【課題】 メラノーマ抗原の特徴を調べることにより、癌、特にメラノーマの免疫療法の新規戦略の開発に貢献することを目的とする。
【解決手段】 本発明は、Ｔリンパ球により認識されるＭＡＲＴ−１と命名されたメラノーマ抗原をコードする核酸配列を提供し、該ＭＡＲＴ−１に由来する免疫原性ペプチド及びｇｐ１００と命名された第二メラノーマ抗原を提供する。これにより、提供されたタンパク質及びペプチドは、メラノーマの予防又は治療のための免疫原として使用できる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願０８／２３１，５６５（１９９４年４月２２日出願）の一部継続出願であり、ここにその全体を参照として取り入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒトの癌の予防および治療の分野内にある。より具体的には、本発明は、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原をコードする遺伝子、およびそれらに関連するタンパク質、ならびにこれらの遺伝子またはタンパク質を用いての予防、診断および治療への適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
メラノーマは、メラニン細胞またはメラニン細胞関連母斑細胞のいずれかから誘導される、攻撃的な、時として転移性の腫瘍である（“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．、Ｌｅｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．、Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．編；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：３４０−３４１）。メラノーマは全皮膚癌のおおよそ３％近くに達し、メラノーマの世界的増加は、女性の肺ガンを除く他のいかなる新生物も及ばない（“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．、Ｌｅｃｈｔｉｍａｎ，Ａ．Ｈ．、Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：３４０−３４１；ＫｉｒｋｗｏｏｄおよびＡｇａｒｗａｌａ、１９９３、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７：１−１６）。メラノーマは、明らかに皮膚に局在している場合でさえ、最大で３０％の患者は、将来、全身に転移し、その大部分は死に至るであろう（ＫｉｒｋｗｏｏｄおよびＡｇａｒｗａｌａ、１９９３、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７；１−１６）。メラノーマ治療の古典的様式には、外科手術、放射線および化学療法が含まれる。過去十年間では、免疫療法および遺伝子治療が、メラノーマ治療の新しい可能性のある方法として現れてきた。
【０００４】
Ｔ細胞は、最多数のネズミ腫瘍モデルで腫瘍の退縮に重要な役割を演じている。単一の癌抗原を認識する腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＴＩＬ）は、多くのネズミ腫瘍から分離することができる。これらＴＩＬ＋インターロイキン２の適切な運搬は、確立された肺および肝臓への転移の退縮を仲介することが出来る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１３１８−１３２１）。さらに、ＴＩＬを注射することによるＩＦＮ−γの分泌は、腫瘍抗原によるＴ細胞の活性化を示唆し、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのネズミ腫瘍の退縮と明らかな相関を示す。（Ｂａｒｔｈ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：６４７−６５８）。腫瘍ＴＩＬを、転移性メラノーマ患者内に養子移入した場合、メラノーマ患者の３５から４０％の転移癌の退縮を仲介することが知られており、このＴＩＬの能力は、抗原を認識することの臨床上の重要性を証明している（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９８８、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３１９：１６７６−１６８０；ＲＯｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０：１８０−１９９）。
【０００５】
ＣＢ８^＋Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターは、抗原性ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２の場合９−１０アミノ酸）、β−２ミクログロブリンおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ型重鎖（ヒトではＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）からなる複合体を認識する。内在的に合成されたタンパク質の消化によって生成したペプチドは、小胞体に輸送され、ＭＨＣ−Ｉ型重鎖およびβ２ミクロブロブリンと結合し、最終的に、細胞表面のＭＨＣ−Ｉ型の分子の溝に発現する。それ故、Ｔ細胞は、細胞表面上に発現した完全な分子を検出する抗体とは対照的に、細胞の内側のタンパク質を起源とする分子を検出することが出来る。それ故、Ｔ細胞によって認識される抗原は、抗体によって認識される抗原より、より有用であろう。
【０００６】
癌に対する免疫応答がヒトに存在することの強力な証拠は、メラノーマ沈積物中にリンパ球が存在することによって提供される。これらのリンパ球は、分離すると、ＭＨＣ制限的に、自己のおよび同種移植のメラノーマに特異的な腫瘍抗原を認識する能力を持つ（Ｉｔｏｈ，Ｋ．ら、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：３０１１−３０１７；Ｍｕｕｌ，Ｌ．Ｍ．ら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：９８９−９９５；Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３７１４−３７２５；Ｄａｒｒｏｗ，Ｔ．Ｌ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３３２９−３３３５；Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１０：１５３−１６４；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：６３８−６４３；Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１３：１８−３０；Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｂ．Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：１４１０−１４１８）。転移メラノーマ患者からのＴＩＬは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でメラノサイト−メラノーマ系に特異的な組織抗原を含む共有抗原を認識する（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１４：８８−９３；Ａｎｉｃｈｉｎｉ，Ａ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：９８９−９８８）。抗メラノーマＴ細胞は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）では、おそらく腫瘍部位でのクローン拡張および蓄積の結果として、ＴＩＬ中に多く存在すると思われる（Ｓｅｎｓｉ，Ｍ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：１２３１−１２４６）。多くのメラノーマ患者がこれらの腫瘍に対して細胞性応答および体液性応答を装備しているという事実、ならびにメラノーマがＭＨＣ抗原および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方を発現しているという事実は、メラノーマ患者を免疫治療するためには、さらなるメラノーマ抗原の同定および特徴付けが重要であることを示唆している。
【０００７】
末梢血液リンパ球は、メラノーマ腫瘍抗原と思われる抗原の同定に用いられた。Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７は、生体内で変異誘発腫瘍細胞を用いて繰り返し免疫化した患者の末梢血液で確認されたＴ細胞クローンを用いて、ＭＡＧＥ−１と呼ばれるメラノーマ抗原をコードする遺伝子の特徴を調べた。メラノーマ患者の末梢血液リンパ球から誘導された細胞毒性Ｔ細胞は、抗原ペプチドをコードするＭＡＧＥ−１の同定に用いられた（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ，Ｃ．ら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１４５３−１４５７）。また、Ｂｒｉｃｈａｒｄら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９−４９５は、生体外で、腫瘍で繰り返し刺激することによって感受性になった患者の末梢血液リンパ球を用いて、チロシナーゼと呼ばれるメラノーマ抗原をコードする遺伝子の特徴を調べた。さらに、メラノーマ抗原の治療への可能性の確認は、Ｂｒｏｗｎら（米国特許第５，２６２，１７７号）によって提供されている。Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，２６２，１７７号は、組換え体ワクシニアウイルスを基礎としたメラノーマワクチンに関し、この中で、メラノーマ抗原ｐ９７はネズミモデルで腫瘍細胞の挑戦を予防する効果を示すと報告している。さらなるメラノーマ抗原の特徴を調べることは、癌、特にメラノーマ、の免疫療法の新規戦略の開発のために重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
本発明は、一般的には、Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原をコードする核酸配列（ＭＡＲＴ−１）、ならびにこれらの配列によってコードされるタンパク質およびペプチドに関する。さらに、本発明は、これらの核酸配列、タンパク質およびペプチドのバイオアッセイを提供する。また、本発明は、ＭＡＲＴ−１アミノ酸配列より誘導され、それらの免疫原性を増強するように修飾したペプチドを提供する。また、本発明は、ここに記載された核酸配列、タンパク質、ペプチドまたは修飾ペプチドの治療への使用を、提供する。
【０００９】
本発明の一般的な目的は、ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原をコードする、実質的に精製され分離された核酸配列を提供することにある。
本発明のその他の目的は、ベクターおよびＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列の全体または部分からなる組換え分子を提供することにある。
【００１０】
本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列の全体または部分によってコードされる組換えタンパク質を作り出すことにある。
本発明のさらなる目的は、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドまたはその部分と反応するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供することにある。
【００１１】
本発明の目的は、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１遺伝子またはＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡを検出する方法を提供することにある。
本発明のその他の目的は、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドを検出する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の目的は、ヒトの病気、特にメラノーマおよび転移性メラノーマ、の診断法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、ＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列の全部または部分およびその関連タンパク質またはＭＡＲＴ−１アミノ酸配列より誘導したペプチドからなる、予防的または治療的使用方法を提供することにある。
【００１３】
また、本発明の目的は、ＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列全体あるいは部分またはその関連タンパク質からなる、メラノーマを予防または治療するための、メラノーマワクチンを提供することからなる。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、ワクチンに用いるための、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列より誘導した免疫原性ペプチドを提供することにある。
本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列から誘導したペプチドの免疫原性を増加させる、またはそれらペプチドのＭＨＣ分子との結合を強化することによって抗メラノーマ免疫応答の誘発を強化するように修飾した、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列誘導ペプチドを、ここに記載したような予防的または治療的方法に用いるために、提供することにある。
【００１５】
さらに、本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体あるいは部分またはその関連タンパク質あるいはペプチド、および哺乳類動物内でメラノーマ抗原に対する抗体の生成を促進する能力を持つ少なくとも一つの免疫原性分子を提供することにある。
【００１６】
本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体あるいは部分またはその関連タンパク質を遺伝子治療の処方箋に従って用いて、メラノーマを予防または治療する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、ワクチンに用いるための、ｇｐ１００メラノーマ抗原タンパク質配列から誘導した免疫原性ペプチドを、提供することにある。
本発明のさらなるその他の目的は、ｇｐ１００メラノーマ抗原配列から誘導されたペプチドの免疫原性を増加させる、またはＭＨＣ分子との結合を強化することによって抗メラノーマ免疫応答の誘発を強化するように修飾したｇｐ１００メラノーマ抗原誘導ペプチドを、ここに記載したような予防的治療的方法に用いるために、提供することにある。
【００１８】
本発明のさらなるその他の目的は、ここに記載したワクチンを用いた、メラノーマの予防的治療的免疫化法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、免疫治療のための潜在的標的を構成するであろうメラノーマ抗原を同定する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明のさらなるその他の目的は、免疫療法に用いるための、ＭＡＲＴ−１配列またはｇｐ１００配列のいずれかより誘導した免疫原性ペプチド候補を同定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明をより完全に理解するために、以下の定義をここに記載する。核酸配列は、これに限定されるわけではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。ここで用いられる核酸配列は、分離精製した核酸配列をさす。ＭＡＲＴ−１メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ＭＡＲＴ−１遺伝子の生成物である一つあるいはそれより多くのＲＮＡ転写物をさす。ここで用いられている実質的に相同とは、図１に示すＭＡＲＴ−１核酸配列（配列番号：１）と任意のその他の核酸配列のそれとの間の実質的な一致をさす。実質的に相同とは、ＭＡＲＴ−１配列とその他の任意の核酸配列のそれとの間で、約５０−１００％の相同の相同性、望ましくは約７０−１００％の相同性、もっとも望ましくは約９０−１００％の相同性を意味する。さらに、ここで用いられる実質的に相同とは、図１に示すＭＡＲＴ−１抗原のアミノ酸配列（配列番号：２）と任意のその他のアミノ酸配列のそれとの間の実質的な一致をもさす。
【００２１】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む、異なる種に記載される組織適合性抗原のシステムを包括して意味する一般的な名称である。
メラノーマという言葉は、限定するわけではないが、黒色腫（メラノーマ）、転移性黒色腫、メラニン細胞（メラノサイト）またはメラニン細胞関連母斑細胞のいずれかから誘導された黒色腫、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、本来の位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）の黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性ほくろ黒色腫、末端性ほくろ性黒色腫、侵襲性黒色腫、または家族性非定型色素母斑−黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ）症候群を含む。哺乳動物のそのような黒色腫は、染色体異常、退行性成長発達障害、分裂促進剤、紫外線照射（ＵＶ）、ウイルス感染、遺伝子の不適切組織での発現、遺伝子発現の変化、または発癌剤に原因を有する場合もある。前述の黒色腫は、本出願に記載した方法に従って、診断、評価または治療することが出来る。
【００２２】
非定型色素母斑とは、異常かつ前癌状態の特徴を持つ色素母斑を意味する。
黒色腫抗原または免疫原とは、哺乳動物中の細胞性あるいは体液性免疫応答の原因となりうる、ＭＡＲＴ−１タンパク質のすべてあるいはその部分またはＭＡＲＴ−１タンパク質配列を基礎としたペプチド、を意味する。そのような抗原はまた、ＭＡＲＴ−１タンパク質（配列番号：２）のすべて、一部または複数の部分を用いて免疫化された動物の抗体と反応するであろう。そのようなタンパク質またはペプチドは、本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列のすべてまたは部分によってコードされるであろう。
【００２３】
免疫原性ペプチドとは、哺乳動物中で細胞性あるいは体液性免疫応答の原因となりうる、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列から誘導されたペプチドまたはｇｐ１００タンパク質配列、を意味する。そのようなペプチドは、ペプチドで免疫化された動物の抗体と反応するであろう。そのようなペプチドは、アミノ酸の長さが、約５−２０、望ましくは約８−１５、最も望ましくは約９−１０、である。
【００２４】
当業者は、本発明のバイオアッセイが任意の脊椎動物種の生体サンプルまたは組織の分析に用いうることを理解するであろう。望ましい実施態様では、哺乳類の生体サンプルまたは組織が分析される。
【００２５】
組織は、単細胞、器官全体およびその部分を含むが、これらに限定されるわけではない。生体サンプルは、組織、哺乳動物組織の初代培養、生体組織検査（生検）検体、病理検体、および検死検体を含むが、これらに限定されるわけではない。哺乳動物は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ネズミ、ラット、ブタ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびヤギを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
本発明は、Ｔ細胞によって認識される、新規のメラノーマ抗原をコードする核酸配列を提供する。この新規のメラノーマ抗原は、ＭＡＲＴ−１（ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ−ｃｅｌｌｓ−１）と呼ぶ。ＭＡＲＴ−１は、いかなる既知のメラノーマ抗原とも意味のある相同性を示さず、それ故新しいメラノーマ抗原であると言える。ＭＡＲＴ−１抗原は、アミノ酸２７−４７（配列番号：２）とそれに続く３つのアルギニン残基からなる高疎水性領域を含み、この配列はトランスメンブレンタンパク質を示唆している。タンパク質全体とは明らかな相同性は存在しなかったが、以前にネズミのナチュラルキラー細胞表面タンパク質ＮＫＲ−Ｐ１（Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｗ．Ｍ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３２２９−３２３６）として認知された、ＩＩ型膜タンパク質と３７％の同一性を示す、２７のアミノ酸からなるセグメント（アミノ酸５７−８３；配列番号：２）が存在する。ＭＡＲＴ−１は、多くのＩ型膜タンパク質の特徴であるリーダータンパク質を含まない（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｊ．、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：２４７−２９６）。
【００２７】
ＭＡＲＴ−１ＲＮＡの発現は、新しい培養したメラノーマおよびメラノサイト細胞系およびヒト網膜に限定されるようであり、この発現は、試験したその他のいかなる新しいまたは培養した組織またはその他の腫瘍組織にも見出されなかった。ＭＡＲＴ−１のｃＤＮＡ配列は、図１（配列番号：１）に示す。また、予想されるＭＡＲＴ−１タンパク質のアミノ酸配列を、図１（配列番号：１）に示す。
【００２８】
図１（配列番号：１）に示すＭＡＲＴ−１の核酸配列は、本発明の望ましい実施態様を表している。しかしながら、遺伝子コードの縮重によって、図１（配列番号：１）に示すｃＤＮＡ配列を変化させても、依然として、ＭＡＲＴ−１タンパク質抗原をコードすることの出来るＤＮＡ配列が結果として得られるであろうことは、当業者に理解される。それ故、そのようなＤＮＡ配列は、図１（配列番号：１）に示した配列と機能的に等価であり、本発明の内に包括されるであろう。さらに、当業者は、図１（配列番号：１）に示すＭＡＲＴ−１核酸配列が与えられた種の中で対立遺伝子変化を自然に起こすことを理解するであろう。これらの変化もまた、本発明によって取り込まれるであろう。
【００２９】
予想されるＭＡＲＴ−１抗原は、約１３Ｋｄの１１８アミノ酸からなるタンパク質である。本発明は、さらに、本発明のＭＡＲＴ−１抗原またはタンパク質と実質的に同一の機能を持つ、ＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドまたはその類似体を含む。そのようなタンパク質またはポリペプチドは、タンパク質のフラグメント、またはＭＡＲＴ−１タンパク質の置換、付加、あるいは欠損変異体を含むが、これらに限定されるわけではない。また、本発明は、ＭＡＲＴ−１抗原と実質的に相同であるタンパク質またはペプチドを包含する。実質的に相同とは、ＭＡＲＴ−１と任意のその他のアミノ酸配列またはタンパク質またはペプチドとの間の、約５０−１００％の相同性、望ましくは約７０−１００％の相同性、最も望ましくは約９０−１００％の相同性を意味する。
【００３０】
「類似体」という言葉は、具体的にここに示したＭＡＲＴ−１配列（図１、配列番号：１）と実質的に同一なアミノ酸残基配列を持つ任意のポリペプチドであって、その一つまたはそれより多くの残基が機能的に同様の残基と保存的に置換され、かつここに記載したようなＭＡＲＴ−１抗原の機能的態様を示している、前記のポリペプチドを含む。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（疎水性）残基の一つをそれ以外の非極性残基と置換すること、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間、のように、極性（親水性）残基の一つをもう一つと置換すること、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような塩基性残基の一つをそれ以外の塩基性残基と置換すること、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような酸性残基の一つをそれ以外の酸性残基と置換することが含まれる。
【００３１】
また「保存的置換」という句は、非誘導残基の代わりに化学的に誘導した残基を用いることを含む。「化学的誘導体」とは、官能基側鎖の反応によって化学的に誘導した一つまたはそれより多くの基を持つ従属ポリペプチドをさす。そのような誘導分子の例としては、例えば、遊離アミノ基を誘導して、アミン塩酸塩、ｐ−トルエン硫酸基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するようなそれらの分子が含まれる。遊離カルボキシル基を誘導して、塩、メチルおよびエチルエステルあるいはその他の型のエステルまたはヒドラジンを形成させても良い。遊離水酸基を誘導して、ｏ−アシルまたはｏ−アルキル誘導体を形成させても良い。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成させても良い。また、化学誘導体としては、２０の標準アミノ酸の一つあるいはそれより多くの自然発生アミノ酸誘導体を含む、タンパク質またはペプチドを含む。例えば：４−ヒドロキシプリンはプリンと置換されて良く；５−ヒドロキシリジンはリジンと置換されて良く；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されて良く；ホモセリンはセリンと置換されて良く；またオルニチンはリジンと置換されて良い。また、必要な活性が維持される限り、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、その配列がＭＡＲＴ−１のＤＮＡにコードされるポリペプチドの配列と関連する、一つあるいはそれより多く残基の付加および／または欠損を持つ任意のポリペプチドを含む。
【００３２】
また、本発明は、ＭＡＲＴ−１核酸配列（配列番号：１）の全体または部分およびベクターからなる組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明で用いるに適した発現ベクターは、核酸配列に機能しうるように結合させた少なくとも一つの発現制御エレメントからなって良い。発現制御エレメントは、ベクター中に挿入され、核酸配列の発現を調節制御する。発現調節エレメントの例として、ｌａｃシステム、ファージラムダのオペレータおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レロトウイルスまたはＳＶ４０から誘導したプロモーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに、望ましいまたは必要とされる機能エレメントには、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに宿主システム中で核酸配列を適切に転写し次いで翻訳するに必要なまたは望ましいその他の任意の配列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。当業者は、必要または望ましい発現調節エレメントの適切な組み合わせは、選択した宿主のシステムに依存することを理解するであろう。さらに、発現ベクターは、宿主システム中で核酸配列を含む発現ベクターを伝達し次いで複製するに必要なエレメントをさらに含むべきであることを、理解するであろう。そのようなエレメントの例としては、複製起源および選択マーカーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに、当業者は、そのようなベクターが従来の方法を用いて容易に構築される（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または商品として入手できることを理解するであろう。
【００３３】
本発明のその他の態様は、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を含む組換え発現ベクターが挿入された宿主生物体に関する。本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列で形質転換される宿主細胞には、動物、植物、昆虫および酵母細胞のような真核生物、ならびに大腸菌のような原核生物が含まれる。遺伝子を運ぶベクターを細胞中に導入する手段としては、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムあるいはその他の当業者に既知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いたマイクロインジェクション、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、形質導入（トランスダクション）、またはトランスフェクションが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００３４】
望ましい実施態様では、真核生物細胞内で機能する真核生物発現ベクターが用いられる。そのようなベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、細菌発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなプラスミド、またはバキュウロウイルス伝達ベクターが含まれる。望ましい真核生物細胞系には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状突起細胞、または単核細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。特に望ましい実施態様では、組換えＭＡＲＴ−１タンパク質発現ベクターは、ＭＡＲＴ−１タンパク質に固有なプロセシングおよび修飾を確実にするために、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状突起細胞、または単核細胞のような哺乳動物細胞に導入される。別の実施態様では、ＭＡＲＴ−１ ＤＮＡが、ＣＯＳ７（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら、１９８１、Ｃｅｌｌ，２３：１７５−１８２）中に導入される。適当な細胞の選択は、当業者の内にある。
【００３５】
ある実施態様では、発現した組換えＭＡＲＴ−１タンパク質は、ＭＡＲＴ−１タンパク質に特異的な抗体を用いたコマジブルー染色およびウエスタンブロッティングを含むこの技術分野で既知の方法に従って、検出されるであろう。
【００３６】
さらなる実施態様では、宿主細胞によって発現した組換えタンパク質は、粗溶解物として得られるか、または分別沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティーおよび免疫親和性クロマトグラフィーおよびその類似物などを含む、この技術分野で既知の標準的なタンパク質精製法によって精製することが出来る（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。免疫親和性クロマトグラフィーの場合には、組換えタンパク質は、ＭＡＲＴ−１タンパク質に特異的な抗体を結合させた樹脂を含むカラムを通過させることによって精製されるであろう（Ａｕｓｅｂｅｌら、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００３７】
本発明の核酸配列またはその部分は、正常なおよび病的な組織中でのＭＡＲＴ−１遺伝子発現を検出するプローブとして有用である。それ故、本発明のその他の態様は、（ａ）本発明の核酸配列の全体または部分を、生体サンプルと、核酸配列とメッセンジャーＲＮＡとの間で複合体を形成させるような条件下で、接触させ、（ｂ）該複合体を検出し、さらに（ｃ）該メッセンジャーＲＮＡのレベルを定量する：段階からなる、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを検出するバイオアッセイに関する。
【００３８】
ＲＮＡは、細胞全体のＲＮＡとして、またはポリ（Ａ）＋ＲＮＡとして分離することが出来る。細胞全体のＲＮＡは、当業者に既知のいろいろな方法によって分離できる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。そのような方法には、分別沈殿によるＲＮＡ抽出（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１４８７−１４９７）、有機溶媒によるＲＮＡ抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９）、および強変性剤によるＲＮＡ抽出（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９）が含まれる。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、オリゴｄ（Ｔ）カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（Ａｖｉｖ，Ｈ．ら、１９７２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６９：１４０８−１４１２）によって、全細胞ＲＮＡから選択することが出来る。段階（ｃ）の細胞内メッセンジャーＲＮＡレベルを定量する方法の例としては、これに限られるわけではないが、ノーザンブロッティング（Ａｌｗｉｎｅ，Ｊ．Ｃ．ら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５３５０−５３５４）、ドットスロット−ハイブリダイゼーション（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．ら、１９７９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７：１５４１−１５２２）、フィルターハイブリダイゼーション（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１７４−１７９）、ＲＮアーゼ防御（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｒｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）、ポリメラーゼ鎖反応（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９２、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”、第二版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および核流出アッセイ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、増補９、１９９０、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）が含まれる。
【００３９】
