ポルフィロモナス・ジンジバリス感染の予防、治療及び診断
本発明はポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態及び疾患の予防及び治療のための細胞性応答及び体液性応答の発生及び使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド及びキメラタンパク質又は融合タンパク質、並びにポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）関連の状態及び疾患の予防及び治療のために細胞性応答及び体液性応答を誘起するためのこれらのタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性歯周炎は、歯槽骨の吸収及び最終的な歯の脱落をもたらす歯の支持組織の炎症性疾患である。該疾患は社会全体における公衆衛生上の大きな問題であり、成人集団の最大１５％が罹患し、５〜６％が重度な形で罹患していると推測される。
【０００３】
慢性歯周炎の発症及び進行は歯肉縁下の歯垢中の特定のグラム陰性細菌に関連付けられてきた。歯肉縁下の歯垢中のポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の存在は疾患に強く関連している。
【０００４】
治療（歯石除去及びルートプレーニング）後に歯周炎患者由来の歯肉縁下の歯垢中にポルフィロモナス・ジンジバリスが残っていることが進行的な歯槽骨の喪失に大きく関連すると報告されている。さらに歯肉縁下の歯垢中でのポルフィロモナス・ジンジバリス細胞数の増加は歯周付着喪失、歯周ポケットの深さ及びプロービング時の出血（bleeding on probing）により測定される疾患重症度と相関関係があることが分かっている。
【０００５】
ポルフィロモナス・ジンジバリスによる口腔感染がマウス、ラット及び非ヒト霊長類において歯周骨喪失を誘導することが分かっている。さらに、歯周病、及びポルフィロモナス・ジンジバリス感染と心血管疾患及び或る特定の癌との関連性が増している。
【０００６】
ポルフィロモナス・ジンジバリスの病原性に寄与する毒性因子が数多く報告されており、これにはＬＰＳ、フィムブリエ（fimbriae）、血球凝集素、溶血素及び「ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素」としても既知の細胞外加水分解酵素（特にＡｒｇ−Ｘ及びＬｙｓ−Ｘ特異的プロテイナーゼ）が含まれる。
【０００７】
公衆衛生上の問題の大きさから、抗血清、特にポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対する強い防御応答を与える特異的な抗体及びこれを提供する手段が必要とされている。
【０００８】
１つの問題は、選択される毒性因子が多すぎるので、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対する強い防御応答をどのようにして得るかがはっきりしていないことである。
【０００９】
毒性因子の中でのエピトープの相対的免疫原性は十分には理解されておらず、特にさらなるエピトープが依然として同定されていないかどうかはっきりしていない場合には所与の因子に対するエピトープの相対的免疫原性は理解されていない。
【００１０】
１つの特定の問題は多くの毒性因子が複合ドメインから構成され、ポルフィロモナス・ジンジバリスで見られた配座に近い配座を提示するように発現させるのが困難であることであった。さらには、これらのドメインを不連続単位として、すなわち他の毒性因子ドメインを単離して発現する場合、これらのドメインはポルフィロモナス・ジンジバリスで見られた配座とは区別される配座に折り畳まれる傾向がある。
【００１１】
さらには、毒性因子の免疫原性を変更するための多くの様々な選択肢の中でどれが最も防御免疫応答を与えやすいかは明らかになっていない。
【００１２】
本発明に至る研究において、本発明者らはポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の領域（該領域はＬｙｓ又はＡｒｇを含有するペプチドにおいてＣ末端に位置するペプチド結合を切断しＬｙｓ又はＡｒｇとするための該酵素における部位を規定している）を形成するアミノ酸配列と同じであるか又は相同性を共有するアミノ酸配列を有するペプチドを同定しており、このようなペプチドを、ワクチンとして使用する場合に天然のポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素又は破壊された全細胞から形成された精製プロテイナーゼ−付着因子（adhesin）複合体よりも歯周組織の破壊に対する良好な防御を提供するキメラタンパク質又は融合タンパク質に組み込んだ。
【発明の概要】
【００１３】
一態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含み、
（Ａ）前記第１のペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質を提供する。
【００１４】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質を提供する。
【００１５】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドであって、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的であり、かつ
（ｉｉ）配列番号６７又は配列番号６８で示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有する、ペプチドを提供する。
【００１６】
一態様において、配列番号６４〜配列番号６８のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有するペプチドをキメラタンパク質又は融合タンパク質の形態で与えることができ、該ペプチドが直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結し、該第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む。
【００１７】
さらに別の態様において本発明は、任意でアジュバントと併せて上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質又はペプチドを含む、抗原性組成物、特にワクチン組成物等の組成物を提供する。
【００１８】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は上記のような組成物を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００１９】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は上記のような組成物の使用を提供する。
【００２０】
別の態様において本発明は、上記で広く記載されたキメラタンパク質若しくは融合タンパク質又はペプチドに対して産生される抗体、特にモノクローナル抗体を提供する。
【００２１】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態の重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような抗体を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００２２】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における上記のような抗体の使用を提供する。
【００２３】
さらに別の態様において本発明は、任意で少なくとも１つの調節要素と操作可能に結び付いた、上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【００２４】
この態様において本発明はさらに、このような核酸分子を含むベクター、及びこのような核酸分子を含む原核細胞又は真核細胞を提供する。
【００２５】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような核酸分子、上記のようなベクター、又は上記のような原核細胞若しくは真核細胞を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００２６】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患若しくは状態の重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患若しくは状態の重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における上記のような核酸分子、上記のようなベクター、又は上記のような原核細胞若しくは真核細胞の使用を提供する。
【００２７】
さらなる態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための上記のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用を含む、方法を提供する。
【００２８】
この態様において本発明は、被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための上記のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用も提供する。
【００２９】
さらに別の態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための上記のような抗体の使用を含む、方法を提供する。
【００３０】
この態様において本発明は、被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための上記のような抗体の使用も提供する。
【００３１】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質の製造のためのポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ若しくはＡｒｇ−Ｘプロテイナーゼの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを有するペプチド、又は該ペプチドをコードする核酸の使用を提供する。この態様では、前記ペプチドは配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５又は配列番号２６のうちの１つで示される配列を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】組換えＫｇｐタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色を示す図である。レーン１＝ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、レーン２＝ＫＬＡ１、レーン３＝ＫｓＡ１、レーン４＝ＫＡＳ１−ＫｓＡ１。分子量マーカーはｋＤａで示す。
【図２】ＫＡＳ２ペプチド及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞の抗体認識を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡにおいてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（ＦＫ−Ｗ５０）、組換えタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１及び合成ＫＡＳ２−ＤＴコンジュゲート及びＰＢＳに対して産生される抗血清を用いてＫＡＳ２ペプチドをプロービングした。（Ｂ）ＥＬＩＳＡにおいてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（ＦＫ−Ｗ５０）、組換えタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＬＡ１及びＰＢＳに対して産生される抗血清を用いてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞をプロービングした。抗体応答はバックグラウンドレベルで得られるＯＤ４１５の２倍の逆数（minus double）をＥＬＩＳＡ力価として表し、それぞれの力価は３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図３】組換えタンパク質及び組換えキメラタンパク質、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス、並びにアジュバント単独（ＰＢＳ、ＩＦＡ）によって免疫付与されたマウス、又は非経口感染した（非チャレンジ）マウスの上顎臼歯のポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の水平な骨喪失を示す図である。この図は、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１をＡＳ２−ＬＡ１として示し、ＫＬＡ１をＬＡ１として示し、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１をＡＳ１−ｓＡ１として示し、ＫｓＡ１をｓＡ１として示す。骨喪失の測定値は左側及び右側の上顎両方の上顎臼歯それぞれの頬側のセメント−エナメル境（ＣＥＪ）から歯槽骨頂（ＡＢＣ）までの平方ミリメートル（ｍｍ２）で測定される面積の平均である。データをルビーン検定の等分散性により測定されるように正規分布させ、ｍｍ２単位で平均（ｎ＝１２）で表し、一元配置分散分析及びダネットＴ３検定を用いて分析した。＊は対照（感染）群よりも有意に（Ｐ＜０．００１）小さい骨喪失を有する群を示し、†はＡＳ２−ＬＡ１群よりも有意に（Ｐ＜０．００１）大きい骨喪失を有する群を示す。
【図４】歯周炎モデルにおける免疫付与マウスの血清抗体サブクラスの応答を示す図である。組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１、並びにホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０によって免疫付与したマウス（Ａ（経口接種前）及びＢ（経口接種後））由来の血清を、吸着抗原としてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０を用いるＥＬＩＳＡに使用した。抗体応答ＩｇＧ（黒色のバー）、ＩｇＧ１（灰色のバー）、ＩｇＧ２ａ（白色のバー）、ＩｇＧ２ｂ（横縞のバー）、ＩｇＧ３（斜め縞のバー）をバックグラウンドレベルを引いて得られたＥＬＩＳＡ力価（ｌｏｇ２）で表し、それぞれの力価は３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図５】ＫＡＳ２ペプチド配列４３３〜４６８を表す重複ペプチドに対するペプチド特異的な抗体反応性のＰＥＰＳＣＡＮ分析を示す。（Ａ）ＫＡＳ１−ＫｓＡ１（白色のバー）、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１（黒色のバー）の抗血清を用いてプロービングしたＫＡＳ２重複ペプチド（オフセット１、オーバーラップ７）。（Ｂ）ＫＡＳ２−ＤＴコンジュゲート抗血清を用いてプロービングしたＫＡＳ２重複ペプチド（オフセット、オーバーラップ７）。それぞれのバーは抗体反応性を示している（４１５ｎｍでの光学密度［ＯＤ］）。
【図６】キメラＡＳ２−ＬＡ１がポルフィロモナス・ジンジバリス全細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を認識する非近交系マウスにおいて抗体応答を誘導することを示す図である。ＣＤ１非近交系マウスをキメラＡＳ２−ＬＡ１（５０ｍｇ／マウス）で免疫付与し、吸収抗原（absorbed antigens）としてＡＳ２−ＬＡ１（Ａ）、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（Ｂ）及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体（Ｃ）を用いるＥＬＩＳＡにおいて回収した血清を使用した。この図では、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１をＡＳ２−ＬＡ１として示す。それぞれの抗原に対するそれぞれの免疫グロブリン（immunoglogulin）アイソタイプに関する力価を求め、データをバックグラウンドレベルで得られるＯＤ４１５の２倍の逆数をＥＬＩＳＡ力価（’０００）として表し、それぞれの力価は３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図７】Ｋｇｐプロテイナーゼ、ＫＡＳ２［Ａｓｎ４３３〜Ｌｙｓ４６８］（Ａ）、ＫＡＳ４［Ａｓｐ３８８〜Ｖａｌ３９５］（Ｂ）、ＫＡＳ５［Ａｓｎ５１０〜Ａｓｐ５１６］（Ｃ）、及びＫＡＳ６［Ｉｌｅ５７０〜Ｔｙｒ５８０］（Ｄ）のタンパク質モデルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書で開示及び規定される本発明は、明細書若しくは図面で言及される又は明細書若しくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せにまで及ぶことが理解される。これらの様々な組合せは全て本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【００３４】
本発明者らによって、ペプチド結合の切断のための触媒部位若しくは活性部位の側面に位置する、又は他の形で触媒部位若しくは活性部位を規定するポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の領域は高度に免疫原性であり、実際ポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対する体液性応答を与えるのに十分であることが分かっている。特に、これらの領域を１つ又は複数含むキメラタンパク質又は融合タンパク質は全細胞に対して産生される抗血清及び他の免疫原で見られるよりも大きい、歯槽骨の喪失に対する防御を与えることが分かっている。これまでにポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の触媒ドメインの免疫原性が比較的弱いことが分かっているので、この所見は特に驚くべきものである。
【００３５】
一態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含み、
（Ａ）前記第１のペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質を提供する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は最大約４０アミノ酸残基、好ましくは５〜４０のアミノ酸残基のアミノ酸配列を表すのに使用される。
【００３７】
一実施形態において、ポリペプチドは「第２のペプチド」に置き換わって、すなわち言い換えれば「第２のペプチド」の代わりに使用される。「ポリペプチド」という用語は少なくとも約４０アミノ酸残基のアミノ酸配列を表すのに使用される。
【００３８】
そのため別の態様では、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質が提供される。
【００３９】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドであって、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的である配列、及び
（ｉｉ）配列番号６７又は配列番号６８で示される配列と同じであるか又は相同的である配列からなる群から選択される、ペプチドを提供する。
【００４０】
本発明の一態様において、前記ペプチドが配列番号６４〜配列番号６８の配列を有する場合、該ペプチドが直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結するキメラタンパク質又は融合タンパク質の形態で与えられ得る。一実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質の第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む。
【００４１】
上記の実施形態において、ポリペプチドが第２のペプチドに置き換わって、すなわち言い換えれば第２のペプチドの代わりに使用される。そのため別の態様では、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列、又は
（ｉｉ）配列番号６７若しくは配列番号６８で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列を含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質が提供される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、ペプチド又はポリペプチドの「ホモログ」に対する言及は、初めに言及されたペプチド若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対する相同性を共有するか、又は初めに言及されたペプチド若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対して相同的であるか、又は初めに言及されたペプチド若しくはポリペプチドのアミノ酸配列との同一性、好ましくは比較をＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルゴリズムのパラメータが各々の参照配列の全長にわたって各々の配列間に最大の適合を与えるように選択される）により行う場合、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％及びさらにより好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドに対する言及である。配列同一性は比較対象の２つの配列のアミノ酸間の正確な適合を表す。このようなホモログはポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの自然発生的な変異体又は単離体から得ることができる。代替的に、このようなホモログがポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ由来のペプチド又はポリペプチドの「保存的置換」変異体であってもよく、ここではペプチド又はポリペプチドの全体の配座及び機能を変えることなく１つ又は複数のアミノ酸残基が変化しており、これにはアミノ酸の同様の特性を有するものへの置き換えが含まれるが、決してこれに限定されない。同様の特性を有するアミノ酸は当該技術分野で既知である。例えば、相互に交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、相互に交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ、相互に交換可能であり得る酸性アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、相互に交換可能であり得る塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リシン及びアルギニンが含まれる。好ましくはこのような保存的置換変異体は２０未満、より好ましくは１５未満、より好ましくは１０未満、及び最も好ましくは５未満のアミノ酸変化を有する。
【００４３】
ペプチド結合の切断に関する酵素における部位を規定する、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素、特にＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ（Ｋｇｐ）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ（ＲｇｐＡ）の領域は、特にＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼに関してポルフィロモナス・ジンジバリスに現れるような触媒部位の三次元配座を予測する方法を例示している図７及び実施例９に関する本明細書の教示に従って決定することができる。実施例１０はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの三次元配座のモデリングに関する方法論を与える。
【００４４】
或る特定の実施形態において、キメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又はその第１若しくは第２のペプチド成分をペプチド模倣薬から形成してもよい。ペプチド模倣薬は所与のペプチドの１つ又は複数の特質、例えば配座を模倣する、及びアミノ酸残基（その幾つかは自然発生的でなくてもよい）からなる分子である。
【００４５】
触媒部位の免疫原性領域を同定した後、本発明者らは体液性応答を誘発する可能性がある様々なペプチド免疫原の配列を決定している。特に、触媒部位の側面に位置する、又は他の形で触媒部位を規定する「６つの」領域を以下のように規定している：ＫＡＳ１／ＲＡＳ１、ＫＡＳ２／ＲＡＳ２、ＫＡＳ３／ＲＡＳ３、ＫＡＳ４／ＲＡＳ４、ＫＡＳ５／ＲＡＳ５及びＫＡＳ６（表１を参照されたい）。この情報を用いて、本発明者らはタンパク質配列データベースに問い合わせ、触媒部位の側面に位置し、そのためポルフィロモナス・ジンジバリスで見られる免疫原性エピトープを表す領域を形成するアミノ酸配列と相同性を共有するペプチドを決定することができた。これらのペプチドの配列を以下の構造式により同定する：
【００４６】
【表１】
【００４７】
本発明者らにより、これらのペプチドを含むキメラタンパク質には多くの有用性があることが分かった。例えば本明細書で記載のように、幾つかのペプチドは慢性歯周炎（periodonitis）で観察されるような骨喪失の治療又は予防に関して高度に防御的である体液性応答をもたらす。上記ペプチドを、該ペプチドが或る個体の血清における特異性を検出又はモニタリングすることができる診断アッセイに使用してもよく、それによりその個体が感染しているか否か、及び感染している場合治療が必要であるか否か、又は治療が与えられた場合に該ペプチドが有効であったか否かが示される。
【００４８】
ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の領域（該領域はＣ末端に位置するペプチド結合を切断しＬｙｓ又はＡｒｇとするための該酵素における部位を規定している）がＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの完全配列を含まないことが理解される。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「異種タンパク質」又は「キメラタンパク質若しくは融合タンパク質」という用語は、異なる供給源又は同じ供給源から得られるアミノ酸の機能的な単位、ドメイン、配列又は領域からなり、かつ該単位、ドメイン、配列又は領域が得られるか又は関連する分子で観察されるものとは区別される構成を有するように会合したタンパク質を表すように使用される。本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質の共通特徴は、ペプチド結合の切断に関する触媒部位を規定するポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の配列と同じであるか又は相同性を共有するアミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも１つ含有することである。
【００５０】
好ましい実施形態において、第１のペプチドがＫｇｐ［４３２〜４６８］領域由来のペプチドを含む場合、第１のペプチドは、（ｉ）ＶＳＦＡＮＹＴ及びＶＧＦＡＮＹＴから選択される配列、より好ましくはＧＶＳＦＡＮＹＴ、ＧＶＧＦＡＮＹＴ、ＶＳＦＡＮＹＴＡ及びＶＧＦＡＮＹＴＡから選択される配列を含むペプチド、又は（ｉｉ）ＥＴＡＷＡＤ、ＥＴＳＷＡＤ、ＴＡＷＡＤＰ及びＴＳＷＡＤＰから選択される配列、好ましくはＳＥＴＡＷＡＤ、ＳＥＴＳＷＡＤ、ＥＴＡＷＡＤＰ、ＥＴＳＷＡＤＰ、ＴＡＷＡＤＰＬ及びＴＳＷＡＤＰＬから選択される配列、より好ましくはＧＳＥＴＡＷＡＤ、ＧＳＥＴＳＷＡＤ、ＳＥＴＡＷＡＤＰ、ＳＥＴＳＷＡＤＰ、ＥＴＡＷＡＤＰＬ、ＥＴＳＷＡＤＰＬ、ＴＡＷＡＤＰＬＬ及びＴＳＷＡＤＰＬＬから選択される配列を含むペプチドであるのが好ましい。より好ましくは、このペプチドは表１に示されるＫＡＳ１［４３２〜４５４］、ＫＡＳ２［４３３〜４６８］及びＫＡＳ３［４３６〜４５５］ペプチドから選択される。代替的に、第１のペプチドは、国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９８／００３１１号（国際公開第９８／０４９１９２号）で開示されたＰＡＳ１（Ｋ４８）としても知られるＰＡＳ１Ｋ［４３２〜４５３］ペプチドであり得る。これらのペプチドに対応する配列識別子を表３に示す。
【００５１】
同様に別の好ましい実施形態において、第１のペプチドがＲｇｐＡ［４２６〜４６２］領域由来のペプチドを含む場合、このペプチドは表１に示されるＲＡＳ１［４２６〜４４８］、ＲＡＳ２［４２７〜４６２］及びＲＡＳ３［４３０〜４４９］ペプチドから選択されるのが好ましい。代替的に、第１のペプチドは、国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９８／００３１１号（国際公開第９８／０４９１９２号）で開示されたＰＡＳ１（Ｒ４５）としても知られるＰＡＳ１Ｒ［４２６〜４４６］ペプチドであり得る。
【００５２】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質において、第２のペプチドはポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素、例えばＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ（Ｋｇｐ）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ（ＲｇｐＡ）又はＨａｇＡの付着因子ドメイン由来のペプチドであり得る（表２を参照されたい）。これらのドメインは時には血球凝集素としても知られている。Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼにおいて、好ましいドメインは表２で特定されるようなＫＡ１、ＫＡ２、ＫＡ３、ＫＡ４、ＫＡ５である。Ａｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼでは、好ましいドメインは表２で特定されるようなＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３及びＲＡ４である。ＨａｇＡでは、好ましいドメインはＨａｇＡ１、ＨａｇＡ１＊及びＨａｇＡ１＊＊である。
【００５３】
【表２】
【００５４】
キメラタンパク質又は融合タンパク質にＫＡＳ１、ＫＡＳ２、ＫＡＳ３、ＫＡＳ４、ＫＡＳ５及びＫＡＳ６、又はＲＡＳ１、ＲＡＳ２及びＲＡＳ３、ＲＡＳ４及びＲＡＳ５等の本発明のペプチドが含まれている場合、このようなペプチドに対する体液性応答が改善することに加えて、付着因子ドメインは免疫原性エピトープも含有し、それにより複合特異性が生じ、防御免疫原性応答を誘起する。付着因子ドメインの免疫原性エピトープが、キメラタンパク質又は融合タンパク質において与えられている場合、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素に近づく形態で保持されるという所見は予期せぬものである。
【００５５】
本発明のこれらの実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の付着因子ドメインのうちのいずれか１つ又は複数、特にＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメイン（ＫＡ１、ＫＡ２、ＫＡ３、ＫＡ４及びＫＡ５）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメイン（ＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３及びＲＡ４）又はＨａｇＡドメイン（ＨａｇＡ１、ＨａｇＡ１＊及びＨａｇＡ１＊＊）のうちのいずれか１つ又は複数と共にＫＡＳ１／ＲＡＳ１、ＫＡＳ２／ＲＡＳ２、ＫＡＳ３／ＲＡＳ３、ＫＡＳ４／ＲＡＳ４、ＫＡＳ５／ＲＡＳ５及びＫＡＳ６／ＲＡＳ６から選択されるペプチドをいずれか１つ又は複数含有してもよいことが理解される。
【００５６】
付着因子ドメインがポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素で観察されるような完全ドメインである必要がないことも理解される。例えば付着因子ドメインはこのようなドメインの断片であってもよく、特に好ましい断片はＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼＡ１ドメインのＫｓＡ１ドメイン断片及びＫＬＡ１ドメイン断片である（表２を参照されたい）。ドメインが付着因子ドメインの断片である場合、該ドメインは一般的に付着因子ドメイン特異的エピトープを１つ又は複数含有する。
【００５７】
付着因子関連ペプチドに対応する配列識別子を表３に示す。
【００５８】
一実施形態において、第２のペプチド又はポリペプチドは配列番号６９〜配列番号７９のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号８３〜配列番号８５のうちの１つ若しくは複数で示される配列を含む。
【００５９】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのＫｇｐ［４３２〜４６８］領域から選択される１つ又は複数のさらなるペプチド、及び／又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのＲｇｐＡ［４２６〜４６２］領域から選択される１つ又は複数のさらなるペプチドを含んでいてもよい。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、ＫｓＡ１又はＫＬＡ１と共にＫＡＳ１、ＫＡＳ２、ＫＡＳ３、ＫＡＳ４、ＫＡＳ５及びＫＡＳ６のうちの１つ若しくは複数、又はＲＡＳ１、ＲＡＳ２、ＲＡＳ３、ＲＡＳ４及びＲＡＳ５のうちの１つ若しくは複数を含む。
