ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド及びその調製と使用
ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド及びその調製方法を提供する。上記コラーゲンペプチドは、タンパク質８０〜９０ｗｔ％、及び糖１０〜２０ｗｔ％を含み、平均分子量が１，０００〜３，０００である。上記コラーゲンペプチドは、単糖としてグルコースを主に含み、アミノ酸として、グリシンを１６％以上、プロリン及びヒドロキシプロリンを合計で１８％以上含む。上記コラーゲンペプチドは、免疫増強作用を有する医薬品、健康製品やスキンケア・美容用品の調製に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド及びその調製プロセスに関し、天然生物活性物質の分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
ユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉｉ）は、中国で「麻zhe（＊「折」の下に「虫」）」と俗称され、腔腸動物門（Ｐｈｙｌｕｍ Ｃｎｉｄａｒｉａ）、ハチクラゲ綱（Ｃｌａｓｓ Ｓｃｙｐｈｏｍｅｄｕｓａｅ）、旗口クラゲ目（Ｏｒｄｅｒ Ｐｈｙｌｕｍ ｃｎｉｄａｒｉａ）、ユウレイクラゲ科（Ｆａｍｉｌｙ Ｃｙａｎｅａ）に属する大形の海洋性プランクトンである。わが国の沿海においては、白色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）、キタユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｃａｐｉｌｌａｔａ）、褐色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚ）、及び紫色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）という４種類がすでに発見され、そのうち、白色のユウレイクラゲが一番数多く、また、最も広く分布している。
【０００３】
ユウレイクラゲは、一般に小形の浮遊動物を餌とし、その生殖腺が発達しており繁殖力が強く、成長速度も極めて速く、現在、わが国においてユウレイクラゲの年間産出量が既に１，０００万トンにも達し、新たな天然海洋生物資源となっている。
【０００４】
海洋由来の多糖、プロテオグリカン、及びコラーゲンペプチドは、非常に重要な天然海洋食品資源として、顕著な生物活性をもっている。例えば、ナマコ多糖、海藻多糖などについて、顕著な生物活性を有することを確認した研究レポートがたくさんある。ユウレイクラゲを素材とするコラーゲンペプチドの分離・抽出・調製についての研究レポートは、国内外でめったに見られず、今まで、その中から免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドを分離抽出することに関するレポートはまだ発見されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド及びその調製プロセスと使用を提供する。本発明は、新たな天然海洋生物資源であるユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉｉ）をコラーゲンペプチドの調製素材として加工することを特徴とし、ユウレイクラゲに対する開発利用の目的が達成されている。本発明によれば、極めて高いスループットで高純度のコラーゲンペプチド製品を得ることができる。これは、ユウレイクラゲという天然海洋生物資源の総合的利用に非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
外見が白色又は淡黄色で、無臭で、苦味のある粉末であり、ユウレイクラゲ科の海洋生物である白色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）、キタユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｃａｐｉｌｌａｔａ）、褐色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚ）、又は紫色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）の捕獲されたばかりの新鮮なもの、または明礬に３回漬け込んだものから分離抽出して得られ、無毒で、顕著な免疫増強活性を有するものであって、タンパク質８０〜９０％、糖１０〜２０％を含み、平均分子量が１，０００〜３，０００であり、単糖としてグルコースを主に含み、アミノ酸として、グリシンを１６％以上、プロリン及びヒドロキシプロリンを合計で１８％以上含むことを特徴とするユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドである。
【０００７】
前記コラーゲンペプチドを調製するプロセスであって、
（ｌ）ユウレイクラゲを水に含浸させる工程と、
（２）含浸された前記ユウレイクラゲを溶融してから、遠心分離を行い、無色または淡黄色の上澄み液を得る工程と、
（３）上澄み液を直接乾燥し、又は、均質化・脱色・脱塩してから乾燥し、白色又は淡黄色の粉末であるコラーゲンペプチドを得る工程と
を含むコラーゲンペプチドの調製プロセスである。
【０００８】
上述した溶融とは、溶融剤により、ユウレイクラゲを液体となるように水に溶かすことである。
