ラマン活性分子がナノ粒子二量体の接合部に位置する二量体コア−シェルナノ粒子、その用途およびその製造方法
本発明は、ラマン活性分子がナノ粒子二量体の接合部に位置する構造のナノ粒子二量体に関し、より具体的には、表面にオリゴヌクレオチドで結合された金または銀コア（ｃｏｒｅ）と、前記コアを取り囲む金または銀シェル（ｓｈｅｌｌ）とからなるコア−シェルナノ粒子二量体に関する。また、本発明は、前記コア−シェルナノ粒子二量体とその製造方法、および用途に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン活性分子がナノ粒子から構成された二量体の接合部に位置するように製造されたナノ粒子二量体に関し、より具体的には、コアの表面にオリゴヌクレオチドで結合されており、前記コアを取り囲む金または銀シェル（ｓｈｅｌｌ）からなるコア−シェルナノ粒子二量体に関する。コアを形成するナノ粒子は、金または銀ナノ粒子である。また、本発明は、前記コア−シェルナノ粒子二量体、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルおよびその他のサンプルからの単一分子に対する高感度の正確な検出は、医学診断学、病理学、毒物学、環境サンプリング、化学的分析およびその他の多い分野で広く使用可能であり、このため、ここ数年、生物−化学分野では、少量の合成物質および生体分子の代謝、分布および結合などを研究するのに特定の物質で標識されたナノ粒子および化学物質を広く使用してきた。代表的には、放射性同位元素を用いた方法、有機蛍光物質を用いた方法、無機物質の量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ）を用いた方法がある。
【０００３】
放射性同位元素を用いた方法において、放射性標識物質（Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｓｏｔｏｐｅ）としては、生体内で広く発見される１Ｈ、１２Ｃ、３１Ｐ、３２Ｓ、１２７Ｉなどの放射性同位体である３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉなどが広く使用される。これらの放射性同位元素は、非放射性の同位体と化学的性質がほぼ類似していて任意に置換が可能であり、放出エネルギーが比較的大きく、少量の検出も可能であるという長所があるため、長い間使用されてきた。しかし、人体に有害な放射線のため取り扱いが容易でなく、一部の同位元素の放射性は、放出エネルギーが大きい代わりに、半減期が短く、長時間の保管や実験に不便な欠点もあった。
【０００４】
放射性同位元素に対する代替法として広く使用されるのは、有機蛍光物質（Ｏｒｇａｎｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ）である。蛍光物質は、特定の波長によって活性化されると、固有の波長を有する光を発光する。特に、検索法の小型化に伴い、放射性物質も検出限界を現わして検索に長時間が要求される。これに対し、蛍光物質の場合、適切な条件で１分子あたり数千個の光子を放出することができ、単一分子水準の検出までも理論的に可能である。しかし、放射性同位元素のように活性リガンドの元素を直接置換することはできず、構造の活性関係により比較的活性に影響を与えない部分を変形して蛍光物質を連結しなければならないという限界があった。また、このような蛍光標識物質は、時間の経過によって蛍光強度が弱くなり（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）、活性化させる光の波長が非常に狭く、発光する光の波長が非常に広く、互いに異なる蛍光物質の間に干渉があるという短所を持っている。また、使用可能な蛍光物質の数が極めて限られている。
【０００５】
また、半導体ナノ物質の量子ドットは、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅなどから構成されており、大きさおよび種類に応じてそれぞれ異なる色の光を発光する。有機蛍光物質に比べて広い活性波長を有し、狭い発光波長を示すため、異なる色を発光する種類が有機蛍光物質より多い。したがって、最近、有機蛍光物質の欠点を克服するための方法として量子ドットが多く用いられている。しかし、毒性が強く、大量生産が困難であるという欠点があった。また、理論的にその種類は多様であるが、実際に使用される数は極めて限られている。
【０００６】
これらの問題を解決するための方法として、最近では、ラマン分光学および／または表面プラズモン共鳴を利用した標識物質を用いている。
【０００７】
その中でも、表面増強ラマン散乱法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＳＥＲＳ）は、金、銀などの金属ナノ構造の粗い（ｒｏｕｇｈｅｎｅｄ）表面に分子が吸着する時、ラマン散乱の強度が１０６〜１０８倍以上急激に増加する現象を利用した分光法である。光を有形媒質に通過させる場合、ある程度の量は固有方向から外れるが、このような現象がラマン散乱として知られている。散乱した光の一部が光の吸収および電子の高いエネルギー準位に励起することにより、固有の刺激された光と振動数が異なり、ラマン放出スペクトルの波長はサンプル内の光吸収分子の化学組成および構造特性を示すため、ラマン分光法は、現在非常に急速な速度で発展しているナノ技術と結合し、たった１つの分子を直接測定することができる高感度の技術として発展可能であり、特に、メディカルセンサとして極めて重要に使用できるものと大きな期待が寄せられている。この表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）の効果は、プラズモン共鳴の現象に関連付けられ、ここで、金属ナノ粒子は、金属内の伝導電子の集団カップリングにより、入射電磁放射線に応答して明確な光学的共鳴を示すため、本質的に、金、銀、銅および他の特定金属のナノ粒子は、電磁放射線の集中化効果を向上させる小型アンテナとして作用することができる。このような粒子の近傍に位置する分子は、ラマン分光法分析に対してはるかに大きな感度を示す。
【０００８】
したがって、高感度ＤＮＡ分析と共に、ＳＥＲＳセンサを用いて多様な疾病に関連する遺伝子、蛋白質（バイオマーカー）の早期診断を行おうとする研究が盛んになっている。ラマン分光法は、他の分析法（赤外線分光法）の方法とは異なり、様々な利点がある。赤外線分光法は、分子の双極子モーメントの変化がある分子の場合に強い信号を得ることができるのに対し、ラマン分光法は、分子の誘導偏極率に変化がある非極性分子の場合にも強い信号を得ることができるため、ほぼすべての有機分子が固有のラマンシフト（Ｒａｍａｎ Ｓｈｉｆｔ、ｃｍ−１）を持っている。また、水分子による干渉に影響されないため、蛋白質、遺伝子などの生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の検出により好適である。しかし、低い信号強度により、長い研究期間にもかかわらず実用化される水準には至らなかった。前記表面増強ラマン散乱法の発見以来、地道な研究を重ね、蛍光分子が吸着したナノ粒子の無秩序な凝集体において単一分子水準の信号が検出可能な表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＳＥＲＳ）が報告されて以降（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９７、２７５（５３０３）、１１０２；Ｐｈｙｓ ｒｅｖ ｌｅｔｔ１９９７、７８（９）、１６６７）、多様なナノ構造（ナノ粒子、ナノシェル、ナノ線）を用いたＳＥＲＳ増強現象に関する研究が報告された。このような高感度のＳＥＲＳ現象をバイオセンサの開発に利用するために、Ｍｉｒｋｉｎ研究チームは、最近、ＤＮＡと結合された金ナノ粒子を用いた高感度ＤＮＡ分析に成功し、このようなフォーマットの検出限界は２０ｆＭであった（２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１５３６）。しかし、ラマン活性分子（例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ６Ｇ）を有する銀（Ａｇ）ナノ粒子の塩誘導凝集（ｓａｌｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）に基づく単一分子ＳＥＲＳ活性基質を製造する方法は、最初の研究以来、ほとんど進んでいない。不均一に（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）凝集されたコロイドは、単にその分画（１％未満）のみが単一分子ＳＥＲＳ活性を有することが報告された（Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ２００２、１０６（２）、３１１）。このようにランダムに不均一になった（粗くなった）表面は、ＳＥＲＳに関連する多量の興味深く必須のデータを提供するが、表面形態学上の小さい変化によっても増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）の変化が大きく変化するため、このような戦略は本質的に再現が不可能である。最近では、ＦａｎｇらがＳＥＲＳにおける増強部位の分布の定量的な測定に関して報告した。最も密集した部位（ＥＦ＞１０９）は、計１，０００，０００部位のうち６４部位であったが、これらは全体のＳＥＲＳ強度に２４％を寄与することが報告された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８、３２１、３８８）。このようなＳＥＲＳ信号が極大化可能な構造体を再現性あるように確保できれば、非常に信頼度の高い有用な超高感度の生体分子分析法となり得、体外診断法のほか、生体内イミジング技術としても非常に有用であると判断される。
【０００９】
しかし、前の多様な分析物のＳＥＲＳ検出に関する方法では、典型的に基板および／または支持体上にコーティングされるコロイド金属粒子、例えば、凝集された銀ナノ粒子を用い、このような配列は、時には１０６〜１０８だけ増加した感度でＳＥＲＳ検出を可能とするのに対し、ヌクレオチドなどの小さい分析物の単一分子の検出はできなかった。また、ＳＥＲＳの利点にもかかわらず、ＳＥＲＳ現象は、メカニズムが完璧に理解されていないだけでなく、正確に構造的に定義されているナノ物質の合成および制御の困難さと、スペクトルの測定時に用いられる光の波長、偏光方向に応じた増強効率の変化などにより、再現性および信頼性の面で解決しなければならない問題が多く、これは、ナノバイオセンサの開発および商用化を含むＳＥＲＳ現象の応用に大きな課題として残されている。このような問題を解決するために構造的に正確に定義されているナノ物質（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の光学的性質に対する理解とこれを用いてＳＥＲＳ現象を正確に制御するための研究の必要性が非常に切実になっている。
【００１０】
このため、Ｊｅｏｎｇ、Ｐｒｏｋｅ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｌｅｅは、金属粒子二量体（ｄｉｍｅｒ）の場合、２つ以上のナノ粒子の間に非常に強い電磁場のホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔまたはｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｅｌｄ）が形成されてＳＥＲＳ信号が増強されると報告し、電磁的な理論計算によれば、前記ホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）によって１０１２程度のＳＥＲＳ増強が予測される。このようにラマン検出の増強された感度は、コロイド粒子凝集体の内部で明確に均一でないが、ホットスポットの存在の有無によって異なる。しかし、このようなホットスポットの物理的構造、増強された感度のナノ粒子からの距離範囲、および感度を増強させる分析物と凝集体ナノ粒子との間の空間的関係性は、その特性が提示されていない。また、凝集されたナノ粒子は溶液中において本質的に不安定で、単一粒子分析物の検出の再現性に逆効果をもたらす。
【００１１】
また、金または銀二量体構造に対する理論的なシミュレーションおよびｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ（概念証明）の試みが存在するとしても、ナノ粒子間の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に実際に単一分子を位置させて製造した例はなかった。金または銀ナノ粒子をＳＥＲＳのよく定義された再現可能な構造を有するように合成することは、依然として挑むべき課題として残されている。
【００１２】
そこで、本発明者らは、単一ＤＮＡの検出に高度の敏感度と再現性を有するナノ粒子構造物を開発しようと集中的で綿密な研究を重ねた結果、コア−シェル構造の二量体ナノ粒子の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に単一ラマン活性分子を位置させ、シェルの厚さを調節して前記二量体ナノ粒子間の間隔距離を特定の範囲に調節することにより、ラマン活性分子が２つのナノ粒子の接合部に位置するコア−シェル構造の二量体ナノ粒子を開発し、前記二量体ナノ粒子が非常に強化された表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＳＥＲＳ）信号を示し、高度に再現可能なホットスポットナノ粒子であることを立証し、前記ナノ粒子のラマン散乱増強は、ＳＥＲＳ増強因子（ＥＥＭ）が〜２．７×１０１２までとなることを確認することにより本発明に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明のーつの目的は、ラマン活性分子がナノ粒子二量体の接合部に位置するコア−シェル構造のナノ粒子二量体を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ナノ粒子二量体の製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記ナノ粒子二量体を用いた分析物の検出方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記ナノ粒子二量体を含む分析物検出用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様として、本発明は、表面にオリゴヌクレオチドが結合された金または銀コア（ｃｏｒｅ）と、前記コアを取り囲む金または銀シェル（ｓｈｅｌｌ）とからなるコア−シェルナノ粒子２つの接合部にラマン活性分子が位置し、前記２つのナノ粒子がオリゴヌクレオチドを介して連結された構造を有するナノ粒子二量体に関するものである。
【００１８】
より具体的には、本発明のナノ粒子二量体は、２つのナノ粒子から構成されており、それぞれのナノ粒子は、コア（金または銀）と、コアを取り囲むシェル（金または銀）とから構成されており、それぞれのナノ粒子のコアの表面にオリゴヌクレオチドが結合されてシェルの外部に露出しており、前記２つのオリゴヌクレオチド間の混成結合によって連結されている構造を持っている。また、前記混成結合がなされる部分の接合部にはラマン活性分子が位置することができる。特に、前記それぞれのナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの一方の末端がコアの表面に結合され、前記オリゴヌクレオチドの一部は、シェルの外部に露出しており、露出した部分の配列により二量体を形成することができる。この時、それぞれ露出した２つのオリゴヌクレオチドが互いに混成結合するか、またはそれぞれ露出した２つのオリゴヌクレオチドとすべて混成結合するオリゴヌクレオチドを介して混成結合することができる。
【００１９】
本発明において、用語「コア」とは、その表面にオリゴヌクレオチドが直接結合されている金属粒子を意味し、好ましくは、金または銀である。また、本発明において、用語「シェル」とは、前記コアを取り囲んでいる金属コーティング層であって、コアの表面に結合されているオリゴヌクレオチドの一部がシェルの内部に位置する。本発明において、シェルとして金または銀を使用することが好ましい。
【００２０】
したがって、好ましい態様として、本発明は、ｉ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｉｉ）銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｉｉｉ）金コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｉｖ）銀コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｖ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子と、銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子とが連結されたナノ粒子二量体とからなる群より選択されるナノ粒子二量体に関するものである。最も好ましくは、本発明のナノ粒子二量体は、金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体である。
【００２１】
前記のような本発明のコア−シェル構造のナノ粒子二量体は、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）として存在することができる。ホモ二量体は、大きさと構造が同一のナノ粒子２つが連結されて二量体を形成したものであり、ヘテロ二量体は、大きさまたは構造が互いに異なるナノ粒子２つが連結されて二量体を形成したものである。
【００２２】
本発明にかかる表面増強ラマン散乱ナノ標識粒子の中心を形成しているコア粒子は、直径が５ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましいが、これは、コアの直径が５ｎｍ未満であれば、ラマン表面増強効果が低下する問題があり、３００ｎｍを超えると、生物学的応用時に多くの制約を受ける問題があるからである。より好ましくは、コアの直径は、１０ｎｍ〜４０ｎｍが好ましい。ナノ粒子は、形状の面においておおよそ球形であり得るが、任意の形状または不規則な形状のナノ粒子が使用可能である。
【００２３】
前記コア粒子の表面にはナノシェルが導入されているが、ナノシェルは、コア粒子の表面に増強されたラマン散乱（Ｒａｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）効果を与えることで、ラマン分光法による分析をより容易にする。すなわち、ナノシェルが導入されたコア粒子は、表面増強散乱効果（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）が非常に大きいため、どのような化学物質のシグナルも得られるという利点がある。好ましくは、本発明のシェルの厚さは、１ｎｍ〜３００ｎｍで、より好ましくは１〜２０ｎｍである。また、シェルの厚さは、コアの大きさと使用されたＤＮＡの長さが増加するにつれて比例的に増加することができる。
【００２４】
本発明のコア粒子の表面には、１つ以上のオリゴヌクレオチドが結合されて機能化されていることを特徴とする。まず、コアＡには、３’末端がチオールで改質された１つ以上の保護オリゴヌクレオチドと、同様に３’末端がチオールで改質された１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドとが結合できる。一方、コアＢには、５’末端がチオールで改質された１つ以上の保護オリゴヌクレオチドと、同様に５’末端がチオールで改質された１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドとが結合できる。また、前記コアＡの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、およびコアＢの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのうちのいずれか一方には、ラマン活性分子が改質されていることを特徴とする。また、コアＡに５’末端を用いた結合、コアＢに３’末端を用いた結合によっても本発明に至ることができる。
【００２５】
本発明において、用語「保護オリゴヌクレオチド」とは、コア粒子の表面に結合されており、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドがコアの表面によく結合できるようにコア粒子を安定化する一方、表面を保護する機能を果たすオリゴヌクレオチドをいう。
【００２６】
本発明において、用語「ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド」とは、ターゲットオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、コアＡのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドとコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、共に１つの共通ターゲットオリゴヌクレオチドと混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）されてナノ粒子二量体構造を形成する。
【００２７】
本発明において、用語「ターゲットオリゴヌクレオチド」とは、コアＡのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドおよびコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド共に相補的な配列を含んでおり、それぞれのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと混成化をなすことにより、２つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドを連結してナノ粒子二量体構造を形成する架橋の役割を果たすオリゴヌクレオチドをいい、本二量体構造を用いた最終目標分析物を意味するものではない。
【００２８】
本発明の保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、３’末端または５’末端が表面結合官能基を有する化合物で改質され、表面結合官能基を介してコア粒子の表面に付着している。
【００２９】