【００６１】
このため或る特定の実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質はさらなるペプチドを少なくとも１つ含んでいてもよく、該さらなるペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む。
【００６２】
本明細書に記載のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質に含まれ得るドメイン、単位、配列又は領域の他の例としては、Ｆｃ結合領域若しくはＦｃ受容体等の受容体若しくはリガンドと結合するドメイン、アルブミン等の半減期を改善するドメイン、又はキメラタンパク質若しくは融合タンパク質の発現若しくは精製を促進するドメインが挙げられる。
【００６３】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質において、第１のペプチドのＣ末端残基が付着因子ドメインポリペプチドのＮ末端残基と共有結合することができるか、又は第１のペプチドのＮ末端残基が付着因子ドメインポリペプチドのＣ末端残基と共有結合することができる。この配置において、第１のペプチドと付着因子ドメインポリペプチドとが「直接結び付いている」又は「近接している」といわれる。
【００６４】
他の実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は第１のペプチドと付着因子ドメインポリペプチドとを結び付けるリンカーを含む。リンカーはアミノ酸及び非アミノ酸のリンカーの両方を含む、ペプチドとポリペプチドとを連結させることが可能な任意のリンカーであり得る。好ましくはリンカーは非免疫原性である。好適なリンカーは最大１５アミノ酸長であり得るが、５アミノ酸未満が好ましい。リンカーは第１のペプチド及び付着因子ドメインポリペプチドを、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素で通常観察されるよりも密接な空間的配置にするように機能し得る。代替的に、第１のペプチドと付着因子ドメインポリペプチドとの間隔が空いていてもよい。
【００６５】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は組換え発現系（例えば組換えＤＮＡ技術）又は化学合成（例えば固相ペプチド合成）により産生することができる。これらの技法は当該技術分野で既知である。
【００６６】
異種タンパク質又はキメラタンパク質は、キメラタンパク質又は融合タンパク質の第１又は第２のペプチド成分を単独で使用して得られる体液性応答に対して、得られる体液性応答が改善するため特に有益である。
【００６７】
本発明者らにより、これらのペプチドを含むキメラタンパク質には多くの有用性があることが分かった。例えば本明細書で記載のように、幾つかのペプチドは慢性歯周炎で観察されるような骨喪失の治療又は予防に関して高度に防御的である体液性応答をもたらす。上記ペプチドを、該ペプチドが或る個体の血清における特異性を検出又はモニタリングすることができる診断アッセイに使用してもよく、それによりその個体が感染しているか否か、及び感染している場合治療が必要であるか否か、又は治療が与えられた場合に該ペプチドが有効であったか否かが示される。
【００６８】
一実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、防御免疫応答、典型的にはポルフィロモナス・ジンジバリス感染に関連する結合組織損傷を少なくとも最小にする又はそうでなければ制限する応答を誘導する。一実施形態では、防御応答がポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の骨喪失を少なくとも最小にする又は制限する。ポルフィロモナス・ジンジバリス感染によって媒介される骨喪失を測定するモデルシステムが本明細書で論じられている。典型的には防御免疫応答は主に体液性応答である。或る特定の実施形態では、防御免疫応答には細胞性応答も含まれる。
【００６９】
本発明は上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質を含む組成物も提供する。典型的には組成物は抗原性又は免疫原性を有する。より具体的には本発明は、任意でアジュバントと併せてキメラタンパク質又は融合タンパク質を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御免疫応答又は治療免疫応答を誘起するのに好適な組成物を提供する。このような組成物は免疫応答を調整する又は高める別の成分を含んでいてもよい。一実施形態では、組成物はワクチンの形態をとる。
【００７０】
様々なアジュバントをワクチン組成物と併用することが知られている。アジュバントは、免疫応答を調整することにより、ワクチン抗原を単独で投与する場合より少量のワクチン抗原又はより小さい用量を用いてより長期的かつより高レベルの免疫を達成するのを助ける。アジュバントの例としては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、アジュバント６５（落花生油、モノオレイン酸マンニド（mannide monooleate）及びモノステアリン酸アルミニウムを含有する）、油型エマルション、Ｒｉｂｉアジュバント、プルロニックポリオール、ポリアミン、アブリジン、Ｑｕｉｌ Ａ、サポニン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１、アルミニウム塩及びカルシウム塩等のミネラルゲル、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、アルミニウム塩等のナノ粒子、マンナン、キトサン等の糖オリゴマー及びポリマーが挙げられる。他の例としてはＳＡＦ−１、ＳＡＦ−０、ＭＦ５９、Seppic製のＩＳＡ７２０等の水中油型エマルション、並びにＩＳＣＯＭ（商標）及びＩＳＣＯＭマトリクス（商標）等の他の粒子状アジュバントが挙げられる。アジュバントの他の例の広範囲に及ぶが限定的ではないリストが、Cox and Coulter 1992 [In: Wong WK (ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-112]に列挙されている。アジュバントの他に、ワクチン組成物は必要に応じて従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、緩衝剤又は希釈剤を含んでいてもよい。アジュバントを含有する１つ又は複数の用量のワクチン組成物を、歯周炎を予防するために予防的に、又は既に存在している歯周炎を治療するために治療的に投与してもよい。
【００７１】
好ましい組成物において、キメラタンパク質又は融合タンパク質を粘膜アジュバントと組合せて、経口、頬側又は鼻の経路を介して投与する。粘膜アジュバントの例はナノ粒子、コレラ毒素及び易熱性の大腸菌毒素、これらの毒素の非毒性Ｂサブユニット、毒性が低減したこれらの毒素の遺伝的突然変異体である。抗原性タンパク質を経口的に／頬側から／鼻から送達するのに利用することができる他の方法には、胃腸管又は他の粘膜表面からのミクロスフェアの取り込みを助ける及びタンパク質の分解を防ぐマイクロカプセル化による、生分解性ポリマーの粒子（例えばアクリレート又はポリエステル）又はナノ粒子（例えばヒドロキシアパタイト）中への又はこれらの上へのタンパク質の取り込み又は吸収が含まれる。リポソーム、ＩＳＣＯＭ（商標）、ヒドロゲルは、抗原性タンパク質の粘膜免疫系への送達のためにＬＴＢ、ＣＴＢ又はレクチン等の標的分子の取り込みによりさらに強化することができる他の有望な方法の例である。抗原性タンパク質及び粘膜アジュバント又は送達系の他に、ワクチン組成物は必要に応じて、従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、コーティング、分散媒、抗細菌剤又は抗真菌剤、及び緩衝剤又は希釈剤を含んでいてもよい。
【００７２】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は上記のような組成物を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００７３】
被験体はヒト又は他の動物被験体であってもよく、好ましくはヒトである。
【００７４】
典型的には、ポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患は慢性歯周炎であるが、骨喪失、特に歯槽骨の喪失、又は冠動脈疾患でもあり得る。
【００７５】
ワクチン組成物のヒト又は動物被験体への投与に関して多くの方法が知られており、これには皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、舌下、頬側及び経口の投与が含まれるがこれらに限定されない。これらの投与経路はワクチン接種に特に有用である。
【００７６】
別の態様において本発明は、上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質に対して産生される抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。
【００７７】
これらの抗体は標準的技法により産生することができ、被験体の受動免疫付与に使用することができる。したがってこの態様では本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような抗体を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００７８】
さらなる態様において本発明は、任意で少なくとも１つの調節要素と操作可能に結び付いた、上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一実施形態では、核酸は単離形態又は実質的な精製形態で提供される。
【００７９】
核酸分子は例えば、発現ベクターの原核宿主細胞又は真核宿主細胞への挿入により、組換えタンパク質としてのキメラタンパク質の産生に好適な発現ベクターに挿入することができる。組換えタンパク質の発現の成功には、発現ベクターが発現に使用される特定の宿主細胞系に適合し、かつこの特定の宿主細胞系によって認識される、転写及び翻訳に必要な調節要素を含有することが要求される。様々な宿主細胞系を組換えタンパク質を発現させるのに利用してもよく、これにはバクテリオファージベクター、プラスミドベクター又はコスミドＤＮＡを用いて形質転換した細菌；酵母ベクターを含有する酵母；真菌ベクターを含有する真菌；ウイルス（例えばバキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞株；及びプラスミド若しくはウイルス発現ベクターを用いてトランスフェクトした、又は組換えウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等）を用いて感染させた哺乳動物細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
分子生物学の分野で既知の方法を用いて、アミノ酸配列の発現の増大が用いられる特定の宿主細胞系に適合していれば（例えば用いられる特定の宿主細胞系に対して非毒性であれば）、様々なプロモーター及びエンハンサーを発現ベクターに組み込み、組換えタンパク質の発現を増大させることができる。
【００８１】
プロモーターの選択は用いられる発現系に依存する。プロモーターによって、強度、すなわち転写促進能が異なる。一般的に、コーディングヌクレオチド配列の高レベルの転写及び組換えタンパク質への高レベルの発現を得るために強いプロモーターを使用することが望まれる。例えば、高レベルの転写が大腸菌を含む宿主細胞系で観察された、当該技術分野で既知の細菌プロモーター、ファージプロモーター、又はプラスミドプロモーターには、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、ＰＲ及びＰＬプロモーター、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ等が含まれ、これらはアミノ酸配列をコードする挿入されたヌクレオチド配列の転写を与えるために使用することができる。
【００８２】
効率的な転写又は翻訳のための他の制御要素にはエンハンサー及び調節シグナルが含まれる。エンハンサー配列は、隣接したコーディングヌクレオチド配列に関するそれらの位置及び配向とは比較的非依存的に転写効率を増大させると考えられるＤＮＡ要素である。このため、用いられる宿主細胞の発現ベクター系に応じて、エンハンサーは挿入されるコーディング配列の上流又は下流のいずれかに配置され、転写効率を増大させ得る。他の調節部位、例えば転写開始シグナル又は翻訳開始シグナルを、コーディング配列の発現を調節するのに使用することができる。
【００８３】
別の実施形態において、ベクターはウイルス又は細菌のワクチンベクターであってもよく、組換えウイルスワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え弱毒化細菌ワクチン、又は不活性化組換えウイルスワクチンを提供するために使用することができる。ワクシニアウイルスは、当該技術分野における他の生物に由来するワクチン抗原を発現するように改変された感染性ウイルスの最も知られる例である。それ自体が疾患を引き起こさないように弱毒化又はそうでなければ処理した組換え生ワクシニアウイルスは宿主に免疫付与するのに使用される。宿主内での組換えウイルスのその後の複製がワクチン抗原による免疫系の連続刺激をもたらし、それにより長期にわたる免疫がもたらされる。
【００８４】
他の生ワクチンベクターには、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、及び好ましくはワクシニア等のポックスウイルス［Paoletti and Panicali、米国特許第４，６０３，１１２号］、及び弱毒化サルモネラ株［Stocker et al.、米国特許第５，２１０，０３５号、同第４，８３７，１５１号及び同第４，７３５，８０１号、並びにCurtiss et al., 1988, Vaccine 6:155-160］が含まれる。生ワクチンは、該生ワクチンが免疫系を連続的に刺激し、かなりの長期にわたる免疫をもたらすことができるため特に有益である。免疫応答がその後のポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御的である場合、生ワクチン自体をポルフィロモナス・ジンジバリスに対する予防ワクチンに使用することができる。特に、生ワクチンは口腔の共生菌（commensal inhabitant）である細菌を基とすることができる。この細菌を組換えキメラタンパク質を保有するベクターを用いて形質転換し、それから口腔、特に口腔粘膜に定着させるのに使用することができる。口腔粘膜に定着すると、組換えタンパク質の発現が粘膜関連リンパ系組織を刺激し、中和抗体が産生される。この実施形態をさらに説明するために、当該技術分野で既知の分子生物学的技法を用いて、本発明のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、エピトープを発現させるが、ワクシニアウイルスベクターの成長又は複製に悪影響を与えない部位でワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡに挿入することができる。得られた組換えウイルスをワクチン製剤における免疫原として使用することができる。例えば免疫原として使用する前に当該技術分野で既知の化学的手段により、発現される免疫原の免疫原性に実質的に影響することなく組換えウイルスを不活性化すること以外は同じ方法を、不活性化組換えウイルスワクチン製剤を構築するのに用いることができる。不活性化組換えワクチンはワクチン抗原に対する免疫学的応答を高めるために好適なアジュバントと共に配合することができる。
【００８５】
本発明は、ワクチン製剤としての直接的な本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用も提供する。１つ又は複数の調節要素と操作可能に結び付いたキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を直接導入し、ポルフィロモナス・ジンジバリスの病原性株に対して個体にワクチン接種することができる（「遺伝子直接導入（direct gene transfer）」）。血管内皮細胞のようなワクチン接種個体の細胞及び主要器官の組織による遺伝物質の発現をもたらすワクチン接種個体への遺伝子直接導入が、発現プラスミド：カチオン性リポソーム複合体の静脈注射のような当該技術分野における技法により実証された［Zhu et al., 1993, Science 261 :209-211］。ベクターＤＮＡを標的細胞へと送達する他の効果的な方法が当該技術分野で既知である。一例として、ウイルス遺伝子を含有する精製組換えプラスミドＤＮＡは、防御免疫応答を誘導するワクチンを（非経口で、粘膜から、又は遺伝子銃免疫付与により）接種するのに使用されている［Fynan et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-11482］。別の例として、個体から取り出された細胞は、当該技術分野で既知の標準的な手法により、トランスフェクト又は電気穿孔することができ、これにより標的細胞内に組換えベクターＤＮＡが導入される。そのため、組換えベクターＤＮＡを含有する細胞はベクターで発現した選択マーカーの使用のような当該技術分野で既知の方法を用いるために選択することができ、それから組換えタンパク質を発現させるために選択された細胞を個体に再導入してもよい。
【００８６】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような核酸分子、上記のようなベクター、又は上記のような原核細胞若しくは真核細胞を該被験体に投与することを含む、方法を提供する。
【００８７】
他の実施形態において、上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質又は抗体を含む医薬組成物が提供される。該組成物はポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の治療のために希釈剤、賦形剤、又は担体又は化学療法剤をさらに含んでいてもよく、経口投与に適合させることができる。本発明の組成物を、例えば温かいガム基剤中に撹拌することにより、又はガム基剤（その例はジェルトン、ゴムラテックス、ビニライト樹脂等である）の外表面を望ましくは従来の可塑剤若しくは軟化剤、グルコース、ソルビトール等の糖若しくは他の甘味料でコーティングすることにより、ロゼンジ又はチューイングガム又は他の製品に組み込むことができる。
【００８８】
上述の医薬組成物を含有する本発明の経口組成物を、歯磨きペースト、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品及び他の食品等の口に適用可能な様々な形態で調製及び使用することができる。本発明による経口組成物は特定の経口組成物の種類及び形態に応じてさらなる既知の成分をさらに含んでいてもよい。
【００８９】
本発明の或る特定の好ましい形態において、経口組成物は実質的に性質として液体のもの、例えば洗口液又はリンスであり得る。このような調製物において、ビヒクルは典型的に望ましくは以下に記載のような保湿剤を含む水−アルコール混合物である。一般的に、アルコールに対する水の重量比は約１：１〜約２０：１の範囲である。この種の調製物における水−アルコール混合物の総量は典型的に調製物の約７０重量％〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは典型的にはエタノール又はイソプロパノールである。エタノールが好ましい。
【００９０】
本発明のこのような液体及び他の調製物のｐＨは概して約５〜約９、典型的には約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨを酸（例えばクエン酸又は安息香酸）若しくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御することができるか、又は（例えばクエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を用いて）緩衝させることができる。
【００９１】
本発明の他の望ましい形態において、医薬組成物は実質的に性質として固体又はペースト状のもの、例えば歯磨き粉、歯垢検出剤（dental tablet）又は歯磨きペースト（歯科用クリーム）又はジェル歯磨き剤であり得る。このような固体又はペースト状の経口調製物のビヒクルは一般的に歯科的に許容される研磨材料を含有する。
【００９２】
歯磨きペーストにおいて、液体ビヒクルは典型的に調製物の約１０重量％〜約８０重量％の範囲の量で水及び保湿剤を含み得る。好適な保湿剤／担体としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及びポリプロピレングリコールが例示される。水、グリセリン及びソルビトールの液体混合物も有益である。屈折率が考慮すべき重要なものである透明なジェルにおいて、約２．５％〜３０％（ｗ／ｗ）の水、０％〜約７０％（ｗ／ｗ）のグリセリン、及び約２０％〜８０％（ｗ／ｗ）のソルビトールを用いるのが好ましい。
【００９３】
歯磨きペースト、クリーム及びジェルは典型的に、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．５％〜約５％（ｗ／ｗ）の割合で天然又は合成の増粘剤又はゲル化剤を含有する。好適な増粘剤は合成ヘクトライト、例えばLaporte Industries Limitedから市販されているＬａｐｏｎｉｔｅ（例えばＣＰ、ＳＰ ２００２、Ｄ）として利用可能な合成コロイドマグネシウムアルカリ金属シリケート複合体粘土である。Ｌａｐｏｎｉｔｅ Ｄはおよそ５８．００重量％ ＳｉＯ２、２５．４０重量％ ＭｇＯ、３．０５重量％ Ｎａ２Ｏ、０．９８重量％ Ｌｉ２Ｏ、並びに幾らかの水及び微量金属である。その真の比重は２．５３であり、湿度８％で１．０ｇ／ｍｌの見掛けのかさ密度を有する。
【００９４】
他の好適な増粘剤には、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、トラガカントゴム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えばＮａｔｒｏｓｏｌとして利用可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び微砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）等のコロイドシリカが含まれる。可溶化剤には、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコール等の湿潤ポリオール、メチルセロソルブ及びエチルセロソルブ等のセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油及びワセリン等の直鎖に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油及びワックス、並びに酢酸アミル、酢酸エチル及び安息香酸ベンジル等のエステルも含まれ得る。
【００９５】
従来通り経口調製物は通常、好適なラベル付きパッケージで販売又はそうでなければ流通していると理解される。このため、マウスリンスのボトルはそれを実質的にマウスリンス又は洗口液として記載し、その使用に関して説明しているラベルを有しており、歯磨きペースト、クリーム又はジェルは通常、それを実質的に歯磨きペースト、ジェル又は歯科クリームとして記載しているラベルを有する、押し出しチューブ（典型的にはアルミニウム、裏打ちされた鉛、若しくはプラスチック製の）、又は内容物を秤量する他の搾り出し式ディスペンサー、ポンプ式ディスペンサー若しくは加圧式ディスペンサー中にある。
【００９６】
予防作用の増大を達成するために、口腔全体への活性剤の徹底的かつ完全な分散を達成するのを助けるために、及び本組成物をより化粧品として許容可能にするために有機界面活性剤を本発明の組成物に使用してもよい。有機界面活性材料は自然状態でアニオン性、非イオン性又は両性であるのが好ましく、活性剤と相互作用しないのが好ましい。組成物に洗浄性及び発泡性を与える洗浄材料を界面活性剤として利用するのが好ましい。アニオン性界面活性剤の好適な例は高級脂肪酸モノ硫酸モノグリセリドの水溶性塩、例えば硬化ヤシ油脂肪酸のモノ硫酸モノグリセリドのナトリウム塩、高級アルキル硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸塩、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホ酢酸塩、スルホン酸１，２−ジヒドロキシプロパンの高級脂肪酸エステル、及び低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、例えば脂肪酸、アルキル又はアシルラジカルに１２個〜１６個の炭素を有するもの等である。最後に言及されたアミドの例は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、並びにセッケン又は同様の高級脂肪酸材料を実質的に含まないＮ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン又はＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム塩、カリウム塩及びエタノールアミン塩である。使用に好適な水溶性の非イオン性界面活性剤の例は、エチレンオキシドと疎水性の長鎖（例えば約１２個〜２０個の炭素原子の脂肪族鎖）を有しそれと反応性を有する様々な反応性水素含有化合物との縮合生成物であり、該縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamers）」)は親水性ポリオキシエチレン部分を含有し、例えばポリ（エチレンオキシド）と脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えばモノステアリン酸ソルビタン）及びポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック材料）との縮合生成物等である。
【００９７】
界面活性剤は典型的に約０．１重量％〜５重量％の量で存在する。界面活性剤が本発明の活性剤の溶解を助け、それにより必要となる可溶化保湿剤の量を減らすことができることは注目に値する。
【００９８】
増白剤、保存料、シリコーン、クロロフィル化合物及び／又は尿素、リン酸二アンモニウム等のアンモニア化材料、並びにそれらの混合物等の様々な他の材料を本発明の経口調製物に組み込んでもよい。これらのアジュバントは存在する場合、所望の特性及び特質に実質的に悪影響を及ぼすことのない量で調製物に組み込まれる。
【００９９】
任意の好適な芳香材料又は甘味材料を利用してもよい。好適な芳香成分の例は芳香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、チョウジ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン及びオレンジの油、並びにサリチル酸メチルである。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル）、サッカリン等が含まれる。好適には芳香剤及び甘味剤はそれぞれ又は共に、調製物の約０．１％〜５％以上（more）含み得る。
【０１００】
経口使用を目的とする組成物を医薬組成物の製造に関して当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は薬学的に有効な（elegant）口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される作用物質を１つ又は複数含有してもよい。錠剤は錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア、並びに平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は錠剤を胃腸管又は歯周ポケットでの崩壊及び吸収を遅らせ、それによりより長期にわたり作用が持続するように既知の技法でコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の遅延材料を利用してもよい。
【０１０１】
経口使用のための製剤を硬ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合される）、又は軟ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は水又は油媒体、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合される）提示してもよい。
【０１０２】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。このような賦形剤は懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムである。分散剤又は湿潤剤は天然のホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。
【０１０３】
水性懸濁液は１つ又は複数の保存料又は抗菌剤、例えばベンゾエート、例えばエチルベンゾエート又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート（別の例はグルコン酸クロルヘキシジンである）、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の芳香剤、及び１つ又は複数の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有していてもよい。
【０１０４】
油性懸濁液を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は液体パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁することにより配合してもよい。油性懸濁液は増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有していてもよい。上記で記載されるような甘味剤、及び芳香剤を口当たりのよい経口調製物を提供するために添加してもよい。これらの組成物をアスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存してもよい。
【０１０５】
さらなる態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための上記のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用を含む、方法を提供する。
【０１０６】
さらなる別の態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための上記のような抗体の使用を含む、方法を提供する。
【０１０７】
さらに別の態様において本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドを提供する。一実施形態では、ペプチドは配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つと相同的である配列を有する。ペプチドは５〜４０のアミノ酸長を有し得る。
【０１０８】
さらに別の態様において本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１０９】
さらに別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質の製造のための配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチド、又は配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸の使用を提供する。
【０１１０】
さらに別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するための配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチド、又は配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸の使用を提供する。一実施形態では、前記ペプチドを
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む第２のペプチドと同時に又は連続して投与する。
【０１１１】
【表３−１】
【０１１２】
【表３−２】
【０１１３】
【表３−３】
【０１１４】
【表３−４】
【０１１５】
【表４−１】
【０１１６】
【表４−２】
【０１１７】
【表５−１】
【０１１８】
【表５−２】
【０１１９】
【表５−３】
【０１２０】
【表５−４】
【０１２１】
【表５−５】
【０１２２】
【表６−１】
【０１２３】
【表６−２】
【０１２４】
【表６−３】
【０１２５】
本発明はさらに以下の実施例により説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく例示として記載される。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
方法及び材料
細菌株及び成長条件
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の凍結乾燥培養物を５μｇ／ｍｌのへミン、０．５μｇ／ｍｌのシステインを添加した溶解ウマ血液寒天プレート（ＨＢ寒天、１０回未満の継代）上で３７℃で嫌気的に成長させた。３〜４日後、コロニーを用いて、５μｇ／ｍｌのへミン、０．５μｇ／ｍｌのシステインを含有するブレインハートインフュージョン培地に接種した（１）。バッチ培養物をＭＫ３嫌気性ワークステーション（Don Whitley Scientific Ltd., Adelaide, Australia）において嫌気的に成長させた。細胞を遠心分離（７５００ｇ、３０分、４℃）により指数成長期中に回収し、嫌気性ワークステーションにおいてＰＧ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び５ｍＭ システイン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて２回洗浄した。バッチ培養物の成長を分光光度計（モデル２９５Ｅ、Perkin-Elmer）を使用して６５０ｎｍでモニタリングした。培養物の純度をグラム染色、顕微鏡検査により、及びSlots（２）による様々な生化学試験を使用することにより定期的に確認した。
