低分子量ＲＮＡの分離精製方法
【課題】ｍｉＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子を簡便に作製する方法、および配列未知のｍｉＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子を作製するための技術を提供することを課題とする。
【解決手段】汎用性の高いＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いることにより任意のｍａｔｕｒｅ ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を作成する手法を新たに開発したことによって解決した。プロモーター領域をＲＴ−ＰＣＲの段階で導入することおよび余分な配列と相補的なプライマー（ＤＮＡ断片）をアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ Ｈ処理およびＤＮａｓｅ処理することにより上記課題は解決された。
【解決手段】汎用性の高いＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いることにより任意のｍａｔｕｒｅ ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を作成する手法を新たに開発したことによって解決した。プロモーター領域をＲＴ−ＰＣＲの段階で導入することおよび余分な配列と相補的なプライマー（ＤＮＡ断片）をアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ Ｈ処理およびＤＮａｓｅ処理することにより上記課題は解決された。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された成熟型ＲＮＡ。
【請求項２】
合成成熟型ＲＮＡ。
【請求項３】
低分子量成熟型ＲＮＡ。
【請求項４】
前記成熟型ＲＮＡは、目的の配列のみからなる、ＲＮＡ。
【請求項５】
所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法であって：
Ａ）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
Ｂ）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
Ｃ）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
Ｄ）該増幅産物に対してＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
Ｅ）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程；
を包含する、方法。
【請求項６】
前記鋳型核酸は、ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リンカー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ライゲーション工程において、前記連結がリガーゼによって媒介される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライゲーション工程において、前記連結がＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼにより媒介される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ａ）ライゲーション反応において、前記第２のリンカー核酸と前記鋳型核酸との連結をまず行って第１連結産物を得、次に前記第１のリンカー核酸と該第１連結産物との連結を行うことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ライゲーション工程は、ｓｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌまたはＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌにて行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記鋳型核酸はＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記鋳型核酸はＲＮＡであり、前記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、前記核酸増幅鋳型はＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸であり、前記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、該逆転写反応において用いられるプライマーが該リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸増幅反応において、プロモーター配列を含むプライマーが用いられる、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸増幅反応において使用される５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、マルチクローニングサイトを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、該プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項３３】
Ｃ）増幅工程の後に、前記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターは、前記プロモーター配列を含まないことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅産物がＤＮＡであり、前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性である、請求項５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、前記プロモーター配列を認識するものである、請求項５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸増幅反応において、使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、該プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれ
前記Ｃ）増幅工程の後に、前記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含し、該ベクターは、前記プロモーター配列を含まず、前記ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーター配列を認識し、かつ、３’側のプライマーの該制限酵素部位を切断する制限酵素で消化して該ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として該ＲＮＡポリメラーゼによる増幅を行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＮＡ増幅工程の後にＤＮＡを除去する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡの除去は、ＤＮａｓｅにより達成される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＮＡ増幅工程において、存在するＲＮＡ分子の量の少なくとも２倍量のプライマーが使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、オーバーハングを生じさせないＲＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項４２】
前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、前記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、前記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーを前記ＲＮＡ産物とハイブリダイズさせてハイブリダイズ産物を生成し、該ハイブリダイズ産物に対してＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解する手段を用いて分解させて、所望の配列のみを含むＲＮＡを生産することを包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項４３】
前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項４５】
前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＲＮａｓｅ Ｈにより達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項４６】