【０００９】
具体的には、まず、本発明者らは、新鮮な、又は明礬に３回漬け込んだ市販のユウレイクラゲを脱塩すると、コラーゲンペプチドの調製素材として利用可能であることを発見した。それに含まれるコラーゲンペプチドは、水による含浸処理に対する安定性があり、本発明者らが採る含浸工程の条件下では、含浸により分解され、水中に抽出されて流失してしまうことがなく、含浸により続く加水分解処理における分散性に影響を与えることもない。即ち、明礬に３回漬け込んだユウレイクラゲと、捕獲されたばかりの新鮮なユウレイクラゲとは同等の加工可能性があり、いずれも高純度で高生物活性のコラーゲンペプチドの調製素材として用いることができる。これにより、ユウレイクラゲを素材として加工し、高純度で高生物活性のコラーゲンペプチドを調製する基礎が打ち立てられている。
【００１０】
次に、本発明者らは、温度、圧力などの加水分解条件、及び水酸化ナトリウム、塩酸、コラーゲン酵素などのよく用いられる様々な溶融剤を体系的に調査して比較した結果、適当な加水分解条件下で、ユウレイクラゲに含まれるコラーゲンが、改質を行うことなく、直接加水分解され、水中に分散することができ、清澄透明で不純物の極めて少ない加水分解分散液が得られることを見出した。
【００１１】
本発明者らは、含浸溶媒、含浸時間、加水分解剤などの加水分解工程のパラメーターのうち、加水分解剤の種類、及び加水分解に用いられる温度が、加水分解収率に最も重要であることを発見した。
【００１２】
そのうち、有効な溶融剤としては、良く見られるアルカリ（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウムの水酸化物や炭酸塩、アンモニア水などで、濃度０．１〜１０ｍｏｌＬ−１）、良く見られる酸（例えば、塩酸、リン酸、硫酸などの無機酸や、ギ酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、レモン酸などの有機酸で、濃度０．１〜１０ｍｏｌＬ−１）、又は各種のプロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、コラーゲン酵素、エラスターゼなど）のうちの１つ又は複数であり、溶融は、ｐＨ０．５〜１４．０、温度１０〜１２０℃、操作圧力０．０００１〜０．５ＭＰａの条件下で行われる。
【００１３】
水酸化ナトリウムを溶融剤として選定して使用する場合、ｐＨは７．０〜１４．０とすべきである。塩酸を溶融剤として選定して使用する場合、ｐＨは０．５〜６．８とすべきである。プロテアーゼ類を溶融剤として選定して使用する場合、ｐＨは選ばれる酵素の最適ｐＨ範囲にすべきである。酸・アルカリを溶融剤として選定して使用する場合、融溶温度は１０〜１２０℃にすべきであり、０〜６０℃にすることが好ましい。プロテアーゼ類を溶融剤として選定して使用する場合、プロテアーゼ類の最適温度で加水分解を行うべきである。
【００１４】
そのほかの各パラメーターとして、含浸は、ｐＨ２〜１２における一定値に調整された、好ましくはｐＨ６．５〜６．８の水中で行われるべきであり、含浸温度は０〜９８℃であり、０〜１５℃が好ましく、含浸操作は、含浸水の導電率が３０μＳｃｍ−１より低くなったときに停止する。遠心分離は、０〜１２０℃、好ましくは０〜１０℃の条件下で行われ、遠心機の回転速度は４０００〜１２０００ｒｐｍであり、６０００〜８０００ｒｐｍが好ましく、遠心時間は１０〜６０ｍｉｎである。液体の乾燥手段としては、凍結乾燥であってもよく、スプレー乾燥であってもよい。
【００１５】
本発明にかかるユウレイクラゲの活性コラーゲンペプチドは、予備研究により、顕著な免疫増強活性を有し、新規な生物活性材料及び健康食品素材として食品、健康製品、スキンケア・美容用品や医薬用品などの分野に広く適用され、免疫増強作用を有する医薬品、健康製品、スキンケア・美容用品の調製に用いられることができることが確認されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
下記の実施例は、本発明の操作方法を詳細に説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００１７】
実施例１
明礬に３回漬け込んだ市販のユウレイクラゲ１０００ｇを取り、脱水した後、室温下で２〜５倍量の脱イオン水に含浸させ、含浸水における塩化ナトリウムの含有量が１．５ｐｐｍより低くなり（塩素イオン検出で陰性を示す）、且つ、含浸水の導電率が３０μＳｃｍ−１より低くなるまで、２〜３時間ごとに水を１回替えた。含浸された脱塩ユウレイクラゲに、４０００Ｕｎｉｔｓの活性力を有するトリプシン１０ｇを添加し、３０〜６０℃で４〜２４時間保温・溶融して、懸濁液を得た。そして、遠心（４℃、８０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）して不融性残留物を除去し、清澄透明な液体であるコラーゲンペプチド液を得た。コラーゲンペプチド液を回転蒸発器に置き、４０℃、０．００１ＭＰａで元の体積の１／５に濃縮した後、スプレー乾燥し（吸気温度１８５℃、排気温度８５℃）、純度が９０％以上に達した顕著な免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドの粉状固体２０ｇを得た。
【００１８】
前記溶融は、操作圧力０．００１ＭＰａの条件下で行われてもよい。
【００１９】
実施例２
