代謝障害の診断及び治療に使用するためのＦＡＴＰ５を含む方法及び組成物
本発明は、脂肪酸輸送体５（ＦＡＴＰ５）活性を阻害する物質、例えば治療用物質の同定方法、及び、ＦＡＴＰ５機能に関連する疾患または状態、例えば、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患の治療方法を提供する。本発明はまた、野生型ＦＡＴＰ５遺伝子をそのゲノムに含む完全無欠動物のＦＡＴＰ５機能を解明するために有用なヒト以外のトランスジェニックＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物、例えば、マウスを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
肥満は最も普遍的な体重障害であり、西欧世界の中年人口の３０−５０％が罹っていると推定されている。肥満は、３０ｋｇ／ｍ２以上のボディ・マス指数（ＢＭＩ）として定義されており、冠状動脈疾患、高血圧、卒中、糖尿病、高脂血症及びある種の癌のような疾病の一因となる。（例えば、Ｎｉｓｈｉｎａ，Ｐ．Ｍ．ら（１９９４），Ｍｅｔａｂ．４３：５５４−５５８；Ｇｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．＆ Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｊ．Ｐ．（１９９０），Ｄｉｓ．Ｍｏｎ．３６：６４１-７３１参照）。肥満は、複雑な多因性慢性疾患であり、遺伝子型と環境との相互作用によって発症し、また、社会的、行動的、文化的、生理的、代謝的及び遺伝的な様々の要因が関与する。
【０００２】
インスリン非依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）即ち２型糖尿病は全世界で最も多い代謝障害である。米国では毎日１７００名の新しい糖尿病患者が診断され、千六百万人の米国人糖尿病患者の少なくとも三分の一は病気に気付いていない。糖尿病は、成人を失明、腎不全及び下肢切断に至らせる有力な原因であり、また、心血管疾患及び卒中の最大の危険要因である。２型糖尿病は、インスリン抵抗性と、絶対的でなく相対的なインスリン不足とが共存することを特徴とする糖尿病の形態である。インスリン抵抗性は、有効な生物活性を発揮するインスリンの能力がある濃度範囲で低下を示すことであると定義される。２型糖尿病に罹患した個体間では２つの欠陥の各々の程度にかなりの違いがあり、主としてインスリン抵抗性を示すがインスリン不足は最小である個体から、主としてインスリン不足を示すがインスリン抵抗性は最小である個体まで症状は多岐にわたる。
【０００３】
正常なグルコースホメオスタシスを維持するためには、血中グルコースレベルの僅かな変化に応じた膵臓ベータ細胞によるインスリンの分泌がグルカゴンのようなカウンター調節ホルモンの分泌と微妙なバランスを保つように精巧に調和した調節が行われる必要がある。インスリンの基本的な作用の１つは、血液から組織特に筋肉及び脂肪へのグルコースの取込みを刺激することである。糖尿病患者の９０％以上が２型即ちインスリン非依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）であり、その特徴は、（１）末梢組織、特に骨格筋及び脂肪細胞へのグルコース取込みを促すインスリン作用に対する抵抗性、（２）肝のグルコース産生を阻害するインスリン作用の低下、及び、（３）インスリン分泌の調節不全、という３つの徴候を示すことである（ＤｅＦｒｏｎｚｏ，（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｖ．５：１７７−２６９）。大抵の患者の２型糖尿病は複雑な遺伝パターンをもつ多遺伝子性疾患である（Ｋａｈｎら、（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：５０９−５３１に概説）。
【０００４】
環境要因、特に、食事、身体活動及び年齢が遺伝的疾病素質と相互作用して罹病率を左右する。複数の研究は、インスリン抵抗性、肥満及び遊離脂肪酸の高い血漿レベルの並存が２型糖尿病を発症する“危険のある”個体及びこの疾患の臨床症状のある個体の双方に共通であることを示す（Ｂｏｄｅｎ，Ｇ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，１１１：２４１−２４８）。インスリン抵抗性及びインスリン分泌欠陥の双方に対する罹患率は遺伝的に決定されていると考えられる（Ｋａｈｎ，ら）。インスリン作用の欠陥は明白な疾患の前兆であり、糖尿病患者の非糖尿病近親者に観察される。従って、２型糖尿病の発症及び病理にこれらの要因が果たす役割を理解することは極めて有用であろう。熱心な究明調査にもかかわらず２型糖尿病の普遍的形態の原因となる遺伝子はいまだ未知である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は少なくとも部分的に、ＦＡＴＰ５欠損トランスジェニック動物が食事誘発肥満及びインスリン抵抗性を防御できるという知見に基づく。しかも、ＦＡＴＰ５欠損動物は絶好の血漿脂質プロフィルを示す。従って本発明は、ＦＡＴＰ５関連障害、例えば代謝障害（例えば、肥満、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、異常脂血症）、心血管障害（例えば、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中）、及び、脂肪肝疾患を変調できる化合物の同定方法を提供する。提供された方法は、ＦＡＴＰ５核酸発現、または、酵素活性や脂肪酸もしくは胆汁酸取込み活性などのＦＡＴＰ５ポリペプチド活性を変調する化合物の能力を検定する段階を含む。更に、ＦＡＴＰ５ポリペプチド活性を変調し、これによってＦＡＴＰ５介在性細胞プロセス及び障害に作用する方法が提供される。
【０００６】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【０００７】
別の実施態様は、上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。
いくつかの実施態様では、モニターしたＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、異常脂血症、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、及び／または、血漿脂質組成の１つまたは複数から選択される。
【０００８】
本発明で提供された方法全体を通じて、いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５活性をアシル−ＣｏＡリガーゼ活性として定義する。別の実施態様ではＦＡＴＰ５活性が胆汁アシル−ＣｏＡリガーゼ活性である。方法は、ホスフェート、アシルＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を測定することによってアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を定量できる実施態様を含む。追加の実施態様は、補酵素Ａ、ＡＴＰまたは脂肪酸／胆汁酸の消費量を測定することによってアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を定量できるという側面を含む。
【０００９】
別の実施態様では、本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ここでは、化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、異常脂血症、血漿脂質組成及び／または胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、の１つまたは複数から選択される。
【００１０】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸／胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡリガーゼもしくは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性、のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００１１】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪酸または胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪酸または胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用し得る候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。
【００１２】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの活性（例えば、アシル−ＣｏＡリガーゼ、胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性）を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００１３】
別の実施態様は、上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５活性（例えば、アシルＣｏＡリガーゼ活性、胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性）を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性体重プロセスを変調したか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、モニターしたＦＡＴＰ５介在性体重プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、異常脂血症、血漿脂質組成、及び／または、胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、の１つまたは複数から選択される。
【００１４】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するとして同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性体重プロセスを変調するか否かを判定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物がＦＡＴＰ５介在性体重プロセスを変調したときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性体重プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、及び／または、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、の１つまたは複数から選択される。
【００１５】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性体重障害は例えば肥満を含む。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸／胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性、のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００１６】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性体重障害は例えば肥満である。
【００１７】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性インスリン抵抗性障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。この方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性インスリン抵抗性障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性インスリン抵抗性障害は例えば２型糖尿病を含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００１８】
別の実施態様は、上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がインスリン抵抗性を変調するか否かを判定する段階と、次いで、インスリン抵抗性を変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、インスリン抵抗性が、全身もしくは組織のグルコース取込み、肝グルコース産出、血中グルコースレベル、または、血中インスリンレベルを検出することによってモニターできる。
【００１９】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がインスリン抵抗性障害を変調するか否かを判定する段階とを含む、インスリン抵抗性を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物がインスリン抵抗性を変調したときに被験化合物をインスリン抵抗性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用したインスリン抵抗性障害はインスリン抵抗性及び２型糖尿病を含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、インスリン抵抗性が、全身もしくは組織のグルコース取込み、肝グルコース産出、血中グルコースレベル、または、血中インスリンレベル、のいずれか１つまたは複数を検出することによって測定できる。
【００２０】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をインスリン抵抗性障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、インスリン抵抗性障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。インスリン抵抗性障害は例えば２型糖尿病を含む。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００２１】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をインスリン抵抗性障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、インスリン抵抗性障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。インスリン抵抗性障害は例えば２型糖尿病を含む。
【００２２】
１つの実施態様では本発明は、化合物が異常脂血症を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのリガーゼ活性（例えば、アシル−ＣｏＡリガーゼ、胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性）が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのリガーゼ活性（例えば、アシル−ＣｏＡリガーゼ、胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性）とは異なっているときに被験化合物を異常脂血症の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用した異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベルを含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００２３】
別の実施態様は上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡリガーゼ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物が異常脂血症を変調するか否かを判定する段階と、次いで、異常脂血症を変調する被験化合物を異常脂血症を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、異常脂血症が、遊離脂肪酸レベル、血清トリグリセリドレベル、及び／または、血漿脂質組成を定量することによってモニターできる。
【００２４】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物が異常脂血症を変調するか否かを判定する段階とを含む、異常脂血症を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物が異常脂血症を変調するときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用した異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、血漿脂質組成の変質を含み得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、異常脂血症が、脂肪酸／胆汁酸取込み、遊離脂肪酸、血清トリグリセリド、及び／または、血漿脂質組成、の１つまたは複数を測定することによって判定できる。
【００２５】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドとは異なっているときに被験化合物を異常脂血症の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、異常脂血症に有効な候補化合物の同定方法を提供する。異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル、及び、血漿脂質組成の変質を含み得る。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００２６】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物を異常脂血症の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、異常脂血症を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル、及び、血清脂質組成の変質を含む。
【００２７】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００２８】
別の実施態様は上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。
いくつかの実施態様では、モニターしたＦＡＴＰ５介在性プロセスが、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、異常脂血症、血漿脂質組成、及び／または、胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、の１つまたは複数から選択される。
【００２９】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、脂肪酸取込み、胆汁酸取込み、異常脂血症、及び／または、血漿脂質組成、の１つまたは複数から選択される。
【００３０】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性、のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００３１】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患のいずれかであり得る。
【００３２】
本文中に記載した知見は、ＦＡＴＰ５活性の阻害が２型真性糖尿病の特徴であるインスリン抵抗性の軽減に導くこと、従ってＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸の取込みを阻害する物質はインスリン抵抗性を軽減するために有用であることを証明する。さらにまた、ＦＡＴＰ５欠損動物は絶好の血漿脂質プロフィルを示し、これは、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸の取込みを阻害する物質が血漿脂質プロフィルの改善に役立つことを示唆する。従って本発明は、ＦＡＴＰ５関連障害、例えば、代謝障害（例えば、肥満、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、異常脂血症）、心血管障害（例えば、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中）、及び、脂肪肝疾患を変調できる化合物の使用方法を提供する。
【００３３】
１つの実施態様で本発明は、有効量のＦＡＴＰ５活性阻害物質を個体に投与する段階を含む、個体のＦＡＴＰ５介在性代謝障害の治療方法を提供する。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、脂肪肝疾患、及び、心血管疾患（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）である。
【００３４】
また別の実施態様で本発明は、ＦＡＴＰ５遺伝子が不活化されたヒト以外の遺伝子操作哺乳動物を提供する。
１つの実施態様では、遺伝子操作されたトランスジェニック動物がマウスまたはラットである。
本発明の追加の特徴及び利点は以下の記載、実施例及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３５】
本発明は少なくとも部分的に、ＦＡＴＰ５欠損トランスジェニック動物が食事誘発肥満及びインスリン抵抗性を防御できるという知見に基づく。しかも、ＦＡＴＰ５欠損動物は、絶好の血漿脂質プロフィルを示す。従って本発明は、ＦＡＴＰ５関連障害、例えば代謝障害（例えば、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症）、心血管障害（例えば、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中）、及び、脂肪肝疾患（例えば、脂肪症）を変調できる化合物の同定方法を提供する。提供された方法は、ＦＡＴＰ５核酸発現、または、酵素活性や脂肪酸／胆汁酸取込み活性などのＦＡＴＰ５ポリペプチド活性を変調する化合物の能力を検定する段階を含む。更に、本発明を使用して同定された化合物を利用し、これによってＦＡＴＰ５介在性細胞プロセスまたは障害を変調する方法が提供される。
【００３６】
多数のＦＡＴＰ５遺伝子の構造及びコーディング配列が報告されている。例えば、Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＪＥら、Ｃｅｌｌ．７９：４２７−４３６（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４７：２５５−２６０（１９９８）；Ｈｉｒｓｃｈ，Ｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９５：８６２５−８６２９（１９９８）；及び、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０２１７９５及びＷＯ９９／０３６５３７参照。マウス及びヒトの配列はそれぞれ受託番号ＮＭ ０１２２５４及びＮＭ ００９５１２でＧｅｎｅＢａｎｋに報告されている。また、遺伝子及びタンパク質の配列はそれぞれ配列１及び配列２と配列３及び配列４で記述されている。
【００３７】
ＦＡＴＰ５は、脂肪酸輸送体及びアシルＣｏＡシンテターゼとして同定されたタンパク質ファミリーの１つである。例えば、Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＪＥら、Ｃｅｌｌ．７９：４２７−４３６（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４７：２５５−２６０（１９９８）；Ｈｉｒｓｃｈ，ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９５：８６２５−８６２９（１９９８）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０２１７９５及びＷＯ９９／０３６５３７；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．５８：３２−４２（１９９９）参照。ノーザン分析による検出で、ＦＡＴＰ５が肝組織で特異的に発現され、肝細胞に特異的に局在することが知見された。ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０２１７９５参照。さらにまた、ＦＡＴＰ５が胆汁酸ＣｏＡリガーゼであり、胆汁酸の再循環に関与することが知見された。例えば、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：１５６０５−１５６０８（２０００）及びＭｉｈａｌｉｋら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２８７６５−２８７７３（２００２）参照。マウスの遺伝子及びタンパク質の配列はそれぞれ配列１及び配列２で記述されており、ヒトの遺伝子及びタンパク質の配列はそれぞれ配列３及び配列４で記述されている。本発明における我々の知見は意外にも、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病のような代謝障害、及び、異常な血清脂質プロフィルを含む心血管障害に関与する介在プロセスに肝特異的ＦＡＴＰ５脂肪酸／胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性が関与していることを証明する。
【００３８】
本文中で使用した“遺伝子”という用語は、単一タンパク質（例えば、ポリペプチド鎖）の合成に必要な遺伝情報（例えば核酸配列）をコードしているＤＮＡ配列を意味する。アミノ酸配列を直接的にコードする配列である“コーディング配列”に加えて、遺伝子はまた、必須の非コーデイングエレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、及び、必須でないフランキング配列とイントロン配列を含む。“ＦＡＴＰ５遺伝子”という用語は、ＦＡＴＰ５タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含む特定の哺乳動物遺伝子を意味する。本発明で提供された方法はこれまでに記述されている既知のＦＡＴＰ５配列を利用している。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ ０１２２５４及びＮＭ ００９５１２参照。当業者に理解されるように、遺伝子配列は１つの集団の個体間で異なる“部位”（配列位置）を含むことができる。従って、遺伝子の配列変異が許容される。各変異配列は、遺伝子の“対立遺伝子”と呼ばれる。典型的には、特定配列、通常は機能的タンパク質をコードしている配列を基準配列、または、“野生型”配列とする。“野生型”という用語は、基準対立遺伝子、典型的には機能的タンパク質をコードしている対立遺伝子または健康な個体に存在する対立遺伝子を含意する記述語である。野生型配列とは異なる対立遺伝子を“対立変異体”と呼ぶ。相同染色体は、減数分裂中に対を形成し実質的に同一の遺伝子座を含有する染色体である。“遺伝子座”という用語は、染色体上の遺伝子の部位（例えば、ロケーション）を含意する。
【００３９】
トランスジェニックＦＡＴＰ５動物
本発明は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ヒト以外の霊長類、マウスまたはラットのような齧歯類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、ウサギまたはヤギの“ノックアウト”またはトランスジェニック動物を提供する。本文中に使用した“ノックアウト”という用語は、特定の遺伝子が破壊されるかまたは欠失しその結果として該遺伝子の発現が全く生じないかまたは低下レベルで生じるようなゲノムを有している遺伝的に修飾された生物を意味する。特定実施態様では、ヒト以外の哺乳類のノックアウト動物が齧歯類、例えばマウスまたはラットである。例えば、ＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物では、内在ＦＡＴＰ５遺伝子が破壊されており、その結果として該哺乳動物の機能的ＦＡＴＰ５タンパク質は欠如しているかまたはそのレベルが低下している。特定実施態様では、ヒト以外のノックアウト哺乳動物が、機能的ＦＡＴＰ５遺伝子産物の欠如またはＦＡＴＰ５４遺伝子産物のレベル低下を示すマウスである。本文中ではトランスジェニックマウスを“トランスジェニックＦＡＴＰ５ノックアウトマウス”または“ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス”と呼ぶ。特定実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのゲノムが、内在ＦＡＴＰ５遺伝子に対して少なくとも１つの非機能的対立遺伝子を含む。従って本発明は、ときには“野生型”と呼ばれる機能的標準ＦＡＴＰ５対立遺伝子をそのゲノムに含む完全無欠動物のＦＡＴＰ５の機能を解明するために役立つ細胞（例えば、組織、細胞、細胞抽出物、オルガネラ）及び動物のソースを提供する。本文中に記載のＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物を作製するために適当な哺乳動物のいずれかを使用できる。例えば適当な哺乳動物はヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、マウス（マウス類）、ラット、ウサギまたはブタでよい。
【００４０】
我々は、機能的ＦＡＴＰ５の欠如したマウス類の作製、このようなマウス類の使用方法、このようなマウス類に由来の細胞の使用方法、ＦＡＴＰ５活性が欠如または部分的に欠如している細胞の使用方法、及び、ＦＡＴＰ５活性を変調する物質をｉｎ ｖｉｔｒｏに同定または評価する方法を記載する。
【００４１】
本文中に使用した“破壊”、“機能不活化”、“変質”及び“欠陥”という用語は、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの一種類の細胞、選択された細胞または全部の細胞の内在遺伝子によってコードされているＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現及び／または機能の部分的または全面的低下を含意する。従って本発明によれば、選択された細胞グループ（例えば、組織または器官）または完全動物の体内でＦＡＴＰ５遺伝子産物の発現または機能を全面的または部分的に破壊または低減（例えば、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上低減）することができる。本文中で使用した“機能的に破壊されたＦＡＴＰ５遺伝子”という用語は、いかなるポリペプチド産物も発現できないかまたは野生型タンパク質の完全アミノ酸ポリペプチド鎖よりも短い切欠タンパク質を発現し、非機能的（部分的にまたは全面的に非機能的）である修飾ＦＡＴＰ５遺伝子を包含する。