ＲＮＡを実質的に分解しないＤＮＡ分解手段によりＤＮＡを分解する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項４７】
さらに、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する前記工程は、電気泳動を包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記成熟型ＲＮＡは、低分子量ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項５０】
前記成熟型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項５１】
所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって：
Ａ１）該所望の配列を有する鋳型核酸に連結させるためのリンカー核酸；
Ａ２）該リンカー核酸を該鋳型核酸に結合させる結合手段；
Ｂ）該鋳型核酸と該リンカー核酸とが連結したリンカー核酸結合鋳型核酸から核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産手段；
Ｃ）該転写反応によって生じる核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を生じさせる核酸増幅手段；
Ｄ）該核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段；および
Ｅ）所望でないＲＮＡ配列を除去するＲＮＡ配列除去手段、
を備える、キット。
【請求項５２】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含むことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まないことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５４】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５５】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５６】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加され、他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５７】
記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、請求項５５または５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５９】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６０】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６１】
前記結合手段は、ＲＮＡリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６２】
前記結合手段は、ＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６３】
前記結合手段は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６４】
前記鋳型核酸はＲＮＡであり、前記核酸増幅鋳型生産手段は、逆転写酵素とプライマーを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６５】
前記プライマーセットは、該リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含むことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項６６】
前記核酸増幅手段は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される増幅反応のための手段を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６７】
前記核酸増幅手段は、ＤＮＡポリメラーゼとプライマーセットとを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６８】
前記プライマーセットは、前記リンカー核酸連結鋳型核酸の一部と同一の配列および相補的な配列をそれぞれ含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６９】
前記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７０】
前記プライマーセットの両方が制限部位を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７１】
前記プライマーセットがマルチクローニングサイトを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７２】
前記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含み、該プライマーセットの両方が制限部位を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７３】
Ｃ−２）前記増幅産物をクローニングするためのベクター、さらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７４】
Ｃ−３）前記増幅産物に含まれる制限部位を認識し切断する制限酵素を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７５】
前記核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段は、ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項７６】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、前記プライマーセットに含まれる前記プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項７７】
前記プロモーター配列がＴ７プロモーター、Ｓ６プロモーターまたはＴ３プロモーターであり、前記ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーターに対応してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項７８】
Ｄ−１）ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅをさらに備える、請求項５１に記載のキット。
【請求項７９】
前記ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅは、前記鋳型となった増幅産物であるＤＮＡを除去するために用いられる、請求項５１に記載のキット。
【請求項８０】
Ｄ−２）生産されたＲＮＡを精製するための精製手段をさらに備える、請求項５１に記載のキット。
【請求項８１】
前記精製手段は、フェノール／クロロホルム抽出手段およびエタノール沈澱手段である、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
前記除去手段は、ＲＮａｓｅである、請求項５１に記載のキット。
【請求項８３】
前記除去手段は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解するＲＮａｓｅである、請求項５１に記載のキット。
【請求項８４】
前記除去手段は、ＲＮａｓｅ Ｈである、請求項５１に記載のキット。
【請求項８５】
前記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、前記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーをさらに包含する、請求項５１に記載のキット。
【請求項８６】
前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８８】
さらに、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する手段を備える、請求項５１に記載のキット。
【請求項８９】
機能を有するＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、
Ａ）対象ＲＮＡを提供する工程；
Ｂ）Ｂ−１）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
Ｂ−２）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
Ｂ−３）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