付着因子配列及びＫｇｐプロテイナーゼ配列をＮ末端に付加した付着因子配列を含有するｐＥＴ２８構築物の構築
活性部位（ＡＳ）のペプチド及びキメラペプチドを表すＫｇｐ残基、並びにＫｇｐＡ１付着因子（Ａ１）ドメインを、ｐＥＴ発現ベクター（Novagen）を使用してｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを有する組換え（ｒ）タンパク質として大腸菌で過剰発現させた。発現したｒタンパク質はｒＫＡＳ２及びｒＫＬＡ１であり、ｒキメラタンパク質はｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ｒＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びｒＫＡＳ４−ＫＡＳ３−ＫＡＳ５−ＫＡＳ６−ＫＬＡ１（マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１とも称される）であった。様々なＡ１ドメイン及びＡＳドメインを表すアミノ酸配列を表１及び表２に記載する。
【０１２７】
ｋｇｐ遺伝子の様々なＫＡＳドメイン及びＫＡ１ドメインを、表４に列挙されるプライマー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）及びＰＣ−９６０サーマルサイクラー（Corbett Research Technologies）を使用して、それぞれｐＮＳ１（ｐＵＣ１８における３．５ｋｂのＢａｍＨＩ ｌｙｓ断片）又はポルフィロモナス・ジンジバリスのゲノムＤＮＡから増幅した。ＫＡＳ２−ＦＯＲとＫＡＳ２−ＲＥＶとのプライマー対及びＫＬＡ１−ＦＯＲとＫＬＡ１−ＲＥＶとのプライマー対を使用し、以下の反応条件を用いてそれぞれＫＡＳ２をコードするＰＣＲ断片及びＫＬＡ１をコードするＰＣＲ断片を生成した：９４℃、３分、その後９４℃、４５秒（変性）、６２℃、４０秒（アニーリング）及び７２℃、２０秒（伸長）を２８サイクル、その後最終サイクルとして７２℃、５分。
【０１２８】
ＫＡＳ２−ＫＬＡ１キメラＰＣＲ産物を、以下の通りに重複伸長（overlap extension）による遺伝子スプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）により産生した：ＰＣＲ産物を上記の条件を用いてＫＡＳ２−ＦＯＲとＫＡＳ２−ＫＬＡ１−キメラ−ＲＥＶとのプライマー対及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１−キメラ−ＦＯＲとＫＬＡ１−ＲＥＶとのプライマー対を使用して産生した。それからＰＣＲ産物をアニーリングし、最終ＰＣＲをプライマーＫＡＳ２−ＦＯＲ及びＫＬＡ１−ＲＥＶを用いて行った（９４℃、２分、その後９４℃、３０秒、５０℃、３０秒及び７２℃、４０秒を２８サイクル、その後最終サイクルとして７２℃、５分）。
【０１２９】
ＫＡＳ１−ＫｓＡ１ ＰＣＲ産物の調製のために、２回の連続したＰＣＲを、連続してそれぞれＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ１プライマー及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ２プライマーと共にＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＲＥＶプライマーを使用して行い（反応条件 ９４℃で２分、その後９４℃、１５秒、６３℃、３０秒及び７２℃、２分を３５サイクル）、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１ ＰＣＲ産物を産生した。ＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ１プライマー及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ２プライマーはこれまでのＰＣＲ産物の５’側に重複する３’側の伸長を含有している。
【０１３０】
マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１ ＰＣＲ断片の調製のために、４回の連続したＰＣＲを、連続してそれぞれマルチＦＯＲ１プライマー、マルチＦＯＲ２プライマー、マルチＦＯＲ３プライマー及びマルチＦＯＲ４プライマーと共にマルチＲＥＶプライマーを使用して行い（反応条件は９５℃、２分、その後９５℃、２０秒、６８℃、１．５分を３５サイクルであった）、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１ ＰＣＲ産物を産生した。それぞれのマルチＦＯＲプライマーはこれまでのＰＣＲ産物の５’側に重複する３’側の伸長を含有している。
【０１３１】
ＫＡＳ２、ＫＬＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びマルチＫＡＳ−ＫＬＡ１をコードするＰＣＲ断片は全てＰＣＲ精製カラム（Qiagen）を使用して精製し、ＴＡクローニングベクター、ｐＧｅｍ−Ｔ Ｅａｓｙ（Promega）にライゲートして、製造業者のプロトコルに従って大腸菌ＪＭ１０９へと形質転換した。精製組換えｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙ構築物をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを用いて消化し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＥＴ２８ｂ（Novagen）に一方向にクローニングして、非発現宿主、大腸菌ＪＭ１０９［ＤＨ５α］へと形質転換した。組換えｐＥＴ２８構築物を精製し、大腸菌発現宿主、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）］（Novagen）へと形質転換して、製造業者の取扱説明書に従い５０μｇのカナマイシンを含有するＬＢ上で選択した。それぞれの挿入物の完全性をＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドプライマー（表４）は必要に応じて制限酵素部位、終止コドン及びｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを組み込むように設計した。ｒＫＡＳ２、ｒＫＬＡ１及びｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１に使用するプライマーはｒタンパク質において外部の（extraneous）コーディング配列がわずか３つのアミノ酸及びｈｅｘａ−ｈｉｓタグに包含されるのを制限するように設計した。ｒＫＡＳ１及びｒＫＬＡ１はＮ末端及びＣ末端の両方にｈｅｘａ−ｈｉｓタグを有するｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１と直接比較できるようにそれぞれＮ末端及びＣ末端にｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを含有するように設計した。ｒＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びマルチＫＡＳ−ＫＬＡ１では、ＨｉｓタグはＣ末端に見られる。
【０１３３】
【表７−１】
【０１３４】
【表７−２】
【０１３５】
組換えタンパク質の発現及び精製
組換えタンパク質を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）による誘導によりｐＥＴ２８：：ＫＬＡ１（ＫＡＳ２、ＫＡＳ２−ＬＡ１、ＫＡＳ１−ＳＡ１、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１）構築物から発現した。組換えタンパク質は全て６−Ｈｉｓタグ融合タンパク質として産生し、変性条件下でＮＩ−ＮＴＡ精製システム（Invitrogen）を用いて精製した。簡潔に述べると、大腸菌（ＤＥ３）単一コロニー形質転換体を使用して、旋回振盪器上で３７℃で一晩５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス２０ｍＬに接種した。それからこの接種材料を使用して、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ １Ｌに接種した。この培養物のＯＤ６００を０．５〜０．７（対数成長中期（mid-log phase））に達せしめた後、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２時間、０．１ｍＭのイソプロピルＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。細胞を回収し（７５００ｇ）、変性結合緩衝液（８Ｍ 尿素、２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ)中で再懸濁して、３に設定しマイクロチップを用いてＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｅｒ ２５０細胞破壊器（Branson Ultronics Corporation, Danbury, CT）を使用して、３０秒間隔で３回×１５秒のバーストのために氷上で超音波処理した後、４℃で３０分間３９０００ｇで遠心分離した。事前に平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムに充填した後、変性洗浄緩衝液（８Ｍ 尿素、２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ)を用いて洗浄し、それにより非結合タンパク質を溶出させることにより、組換えタンパク質を上清から精製した。その後カラムを１０容量の結合緩衝液Ｂを用いて洗浄し、組換えタンパク質を変性溶出緩衝液（８Ｍ 尿素、２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５Ｍ イミダゾール）を用いて溶出させた。精製タンパク質を２Ｍ 尿素−ＰＢＳに対して透析し、−８０℃で保存した。
【０１３６】
組換えタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、それらの分子量をＰｒｏｔＰａｒａｍオンライン（http://au.expasy.org/tools/protparam.html）を用いて決定した。全ての試料のタンパク質濃度をスタンダードとしてＢＳＡを使用してBio-Rad製のタンパク質アッセイにより決定した。
免疫付与及びマウス歯周炎モデル
マウス歯周炎実験をこれまでに記載された（３）ように行い、メルボルン大学の動物実験に関する倫理委員会（University of Melbourne Ethics Committee for Animal Experimentation）の認可を受けた。マイクロアイソレーター（microisolators）に収容した６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１２匹のマウス）を組換えタンパク質又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体、ポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０のホルマリンで死滅させた２×１０９個の細胞又はＰＢＳのうちのいずれか１つを５０μｇ用いて皮下で（皮下で１００μＬ）免疫付与し、それぞれの抗原を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化した。３０日後に、マウスを抗原（皮下注射、ＩＦＡ中で乳化した）を用いて追加免疫した（boosted）後、１２日後に球後神経叢（retrobulbar plexus）から採血した。２回目の免疫付与の４日後、マウスに１ｍｇ／ｍｌのカナマイシン（Sigma-Aldrich, New South Wales, Australia）の脱イオン水溶液を自由に７日間与えた。抗生物質による治療の３日後（採血の２日後）、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Sigma-Aldrich, New South Wales, Australia）を含有するＰＧ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び５ｍＭ システイン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で１×１０１０個の生存ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（２５μｌ）を用いて２日に分けて４回マウスに経口接種し、対照群を２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＣＭＣだけを含有するＰＧ緩衝液を用いて偽感染させた。接種材料を嫌気性チャンバで調製した後、すぐに上顎臼歯の歯肉縁に適用した。２週間後、マウスに２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＣＭＣを含有するＰＧ緩衝液中で１×１０１０個の細胞の生存ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（２５μｌ）をさらに４用量（２日に分けて）摂取させた。それぞれの接種材料における生存細菌の数を血液寒天上で数える（enumeration）ことにより検証した。マウスに軟らかい粉末状の食餌（Barastock, Australia）を与え、寝床（bedding）へと近づくのを防ぐために高くした金網底を備えたケージに収容した。最後の投薬の４週間後、マウスの球後神経叢から採血し、屠殺して、上顎を取り外し半分に切断して、半分（右側）を歯槽骨喪失の測定に使用し、残りの半分（左側）をリアルタイムＰＣＲに使用した。
【０１３７】
上顎の右半分を脱イオン水で煮沸し（１分）、機械的に肉を剥がし（defleshed）、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）水酸化カリウム中に浸漬した（１６時間、２５℃）。それから上顎の半分を洗浄し（脱イオン水で２回）、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）過酸化水素中に浸漬した（６時間、２５℃）。上顎の半分を洗浄した（脱イオン水で２回）後、それらを０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチレンブルー水溶液で染色し、上顎の半分それぞれの頬側のデジタル画像をＯＬＹＳＩＡ ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバーション３．２（Olympus Australia Pty Ltd., New South Wales, Australia）を使用して解剖顕微鏡に取り付けられたOlympus製のＤＰ１２デジタルカメラを用いて撮影し、水平な骨喪失を評価した。水平な骨喪失は歯槽骨頂（ＡＢＣ）に垂直な水平板で起こる喪失であり、これにより骨頂高の低減が起こる。上顎の半分をそれぞれ、それぞれの歯画像の臼歯の頬側及び舌側の歯尖が重なるように配列させ、それぞれの画像で測定結果を標準化できるようにフレーム単位でマイクロメートル尺度で画像を撮影した。それぞれの臼歯に関してセメントーエナメル境からＡＢＣまでの面積を、ＯＬＹＳＩＡ ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバージョン３．２画像化ソフトウェアを用いて測定した。骨喪失の測定結果を、ランダム化盲検（randomized and blinded）プロトコルを用いて、１人の検査官により２回求めた。
ＥＬＩＳＡによるサブクラス抗体の決定
マウス血清のサブクラス抗体応答を決定するために、酵素結合免疫測定吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する、５μｇ／ｍｌのホルマリン溶液で死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）（ｐＨ７．０）（ＰＢＳＴ）を用いて三連で行い、平底ポリビニルマイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories, McLean, VA）のウェルをコーティングした。コーティング溶液を除去した後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴをウェルに加え、室温で１時間コーティングしていないプラスチックをブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ＳＫ−ＰＢＳＴ）でのマウス血清の段階希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１６時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Sigma, New South Wales, Australia）に対する２０００倍希釈のヤギＩｇＧをＳＫ−ＰＢＳＴに添加し、室温で２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＳＫ−ＰＢＳＴ中での５０００倍希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma, New South Wales, Australia）をそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合抗体を１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭのクエン酸（ｐＨ４．０）中での０．９ｍＭの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸］をそれぞれのウェルに加えることにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad製のマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法及びウェスタンブロッティング
組換えタンパク質（１０μｇ）を、ＸＣｅｌｌ ｓｕｒｅｌｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ電気泳動システムを用いて分析した。組換えタンパク質を２０μｌの還元試料緩衝液（１０％［ｗｔ／ｖｏｌ］ＳＤＳ、０．０５％［ｗｔ／ｖｏｌ］ブロモフェノールブルー、２５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］グリセロール及び０．０５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］２−メルカプトエタノール）中に混合した。ｐＨを１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いて８．０に調整した後、溶液を１００℃で５分間加熱した。組換えタンパク質（１０μｇ／レーン）をＮｏｖｅｘ １２％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｓ−グリシンプレキャストミニゲル上に充填し、Ｎｏｖｅｘ電気泳動システム（Novex, San Diego, CA）を使用して３０ｍＡ〜５０ｍＡの電流、及び１２５Ｖの電位差を用いて電気泳動を行った。０．２５％（ｗ／ｖ）クマシーブルーＲ２５０を使用してタンパク質を可視化した。
Ｋｇｐプロテイナーゼ活性部位ペプチド（ＫＡＳ−２）配列のエピトープ分析
Ｌｙｓ特異的プロテイナーゼ活性部位ペプチドＫＡＳ２に関する抗体結合部位（４３３〜４６８、配列番号２８）を、Ｆｍｏｃケミストリに関する標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて複数ピン（multipin）ペプチド合成システム（Chiron Technologies, Melbourne, Australia）でＮ末端にビオチン化した重複８残基ペプチド（１残基でオフセット、７残基で重複）を合成することにより決定した。０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のビオチン化ペプチド（５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（strepavidin）コーティングプレートに４℃で一晩結合させた（Nunc, NSW Australia）。ＰＢＳＴエピトープでウェルを４回洗浄した後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０００倍希釈の１％（ｗ／ｖ）無脂脱脂粉乳（ＳＫ−ＰＢＳＴ）でマウス血清を使用して、Chiron Technologiesの取扱説明書通りにＥＬＩＳＡによりプレートに結合したペプチドのマッピングを行った。ＰＢＳＴでウェルを６回洗浄した後、マウスＩｇＧに対するヤギＩｇＧ（Sigma, New South Wales, Australia）の２０００倍希釈液をＳＫ−ＰＢＳＴ中に添加し、室温で２時間結合させた。ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄し、ＳＫ−ＰＢＳＴ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma, New South Wales, Australia）の５０００倍希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを６回洗浄した後、結合抗体を１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭ クエン酸（ｐＨ４．０）中での０．９ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸］をそれぞれのウェルに加えることにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad製のマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
【０１３８】
統計分析
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットＴ３検定（ウィンドウズ（登録商標）用ＳＰＳＳ、バージョン１２）を用いて骨喪失データを統計的に分析した。ＳＰＳＳソフトウェア（ウィンドウズ（登録商標）用ＳＰＳＳ、バージョン１２）を使用するスチューデントｔ検定を用いてＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブクラス抗体力価を統計的に分析した。
【０１３９】
実施例２
組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）の特性化及び精製
Ｋｇｐ付着因子Ａ１ドメイン断片及びキメラＫｇｐプロテイナーゼ及びＫｇｐ付着因子Ａ１ドメイン断片のポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御する能力を特性化するために、本発明者らは組換えタンパク質：−ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１を発現及び精製した。ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィを用いて、組換えタンパク質（ＫｓＡ１及びＫＬＡ１）及び組換えキメラタンパク質（ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）を封入体から精製し、精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１）。それぞれの精製組換えタンパク質はＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＬＡ１、ＫｓＡ１及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１に対応する分子量が４０ｋＤａ、３６ｋＤａ、３１ｋＤａ及び３２ｋＤａである１つの主要タンパク質バンドからなっており、これらの分子量はＰｒｏｔＰａｒａｍを用いて算出されたＨｉｓ−タグ組換えタンパク質の分子量に対応していた。組換えタンパク質の免疫原性を特性化するために、ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１を使用しマウスを免疫付与して、これらの血清を使用し、ＫＡＳ２ペプチドコーティングプレート及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞コーティングプレートをプロービングした（図２）。組換えキメラタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１抗血清は、ＫＡＳ２特異的抗血清（ＫＡＳ２−ジフテリアトキソイドコンジュゲート）と同様のレベルでＫＡＳ２ペプチド（図２Ａ）及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（図２Ｂ）を認識することが分かった。しかしながら、組換えタンパク質ＫＬＡ１に対する抗血清はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞を認識するだけであった（図２Ｂ）。
【０１４０】
実施例３
マウス歯周炎モデルにおけるポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨喪失に対する組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）による免疫付与の影響
組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を使用して、Baker et al（４）による報告に基づき歯周骨喪失の修正マウスモデルを用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨喪失に対して誘導される防御を決定及び比較した。組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１又はＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体、又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（ＦＫ−Ｗ５０）細胞、又はＰＢＳアジュバント単独のいずれかでマウスを免疫付与した後（０日及び３０日）、生存ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０で経口でチャレンジした。ＢＡＬＢ／ｃマウスがＰＢＳ免疫付与群と比較して有意に（ｐ＜０．００１）低い骨喪失を示したので、全ての組換え抗原、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体及びＦＫ−Ｗ５０細胞による免疫付与がポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨喪失に対してこれらの動物を防御した（図３）。しかしながら、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１免疫付与マウスは、ＫＬＡ１（ｐ＜０．０１）；ＫｓＡ１（ｐ＜０．００１）、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体（ｐ＜０．００１）、ＦＫ−Ｗ５０細胞（ｐ＜０．００１）で免疫付与したマウス、及び非チャレンジマウス（ｐ＜０．００１）よりも骨喪失が有意に低かった。ＫＡＳ２−ＫＬＡ１免疫付与マウスとＫＡＳ１−ＫｓＡ１免疫付与マウスとの間の骨喪失に有意差はなかった。さらに、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１免疫付与マウスは非チャレンジマウス（ｐ＜０．０１）及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体免疫付与マウス（ｐ＜０．０５）よりも有意に低い骨喪失を示したが、ＫｓＡ１、ＫＬＡ１及びＦＫ−Ｗ５０免疫付与マウスとは有意に異なってはいなかった。ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体及びＦＫ−Ｗ５０免疫付与マウス間の骨喪失に有意差はなかった。
【０１４１】
実施例４
マウス歯周炎モデルにおける組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）による免疫付与により誘導された抗体サブクラス応答
生存ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞による経口接種チャレンジの前後で、マウスを採血し、血清を遠心分離で回収した。図４はマウス歯周炎モデルにおけるそれぞれの免疫原（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１又はＫＡＳ２−ＫＬＡ１又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（ＦＫ−Ｗ５０）細胞）に関するホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞に対する抗体サブクラス反応性を示す。全ての防御免疫原がＦＫ−Ｗ５０に対する高いＩｇＧ抗体力価を誘導した。さらに、それぞれの防御免疫原が誘導した主要抗体サブクラスはＩｇＧ１であり、免疫反応性ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３ ＦＫ−Ｗ５０特異的抗体は非常に弱く誘導された（図４）。経口接種前（図４Ａ）及び経口接種後（図４Ｂ）の両方でそれぞれ免疫原によって誘導された主要抗体サブクラスはＩｇＧ１であった。
【０１４２】
実施例５
ＫＡＳ２（４３３〜４６８）のエピトープマッピング
ＫＡＳ２（４３３〜４６８）に関するビオチン化した重複８残基ペプチド（１残基でオフセット、７残基で重複）を合成し、ストレプトアビジンコーティングプレートをコーティングするのに使用した。それから、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１及びＫＡＳ２−ジフテリアトキソイドコンジュゲートで免疫付与したマウス由来の抗血清を使用して抗体結合エピトープを同定した（図５）。バックグラウンドでの光学密度（４１５ｎｍ）の２倍の上昇は陽性抗体応答（閾値ＯＤ）と考えられた。該抗血清は配列番号２８に由来する以下のペプチド配列を認識した。すなわちＫＡＳ１−ＫｓＡ１はペプチド４３５〜４４２、４３６〜４４３、４４５〜４５２、４４６〜４５３及び４４７〜４５４を認識し（閾値ＯＤ＝０．０７、図５Ａ）、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１はペプチド４３５〜４４２、４４７〜４５４及び４４８〜４５５を認識した（閾値ＩＤ＝０．０７、図５Ａ）。これにより、多くの最小エピトープ、すなわちペプチド４３６〜４４２（ＶＳＦＡＮＹＴ及びその変異型ＶＧＦＡＮＹＴ）、ペプチド４４７〜４５２（ＥＴＡＷＡＤ及びその変異型ＥＴＳＷＡＤ）、及びペプチド４４８〜４５３（ＴＡＷＡＤＰ及びその変異型ＴＳＷＡＤＰ）の認識が示唆されている。ペプチド４３６〜４４２のエピトープを含むペプチドには、ＧＶＳＦＡＮＹＴ、ＧＶＧＦＡＮＹＴ、ＶＳＦＡＮＹＴＡ及びＶＧＦＡＮＹＴＡが含まれる。ペプチド４４７〜４５２及び／又は４４８〜４５３のエピトープを含むペプチドにはＳＥＴＡＷＡＤ、ＳＥＴＳＷＡＤ、ＥＴＡＷＡＤＰ、ＥＴＳＷＡＤＰ、ＴＡＷＡＤＰＬ及びＴＳＷＡＤＰＬ、より具体的にはＧＳＥＴＡＷＡＤ、ＧＳＥＴＳＷＡＤ、ＳＥＴＡＷＡＤＰ、ＳＥＴＳＷＡＤＰ、ＥＴＡＷＡＤＰＬ、ＥＴＳＷＡＤＰＬ、ＴＡＷＡＤＰＬＬ及びＴＳＷＡＤＰＬＬが含まれる。
【０１４３】
実施例６
タンパク質との結合に関するＫＡＳペプチド及びＲＡＳペプチドの合成
ペプチドを手動で又はＣＥＭ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチドシンセサイザーを使用して合成した。Ｆｍｏｃケミストリに関する標準的な固相ペプチド合成プロトコルを全体を通して使用した。Ｒｉｎｋ−リンカー由来ＡＭ−ｓｕｒｅ樹脂（AAPPTEC, KY, USA）を使用してペプチドをカルボキシアミド形態として構築した。４当量のＦｍｏｃ−アミノ酸と６当量のＤＩＰＥＡとを使用してＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化によりカップリングが達成された。Ｆｍｏｃ基を１Ｍ ＨＯＢｔ／ＤＭＦ中の２０％ピペリジンにより取り除いた。
【０１４４】
ＫＡＳペプチド又はＲＡＳペプチドを保有する樹脂をＤＭＦ中で膨潤させ、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２％（ｖ／ｖ）ピペリジンを含有するＤＭＦ中の２％（ｖ／ｖ）ＤＢＵで取り除いた。それから５当量のＳＡＭＡ−ＯＰｆｐ及び５当量のＨＯＢｔを使用してＳ−アセチルメルカプト酢酸（ＳＡＭＡ）基によりＮ末端アミノ基を誘導体化した。反応をトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）試験によりモニタリングした。ＴＮＢＳＡ試験が陰性に戻ったら、樹脂を洗浄した（５×ＤＭＦ、３×ＤＣＭ及び３×ジエチルエーテル）。それから樹脂を真空下で乾燥させた。樹脂支持体からのペプチドの切断を、ペプチドのアルギニン含有量に応じて２．５時間又は４時間、ＴＦＡ：フェノール：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ：水（９２：２：２：２：２）切断カクテルを使用して行った。切断後、樹脂を濾過により取り除き、濾液を窒素の蒸気下でおよそ１ｍＬに濃縮した。ペプチド産物を冷エーテル中で析出させた後、遠心分離し、３回洗浄した。ペプチド析出物を０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含有する水５ｍＬ〜１０ｍＬに溶解し、不溶性残基を遠心分離により取り除いた。ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
【０１４５】
