施例２の(2.3)で得られた第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物１）について、下記に記載のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を９６穴（ｗｅｌｌ）マイクロプレートを用いた無菌水希釈法により求め、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145に対する特異的殺菌性能を検討した。
【００９２】
また、実施例２の(2.2)の原料である第四アンモニウム塩（４−ヒドロキシルメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド、比較化合物Ａ）および(2.1)のペプチド（比較化合物Ｂ）についても、上記と同じようにグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を求めた。
【００９３】
供試菌
・グラム陰性菌
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Klebsiella pneumoniae ATCC 4352
Escherichia coli NBRC 12713
Proteus mirabilis NBRC 3849
Serratia marcescens ATCC 13880
・グラム陰性菌
Kocuria rhizophila NBRC 12708
Staphylococcus aureus NBRC 12732
Staphylococcus aureus COL 1(MRSA)
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定
この測定は、無菌フード（エアテック社製、クリーンベンチ）内で行い、特に記載のない限り、微生物は氷冷下に保った。細菌をＬ−ｂｒｏｔｈ（トリプトン１．０％（Ｗ／Ｖ）、酵母抽出物０．５％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ７．０〜７．２）５ｍｌ中で、３７℃、１８時間前培養した。この前培養菌体を遠心分離機（株式会社佐久間製作所製、ＭＯＤＥＬ ５０Ａ−７）で冷却遠心分離（０℃、６５００ｒｐｍ×１０分）により集菌し、生理食塩水で洗菌後、無菌水で希釈し、分光光度計（株式会社島津製作所製、型名：ＵＶ−１７００）を用いて、菌懸濁液濃度が１×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ（ＯＤ６６０＝０．００００１）となるように調製した。殺菌試験については、８０％のエチルアルコールを用いて調製した薬剤溶液を、無菌水で５０倍希釈した後、２倍の１０段階希釈した。各薬剤溶液２５μｌに上記の菌懸濁液２５μｌを接種し、３７℃、１時間薬剤接触した後、試料液２０μｌを分取し、ＮＢ培地２００μｌ中に接種した。このＮＢ判定培地を３７℃で２４時間培養し、増殖の有無を肉眼で判定し、増殖の認められない最小薬剤濃度を最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration、ＭＢＣ）とした。本発明化合物１および比較化合物Ａについては上記試験を３回以上行った。
【００９４】
結果を表１に示す。
【００９５】
【表１】
【００９６】
表１から、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物１）は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145）に対してのみ優れた抗菌性、殺菌性を有し、他の菌種に対しては抗菌効果が低いことが明らかである。また、未結合の第四アンモニウム塩（比較化合物Ａ）単独では低い抗菌力であったのに対し、ペプチド（比較化合物Ｂ）に結合させたことによって著しく抗菌性が上昇したことから、ペプチドの緑膿菌吸着特異性が十分に発揮され、第四アンモニウム塩の菌種特異性が付与されていることが明らかになった。
【００９７】
実施例４
実施例２の(2.4)で得られた第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物２）について、下記に記載のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を９６穴（ｗｅｌｌ）マイクロプレートを用いた無菌水希釈法により求め、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145に対する特異的殺菌性能を検討した。
【００９８】
また、実施例２の(2.2)の原料である第四アンモニウム塩（４−ヒドロキシルメチル−１−オクチルピリジニウムブロマイド、比較化合物Ａ）についても、上記と同じようにグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する殺菌力（最小殺菌濃度：ＭＢＣ）を求めた。
【００９９】
供試菌
・グラム陰性菌
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Klebsiella pneumoniae ATCC 4352
Escherichia coli NBRC 12713
Serratia marcescens ATCC 13880
・グラム陰性菌
Kocuria rhizophila NBRC 12708
Staphylococcus aureus NBRC 12732
Staphylococcus aureus COL 1(MRSA)
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定
この測定は、実施例３と同様に行い、本発明化合物２および比較化合物Ａについては上記試験を３回以上行った。
【０１００】
結果を表２に示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
表２から、本発明の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物（本発明化合物２）は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145）に対してのみ優れた抗菌性、殺菌性を有し、他の菌種に対しては抗菌効果が低いことが明らかである。また、未結合の第四アンモニウム塩（比較化合物Ａ）単独では低い抗菌力であったのに対し、ペプチドに結合させたことによって著しく抗菌性が上昇したことから、ペプチドの緑膿菌吸着特異性が十分に発揮され、第四アンモニウム塩の菌種特異性が付与されていることが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１：ＳｅｒＩｌｅＬｅｕＰｒｏＴｙｒＰｒｏＴｙｒ
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と下記一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【化１】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
【請求項５】
請求項４に記載の化合物が、一般式（２）または（３）
【化２】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、請求項１または請求項２に記載のペプチドを示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＺは、上記と同義である。］
で表される化合物である、請求項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【請求項６】
請求項４に記載の化合物が、一般式（４）
【化３】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、請求項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【請求項７】
請求項４に記載の化合物が、一般式（５）