新鮮なユウレイクラゲ１００ｋｇを取り、３〜１０℃で２〜５倍量の脱イオン水に含浸させ、含浸水の導電率が３０μＳｃｍ−１より低くなるまで、２〜３時間ごとに水を１回替えた。含浸された脱塩ユウレイクラゲに、複合酵素製剤（市販のトリプシン、パパイン、コラーゲン酵素、及び中性プロテアーゼを１：１：１：１の配合比で配合したもの）５００ｇを添加し、３５〜５０℃で８〜１６時間保温してから、４℃、８０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心した。不融性残留物を除去し、清澄透明な液体であるコラーゲンペプチド液を得た。コラーゲンペプチド液を４０℃、０．００１ＭＰａで元の体積の１／２に濃縮した後、凍結乾燥して、純度が９５％以上に達した顕著な免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドの粉状固体１０００ｇを得た。
【００２０】
前記溶融は、操作圧力０．１ＭＰａの条件下で行われてもよい。
【００２１】
実施例３
１つのコラーゲンペプチド粉のサンプル（例えば、実施形態２の方法により調製して得られたもの）に対して、タンパク含有量の測定、全糖含有量の測定、アミノ酸組成の測定、及び単糖組成の測定を行った。測定の結果から、このサンプルにタンパク質８８％、糖１０．５％を含み、平均分子量が１２７４であることが分かる。単糖としてはグルコースを主に含んでおり、アミノ酸の組成は表１に示す通りである。
【００２２】
表１ 試験用サンプルのアミノ酸組成
【表１】
【００２３】
実施例４
健康な昆明種白マウス（雌雄半分ずつ、満４年子、体重１８〜２２ｇ、無錫市恵山江南実験動物場より（認可番号：ＳＣＸＫ（蘇）２００２−０００６））を実験動物とし、得られたコラーゲンペプチド粉（例えば、実施例２の方法により調製して得られたもの）に対して急性毒性試験を行った。結果を表２及び表３に示す。
【００２４】
表２ 試験用サンプルのマウスの体重に対する影響
【表２】
【００２５】
表３ 急性毒性試験の結果
【表３】
【００２６】
投薬してから１時間において、マウスはいずれも動きが減少したが、４時間後、除々に正常に動くようになったことが観察された。試験群は、７日間において、摂食量が次第に増加し、マウスの食欲、活力、毛色は正常であり、７日間後、頸椎脱臼で殺し、肉眼で検死解剖したところ、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓などの主な臓器において病理変化や中毒現象が見られなかった。観察期間の７日間において毎日体重を量ったが、試験群のマウスの体重は次第に増えた。研究の結果から、試験用サンプルを大量に胃内投与した場合に、マウスの死亡が現れず、明らかな毒性反応もないことが分かる。これは、その毒性が無い又は極めて小さく、その最大安全投与量が７５００ｍｇ／Ｋｇ以上であることを示す。
【００２７】
実施例５
健康な昆明種白マウス（雌雄半分ずつ、満４年子、体重１８〜２２ｇ、無錫市恵山江南実験動物場より（認可番号：ＳＣＸＫ（蘇）２００２−０００６））を実験動物とし、得られたコラーゲンペプチド粉（例えば、実施例２の方法により調製して得られたもの）に対して免疫増強テストを行った。その結果を表４〜６に示す。
【００２８】
１ マウスの血清溶血素測定
【００２９】
表４ 試験用サンプルのマウスの血清溶血素に対する影響
【表４】
分散分析で、Ｐ＜０．０５；対照群との比較で、＊Ｐ＜０．０５
【００３０】
溶血素（ＩｇＭ）は、体液の免疫機能状況を反映する手段であり、投薬後、溶血素の生成が増えると、赤血球の溶血が起こる時の吸光度値が高くなり、投薬後の体内における体液の免疫機能が強くなることを示す。表４の結果から、高投与量群とブランク対照群との比較では、差異が顕著である（Ｐ＜０．０５）が、低投薬量群及び中投薬量群と対照群との比較では、差異が無い（Ｐ＞０．０５）ことが分かる。これは、高投与量の試験用サンプルが血清溶血素（ＩｇＭ）の生成に非常に顕著な影響があり、良好な体液免疫増強作用が果たされることを示す。
【００３１】
２ マウスの遅延型過敏反応（ＤＴＨ）測定
【００３２】
表５ 試験用サンプルのマウスの遅延型過敏反応に対する影響
【表５】
分散分析で、Ｐ＜０．０１；対照群との比較で、＊＊Ｐ＜０．０１
【００３３】
遅延型過敏反応は、細胞の免疫機能状況を反映する手段である。表５から、試験群のマウスの左右耳殻の重さの差は、対照群と比較すると、いずれも増えているが、中投与量群とクランク対照群との比較では、差異がとても顕著であり（Ｐ＜０．０１）、低投与量群及び高投与量群と対照群との比較では、顕著な差異が無い（Ｐ＞０．０５）ことが分かる。これは、試験用サンプルが一定の濃度範囲においてマウスの細胞免疫機能を明らかに向上させることができることを示す。
【００３４】
３ マウスの食細胞の食作用測定
【００３５】
表６ 試験用サンプルのマウス食細胞の食作用に対する影響
【表６】
分散分析で、Ｐ＜０．０１；対照群との比較で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１
【００３６】
食細胞の食作用は、非特異免疫機能状況を反映する手段である。表６から、中投与量群及び高投与量群と対照群との比較では、貪食率の差異が顕著であり（Ｐ＜０．０５）、中投与量群及び高投与量群と対照群との比較では、貪食指数の差異が非常に顕著であり（Ｐ＜０．０１）、低投与量群と対照群との比較では、差異がない（Ｐ＞０．０５）ことが分かる。これは、一定投与量の試験用サンプルが貪食活性を賦活し、単核食細胞系の食作用を向上させることができることを示す。
【００３７】