多くの種々の化学的部分を、タンパク質との結合に関するペプチドを誘導体化させるのに使用することができ、これらは反応基、例えばハロゲン化物（ブロモ、クロロ及びヨード）、マレイミド、スクシンイミジル、ヒドラジニル、オキシム、チオールを誘導し、その後その天然システイン残基を介して誘導体化したペプチドとＫｇｐＡ１等のタンパク質とを結合させるか、又はペプチドを相補的な反応基で誘導体化させ、それにより化学的ライゲーションを進行させ、ペプチド−タンパク質コンジュゲートを形成するのに使用される。
ＳＡＭＡ−ペプチドとＫＡ１との結合
１０ｍｇ／ｍＬの組換えＫＡ１又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体の他の付着因子ドメインを含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム、０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に、０．１ｍＬの１％（ｗ／ｖ）のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のＤＭＦ溶液を添加した。３０分後、反応していないＭＢＳを取り除き、ＭＢＳ修飾ＫＡ１を、結合緩衝液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中で平衡化したＰＤ１０カラム（Pharmacia, NSW, Australia）を使用してゲル濾過により回収した。精製ＳＡＭＡ−ペプチド（１．３μモル）を、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）を含有する２００μＬの６Ｍ グアニジンＨＣｌ中に溶解し、８００μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を用いて希釈し、ＭｉｌｌｉＱ水中に溶解した２Ｍ ＮＨ２ＯＨ（４０等量）２５μＬを添加することによりｉｎ ｓｉｔｕで脱保護した。回収したＭＢＳ−ＫＡ１を脱保護したＳＡＭＡ−ペプチドとすぐに反応させ、室温で１時間撹拌した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で平衡化したＰＤ１０カラムを使用してゲル濾過によりペプチド−ＫＡ１コンジュゲートを反応していないペプチドから分離し凍結乾燥した。Ｅｌｌｍａｎｓ試験を使用して反応をモニタリングした。
【０１４６】
実施例７
抗体の調製
タンパク質を用いて皮下で免疫付与することにより、組換えタンパク質に対するポリクローナル抗血清をマウスで産生させる。マウスを不完全フロイントアジュバント中の２５μｇのタンパク質を用いて０日目に、及び不完全フロイントアジュバント中の２５μｇのタンパク質を用いて３０日目に免疫付与する。免疫付与は標準的な手法を用いて行う。タンパク質に対して高い力価を有するポリクローナル抗血清が得られる。所望に応じて標準的な手法を用いて、組換えタンパク質に特異的に指向性を有するモノクローナル抗体が得られる。
【０１４７】
実施例８
抗体の生成のための免疫付与
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス又はＣＤ１（スイス非近交系マウス）（１群当たり１０匹のマウス）を、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させた抗原のいずれかを５０μｇ用いて皮下で（皮下で１００μＬ）免疫付与した。３０日後、抗原を用いて（皮下注射、ＩＦＡ中で乳化）マウスを追加免疫し、１２日後、マウスを屠殺し、心臓を採血して、血清を回収した。
ＥＬＩＳＡによるサブクラス抗体の決定
マウス血清のサブクラス抗体応答を決定するために、酵素結合免疫測定吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）（ｐＨ７．０）（ＰＢＳＴ）中のＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体の５μｇ／ｍｌ溶液を用いて三連で行い、平底ポリビニルマイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories, McLean, VA）のウェルをコーティングした。コーティング溶液を取り除いた後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴをウェルに加え、コーティングしていないプラスチックを室温で１時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ＳＫ−ＰＢＳＴ）でのマウス血清の段階希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１６時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Sigma, New South Wales, Australia）に対するヤギＩｇＧの２０００倍希釈液をＳＫ−ＰＢＳＴに添加し、室温で２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＳＫ−ＰＢＳＴ中でのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma, New South Wales, Australia）の５０００倍希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合抗体を１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭのクエン酸（ｐＨ４．０）中での０．９ｍＭの２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸］をそれぞれのウェルに加えることにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad製のマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
非近交系（ＣＤ１、スイス）マウスにおける組換えタンパク質ＫＡＳ２−ＫＬＡ１による免疫付与により誘導した抗体サブクラス応答
ＣＤ１（スイス）マウスをＫＡＳ２−ＬＡ１キメラで免疫付与し、採血して、血清を遠心分離により回収した。図６はＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体に対する抗体サブクラス反応性を示す。ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラは、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラを認識し、ＦＫポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体と強く交差反応する主要なＩｇＧ１抗体応答と共に強いＩｇＧ抗体を誘導した（図６）。さらに、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラは免疫反応性ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３抗原特異的抗体の弱い誘導しかもたらさなかった（図６）。
【０１４８】
実施例９
Ｋｇｐ構造モデルの開発、及び活性部位表面に接近可能な配列の同定
本発明者らの研究により、Ｋｇｐプロテイナーゼ活性部位ペプチドが高度に免疫原性であり、ポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の骨喪失に対する高レベルの防御を誘導することが示されている。ワクチン候補としてさらなるプロテイナーゼ活性部位ペプチドを同定するために、Ｋｇｐの触媒ドメインのモデルを、Ｓｙｂｙｌ７．３内のＯｒｃｈｅｓｔｒａｒスイートのプログラムを用いて開発した（図７）。該モデルはポルフィロモナス・ジンジバリス由来のＲｇｐＢプロテアーゼのＰＤＢ構造１ｃｒｖに基づいており、タンパク質は２３．５８％のペアワイズ（pairwise）同一性を有し、Ｚスコアは２５．０９である（高信頼度モデル）。Ｍｅｔａ−ＰＰｉｓｐタンパク質相互作用サーバーがＫｇｐに対する２つのタンパク質−タンパク質相互作用表面：基質結合表面（ＲｇｐＢ等の場合）、及びＫｇｐに特有の第２の表面を予測している。ＲｇｐＢモデルとＫｇｐモデルとの主な違いは第２の相互作用表面を構成するループと、第２の相互作用表面内にあるＫｇｐではモデリングすることができなかった１９残基ギャップ（Ｖａｌ５２６〜Ｐｈｅ５４５）とである。図７はＫｇｐのプロテイナーゼ活性部位の周りに表面に接近可能な配列を示すより肥厚なリボン構造（ribbons）を有するＫｇｐモデルを示し、表面に接近可能な配列はＡｓｐ３８８〜Ｇｌｎ３９４、Ｌｅｕ４２１〜Ａｌａ４２３、Ａｌａ４５１を有するＡｌａ４４３〜Ｇｌｕ４４７、Ａｓｎ５１０〜Ｔｒｐ５１３、及びＴｙｒ５８０を有するＩｌｅ５７０〜Ｇｌｙ５７７であることが分かった。モデル（図６）から、ＫＡＳ２（Ａ）の他に、他の３つの配列ＫＡＳ４（Ａｓｐ３８８〜Ｖａｌ３９５）（Ｂ）、ＫＡＳ５（Ａｓｎ５１０〜Ａｓｐ５１６）（Ｃ）及びＫＡＳ６（Ｉｌｅ５７０〜Ｔｙｒ５８０）（Ｄ）が優勢であり、ワクチン標的となるのに十分な長さであることが明らかである。このため、配列内にこれらのペプチドをそれぞれ有する組換えキメラタンパク質を産生し、ＫＬＡ１のＮ末端で連結し、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１を産生することができ、この組換えキメラタンパク質を、免疫応答を誘導し、それによりポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態に対して防御するのに使用することができる。
【０１４９】
実施例１０
触媒部位に隣接する免疫原性領域を同定するためのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼをモデリングするプロセス
Ａｒｇ−Ｘプロテイナーゼの三次元構造を、Eichinger A, Beisel HG, Jacob U, Huber R, Medrano FJ, Banbula A, Potempa J, Travis J, Bode W. Crystalstructure of gingipain R: an Arg-specific bacterial cysteine proteinasewith a caspase-like fold. EMBO J. 1999 Oct 15;18(20):5453-62の方法に従って決定した。
【０１５０】
実施例１１
以下は抗体を含有する歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
グリセロール ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウリル硫酸ナトリウム １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート（sarconisate） ０．５
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
特異的抗体を含有するヤギ血清 ０．２
水 残り（balance）
【０１５１】
実施例１２
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウリル硫酸ナトリウム １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート ０．５
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
特異的抗体を含有するウシ血清 ０．２
水 残り
【０１５２】
実施例１３
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウロイルジエタノールアミド １．０
モノラウリン酸スクロース ２．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
特異的抗体を含有する牛乳Ｉｇ ０．１
水 残り
【０１５３】
実施例１４
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ソルビトール ２２．０
アイリッシュモス １．０
水酸化ナトリウム（５０％） １．０
Ｇａｎｔｒｅｚ １９．０
水（脱イオン水） ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７６
サッカリンナトリウム ０．３
ピロホスフェート ２．０
アルミナ水和物 ４８．０
香料オイル ０．９５
マウスモノクローナル抗体 ０．３
ラウリル硫酸ナトリウム ２．００
【０１５４】
実施例１５
以下は液体歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ポリアクリル酸ナトリウム ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
エタノール ３．０
特異的抗体を含有するウマＩｇ ０．２
リノール酸 ０．０５
水 残り
【０１５５】
実施例１６
以下は洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
エタノール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．３
特異的抗体を含有するウサギＩｇ ０．２
水 残り
【０１５６】
実施例１７
以下は洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｇａｎｔｒｅｚ Ｓ−９７ ２．５
グリセリン １０．０
香料オイル ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．２
マウスモノクローナル抗体 ０．３
水 残り
【０１５７】
実施例１８
以下はロゼンジ製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
糖 ７５〜８０
トウモロコシシロップ １〜２０
香料オイル １〜２
ＮａＦ ０．０１〜０．０５
マウスモノクローナル抗体 ０．３
ステアリン酸Ｍｇ １〜５
水 残り
【０１５８】
実施例１９
以下は歯肉マッサージクリーム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ホワイトワセリン ８．０
プロピレングリコール ４．０
ステアリルアルコール ８．０
ポリエチレングリコール４０００ ２５．０
ポリエチレングリコール４００ ３７．０
モノステアリン酸スクロース ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン（Chlorohexidine gluconate）０．１
マウスモノクローナル抗体 ０．３
水 残り
【０１５９】
実施例２０
以下はチューイングガム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ガム基剤 ３０．０
炭酸カルシウム ２．０
結晶性ソルビトール ５３．０
グリセリン ０．５
香料オイル ０．１
マウスモノクローナル抗体 ０．３
水 残り
【０１６０】
実施例２１
以下は医薬製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ヒト化特異的モノクローナル抗体 １０
滅菌リン酸緩衝生理食塩水 ９０
【０１６１】
実施例２２
以下は歯周ジェル製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７ ２０．０
ステアリルアルコール ８．０
特異的抗体 ３．０
コロイド二酸化ケイ素（Ａｅｒｏｓｉｌ ２００） １．０
グルコン酸クロルヘキシジン ０．１
水 残り
本発明は本明細書でより詳細に説明されているが、実施例は例示目的のものにすぎないことを理解されたい。分子生物学の当業者にとって明らかである本発明の実施形態の他の変更形態、歯科診断、及び関連のディシプリンが本発明の範囲内であることが意図される。
【０１６２】
【表８】
【配列表フリーテキスト】
【０１６３】
配列番号１：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
ＸはＬもしくはＶになり得る
ＸはＡもしくはＴになり得る
ＸはＴもしくはＳになり得る
ＸはＶもしくはＬになり得る
ＸはＤもしくはＮになり得る
配列番号２：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号２７：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
配列番号２８：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
ＸはＬもしくはＶになり得る
ＸはＡもしくはＴになり得る
ＸはＴもしくはＳになり得る
ＸはＶもしくはＬになり得る
ＸはＤもしくはＮになり得る
配列番号２９：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
ＸはＬもしくはＶになり得る
配列番号３１：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号３２：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号３３：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号６４：ＸはＳもしくはＹになり得る
ＸはＹもしくはＳになり得る
ＸはＰもしくはＳになり得る
ＸはＫもしくはＱになり得る
ＸはＩもしくはＶになり得る
配列番号６６：ＸはＶもしくはＩになり得る
配列番号６８：ＸはＮもしくはＤになり得る
ＸはＳもしくはＹになり得る
ＸはＳもしくはＰになり得る
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド及びキメラタンパク質又は融合タンパク質、並びにポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）関連の状態及び疾患の予防及び治療のために細胞性応答及び体液性応答を誘起するためのこれらのタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性歯周炎は、歯槽骨の吸収及び最終的な歯の脱落をもたらす歯の支持組織の炎症性疾患である。該疾患は社会全体における公衆衛生上の大きな問題であり、成人集団の最大１５％が罹患し、５〜６％が重度な形で罹患していると推測される。
【０００３】
慢性歯周炎の発症及び進行は歯肉縁下の歯垢中の特定のグラム陰性細菌に関連付けられてきた。歯肉縁下の歯垢中のポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）の存在は疾患に強く関連している。
【０００４】
治療（歯石除去及びルートプレーニング）後に歯周炎患者由来の歯肉縁下の歯垢中にポルフィロモナス・ジンジバリスが残っていることが進行的な歯槽骨の喪失に大きく関連すると報告されている。さらに歯肉縁下の歯垢中でのポルフィロモナス・ジンジバリス細胞数の増加は歯周付着喪失、歯周ポケットの深さ及びプロービング時の出血（bleeding on probing）により測定される疾患重症度と相関関係があることが分かっている。
【０００５】
ポルフィロモナス・ジンジバリスによる口腔感染がマウス、ラット及び非ヒト霊長類において歯周骨喪失を誘導することが分かっている。さらに、歯周病、及びポルフィロモナス・ジンジバリス感染と心血管疾患及び或る特定の癌との関連性が増している。
【０００６】
ポルフィロモナス・ジンジバリスの病原性に寄与する毒性因子が数多く報告されており、これにはＬＰＳ、フィムブリエ（fimbriae）、血球凝集素、溶血素及び「ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素」としても既知の細胞外加水分解酵素（特にＡｒｇ−Ｘ及びＬｙｓ−Ｘ特異的プロテイナーゼ）が含まれる。
【０００７】
公衆衛生上の問題の大きさから、抗血清、特にポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対する強い防御応答を与える特異的な抗体及びこれを提供する手段が必要とされている。
【０００８】
１つの問題は、選択される毒性因子が多すぎるので、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対する強い防御応答をどのようにして得るかがはっきりしていないことである。
【０００９】
毒性因子の中でのエピトープの相対的免疫原性は十分には理解されておらず、特にさらなるエピトープが依然として同定されていないかどうかはっきりしていない場合には所与の因子に対するエピトープの相対的免疫原性は理解されていない。
【００１０】
１つの特定の問題は多くの毒性因子が複合ドメインから構成され、ポルフィロモナス・ジンジバリスで見られた配座に近い配座を提示するように発現させるのが困難であることであった。さらには、これらのドメインを不連続単位として、すなわち他の毒性因子ドメインを単離して発現する場合、これらのドメインはポルフィロモナス・ジンジバリスで見られた配座とは区別される配座に折り畳まれる傾向がある。
【００１１】
さらには、毒性因子の免疫原性を変更するための多くの様々な選択肢の中でどれが最も防御免疫応答を与えやすいかは明らかになっていない。
【００１２】
本発明に至る研究において、本発明者らはポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の領域（該領域はＬｙｓ又はＡｒｇを含有するペプチドにおいてＣ末端に位置するペプチド結合を切断しＬｙｓ又はＡｒｇとするための該酵素における部位を規定している）を形成するアミノ酸配列と同じであるか又は相同性を共有するアミノ酸配列を有するペプチドを同定しており、このようなペプチドを、ワクチンとして使用する場合に天然のポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素又は破壊された全細胞から形成された精製プロテイナーゼ−付着因子（adhesin）複合体よりも歯周組織の破壊に対する良好な防御を提供するキメラタンパク質又は融合タンパク質に組み込んだ。
【発明の概要】
【００１３】
一態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含み、
（Ａ）前記第１のペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質を提供する。
【００１４】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質を提供する。
【００１５】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドであって、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的であり、かつ
（ｉｉ）配列番号６７又は配列番号６８で示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有する、ペプチドを提供する。
【００１６】
一態様において、配列番号６４〜配列番号６８のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有するペプチドをキメラタンパク質又は融合タンパク質の形態で与えることができ、該ペプチドが直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結し、該第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む。
【００１７】
さらに別の態様において本発明は、任意でアジュバントと併せて上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質又はペプチドを含む、抗原性組成物、特にワクチン組成物等の組成物を提供する。
【００１８】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は上記のような組成物を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００１９】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は上記のような組成物の使用を提供する。
【００２０】
別の態様において本発明は、上記で広く記載されたキメラタンパク質若しくは融合タンパク質又はペプチドに対して産生される抗体、特にモノクローナル抗体を提供する。
【００２１】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態の重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような抗体を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００２２】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における上記のような抗体の使用を提供する。
【００２３】
さらに別の態様において本発明は、任意で少なくとも１つの調節要素と操作可能に結び付いた、上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【００２４】
この態様において本発明はさらに、このような核酸分子を含むベクター、及びこのような核酸分子を含む原核細胞又は真核細胞を提供する。
【００２５】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような核酸分子、上記のようなベクター、又は上記のような原核細胞若しくは真核細胞を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００２６】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患若しくは状態の重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患若しくは状態の重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における上記のような核酸分子、上記のようなベクター、又は上記のような原核細胞若しくは真核細胞の使用を提供する。
【００２７】
さらなる態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための上記のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用を含む、方法を提供する。
【００２８】
この態様において本発明は、被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための上記のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用も提供する。
【００２９】
さらに別の態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための上記のような抗体の使用を含む、方法を提供する。
【００３０】
この態様において本発明は、被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための上記のような抗体の使用も提供する。
【００３１】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質の製造のためのポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ若しくはＡｒｇ−Ｘプロテイナーゼの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを有するペプチド、又は該ペプチドをコードする核酸の使用を提供する。この態様では、前記ペプチドは配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５又は配列番号２６のうちの１つで示される配列を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】組換えＫｇｐタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色を示す図である。レーン１＝ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、レーン２＝ＫＬＡ１、レーン３＝ＫｓＡ１、レーン４＝ＫＡＳ１−ＫｓＡ１。分子量マーカーはｋＤａで示す。
【図２】ＫＡＳ２ペプチド及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞の抗体認識を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡにおいてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（ＦＫ−Ｗ５０）、組換えタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１及び合成ＫＡＳ２−ＤＴコンジュゲート及びＰＢＳに対して産生される抗血清を用いてＫＡＳ２ペプチドをプロービングした。（Ｂ）ＥＬＩＳＡにおいてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（ＦＫ−Ｗ５０）、組換えタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＬＡ１及びＰＢＳに対して産生される抗血清を用いてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞をプロービングした。抗体応答はバックグラウンドレベルで得られるＯＤ４１５の２倍の逆数（minus double）をＥＬＩＳＡ力価として表し、それぞれの力価は３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図３】組換えタンパク質及び組換えキメラタンパク質、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス、並びにアジュバント単独（ＰＢＳ、ＩＦＡ）によって免疫付与されたマウス、又は非経口感染した（非チャレンジ）マウスの上顎臼歯のポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の水平な骨喪失を示す図である。この図は、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１をＡＳ２−ＬＡ１として示し、ＫＬＡ１をＬＡ１として示し、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１をＡＳ１−ｓＡ１として示し、ＫｓＡ１をｓＡ１として示す。骨喪失の測定値は左側及び右側の上顎両方の上顎臼歯それぞれの頬側のセメント−エナメル境（ＣＥＪ）から歯槽骨頂（ＡＢＣ）までの平方ミリメートル（ｍｍ２）で測定される面積の平均である。データをルビーン検定の等分散性により測定されるように正規分布させ、ｍｍ２単位で平均（ｎ＝１２）で表し、一元配置分散分析及びダネットＴ３検定を用いて分析した。＊は対照（感染）群よりも有意に（Ｐ＜０．００１）小さい骨喪失を有する群を示し、†はＡＳ２−ＬＡ１群よりも有意に（Ｐ＜０．００１）大きい骨喪失を有する群を示す。
【図４】歯周炎モデルにおける免疫付与マウスの血清抗体サブクラスの応答を示す図である。組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１、並びにホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０によって免疫付与したマウス（Ａ（経口接種前）及びＢ（経口接種後））由来の血清を、吸着抗原としてホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０を用いるＥＬＩＳＡに使用した。抗体応答ＩｇＧ（黒色のバー）、ＩｇＧ１（灰色のバー）、ＩｇＧ２ａ（白色のバー）、ＩｇＧ２ｂ（横縞のバー）、ＩｇＧ３（斜め縞のバー）をバックグラウンドレベルを引いて得られたＥＬＩＳＡ力価（ｌｏｇ２）で表し、それぞれの力価は３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図５】ＫＡＳ２ペプチド配列４３３〜４６８を表す重複ペプチドに対するペプチド特異的な抗体反応性のＰＥＰＳＣＡＮ分析を示す。（Ａ）ＫＡＳ１−ＫｓＡ１（白色のバー）、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１（黒色のバー）の抗血清を用いてプロービングしたＫＡＳ２重複ペプチド（オフセット１、オーバーラップ７）。（Ｂ）ＫＡＳ２−ＤＴコンジュゲート抗血清を用いてプロービングしたＫＡＳ２重複ペプチド（オフセット、オーバーラップ７）。それぞれのバーは抗体反応性を示している（４１５ｎｍでの光学密度［ＯＤ］）。
【図６】キメラＡＳ２−ＬＡ１がポルフィロモナス・ジンジバリス全細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を認識する非近交系マウスにおいて抗体応答を誘導することを示す図である。ＣＤ１非近交系マウスをキメラＡＳ２−ＬＡ１（５０ｍｇ／マウス）で免疫付与し、吸収抗原（absorbed antigens）としてＡＳ２−ＬＡ１（Ａ）、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（Ｂ）及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体（Ｃ）を用いるＥＬＩＳＡにおいて回収した血清を使用した。この図では、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１をＡＳ２−ＬＡ１として示す。それぞれの抗原に対するそれぞれの免疫グロブリン（immunoglogulin）アイソタイプに関する力価を求め、データをバックグラウンドレベルで得られるＯＤ４１５の２倍の逆数をＥＬＩＳＡ力価（’０００）として表し、それぞれの力価は３つの値の平均±標準偏差を表す。
【図７】Ｋｇｐプロテイナーゼ、ＫＡＳ２［Ａｓｎ４３３〜Ｌｙｓ４６８］（Ａ）、ＫＡＳ４［Ａｓｐ３８８〜Ｖａｌ３９５］（Ｂ）、ＫＡＳ５［Ａｓｎ５１０〜Ａｓｐ５１６］（Ｃ）、及びＫＡＳ６［Ｉｌｅ５７０〜Ｔｙｒ５８０］（Ｄ）のタンパク質モデルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書で開示及び規定される本発明は、明細書若しくは図面で言及される又は明細書若しくは図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せにまで及ぶことが理解される。これらの様々な組合せは全て本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【００３４】