【００４２】
ＦＡＴＰ５遺伝子の破壊は、当業者に公知の多様な方法によって行うことができる。ＦＡＴＰ５遺伝子を破壊するために例えば、相同的組換えを使用する遺伝子ターゲティング、突然変異誘発（例えば、点突然変異）、ＲＮＡ干渉及びアンチセンステクノロジイを使用できる。
【００４３】
より具体的には本発明は、そのＦＡＴＰ５遺伝子のホモ接合またはヘテロ接合の破壊をゲノムに含むノックアウト哺乳動物、例えば、マウスを提供する。ゲノムにホモ接合破壊を含むノックアウト哺乳動物の特徴は、その体細胞及び胚細胞がＦＡＴＰ５遺伝子の２つの非機能的（破壊された）対立遺伝子を含むことであり、ゲノムにヘテロ接合破壊を含むノックアウト哺乳動物の特徴は、その体細胞及び胚細胞がＦＡＴＰ５遺伝子の１つの野生型対立遺伝子と１つの非機能的対立遺伝子とを含むことである。
【００４４】
本文中で使用した“遺伝子型”という用語は、動物の遺伝子組成（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｋｅｕｐ）を意味する。個々の遺伝子型は、１つまたは複数の特定の遺伝子、例えばＦＡＴＰ５を表す。より詳細には、遺伝子型という用語は、動物のＦＡＴＰ５対立遺伝子の状態、即ち、対立遺伝子が完全無欠で機能的であること（例えば、野生型または＋／＋）、または、ヘテロ接合型（＋／−）もしくはホモ接合型（−／−）のノックアウト遺伝子型を与えるように破壊されていること（例えば、ノックアウト）を表す。
【００４５】
本発明はまた、機能的ＦＡＴＰ５遺伝子の欠如したヒト以外の哺乳動物の産生方法を提供する。簡単に説明すると、ノックアウト胚の標準的な産生方法では、ターゲットとした遺伝子の内在核酸配列との相同的組換えによって適当な胚性幹（ＥＳ）細胞に組込まれるように設計されたターゲティング構築物の導入が必要である。次に、ＥＳ細胞を相同的組換え（即ち、ターゲティング構築物の組換え核酸配列と宿主細胞染色体のゲノム核酸配列との組換え）が可能な条件下で培養する。組換え対立遺伝子を含むノックアウト遺伝子型を有していると同定された遺伝子操作幹細胞を当業界で公知の標準技術を使用して（例えば、遺伝子操作胚性幹（ＥＳ）細胞を未分化胎細胞にマイクロインジェクションする方法によって）胚形成期の動物またはその親に導入する。次に、得られたキメラ未分化胎細胞を偽妊娠仮母親の子宮に入れて生存可能な子を発生させる。得られた生存可能な子のうちには、その体細胞及び胚細胞系列組織に遺伝子操作ＥＳ細胞とレシピエントの未分化胎細胞とに由来の細胞混合物を含む潜在的にキメラ創始動物が含まれている。得られたキメラマウスの胚細胞系列に遺伝子変質ＥＳ細胞が与えられると、破壊されたターゲット遺伝子を含む変質ＥＳ細胞ゲノムがこれらの創始動物の後代に伝達され、これによって、ターゲット遺伝子中に特定の欠陥を含むように遺伝子操作された遺伝子をゲノムに含む“ノックアウト動物”が容易に産生される。
【００４６】
ＦＡＴＰ５遺伝子はいくつかの異なる方法で破壊されることができ、これらの方法のいずれかを本発明のＦＡＴＰ５ノックアウト動物の産生に使用できることは当業者に容易に理解されよう。例えば、遺伝子ターゲティングの方法によって本発明のノックアウトマウスを産生できる。本文中で使用した“遺伝子ターゲティング”という用語は、変質（例えば、破壊）のターゲットとしたゲノム遺伝子座の核酸配列の対応部分に配置されて組換えられることによって内在遺伝子に計画的変質を付与し得る外来組換え核酸配列を導入するように設計されたターゲティング構築物（例えば、ベクター）を哺乳類細胞（例えば、ＥＳ細胞）に導入した結果として生じる相同的組換えの一種を意味する。
【００４７】
すなわち、相同的組換えは、特定のＤＮＡ配列が遺伝子操作外来配列によって置換されるプロセス（例えば、方法）である。より詳細には、トランスジェニック破壊のターゲット遺伝子の内在ヌクレオチド配列に相同的または相補的になるように遺伝子操作されたターゲティングベクターの領域が互いに結集するかまたは組換えられ、その結果としてターゲティングベクターのヌクレオチド配列が内在遺伝子の対応部分に取込まれる（例えば組込まれる）。
【００４８】
本発明の１つの実施態様は、野生型（内在）ＦＡＴＰ５遺伝子の機能を破壊するように設計されたベクター構築物（例えば、ＦＡＴＰ５ターゲティングベクターまたはＦＡＴＰ５ターゲティング構築物）を提供する。一般的に言えば、有効なＦＡＴＰ５ターゲティングベクターは、内在ＦＡＴＰ５遺伝子との相同的組換えに有効な組換え配列を含む。例えば、選択可能マーカー遺伝子をコードしている第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたターゲット配列に相同のゲノムヌクレオチド配列を含む置換ターゲティングベクターは有効なターゲティングベクターの代表例である。相同的組換えの結果として宿主細胞（例えば、胚性幹細胞）の染色体ＤＮＡにターゲティング配列が組込まれると、内在遺伝子例えばＦＡＴＰ５遺伝子のターゲット配列に計画的な破壊、欠陥または変質（例えば、挿入、欠失または置換）が導入される。本発明の１つの特徴は、ＦＡＴＰ５ポリペプチドをコードしているヒト以外の哺乳動物の遺伝子のヌクレオチド配列の全部または一部を置換し、これによってトランスジェニックＦＡＴＰ５ノックアウトを作製することである。
【００４９】
ＦＡＴＰ５ターゲティングベクターを構築するためには、破壊対象として予め選択した特定部位で相同的組換えを促進するような適正な長さ及び組成をもつＦＡＴＰ５ゲノムヌクレオチド配列を使用すればよいことが当業者には理解されよう。配列の選択及び使用の指針は例えば、Ｄｅｎｇ，Ｃ．＆ Ｃａｐｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３３６５−３３７１、及び、Ｂｏｌｌａｇ，Ｒ．ら、１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１９９−２２５に記載されている。例えば、ＦＡＴＰ５遺伝子の遺伝子座の全部または一部に組換え核酸配列（例えば、ＦＡＴＰ５ターゲティング構築物またはベクター）を挿入することによって野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を突然変異させるか及び／または破壊することができる。ターゲティング構築物は例えば、ＦＡＴＰ５遺伝子のエンハンサー、プロモーター、コーディング領域、開始コドン、非コーディング配列、イントロンまたはエキソンの内部の特定部分と組換えられるように設計できる。あるいは、ターゲティング構築物が、ＦＡＴＰ５遺伝子のエキソンの後方に停止コドンを導入するように設計された組換え核酸を含むこともできる。
【００５０】
本発明の適当なターゲティング構築物は、当業者に公知の標準的分子生物学技術を使用して調製できる。例えば、適当なベクターの調製に有用な技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；によって記載されている。この文献の開示は参照によって本発明に含まれるものとする。適正なベクターは、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，１９８９，３０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２８８−９２によって記載された挿入ベクターのような置換ベクター、または、Ｂｒａｄｌｅｙ，ら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），１０：５３４−５３９；及びＡｓｋｅｗ，Ｇ．ら、１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：４１１５−４１２４によって記載されたプロモータートラップ戦略またはポリアデニル化トラップ、または、“タグ−アンド−エクスチェンジ”戦略に基づくベクターを含む。これらの文献の開示は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００５１】
当業界で公知の多数の適正ベクターを適当なターゲティングベクターの基材として使用できることが当業者には理解されよう。実際、相同的組換えを指示しかつターゲット遺伝子を破壊するために必要な組換え核酸配列を収容する能力を有しているいかなるベクターも使用できる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹ１６４、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ８、ｐＫＧ、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ１０１またはその他のプラスミドベクターを使用できる。あるいは、ラムダｇｔ１１ベクター系のようなウイルスベクターはターゲティング構築物の主鎖（例えば、カセット）を提供できる。
【００５２】
当業者に公知の技術によれば、遺伝子操作された（例えば、電気穿孔法によってトランスフェクトされたかまたは感染によって形質転換された）胚性幹細胞をヒト以外のトランスジェニックノックアウト胚を産生するための常套手段として使用できる。胚性幹（ＥＳ）細胞は哺乳類の未分化胎細胞の内部細胞塊から単離された多能性細胞である。ＥＳ細胞は、未分化状態で適正培養条件下にｉｎ ｖｉｔｒｏ培養でき、未分化胎細胞と組換えられて偽妊娠仮母親の子宮に導入された結果として正常なｉｎ ｖｉｖｏ発生及び分化を再開する能力を維持できる。
【００５３】
多様な幹細胞が当業界で公知であり、例えば、ＡＢ−１、ＨＭ−１、Ｄ３．ＣＣ１．２、Ｅ−１４Ｔ６２ａ、ＲＷ４またはＪＩなどがあることは当業者に容易に理解されよう（Ｔｅｒａｔｏｍａｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）。
【００５４】
本文中に記載のＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物が上述の胚性幹細胞方法以外の方法によって産生できること、例えば、１細胞または形質転換胚の前核に組換え遺伝子を前核注入することによって、または、トランスフェクトもしくは形質転換したＥＳ細胞の使用に依存しない別の遺伝子ターゲティング方法によって産生できること、また、上記に概説した１つの方法の例示はこのプロトコルによって産生した動物だけに本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００５５】
本発明に記載のＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物はまた、機能的ＦＡＴＰ５を天然にコードしておりかつ発現する内在遺伝子の少なくとも１つの非機能的対立遺伝子をゲノムに含む動物のコロニーを産生するために適正相手と交配（近親交配、異系交配または異種交配）することもできる。このような交配戦略の非限定例は、ホモ接合動物を産生するためのヘテロ接合ノックアウト動物の交雑；創始動物（例えば、ヘテロ接合またはホモ接合ノックアウト）と異常なインスリン及び／またはグルコースホメオスタシスを与える近交系遺伝背景を有しているマウスまたは糖尿病の動物モデルを提供するマウスとの異系交配、及び、創始動物と糖尿病及び／または肥満の高い罹患率に関連する遺伝子を超発現するように遺伝子操作した独立トランスジェニック動物との異種交配、などである。例えば、創始ノックアウトマウスを、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス及び／またはＡＹマウスと交配できる。
【００５６】
ＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物、例えばマウスは、多様な目的に役立つ。１つの実施態様では、当業界で公知の技能を使用してＦＡＴＰ５ノックアウト細胞または細胞系を作製できる。例えば、内在ＦＡＴＰ５遺伝子を所有していないかまたは常態ではＦＡＴＰ５を発現しない細胞を操作してそれらが可能な細胞にすることができる。例えば、内在ＦＡＴＰ５遺伝子を所有していない細胞に外来ＦＡＴＰ５遺伝子を導入し、外来ＦＡＴＰ５遺伝子の存在によって細胞がＦＡＴＰ５を発現できるようにする。あるいは、常態ではサイレントなＦＡＴＰ５遺伝子を“ターンオン”するために、常態ではＦＡＴＰ５を発現しない細胞のゲノムに外来核酸をスプライスすることもできる。補佐物質は例えば、核酸分子、ポリペプチド、有機分子、無機分子、融合タンパク質などである。
【００５７】
その後に、操作された細胞中のＦＡＴＰ５遺伝子を、本文中に記載の方法や本発明の方法及び組成物に使用できる当業者に公知の方法を使用して破壊できる。
【００５８】
ＦＡＴＰ５遺伝子の破壊の結果として、本発明のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは特定の表現型を示し得る。表現型という用語は、特定の遺伝子型に帰因する生化学的または生理学的な結果を意味する。ノックアウトマウスを創製した場合に観察される表現型は、ノックアウトされた遺伝子が喪失した結果である。１つの実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスにおいてインスリン／グルコースホメオスタシス及び食餌誘発インスリン抵抗性に対する反応が変質している。ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは、高脂肪食を給餌した野生型マウスに比べてインスリン抵抗性が軽減している。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは、血清トリグリセリドレベル及び遊離脂肪酸レベルの低下を示す。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは脂肪過多症の減少を示す。より詳細には、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは、野生型対照マウスに比べて白色脂肪量の有意な減少を示す。この表現型は動物に高脂肪食を給餌したときに激化する。更に、ＦＡＴＰ５マウスは摂食量の減少とエネルギー消費量の増加とを示した。
【００５９】
本発明は、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのインスリン抵抗性が軽減しているという知見に基づく。インスリン抵抗性の軽減はグルコース代謝レベルを上昇させる。２型真性糖尿病の特徴はインスリン抵抗性及び低いグルコース代謝レベルであるから、本文中に記載した結果は、２型真性糖尿病や、これに付随する表現型、例えば、グルコース代謝低下、インスリン抵抗性及び脂肪酸蓄積の治療方法を可能にする。
【００６０】
別の実施態様では、本文中に記載した知見はまた、ＦＡＴＰ５活性阻害の結果として絶好の血漿脂質プロフィルが得られることを証明する。別の実施態様では本発明はまた、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスでは血清トリグリセリド及び遊離脂肪酸のレベルが低下しているという認知に基づく。従って、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸輸送を阻害する物質は、脂質及び／または遊離脂肪酸の増加が心血管疾患の因子であるような心血管疾患の治療に有効である。脂質及び／または遊離脂肪酸の増加に付随する心血管疾患は冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患などである。
【００６１】
本文中で言及した心臓に関する障害、即ち、“心血管疾患”または“心血管障害”は、心血管系、例えば、心臓、血管及び／または血液を冒す疾患または障害を含む。心血管障害は、動脈圧の平衡失調、心臓の機能不全または例えば血栓による血管の閉塞によって生じる。心血管疾患の非限定例は、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈炎症、冠状動脈の微小塞栓、頻脈、徐脈、圧力過負荷（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｖｅｒｌｏａｄ）、脈管性心疾患、うっ血性心不全、狭心症、心不全、高血圧、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、虚血性疾患及び不整脈などである。
【００６２】
別の側面によれば、本文中に記載の知見はまた、ＦＡＴＰ５活性阻害が脂肪過多症に有益な効果を有することを示す。また別の特徴によれば、本発明は、ＦＡＴＰ５活性の阻害によってエネルギー消費量を増加させることを提案する。本発明は、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスが野生型マウスに比べて白色脂肪量の有意な減少を示すという事実に基づく。更に、マウスに高脂肪食を給餌したときにＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの脂肪過多症の減少がいっそう顕著になる。別の実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは高脂肪に誘発される体重増加及び脂肪過多症を完全に防御する。別の実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照に比べて摂食量の減少を示した。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べてエネルギー消費量の増加を示した。
【００６３】
アッセイ
本発明は、代謝障害、例えば、体重、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、例えば高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル、脂肪肝疾患、及び、心血管疾患、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧を治療できる化合物の同定方法を提供する。方法は、ＦＡＴＰ５の核酸発現またはＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調する化合物の能力を検定する段階を含む。いくつかの特徴によれば、ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調する化合物の能力はホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を検出することによって定量できる。追加の特徴によれば、ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡ活性を変調する化合物の能力は、補酵素Ａ、ＡＴＰまたは脂肪酸／胆汁酸の消費量を検出することによって定量できる。
【００６４】
さらに別の側面によれば、ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡ活性を変調する化合物の能力は、ＦＡＴＰ５介在性プロセスの変調を検出することによって判定できる。このようなプロセスとしては例えば、細胞プロセス（例えば、脂肪酸または胆汁酸の取込み）または身体プロセス（例えば、体重、体脂肪組成、エネルギー消費量または摂食行動、血中グルコースレベル、血清トリグリセリドレベル、血清遊離脂肪酸レベル、胆汁、血漿、尿もしくは糞便中の胆汁酸組成）がある。さらに別の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、障害（例えば、脂肪肝疾患、心血管疾患（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患）、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症を包含し得る。
【００６５】
別の側面によれば本発明は、ＦＡＴＰ５機能を変調例えば亢進または抑制する物質（例えば、治療用物質）の同定方法、及び、ＦＡＴＰ５機能に関連した疾患または状態（例えば肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患）の治療方法を提供する。
【００６６】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込みを阻害すると、外来または内在インスリンに対する生物応答の低下を意味する“インスリン抵抗性”が有意に軽減されることが判明した。インスリン抵抗性は２型真性糖尿病の特徴であり、罹患個体からグルコース代謝能力を奪う。例えば、血流からのグルコースクリアランス及び細胞内へのグルコース取込みができなくなり、肝グルコース産生が亢進する。
【００６７】
ＦＡＴＰ５が脂肪酸及び胆汁酸の取込みを促進しまたアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を有していることは、酵素活性と観察された輸送活性とが関連していることを示唆する。しかしながら、酵素活性だけをより詳細に特性決定するために輸送の非存在下のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を測定することもできる。
【００６８】
従って、本文中に提示したデータは、ＦＡＴＰ５障害、例えば、体重、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中を治療するための治療ターゲット分子を同定する。ＦＡＴＰ５の阻害は修飾された脂肪酸及び／または胆汁酸の取込みとインスリン抵抗性とを抑制し、血清トリグリセリド及び遊離脂肪酸を減少させる。従って、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患の治療に使用するためのＦＡＴＰ５阻害物質を同定する方法も本発明の目的の一部である。
【００６９】
ＦＡＴＰ５活性、例えば、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸もしくは胆汁酸取込みまたはアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調または変質させる物質の同定は、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸もしくは胆汁酸取込み及び／またはＦＡＴＰ５アシル−ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階を含む。このような活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定できる。ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込み活性は例えば、アシル−ＣｏＡ−修飾脂肪酸または胆汁酸の細胞内蓄積レベル（本文中では量または率の双方を表す）；肝臓、胆汁、血漿、尿または糞便中の胆汁酸組成；血清トリグリセリドレベル；遊離脂肪酸レベル；血漿脂質組成；グルコース取込み；グルコースクリアランス；または肝グルコース産出を定量することによって測定できる。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性は例えば、アシル−ＣｏＡ−修飾脂肪酸またはアシル−ＣｏＡ−修飾胆汁酸の蓄積レベル；補酵素Ａ、ＡＴＰ、及び／または脂肪酸／胆汁酸の消費量；及び／またはホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を定量することによって測定できる（実施例参照）。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性の適当な定量方法は当業界で公知であり、本発明で提供された方法に適宜応用できる。例えば、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，ＳＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．２５７：６１５−６２１（１９９９）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，ＳＪら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．５８：３２−４２（１９９９）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，ＳＪら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１５６０５−１５６０８（２０００）参照。
【００７０】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込みはまた、コントロール食（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）を給餌したマウスの白色脂肪重量をモニターすることによって定量できる。実施例２に示すようにして体重及び脂肪過多症を測定する実験を行った。野生型マウスのグループとＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグループとを標準的な実験用コントロール食に６ヶ月間維持した。ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは野生型対照に比べて有意に少ない白色脂肪量を示した。このように白色脂肪量を測定することによって動物のＦＡＴＰ５活性を評価できる。
【００７１】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込みはまた、高脂肪食に維持したマウスの体重、エネルギー消費量及び／または摂食量をモニターすることによって評価できる。実施例３及び４に示すようにして高脂肪食に維持したマウスの体重及び摂食量を測定する実験を行った。ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは同じ食餌に維持した野生型マウスよりも有意に少ない体重を示した。更にＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは野生型マウスよりも有意に少ない摂食量を示した。また、実施例５に示すように、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは野生型マウスよりも有意に多いエネルギー消費量を示した。このように高脂肪食に維持した動物の体重、エネルギー消費量及び／または摂食量を定量することによってマウスのＦＡＴＰ５活性を評価できる。
【００７２】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸取込みはまた、高脂肪食を給餌したマウスの全脂肪量をモニターすることによって評価できる。実施例４に示すようにして高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの脂肪量を測定する実験を行った。データは、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスが野生型マウスよりも有意に少ない脂肪量を有していたことを示す。従って本発明の別の目的は、高脂肪食に維持した動物の全脂肪量の定量によるＦＡＴＰ５活性の評価を提案することである。
別の特徴によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は遊離脂肪酸及び血清トリグリセリドのレベルの低下を示した。実施例６に示すようにして高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの遊離脂肪酸及び血清トリグリセリドのレベルを測定する実験を行った。次にマウスを一夜絶食させ、血清を採取した。結果は、遊離脂肪酸及びトリグリセリドの血清レベルについてはＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのほうが低い値を有していたことを示す。従って、追加の実施態様では、高脂肪食に維持した動物の遊離脂肪酸及びトリグリセリドの血清レベルをモニターすることによってＦＡＴＰ５活性を評価できる。
【００７３】
別の特徴によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は肝脂質の湿潤重量パーセントの減少を示す。実施例７に示すように、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスを高脂肪食に維持した。動物の肝臓を採取し、肝脂質の湿潤重量パーセントを測定した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて有意に低い肝脂質の湿潤重量パーセントを示した。このように、高脂肪食に維持した動物の肝脂質含量を測定することによって行うＦＡＴＰ５活性の別の評価方法が提供される。
【００７４】
また別の特徴によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物の表現型は食餌誘発インスリン抵抗性の防御として表れる。実施例５は、グルコースの腹腔内注射後のグルコースの消滅率を比較するために行った実験の結果を示す。グルコース消滅率は、野生型マウスとノックアウトマウスとの間のインスリン刺激全身グルコース取込み及びインスリン介在性肝グルコース産出抑制の割合を表す。インスリン抵抗性を誘発するために、野生型マウスのグループとＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグループとを高脂肪食に維持した。高脂肪食を給餌した野生型マウスではグルコースクリアランス能力が低下しておりインスリン抵抗性の進行を示したが、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは脂質注入及び高脂肪食の効果を完全に防御し正常なグルコース消滅レベルを示しており、これはＦＡＴＰ５欠失によってインスリン抵抗性が防御されたことを示す。従って本発明の別の実施態様は、高脂肪食によって誘発されたインスリン抵抗性の防御を判定することによってＦＡＴＰ５活性を評価する方法を提供する。この判定は、グルコース負荷試験による測定を含む当業界で公知の方法を使用して行うことができる。
【００７５】