免疫増強テストの結果から、一定投与量の試験用サンプルが、マウスの体液免疫機能、細胞免疫機能、及び単核−大食細胞機能に対してある程度の強化作用があることが分かる。
【００３８】
機能学の評価検査方法により、細胞免疫機能、体液免疫機能、単核−大食細胞機能、ＮＫ細胞活性という４つの面の何れか２つの面において結果が陽性を示すと、前記被験サンプルが免疫機能増強作用を有することを判定することができる。本実験は、実験マウスの細胞免疫機能、体液免疫機能、単核−大食細胞機能という３つの面において結果が陽性を示しているので、試験用サンプルが免疫増強作用を有することが判定可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド及びその調製プロセスに関し、天然生物活性物質の分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
ユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉｉ）は、中国で「麻zhe（＊「折」の下に「虫」）」と俗称され、腔腸動物門（Ｐｈｙｌｕｍ Ｃｎｉｄａｒｉａ）、ハチクラゲ綱（Ｃｌａｓｓ Ｓｃｙｐｈｏｍｅｄｕｓａｅ）、旗口クラゲ目（Ｏｒｄｅｒ Ｐｈｙｌｕｍ ｃｎｉｄａｒｉａ）、ユウレイクラゲ科（Ｆａｍｉｌｙ Ｃｙａｎｅａ）に属する大形の海洋性プランクトンである。わが国の沿海においては、白色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）、キタユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｃａｐｉｌｌａｔａ）、褐色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚ）、及び紫色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）という４種類がすでに発見され、そのうち、白色のユウレイクラゲが一番数多く、また、最も広く分布している。
【０００３】
ユウレイクラゲは、一般に小形の浮遊動物を餌とし、その生殖腺が発達しており繁殖力が強く、成長速度も極めて速く、現在、わが国においてユウレイクラゲの年間産出量が既に１，０００万トンにも達し、新たな天然海洋生物資源となっている。
【０００４】
海洋由来の多糖、プロテオグリカン、及びコラーゲンペプチドは、非常に重要な天然海洋食品資源として、顕著な生物活性をもっている。例えば、ナマコ多糖、海藻多糖などについて、顕著な生物活性を有することを確認した研究レポートがたくさんある。ユウレイクラゲを素材とするコラーゲンペプチドの分離・抽出・調製についての研究レポートは、国内外でめったに見られず、今まで、その中から免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドを分離抽出することに関するレポートはまだ発見されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド及びその調製プロセスと使用を提供する。本発明は、新たな天然海洋生物資源であるユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉｉ）をコラーゲンペプチドの調製素材として加工することを特徴とし、ユウレイクラゲに対する開発利用の目的が達成されている。本発明によれば、極めて高いスループットで高純度のコラーゲンペプチド製品を得ることができる。これは、ユウレイクラゲという天然海洋生物資源の総合的利用に非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
外見が白色又は淡黄色で、無臭で、苦味のある粉末であり、ユウレイクラゲ科の海洋生物である白色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）、キタユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｃａｐｉｌｌａｔａ）、褐色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚ）、又は紫色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）の捕獲されたばかりの新鮮なもの、または明礬に３回漬け込んだものから分離抽出して得られ、無毒で、顕著な免疫増強活性を有するものであって、タンパク質８０〜９０％、糖１０〜２０％を含み、平均分子量が１，０００〜３，０００であり、単糖としてグルコースを主に含み、アミノ酸として、グリシンを１６％以上、プロリン及びヒドロキシプロリンを合計で１８％以上含むことを特徴とするユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドである。
【０００７】
前記コラーゲンペプチドを調製するプロセスであって、
（ｌ）ユウレイクラゲを水に含浸させる工程と、
（２）含浸された前記ユウレイクラゲを溶融してから、遠心分離を行い、無色または淡黄色の上澄み液を得る工程と、
（３）上澄み液を直接乾燥し、又は、均質化・脱色・脱塩してから乾燥し、白色又は淡黄色の粉末であるコラーゲンペプチドを得る工程と
を含むコラーゲンペプチドの調製プロセスである。
【０００８】
上述した溶融とは、溶融剤により、ユウレイクラゲを液体となるように水に溶かすことである。
【０００９】