また、バイオアッセイの段階（ｂ）の複合体の検出は、様々な技術によって実行することが出来る。シグナル増幅による複合体の検出は、放射能標識および酵素を含むいくつかの従来の標識技術によって成し遂げることが出来る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。また、放射能標識キットは、商品として入手することが出来る。バイオアッセイの段階（ｃ）でプローブとして用いられるＭＡＲＴ−１核酸配列は、ＲＮＡであっても、またはＤＮＡであって良い。ＤＮＡ配列を標識する望ましい方法は、クレノウ酵素またはポリヌクレオチドキナーゼを用い、^３２Ｐで標識する方法である。ＲＮＡまたはリボプローブ配列を標識する望ましい方法は、ＲＮＡポリメラーゼを用い、^３２Ｐまたは^３５Ｓで標識する方法である。さらに、ピリミジンおよびプリン環に化学基を付着させる方法（Ｄａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．ら、１９７３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７０：２２３８−２２４２；Ｈｅｃｈ，Ｒ．Ｆ．、１９６８、Ｓ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９０：５５１８−５５２３）、化学蛍光によって検出する方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ．ら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：８７３６−８７４０）およびビオチニル化した核酸プローブを用いる方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．ら、１９８３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３：１２５−１３１；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．ら、１９８２、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：２４１−２４９；Ｍａｔｔｈａｅｉ，Ｆ．Ｓ．ら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７：１２３−１２８）、および商品として入手できる製品を用いた蛍光による検出方法、を含む、放射能によらないシグナル増幅技術が知られている。
【００４０】
このバイオアッセイ中で用いることの出来る生体サンプルの例としては、これらに限られるわけではないが、哺乳動物の初代培養、メラノサイト細胞系のような哺乳動物の連続細胞系、皮膚または網膜のような哺乳動物の器官、組織、生体組織検査検体、新生物、病理検体、および検死検体が含まれる。
【００４１】
望ましい実施態様では、実施例１に例示されているように、^３２Ｐ放射能標識ＭＡＲＴ−１プローブが用いられる。望ましいＭＡＲＴ−１プローブは、図１の全長のｃＤＮＡ（配列番号：１）である。おおよそ１．６キロベース（Ｋｂ）のｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）は、ベクター内へクローン化され、得られたプラスミドは、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２ ＵＳＡに、１９９４年４月１４日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号７５７３８を与えられた。全長のＭＡＲＴ−１核酸配列は、ｐＣＲＩＩプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化することによって分離することが出来る。この１．６Ｋｂの核酸配列は、次に、プローブとして用いることが出来る。このプローブは、様々な組織あるいは生体サンプルから分離された全ＲＮＡまたはポリＡ^＋ＲＮＡ中のＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡの検出に用いられる。
【００４２】
その他の実施態様では、図１（配列番号：１）のＭＡＲＴ−１配列を基にしたオリゴヌクレオチド対の組み合わせは、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡを検出するためのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして用いられる。これらのプライマーは、選択されたＲＮＡ核酸配列を増幅するための逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＴ−ＰＣＲ）の過程に次いで、方法中で用いることが出来、その詳細は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”１５章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、に記載されている。オリゴヌクレオチドは、様々な製造者によって販売されている自動装置によって合成することが出来るし、あるいは、本発明の核酸配列を基にして商品として製造することもできる。当業者は、サンプル中のＭＡＲＴ−１ＲＮＡを増幅させるための、ＭＡＲＴ−１核酸配列を基にしたＰＣＲプライマーを選択する方法を知るであろう。
【００４３】
本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列またはその部分（図１：配列番号：１）は、正常または異常な哺乳動物組織中のＭＡＲＴ−１遺伝子の変化を検出するのに有用である。変化とは、ＭＡＲＴ−１遺伝子配列の付加、欠失、置換あるいは重複、またはＭＡＲＴ−１遺伝子配列の遺伝子増幅を意味する。それ故、本発明のその他の態様は、（ａ）本発明の核酸配列の全体または部分を、生体サンプルから分離したゲノムＤＮＡと、該核酸配列と該ゲノムＤＮＡの間で複合体が形成されるような条件下で、接触させ、（ｂ）該サンプルを検出し、さらに、（ｃ）対照サンプルと比較することによって、該ＭＡＲＴ−１遺伝子中の変化を決定する：段階からなる、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１遺伝子の変化を検出するためのアッセイに関する。
【００４４】
生体サンプルからＤＮＡを分離し、遺伝子中の変化を検出し、ＭＡＲＴ−１核酸プローブとゲノムＤＮＡ配列との複合体を検出するための、標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋのようなマニュアルに提供されている。
【００４５】
また、本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列（図１；配列番号：１）は、他の種のＭＡＲＴ−１同族体を分離するプローブとして用いることが出来る。望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１ｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）は、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いられ、陽性クローンを選択し配列決定を行う。ｃＤＮＡライブラリーを組み立てうる組織源の例としては、皮膚、網膜、メラノサイト、新生児の皮膚および胎芽が含まれるが、これらに限られるわけではない。望ましくは、哺乳動物のライブラリーは、プローブとしてＭＡＲＴ−１ｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）を用いて、スクリーニングされる。当業者は、同族体の検出に用いられるに適当なハイブリダイゼーション条件を理解するであろう。核酸のハイブリダイゼーション、ライブラリーの構築およびクローニング技術のための従来からの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、１９８７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【００４６】
ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体またはその部分は、メラノーマ細胞上に表示される抗原であることが知られている。それ故、本発明のその他の態様では、病気に苦しむ哺乳動物から分離した生体サンプル中のＭＡＲＴ−１ＲＮＡまたはＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡのレベルの変化の検出に用いられるＭＡＲＴ−１核酸プローブを提供する。そのような病気の例としては、これらに限られるわけではないが、メラノーマが含まれる。ＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡレベルでの変化とは、対照となるサンプルと比較したＲＮＡレベルの増加あるいは減少、または対照サンプルと比較したＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡの出現あるいは消滅を意味する。ＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡの変化の検出は、病状の診断または評価を可能にするであろう。それ故、ＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡレベルの変化は、罹患した哺乳動物の予後を予想するであろう。
【００４７】
その他の実施態様では、本発明の核酸は、哺乳動物組織のそのままの位置でのハイブリダイゼーションに用いられ、組織内でのＭＡＲＴ−１遺伝子発現の正確な位置または細胞内での位置を決定することが出来る。ＭＡＲＴ−１核酸配列を標識する望ましい方法は、ＳＰ６ポリメラーゼを用いた生体外での転写による^３５Ｓ標識ＲＮＡプローブを合成することである。ＭＡＲＴ−１プラスミド（ＡＴＣＣ寄託＃７５７３８）では、センスストランドはＴ７プロモーターの制御下にあり、アンチセンスストランドは、ＳＰ６プロモーター制御下にある。プローブは、おおよそ４００−２００塩基対の長さのプローブに加水分解されることが望ましい。組織をその位置で調製し、プローブを合成し、シグナルを検出する従来の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １４章、およびＶａｎｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ，Ｍ．，Ｒａａｐ，Ａ．Ｋ．、１９８８、“Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ”Ｇｏｅｒｔｔｌｅｒ，Ｋ．，Ｆｅｉｃｈｔｅｒ，ＧＥ．，Ｗｉｔｔｅ，Ｓ．編、１３−２１頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことが出来る。次いで、プローブを哺乳動物の組織切片と接触させ、そのままの位置で、従来の方法によって分析が行われる。用いられうる組織の例としては、哺乳動物の胎芽、皮膚、リンパ節および網膜のような哺乳動物成体組織、生検検体、病理検体および検死検体が含まれるが、これらに限られるわけではない。望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１プローブは、元の位置で、メラノーマ病変の急激な増殖期を特徴とする侵略性初期メラノーマの病変組織中でＭＡＲＴ−１ＲＮＡの発現を上昇させるために、また組織内での病変の縁を評価するために、用いられても良い。
【００４８】
本発明のさらなるその他の実施態様では、ＭＡＲＴ−１（配列番号：１）核酸配列の全体またはその部分は、形質転換動物を作り出すために用いることが出来る。望ましくは、ＭＡＲＴ−１遺伝子は、胎芽期、望ましくは一細胞期、一般的には八細胞期より以前に、動物または動物の祖先に導入される。ＭＡＲＴ−１遺伝子を持つ形質転換動物を作り出す手段はいくつかある。その一つの方法は、ＭＡＲＴ−１配列の全体または部分を持つレトロウイルスを使用することからなる。形質転換遺伝子を含むレトロウイルスは、トランスフェクションによって胎芽動物内に導入される。その他の方法は、胎芽内に形質転換遺伝子を直接注入することを含む。さらなるその他の方法としては、当業者に既知の胎芽幹細胞法または相同組換え法が用いられる。ＭＡＲＴ−１トランス遺伝子を導入できる動物の例としては、霊長類、マウス、ラットまたはその他の齧歯類が含まれるが、これらに限られるわけではない。そのようなトランス遺伝子動物は、メラノーマ研究用生体モデルとして、また、メラノーマの診断法または治療法を評価するために有用であろう。
【００４９】
さらに、本発明は、ＭＡＲＴ−１タンパク質、または、図１（配列番号：２）に定義したアミノ酸配列あるいはその唯一の部分を持つ、ペプチドまたは修飾ペプチドまたはその類似体と反応するひとつの抗体または複数の抗体類からなる。本発明の実施態様では、抗体は、起源的にモノクローナルまたはポリクローナルである。抗体を生成するために用いられるＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドは、天然物または組み換え体を源にして良く、化学合成によって合成しても良い。天然のＭＡＲＴ−１タンパク質は、哺乳動物の生体サンプルから分離することが出来る。生体サンプルには、新鮮なメラノーマ、皮膚、網膜のような、哺乳動物組織、メラノーマ培養物あるいは培養メラノサイトのような哺乳動物細胞の初代培養または連続培養が含まれるが、これらに限られるわけではない。天然ＭＡＲＴ−１タンパク質は、組換えタンパク質の分離法として上に記載した方法と同一の方法で分離しても良い。組換えＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドは、従来の方法で生成されて良く、また従来の方法で精製しても良い。合成ＭＡＲＴ−１ペプチドは、本発明から予想されるアミノ酸配列（図１；配列番号：２）を基にして特別注文するかあるいは商品として製造するか、または当業者に既知の方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．、１９６３、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．８５：２１４９）によって合成しても良い。ＭＡＲＴ−１ペプチドの例としては、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２；配列番号：４）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ１０−３；配列番号：１７）およびＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（Ｍ１０−４；配列番号：１８）（ペプチドは、一文字のアミノ酸コードで表す）が含まれるが、これらに限られるわけではない。最も望ましいペプチドは、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）である。
【００５０】
別の方法として、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列から誘導したペプチドは、ペプチドが存在しているＭＨＣ分子とペプチドとの結合を強化することによってそれらの免疫原性を増加させるように修飾しても良い。用いられて良いそのような修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドの例は、表１４に示すペプチドであるが、これらに限定されるわけではない。望ましい実施態様では、Ｉ型ＭＨＣとの結合を強化するように修飾されたＭＡＲＴ−１ペプチドは、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）である。修飾ペプチドの例としては、ＡＬＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−２Ｌ）（配列番号：５０）、ＷＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−１Ｗ）（配列番号：５３）、ＦＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−１Ｆ）（配列番号：５４）およびＡＡＹＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−３Ｙ）（配列番号：５８）が挙げられる。ペプチドまたは修飾ペプチドは、ペプチドの抗原性を強化するためにキャリヤー分子と結合させても良い。キャリヤー分子の例としては、これらに限定されるわけではないが、ヒト−アルブミン、ウシ−アルブミン、リポタンパク質およびキーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｆ．およびＴｅｒｒ Ａ．Ｉ．編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。
【００５１】
本発明の検出方法として用いられる典型的な抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、または、抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の部分であり、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）_２およびＦ（Ｖ）としてこの技術分野で既知のそれらの免疫グロブリン分子の部分を含む。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、この技術分野で既知の方法に従って生成されて良い（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、Ｂｕｒｄｏｎら編、１９８５、“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。また、抗体または抗原結合フラグメントは、遺伝子工学によって作り出されても良い。大腸菌内で重鎖と軽鎖の両方の遺伝子を発現させる技術は、ＰＣＴ特許出願：公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４、ならびにＨｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１の主題である。
【００５２】
本発明の抗体は、天然のまたは変性させたＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ペプチドあるいはその類似体と反応するであろう。抗体が用いられる具体的なイムノアッセイは、抗体に望ましいように行われるであろう。抗体は、ＭＡＲＴ−１タンパク質あるいはその部分に対して、またはＭＡＲＴ−１アミノ酸配列に相同な合成ペプチドに対して、高められて良い。
【００５３】
一つの実施態様では、本発明の抗体は、生体サンプル中の新規のＭＡＲＴ−１タンパク質を検出するためにイムノアッセイに用いられる。この方法では、本発明の抗体を生体サンプルと接触させ、ＭＡＲＴ−１抗原と抗体の間の複合体の形成を検出する。本発明のイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイおよびその類似アッセイなどであって良い（“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”、１９９１、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．ＰｒｉｃｅおよびＤａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。この技術分野で既知のＥＬＩＳＡの標準技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第二版、ＲｏｓｅおよびＢｉｇａｚｚｉ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０、およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４、に記載されており、これらの両方はここに参照として取り入れられる。そのようなアッセイは、以下に記載されている、直接的、間接的、競合的または非競合的イムノアッセイであって良い（“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”、１９９１、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．ＰｒｉｃｅおよびＤａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ；Ｏｅｌｌｉｒｉｃｈ，Ｍ．、１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：８９５−９０４）。そのような検出アッセイに適当な生体サンプルは、哺乳動物組織、メラノーマおよびメラノサイト細胞系、皮膚、胎芽、リンパ節、病理検体、検死検体、および生検検体を含む。タンパク質は、以下に記載の従来の方法で、生体サンプルから分離されて良い（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００５４】
本発明の抗体は、それ故、病気または疾病に苦しむ哺乳動物から分離した生体サンプル中の、ＭＡＲＴ−１抗原またはＭＡＲＴ−１抗原の発現レベルの変化を検出するイムノアッセイに用いることが出来る。生体サンプルの例としては、これらに限定されるわけではないが、哺乳動物組織、生検組織サンプル、メラノーマおよびリンパ節生検サンプル、病理および組織サンプルが含まれる。これらのイムノアッセイによって評価できる病気の例としては、これらに限定されるわけではないが、メラノーマおよびメラノーマが次に転移する部位の組織が含まれる。発現レベルの変化とは、対照サンプルと比較してのＭＡＲＴタンパク質あるいはその部分の増加または減少を意味する。また、変化とは、ＭＡＲＴ−１タンパク質の置換、欠失または付加変異を包含する。そのような変異は、ＭＡＲＴ−１タンパク質に特異的なエピトープと反応することが知られている本発明の抗体を用いることによって、また対照と比較してエピトープが存在するか否かを決定することによって、決定することが出来る。それ故、本発明の抗体は、病気に罹った哺乳動物を診断、評価、予知するためのイムノアッセイに用いることが出来る。
【００５５】
望ましい実施態様では、本発明のＭＡＲＴ−１抗体は、免疫細胞化学の手法を用いてメラノーマに苦しむ哺乳動物の組織生検からＭＡＲＴ−１抗原の存在を評価するために、用いられる。そのような病気組織中のＭＡＲＴ−１抗原の詳述な評価は、病気に苦しむ哺乳動物の病気の進行を予知するために用いることが出来る。具体的には、ＭＡＲＴ−１抗体は、メラノーマ病害の急激な増殖期を特徴づけるために用いることが出来る。免疫組織化学のための従来の方法は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｂｅｌら編、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；に記載されている。
【００５６】
その他の実施態様では、本発明の抗体は、ＭＡＲＴ−１タンパク質またはその部分を精製するために用いられて良い。免疫親和性クロマトグラフィーは、当業者に既知の従来の方法によって行うことが出来る（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００５７】
その他の望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１タンパク質を特異的に認識する抗体を含むウサギの抗血清は、ウエスタンブロット分析で該タンパク質を検出するために用いられる。そのような抗血清は、ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体あるいはその一つあるいはいくつかの部分、またはＭＡＲＴ−１タンパク質配列から合成したペプチドを直示する。望ましくは、ＭＡＲＴ−１の予想アミノ酸配列から誘導されたＭＡＲＴ−１合成ペプチドが用いられる（図１、配列番号：２）。別の方法として、修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドを用いても良い、ペプチドは、自動ペプチドシンセサイザーを用いて標準方法で合成され、実施例２に記載したような高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製される。精製したペプチドは、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、１９８４、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載のように、担体に結合させて良い。従来の方法を用いると、ウサギは、担体と結合させたＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドで免疫化されて良い。望ましくは、アジュバンド中、約０．１から約１０（ｍｇ）の抗原が用いられて良く、最も望ましくは、アジュバンド中、約１ｍｇの抗原を用いて良い。動物は、同様の効能促進剤の投与を受け、抗血清力価は、ＥＬＩＳＡアッセイによって評価される。抗血清の満足できるレベルは、抗ペプチド抗体力価がプラトーに達する時点で、得られる。この抗体は、上記の標準イムノアッセイに用いることが出来る。
【００５８】
Ｔ−リンパ球は、ＭＨＣ分子と結合したペプチドフラグメントの形でＩ型またはＩＩ型のＭＨＣ分子と関連する抗原を認識する。与えられたＭＨＣ対立遺伝子と結合するペプチドの程度は、ペプチド内での特定位置のアミノ酸による（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４９：３５８０；Ｋｕｂｏら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５２：３９１３−３９２４；Ｒｕｐｐｅｒｔ Ｊ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ，７４：９２９−９３７；Ｆａｌｋら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ，３５１：２９０−２９６、これらは、それぞれ、ここに参照として取り入れられる）。それ故、本発明のその他の実施態様は、ペプチドの関連するＭＨＣ分子とペプチドとの結合を強化することによって、免疫原性を増加させるように修飾したＭＡＲＴ−１タンパク質配列（図１；配列番号：２）から誘導したペプチドに関する。例として、修飾は、与えられた免疫原性ペプチド配列内のアミノ酸の置換、欠失あるいは付加、与えられた免疫原性ペプチド配列内に存在するアミノ酸変異または与えられた免疫原性ペプチド配列内の存在するアミノ酸の誘導体を含んで良い。免疫原性ペプチド配列からなる任意のアミノ酸は、本発明に従って修飾されて良い。望ましい実施態様では、与えられた免疫原性ペプチド配列内で、少なくとも一つのアミノ酸が置換または置き換えられる。任意のアミノ酸が、免疫原性ペプチド配列内の与えられたアミノ酸を置換または置き換えるために用いられて良い。修飾ペプチドとは、修飾され、Ｔ−細胞に存在する場合に関連するＭＨＣ分子との結合強化を示す、任意の免疫原性ＭＡＲＴ−１ペプチドを含むつもりである。
【００５９】
例として、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、９または１０のアミノ酸からなるペプチドを結合する。結合を強化するために変えても良いペプチドの位置の例としては、ペプチドの第一の位置、第二の位置、第三の位置、および最終位置が含まれるが、これらに限定されるわけではない。免疫原性ペプチド配列のこれらの位置を置換または置き換えるために、任意のアミノ酸が用いられて良い。ＨＬＡ−Ａ２との結合を強化するために、ペプチドの第二の位置のアミノ酸は、疎水性の脂肪族アミノ酸であることが望ましい。第二の位置で用いられて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、ロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、スレオニンまたはグリシンが含まれる。望ましくは、ロイシンまたはメチオニンがペプチドの第二の位置に見出される。ペプチドの最後のアミノ酸（ペプチドの長さによって９番目か１０番目かいずれかのアミノ酸）は、疎水性脂肪族アミノ酸が望ましい。ペプチドの最後の位置に用いても良いアミノ酸の例としては、バリン、メチオニン、ロイシン、アラニン、イソロイシン、スレオニンまたはグリシンが含まれるが、これらに限られるわけではない。望ましくは、バリンがペプチドの最後の位置に見出される。また、ペプチドの第一および第三の位置のアミノ酸は、Ｉ型ＭＨＣ分子とペプチドの結合を強化するために修飾されても良い。ペプチドの第一および第三の位置のアミノ酸は、任意のアミノ酸であって良い。望ましくは、第一および第三の位置のアミノ酸は、疎水性の脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。これらの位置に用いられて良いアミノ酸の例としては、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、アスパラギン酸またはリジンが含まれるが、これらに限られるわけではない。修飾されて良いＭＡＲＴ−１ペプチドの例としては、これらに限定されるわけではないが、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１７）およびＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（配列番号：１８）（ペプチドは一文字アミノ酸コードで表されている）が含まれる。例として、免疫原性ＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）は、次式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＩＧＩＬＴＸ_４（配列番号：１２２）、に従って修飾されて良い：
式中、Ｘ_１は、任意のアミノ酸、望ましくは任意の疎水性脂肪族アミノ酸、または芳香族アミノ酸であって良い。用いて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、リシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、グリシンまたはセリンが含まれる。
【００６０】
Ｘ_２は、任意の疎水性アミノ酸、望ましくは脂肪族疎水性アミノ酸であって良い。用いて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、スレオニン、アラニンまたはグリシンが含まれる。
【００６１】
Ｘ_３は、任意のアミノ酸、望ましくは、任意の疎水性の脂肪族アミノ酸、または芳香族アミノ酸であって良い。用いて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、セリン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、またはスレオニンが含まれる。
【００６２】
Ｘ_４は、任意の疎水性アミノ酸、望ましくは疎水性の脂肪族アミノ酸であって良い。用いられて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、スレオニン、またはグリシンが含まれる。
【００６３】
作り出されて良い修飾ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）ペプチド配列の例として、表１４（実施例５）にペプチドを示すが、これらに限られるわけではない。
さらに、本発明は、修飾したＭＡＲＴ−１アミノ酸配列（図１；配列番号：２）から誘導したこれらの免疫原修飾ペプチドの類似体を含む。類似体という言葉は、これらの修飾ペプチドの機能的態様を示す任意のペプチドを含むつもりである。類似体という言葉は、また、上記のようなこれらの修飾ペプチドの保存的置換または化学誘導体を含む。これらの修飾ペプチドは、従来の方法に従って、合成によってまたは組換えによって作り出されて良い。
【００６４】
組換えあるいは天然のＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体は、予防または治療のどちらかのためのワクチンとして用いられて良い。治療目的で提供される場合、ワクチンは、メラノーマのいかなる存在にも先だって提供される。ＭＡＲＴ−１ワクチンの予防投与では、哺乳動物内のメラノーマを防ぐまたは減退させるために供されるべきである。望ましい実施態様では、メラノーマに罹る危険性の高い哺乳動物、望ましくはヒト、は、本発明のワクチンで予防的に処置される。そのような哺乳動物の例としては、これらに限られるわけではないが、メラノーマの家族歴を持つヒト、異型色素性母斑歴を持つヒト、ＦＡＭ−Ｍ症候群歴を持つヒト、または以前にメラノーマを一部切除しそれ故再発の危険性のあるヒトが含まれる。治療目的で提供される場合、ワクチンは、メラノーマまたは転移性メラノーマ上に存在する腫瘍抗原への患者自身の免疫応答を強化するために提供される。免疫原として作用するワクチンは、細胞、組換え発現ベクターを移入した細胞からの細胞溶解物、ＭＡＲＴ−１組換え発現ベクターを移入した細胞からの細胞溶解物、または発現したタンパク質を含む培養上澄み液であって良い。別の方法では、免疫原は、部分的にあるいは実質的に精製した組み換えＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾したペプチドあるいはその類似体である。タンパク質またはペプチドは、リポタンパク質と結合させるか、またはリポゾームの形であるいは補助剤と共に投与されて良い。
【００６５】
免疫原は純粋なまたは実質的に純粋な形で投与することが出来るが、医薬組成物、調合物または調製物として存在することが望ましい。
本発明の調合物は、獣医学およびヒトへの両方に用いられるが、一つまたはそれより多くの医薬として受け入れうる担体、および所望するならばその他の治療成分と共に、上記のような免疫原からなる。担体は、調合物のその他の成分と矛盾せず、その宿主に有害でない範囲で「受け入れ可能」であらねばならない。調合物は、便宜上、単位投与の形で存在して良く、医薬分野で熟知されている任意の方法によって調製されて良い。
【００６６】
すべての方法は、一つまたはそれより多くの補助成分を構成する担体と共に活性成分を組み合わせの中に持ち込む段階を含む。一般的には、調合物は、液体担体または微細に分割される固体担体またはその両方と共に活性成分を組み合わせの中に均一にかつ親密に持ち込み、次いで、必要であれば、望ましい調合物に生成物を適合させることによって、調製される。
【００６７】
静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与に適した調合物は、宿主の血液と等張であることが望ましい溶液と共に、活性成分の無菌水溶液からなると便利である。そのような調合物は、便宜上、塩化ナトリウム（例えば０．１−２．０Ｍ）、グリシンおよびその類似物などのような生理学的に矛盾しない物質を含み、生理学的状態と矛盾しない緩衝ｐＨを持って水溶液を生成し、かつ該水溶液を無菌にするような水中に、個体活性成分を溶解することによって調製されて良い。これらは、ユニット中または複数の投与容器中、例えば密封アンプルまたはバイアル中に存在して良い。
【００６８】
本発明の調合物は、安定化剤を組み込んでも良い。安定化剤の例としては、それらのみでまたは混合物として用いられるポリエチレングリコール、タンパク質、サッカライド、アミノ酸、無機酸および有機酸が挙げられる。これらの安定化剤は、望ましくは、免疫原重量当たり０．１１−１０，０００重量の量で混合される。二種類またはそれより多くの安定化剤が用いられる予定の場合、それらの総量は、上記の範囲であることが望ましい。これらの安定化剤は、適当な濃度およびｐＨの水溶液中で用いられる。そのような水溶液の具体的な浸透圧は、一般的には、０．１−３．０オスモルの範囲であり、望ましくは０．８−１．２の範囲である。水溶液ｐＨは、５．０−９．０の範囲内、望ましくは６−８の範囲内に調製される。本発明の免疫原の調合には、抗吸着剤を用いても良い。
【００６９】
さらなる医薬的方法が、作用の持続期間を調節するために用いられても良い。調製物の遊離の調節は、タンパク質またはそれらの誘導体を複合または吸収するポリマーの使用を通して成し遂げられて良い。配達の調節は、適当な高分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン）および高分子の濃度、ならびに遊離を調節するために組み込み方法を選択することによって、行われて良い。調製物の遊離を調節することによって作用持続期間を調節するためのその他の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテート共重合体のような、重合体物質の粒子内に、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドおよびその類似体を組み込むことである。別法として、重合体粒子内にこれらの薬剤を組み込む代わりに、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、あるいは、ゼラチン−ミクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）ミクロカプセル）によって調製されたミクロカプセル内に、または、コロイド薬剤配達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内、およびマクロエマルジョン内に、これらの物質を閉じ込めることが可能である。