さらに別の特徴によれば、本発明は、新しい胆汁酸の生合成またはコレステロールの生合成と生合成プロセスに関与する遺伝子とをモニターすることによってＦＡＴＰ５活性を評価する方法を提供する。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物がコレステロール生合成、胆汁酸生合成に関与する遺伝子の正の調節及び糖新生に関与する遺伝子の負の調節を示すことが知見された。実施例１０に示すようにしてＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの胆汁酸含量と生合成経路の遺伝子発現とをモニターした。動物の肝臓を採取し、組織の胆汁酸及び遺伝子発現を分析した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて再循環胆汁酸の抱合不足と新しい胆汁酸の生合成及びコレステロール生合成に関与する遺伝子の発現増加とを示した。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて糖新生に関与する遺伝子の発現減少を示した。このように、胆汁酸抱合と胆汁酸またはコレステロールの生合成経路とを測定することによってＦＡＴＰ５活性を評価する別の方法が提供される。
【００７６】
ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性は例えば、アシル−ＣｏＡ−修飾脂肪酸または胆汁酸の蓄積レベル；補酵素Ａ、ＡＴＰ及び脂肪酸／胆汁酸の消費量；及び／またはホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を定量することによって測定できる。標識試薬、例えば、蛍光標識、酵素標識または放射性標識した反応体または生成物は当業界で公知の方法で入手及び検出できる。例えば、補酵素Ａ、ＡＴＰ及び脂肪酸／胆汁酸の消費量は、放射性標識された補酵素Ａ、ＡＴＰおよび脂肪酸／胆汁酸のレベルをモニターすることによってモニターできる。あるいは、標識されたホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰを検出しモニターすることもできる。
【００７７】
例えば、１つのタイプのアッセイ例えば細胞ベースのアッセイでは、ＦＡＴＰ５活性に対する変調用化合物（例えば、インヒビター）の効果を定量するために、ＢＯＤＩＰＹ−脂肪酸（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−ドデカン酸）と放射性標識した脂肪酸または胆汁酸（例えば、１４Ｃ−ラウレート）とを使用する。このアッセイでは、ＦＡＴＰ５を発現する細胞を脂肪酸または胆汁酸に接触させ、取込まれなかった脂肪／胆汁酸を洗浄によって除去し、細胞に会合した蛍光または放射能を適当な検出デバイスを使用して測定する。トランスフェクト細胞系（例えば、安定にトランスフェクトされたＦＡＴＰ５を発現するＨＥＫ２９３細胞）及びＦＡＴＰ５を天然に発現する細胞（例えば一次肝細胞）のような適当なＦＡＴＰ５発現細胞を細胞ベースアッセイに使用できる。
【００７８】
別のタイプの細胞ベースアッセイでは、脂肪酸の取込みによる細胞内ｐＨの変化を指標物質フルオロホアによって追跡できる。フルオロホアはプレインキュベーション段階で細胞に取込ませる。細胞培地に脂肪酸を添加し、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸取込みができるインキュベーション期間の後、蛍光最大値の変化を測定し、細胞内ｐＨ変化を表す指標とする。フルオロホアの蛍光最大値はその環境のｐＨに伴って変化するので脂肪酸取込みを表す指標となり得る。このようなフルオロホアの一例はＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス（２−カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセインである。Ｒｉｎｋ，Ｔ．ら、１９８２，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９５：１８９−１９６参照。このようにしてこのアッセイでは、脂肪酸取込みが細胞内ｐＨの低下によって表される。
【００７９】
また別のタイプの細胞ベースアッセイは、標識した非抱合胆汁酸に細胞を接触させ、次いで胆汁酸取込みをモニターし、適正な検出方法を使用して細胞内の抱合胆汁酸の量を定量する段階を含む。
ＦＡＴＰ５ノックアウト細胞及び哺乳動物が入手可能になれば、ＦＡＴＰ５介在性シグナル伝達経路の遺伝的解剖が促進され、ＦＡＴＰ５特異的インヒビターの同定が可能になる。例えば、ノックアウト細胞系及びその野生型親細胞系でＦＡＴＰ５の機能を同等に阻害する物質はＦＡＴＰ５非特異的インヒビターとして認知されるであろうが、野生型細胞系のＦＡＴＰ５機能を阻害するがノックアウト細胞系で効果のない物質はＦＡＴＰ５特異的インヒビターとして認知されるであろう。
【００８０】
本発明の他の実施態様は、哺乳類ＦＡＴＰ５の活性（機能）を阻害する物質、例えば、アンタゴニスト、部分的アンタゴニストを同定する方法を提供する。ＦＡＴＰ５のインヒビターは、ＦＡＴＰ５遺伝子発現を阻害（発現の部分的または全面的阻害）するかまたはＦＡＴＰ５タンパク質の機能を阻害（機能の部分的または全面的阻害）する物質を包含する。本文中に記載のＦＡＴＰ５活性測定方法は例えばスクリーニング方法及び当業界で公知のＦＡＴＰ５活性測定方法に使用できる。本発明によれば、物質を細胞、一次組織と合せるか及び／または完全動物に投与する。後出の実施例に示すように、投与は、培養培地への添加、組織潅流、ベクターからの発現または注射のような様々な方法で行うことができる。
【００８１】
１つの実施態様では、物質をそのＦＡＴＰ５阻害能力、それによるインスリン抵抗性の軽減能力に基づいて同定または評価する。このようなスクリーンはｉｎ ｖｉｖｏで行うこともでき、または、処置した動物から単離した細胞を使用してｅｘ ｖｉｖｏで行うこともできる。
【００８２】
例えば、インスリン抵抗性マウスまたはインスリン抵抗性を示す細胞を本文中に記載のスクリーニング方法に使用できる。本文中に記載の方法または当業界で公知の方法のいずれかによって測定されたグルコース代謝（例えば、取込みまたはクリアランス）の基底レベルを定量できる。本文中では基底レベルという用語を、系の特定操作前のレベルという意味で使用した。被験物質の添加後、グルコース代謝を再度測定する。インスリン抵抗状態に従ってグルコース代謝は変質する。被験物質の存在下でグルコース代謝が正常値に戻る傾向を示すならば、インスリン抵抗性は軽減しており、物質はＦＡＴＰ５インヒビターである。
【００８３】
本文中に記載のスクリーニング方法は更に何らかの適当な対照の使用を含み得る。例えば１つの実施態様では、スクリーニング方法が更に、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースを物質の非存在下及び存在下で野生型マウスに投与する段階と、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースを物質の存在下でＦＡＴＰ５ノックアウトマウスに投与する段階とを含む。マウスのグルコースクリアランス率を定量する。物質の存在下の野生型マウスのグルコースクリアランス率を物質の非存在下の野生型マウスのグルコースクリアランス率に比較する。また、物質の存在下のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグルコースクリアランス率を物質の非存在下のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグルコースクリアランス率に比較する。
【００８４】
物質の存在下の野生型マウスのグルコースクリアランス率が物質の非存在下の野生型マウスによるグルコースクリアランス率に比べて増加しており、また、物質の存在下のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスによるグルコースクリアランス率が物質の非存在下のノックアウトマウスによって生じたレベルと同等であるならば、この物質はＦＡＴＰ５を特異的に阻害する。本発明のスクリーニング方法では、細胞、野生型マウスまたはＦＡＴＰ５ノックアウトマウスによるグルコース取込み率を本文中に記載または当業者に公知の多様な方法によって定量できる。哺乳動物を使用して体重、肥満、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、異常脂血症、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中の治療に有用な物質をスクリーニングする方法も本発明の範囲内である。インスリン抵抗性の治療に有用な物質を同定するための適当なｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏスクリーニング方法は、野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を含む哺乳動物、組織または培養細胞、例えばマウスに、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースと被験物質とを投与する段階を含む。
【００８５】
マウスのグルコースクリアランス率を測定する。マウスのグルコースクリアランス率を、被験物質の非存在下で同量のグルコースを投与した同一または同様のマウスのグルコースクリアランス率に比較する。マウスのグルコースクリアランス率が被験物質の存在下で増加しているならばインスリン抵抗性の治療に有用な物質が同定されている。
【００８６】
同様に、インスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用な物質を同定するための適当なｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング方法は、野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を含む哺乳動物例えばマウスに、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースと被験物質とを投与する段階を含む。マウスのグルコースクリアランス率を測定する。マウスのグルコースクリアランス率を、被験物質の非存在下で同量のグルコースを投与した同一または同様のマウスのグルコースクリアランス率に比較する。マウスのグルコースクリアランス率が被験物質の存在下で増加しているならば、インスリン非抵抗性真性糖尿病（ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）の治療に有用な物質が同定されている。
【００８７】
遊離脂肪酸及びトリグリセリド例えば血清トリグリセリドのレベルを変調するために有用な物質のｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏのスクリーニング方法も考察できる。このような方法は、野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を含む哺乳動物例えばマウスに被験物質を投与する段階を含む。被験物質投与後のトリグリセリド及び／または脂肪酸の量を測定し、被験物質投与前のトリグリセリド及び／または脂肪酸の量に比較する。被験物質投与後のトリグリセリド及び／または脂肪酸の量が有意に違っているならば、トリグリセリド及び／または脂肪酸のレベルを変調する物質が同定されている。このような変調は、トリグリセリド及び／または血清トリグリセリドレベルの上昇及び低下の双方を含む。
【００８８】
種々の脂肪酸代謝産物の産生または蓄積もこのようにして測定できる。
【００８９】
ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性は上述のように、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの方法によって測定できる。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性に基づくスクリーニング方法は例えば、ＦＡＴＰ５に結合し、アシル−ＣｏＡの蓄積などによって測定されるＦＡＴＰ５のｉｎ ｖｉｔｒｏリガーゼ活性を阻害する物質の同定方法であってもよい。更に、細胞（例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または心臓細胞）、組織または動物体内のアシル−ＣｏＡの蓄積もＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を阻害する物質のスクリーニングアッセイに使用できる。
【００９０】
１つの実施態様で本発明は、インスリン抵抗性の治療に有用な物質のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ同定方法を目的とする。本文中に記載したように、ＦＡＴＰ５の阻害はインスリン抵抗性の軽減または消去に導く。従って、ＦＡＴＰ５を阻害する物質はインスリン抵抗性を軽減する物質として有用であろう。
【００９１】
該方法は、被験物質を哺乳類のＦＡＴＰ５に（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ、例えば、生の（ｎａｔｉｖｅ）状態でまたは哺乳類ＦＡＴＰ５を超発現するように操作された培養細胞系中で）接触させる段階を含む。被験物質の存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルを定量し、被験物質の非存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルに比較する。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが被験物質の存在下で低下しているときはインスリン抵抗性の治療に有用な物質が同定されている。
【００９２】
同様にして、別の実施態様で本発明は、インスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用な物質のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ同定方法を目的とする。インスリン抵抗性は２型糖尿病（インスリン非依存型真性糖尿病）の特徴なので、インスリン抵抗性を軽減する物質、例えば、ＦＡＴＰ５を阻害する物質がインスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用である。該方法は、被験物質を哺乳類のＦＡＴＰ５に接触させる段階を含む。被験物質の存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルを定量し、被験物質の非存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルに比較する。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが被験物質の存在下で低下しているときはインスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用な物質が同定されている。
【００９３】
トリグリセリド及び／または脂肪酸レベルを低下させるために有用な物質のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ同定方法も考察される。該方法は、被験物質を哺乳類のＦＡＴＰ５に接触させる段階を含む。被験物質の存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルを定量し、被験物質の非存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルに比較する。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが被験物質の存在下で違っているときはトリグリセリド及び／または脂肪酸蓄積の治療に有用な物質が同定されている。
【００９４】
いくつかの特定実施態様では、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが物質の存在下で上昇している。別の実施態様では、アシル−ＣｏＡリガーゼのレベルが物質の存在下で低下している。変質した活性、即ち活性の変調は本発明に記載の方法によって測定できる。
【００９５】
治療方法
本発明はまた、ＦＡＴＰ５機能によって冒される状態（例えば、高血糖症）または疾病または障害（例えば、２型糖尿病）の治療または予防方法に関する。例えば本発明は、変質したグルコース／インスリンホメオスタシスを治療（例えば、症状の軽減）または予防する（例えば発症体質個体で）方法を提供する。本文中で使用した“個体”という用語は、ヒト患者を含む種の単一構成員を包含すると理解されたい。１つの実施態様で本発明は、ＦＡＴＰ５活性を阻害する物質を個体に投与することによって個体の全身グルコースクリアランスを増進する方法を提供する。
【００９６】
この増進は、筋肉細胞及び脂肪細胞へのインスリン刺激性グルコース取込みが増進されたかまたは肝細胞によるインスリン介在性グルコース産生が減退した結果として生じる。いくつかの実施態様で本発明はまた、血清トリグリセリド及び遊離脂肪酸の蓄積を抑制する方法を提供する。
【００９７】
別の実施態様で本発明は、ＦＡＴＰ５活性を阻害する物質を個体に投与する段階を含む、個体の血中グルコースを減少させる方法を提供する。本発明は更に、ＦＡＴＰ５活性を阻害する物質を個体に投与する段階を含む個体の糖尿病（例えば、２型糖尿病）の治療方法を提供する。
【００９８】
本発明の方法に使用される物質は例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、有機分子、無機分子、融合タンパク質、などでよい。
【００９９】
物質（例えば、ＦＡＴＰ５インヒビターのような治療用物質）は多様な方法で宿主に投与できる。可能な投与経路としては、皮内、経皮（例えば、徐放性ポリマーの使用）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または経口などの経路がある。簡便な任意の投与経路、例えば、注入もしくは濃縮塊注入、または、上皮もしくは粘膜皮膚のライニングによる吸収を使用できる。物質は医薬品に許容される賦形剤、担体、ビヒクルまたは希釈剤のような他の成分と組合せて投与できる。
【０１００】
ＦＡＴＰ５の機能を阻害するように設計された治療方法では、“有効量”の物質を個体に投与する。本文中で使用した“有効量”という用語は、例えば、ＦＡＴＰ５の活性を阻害し（または低下させ）その結果として有意な、例えば統計的に有意な差を生じさせる量、例えば、常態ではＦＡＴＰ５の調節下、例えば負の調節下にある細胞機能の亢進または減退を生じさせる量を意味する。例えば、高血糖症個体に投与された有効量の治療用物質という用語は、ＦＡＴＰ５によって促進される脂肪酸または胆汁酸の取込みを変質させ（阻害し）これによってインスリンの有効使用を促進するため、即ちインスリン抵抗性を軽減するために十分な量を含意するであろう。ＦＡＴＰ５活性を阻害するために必要な物質の量は、宿主の体格、年齢、体重、全般的健康状態、性別及び食事や、投与時間、治療対象である特定の状態または疾病の期間または時期のような多様な要因次第で変更されるであろう。有効な用量範囲はヒト以外の、例えば、本文中に記載のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスを利用するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの試験系で得られた用量−応答曲線から外挿できる。
【０１０１】
本文中で参照したすべての特許、特許出願及び参考文献はその記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする。
以下の実施例の目的は本発明を例示することであり、本発明の範囲がこれらに限定されないことを理解されたい。
【実施例１】
【０１０２】
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの作製
ＦＡＴＰ５ターゲティング構築物の作製：
マウスＦＡＴＰ５遺伝子座を含有するゲノムＤＮＡは、１２９／Ｓｖゲノム細菌性人工染色体ライブラリー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）をマウスＦＡＴＰ５コーディング配列の５’端を含有しているフラグメントでスクリーニングすることによって得られた。陽性クローンをＰｓｔＩで消化した。ＦＡＴＰ５−含有フラグメントをサザンブロット法によって同定し、標準シャトルベクターにサブクローニングした。ターゲティング構築物を作製するために、ＰＣＲプライマーは、開始コドンの直ぐ上流のゲノムＤＮＡ（５’アーム）と第一コーディングエキソンの直ぐ下流のゲノムＤＮＡ（３’アーム）とを増幅できるように設計した。ＰＣＲプライマーは、５’アームの３’端にＸｂａＩ部位及び３’アームの５’端にＰｓｔＩ部位を導入するように設計した。増幅されたアームをターゲティングベクターｐＧＥＭｎｅｏ−ｌａｃＺ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。Ｍｅｒｃｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ ７：７０３−７１６，１９９１参照。ｌａｃＺコーディング配列は５’アームの直ぐ下流に局在し、従ってｌａｃＺはＦＡＴＰ５プロモーターの転写コントロール下に置かれた。
【０１０３】
サザンブロット法によって組換えイベントが確認できるように、プローブはターゲティング構築物に存在するアームに直ぐ隣接のゲノムＤＮＡから作製した。５’プローブを作製するために、５’アームの直ぐ上流を起点とするゲノムＤＮＡのフラグメントをＰＣＲによって増幅し、シャトルベクターにサブクローニングした。３’プローブを作製するために、３’アームの９０ヌクレオチド下流を起点とするゲノムＤＮＡのフラグメントをＰＣＲによって増幅し、シャトルベクターにサブクローニングした。正しい組換えイベントが生じると、ＦＡＴＰ５タンパク質の第一アミノ酸が欠失し、ＦＡＴＰ５遺伝子の第一コーディングエキソンがｌａｃＺ遺伝子で置換され、その後方にＰＧＫ−ｎｅｏカセットが存在する。
【０１０４】
ターゲットとしたＥＳ細胞の作製：
１２９ＳｖＥｖ ＥＳ細胞系は、有糸分裂的に不活性のＳＮＬ７６／７支持細胞上で従来技術に記載されているようにして培養した。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｅ．Ｊ．，ｅｄ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７．Ｐｐ７１−１１２参照。細胞の電気穿孔は従来技術に記載されているようにして行った。Ｈｕｓｚａｒら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：１３１−１４１参照。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、１．０×１０７／ｍｌの濃度でＰＢＳ（Ｃａ及びＭｇ非含有、Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。０．７ｍｌのアリコート（７×１０６細胞）を２０μｇの直鎖化したターゲティングベクターと混合し、２５０Ｖ，５００μＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）でパルスを加えた。次いで、細胞を培養培地に希釈し、支持細胞を入れたプレート１００ｍｍあたり１−２×１０６で平板培養し、２４時間後、Ｇ４１８スルフェート（３００μｇ／ｍｌ溶液；Ｇｉｂｃｏ）中で選択下に維持した。Ｇ４１８−耐性クローンを採取し、トリプシンで解離し、２個の９６−ウェルプレートの各々の１つのウェルに分配した。単層集密状態に達すると、従来技術に記載されたようにして一方の９６−ウェルプレートのＥＳ細胞を凍結させた。例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓら、（１９９３）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２２５：８５５−８７８参照。サザンブロットハイブリダイゼーションによってスクリーニングするためのＤＮＡを他方のプレートから調製した。陽性クローンを伸長し、組換えを確認するために５’及び３’のフランキングプローブを使用しサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。
【０１０５】
ＦＡＴＰ５−欠損マウスの作製：
正しい相同的組換えイベントを生じたＥＳ細胞クローンを未分化胎細胞に注入し、次いで偽妊娠雌マウスに移入してキメラ子孫を産生させた。雄のキメラをＣ５７Ｂ／６Ｊ雌と交尾させ、破壊されたＦＡＴＰ５遺伝子の胚細胞系列が伝達されるようにした。得られたヘテロ接合体を交配（ｉｎｔｅｒｂｒｅｅｄ）すると、ＦＡＴＰ５突然変異に関してホモ接合（ＦＡＴＰノックアウト、ＦＡＴＰ ＫＯ）またはヘテロ接合のマウスが野生型同腹仔と共に産生した。いくつかの実験では、同一世代のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの交配によって産生したホモ接合ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスと、同一世代の野生型マウスの交配によって産生した野生型同腹仔とを使用した。
【実施例２】
【０１０６】
コントロール食に維持した野生型マウス及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの体重及び脂肪過多症
６匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯ及び野生型同腹仔（対照）を誕生から２６週齢まで標準コントロール食（２０ｋｃａｌ％脂肪）に維持した。体重、白色脂肪、例えば、精巣上体の脂肪パッドと腹膜後方の脂肪パッド、及び、褐色脂肪、例えば、肩甲骨内の褐色脂肪組織の重量を２６週の期間後に測定した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは野生型対照に比べて白色脂肪量が有意に減少していた。表Ｉ参照。
【０１０７】
【表１】
【実施例３】
【０１０８】
高脂肪食に維持した野生型及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの体重／摂食量
１４匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを８週齢から開始した高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）に維持した。高脂肪食の開始前に体重を測定し、高脂肪食の１１週後に再度測定した。同様にして、１１週間の累積摂食量を測定した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは野生型対照に比べて高脂肪誘発体重増加を完全に防御していた。更に、高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは摂食量の減少を示した。表ＩＩ参照。
【０１０９】
【表２】
【実施例４】
【０１１０】
高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの体組成
１４匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを実施例３と同様にして高脂肪食に維持した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは上記と同様に高脂肪誘発体重増加を完全に防御した。１７週の高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）後に体重及び体組成を定量した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは脂肪過多症を防御していたが、ＦＡＴＰ５ ＫＯ動物と野生型動物との間で無脂肪量の差は観察されなかった。表ＩＩＩ参照。
【０１１１】
【表３】
【実施例５】
【０１１２】
高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスのエネルギー消費量
１４匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを実施例３と同様にして高脂肪食に維持した。１７週の高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）後に熱量測定分析を使用してエネルギー消費量を定量した。結果は、ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスが野生型マウスよりも有意に高いエネルギー消費量を有していたことを示した。表ＩＶ参照。
【０１１３】
【表４】
【実施例６】
【０１１４】
ＦＡＴＰ５欠失は食餌誘発インスリン抵抗性を防御する
高脂肪給餌はマウスのインスリン抵抗性を誘発する。ＦＡＴＰ５が食餌誘発インスリン抵抗性を防御するか否かを判定するために、グルコース負荷試験を行った。簡単に説明すると、ＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）または標準規定のコントロール食に維持した。マウスを一夜絶食させ、２ｍｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内注射した。グルコース計（Ｂａｙｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って使用して１８０分間を６等分した時間毎に血中グルコースレベルを測定した。高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ ＫＯ動物はコントロール食に維持した野生型マウスと同様のグルコースクリアランスプロフィルを有していたが、高脂肪食に維持した野生型マウスではグルコースクリアランスプロフィルが有意に悪化していた。表Ｖ参照。
【０１１５】
【表５】
【実施例７】
【０１１６】
ＦＡＴＰ５欠失動物は絶好の血漿脂質プロフィルを示す
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウス（ｎ＝１４、８週齢）に高脂肪食を２８週間給餌した。対照として対等な週齢の野生型マウスをコントロール食に維持した。一夜絶食させた動物から血清を採取した。市販のキットを使用して、トリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロール、ベータ−ヒドロキシブチレート（いずれもＳｉｇｍａ）並びにインスリン及びレプチン（双方ともＣｒｙｓｔａｌＣｈｅｍ）を測定した。血清トリグリセリドレベルの低下傾向が観察され、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物では遊離脂肪酸レベルが有意に低下した。一夜絶食させた動物の血清検査によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は血清コレステロール、ケトン体（ベータ−ヒドロキシ−ブチレート）またはリポタンパク質プロフィル（示さず）の変化を示さなかったので、他のパラメーターはＫＯ動物と野生型動物との間で有意な差がほとんどないことが判明した。従って、ＦＡＴＰ５の阻害は副作用をまったく生じないと考えることができ、血中脂質プロフィルにプラスの効果を与えるであろう。表ＶＩ参照。
【０１１７】
【表６】
【実施例８】
【０１１８】
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは肝脂質レベルの低下を示す