本発明において、用語「表面結合官能基を有する化合物」は、オリゴヌクレオチドをコア粒子の表面に付着させるために、各オリゴヌクレオチドの３’または５’末端に連結させた化合物をいう。このような表面結合官能基を有する化合物の類型は、溶液に沈殿しない小凝集体のナノ粒子を生成する限り限定されない。表面結合官能基を介してナノ粒子を架橋結合させる方法は、当分野において公知である（Ｆｅｌｄｈｅｉｍ、Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、Ｆａｌｌ、２００１、ｐｐ．２２−２５参照）。表面結合官能基を有する化合物の一末端は、コア粒子の表面に付着する表面結合官能基を保有するが、好ましくは、硫黄を含む基、例えば、チオール基またはスルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、ＨＳ）である。前記反応基は、アルコールおよびフェノールの誘導体として酸素サイトに硫黄を含むＲＳＨの式を有する化合物であり得る。あるいは、前記反応基は、それぞれＲＳＳＲ’またはＲＳＲ’の式を有するチオールエステル（ｔｈｉｏｌ ｅｓｔｅｒ）またはジチオールエステル（ｄｉｔｈｉｏｌ ｅｓｔｅｒ）であり得る。あるいは、前記反応基は、アミノ基（−ＮＨ２）であり得る。追加的に、前記表面結合官能基を有する化合物は、ＤＮＡプローブ、抗体、オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸などのような生体分子に対する反応グループ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）であって、例えば、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＣＯ、およびエポキシド基のような多様な反応基に連結できる。このような多くの反応性基は、当分野において公知であり、本方法および装置に使用可能である。
【００３０】
また、前記オリゴヌクレオチドにおいて、表面結合官能基を有する化合物の反対末端は、スペーサー配列を含むことができ、スペーサー配列は、コアの表面に導入されるシェルがターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのターゲット認識配列をカバー（ｃｏｖｅｒｉｎｇ）しながら、適切なシェルの厚さを維持できる空間を提供する。本発明では、スペーサー配列の一例として、Ａ１０−ＰＥＧを用いた。
【００３１】
本発明において、用語「ラマン活性分子」とは、本発明のナノ粒子二量体が１つ以上の分析物に付着した時、ラマン検出装置による分析物の検出および測定を容易にする物質をいう。本発明では、コアＡの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、およびコアＢの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのうちのいずれか一方には、ラマン活性分子が改質されていることを特徴とする。ラマン活性分子は、特定のラマンスペクトルを示すため、以降、生体分子をより効果的に分析できるようにするという利点がある。
【００３２】
ラマン分光法に使用可能なラマン活性分子は、有機または無機分子、原子、複合体または合成分子、染料、天然発生染料（フィコエリトリンなど）、Ｃ６０のような有機ナノ構造体、バッキーボール、炭素ナノチューブ、量子ドット、有機蛍光分子などを含む。具体的には、ラマン活性分子の例として、ＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート）、ＭＧＩＴＣ（マラカイトグリーンイソチオシアネート）、ＸＲＩＴＣ（Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアネート）、ＤＴＤＣ（３，３−ジエチルチアジカルボシアニンヨージド）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−１，３−ジアゾール）、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、パラ−アミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ、フルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、炭素同素体、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リンまたは硫黄などがあるが、これらに限定されず、使用されたラマン活性分子が明確なラマンスペクトルを示さなければならず、互いに異なる類型の分析物と特に結合したり関連付けられなければならない。好ましくは、シアニン系の蛍光維持分子のＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、またはＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ系の蛍光分子を含む有機蛍光分子である。有機蛍光分子は、ラマン分析時に用いるレーザ波長と共鳴し、より高いラマン信号の検出が可能であるという利点がある。ラマン活性分子は、分析物に直接付着できるか、多様なリンカー化合物を介して付着できる。
【００３３】
本発明者らは、ラマン活性分子がナノ粒子二量体の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に位置する場合にのみ、ＳＥＲＳ信号の検出が可能であることを確認した。具体的には、コア−シェルモノマー構造では、ホットスポットがなく、また、たった１つのラマン活性分子が存在するため、ＳＥＲＳ信号が検出されなかった（図３（Ａ）−１、２）。
【００３４】
他の態様として、本発明は、前記ラマン活性分子でラベリングされたコア−シェル構造のナノ粒子二量体の製造方法に関するものである。
【００３５】
より具体的には、１）表面が保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＡと、表面が保護オリゴヌクレオチドおよびラマン活性分子が末端に結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＢとをそれぞれ製造するステップと、２）前記製造されたコアＡおよびコアＢにターゲットオリゴヌクレオチドを処理して混成化させることにより、二量体を形成するステップと、３）前記コアＡおよびコアＢの表面にそれぞれシェルを導入するステップとを含むナノ粒子二量体の製造方法に関するものである。
【００３６】
ステップ１）は、それぞれ表面が保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されているコアＡおよびコアＢを製造するステップである。本発明の具体的な実施例では、１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列がコア粒子の表面に結合されるように調節するために、金コア粒子Ａを、３’末端がチオールで改質された２種のオリゴヌクレオチド配列である、１つ以上の保護オリゴヌクレオチドおよび１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合した。金コア粒子Ｂも、５’末端がチオールで改質された２種のオリゴヌクレオチド配列によって結合した。前記２種のオリゴヌクレオチド配列のモル比は、金コア粒子の表面のオリゴヌクレオチドのナノ粒子−大きさ依存的ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）能力に基づき、コアＡに対しては９９：１、コアＢに対しては１９９：１となるように調節した（図１（Ａ））。重要なこととして、コアＢに結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列の末端に、ラマン信号の機能を果たすＣｙ３、ＦＡＭ、またはＤａｂｃｙｌを結合させた。
【００３７】
また、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が結合されないモノマー粒子を除去し、オリゴヌクレオチド改質されたコアＡおよびＢを精製するために、磁気（ｍａｇｎｅｔｉｃ）分離技術を利用することができる。トシル（ｔｏｓｙｌ）グループマグネチックビーズ（直径１μｍ、インビトロジェン）は、アミン改質されたオリゴヌクレオチドの相補的配列により、それぞれコアＡまたはＢのターゲット捕捉配列で置換結合することができる。ターゲット捕捉配列で結合されたコア粒子のみがマグネチックビーズに相補的な混成結合をするため、反応後溶液中において外部磁場を加えて磁性ナノ粒子を分離した後、二重螺旋ＤＮＡ塩基配列の溶融点（Ｔｍ）以上に昇温し、磁性ナノ粒子に結合されたコア粒子を分離することができる。
【００３８】
追加的に、前記ステップ１）でコアＡとコアＢとをそれぞれ製造した後、コアＡとコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する磁性マイクロ粒子と混成化反応を進行し、コアＡとコアＢからターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが結合されたナノ粒子のみを分離する過程をさらに含むことができる。
【００３９】
ステップ２）は、前記製造されたコアＡおよびコアＢにターゲットオリゴヌクレオチドを加えて混成化させることにより、二量体を形成するステップである。ステップ１）でマグネチックビーズによって分離および精製されたコア粒子ＡおよびＢの溶液は、例えば、０．３ＭのＰＢＳ内の十分な量のターゲットオリゴヌクレオチド配列との混成結合により、目的の二量体ナノ粒子を合成することができる。したがって、本発明にかかる二量体合成法は、非常に高い収率（７０−８０％）で二量体を合成することができる。
【００４０】
ステップ３）として、コア粒子の表面へのナノシェル粒子の導入は、例えば、金コア粒子および銀ナノ粒子の前駆体を、溶媒の存在下に１０〜１００℃で反応させることによって導入されることが好ましい。前記銀ナノ粒子の前駆体は、ＡｇＮＯ３、またはＡｇＣｌＯ４を選択することが好ましく、金ナノ粒子の前駆体は、ＨＡｕＣｌ４などのＡｕイオンを含むいずれの化合物も前駆体として使用可能である。また、銀イオンや金イオンを金または銀ナノ粒子に転換するのに必要な還元剤は、ヒドロキノン（ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、アスコルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｓｃｏｒｂａｔｅ）などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。ナノシェル形成反応の溶媒は、水溶液（精製水またはリン酸バッファーなどが存在してもかまわない）が好ましい。ナノシェルの精密な厚さ調節のために、さらに安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を追加することができる。前記反応温度が１０℃未満であれば、銀ナノ粒子を形成させるのに過度に多い時間がかかる問題があり、１００℃を超えると、銀ナノ粒子が不均一に形成される問題があるため、前記範囲の温度で反応させることが好ましい。前記において、反応時間は、反応温度に応じて１０〜２４時間の間に調節できる。
【００４１】
本発明にかかるラマン活性分子が２つのナノ粒子の接合部に位置するコア−シェル構造のナノ粒子二量体は、ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子が機能化され、各種生体分子を検出するのに応用可能である。
【００４２】
例えば、検出しようとする分析物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、グリコプロテイン、リポプロテイン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝産物、補助因子、抑制剤、薬物、薬学物、営養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学無機剤、生体有害性製剤、放射線同位元素、ビタミン、ヘテロ環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発要因、痲酔剤、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物または汚染物であり得る。また、分析物が核酸の場合、前記核酸は、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、カビＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、改質されたオリゴヌクレオチド、単鎖および二本鎖核酸、自然的および合成核酸を含む。
【００４３】
また、前記分析物を認識できる、ナノ粒子二量体などの表面に結合可能なバイオ分子の非限定的な例は、抗体、抗体断片、遺伝操作抗体、単鎖抗体、受容体蛋白質、結合蛋白質、酵素、抑制剤蛋白質、レクチン、細胞癒着蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸またはアプタマーを挙げることができる。
【００４４】
さらに、本発明のナノ粒子二量体は、ナノ粒子二量体全体が無機物でコーティングできる。無機物でナノ粒子二量体全体がコーティングされると、構造が変形する可能性が少なくなるため、ナノ粒子二量体の構造を安定して維持することができ、保管および使用により好ましい。前記無機物は、ナノ粒子二量体の構造を維持し、ラマン信号に影響を与えない物質であれば限定はなく、一例として、シリカを使用することができる。
【００４５】
さらに他の態様として、本発明は、前記のような本発明のナノ粒子二量体を用いた分析物の検出方法を提供する。
【００４６】
より具体的には、１）本発明のナノ粒子二量体を製造するステップと、２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子を機能化するステップと、３）前記ナノ粒子二量体を、１つ以上の分析物を含むサンプルに露出させるステップと、４）レーザ励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）およびラマン分光法を用いて１つ以上の分析物を検出および確認するステップとを含む分析物の検出方法に関するものである。
【００４７】
好ましくは、本発明の分析物は、任意の公知のラマン分光法によって検出または確認可能であり、好ましくは、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ、Ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ハイパー−ラマンおよび／または非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ、ｃｏｈｅｒｅｎｔ ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を用いることができる。
【００４８】
本発明において、用語「表面増強ラマン散乱法（ＳＥＲＳ）」とは、粗く処理された特定の金属表面に吸着していたり、数百ナノメートル以内の距離に位置している時に発生するラマン散乱の一種で、この時、ラマン散乱の強度は、一般的なラマンの強度に比べて１０６〜１０８倍以上増加する現象を利用した分光法をいう。用語「表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）」とは、ＳＥＲＳ活性表面での吸着物に対するレーザ励起波長の共鳴現象を利用した分光法をいう。用語「非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）」とは、ラマン活性媒質に固定可変の２つのレーザ光を入射させ、これらの結合によって得られる反ストークス放射のスペクトルを測定する分光法をいう。
【００４９】
より具体的な態様として、本発明の前記分析物の検出方法は、１）本発明のナノ粒子二量体を製造するステップと、２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする核酸に相補的なバイオ分子を機能化するステップと、３）試料から核酸を抽出、精製、および増幅させるステップと、４）前記増幅された核酸の特定配列にコア−シェルナノ粒子二量体を反応させて混成化を行うステップと、５）前記ナノ粒子二量体が結合された核酸にラマン分光を行うステップとを含む核酸の検出方法であり得る。また、これと同じ類型の方法を用いて核酸に関するその他の情報、例えば、サンプルに存在する１種以上の単一塩基多型性（ＳＮＰ）または他の遺伝的変異の形態を検出することができ、ひいては、ＤＮＡシーケンシングにも応用可能である。
【００５０】
このような実施態様において、ラマン活性基板は、１つ以上のラマン検出単位装置と作動可能に結合できる。ラマン分光法による分析物の検出のための様々な方法は、当該分野において公知である（例えば、米国特許第６，００２，４７１号、第６，０４０，１９１号、第６，１４９，８６８号、第６，１７４，６７７号、第６，３１３，９１４号）。ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳにおいて、ラマン検出の感度は、粗い金属表面、例えば、銀、金、白金、銅またはアルミニウム表面上に吸収された分子に対して１０６以上に増強される。
【００５１】
ラマン検出装置の非限定的な例は、米国特許第６，００２，４７１号に開示されている。励起ビームは、５３２ｎｍの波長における周波数重畳されたＮｄ：ＹＡＧレーザ、または３６５ｎｍの波長における周波数重畳されたＴｉ：サファイアレーザによって生成される。パルスレーザビームまたは連続レーザビームが使用可能である。励起ビームは、共焦点の光学器および顕微鏡レンズを通過して１つ以上の分析物を含むラマン活性基板上に焦点が集められる。分析物からのラマン放出光は、顕微鏡レンズおよび共焦点光学器によって集められ、スペクトル分離のために単色光装置と結合される。共焦点光学器としては、背景信号を減少させるための干渉フィルタ（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｆｉｌｔｅｒ）、遮断フィルタ、共焦点ピンホール、対物レンズおよび鏡の組み合わせを含む。共焦点光学器のみならず、標準フルフィールド（ｆｕｌｌ ｆｉｅｌｄ）光学器も使用可能である。ラマン放出信号は、信号をカウントしデジタル化するコンピュータとインタフェースで連結されたなだれ型光ダイオードを含むラマン検出器によって検出される。
【００５２】
検出装置の他の例は、米国特許第５，３０６，４０３号に開示されており、ここでは、単光子カウント方式で作動するガリウム−砒素光電子増倍管（ＲＣＡ Ｍｏｄｅｌ Ｃ３１０３４またはＢｕｒｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｍｏｄｅｌ Ｃ３１０３４０２）が備えられたＳｐｅｘ Ｍｏｄｅｌ１４０３二重格子分光計を挙げることができる。励起化供給源は、ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ、モデル１６６からの５１４．５ｎｍ線アルゴン−イオンレーザ、およびクリプトン（ｋｒｙｐｔｏｎ）−イオンレーザ（Ｉｎｎｏｖａ７０、非干渉性）の６４７．１ｎｍ線を含む。
【００５３】
他の励起化供給源としては、３３７ｎｍにおける窒素レーザ（Ｌａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）、および３２５ｎｍにおけるヘリウム−カドミウムレーザ（Ｌｉｃｏｎｏｘ（米国特許第６，１７４，６７７号））、発光ダイオード、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、および／または多様なイオンレーザおよび／または染料レーザを含む。励起ビームは、バンドパスフィルタ（Ｃｏｒｉｏｎ）によりスペクトルで精製され、６Ｘ対物レンズ（Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｍｏｄｅｌ Ｌ６Ｘ）を用いるラマン活性基板上に焦点化できる。対物レンズは、ホログラフィービームスプリッタ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｄｅｌ ＨＢ６４７−２６Ｎ１８）を用いて分析物を励起させ、ラマン信号を収集して励起ビームおよび放出されたラマン信号に対する直角形態を作るのにすべて使用可能である。ホログラフィーノッチフィルタ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）は、レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）散乱放射線を減少させるのに使用可能である。他のラマン検出器としては、赤色増強された高感度電荷結合素子（ＲＥ−ＩＣＣＤ）検出システム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）が装着されたＩＳＡ ＨＲ−３２０分光器を含む。フーリエ変換分光器（マイケルソン干渉計に基づく）、荷電注入装置、光ダイオードアレイ、ＩｎＣａＡｓ検出器、電子増倍ＣＣＤ、高感度ＣＣＤおよび／または光トランジスタアレイなど、他の類型の検出器が使用可能である。
【００５４】
当該分野において公知の任意の適切な形態または構成のラマン分光法または関連手法が分析物の検出に使用可能であり、ここでは、ノーマルラマンスキャッタリング、共鳴ラマンスキャッタリング、表面増強ラマンスキャッタリング、表面増強共鳴ラマンスキャッタリング、非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、刺激ラマンスキャッタリング、逆ラマン分光法、刺激ゲインラマン分光法、ハイパー−ラマンスキャッタリング、分子光学レーザ試験器（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｌａｓｅｒ ｅｘａｍｉｎｅｒ、ＭＯＬＥ）またはラマンマイクロ探針またはラマン顕微鏡法または共焦点ラマンマイクロ分光器、３次元またはスキャニングラマン、ラマン飽和分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマン解離分光法またはＵＶ−ラマン顕微鏡法を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の特定の実施態様において、ラマン検出装置は、コンピュータを含むことができる。前記実施態様は、使用されるコンピュータの類型について制限を設けない。例示的なコンピュータは、情報を相互交換するバスおよび情報処理のためのプロセッサを含むことができる。コンピュータは、ＲＡＭまたは他の動的格納装置、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）または他の静的格納装置およびデータ格納装置、例えば、マグネチックディスクまたは光学ディスクおよびこれに相応するドライブをさらに含むことができる。また、コンピュータは、当該分野において公知の周辺装置、例えば、表示装置（例えば、陰極線管または液晶表示）、アルファベット入力装置（例えば、キーボード）、カーソル調整装置（例えば、マウス、トラックボールまたはカーソル方向キー）およびコミュニケーション装置（例えば、モデム、ネットワークインタフェースカードまたはイーサネット、トークンリングまたはその他の類型のネットワークと結合するのに用いられたインタフェース装置）を含むことができる。