本発明者らによって、ペプチド結合の切断のための触媒部位若しくは活性部位の側面に位置する、又は他の形で触媒部位若しくは活性部位を規定するポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の領域は高度に免疫原性であり、実際ポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対する体液性応答を与えるのに十分であることが分かっている。特に、これらの領域を１つ又は複数含むキメラタンパク質又は融合タンパク質は全細胞に対して産生される抗血清及び他の免疫原で見られるよりも大きい、歯槽骨の喪失に対する防御を与えることが分かっている。これまでにポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の触媒ドメインの免疫原性が比較的弱いことが分かっているので、この所見は特に驚くべきものである。
【００３５】
一態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含み、
（Ａ）前記第１のペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質を提供する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は最大約４０アミノ酸残基、好ましくは５〜４０のアミノ酸残基のアミノ酸配列を表すのに使用される。
【００３７】
一実施形態において、ポリペプチドは「第２のペプチド」に置き換わって、すなわち言い換えれば「第２のペプチド」の代わりに使用される。「ポリペプチド」という用語は少なくとも約４０アミノ酸残基のアミノ酸配列を表すのに使用される。
【００３８】
そのため別の態様では、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質が提供される。
【００３９】
別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドであって、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的である配列、及び
（ｉｉ）配列番号６７又は配列番号６８で示される配列と同じであるか又は相同的である配列からなる群から選択される、ペプチドを提供する。
【００４０】
本発明の一態様において、前記ペプチドが配列番号６４〜配列番号６８の配列を有する場合、該ペプチドが直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結するキメラタンパク質又は融合タンパク質の形態で与えられ得る。一実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質の第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む。
【００４１】
上記の実施形態において、ポリペプチドが第２のペプチドに置き換わって、すなわち言い換えれば第２のペプチドの代わりに使用される。そのため別の態様では、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列、又は
（ｉｉ）配列番号６７若しくは配列番号６８で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列を含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質が提供される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、ペプチド又はポリペプチドの「ホモログ」に対する言及は、初めに言及されたペプチド若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対する相同性を共有するか、又は初めに言及されたペプチド若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対して相同的であるか、又は初めに言及されたペプチド若しくはポリペプチドのアミノ酸配列との同一性、好ましくは比較をＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルゴリズムのパラメータが各々の参照配列の全長にわたって各々の配列間に最大の適合を与えるように選択される）により行う場合、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％及びさらにより好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドに対する言及である。配列同一性は比較対象の２つの配列のアミノ酸間の正確な適合を表す。このようなホモログはポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの自然発生的な変異体又は単離体から得ることができる。代替的に、このようなホモログがポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ由来のペプチド又はポリペプチドの「保存的置換」変異体であってもよく、ここではペプチド又はポリペプチドの全体の配座及び機能を変えることなく１つ又は複数のアミノ酸残基が変化しており、これにはアミノ酸の同様の特性を有するものへの置き換えが含まれるが、決してこれに限定されない。同様の特性を有するアミノ酸は当該技術分野で既知である。例えば、相互に交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、相互に交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ、相互に交換可能であり得る酸性アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、相互に交換可能であり得る塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リシン及びアルギニンが含まれる。好ましくはこのような保存的置換変異体は２０未満、より好ましくは１５未満、より好ましくは１０未満、及び最も好ましくは５未満のアミノ酸変化を有する。
【００４３】
ペプチド結合の切断に関する酵素における部位を規定する、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素、特にＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ（Ｋｇｐ）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ（ＲｇｐＡ）の領域は、特にＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼに関してポルフィロモナス・ジンジバリスに現れるような触媒部位の三次元配座を予測する方法を例示している図７及び実施例９に関する本明細書の教示に従って決定することができる。実施例１０はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの三次元配座のモデリングに関する方法論を与える。
【００４４】
或る特定の実施形態において、キメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又はその第１若しくは第２のペプチド成分をペプチド模倣薬から形成してもよい。ペプチド模倣薬は所与のペプチドの１つ又は複数の特質、例えば配座を模倣する、及びアミノ酸残基（その幾つかは自然発生的でなくてもよい）からなる分子である。
【００４５】
触媒部位の免疫原性領域を同定した後、本発明者らは体液性応答を誘発する可能性がある様々なペプチド免疫原の配列を決定している。特に、触媒部位の側面に位置する、又は他の形で触媒部位を規定する「６つの」領域を以下のように規定している：ＫＡＳ１／ＲＡＳ１、ＫＡＳ２／ＲＡＳ２、ＫＡＳ３／ＲＡＳ３、ＫＡＳ４／ＲＡＳ４、ＫＡＳ５／ＲＡＳ５及びＫＡＳ６（表１を参照されたい）。この情報を用いて、本発明者らはタンパク質配列データベースに問い合わせ、触媒部位の側面に位置し、そのためポルフィロモナス・ジンジバリスで見られる免疫原性エピトープを表す領域を形成するアミノ酸配列と相同性を共有するペプチドを決定することができた。これらのペプチドの配列を以下の構造式により同定する：
【００４６】
【表１】
【００４７】
本発明者らにより、これらのペプチドを含むキメラタンパク質には多くの有用性があることが分かった。例えば本明細書で記載のように、幾つかのペプチドは慢性歯周炎（periodonitis）で観察されるような骨喪失の治療又は予防に関して高度に防御的である体液性応答をもたらす。上記ペプチドを、該ペプチドが或る個体の血清における特異性を検出又はモニタリングすることができる診断アッセイに使用してもよく、それによりその個体が感染しているか否か、及び感染している場合治療が必要であるか否か、又は治療が与えられた場合に該ペプチドが有効であったか否かが示される。
【００４８】
ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の領域（該領域はＣ末端に位置するペプチド結合を切断しＬｙｓ又はＡｒｇとするための該酵素における部位を規定している）がＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの完全配列を含まないことが理解される。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「異種タンパク質」又は「キメラタンパク質若しくは融合タンパク質」という用語は、異なる供給源又は同じ供給源から得られるアミノ酸の機能的な単位、ドメイン、配列又は領域からなり、かつ該単位、ドメイン、配列又は領域が得られるか又は関連する分子で観察されるものとは区別される構成を有するように会合したタンパク質を表すように使用される。本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質の共通特徴は、ペプチド結合の切断に関する触媒部位を規定するポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の配列と同じであるか又は相同性を共有するアミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも１つ含有することである。
【００５０】
好ましい実施形態において、第１のペプチドがＫｇｐ［４３２〜４６８］領域由来のペプチドを含む場合、第１のペプチドは、（ｉ）ＶＳＦＡＮＹＴ及びＶＧＦＡＮＹＴから選択される配列、より好ましくはＧＶＳＦＡＮＹＴ、ＧＶＧＦＡＮＹＴ、ＶＳＦＡＮＹＴＡ及びＶＧＦＡＮＹＴＡから選択される配列を含むペプチド、又は（ｉｉ）ＥＴＡＷＡＤ、ＥＴＳＷＡＤ、ＴＡＷＡＤＰ及びＴＳＷＡＤＰから選択される配列、好ましくはＳＥＴＡＷＡＤ、ＳＥＴＳＷＡＤ、ＥＴＡＷＡＤＰ、ＥＴＳＷＡＤＰ、ＴＡＷＡＤＰＬ及びＴＳＷＡＤＰＬから選択される配列、より好ましくはＧＳＥＴＡＷＡＤ、ＧＳＥＴＳＷＡＤ、ＳＥＴＡＷＡＤＰ、ＳＥＴＳＷＡＤＰ、ＥＴＡＷＡＤＰＬ、ＥＴＳＷＡＤＰＬ、ＴＡＷＡＤＰＬＬ及びＴＳＷＡＤＰＬＬから選択される配列を含むペプチドであるのが好ましい。より好ましくは、このペプチドは表１に示されるＫＡＳ１［４３２〜４５４］、ＫＡＳ２［４３３〜４６８］及びＫＡＳ３［４３６〜４５５］ペプチドから選択される。代替的に、第１のペプチドは、国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９８／００３１１号（国際公開第９８／０４９１９２号）で開示されたＰＡＳ１（Ｋ４８）としても知られるＰＡＳ１Ｋ［４３２〜４５３］ペプチドであり得る。これらのペプチドに対応する配列識別子を表３に示す。
【００５１】
同様に別の好ましい実施形態において、第１のペプチドがＲｇｐＡ［４２６〜４６２］領域由来のペプチドを含む場合、このペプチドは表１に示されるＲＡＳ１［４２６〜４４８］、ＲＡＳ２［４２７〜４６２］及びＲＡＳ３［４３０〜４４９］ペプチドから選択されるのが好ましい。代替的に、第１のペプチドは、国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９８／００３１１号（国際公開第９８／０４９１９２号）で開示されたＰＡＳ１（Ｒ４５）としても知られるＰＡＳ１Ｒ［４２６〜４４６］ペプチドであり得る。
【００５２】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質において、第２のペプチドはポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素、例えばＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼ（Ｋｇｐ）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼ（ＲｇｐＡ）又はＨａｇＡの付着因子ドメイン由来のペプチドであり得る（表２を参照されたい）。これらのドメインは時には血球凝集素としても知られている。Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼにおいて、好ましいドメインは表２で特定されるようなＫＡ１、ＫＡ２、ＫＡ３、ＫＡ４、ＫＡ５である。Ａｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼでは、好ましいドメインは表２で特定されるようなＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３及びＲＡ４である。ＨａｇＡでは、好ましいドメインはＨａｇＡ１、ＨａｇＡ１＊及びＨａｇＡ１＊＊である。
【００５３】
【表２】
【００５４】
キメラタンパク質又は融合タンパク質にＫＡＳ１、ＫＡＳ２、ＫＡＳ３、ＫＡＳ４、ＫＡＳ５及びＫＡＳ６、又はＲＡＳ１、ＲＡＳ２及びＲＡＳ３、ＲＡＳ４及びＲＡＳ５等の本発明のペプチドが含まれている場合、このようなペプチドに対する体液性応答が改善することに加えて、付着因子ドメインは免疫原性エピトープも含有し、それにより複合特異性が生じ、防御免疫原性応答を誘起する。付着因子ドメインの免疫原性エピトープが、キメラタンパク質又は融合タンパク質において与えられている場合、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素に近づく形態で保持されるという所見は予期せぬものである。
【００５５】
本発明のこれらの実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素の付着因子ドメインのうちのいずれか１つ又は複数、特にＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメイン（ＫＡ１、ＫＡ２、ＫＡ３、ＫＡ４及びＫＡ５）又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメイン（ＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３及びＲＡ４）又はＨａｇＡドメイン（ＨａｇＡ１、ＨａｇＡ１＊及びＨａｇＡ１＊＊）のうちのいずれか１つ又は複数と共にＫＡＳ１／ＲＡＳ１、ＫＡＳ２／ＲＡＳ２、ＫＡＳ３／ＲＡＳ３、ＫＡＳ４／ＲＡＳ４、ＫＡＳ５／ＲＡＳ５及びＫＡＳ６／ＲＡＳ６から選択されるペプチドをいずれか１つ又は複数含有してもよいことが理解される。
【００５６】
付着因子ドメインがポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素で観察されるような完全ドメインである必要がないことも理解される。例えば付着因子ドメインはこのようなドメインの断片であってもよく、特に好ましい断片はＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼＡ１ドメインのＫｓＡ１ドメイン断片及びＫＬＡ１ドメイン断片である（表２を参照されたい）。ドメインが付着因子ドメインの断片である場合、該ドメインは一般的に付着因子ドメイン特異的エピトープを１つ又は複数含有する。
【００５７】
付着因子関連ペプチドに対応する配列識別子を表３に示す。
【００５８】
一実施形態において、第２のペプチド又はポリペプチドは配列番号６９〜配列番号７９のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号８３〜配列番号８５のうちの１つ若しくは複数で示される配列を含む。
【００５９】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、Ｌｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼのＫｇｐ［４３２〜４６８］領域から選択される１つ又は複数のさらなるペプチド、及び／又はＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼのＲｇｐＡ［４２６〜４６２］領域から選択される１つ又は複数のさらなるペプチドを含んでいてもよい。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、ＫｓＡ１又はＫＬＡ１と共にＫＡＳ１、ＫＡＳ２、ＫＡＳ３、ＫＡＳ４、ＫＡＳ５及びＫＡＳ６のうちの１つ若しくは複数、又はＲＡＳ１、ＲＡＳ２、ＲＡＳ３、ＲＡＳ４及びＲＡＳ５のうちの１つ若しくは複数を含む。
【００６１】
このため或る特定の実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質はさらなるペプチドを少なくとも１つ含んでいてもよく、該さらなるペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む。
【００６２】
本明細書に記載のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質に含まれ得るドメイン、単位、配列又は領域の他の例としては、Ｆｃ結合領域若しくはＦｃ受容体等の受容体若しくはリガンドと結合するドメイン、アルブミン等の半減期を改善するドメイン、又はキメラタンパク質若しくは融合タンパク質の発現若しくは精製を促進するドメインが挙げられる。
【００６３】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質において、第１のペプチドのＣ末端残基が付着因子ドメインポリペプチドのＮ末端残基と共有結合することができるか、又は第１のペプチドのＮ末端残基が付着因子ドメインポリペプチドのＣ末端残基と共有結合することができる。この配置において、第１のペプチドと付着因子ドメインポリペプチドとが「直接結び付いている」又は「近接している」といわれる。
【００６４】
他の実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は第１のペプチドと付着因子ドメインポリペプチドとを結び付けるリンカーを含む。リンカーはアミノ酸及び非アミノ酸のリンカーの両方を含む、ペプチドとポリペプチドとを連結させることが可能な任意のリンカーであり得る。好ましくはリンカーは非免疫原性である。好適なリンカーは最大１５アミノ酸長であり得るが、５アミノ酸未満が好ましい。リンカーは第１のペプチド及び付着因子ドメインポリペプチドを、ポルフィロモナス・ジンジバリスのトリプシン様酵素で通常観察されるよりも密接な空間的配置にするように機能し得る。代替的に、第１のペプチドと付着因子ドメインポリペプチドとの間隔が空いていてもよい。
【００６５】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は組換え発現系（例えば組換えＤＮＡ技術）又は化学合成（例えば固相ペプチド合成）により産生することができる。これらの技法は当該技術分野で既知である。
【００６６】
異種タンパク質又はキメラタンパク質は、キメラタンパク質又は融合タンパク質の第１又は第２のペプチド成分を単独で使用して得られる体液性応答に対して、得られる体液性応答が改善するため特に有益である。
【００６７】
本発明者らにより、これらのペプチドを含むキメラタンパク質には多くの有用性があることが分かった。例えば本明細書で記載のように、幾つかのペプチドは慢性歯周炎で観察されるような骨喪失の治療又は予防に関して高度に防御的である体液性応答をもたらす。上記ペプチドを、該ペプチドが或る個体の血清における特異性を検出又はモニタリングすることができる診断アッセイに使用してもよく、それによりその個体が感染しているか否か、及び感染している場合治療が必要であるか否か、又は治療が与えられた場合に該ペプチドが有効であったか否かが示される。
【００６８】
一実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、防御免疫応答、典型的にはポルフィロモナス・ジンジバリス感染に関連する結合組織損傷を少なくとも最小にする又はそうでなければ制限する応答を誘導する。一実施形態では、防御応答がポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の骨喪失を少なくとも最小にする又は制限する。ポルフィロモナス・ジンジバリス感染によって媒介される骨喪失を測定するモデルシステムが本明細書で論じられている。典型的には防御免疫応答は主に体液性応答である。或る特定の実施形態では、防御免疫応答には細胞性応答も含まれる。
【００６９】
本発明は上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質を含む組成物も提供する。典型的には組成物は抗原性又は免疫原性を有する。より具体的には本発明は、任意でアジュバントと併せてキメラタンパク質又は融合タンパク質を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御免疫応答又は治療免疫応答を誘起するのに好適な組成物を提供する。このような組成物は免疫応答を調整する又は高める別の成分を含んでいてもよい。一実施形態では、組成物はワクチンの形態をとる。
【００７０】
様々なアジュバントをワクチン組成物と併用することが知られている。アジュバントは、免疫応答を調整することにより、ワクチン抗原を単独で投与する場合より少量のワクチン抗原又はより小さい用量を用いてより長期的かつより高レベルの免疫を達成するのを助ける。アジュバントの例としては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、アジュバント６５（落花生油、モノオレイン酸マンニド（mannide monooleate）及びモノステアリン酸アルミニウムを含有する）、油型エマルション、Ｒｉｂｉアジュバント、プルロニックポリオール、ポリアミン、アブリジン、Ｑｕｉｌ Ａ、サポニン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１、アルミニウム塩及びカルシウム塩等のミネラルゲル、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、アルミニウム塩等のナノ粒子、マンナン、キトサン等の糖オリゴマー及びポリマーが挙げられる。他の例としてはＳＡＦ−１、ＳＡＦ−０、ＭＦ５９、Seppic製のＩＳＡ７２０等の水中油型エマルション、並びにＩＳＣＯＭ（商標）及びＩＳＣＯＭマトリクス（商標）等の他の粒子状アジュバントが挙げられる。アジュバントの他の例の広範囲に及ぶが限定的ではないリストが、Cox and Coulter 1992 [In: Wong WK (ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-112]に列挙されている。アジュバントの他に、ワクチン組成物は必要に応じて従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、緩衝剤又は希釈剤を含んでいてもよい。アジュバントを含有する１つ又は複数の用量のワクチン組成物を、歯周炎を予防するために予防的に、又は既に存在している歯周炎を治療するために治療的に投与してもよい。
【００７１】
好ましい組成物において、キメラタンパク質又は融合タンパク質を粘膜アジュバントと組合せて、経口、頬側又は鼻の経路を介して投与する。粘膜アジュバントの例はナノ粒子、コレラ毒素及び易熱性の大腸菌毒素、これらの毒素の非毒性Ｂサブユニット、毒性が低減したこれらの毒素の遺伝的突然変異体である。抗原性タンパク質を経口的に／頬側から／鼻から送達するのに利用することができる他の方法には、胃腸管又は他の粘膜表面からのミクロスフェアの取り込みを助ける及びタンパク質の分解を防ぐマイクロカプセル化による、生分解性ポリマーの粒子（例えばアクリレート又はポリエステル）又はナノ粒子（例えばヒドロキシアパタイト）中への又はこれらの上へのタンパク質の取り込み又は吸収が含まれる。リポソーム、ＩＳＣＯＭ（商標）、ヒドロゲルは、抗原性タンパク質の粘膜免疫系への送達のためにＬＴＢ、ＣＴＢ又はレクチン等の標的分子の取り込みによりさらに強化することができる他の有望な方法の例である。抗原性タンパク質及び粘膜アジュバント又は送達系の他に、ワクチン組成物は必要に応じて、従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、コーティング、分散媒、抗細菌剤又は抗真菌剤、及び緩衝剤又は希釈剤を含んでいてもよい。
【００７２】
この態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は上記のような組成物を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００７３】
被験体はヒト又は他の動物被験体であってもよく、好ましくはヒトである。
【００７４】
典型的には、ポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患は慢性歯周炎であるが、骨喪失、特に歯槽骨の喪失、又は冠動脈疾患でもあり得る。
【００７５】
ワクチン組成物のヒト又は動物被験体への投与に関して多くの方法が知られており、これには皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、舌下、頬側及び経口の投与が含まれるがこれらに限定されない。これらの投与経路はワクチン接種に特に有用である。
【００７６】
別の態様において本発明は、上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質に対して産生される抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。
【００７７】
これらの抗体は標準的技法により産生することができ、被験体の受動免疫付与に使用することができる。したがってこの態様では本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような抗体を該被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【００７８】
さらなる態様において本発明は、任意で少なくとも１つの調節要素と操作可能に結び付いた、上記で広く記載されたキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一実施形態では、核酸は単離形態又は実質的な精製形態で提供される。
【００７９】
核酸分子は例えば、発現ベクターの原核宿主細胞又は真核宿主細胞への挿入により、組換えタンパク質としてのキメラタンパク質の産生に好適な発現ベクターに挿入することができる。組換えタンパク質の発現の成功には、発現ベクターが発現に使用される特定の宿主細胞系に適合し、かつこの特定の宿主細胞系によって認識される、転写及び翻訳に必要な調節要素を含有することが要求される。様々な宿主細胞系を組換えタンパク質を発現させるのに利用してもよく、これにはバクテリオファージベクター、プラスミドベクター又はコスミドＤＮＡを用いて形質転換した細菌；酵母ベクターを含有する酵母；真菌ベクターを含有する真菌；ウイルス（例えばバキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞株；及びプラスミド若しくはウイルス発現ベクターを用いてトランスフェクトした、又は組換えウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等）を用いて感染させた哺乳動物細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
分子生物学の分野で既知の方法を用いて、アミノ酸配列の発現の増大が用いられる特定の宿主細胞系に適合していれば（例えば用いられる特定の宿主細胞系に対して非毒性であれば）、様々なプロモーター及びエンハンサーを発現ベクターに組み込み、組換えタンパク質の発現を増大させることができる。
【００８１】
プロモーターの選択は用いられる発現系に依存する。プロモーターによって、強度、すなわち転写促進能が異なる。一般的に、コーディングヌクレオチド配列の高レベルの転写及び組換えタンパク質への高レベルの発現を得るために強いプロモーターを使用することが望まれる。例えば、高レベルの転写が大腸菌を含む宿主細胞系で観察された、当該技術分野で既知の細菌プロモーター、ファージプロモーター、又はプラスミドプロモーターには、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、ＰＲ及びＰＬプロモーター、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ等が含まれ、これらはアミノ酸配列をコードする挿入されたヌクレオチド配列の転写を与えるために使用することができる。
【００８２】
効率的な転写又は翻訳のための他の制御要素にはエンハンサー及び調節シグナルが含まれる。エンハンサー配列は、隣接したコーディングヌクレオチド配列に関するそれらの位置及び配向とは比較的非依存的に転写効率を増大させると考えられるＤＮＡ要素である。このため、用いられる宿主細胞の発現ベクター系に応じて、エンハンサーは挿入されるコーディング配列の上流又は下流のいずれかに配置され、転写効率を増大させ得る。他の調節部位、例えば転写開始シグナル又は翻訳開始シグナルを、コーディング配列の発現を調節するのに使用することができる。
【００８３】
別の実施形態において、ベクターはウイルス又は細菌のワクチンベクターであってもよく、組換えウイルスワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え弱毒化細菌ワクチン、又は不活性化組換えウイルスワクチンを提供するために使用することができる。ワクシニアウイルスは、当該技術分野における他の生物に由来するワクチン抗原を発現するように改変された感染性ウイルスの最も知られる例である。それ自体が疾患を引き起こさないように弱毒化又はそうでなければ処理した組換え生ワクシニアウイルスは宿主に免疫付与するのに使用される。宿主内での組換えウイルスのその後の複製がワクチン抗原による免疫系の連続刺激をもたらし、それにより長期にわたる免疫がもたらされる。
【００８４】
他の生ワクチンベクターには、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、及び好ましくはワクシニア等のポックスウイルス［Paoletti and Panicali、米国特許第４，６０３，１１２号］、及び弱毒化サルモネラ株［Stocker et al.、米国特許第５，２１０，０３５号、同第４，８３７，１５１号及び同第４，７３５，８０１号、並びにCurtiss et al., 1988, Vaccine 6:155-160］が含まれる。生ワクチンは、該生ワクチンが免疫系を連続的に刺激し、かなりの長期にわたる免疫をもたらすことができるため特に有益である。免疫応答がその後のポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御的である場合、生ワクチン自体をポルフィロモナス・ジンジバリスに対する予防ワクチンに使用することができる。特に、生ワクチンは口腔の共生菌（commensal inhabitant）である細菌を基とすることができる。この細菌を組換えキメラタンパク質を保有するベクターを用いて形質転換し、それから口腔、特に口腔粘膜に定着させるのに使用することができる。口腔粘膜に定着すると、組換えタンパク質の発現が粘膜関連リンパ系組織を刺激し、中和抗体が産生される。この実施形態をさらに説明するために、当該技術分野で既知の分子生物学的技法を用いて、本発明のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、エピトープを発現させるが、ワクシニアウイルスベクターの成長又は複製に悪影響を与えない部位でワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡに挿入することができる。得られた組換えウイルスをワクチン製剤における免疫原として使用することができる。例えば免疫原として使用する前に当該技術分野で既知の化学的手段により、発現される免疫原の免疫原性に実質的に影響することなく組換えウイルスを不活性化すること以外は同じ方法を、不活性化組換えウイルスワクチン製剤を構築するのに用いることができる。不活性化組換えワクチンはワクチン抗原に対する免疫学的応答を高めるために好適なアジュバントと共に配合することができる。
【００８５】
本発明は、ワクチン製剤としての直接的な本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用も提供する。１つ又は複数の調節要素と操作可能に結び付いたキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を直接導入し、ポルフィロモナス・ジンジバリスの病原性株に対して個体にワクチン接種することができる（「遺伝子直接導入（direct gene transfer）」）。血管内皮細胞のようなワクチン接種個体の細胞及び主要器官の組織による遺伝物質の発現をもたらすワクチン接種個体への遺伝子直接導入が、発現プラスミド：カチオン性リポソーム複合体の静脈注射のような当該技術分野における技法により実証された［Zhu et al., 1993, Science 261 :209-211］。ベクターＤＮＡを標的細胞へと送達する他の効果的な方法が当該技術分野で既知である。一例として、ウイルス遺伝子を含有する精製組換えプラスミドＤＮＡは、防御免疫応答を誘導するワクチンを（非経口で、粘膜から、又は遺伝子銃免疫付与により）接種するのに使用されている［Fynan et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-11482］。別の例として、個体から取り出された細胞は、当該技術分野で既知の標準的な手法により、トランスフェクト又は電気穿孔することができ、これにより標的細胞内に組換えベクターＤＮＡが導入される。そのため、組換えベクターＤＮＡを含有する細胞はベクターで発現した選択マーカーの使用のような当該技術分野で既知の方法を用いるために選択することができ、それから組換えタンパク質を発現させるために選択された細胞を個体に再導入してもよい。