【００７０】
経口調製物が所望される場合、組成物は、ラクトース、スクロース、デンプン、タルクステアリン酸マグネシウム、結晶化セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたはアラビアゴムのような、典型的な担体と組み合わせて良い。
【００７１】
本発明のタンパク質は、キットの形で、単独で、または上記の医薬組成物の形で供給されて良い。
ワクチン注射は、従来の方法で行うことが出来る。例えば、免疫原は、塩類溶液または水のような適当な希釈液、または完全あるいは不完全な補助剤中で用いることが出来る。さらに、免疫原は、タンパク質免疫原性を作り出すために担体に結合させても良いが、させなくても良い。そのような担体分子には、これらに限られるわけではないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風毒素、およびその類似物などが含まれる。また、免疫原は、リポタンパク質とカップリングさせても、またはリポソームの形であるいは補助剤と共に投与されても良い。免疫原は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、およびその類似部位等のような、抗体生成に適した任意の経路によって投与することが出来る。免疫原は、一度に、または抗ＭＡＲＴ−１免疫細胞または抗ＭＡＲＴ−１抗体の有効な力価が作り出されるまで断続的な間隔で、投与されて良い。抗ＭＡＲＴ−１免疫細胞の存在は、免疫化される前および後のＭＡＲＴ−１抗原に対するＣＴＬ前駆体（細胞毒性Ｔリンパ球）の頻度を、ＣＴＬ前駆体分析アッセイ（Ｃｏｕｌｉｅ，Ｐ．ら、１９９２、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，５０：２８９−２９７）を用いて測定することによって評価されてであろう。抗体は、上記のイムノアッセイを用いて血清中で検出されるであろう。
【００７２】
本発明のワクチンまたは免疫原の投与は、予防目的または治療目的のいずれかであって良い。予防目的で提供される場合、免疫原は、いかなる存在もに先んじて、またはメラノーマによるいかなる徴候にも先んじて、提供される。免疫原の予防投与では、哺乳動物内のメラノーマを予防するまたは弱毒化するために供される。治療目的で提供される場合、免疫原は、病気の始まりに（あるいはすぐ後に）または病気の任意の徴候の始まりに提供される。免疫原の治療投与は、病気を弱毒化するために供される。
【００７３】
望ましい実施態様では、ワクチンは、組み換えＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチド発現ベクターを用いて調製される。個体にワクチンを供給するために、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分をコードする遺伝子配列を、上記のように発現ベクタ内に挿入し、免疫化される哺乳動物内に導入する。前述のワクチンに用いて良いベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、不完全なレトロウイスルベクター、アデノウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、またはその他のウイルスベクターが、含まれる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２）。ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を運搬するウイルスベクターは、メラノーマのいかなる証拠も認められない間に、またはメラノーマに罹った哺乳動物の病気の退縮を仲介するためかのどちらかに、哺乳動物内に導入することが出来る。哺乳動物にウイルスベクターを投与するための方法の例としては、これらに限られるわけではないが、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でウイルスに細胞をさらすこと、罹患組織内へのレロトウイルスまたはウイルスの生産細胞系の注入、またはウイルスの静脈内投与が含まれる。別法として、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を持つウイルスベクターは、医薬として受け入れうる担体内で、メラノーマ内に直接注入するまたは局所適用することによって、局所的に投与されて良い。ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を持つ、ウイルスベクターの投与量は、ウイルス粒子の力価を基本とする。投与される免疫原の望ましい範囲は、哺乳動物、望ましくはヒト当たり、約１０^６から約１０^１１ウイルス粒子であろう。免疫化後のワクチンの効果は、特異的溶解活性あるいは特異的サイトカイン生成によってまたは腫瘍退縮によって評価されるのと同様に、抗原を認識する抗体または免疫細胞の生成によって評価することが出来る。当業者は、前述のパラメーターを評価する従来からの方法を知っているであろう。免疫化される哺乳動物が既にメラノーマまたは転移性メラノーマに罹っている場合、ワクチンは、その他の治療処置と共に投与することが出来る。その他の治療処置の例としては、これらに限られるわけではないが、Ｔ細胞免疫療法の採用、サイトカインまたはメラノーマ用のその他の治療薬剤の共投与が含まれる。
【００７４】
代わりに、実質的にあるいは部分的に精製したＭＡＲＴ−１タンパク質の全体または部分を、医薬として受け入れうる担体内のワクチンとして投与しても良い。投与されて良いＭＡＲＴ−１タンパク質の範囲は、患者当たり約０．００１から約１００ｍｇであり、望まし投与量は、患者当たり約０．０１から約１００ｍｇである。望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）（一文字コードで表す）またはその類似体が、そのような治療を必要とする哺乳動物に治療目的でまたは予防目的で投与される。修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドの代わりに、表１４に示した例を用いても良い。望ましい投与量は、約０．００１ｍｇから約１００ｍｇ、最も望ましくは約０．０１ｍｇから約１００ｍｇであろう。ペプチドは、合成によってまたは組換えによって作り出されて良い。免疫化は、抗免疫原抗体または免疫細胞の充分な力価が得られるまで、必要に応じて繰り返して行われる。
【００７５】
さらなるその他の代わりの実施態様では、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを、哺乳動物細胞内へ導入することもできる。レトロウイルスベクターを導入することの出来る哺乳動物細胞の例としては、これらに限られるわけではないが、哺乳動物の初代培養または哺乳動物の継代培養、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、または２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）が含まれる。遺伝子を運搬するベクターを細胞内に導入する手段には、これらに限られるわけではないが、ミクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクション、またはＤＥＡＥデキストラン、リポフェクチン、リン酸カルシウムを用いたトランスフェクション、または当業者に既知のその他の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）が含まれる。ＭＡＲＴ−１抗原を発現している哺乳動物細胞は、哺乳動物に投与することができ、ワクチンまたは免疫原として供される。ＭＡＲＴ−１抗原発現細胞を投与する方法の例としては、これらに限られるわけではないが、静脈内、腹腔内または病巣内が含まれる。望ましい実施態様では、ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）に関連するＭＡＲＴ−１核酸配列の部分が、ＭＡＲＴ−１発現ベクターに挿入され、哺乳動物細胞内に導入される。代わりに、ＭＨＣ分子とのそれらの結合を強化するように修飾されたＭＡＲＴ−１ペプチド関連核酸配列を用いても良い。例として、表１４に示す修飾ペプチドをコードする核酸配列を、発現ベクターに挿入し、哺乳動物細胞内に導入しても良い。
【００７６】
本発明のワクチン調合物は、メラノーマ関連ＭＡＲＴ−１抗原のようなメラノーマ関連抗原に対して直接的な免疫応答を誘発する免疫原からなる。ワクチン調合物は、最初に動物モデルで、手始めに齧歯動物、次いでヒト以外の霊長類、最後にヒトで評価されて良い。免疫化法の安全性は、免疫化された動物の一般的健康状態への免疫化による影響（体重変化、発熱、食欲状態等）を探し出すことによって、また検死の病理学的変化を探し出すことによって、決定される。動物で最初に試験した後、メラノーマ癌患者で試験できる。従来からの方法を用いて、患者の免疫応答が評価され、ワクチンの効果が決定されるであろう。
【００７７】
本発明のさらなるその他の実施態様では、ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体、一つあるいはいくつかの部分、またはＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体を、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養された樹状突起細胞にさらして良い。培養樹状突起細胞は、樹状突起細胞修飾抗原または抗原でパルス処理した樹状突起細胞からなるＴ細胞依存性抗原を作り出す手段を提供し、樹状突起細胞内で、抗原は処理され抗原活性化樹状突起細胞上に発現する。ＭＡＲＴ−１抗原活性化樹状突起細胞または処理された樹状突起細胞抗原は、ワクチンまたはメラノーマ治療用の免疫原として用いられて良い。樹状突起細胞は、抗原が中に取り込まれ樹状突起細胞表面上に示されるに充分な時間、抗原にさらされるべきである。得られた樹状突起細胞または樹状突起細胞処理抗原は、次いで、治療を必要とする個体に投与することが出来る。そのような方法は、Ｓｔｅｉｎｍａｎら、ＷＯ９３／２０８１８５およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら、ＥＰＯ出願Ｏ５６３４８５Ａ１に記載されており、ここに参照として取り入れる。
【００７８】
本発明のさらなるその他の実施態様では、個体から分離されたＴ細胞は、生体外で（ｉｎｖｉｔｒｏ）、ＭＡＲＴ−１タンパク質あるいはその部分、またはＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体、またはＭＡＲＴ−１修飾ペプチドあるいはその類似体に、さらし、次いで、そのような治療を必要とする患者に治療上有効な量を投与することが出来る。Ｔ−リンパ球を分離できる例としては、これらに限られるわけではないが、抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、リンパ節、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）が含まれる。そのようなリンパ球は、処置した個体からまたは宿主から、この技術分野で既知の方法によって分離し、生体外で培養することが出来る（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：２４５３−３４６１）。リンパ球は、ＲＰＭＩあるいはＲＰＭＩ１６４０またはＡＩＭ−Ｖのような培地中で、１−１０週間培養される。生存能力は、トリパンブルー色素排除試験によって評価される。リンパ球は、培養の一部または全期間中、ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体または部分にさらされる。望ましい実施態様では、リンパ球は、１０^７細胞当たり約１から約１０μｇ／ｍｌの濃度で、リンパ球培養の全期間または一部期間、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）ペプチド（一文字コードで表す）にさらされる。ペプチドに感作させた後、Ｔ−リンパ球は、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与される。代わりに、表１４に示す修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドをリンパ球にさらしても良い。このような感作Ｔ細胞を哺乳動物に投与するための方法の例としては、これらに限られるわけではないが、静脈内、腹腔内、または病巣内が含まれる。これらの感作Ｔ−リンパ球の効果を測定し評価するパラメーターには、これらに限定されるわけではないが、治療される哺乳動物内での免疫細胞の生成または腫瘍の退縮が含まれる。従来からの方法が、これらのパラメーターを評価するために用いられる。そのような治療は、サイトカインまたは遺伝子修飾細胞と共に施すことが出来る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９９２、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：７５−９０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９９２、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：５７−７３）。
【００７９】
ワクチンとしての使用に加えて、組成物は、ＭＡＲＴ−１抗原、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドおよびその類似体、に対する抗体を調製するために用いることが出来る。抗体は、抗メラノーマ薬剤として直接用いることが出来る。抗体を調製するために、宿主動物は、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ペプチドあるいはその類似体を、免疫原として用いて免疫化され、上記のようなワクチン用担体と結合される。宿主の血清または血漿は、適当な時間間隔で集められて、免疫原と反応する抗体からなる組成物を提供する。γ−グロブリン画分またはＩｇＧ抗体は、例えば、飽和硫酸アンモニウムあるいはＤＥＡＥセファデックス、またはその他の当業者に既知の技術を用いることによって、得ることが出来る。抗体は、化学療法のようなその他の抗癌薬剤と関連するであろう多くの不利な副作用とは実質上無関係である。
【００８０】
抗体組成物は、潜在する不利な免疫システム応答を最小にすることによって、宿主システムとより一層矛盾なく作ることが出来る。この事は、外来種抗体のＦｃ部分の全体あるいは一部を除去することによって、または、例えばヒト／ヒトハイブリドーマからの抗体を用いると言ったような宿主動物と同一種の抗体を用いることによって、成し遂げられる。ヒトに適応させた（即ちヒトに非免疫原性である）抗体は、例えば、抗体の免疫原性部分を、類似しているが非免疫原性である部分で置き換える（即ち、キメラ抗体）ことによって、作られて良い。そのようなキメラ抗体は、一つの種からの抗体の反応性または抗原結合部分、および異なる種からの抗体のＦｃ部分（非免疫原性）を含んでよい。キメラ抗体の例としては、これらに限られるわけではないが、非ヒト哺乳動物−ヒトのキメラ、齧歯動物−ヒトのキメラ、ねずみ−ヒトおよびラット−ヒトのキメラ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３４３９；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，４７：９９９；Ｗｏｏｄら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４６６；Ｓｈａｗら、１９８８、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０：１５５５３、ここにそのすべてを参照として取り入れる）が含まれる。
【００８１】
「人体に適用させた」キメラ抗体の一般的レビューは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２によって、およびＯｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ，４：２１４によって提供される。
【００８２】
適当に「人体に適用させた」抗体は、ＣＤＲまたはＣＥＡの置換によって代わりに作り出すことが出来る（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５５２；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｂｉｅｄｌｅｒｅｔら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１：４０５３、これらのすべてはここに参照として取り入れる）。
【００８３】
抗体または抗原結合フラグメントは、また、遺伝子工学によって作り出されても良い。大腸菌内での重鎖および軽鎖の両方の遺伝子を発現させるための技術は、以下のＰＣＴ特許出願；公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４、ならびにＨｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１の主題である。
【００８４】
また、抗体は、免疫応答を強化する手段として用いることもできる。抗体は、抗体のその他の治療投与に用いられるそれと同様の量を投与することが出来る。例えば、プールしたγグロブリンは、患者当たり約１ｍｇから約１００ｍｇの範囲で、投与される。このように、ＭＡＲＴ−１抗原と反応する抗体は、単独でまたはメラノーマに罹った哺乳動物への他の抗癌治療と共に、抵抗なく投与することが出来る。抗癌治療の例としては、これらに限られるわけではないが、化学療法、放射線治療、ＴＩＬの免疫療法採用療法が含まれる。
【００８５】
代わりに、抗ＭＡＲＴ−１抗原抗体は、免疫原としての抗イディオタイプ抗体を投与することによって、誘発することもできる。便宜上、上記の方法に従って調製した精製抗ＭＡＲＴ−１抗体調製物を用いて、宿主動物に抗イディオタイプ抗体を誘発させる。組成物は、適当に希釈されて宿主動物へ投与される。投与の後、通常は繰り返し投与の後、宿主は、抗−イディオタイプ抗体を作り出す。Ｆｃ領域への免疫原性応答を排除するために、宿主動物と同じ種によって作りだした抗体を用いるか、または投与した抗体のＦｃ領域を排除することが出来る。宿主動物内の抗イディオ抗体の導入に次いで、血清または血漿は、抗体組成物を提供するために、取り除かれる。組成物は、抗ＭＡＲＴ−１抗体のための上記の方法に従って、または親和性マトリックスに結合した抗ＭＡＲＴ−１抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、精製することができる。生成された抗イディオタイプ抗体は、標準的なＭＡＲＴ−１抗原とコンフォメーションが同じであり、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチド類似体またはその部分を用いるよりもむしろ、ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原ワクチンを調製するために用いられて良い。
【００８６】
動物に抗ＭＡＲＴ−１抗体を誘発させる手段として用いた場合、抗体を注入する方法は、ワクチン注射の目的と同じ、即ち、補助剤ととにまたは補助剤を用いずに、生理学的に適当な希釈剤中、有効濃度で、筋肉内、腹腔内、皮下、病巣内、またはその類似部位などに注射される。一種類またはそれより多くの効能促進剤の注入が望ましい。
【００８７】
また、本発明のＭＡＲＴ−１誘導タンパク質またはペプチドまたは修飾ペプチドは、病気前後の予防を意図する抗血清の生成に用いるつもりである。ここでは、ＭＡＲＴ−１抗原、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体は、適当な補助剤と調合され、ヒト抗血清を生成するための既知の方法に従って、ヒト志願者に注射により投与される。注射されたタンパク質に応答する抗体は、免疫化に次いで、数週間の間、抹消血清をサンプリングすることによって、抗ＭＡＲＴ−１血清抗体の存在を検出するために、ここに記載されたようなイムノアッセイを用いて、モニターされる。
【００８８】
免疫化された個体からの抗血清は、進行性メラノーマの危険性のある個体の予防処置として投与されて良い。抗血清は、また、メラノーマに罹った個体の病後の予防治療にも有用である。
【００８９】
ＭＡＲＴ−１抗原の抗体および抗イディオタイプ抗体のインビボでの使用および診断的使用の両方に対してモノクローナル抗体を使用するのが好適であろう。モノクローナルの抗−ＭＡＲＴ−１抗体または抗−イディオタイプ抗体は以下のように製造できる。免疫化動物から脾臓またはリンパ球を取り出し、不死化させるかまたは当業者には既知の方法によりハイブリドーマの製造に使用した。（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．１９８３．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＰｌａｄｅｒｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．５６−９７）。ヒトーヒトハイブリドーマを製造するために、ヒトリンパ球供与者が選択された。ＭＡＲＴ−１抗原を運ぶメラノーマを持つことが知られている供与者が適したリンパ球供与者であろう。リンパ球は末梢血試料から単離でき、もし供与者が脾摘出を受けるならば脾臓細胞を使用してもよい。エプスタインーバールウイルス（ＥＢＶ）がヒトリンパ球の不死化に使用でき、ヒトーヒトハイブリドーマを産生するためにはヒト融合パートナーが使用できる。ペプチドによる一次インビトロ免疫化もまたヒトモノクローナル抗体の発生に使用できる。好適なＭＡＲＴ−１ペプチドの例としては、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１７）およびＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（配列番号：１８）（ペプチドは単一文字アミノ酸コードで表されている）が挙げられるがそれらに制限されるわけではない。最も好適にはＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）が免疫原として使用される。もしくは、ＭＡＲＴ−１アミノ酸配列から誘導され、ＭＨＣクラスＩ分子への結合性を促進させるように修飾されたペプチドもまた使用される。例えば、表１４に示された修飾ペプチドが免疫原として使用されるであろう。
【００９０】
不死化細胞により分泌される抗体をスクリーニングして所望の特異性を持つ抗体を分泌するクローンを決定する。モノクローナルＭＡＲＴ−１抗原またはペプチド抗体については、抗体はＭＡＲＴ−１抗原またはペプチドに結合しなければならない。モノクローナル抗イディオタイプ抗体については、抗体は抗ＭＡＲＴ−１抗体に結合しなければならない。所望の特異性を持つ抗体を産生する細胞が選択される。
【００９１】
ここに記載された抗体またはキメラ抗体はまた常法により毒素分子、放射性同位元素および薬剤と結合させてもよい（Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ｉｎ“Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”Ｄｅ Ｖｉｔａ ＶＴ，Ｈｅｌｌｍａｎ Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（ｅｄｓ）Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；Ｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）ｉｎ“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ”Ｄｅ Ｖｉｔａ Ｖ．Ｔ．，Ｈｅｌｌｍａｎ Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（ｅｄｓ）Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。抗体が結合されるであろう毒素の例としてはリシンまたはジフテリア毒素が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。薬剤または化学療法剤の例にはシクロホスファミドまたはドキソルブシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。放射性同位元素の例には^１３１Ｉが挙げられるが、それに限定されるわけではない。上記の薬品に共有結合で結合する抗体は癌免疫療法においてメラノーマに処置に使用できる。
【００９２】
病変のある部位への局所的投与は、局所適用、注射および組換え的に注入液を発現している細胞を含む多孔性装置の移植、ＭＡＲＴ−１抗体またはキメラ抗体、毒素、薬剤または放射性標識またはそれらの一部が含まれた多孔性装置の移植を含む（これらに限定されるわけではない）本分野では既知の手段により達成される。
【００９３】
上記の抗体およびそれらの抗原結合性断片はキット単独としてまたはインビボ使用のための医薬組成物として供給される。抗体は治療的使用、イムノアッセイにおける診断的使用またはここに記載したＭＡＲＴ−１蛋白質またはペプチドを精製するための免疫アフィニティー試薬としての使用において用いられるであろう。
【００９４】
本発明はまた腫瘍浸潤リンパ球により認識される第二のメラノーマをコードしているｃ（相補的）ＤＮＡ２５（図４Ａおよび４Ｂ；配列番号：２６）と称される、実質的に精製され単離された核酸配列も提供する。ｃＤＮＡ２５によりコードされたメラノーマ抗原を認識するＴＩＬはインビボ腫瘍排除に関連している。ＴＩＬはＨＬＡ−Ａ２に関連してｃＤＮＡ２５によりコードされているメラノーマ抗原を認識した。ｃＤＮＡ２５核酸配列（図４Ａおよび４Ｂ；配列番号：２６）とメラノサイトーメラノーマ特異的蛋白質ｇｐ１００をコードしている遺伝子の核酸配列との比較により、この配列はｇｐ１００として以前に同定された配列とは似てはいるが異なっていることが示された。ｇｐ１００として以前に同定された配列にはｇｐ１００（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号 Ｍ３２２９５；ｇｐ９５とも称される）、Ｐｍｅｌ １７（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号 Ｍ７７３４８；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）８８：９２２８−９２３２）およびＭＥ２０（Ｍａｒｅｓｈｅｔ ａｌ．（１９９４）ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：８７−９５）が挙げられる。
【００９５】
ここに提供されるｃＤＮＡ２５配列（図４Ａおよび４Ｂ；配列番号：２６）はＧｅｎｂａｎｋの以前に報告されたｇｐ１００配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３２２９５）とは２ヌクレオチド異なっており、Ｐｍｅｌ １７配列（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）８８：９２２８−９２３２）とは３ヌクレオチド異なっており、かつ２１塩基対が欠失し、およびＭＥ２０配列（Ｍａｒｅｓｈｅｔ ａｌ．（１９９４）ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：８７−９５）とは１ヌクレオチド異なっている。アミノ酸レベルでは、ｃＤＮＡ２５によりコードされている蛋白質はＧｅｎｂａｎｋのｇｐ１００配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３２２９５）とは１６２位の１アミノ酸、Ｐｍｅｌ １７と比較すると１６２位および２７２位の２つのアミノ酸が異なっており、しかもＰｍｅｌ １７の５８８−５９４位に存在している７つのアミノ酸が含まれていない。従って、ｃＤＮＡ２５はｇｐ１００の遺伝子の異なった一つの形をコードしているように思われる。ｃＤＮＡ２５核酸配列（図４Ａおよび４Ｂ；配列番号：２６）およびアミノ酸配列（図５Ａ；配列番号：２７）と以前に報告されているｇｐ１００配列間の相違は多形、対立遺伝子変異または腫瘍中での突然変異によるものであろう。マウス腫瘍での実験でＴ細胞により認識される新規抗原は不活性化遺伝子のコード領域における点突然変異から生じることが示されている（Ｂｏｏｎ，Ｔ（１９９２）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５８：１７７−２１０）。
【００９６】
本発明はまたここで提供されるｇｐ１００蛋白質配列またはその類似体から誘導される免疫原性ペプチドを提供する。（図５Ａおよび図７Ａ；配列番号：２７および１２１）。これらの免疫原性ペプチドはＴＩＬにより認識されるｇｐ１００蛋白質の抗原性部分（図５Ａおよび図７Ａ；配列番号：２７および１２１）を表している。免疫原性ペプチドの例にはＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ（ペプチドＧ１０−４；配列番号：３３）、ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ（ペプチドＧ１０−５；配列番号：３４）、ＡＬＤＧＧＮＫＨＦＬ（ペプチドＧ１０−２２；配列番号：３５）、ＶＬＫＲＣＬＬＨＬ（ペプチドＧ９−１９；配列番号：３６）、ＶＬＰＳＰＡＣＱＬＶ（ペプチドＧ１０−８；配列番号：３７）、ＳＬＡＤＴＮＳＬＡＶ（ペプチドＧ１０−９；配列番号：３８）、ＳＶＳＶＳＱＬＲＡ（ペプチドＧ９−２１６；配列番号：３９）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（ペプチドＧ９−２８０；配列番号：４０）、ＬＮＶＳＬＡＤＴＮ（ペプチドＧ１０−４００；配列番号：４１）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（ペプチドＧ９_１５４；配列番号：４６；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６２）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶＬ（ペプチドＧ１０_１５４；配列番号：４７；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ９_２０９；配列番号：４８；図７Ａ；アミノ酸２０９から２１７）およびＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ１０_２０８；配列番号：４９；図７Ａ；アミノ酸２０８から２１７）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本発明はさらにｇｐ１００アミノ酸配列（図５Ａおよび図７Ａ；配列番号：２７および１２１）から誘導されるこれらの免疫原性ペプチドの類似体も含んでいる。術語類似体とはこれらの免疫原性ペプチドの機能的特色を示す任意のペプチドを含んでいる。術語類似体はまた上記のペプチドの保存的置換体または化学誘導体も含んでいる。これらの免疫原性ペプチドはＭＡＲＴ−１に対して記載したように、同一の方法または様式により合成的にまたは組換えにより製造されるであろう。
【００９７】
本発明のさらに別の態様では、ｇｐ１００配列（図５Ａおよび図７Ａ；配列番号：２７および１２１）から誘導される免疫原性ペプチドは、Ｔ細胞に渡された場合にペプチドが会合するＭＨＣ分子への結合を促進することにより免疫原性を増加させるように修飾される。例えば、修飾には免疫原性ペプチド配列内の一つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失または付加、または所定の免疫原性ペプチド配列内のアミノ酸の挿入、または所定の免疫原性ペプチド配列内に存在するアミノ酸の誘導体化、または所定の免疫原性ペプチド配列内のアミノ酸の突然変異が含まれるであろう。好適な修飾においては、所定の免疫原性ペプチド配列において少なくとも一つのアミノ酸が置換されるかまたは置き換えられる。所定の免疫原性ペプチド配列を構成する任意のアミノ酸は本発明により修飾されるであろう。任意のアミノ酸が免疫原性ペプチド配列内の所定のアミノ酸の置換または置き換えに使用されるであろう。修飾は免疫原性ｇｐ１００ペプチド内のどのアミノ酸位置で生じてもよい。修飾ｇｐ１００ペプチドにはＴ細胞に渡された場合にペプチドが会合するＭＨＣ分子への促進された結合を示す任意の修飾ｇｐ１００ペプチドが含まれるつもりである。
【００９８】
例えば、ＨＬＡ−Ａ２に関連してＴ細胞に認識されるペプチドは９から１０のアミノ酸の長さである。好適には、ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの促進された結合のためには、ペプチド中の二番目の位置および最後の位置は疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。二番目の位置はロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシンまたはアラニンのような脂肪族疎水性アミノ酸であろうが、それらに限定されるわけではない。ペプチドの最後の位置は（ペプチドの長さに依存して九または十番目の位置）バリン、ロイシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、またはトレオニンのような脂肪族疎水性アミノ酸であろうが、それらに限定されるわけではない。
【００９９】
免疫原性ペプチドの一番目および三番目の位置は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸で置換または置き換えられていてもよい。ペプチドの一番目および三番目の位置に使用できるアミノ酸の例としてはアラニン、ロイシン、リジン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、リジンまたはチロシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１００】
本態様に従って修飾されるであろうｇｐ１００ペプチドの例としてはＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ（ペプチドＧ１０−４；配列番号：３３）、ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ（ペプチドＧ１０−５；配列番号：３４）、ＡＬＤＧＧＮＫＨＦＬ（ペプチドＧ１０−２２；配列番号：３５）、ＶＬＫＲＣＬＬＨＬ（ペプチドＧ９−１９；配列番号：３６）、ＶＬＰＳＰＡＣＱＬＶ（ペプチドＧ１０−８；配列番号：３７）、ＳＬＡＤＴＮＳＬＡＶ（ペプチドＧ１０−９；配列番号：３８）、ＳＶＳＶＳＱＬＲＡ（ペプチドＧ９−２１６；配列番号：３９）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（ペプチドＧ９−２８０；配列番号：４０）、ＬＮＶＳ ＡＤＴＮ（ペプチドＧ１０−４００；配列番号：４１）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（ペプチドＧ９_１５４；配列番号：４６；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６２）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶＬ（ペプチドＧ１０_１５４；配列番号：４７；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ９_２０９；配列番号：４８；図７Ａ；アミノ酸２０９から２１７）およびＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ１０_２０８；配列番号：４９；図７Ａ；アミノ酸２０８から２１７）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０１】
例えば、免疫原性ｇｐ１００ペプチドＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号：４６）から誘導される修飾ｇｐ１００ペプチドは式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＧＱＹＷＱＸ_４（配列番号：１２３）を持っており、式中：