【００５６】
本発明の特定の実施態様において、ラマン検出装置は、コンピュータと作動可能に結合できる。検出装置からのデータは、プロセッサによって処理され、データは主記憶装置に格納できる。標準分析物に対する放出プロファイル上のデータはさらに主記憶装置またはＲＯＭに格納できる。プロセッサは、ラマン活性基板での分析物からの放出スペクトルを比較し、サンプルの分析物の類型を確認することができる。プロセッサは、検出装置からのデータを分析し、様々な分析物の正体および／または濃度を測定することができる。互いに異なって備えられたコンピュータは、特定の履行に使用可能である。したがって、システムの構造は、本発明の相違する実施態様で異なり得る。データの収集作業後、典型的には、データはデータ分析作業に送られる。分析作業を容易にするために、検出装置によって得られたデータは、前述したように、デジタルコンピュータを用いて典型的に分析する。典型的には、コンピュータは、検出装置からのデータの収容および格納のみならず、収集されたデータの分析および報告のために適切にプログラミングされる。
【００５７】
さらに他の態様として、本発明は、本発明のナノ粒子二量体を含む分析物検出用キットに関するものである。
【００５８】
具体的には、検出しようとする分析物が核酸の場合には、試料に含まれた核酸を増幅するために、ＲＴ−ＰＣＲを行うために必要な要素を含むキットであり得る。ＲＴ−ＰＣＲキットは、検出対象の核酸に対する特異的なそれぞれのプライマー対のほか、テストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウムの濃度は様々である）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などをさらに含むことができる。また、定量対照区として使用される遺伝子に特異的なプライマー対をさらに含むことができる。より好ましくは、本発明のキットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含む検出キットであり得る。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡがプローブで付着している基板、および蛍光標識プローブを製作するための試薬、製剤、酵素などをさらに含むことができる。また、基板は、定量対照区の遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡをさらに含むことができる。
【００５９】
他の具体例として、検出しようとする分析物が蛋白質の場合には、抗体の免疫学的検出のために、基質、適当な緩衝溶液、本発明のナノ粒子二量体で標識された２次抗体、発色基質などをさらに含むことができる。前記基質は、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、およびガラスからなるスライドガラスなどが使用可能である。
【００６０】
このような検出キットには、当分野において一般的に用いられる道具、試薬などが含まれる。このような道具／試薬としては、好適な担体、検出可能な信号を生成できる標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などを含むが、これらに限定されない。標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定可能な基質および反応停止剤を含むことができる。好適な担体としては、これらに限定されないが、可溶性担体、例えば、当分野において公知の生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカリド、ラテックスに金属めっきした磁性微粒子のような高分子、その他の紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組み合わせであり得る。
【００６１】
抗原−抗体複合体の形成は、組職免疫染色、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈澱分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫拡散分析法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、蛋白質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）などがあり、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００６２】
本発明にかかるラマン活性分子が２つのナノ粒子の接合部に位置するコア−シェルナノ粒子二量体は、ラマン活性分子が正確に２つのナノ粒子の接合部に位置しており、ラマン活性分子とナノ粒子の表面との間の距離は、銀または金ナノ粒子で正確に厚さが調節されているため、非常に強化された表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）信号を得ることができる。しかも、たった１つのラマン活性分子が位置しているにもかかわらず、強いラマン信号を得ることができる。また、前記コア−シェルナノ粒子二量体を合成した方法などは、非常に高い純度で二量体を合成できる有用な方法であり、特に、コアＡ、Ｂの合成時のオリゴヌクレオチドの当量的調節、磁性ナノ粒子を用いたコアＡ、Ｂの精製などにより、高純度で目的のナノ構造体を合成することができた。さらに、２つのナノ粒子間のギャップは、ナノ水準に調節可能な方法でギャップ間の距離を調節することができる。したがって、このコア−シェルナノ構造は、非常に高い程度に信号が増幅されたナノ構造体であるため、これを用いたＤＮＡ、特定疾病の発病と進行に関連する蛋白質（バイオマーカー）などの分析物の検出に高度に適用可能であり、大規模ゲノム配列分析、単一塩基多型性（ＳＮＰ）の検出、配列の比較、遺伝子型別分析、疾病相関および薬剤の開発などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】（Ａ）および（Ｂ）は、マグネチック精製、ＤＮＡハイブリッド化、および銀シェルの形成過程による金ナノ粒子二量体の合成過程を示す概路図である。プローブＡ保護配列は、３’−ＨＳ−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＣ−５’、プローブＡターゲット結合配列は、３’−ＨＳ−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＣＴＣＣＣＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴ−５’、ＭＭＰ−Ａの変形した配列は、３’−ＮＨ２−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＧＧＧＡＧ−５’（Ｔｍ＝３８℃）である。プローブＢ保護配列は、５’−ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＣ−３’、プローブＢターゲット結合配列は、５’−ＨＳ−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡ−Ｃｙ３−３’ＭＭＰ−Ｂの変形した配列は、５’−ＮＨ２−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＴＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴ−３’（Ｔｍ＝４０℃）である。下線の配列は、銀シェルの形成を促進するためにデザインされたスペーサー配列である。ターゲットＤＮＡ配列は、５’−ＧＡＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴ−３’（炭疽菌配列）である。（Ｃ）は、各二量体ナノ粒子からＳＥＲＳホットスポット構造を調べるための校正されたＡＦＭ、共焦点ラマン分光器（レーザ焦点径２５０ｎｍ）を用いた実験装置を示したものである。
【図２】（Ａ）は、金ナノ粒子二量体を形成する前と後の紫外線−可視光線スペクトルおよびＨＲ−ＴＥＭイメージを示したものである。（Ｂ）は、金ナノ粒子二量体に銀シェルを導入する前と後の紫外線−可視光線スペクトルおよびＨＲ−ＴＥＭイメージを示したものである。（Ｃ）は、銀シェルの厚さに応じて〜４００ｎｍの銀ナノパーティクルのプラズモン共鳴を示したものである。金−銀コア−シェル二量体構造のＨＲ−ＴＥＭイメージに対応する。図示のコア−シェルナノ粒子のＨＲ−ＴＥＭイメージであるＣ．１ａ、Ｃ．１ｂは、それぞれ銀シェルの厚さが５ｎｍ、１０ｎｍの金−銀コア−シェルモノマーを示す。Ｃ．２、Ｃ．３、Ｃ．４は、銀シェルの厚さがそれぞれ〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍの金−銀コア−シェルヘテロ二量体粒子を示す。
【図３】（Ａ）は、金−銀コア−シェルモノマーおよびヘテロ二量体ナノ粒子のＡＦＭ（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ、１μｍ×１μｍ）を示す。（Ｂ）は、金−銀コア−シェルナノ粒子のモノマーまたは二量体から得た校正されたＳＥＲＳスペクトルを示したものである。（Ｃ）は、５１４．５ｎｍの励起レーザ、１ｓ蓄積（１ｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）、サンプル１００μＷ、レーザ焦点径２５０ｎｍで得たすべてのスペクトルを示したものである。ラマンスペクトル（赤い線）は、ＮａＣｌ溶液による、凝集された銀コロイドにおいてＣｙ３改質されたオリゴヌクレオチドから得たものであり、ラマンスペクトル（黒い線）は、同様の条件においてＣｙ３−フリーオリゴヌクレオチドから得たのである。
【図４】各分析された金−銀コア−シェル二量体ナノ粒子が単一分子活性を有するＣｙ３に相応するＳＥＲＳ信号を示す図である。（Ａ）は、金−銀コア−シェル二量体のタッピングモードのＡＦＭイメージ（５μｍ×５μｍ）を示す（図２（Ｂ）−２の銀シェルの厚さ〜５ｎｍ、間隔距離１ｎｍ以下に対応する）。（Ｂ）は、各二量体構造から得たＣｙ３の表面増強ラマンスペクトルを示したもので、レーザ波長５１４．５ｎｍ、レーザ電力〜８０μＷ、レーザ焦点径〜２５０ｎｍ、露光時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）１秒で測定したものである。
【図５】（Ａ）および（Ｂ）は、蓄積時間１秒で同一の粒子から得たブリンキングＳＥＲＳスペクトルを示したものであり、（Ｃ）は、他の入射レーザ偏光における金−銀コア−シェルヘテロ二量体から得たＳＥＲＳスペクトルを示したものであり、（Ｄ）は、θに関する１４７０および１５８０ｃｍ−１のラマンバンドの統合ＳＥＲＳ強度のｐｏｌａｒ ｓｐｏｔを示す。レーザ波長５１４．５ｎｍ、レーザ電力〜４０μＷ、レーザ焦点径〜２５０ｎｍ、露光時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）２０秒で測定したものである。
【図６】ＦＡＭとＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチドで改質されたナノ粒子二量体から得たＳＥＲＳスペクトルを示したものである。（Ａ）は、溶液内のＦＡＭラベリングされたオリゴヌクレオチド（１ｎＭ）、およびＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチド（１ｎＭ）のラマンスペクトルを示す。（Ｂ）は、ＦＡＭラベリングされた金−銀コア−シェルナノ粒子二量体（銀シェル、５ｎｍ）、Ｄａｂｃｙｌラベリングされた金−銀コア−シェルナノ粒子二量体（銀シェル、５ｎｍ）のラマンスペクトルを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されたものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００６５】
＜実施例１．ラマン活性分子（Ｃｙ３）が２つのナノ粒子の接合部に位置する金−銀コア−シェルナノ粒子の製造＞
ラマン活性金−銀コア−シェル二量体の合成は、ターゲットオリゴヌクレオチドが結合された金ナノ粒子およびそれに追加的に銀前駆体の量によって調節される銀シェル形成のＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄに基づいて合成した（図１）。
【００６６】
まず、保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）およびターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列のモル比の正確な調節および効果的な精製ステップにより、ターゲットオリゴヌクレオチドを有する高度に精製された金ナノ粒子二量体構造を得た。依然として金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の表面およびＣｙ３分子間の最大間隔距離ｄ（ｇａｐ ｄｉｓｔａｎｃｅ）が７．５ｎｍであるため、増幅された電磁的増大を得るために間隔を減らす必要があった。ＳＥＲＳ検出において、銀が金に比べて数倍より向上した効果があるため、銀ナノシェルを導入することとした。
【００６７】
具体的には、増幅されたＳＥＲＳ信号を作るために、ナノ粒子間の間隔距離を減らすため、銀ナノシェルを既存に知られた改質方法（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００８、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００４、１０８、５８８２−５８８８）によってナノメートル水準に調節し、金ナノ粒子二量体の表面をコーティングした。常温で３時間、０．３ＭのＰＢＳ溶液内で、安定化剤として１００μＬのポリ（ビニル）ピロリドン、および還元剤として５０μＬのＬ−アスコルビン酸ナトリウム［１０−１Ｍ］の存在下に、金ナノ粒子二量体溶液２５０μＭを多様な量のＡｇＮＯ３［１０−３Ｍ］と反応させた。〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍの銀シェルの厚さを有する金−銀コア−シェルヘテロ二量体ナノ粒子は、それぞれ３０μＬ、４０μＬ、７０μＬのＡｇＮＯ３［１０−３Ｍ］溶液を用いて合成した。この方法により、銀シェルの厚さを、〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍなどのナノ単位で調節するのに成功し、ターゲットオリゴヌクレオチドと結合された金−銀コア−シェルヘテロ二量体構造を得ることができた。
【００６８】
典型的な合成方法により、１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列が金ナノ粒子の表面に改質されるように調節するために、プローブＡに対する金ナノ粒子（１５ｎｍ）を２種の３’末端チオール改質されたオリゴヌクレオチド配列で機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）した。プローブＢに対する金ナノ粒子（３０ｎｍ）も、２種の５’末端チオール改質されたオリゴヌクレオチド配列によって機能化した。２種の配列のモル比は、金ナノ粒子の表面のオリゴヌクレオチドのナノ粒子−大きさ依存的ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）能力に基づき、プローブＡに対して９９：１、プローブＢに対して１９９：１となるように調節した（図１）。重要なことには、プローブＢに対してターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列は、ラマンタグとして機能するＣｙ３を末端に結合した。オリゴヌクレオチド改質されたプローブＡおよびＢはさらに、ターゲット捕捉分子配列（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が結合されないモノマー粒子を除去するために、磁気（ｍａｇｎｅｔｉｃ）分離技術によって精製する。マグネチックビーズ（直径１μｍ、インビトロジェン）のトシル（ｔｏｓｙｌ）グループは、アミン改質されたオリゴヌクレオチド相補的配列により、それぞれプローブＡまたはＢのターゲット捕捉配列で置換結合された。ターゲット捕捉配列で結合されている金ナノ粒子のみがマグネチックビーズによって分離できる。次に、精製されたプローブＡおよびＢ溶液は、０．３ＭのＰＢＳ内の十分な量のターゲットオリゴヌクレオチド配列で混成反応した。
【００６９】
また、前記と類似の方法により、ラマン活性分子としてそれぞれＦＡＭとＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチドで改質された金−銀コア−シェルナノ粒子二量体を製造した。
【００７０】
＜実施例２．紫外線−可視光線分光法（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）およびＨＲ−ＴＥＭイメージ分析＞
金ナノ粒子二量体の形成（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）は、紫外線−可視光線分光法（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）およびＨＲ−ＴＥＭイメージから確認した（図２）。紫外線−可視光線スペクトルは、二量体の形成後に若干の赤色変換されたスペクトルを示し、これは、Ｏａｕｌ Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓら（Ａｎｇｅｗ ｃｈｅｍ．１９９９．３８（１２）、１８０８）が報告した前の結果と一致する。図２（Ａ）は、金ナノ粒子二量体の典型的なＨＲ−ＴＥＭを示す。最小２００個を分析した結果、２５％の粒子がモノマーで存在し、６５％が二量体で存在し、１０％以下が三量体または四量体またはそれ以上の凝集体で存在した。金粒子間の粒子間距離は、ＨＲ−ＴＥＭ分析による時、ｃａ．２〜３ｎｍであった。実際に、溶液状態（０．３ＰＢＳ）におけるナノ粒子間の間隔距離は、乾燥状態よりはるかに長い〜１５ｎｍであることが予想される。また、増幅されたＳＥＲＳ信号を作るために、ナノ粒子間の間隔距離を減らすため、銀ナノ粒子が既存に知られた改質方法（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００８、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００４、１０８、５８８２−５８８８）によってナノメートルで調節しながら、金ナノ粒子二量体の表面に導入した（実施例１参照）。〜３ｎｍ〜１０ｎｍの銀シェルの厚さを有する金−銀コア−シェルモノマー（図２（Ｃ）の１ａ、１ｂ）も、類似の条件で精製されたプローブＢ溶液（３０ｎｍのＡｕＮＰ）から合成した。各溶液の紫外線−可視光線スペクトル（図２（Ｂ））は、銀シェルの厚さに応じて〜４００ｎｍのプラズモン共鳴ピークで区別された。図２（Ｃ）は、個別の金−銀コア−シェルヘテロ二量体のＨＲ−ＴＥＭイメージを示し、直径２６ｎｍ−３６ｎｍ（図２（Ｃ）−２）、３０ｎｍ−４０ｎｍ（図２（Ｃ）−３）、４０ｎｍ−５０ｎｍ（図２（Ｃ）−３）の２つのコア−シェルナノ粒子の球形および銀シェルの厚さを示す。２つのナノ粒子の間には１ｎｍ以下の狭い隙間がある。図２（Ｃ）−１ａ、１ｂはさらに、個別の金−銀コア−シェルモノマーのＨＲ−ＴＥＭイメージを示し、直径４０ｎｍ（シェルの厚さ＝５ｎｍ、図２（Ｃ）−１ａ）、５０ｎｍ（シェルの厚さ＝１０ｎｍ、図２（Ｃ）−１ｂ）の各ナノ粒子の球形および銀シェルの厚さを示す。
【００７１】
次に、コア−シェルナノ粒子のモノマーまたはヘテロ二量体（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）のＳＥＲＳ／ＡＦＭを測定した。典型的な方法において、繰り返された遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分、３回）によって洗浄された金−銀コア−シェルヘテロ二量体溶液のａｌｉｑｕｏｔ（２０μＬ）は、ポリ−Ｌ−リシンコーティングされたガラスの表面にスピンコーティング（ｓｐｉｎ ｃｏａｔｅｄ）し、超純水ウォーター（ｎａｎｏｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）で数回洗浄した後、空気中で乾燥した。サンプルの製造後、直ちにＡＦＭおよびＳＥＲＳ測定に用いた。ＳＥＲＳスペクトルは、変換光学顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ａｘｏｖｅｒｔ２００、Ｚｅｉｓｓ）が装着されたＡＦＭ関連のＮａｎｏＲａｍａｎ顕微鏡によって記録し、これとは別のホームメードスキャニングコントローラによって圧電（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）ｘ−ｙサンプルスキャナ（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を調整した。アルゴンイオンレーザ（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ、ＵＳＡ）の５１４．５ｎｍ線が単一モードの光学繊維とカップリングされた励起ソース（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）として用いられた。カラーフィルタ（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｍｉｒｒｏｒ）（５２０ＤＣＬＰ、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）は、５０ｎＷ〜１ｍＷにおいて励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）レーザビームがガラスカバースリップ上層表面上の回折−限界スポット（２５０ｎｍ）にビームの焦点を置いた油浸対物レンズ顕微鏡（ｏｉｌ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ顕微鏡）（１００×、１．６Ｎ．Ａ．、Ｚｅｉｓｓ）を向くようにした。Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＶコントローラを用いて、ＡＦＭ（Ｂｉｏｓｃｏｐｅ、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｖｅｅｃｏ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）を微小機械（ｍｉｃｒｏ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）ステージに置いた。光学顕微鏡ステージ上端のタッピングモードのＡＦＭモジュールは、１００ｎｍのオーバーラップｐｒｅｃｉｓｉｏｎのＡＦＭ地形イメージ（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｉｍａｇｅ）のラマン信号に関連付けられている。レーザ焦点スポットは、ＡＦＭチップの中心に合わせられており、ＡＦＭチップの末端に対して対称的に散乱する。ラマン信号のバックグラウンドは、ＬＮ２冷却された（−１２５℃）電荷結合装置で集められる。散乱したスペクトルは、１つのａｃｑｕｉｓｉｏｎ、１秒間の蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）、４００μＷ、５００−２０００ｃｍ−１の範囲で記録した。すべてのデータは、Ｓｉからバックグラウンド信号を引くことによって修正されたベースラインである。