【００８６】
この態様において本発明はさらに、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、上記のような核酸分子、上記のようなベクター、又は上記のような原核細胞若しくは真核細胞を該被験体に投与することを含む、方法を提供する。
【００８７】
他の実施形態において、上記のようなキメラタンパク質若しくは融合タンパク質又は抗体を含む医薬組成物が提供される。該組成物はポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の治療のために希釈剤、賦形剤、又は担体又は化学療法剤をさらに含んでいてもよく、経口投与に適合させることができる。本発明の組成物を、例えば温かいガム基剤中に撹拌することにより、又はガム基剤（その例はジェルトン、ゴムラテックス、ビニライト樹脂等である）の外表面を望ましくは従来の可塑剤若しくは軟化剤、グルコース、ソルビトール等の糖若しくは他の甘味料でコーティングすることにより、ロゼンジ又はチューイングガム又は他の製品に組み込むことができる。
【００８８】
上述の医薬組成物を含有する本発明の経口組成物を、歯磨きペースト、歯磨き粉及び歯磨き液を含む歯磨き剤、洗口液、トローチ、チューイングガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品及び他の食品等の口に適用可能な様々な形態で調製及び使用することができる。本発明による経口組成物は特定の経口組成物の種類及び形態に応じてさらなる既知の成分をさらに含んでいてもよい。
【００８９】
本発明の或る特定の好ましい形態において、経口組成物は実質的に性質として液体のもの、例えば洗口液又はリンスであり得る。このような調製物において、ビヒクルは典型的に望ましくは以下に記載のような保湿剤を含む水−アルコール混合物である。一般的に、アルコールに対する水の重量比は約１：１〜約２０：１の範囲である。この種の調製物における水−アルコール混合物の総量は典型的に調製物の約７０重量％〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは典型的にはエタノール又はイソプロパノールである。エタノールが好ましい。
【００９０】
本発明のこのような液体及び他の調製物のｐＨは概して約５〜約９、典型的には約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨを酸（例えばクエン酸又は安息香酸）若しくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御することができるか、又は（例えばクエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を用いて）緩衝させることができる。
【００９１】
本発明の他の望ましい形態において、医薬組成物は実質的に性質として固体又はペースト状のもの、例えば歯磨き粉、歯垢検出剤（dental tablet）又は歯磨きペースト（歯科用クリーム）又はジェル歯磨き剤であり得る。このような固体又はペースト状の経口調製物のビヒクルは一般的に歯科的に許容される研磨材料を含有する。
【００９２】
歯磨きペーストにおいて、液体ビヒクルは典型的に調製物の約１０重量％〜約８０重量％の範囲の量で水及び保湿剤を含み得る。好適な保湿剤／担体としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及びポリプロピレングリコールが例示される。水、グリセリン及びソルビトールの液体混合物も有益である。屈折率が考慮すべき重要なものである透明なジェルにおいて、約２．５％〜３０％（ｗ／ｗ）の水、０％〜約７０％（ｗ／ｗ）のグリセリン、及び約２０％〜８０％（ｗ／ｗ）のソルビトールを用いるのが好ましい。
【００９３】
歯磨きペースト、クリーム及びジェルは典型的に、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．５％〜約５％（ｗ／ｗ）の割合で天然又は合成の増粘剤又はゲル化剤を含有する。好適な増粘剤は合成ヘクトライト、例えばLaporte Industries Limitedから市販されているＬａｐｏｎｉｔｅ（例えばＣＰ、ＳＰ ２００２、Ｄ）として利用可能な合成コロイドマグネシウムアルカリ金属シリケート複合体粘土である。Ｌａｐｏｎｉｔｅ Ｄはおよそ５８．００重量％ ＳｉＯ２、２５．４０重量％ ＭｇＯ、３．０５重量％ Ｎａ２Ｏ、０．９８重量％ Ｌｉ２Ｏ、並びに幾らかの水及び微量金属である。その真の比重は２．５３であり、湿度８％で１．０ｇ／ｍｌの見掛けのかさ密度を有する。
【００９４】
他の好適な増粘剤には、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、トラガカントゴム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えばＮａｔｒｏｓｏｌとして利用可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び微砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）等のコロイドシリカが含まれる。可溶化剤には、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコール等の湿潤ポリオール、メチルセロソルブ及びエチルセロソルブ等のセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油及びワセリン等の直鎖に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油及びワックス、並びに酢酸アミル、酢酸エチル及び安息香酸ベンジル等のエステルも含まれ得る。
【００９５】
従来通り経口調製物は通常、好適なラベル付きパッケージで販売又はそうでなければ流通していると理解される。このため、マウスリンスのボトルはそれを実質的にマウスリンス又は洗口液として記載し、その使用に関して説明しているラベルを有しており、歯磨きペースト、クリーム又はジェルは通常、それを実質的に歯磨きペースト、ジェル又は歯科クリームとして記載しているラベルを有する、押し出しチューブ（典型的にはアルミニウム、裏打ちされた鉛、若しくはプラスチック製の）、又は内容物を秤量する他の搾り出し式ディスペンサー、ポンプ式ディスペンサー若しくは加圧式ディスペンサー中にある。
【００９６】
予防作用の増大を達成するために、口腔全体への活性剤の徹底的かつ完全な分散を達成するのを助けるために、及び本組成物をより化粧品として許容可能にするために有機界面活性剤を本発明の組成物に使用してもよい。有機界面活性材料は自然状態でアニオン性、非イオン性又は両性であるのが好ましく、活性剤と相互作用しないのが好ましい。組成物に洗浄性及び発泡性を与える洗浄材料を界面活性剤として利用するのが好ましい。アニオン性界面活性剤の好適な例は高級脂肪酸モノ硫酸モノグリセリドの水溶性塩、例えば硬化ヤシ油脂肪酸のモノ硫酸モノグリセリドのナトリウム塩、高級アルキル硫酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸塩、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルキルスルホ酢酸塩、スルホン酸１，２−ジヒドロキシプロパンの高級脂肪酸エステル、及び低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、例えば脂肪酸、アルキル又はアシルラジカルに１２個〜１６個の炭素を有するもの等である。最後に言及されたアミドの例は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、並びにセッケン又は同様の高級脂肪酸材料を実質的に含まないＮ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン又はＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム塩、カリウム塩及びエタノールアミン塩である。使用に好適な水溶性の非イオン性界面活性剤の例は、エチレンオキシドと疎水性の長鎖（例えば約１２個〜２０個の炭素原子の脂肪族鎖）を有しそれと反応性を有する様々な反応性水素含有化合物との縮合生成物であり、該縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamers）」)は親水性ポリオキシエチレン部分を含有し、例えばポリ（エチレンオキシド）と脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えばモノステアリン酸ソルビタン）及びポリプロピレンオキシド（例えばプルロニック材料）との縮合生成物等である。
【００９７】
界面活性剤は典型的に約０．１重量％〜５重量％の量で存在する。界面活性剤が本発明の活性剤の溶解を助け、それにより必要となる可溶化保湿剤の量を減らすことができることは注目に値する。
【００９８】
増白剤、保存料、シリコーン、クロロフィル化合物及び／又は尿素、リン酸二アンモニウム等のアンモニア化材料、並びにそれらの混合物等の様々な他の材料を本発明の経口調製物に組み込んでもよい。これらのアジュバントは存在する場合、所望の特性及び特質に実質的に悪影響を及ぼすことのない量で調製物に組み込まれる。
【００９９】
任意の好適な芳香材料又は甘味材料を利用してもよい。好適な芳香成分の例は芳香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、チョウジ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン及びオレンジの油、並びにサリチル酸メチルである。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル）、サッカリン等が含まれる。好適には芳香剤及び甘味剤はそれぞれ又は共に、調製物の約０．１％〜５％以上（more）含み得る。
【０１００】
経口使用を目的とする組成物を医薬組成物の製造に関して当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は薬学的に有効な（elegant）口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される作用物質を１つ又は複数含有してもよい。錠剤は錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア、並びに平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は錠剤を胃腸管又は歯周ポケットでの崩壊及び吸収を遅らせ、それによりより長期にわたり作用が持続するように既知の技法でコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の遅延材料を利用してもよい。
【０１０１】
経口使用のための製剤を硬ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合される）、又は軟ゼラチンカプセルとして（その中で活性成分は水又は油媒体、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合される）提示してもよい。
【０１０２】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。このような賦形剤は懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムである。分散剤又は湿潤剤は天然のホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。
【０１０３】
水性懸濁液は１つ又は複数の保存料又は抗菌剤、例えばベンゾエート、例えばエチルベンゾエート又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート（別の例はグルコン酸クロルヘキシジンである）、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の芳香剤、及び１つ又は複数の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有していてもよい。
【０１０４】
油性懸濁液を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は液体パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁することにより配合してもよい。油性懸濁液は増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有していてもよい。上記で記載されるような甘味剤、及び芳香剤を口当たりのよい経口調製物を提供するために添加してもよい。これらの組成物をアスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存してもよい。
【０１０５】
さらなる態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための上記のようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用を含む、方法を提供する。
【０１０６】
さらなる別の態様において本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための上記のような抗体の使用を含む、方法を提供する。
【０１０７】
さらに別の態様において本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドを提供する。一実施形態では、ペプチドは配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つと相同的である配列を有する。ペプチドは５〜４０のアミノ酸長を有し得る。
【０１０８】
さらに別の態様において本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１０９】
さらに別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質の製造のための配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチド、又は配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸の使用を提供する。
【０１１０】
さらに別の態様において本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するための配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチド、又は配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を有するペプチドをコードする核酸の使用を提供する。一実施形態では、前記ペプチドを
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む第２のペプチドと同時に又は連続して投与する。
【０１１１】
【表３−１】
【０１１２】
【表３−２】
【０１１３】
【表３−３】
【０１１４】
【表３−４】
【０１１５】
【表４−１】
【０１１６】
【表４−２】
【０１１７】
【表５−１】
【０１１８】
【表５−２】
【０１１９】
【表５−３】
【０１２０】
【表５−４】
【０１２１】
【表５−５】
【０１２２】
【表６−１】
【０１２３】
【表６−２】
【０１２４】
【表６−３】
【０１２５】
本発明はさらに以下の実施例により説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく例示として記載される。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
方法及び材料
細菌株及び成長条件
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の凍結乾燥培養物を５μｇ／ｍｌのへミン、０．５μｇ／ｍｌのシステインを添加した溶解ウマ血液寒天プレート（ＨＢ寒天、１０回未満の継代）上で３７℃で嫌気的に成長させた。３〜４日後、コロニーを用いて、５μｇ／ｍｌのへミン、０．５μｇ／ｍｌのシステインを含有するブレインハートインフュージョン培地に接種した（１）。バッチ培養物をＭＫ３嫌気性ワークステーション（Don Whitley Scientific Ltd., Adelaide, Australia）において嫌気的に成長させた。細胞を遠心分離（７５００ｇ、３０分、４℃）により指数成長期中に回収し、嫌気性ワークステーションにおいてＰＧ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び５ｍＭ システイン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて２回洗浄した。バッチ培養物の成長を分光光度計（モデル２９５Ｅ、Perkin-Elmer）を使用して６５０ｎｍでモニタリングした。培養物の純度をグラム染色、顕微鏡検査により、及びSlots（２）による様々な生化学試験を使用することにより定期的に確認した。
付着因子配列及びＫｇｐプロテイナーゼ配列をＮ末端に付加した付着因子配列を含有するｐＥＴ２８構築物の構築
活性部位（ＡＳ）のペプチド及びキメラペプチドを表すＫｇｐ残基、並びにＫｇｐＡ１付着因子（Ａ１）ドメインを、ｐＥＴ発現ベクター（Novagen）を使用してｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを有する組換え（ｒ）タンパク質として大腸菌で過剰発現させた。発現したｒタンパク質はｒＫＡＳ２及びｒＫＬＡ１であり、ｒキメラタンパク質はｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ｒＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びｒＫＡＳ４−ＫＡＳ３−ＫＡＳ５−ＫＡＳ６−ＫＬＡ１（マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１とも称される）であった。様々なＡ１ドメイン及びＡＳドメインを表すアミノ酸配列を表１及び表２に記載する。
【０１２７】
ｋｇｐ遺伝子の様々なＫＡＳドメイン及びＫＡ１ドメインを、表４に列挙されるプライマー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）及びＰＣ−９６０サーマルサイクラー（Corbett Research Technologies）を使用して、それぞれｐＮＳ１（ｐＵＣ１８における３．５ｋｂのＢａｍＨＩ ｌｙｓ断片）又はポルフィロモナス・ジンジバリスのゲノムＤＮＡから増幅した。ＫＡＳ２−ＦＯＲとＫＡＳ２−ＲＥＶとのプライマー対及びＫＬＡ１−ＦＯＲとＫＬＡ１−ＲＥＶとのプライマー対を使用し、以下の反応条件を用いてそれぞれＫＡＳ２をコードするＰＣＲ断片及びＫＬＡ１をコードするＰＣＲ断片を生成した：９４℃、３分、その後９４℃、４５秒（変性）、６２℃、４０秒（アニーリング）及び７２℃、２０秒（伸長）を２８サイクル、その後最終サイクルとして７２℃、５分。
【０１２８】
ＫＡＳ２−ＫＬＡ１キメラＰＣＲ産物を、以下の通りに重複伸長（overlap extension）による遺伝子スプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）により産生した：ＰＣＲ産物を上記の条件を用いてＫＡＳ２−ＦＯＲとＫＡＳ２−ＫＬＡ１−キメラ−ＲＥＶとのプライマー対及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１−キメラ−ＦＯＲとＫＬＡ１−ＲＥＶとのプライマー対を使用して産生した。それからＰＣＲ産物をアニーリングし、最終ＰＣＲをプライマーＫＡＳ２−ＦＯＲ及びＫＬＡ１−ＲＥＶを用いて行った（９４℃、２分、その後９４℃、３０秒、５０℃、３０秒及び７２℃、４０秒を２８サイクル、その後最終サイクルとして７２℃、５分）。
【０１２９】
ＫＡＳ１−ＫｓＡ１ ＰＣＲ産物の調製のために、２回の連続したＰＣＲを、連続してそれぞれＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ１プライマー及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ２プライマーと共にＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＲＥＶプライマーを使用して行い（反応条件 ９４℃で２分、その後９４℃、１５秒、６３℃、３０秒及び７２℃、２分を３５サイクル）、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１ ＰＣＲ産物を産生した。ＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ１プライマー及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１−ＦＯＲ２プライマーはこれまでのＰＣＲ産物の５’側に重複する３’側の伸長を含有している。
【０１３０】
マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１ ＰＣＲ断片の調製のために、４回の連続したＰＣＲを、連続してそれぞれマルチＦＯＲ１プライマー、マルチＦＯＲ２プライマー、マルチＦＯＲ３プライマー及びマルチＦＯＲ４プライマーと共にマルチＲＥＶプライマーを使用して行い（反応条件は９５℃、２分、その後９５℃、２０秒、６８℃、１．５分を３５サイクルであった）、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１ ＰＣＲ産物を産生した。それぞれのマルチＦＯＲプライマーはこれまでのＰＣＲ産物の５’側に重複する３’側の伸長を含有している。
【０１３１】
ＫＡＳ２、ＫＬＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びマルチＫＡＳ−ＫＬＡ１をコードするＰＣＲ断片は全てＰＣＲ精製カラム（Qiagen）を使用して精製し、ＴＡクローニングベクター、ｐＧｅｍ−Ｔ Ｅａｓｙ（Promega）にライゲートして、製造業者のプロトコルに従って大腸菌ＪＭ１０９へと形質転換した。精製組換えｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙ構築物をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを用いて消化し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＥＴ２８ｂ（Novagen）に一方向にクローニングして、非発現宿主、大腸菌ＪＭ１０９［ＤＨ５α］へと形質転換した。組換えｐＥＴ２８構築物を精製し、大腸菌発現宿主、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）］（Novagen）へと形質転換して、製造業者の取扱説明書に従い５０μｇのカナマイシンを含有するＬＢ上で選択した。それぞれの挿入物の完全性をＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドプライマー（表４）は必要に応じて制限酵素部位、終止コドン及びｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを組み込むように設計した。ｒＫＡＳ２、ｒＫＬＡ１及びｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１に使用するプライマーはｒタンパク質において外部の（extraneous）コーディング配列がわずか３つのアミノ酸及びｈｅｘａ−ｈｉｓタグに包含されるのを制限するように設計した。ｒＫＡＳ１及びｒＫＬＡ１はＮ末端及びＣ末端の両方にｈｅｘａ−ｈｉｓタグを有するｒＫＡＳ２−ＫＬＡ１と直接比較できるようにそれぞれＮ末端及びＣ末端にｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを含有するように設計した。ｒＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びマルチＫＡＳ−ＫＬＡ１では、ＨｉｓタグはＣ末端に見られる。
【０１３３】
【表７−１】
【０１３４】
【表７−２】
【０１３５】
組換えタンパク質の発現及び精製
組換えタンパク質を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）による誘導によりｐＥＴ２８：：ＫＬＡ１（ＫＡＳ２、ＫＡＳ２−ＬＡ１、ＫＡＳ１−ＳＡ１、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１）構築物から発現した。組換えタンパク質は全て６−Ｈｉｓタグ融合タンパク質として産生し、変性条件下でＮＩ−ＮＴＡ精製システム（Invitrogen）を用いて精製した。簡潔に述べると、大腸菌（ＤＥ３）単一コロニー形質転換体を使用して、旋回振盪器上で３７℃で一晩５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス２０ｍＬに接種した。それからこの接種材料を使用して、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ １Ｌに接種した。この培養物のＯＤ６００を０．５〜０．７（対数成長中期（mid-log phase））に達せしめた後、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２時間、０．１ｍＭのイソプロピルＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。細胞を回収し（７５００ｇ）、変性結合緩衝液（８Ｍ 尿素、２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ)中で再懸濁して、３に設定しマイクロチップを用いてＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｅｒ ２５０細胞破壊器（Branson Ultronics Corporation, Danbury, CT）を使用して、３０秒間隔で３回×１５秒のバーストのために氷上で超音波処理した後、４℃で３０分間３９０００ｇで遠心分離した。事前に平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムに充填した後、変性洗浄緩衝液（８Ｍ 尿素、２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ)を用いて洗浄し、それにより非結合タンパク質を溶出させることにより、組換えタンパク質を上清から精製した。その後カラムを１０容量の結合緩衝液Ｂを用いて洗浄し、組換えタンパク質を変性溶出緩衝液（８Ｍ 尿素、２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５Ｍ イミダゾール）を用いて溶出させた。精製タンパク質を２Ｍ 尿素−ＰＢＳに対して透析し、−８０℃で保存した。
【０１３６】
組換えタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、それらの分子量をＰｒｏｔＰａｒａｍオンライン（http://au.expasy.org/tools/protparam.html）を用いて決定した。全ての試料のタンパク質濃度をスタンダードとしてＢＳＡを使用してBio-Rad製のタンパク質アッセイにより決定した。
免疫付与及びマウス歯周炎モデル
マウス歯周炎実験をこれまでに記載された（３）ように行い、メルボルン大学の動物実験に関する倫理委員会（University of Melbourne Ethics Committee for Animal Experimentation）の認可を受けた。マイクロアイソレーター（microisolators）に収容した６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１２匹のマウス）を組換えタンパク質又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体、ポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０のホルマリンで死滅させた２×１０９個の細胞又はＰＢＳのうちのいずれか１つを５０μｇ用いて皮下で（皮下で１００μＬ）免疫付与し、それぞれの抗原を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化した。３０日後に、マウスを抗原（皮下注射、ＩＦＡ中で乳化した）を用いて追加免疫した（boosted）後、１２日後に球後神経叢（retrobulbar plexus）から採血した。２回目の免疫付与の４日後、マウスに１ｍｇ／ｍｌのカナマイシン（Sigma-Aldrich, New South Wales, Australia）の脱イオン水溶液を自由に７日間与えた。抗生物質による治療の３日後（採血の２日後）、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Sigma-Aldrich, New South Wales, Australia）を含有するＰＧ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び５ｍＭ システイン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で１×１０１０個の生存ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（２５μｌ）を用いて２日に分けて４回マウスに経口接種し、対照群を２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＣＭＣだけを含有するＰＧ緩衝液を用いて偽感染させた。接種材料を嫌気性チャンバで調製した後、すぐに上顎臼歯の歯肉縁に適用した。２週間後、マウスに２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＣＭＣを含有するＰＧ緩衝液中で１×１０１０個の細胞の生存ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（２５μｌ）をさらに４用量（２日に分けて）摂取させた。それぞれの接種材料における生存細菌の数を血液寒天上で数える（enumeration）ことにより検証した。マウスに軟らかい粉末状の食餌（Barastock, Australia）を与え、寝床（bedding）へと近づくのを防ぐために高くした金網底を備えたケージに収容した。最後の投薬の４週間後、マウスの球後神経叢から採血し、屠殺して、上顎を取り外し半分に切断して、半分（右側）を歯槽骨喪失の測定に使用し、残りの半分（左側）をリアルタイムＰＣＲに使用した。
【０１３７】
上顎の右半分を脱イオン水で煮沸し（１分）、機械的に肉を剥がし（defleshed）、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）水酸化カリウム中に浸漬した（１６時間、２５℃）。それから上顎の半分を洗浄し（脱イオン水で２回）、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）過酸化水素中に浸漬した（６時間、２５℃）。上顎の半分を洗浄した（脱イオン水で２回）後、それらを０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチレンブルー水溶液で染色し、上顎の半分それぞれの頬側のデジタル画像をＯＬＹＳＩＡ ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバーション３．２（Olympus Australia Pty Ltd., New South Wales, Australia）を使用して解剖顕微鏡に取り付けられたOlympus製のＤＰ１２デジタルカメラを用いて撮影し、水平な骨喪失を評価した。水平な骨喪失は歯槽骨頂（ＡＢＣ）に垂直な水平板で起こる喪失であり、これにより骨頂高の低減が起こる。上顎の半分をそれぞれ、それぞれの歯画像の臼歯の頬側及び舌側の歯尖が重なるように配列させ、それぞれの画像で測定結果を標準化できるようにフレーム単位でマイクロメートル尺度で画像を撮影した。それぞれの臼歯に関してセメントーエナメル境からＡＢＣまでの面積を、ＯＬＹＳＩＡ ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバージョン３．２画像化ソフトウェアを用いて測定した。骨喪失の測定結果を、ランダム化盲検（randomized and blinded）プロトコルを用いて、１人の検査官により２回求めた。
ＥＬＩＳＡによるサブクラス抗体の決定
マウス血清のサブクラス抗体応答を決定するために、酵素結合免疫測定吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する、５μｇ／ｍｌのホルマリン溶液で死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）（ｐＨ７．０）（ＰＢＳＴ）を用いて三連で行い、平底ポリビニルマイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories, McLean, VA）のウェルをコーティングした。コーティング溶液を除去した後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴをウェルに加え、室温で１時間コーティングしていないプラスチックをブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ＳＫ−ＰＢＳＴ）でのマウス血清の段階希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１６時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Sigma, New South Wales, Australia）に対する２０００倍希釈のヤギＩｇＧをＳＫ−ＰＢＳＴに添加し、室温で２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＳＫ−ＰＢＳＴ中での５０００倍希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma, New South Wales, Australia）をそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合抗体を１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭのクエン酸（ｐＨ４．０）中での０．９ｍＭの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸］をそれぞれのウェルに加えることにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad製のマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法及びウェスタンブロッティング