Ｘ_１は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはアラニン、ロイシン、リジン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジンまたはセリン、アスパラギン酸またはチロシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_２は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、イソロイシン、アラニン、トレオニン、グリシンまたはバリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。最も好適であるのは；ロイシン、メチオニンまたはイソロイシンである。
【０１０２】
Ｘ_３は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはアラニン、ロイシン、リジン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、リジンまたはチロシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_４は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン、トレオニンまたはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０３】
修飾ペプチドの例は表１５に示されている。好適な修飾ペプチドはＫＩＷＧＱＹＷＱＶ（Ｇ９−１５４−２１）（配列番号：７０）である。
もしくは、免疫原性ｇｐ１００ ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（Ｇ９−２０９；配列番号：４８）が修飾され、そのような修飾ペプチドは一般式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＱＶＰＦＳＸ_４（配列番号：１２４）を持っており、式中：
Ｘ_１は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_２は任意の疎水性アミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、またはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_３は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_４は任意の疎水性アミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリンまたはトレオニンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０４】
ＩＴＤＱＶＰＦＳＶから誘導される修飾ペプチドの例が表１６に示されている。好適にはペプチドＦＬＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ９−２０９−１Ｆ２Ｌ）が使用される。
例えば、免疫原性ｇｐ１００ペプチドＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（Ｇ９−２８０；配列番号：４０）から誘導される修飾ｇｐ１００ペプチドはまたＭＨＣクラスＩ分子、好適にはＨＬＡ−Ａ２またはそのサブタイプへの結合を促進するように修飾される。
【０１０５】
修飾ペプチドは一般式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＰＧＰＶＴＸ_４（配列番号：１２５）を持っており、式中：
Ｘ_１は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_２は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、またはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_３は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；
Ｘ_４は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニンまたはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０６】
ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（Ｇ９−２８０；配列番号：４０）から誘導される修飾ペプチドの例は表１７に示されている。好適な修飾ペプチドはＹＬＥＰＧＰＶＴＶ（Ｇ９−２８０−９Ｖ）（配列番号：１０４）である。
【０１０７】
本発明にはここに開示したｇｐ１００配列（図５Ａ；配列番号：２７および図７Ａ；配列番号：１２１）から誘導されるこれらの修飾ペプチドの類似体もさらに含まれる。術語類似体には上記のこれらの修飾ペプチドの機能的特色を示す任意のペプチドが含まれるつもりである。これらの修飾ペプチドは常法により合成的にまたは組換え的に提供される。
【０１０８】
別の態様では、表１５−１７に示されたようなｇｐ１００アミノ酸配列または修飾ｇｐ１００ペプチドまたはそれらの類似体は治療的にまたは予防的にワクチンとして使用される。予防的には、ワクチンはメラノーマが明白になる前に投与される。これらのペプチドの予防的投与は哺乳類においてメラノーマを防止または減少させるために働くべきである。
【０１０９】
好適な態様において、メラノーマの高い危険性を持つ哺乳類（好適にはヒト）はこれらのワクチンで予防的に処置される。もしくは、メラノーマまたは転移性メラノーマで表される腫瘍抗原への患者自信の免疫応答を促進するために治療的にワクチンが投与されるであろう。免疫原として働くワクチンは細胞、ｇｐ１００免疫原性ペプチドをコードしている核酸配列を運ぶ組換え体発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物または発現された蛋白質を含んでいる培養上清液であろう。これらの免疫原性ペプチドをコードしている核酸配列が導入される発現ベクターはＭＡＲＴ−１で記載したものと同一である。もしくは、免疫原は部分的または実質的に精製された組換え体ｇｐ１００ペプチドまたはそれらの類似体である。
【０１１０】
投与されるべき免疫原は純粋なまたは実質的に純粋な形でも可能であるが、上記ＭＡＲＴ−１で記載した医薬組成物、処方または製剤として存在させるのが好適である。ワクチン接種は前にＭＡＲＴ−１で記載したような常法により実施できる。
【０１１１】
本発明のさらに別の態様において、一つまたはそれ以上のメラノーマ抗原に対する多価ワクチンが提供される。そのような多価ワクチンはＭＡＲＴ−１蛋白質ペプチドまたは修飾ペプチドのすべてまたは一部、またはｇｐ１００ペプチドまたは修飾ペプチドまたはそれらの組み合わせを含んでいる。
【０１１２】
メラノーマ抗原をコードしている遺伝子の同定において従来は抗原で免疫化または前もって処置したメラノーマ患者から単離されたＰＢＬを利用していた（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４７；Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５；Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１４５３−１４５７）。好適な方法は腫瘍を持つ患者を免疫化することなく、該患者からのＴＩＬにより認識される腫瘍抗原をコードしている遺伝子を同定することである。同定された遺伝子は増殖している癌に対する自然の免疫応答に含まれた抗原をコードしているのでそのような方法で可能性が大きくなる。従って、本発明はメラノーマを持つ患者の腫瘍からの腫瘍浸潤性リンパ球単離物（ＴＩＬ）を用いるｃＤＮＡ発現クローニングを利用するメラノーマ抗原コード遺伝子の同定法も提供する。本方法は以下の工程を含んでいる：（ａ）メラノーマを持つ哺乳類の腫瘍から腫瘍浸潤性リンパ球を単離し；（ｂ）哺乳類細胞株内にメラノーマｃＤＮＡライブラリーを導入し；（ｃ）該哺乳類細胞を該ＴＩＬに暴露し；（ｄ）該ＴＩＬにより認識される該哺乳類細胞中の該ｃＤＮＡによりコードされている抗原の発現をスクリーニングし；および（ｅ）該抗原に対応する該ｃＤＮＡを単離する。工程（ａ）の腫瘍浸潤性リンパ球はメラノーマを持つ患者の病巣、皮下組織または内臓を含む（しかしこれらに限定されるわけではない）から単離されるであろう。工程（ｂ）で使用されるｃＤＮＡライブラリーの製造に使用される細胞の例としては新鮮なまたは培養されたメラノーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。好適には、ｃＤＮＡライブラリーはメラノーマ抗原を発現していない哺乳類細胞内へ導入される。もしＴＩＬによる認識のための所望のＨＬＡハロタイプを発現していない非ヒト哺乳類細胞またはヒト細胞が工程（ｂ）で使用されるならば、そのような細胞は以下に記載するようにＨＬＡ遺伝子で同時トランスフェクションできる。工程（ｂ）で使用できる細胞の例としては乳癌細胞株ＭＤＡ２３１（ＡＴＣＣ＃ ＨＴＢ２６）またはＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１６５１）のような腫瘍細胞株が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。使用できるＭＨＣ遺伝子の例としてはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ遺伝子、好適であるのはＨＬＡ−Ａ２およびそのサブタイプ（Ｚｅｍｍｏｕｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４０：２２１−２２８）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。使用するのに適したＭＨＣ遺伝子はｃＤＮＡライブラリー源であった腫瘍細胞のハロタイプにより決定される。標準的な方法がＴＩＬ単離物により認識されるハロタイプの決定に使用できる（ＡＳＨＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版 １９９０）。ＴＩＬにより認識される抗原を発現しているｃＤＮＡクローンを含む細胞の認識を如何にして評価するかの例としてはγインターフェロンアッセイ、ＴＮＦ分泌（Ｖａｎ ｄｅ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４７）または認識された抗原をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の溶解などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。そのようなアッセイは当業者には既知の常法により実施される。ｃＤＮＡを含むベクターの隣接部位に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによりメラノーマ抗原が単離できる。ＴＩＬにより認識される抗原に対応するｃＤＮＡを如何にして単離するのかの例としてはＰＣＲが挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【０１１３】
メラノーマ抗原をコードしている遺伝子または核酸配列が同定されたら、次の工程はこれらの遺伝子によりコードされている蛋白質の抗原性部分またはエピトープを同定することである。従って、本発明のさらに別の態様では、ＭＡＲＴ−１蛋白質（図１；配列番号：２）またはｇｐ１００蛋白質（図５Ａおよび図７Ａ；配列番号：２７および配列番号１２１）の予測されるアミノ酸配列から誘導されるペプチドの免疫原性を評価するための方法が提供される。本方法は以下の工程を含んでいる：（ａ）ＭＡＲＴ−１（図１；配列番号：２）またはｇｐ１００（図５Ａおよび図７Ａ；配列番号：２７および配列番号１２１）アミノ酸配列に基づく多数のペプチドを調製し；（ｂ）少なくとも一つの該ペプチドと哺乳類細胞株をインキュベートし；（ｃ）該ペプチドとインキュベートした該哺乳類細胞を腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に暴露し；および（ｄ）該ペプチドとインキュベートした該細胞をＴＩＬの認識でスクリーニングする。約２５から５のアミノ酸、より好適には２０から１０のアミノ酸、および最も好適には９−１０のアミノ酸のペプチドを使用するのが好ましい。工程（ｂ）で使用される細胞の例としてはＴ２細胞（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４５：４４９−４５２）またはＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３７１４−３７２５）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ペプチドとインキュベートされた細胞の認識をどのように評価するのかの例としては^５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイ（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４９−４５２）またはγ−ＩＦＮまたはＴＮＦ分泌のようなリンホカインアッセイ（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４６：３６７４−６８１）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１４】
Ｔ細胞認識抗原はＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成する。すべての哺乳類種のＭＨＣ座は多数の遺伝子を含んでおり、高度に多形である。異なったＭＨＣ分子またはハロタイプ型は異なった抗原に結合する。ヒトにおいてＨＬＡ複合体はクラスＩ分子をコードしているＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ遺伝子座を含んでいる。リンパ球はＨＬＡクラスＩ分子に関して腫瘍抗原を認識するであろう。もし組換え体ＭＡＲＴ−１発現ベクターを含む細胞がＴＩＬでスクリーニングされるがヒト細胞ではなく（ＣＯＳ細胞のような）、または所望のハロタイプを発現しないならば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子を含む発現ベクターが細胞内へ導入されるであろう（実施例１参照）。これは本発明のさらに別の態様を表している。ＭＡＲＴ−１抗原およびＨＬＡ抗原を発現している細胞は特異的ＭＨＣクラスＩ制限型に関連して腫瘍抗原の存在を検出するためにＴＩＬでスクリーニングできる。適したハロタイプはライブラリーが誘導される腫瘍のハロタイプにより決定される。使用できるＭＨＣクラスＩ遺伝子の例としてはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好適なＭＨＣ特異性または制限型の例としてはＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２．１サブタイプ（Ｚｅｍｍｏｕｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４０：２２１−２２８）のようなＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。最も好適であるのはＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子である。
【０１１５】
獣医学的な使用もまたここに記載された組成物および治療的応用により含まれているつもりである。
【実施例】
【０１１６】
本明細書で引用したすべての本、文献および特許は全文のまま引例として含まれている。以下の実施例は本発明の種々の態様を例示するものであり、その範囲を限定しているものではない。
【０１１７】
腫瘍内浸潤自己由来Ｔ細胞により認識される共有されたヒトメラノーマ抗原の遺伝子コードのクローニング
実施例１
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生および細胞株の培養
Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１に記載されているように、ＣＴＬは切り出された腫瘍標本から細胞の懸濁液を６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）と３０−７０日培養することにより発生させた。ＴＩＬ５０１およびＴＩＬ１２３５は主としてＣＤ８^＋であり、進行した転移性メラノーマを持つ患者の腫瘍標本から誘導された。ＣＤ８^＋Ｔ細胞クローン、ＴＩＬ５０１．Ａ４２は限界希釈法により確立され、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と照射された（一週間の一度を４から６回）自己由来腫瘍細胞とともに培養された。
【０１１８】
メラノーマ細胞株３９７ｍｅｌ、５０１ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ、５３７ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ、９５２ｍｅｌおよびエプスタインーバールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞株、５０１ＥＢＶＢ、８３６ＥＢＶＢは我々の研究室で確立され、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ／Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ Ｎ．Ｙ．）培地中で培養された（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３７１４−３７２５）。正常培養メラノサイト、ＮＨＥＭ４８３、ＮＨＥＭ４９３、ＮＨＥＭ５２７、ＮＨＥＭ５２９、ＮＨＥＭ５３０、ＮＨＥＭ５３３、ＮＨＥＭ６１６およびＮＨＥＭ６８０はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入され、ＦＭ７２５、ＦＭ８０１、ＦＭ９０２はＭ．Ｈｅｒｌｙｎ，Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡから提供を受け、ＨＡ００２はＲ．Ｈａｌａｂａｎ，Ｙａｌｅ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴから提供を受け、メラノサイト増殖培地（ＭＧＭ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で培養した。メラノーマ細胞株Ｃ３２、ＲＰＭＩ７９５１、ＷＭ１１５、Ａ３７５、ＨＳ６９５Ｔ、Ｍａｌｍｅ３Ｍ、結腸癌細胞株Ｃｏｌｌｏ、ＳＷ４８０、ＷｉＤｒ、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１、ＭＣＦ７、ＨＳ５７８、ＺＲ７５、神経芽細胞腫細胞株ＳＲ−Ｎ−ＳＨ、膠腫細胞株Ｕ１３８ＭＧ、ＨＳ６８３、Ｈ４、肉腫細胞株１４３Ｂ、アデノウイルスタイプ５で形質転換された胎児性腎臓細胞株２９３はＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入され、腎癌細胞株ＵＯＫ１０８およびＵＯＫ１１７はＭ．Ｌｉｎｅｈａｎ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。小細胞肺癌細胞株Ｈ１０９２はＪ．Ｄ．Ｍｉｎｎａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸから提供された。Ｅｗｉｎｇ肉腫細胞株ＴＣ７１、ＲＤ−ＥＳ、６６７４はＭ．Ｔｓｏｋｏｓ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供された。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳはＯ．Ｍ．Ｅｌ Ｂａｄｒｙ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。形質細胞腫細胞株ＨＭＹ−Ｃ１ＲおよびＭ１線維芽細胞株はＷ．Ｂｉｄｄｉｓｏｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。腎臓上皮細胞ＫＡＭ、ＷＬＣはＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣのＤ．Ｊ．Ｈａｚｅｎ−ＭａｒｔｉｎおよびＤ．Ａ．Ｓｅｎｓから提供された。サル腎臓細胞株ＣＯＳ７はＷ．Ｌｅｏｎａｒｄ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。
【０１１９】
細胞毒性アッセイ
^５１Ｃｒ放出アッセイはＫａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１に記載されているように実施された。簡単に記すと、^５１Ｃｒで標識された５０００の標的細胞を異なった数のエフェクター細胞と混合し、５時間インキュベートした。次に上清液を集め、放射活性を測定して特異的溶解のパーセントを計算した。
【０１２０】
ＩＦＮ−γ放出アッセイ
９６フラットウェルマイクロプレートを用い、ウェル当たり１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む３００μｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、５万から１０万の応答細胞および４ｘ１０^４−１０^５の刺激要因細胞を混合した。２０時間インキュベーションした後、１００μｌの上清を集め、抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ，ＣＡ）で被覆した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プレート（Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、プレートを３回洗浄し、ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γポリクローナル抗体（Ａｂ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ，ＣＡ）の１：２０００希釈液を１００μｌ加えて３７℃で２時間インキュベートした。プレートは３回洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の１：２０００希釈液を１００μｌ加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、１００μｌの４ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェノール ホスフェート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、室温、暗所にて１０−２０分インキュベートし、反応を停止させるために２５μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えた。４０５ｎｍの波長で光学密度を測定し、同一のアッセイで測定された組換え体ＩＦＮ−γ標品（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と比較してＩＦＮ−γの濃度を計算した。
【０１２１】
ｃＤＮＡ発現クローニング
ｃＤＮＡライブラリーは（Ｍｉｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ；８３：１３７−１４６；Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｉ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５１６７−５１７１）に記載されているようにＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞株５０１ｍｅｌからのポリＡ ＲＮＡから構築された。簡単に記すと、第一鎖ｃＤＮＡはリンカープライマーＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣ（Ｔ）_４０（配列番号：４２）で合成され、続いて第二鎖ｃＤＮＡ合成が行われた。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで処理した後、二つのオリゴヌクレオチドＣＣＡＩＴＣＧＣＧＡＣＣ（配列番号：４３）およびＧＧＴＣＧＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡ（配列番号：４４）からなるＳｆｉＩアダプターをｃＤＮＡの末端に連結した。ｃＤＮＡはＳｆｉＩで消化し、消化された断片はスパンカラムを通して単離された。ｃＤＮＡは次にＳｆｉＩ消化により調製されたバクテリオファージλｐＣＥＶ２７（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）８８：５１６７−５７７１）ベクターアームと混合し、インビトロ パッケージングが実施された。
【０１２２】
メラノーマ抗原をスクリーニングするため、改良リン酸カルシウム法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、約１０^７クローンを含む増幅ｃＤＮＡライブラリーがＨＬＡ−Ａ２^＋抗原非発現細胞株、ＭＤＡ２３１クローン７およびＡ３７５クローン１−４内へトランスフェクトされた。Ｇ４１８（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）選択後、個々のコロニーを単離し、９６ウェルマイクロプレート中で培養してレプリカプレートを作製した。５ｘ１０^４ＴＩＬ１２００および５ｘ１０^４ＴＩＬ１２３５の混合物を、コンフルエント近くまで増殖しているトランスフェクト体を含むマイクロプレートのウェルに加え、２０時間インキュベートした。上清を集め、ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。
【０１２３】
陽性トランスフェクト体のゲノムＤＮＡからトランスフェクトされた遺伝子を取り出すため、挿入された遺伝子に隣接するＳＰ６およびＴ７プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された。増幅生成物はｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。ｃＤＮＡ２２および２３については、完全長ｃＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ断片が発現ベクターｐｃＤＮＡ３（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へサブクローン化された。
【０１２４】
クローン化ｃＤＮＡが腫瘍抗原をコードしているかどうかを試験するため、クローン化遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３がＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｅｅｄ，Ｂ．およびＡｒｕｆｆｏ，Ａ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：３３６５−３３６９）によりＣＯＳ７細胞株内へ過渡的にトランスフェクトされた。簡単に記すと、６ウェルプレートを用い、ウェル当たり３ｘ１０^５の細胞を１００μｇのＤＥＡＥデキストラン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭのクロロキンおよびクローン化遺伝子および／またはｐｃＤＮＡ−ＨＬＡ−Ａ２．１（Ｚｅｍｍｏｕｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４０：２２１−２２８）を含むｐｃＤＮＡ３を１μｇ含む０．７５ｍｌのＤＭＥＭ中、３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去した後、１０％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＳ緩衝液を加えて２分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、７．５％ＦＣＳ ＤＭＥＭ中で２日間インキュベートした。２９３細胞株はリポフェクタミン（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用い、使用説明書に従って過渡的にトランスフェクトされた。インキュベーション後、トランスフェクトされたＣＯＳ７または２９３細胞のＴＩＬからＩＦＮ−γ放出を媒介する能力が評価された。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子の発現はフローサイトメトリーにより試験された。安定なトランスフェクト体はリン酸カルシウム法により作製され、個々のコロニーおよびプールされたトランスフェクト体は細胞毒性およびＩＦＮ−γ放出アッセイによりＴＩＬへの反応性が試験された。
【０１２５】
クローン化遺伝子のＤＮＡ配列決定はｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰを用いるジデオキシ鎖停止法により実施された。ＤＮＡおよび蛋白質配列はＧｅｎｅＢａｎｋのＧＣＧプログラム、ＥＭＢＬデータライブラリー ヌクレオチドデータベースおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＧｅｎＰｅｐｔ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ蛋白質データバンク蛋白質データベースにより分析された。
【０１２６】
ノーザンブロット分析
全ＲＮＡはグアニジンーイソシアネートー塩化セシウム遠心分離法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：５２９４）により単離された。正常組織からの全ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ，（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入された。全ＲＮＡの１０から２０μｇが１％アガロース ホルムアルデヒドゲルの電気泳動にかけられ、ナイロン膜（Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶ 膜、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。クローン２２からの完全長ｃＤＮＡを含むＳａｌＩ消化断片およびβ−アクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）はランダムプライミングにより標識され、プローブとして使用された。プローブとのハイブリダイゼーションはＱｕｉｋＨｙｂプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って６８℃で２−１６時間行われた。膜を２回２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて６０℃にて１５分間、１回０．１ＸＳＳＣを用いて６０℃にて１５分間洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。
【０１２７】
メラノーマ患者からの培養ＴＩＬの特性付け
ＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ患者から複数のＴＩＬが確立され、ＨＬＡ−Ａ２^＋およびＨＬＡ−Ａ２⁻患者からのメラノーマ細胞株の溶解が試験された。患者のＨＬＡ型検査は通常のＨＬＡ型検査技術により実施された。クラスＩ ＭＨＣ抗原を最もよく発現し、メラノーマ抗原の認識の優勢な制限要素であることが示されている（Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９２−１６９４）のでＨＬＡ−Ａ２が選択された。ＴＩＬ５０１、ＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ１２００はＨＬＡ−Ａ２制限様式で共有メラノーマ抗原の特異的認識を示した。ＴＩＬ５０１．Ａ４２は限界希釈によりＴＩＬ５０１から確立されたＴ細胞クローンであった。これらのＴＩＬは種々のＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマまたはメラノサイト株と同時培養された場合には溶解またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカインの放出を起こすが、ＨＬＡ−Ａ２⁻メラノーマ細胞株または乳癌細胞株ＭＤＡ２３１を含むＨＬＡ−Ａ２^＋非メラノーマ細胞株では起こさない。二つの代表的な実験が表１に示されている。従って、これらのＣＴＬはメラノサイト系特異的抗原から誘導される非突然変異体ペプチドを認識するように思われる。
【０１２８】
Ｔ細胞により認識されるメラノーマ抗原のｃＤＮＡコードのクローニング
ＨＬＡ−Ａ２^＋５０１ｍｅｌメラノーマ細胞株からのｃＤＮＡライブラリーを二つの非常にトランスフェクト可能なＨＬＡ−Ａ２．１^＋癌細胞株ＭＤＡ２３１およびＡ３７５内へトランスフェクトした。これらの細胞株はメラノーマ特異性ＴＩＬにより溶解されないが、Ｍ１_{５９−６６}ペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；一文字コード（配列番号：４５）、インフルエンザマトリックス蛋白質またはＭ１遺伝子を含む組換え体ワクシニアウイルスの感染を誘導（データは示されていない））でインキュベーション後にＨＬＡ−Ａ２制限インフルエンザＭ１特異性ＣＴＬにより溶解される。従って、これらの細胞株は正常抗原プロセッシングおよび発生能力を示すが、関連メラノーマ抗原の発現が欠けているためこれらのメラノーマ特異性ＴＩＬにより溶解されない。Ｇ４１８で選択後、各々の細胞株から約６７００のトランスフェクトされたクローンが単離され、マイクロプレートで増殖された。ＩＦＮ−γ放出アッセイを用い、２１のＭＤＡ２３１および２７のＡ３７５陽性クローンが単離され、再スクリーニングされた。これらのクローンの内、８つのＭＤＡ２３１および７つのＡ３７５クローンが二回めのスクリーニングアッセイで陽性であった。
【０１２９】
組み込まれた遺伝子をとるため、これらの陽性トランスフェクト体からのゲノムＤＮＡを用い、挿入遺伝子に隣接するＳＰ６およびＴ７プライマーでＰＣＲが行われた。ＭＤＡ−２２およびＭＤＡ−２３トランスフェクト体からの１．６ｋｂバンドを含む１から２の鮮明なバンドを示した７つのトランスフェクト体から増幅された８つの遺伝子がｐＣＲＩＩクローニングベクター内へサブクローン化され、さらにｐｃＤＮＡ３真核生物発現ベクター内へクローン化された。ｃＤＮＡ２２プローブによるノーザンブロット分析により検出された１．６ｋｂバンドは、この断片が完全長ｃＤＮＡであったことを示唆した。
【０１３０】
クローン２２または２３からのｃＤＮＡを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３のＣＯＳ７または２９３細胞内への過渡的トランスフェクションはＨＬＡ−Ａ２．１と一緒に加えるとＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ５０１．Ａ４２にＩＦＮ−γの特異的放出により示される反応性を与えた（表２、実験１および２）。これらのｃＤＮＡ断片のＭＤＡ２３１またはＡ３７５ｍｅｌ細胞株内への安定なトランスフェクションもまたＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ５０１．Ａ４２に反応性を与えた（表２、実験３）。ＴＩＬ５０１．Ａ４２はｃＤＮＡ２２で安定にトランスフェクションされたＭＤＡ２３１を溶解できた（データは示されていない）。以上の結果は、メラノーマ患者からのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬにより認識されるメラノーマ抗原をこれらのｃＤＮＡがコードしていることを示している。別のクローン、ＭＤＡ−２５のトランスフェクションはＴＩＬ１２００のみからインターフェロン−γの放出を刺激した。このｃＤＮＡの特性付けにより、それはモノクローナル抗体ＨＭＢ４５により認識され、従来記述されているメラノーマ抗原ｇｐ１００とは類似しているものの異なっていることが明らかにされた。このクローンは実施例３により詳細に記載されている。
【０１３１】
【表１Ａ】