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスを高脂肪食に２８週間維持した。対照として対等な週齢の野生型マウスをコントロール食に維持した。２８週後に肝臓を摘出し、肝脂質を湿潤重量％として測定した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて肝脂質レベルが低下していた。これは脂肪肝疾患の防御を示唆する。表ＶＩＩ参照。
【０１１９】
【表７】
【実施例９】
【０１２０】
ＦＡＴＰ５欠失の結果として糞便の脂肪は少し減少するが糞便のカロリーに有意な差はない
ＦＡＴＰ５ノックアウト動物及び野生型動物を上述のようにして高脂肪食に１１週間維持した。動物の糞便を集めて糞便中の脂質レベルを乾燥重量パーセントとして測定した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は糞便脂質レベルの僅かな上昇を示した。表ＶＩＩＩ参照。また、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物に高脂肪食を５日間給餌し、糞便を集め、ボンベカロリー測定法で糞便の全カロリー含量を測定した。データは、糞便の全カロリーは野生型マウスとＦＡＴＰ５ノックアウトマウスとの間で差がないことを示す。表ＩＸ参照。
【０１２１】
【表８】
【０１２２】
【表９】
【実施例１０】
【０１２３】
ＦＡＴＰ５欠失マウスは再循環胆汁酸の抱合不足があり、新しい胆汁酸の生合成の増加を示す
ＦＡＴＰ５欠失マウスの胆汁酸組成
絶食させた野生型マウス及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスから胆汁を採取し、胆汁酸組成をＬＣ−ＭＳによって分析した。胆汁酸グループは市販の標準を使用して同定した。主要胆汁酸グループの各々で個々の胆汁酸ピークの曲線下方面積（ＡＵＣ）を定量し、野生型マウス及びノックアウトマウスの主要胆汁酸グループの相対的存在量として同定した。胆汁酸の総量は双方のマウスグループで同様であったが、ＦＡＴＰ５欠失マウスから採取した胆汁は主として非抱合の胆汁酸を含有していたのに、野生型マウスから採取した胆汁酸のほとんどは抱合していた。更に、ＦＡＴＰ５欠失マウスは野生型マウスに比べてジヒドロキシ化胆汁酸が有意に少なく、テトラヒドロキシル化胆汁酸が増加していた。表Ｘ参照。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
野生型マウス及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの各々のタウリン−抱合ジヒドロキシル化胆汁酸の検査は、ＦＡＴＰ５欠損動物グループ中のこの画分は全面的にタウロケノデオキシコレート即ち新規合成によって産生される胆汁酸から構成されることを証明した。対照的に、新規合成でなく腸肝再循環中に産生される胆汁酸の２つの種、タウロヒオデオキシコレート及びタウロデオキシコレートは野生型動物で検出されたが、ノックアウトマウスではバックグラウンドレベルを上回って検出されることはなかった。表ＸＩ参照。我々のデータは、ＦＡＴＰ５が腸肝再循環中の胆汁酸の抱合には必要であるが新規合成には必要でないことを示唆する。新規合成は胆汁中の胆汁酸の少ないパーセンテージを占めるだけなので、腸肝再循環の欠如は全胆汁酸プールを非抱合種の方向にシフトさせるであろう。
【０１２６】
【表１１】
【０１２７】
遺伝子発現解析
ＦＡＴＰ５欠失の結果を更に検討するために、我々は転写プロファイリングとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析とを併用して野生型マウスとＦＡＴＰ５欠失マウスとの肝臓における遺伝子発現を比較した。転写プロファイリングＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を製造業者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の指示通りに行うことによって、または、ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ解析を製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）の指示通りに行うことによって遺伝子発現を測定した。
【０１２８】
転写プロファイリング実験のためには、ＴｒｉａｚｏｌＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造業者の指示通りに使用することによって均質化組織から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡをジエチルピロカーボネートで処理した脱イオン水に入れて８０℃で保存した。サンプルの標識及びその後のアレイへのハイブリダイゼーションに関する方法の詳細はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から得られる。簡単に説明すると、５．０μｇの全ＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）を含有しているＴ７−（ｄＴ）２４プライマーと共に第一ストランド合成をプライミングする二重鎖ｃＤＮＡに変換した（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。次いで、全部の二重鎖ｃＤＮＡを、取込んだＴ７プロモーター配列を使用するビオチニル化ｃＲＮＡ作製の鋳型として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット；Ａｍｂｉｏｎ及びＢｉｏ−１１−ＣＴＰ及びＢｉｏ−１６−ＵＴＰ；Ｅｎｚｏ）に使用した。１０μｇのｃＲＮＡに対照オリゴヌクレオチド及びスパイクを添加し、次いでＭｕ Ｕ７４オリゴヌクレオチドアレイに定速回転を維持しながら４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。次にアレイを洗浄し、ＥＵＫＧＥ−ＷＳ１プロトコルを使用してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションで染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーで走査した。ＭＡＳ５．０ソフトウェアを使用してデータ解析を行った。
【０１２９】
リアルタイムＰＣＲ実験のためには、同じくｔｒｉｚｏｌ法を使用して全ＲＮＡを作製し、ＤＮアーゼで処理して夾雑ゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡを標準法で合成した。逆転写酵素の非存在下のＭｏｃｋ ｃＤＮＡ合成によって得られたサンプルでは対照１８Ｓ遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅が全く生じていなかったので、ゲノムＤＮＡ夾雑の効率的な除去が確認された。ＰＣＲプローブは該当遺伝子配列に基づくＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって設計した。異なる組織間の結果を標準化するために、異なる蛍光ラベルによって識別できる２つのプローブを各サンプルに加えた。このように遺伝子用プローブと１８Ｓ ＲＮＡ用プローブ（内部対照として）との示差標識を使用すると同一ウェル中の双方の同時的測定が可能であった。順方向及び逆方向のプライマーと１８Ｓ ＲＮＡ及び該当遺伝子の双方のプローブとをＴａｑＭａｎ汎用ＰＣＲマスターミックス（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に加えた。プライマー及びプローブの最終濃度が変わることはあったが、所与の１つの実験中では各々の濃度が内部的に不変であった。典型的な実験では、１８Ｓ ＲＮＡには各２００ｎＭの順方向及び逆方向のプライマーと１００ｎＭのプローブとを使用し、該当遺伝子には各６００ｎＭの順方向及び逆方向のプライマーと２００ｎＭのプローブとを使用した。ＴａｑＭａｎマトリックス実験はＡＢＩＰＲＩＳＭ７７０配列検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。サーマルサイクラーには以下の条件を使用した：５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで、９５℃で１５秒次いで６０℃で１分の２段階ＰＣＲを４０サイクル。
【０１３０】
組織サンプル中の遺伝子発現を同じ組織中の１８Ｓ ＲＮＡ発現に相対的に定量計算するために以下の方法を使用した。ＰＣＲ増幅が開始される閾値を製造業者のソフトウェアを使用して決定した。閾値におけるＰＣＲサイクル回数をＣＴで表す。相対的発現は、２−（（ＣＴｔｅｓｔ−ＣＴ１８Ｓ）該当組織−（ＣＴｔｅｓｔ−ＣＴ１８Ｓ）パネル中の最低発現組織）として計算した。サンプルを重複処理し、内部対照１８Ｓの勾配と同様の勾配をもつ鋳型ｃＤＮＡの量に比例した２つの相対的発現レベルの平均を使用した。発現倍率は野生型対照動物の相対的発現レベルに比べたＦＡＴＰ５欠失動物の相対的発現として定量した。
【０１３１】
コレステロール及び胆汁酸の双方の生合成経路に関与する遺伝子の正の調節が観察された。胆汁酸によって活性化される既知の核ホルモン受容体であるＦＸＲのいくつかのターゲット遺伝子（Ｐａｒｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１３６５−８，１９９９）は、ＦＸＲの活性低下を示唆するように調節されている。ＦＸＲはジヒドロキシ胆汁酸によって強力に活性化されるが、トリヒドロキシ胆汁酸にはほとんど感応しないので（Ｐａｒｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１３６５−８，１９９９）、ＦＸＲの活性低下はＦＡＴＰ５ノックアウト動物に見られるジヒドロキシ胆汁酸のレベル低下と符合する。表ＸＩＩ参照。
【０１３２】
コレステロールの生合成及びコレステロール取込みに関与する遺伝子ＬＤＬ−Ｒの双方の正の調節は、胆汁酸合成亢進の存在下で細胞内コレステロールレベルを正常に維持する適応応答であった。ノックアウト動物で脂肪酸酸化遺伝子の調節はほとんど観察できなかったが、これは、ＦＡＴＰ５欠失動物で呼吸交換率が不変であるという知見と符合する。更に我々は、糖新生に関与する基幹遺伝子の強力な負の調節を観察した。これもＦＡＴＰ５欠失動物でインスリン感受性が改善される理由の１つであろう。表ＸＩＩ参照
【０１３３】
【表１２】
【実施例１１】
【０１３４】
ＦＡＴＰ５によるアシル−ＣｏＡリガーゼ活性
ｈｓＦＡＴＰ５の発現及び精製
Ｃ−末端６ｘ−ＨＩＳタグを含んでいるヒトＦＡＴＰ５コーディング配列をｐＦａｓｔＢＡＣベクターに挿入し、ｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓを発現するバキュロウイルスを常法を使用して構築した。ｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓを含有しているバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞に感染させ、４８時間後に採取し、液体窒素で凍結した。溶菌バッファ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、２０ｍＭのイミダゾール、１ＭのＮａＣｌ、０．５％のｎ−ドデシル−マルトシド、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビターの標準カクテルを含有している１ｍＭの２−メルカプト−エタノール）に入れた細胞を氷上で解凍し、音波処理によって溶解した。溶解液を４℃、１７，７００ｇで３０分間過流させ、上清を溶菌バッファで平衡させたＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂（Ｑｕｉａｇｅｎ）に塗布した。０．５リットルの細胞あたり５００μｌの樹脂を使用した。樹脂を穏やかに撹拌しながら４℃で１時間インキュベートし、４℃、４００ｇで１５分間遠心し、樹脂を１０ｍｌのＢｉｏｒａｄ使い捨てカラムに移した。４０カラム容量の平衡バッファでカラムを洗浄し、２カラム容量の溶出バッファ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、２５０ｍＭのイミダゾール、１ＭのＮａＣｌ、０．５％のｎ−ドデシル−マルトシド、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビターの標準カクテルを含有している１ｍＭの２−メルカプト−エタノール）を添加することによって結合材料を溶出させた。各溶出画分でｈｓＦＡＴＰ５が主要バンドであり、Ｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）染色によって判定すると約７０％純度であった。主要バンドがｈｓＦＡＴＰ５に一致することはトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析及びＮ−末端マイクロ配列決定によって確認された。溶出した材料を−２０℃で保存した。ウェスタンブロット分析は、この方法を使用してＦＡＴＰ５を精製することはできるが流出画分中にも有意量のｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓが存在することを示した。
【０１３５】
Ｎ−末端ＧＳＴタグを含有しているヒトＦＡＴＰ５コーディング配列をｐＦａｓｔＢＡＣベクターに挿入し、ＧＳＴ−ｈｓＦＡＴＰ５を発現するバキュロウイルスを常法を使用して構築した。ｈｓＧＳＴ−ＦＡＴＰ５を含有しているバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞に感染させ、４８時間後に採取し、液体窒素で凍結した。精製にグルタチオンセファロース４Ｂ樹脂を使用しタンパク質をグルタチオン溶出バッファ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、５０ｍＭのグルタチオン、１ＭのＮａＣｌ、０．５％のｎ−ドデシル−マルトシド、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビターの標準カクテルを含有している１ｍＭの２−メルカプト−エタノール）で溶出させた以外はｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓに関して上述した手順と同様の手順で細胞を解凍し、タンパク質を精製した。
【０１３６】
ＦＡＴＰ５ アシル−ＣｏＡリガーゼ活性は当業界で公知の方法のいずれかによって測定できる。粗アッセイ、マラカイトグリーンアッセイまたは質量分析法を使用する酵素活性定量法などが代表例である。
【０１３７】
粗アシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイ
ＫｅｌｌｙとＶｅｓｓｅｙの修正方法（（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３０４：９４５−９４９）を使用してアシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイを行った。５０μｇの未精製上清または２μｇのカラム精製材料を０．５ｍＬの容量中、１００ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、１０μＭのＣｏＡ、１０μＭのコレート、１５ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰと共に３０℃でインキュベートした。０．０５ｍＬの０．１ＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５及び０．２ｍＬの６０ｍＭのコハク酸を加えて反応を停止させた。未反応のコレートをドール試薬（イソプロピルアルコール、ヘプタン、１ＭのＨ２ＳＯ４；容量比４０：１０：１）で抽出した。激しく撹拌した後、遠心によってタンパク質を除去し、６５０μｌの上清を、３５０μｌのヘプタンと１９０μｌの４００ｎＭのＭｏｐｓ−ＮＡＯＨ（ｐＨ６．５）含有溶液で抽出した。下部相（水相）を４００μｌのヘプタンで３回洗浄し、この画分中の放射能をシンチレーションカウンターで測定した。活性をタンパク質１ｍｇあたりのｐｍｏｌ／分として表した。
【０１３８】
マラカイトグリーンアシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイ
ＦＡＴＰ５活性はまたマラカイトグリーンを検出手段として使用する方法によって測定できる。反応ミックスは、以下の成分を含有している：５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．５、６０μＭの胆汁／脂肪酸、５０μＭの補酵素Ａ、０．６２５Ｕ／ｍｌの無機ピロホスファターゼ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１２０μＭのＡＴＰ、及び、ＦＡＴＰ５未精製膜調製またはカラム精製から得られた２μｇの全タンパク質。ＥＤＴＡ（最終濃度０．１Ｍ）で反応を停止させ、ホスフェート検出のために５０μｌのマラカイトグリーン溶液（０．４５ｇのマラカイトグリーン、７グラムのモリブデン酸アンモニウム、１．３３ＮのＨＣｌ、１Ｌの最終容量）を添加した。マラカイトグリーン添加の３０分後にＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ３８４プレートリーダーで６１０ｎｍの吸光度を測定する。
【０１３９】
ＬＣ／ＭＳを使用するアシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイ
さらにまた、ＦＡＴＰ５酵素活性は、Ｉｋｅｇａｗａら（（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６；１２５−１３２）によって開発されたＬＣ／ＭＳアッセイの修正バージョンを使用する生成物アシル−ＣｏＡの直接検出によって測定できる。胆汁酸基質としてコレート及びケノデオキシコレートを使用するＦＡＴＰ５のＬＣ／ＭＳアッセイを以下に説明する。基質として脂肪酸も使用した。
【０１４０】
反応ミックスは、以下の成分を含有している：５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．５、６０μＭの胆汁酸（または脂肪酸）、５０μＭの補酵素Ａ、１ｍＭのＤＴＴ、０．４２Ｕ／ｍｌの無機ピロホスファターゼ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１２０μＭのＡＴＰ、及び、ＦＡＴＰ５精製（上述）から得られた２μｇの全タンパク質。反応は基質の添加によって開始し、酢酸（最終濃度＝０．６３％）によって停止する。停止した反応混合物（５０μＬ）を、シングル四重複質量分析計（Ｇ１９４６Ｄ ＳＬモード）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステムに注入する。５−９５％アセトニトリル勾配（有機相またはＢ相）に０．５ｍＬ／分の流速で１８分間流す（水相またはＡ相は１０ｍＭの酢酸アンモニウム）。総処理時間は２０分で、１分間の初期平衡時間と勾配終了後の１分間の平衡時間とを含む。以下の質量対電荷比をＳＩＭ（ｓｉｎｇｌｅ ｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードでモニターする：コレート（４０７．６）コリル−ＣｏＡ（１１５６．５，５７７．５）、ケノデオキシコレート（１１４１，５６９）及びＣｏＡ（７６６）。
【０１４１】
ＦＡＴＰ５未精製膜調製から得られた材料は０．０６μＭ／分のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を示したが、精製タンパク質画分は０．０９μＭ／分のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を示した。対照的に、非類縁タンパク質を発現している昆虫細胞から得られた材料は精製画分中でいかなる活性も示さなかった。これらのデータは、ＣｏＡリガーゼ活性がＦＡＴＰ５タンパク質と関連している証拠を提供しＦＡＴＰ５タンパク質機能を検定するために使用できるであろう。
【０１４２】
本文中に記載のアッセイまたはアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を評価する当業界で公知の他の類縁アッセイは、ＦＡＴＰ５インヒビター候補化合物の高スループットスクリーニングに対応するように修正できる。
【実施例１２】
【０１４３】
胆汁酸または脂肪酸の取込みを変調する物質のスクリーニング
ｐＩＲＥＳ−ｍＦＡＴＰ５ベクターを安定にトランスフェクトしたヒト胚性腎２９３細胞を培養し、ＤＭＥＭ基礎培地に移した。ウェルあたり８×１０４細胞を９６−ウェルのマイクロタイタープレートで平板培養し、洗浄バッファ（１×のハンクス基礎塩類溶液中に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４．２ｍＭのＮａＨＣＯ３）で洗浄した。次に洗浄バッファ中の１ｍＭのタウロコレート中のインヒビターを３７℃で細胞に添加する。５ｍＭの最終濃度のＢＯＤＩＰＹ−脂肪酸（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−ドデカン酸）を添加することによって取込みアッセイを開始する。取込みアッセイを１５−６０分間維持し、洗浄バッファ中の０．１％ウシ血清アルブミンで洗浄することによって停止させる。次に、細胞によって取込まれたＢＯＤＩＰＹ−脂肪酸の量を、洗浄後の細胞の蛍光を測定することによって定量する（励起＝４５０ｎｍ、発光＝５３０ｎｍ）。取込みの阻害をインヒビター濃度の関数として示すグラフを作成し、等式（Ｙ＝ｍａｘ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０Ａ（ｌｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））に適合させることによってインヒビターのＩＣ５０値を計算する。
【０１４４】
本発明をその好ましい実施態様に基づいて詳細に表示及び記述したが、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく形態及び細部の多様な変更が可能であることは当業者には理解されよう。
【技術分野】
【０００１】
肥満は最も普遍的な体重障害であり、西欧世界の中年人口の３０−５０％が罹っていると推定されている。肥満は、３０ｋｇ／ｍ２以上のボディ・マス指数（ＢＭＩ）として定義されており、冠状動脈疾患、高血圧、卒中、糖尿病、高脂血症及びある種の癌のような疾病の一因となる。（例えば、Ｎｉｓｈｉｎａ，Ｐ．Ｍ．ら（１９９４），Ｍｅｔａｂ．４３：５５４−５５８；Ｇｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．＆ Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｊ．Ｐ．（１９９０），Ｄｉｓ．Ｍｏｎ．３６：６４１-７３１参照）。肥満は、複雑な多因性慢性疾患であり、遺伝子型と環境との相互作用によって発症し、また、社会的、行動的、文化的、生理的、代謝的及び遺伝的な様々の要因が関与する。
【０００２】
インスリン非依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）即ち２型糖尿病は全世界で最も多い代謝障害である。米国では毎日１７００名の新しい糖尿病患者が診断され、千六百万人の米国人糖尿病患者の少なくとも三分の一は病気に気付いていない。糖尿病は、成人を失明、腎不全及び下肢切断に至らせる有力な原因であり、また、心血管疾患及び卒中の最大の危険要因である。２型糖尿病は、インスリン抵抗性と、絶対的でなく相対的なインスリン不足とが共存することを特徴とする糖尿病の形態である。インスリン抵抗性は、有効な生物活性を発揮するインスリンの能力がある濃度範囲で低下を示すことであると定義される。２型糖尿病に罹患した個体間では２つの欠陥の各々の程度にかなりの違いがあり、主としてインスリン抵抗性を示すがインスリン不足は最小である個体から、主としてインスリン不足を示すがインスリン抵抗性は最小である個体まで症状は多岐にわたる。
【０００３】
正常なグルコースホメオスタシスを維持するためには、血中グルコースレベルの僅かな変化に応じた膵臓ベータ細胞によるインスリンの分泌がグルカゴンのようなカウンター調節ホルモンの分泌と微妙なバランスを保つように精巧に調和した調節が行われる必要がある。インスリンの基本的な作用の１つは、血液から組織特に筋肉及び脂肪へのグルコースの取込みを刺激することである。糖尿病患者の９０％以上が２型即ちインスリン非依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）であり、その特徴は、（１）末梢組織、特に骨格筋及び脂肪細胞へのグルコース取込みを促すインスリン作用に対する抵抗性、（２）肝のグルコース産生を阻害するインスリン作用の低下、及び、（３）インスリン分泌の調節不全、という３つの徴候を示すことである（ＤｅＦｒｏｎｚｏ，（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｖ．５：１７７−２６９）。大抵の患者の２型糖尿病は複雑な遺伝パターンをもつ多遺伝子性疾患である（Ｋａｈｎら、（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：５０９−５３１に概説）。
【０００４】
環境要因、特に、食事、身体活動及び年齢が遺伝的疾病素質と相互作用して罹病率を左右する。複数の研究は、インスリン抵抗性、肥満及び遊離脂肪酸の高い血漿レベルの並存が２型糖尿病を発症する“危険のある”個体及びこの疾患の臨床症状のある個体の双方に共通であることを示す（Ｂｏｄｅｎ，Ｇ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，１１１：２４１−２４８）。インスリン抵抗性及びインスリン分泌欠陥の双方に対する罹患率は遺伝的に決定されていると考えられる（Ｋａｈｎ，ら）。インスリン作用の欠陥は明白な疾患の前兆であり、糖尿病患者の非糖尿病近親者に観察される。従って、２型糖尿病の発症及び病理にこれらの要因が果たす役割を理解することは極めて有用であろう。熱心な究明調査にもかかわらず２型糖尿病の普遍的形態の原因となる遺伝子はいまだ未知である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は少なくとも部分的に、ＦＡＴＰ５欠損トランスジェニック動物が食事誘発肥満及びインスリン抵抗性を防御できるという知見に基づく。しかも、ＦＡＴＰ５欠損動物は絶好の血漿脂質プロフィルを示す。従って本発明は、ＦＡＴＰ５関連障害、例えば代謝障害（例えば、肥満、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、異常脂血症）、心血管障害（例えば、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中）、及び、脂肪肝疾患を変調できる化合物の同定方法を提供する。提供された方法は、ＦＡＴＰ５核酸発現、または、酵素活性や脂肪酸もしくは胆汁酸取込み活性などのＦＡＴＰ５ポリペプチド活性を変調する化合物の能力を検定する段階を含む。更に、ＦＡＴＰ５ポリペプチド活性を変調し、これによってＦＡＴＰ５介在性細胞プロセス及び障害に作用する方法が提供される。
【０００６】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【０００７】
別の実施態様は、上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。
いくつかの実施態様では、モニターしたＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、異常脂血症、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、及び／または、血漿脂質組成の１つまたは複数から選択される。
【０００８】
本発明で提供された方法全体を通じて、いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５活性をアシル−ＣｏＡリガーゼ活性として定義する。別の実施態様ではＦＡＴＰ５活性が胆汁アシル−ＣｏＡリガーゼ活性である。方法は、ホスフェート、アシルＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を測定することによってアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を定量できる実施態様を含む。追加の実施態様は、補酵素Ａ、ＡＴＰまたは脂肪酸／胆汁酸の消費量を測定することによってアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を定量できるという側面を含む。
【０００９】
別の実施態様では、本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ここでは、化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、異常脂血症、血漿脂質組成及び／または胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、の１つまたは複数から選択される。
【００１０】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸／胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡリガーゼもしくは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性、のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００１１】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪酸または胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪酸または胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用し得る候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性代謝障害は、体重障害（例えば、肥満）、インスリン抵抗性障害（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、心血管障害（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）、及び、脂肪肝疾患（脂肪症）のいずれかであり得る。
【００１２】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの活性（例えば、アシル−ＣｏＡリガーゼ、胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性）を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００１３】