【００７２】
＜実施例３．金−銀コア−シェルナノ粒子のＡＦＭ（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）分析＞
図３（Ａ）は、代表的なコア−シェルモノマーおよびヘテロ二量体ナノ構造（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）の拡大されたＡＭＦ（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）イメージ（１μｍ×１μｍ）を示す。形状および直径は、ＨＲ−ＴＥＭ分析結果と一致した。図３（Ｂ）は、ＳＥＲＳスペクトルが、図３（Ａ）で指示された単一粒子に対するＡＦＭイメージによって校正されたことを示す。コア−シェルモノマー構造にはホットスポットがなく、また、たった１つのＣｙ３分子のみが存在するため、銀シェルの厚さが５ｎｍ（図３（Ａ）−１）または１０ｎｍ（図３（Ａ）−２）の金−銀コア−シェルモノマーはＳＥＲＳ信号が検出されなかった。銀シェルがない金二量体または１ｎｍ以下の間隔距離を有する金二量体もＳＥＲＳ信号が検出されなかった。これは、５１４．５ｎｍのレーザ励起条件下の電磁的増大が不足するからである。シェルの厚さが薄い（３ｎｍ未満）図３（Ａ）−４の場合、同様に入射レーザパワー（〜２００μＭ）を高めた場合にも信号が検出されなかった。この結果は、非常に薄い銀レイヤー（ｌａｙｅｒ）は、十分な電磁的増大を生産することができないことを示す。一方、シェルの厚さが〜５ｎｍの図３（Ａ）−５の場合には、１つのＣｙ３がナノ粒子間の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に位置する単一金−銀コア−シェル二量体から検出した相対的に高いＳＥＲＳ信号が現れた。低い強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）にもかかわらず、５１４．５ｎｍのレーザ励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）での指紋スペクトル（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｓｐｅｃｔｒａ）である１４７０および１５８０ｃｍ−１においてＣｙ３の特徴的なピークが現れた。低い強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、単一分子ＳＥＲＳ研究（ｓｃｉｅｎｃｅ１９９７．２７５（５２０３）、１１０２、Ｐｈｙｓ ｒｅｖ ｌｅｔｔ１９９７、７８（９）、１６６７、Ｎａｎｏ ｌｅｔｔ２００６、６（１）２１７３、Ｎａｎｏ ｌｅｔｔ ＤＯＩ：１０．１０２１／ｎｉ８０３６２１ｘ）で用いたパワー強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に比べた時、比較的低いレーザパワー（１００μＷ）およびホットスポット部位内でたった１つの分子に影響を与える。また、金ナノ粒子上で改質されたオリゴヌクレオチドのような他種からのシグナルを測定した。図３（Ｃ）は、凝集された銀コロイドにおいて、Ｃｙ３改質されたオリゴヌクレオチド（５−ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡ−Ｃｙ３−３’、１ｎＭ、赤い線）のＳＥＲＳスペクトルを、Ｃｙ３−フリーオリゴヌクレオチド（５−ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡ−３’、１ｎＭ、黒い線）のＳＥＲＳスペクトルと比較した結果を示す。図３（Ｃ）（黒い線）のＳＥＲＳスペクトルは、アデニン塩基（Ａ１０がスペーサー配列として用いられた）がリッチであることにより、アデニンモード（７３４ｃｍ−１、１３２０ｃｍ−１）が優位にあることと、他の塩基よりも増大していることを示す（ＪＡＣＳ、２００８、１３０（１６）、５５２３）。また、他のＤＮＡ塩基に対してこれまで報告された最も低い検出限界がマイクロモル以下（ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）の範囲であることも重要である（ＪＡＣＳ、２００６、１２８、１５５８０）。しかし、図３（Ｃ）のＳＥＲＳスペクトル（赤い線）は、Ｃｙ３分子で発生した信号である１４７０ｃｍ−１、１５８０ｃｍ−１における相対的に高い信号を示す（Ａｎａｎｌ ｃｈｅｍ．２００４、７６、４１２−４１７）。しかし、ラマン強度および時間によるスペクトル位置変動（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｌｕｃｔｕａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ）、およびスペクトルが各二量体ごとに異なって観察される（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００２、１０６、８０９６）。したがって、スペクトルパターンは、既存に報告されたのと完全には符合しない。銀シェルの厚さに関係なく、実験条件下で金−銀コア−シェルモノマーでの検出可能なＳＥＲＳ信号の不在は、二量体構造の接合部に位置するＣｙ構造のみが１４７０および１５８０ｃｍ−１においてＳＥＲＳピークを誘導することを確認させる。シェルの厚さが〜１０ｎｍにおけるコア−シェル二量体のラマンスペクトル（図３（Ａ）−６）は、１４８０ｃｍ−１における他のＣｙ−３関連ピークとともに、７３４ｃｍ−１、１３２０ｃｍ−１におけるアデニンモードが優位にあることを示す。他のナノ粒子に対するラマン散乱強度は、実験ごとに一定の形式（ｆｏｒｍ）を維持しない。厚い銀シェルは、適切でない電磁的増強をもたらすＣｙ３分子をカバーすることができる。
【００７３】
＜実施例４．金−銀コア−シェル二量体ナノ粒子の入射レーザの偏光によるＳＥＲＳスペクトル分析＞
シェルの厚さが〜５ｎｍである大部分のコア−シェル二量体ナノ粒子（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）は、図４（Ａ）、（Ｂ）に示すように、単一粒子から検出可能なＳＥＲＳを示した。入射レーザ光（ｉｎｃｉｄｅｎｔ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ）が二量体の粒子間軸に正確に偏光されないことを考慮すれば（図４（Ａ）−１、２、３、４、５）、垂直的に偏光化された各二量体ナノ粒子は、検出可能なＳＥＲＳ信号を示す。しかし、図５（Ｃ）は、１４７０ｃｍ−１において小さいピークのみを示すが、これは、二量体の発生（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が入射管に略垂直であるからである。したがって、シェルの厚さが最適化されたこれらのコア−シェル二量体ナノ構造が単一ＤＮＡの検出に高度に適用可能なホットスポット構造であり得ることを発見した。
【００７４】
単一分子の検出においてオン−オフブリンキング（ｂｌｉｎｋｉｎｇ）が発見されることは実験的によく知られている（図５（Ａ））（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００２、１０６、８０９６）。ラマン強度がない時、１０秒の時間が生じ、次いで、ラマン強度が戻ると、周期的なｏｎ”時間が生じる。このオン−オフサイクリング現象は、信号が存在する超強力場（ｉｎｔｅｎｓｅ ｆｉｅｌｄ）からついには永遠に消えるまで数分間継続することができる。また、ホットスポットの内外で分子の運動による秒単位のＳＥＲＳ強度変化（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）を観察することができる。これらのブリンキングおよび変動（ｂｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）現象は前の文献とよく合致する。
【００７５】
図５（Ｃ）および図５（Ｄ）は、金−銀コア−シェル二量体に対するＳＥＲＳ信号の入射レーザの偏光化された依存を示す。すべてのスペクトルは、５１４．５ｎｍの励起レーザ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｌａｓｅｒ）、２０ｓ蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）、サンプル４０μＷで検出される。入射されたレーザ光が二量体の縦軸（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｘｉｓ）に平行に偏光化された時、Ｃｙ３ピークが最大化された。レーザが縦軸から２０および４０度回転した時、Ｃｙ３信号は次第に減少した。最後に、光が縦軸に垂直に偏光した時、Ｃｙ３ピークは消えた（例えば、９０および２７０度）。１５８０ｃｍ−１において、次の公式により二量体構造でホットスポットの増強因子（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ：ＥＦ）を測定した。
【００７６】
ＥＦ＝（Ｉｓｅｒｓ×Ｎｂｕｌｋ）／（Ｉｂｕｌｋ×Ｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）
【００７７】
ＩｓｅｒｓとＩｂｕｌｋは、ＳＥＲＳおよびｂｕｌｋスペクトルに対する同一バンドの強度を示し、Ｎｂｕｌｋは、ｂｕｌｋサンプルに対するｂｕｌｋ分子標識の数を示し、Ｎｍｏｌｅｃｕｌｅは、ＳＥＲＳスペクトルにおいてＣｙ３分子標識の数を示す（Ｎｍｏｌｅｃｕｌｅ＝１）。１５８０ｃｍ−１のバンド領域で最も強いスペクトルとバンドが現れたため、このバンドをＩｓｅｒｓとＩｂｕｌｋ強度として用いた。このような接近により、ホットスポットのＥＦは２．７×１０１２で計算された。
【００７８】
一方、ＦＡＭとＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチドで改質されたナノ粒子二量体からＳＥＲＳスペクトルを測定した場合にも、Ｃｙ３の場合と同様に、高感度のラマンスペクトルを得ることができ、本発明にかかるナノ粒子二量体の構造および製造方法は、一般的なラマン活性分子に対して効果があることを確認することができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン活性分子がナノ粒子から構成された二量体の接合部に位置するように製造されたナノ粒子二量体に関し、より具体的には、コアの表面にオリゴヌクレオチドで結合されており、前記コアを取り囲む金または銀シェル（ｓｈｅｌｌ）からなるコア−シェルナノ粒子二量体に関する。コアを形成するナノ粒子は、金または銀ナノ粒子である。また、本発明は、前記コア−シェルナノ粒子二量体、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルおよびその他のサンプルからの単一分子に対する高感度の正確な検出は、医学診断学、病理学、毒物学、環境サンプリング、化学的分析およびその他の多い分野で広く使用可能であり、このため、ここ数年、生物−化学分野では、少量の合成物質および生体分子の代謝、分布および結合などを研究するのに特定の物質で標識されたナノ粒子および化学物質を広く使用してきた。代表的には、放射性同位元素を用いた方法、有機蛍光物質を用いた方法、無機物質の量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ）を用いた方法がある。
【０００３】
放射性同位元素を用いた方法において、放射性標識物質（Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｓｏｔｏｐｅ）としては、生体内で広く発見される１Ｈ、１２Ｃ、３１Ｐ、３２Ｓ、１２７Ｉなどの放射性同位体である３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉなどが広く使用される。これらの放射性同位元素は、非放射性の同位体と化学的性質がほぼ類似していて任意に置換が可能であり、放出エネルギーが比較的大きく、少量の検出も可能であるという長所があるため、長い間使用されてきた。しかし、人体に有害な放射線のため取り扱いが容易でなく、一部の同位元素の放射性は、放出エネルギーが大きい代わりに、半減期が短く、長時間の保管や実験に不便な欠点もあった。
【０００４】
放射性同位元素に対する代替法として広く使用されるのは、有機蛍光物質（Ｏｒｇａｎｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ）である。蛍光物質は、特定の波長によって活性化されると、固有の波長を有する光を発光する。特に、検索法の小型化に伴い、放射性物質も検出限界を現わして検索に長時間が要求される。これに対し、蛍光物質の場合、適切な条件で１分子あたり数千個の光子を放出することができ、単一分子水準の検出までも理論的に可能である。しかし、放射性同位元素のように活性リガンドの元素を直接置換することはできず、構造の活性関係により比較的活性に影響を与えない部分を変形して蛍光物質を連結しなければならないという限界があった。また、このような蛍光標識物質は、時間の経過によって蛍光強度が弱くなり（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）、活性化させる光の波長が非常に狭く、発光する光の波長が非常に広く、互いに異なる蛍光物質の間に干渉があるという短所を持っている。また、使用可能な蛍光物質の数が極めて限られている。
【０００５】
また、半導体ナノ物質の量子ドットは、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅなどから構成されており、大きさおよび種類に応じてそれぞれ異なる色の光を発光する。有機蛍光物質に比べて広い活性波長を有し、狭い発光波長を示すため、異なる色を発光する種類が有機蛍光物質より多い。したがって、最近、有機蛍光物質の欠点を克服するための方法として量子ドットが多く用いられている。しかし、毒性が強く、大量生産が困難であるという欠点があった。また、理論的にその種類は多様であるが、実際に使用される数は極めて限られている。
【０００６】
これらの問題を解決するための方法として、最近では、ラマン分光学および／または表面プラズモン共鳴を利用した標識物質を用いている。
【０００７】
その中でも、表面増強ラマン散乱法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＳＥＲＳ）は、金、銀などの金属ナノ構造の粗い（ｒｏｕｇｈｅｎｅｄ）表面に分子が吸着する時、ラマン散乱の強度が１０６〜１０８倍以上急激に増加する現象を利用した分光法である。光を有形媒質に通過させる場合、ある程度の量は固有方向から外れるが、このような現象がラマン散乱として知られている。散乱した光の一部が光の吸収および電子の高いエネルギー準位に励起することにより、固有の刺激された光と振動数が異なり、ラマン放出スペクトルの波長はサンプル内の光吸収分子の化学組成および構造特性を示すため、ラマン分光法は、現在非常に急速な速度で発展しているナノ技術と結合し、たった１つの分子を直接測定することができる高感度の技術として発展可能であり、特に、メディカルセンサとして極めて重要に使用できるものと大きな期待が寄せられている。この表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）の効果は、プラズモン共鳴の現象に関連付けられ、ここで、金属ナノ粒子は、金属内の伝導電子の集団カップリングにより、入射電磁放射線に応答して明確な光学的共鳴を示すため、本質的に、金、銀、銅および他の特定金属のナノ粒子は、電磁放射線の集中化効果を向上させる小型アンテナとして作用することができる。このような粒子の近傍に位置する分子は、ラマン分光法分析に対してはるかに大きな感度を示す。
【０００８】
したがって、高感度ＤＮＡ分析と共に、ＳＥＲＳセンサを用いて多様な疾病に関連する遺伝子、蛋白質（バイオマーカー）の早期診断を行おうとする研究が盛んになっている。ラマン分光法は、他の分析法（赤外線分光法）の方法とは異なり、様々な利点がある。赤外線分光法は、分子の双極子モーメントの変化がある分子の場合に強い信号を得ることができるのに対し、ラマン分光法は、分子の誘導偏極率に変化がある非極性分子の場合にも強い信号を得ることができるため、ほぼすべての有機分子が固有のラマンシフト（Ｒａｍａｎ Ｓｈｉｆｔ、ｃｍ−１）を持っている。また、水分子による干渉に影響されないため、蛋白質、遺伝子などの生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の検出により好適である。しかし、低い信号強度により、長い研究期間にもかかわらず実用化される水準には至らなかった。前記表面増強ラマン散乱法の発見以来、地道な研究を重ね、蛍光分子が吸着したナノ粒子の無秩序な凝集体において単一分子水準の信号が検出可能な表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＳＥＲＳ）が報告されて以降（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９７、２７５（５３０３）、１１０２；Ｐｈｙｓ ｒｅｖ ｌｅｔｔ１９９７、７８（９）、１６６７）、多様なナノ構造（ナノ粒子、ナノシェル、ナノ線）を用いたＳＥＲＳ増強現象に関する研究が報告された。このような高感度のＳＥＲＳ現象をバイオセンサの開発に利用するために、Ｍｉｒｋｉｎ研究チームは、最近、ＤＮＡと結合された金ナノ粒子を用いた高感度ＤＮＡ分析に成功し、このようなフォーマットの検出限界は２０ｆＭであった（２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、１５３６）。しかし、ラマン活性分子（例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ６Ｇ）を有する銀（Ａｇ）ナノ粒子の塩誘導凝集（ｓａｌｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）に基づく単一分子ＳＥＲＳ活性基質を製造する方法は、最初の研究以来、ほとんど進んでいない。不均一に（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）凝集されたコロイドは、単にその分画（１％未満）のみが単一分子ＳＥＲＳ活性を有することが報告された（Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ２００２、１０６（２）、３１１）。このようにランダムに不均一になった（粗くなった）表面は、ＳＥＲＳに関連する多量の興味深く必須のデータを提供するが、表面形態学上の小さい変化によっても増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）の変化が大きく変化するため、このような戦略は本質的に再現が不可能である。最近では、ＦａｎｇらがＳＥＲＳにおける増強部位の分布の定量的な測定に関して報告した。最も密集した部位（ＥＦ＞１０９）は、計１，０００，０００部位のうち６４部位であったが、これらは全体のＳＥＲＳ強度に２４％を寄与することが報告された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８、３２１、３８８）。このようなＳＥＲＳ信号が極大化可能な構造体を再現性あるように確保できれば、非常に信頼度の高い有用な超高感度の生体分子分析法となり得、体外診断法のほか、生体内イミジング技術としても非常に有用であると判断される。
【０００９】
しかし、前の多様な分析物のＳＥＲＳ検出に関する方法では、典型的に基板および／または支持体上にコーティングされるコロイド金属粒子、例えば、凝集された銀ナノ粒子を用い、このような配列は、時には１０６〜１０８だけ増加した感度でＳＥＲＳ検出を可能とするのに対し、ヌクレオチドなどの小さい分析物の単一分子の検出はできなかった。また、ＳＥＲＳの利点にもかかわらず、ＳＥＲＳ現象は、メカニズムが完璧に理解されていないだけでなく、正確に構造的に定義されているナノ物質の合成および制御の困難さと、スペクトルの測定時に用いられる光の波長、偏光方向に応じた増強効率の変化などにより、再現性および信頼性の面で解決しなければならない問題が多く、これは、ナノバイオセンサの開発および商用化を含むＳＥＲＳ現象の応用に大きな課題として残されている。このような問題を解決するために構造的に正確に定義されているナノ物質（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の光学的性質に対する理解とこれを用いてＳＥＲＳ現象を正確に制御するための研究の必要性が非常に切実になっている。
【００１０】
このため、Ｊｅｏｎｇ、Ｐｒｏｋｅ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｌｅｅは、金属粒子二量体（ｄｉｍｅｒ）の場合、２つ以上のナノ粒子の間に非常に強い電磁場のホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔまたはｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｅｌｄ）が形成されてＳＥＲＳ信号が増強されると報告し、電磁的な理論計算によれば、前記ホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）によって１０１２程度のＳＥＲＳ増強が予測される。このようにラマン検出の増強された感度は、コロイド粒子凝集体の内部で明確に均一でないが、ホットスポットの存在の有無によって異なる。しかし、このようなホットスポットの物理的構造、増強された感度のナノ粒子からの距離範囲、および感度を増強させる分析物と凝集体ナノ粒子との間の空間的関係性は、その特性が提示されていない。また、凝集されたナノ粒子は溶液中において本質的に不安定で、単一粒子分析物の検出の再現性に逆効果をもたらす。