【０１３２】
【表１Ｂ】

【０１３３】
ＴＩＬ５０１．Ａ４２およびＴＩＬ１２３５はほとんどのＨＬＡ−Ａ２メラノーマ細胞株を溶解し、ＨＬＡ−Ａ２メラノーマおよびメラノサイトと培養した場合ＩＦＮ−γを分泌した。
^＊５１Ｃｒ放出アッセイはＴＩＬ５０１．Ａ４２に対してはＥ：Ｔ＝２０：１で、ＴＩＬ１２３５に対しては４０：１で行われた。乳癌細胞株ＭＤＡ２３１を除いてすべての標的はメラノーマ細胞株である。
^＊＊ＴＩＬおよび刺激細胞を２０時間一緒に培養した後、上清中のＩＦＮ−γが測定された。５０１ｍｅｌおよび５８６ｍｅｌはメラノーマ細胞株である。他のすべては正常メラノサイト株である。
^＋ＬＡＫ：リンホカイン活性化キラー細胞。
^＋＋ＴＩＬ５８６はクラスＩ ＭＨＣ制限メラノーマ特異性ＴＩＬであり、ＨＬＡ−Ａ２により制限されない。
【０１３４】
クローン２２および２３のｃＤＮＡ配列はＰＣＲにより導入された変化と信じられる単一の塩基を除いて同一であった。二つの他の独立して増幅された断片もまたこの領域を明らかにするために配列決定され、共通配列が図１に示されている。この遺伝子中の最も長い読み枠は１３ｋｄの１１８アミノ酸蛋白質に対応する３５４の塩基から成っている。この配列は確立されたデータベース内のどの完全ヌクレオチドまたは蛋白質配列とも有意な類似性を示さなかった。アミノ酸２７−４７はＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド（Ｆａｌｋ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６；Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３；Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７；Ｎｉｊｍａｎ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１２１５−１２１９）を含むであろう疎水領域から成っている。ｃＤＮＡ２２および２３によりコードされている抗原はＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞−１により認識されるメラノーマ抗原）と称された。発生させた１０のＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬの９つがＭＡＲＴ−１を認識し、４つがここに記載し、単離されたｇｐ１００の型を認識したが（実施例３参照）、どれもＭＡＧＥ−１を認識しなかった（Ｚａｋｕｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５−８；データは示されていない）。
【０１３５】
【表２】

【０１３６】
ＤＥＡＥデキストラン法によりＨＬＡ−Ａ２．１および／またはｃＤＮＡ２２を含むｐｃＤＮＡ３で過渡的にトランスフェクトされたＣＯＳ７または２９３細胞株（実験１＆２）、またはｃＤＮＡ２３で安定にトランスフェクトされたＡ３７５またはＭＤＡ２３１細胞株（実験３）と２０時間一緒にＴＩＬをインキュベートした後に上清中のＩＦＮ−γが測定された。ＩＦＮ−γはＴＩＬがｃＤＮＡ２２または２３でトランスフェクトされたＨＬＡ−Ａ２^＋とインキュベートされた場合のみに分泌された。
^＊刺激剤なしのＴＩＬ単独により分泌されたＩＦＮ−γ（＜５０ｐｇ／ｍｌ）は差し引かれている。
^＋実施されなかった。
【０１３７】
【表３】

【０１３８】
遺伝子２２の完全長ｃＤＮＡをプローブとして、１０−２０μｇの全ＲＮＡをノーザンブロット分析で調べた。ほとんどのメラノーマ、試験されたすべてのメラノサイト株および網膜が陽性であった。
【０１３９】
ＭＡＲＴ−１の発現
ＭＡＲＴ−１をコードしている遺伝子の発現を評価するためメラノーマ、メラノサイトおよび非メラノーマ癌細胞株および正常組織を含む種々の細胞株のノーザンブロット分析が実施された（表３）。１０のＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞株の内の７つ、４つのすべてのＨＬＡ−Ａ２⁻メラノーマ細胞株、試験された７つのすべてのメラノサイト株がＭＡＲＴ−１ ＲＮＡ発現が陽性であった。最近我々の研究室で確立されたすべてのＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞株はこのノーザン分析においてＭＡＲＴ−１ ＲＮＡを発現した。表３に示した１０のＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞株においてＭＡＲＴ−１発現とＴＩＬ５０１．Ａ４２による溶解の間には完全な相関がある。ＭＡＲＴ−１ Ａｇを認識するＴＩＬ５０１．Ａ４２は試験された１７のＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞株の１３（７６％）を溶解させた（データは示されていない）。ノーザンブロット分析によるｍＲＮＡ発現が試験された１０の正常ヒト組織では網膜のみが陽性であった。Ｔ細胞、Ｂ細胞、腎臓上皮細胞または線維芽細胞または１９の非メラノーマ腫瘍では陽性は観察されなかった。従って、ＭＡＲＴ−１は皮膚および網膜からのメラノサイト系細胞で発現され、またメラノーマ細胞でも発現されるこれまでに記載のない抗原であるようである。
【０１４０】
Ｔ細胞クローンおよび免疫選択メラノーマクローン（Ｋｎｕｔｈ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：２８０４−２８０８；Ｗｏｌｆｅｌ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：７９７−８１０）の一団を用いた研究、並びにメラノーマ細胞からのＨＰＬＣ分画ペプチド分析の研究（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２９５５−２９６３；Ｓｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３７１９−３７２７）は免疫応答を惹起できる複数の抗原性ペプチドがメラノーマ上に存在することを示唆している。ｃＤＮＡクローニングにより、メラノーマ抗原をコードしている二つの遺伝子が同定されている；ＭＡＲＴ−１（図１；配列番号：１）およびｇｐ１００遺伝子（実施例３参照；図４Ａおよび４Ｂ；配列番号：２６）。ＭＡＲＴ−１およびここで同定されたｇｐ１００の型（図４＆５Ａ；配列番号：２６および２７）は両方ともＨＬＡ−Ａ２．１制限ＴＩＬで認識される。ＭＡＲＴ−１抗原は約１３ｋｄの１１８アミノ酸の蛋白質である。ＭＡＲＴ−１に関する遺伝子またはアミノ酸配列はこれまで報告されていない。
【０１４１】
ＭＡＲＴ−１ ＲＮＡは１４のＨＬＡ−Ａ２．１陽性または陰性メラノーマ株の内の１１、７つのメラノサイト株の内の７つで発現された。網膜組織を除き、試験された正常組織、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、腎臓上皮株、線維芽細胞株または結腸、乳、脳、腎臓、肺または骨の癌からの１９の腫瘍細胞株ではＭＡＲＴ−１発現は観察されなかった。
【０１４２】
繰り返しのインビボまたはインビトロ免疫化に続いて末梢血リンパ球に由来するＴ細胞により認識される別のメラノーマ抗原、ＭＡＧＥ−１が記載されている（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４７）。
【０１４３】
メラノーマ腫瘍抗原に関連した遺伝子の同定は、ウイルスまたは細菌ベクター系内へのこれらの遺伝子の導入に基づく癌患者の免疫療法において活性で特異的な免疫化法に対する新規な可能性を開くものである。ＭＡＲＴ−１のようなメラノサイトーメラノーマに対して誘導された免疫反応は正常細胞に対しても発生されるであろう可能性が存在する。多分抗メラノサイト免疫反応から生じる白斑がメラノーマ患者においての好ましい予後に付随することが報告されており（Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９：６８９−６９５）；Ｂｙｓｔｒｙｎ，Ｊ−Ｃ，ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２３：１０５３−１０５５）、化学免疫療法に応答しても報告されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：１３３８−１３４３）。抗メラノサイトーメラノーマ反応性を持つＴＩＬが進行したメラノーマの患者に投与されており（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１９：１６７６−１６８０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ａ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：１８０−１９９）、散在性白斑がこれらの患者に見られるが、網膜細胞上のこれらのメラノサイト抗原の発現に関係した不利な眼科学的影響は観察されなかった。
【０１４４】
ＨＬＡ−Ａ２は約５０％の個体に存在しており、ＨＬＡ−Ａ２制限ＭＡＲＴ−１抗原もまたメラノーマ上に広く発現されているので、ＭＡＲＴ−１による免疫化は活性な免疫療法の開発に特に有用であろう。
【０１４５】
実施例２
ＭＡＲＴ−１の免疫原性エピトープの特性付け
ＴＩＬからのメラノーマ特異的ＣＴＬ株およびクローンの発生
メラノーマ特異性ＣＴＬ株は、前に報告されているように（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３）転移性メラノーマから作製される単一細胞懸濁液を６０００Ｕ／ｍｌのＩＬ２（Ｃｅｔｕｓ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）と培養することにより発生させた。Ｔ細胞クローン、Ａ４２は患者５０１から限界希釈法により確立された。
【０１４６】
ＣＴＬによる抗原認識の評価
Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８に記載されているように、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＦＳおよびＴＮＦ−αを測定するために^５１Ｃｒ放出アッセイおよびＥＬＩＳＡを用いるサイトカイン放出アッセイが実施されＴＩＬの反応性が分析された（実施例１参照）。メラノーマ細胞株は本研究室で確立された。ＴＩＬによる既知の抗原の認識の分析のため、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００かまたはチロシナーゼ関連蛋白質（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：２８０７）をコードしているｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞株、並びにＨＬＡ−Ａ２．１ ｃＤＮＡがＴＩＬと２０時間インキュベートされ、上清へ分泌されたＩＦＮ−γが実施例１に記載されたようにＥＬＩＳＡにより測定された。プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ ＤＩｅｇｏ，ＣＡ）中のＭＡＲＴ−１（実施例１参照）またはｇｐ１００（実施例３参照）コード化ｃＤＮＡはＴＩＬ１２３５またはＴＩＬ１２００を各々スクリーニングすることにより５０１ｍｅｌメラノーマｃＤＮＡからクローン化された（実施例１参照）。ｐＣＥＶ２７プラスミド中のチロシナーゼ関連蛋白質（ｇｐ７５）はｇｐ７５の報告されている配列（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：２８０７）に基づいたＰＣＲにより発生させたプローブを用いて５０１ｍｅｌメラノーマｃＤＮＡライブラリーから単離された。
【０１４７】
ペプチド合成および抗原性ペプチドの同定
ペプチドはＧｉｌｓｏｎ ＡＭＳ４２２多ペプチド合成機を用いて固相法により合成された。ペプチドはＶｙｄａｃ Ｃ−４カラムを用いて０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルで溶出するＨＰＬＣにより精製した。抗原性ペプチドを同定するため、各々のペプチドと２時間前もってインキュベートしたＴ２細胞株のＴＩＬ溶解が^５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイを用いて測定された。
【０１４８】
ＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＴＩＬ
ＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＣＴＬ株およびクローン，Ａ４２は１０人のメラノーマ患者の腫瘍浸潤リンパ球から確立された。これらのＴＩＬはＨＬＡ−Ａ２を発現している自己由来およびほとんどの同種由来の新鮮または培養メラノーマを認識するが、ＨＬＡ−Ａ２⁻メラノーマまたはＨＬＡ−Ａ２^＋非メラノーマ細胞株（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：６３８）を認識しない。またそれらは新生児皮膚から誘導されたＨＬＡ−Ａ２^＋正常培養メラノサイトも認識する（実施例１およびＫａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １４：８８参照）。従って、これらのＴＩＬはＨＬＡ−Ａ２に関連してメラノーマおよびメラノサイトで発現される蛋白質から誘導された非突然変異体自己ペプチドを認識した。
【０１４９】
ＴＩＬによる別のメラノーマ蛋白質の認識
ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００の一つの型（図５Ａ；配列番号：２６、実施例３参照）およびチロシナーゼ関連蛋白質（ｇｐ７５）を含む４つの単離されたメラノーマ蛋白質の認識の頻度を評価するため、ＣＯＳ７に対する反応性がＨＬＡ−Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡと、またはなしで、これらの３つの蛋白質をコードしているｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞株上で試験された。９のＴＩＬとのいくつかの実験の内の一つが表４に示されている。９つのＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異性ＴＩＬのうちの８つがＭＡＲＴ−１およびＨＬＡ−Ａ２．１で同時にトランスフェクトされたＣＯＳ７とインキュベートした場合にＩＦＮ−γを分泌した。比較的オリゴクローナルＣＴＬ株であるＴＩＬ１２００（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：２８２９）のみがこのＣＯＳトランスフェクト体に応答しなかった。４つのＴＩＬ（６２０，６６０，１１４３，１２００）はＨＬＡ−Ａ２．１とともにトランスフェクトした場合にｇｐ１００を認識した。ＴＩＬ１２００はＴＩＬ６２０、６６０および１１４３と比較して多量のＩＦＮ−γを分泌しており、これらの後者の３つのＴＩＬ株中のＴ細胞の小さなサブセットのみがｇｐ１００を認識したことを示唆している。これらのＴＩＬのいずれもがこのアッセイを用いてもｇｐ７５を認識しなかった。従って、ＭＡＲＴ−１はメラノーマ患者から誘導されるほとんどのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬにより認識される共通のメラノーマ抗原である。
【０１５０】
ＴＩＬのためのＭＡＲＴ−１エピトープの同定
これらのＴＩＬのためのＭＡＲＴ−１エピトープを同定するため、ＨＬＡ−Ａ２．１への既知のペプチドの結合モチーフ（Ｆａｌｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３５１：２９０；Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１２６１；Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：９２９）に基づいて２３のペプチドが選択され、合成され（＞９０％の純度）、および各々のペプチドとＴ２株をインキュベーション後にＴＩＬによるＨＬＡ−Ａ２．１^＋Ｔ２細胞株の溶解を試験することによりスクリーニングされた（表５）。Ｔ２細胞（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．；（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４９−４５２）細胞株は、ペプチドＭ９−２、Ｍ１０−３またはＭ１０−４と前もってインキュベートした場合、試験された４つすべてのＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異性ＴＩＬにより溶解された。両方とも１０のアミノ酸ペプチドであるＭ１０−３およびＭ１０−４はＭ９−２配列を含んでおり、Ｍ１０−３はそのＮ−末端に追加のグルタミン酸を持ち、Ｍ１０−４はそのＣ−末端に余分のイソロイシンを持っている。これらのペプチドはＭＡＲＴ−１の疎水性の推定されるトランスメンブランドメインに位置している。これらのペプチドとインキュベートされた他のＨＬＡ−Ａ２^＋細胞を標的として使用した場合に同一の溶解が観察され、それらにはＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされたＫ４Ｂ（Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂｉｄｄｓｏｎ，ＮＩＨから提供を受けた；Ｓｔｏｒｋｕｓ．Ｗ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１：３７１９−３７２７）および５０１ＥＢＶＢエプスタインーバールウイルス形質転換Ｂ細胞（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３７１４−３７２５）またはＨＭＹ−ＣＩＲ Ｂ細胞（Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂｉｄｄｓｏｎ；ＮＩＨ；Ｓｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３７１９−３７２７）が含まれる（データは示されていない）。
【０１５１】
ペプチドＭ９−１、Ｍ９−２、Ｍ９−３、Ｍ１０−２、Ｍ１０−３、Ｍ１０−４およびＭ１０−５はさらに精製され、ＭＡＲＴ−１反応性ＴＩＬ１２３５またはＴ細胞クローンＡ４２（図２）によるＴ２細胞の溶解を感作する相対的能力を評価するために力価を測定された。精製されたペプチドＭ９−２、Ｍ１０−３およびＭ１０−４は各々１ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌの最少濃度が必要とされた。精製されたＭ１０−４は図２に示したように１０μｇでさえもＴＩＬクローンＡ４２により認識されなかった。Ｍ９−１、Ｍ９−３、Ｍ１０−２およびＭ１０−５ペプチドはＡ４２またはＴＩＬ１２３５の両方で認識されなかった。
【０１５２】
【表４】

【０１５３】
ＨＬＡ−Ａ２．１と、またはなしで、メラノーマで発現される蛋白質をコードしているｃＤＮＡで同時トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞と一緒にＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異性ＴＩＬをインキュベートした後の上清でＩＮＦ−γは測定された。ＴＩＬ１２００を除くすべてのＴＩＬはＭＡＲＴ−１およびＨＬＡ−Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡで同時トランスフェクトされたＣＯＳ７と培養した場合ＩＦＮ−γを分泌した。ＴＩＬ６２０、６６０、１１４３および１２００はｇｐ１００およびＨＬＡ−Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡで同時トランスフェクトされたＣＯＳ７と培養した場合ＩＦＮ−γを分泌した。
【０１５４】
【表５】