【化４】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、請求項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【請求項８】
請求項５に記載の一般式（２）または（３）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法であって、
一般式（１）
【化５】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
で表される第四アンモニウム塩と一般式（６）または（７）
【化６】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、請求項１または請求項２に記載のペプチドを示す。］
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
【請求項９】
請求項６に記載の一般式（４）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【化７】
［式中、Ｒ１ａは、請求項６に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、請求項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（８）
【化８】
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の一般式（５）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【化９】
［式中、Ｒ１ａは、請求項７に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、請求項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（９）
【化１０】
で表されるシステイン−ペプチド付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
【請求項１１】
請求項４〜請求項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する抗菌もしくは殺菌剤。
【請求項１２】
請求項４〜請求項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する消毒剤。
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１：ＳｅｒＩｌｅＬｅｕＰｒｏＴｙｒＰｒｏＴｙｒ
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端にシステイン以外のアミノ酸が１〜５個付加したペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に導入したＬ−システイン残基のチオール基と下記一般式（１）で表される第四アンモニウム塩とを共有結合により結合させた、第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【化１】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
【請求項５】
請求項４に記載の化合物が、一般式（２）または（３）
【化２】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、請求項１または請求項２に記載のペプチドを示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＺは、上記と同義である。］
で表される化合物である、請求項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【請求項６】
請求項４に記載の化合物が、一般式（４）
【化３】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、請求項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【請求項７】
請求項４に記載の化合物が、一般式（５）
【化４】
［式中、Ｒ１ａは、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基またはｎ−オクタデシル基を示す。Ｚは、上記と同義である。］
で表される化合物である、請求項４に記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物。
【請求項８】
請求項５に記載の一般式（２）または（３）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法であって、
一般式（１）
【化５】
［式中、Ｒ１は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基を示す。Ｒ２は、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状アルキレン基を示す。Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。Ｙは、ハロゲン原子またはＲ４ＳＯ３基（Ｒ４は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。Ｚは、ハロゲン原子、ＯＨ基、ＣＦ３ＣＯＯ基またはＲ５ＳＯ３基（Ｒ５は低級アルキル基または置換もしくは無置換のフェニル基を示す）を示す。］
で表される第四アンモニウム塩と一般式（６）または（７）
【化６】
［式中、Ｄは、アミノ基またはＮ−アシルアミノ基を示す。Ｅは、水酸基またはアミノ基を示す。Ｘは、請求項１または請求項２に記載のペプチドを示す。］
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
【請求項９】
請求項６に記載の一般式（４）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【化７】
［式中、Ｒ１ａは、請求項６に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、請求項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（８）
【化８】
で表されるペプチド−システイン付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の一般式（５）で表される第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を製造する方法であって、
一般式（１ａ）
【化９】
［式中、Ｒ１ａは、請求項７に記載のＲ１ａと同義である。ＹおよびＺは、請求項８に記載のＹおよびＺと同義である。］
で表される第四アンモニウム塩と式（９）
【化１０】
で表されるシステイン−ペプチド付加物とを反応させる、
第四アンモニウム塩−ペプチド化合物の製造方法。
【請求項１１】
請求項４〜請求項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する抗菌もしくは殺菌剤。
【請求項１２】
請求項４〜請求項７のいずれかに記載の第四アンモニウム塩−ペプチド化合物を有効成分として含有する消毒剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２５４３５５（Ｐ２００９−２５４３５５Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６５４６４（Ｐ２００９−６５４６４）
【出願日】平成２１年３月１８日（２００９．３．１８）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１８日（２００９．３．１８）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
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