【００１１】
また、金または銀二量体構造に対する理論的なシミュレーションおよびｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ（概念証明）の試みが存在するとしても、ナノ粒子間の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に実際に単一分子を位置させて製造した例はなかった。金または銀ナノ粒子をＳＥＲＳのよく定義された再現可能な構造を有するように合成することは、依然として挑むべき課題として残されている。
【００１２】
そこで、本発明者らは、単一ＤＮＡの検出に高度の敏感度と再現性を有するナノ粒子構造物を開発しようと集中的で綿密な研究を重ねた結果、コア−シェル構造の二量体ナノ粒子の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に単一ラマン活性分子を位置させ、シェルの厚さを調節して前記二量体ナノ粒子間の間隔距離を特定の範囲に調節することにより、ラマン活性分子が２つのナノ粒子の接合部に位置するコア−シェル構造の二量体ナノ粒子を開発し、前記二量体ナノ粒子が非常に強化された表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＳＥＲＳ）信号を示し、高度に再現可能なホットスポットナノ粒子であることを立証し、前記ナノ粒子のラマン散乱増強は、ＳＥＲＳ増強因子（ＥＥＭ）が〜２．７×１０１２までとなることを確認することにより本発明に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明のーつの目的は、ラマン活性分子がナノ粒子二量体の接合部に位置するコア−シェル構造のナノ粒子二量体を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ナノ粒子二量体の製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記ナノ粒子二量体を用いた分析物の検出方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記ナノ粒子二量体を含む分析物検出用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様として、本発明は、表面にオリゴヌクレオチドが結合された金または銀コア（ｃｏｒｅ）と、前記コアを取り囲む金または銀シェル（ｓｈｅｌｌ）とからなるコア−シェルナノ粒子２つの接合部にラマン活性分子が位置し、前記２つのナノ粒子がオリゴヌクレオチドを介して連結された構造を有するナノ粒子二量体に関するものである。
【００１８】
より具体的には、本発明のナノ粒子二量体は、２つのナノ粒子から構成されており、それぞれのナノ粒子は、コア（金または銀）と、コアを取り囲むシェル（金または銀）とから構成されており、それぞれのナノ粒子のコアの表面にオリゴヌクレオチドが結合されてシェルの外部に露出しており、前記２つのオリゴヌクレオチド間の混成結合によって連結されている構造を持っている。また、前記混成結合がなされる部分の接合部にはラマン活性分子が位置することができる。特に、前記それぞれのナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの一方の末端がコアの表面に結合され、前記オリゴヌクレオチドの一部は、シェルの外部に露出しており、露出した部分の配列により二量体を形成することができる。この時、それぞれ露出した２つのオリゴヌクレオチドが互いに混成結合するか、またはそれぞれ露出した２つのオリゴヌクレオチドとすべて混成結合するオリゴヌクレオチドを介して混成結合することができる。
【００１９】
本発明において、用語「コア」とは、その表面にオリゴヌクレオチドが直接結合されている金属粒子を意味し、好ましくは、金または銀である。また、本発明において、用語「シェル」とは、前記コアを取り囲んでいる金属コーティング層であって、コアの表面に結合されているオリゴヌクレオチドの一部がシェルの内部に位置する。本発明において、シェルとして金または銀を使用することが好ましい。
【００２０】
したがって、好ましい態様として、本発明は、ｉ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｉｉ）銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｉｉｉ）金コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｉｖ）銀コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、ｖ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子と、銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子とが連結されたナノ粒子二量体とからなる群より選択されるナノ粒子二量体に関するものである。最も好ましくは、本発明のナノ粒子二量体は、金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体である。
【００２１】
前記のような本発明のコア−シェル構造のナノ粒子二量体は、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）として存在することができる。ホモ二量体は、大きさと構造が同一のナノ粒子２つが連結されて二量体を形成したものであり、ヘテロ二量体は、大きさまたは構造が互いに異なるナノ粒子２つが連結されて二量体を形成したものである。
【００２２】
本発明にかかる表面増強ラマン散乱ナノ標識粒子の中心を形成しているコア粒子は、直径が５ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましいが、これは、コアの直径が５ｎｍ未満であれば、ラマン表面増強効果が低下する問題があり、３００ｎｍを超えると、生物学的応用時に多くの制約を受ける問題があるからである。より好ましくは、コアの直径は、１０ｎｍ〜４０ｎｍが好ましい。ナノ粒子は、形状の面においておおよそ球形であり得るが、任意の形状または不規則な形状のナノ粒子が使用可能である。
【００２３】
前記コア粒子の表面にはナノシェルが導入されているが、ナノシェルは、コア粒子の表面に増強されたラマン散乱（Ｒａｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）効果を与えることで、ラマン分光法による分析をより容易にする。すなわち、ナノシェルが導入されたコア粒子は、表面増強散乱効果（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）が非常に大きいため、どのような化学物質のシグナルも得られるという利点がある。好ましくは、本発明のシェルの厚さは、１ｎｍ〜３００ｎｍで、より好ましくは１〜２０ｎｍである。また、シェルの厚さは、コアの大きさと使用されたＤＮＡの長さが増加するにつれて比例的に増加することができる。
【００２４】
本発明のコア粒子の表面には、１つ以上のオリゴヌクレオチドが結合されて機能化されていることを特徴とする。まず、コアＡには、３’末端がチオールで改質された１つ以上の保護オリゴヌクレオチドと、同様に３’末端がチオールで改質された１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドとが結合できる。一方、コアＢには、５’末端がチオールで改質された１つ以上の保護オリゴヌクレオチドと、同様に５’末端がチオールで改質された１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドとが結合できる。また、前記コアＡの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、およびコアＢの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのうちのいずれか一方には、ラマン活性分子が改質されていることを特徴とする。また、コアＡに５’末端を用いた結合、コアＢに３’末端を用いた結合によっても本発明に至ることができる。
【００２５】
本発明において、用語「保護オリゴヌクレオチド」とは、コア粒子の表面に結合されており、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドがコアの表面によく結合できるようにコア粒子を安定化する一方、表面を保護する機能を果たすオリゴヌクレオチドをいう。
【００２６】
本発明において、用語「ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド」とは、ターゲットオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、コアＡのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドとコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、共に１つの共通ターゲットオリゴヌクレオチドと混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）されてナノ粒子二量体構造を形成する。
【００２７】
本発明において、用語「ターゲットオリゴヌクレオチド」とは、コアＡのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドおよびコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド共に相補的な配列を含んでおり、それぞれのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと混成化をなすことにより、２つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドを連結してナノ粒子二量体構造を形成する架橋の役割を果たすオリゴヌクレオチドをいい、本二量体構造を用いた最終目標分析物を意味するものではない。
【００２８】
本発明の保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、３’末端または５’末端が表面結合官能基を有する化合物で改質され、表面結合官能基を介してコア粒子の表面に付着している。
【００２９】
本発明において、用語「表面結合官能基を有する化合物」は、オリゴヌクレオチドをコア粒子の表面に付着させるために、各オリゴヌクレオチドの３’または５’末端に連結させた化合物をいう。このような表面結合官能基を有する化合物の類型は、溶液に沈殿しない小凝集体のナノ粒子を生成する限り限定されない。表面結合官能基を介してナノ粒子を架橋結合させる方法は、当分野において公知である（Ｆｅｌｄｈｅｉｍ、Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、Ｆａｌｌ、２００１、ｐｐ．２２−２５参照）。表面結合官能基を有する化合物の一末端は、コア粒子の表面に付着する表面結合官能基を保有するが、好ましくは、硫黄を含む基、例えば、チオール基またはスルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、ＨＳ）である。前記反応基は、アルコールおよびフェノールの誘導体として酸素サイトに硫黄を含むＲＳＨの式を有する化合物であり得る。あるいは、前記反応基は、それぞれＲＳＳＲ’またはＲＳＲ’の式を有するチオールエステル（ｔｈｉｏｌ ｅｓｔｅｒ）またはジチオールエステル（ｄｉｔｈｉｏｌ ｅｓｔｅｒ）であり得る。あるいは、前記反応基は、アミノ基（−ＮＨ２）であり得る。追加的に、前記表面結合官能基を有する化合物は、ＤＮＡプローブ、抗体、オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸などのような生体分子に対する反応グループ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）であって、例えば、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＣＯ、およびエポキシド基のような多様な反応基に連結できる。このような多くの反応性基は、当分野において公知であり、本方法および装置に使用可能である。
【００３０】
また、前記オリゴヌクレオチドにおいて、表面結合官能基を有する化合物の反対末端は、スペーサー配列を含むことができ、スペーサー配列は、コアの表面に導入されるシェルがターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのターゲット認識配列をカバー（ｃｏｖｅｒｉｎｇ）しながら、適切なシェルの厚さを維持できる空間を提供する。本発明では、スペーサー配列の一例として、Ａ１０−ＰＥＧを用いた。
【００３１】
本発明において、用語「ラマン活性分子」とは、本発明のナノ粒子二量体が１つ以上の分析物に付着した時、ラマン検出装置による分析物の検出および測定を容易にする物質をいう。本発明では、コアＡの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、およびコアＢの表面に改質されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのうちのいずれか一方には、ラマン活性分子が改質されていることを特徴とする。ラマン活性分子は、特定のラマンスペクトルを示すため、以降、生体分子をより効果的に分析できるようにするという利点がある。
【００３２】
ラマン分光法に使用可能なラマン活性分子は、有機または無機分子、原子、複合体または合成分子、染料、天然発生染料（フィコエリトリンなど）、Ｃ６０のような有機ナノ構造体、バッキーボール、炭素ナノチューブ、量子ドット、有機蛍光分子などを含む。具体的には、ラマン活性分子の例として、ＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート）、ＭＧＩＴＣ（マラカイトグリーンイソチオシアネート）、ＸＲＩＴＣ（Ｘ−ローダミン−５−イソチオシアネート）、ＤＴＤＣ（３，３−ジエチルチアジカルボシアニンヨージド）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−１，３−ジアゾール）、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、パラ−アミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ、フルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、炭素同素体、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リンまたは硫黄などがあるが、これらに限定されず、使用されたラマン活性分子が明確なラマンスペクトルを示さなければならず、互いに異なる類型の分析物と特に結合したり関連付けられなければならない。好ましくは、シアニン系の蛍光維持分子のＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、またはＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ系の蛍光分子を含む有機蛍光分子である。有機蛍光分子は、ラマン分析時に用いるレーザ波長と共鳴し、より高いラマン信号の検出が可能であるという利点がある。ラマン活性分子は、分析物に直接付着できるか、多様なリンカー化合物を介して付着できる。
【００３３】
本発明者らは、ラマン活性分子がナノ粒子二量体の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に位置する場合にのみ、ＳＥＲＳ信号の検出が可能であることを確認した。具体的には、コア−シェルモノマー構造では、ホットスポットがなく、また、たった１つのラマン活性分子が存在するため、ＳＥＲＳ信号が検出されなかった（図３（Ａ）−１、２）。
【００３４】
他の態様として、本発明は、前記ラマン活性分子でラベリングされたコア−シェル構造のナノ粒子二量体の製造方法に関するものである。
【００３５】
より具体的には、１）表面が保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＡと、表面が保護オリゴヌクレオチドおよびラマン活性分子が末端に結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＢとをそれぞれ製造するステップと、２）前記製造されたコアＡおよびコアＢにターゲットオリゴヌクレオチドを処理して混成化させることにより、二量体を形成するステップと、３）前記コアＡおよびコアＢの表面にそれぞれシェルを導入するステップとを含むナノ粒子二量体の製造方法に関するものである。
【００３６】
ステップ１）は、それぞれ表面が保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されているコアＡおよびコアＢを製造するステップである。本発明の具体的な実施例では、１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列がコア粒子の表面に結合されるように調節するために、金コア粒子Ａを、３’末端がチオールで改質された２種のオリゴヌクレオチド配列である、１つ以上の保護オリゴヌクレオチドおよび１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合した。金コア粒子Ｂも、５’末端がチオールで改質された２種のオリゴヌクレオチド配列によって結合した。前記２種のオリゴヌクレオチド配列のモル比は、金コア粒子の表面のオリゴヌクレオチドのナノ粒子−大きさ依存的ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）能力に基づき、コアＡに対しては９９：１、コアＢに対しては１９９：１となるように調節した（図１（Ａ））。重要なこととして、コアＢに結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列の末端に、ラマン信号の機能を果たすＣｙ３、ＦＡＭ、またはＤａｂｃｙｌを結合させた。
【００３７】
また、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が結合されないモノマー粒子を除去し、オリゴヌクレオチド改質されたコアＡおよびＢを精製するために、磁気（ｍａｇｎｅｔｉｃ）分離技術を利用することができる。トシル（ｔｏｓｙｌ）グループマグネチックビーズ（直径１μｍ、インビトロジェン）は、アミン改質されたオリゴヌクレオチドの相補的配列により、それぞれコアＡまたはＢのターゲット捕捉配列で置換結合することができる。ターゲット捕捉配列で結合されたコア粒子のみがマグネチックビーズに相補的な混成結合をするため、反応後溶液中において外部磁場を加えて磁性ナノ粒子を分離した後、二重螺旋ＤＮＡ塩基配列の溶融点（Ｔｍ）以上に昇温し、磁性ナノ粒子に結合されたコア粒子を分離することができる。
【００３８】
追加的に、前記ステップ１）でコアＡとコアＢとをそれぞれ製造した後、コアＡとコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する磁性マイクロ粒子と混成化反応を進行し、コアＡとコアＢからターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが結合されたナノ粒子のみを分離する過程をさらに含むことができる。
【００３９】
ステップ２）は、前記製造されたコアＡおよびコアＢにターゲットオリゴヌクレオチドを加えて混成化させることにより、二量体を形成するステップである。ステップ１）でマグネチックビーズによって分離および精製されたコア粒子ＡおよびＢの溶液は、例えば、０．３ＭのＰＢＳ内の十分な量のターゲットオリゴヌクレオチド配列との混成結合により、目的の二量体ナノ粒子を合成することができる。したがって、本発明にかかる二量体合成法は、非常に高い収率（７０−８０％）で二量体を合成することができる。
【００４０】
ステップ３）として、コア粒子の表面へのナノシェル粒子の導入は、例えば、金コア粒子および銀ナノ粒子の前駆体を、溶媒の存在下に１０〜１００℃で反応させることによって導入されることが好ましい。前記銀ナノ粒子の前駆体は、ＡｇＮＯ３、またはＡｇＣｌＯ４を選択することが好ましく、金ナノ粒子の前駆体は、ＨＡｕＣｌ４などのＡｕイオンを含むいずれの化合物も前駆体として使用可能である。また、銀イオンや金イオンを金または銀ナノ粒子に転換するのに必要な還元剤は、ヒドロキノン（ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、アスコルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｓｃｏｒｂａｔｅ）などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。ナノシェル形成反応の溶媒は、水溶液（精製水またはリン酸バッファーなどが存在してもかまわない）が好ましい。ナノシェルの精密な厚さ調節のために、さらに安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）を追加することができる。前記反応温度が１０℃未満であれば、銀ナノ粒子を形成させるのに過度に多い時間がかかる問題があり、１００℃を超えると、銀ナノ粒子が不均一に形成される問題があるため、前記範囲の温度で反応させることが好ましい。前記において、反応時間は、反応温度に応じて１０〜２４時間の間に調節できる。
【００４１】
本発明にかかるラマン活性分子が２つのナノ粒子の接合部に位置するコア−シェル構造のナノ粒子二量体は、ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子が機能化され、各種生体分子を検出するのに応用可能である。
【００４２】
例えば、検出しようとする分析物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、グリコプロテイン、リポプロテイン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝産物、補助因子、抑制剤、薬物、薬学物、営養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学無機剤、生体有害性製剤、放射線同位元素、ビタミン、ヘテロ環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発要因、痲酔剤、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物または汚染物であり得る。また、分析物が核酸の場合、前記核酸は、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、カビＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、改質されたオリゴヌクレオチド、単鎖および二本鎖核酸、自然的および合成核酸を含む。