【０１５５】
２３のペプチド（配列番号：３−２５）（１２の９−ｍｅｒおよび１１の１０−ｍｅｒ）（＞９０％純度）が合成され、異なった患者からのＴＩＬクローンＡ４２、ＴＩＬ株ＴＩＬ１２３５、ＴＩＬ６６０およびＴＩＬ１０７４による溶解され易さが各々のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と前もってインキュベートされたＨＬＡ−Ａ２^＋Ｔ２細胞に対し、Ａ４２に対しては２０：１のＥ：Ｔ比で、他のＴＩＬ株に対しては４０：１での４時間の^５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイで試験された。Ｍ９−２、Ｍ１０−３およびＭ１０−４とインキュベートされた場合Ｔ２細胞はよく溶解された。Ｍ１０−３およびＭ１０−４は全Ｍ９−２配列（下線）を含んでいる。
【０１５６】
異なった患者から確立されたＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬによるＭＡＲＴ−１ペプチドの認識
種々のＨＬＡ−Ａ２制限ＭＡＲＴ−１特異性ＴＩＬがＭＡＲＴ−１抗原中の同一または異なったエピトープを認識するかどうかを評価するため、各々のペプチドと前もってインキュベートされたＴ２細胞の溶解（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４９−４５２）が１０人のメラノーマ患者から誘導されたＴＩＬで試験された。１０のＴＩＬの代表的な実験は表６に示されている。Ｍ９−２およびＭ１０−３は１０のＴＩＬの内の９つ、ならびにＡ４２クローンで認識され（ＴＩＬ１２００のみが陰性であった）、ＭＡＲＴ−１およびＨＬＡ−Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡで同時にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞と溶解の同一のパターンであった。ＴＩＬ６２０およびＴＩＬ１０８８はペプチドなしでまたは無関係のペプチドの添加後に低レベルの非特異的溶解を示したが、Ｍ９−２、Ｍ１０−３およびＭ１０−５ペプチドと前もってインキュベートすると有意にＴ２細胞の溶解の増加を示した。Ｍ１０−４の認識はＴＩＬ内では異なっているが、Ｔ細胞クローンＡ４２またはＴ細胞株ＴＩＬ１２３５によるＭ１０−４への異なった反応性と似ていた（図２Ａおよび２Ｂ）。Ｍ９−２またはＭ１０−３に必要とされるよりも、より高い濃度（１μｇ／ｍｌ）が溶解のためにＭ１０−４では必要とされた。これらの１０のＴＩＬおよびクローンＡ４２はまた、Ｍ９−２またはＭ１０−３と前もってインキュベートされたＴ２細胞とインキュベートした場合、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αを含むサイトカインも分泌した（データは示されていない）。従って、Ｍ９−２またはＭ１０−３はＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＴＩＬの大多数により認識される共通のエピトープである。
【０１５７】
【表６】

【０１５８】
１０人の患者から誘導されたＴＩＬクローンＡ４２およびＴＩＬ株による溶解性が精製されたペプチドＭ９−１、Ｍ９−２、Ｍ９−３、Ｍ１０−３、Ｍ１０−４およびＭ１０−５と前もってインキュベートされたＴ２細胞を用い、Ａ４２に対しては２０：１のＥ：Ｔ比で、他のＴＩＬ株に対しては４０：１での４時間の^５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイで試験された。１０のＴＩＬの内の９つはＭ９−２またはＭ１０−３とインキュベートされたＴ２細胞を溶解した。１０のＴＩＬの内の７つは１μｇ／ｍｌの濃度のペプチドＭ１０−４とインキュベートされたＴ２細胞を溶解した。
【０１５９】
１０人のメラノーマ患者から誘導されたＴ細胞による既知のメラノーマ蛋白質の認識の相対的頻度が試験された。これらのＴＩＬの９つにより優性に認識されたＭＡＲＴ−１抗原中の共通のエピトープＭ９−２およびＭ１０−３が同定された。スクリーニングアッセイにおいて、ＴＩＬ１２３５を用いるｃＤＮＡ発現クローニングによりＭＡＲＴ−１をコードしているｃＤＮＡが単離された（実施例１参照）。ＭＡＲＴ−１は一つのトランスメンブランドメインを含む１１８のアミノ酸の蛋白質であり、実施例３に記載したｇｐ１００の一つの型のｃＤＮＡの発現パターンと類似し、ほとんどのメラノーマ細胞ならびに培養メラノサイトおよび網膜で発現される。ｇｐ１００は１０のＴＩＬの４つにより認識された。
【０１６０】
用量応答分析に基づくと、ペプチドＭ９−２が溶解について最も効果的にＴ２細胞を感作し（図２）、このペプチドが自然に加工され腫瘍細胞上に存在するかもしれないことが示唆される。Ｍ９−２を認識するＴ細胞はペプチドＭ１０−３またはＭ１０−４と反応するであろう（なぜなら、後者の１０−ｍｅｒペプチドはペプチドＭ９−２の９つのアミノ酸配列を含んでいるから）。異なったＴＩＬによるこれら３つのペプチドの認識にはいくらかの相違が存在する。例えば、Ｍ１０−４はＴ細胞クローンＡ４２によってはあまり認識されないが、いくつかのＴＩＬ株によってはよく認識される（しかしながら溶解を観察するにはより高いＭ１０−４の濃度が必要とされた）。このことはＨＬＡ−Ａ２に関連するＭ９−２またはＭ１０−４ペプチドへのＴＣＰ親和性の変化によるものであろうし、もしくは、ＴＩＬ株はＭ９−２かまたはＭ１０−４のみを認識する異なったＴ細胞クローンを含んでいるかもしれない。ペプチドＭ１０−３およびＭ１０−４もまた自然に加工され腫瘍細胞上に存在するかもしれない。ＨＬＡ−Ａ２により示される多メラノーマ抗体の存在は種々のＴ細胞クローンによるメラノーマ細胞クローン認識分析（Ｋｎｕｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：２８０４；Ｗｏｌｆｅｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：７９７）、またはＨＬＡ−Ａ２メラノーマ細胞から単離されたＨＰＬＣペプチド分画の分析（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，Ｃ．Ｌ．Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２９５５；Ｓｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３７１９）により示唆されてきている。
【０１６１】
メラノーマ患者からのほとんどのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬがｇｐ７５を除いて共通のＭＡＲＴ−１ペプチドを認識するという観察結果は、Ｍ９−２またはＭ１０−３ ＭＡＲＴ−１ペプチドがインビボでのＴ細胞応答を誘導する点で他の既知のメラノーマ抗原よりも強い免疫原であることを示唆している。本研究で使用されたいくつかのＴＩＬがＩＬ−２とともに自己由来患者に注射され、興味あることにｇｐ１００蛋白質（図５Ａ；配列番号：２７）を認識する４つのＴＩＬ（６２０、６６０、１０７４、１２００）すべてが有効な腫瘍退行を誘導した（腫瘍の５０％減少）。ＴＩＬ１２００を除くすべてはＭＡＲＴ−１も認識した。
【０１６２】
実施例３
インビボ腫瘍拒絶に付随する腫瘍浸潤リンパ球により認識される第二のヒトメラノーマ抗原の同定
ｃＤＮＡ発現クローニング
ｇｐ１００と称されるメラノーマ抗原の一つの型をコードしているｃＤＮＡ２５クローンは実施例１およびＭｉｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：５１６７−５１７１に記載されているような技術と類似の技術を用いてクローン化された。簡単に記すと、５０１ｍｅｌメラノーマ細胞株から作製されたλｐＣＥＶ２７中のｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた乳癌細胞株ＭＤＡ２３１（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ２６）をＴＩＬと同時培養した場合のインターフェロンλ（ＩＦＮ−γ）分泌の測定により抗原陽性をスクリーニングした。ＴＩＬ１２００はＫａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８，２１８３−２１９１に記載されているように発生させた。組み込まれたｃＤＮＡは陽性トランスフェクト体のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより回収され、哺乳類発現プラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。ｃＤＮＡ２５のための完全長ｃＤＮＡはｃＤＮＡ２５プローブを用いて５０１ｍｅｌ λファージライブラリーから単離された。完全長ｃＤＮＡ２５を含むλファージはＸｈｏＩで消化し、次にＴ４ ＤＮＡリガーゼで自己連結してプラスミドｐＣＥＶ２７−ＦＬ２５を作製した。もしくは、ｇｐ１００のために設計された特異的プライマーを用いてＰＣＲにより完全長ｃＤＮＡ２５をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、続いてｐｃＤＮＡ３内へクローン化した（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬ２５）。このｃＤＮＡがメラノーマ抗原をコードしているか否かを試験するため、ＣＯＳ７、Ａ３７５またはＭＤＡ２３１内へ再トランスフェクトし、得られたトランスフェクト体はＴＩＬ１２００の刺激で試験した。プラスミドクローンｐＣＥＶ２７−ＦＬ−２５のＤＮＡ配列を自動化ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）にて、Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用い、使用説明書に従って決定した。
【０１６３】
ペプチド合成および抗原性ペプチドの同定
ペプチドはＧｉｌｓｏｎ ＡＭＳ４２２多ペプチド合成機を用いて固相法により合成された。ペプチドはＶｙｄａｃ Ｃ−４カラムを用いて０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルで溶出するＨＰＬＣにより精製した。抗原性ペプチドを同定するため、ペプチドと２時間前もってインキュベートしたＴ２ＲＥＴ細胞のＴＩＬ溶解が^５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイを用いて測定された。
【０１６４】
ＴＩＬ１２００を用いる転移性メラノーマ患者の処置
広く転移したメラノーマを持ち、化学療法および放射線治療がうまくいかなかった２９才の男性患者（患者番号１２００）を２５ｍｇ／Ｋｇのシクロホスホアミドの単一用量で処置し、続いて１．６ｘ１０^１１ＴＩＬ（９．１ｘ１０^９のインジウム標識ＴＩＬを含む）に加えて７用量のＩＬ−２（７２０，０００ＩＵ／Ｋｇ）を８時間ごとに静脈注射した。ＴＩＬおよびＩＬ−２による２回目の処置は３週間後に行われた。放射性核種のスキャンはＴＩＬの腫瘍沈着による局在化を示した（図３Ａ）。処置後８および１１日目での皮下腫瘍のバイオプシは腫瘍へのＴＩＬの有意な局在化を示した（正常組織と比較した場合腫瘍におけるグラム当たりの注射物の比は各々１４．９および１４．０であった）。患者の癌は一回目の処置後急速に退行した。処置後三ヶ月では三つの肝臓病変の二つが消失し、三番目の病変も５０％縮んでいた。多数の皮下転移物も図３Ｂに示されているように（個々の病変の垂直面直径の結果が示されている）完全に退行していた。
【０１６５】
ＴＩＬ１２００のインビトロ機能の特性付け
ＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ患者から確立された多数のＴＩＬ株はクラスＩ ＭＨＺＣ制限様式でメラノーマ細胞株を溶解させ（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：６３８−６４３）、同一の腫瘍細胞株と一緒に培養した場合ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）または顆粒球ーマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を放出することが示されている（Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１３：１８−３０）。患者１２００の転移性皮下腫瘍塊から確立されたＣＤ８^＋ＣＴＬ株、ＴＩＬ１２００は新しい自己由来メラノーマ細胞、ならびに１５のＨＬＡ−Ａ２^＋同種由来メラノーマ細胞株の内の１０を溶解させるが、１８のＨＬＡ−Ａ２⁻メラノーマ細胞株の内の１６または８のＨＬＡ−Ａ２^＋非メラノーマ細胞株の内の６は溶解させない（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，２８２９−２８３３、未発表データ）。表７はＴＩＬにより溶解される５つの代表的なＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞株、ＴＩＬにより溶解されない４つの代表的なＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞株および１つのＨＬＡ−Ａ２⁻メラノーマ細胞株に対する細胞毒性アッセイを示している。ＴＩＬ１２００はまた新生児包皮から確立されたＨＬＡ−Ａ２^＋正常培養メラノサイトならびにＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞株が同時培養された場合ＩＦＮ−γを分泌した（表８）。従って、ＴＩＬ１２００はほとんどのメラノーマおよびＨＬＡ−Ａ２制限様式の培養新生児メラノサイトにおいて発現される非突然変異自己ペプチドを認識するようである。
【０１６６】
【表７】

【０１６７】
前に記載したように（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１）４０：１のエフェクター：標的比で細胞毒性測定のために５時間−^５１Ｃｒ放出アッセイが実施された。モノクローナル抗体ＨＭＢ４５（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）により認められるＨＬＡ−Ａ２およびｇｐ１００の発現はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定された。ｇｐ１００ ＲＮＡの発現はｃＤＮＡ２５をプローブとし、ノーザンブロットにより分析された。
^＊−／＋は非常に弱い陽性を示している。
【０１６８】
【表８】

【０１６９】
ＴＩＬによるＩＦＮ−γ分泌は実施例１で前に記載したようにＥＬＩＳＡで測定した。ＴＩＬ単独で分泌されたＩＦＮ−γの量は差し引かれている（ＴＩＬ８８８に対しては８８ｐｇ／ｍｌ、ＴＩＬ１２００に対してはゼロ）。ＴＩＬ８８８はクラスＩ ＭＨＣ制限メラノーマ特異的ＣＴＬであるが、ＨＬＡ−Ａ２によっては制限されない。ＮＨＥＭ、ＦＭおよびＨＡは正常培養メラノサイト株に当てはまるが、他はすべてメラノーマ細胞株である。
【０１７０】
Ｔ細胞に認識されるメラノーマ抗原のためのｃＤＮＡコードのクローニング
ほとんどのＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＴＩＬにより溶解されたＨＬＡ−Ａ２^＋５０１ｍｅｌメラノーマ細胞株からのλｐＣＥＶ２７中のｃＤＮＡライブラリーは、非常にトランスフェクトされ易いＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ抗原陰性ＭＤＡ２３１クローン７またはＡ３７５クローン１−４内へ安定にトランスフェクトされた。Ｇ４１８耐性細胞を集め、各々の細胞株からの約６７００の個々のトランスフェクト体を単離し、ＴＩＬ１２００からのＩＦＮ−γ分泌を刺激する能力でスクリーニングした。２回目のスクリーニングで陽性であった４つのＭＤＡ２３１および１つのＡ３７５トランスフェクト体から、組み込まれたＤＮＡに隣接するＳＰ６／Ｔ７プライマーを用いるＰＣＲにより６つのＤＮＡ断片が単離され、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へクローン化された。
【０１７１】
ｐｃＤＮＡ３ベクター中のこれらの断片は、ｐｃＤＮＡ３−ＨＬＡ−Ａ２．１と、またはなしで、ＣＯＳ７細胞において一時的に発現させた。ＨＬＡ−Ａ２．１とともに試験されたｃＤＮＡの一つ、ｃＤＮＡ２５をＣＯＳ７内へトランスフェクトすると、再現性よくＴＩＬ１２００からのＩＦＮ−γの分泌を刺激する能力が与えられた。Ａ３７５内へのｃＤＮＡ２５の安定なトランスフェクションもまたＴＩＬ１２００からのＩＦＮ−γ放出を刺激した（表９、実験１および実験２）。ｃＤＮＡ２５プローブを使用したメラノーマのノーザンブロット分析により検出された２．２ｋｂバンドはクローン化１．６ｋｂ断片は完全長ｃＤＮＡではなかったことを示唆している。３つのｃＤＮＡ２５のクローンを独立にＰＣＲで増幅して、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのコンセンサスＤＮＡ 配列と比較したところ、ｃＤＮＡ２５は、過去に登録された２つの遺伝子、すなわちｇｐ１００（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓ Ｎｏ．Ｍ７７３４８）およびＰｍｅｌ１７（Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８８，９２２８−９２３２）とは異なることが判明した。ｃＤＮＡ２５は、ＧｅｎＢａｎｋのｇｐ１００（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７７３４８、ｇｐ９５としても知られている。）とは２つのヌクレオチドが異なっており、Ｐｍｅｌ１７の配列（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８８，９２２８−９２３２）と比べると、３塩基の違いと、２１塩基の欠失がある点で異なっていた（図５Ｂ）。
【０１７２】
【表９】

【０１７３】
一部を欠損させたｃＤＮＡ２５を含むｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３−２５）に安定に感染させたＨＬＡ−Ａ２^＋Ａ３７５（実験１）、またはｐｃＤＮＡ３−２５（実験２）、ｃＤＮＡ２５の全長を含むｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬ２５）、またはｃＤＮＡ２５の全長を含むｐＣＥＶ２７−ＦＬ２５）（実験３）を、ＨＬＡ−Ａ２．１を含むｐｃＤＮＡ３（ＨＬＡ−Ａ２．１）と共に一時的に感染させたＣＯＳ７を、ＴＩＬ１２００とともに加温したところ、ＴＩＬ１２００はＩＦＮ−γを分泌した。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、フロー・サイトメトリーにより決定され、インターフェロン−γの分泌は、ＥＬＩＳＡにより測定された。
【０１７４】
ｃＤＮＡ２５の全長（ＦＬ２５）を、２つのプラスミド、ｐＣＥＶ２７−ＦＬ２５またはｐｃＤＮＡ３−ＦＬ２５に単離した。いずれのプラスミドもｐｃＤＮＡ３−ＨＬＡ−Ａ２．１と共にＣＯＳ７に感染させたところ、ＴＩＬ１２００によるＩＦＮ−γの分泌を誘導する能力が、ＣＯＳ７に付与された。全長のＤＮＡにＨＬＡ−Ａ２．１を付け加えたものを感染させたＣＯＳ７により刺激された、ＩＦＮ−γの分泌の量は、５０１ｍｅｌの刺激による量と同程度であり、一部を欠損したｃＤＮＡ２５に感染させたＣＯＳ７の刺激による量よりも高かった。これはおそらく一部欠損のｃＤＮＡ２５において、通常のＡＵＧ開始コドンでの翻訳開始が変化したことによると思われる（表９，実験２，３）。あるいは、一部欠損のｃＤＮＡ２５で失われた５’領域が、ＴＩＬ１２００においてクローンにより認識される他のエピトープ（抗原決定基）を含んでいるのかもしれない。ＴＩＬ１２００からのＩＦＮ−γの放出にはＨＬＡ−Ａ２．１の発現が必要であったこと、および、感染した細胞が、無関係なＴＩＬからのＩＦＮ−γの分泌を刺激しなかったという事実（データは示していない）は、ｃＤＮＡ２５が、ＨＬＡ−Ａ２．１の存在下でＴＩＬ１２００により認識される抗原をコードしていたこと、および、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの放出を非特異的に誘導する分子をコードしていなかったことを示す。
【０１７５】
５０１ｍｅｌ ｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ２５プローブを用いたスクリーニングによりクローニングされた、一部欠損のｃＤＮＡ２５および全長のｃＤＮＡ２５の塩基配列、および、対応するアミノ酸配列（図５Ａ）を、通常のメラニン細胞から単離されたＰｍｅｌ１７、およびメラノーマ細胞系列ＭＥＬ−１から単離されたｇｐ１００のＧｅｎＢａｎｋの配列（図５Ｂ）と比較した。全長のｃＤＮＡ２５は、ｇｐ１００のアミノ酸配列と比べると、１６２番目において異なっていた。このアミノ酸の相違は、おそらく多型または腫瘍における突然変異により生じたのであろう。Ｐｍｅｌ１７と比較すると、ｃＤＮＡ２５は、１６２番目および２７４番目の２つのアミノ酸が異なり、Ｐｍｅｌ１７では５８８−５９４番目に存在した７つのアミノ酸を含まなかった。オリジナルのＭＤＡ２３１感染体から単離された一部欠損のｃＤＮＡ２５のアミノ酸配列は、３’末端（６４９番目から最後まで）に、１つの余分なシチジル酸の付加によるフレームシフトに伴う、異なる配列を持つ。この相違が、真に異なる対立遺伝子であることによるのか、または、ＤＮＡを操作する過程で生じた突然変異によるのかは明確ではない。とはいえ、ＴＩＬ１２００は、２３６番目から６４８番目までの間に位置する、突然変異のないペプチドを認識するようである。ｃＤＮＡ２５はまた、アミノ酸配列において、ウシの網膜色素上皮で特異的に発現するｃＤＮＡ ＲＰＥ１（Ｋｉｍ，Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｓｔｏｗ，Ｇ．Ｊ．（１９９２）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５： ６５７−６６２）と８７%の類似性、および、ニワトリの色素上皮細胞から単離されたメラノソーム基質蛋白質をコードするｃＤＮＡ ＭＭＰ１１５（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９１，２８２９−２８３３）と６０%の類似性を示した。
【０１７６】
ｇｐ１００蛋白質は、モノクローナル抗体ＨＭＢ４５により認識されることが知られていた（Ａｄｅｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１４３： １５７９−１５８５）。全長のｃＤＮＡ２５に感染させたＣＯＳ７細胞は、フロー・サイトメトリーで、このモノクローナル抗体を用いて検出された。ｐＣＥＶ２７−ＦＬ２５またはｐｃＤＮＡ３−ＦＬ２５のいずれかを一過的に発現した後、ＣＯＳ７は、ＨＭＢ４５により検出される抗原を発現した（データは示していない）。
【０１７７】
ｃＤＮＡ２５に対するＲＮＡの発現
ｃＤＮＡの組織特異的発現を評価するため、ｃＤＮＡ２５プローブを用いてノザン・ブロット解析を行った。１５のメラノーマ細胞系列のうち１０系列、および、６つのメラニン細胞系列のすべてが、ｃＤＮＡ２５を発現していた（図６Ａおよび６Ｂ）。多くの通常の組織では、網膜のみで発現がみられた（図６Ｃ）。Ｔ細胞（ＴＩＬＡ，Ｂ）由来の７つの細胞系列、Ｂ細胞（５０１ＥＢＶＢ，８３６ＥＢＶＢ）、および繊維芽細胞（Ｍ１）、および２０のメラノーマでない腫瘍細胞系列（結腸癌のＣｏｌｌｏ，ＳＷ４８０，ＷｉＤｒ、および乳癌のＭＤＡ２３１，ＭＣＦ７，ＨＳ５７８，ＺＲ７５、および神経芽腫のＳＫ−Ｎ−ＡＳ，ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、およびＥｗｉｎｇ肉腫のＴＣ７５，ＲＤ−ＥＳ，６６４７、および肉腫の１４３Ｂ、および神経膠腫のＵ１３８ＭＧ，ＨＳ６８３、および腎細胞癌のＵＯＫ１０８，ＵＯＫ１１７、および小細胞肺癌のＨ１０９２、およびＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫のＤａｕｄｉ、および骨髄腫のＨＭＹ）はすべてｃＤＮＡ２５を発現していなかった（データは示していない）。したがって、この遺伝子は、モノクローナル抗体であるＨＭＢ４５、ＮＫＩ／ｂｅｔａｂ、またはＨＭＢ−５０を用いて解析したとき（Ａｄｅｍａ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４３：１５７９−１５８５、Ｇｏｗｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １２３：１９５−２０３、Ｃｏｌｏｍｂａｒｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ Ａ Ｐａｔｈｏｌ Ａｎａｔ ４１３：１７−２４、Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０：１７９−１９２、Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｅｓｃｌａｍａｄｏ，Ｒ．Ｍ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：１２８６−１２９４）の、過去に単離された形のｇｐ１００の発現パターンと同様に、メラニン細胞系列で特異的に発現していることが明らかとなった。ｃＤＮＡ２５プローブにより、新生児の培養メラニン細胞系列で検出されたＲＮＡの発現レベルは、メラノーマ細胞系列での発現に比べて有意に低かった。ｃＤＮＡ２５を用いたノザン・ブロット解析およびＨＭＢ４５抗体を用いたフロー・サイトメトリーにより検出されたｇｐ１００の発現、および１０のＨＬＡ−Ａ２^＋メラノーマ細胞系列でのＴＩＬ１２００によるメラノーマの溶解の間には、Ｔａｂｌｅ ７に示すように完全な相関があった。
【０１７８】
ｇｐ１００でのエピトープの同定
一部欠損した形のｃＤＮＡ２５のアミノ酸配列を、ＨＬＡ−Ａ２．１の既知の結合領域（Ｆａｌｋ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６、Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７）と比較することにより、ｃＤＮＡ２５をもとに、９または１０アミノ酸の長さをもつ３０のペプチドを合成した。ＴＩＬ１２００は、ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ配列のペプチド（配列番号：２７、４５７−４８６残基。図５Ａ、配列番号：３３）と共に加温したときのみ、ＨＬＡ−Ａ２^＋の細胞系列であるＴ２を溶解したが、他の２９のペプチドと共に加温したときには、溶解しなかった（表１０，図５Ａ）。ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ配列のペプチド（配列番号：３３）のみが、ＴＩＬ１２００によるＩＦＮ−γの分泌をも刺激することができた（データは示していない）。
【０１７９】
ＴＩＬ由来の多くのメラノーマ特異的ＣＴＬが、メラニン細胞−メラノーマ系列に特異的な蛋白質に由来する、突然変異のない自己のペプチドを認識するようである。なぜなら、これらのＴＩＬは、適切な制限エレメント（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）を共有する、ほとんどのメラノーマ細胞系列、および正常の培養メラニン細胞を認識するからである（Ａｎｉｃｈｉｎｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：９８９−９９８、Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：８８−９３）。メラノーマの患者の免疫治療に有益なメラノーマ抗原を単離および同定する目的で、ＴＩＬ１２００が用いられた。ＴＩＬは転移癌の患者に投与すると、腫瘍部位に局在し、かつ腫瘍の劇的な退行を伴った。活性化されていないリンパ球、およびリンフォカインで活性化されたキラー細胞とは対照的に、自己のＴＩＬは、腫瘍部位に局在することが示されている。この局在は、これらのＴＩＬが腫瘍の退行を仲介する能力と相関していた（データは示していない）。複数のＣＴＬ種を含むＴＩＬ系列の１つであるＴＩＬ１２００は、最も高頻度で発現するクラスＩ ＭＨＣ抗原（約５０%の人がもつ）であり、かつメラノーマ特異的ＣＴＬの誘導における主要な制限エレメントであることが示されているＨＬＡ−Ａ２の存在下で腫瘍抗原を認識した（Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，１６９２−１６９９）。
【０１８０】
Ｔ細胞による認識をスクリーニングに用いてｃＤＮＡ発現クローニングを行うことにより、ＴＩＬ１２００によって認識される抗原をコードし、かつ、モノクローナル抗体であるＨＭＢ４５、ＨＭＢ５０、またはＮＫＩ／ｂｅｔａｂによっても認識される膜局在糖蛋白質ｇｐ１００の１つの形として同定された、１つのｃＤＮＡ（図４Ａおよび４Ｂ、配列番号： ２６）が同定されている（Ａｄｅｍａ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４３，１５７９−１５８５、Ｇｏｗｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １２３，１９５−２０３、Ｃｏｌｏｍｂａｒｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ Ａ Ｐａｔｈｏｌ Ａｎａｔ．４１３，１７−２４、Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０，１７９−１９２、Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｅｓｃｌａｍａｄｏ Ｒ．Ｍ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，１２８６−１２９４）。これらの抗体は、メラニン細胞系列の組織に高度に特異的で、かつほとんどのメラノーマ細胞を強く染色する。ＮＫＩ／ｂｅｔａｂは、成人の通常の皮膚のメラニン細胞とも相互作用する（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０，１７９−１９２）。ＨＭＢ４５またはＮＫＩ／ｂｅｔａｂ抗体のいずれかを用いた免疫電子顕微鏡の研究によって、ｇｐ１００タンパク質は主に膜および細胞質内の第ＩおよびＩＩ期のメラノソームの繊維状マトリックスに位置することが明らかになった（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０，１７９−１９２； Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ−Ｌｅｖｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１８，４３２−４３５）。まったく独立な手順によって、別の型のｇｐ１００をコードするｃＤＮＡがｇｐ１００に対するウサギのポリクローナル抗血清を用いたスクリーニングによって単離され（Ａｄｅｍａ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４３：１５７９−１５８５）、ＴＩＬ１２００はこのｃＤＮＡクローンをトランスフェクションさせたＨＬＡ−Ａ２^＋細胞系列も溶解した（Ｂａｋｋｅｒ，Ａ．Ｂ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１００５−１００９）。
【０１８１】
【表１０】