Ｂ−４）該増幅産物をベクターに配置し、該ベクターで宿主を形質転換する工程；
Ｂ−５）該宿主を増幅させる増幅された宿主からベクターを入手する工程；
Ｂ−６）該ベクターを鋳型として用いてＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
Ｂ−７）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程、
を行って、対象ＲＮＡを増幅生産する工程、
Ｃ）該対象ＲＮＡを試験細胞に感染させる工程；
Ｄ）該試験細胞が所望の機能を発現した場合、該発現が見出される試験細胞に含まれる対象ＲＮＡに対応する宿主をさらに培養して増幅させる工程；
Ｅ）必要に応じて、Ｂ−５〜Ｂ−７、ＣおよびＤを繰り返し、単一コロニーを探索する工程、
Ｆ）該単一コロニーに含まれるＲＮＡの配列を決定する工程；
ここで、該決定された配列と該機能と関連付けて、機能を有するRNAが同定される、方法。
【請求項９０】
Ｇ）該ＲＮＡの発現パターン解析を行う工程、をさらに包含する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
請求項１〜４に記載のRNAまたは請求項５〜８８に記載の方法によって生産されたRNAの、該RNAの機能を利用する分析または診断のための使用。
【請求項９２】
所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する方法であって、
ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマーと該所望の配列を含むＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程；および
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する工程、
を包含する、方法。
【請求項９３】
前記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって、
ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマー；および
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する手段、
を備える、キット。
【請求項９５】
前記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、請求項９４に記載のキット。
【請求項１】
単離された成熟型ＲＮＡ。
【請求項２】
合成成熟型ＲＮＡ。
【請求項３】
低分子量成熟型ＲＮＡ。
【請求項４】
前記成熟型ＲＮＡは、目的の配列のみからなる、ＲＮＡ。
【請求項５】
所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産する方法であって：
Ａ）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
Ｂ）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
Ｃ）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
Ｄ）該増幅産物に対してＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
Ｅ）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程；
を包含する、方法。
【請求項６】
前記鋳型核酸は、ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リンカー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ライゲーション工程において、前記連結がリガーゼによって媒介される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライゲーション工程において、前記連結がＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼにより媒介される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ａ）ライゲーション反応において、前記第２のリンカー核酸と前記鋳型核酸との連結をまず行って第１連結産物を得、次に前記第１のリンカー核酸と該第１連結産物との連結を行うことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ライゲーション工程は、ｓｍａｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌまたはＮｅｌｓｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌにて行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記鋳型核酸はＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記鋳型核酸はＲＮＡであり、前記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、前記核酸増幅鋳型はＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンカー核酸結合鋳型核酸がＲＮＡとＤＮＡとのキメラ核酸であり、前記核酸増幅鋳型の生産は逆転写反応により達成され、該逆転写反応において用いられるプライマーが該リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸増幅反応において、プロモーター配列を含むプライマーが用いられる、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸増幅反応において使用される５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、マルチクローニングサイトを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸増幅反応において使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、該プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項３３】
Ｃ）増幅工程の後に、前記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターは、前記プロモーター配列を含まないことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅産物がＤＮＡであり、前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性である、請求項５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、前記プロモーター配列を認識するものである、請求項５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸増幅反応において、使用されるプライマーが、リンカー核酸の配列またはその相補配列あるいはその一部を含み、該プライマーが、制限酵素部位の配列を含み、５’側のプライマーにプロモーター配列が含まれ
前記Ｃ）増幅工程の後に、前記増幅産物を、ベクターにクローニングする工程をさらに包含し、該ベクターは、前記プロモーター配列を含まず、前記ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーター配列を認識し、かつ、３’側のプライマーの該制限酵素部位を切断する制限酵素で消化して該ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として該ＲＮＡポリメラーゼによる増幅を行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＮＡ増幅工程の後にＤＮＡを除去する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡの除去は、ＤＮａｓｅにより達成される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＮＡ増幅工程において、存在するＲＮＡ分子の量の少なくとも２倍量のプライマーが使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、オーバーハングを生じさせないＲＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項４２】