別の実施態様は、上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５活性（例えば、アシルＣｏＡリガーゼ活性、胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性）を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性体重プロセスを変調したか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、モニターしたＦＡＴＰ５介在性体重プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、異常脂血症、血漿脂質組成、及び／または、胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、の１つまたは複数から選択される。
【００１４】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するとして同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性体重プロセスを変調するか否かを判定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物がＦＡＴＰ５介在性体重プロセスを変調したときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性体重プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、及び／または、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、の１つまたは複数から選択される。
【００１５】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性体重障害は例えば肥満を含む。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸／胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性、のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００１６】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性体重障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性体重障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性体重障害は例えば肥満である。
【００１７】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性インスリン抵抗性障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。この方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性インスリン抵抗性障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性インスリン抵抗性障害は例えば２型糖尿病を含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００１８】
別の実施態様は、上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がインスリン抵抗性を変調するか否かを判定する段階と、次いで、インスリン抵抗性を変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、インスリン抵抗性が、全身もしくは組織のグルコース取込み、肝グルコース産出、血中グルコースレベル、または、血中インスリンレベルを検出することによってモニターできる。
【００１９】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がインスリン抵抗性障害を変調するか否かを判定する段階とを含む、インスリン抵抗性を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物がインスリン抵抗性を変調したときに被験化合物をインスリン抵抗性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用したインスリン抵抗性障害はインスリン抵抗性及び２型糖尿病を含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、インスリン抵抗性が、全身もしくは組織のグルコース取込み、肝グルコース産出、血中グルコースレベル、または、血中インスリンレベル、のいずれか１つまたは複数を検出することによって測定できる。
【００２０】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をインスリン抵抗性障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、インスリン抵抗性障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。インスリン抵抗性障害は例えば２型糖尿病を含む。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００２１】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をインスリン抵抗性障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、インスリン抵抗性障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。インスリン抵抗性障害は例えば２型糖尿病を含む。
【００２２】
１つの実施態様では本発明は、化合物が異常脂血症を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのリガーゼ活性（例えば、アシル−ＣｏＡリガーゼ、胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性）が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのリガーゼ活性（例えば、アシル−ＣｏＡリガーゼ、胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性）とは異なっているときに被験化合物を異常脂血症の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用した異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベルを含む。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００２３】
別の実施態様は上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡリガーゼ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物が異常脂血症を変調するか否かを判定する段階と、次いで、異常脂血症を変調する被験化合物を異常脂血症を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。いくつかの実施態様では、異常脂血症が、遊離脂肪酸レベル、血清トリグリセリドレベル、及び／または、血漿脂質組成を定量することによってモニターできる。
【００２４】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物が異常脂血症を変調するか否かを判定する段階とを含む、異常脂血症を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物が異常脂血症を変調するときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用した異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、血漿脂質組成の変質を含み得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、異常脂血症が、脂肪酸／胆汁酸取込み、遊離脂肪酸、血清トリグリセリド、及び／または、血漿脂質組成、の１つまたは複数を測定することによって判定できる。
【００２５】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドとは異なっているときに被験化合物を異常脂血症の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、異常脂血症に有効な候補化合物の同定方法を提供する。異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル、及び、血漿脂質組成の変質を含み得る。いくつかの実施態様ではＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００２６】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物を異常脂血症の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、異常脂血症を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。異常脂血症は例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル、及び、血清脂質組成の変質を含む。
【００２７】
１つの実施態様で本発明は、化合物がＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定する方法を提供する。方法は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階と、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。
【００２８】
別の実施態様は上記方法を含み、更に、上述の方法でＦＡＴＰ５アシルＣｏＡ／胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階とを含む。
いくつかの実施態様では、モニターしたＦＡＴＰ５介在性プロセスが、インスリン抵抗性、グルコース取込み、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、異常脂血症、血漿脂質組成、及び／または、胆汁、糞便、尿もしくは血漿中の胆汁酸組成、の１つまたは複数から選択される。
【００２９】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、次いで、ＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。このようにして、化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調したときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する。本文中に使用したＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、膜調製物、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する組織、または、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドであればよい。追加の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、脂肪酸取込み、胆汁酸取込み、異常脂血症、及び／または、血漿脂質組成、の１つまたは複数から選択される。
【００３０】
別の実施態様で本発明は、被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、次いで、化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調するために有用な候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み、または、アシル−ＣｏＡリガーゼまたは胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性、のいずれか１つまたは複数をモニターすることによって測定できる。
【００３１】
また別の実施態様は、被験化合物及び脂肪／胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞とを合せる段階と、試験細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みを測定する段階と、化合物の存在下の細胞中の脂肪／胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の脂肪／胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性心血管障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階とを含む、ＦＡＴＰ５介在性心血管障害を変調し得る候補化合物の同定方法を提供する。ＦＡＴＰ５介在性心血管障害は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患のいずれかであり得る。
【００３２】
本文中に記載した知見は、ＦＡＴＰ５活性の阻害が２型真性糖尿病の特徴であるインスリン抵抗性の軽減に導くこと、従ってＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸の取込みを阻害する物質はインスリン抵抗性を軽減するために有用であることを証明する。さらにまた、ＦＡＴＰ５欠損動物は絶好の血漿脂質プロフィルを示し、これは、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸の取込みを阻害する物質が血漿脂質プロフィルの改善に役立つことを示唆する。従って本発明は、ＦＡＴＰ５関連障害、例えば、代謝障害（例えば、肥満、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、異常脂血症）、心血管障害（例えば、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中）、及び、脂肪肝疾患を変調できる化合物の使用方法を提供する。
【００３３】
１つの実施態様で本発明は、有効量のＦＡＴＰ５活性阻害物質を個体に投与する段階を含む、個体のＦＡＴＰ５介在性代謝障害の治療方法を提供する。いくつかの実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性（例えば、２型糖尿病）、異常脂血症（例えば、高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル）、脂肪肝疾患、及び、心血管疾患（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、虚血性心疾患）である。
【００３４】
また別の実施態様で本発明は、ＦＡＴＰ５遺伝子が不活化されたヒト以外の遺伝子操作哺乳動物を提供する。
１つの実施態様では、遺伝子操作されたトランスジェニック動物がマウスまたはラットである。
本発明の追加の特徴及び利点は以下の記載、実施例及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３５】
本発明は少なくとも部分的に、ＦＡＴＰ５欠損トランスジェニック動物が食事誘発肥満及びインスリン抵抗性を防御できるという知見に基づく。しかも、ＦＡＴＰ５欠損動物は、絶好の血漿脂質プロフィルを示す。従って本発明は、ＦＡＴＰ５関連障害、例えば代謝障害（例えば、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症）、心血管障害（例えば、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中）、及び、脂肪肝疾患（例えば、脂肪症）を変調できる化合物の同定方法を提供する。提供された方法は、ＦＡＴＰ５核酸発現、または、酵素活性や脂肪酸／胆汁酸取込み活性などのＦＡＴＰ５ポリペプチド活性を変調する化合物の能力を検定する段階を含む。更に、本発明を使用して同定された化合物を利用し、これによってＦＡＴＰ５介在性細胞プロセスまたは障害を変調する方法が提供される。
【００３６】
多数のＦＡＴＰ５遺伝子の構造及びコーディング配列が報告されている。例えば、Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＪＥら、Ｃｅｌｌ．７９：４２７−４３６（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４７：２５５−２６０（１９９８）；Ｈｉｒｓｃｈ，Ｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９５：８６２５−８６２９（１９９８）；及び、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０２１７９５及びＷＯ９９／０３６５３７参照。マウス及びヒトの配列はそれぞれ受託番号ＮＭ ０１２２５４及びＮＭ ００９５１２でＧｅｎｅＢａｎｋに報告されている。また、遺伝子及びタンパク質の配列はそれぞれ配列１及び配列２と配列３及び配列４で記述されている。
【００３７】
ＦＡＴＰ５は、脂肪酸輸送体及びアシルＣｏＡシンテターゼとして同定されたタンパク質ファミリーの１つである。例えば、Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＪＥら、Ｃｅｌｌ．７９：４２７−４３６（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４７：２５５−２６０（１９９８）；Ｈｉｒｓｃｈ，ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９５：８６２５−８６２９（１９９８）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０２１７９５及びＷＯ９９／０３６５３７；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．５８：３２−４２（１９９９）参照。ノーザン分析による検出で、ＦＡＴＰ５が肝組織で特異的に発現され、肝細胞に特異的に局在することが知見された。ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０２１７９５参照。さらにまた、ＦＡＴＰ５が胆汁酸ＣｏＡリガーゼであり、胆汁酸の再循環に関与することが知見された。例えば、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：１５６０５−１５６０８（２０００）及びＭｉｈａｌｉｋら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２８７６５−２８７７３（２００２）参照。マウスの遺伝子及びタンパク質の配列はそれぞれ配列１及び配列２で記述されており、ヒトの遺伝子及びタンパク質の配列はそれぞれ配列３及び配列４で記述されている。本発明における我々の知見は意外にも、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病のような代謝障害、及び、異常な血清脂質プロフィルを含む心血管障害に関与する介在プロセスに肝特異的ＦＡＴＰ５脂肪酸／胆汁酸ＣｏＡリガーゼの活性が関与していることを証明する。
【００３８】
本文中で使用した“遺伝子”という用語は、単一タンパク質（例えば、ポリペプチド鎖）の合成に必要な遺伝情報（例えば核酸配列）をコードしているＤＮＡ配列を意味する。アミノ酸配列を直接的にコードする配列である“コーディング配列”に加えて、遺伝子はまた、必須の非コーデイングエレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、及び、必須でないフランキング配列とイントロン配列を含む。“ＦＡＴＰ５遺伝子”という用語は、ＦＡＴＰ５タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含む特定の哺乳動物遺伝子を意味する。本発明で提供された方法はこれまでに記述されている既知のＦＡＴＰ５配列を利用している。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ ０１２２５４及びＮＭ ００９５１２参照。当業者に理解されるように、遺伝子配列は１つの集団の個体間で異なる“部位”（配列位置）を含むことができる。従って、遺伝子の配列変異が許容される。各変異配列は、遺伝子の“対立遺伝子”と呼ばれる。典型的には、特定配列、通常は機能的タンパク質をコードしている配列を基準配列、または、“野生型”配列とする。“野生型”という用語は、基準対立遺伝子、典型的には機能的タンパク質をコードしている対立遺伝子または健康な個体に存在する対立遺伝子を含意する記述語である。野生型配列とは異なる対立遺伝子を“対立変異体”と呼ぶ。相同染色体は、減数分裂中に対を形成し実質的に同一の遺伝子座を含有する染色体である。“遺伝子座”という用語は、染色体上の遺伝子の部位（例えば、ロケーション）を含意する。
【００３９】
トランスジェニックＦＡＴＰ５動物
本発明は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ヒト以外の霊長類、マウスまたはラットのような齧歯類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、ウサギまたはヤギの“ノックアウト”またはトランスジェニック動物を提供する。本文中に使用した“ノックアウト”という用語は、特定の遺伝子が破壊されるかまたは欠失しその結果として該遺伝子の発現が全く生じないかまたは低下レベルで生じるようなゲノムを有している遺伝的に修飾された生物を意味する。特定実施態様では、ヒト以外の哺乳類のノックアウト動物が齧歯類、例えばマウスまたはラットである。例えば、ＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物では、内在ＦＡＴＰ５遺伝子が破壊されており、その結果として該哺乳動物の機能的ＦＡＴＰ５タンパク質は欠如しているかまたはそのレベルが低下している。特定実施態様では、ヒト以外のノックアウト哺乳動物が、機能的ＦＡＴＰ５遺伝子産物の欠如またはＦＡＴＰ５４遺伝子産物のレベル低下を示すマウスである。本文中ではトランスジェニックマウスを“トランスジェニックＦＡＴＰ５ノックアウトマウス”または“ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス”と呼ぶ。特定実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのゲノムが、内在ＦＡＴＰ５遺伝子に対して少なくとも１つの非機能的対立遺伝子を含む。従って本発明は、ときには“野生型”と呼ばれる機能的標準ＦＡＴＰ５対立遺伝子をそのゲノムに含む完全無欠動物のＦＡＴＰ５の機能を解明するために役立つ細胞（例えば、組織、細胞、細胞抽出物、オルガネラ）及び動物のソースを提供する。本文中に記載のＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物を作製するために適当な哺乳動物のいずれかを使用できる。例えば適当な哺乳動物はヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、マウス（マウス類）、ラット、ウサギまたはブタでよい。
【００４０】
我々は、機能的ＦＡＴＰ５の欠如したマウス類の作製、このようなマウス類の使用方法、このようなマウス類に由来の細胞の使用方法、ＦＡＴＰ５活性が欠如または部分的に欠如している細胞の使用方法、及び、ＦＡＴＰ５活性を変調する物質をｉｎ ｖｉｔｒｏに同定または評価する方法を記載する。
【００４１】
本文中に使用した“破壊”、“機能不活化”、“変質”及び“欠陥”という用語は、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの一種類の細胞、選択された細胞または全部の細胞の内在遺伝子によってコードされているＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現及び／または機能の部分的または全面的低下を含意する。従って本発明によれば、選択された細胞グループ（例えば、組織または器官）または完全動物の体内でＦＡＴＰ５遺伝子産物の発現または機能を全面的または部分的に破壊または低減（例えば、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上低減）することができる。本文中で使用した“機能的に破壊されたＦＡＴＰ５遺伝子”という用語は、いかなるポリペプチド産物も発現できないかまたは野生型タンパク質の完全アミノ酸ポリペプチド鎖よりも短い切欠タンパク質を発現し、非機能的（部分的にまたは全面的に非機能的）である修飾ＦＡＴＰ５遺伝子を包含する。
【００４２】
ＦＡＴＰ５遺伝子の破壊は、当業者に公知の多様な方法によって行うことができる。ＦＡＴＰ５遺伝子を破壊するために例えば、相同的組換えを使用する遺伝子ターゲティング、突然変異誘発（例えば、点突然変異）、ＲＮＡ干渉及びアンチセンステクノロジイを使用できる。
【００４３】
より具体的には本発明は、そのＦＡＴＰ５遺伝子のホモ接合またはヘテロ接合の破壊をゲノムに含むノックアウト哺乳動物、例えば、マウスを提供する。ゲノムにホモ接合破壊を含むノックアウト哺乳動物の特徴は、その体細胞及び胚細胞がＦＡＴＰ５遺伝子の２つの非機能的（破壊された）対立遺伝子を含むことであり、ゲノムにヘテロ接合破壊を含むノックアウト哺乳動物の特徴は、その体細胞及び胚細胞がＦＡＴＰ５遺伝子の１つの野生型対立遺伝子と１つの非機能的対立遺伝子とを含むことである。
【００４４】
本文中で使用した“遺伝子型”という用語は、動物の遺伝子組成（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｋｅｕｐ）を意味する。個々の遺伝子型は、１つまたは複数の特定の遺伝子、例えばＦＡＴＰ５を表す。より詳細には、遺伝子型という用語は、動物のＦＡＴＰ５対立遺伝子の状態、即ち、対立遺伝子が完全無欠で機能的であること（例えば、野生型または＋／＋）、または、ヘテロ接合型（＋／−）もしくはホモ接合型（−／−）のノックアウト遺伝子型を与えるように破壊されていること（例えば、ノックアウト）を表す。
【００４５】
本発明はまた、機能的ＦＡＴＰ５遺伝子の欠如したヒト以外の哺乳動物の産生方法を提供する。簡単に説明すると、ノックアウト胚の標準的な産生方法では、ターゲットとした遺伝子の内在核酸配列との相同的組換えによって適当な胚性幹（ＥＳ）細胞に組込まれるように設計されたターゲティング構築物の導入が必要である。次に、ＥＳ細胞を相同的組換え（即ち、ターゲティング構築物の組換え核酸配列と宿主細胞染色体のゲノム核酸配列との組換え）が可能な条件下で培養する。組換え対立遺伝子を含むノックアウト遺伝子型を有していると同定された遺伝子操作幹細胞を当業界で公知の標準技術を使用して（例えば、遺伝子操作胚性幹（ＥＳ）細胞を未分化胎細胞にマイクロインジェクションする方法によって）胚形成期の動物またはその親に導入する。次に、得られたキメラ未分化胎細胞を偽妊娠仮母親の子宮に入れて生存可能な子を発生させる。得られた生存可能な子のうちには、その体細胞及び胚細胞系列組織に遺伝子操作ＥＳ細胞とレシピエントの未分化胎細胞とに由来の細胞混合物を含む潜在的にキメラ創始動物が含まれている。得られたキメラマウスの胚細胞系列に遺伝子変質ＥＳ細胞が与えられると、破壊されたターゲット遺伝子を含む変質ＥＳ細胞ゲノムがこれらの創始動物の後代に伝達され、これによって、ターゲット遺伝子中に特定の欠陥を含むように遺伝子操作された遺伝子をゲノムに含む“ノックアウト動物”が容易に産生される。
【００４６】
ＦＡＴＰ５遺伝子はいくつかの異なる方法で破壊されることができ、これらの方法のいずれかを本発明のＦＡＴＰ５ノックアウト動物の産生に使用できることは当業者に容易に理解されよう。例えば、遺伝子ターゲティングの方法によって本発明のノックアウトマウスを産生できる。本文中で使用した“遺伝子ターゲティング”という用語は、変質（例えば、破壊）のターゲットとしたゲノム遺伝子座の核酸配列の対応部分に配置されて組換えられることによって内在遺伝子に計画的変質を付与し得る外来組換え核酸配列を導入するように設計されたターゲティング構築物（例えば、ベクター）を哺乳類細胞（例えば、ＥＳ細胞）に導入した結果として生じる相同的組換えの一種を意味する。
【００４７】
すなわち、相同的組換えは、特定のＤＮＡ配列が遺伝子操作外来配列によって置換されるプロセス（例えば、方法）である。より詳細には、トランスジェニック破壊のターゲット遺伝子の内在ヌクレオチド配列に相同的または相補的になるように遺伝子操作されたターゲティングベクターの領域が互いに結集するかまたは組換えられ、その結果としてターゲティングベクターのヌクレオチド配列が内在遺伝子の対応部分に取込まれる（例えば組込まれる）。
【００４８】
本発明の１つの実施態様は、野生型（内在）ＦＡＴＰ５遺伝子の機能を破壊するように設計されたベクター構築物（例えば、ＦＡＴＰ５ターゲティングベクターまたはＦＡＴＰ５ターゲティング構築物）を提供する。一般的に言えば、有効なＦＡＴＰ５ターゲティングベクターは、内在ＦＡＴＰ５遺伝子との相同的組換えに有効な組換え配列を含む。例えば、選択可能マーカー遺伝子をコードしている第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたターゲット配列に相同のゲノムヌクレオチド配列を含む置換ターゲティングベクターは有効なターゲティングベクターの代表例である。相同的組換えの結果として宿主細胞（例えば、胚性幹細胞）の染色体ＤＮＡにターゲティング配列が組込まれると、内在遺伝子例えばＦＡＴＰ５遺伝子のターゲット配列に計画的な破壊、欠陥または変質（例えば、挿入、欠失または置換）が導入される。本発明の１つの特徴は、ＦＡＴＰ５ポリペプチドをコードしているヒト以外の哺乳動物の遺伝子のヌクレオチド配列の全部または一部を置換し、これによってトランスジェニックＦＡＴＰ５ノックアウトを作製することである。
【００４９】