【００４３】
また、前記分析物を認識できる、ナノ粒子二量体などの表面に結合可能なバイオ分子の非限定的な例は、抗体、抗体断片、遺伝操作抗体、単鎖抗体、受容体蛋白質、結合蛋白質、酵素、抑制剤蛋白質、レクチン、細胞癒着蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸またはアプタマーを挙げることができる。
【００４４】
さらに、本発明のナノ粒子二量体は、ナノ粒子二量体全体が無機物でコーティングできる。無機物でナノ粒子二量体全体がコーティングされると、構造が変形する可能性が少なくなるため、ナノ粒子二量体の構造を安定して維持することができ、保管および使用により好ましい。前記無機物は、ナノ粒子二量体の構造を維持し、ラマン信号に影響を与えない物質であれば限定はなく、一例として、シリカを使用することができる。
【００４５】
さらに他の態様として、本発明は、前記のような本発明のナノ粒子二量体を用いた分析物の検出方法を提供する。
【００４６】
より具体的には、１）本発明のナノ粒子二量体を製造するステップと、２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子を機能化するステップと、３）前記ナノ粒子二量体を、１つ以上の分析物を含むサンプルに露出させるステップと、４）レーザ励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）およびラマン分光法を用いて１つ以上の分析物を検出および確認するステップとを含む分析物の検出方法に関するものである。
【００４７】
好ましくは、本発明の分析物は、任意の公知のラマン分光法によって検出または確認可能であり、好ましくは、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ、Ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ハイパー−ラマンおよび／または非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ、ｃｏｈｅｒｅｎｔ ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を用いることができる。
【００４８】
本発明において、用語「表面増強ラマン散乱法（ＳＥＲＳ）」とは、粗く処理された特定の金属表面に吸着していたり、数百ナノメートル以内の距離に位置している時に発生するラマン散乱の一種で、この時、ラマン散乱の強度は、一般的なラマンの強度に比べて１０６〜１０８倍以上増加する現象を利用した分光法をいう。用語「表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）」とは、ＳＥＲＳ活性表面での吸着物に対するレーザ励起波長の共鳴現象を利用した分光法をいう。用語「非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）」とは、ラマン活性媒質に固定可変の２つのレーザ光を入射させ、これらの結合によって得られる反ストークス放射のスペクトルを測定する分光法をいう。
【００４９】
より具体的な態様として、本発明の前記分析物の検出方法は、１）本発明のナノ粒子二量体を製造するステップと、２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする核酸に相補的なバイオ分子を機能化するステップと、３）試料から核酸を抽出、精製、および増幅させるステップと、４）前記増幅された核酸の特定配列にコア−シェルナノ粒子二量体を反応させて混成化を行うステップと、５）前記ナノ粒子二量体が結合された核酸にラマン分光を行うステップとを含む核酸の検出方法であり得る。また、これと同じ類型の方法を用いて核酸に関するその他の情報、例えば、サンプルに存在する１種以上の単一塩基多型性（ＳＮＰ）または他の遺伝的変異の形態を検出することができ、ひいては、ＤＮＡシーケンシングにも応用可能である。
【００５０】
このような実施態様において、ラマン活性基板は、１つ以上のラマン検出単位装置と作動可能に結合できる。ラマン分光法による分析物の検出のための様々な方法は、当該分野において公知である（例えば、米国特許第６，００２，４７１号、第６，０４０，１９１号、第６，１４９，８６８号、第６，１７４，６７７号、第６，３１３，９１４号）。ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳにおいて、ラマン検出の感度は、粗い金属表面、例えば、銀、金、白金、銅またはアルミニウム表面上に吸収された分子に対して１０６以上に増強される。
【００５１】
ラマン検出装置の非限定的な例は、米国特許第６，００２，４７１号に開示されている。励起ビームは、５３２ｎｍの波長における周波数重畳されたＮｄ：ＹＡＧレーザ、または３６５ｎｍの波長における周波数重畳されたＴｉ：サファイアレーザによって生成される。パルスレーザビームまたは連続レーザビームが使用可能である。励起ビームは、共焦点の光学器および顕微鏡レンズを通過して１つ以上の分析物を含むラマン活性基板上に焦点が集められる。分析物からのラマン放出光は、顕微鏡レンズおよび共焦点光学器によって集められ、スペクトル分離のために単色光装置と結合される。共焦点光学器としては、背景信号を減少させるための干渉フィルタ（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｆｉｌｔｅｒ）、遮断フィルタ、共焦点ピンホール、対物レンズおよび鏡の組み合わせを含む。共焦点光学器のみならず、標準フルフィールド（ｆｕｌｌ ｆｉｅｌｄ）光学器も使用可能である。ラマン放出信号は、信号をカウントしデジタル化するコンピュータとインタフェースで連結されたなだれ型光ダイオードを含むラマン検出器によって検出される。
【００５２】
検出装置の他の例は、米国特許第５，３０６，４０３号に開示されており、ここでは、単光子カウント方式で作動するガリウム−砒素光電子増倍管（ＲＣＡ Ｍｏｄｅｌ Ｃ３１０３４またはＢｕｒｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｍｏｄｅｌ Ｃ３１０３４０２）が備えられたＳｐｅｘ Ｍｏｄｅｌ１４０３二重格子分光計を挙げることができる。励起化供給源は、ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ、モデル１６６からの５１４．５ｎｍ線アルゴン−イオンレーザ、およびクリプトン（ｋｒｙｐｔｏｎ）−イオンレーザ（Ｉｎｎｏｖａ７０、非干渉性）の６４７．１ｎｍ線を含む。
【００５３】
他の励起化供給源としては、３３７ｎｍにおける窒素レーザ（Ｌａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）、および３２５ｎｍにおけるヘリウム−カドミウムレーザ（Ｌｉｃｏｎｏｘ（米国特許第６，１７４，６７７号））、発光ダイオード、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、および／または多様なイオンレーザおよび／または染料レーザを含む。励起ビームは、バンドパスフィルタ（Ｃｏｒｉｏｎ）によりスペクトルで精製され、６Ｘ対物レンズ（Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｍｏｄｅｌ Ｌ６Ｘ）を用いるラマン活性基板上に焦点化できる。対物レンズは、ホログラフィービームスプリッタ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｄｅｌ ＨＢ６４７−２６Ｎ１８）を用いて分析物を励起させ、ラマン信号を収集して励起ビームおよび放出されたラマン信号に対する直角形態を作るのにすべて使用可能である。ホログラフィーノッチフィルタ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）は、レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）散乱放射線を減少させるのに使用可能である。他のラマン検出器としては、赤色増強された高感度電荷結合素子（ＲＥ−ＩＣＣＤ）検出システム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）が装着されたＩＳＡ ＨＲ−３２０分光器を含む。フーリエ変換分光器（マイケルソン干渉計に基づく）、荷電注入装置、光ダイオードアレイ、ＩｎＣａＡｓ検出器、電子増倍ＣＣＤ、高感度ＣＣＤおよび／または光トランジスタアレイなど、他の類型の検出器が使用可能である。
【００５４】
当該分野において公知の任意の適切な形態または構成のラマン分光法または関連手法が分析物の検出に使用可能であり、ここでは、ノーマルラマンスキャッタリング、共鳴ラマンスキャッタリング、表面増強ラマンスキャッタリング、表面増強共鳴ラマンスキャッタリング、非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、刺激ラマンスキャッタリング、逆ラマン分光法、刺激ゲインラマン分光法、ハイパー−ラマンスキャッタリング、分子光学レーザ試験器（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｌａｓｅｒ ｅｘａｍｉｎｅｒ、ＭＯＬＥ）またはラマンマイクロ探針またはラマン顕微鏡法または共焦点ラマンマイクロ分光器、３次元またはスキャニングラマン、ラマン飽和分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマン解離分光法またはＵＶ−ラマン顕微鏡法を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の特定の実施態様において、ラマン検出装置は、コンピュータを含むことができる。前記実施態様は、使用されるコンピュータの類型について制限を設けない。例示的なコンピュータは、情報を相互交換するバスおよび情報処理のためのプロセッサを含むことができる。コンピュータは、ＲＡＭまたは他の動的格納装置、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）または他の静的格納装置およびデータ格納装置、例えば、マグネチックディスクまたは光学ディスクおよびこれに相応するドライブをさらに含むことができる。また、コンピュータは、当該分野において公知の周辺装置、例えば、表示装置（例えば、陰極線管または液晶表示）、アルファベット入力装置（例えば、キーボード）、カーソル調整装置（例えば、マウス、トラックボールまたはカーソル方向キー）およびコミュニケーション装置（例えば、モデム、ネットワークインタフェースカードまたはイーサネット、トークンリングまたはその他の類型のネットワークと結合するのに用いられたインタフェース装置）を含むことができる。
【００５６】
本発明の特定の実施態様において、ラマン検出装置は、コンピュータと作動可能に結合できる。検出装置からのデータは、プロセッサによって処理され、データは主記憶装置に格納できる。標準分析物に対する放出プロファイル上のデータはさらに主記憶装置またはＲＯＭに格納できる。プロセッサは、ラマン活性基板での分析物からの放出スペクトルを比較し、サンプルの分析物の類型を確認することができる。プロセッサは、検出装置からのデータを分析し、様々な分析物の正体および／または濃度を測定することができる。互いに異なって備えられたコンピュータは、特定の履行に使用可能である。したがって、システムの構造は、本発明の相違する実施態様で異なり得る。データの収集作業後、典型的には、データはデータ分析作業に送られる。分析作業を容易にするために、検出装置によって得られたデータは、前述したように、デジタルコンピュータを用いて典型的に分析する。典型的には、コンピュータは、検出装置からのデータの収容および格納のみならず、収集されたデータの分析および報告のために適切にプログラミングされる。
【００５７】
さらに他の態様として、本発明は、本発明のナノ粒子二量体を含む分析物検出用キットに関するものである。
【００５８】
具体的には、検出しようとする分析物が核酸の場合には、試料に含まれた核酸を増幅するために、ＲＴ−ＰＣＲを行うために必要な要素を含むキットであり得る。ＲＴ−ＰＣＲキットは、検出対象の核酸に対する特異的なそれぞれのプライマー対のほか、テストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウムの濃度は様々である）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などをさらに含むことができる。また、定量対照区として使用される遺伝子に特異的なプライマー対をさらに含むことができる。より好ましくは、本発明のキットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含む検出キットであり得る。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡがプローブで付着している基板、および蛍光標識プローブを製作するための試薬、製剤、酵素などをさらに含むことができる。また、基板は、定量対照区の遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡをさらに含むことができる。
【００５９】
他の具体例として、検出しようとする分析物が蛋白質の場合には、抗体の免疫学的検出のために、基質、適当な緩衝溶液、本発明のナノ粒子二量体で標識された２次抗体、発色基質などをさらに含むことができる。前記基質は、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、およびガラスからなるスライドガラスなどが使用可能である。
【００６０】
このような検出キットには、当分野において一般的に用いられる道具、試薬などが含まれる。このような道具／試薬としては、好適な担体、検出可能な信号を生成できる標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などを含むが、これらに限定されない。標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定可能な基質および反応停止剤を含むことができる。好適な担体としては、これらに限定されないが、可溶性担体、例えば、当分野において公知の生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカリド、ラテックスに金属めっきした磁性微粒子のような高分子、その他の紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組み合わせであり得る。
【００６１】
抗原−抗体複合体の形成は、組職免疫染色、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈澱分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫拡散分析法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、蛋白質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）などがあり、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００６２】
本発明にかかるラマン活性分子が２つのナノ粒子の接合部に位置するコア−シェルナノ粒子二量体は、ラマン活性分子が正確に２つのナノ粒子の接合部に位置しており、ラマン活性分子とナノ粒子の表面との間の距離は、銀または金ナノ粒子で正確に厚さが調節されているため、非常に強化された表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）信号を得ることができる。しかも、たった１つのラマン活性分子が位置しているにもかかわらず、強いラマン信号を得ることができる。また、前記コア−シェルナノ粒子二量体を合成した方法などは、非常に高い純度で二量体を合成できる有用な方法であり、特に、コアＡ、Ｂの合成時のオリゴヌクレオチドの当量的調節、磁性ナノ粒子を用いたコアＡ、Ｂの精製などにより、高純度で目的のナノ構造体を合成することができた。さらに、２つのナノ粒子間のギャップは、ナノ水準に調節可能な方法でギャップ間の距離を調節することができる。したがって、このコア−シェルナノ構造は、非常に高い程度に信号が増幅されたナノ構造体であるため、これを用いたＤＮＡ、特定疾病の発病と進行に関連する蛋白質（バイオマーカー）などの分析物の検出に高度に適用可能であり、大規模ゲノム配列分析、単一塩基多型性（ＳＮＰ）の検出、配列の比較、遺伝子型別分析、疾病相関および薬剤の開発などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】（Ａ）および（Ｂ）は、マグネチック精製、ＤＮＡハイブリッド化、および銀シェルの形成過程による金ナノ粒子二量体の合成過程を示す概路図である。プローブＡ保護配列は、３’−ＨＳ−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＣ−５’、プローブＡターゲット結合配列は、３’−ＨＳ−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＣＴＣＣＣＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴ−５’、ＭＭＰ−Ａの変形した配列は、３’−ＮＨ２−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＧＧＧＡＧ−５’（Ｔｍ＝３８℃）である。プローブＢ保護配列は、５’−ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＣ−３’、プローブＢターゲット結合配列は、５’−ＨＳ−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡ−Ｃｙ３−３’ＭＭＰ−Ｂの変形した配列は、５’−ＮＨ２−（ＣＨ２）３−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＴＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴ−３’（Ｔｍ＝４０℃）である。下線の配列は、銀シェルの形成を促進するためにデザインされたスペーサー配列である。ターゲットＤＮＡ配列は、５’−ＧＡＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴ−３’（炭疽菌配列）である。（Ｃ）は、各二量体ナノ粒子からＳＥＲＳホットスポット構造を調べるための校正されたＡＦＭ、共焦点ラマン分光器（レーザ焦点径２５０ｎｍ）を用いた実験装置を示したものである。
【図２】（Ａ）は、金ナノ粒子二量体を形成する前と後の紫外線−可視光線スペクトルおよびＨＲ−ＴＥＭイメージを示したものである。（Ｂ）は、金ナノ粒子二量体に銀シェルを導入する前と後の紫外線−可視光線スペクトルおよびＨＲ−ＴＥＭイメージを示したものである。（Ｃ）は、銀シェルの厚さに応じて〜４００ｎｍの銀ナノパーティクルのプラズモン共鳴を示したものである。金−銀コア−シェル二量体構造のＨＲ−ＴＥＭイメージに対応する。図示のコア−シェルナノ粒子のＨＲ−ＴＥＭイメージであるＣ．１ａ、Ｃ．１ｂは、それぞれ銀シェルの厚さが５ｎｍ、１０ｎｍの金−銀コア−シェルモノマーを示す。Ｃ．２、Ｃ．３、Ｃ．４は、銀シェルの厚さがそれぞれ〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍの金−銀コア−シェルヘテロ二量体粒子を示す。
【図３】（Ａ）は、金−銀コア−シェルモノマーおよびヘテロ二量体ナノ粒子のＡＦＭ（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ、１μｍ×１μｍ）を示す。（Ｂ）は、金−銀コア−シェルナノ粒子のモノマーまたは二量体から得た校正されたＳＥＲＳスペクトルを示したものである。（Ｃ）は、５１４．５ｎｍの励起レーザ、１ｓ蓄積（１ｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）、サンプル１００μＷ、レーザ焦点径２５０ｎｍで得たすべてのスペクトルを示したものである。ラマンスペクトル（赤い線）は、ＮａＣｌ溶液による、凝集された銀コロイドにおいてＣｙ３改質されたオリゴヌクレオチドから得たものであり、ラマンスペクトル（黒い線）は、同様の条件においてＣｙ３−フリーオリゴヌクレオチドから得たのである。
【図４】各分析された金−銀コア−シェル二量体ナノ粒子が単一分子活性を有するＣｙ３に相応するＳＥＲＳ信号を示す図である。（Ａ）は、金−銀コア−シェル二量体のタッピングモードのＡＦＭイメージ（５μｍ×５μｍ）を示す（図２（Ｂ）−２の銀シェルの厚さ〜５ｎｍ、間隔距離１ｎｍ以下に対応する）。（Ｂ）は、各二量体構造から得たＣｙ３の表面増強ラマンスペクトルを示したもので、レーザ波長５１４．５ｎｍ、レーザ電力〜８０μＷ、レーザ焦点径〜２５０ｎｍ、露光時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）１秒で測定したものである。
【図５】（Ａ）および（Ｂ）は、蓄積時間１秒で同一の粒子から得たブリンキングＳＥＲＳスペクトルを示したものであり、（Ｃ）は、他の入射レーザ偏光における金−銀コア−シェルヘテロ二量体から得たＳＥＲＳスペクトルを示したものであり、（Ｄ）は、θに関する１４７０および１５８０ｃｍ−１のラマンバンドの統合ＳＥＲＳ強度のｐｏｌａｒ ｓｐｏｔを示す。レーザ波長５１４．５ｎｍ、レーザ電力〜４０μＷ、レーザ焦点径〜２５０ｎｍ、露光時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）２０秒で測定したものである。
【図６】ＦＡＭとＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチドで改質されたナノ粒子二量体から得たＳＥＲＳスペクトルを示したものである。（Ａ）は、溶液内のＦＡＭラベリングされたオリゴヌクレオチド（１ｎＭ）、およびＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチド（１ｎＭ）のラマンスペクトルを示す。（Ｂ）は、ＦＡＭラベリングされた金−銀コア−シェルナノ粒子二量体（銀シェル、５ｎｍ）、Ｄａｂｃｙｌラベリングされた金−銀コア−シェルナノ粒子二量体（銀シェル、５ｎｍ）のラマンスペクトルを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されたものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００６５】