具体的には、まず、本発明者らは、新鮮な、又は明礬に３回漬け込んだ市販のユウレイクラゲを脱塩すると、コラーゲンペプチドの調製素材として利用可能であることを発見した。それに含まれるコラーゲンペプチドは、水による含浸処理に対する安定性があり、本発明者らが採る含浸工程の条件下では、含浸により分解され、水中に抽出されて流失してしまうことがなく、含浸により続く加水分解処理における分散性に影響を与えることもない。即ち、明礬に３回漬け込んだユウレイクラゲと、捕獲されたばかりの新鮮なユウレイクラゲとは同等の加工可能性があり、いずれも高純度で高生物活性のコラーゲンペプチドの調製素材として用いることができる。これにより、ユウレイクラゲを素材として加工し、高純度で高生物活性のコラーゲンペプチドを調製する基礎が打ち立てられている。
【００１０】
次に、本発明者らは、温度、圧力などの加水分解条件、及び水酸化ナトリウム、塩酸、コラーゲン酵素などのよく用いられる様々な溶融剤を体系的に調査して比較した結果、適当な加水分解条件下で、ユウレイクラゲに含まれるコラーゲンが、改質を行うことなく、直接加水分解され、水中に分散することができ、清澄透明で不純物の極めて少ない加水分解分散液が得られることを見出した。
【００１１】
本発明者らは、含浸溶媒、含浸時間、加水分解剤などの加水分解工程のパラメーターのうち、加水分解剤の種類、及び加水分解に用いられる温度が、加水分解収率に最も重要であることを発見した。
【００１２】
そのうち、有効な溶融剤としては、良く見られるアルカリ（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウムの水酸化物や炭酸塩、アンモニア水などで、濃度０．１〜１０ｍｏｌＬ−１）、良く見られる酸（例えば、塩酸、リン酸、硫酸などの無機酸や、ギ酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、レモン酸などの有機酸で、濃度０．１〜１０ｍｏｌＬ−１）、又は各種のプロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、コラーゲン酵素、エラスターゼなど）のうちの１つ又は複数であり、溶融は、ｐＨ０．５〜１４．０、温度１０〜１２０℃、操作圧力０．０００１〜０．５ＭＰａの条件下で行われる。
【００１３】
水酸化ナトリウムを溶融剤として選定して使用する場合、ｐＨは７．０〜１４．０とすべきである。塩酸を溶融剤として選定して使用する場合、ｐＨは０．５〜６．８とすべきである。プロテアーゼ類を溶融剤として選定して使用する場合、ｐＨは選ばれる酵素の最適ｐＨ範囲にすべきである。酸・アルカリを溶融剤として選定して使用する場合、融溶温度は１０〜１２０℃にすべきであり、０〜６０℃にすることが好ましい。プロテアーゼ類を溶融剤として選定して使用する場合、プロテアーゼ類の最適温度で加水分解を行うべきである。
【００１４】
そのほかの各パラメーターとして、含浸は、ｐＨ２〜１２における一定値に調整された、好ましくはｐＨ６．５〜６．８の水中で行われるべきであり、含浸温度は０〜９８℃であり、０〜１５℃が好ましく、含浸操作は、含浸水の導電率が３０μＳｃｍ−１より低くなったときに停止する。遠心分離は、０〜１２０℃、好ましくは０〜１０℃の条件下で行われ、遠心機の回転速度は４０００〜１２０００ｒｐｍであり、６０００〜８０００ｒｐｍが好ましく、遠心時間は１０〜６０ｍｉｎである。液体の乾燥手段としては、凍結乾燥であってもよく、スプレー乾燥であってもよい。
【００１５】
本発明にかかるユウレイクラゲの活性コラーゲンペプチドは、予備研究により、顕著な免疫増強活性を有し、新規な生物活性材料及び健康食品素材として食品、健康製品、スキンケア・美容用品や医薬用品などの分野に広く適用され、免疫増強作用を有する医薬品、健康製品、スキンケア・美容用品の調製に用いられることができることが確認されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
下記の実施例は、本発明の操作方法を詳細に説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００１７】
実施例１
明礬に３回漬け込んだ市販のユウレイクラゲ１０００ｇを取り、脱水した後、室温下で２〜５倍量の脱イオン水に含浸させ、含浸水における塩化ナトリウムの含有量が１．５ｐｐｍより低くなり（塩素イオン検出で陰性を示す）、且つ、含浸水の導電率が３０μＳｃｍ−１より低くなるまで、２〜３時間ごとに水を１回替えた。含浸された脱塩ユウレイクラゲに、４０００Ｕｎｉｔｓの活性力を有するトリプシン１０ｇを添加し、３０〜６０℃で４〜２４時間保温・溶融して、懸濁液を得た。そして、遠心（４℃、８０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）して不融性残留物を除去し、清澄透明な液体であるコラーゲンペプチド液を得た。コラーゲンペプチド液を回転蒸発器に置き、４０℃、０．００１ＭＰａで元の体積の１／５に濃縮した後、スプレー乾燥し（吸気温度１８５℃、排気温度８５℃）、純度が９０％以上に達した顕著な免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドの粉状固体２０ｇを得た。
【００１８】
前記溶融は、操作圧力０．００１ＭＰａの条件下で行われてもよい。
【００１９】
実施例２