組換えタンパク質（１０μｇ）を、ＸＣｅｌｌ ｓｕｒｅｌｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ電気泳動システムを用いて分析した。組換えタンパク質を２０μｌの還元試料緩衝液（１０％［ｗｔ／ｖｏｌ］ＳＤＳ、０．０５％［ｗｔ／ｖｏｌ］ブロモフェノールブルー、２５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］グリセロール及び０．０５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］２−メルカプトエタノール）中に混合した。ｐＨを１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いて８．０に調整した後、溶液を１００℃で５分間加熱した。組換えタンパク質（１０μｇ／レーン）をＮｏｖｅｘ １２％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｓ−グリシンプレキャストミニゲル上に充填し、Ｎｏｖｅｘ電気泳動システム（Novex, San Diego, CA）を使用して３０ｍＡ〜５０ｍＡの電流、及び１２５Ｖの電位差を用いて電気泳動を行った。０．２５％（ｗ／ｖ）クマシーブルーＲ２５０を使用してタンパク質を可視化した。
Ｋｇｐプロテイナーゼ活性部位ペプチド（ＫＡＳ−２）配列のエピトープ分析
Ｌｙｓ特異的プロテイナーゼ活性部位ペプチドＫＡＳ２に関する抗体結合部位（４３３〜４６８、配列番号２８）を、Ｆｍｏｃケミストリに関する標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて複数ピン（multipin）ペプチド合成システム（Chiron Technologies, Melbourne, Australia）でＮ末端にビオチン化した重複８残基ペプチド（１残基でオフセット、７残基で重複）を合成することにより決定した。０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のビオチン化ペプチド（５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（strepavidin）コーティングプレートに４℃で一晩結合させた（Nunc, NSW Australia）。ＰＢＳＴエピトープでウェルを４回洗浄した後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０００倍希釈の１％（ｗ／ｖ）無脂脱脂粉乳（ＳＫ−ＰＢＳＴ）でマウス血清を使用して、Chiron Technologiesの取扱説明書通りにＥＬＩＳＡによりプレートに結合したペプチドのマッピングを行った。ＰＢＳＴでウェルを６回洗浄した後、マウスＩｇＧに対するヤギＩｇＧ（Sigma, New South Wales, Australia）の２０００倍希釈液をＳＫ−ＰＢＳＴ中に添加し、室温で２時間結合させた。ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄し、ＳＫ−ＰＢＳＴ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma, New South Wales, Australia）の５０００倍希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを６回洗浄した後、結合抗体を１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭ クエン酸（ｐＨ４．０）中での０．９ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸］をそれぞれのウェルに加えることにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad製のマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
【０１３８】
統計分析
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットＴ３検定（ウィンドウズ（登録商標）用ＳＰＳＳ、バージョン１２）を用いて骨喪失データを統計的に分析した。ＳＰＳＳソフトウェア（ウィンドウズ（登録商標）用ＳＰＳＳ、バージョン１２）を使用するスチューデントｔ検定を用いてＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブクラス抗体力価を統計的に分析した。
【０１３９】
実施例２
組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）の特性化及び精製
Ｋｇｐ付着因子Ａ１ドメイン断片及びキメラＫｇｐプロテイナーゼ及びＫｇｐ付着因子Ａ１ドメイン断片のポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御する能力を特性化するために、本発明者らは組換えタンパク質：−ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１を発現及び精製した。ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィを用いて、組換えタンパク質（ＫｓＡ１及びＫＬＡ１）及び組換えキメラタンパク質（ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）を封入体から精製し、精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１）。それぞれの精製組換えタンパク質はＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＫＬＡ１、ＫｓＡ１及びＫＡＳ１−ＫｓＡ１に対応する分子量が４０ｋＤａ、３６ｋＤａ、３１ｋＤａ及び３２ｋＤａである１つの主要タンパク質バンドからなっており、これらの分子量はＰｒｏｔＰａｒａｍを用いて算出されたＨｉｓ−タグ組換えタンパク質の分子量に対応していた。組換えタンパク質の免疫原性を特性化するために、ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１を使用しマウスを免疫付与して、これらの血清を使用し、ＫＡＳ２ペプチドコーティングプレート及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞コーティングプレートをプロービングした（図２）。組換えキメラタンパク質ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１抗血清は、ＫＡＳ２特異的抗血清（ＫＡＳ２−ジフテリアトキソイドコンジュゲート）と同様のレベルでＫＡＳ２ペプチド（図２Ａ）及びホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞（図２Ｂ）を認識することが分かった。しかしながら、組換えタンパク質ＫＬＡ１に対する抗血清はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞を認識するだけであった（図２Ｂ）。
【０１４０】
実施例３
マウス歯周炎モデルにおけるポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨喪失に対する組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）による免疫付与の影響
組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体を使用して、Baker et al（４）による報告に基づき歯周骨喪失の修正マウスモデルを用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨喪失に対して誘導される防御を決定及び比較した。組換えタンパク質ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１又はＫＡＳ２−ＫＬＡ１、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体、又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（ＦＫ−Ｗ５０）細胞、又はＰＢＳアジュバント単独のいずれかでマウスを免疫付与した後（０日及び３０日）、生存ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０で経口でチャレンジした。ＢＡＬＢ／ｃマウスがＰＢＳ免疫付与群と比較して有意に（ｐ＜０．００１）低い骨喪失を示したので、全ての組換え抗原、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体及びＦＫ−Ｗ５０細胞による免疫付与がポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の歯槽骨喪失に対してこれらの動物を防御した（図３）。しかしながら、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１免疫付与マウスは、ＫＬＡ１（ｐ＜０．０１）；ＫｓＡ１（ｐ＜０．００１）、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体（ｐ＜０．００１）、ＦＫ−Ｗ５０細胞（ｐ＜０．００１）で免疫付与したマウス、及び非チャレンジマウス（ｐ＜０．００１）よりも骨喪失が有意に低かった。ＫＡＳ２−ＫＬＡ１免疫付与マウスとＫＡＳ１−ＫｓＡ１免疫付与マウスとの間の骨喪失に有意差はなかった。さらに、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１免疫付与マウスは非チャレンジマウス（ｐ＜０．０１）及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体免疫付与マウス（ｐ＜０．０５）よりも有意に低い骨喪失を示したが、ＫｓＡ１、ＫＬＡ１及びＦＫ−Ｗ５０免疫付与マウスとは有意に異なってはいなかった。ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体及びＦＫ−Ｗ５０免疫付与マウス間の骨喪失に有意差はなかった。
【０１４１】
実施例４
マウス歯周炎モデルにおける組換えタンパク質（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１及びＫＡＳ２−ＫＬＡ１）による免疫付与により誘導された抗体サブクラス応答
生存ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞による経口接種チャレンジの前後で、マウスを採血し、血清を遠心分離で回収した。図４はマウス歯周炎モデルにおけるそれぞれの免疫原（ＫｓＡ１、ＫＬＡ１、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１又はＫＡＳ２−ＫＬＡ１又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリス株Ｗ５０（ＦＫ−Ｗ５０）細胞）に関するホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞に対する抗体サブクラス反応性を示す。全ての防御免疫原がＦＫ−Ｗ５０に対する高いＩｇＧ抗体力価を誘導した。さらに、それぞれの防御免疫原が誘導した主要抗体サブクラスはＩｇＧ１であり、免疫反応性ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３ ＦＫ−Ｗ５０特異的抗体は非常に弱く誘導された（図４）。経口接種前（図４Ａ）及び経口接種後（図４Ｂ）の両方でそれぞれ免疫原によって誘導された主要抗体サブクラスはＩｇＧ１であった。
【０１４２】
実施例５
ＫＡＳ２（４３３〜４６８）のエピトープマッピング
ＫＡＳ２（４３３〜４６８）に関するビオチン化した重複８残基ペプチド（１残基でオフセット、７残基で重複）を合成し、ストレプトアビジンコーティングプレートをコーティングするのに使用した。それから、ＫＡＳ１−ＫｓＡ１、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１及びＫＡＳ２−ジフテリアトキソイドコンジュゲートで免疫付与したマウス由来の抗血清を使用して抗体結合エピトープを同定した（図５）。バックグラウンドでの光学密度（４１５ｎｍ）の２倍の上昇は陽性抗体応答（閾値ＯＤ）と考えられた。該抗血清は配列番号２８に由来する以下のペプチド配列を認識した。すなわちＫＡＳ１−ＫｓＡ１はペプチド４３５〜４４２、４３６〜４４３、４４５〜４５２、４４６〜４５３及び４４７〜４５４を認識し（閾値ＯＤ＝０．０７、図５Ａ）、ＫＡＳ２−ＫＬＡ１はペプチド４３５〜４４２、４４７〜４５４及び４４８〜４５５を認識した（閾値ＩＤ＝０．０７、図５Ａ）。これにより、多くの最小エピトープ、すなわちペプチド４３６〜４４２（ＶＳＦＡＮＹＴ及びその変異型ＶＧＦＡＮＹＴ）、ペプチド４４７〜４５２（ＥＴＡＷＡＤ及びその変異型ＥＴＳＷＡＤ）、及びペプチド４４８〜４５３（ＴＡＷＡＤＰ及びその変異型ＴＳＷＡＤＰ）の認識が示唆されている。ペプチド４３６〜４４２のエピトープを含むペプチドには、ＧＶＳＦＡＮＹＴ、ＧＶＧＦＡＮＹＴ、ＶＳＦＡＮＹＴＡ及びＶＧＦＡＮＹＴＡが含まれる。ペプチド４４７〜４５２及び／又は４４８〜４５３のエピトープを含むペプチドにはＳＥＴＡＷＡＤ、ＳＥＴＳＷＡＤ、ＥＴＡＷＡＤＰ、ＥＴＳＷＡＤＰ、ＴＡＷＡＤＰＬ及びＴＳＷＡＤＰＬ、より具体的にはＧＳＥＴＡＷＡＤ、ＧＳＥＴＳＷＡＤ、ＳＥＴＡＷＡＤＰ、ＳＥＴＳＷＡＤＰ、ＥＴＡＷＡＤＰＬ、ＥＴＳＷＡＤＰＬ、ＴＡＷＡＤＰＬＬ及びＴＳＷＡＤＰＬＬが含まれる。
【０１４３】
実施例６
タンパク質との結合に関するＫＡＳペプチド及びＲＡＳペプチドの合成
ペプチドを手動で又はＣＥＭ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチドシンセサイザーを使用して合成した。Ｆｍｏｃケミストリに関する標準的な固相ペプチド合成プロトコルを全体を通して使用した。Ｒｉｎｋ−リンカー由来ＡＭ−ｓｕｒｅ樹脂（AAPPTEC, KY, USA）を使用してペプチドをカルボキシアミド形態として構築した。４当量のＦｍｏｃ−アミノ酸と６当量のＤＩＰＥＡとを使用してＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化によりカップリングが達成された。Ｆｍｏｃ基を１Ｍ ＨＯＢｔ／ＤＭＦ中の２０％ピペリジンにより取り除いた。
【０１４４】
ＫＡＳペプチド又はＲＡＳペプチドを保有する樹脂をＤＭＦ中で膨潤させ、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２％（ｖ／ｖ）ピペリジンを含有するＤＭＦ中の２％（ｖ／ｖ）ＤＢＵで取り除いた。それから５当量のＳＡＭＡ−ＯＰｆｐ及び５当量のＨＯＢｔを使用してＳ−アセチルメルカプト酢酸（ＳＡＭＡ）基によりＮ末端アミノ基を誘導体化した。反応をトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）試験によりモニタリングした。ＴＮＢＳＡ試験が陰性に戻ったら、樹脂を洗浄した（５×ＤＭＦ、３×ＤＣＭ及び３×ジエチルエーテル）。それから樹脂を真空下で乾燥させた。樹脂支持体からのペプチドの切断を、ペプチドのアルギニン含有量に応じて２．５時間又は４時間、ＴＦＡ：フェノール：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ：水（９２：２：２：２：２）切断カクテルを使用して行った。切断後、樹脂を濾過により取り除き、濾液を窒素の蒸気下でおよそ１ｍＬに濃縮した。ペプチド産物を冷エーテル中で析出させた後、遠心分離し、３回洗浄した。ペプチド析出物を０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含有する水５ｍＬ〜１０ｍＬに溶解し、不溶性残基を遠心分離により取り除いた。ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
【０１４５】
多くの種々の化学的部分を、タンパク質との結合に関するペプチドを誘導体化させるのに使用することができ、これらは反応基、例えばハロゲン化物（ブロモ、クロロ及びヨード）、マレイミド、スクシンイミジル、ヒドラジニル、オキシム、チオールを誘導し、その後その天然システイン残基を介して誘導体化したペプチドとＫｇｐＡ１等のタンパク質とを結合させるか、又はペプチドを相補的な反応基で誘導体化させ、それにより化学的ライゲーションを進行させ、ペプチド−タンパク質コンジュゲートを形成するのに使用される。
ＳＡＭＡ−ペプチドとＫＡ１との結合
１０ｍｇ／ｍＬの組換えＫＡ１又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体の他の付着因子ドメインを含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム、０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に、０．１ｍＬの１％（ｗ／ｖ）のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のＤＭＦ溶液を添加した。３０分後、反応していないＭＢＳを取り除き、ＭＢＳ修飾ＫＡ１を、結合緩衝液（０．１Ｍ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中で平衡化したＰＤ１０カラム（Pharmacia, NSW, Australia）を使用してゲル濾過により回収した。精製ＳＡＭＡ−ペプチド（１．３μモル）を、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）を含有する２００μＬの６Ｍ グアニジンＨＣｌ中に溶解し、８００μＬ ＭｉｌｌｉＱ水を用いて希釈し、ＭｉｌｌｉＱ水中に溶解した２Ｍ ＮＨ２ＯＨ（４０等量）２５μＬを添加することによりｉｎ ｓｉｔｕで脱保護した。回収したＭＢＳ−ＫＡ１を脱保護したＳＡＭＡ−ペプチドとすぐに反応させ、室温で１時間撹拌した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で平衡化したＰＤ１０カラムを使用してゲル濾過によりペプチド−ＫＡ１コンジュゲートを反応していないペプチドから分離し凍結乾燥した。Ｅｌｌｍａｎｓ試験を使用して反応をモニタリングした。
【０１４６】
実施例７
抗体の調製
タンパク質を用いて皮下で免疫付与することにより、組換えタンパク質に対するポリクローナル抗血清をマウスで産生させる。マウスを不完全フロイントアジュバント中の２５μｇのタンパク質を用いて０日目に、及び不完全フロイントアジュバント中の２５μｇのタンパク質を用いて３０日目に免疫付与する。免疫付与は標準的な手法を用いて行う。タンパク質に対して高い力価を有するポリクローナル抗血清が得られる。所望に応じて標準的な手法を用いて、組換えタンパク質に特異的に指向性を有するモノクローナル抗体が得られる。
【０１４７】
実施例８
抗体の生成のための免疫付与
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス又はＣＤ１（スイス非近交系マウス）（１群当たり１０匹のマウス）を、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させた抗原のいずれかを５０μｇ用いて皮下で（皮下で１００μＬ）免疫付与した。３０日後、抗原を用いて（皮下注射、ＩＦＡ中で乳化）マウスを追加免疫し、１２日後、マウスを屠殺し、心臓を採血して、血清を回収した。
ＥＬＩＳＡによるサブクラス抗体の決定
マウス血清のサブクラス抗体応答を決定するために、酵素結合免疫測定吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）（ｐＨ７．０）（ＰＢＳＴ）中のＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ又はホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０又はＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体の５μｇ／ｍｌ溶液を用いて三連で行い、平底ポリビニルマイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories, McLean, VA）のウェルをコーティングした。コーティング溶液を取り除いた後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴをウェルに加え、コーティングしていないプラスチックを室温で１時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ＳＫ−ＰＢＳＴ）でのマウス血清の段階希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１６時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Sigma, New South Wales, Australia）に対するヤギＩｇＧの２０００倍希釈液をＳＫ−ＰＢＳＴに添加し、室温で２時間結合させた。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＳＫ−ＰＢＳＴ中でのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Sigma, New South Wales, Australia）の５０００倍希釈液をそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合抗体を１００μｌのＡＢＴＳ基質［０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有する８０ｍＭのクエン酸（ｐＨ４．０）中での０．９ｍＭの２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６）スルホン酸］をそれぞれのウェルに加えることにより検出した。４１５ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad製のマイクロプレートリーダー、モデル４５０）を使用して測定した。
非近交系（ＣＤ１、スイス）マウスにおける組換えタンパク質ＫＡＳ２−ＫＬＡ１による免疫付与により誘導した抗体サブクラス応答
ＣＤ１（スイス）マウスをＫＡＳ２−ＬＡ１キメラで免疫付与し、採血して、血清を遠心分離により回収した。図６はＫＡＳ２−ＬＡ１キメラ、ホルマリンで死滅させたポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体に対する抗体サブクラス反応性を示す。ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラは、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラを認識し、ＦＫポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０細胞及びＲｇｐＡ−Ｋｇｐ複合体と強く交差反応する主要なＩｇＧ１抗体応答と共に強いＩｇＧ抗体を誘導した（図６）。さらに、ＫＡＳ２−ＬＡ１キメラは免疫反応性ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３抗原特異的抗体の弱い誘導しかもたらさなかった（図６）。
【０１４８】
実施例９
Ｋｇｐ構造モデルの開発、及び活性部位表面に接近可能な配列の同定
本発明者らの研究により、Ｋｇｐプロテイナーゼ活性部位ペプチドが高度に免疫原性であり、ポルフィロモナス・ジンジバリス誘導性の骨喪失に対する高レベルの防御を誘導することが示されている。ワクチン候補としてさらなるプロテイナーゼ活性部位ペプチドを同定するために、Ｋｇｐの触媒ドメインのモデルを、Ｓｙｂｙｌ７．３内のＯｒｃｈｅｓｔｒａｒスイートのプログラムを用いて開発した（図７）。該モデルはポルフィロモナス・ジンジバリス由来のＲｇｐＢプロテアーゼのＰＤＢ構造１ｃｒｖに基づいており、タンパク質は２３．５８％のペアワイズ（pairwise）同一性を有し、Ｚスコアは２５．０９である（高信頼度モデル）。Ｍｅｔａ−ＰＰｉｓｐタンパク質相互作用サーバーがＫｇｐに対する２つのタンパク質−タンパク質相互作用表面：基質結合表面（ＲｇｐＢ等の場合）、及びＫｇｐに特有の第２の表面を予測している。ＲｇｐＢモデルとＫｇｐモデルとの主な違いは第２の相互作用表面を構成するループと、第２の相互作用表面内にあるＫｇｐではモデリングすることができなかった１９残基ギャップ（Ｖａｌ５２６〜Ｐｈｅ５４５）とである。図７はＫｇｐのプロテイナーゼ活性部位の周りに表面に接近可能な配列を示すより肥厚なリボン構造（ribbons）を有するＫｇｐモデルを示し、表面に接近可能な配列はＡｓｐ３８８〜Ｇｌｎ３９４、Ｌｅｕ４２１〜Ａｌａ４２３、Ａｌａ４５１を有するＡｌａ４４３〜Ｇｌｕ４４７、Ａｓｎ５１０〜Ｔｒｐ５１３、及びＴｙｒ５８０を有するＩｌｅ５７０〜Ｇｌｙ５７７であることが分かった。モデル（図６）から、ＫＡＳ２（Ａ）の他に、他の３つの配列ＫＡＳ４（Ａｓｐ３８８〜Ｖａｌ３９５）（Ｂ）、ＫＡＳ５（Ａｓｎ５１０〜Ａｓｐ５１６）（Ｃ）及びＫＡＳ６（Ｉｌｅ５７０〜Ｔｙｒ５８０）（Ｄ）が優勢であり、ワクチン標的となるのに十分な長さであることが明らかである。このため、配列内にこれらのペプチドをそれぞれ有する組換えキメラタンパク質を産生し、ＫＬＡ１のＮ末端で連結し、マルチＫＡＳ−ＫＬＡ１を産生することができ、この組換えキメラタンパク質を、免疫応答を誘導し、それによりポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態に対して防御するのに使用することができる。
【０１４９】
実施例１０
触媒部位に隣接する免疫原性領域を同定するためのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼをモデリングするプロセス
Ａｒｇ−Ｘプロテイナーゼの三次元構造を、Eichinger A, Beisel HG, Jacob U, Huber R, Medrano FJ, Banbula A, Potempa J, Travis J, Bode W. Crystalstructure of gingipain R: an Arg-specific bacterial cysteine proteinasewith a caspase-like fold. EMBO J. 1999 Oct 15;18(20):5453-62の方法に従って決定した。
【０１５０】
実施例１１
以下は抗体を含有する歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
グリセロール ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウリル硫酸ナトリウム １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート（sarconisate） ０．５
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
特異的抗体を含有するヤギ血清 ０．２
水 残り（balance）
【０１５１】
実施例１２
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウリル硫酸ナトリウム １．５
ナトリウムラウロイルサルコニセート ０．５
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
特異的抗体を含有するウシ血清 ０．２
水 残り
【０１５２】
実施例１３
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
リン酸二カルシウム二水和物 ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０
ラウロイルジエタノールアミド １．０
モノラウリン酸スクロース ２．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
デキストラナーゼ ０．０１
特異的抗体を含有する牛乳Ｉｇ ０．１
水 残り
【０１５３】
実施例１４
以下は歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ソルビトール ２２．０
アイリッシュモス １．０
水酸化ナトリウム（５０％） １．０
Ｇａｎｔｒｅｚ １９．０
水（脱イオン水） ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７６
サッカリンナトリウム ０．３
ピロホスフェート ２．０
アルミナ水和物 ４８．０
香料オイル ０．９５
マウスモノクローナル抗体 ０．３
ラウリル硫酸ナトリウム ２．００
【０１５４】
実施例１５
以下は液体歯磨きペースト製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ポリアクリル酸ナトリウム ５０．０
ソルビトール １０．０
グリセロール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
エタノール ３．０
特異的抗体を含有するウマＩｇ ０．２
リノール酸 ０．０５
水 残り
【０１５５】
実施例１６
以下は洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
エタノール ２０．０
香料 １．０
サッカリンナトリウム ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．３
特異的抗体を含有するウサギＩｇ ０．２
水 残り
【０１５６】
実施例１７
以下は洗口液製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｇａｎｔｒｅｚ Ｓ−９７ ２．５
グリセリン １０．０
香料オイル ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド ０．２
マウスモノクローナル抗体 ０．３
水 残り
【０１５７】
実施例１８
以下はロゼンジ製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
糖 ７５〜８０
トウモロコシシロップ １〜２０
香料オイル １〜２
ＮａＦ ０．０１〜０．０５
マウスモノクローナル抗体 ０．３
ステアリン酸Ｍｇ １〜５
水 残り
【０１５８】
実施例１９
以下は歯肉マッサージクリーム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ホワイトワセリン ８．０
プロピレングリコール ４．０
ステアリルアルコール ８．０
ポリエチレングリコール４０００ ２５．０
ポリエチレングリコール４００ ３７．０
モノステアリン酸スクロース ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン（Chlorohexidine gluconate）０．１
マウスモノクローナル抗体 ０．３
水 残り
【０１５９】
実施例２０
以下はチューイングガム製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ガム基剤 ３０．０
炭酸カルシウム ２．０
結晶性ソルビトール ５３．０
グリセリン ０．５
香料オイル ０．１
マウスモノクローナル抗体 ０．３
水 残り
【０１６０】
実施例２１
以下は医薬製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
ヒト化特異的モノクローナル抗体 １０
滅菌リン酸緩衝生理食塩水 ９０
【０１６１】
実施例２２
以下は歯周ジェル製剤の一例である。
成分 ％（ｗ／ｗ）
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７ ２０．０
ステアリルアルコール ８．０
特異的抗体 ３．０
コロイド二酸化ケイ素（Ａｅｒｏｓｉｌ ２００） １．０
グルコン酸クロルヘキシジン ０．１
水 残り
本発明は本明細書でより詳細に説明されているが、実施例は例示目的のものにすぎないことを理解されたい。分子生物学の当業者にとって明らかである本発明の実施形態の他の変更形態、歯科診断、及び関連のディシプリンが本発明の範囲内であることが意図される。
【０１６２】
【表８】
【配列表フリーテキスト】
【０１６３】
配列番号１：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
ＸはＬもしくはＶになり得る
ＸはＡもしくはＴになり得る
ＸはＴもしくはＳになり得る
ＸはＶもしくはＬになり得る
ＸはＤもしくはＮになり得る
配列番号２：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号２７：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
配列番号２８：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
ＸはＬもしくはＶになり得る
ＸはＡもしくはＴになり得る
ＸはＴもしくはＳになり得る
ＸはＶもしくはＬになり得る
ＸはＤもしくはＮになり得る
配列番号２９：ＸはＧもしくはＳになり得る
ＸはＳもしくはＡになり得る
ＸはＳもしくはＬになり得る
ＸはＬもしくはＶになり得る
配列番号３１：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号３２：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号３３：ＸはＶもしくはＡになり得る
配列番号６４：ＸはＳもしくはＹになり得る