ＦＡＴＰ５ターゲティングベクターを構築するためには、破壊対象として予め選択した特定部位で相同的組換えを促進するような適正な長さ及び組成をもつＦＡＴＰ５ゲノムヌクレオチド配列を使用すればよいことが当業者には理解されよう。配列の選択及び使用の指針は例えば、Ｄｅｎｇ，Ｃ．＆ Ｃａｐｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３３６５−３３７１、及び、Ｂｏｌｌａｇ，Ｒ．ら、１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１９９−２２５に記載されている。例えば、ＦＡＴＰ５遺伝子の遺伝子座の全部または一部に組換え核酸配列（例えば、ＦＡＴＰ５ターゲティング構築物またはベクター）を挿入することによって野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を突然変異させるか及び／または破壊することができる。ターゲティング構築物は例えば、ＦＡＴＰ５遺伝子のエンハンサー、プロモーター、コーディング領域、開始コドン、非コーディング配列、イントロンまたはエキソンの内部の特定部分と組換えられるように設計できる。あるいは、ターゲティング構築物が、ＦＡＴＰ５遺伝子のエキソンの後方に停止コドンを導入するように設計された組換え核酸を含むこともできる。
【００５０】
本発明の適当なターゲティング構築物は、当業者に公知の標準的分子生物学技術を使用して調製できる。例えば、適当なベクターの調製に有用な技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；によって記載されている。この文献の開示は参照によって本発明に含まれるものとする。適正なベクターは、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，１９８９，３０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２８８−９２によって記載された挿入ベクターのような置換ベクター、または、Ｂｒａｄｌｅｙ，ら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），１０：５３４−５３９；及びＡｓｋｅｗ，Ｇ．ら、１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：４１１５−４１２４によって記載されたプロモータートラップ戦略またはポリアデニル化トラップ、または、“タグ−アンド−エクスチェンジ”戦略に基づくベクターを含む。これらの文献の開示は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００５１】
当業界で公知の多数の適正ベクターを適当なターゲティングベクターの基材として使用できることが当業者には理解されよう。実際、相同的組換えを指示しかつターゲット遺伝子を破壊するために必要な組換え核酸配列を収容する能力を有しているいかなるベクターも使用できる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹ１６４、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ８、ｐＫＧ、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ１０１またはその他のプラスミドベクターを使用できる。あるいは、ラムダｇｔ１１ベクター系のようなウイルスベクターはターゲティング構築物の主鎖（例えば、カセット）を提供できる。
【００５２】
当業者に公知の技術によれば、遺伝子操作された（例えば、電気穿孔法によってトランスフェクトされたかまたは感染によって形質転換された）胚性幹細胞をヒト以外のトランスジェニックノックアウト胚を産生するための常套手段として使用できる。胚性幹（ＥＳ）細胞は哺乳類の未分化胎細胞の内部細胞塊から単離された多能性細胞である。ＥＳ細胞は、未分化状態で適正培養条件下にｉｎ ｖｉｔｒｏ培養でき、未分化胎細胞と組換えられて偽妊娠仮母親の子宮に導入された結果として正常なｉｎ ｖｉｖｏ発生及び分化を再開する能力を維持できる。
【００５３】
多様な幹細胞が当業界で公知であり、例えば、ＡＢ−１、ＨＭ−１、Ｄ３．ＣＣ１．２、Ｅ−１４Ｔ６２ａ、ＲＷ４またはＪＩなどがあることは当業者に容易に理解されよう（Ｔｅｒａｔｏｍａｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）。
【００５４】
本文中に記載のＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物が上述の胚性幹細胞方法以外の方法によって産生できること、例えば、１細胞または形質転換胚の前核に組換え遺伝子を前核注入することによって、または、トランスフェクトもしくは形質転換したＥＳ細胞の使用に依存しない別の遺伝子ターゲティング方法によって産生できること、また、上記に概説した１つの方法の例示はこのプロトコルによって産生した動物だけに本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００５５】
本発明に記載のＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物はまた、機能的ＦＡＴＰ５を天然にコードしておりかつ発現する内在遺伝子の少なくとも１つの非機能的対立遺伝子をゲノムに含む動物のコロニーを産生するために適正相手と交配（近親交配、異系交配または異種交配）することもできる。このような交配戦略の非限定例は、ホモ接合動物を産生するためのヘテロ接合ノックアウト動物の交雑；創始動物（例えば、ヘテロ接合またはホモ接合ノックアウト）と異常なインスリン及び／またはグルコースホメオスタシスを与える近交系遺伝背景を有しているマウスまたは糖尿病の動物モデルを提供するマウスとの異系交配、及び、創始動物と糖尿病及び／または肥満の高い罹患率に関連する遺伝子を超発現するように遺伝子操作した独立トランスジェニック動物との異種交配、などである。例えば、創始ノックアウトマウスを、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス及び／またはＡＹマウスと交配できる。
【００５６】
ＦＡＴＰ５ノックアウト哺乳動物、例えばマウスは、多様な目的に役立つ。１つの実施態様では、当業界で公知の技能を使用してＦＡＴＰ５ノックアウト細胞または細胞系を作製できる。例えば、内在ＦＡＴＰ５遺伝子を所有していないかまたは常態ではＦＡＴＰ５を発現しない細胞を操作してそれらが可能な細胞にすることができる。例えば、内在ＦＡＴＰ５遺伝子を所有していない細胞に外来ＦＡＴＰ５遺伝子を導入し、外来ＦＡＴＰ５遺伝子の存在によって細胞がＦＡＴＰ５を発現できるようにする。あるいは、常態ではサイレントなＦＡＴＰ５遺伝子を“ターンオン”するために、常態ではＦＡＴＰ５を発現しない細胞のゲノムに外来核酸をスプライスすることもできる。補佐物質は例えば、核酸分子、ポリペプチド、有機分子、無機分子、融合タンパク質などである。
【００５７】
その後に、操作された細胞中のＦＡＴＰ５遺伝子を、本文中に記載の方法や本発明の方法及び組成物に使用できる当業者に公知の方法を使用して破壊できる。
【００５８】
ＦＡＴＰ５遺伝子の破壊の結果として、本発明のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは特定の表現型を示し得る。表現型という用語は、特定の遺伝子型に帰因する生化学的または生理学的な結果を意味する。ノックアウトマウスを創製した場合に観察される表現型は、ノックアウトされた遺伝子が喪失した結果である。１つの実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスにおいてインスリン／グルコースホメオスタシス及び食餌誘発インスリン抵抗性に対する反応が変質している。ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは、高脂肪食を給餌した野生型マウスに比べてインスリン抵抗性が軽減している。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは、血清トリグリセリドレベル及び遊離脂肪酸レベルの低下を示す。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは脂肪過多症の減少を示す。より詳細には、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは、野生型対照マウスに比べて白色脂肪量の有意な減少を示す。この表現型は動物に高脂肪食を給餌したときに激化する。更に、ＦＡＴＰ５マウスは摂食量の減少とエネルギー消費量の増加とを示した。
【００５９】
本発明は、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのインスリン抵抗性が軽減しているという知見に基づく。インスリン抵抗性の軽減はグルコース代謝レベルを上昇させる。２型真性糖尿病の特徴はインスリン抵抗性及び低いグルコース代謝レベルであるから、本文中に記載した結果は、２型真性糖尿病や、これに付随する表現型、例えば、グルコース代謝低下、インスリン抵抗性及び脂肪酸蓄積の治療方法を可能にする。
【００６０】
別の実施態様では、本文中に記載した知見はまた、ＦＡＴＰ５活性阻害の結果として絶好の血漿脂質プロフィルが得られることを証明する。別の実施態様では本発明はまた、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスでは血清トリグリセリド及び遊離脂肪酸のレベルが低下しているという認知に基づく。従って、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸輸送を阻害する物質は、脂質及び／または遊離脂肪酸の増加が心血管疾患の因子であるような心血管疾患の治療に有効である。脂質及び／または遊離脂肪酸の増加に付随する心血管疾患は冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患などである。
【００６１】
本文中で言及した心臓に関する障害、即ち、“心血管疾患”または“心血管障害”は、心血管系、例えば、心臓、血管及び／または血液を冒す疾患または障害を含む。心血管障害は、動脈圧の平衡失調、心臓の機能不全または例えば血栓による血管の閉塞によって生じる。心血管疾患の非限定例は、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈炎症、冠状動脈の微小塞栓、頻脈、徐脈、圧力過負荷（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｖｅｒｌｏａｄ）、脈管性心疾患、うっ血性心不全、狭心症、心不全、高血圧、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、虚血性疾患及び不整脈などである。
【００６２】
別の側面によれば、本文中に記載の知見はまた、ＦＡＴＰ５活性阻害が脂肪過多症に有益な効果を有することを示す。また別の特徴によれば、本発明は、ＦＡＴＰ５活性の阻害によってエネルギー消費量を増加させることを提案する。本発明は、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスが野生型マウスに比べて白色脂肪量の有意な減少を示すという事実に基づく。更に、マウスに高脂肪食を給餌したときにＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの脂肪過多症の減少がいっそう顕著になる。別の実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは高脂肪に誘発される体重増加及び脂肪過多症を完全に防御する。別の実施態様では、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照に比べて摂食量の減少を示した。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べてエネルギー消費量の増加を示した。
【００６３】
アッセイ
本発明は、代謝障害、例えば、体重、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、例えば高い血清トリグリセリドレベル、高い遊離脂肪酸レベル、脂肪肝疾患、及び、心血管疾患、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧を治療できる化合物の同定方法を提供する。方法は、ＦＡＴＰ５の核酸発現またはＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調する化合物の能力を検定する段階を含む。いくつかの特徴によれば、ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調する化合物の能力はホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を検出することによって定量できる。追加の特徴によれば、ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡ活性を変調する化合物の能力は、補酵素Ａ、ＡＴＰまたは脂肪酸／胆汁酸の消費量を検出することによって定量できる。
【００６４】
さらに別の側面によれば、ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡ活性を変調する化合物の能力は、ＦＡＴＰ５介在性プロセスの変調を検出することによって判定できる。このようなプロセスとしては例えば、細胞プロセス（例えば、脂肪酸または胆汁酸の取込み）または身体プロセス（例えば、体重、体脂肪組成、エネルギー消費量または摂食行動、血中グルコースレベル、血清トリグリセリドレベル、血清遊離脂肪酸レベル、胆汁、血漿、尿もしくは糞便中の胆汁酸組成）がある。さらに別の実施態様では、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、障害（例えば、脂肪肝疾患、心血管疾患（例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患）、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症を包含し得る。
【００６５】
別の側面によれば本発明は、ＦＡＴＰ５機能を変調例えば亢進または抑制する物質（例えば、治療用物質）の同定方法、及び、ＦＡＴＰ５機能に関連した疾患または状態（例えば肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患）の治療方法を提供する。
【００６６】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込みを阻害すると、外来または内在インスリンに対する生物応答の低下を意味する“インスリン抵抗性”が有意に軽減されることが判明した。インスリン抵抗性は２型真性糖尿病の特徴であり、罹患個体からグルコース代謝能力を奪う。例えば、血流からのグルコースクリアランス及び細胞内へのグルコース取込みができなくなり、肝グルコース産生が亢進する。
【００６７】
ＦＡＴＰ５が脂肪酸及び胆汁酸の取込みを促進しまたアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を有していることは、酵素活性と観察された輸送活性とが関連していることを示唆する。しかしながら、酵素活性だけをより詳細に特性決定するために輸送の非存在下のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を測定することもできる。
【００６８】
従って、本文中に提示したデータは、ＦＡＴＰ５障害、例えば、体重、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中を治療するための治療ターゲット分子を同定する。ＦＡＴＰ５の阻害は修飾された脂肪酸及び／または胆汁酸の取込みとインスリン抵抗性とを抑制し、血清トリグリセリド及び遊離脂肪酸を減少させる。従って、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患の治療に使用するためのＦＡＴＰ５阻害物質を同定する方法も本発明の目的の一部である。
【００６９】
ＦＡＴＰ５活性、例えば、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸もしくは胆汁酸取込みまたはアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調または変質させる物質の同定は、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸もしくは胆汁酸取込み及び／またはＦＡＴＰ５アシル−ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階を含む。このような活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定できる。ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込み活性は例えば、アシル−ＣｏＡ−修飾脂肪酸または胆汁酸の細胞内蓄積レベル（本文中では量または率の双方を表す）；肝臓、胆汁、血漿、尿または糞便中の胆汁酸組成；血清トリグリセリドレベル；遊離脂肪酸レベル；血漿脂質組成；グルコース取込み；グルコースクリアランス；または肝グルコース産出を定量することによって測定できる。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性は例えば、アシル−ＣｏＡ−修飾脂肪酸またはアシル−ＣｏＡ−修飾胆汁酸の蓄積レベル；補酵素Ａ、ＡＴＰ、及び／または脂肪酸／胆汁酸の消費量；及び／またはホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を定量することによって測定できる（実施例参照）。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性の適当な定量方法は当業界で公知であり、本発明で提供された方法に適宜応用できる。例えば、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，ＳＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．２５７：６１５−６２１（１９９９）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，ＳＪら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．５８：３２−４２（１９９９）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，ＳＪら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１５６０５−１５６０８（２０００）参照。
【００７０】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込みはまた、コントロール食（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）を給餌したマウスの白色脂肪重量をモニターすることによって定量できる。実施例２に示すようにして体重及び脂肪過多症を測定する実験を行った。野生型マウスのグループとＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグループとを標準的な実験用コントロール食に６ヶ月間維持した。ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは野生型対照に比べて有意に少ない白色脂肪量を示した。このように白色脂肪量を測定することによって動物のＦＡＴＰ５活性を評価できる。
【００７１】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸または胆汁酸取込みはまた、高脂肪食に維持したマウスの体重、エネルギー消費量及び／または摂食量をモニターすることによって評価できる。実施例３及び４に示すようにして高脂肪食に維持したマウスの体重及び摂食量を測定する実験を行った。ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは同じ食餌に維持した野生型マウスよりも有意に少ない体重を示した。更にＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは野生型マウスよりも有意に少ない摂食量を示した。また、実施例５に示すように、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは野生型マウスよりも有意に多いエネルギー消費量を示した。このように高脂肪食に維持した動物の体重、エネルギー消費量及び／または摂食量を定量することによってマウスのＦＡＴＰ５活性を評価できる。
【００７２】
ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸取込みはまた、高脂肪食を給餌したマウスの全脂肪量をモニターすることによって評価できる。実施例４に示すようにして高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの脂肪量を測定する実験を行った。データは、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスが野生型マウスよりも有意に少ない脂肪量を有していたことを示す。従って本発明の別の目的は、高脂肪食に維持した動物の全脂肪量の定量によるＦＡＴＰ５活性の評価を提案することである。
別の特徴によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は遊離脂肪酸及び血清トリグリセリドのレベルの低下を示した。実施例６に示すようにして高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの遊離脂肪酸及び血清トリグリセリドのレベルを測定する実験を行った。次にマウスを一夜絶食させ、血清を採取した。結果は、遊離脂肪酸及びトリグリセリドの血清レベルについてはＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのほうが低い値を有していたことを示す。従って、追加の実施態様では、高脂肪食に維持した動物の遊離脂肪酸及びトリグリセリドの血清レベルをモニターすることによってＦＡＴＰ５活性を評価できる。
【００７３】
別の特徴によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は肝脂質の湿潤重量パーセントの減少を示す。実施例７に示すように、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスを高脂肪食に維持した。動物の肝臓を採取し、肝脂質の湿潤重量パーセントを測定した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて有意に低い肝脂質の湿潤重量パーセントを示した。このように、高脂肪食に維持した動物の肝脂質含量を測定することによって行うＦＡＴＰ５活性の別の評価方法が提供される。
【００７４】
また別の特徴によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物の表現型は食餌誘発インスリン抵抗性の防御として表れる。実施例５は、グルコースの腹腔内注射後のグルコースの消滅率を比較するために行った実験の結果を示す。グルコース消滅率は、野生型マウスとノックアウトマウスとの間のインスリン刺激全身グルコース取込み及びインスリン介在性肝グルコース産出抑制の割合を表す。インスリン抵抗性を誘発するために、野生型マウスのグループとＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグループとを高脂肪食に維持した。高脂肪食を給餌した野生型マウスではグルコースクリアランス能力が低下しておりインスリン抵抗性の進行を示したが、ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは脂質注入及び高脂肪食の効果を完全に防御し正常なグルコース消滅レベルを示しており、これはＦＡＴＰ５欠失によってインスリン抵抗性が防御されたことを示す。従って本発明の別の実施態様は、高脂肪食によって誘発されたインスリン抵抗性の防御を判定することによってＦＡＴＰ５活性を評価する方法を提供する。この判定は、グルコース負荷試験による測定を含む当業界で公知の方法を使用して行うことができる。
【００７５】
さらに別の特徴によれば、本発明は、新しい胆汁酸の生合成またはコレステロールの生合成と生合成プロセスに関与する遺伝子とをモニターすることによってＦＡＴＰ５活性を評価する方法を提供する。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物がコレステロール生合成、胆汁酸生合成に関与する遺伝子の正の調節及び糖新生に関与する遺伝子の負の調節を示すことが知見された。実施例１０に示すようにしてＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの胆汁酸含量と生合成経路の遺伝子発現とをモニターした。動物の肝臓を採取し、組織の胆汁酸及び遺伝子発現を分析した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて再循環胆汁酸の抱合不足と新しい胆汁酸の生合成及びコレステロール生合成に関与する遺伝子の発現増加とを示した。更に、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて糖新生に関与する遺伝子の発現減少を示した。このように、胆汁酸抱合と胆汁酸またはコレステロールの生合成経路とを測定することによってＦＡＴＰ５活性を評価する別の方法が提供される。
【００７６】
ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性は例えば、アシル−ＣｏＡ−修飾脂肪酸または胆汁酸の蓄積レベル；補酵素Ａ、ＡＴＰ及び脂肪酸／胆汁酸の消費量；及び／またはホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生量を定量することによって測定できる。標識試薬、例えば、蛍光標識、酵素標識または放射性標識した反応体または生成物は当業界で公知の方法で入手及び検出できる。例えば、補酵素Ａ、ＡＴＰ及び脂肪酸／胆汁酸の消費量は、放射性標識された補酵素Ａ、ＡＴＰおよび脂肪酸／胆汁酸のレベルをモニターすることによってモニターできる。あるいは、標識されたホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰを検出しモニターすることもできる。
【００７７】
例えば、１つのタイプのアッセイ例えば細胞ベースのアッセイでは、ＦＡＴＰ５活性に対する変調用化合物（例えば、インヒビター）の効果を定量するために、ＢＯＤＩＰＹ−脂肪酸（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−ドデカン酸）と放射性標識した脂肪酸または胆汁酸（例えば、１４Ｃ−ラウレート）とを使用する。このアッセイでは、ＦＡＴＰ５を発現する細胞を脂肪酸または胆汁酸に接触させ、取込まれなかった脂肪／胆汁酸を洗浄によって除去し、細胞に会合した蛍光または放射能を適当な検出デバイスを使用して測定する。トランスフェクト細胞系（例えば、安定にトランスフェクトされたＦＡＴＰ５を発現するＨＥＫ２９３細胞）及びＦＡＴＰ５を天然に発現する細胞（例えば一次肝細胞）のような適当なＦＡＴＰ５発現細胞を細胞ベースアッセイに使用できる。
【００７８】
別のタイプの細胞ベースアッセイでは、脂肪酸の取込みによる細胞内ｐＨの変化を指標物質フルオロホアによって追跡できる。フルオロホアはプレインキュベーション段階で細胞に取込ませる。細胞培地に脂肪酸を添加し、ＦＡＴＰ５介在性脂肪酸取込みができるインキュベーション期間の後、蛍光最大値の変化を測定し、細胞内ｐＨ変化を表す指標とする。フルオロホアの蛍光最大値はその環境のｐＨに伴って変化するので脂肪酸取込みを表す指標となり得る。このようなフルオロホアの一例はＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス（２−カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセインである。Ｒｉｎｋ，Ｔ．ら、１９８２，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９５：１８９−１９６参照。このようにしてこのアッセイでは、脂肪酸取込みが細胞内ｐＨの低下によって表される。
【００７９】
また別のタイプの細胞ベースアッセイは、標識した非抱合胆汁酸に細胞を接触させ、次いで胆汁酸取込みをモニターし、適正な検出方法を使用して細胞内の抱合胆汁酸の量を定量する段階を含む。
ＦＡＴＰ５ノックアウト細胞及び哺乳動物が入手可能になれば、ＦＡＴＰ５介在性シグナル伝達経路の遺伝的解剖が促進され、ＦＡＴＰ５特異的インヒビターの同定が可能になる。例えば、ノックアウト細胞系及びその野生型親細胞系でＦＡＴＰ５の機能を同等に阻害する物質はＦＡＴＰ５非特異的インヒビターとして認知されるであろうが、野生型細胞系のＦＡＴＰ５機能を阻害するがノックアウト細胞系で効果のない物質はＦＡＴＰ５特異的インヒビターとして認知されるであろう。
【００８０】
本発明の他の実施態様は、哺乳類ＦＡＴＰ５の活性（機能）を阻害する物質、例えば、アンタゴニスト、部分的アンタゴニストを同定する方法を提供する。ＦＡＴＰ５のインヒビターは、ＦＡＴＰ５遺伝子発現を阻害（発現の部分的または全面的阻害）するかまたはＦＡＴＰ５タンパク質の機能を阻害（機能の部分的または全面的阻害）する物質を包含する。本文中に記載のＦＡＴＰ５活性測定方法は例えばスクリーニング方法及び当業界で公知のＦＡＴＰ５活性測定方法に使用できる。本発明によれば、物質を細胞、一次組織と合せるか及び／または完全動物に投与する。後出の実施例に示すように、投与は、培養培地への添加、組織潅流、ベクターからの発現または注射のような様々な方法で行うことができる。
【００８１】
１つの実施態様では、物質をそのＦＡＴＰ５阻害能力、それによるインスリン抵抗性の軽減能力に基づいて同定または評価する。このようなスクリーンはｉｎ ｖｉｖｏで行うこともでき、または、処置した動物から単離した細胞を使用してｅｘ ｖｉｖｏで行うこともできる。
【００８２】
例えば、インスリン抵抗性マウスまたはインスリン抵抗性を示す細胞を本文中に記載のスクリーニング方法に使用できる。本文中に記載の方法または当業界で公知の方法のいずれかによって測定されたグルコース代謝（例えば、取込みまたはクリアランス）の基底レベルを定量できる。本文中では基底レベルという用語を、系の特定操作前のレベルという意味で使用した。被験物質の添加後、グルコース代謝を再度測定する。インスリン抵抗状態に従ってグルコース代謝は変質する。被験物質の存在下でグルコース代謝が正常値に戻る傾向を示すならば、インスリン抵抗性は軽減しており、物質はＦＡＴＰ５インヒビターである。
【００８３】