新鮮なユウレイクラゲ１００ｋｇを取り、３〜１０℃で２〜５倍量の脱イオン水に含浸させ、含浸水の導電率が３０μＳｃｍ−１より低くなるまで、２〜３時間ごとに水を１回替えた。含浸された脱塩ユウレイクラゲに、複合酵素製剤（市販のトリプシン、パパイン、コラーゲン酵素、及び中性プロテアーゼを１：１：１：１の配合比で配合したもの）５００ｇを添加し、３５〜５０℃で８〜１６時間保温してから、４℃、８０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心した。不融性残留物を除去し、清澄透明な液体であるコラーゲンペプチド液を得た。コラーゲンペプチド液を４０℃、０．００１ＭＰａで元の体積の１／２に濃縮した後、凍結乾燥して、純度が９５％以上に達した顕著な免疫増強活性を有するコラーゲンペプチドの粉状固体１０００ｇを得た。
【００２０】
前記溶融は、操作圧力０．１ＭＰａの条件下で行われてもよい。
【００２１】
実施例３
１つのコラーゲンペプチド粉のサンプル（例えば、実施形態２の方法により調製して得られたもの）に対して、タンパク含有量の測定、全糖含有量の測定、アミノ酸組成の測定、及び単糖組成の測定を行った。測定の結果から、このサンプルにタンパク質８８％、糖１０．５％を含み、平均分子量が１２７４であることが分かる。単糖としてはグルコースを主に含んでおり、アミノ酸の組成は表１に示す通りである。
【００２２】
表１ 試験用サンプルのアミノ酸組成
【表１】
【００２３】
実施例４
健康な昆明種白マウス（雌雄半分ずつ、満４年子、体重１８〜２２ｇ、無錫市恵山江南実験動物場より（認可番号：ＳＣＸＫ（蘇）２００２−０００６））を実験動物とし、得られたコラーゲンペプチド粉（例えば、実施例２の方法により調製して得られたもの）に対して急性毒性試験を行った。結果を表２及び表３に示す。
【００２４】
表２ 試験用サンプルのマウスの体重に対する影響
【表２】
【００２５】
表３ 急性毒性試験の結果
【表３】
【００２６】
投薬してから１時間において、マウスはいずれも動きが減少したが、４時間後、除々に正常に動くようになったことが観察された。試験群は、７日間において、摂食量が次第に増加し、マウスの食欲、活力、毛色は正常であり、７日間後、頸椎脱臼で殺し、肉眼で検死解剖したところ、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓などの主な臓器において病理変化や中毒現象が見られなかった。観察期間の７日間において毎日体重を量ったが、試験群のマウスの体重は次第に増えた。研究の結果から、試験用サンプルを大量に胃内投与した場合に、マウスの死亡が現れず、明らかな毒性反応もないことが分かる。これは、その毒性が無い又は極めて小さく、その最大安全投与量が７５００ｍｇ／Ｋｇ以上であることを示す。
【００２７】
実施例５
健康な昆明種白マウス（雌雄半分ずつ、満４年子、体重１８〜２２ｇ、無錫市恵山江南実験動物場より（認可番号：ＳＣＸＫ（蘇）２００２−０００６））を実験動物とし、得られたコラーゲンペプチド粉（例えば、実施例２の方法により調製して得られたもの）に対して免疫増強テストを行った。その結果を表４〜６に示す。
【００２８】
１ マウスの血清溶血素測定
【００２９】
表４ 試験用サンプルのマウスの血清溶血素に対する影響
【表４】
分散分析で、Ｐ＜０．０５；対照群との比較で、＊Ｐ＜０．０５
【００３０】
溶血素（ＩｇＭ）は、体液の免疫機能状況を反映する手段であり、投薬後、溶血素の生成が増えると、赤血球の溶血が起こる時の吸光度値が高くなり、投薬後の体内における体液の免疫機能が強くなることを示す。表４の結果から、高投与量群とブランク対照群との比較では、差異が顕著である（Ｐ＜０．０５）が、低投薬量群及び中投薬量群と対照群との比較では、差異が無い（Ｐ＞０．０５）ことが分かる。これは、高投与量の試験用サンプルが血清溶血素（ＩｇＭ）の生成に非常に顕著な影響があり、良好な体液免疫増強作用が果たされることを示す。
【００３１】
２ マウスの遅延型過敏反応（ＤＴＨ）測定
【００３２】
表５ 試験用サンプルのマウスの遅延型過敏反応に対する影響
【表５】
分散分析で、Ｐ＜０．０１；対照群との比較で、＊＊Ｐ＜０．０１
【００３３】
遅延型過敏反応は、細胞の免疫機能状況を反映する手段である。表５から、試験群のマウスの左右耳殻の重さの差は、対照群と比較すると、いずれも増えているが、中投与量群とクランク対照群との比較では、差異がとても顕著であり（Ｐ＜０．０１）、低投与量群及び高投与量群と対照群との比較では、顕著な差異が無い（Ｐ＞０．０５）ことが分かる。これは、試験用サンプルが一定の濃度範囲においてマウスの細胞免疫機能を明らかに向上させることができることを示す。
【００３４】
３ マウスの食細胞の食作用測定
【００３５】
表６ 試験用サンプルのマウス食細胞の食作用に対する影響
【表６】
分散分析で、Ｐ＜０．０１；対照群との比較で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１
【００３６】
食細胞の食作用は、非特異免疫機能状況を反映する手段である。表６から、中投与量群及び高投与量群と対照群との比較では、貪食率の差異が顕著であり（Ｐ＜０．０５）、中投与量群及び高投与量群と対照群との比較では、貪食指数の差異が非常に顕著であり（Ｐ＜０．０１）、低投与量群と対照群との比較では、差異がない（Ｐ＞０．０５）ことが分かる。これは、一定投与量の試験用サンプルが貪食活性を賦活し、単核食細胞系の食作用を向上させることができることを示す。
【００３７】
免疫増強テストの結果から、一定投与量の試験用サンプルが、マウスの体液免疫機能、細胞免疫機能、及び単核−大食細胞機能に対してある程度の強化作用があることが分かる。
【００３８】