【０１８２】
_＊ＴＩＬ１２００は、ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ（４５７−４６６残基）の１０量体ペプチドと共に刺激するとＴ２細胞を溶解したが、他の２９のペプチド（配列番号：２７）（２７３−２８１，２９７−３０６，３７３−３８１，３９９−４０７，３９９−４０８，４０９−４１８，４５６−４６４，４６３−４７１，４６５−４７３，４７６−４８５，５１１−５２０，５１９−５２８，５４４−５５２，５４４−５５３，５７０−５７９，５７６−５８４，５７６−５８５，５８５−５９３，５９２−６００，５９７−６０５，５９７−６０６，６０２−６１０，６０２−６１１，６０３−６１１，６０５，６１４，６０６−６１４，６０６−６１５，６１９−６２７，６２９−６３８）の場合は溶解しなかった。
^＋ＴＩＬ１２３５は、ＨＬＡ−Ａ２に制限されるメラノーマ特異的ＣＴＬであり、ｇｐ−１００を認識しない。
_＊＊Ｅ：Ｔは５０：１である。
^＋＋ＮＤは、行っていないことを示す。
【０１８３】
腫瘍内自己抗原ｇｐ１００と反応性のあるＴ細胞の存在および抗原反応細胞の特異的な蓄積および増加から考えられる結果としての腫瘍部位におけるこれらのＴ細胞の豊富化の可能性（Ｓｅｎｓｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１２３１−１２４６）は、癌の成長における自己抗原への免疫反応の性質および自己抗原に対する免疫寛容の機構について重要な疑問を提起する。ノーザンブロット解析によって示されたメラノサイトにおけるｇｐ１００の発現の増加と比べてメラノーマ細胞におけるｇｐ１００の発現が増加していること、または腫瘍部位に独特の炎症状態（サイトカインの分泌および細胞表面の補助刺激性分子の発現と関係していると思われる）が存在することが、ｇｐ１００に対する寛容を発生させる可能性がある。脱色素化が、優れた予後と関連し（Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９：６８９−６９５； Ｂｙｓｔｒｙｎ，Ｊ−Ｃ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２３：１０５３−１０５５）、そしてメラノーマ患者への化学免疫治療に対する臨床の応答（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：１３３８−１３４３）とも関連することが報告されている。メラノーマ特異的ＴＩＬが投与された患者には散発性の白斑が見られるが、メラノサイトの破壊に関連する不都合な眼科学的作用は観察されていない。患者１２００は白斑またはいかなる眼科的副作用も生じなかった。
【０１８４】
ＴＩＬ１２００とＩＬ２の患者１２００への導入が癌の退縮に関連していたため、ｇｐ１００タンパク質（図５Ａ；配列番号：２７）および同定された１０アミノ酸からなるペプチドはヒトの腫瘍拒絶抗原を代表すると思われる。ＩＬ２もまた腫瘍の拒絶に関連しているであろうが、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるＴＩＬ２０００の腫瘍沈澱への到達および抗腫瘍応答の急速性はＴＩＬ治療の応答の特徴である。ＭＡＲＴ−１同様にｇｐ１００を認識した他の３種のＴＩＬ系列の養子免疫投与（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）も腫瘍の退縮に関連していた（データは示していない）。
【０１８５】
チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，４８９−４９５）およびＭＡＲＴ−１（実施例１を参照）はＨＬＡ−Ａ２制限されたＣＴＬによって認識されたメラノーマ抗原として同定されている。もう一つの抗原であるＭＡＧＥ−１はＨＬＡ−Ａ１制限されたメラノーマ特異的なＣＴＬによって認識され、精巣および様々な癌細胞において発現している（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７）。しかし、近年開発された１０種のＨＬＡ−Ａ２制限されたＴＩＬはいずれもＭＡＧＥ−１を認識しないと思われている（Ｚａｋｕｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５−８）。
【０１８６】
患者の５０%に存在している、メラノーマにおけるｇｐ１００タンパク質の広範な発現、腫瘍に侵入するＴ細胞によるペプチドの認識、ＨＬＡ−Ａ２による制限、および抗ｇｐ１００反応性と患者１２００における癌の退縮との関連は、ｇｐ１００抗原、特にｇｐ１００アミノ酸配列に由来する新規の免疫原ペプチド（図５Ａ；配列番号：２７）がメラノーマの患者に対する有効な免疫治療の開発に有用であることを示唆する。
【０１８７】
実施例４
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍認識に関連するＴＩＬによるヒトメラノーマ抗原の複エピトープの認識
材料と方法
ＴＩＬからのＣＴＬの生成および転移性メラノーマの患者の治療
メラノーマ特異的なＣＴＬは、以前に記載された方法（Ｋａｗａｋａｍｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３）に従って、６０００ＩＵのＩＬ２を含む培地においてＴＩＬから誘導および増殖させた。Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＣＩの自家移植の患者に投与された、全ての使用可能なＨＬＡ−Ａ２制限されたメラノーマ特異的ＣＴＬが本研究において使われた。ＴＩＬは以前に報告されているように（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１９：１６７６； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．ＮＣＩ．８６：１１５９）、ＩＬ２とともに転移性メラノーマの自家移植の患者の静脈内に投与した。Ｆｉｓｈｅｒの精密検定を使用して、ＴＩＬによるｇｐ１００の認識とＴＩＬ処理に対する外科的応答との関連の決定、並びにＭＡＲＴ−１認識との関連の決定を行った。
【０１８８】
ペプチドの合成
ペプチドはペプチド合成機（モデル ＡＭＳ ４２２；Ｇｉｌｓｏｎ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＯＨ）を使用して固相法により合成した（純度＞９０%）。合成されるペプチドは、報告されているＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフに基づくヒトのｇｐ１００の配列から選択した（Ｆａｌｋ，Ｋ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０； Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１； Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：９２９； Ｋｕｂｏ，ＲＴ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３１９３）。次のペプチドも試した： ８個の８量体ペプチド（１９９，２１２，２１８，２３７，２６６，２６７，２６８，２６９の残基から始まる； 図７Ａ参照）、８４個の９量体ペプチド（残基が２，４，１１，１８，１５４，１６２，１６９，１７１，１７８，１９９，２０５，２０９，２１６，２４１，２４８，２５０，２５５，２６２，２６６，２６７，２６８，２７３，２７８，２８０，２８３，２８６，２８７，２９８，２９０，３０９，３１６，３３２，３３５，３５０，３５４，３５８，３６１，３７１，３７３，３８４，３８９，３９７，３９９，４００，４０２，４０７，４０８，４２０，４２３，４２５，４４６，４４９，４５０，４５６，４６３，４６５，４８５，４８８，５０１，５１２，５３６，５４４，５６３，５７０，５７１，５７６，５７７，５７８，５８３，５８５，５９０，５９２，５９５，５９８，５９９，６０１，６０２，６０３，６０４，６０６，６０７，６１３，６１９，６４８から始まる； 図７Ａ参照）および７７個の１０量体ペプチド（残基が９，１７，５７，８７，９６，１５４，１６１，１６９，１７７，１９７，１９９，２００，２０８，２１６，２２４，２３２，２４０，２４３，２５０，２６６，２６７，２６８，２７２，２８５，２８７，２８９，２９７，３１８，３２３，３３１，３４２，３５０，３５５，３５７，３６５，３８０，３８３，３８８，３９１，３９５，３９９，４００，４０６，４０７，４０９，４１５，４３２，４４９，４５３，４５７，４６２，４７６，４８４，４８９，４９２，５１１，５１９，５３６，５４３，５４４，５４８，５６８，５７０，５７１，５７６，５７７，５８４，５９０，５９５，５９８，５９９，６０１，６０２，６０３，６０５，６１１，６２９から始まる； 図７Ａ参照）を合成した。第１のスクリーニングにおいて同定された、可能性のあるエピトープはＣ−４カラム（ＶＹＤＡＣ，Ｈｅｐｓｅｒｉａ，ＣＡ）を用いてＨＰＬＣによって精製し（純度＞９８%）、ペプチドの分子量は以前に記載されているように（実施例３； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：６４５８）、質量分析測定によって確認された。
【０１８９】
ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１への結合分析
以前に記述されているように（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：９２９； Ｋｕｂｏ，ＲＴ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３； Ｓｅｔｔ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３）、可溶性ＨＬＡ−Ａ２．１重鎖、ヒトβ２−マイクログロブリン、放射性標識したペプチドＨＢｃ_{１８−２７}（ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ）および様々な濃度の試料ペプチドを、プロテアーゼ阻害剤の存在下で２日間室温でともにインキュベートした。ＨＬＡ−Ａ２．１に結合した標識ペプチドのパーセント割合はゲルろ過による分離の後に計算され、標識ペプチドの結合の５０%を阻害するのに必要な試料ペプチドの濃度を計算した。ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１への相対親和性についても、以前に記載されたように（Ｓｅｔｔ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３）、比（標識ペプチドの結合の５０%を阻害するための標準ＨＢｃ_{１８−２７}ペプチドの濃度／標識ペプチドの結合の５０%を阻害するための試料ペプチドの濃度）として計算した。ペプチドの結合は、強（＜５０ｎＭで５０%を阻害，比＞０．１）、中（５０−５００ｎＭ，比 ０．１−０．０１）、または弱（＞５００ｎＭ，比＜０．０１）として定義する（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：９２９； Ｋｕｂｏ，ＲＴ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３； Ｓｅｔｔ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３）。
【０１９０】
ｇｐ１００の全長のｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３プラスミド（実施例３；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐａｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：６４５８）をＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断した。α−ホスホロチオン酸デオキシヌクレオシド３リン酸をＸｂａＩ部位へ取り込ませた後、Ｅｘｏ Ｓｉｚｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて標準エクソヌクレアーゼＩＩＩ段階切除（ｎｅｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を行なった。切除したクローンはセルフライゲーションおよび増幅を行なった。それぞれのクローンの正確な切除はＤＮＡ配列決定によって確認した。エピトープを含む領域を同定するために、全長のｇｐ１００ ｃＤＮＡの３’末端からエクソヌクレアーゼによる連続切除によって作製されたｃＤＮＡ断片（Ｄ３，Ｄ５，Ｄ４，Ｃ３）並びに５’−コード領域を欠く欠失型ｇｐ１００ ｃＤＮＡ（２５ＴＲ）（実施例６３；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：６４５８）を含むｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）をＨＬＡ−Ａ２．１ ｃＤＮＡとともにＣＯＳ７細胞にトランスフェクションさせ、トランスフェクションされたＣＯＳ細胞のＴＩＬによる認識をＩＦＮ−γ放出分析を用いて評価した（実施例１； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：３５１５）。
【０１９１】
Ｔ細胞による抗原認識の評価
Ｔ細胞による抗原認識を調査するために、^５１Ｃｒ放出分析またはＩＦＮ−γ放出分析を以前に記載されている方法によって行なった（実施例１，２； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：３５１５； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３）。メラノーマ抗原をコードするｃＤＮＡおよびＨＬＡ−Ａ２．１ ｃＤＮＡをトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞またはペプチドと事前にインキュベートしておいたＴ２細胞のいずれかを刺激因子としてＩＦＮ−γ放出分析に使用した。ペプチドで刺激したＴ２細胞は細胞毒性分析の標的としても使用した（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７）。
【０１９２】
ＴＩＬ処理に対する臨床的応答に相関したＴＩＬによるｇｐ１００の認識
１４種の、ＴＩＬに由来するＨＬＡ−Ａ２制限されたメラノーマ特異的ＣＴＬの中の４種がｇｐ１００を認識し、１３種がＭＡＲＴ−１を認識した（３種はｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１の両方を認識した）。メラノーマ抗原をコードするｃＤＮＡをＨＬＡ−Ａ２．１ ｃＤＮＡとともにトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対するＴＩＬの反応性によって調べたところ、いずれもチロシナーゼまたはｇｐ７５を認識しなかった（実施例２； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７）。これらの４種のＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２制限およびｇｐ１００反応性認識特異性については以前に行われている（実施例１−３； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：６４５８； Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：６３８； Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１０：１４１８；Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：２８２９）。１４種のＣＴＬのうち１０種をＩＬ２とともに自家移植の患者に投与した。表１１に要約されるように、ｇｐ１００を認識可能なＣＴＬによって治療した患者４人全てが客観的な部分的応答（＞５０% 腫瘍の退縮）を生じた。ＴＩＬ治療に対する臨床的応答はＴＩＬのｇｐ１００に対する反応性と関連した（ｐ=０．００４８）が、ＭＡＲＴ−１とは関連しなかった（ｐ=０．４）。これらのデータはｇｐ１００が生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍の縮退に関与しうるエピトープを含むことを示唆した。
【０１９３】
ｇｐ１００反応性ＴＩＬによって認識されるエピトープの同定
これら４種のｇｐ１００反応性ＣＴＬによって認識されるエピトープを同定するために、ＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフを含む１６９個のペプチドを合成した。ペプチド認識は、それぞれのペプチドとともに予めインキュベートしたＨＬＡ−Ａ２．１＋ Ｔ２細胞に対するこれらのＣＴＬの反応性を細胞毒性分析およびＩＦＮ−γ放出分析を用いて試験することによって評価した。表１２に示すように、細胞毒性分析において７個のペプチドがｇｐ１００反応性ＴＩＬによって認識された。同時に行われたＩＦＮ−γ放出分析の結果は細胞毒性分析の結果と矛盾しないものであった。ＴＩＬ６２０（６２０−１，６２０−２）またはＴＩＬ６６０（６６０−１，６６０−２，６６０−３）の別々のサブカルチャーを、自家移植の患者に投与したＴＩＬ培養から成長させて別々に培養すると、少しずつ異なる特異性をもっていたが、これは恐らく試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で異なるクローンが増殖したことによると思われる。Ｇ９_２０９（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）（配列番号：４８）およびＧ９_２０９のＮ末端に余分のスレオニンを持つＧ１０_２０８（ＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）（配列番号：４９）はＴＩＬ６２０によってのみ認識された。Ｇ９_１５４（ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ）（配列番号：４６）およびＧ９_１５４のＣ末端に余分にロイシンを持つＧ１０_１５４（ＫＴＷＧＱＹＷＱＶＬ）（配列番号：４７）はＴＩＬ１２００、ＴＩＬ６２０−２およびＴＩＬ６６０−２によって認識された。Ｇ１０−４（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ）（配列番号：３３）は示したように（実施例３）、ＴＩＬ１２００によって認識された。ペプチドＧ９_２８０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）（配列番号：４０）はＴＩＬ６６０およびＴＩＬ１１４３によって認識された。ＴＩＬ６６０−３はＧ９_２８０同様にＧ１０−５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ）（配列番号：３４）も認識した。Ｇ１０−５とともに予めインキュベートしたＴ２細胞の破壊は反復的に低く、これは恐らく、Ｔ細胞クローン中の小サブセットがこのエピトープに特異的であったためである。
【０１９４】
既知のＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフを用いたエピトープの同定を補うために、もう一つの方法がエピトープを含む領域の同定に使用された。５種のｇｐ１００ ｃＤＮＡ断片すなわち、４種はｃＤＮＡ（Ｄ３，Ｄ４，Ｄ５，Ｃ４）の３’末端からのエクソヌクレアーゼ切除法により作製され、１種は５’コード領域の最初の７０５塩基対を欠く部分的なｃＤＮＡクローン（２５ＴＲ）であり、これらをｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入し、ＨＬＡ−Ａ２．１ ｃＤＮＡとともにＣＯＳ７細胞にトランスフェクションさせた。断片の位置は図７Ａに示してある。４種のｇｐ１００反応性ＴＩＬによるこれらのトランスフェクション細胞の認識はＩＦＮ−γ放出分析を用いて評価した（図７Ｂ）。ＴＩＬ１２００は２５ＴＲ，Ｄ５，Ｄ４またはＣ４断片をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を認識したが、Ｄ３については認識せず、少なくとも２個のエピトープがアミノ酸残基１４６−１６３および２３６−６６１の領域に存在していることを示唆している。１４６−１６３の領域にＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフを含むペプチドはＧ９_１５４およびＧ１０_１５４のみに過ぎず、両者ともＴＩＬ１２００によって認識された。Ｇ１０−４は領域２３６−６６１に位置し、ＴＩＬ１２００によって認識された。ＴＩＬ６２０−１はＣ４をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を認識したが、Ｄ３，Ｄ５，Ｄ４または２５ＴＲについては認識せず、エピトープは残基１８７−２７０の内部に存在することを示唆している。ＴＩＬ６２０−１によって認識されたＧ９_２０９およびＧ１０_２０８はこの領域に位置した。ＴＩＬ６２０のもう一つのサブカルチャーであるＴＩＬ６２０−２もまたＤ５およびＤ４をトランスフェクションした細胞を認識したがＤ３は認識せず、および１４７−１６３の領域内のＧ９_１５４およびＧ１０_１５４を認識した（これらはＴＩＬ１２００によっても認識された）。ＴＩＬ６６０−１およびＴＩＬ１１４３はＣ４または２５ＴＲをトランスフェクションした細胞を認識したがＤ３，Ｄ５，またはＤ４は認識せず、エピトープが１８７−２７０および２３６−６６１の２領域に存在することを示唆している。２５ＴＲ断片内に位置するがＣ４断片内には位置しないＧ９_２８０はＴＩＬ６６０およびＴＩＬ１１４３によって認識された。
【０１９５】
メラノーマのエピトープの試験管内での（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性
Ｔ２細胞をＣＴＬ溶解に対し感受性にするために１μｇ／ｍｌの濃度が必要であるＧ１０−４を除き（実施例３；ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９１：６４５８），この研究で同定されたすべてのｇｐ１００エピトープはＴ２細胞をＣＴＬ溶解に対し１ｎｇ／ｍｌの濃度で感受性にした（図８Ａ−８Ｄ）。Ｇ１０−５は１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度ではＣＴＬでの細胞毒活性を阻害するようであった。なぜなら、ペプチドが培養液中に細胞毒性検定の間４時間完全に存在する条件の下、１０ｎｇ／ｍｌ以上のＧ１０−５と共に保温したＴ２細胞の溶解は、この検定を１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で行ったときより低くなったからである（図８Ｄ）。これらのエピトープのＨＬＡ−Ａ２．１に対する相対的な結合親和性も試験管内の競合的結合検定を用いて測定された（表１３）。Ｇ９_１５４のＨＬＡ−Ａ２・１分子との結合親和性（１１ｎＭで標準的ペプチドの５０％阻害）はＧ９_１５４のＣ末端に余計にロイシンを含むＧ１０_１５４（１０１０ｎＭ）より高く、Ｇ１０_１５４よりも低濃度でＴ２細胞を感受性にすることが出来た（図８Ａ）。Ｇ９_２０９のＨＬＡ−Ａ２．１との結合親和性（８４ｎＭ）はまた、Ｇ９_２０９のＮ末端に余分のスレオニンを含むＧ１０_２０９より（２０８０ｎＭ）高く、Ｇ１０_２０８よりも低濃度でＴ２細胞を感受性にすることが出来た（図８Ｂ）。ゆえに、９量体のペプチドは対応している１０量体のペプチドより、Ｔ２細胞をＣＴＬ溶解に感受性にする効果が大きく、ＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性も、より高かった。これは、同定されたＭＡＲＴ−１の９及び１０アミノ酸ペプチド（Ｍ９−２，Ｍ１０−３，Ｍ１０−４）にもあてはまった（実施例２；ｋａｗａｋａｍｉ ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７）。Ｔ２細胞の溶解検定の結果得られたペプチドの力価は試験管内で検定した、ＨＬＡ−Ａ２．１との結合親和性の測定結果に一致した。他のｇｐ１００エピトープ、Ｇ９_２８０，Ｇ１０−４またはＧ１０−５は、ＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性を持ち、各々９５ｎＭ、４８３ｎＭまたは１３ｎＭで５０％阻害を示した。以前に同定されたＨＬＡ−Ａ２のＨＬＡ−Ａ２．１結合親和性はＭＡＲＴ−１中のメラノーマエピトープを制限した。（実施例２；ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７）そして、チロシナーゼ（Ｗｏｌｆｅｌ，Ｔ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：７５９； 配列番号：３１と３２）も同様に測定された。（Ｍ９−２（３９７ｎＭ），Ｍ１０−３（２２７２ｎＭ）Ｍ１０−４（５５５５ｎＭ），Ｔ９_１（３３３ｎＭ），Ｔ９_３６９（４０ｎＭ））１０量体ペプチド（Ｇ１０_１５４，Ｇ１０_２０８，Ｇ１０−３，Ｇ１０−４）の他に、これを含んでいる９量体エピトープ（Ｇ９_１５４，Ｇ９_２０９，Ｍ９−２）が存在し、すべてのメラノーマエピトープはいずれも高いＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性（Ｇ９_１５４，Ｇ１０−５，Ｔ９_３６９）または、中程度の結合親和性（Ｇ９_２０９，Ｇ９_２８０，Ｇ１０−４，Ｍ９−２，Ｔ９_１）を持っている。
【０１９６】
考察
自家移植患者へ移した時の腫瘍の後退にかかわる４つのＴＩＬによって認識される、人のメラノーマ抗原ｇｐ１００の複数のエピトープはこの研究で同定された。この研究で記載された５つのエピトープのうち、Ｇ９_１５４またはＧ１０_１５４が最も一般的に認識されるようであった。これらは異なる患者由来の４つのｇｐ１００に反応的なＴＩＬのうち３つによって認識されるからである。Ｇ９_２８０ペプチドは異なる患者のＰＢＬ由来の５つすべてのＣＴＬによって認識されることが報告されているが（Ｃｏｘ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６４：７１６）、この研究では、これは４つのｇｐ１００反応的ＴＩＬのうち２つにしか認識されていない。この違いは、使われたＴ細胞の源（ＴＩＬとＰＢＬ）によって生じたのだろう。
【０１９７】
ＭＡＲＴ−１ペプチドのＭ９−２はＭ９_２７とも呼ばれ、ＭＡＲＴ−１ペプチドＭ１０−３はＭ１０_２６とも呼ばれ、そしてＭＡＲＴ−１ペプチドのＭ１０−４はＭ１０_２７とも呼ばれることは理解されよう。ｇｐ１００ペプチドのＧ１０−４もまたＧ１０_４５７と呼ばれ、ｇｐ１００ペプチドのＧ１０−５もまたＧ１０_４７６と呼ばれることも認められるであろう。
【０１９８】
【表１１】