ＸはＹもしくはＳになり得る
ＸはＰもしくはＳになり得る
ＸはＫもしくはＱになり得る
ＸはＩもしくはＶになり得る
配列番号６６：ＸはＶもしくはＩになり得る
配列番号６８：ＸはＮもしくはＤになり得る
ＸはＳもしくはＹになり得る
ＸはＳもしくはＰになり得る
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含み、
（Ａ）前記第１のペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子(adhesin)ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１のペプチドが配列番号３又は配列番号４で示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１のペプチドが配列番号５〜配列番号８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１のペプチドが配列番号９〜配列番号１２のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１のペプチドが配列番号１３〜配列番号１８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項６】
前記第１のペプチドが配列番号１９〜配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項７】
前記第１のペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項８】
前記第１のペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項９】
前記第１のペプチドが配列番号３〜配列番号３４のうちの１つと相同的である配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１０】
前記第２のペプチドが配列番号３５で示される配列、又は配列番号３６で示される配列を含むその断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１１】
前記第２のペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１２】
（ａ）前記第１のペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記第２のペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１３】
前記第２のペプチドが配列番号３８で示される配列、又は配列番号３９で示される配列を含むその断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１４】
前記第２のペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項１３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１５】
（ａ）前記第１のペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記第２のペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１６】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ペプチドが配列番号３又は配列番号４で示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ペプチドが配列番号５〜配列番号８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６又は１７に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ペプチドが配列番号９〜配列番号１２のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ペプチドが配列番号１３〜配列番号１８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ペプチドが配列番号１９〜配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ペプチドが配列番号３〜配列番号３４のうちの１つと相同的である配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが配列番号３５で示される配列、又は配列番号３６で示される配列を含むその断片を含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２７】
（ａ）前記ペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記ポリペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが配列番号３８で示される配列、又は配列番号３９で示される配列を含むその断片を含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項２８に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３０】
（ａ）前記ペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記ポリペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３１】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドであって、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的である配列、及び
（ｉｉ）配列番号６７又は配列番号６８で示される配列と同じであるか又は相同的である配列からなる群から選択される、ペプチド。
【請求項３２】
直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含むキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該第１のペプチドが請求項３１に記載のペプチドである、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３３】
前記第２のペプチドが、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、請求項３２に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３４】
前記第２のペプチドが配列番号３５で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列、又は配列番号３６で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列を有する断片を有する、請求項３３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３５】
前記第２のペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有する、請求項３３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３６】
前記第２のペプチドが配列番号３８で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列、又は配列番号３９で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列を有する断片を有する、請求項３３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３７】
前記第２のペプチドが配列番号３９で示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有する、請求項３６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３８】
前記第２のペプチドがポリペプチドの形態で与えられる、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３９】
さらなるペプチドを少なくとも１つ含む請求項１〜３０又は請求項３２〜３８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、
（Ｃ）前記さらなるペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４０】
前記第１のペプチドのＣ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記第２のペプチドのＮ末端残基と共有結合するか、又は前記ペプチドのＣ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記ポリペプチドのＮ末端残基と共有結合する、請求項１〜３０又は請求項３２〜３９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４１】
前記第１のペプチドのＮ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記第２のペプチドのＣ末端残基と共有結合するか、又は前記ペプチドのＮ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記ポリペプチドのＣ末端残基と共有結合する、請求項１〜３０又は請求項３２〜３９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４２】
前記第１のペプチドが最大１５アミノ酸長、好ましくは５アミノ酸長未満のリンカーを介して前記第２のペプチドと連結するか又は前記ペプチドが最大１５アミノ酸長、好ましくは５アミノ酸長未満のリンカーを介して前記ポリペプチドと連結する、請求項１〜３０又は請求項３２〜４１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４３】
請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質を含む組成物。
【請求項４４】
アジュバントをさらに含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、請求項１〜３０若しくは請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は請求項４３若しくは４４に記載の組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における請求項１〜３０若しくは請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は請求項４３若しくは４４に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質に対して産生される抗体。
【請求項４８】
モノクローナル抗体である、請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態の重症度を抑える又は低減する方法であって、請求項４７又は４８に記載の抗体を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する薬剤の製造における請求項４７又は４８に記載の抗体の使用。
【請求項５１】
請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードする配列を含む核酸分子。
【請求項５２】
前記配列が少なくとも１つの調節要素と操作可能に結び付いている、請求項５１に記載の核酸分子。
【請求項５３】
請求項５１又は５２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５４】
ウイルス又は細菌のワクチンベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項５１若しくは５２に記載の核酸分子又は請求項５３若しくは５４に記載のベクターを含む原核細胞又は真核細胞。
【請求項５６】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、請求項５１若しくは５２に記載の核酸分子、請求項５３若しくは５４に記載のベクター、又は請求項５５に記載の原核細胞若しくは真核細胞を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５７】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態の重症度を抑える又は低減する薬剤の製造における請求項５１若しくは５２に記載の核酸分子、請求項５３若しくは５４に記載のベクター、又は請求項５５に記載の原核細胞若しくは真核細胞の使用。
【請求項５８】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用を含む、方法。
【請求項５９】
被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用。
【請求項６０】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための請求項４７又は４８に記載の抗体の使用を含む、方法。
【請求項６１】
被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための請求項４７又は４８に記載の抗体の使用。
【請求項６２】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチド。
【請求項６３】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つと相同的である配列を有する、請求項６２に記載のペプチド。
【請求項６４】
５〜４０のアミノ酸長を有する、請求項６２又は６３に記載のペプチド。
【請求項６５】
請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項６６】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質の製造のための請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項６５に記載の核酸の使用。
【請求項６７】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するための請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項６８】
前記ペプチドを
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む第２のペプチドと同時に又は連続して投与する、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記第２のペプチドが配列番号６９〜配列番号７９のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号８３〜配列番号８５のうちの１つ若しくは複数で示される配列を含むか又はそれらからなる、請求項１又は３２に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項７０】
前記第１のペプチドが配列番号３〜配列番号２６のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号６４〜配列番号６８のうちの１つ若しくは複数で示される配列を含むか又はそれらからなる、請求項６９に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含み、
（Ａ）前記第１のペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記第２のペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子(adhesin)ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１のペプチドが配列番号３又は配列番号４で示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１のペプチドが配列番号５〜配列番号８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１のペプチドが配列番号９〜配列番号１２のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１のペプチドが配列番号１３〜配列番号１８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項６】
前記第１のペプチドが配列番号１９〜配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項７】
前記第１のペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項８】
前記第１のペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項９】
前記第１のペプチドが配列番号３〜配列番号３４のうちの１つと相同的である配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１０】
前記第２のペプチドが配列番号３５で示される配列、又は配列番号３６で示される配列を含むその断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１１】
前記第２のペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１２】
（ａ）前記第１のペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記第２のペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１３】
前記第２のペプチドが配列番号３８で示される配列、又は配列番号３９で示される配列を含むその断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１４】
前記第２のペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項１３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１５】
（ａ）前記第１のペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記第２のペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１６】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該タンパク質が直接又はリンカーを介してポリペプチドと連結するペプチドを含み、
（Ａ）前記ペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含み、
（Ｂ）前記ポリペプチドが
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ペプチドが配列番号３又は配列番号４で示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ペプチドが配列番号５〜配列番号８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６又は１７に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ペプチドが配列番号９〜配列番号１２のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ペプチドが配列番号１３〜配列番号１８のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ペプチドが配列番号１９〜配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ペプチドが配列番号３〜配列番号３４のうちの１つと相同的である配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが配列番号３５で示される配列、又は配列番号３６で示される配列を含むその断片を含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２７】
（ａ）前記ペプチドが配列番号２７〜配列番号３０のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記ポリペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが配列番号３８で示される配列、又は配列番号３９で示される配列を含むその断片を含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項２８に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３０】
（ａ）前記ペプチドが配列番号３１〜配列番号３４のうちの１つで示される配列を含み、
（ｂ）前記ポリペプチドが配列番号３９で示される配列を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３１】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチドであって、
（ｉ）配列番号６４〜配列番号６６のうちの１つで示される配列と同じであるか又は相同的である配列、及び
（ｉｉ）配列番号６７又は配列番号６８で示される配列と同じであるか又は相同的である配列からなる群から選択される、ペプチド。
【請求項３２】
直接又はリンカーを介して第２のペプチドと連結する第１のペプチドを含むキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、該第１のペプチドが請求項３１に記載のペプチドである、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３３】
前記第２のペプチドが、
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、請求項３２に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３４】
前記第２のペプチドが配列番号３５で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列、又は配列番号３６で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列を有する断片を有する、請求項３３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３５】
前記第２のペプチドが配列番号３６又は配列番号３７で示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有する、請求項３３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３６】
前記第２のペプチドが配列番号３８で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列、又は配列番号３９で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列を有する断片を有する、請求項３３に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３７】
前記第２のペプチドが配列番号３９で示される配列と同じであるか又は相同的である配列を有する、請求項３６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３８】
前記第２のペプチドがポリペプチドの形態で与えられる、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項３９】
さらなるペプチドを少なくとも１つ含む請求項１〜３０又は請求項３２〜３８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、
（Ｃ）前記さらなるペプチドが
（ｉ）配列番号１で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）配列番号２で示される配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｖ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４０】
前記第１のペプチドのＣ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記第２のペプチドのＮ末端残基と共有結合するか、又は前記ペプチドのＣ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記ポリペプチドのＮ末端残基と共有結合する、請求項１〜３０又は請求項３２〜３９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４１】
前記第１のペプチドのＮ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記第２のペプチドのＣ末端残基と共有結合するか、又は前記ペプチドのＮ末端残基が直接若しくはリンカーを介して前記ポリペプチドのＣ末端残基と共有結合する、請求項１〜３０又は請求項３２〜３９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４２】
前記第１のペプチドが最大１５アミノ酸長、好ましくは５アミノ酸長未満のリンカーを介して前記第２のペプチドと連結するか又は前記ペプチドが最大１５アミノ酸長、好ましくは５アミノ酸長未満のリンカーを介して前記ポリペプチドと連結する、請求項１〜３０又は請求項３２〜４１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項４３】
請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質を含む組成物。
【請求項４４】
アジュバントをさらに含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、請求項１〜３０若しくは請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は請求項４３若しくは４４に記載の組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する際の、又は被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態若しくは疾患の罹患率若しくは重症度を抑える若しくは低減する薬剤の製造における請求項１〜３０若しくは請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は請求項４３若しくは４４に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質に対して産生される抗体。
【請求項４８】
モノクローナル抗体である、請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態の重症度を抑える又は低減する方法であって、請求項４７又は４８に記載の抗体を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する薬剤の製造における請求項４７又は４８に記載の抗体の使用。
【請求項５１】
請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質をコードする配列を含む核酸分子。
【請求項５２】
前記配列が少なくとも１つの調節要素と操作可能に結び付いている、請求項５１に記載の核酸分子。
【請求項５３】
請求項５１又は５２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５４】
ウイルス又は細菌のワクチンベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項５１若しくは５２に記載の核酸分子又は請求項５３若しくは５４に記載のベクターを含む原核細胞又は真核細胞。
【請求項５６】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患の罹患率又は重症度を抑える又は低減する方法であって、請求項５１若しくは５２に記載の核酸分子、請求項５３若しくは５４に記載のベクター、又は請求項５５に記載の原核細胞若しくは真核細胞を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５７】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の疾患又は状態の重症度を抑える又は低減する薬剤の製造における請求項５１若しくは５２に記載の核酸分子、請求項５３若しくは５４に記載のベクター、又は請求項５５に記載の原核細胞若しくは真核細胞の使用。
【請求項５８】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用を含む、方法。
【請求項５９】
被験体由来の生体試料において抗ポルフィロモナス・ジンジバリス抗体を検出するための請求項１〜３０又は請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用。
【請求項６０】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリス関連の状態又は疾患を診断又はモニタリングする方法であって、前記被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための請求項４７又は４８に記載の抗体の使用を含む、方法。
【請求項６１】
被験体由来の生体試料においてポルフィロモナス・ジンジバリスの存在を検出するための請求項４７又は４８に記載の抗体の使用。
【請求項６２】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つで示される配列を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するペプチド。
【請求項６３】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号２６のうちの１つと相同的である配列を有する、請求項６２に記載のペプチド。
【請求項６４】
５〜４０のアミノ酸長を有する、請求項６２又は６３に記載のペプチド。
【請求項６５】
請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項６６】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するキメラタンパク質又は融合タンパク質の製造のための請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項６５に記載の核酸の使用。
【請求項６７】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を誘導するための請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項６８】
前記ペプチドを
（ｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＬｙｓ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＡｒｇ−Ｘ−プロテイナーゼの付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全て、又は
（ｉｉｉ）ポルフィロモナス・ジンジバリスのＨａｇＡ付着因子ドメインの配列と同じであるか若しくは相同的である配列の一部若しくは全てを含む第２のペプチドと同時に又は連続して投与する、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記第２のペプチドが配列番号６９〜配列番号７９のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号８３〜配列番号８５のうちの１つ若しくは複数で示される配列を含むか又はそれらからなる、請求項１又は３２に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【請求項７０】
前記第１のペプチドが配列番号３〜配列番号２６のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号６４〜配列番号６８のうちの１つ若しくは複数で示される配列を含むか又はそれらからなる、請求項６９に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５００６３３（Ｐ２０１２−５００６３３Ａ）
【公表日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２４１３５（Ｐ２０１１−５２４１３５）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１１１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２２４６３
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５１０００７６１０）オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１１１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２２４６３
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５１０００７６１０）オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]