機能学の評価検査方法により、細胞免疫機能、体液免疫機能、単核−大食細胞機能、ＮＫ細胞活性という４つの面の何れか２つの面において結果が陽性を示すと、前記被験サンプルが免疫機能増強作用を有することを判定することができる。本実験は、実験マウスの細胞免疫機能、体液免疫機能、単核−大食細胞機能という３つの面において結果が陽性を示しているので、試験用サンプルが免疫増強作用を有することが判定可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外見が白色又は淡黄色で、無臭で、苦味のある粉末であり、ユウレイクラゲ科の海洋生物である白色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）、キタユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｃａｐｉｌｌａｔａ）、褐色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚ）、又は紫色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）の捕獲されたばかりの新鮮なもの、または明礬に３回漬け込んだものから分離抽出して得られ、無毒で、顕著な免疫増強活性を有するものであって、
タンパク質８０〜９０％、糖１０〜２０％を含み、平均分子量が１，０００〜３，０００であり、単糖としてグルコースを主に含み、アミノ酸として、グリシンを１６％以上、プロリン及びヒドロキシプロリンを合計で１８％以上含むことを特徴とする、ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のコラーゲンペプチドを調製するプロセスであって、
（ｌ）ユウレイクラゲを水に含浸させる工程と、
（２）含浸された前記ユウレイクラゲを溶融してから、遠心分離を行い、無色または淡黄色の上澄み液を得る工程と、
（３）上澄み液を直接乾燥し、又は、均質化・脱色・脱塩してから乾燥し、白色又は淡黄色の粉末であるコラーゲンペプチドを得る工程と
を含むことを特徴とする、コラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項３】
前記ユウレイクラゲは、含浸水の導電率が３０μｃｍ−１より低くなるまで、ｐＨ２〜１２における一定値に調整された水に含浸され、
含浸温度が０〜９８℃であることを特徴とする、請求項２に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項４】
前記溶融は、溶融剤により、ユウレイクラゲを液体となるように水に溶かすことであることを特徴とする、請求項２に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項５】
前記溶融剤は、アルカリ、酸、又は各種のプロテアーゼのうちの１つ又は複数の混合であることを特徴とする、請求項４に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項６】
前記アルカリは、濃度０．１〜１０ｍｏ１Ｌ−１のナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウムの水酸化物や炭酸塩、アンモニア水であり、
前記酸は、濃度０．１〜１０ｍｏｌＬ−１の塩酸、リン酸、硫酸、ギ酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸又はレモン酸であり、
前記プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、コラーゲン酵素又はエラスターゼのうちの１つ又は複数であることを特徴とする、請求項５に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項７】
前記溶融は、ｐＨ０．５〜１４．０、温度１０〜１２０℃、操作圧力０．０００１〜０．５ＭＰａの条件下で行われることを特徴とする、請求項４に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項８】
前記乾燥は、凍結乾燥又はスプレー乾燥であることを特徴とする、請求項２に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項９】
免疫増強作用を有する医薬品、健康製品、スキンケア・美容用品の調製における請求項１に記載のコラーゲンペプチドの使用。
【請求項１】
外見が白色又は淡黄色で、無臭で、苦味のある粉末であり、ユウレイクラゲ科の海洋生物である白色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｎｏｚａｋｉ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）、キタユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｃａｐｉｌｌａｔａ）、褐色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚ）、又は紫色のユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）の捕獲されたばかりの新鮮なもの、または明礬に３回漬け込んだものから分離抽出して得られ、無毒で、顕著な免疫増強活性を有するものであって、