【０１９９】
【表１２】

【０２００】
ＴＩＬによる、ＭＡＲＴ１抗原決定基、Ｍ９−２（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）及びｇｐ１００細胞決定基、Ｇ９_１５４（ＫＴＷＧＯＹＷＱＶ）、Ｇ１０_１５４（ＫＴＷＧＱＹＷＧＶＬ）、Ｇ９_２０９（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、Ｇ１０_２０８（ＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、Ｇ９_２８０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）、Ｇ１０−４（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ）、Ｇ１０−５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ）の１μｇ／ｍｌ（^* １ｎｇ／ｍｌ）と共に前もって保温したＴ２細胞の溶解は、４ｈ−^５１Ｃｒ遊離検定で測定された。ＴＩＬ６２０−１，−２またはＴＩＬ６６０−１，−２，−３は、自己移植した患者にほどこされたＴＩＬと同じＴＩＬから増殖させたが、但し別々に培養した。６２４ｍｅｌは、ＨＬＡ−Ａ２^＋，ｇｐ１００^＋，ＭＡＲＴ−１^＋のメラノーマ細胞系列であり、３９７ｍｅｌは、ＨＬＡ−Ａ２⁻メラノーマ細胞系列であり、Ｔ２細胞は、ＨＬＡ−Ａ２^＋Ｔ細胞−Ｂ−細胞ハイブリドーマである。アンダーラインの数値は統計的に有意な溶解である。
【０２０１】
【表１３】

【０２０２】
ａ．標準となる放射線標識したＨＢＣ１８−２７ペプチドの５０％阻害に必要となる試料ペプチドの濃度
ｂ．試料ペプチドの結合親和性と、標準となるペプチド（５ｎＭで５０％阻害を示す）の結合親和性の相対比
ペプチドは５０％阻害を５０ｎＭ以下で示す、つまり相対比が０．１以上の時、高い親和性；５０〜５００ｎＭで５０％阻害つまり相対比が０．１〜０．０１の時、中程度の；５００ｎＭ以上で５０％阻害つまり、相対比が０．０１以下なら弱い；
結合ペプチドと定義される。
【０２０３】
実施例５
メラノーマの修飾
免疫性の改良のためのエピトープ
材料と方法
ペプチド合成とＨＬＡ−Ａ２．１結合検定
ペプチドは固相法によって多ペプチド合成機を用いて合成され、前に記載したようにＨＰＬＣによって精製された（Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ，Ｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４：２２５７−２２６５）。ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合の相対比は、放射線標識した標準ペプチドの可溶化した標的ＭＨＣ分子に対する結合の阻害に基づいて、前に記載したように測定された（Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ，Ｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４：２２５７−２２６５）。手短かにいうと、様々な濃度の試験ペプチド（１００μＭから１ｎＭの範囲）を５ｎＭの放射線標識したＨｂｃ１８−２７（ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ）（配列番号：１２５）ペプチド及びＨＬＡ−Ａ２．１重鎖及びβ２−ミクログロブリンと共に室温において２日間プロテアーゼ阻害剤存在下で保温した。ＭＨＣ結合の放射線活性のパーセント割合はゲル濾過によって決定し、各々のペプチドについて５０％阻害する量が計算された。
【０２０４】
ペプチド特異的ＣＴＬの誘導： ＰＢＭＣはＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ患者及び正常な供与者の末梢血液からフィコール−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心によって分離され、新鮮な状態または低温保存の試料として用いられた。ペプチド特異的ＣＴＬ系列は次のように生成された。０日目に、ＰＢＭＣを１．５×１０^６／ｍｌの濃度で２４穴プレート（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）の１０％のヒトのＡＢ血清、Ｌ−グルタミン、抗生物質（ＣＭ）を含み、１μｇ／ｍｌのペプチドが存在するＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地に培養した。２日後、１２ＩＵ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を培養液に加えた。リンパ球は次のように弱く再び刺激された。：応答細胞を回収し、一度洗浄し、２４穴プレートに２．５×１０^５細胞／ｍｌの濃度になるようＣＭ存在下で移した。自家移植したＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳで２回洗浄し、５−８×１０^６細胞／ｍｌの濃度にＣＭに懸濁する。そして１μｇ／ｍｌペプチドと１５ｍｌの円錐型チューブ（５ｍｌ／チューブ）中において３時間３７℃で反応させた。これらのＰＢＭＣ（刺激剤）に３０００ｒａｄｓの線量の放射線を照射して、一度ＰＢＳで洗浄し、応答細胞に応答細胞：刺激物の比が１：３から１：１０の間の範囲で加えた。次の日、１２ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を培養液に加えた。これらのＣＴＬの活性は最低２回の（１４日間）ペプチドの刺激の後に細胞毒性検定によって試験された。ＴＩＬからＣＴＬを生成するため、単離した腫瘍の懸濁液を１−２日間、腫瘍細胞の接着を許す１０％ＦＣＳ ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。非接着画分から採られたリンパ球は前に記載したようにペプチド特異的ＣＴＬの誘導に用いられた。
【０２０５】
ＣＴＬによる抗原認識の評価：^５１Ｃｒ放出細胞毒性検定をＣＴＬによるペプチドとメラノーマ細胞の認識を検出するために行った。ペプチドの認識を解析するためＴ２細胞系を１μｇ／ｍｌのペプチドと共に３７℃で２時間前もって保温した。そして、洗浄してから^５１Ｃｒ放出細胞毒性検定に用いた。メラノーマ細胞系６２４ｍｅｌは我々の研究所において確立された。（実施例１参照）
抗メラノーマＴ細胞の誘導のために、自然のメラノーマエピトープより抗原性の強いペプチドを生成する目的で、特異的ＭＨＣクラスＩ対立形質に結合するペプチドの普遍的モティーフをもとに、少なくとも１つのアミノ酸が変化するように様々なペプチドを作製した（Ｆａｌｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５１：２９１； Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３； Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１４９：３５８０；Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７）（表１４、１５、１６、及び１７）。ほとんどの従来単離されたウィルス性のエピトープ及び自然に処理されたＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドは２つ目の主要な錨部位に、ロイシンまたはメチオニン、最後の主要な錨部位（支配的な錨アミノ酸）にはバリンを含み、ＨＬＡ−Ａ２．１、に対し高い結合親和性を持っていたが、単離されたＭＡＲＴ−１またはｇｐ１００メラノーマエピトープは、主要な錨部位にアラニン（Ｍ９−２の２つ目の部位，及びＧ９−２８０の９つ目の部位）や、スレオニン（Ｇ９−１５４、及びＧ９−２０９の２つ目の部位）のような非優勢アミノ酸を含む。Ｍ９−２，Ｇ９−２０９及びＧ９−２８０は、高い親和性の結合者ではない。ＨＬＡ−Ａ２のペプチドとの結合に対し重要であるが、Ｔ細胞受容体による認識にそれほど重要でない１、２、３、または９番目の部位のアミノ酸の変化によって、人工的にＨＬＡ−Ａ２．１により高い親和性で結合し、しかも天然のエピトープ特異的Ｔ細胞によって認識されるペプチドが作られるであろう。
【０２０６】
修飾されたＭ９−２、Ｇ９−２８０、Ｇ９−２０９、Ｇ９−１５４ペプチドのうちで、Ｍ９−２−２Ｌ、Ｍ９−２−１Ｆ、Ｍ９−２−３Ｙ、Ｇ９−２８０−９Ｖ、Ｇ９−２８０−９Ｌ、Ｇ９−２８０−９１、Ｇ９−２８０−１Ｆ、Ｇ９−２０９−２Ｌ、Ｇ９−２０９−２Ｍ、Ｇ９−２０９−２１、Ｇ９−２０９−１Ｆ、Ｇ９−２０９−１Ｙ、Ｇ９−２０９−１Ｗ２Ｌ、Ｇ９−２０９−１Ｆ２Ｌ、Ｇ９−２０９−１Ｙ２Ｌは、より高い結合親和性を持ち、もとのメラノーマ反応性Ｔ細胞によって認識される（表１４、１５、１６、及び１７）。Ｇ９−１５４−２Ｉ、Ｇ９−２０９−１Ｆ２ＬまたはＧ９−２８０−９Ｖ（表１８、１９及び２０）を作用させた自己ＰＢＭＣで刺激したＰＢＬは、元のエピトープのみならずメラノーマ瘍細胞（６２４ｍｅｌ）をも天然のエピトープ（Ｇ９−１５４、Ｇ９−２０９、Ｇ９−２８０）で刺激したＰＢＬよりもよく認識し、溶解させた。
【０２０７】
これらの結果は、修飾したペプチドは天然のエピトープのかわりに抗腫瘍Ｔ細胞の誘導のために使うことが出来ることを示した。我々の研究で使われた特定のＴ細胞によって認識されなかったがＨＬＡ−Ａ２．１に対して高い結合親和性を持つほかのペプチドは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で元のメラノーマエピトープを認識することの出来る異なるＴ細胞の組を誘導するであろう。これらの修飾したペプチドは試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での抗メラノーマＴ細胞の誘導、及びメラノーマの患者の治療またはメラノーマの予防のために、患者に対し免疫予防注射に用いることが出来るだろう。
【０２０８】
【表１４】

【０２０９】
【表１５】

【０２１０】
【表１６】

【０２１１】
＊標準的な放射性標識したＨＢＣ１８−２７ペプチドを５０％阻害するのに必要な試料ペプチドの濃度。ププチドは、高結合親和性（＜５０ｎＭで５０％阻害）、中結合親和性（５０−５００ｎＭ）、および低結合親和性（＞５００ｎＭ）として定義される。（実施例４参照）
【０２１２】
【表１７】

【０２１３】
【表１８】

【０２１４】
Ｃｒ放出測定は、ペプチドであらかじめインキュベートした自己のＰＢＭＣで４回刺激した後に行った。
【０２１５】
【表１９】

【０２１６】
Ｃｒ放出測定は、ペプチドであらかじめインキュベートした自己のＰＢＭＣで４回刺激したあとに行った。
【０２１７】
【表２０】

【０２１８】
Ｃｒ放出測定は、ペプチドであらかじめインキュベートした自己のＰＢＭＣで４回刺激したあとに行った。
【０２１９】
実施例６
哺乳動物におけるメラノーマの治療のためのＭＡＲＴ−１ワクチン
ＭＡＲＴ−１ワクチンは、メラノーマにくるしむ哺乳動物を治療するのに効果的であろう。例えば、ＭＡＲＴ−１は、個体に投与できる。哺乳動物は、約１ｍｇから約１００ｍｇの範囲でＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドまたは本明細書中に記載した改変ペプチドで免疫できる。または、哺乳動物、好適にはヒトは、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたは鶏ポックスウイルスのようなウイルスベクター中に挿入したＭＡＲＴ−１核酸配列で免疫できる。免疫性ＭＡＲＴ−１ペプチドまたは改変ペプチドまたはその類似体に相当する、ＭＡＲＴ−１核酸配列を持つ約１０^６個から約１０^１１個の範囲のウイルス粒子を、哺乳動物個体、好適にはヒトに投与できる。哺乳動物は、免疫原に対する抗体、または免疫原を認識する細胞毒性リンパ細胞（ＣＴＬ）の増加について従来の方法によって、または病気の臨床的症状の緩和について測定する。評価の対象となる特定の変数は、ワクチン抗原または腫瘍退縮を認識する免疫細胞の生産を含む。このようなワクチンは、予防的にまたは治療的に投与される。哺乳動物は、また、レトロウイルスベクターに挿入したｇｐ−１００核酸配列またはＧＰ−１００免疫原性ペプチドまたは改変ペプチドまたはその類似体で免疫できる。使用されるレトロウイルス中の抗原の示唆される量の範囲は、哺乳動物、好適にはヒト、一体につきウイルス粒子約１０^６個から約１０^１１個である。レトロウイルスワクチンの反応および効能は、上述したように測定される。
【０２２０】
実施例７
メラノーマに苦しむ哺乳動物を治療的に処置するためのメラノーマ抗原由来の免疫原ペプチドに対して感作されたリンパ細胞の使用
メラノーマ抗原によってあらかじめ感作されたＴ−リンパ細胞は、メラノーマに苦しむ哺乳動物を治療的に処方するのに効果的である。Ｔ−リンパ細胞は、末梢血液リンパ細胞または腫瘍浸潤リンパ細胞より単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドにさらす。Ｔ−リンパ細胞は、末梢血液またはメラノーマ懸濁液から単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養する（川上，Ｙ．ら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１）。Ｔ−リンパ細胞は、約１から約１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて１−１６時間のあいだＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶにさらす。抗原にさらされたＴ−リンパ細胞は、哺乳動物、好適にはヒトに、哺乳動物にたいして約１０^９個から約１０^１２個リンパ細胞として投与される。あるいは、Ｔ−リンパ細胞は、改変ＭＡＲＴ−１ペプチドにさらされる。リンパ細胞は、静脈注射、腹膜内または傷害部に投与される。この処置は、サイトカイン、放射治療、メラノーマ病変の外科的切除および化学治療薬、養子免疫法によるＴリンパ細胞治療のような他の治療的処置とともに同時に投与できる。または、Ｔ−リンパ細胞を、ｇｐ１００免疫原ペプチドまたは本明細書中に記載した改変免疫原ペプチドにさらしてもよい。
【０２２１】
寄託した態様は本発明の一つの側面についての単なる例示であり、本発明は寄託した核酸配列の範囲に限らず、機能的に同等であるいかなる配列も本発明の範囲内である。実際に、本明細書中に示し、記載したものに加えて発明を様々に改変することは、前の記載および以下の図により当業者には可能である。このような改変は、請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、ＭＡＲＴ−１抗原をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を示す。疎水性領域を下線で示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＩＬによって認識されるＭＡＲＴ−１ペプチドの滴定について示している。Ｔ２細胞を、様々な濃度の精製ＭＡＲＴ−１ペプチド、Ｍ９−１、Ｍ９−２、Ｍ９−３、Ｍ１０−３、Ｍ１０−４およびＭ１０−５と共にインキュベーションし、ＴＩＬクローンＡ４２（図２Ａ）またはＴＩＬ細胞系ＴＩＬ１２３５（図２Ｂ）による溶解を、Ｅ（エフェクター）：Ｔ（標的）比をＡ４２では２０：１、ＴＩＬ１２３５では４０：１として、４ｈ−^５１Ｃｒ遊離細胞毒性アッセイによって測定した。ペプチドＭ９−２は、１ｎｇ／ｍｌの濃度でＴ２細胞を感受性にした。精製したペプチドＭ１０−４は、ＴＩＬ１２３５によって認識されたが、Ａ４２によっては認識されなかった（Ｍ９−１ ｜−｜、Ｍ９−２ ●−●、Ｍ９−３ 黒四角−黒四角、Ｍ１０−２ ▲−▲、Ｍ１０−３ ▼−▼、Ｍ１０−４ 黒四角−黒四角、Ｍ１０−５ ＋−＋）。
【図３】図３Ａは、自己由来の^１１１Ｉｎ標識ＴＩＬ１２００の養子移入を受け入れた後の転移性メラノーマ患者１２００の放射性核種走査を示す。矢印は、左腿の転移病巣に該当するＴＩＬ蓄積領域の一つを示す。図３Ｂは、ＴＩＬ１２００＋ＩＬ−２での治療の後の皮下の転移腫瘍の退縮を示す。治療は０日に開始した。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ｃＤＮＡ２５の全長の核酸配列を示す。開始コドンおよび停止コドンを下線で示す。
【図５】図５Ａは、ｃＤＮＡ２５の全長のアミノ酸配列を示す。抗原性ペプチドを下線で示す。図５Ｂは、全長のｃＤＮＡ２５（ｃＤＮＡ２５ＦＬ）、端を切り取った形のｃＤＮＡ２５（ｃＤＮＡ２５ＴＲ）、Ｐｍｅ１１７、ＭＥ２０およびｇｐ１００のアミノ酸配列の比較を示す（●は欠損を示し；−は同一を示す）。
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、メラノーマ（図６Ａ）および新生児メラノサイト細胞系（図６Ｂ）および様々な新鮮組織（図６Ｃ）（１０−２０μｇの全ＲＮＡ）と、ｃＤＮＡ２５プローブ（ｐＣＲＩＩ−ｃＤＮＡ２５のＳａｌＩ消化フラグメント）およびβ−アクチンプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とのノーザンブロット分析を示す。Ｃ３２、５８６ｍｅｌメラノーマ細胞系およびＮＨＥＭ５２９、ＮＨＥＭ５３０新生児メラノサイト細胞系は、非常に弱い陽性であった。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、ｇｐ１００エピトープおよびエピトープ分析で試験したＤＮＡフラグメントの位置ならびにＣＴＬによる認識を示す。図７Ａ；エピトープ分析で試験した５つのＤＮＡフラグメント（Ｄ３、Ｄ５、Ｄ４、Ｃ４、２５ＴＲ）を示す（−−−、同一アミノ酸）。同定されたエピトープの位置を下線で示す。図７Ｂ；ＩＦＮ−γ分泌アッセイによって、ＨＬＡ−Ａ２．１ｃＤＮＡと共に、ｐｃＤＮＡ３プラスミド中のそれぞれのＤＮＡフラグメントを移入したＣＯＳ７細胞のＣＴＬ（６２０−１、６２０−２、６６０−１、１１４３、１２００）による認識を示す（＋、認識；−、非認識）。
【図８】図８Ａ−８Ｄは、ＣＴＬ溶解に対してＨＬＡ−Ａ２．１＋Ｔ２細胞を増感させることによるｇｐ１００の滴定を示す。ペプチドと共に前もってインキュベーションしたＴ２細胞の溶解は、４ｈ^５１Ｃｒ遊離細胞毒性アッセイで試験した。図８Ａ；Ｇ９_１５４（黒四角）またはＧ１０_１５４（●）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ１２００による溶解。図８Ｂ；Ｇ９_２０９（黒四角）またはＧ１０_２０８（●）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ６２０による溶解。図８Ｃ；Ｇ９_２８０（黒四角）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ６６０−１による溶解。図８Ｄ；Ｇ１０−５（黒四角）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ６６０−２による溶解。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍浸潤リンパ球に反応性である、ｇｐ１００（配列番号：１２１）の少なくとも約８つの隣接するアミノ酸を有する免疫原性ペプチド。
【請求項２】
ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ（配列番号：３３）、ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ（配列番号：３４）、ＶＬＫＲＣＬＬＨＬ（配列番号：３６）、ＡＬＤＧＧＮＫＨＦＬ（配列番号：３５）、ＶＬＰＳＰＡＣＱＬＶ（配列番号：３７）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号：４０）、ＳＬＡＤＴＮＳＬＡＶ（配列番号：３８）、ＳＶＳＶＳＱＬＲＡ（配列番号：３９）、ＬＮＶＳＬＡＤＴＮ（配列番号：４１）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号：４６）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶＬ（配列番号：４７）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：４８）、ＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号：４９）、配列番号：１２１のアミノ酸１−１５４、配列番号１２１：のアミノ酸１−１６３、配列番号１２１：のアミノ酸１−１９５、配列番号：１２１のアミノ酸１−２７０、及び配列番号：１２１のアミノ酸２３６−６６１からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項３】
ｇｐ１００配列の少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１又は２に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項４】
前記修飾がペプチド配列中の少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する、請求項３に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、ペプチド配列中の（ｉ）１位、（ｉｉ）２位、（ｉｉｉ）３位、（ｉｖ）９位、（ｖ）１０位、及び（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のうちの少なくとも二つの組み合わせ、からなる群から選択される部位に存在する、請求項４に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項６】
配列番号：６８−７０、７４−７９、８３−８８、及び１０１−１０８からなる群から選択される、請求項５に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項７】
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＧＱＹＷＱＸ_４、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＱＶＰＦＳＸ_４、及びＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＰＧＰＶＴＸ_４：
［式中、
Ｘ_１は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ_２は、任意の疎水性脂肪族アミノ酸であり；
Ｘ_３は、任意のアミノ酸であり；そして
Ｘ_４は、疎水性脂肪族アミノ酸である］
からなる群から選択される式を有する免疫原性ペプチド。
【請求項８】
Ｘ_１のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、スレオニン、イソロイシン、バリン、チロシン、セリン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジン、及びアスパラギン酸からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項９】
Ｘ_２が、メチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、及びスレオニンからなる群から選択される、請求項７又は８に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１０】
Ｘ_３が、メチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、リジン、及びアスパラギン酸からなる群から選択される、請求項７ないし９のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１１】
Ｘ_４が、メチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、及びスレオニンからなる群から選択される、請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１２】
ＨＬＡ−Ａ２制限腫瘍浸潤リンパ球に反応性である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１３】
天然、合成、又は組換えペプチドである、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１４】
配列番号：２７のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質、又はその免疫原性ペプチドであって、配列番号：２７の少なくとも５つの隣接するアミノ酸を含む免疫原性ペプチド。
【請求項１５】
配列番号：２７のアミノ酸１６２を含む、請求項１４に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１６】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を刺激することができる、請求項１４又は１５に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載のペプチド又は請求項１４に記載のタンパク質をコードする精製され単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１７の少なくとも１つの核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
真核発現ベクター又は原核発現ベクターである、請求項１８に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載の核酸又は請求項１８若しくは１９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１８又は１９に記載の発現ベクターを含む非ヒト宿主生物。
【請求項２２】
請求項１４に記載のタンパク質又は請求項１ないし１６のいずれか１項に記載のペプチドに結合する抗体。
【請求項２３】
請求項１４に記載のタンパク質、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド、請求項１７に記載の核酸、請求項１８若しくは１９に記載の発現ベクター、請求項２０に記載の宿主細胞、又は請求項２２に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項２４】
請求項１に記載のタンパク質、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド、請求項１７に記載の核酸、請求項１８若しくは１９に記載の発現ベクター、請求項２０に記載の宿主細胞、又は請求項２２に記載の抗体、及び薬学的に許容される助剤、希釈剤、又は担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
被験者における疾患を治療又は予防するための請求項２４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
疾患が癌である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
癌がメラノーマである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
被験者がヒトである、請求項２５ないし２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記医薬組成物がＩＬ−２と組み合わせて使用される、請求項２５ないし２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
ヒトの癌を治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項１に記載のタンパク質、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド、請求項１７に記載の核酸、請求項１８若しくは１９に記載の発現ベクター、請求項２０に記載の宿主細胞、又は請求項２２に記載の抗体の使用。
【請求項３１】
前記薬剤がさらにＩＬ−２を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
配列番号：２７又は１２１のペプチドの免疫原性を評価するインビトロの方法であって、
（ａ）配列番号２７又は１２１の複数のペプチドを調製し；
（ｂ）前記ペプチドの少なくとも一つと哺乳類の細胞株とをインキュベートし；
（ｃ）前記哺乳類の細胞株を腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に暴露し；そして
（ｄ）前記ＴＩＬの認識をスクリーニングして、それにより前記ペプチドの免疫原性を評価する
ことを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記ペプチドが９ないし１０個のアミノ酸である、請求項３２に記載のインビトロの方法。
【請求項３４】
工程（ｂ）における哺乳類の細胞株の細胞が、ＣＯＳ細胞、Ｔ２細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、樹状突起細胞、単核細胞、及びＥＢＶでトランスフォームされたＢ細胞株からなる群から選択される、請求項３２又は３３に記載のインビトロの方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【公開番号】特開２００６−７５１６１（Ｐ２００６−７５１６１Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５３４６４（Ｐ２００５−２５３４６４）
【出願日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【分割の表示】特願平７−５２７８２１の分割
【原出願日】平成７年４月２１日（１９９５．４．２１）
【出願人】（５０２００６７８２）アメリカ合衆国 (47)
【Ｆターム（参考）】