本文中に記載のスクリーニング方法は更に何らかの適当な対照の使用を含み得る。例えば１つの実施態様では、スクリーニング方法が更に、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースを物質の非存在下及び存在下で野生型マウスに投与する段階と、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースを物質の存在下でＦＡＴＰ５ノックアウトマウスに投与する段階とを含む。マウスのグルコースクリアランス率を定量する。物質の存在下の野生型マウスのグルコースクリアランス率を物質の非存在下の野生型マウスのグルコースクリアランス率に比較する。また、物質の存在下のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグルコースクリアランス率を物質の非存在下のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスのグルコースクリアランス率に比較する。
【００８４】
物質の存在下の野生型マウスのグルコースクリアランス率が物質の非存在下の野生型マウスによるグルコースクリアランス率に比べて増加しており、また、物質の存在下のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスによるグルコースクリアランス率が物質の非存在下のノックアウトマウスによって生じたレベルと同等であるならば、この物質はＦＡＴＰ５を特異的に阻害する。本発明のスクリーニング方法では、細胞、野生型マウスまたはＦＡＴＰ５ノックアウトマウスによるグルコース取込み率を本文中に記載または当業者に公知の多様な方法によって定量できる。哺乳動物を使用して体重、肥満、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、異常脂血症、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、冠状動脈疾患、高血圧及び卒中の治療に有用な物質をスクリーニングする方法も本発明の範囲内である。インスリン抵抗性の治療に有用な物質を同定するための適当なｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏスクリーニング方法は、野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を含む哺乳動物、組織または培養細胞、例えばマウスに、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースと被験物質とを投与する段階を含む。
【００８５】
マウスのグルコースクリアランス率を測定する。マウスのグルコースクリアランス率を、被験物質の非存在下で同量のグルコースを投与した同一または同様のマウスのグルコースクリアランス率に比較する。マウスのグルコースクリアランス率が被験物質の存在下で増加しているならばインスリン抵抗性の治療に有用な物質が同定されている。
【００８６】
同様に、インスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用な物質を同定するための適当なｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング方法は、野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を含む哺乳動物例えばマウスに、インスリン産生を刺激するために十分な量のグルコースと被験物質とを投与する段階を含む。マウスのグルコースクリアランス率を測定する。マウスのグルコースクリアランス率を、被験物質の非存在下で同量のグルコースを投与した同一または同様のマウスのグルコースクリアランス率に比較する。マウスのグルコースクリアランス率が被験物質の存在下で増加しているならば、インスリン非抵抗性真性糖尿病（ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）の治療に有用な物質が同定されている。
【００８７】
遊離脂肪酸及びトリグリセリド例えば血清トリグリセリドのレベルを変調するために有用な物質のｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏのスクリーニング方法も考察できる。このような方法は、野生型ＦＡＴＰ５遺伝子を含む哺乳動物例えばマウスに被験物質を投与する段階を含む。被験物質投与後のトリグリセリド及び／または脂肪酸の量を測定し、被験物質投与前のトリグリセリド及び／または脂肪酸の量に比較する。被験物質投与後のトリグリセリド及び／または脂肪酸の量が有意に違っているならば、トリグリセリド及び／または脂肪酸のレベルを変調する物質が同定されている。このような変調は、トリグリセリド及び／または血清トリグリセリドレベルの上昇及び低下の双方を含む。
【００８８】
種々の脂肪酸代謝産物の産生または蓄積もこのようにして測定できる。
【００８９】
ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性は上述のように、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの方法によって測定できる。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性に基づくスクリーニング方法は例えば、ＦＡＴＰ５に結合し、アシル−ＣｏＡの蓄積などによって測定されるＦＡＴＰ５のｉｎ ｖｉｔｒｏリガーゼ活性を阻害する物質の同定方法であってもよい。更に、細胞（例えば、脂肪細胞、筋肉細胞または心臓細胞）、組織または動物体内のアシル−ＣｏＡの蓄積もＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を阻害する物質のスクリーニングアッセイに使用できる。
【００９０】
１つの実施態様で本発明は、インスリン抵抗性の治療に有用な物質のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ同定方法を目的とする。本文中に記載したように、ＦＡＴＰ５の阻害はインスリン抵抗性の軽減または消去に導く。従って、ＦＡＴＰ５を阻害する物質はインスリン抵抗性を軽減する物質として有用であろう。
【００９１】
該方法は、被験物質を哺乳類のＦＡＴＰ５に（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ、例えば、生の（ｎａｔｉｖｅ）状態でまたは哺乳類ＦＡＴＰ５を超発現するように操作された培養細胞系中で）接触させる段階を含む。被験物質の存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルを定量し、被験物質の非存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルに比較する。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが被験物質の存在下で低下しているときはインスリン抵抗性の治療に有用な物質が同定されている。
【００９２】
同様にして、別の実施態様で本発明は、インスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用な物質のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ同定方法を目的とする。インスリン抵抗性は２型糖尿病（インスリン非依存型真性糖尿病）の特徴なので、インスリン抵抗性を軽減する物質、例えば、ＦＡＴＰ５を阻害する物質がインスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用である。該方法は、被験物質を哺乳類のＦＡＴＰ５に接触させる段階を含む。被験物質の存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルを定量し、被験物質の非存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルに比較する。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが被験物質の存在下で低下しているときはインスリン非依存型真性糖尿病の治療に有用な物質が同定されている。
【００９３】
トリグリセリド及び／または脂肪酸レベルを低下させるために有用な物質のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ同定方法も考察される。該方法は、被験物質を哺乳類のＦＡＴＰ５に接触させる段階を含む。被験物質の存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルを定量し、被験物質の非存在下の哺乳類ＦＡＴＰ５のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルに比較する。アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが被験物質の存在下で違っているときはトリグリセリド及び／または脂肪酸蓄積の治療に有用な物質が同定されている。
【００９４】
いくつかの特定実施態様では、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のレベルが物質の存在下で上昇している。別の実施態様では、アシル−ＣｏＡリガーゼのレベルが物質の存在下で低下している。変質した活性、即ち活性の変調は本発明に記載の方法によって測定できる。
【００９５】
治療方法
本発明はまた、ＦＡＴＰ５機能によって冒される状態（例えば、高血糖症）または疾病または障害（例えば、２型糖尿病）の治療または予防方法に関する。例えば本発明は、変質したグルコース／インスリンホメオスタシスを治療（例えば、症状の軽減）または予防する（例えば発症体質個体で）方法を提供する。本文中で使用した“個体”という用語は、ヒト患者を含む種の単一構成員を包含すると理解されたい。１つの実施態様で本発明は、ＦＡＴＰ５活性を阻害する物質を個体に投与することによって個体の全身グルコースクリアランスを増進する方法を提供する。
【００９６】
この増進は、筋肉細胞及び脂肪細胞へのインスリン刺激性グルコース取込みが増進されたかまたは肝細胞によるインスリン介在性グルコース産生が減退した結果として生じる。いくつかの実施態様で本発明はまた、血清トリグリセリド及び遊離脂肪酸の蓄積を抑制する方法を提供する。
【００９７】
別の実施態様で本発明は、ＦＡＴＰ５活性を阻害する物質を個体に投与する段階を含む、個体の血中グルコースを減少させる方法を提供する。本発明は更に、ＦＡＴＰ５活性を阻害する物質を個体に投与する段階を含む個体の糖尿病（例えば、２型糖尿病）の治療方法を提供する。
【００９８】
本発明の方法に使用される物質は例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、有機分子、無機分子、融合タンパク質、などでよい。
【００９９】
物質（例えば、ＦＡＴＰ５インヒビターのような治療用物質）は多様な方法で宿主に投与できる。可能な投与経路としては、皮内、経皮（例えば、徐放性ポリマーの使用）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または経口などの経路がある。簡便な任意の投与経路、例えば、注入もしくは濃縮塊注入、または、上皮もしくは粘膜皮膚のライニングによる吸収を使用できる。物質は医薬品に許容される賦形剤、担体、ビヒクルまたは希釈剤のような他の成分と組合せて投与できる。
【０１００】
ＦＡＴＰ５の機能を阻害するように設計された治療方法では、“有効量”の物質を個体に投与する。本文中で使用した“有効量”という用語は、例えば、ＦＡＴＰ５の活性を阻害し（または低下させ）その結果として有意な、例えば統計的に有意な差を生じさせる量、例えば、常態ではＦＡＴＰ５の調節下、例えば負の調節下にある細胞機能の亢進または減退を生じさせる量を意味する。例えば、高血糖症個体に投与された有効量の治療用物質という用語は、ＦＡＴＰ５によって促進される脂肪酸または胆汁酸の取込みを変質させ（阻害し）これによってインスリンの有効使用を促進するため、即ちインスリン抵抗性を軽減するために十分な量を含意するであろう。ＦＡＴＰ５活性を阻害するために必要な物質の量は、宿主の体格、年齢、体重、全般的健康状態、性別及び食事や、投与時間、治療対象である特定の状態または疾病の期間または時期のような多様な要因次第で変更されるであろう。有効な用量範囲はヒト以外の、例えば、本文中に記載のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスを利用するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの試験系で得られた用量−応答曲線から外挿できる。
【０１０１】
本文中で参照したすべての特許、特許出願及び参考文献はその記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする。
以下の実施例の目的は本発明を例示することであり、本発明の範囲がこれらに限定されないことを理解されたい。
【実施例１】
【０１０２】
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの作製
ＦＡＴＰ５ターゲティング構築物の作製：
マウスＦＡＴＰ５遺伝子座を含有するゲノムＤＮＡは、１２９／Ｓｖゲノム細菌性人工染色体ライブラリー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）をマウスＦＡＴＰ５コーディング配列の５’端を含有しているフラグメントでスクリーニングすることによって得られた。陽性クローンをＰｓｔＩで消化した。ＦＡＴＰ５−含有フラグメントをサザンブロット法によって同定し、標準シャトルベクターにサブクローニングした。ターゲティング構築物を作製するために、ＰＣＲプライマーは、開始コドンの直ぐ上流のゲノムＤＮＡ（５’アーム）と第一コーディングエキソンの直ぐ下流のゲノムＤＮＡ（３’アーム）とを増幅できるように設計した。ＰＣＲプライマーは、５’アームの３’端にＸｂａＩ部位及び３’アームの５’端にＰｓｔＩ部位を導入するように設計した。増幅されたアームをターゲティングベクターｐＧＥＭｎｅｏ−ｌａｃＺ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。Ｍｅｒｃｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ ７：７０３−７１６，１９９１参照。ｌａｃＺコーディング配列は５’アームの直ぐ下流に局在し、従ってｌａｃＺはＦＡＴＰ５プロモーターの転写コントロール下に置かれた。
【０１０３】
サザンブロット法によって組換えイベントが確認できるように、プローブはターゲティング構築物に存在するアームに直ぐ隣接のゲノムＤＮＡから作製した。５’プローブを作製するために、５’アームの直ぐ上流を起点とするゲノムＤＮＡのフラグメントをＰＣＲによって増幅し、シャトルベクターにサブクローニングした。３’プローブを作製するために、３’アームの９０ヌクレオチド下流を起点とするゲノムＤＮＡのフラグメントをＰＣＲによって増幅し、シャトルベクターにサブクローニングした。正しい組換えイベントが生じると、ＦＡＴＰ５タンパク質の第一アミノ酸が欠失し、ＦＡＴＰ５遺伝子の第一コーディングエキソンがｌａｃＺ遺伝子で置換され、その後方にＰＧＫ−ｎｅｏカセットが存在する。
【０１０４】
ターゲットとしたＥＳ細胞の作製：
１２９ＳｖＥｖ ＥＳ細胞系は、有糸分裂的に不活性のＳＮＬ７６／７支持細胞上で従来技術に記載されているようにして培養した。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｅ．Ｊ．，ｅｄ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７．Ｐｐ７１−１１２参照。細胞の電気穿孔は従来技術に記載されているようにして行った。Ｈｕｓｚａｒら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：１３１−１４１参照。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、１．０×１０７／ｍｌの濃度でＰＢＳ（Ｃａ及びＭｇ非含有、Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。０．７ｍｌのアリコート（７×１０６細胞）を２０μｇの直鎖化したターゲティングベクターと混合し、２５０Ｖ，５００μＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）でパルスを加えた。次いで、細胞を培養培地に希釈し、支持細胞を入れたプレート１００ｍｍあたり１−２×１０６で平板培養し、２４時間後、Ｇ４１８スルフェート（３００μｇ／ｍｌ溶液；Ｇｉｂｃｏ）中で選択下に維持した。Ｇ４１８−耐性クローンを採取し、トリプシンで解離し、２個の９６−ウェルプレートの各々の１つのウェルに分配した。単層集密状態に達すると、従来技術に記載されたようにして一方の９６−ウェルプレートのＥＳ細胞を凍結させた。例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓら、（１９９３）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２２５：８５５−８７８参照。サザンブロットハイブリダイゼーションによってスクリーニングするためのＤＮＡを他方のプレートから調製した。陽性クローンを伸長し、組換えを確認するために５’及び３’のフランキングプローブを使用しサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。
【０１０５】
ＦＡＴＰ５−欠損マウスの作製：
正しい相同的組換えイベントを生じたＥＳ細胞クローンを未分化胎細胞に注入し、次いで偽妊娠雌マウスに移入してキメラ子孫を産生させた。雄のキメラをＣ５７Ｂ／６Ｊ雌と交尾させ、破壊されたＦＡＴＰ５遺伝子の胚細胞系列が伝達されるようにした。得られたヘテロ接合体を交配（ｉｎｔｅｒｂｒｅｅｄ）すると、ＦＡＴＰ５突然変異に関してホモ接合（ＦＡＴＰノックアウト、ＦＡＴＰ ＫＯ）またはヘテロ接合のマウスが野生型同腹仔と共に産生した。いくつかの実験では、同一世代のＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの交配によって産生したホモ接合ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスと、同一世代の野生型マウスの交配によって産生した野生型同腹仔とを使用した。
【実施例２】
【０１０６】
コントロール食に維持した野生型マウス及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの体重及び脂肪過多症
６匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯ及び野生型同腹仔（対照）を誕生から２６週齢まで標準コントロール食（２０ｋｃａｌ％脂肪）に維持した。体重、白色脂肪、例えば、精巣上体の脂肪パッドと腹膜後方の脂肪パッド、及び、褐色脂肪、例えば、肩甲骨内の褐色脂肪組織の重量を２６週の期間後に測定した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは野生型対照に比べて白色脂肪量が有意に減少していた。表Ｉ参照。
【０１０７】
【表１】
【実施例３】
【０１０８】
高脂肪食に維持した野生型及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの体重／摂食量
１４匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを８週齢から開始した高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）に維持した。高脂肪食の開始前に体重を測定し、高脂肪食の１１週後に再度測定した。同様にして、１１週間の累積摂食量を測定した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは野生型対照に比べて高脂肪誘発体重増加を完全に防御していた。更に、高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは摂食量の減少を示した。表ＩＩ参照。
【０１０９】
【表２】
【実施例４】
【０１１０】
高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスの体組成
１４匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを実施例３と同様にして高脂肪食に維持した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは上記と同様に高脂肪誘発体重増加を完全に防御した。１７週の高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）後に体重及び体組成を定量した。ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスは脂肪過多症を防御していたが、ＦＡＴＰ５ ＫＯ動物と野生型動物との間で無脂肪量の差は観察されなかった。表ＩＩＩ参照。
【０１１１】
【表３】
【実施例５】
【０１１２】
高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスのエネルギー消費量
１４匹の雄のＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを実施例３と同様にして高脂肪食に維持した。１７週の高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）後に熱量測定分析を使用してエネルギー消費量を定量した。結果は、ＦＡＴＰ５ ＫＯマウスが野生型マウスよりも有意に高いエネルギー消費量を有していたことを示した。表ＩＶ参照。
【０１１３】
【表４】
【実施例６】
【０１１４】
ＦＡＴＰ５欠失は食餌誘発インスリン抵抗性を防御する
高脂肪給餌はマウスのインスリン抵抗性を誘発する。ＦＡＴＰ５が食餌誘発インスリン抵抗性を防御するか否かを判定するために、グルコース負荷試験を行った。簡単に説明すると、ＦＡＴＰ５ ＫＯマウス及び野生型マウスを高脂肪食（５８ｋｃａｌ％脂肪）または標準規定のコントロール食に維持した。マウスを一夜絶食させ、２ｍｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内注射した。グルコース計（Ｂａｙｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って使用して１８０分間を６等分した時間毎に血中グルコースレベルを測定した。高脂肪食に維持したＦＡＴＰ５ ＫＯ動物はコントロール食に維持した野生型マウスと同様のグルコースクリアランスプロフィルを有していたが、高脂肪食に維持した野生型マウスではグルコースクリアランスプロフィルが有意に悪化していた。表Ｖ参照。
【０１１５】
【表５】
【実施例７】
【０１１６】
ＦＡＴＰ５欠失動物は絶好の血漿脂質プロフィルを示す
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウス（ｎ＝１４、８週齢）に高脂肪食を２８週間給餌した。対照として対等な週齢の野生型マウスをコントロール食に維持した。一夜絶食させた動物から血清を採取した。市販のキットを使用して、トリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロール、ベータ−ヒドロキシブチレート（いずれもＳｉｇｍａ）並びにインスリン及びレプチン（双方ともＣｒｙｓｔａｌＣｈｅｍ）を測定した。血清トリグリセリドレベルの低下傾向が観察され、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物では遊離脂肪酸レベルが有意に低下した。一夜絶食させた動物の血清検査によれば、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は血清コレステロール、ケトン体（ベータ−ヒドロキシ−ブチレート）またはリポタンパク質プロフィル（示さず）の変化を示さなかったので、他のパラメーターはＫＯ動物と野生型動物との間で有意な差がほとんどないことが判明した。従って、ＦＡＴＰ５の阻害は副作用をまったく生じないと考えることができ、血中脂質プロフィルにプラスの効果を与えるであろう。表ＶＩ参照。
【０１１７】
【表６】
【実施例８】
【０１１８】
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウスは肝脂質レベルの低下を示す
ＦＡＴＰ５ノックアウトマウス及び野生型マウスを高脂肪食に２８週間維持した。対照として対等な週齢の野生型マウスをコントロール食に維持した。２８週後に肝臓を摘出し、肝脂質を湿潤重量％として測定した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は野生型対照動物に比べて肝脂質レベルが低下していた。これは脂肪肝疾患の防御を示唆する。表ＶＩＩ参照。
【０１１９】
【表７】
【実施例９】
【０１２０】
ＦＡＴＰ５欠失の結果として糞便の脂肪は少し減少するが糞便のカロリーに有意な差はない
ＦＡＴＰ５ノックアウト動物及び野生型動物を上述のようにして高脂肪食に１１週間維持した。動物の糞便を集めて糞便中の脂質レベルを乾燥重量パーセントとして測定した。ＦＡＴＰ５ノックアウト動物は糞便脂質レベルの僅かな上昇を示した。表ＶＩＩＩ参照。また、ＦＡＴＰ５ノックアウト動物に高脂肪食を５日間給餌し、糞便を集め、ボンベカロリー測定法で糞便の全カロリー含量を測定した。データは、糞便の全カロリーは野生型マウスとＦＡＴＰ５ノックアウトマウスとの間で差がないことを示す。表ＩＸ参照。
【０１２１】
【表８】
【０１２２】
【表９】
【実施例１０】
【０１２３】
ＦＡＴＰ５欠失マウスは再循環胆汁酸の抱合不足があり、新しい胆汁酸の生合成の増加を示す
ＦＡＴＰ５欠失マウスの胆汁酸組成
絶食させた野生型マウス及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスから胆汁を採取し、胆汁酸組成をＬＣ−ＭＳによって分析した。胆汁酸グループは市販の標準を使用して同定した。主要胆汁酸グループの各々で個々の胆汁酸ピークの曲線下方面積（ＡＵＣ）を定量し、野生型マウス及びノックアウトマウスの主要胆汁酸グループの相対的存在量として同定した。胆汁酸の総量は双方のマウスグループで同様であったが、ＦＡＴＰ５欠失マウスから採取した胆汁は主として非抱合の胆汁酸を含有していたのに、野生型マウスから採取した胆汁酸のほとんどは抱合していた。更に、ＦＡＴＰ５欠失マウスは野生型マウスに比べてジヒドロキシ化胆汁酸が有意に少なく、テトラヒドロキシル化胆汁酸が増加していた。表Ｘ参照。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
野生型マウス及びＦＡＴＰ５ノックアウトマウスの各々のタウリン−抱合ジヒドロキシル化胆汁酸の検査は、ＦＡＴＰ５欠損動物グループ中のこの画分は全面的にタウロケノデオキシコレート即ち新規合成によって産生される胆汁酸から構成されることを証明した。対照的に、新規合成でなく腸肝再循環中に産生される胆汁酸の２つの種、タウロヒオデオキシコレート及びタウロデオキシコレートは野生型動物で検出されたが、ノックアウトマウスではバックグラウンドレベルを上回って検出されることはなかった。表ＸＩ参照。我々のデータは、ＦＡＴＰ５が腸肝再循環中の胆汁酸の抱合には必要であるが新規合成には必要でないことを示唆する。新規合成は胆汁中の胆汁酸の少ないパーセンテージを占めるだけなので、腸肝再循環の欠如は全胆汁酸プールを非抱合種の方向にシフトさせるであろう。
【０１２６】
【表１１】
【０１２７】
遺伝子発現解析
ＦＡＴＰ５欠失の結果を更に検討するために、我々は転写プロファイリングとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析とを併用して野生型マウスとＦＡＴＰ５欠失マウスとの肝臓における遺伝子発現を比較した。転写プロファイリングＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を製造業者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の指示通りに行うことによって、または、ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ解析を製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）の指示通りに行うことによって遺伝子発現を測定した。
【０１２８】
転写プロファイリング実験のためには、ＴｒｉａｚｏｌＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造業者の指示通りに使用することによって均質化組織から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡをジエチルピロカーボネートで処理した脱イオン水に入れて８０℃で保存した。サンプルの標識及びその後のアレイへのハイブリダイゼーションに関する方法の詳細はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から得られる。簡単に説明すると、５．０μｇの全ＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）を含有しているＴ７−（ｄＴ）２４プライマーと共に第一ストランド合成をプライミングする二重鎖ｃＤＮＡに変換した（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。次いで、全部の二重鎖ｃＤＮＡを、取込んだＴ７プロモーター配列を使用するビオチニル化ｃＲＮＡ作製の鋳型として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット；Ａｍｂｉｏｎ及びＢｉｏ−１１−ＣＴＰ及びＢｉｏ−１６−ＵＴＰ；Ｅｎｚｏ）に使用した。１０μｇのｃＲＮＡに対照オリゴヌクレオチド及びスパイクを添加し、次いでＭｕ Ｕ７４オリゴヌクレオチドアレイに定速回転を維持しながら４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。次にアレイを洗浄し、ＥＵＫＧＥ−ＷＳ１プロトコルを使用してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションで染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーで走査した。ＭＡＳ５．０ソフトウェアを使用してデータ解析を行った。
【０１２９】