＜実施例１．ラマン活性分子（Ｃｙ３）が２つのナノ粒子の接合部に位置する金−銀コア−シェルナノ粒子の製造＞
ラマン活性金−銀コア−シェル二量体の合成は、ターゲットオリゴヌクレオチドが結合された金ナノ粒子およびそれに追加的に銀前駆体の量によって調節される銀シェル形成のＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄに基づいて合成した（図１）。
【００６６】
まず、保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）およびターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列のモル比の正確な調節および効果的な精製ステップにより、ターゲットオリゴヌクレオチドを有する高度に精製された金ナノ粒子二量体構造を得た。依然として金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の表面およびＣｙ３分子間の最大間隔距離ｄ（ｇａｐ ｄｉｓｔａｎｃｅ）が７．５ｎｍであるため、増幅された電磁的増大を得るために間隔を減らす必要があった。ＳＥＲＳ検出において、銀が金に比べて数倍より向上した効果があるため、銀ナノシェルを導入することとした。
【００６７】
具体的には、増幅されたＳＥＲＳ信号を作るために、ナノ粒子間の間隔距離を減らすため、銀ナノシェルを既存に知られた改質方法（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００８、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００４、１０８、５８８２−５８８８）によってナノメートル水準に調節し、金ナノ粒子二量体の表面をコーティングした。常温で３時間、０．３ＭのＰＢＳ溶液内で、安定化剤として１００μＬのポリ（ビニル）ピロリドン、および還元剤として５０μＬのＬ−アスコルビン酸ナトリウム［１０−１Ｍ］の存在下に、金ナノ粒子二量体溶液２５０μＭを多様な量のＡｇＮＯ３［１０−３Ｍ］と反応させた。〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍの銀シェルの厚さを有する金−銀コア−シェルヘテロ二量体ナノ粒子は、それぞれ３０μＬ、４０μＬ、７０μＬのＡｇＮＯ３［１０−３Ｍ］溶液を用いて合成した。この方法により、銀シェルの厚さを、〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍなどのナノ単位で調節するのに成功し、ターゲットオリゴヌクレオチドと結合された金−銀コア−シェルヘテロ二量体構造を得ることができた。
【００６８】
典型的な合成方法により、１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列が金ナノ粒子の表面に改質されるように調節するために、プローブＡに対する金ナノ粒子（１５ｎｍ）を２種の３’末端チオール改質されたオリゴヌクレオチド配列で機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）した。プローブＢに対する金ナノ粒子（３０ｎｍ）も、２種の５’末端チオール改質されたオリゴヌクレオチド配列によって機能化した。２種の配列のモル比は、金ナノ粒子の表面のオリゴヌクレオチドのナノ粒子−大きさ依存的ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）能力に基づき、プローブＡに対して９９：１、プローブＢに対して１９９：１となるように調節した（図１）。重要なことには、プローブＢに対してターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列は、ラマンタグとして機能するＣｙ３を末端に結合した。オリゴヌクレオチド改質されたプローブＡおよびＢはさらに、ターゲット捕捉分子配列（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が結合されないモノマー粒子を除去するために、磁気（ｍａｇｎｅｔｉｃ）分離技術によって精製する。マグネチックビーズ（直径１μｍ、インビトロジェン）のトシル（ｔｏｓｙｌ）グループは、アミン改質されたオリゴヌクレオチド相補的配列により、それぞれプローブＡまたはＢのターゲット捕捉配列で置換結合された。ターゲット捕捉配列で結合されている金ナノ粒子のみがマグネチックビーズによって分離できる。次に、精製されたプローブＡおよびＢ溶液は、０．３ＭのＰＢＳ内の十分な量のターゲットオリゴヌクレオチド配列で混成反応した。
【００６９】
また、前記と類似の方法により、ラマン活性分子としてそれぞれＦＡＭとＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチドで改質された金−銀コア−シェルナノ粒子二量体を製造した。
【００７０】
＜実施例２．紫外線−可視光線分光法（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）およびＨＲ−ＴＥＭイメージ分析＞
金ナノ粒子二量体の形成（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）は、紫外線−可視光線分光法（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）およびＨＲ−ＴＥＭイメージから確認した（図２）。紫外線−可視光線スペクトルは、二量体の形成後に若干の赤色変換されたスペクトルを示し、これは、Ｏａｕｌ Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓら（Ａｎｇｅｗ ｃｈｅｍ．１９９９．３８（１２）、１８０８）が報告した前の結果と一致する。図２（Ａ）は、金ナノ粒子二量体の典型的なＨＲ−ＴＥＭを示す。最小２００個を分析した結果、２５％の粒子がモノマーで存在し、６５％が二量体で存在し、１０％以下が三量体または四量体またはそれ以上の凝集体で存在した。金粒子間の粒子間距離は、ＨＲ−ＴＥＭ分析による時、ｃａ．２〜３ｎｍであった。実際に、溶液状態（０．３ＰＢＳ）におけるナノ粒子間の間隔距離は、乾燥状態よりはるかに長い〜１５ｎｍであることが予想される。また、増幅されたＳＥＲＳ信号を作るために、ナノ粒子間の間隔距離を減らすため、銀ナノ粒子が既存に知られた改質方法（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００８、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００４、１０８、５８８２−５８８８）によってナノメートルで調節しながら、金ナノ粒子二量体の表面に導入した（実施例１参照）。〜３ｎｍ〜１０ｎｍの銀シェルの厚さを有する金−銀コア−シェルモノマー（図２（Ｃ）の１ａ、１ｂ）も、類似の条件で精製されたプローブＢ溶液（３０ｎｍのＡｕＮＰ）から合成した。各溶液の紫外線−可視光線スペクトル（図２（Ｂ））は、銀シェルの厚さに応じて〜４００ｎｍのプラズモン共鳴ピークで区別された。図２（Ｃ）は、個別の金−銀コア−シェルヘテロ二量体のＨＲ−ＴＥＭイメージを示し、直径２６ｎｍ−３６ｎｍ（図２（Ｃ）−２）、３０ｎｍ−４０ｎｍ（図２（Ｃ）−３）、４０ｎｍ−５０ｎｍ（図２（Ｃ）−３）の２つのコア−シェルナノ粒子の球形および銀シェルの厚さを示す。２つのナノ粒子の間には１ｎｍ以下の狭い隙間がある。図２（Ｃ）−１ａ、１ｂはさらに、個別の金−銀コア−シェルモノマーのＨＲ−ＴＥＭイメージを示し、直径４０ｎｍ（シェルの厚さ＝５ｎｍ、図２（Ｃ）−１ａ）、５０ｎｍ（シェルの厚さ＝１０ｎｍ、図２（Ｃ）−１ｂ）の各ナノ粒子の球形および銀シェルの厚さを示す。
【００７１】
次に、コア−シェルナノ粒子のモノマーまたはヘテロ二量体（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）のＳＥＲＳ／ＡＦＭを測定した。典型的な方法において、繰り返された遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分、３回）によって洗浄された金−銀コア−シェルヘテロ二量体溶液のａｌｉｑｕｏｔ（２０μＬ）は、ポリ−Ｌ−リシンコーティングされたガラスの表面にスピンコーティング（ｓｐｉｎ ｃｏａｔｅｄ）し、超純水ウォーター（ｎａｎｏｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）で数回洗浄した後、空気中で乾燥した。サンプルの製造後、直ちにＡＦＭおよびＳＥＲＳ測定に用いた。ＳＥＲＳスペクトルは、変換光学顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ａｘｏｖｅｒｔ２００、Ｚｅｉｓｓ）が装着されたＡＦＭ関連のＮａｎｏＲａｍａｎ顕微鏡によって記録し、これとは別のホームメードスキャニングコントローラによって圧電（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）ｘ−ｙサンプルスキャナ（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を調整した。アルゴンイオンレーザ（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ、ＵＳＡ）の５１４．５ｎｍ線が単一モードの光学繊維とカップリングされた励起ソース（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）として用いられた。カラーフィルタ（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｍｉｒｒｏｒ）（５２０ＤＣＬＰ、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）は、５０ｎＷ〜１ｍＷにおいて励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）レーザビームがガラスカバースリップ上層表面上の回折−限界スポット（２５０ｎｍ）にビームの焦点を置いた油浸対物レンズ顕微鏡（ｏｉｌ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ顕微鏡）（１００×、１．６Ｎ．Ａ．、Ｚｅｉｓｓ）を向くようにした。Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＶコントローラを用いて、ＡＦＭ（Ｂｉｏｓｃｏｐｅ、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｖｅｅｃｏ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）を微小機械（ｍｉｃｒｏ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）ステージに置いた。光学顕微鏡ステージ上端のタッピングモードのＡＦＭモジュールは、１００ｎｍのオーバーラップｐｒｅｃｉｓｉｏｎのＡＦＭ地形イメージ（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｉｍａｇｅ）のラマン信号に関連付けられている。レーザ焦点スポットは、ＡＦＭチップの中心に合わせられており、ＡＦＭチップの末端に対して対称的に散乱する。ラマン信号のバックグラウンドは、ＬＮ２冷却された（−１２５℃）電荷結合装置で集められる。散乱したスペクトルは、１つのａｃｑｕｉｓｉｏｎ、１秒間の蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）、４００μＷ、５００−２０００ｃｍ−１の範囲で記録した。すべてのデータは、Ｓｉからバックグラウンド信号を引くことによって修正されたベースラインである。
【００７２】
＜実施例３．金−銀コア−シェルナノ粒子のＡＦＭ（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）分析＞
図３（Ａ）は、代表的なコア−シェルモノマーおよびヘテロ二量体ナノ構造（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）の拡大されたＡＭＦ（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）イメージ（１μｍ×１μｍ）を示す。形状および直径は、ＨＲ−ＴＥＭ分析結果と一致した。図３（Ｂ）は、ＳＥＲＳスペクトルが、図３（Ａ）で指示された単一粒子に対するＡＦＭイメージによって校正されたことを示す。コア−シェルモノマー構造にはホットスポットがなく、また、たった１つのＣｙ３分子のみが存在するため、銀シェルの厚さが５ｎｍ（図３（Ａ）−１）または１０ｎｍ（図３（Ａ）−２）の金−銀コア−シェルモノマーはＳＥＲＳ信号が検出されなかった。銀シェルがない金二量体または１ｎｍ以下の間隔距離を有する金二量体もＳＥＲＳ信号が検出されなかった。これは、５１４．５ｎｍのレーザ励起条件下の電磁的増大が不足するからである。シェルの厚さが薄い（３ｎｍ未満）図３（Ａ）−４の場合、同様に入射レーザパワー（〜２００μＭ）を高めた場合にも信号が検出されなかった。この結果は、非常に薄い銀レイヤー（ｌａｙｅｒ）は、十分な電磁的増大を生産することができないことを示す。一方、シェルの厚さが〜５ｎｍの図３（Ａ）−５の場合には、１つのＣｙ３がナノ粒子間の接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に位置する単一金−銀コア−シェル二量体から検出した相対的に高いＳＥＲＳ信号が現れた。低い強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）にもかかわらず、５１４．５ｎｍのレーザ励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）での指紋スペクトル（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｓｐｅｃｔｒａ）である１４７０および１５８０ｃｍ−１においてＣｙ３の特徴的なピークが現れた。低い強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、単一分子ＳＥＲＳ研究（ｓｃｉｅｎｃｅ１９９７．２７５（５２０３）、１１０２、Ｐｈｙｓ ｒｅｖ ｌｅｔｔ１９９７、７８（９）、１６６７、Ｎａｎｏ ｌｅｔｔ２００６、６（１）２１７３、Ｎａｎｏ ｌｅｔｔ ＤＯＩ：１０．１０２１／ｎｉ８０３６２１ｘ）で用いたパワー強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に比べた時、比較的低いレーザパワー（１００μＷ）およびホットスポット部位内でたった１つの分子に影響を与える。また、金ナノ粒子上で改質されたオリゴヌクレオチドのような他種からのシグナルを測定した。図３（Ｃ）は、凝集された銀コロイドにおいて、Ｃｙ３改質されたオリゴヌクレオチド（５−ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡ−Ｃｙ３−３’、１ｎＭ、赤い線）のＳＥＲＳスペクトルを、Ｃｙ３−フリーオリゴヌクレオチド（５−ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ａ１０−ＰＥＧ１８−ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡ−３’、１ｎＭ、黒い線）のＳＥＲＳスペクトルと比較した結果を示す。図３（Ｃ）（黒い線）のＳＥＲＳスペクトルは、アデニン塩基（Ａ１０がスペーサー配列として用いられた）がリッチであることにより、アデニンモード（７３４ｃｍ−１、１３２０ｃｍ−１）が優位にあることと、他の塩基よりも増大していることを示す（ＪＡＣＳ、２００８、１３０（１６）、５５２３）。また、他のＤＮＡ塩基に対してこれまで報告された最も低い検出限界がマイクロモル以下（ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）の範囲であることも重要である（ＪＡＣＳ、２００６、１２８、１５５８０）。しかし、図３（Ｃ）のＳＥＲＳスペクトル（赤い線）は、Ｃｙ３分子で発生した信号である１４７０ｃｍ−１、１５８０ｃｍ−１における相対的に高い信号を示す（Ａｎａｎｌ ｃｈｅｍ．２００４、７６、４１２−４１７）。しかし、ラマン強度および時間によるスペクトル位置変動（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｌｕｃｔｕａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ）、およびスペクトルが各二量体ごとに異なって観察される（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００２、１０６、８０９６）。したがって、スペクトルパターンは、既存に報告されたのと完全には符合しない。銀シェルの厚さに関係なく、実験条件下で金−銀コア−シェルモノマーでの検出可能なＳＥＲＳ信号の不在は、二量体構造の接合部に位置するＣｙ構造のみが１４７０および１５８０ｃｍ−１においてＳＥＲＳピークを誘導することを確認させる。シェルの厚さが〜１０ｎｍにおけるコア−シェル二量体のラマンスペクトル（図３（Ａ）−６）は、１４８０ｃｍ−１における他のＣｙ−３関連ピークとともに、７３４ｃｍ−１、１３２０ｃｍ−１におけるアデニンモードが優位にあることを示す。他のナノ粒子に対するラマン散乱強度は、実験ごとに一定の形式（ｆｏｒｍ）を維持しない。厚い銀シェルは、適切でない電磁的増強をもたらすＣｙ３分子をカバーすることができる。
【００７３】
＜実施例４．金−銀コア−シェル二量体ナノ粒子の入射レーザの偏光によるＳＥＲＳスペクトル分析＞
シェルの厚さが〜５ｎｍである大部分のコア−シェル二量体ナノ粒子（ラマン活性分子としてＣｙ３を使用）は、図４（Ａ）、（Ｂ）に示すように、単一粒子から検出可能なＳＥＲＳを示した。入射レーザ光（ｉｎｃｉｄｅｎｔ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ）が二量体の粒子間軸に正確に偏光されないことを考慮すれば（図４（Ａ）−１、２、３、４、５）、垂直的に偏光化された各二量体ナノ粒子は、検出可能なＳＥＲＳ信号を示す。しかし、図５（Ｃ）は、１４７０ｃｍ−１において小さいピークのみを示すが、これは、二量体の発生（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が入射管に略垂直であるからである。したがって、シェルの厚さが最適化されたこれらのコア−シェル二量体ナノ構造が単一ＤＮＡの検出に高度に適用可能なホットスポット構造であり得ることを発見した。
【００７４】
単一分子の検出においてオン−オフブリンキング（ｂｌｉｎｋｉｎｇ）が発見されることは実験的によく知られている（図５（Ａ））（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００２、１０６、８０９６）。ラマン強度がない時、１０秒の時間が生じ、次いで、ラマン強度が戻ると、周期的なｏｎ”時間が生じる。このオン−オフサイクリング現象は、信号が存在する超強力場（ｉｎｔｅｎｓｅ ｆｉｅｌｄ）からついには永遠に消えるまで数分間継続することができる。また、ホットスポットの内外で分子の運動による秒単位のＳＥＲＳ強度変化（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）を観察することができる。これらのブリンキングおよび変動（ｂｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）現象は前の文献とよく合致する。
【００７５】
図５（Ｃ）および図５（Ｄ）は、金−銀コア−シェル二量体に対するＳＥＲＳ信号の入射レーザの偏光化された依存を示す。すべてのスペクトルは、５１４．５ｎｍの励起レーザ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｌａｓｅｒ）、２０ｓ蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）、サンプル４０μＷで検出される。入射されたレーザ光が二量体の縦軸（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｘｉｓ）に平行に偏光化された時、Ｃｙ３ピークが最大化された。レーザが縦軸から２０および４０度回転した時、Ｃｙ３信号は次第に減少した。最後に、光が縦軸に垂直に偏光した時、Ｃｙ３ピークは消えた（例えば、９０および２７０度）。１５８０ｃｍ−１において、次の公式により二量体構造でホットスポットの増強因子（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ：ＥＦ）を測定した。
【００７６】
ＥＦ＝（Ｉｓｅｒｓ×Ｎｂｕｌｋ）／（Ｉｂｕｌｋ×Ｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）
【００７７】
ＩｓｅｒｓとＩｂｕｌｋは、ＳＥＲＳおよびｂｕｌｋスペクトルに対する同一バンドの強度を示し、Ｎｂｕｌｋは、ｂｕｌｋサンプルに対するｂｕｌｋ分子標識の数を示し、Ｎｍｏｌｅｃｕｌｅは、ＳＥＲＳスペクトルにおいてＣｙ３分子標識の数を示す（Ｎｍｏｌｅｃｕｌｅ＝１）。１５８０ｃｍ−１のバンド領域で最も強いスペクトルとバンドが現れたため、このバンドをＩｓｅｒｓとＩｂｕｌｋ強度として用いた。このような接近により、ホットスポットのＥＦは２．７×１０１２で計算された。
【００７８】
一方、ＦＡＭとＤａｂｃｙｌラベリングされたオリゴヌクレオチドで改質されたナノ粒子二量体からＳＥＲＳスペクトルを測定した場合にも、Ｃｙ３の場合と同様に、高感度のラマンスペクトルを得ることができ、本発明にかかるナノ粒子二量体の構造および製造方法は、一般的なラマン活性分子に対して効果があることを確認することができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にオリゴヌクレオチドが結合された金または銀コア（ｃｏｒｅ）と、前記コアを取り囲む金または銀シェル（ｓｈｅｌｌ）とからなるコア−シェルナノ粒子２つの接合部にラマン活性分子が位置し、前記２つのナノ粒子がオリゴヌクレオチドを介して連結された構造を有することを特徴とするナノ粒子二量体。
【請求項２】
前記それぞれのナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの一方の末端がコアの表面に結合され、前記オリゴヌクレオチドの一部は、シェルの外部に露出していることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項３】