タンパク質８０〜９０％、糖１０〜２０％を含み、平均分子量が１，０００〜３，０００であり、単糖としてグルコースを主に含み、アミノ酸として、グリシンを１６％以上、プロリン及びヒドロキシプロリンを合計で１８％以上含むことを特徴とする、ユウレイクラゲ由来で免疫増強活性を有するコラーゲンペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のコラーゲンペプチドを調製するプロセスであって、
（ｌ）ユウレイクラゲを水に含浸させる工程と、
（２）含浸された前記ユウレイクラゲを溶融してから、遠心分離を行い、無色または淡黄色の上澄み液を得る工程と、
（３）上澄み液を直接乾燥し、又は、均質化・脱色・脱塩してから乾燥し、白色又は淡黄色の粉末であるコラーゲンペプチドを得る工程と
を含むことを特徴とする、コラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項３】
前記ユウレイクラゲは、含浸水の導電率が３０μｃｍ−１より低くなるまで、ｐＨ２〜１２における一定値に調整された水に含浸され、
含浸温度が０〜９８℃であることを特徴とする、請求項２に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項４】
前記溶融は、溶融剤により、ユウレイクラゲを液体となるように水に溶かすことであることを特徴とする、請求項２に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項５】
前記溶融剤は、アルカリ、酸、又は各種のプロテアーゼのうちの１つ又は複数の混合であることを特徴とする、請求項４に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項６】
前記アルカリは、濃度０．１〜１０ｍｏ１Ｌ−１のナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウムの水酸化物や炭酸塩、アンモニア水であり、
前記酸は、濃度０．１〜１０ｍｏｌＬ−１の塩酸、リン酸、硫酸、ギ酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸又はレモン酸であり、
前記プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、コラーゲン酵素又はエラスターゼのうちの１つ又は複数であることを特徴とする、請求項５に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項７】
前記溶融は、ｐＨ０．５〜１４．０、温度１０〜１２０℃、操作圧力０．０００１〜０．５ＭＰａの条件下で行われることを特徴とする、請求項４に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項８】
前記乾燥は、凍結乾燥又はスプレー乾燥であることを特徴とする、請求項２に記載のコラーゲンペプチドの調製プロセス。
【請求項９】
免疫増強作用を有する医薬品、健康製品、スキンケア・美容用品の調製における請求項１に記載のコラーゲンペプチドの使用。
【公表番号】特表２０１１−５２０９２７（Ｐ２０１１−５２０９２７Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０９８３９（Ｐ２０１１−５０９８３９）
【出願日】平成２０年９月１７日（２００８．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０７２３９７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４０８３３
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５１０３０７２８８）
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＡＮＧ， Ｌｉｌｉ
【住所又は居所原語表記】１６５０−１６−１６０１ Ｊｉｎｘｉｕ Ｒｏａｄ， Ｐｕｄｏｎｇ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２００１２７ Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
【出願人】（５０９３３２４１９）江南大学 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１７日（２００８．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０７２３９７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４０８３３
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５１０３０７２８８）
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＡＮＧ， Ｌｉｌｉ
【住所又は居所原語表記】１６５０−１６−１６０１ Ｊｉｎｘｉｕ Ｒｏａｄ， Ｐｕｄｏｎｇ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２００１２７ Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
【出願人】（５０９３３２４１９）江南大学 (2)
【Ｆターム（参考）】
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