リアルタイムＰＣＲ実験のためには、同じくｔｒｉｚｏｌ法を使用して全ＲＮＡを作製し、ＤＮアーゼで処理して夾雑ゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡを標準法で合成した。逆転写酵素の非存在下のＭｏｃｋ ｃＤＮＡ合成によって得られたサンプルでは対照１８Ｓ遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅が全く生じていなかったので、ゲノムＤＮＡ夾雑の効率的な除去が確認された。ＰＣＲプローブは該当遺伝子配列に基づくＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって設計した。異なる組織間の結果を標準化するために、異なる蛍光ラベルによって識別できる２つのプローブを各サンプルに加えた。このように遺伝子用プローブと１８Ｓ ＲＮＡ用プローブ（内部対照として）との示差標識を使用すると同一ウェル中の双方の同時的測定が可能であった。順方向及び逆方向のプライマーと１８Ｓ ＲＮＡ及び該当遺伝子の双方のプローブとをＴａｑＭａｎ汎用ＰＣＲマスターミックス（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に加えた。プライマー及びプローブの最終濃度が変わることはあったが、所与の１つの実験中では各々の濃度が内部的に不変であった。典型的な実験では、１８Ｓ ＲＮＡには各２００ｎＭの順方向及び逆方向のプライマーと１００ｎＭのプローブとを使用し、該当遺伝子には各６００ｎＭの順方向及び逆方向のプライマーと２００ｎＭのプローブとを使用した。ＴａｑＭａｎマトリックス実験はＡＢＩＰＲＩＳＭ７７０配列検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。サーマルサイクラーには以下の条件を使用した：５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで、９５℃で１５秒次いで６０℃で１分の２段階ＰＣＲを４０サイクル。
【０１３０】
組織サンプル中の遺伝子発現を同じ組織中の１８Ｓ ＲＮＡ発現に相対的に定量計算するために以下の方法を使用した。ＰＣＲ増幅が開始される閾値を製造業者のソフトウェアを使用して決定した。閾値におけるＰＣＲサイクル回数をＣＴで表す。相対的発現は、２−（（ＣＴｔｅｓｔ−ＣＴ１８Ｓ）該当組織−（ＣＴｔｅｓｔ−ＣＴ１８Ｓ）パネル中の最低発現組織）として計算した。サンプルを重複処理し、内部対照１８Ｓの勾配と同様の勾配をもつ鋳型ｃＤＮＡの量に比例した２つの相対的発現レベルの平均を使用した。発現倍率は野生型対照動物の相対的発現レベルに比べたＦＡＴＰ５欠失動物の相対的発現として定量した。
【０１３１】
コレステロール及び胆汁酸の双方の生合成経路に関与する遺伝子の正の調節が観察された。胆汁酸によって活性化される既知の核ホルモン受容体であるＦＸＲのいくつかのターゲット遺伝子（Ｐａｒｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１３６５−８，１９９９）は、ＦＸＲの活性低下を示唆するように調節されている。ＦＸＲはジヒドロキシ胆汁酸によって強力に活性化されるが、トリヒドロキシ胆汁酸にはほとんど感応しないので（Ｐａｒｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１３６５−８，１９９９）、ＦＸＲの活性低下はＦＡＴＰ５ノックアウト動物に見られるジヒドロキシ胆汁酸のレベル低下と符合する。表ＸＩＩ参照。
【０１３２】
コレステロールの生合成及びコレステロール取込みに関与する遺伝子ＬＤＬ−Ｒの双方の正の調節は、胆汁酸合成亢進の存在下で細胞内コレステロールレベルを正常に維持する適応応答であった。ノックアウト動物で脂肪酸酸化遺伝子の調節はほとんど観察できなかったが、これは、ＦＡＴＰ５欠失動物で呼吸交換率が不変であるという知見と符合する。更に我々は、糖新生に関与する基幹遺伝子の強力な負の調節を観察した。これもＦＡＴＰ５欠失動物でインスリン感受性が改善される理由の１つであろう。表ＸＩＩ参照
【０１３３】
【表１２】
【実施例１１】
【０１３４】
ＦＡＴＰ５によるアシル−ＣｏＡリガーゼ活性
ｈｓＦＡＴＰ５の発現及び精製
Ｃ−末端６ｘ−ＨＩＳタグを含んでいるヒトＦＡＴＰ５コーディング配列をｐＦａｓｔＢＡＣベクターに挿入し、ｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓを発現するバキュロウイルスを常法を使用して構築した。ｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓを含有しているバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞に感染させ、４８時間後に採取し、液体窒素で凍結した。溶菌バッファ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、２０ｍＭのイミダゾール、１ＭのＮａＣｌ、０．５％のｎ−ドデシル−マルトシド、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビターの標準カクテルを含有している１ｍＭの２−メルカプト−エタノール）に入れた細胞を氷上で解凍し、音波処理によって溶解した。溶解液を４℃、１７，７００ｇで３０分間過流させ、上清を溶菌バッファで平衡させたＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂（Ｑｕｉａｇｅｎ）に塗布した。０．５リットルの細胞あたり５００μｌの樹脂を使用した。樹脂を穏やかに撹拌しながら４℃で１時間インキュベートし、４℃、４００ｇで１５分間遠心し、樹脂を１０ｍｌのＢｉｏｒａｄ使い捨てカラムに移した。４０カラム容量の平衡バッファでカラムを洗浄し、２カラム容量の溶出バッファ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、２５０ｍＭのイミダゾール、１ＭのＮａＣｌ、０．５％のｎ−ドデシル−マルトシド、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビターの標準カクテルを含有している１ｍＭの２−メルカプト−エタノール）を添加することによって結合材料を溶出させた。各溶出画分でｈｓＦＡＴＰ５が主要バンドであり、Ｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）染色によって判定すると約７０％純度であった。主要バンドがｈｓＦＡＴＰ５に一致することはトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析及びＮ−末端マイクロ配列決定によって確認された。溶出した材料を−２０℃で保存した。ウェスタンブロット分析は、この方法を使用してＦＡＴＰ５を精製することはできるが流出画分中にも有意量のｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓが存在することを示した。
【０１３５】
Ｎ−末端ＧＳＴタグを含有しているヒトＦＡＴＰ５コーディング配列をｐＦａｓｔＢＡＣベクターに挿入し、ＧＳＴ−ｈｓＦＡＴＰ５を発現するバキュロウイルスを常法を使用して構築した。ｈｓＧＳＴ−ＦＡＴＰ５を含有しているバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞に感染させ、４８時間後に採取し、液体窒素で凍結した。精製にグルタチオンセファロース４Ｂ樹脂を使用しタンパク質をグルタチオン溶出バッファ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、５０ｍＭのグルタチオン、１ＭのＮａＣｌ、０．５％のｎ−ドデシル−マルトシド、１０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビターの標準カクテルを含有している１ｍＭの２−メルカプト−エタノール）で溶出させた以外はｈｓＦＡＴＰ５−Ｈｉｓに関して上述した手順と同様の手順で細胞を解凍し、タンパク質を精製した。
【０１３６】
ＦＡＴＰ５ アシル−ＣｏＡリガーゼ活性は当業界で公知の方法のいずれかによって測定できる。粗アッセイ、マラカイトグリーンアッセイまたは質量分析法を使用する酵素活性定量法などが代表例である。
【０１３７】
粗アシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイ
ＫｅｌｌｙとＶｅｓｓｅｙの修正方法（（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３０４：９４５−９４９）を使用してアシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイを行った。５０μｇの未精製上清または２μｇのカラム精製材料を０．５ｍＬの容量中、１００ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、１０μＭのＣｏＡ、１０μＭのコレート、１５ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰと共に３０℃でインキュベートした。０．０５ｍＬの０．１ＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５及び０．２ｍＬの６０ｍＭのコハク酸を加えて反応を停止させた。未反応のコレートをドール試薬（イソプロピルアルコール、ヘプタン、１ＭのＨ２ＳＯ４；容量比４０：１０：１）で抽出した。激しく撹拌した後、遠心によってタンパク質を除去し、６５０μｌの上清を、３５０μｌのヘプタンと１９０μｌの４００ｎＭのＭｏｐｓ−ＮＡＯＨ（ｐＨ６．５）含有溶液で抽出した。下部相（水相）を４００μｌのヘプタンで３回洗浄し、この画分中の放射能をシンチレーションカウンターで測定した。活性をタンパク質１ｍｇあたりのｐｍｏｌ／分として表した。
【０１３８】
マラカイトグリーンアシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイ
ＦＡＴＰ５活性はまたマラカイトグリーンを検出手段として使用する方法によって測定できる。反応ミックスは、以下の成分を含有している：５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．５、６０μＭの胆汁／脂肪酸、５０μＭの補酵素Ａ、０．６２５Ｕ／ｍｌの無機ピロホスファターゼ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１２０μＭのＡＴＰ、及び、ＦＡＴＰ５未精製膜調製またはカラム精製から得られた２μｇの全タンパク質。ＥＤＴＡ（最終濃度０．１Ｍ）で反応を停止させ、ホスフェート検出のために５０μｌのマラカイトグリーン溶液（０．４５ｇのマラカイトグリーン、７グラムのモリブデン酸アンモニウム、１．３３ＮのＨＣｌ、１Ｌの最終容量）を添加した。マラカイトグリーン添加の３０分後にＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ３８４プレートリーダーで６１０ｎｍの吸光度を測定する。
【０１３９】
ＬＣ／ＭＳを使用するアシル−ＣｏＡリガーゼ活性アッセイ
さらにまた、ＦＡＴＰ５酵素活性は、Ｉｋｅｇａｗａら（（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６；１２５−１３２）によって開発されたＬＣ／ＭＳアッセイの修正バージョンを使用する生成物アシル−ＣｏＡの直接検出によって測定できる。胆汁酸基質としてコレート及びケノデオキシコレートを使用するＦＡＴＰ５のＬＣ／ＭＳアッセイを以下に説明する。基質として脂肪酸も使用した。
【０１４０】
反応ミックスは、以下の成分を含有している：５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．５、６０μＭの胆汁酸（または脂肪酸）、５０μＭの補酵素Ａ、１ｍＭのＤＴＴ、０．４２Ｕ／ｍｌの無機ピロホスファターゼ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１２０μＭのＡＴＰ、及び、ＦＡＴＰ５精製（上述）から得られた２μｇの全タンパク質。反応は基質の添加によって開始し、酢酸（最終濃度＝０．６３％）によって停止する。停止した反応混合物（５０μＬ）を、シングル四重複質量分析計（Ｇ１９４６Ｄ ＳＬモード）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステムに注入する。５−９５％アセトニトリル勾配（有機相またはＢ相）に０．５ｍＬ／分の流速で１８分間流す（水相またはＡ相は１０ｍＭの酢酸アンモニウム）。総処理時間は２０分で、１分間の初期平衡時間と勾配終了後の１分間の平衡時間とを含む。以下の質量対電荷比をＳＩＭ（ｓｉｎｇｌｅ ｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードでモニターする：コレート（４０７．６）コリル−ＣｏＡ（１１５６．５，５７７．５）、ケノデオキシコレート（１１４１，５６９）及びＣｏＡ（７６６）。
【０１４１】
ＦＡＴＰ５未精製膜調製から得られた材料は０．０６μＭ／分のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を示したが、精製タンパク質画分は０．０９μＭ／分のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を示した。対照的に、非類縁タンパク質を発現している昆虫細胞から得られた材料は精製画分中でいかなる活性も示さなかった。これらのデータは、ＣｏＡリガーゼ活性がＦＡＴＰ５タンパク質と関連している証拠を提供しＦＡＴＰ５タンパク質機能を検定するために使用できるであろう。
【０１４２】
本文中に記載のアッセイまたはアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を評価する当業界で公知の他の類縁アッセイは、ＦＡＴＰ５インヒビター候補化合物の高スループットスクリーニングに対応するように修正できる。
【実施例１２】
【０１４３】
胆汁酸または脂肪酸の取込みを変調する物質のスクリーニング
ｐＩＲＥＳ−ｍＦＡＴＰ５ベクターを安定にトランスフェクトしたヒト胚性腎２９３細胞を培養し、ＤＭＥＭ基礎培地に移した。ウェルあたり８×１０４細胞を９６−ウェルのマイクロタイタープレートで平板培養し、洗浄バッファ（１×のハンクス基礎塩類溶液中に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４．２ｍＭのＮａＨＣＯ３）で洗浄した。次に洗浄バッファ中の１ｍＭのタウロコレート中のインヒビターを３７℃で細胞に添加する。５ｍＭの最終濃度のＢＯＤＩＰＹ−脂肪酸（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−ドデカン酸）を添加することによって取込みアッセイを開始する。取込みアッセイを１５−６０分間維持し、洗浄バッファ中の０．１％ウシ血清アルブミンで洗浄することによって停止させる。次に、細胞によって取込まれたＢＯＤＩＰＹ−脂肪酸の量を、洗浄後の細胞の蛍光を測定することによって定量する（励起＝４５０ｎｍ、発光＝５３０ｎｍ）。取込みの阻害をインヒビター濃度の関数として示すグラフを作成し、等式（Ｙ＝ｍａｘ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０Ａ（ｌｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））に適合させることによってインヒビターのＩＣ５０値を計算する。
【０１４４】
本発明をその好ましい実施態様に基づいて詳細に表示及び記述したが、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく形態及び細部の多様な変更が可能であることは当業者には理解されよう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、
ｂ．被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階と、
ｃ．化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドアシル−ＣｏＡリガーゼ活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドアシル−ＣｏＡリガーゼ活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、体重、インスリン抵抗性、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項２】
ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む膜調製物、及び、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドから成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼ活性が、
ａ．ホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生、
ｂ．補酵素Ａ、ＡＴＰまたは脂肪酸もしくは胆汁酸の消費、及び、
ｃ．脂肪酸または胆汁酸の取込み
から成るグループから選択される活性を測定することによって定量される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アシル−ＣｏＡリガーゼ活性が胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、
ｂ．被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、
ｃ．段階（ｂ）でＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、
ｄ．被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階と、
ｅ．段階（ｄ）でＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、肝グルコース産出、脂肪酸取込み、胆汁酸取込み、肝脂質含量、血漿、肝臓、胆汁または糞便中の胆汁酸組成、異常脂血症、及び、血漿脂質組成から成るグループから選択され、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、体重、インスリン抵抗性、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項６】
ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む膜調製物、及び、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドから成るグループから選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
更に、
ｃ．ＦＡＴＰ５アシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、
ｄ．被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階と、
ｅ．段階（ｄ）でＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、肝グルコース産出、脂肪酸取込み、胆汁酸取込み、肝脂質含量、血漿、肝臓、胆汁または糞便中の胆汁酸組成、異常脂血症、及び、血漿脂質組成から成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、
ｂ．被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、
ｃ．化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、体重、インスリン抵抗性、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項９】
ＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み活性、または、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のいずれかを測定することによって定量される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有効量のＦＡＴＰ５活性阻害物質を個体に投与する段階を含む個体のＦＡＴＰ５介在性代謝障害の治療方法。
【請求項１１】
ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患のグループから選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異常脂血症が、高い血清トリグリセリドレベル、高い胆汁酸レベル、及び、高い遊離脂肪酸レベルから成るグループから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
心血管疾患が、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患から成るグループから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物及び脂肪酸または胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する試験細胞とを合せる段階と、
ｂ．試験細胞中の脂肪酸または胆汁酸の取込みを測定する段階と、
ｃ．化合物の存在下の試験細胞への脂肪酸または胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の試験細胞への脂肪酸または胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項１５】
異常脂血症が、高い血清トリグリセリドレベル、高い胆汁酸レベル、及び、高い遊離脂肪酸レベルから成るグループから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
心血管疾患が、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患から成るグループから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、
ｂ．被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼ活性を測定する段階と、
ｃ．化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドアシル−ＣｏＡリガーゼ活性が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチドアシル−ＣｏＡリガーゼ活性とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、体重、インスリン抵抗性、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項２】
ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む膜調製物、及び、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドから成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＡＴＰ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡリガーゼ活性が、
ａ．ホスフェート、アシル−ＣｏＡまたはＡＭＰの産生、
ｂ．補酵素Ａ、ＡＴＰまたは脂肪酸もしくは胆汁酸の消費、及び、
ｃ．脂肪酸または胆汁酸の取込み
から成るグループから選択される活性を測定することによって定量される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アシル−ＣｏＡリガーゼ活性が胆汁酸ＣｏＡリガーゼ活性である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物とを合せる段階と、
ｂ．被験化合物がＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合するか否かを判定する段階と、
ｃ．段階（ｂ）でＦＡＴＰ５ポリペプチドに結合すると同定された化合物を哺乳動物に投与する段階と、
ｄ．被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階と、
ｅ．段階（ｄ）でＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、肝グルコース産出、脂肪酸取込み、胆汁酸取込み、肝脂質含量、血漿、肝臓、胆汁または糞便中の胆汁酸組成、異常脂血症、及び、血漿脂質組成から成るグループから選択され、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、体重、インスリン抵抗性、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項６】
ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む組成物が、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する細胞、ＦＡＴＰ５ポリペプチドを含む膜調製物、及び、単離ＦＡＴＰ５ポリペプチドから成るグループから選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
更に、
ｃ．ＦＡＴＰ５アシル−ＣｏＡリガーゼ活性を変調すると同定された被験化合物を哺乳動物に投与する段階と、
ｄ．被験化合物がＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調するか否かを判定する段階と、
ｅ．段階（ｄ）でＦＡＴＰ５介在性プロセスを変調する被験化合物をＦＡＴＰ５介在性障害を変調するために有用な候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性プロセスが、体重、体脂肪組成、摂食行動、インスリン抵抗性、グルコース取込み、肝グルコース産出、脂肪酸取込み、胆汁酸取込み、肝脂質含量、血漿、肝臓、胆汁または糞便中の胆汁酸組成、異常脂血症、及び、血漿脂質組成から成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現し得る細胞を含む組成物とを合せる段階と、
ｂ．被験化合物の存在下及び非存在下の組成物中のＦＡＴＰ５ポリペプチドの発現を測定する段階と、
ｃ．化合物の存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現が化合物の非存在下のＦＡＴＰ５ポリペプチド発現とは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、体重、インスリン抵抗性、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項９】
ＦＡＴＰ５発現が、転写物レベル、タンパク質レベル、脂肪酸もしくは胆汁酸取込み活性、または、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性のいずれかを測定することによって定量される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有効量のＦＡＴＰ５活性阻害物質を個体に投与する段階を含む個体のＦＡＴＰ５介在性代謝障害の治療方法。
【請求項１１】
ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患のグループから選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異常脂血症が、高い血清トリグリセリドレベル、高い胆汁酸レベル、及び、高い遊離脂肪酸レベルから成るグループから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
心血管疾患が、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患から成るグループから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
化合物がＦＡＴＰ５介在性代謝障害を変調し得る候補化合物であるか否かを同定するための方法であって、
ａ．被験化合物及び脂肪酸または胆汁酸とＦＡＴＰ５ポリペプチドを発現する試験細胞とを合せる段階と、
ｂ．試験細胞中の脂肪酸または胆汁酸の取込みを測定する段階と、
ｃ．化合物の存在下の試験細胞への脂肪酸または胆汁酸の取込みが化合物の非存在下の試験細胞への脂肪酸または胆汁酸の取込みとは異なっているときに被験化合物をＦＡＴＰ５介在性代謝障害の変調に使用するための候補化合物として同定する段階と、
を含み、ＦＡＴＰ５介在性代謝障害が、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異常脂血症、脂肪肝疾患及び心血管疾患から成るグループから選択される方法。
【請求項１５】
異常脂血症が、高い血清トリグリセリドレベル、高い胆汁酸レベル、及び、高い遊離脂肪酸レベルから成るグループから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
心血管疾患が、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧及び虚血性心疾患から成るグループから選択される請求項１４に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５０２６１９（Ｐ２００７−５０２６１９Ａ）
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３９７３（Ｐ２００６−５２３９７３）
【出願日】平成１６年８月１７日（２００４．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９４２３
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５００２８７６３９）ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (98)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＥＮＮＩＵＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１７日（２００４．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９４２３
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５００２８７６３９）ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (98)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＥＮＮＩＵＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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