前記それぞれのナノ粒子の表面に結合されたオリゴヌクレオチドは、保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２に記載のナノ粒子二量体。
【請求項４】
前記２つのナノ粒子の表面に結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、ターゲットオリゴヌクレオチドと混成化をなしていることを特徴とする請求項３に記載のナノ粒子二量体。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、チオール基、アミン基およびアルコール基からなる群より選択されるいずれか１つの表面結合官能基で金ナノ粒子、銀ナノ粒子の表面に結合されていることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、前記表面結合官能基とオリゴヌクレオチドとの間にスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項５に記載のナノ粒子二量体。
【請求項７】
前記ナノ粒子二量体は、
ｉ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｉｉ）銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｉｉｉ）金コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｉｖ）銀コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｖ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子と、銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子とが連結されたナノ粒子二量体とからなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項８】
前記コアの直径は、５〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項９】
前記コアの直径は、１０〜４０ｎｍであることを特徴とする請求項８に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１０】
前記シェルの厚さは、１〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１１】
前記シェルの厚さは、１〜２０ｎｍであることを特徴とする請求項１０に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１２】
前記ラマン活性分子は、ＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−１，３−ジアゾール）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアント（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ）クレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ、フルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、炭素ナノチューブ、炭素同素体、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リン、硫黄およびシアニン染料（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１３】
前記ラマン活性分子は、有機蛍光分子であることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１４】
請求項１に記載のナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子が機能化されていることを特徴とするナノ粒子二量体。
【請求項１５】
前記検出しようとする分析物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、グリコプロテイン、リポプロテイン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝産物、補助因子、抑制剤、薬物、薬学物、営養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学無機剤、生体有害性製剤、放射線同位元素、ビタミン、ヘテロ環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発要因、痲酔剤、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物または汚染物であることを特徴とする請求項１４に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１６】
前記バイオ分子は、抗体、抗体断片、受容体蛋白質、結合蛋白質、酵素、抑制剤蛋白質、細胞癒着蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸またはアプタマーであることを特徴とする請求項１４に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１７】
前記ナノ粒子二量体は、無機物で全体がコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１８】
前記無機物は、シリカであることを特徴とする請求項１７に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１９】
１）表面が保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＡと、表面が保護オリゴヌクレオチドおよびラマン活性分子が末端に結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＢとをそれぞれ製造するステップと、
２）前記製造されたコアＡおよびコアＢにターゲットオリゴヌクレオチドを処理して混成化させることにより、二量体を形成するステップと、
３）前記コアＡおよびコアＢの表面にそれぞれシェルを導入するステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体の製造方法。
【請求項２０】
前記ステップ１）でコアＡとコアＢとをそれぞれ製造した後、コアＡとコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する磁性マイクロ粒子と混成化反応を進行し、コアＡとコアＢからターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが結合されたナノ粒子のみを分離する過程をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載のナノ二量体の製造方法。
【請求項２１】
前記シェルの導入は、コアからなる二量体とシェル前駆体を、還元剤および安定化剤の存在下で反応させることによって行われることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
１）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子二量体を製造するステップと、
２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子を機能化するステップと、
３）前記ナノ粒子二量体を、１つ以上の分析物を含むサンプルに露出させるステップと、
４）レーザ励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）およびラマン分光法を用いて１つ以上の分析物を検出および確認するステップとを含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項２３】
１）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子二量体を製造するステップと、
２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする核酸に相補的なバイオ分子を機能化するステップと、
３）試料から核酸を抽出、精製、および増幅させるステップと、
４）前記増幅された核酸の特定配列にコア−シェルナノ粒子二量体を反応させて混成化を行うステップと、
５）前記ナノ粒子二量体が結合された核酸にラマン分光を行うステップとを含むことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２４】
前記核酸の検出方法は、疾病の診断のための核酸の検出方法であることを特徴とする請求項２３に記載の核酸の検出方法。
【請求項２５】
前記核酸の検出方法は、単一塩基多型性（ＳＮＰ）の検出方法であることを特徴とする請求項２３に記載の核酸の検出方法。
【請求項２６】
前記ラマン分光法が、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）ハイパーラマンおよび／または非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）であることを特徴とする請求項２２に記載の分析物の検出方法。
【請求項２７】
前記核酸は、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、カビＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、改質されたオリゴヌクレオチド、単鎖および二本鎖核酸、自然的および合成核酸であることを特徴とする請求項２２に記載の分析物の検出方法。
【請求項２８】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子二量体を含むことを特徴とする分析物検出用キット。
【請求項１】
表面にオリゴヌクレオチドが結合された金または銀コア（ｃｏｒｅ）と、前記コアを取り囲む金または銀シェル（ｓｈｅｌｌ）とからなるコア−シェルナノ粒子２つの接合部にラマン活性分子が位置し、前記２つのナノ粒子がオリゴヌクレオチドを介して連結された構造を有することを特徴とするナノ粒子二量体。
【請求項２】
前記それぞれのナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの一方の末端がコアの表面に結合され、前記オリゴヌクレオチドの一部は、シェルの外部に露出していることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項３】
前記それぞれのナノ粒子の表面に結合されたオリゴヌクレオチドは、保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２に記載のナノ粒子二量体。
【請求項４】
前記２つのナノ粒子の表面に結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、ターゲットオリゴヌクレオチドと混成化をなしていることを特徴とする請求項３に記載のナノ粒子二量体。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、チオール基、アミン基およびアルコール基からなる群より選択されるいずれか１つの表面結合官能基で金ナノ粒子、銀ナノ粒子の表面に結合されていることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、前記表面結合官能基とオリゴヌクレオチドとの間にスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項５に記載のナノ粒子二量体。
【請求項７】
前記ナノ粒子二量体は、
ｉ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｉｉ）銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｉｉｉ）金コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｉｖ）銀コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子２つが連結されたナノ粒子二量体と、
ｖ）金コアおよび銀シェルからなるコア−シェルナノ粒子と、銀コアおよび金シェルからなるコア−シェルナノ粒子とが連結されたナノ粒子二量体とからなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項８】
前記コアの直径は、５〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項９】
前記コアの直径は、１０〜４０ｎｍであることを特徴とする請求項８に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１０】
前記シェルの厚さは、１〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１１】
前記シェルの厚さは、１〜２０ｎｍであることを特徴とする請求項１０に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１２】
前記ラマン活性分子は、ＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−１，３−ジアゾール）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアント（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ）クレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ、フルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、炭素ナノチューブ、炭素同素体、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リン、硫黄およびシアニン染料（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１３】
前記ラマン活性分子は、有機蛍光分子であることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１４】
請求項１に記載のナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子が機能化されていることを特徴とするナノ粒子二量体。
【請求項１５】
前記検出しようとする分析物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、グリコプロテイン、リポプロテイン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝産物、補助因子、抑制剤、薬物、薬学物、営養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学無機剤、生体有害性製剤、放射線同位元素、ビタミン、ヘテロ環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発要因、痲酔剤、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物または汚染物であることを特徴とする請求項１４に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１６】
前記バイオ分子は、抗体、抗体断片、受容体蛋白質、結合蛋白質、酵素、抑制剤蛋白質、細胞癒着蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸またはアプタマーであることを特徴とする請求項１４に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１７】
前記ナノ粒子二量体は、無機物で全体がコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１８】
前記無機物は、シリカであることを特徴とする請求項１７に記載のナノ粒子二量体。
【請求項１９】
１）表面が保護オリゴヌクレオチドおよびターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＡと、表面が保護オリゴヌクレオチドおよびラマン活性分子が末端に結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドで結合されたコアＢとをそれぞれ製造するステップと、
２）前記製造されたコアＡおよびコアＢにターゲットオリゴヌクレオチドを処理して混成化させることにより、二量体を形成するステップと、
３）前記コアＡおよびコアＢの表面にそれぞれシェルを導入するステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子二量体の製造方法。
【請求項２０】
前記ステップ１）でコアＡとコアＢとをそれぞれ製造した後、コアＡとコアＢのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する磁性マイクロ粒子と混成化反応を進行し、コアＡとコアＢからターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが結合されたナノ粒子のみを分離する過程をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載のナノ二量体の製造方法。
【請求項２１】
前記シェルの導入は、コアからなる二量体とシェル前駆体を、還元剤および安定化剤の存在下で反応させることによって行われることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
１）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子二量体を製造するステップと、
２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする分析物を認識できるバイオ分子を機能化するステップと、
３）前記ナノ粒子二量体を、１つ以上の分析物を含むサンプルに露出させるステップと、
４）レーザ励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）およびラマン分光法を用いて１つ以上の分析物を検出および確認するステップとを含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項２３】
１）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子二量体を製造するステップと、
２）前記ナノ粒子二量体の表面またはコアの表面に、検出しようとする核酸に相補的なバイオ分子を機能化するステップと、
３）試料から核酸を抽出、精製、および増幅させるステップと、
４）前記増幅された核酸の特定配列にコア−シェルナノ粒子二量体を反応させて混成化を行うステップと、
５）前記ナノ粒子二量体が結合された核酸にラマン分光を行うステップとを含むことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２４】
前記核酸の検出方法は、疾病の診断のための核酸の検出方法であることを特徴とする請求項２３に記載の核酸の検出方法。
【請求項２５】
前記核酸の検出方法は、単一塩基多型性（ＳＮＰ）の検出方法であることを特徴とする請求項２３に記載の核酸の検出方法。
【請求項２６】
前記ラマン分光法が、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）ハイパーラマンおよび／または非干渉性反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）であることを特徴とする請求項２２に記載の分析物の検出方法。
【請求項２７】
前記核酸は、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、カビＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、改質されたオリゴヌクレオチド、単鎖および二本鎖核酸、自然的および合成核酸であることを特徴とする請求項２２に記載の分析物の検出方法。
【請求項２８】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子二量体を含むことを特徴とする分析物検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５１３７９６（Ｐ２０１３−５１３７９６Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４３０２７（Ｐ２０１２−５４３０２７）
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００８８６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７１３４３
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．イーサネット
【出願人】（３０８０１１２４７）コリア リサーチ インスティチュートオブ ケミカルテクノロジー (2)
【出願人】（５０８３６９９０６）エスエヌユー アール アンド ディービー ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００８８６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７１３４３
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．イーサネット
【出願人】（３０８０１１２４７）コリア リサーチ インスティチュートオブ ケミカルテクノロジー (2)
【出願人】（５０８３６９９０６）エスエヌユー アール アンド ディービー ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
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