前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、前記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、前記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーを前記ＲＮＡ産物とハイブリダイズさせてハイブリダイズ産物を生成し、該ハイブリダイズ産物に対してＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解する手段を用いて分解させて、所望の配列のみを含むＲＮＡを生産することを包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項４３】
前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項４５】
前記所望でないＲＮＡ配列の除去は、ＲＮａｓｅ Ｈにより達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項４６】
ＲＮＡを実質的に分解しないＤＮＡ分解手段によりＤＮＡを分解する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項４７】
さらに、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する前記工程は、電気泳動を包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記成熟型ＲＮＡは、低分子量ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項５０】
前記成熟型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項５１】
所望の配列を有する成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって：
Ａ１）該所望の配列を有する鋳型核酸に連結させるためのリンカー核酸；
Ａ２）該リンカー核酸を該鋳型核酸に結合させる結合手段；
Ｂ）該鋳型核酸と該リンカー核酸とが連結したリンカー核酸結合鋳型核酸から核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産手段；
Ｃ）該転写反応によって生じる核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を生じさせる核酸増幅手段；
Ｄ）該核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段；および
Ｅ）所望でないＲＮＡ配列を除去するＲＮＡ配列除去手段、
を備える、キット。
【請求項５２】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含むことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記リンカー核酸は、制限酵素部位を含まないことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５４】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５５】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端がライゲーション妨害基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５６】
前記リンカー核酸が二つ提供され、その一方の末端にリン酸が付加され、他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５７】
記ライゲーション妨害基が、ジデオキシヌクレオチドである、請求項５５または５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記リンカー核酸が二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されていることを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項５９】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は少なくとも３’側がＲＮＡである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６０】
前記リンカーが二つ提供され、前記リンカー核酸が第１のリンカー核酸および第２のリンカー核酸の二つ提供され、そのうちの第１のリンカー核酸の一方の末端にリン酸が付加され、該第１のリンカー核酸の他方の末端がライゲーションを妨害する基で改変されており、第２のリンカー核酸は５’側がＤＮＡであり３’側がＲＮＡである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６１】
前記結合手段は、ＲＮＡリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６２】
前記結合手段は、ＤＮＡとＲＮＡとの連結を媒介する能力も有するリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６３】
前記結合手段は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項６４】
前記鋳型核酸はＲＮＡであり、前記核酸増幅鋳型生産手段は、逆転写酵素とプライマーを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６５】
前記プライマーセットは、該リンカー核酸結合鋳型核酸のリンカー核酸部分に相補的な配列を含むことを特徴とする、請求項５１に記載のキット。
【請求項６６】
前記核酸増幅手段は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される増幅反応のための手段を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６７】
前記核酸増幅手段は、ＤＮＡポリメラーゼとプライマーセットとを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６８】
前記プライマーセットは、前記リンカー核酸連結鋳型核酸の一部と同一の配列および相補的な配列をそれぞれ含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項６９】
前記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７０】
前記プライマーセットの両方が制限部位を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７１】
前記プライマーセットがマルチクローニングサイトを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７２】
前記プライマーセットのうち少なくとも１つがプロモーター配列を含み、該プライマーセットの両方が制限部位を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７３】
Ｃ−２）前記増幅産物をクローニングするためのベクター、さらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７４】
Ｃ−３）前記増幅産物に含まれる制限部位を認識し切断する制限酵素を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項７５】
前記核酸増幅反応によって増幅された産物を鋳型としてＲＮＡを生産する手段は、ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項７６】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、前記プライマーセットに含まれる前記プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項７７】
前記プロモーター配列がＴ７プロモーター、Ｓ６プロモーターまたはＴ３プロモーターであり、前記ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーターに対応してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１に記載のキット。
【請求項７８】
Ｄ−１）ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅをさらに備える、請求項５１に記載のキット。
【請求項７９】
前記ＲＮａｓｅ活性のないＤＮａｓｅは、前記鋳型となった増幅産物であるＤＮＡを除去するために用いられる、請求項５１に記載のキット。
【請求項８０】
Ｄ−２）生産されたＲＮＡを精製するための精製手段をさらに備える、請求項５１に記載のキット。
【請求項８１】
前記精製手段は、フェノール／クロロホルム抽出手段およびエタノール沈澱手段である、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
前記除去手段は、ＲＮａｓｅである、請求項５１に記載のキット。
【請求項８３】
前記除去手段は、ＤＮＡと結合している一本鎖ＲＮＡのみを選択的に分解するＲＮａｓｅである、請求項５１に記載のキット。
【請求項８４】
前記除去手段は、ＲＮａｓｅ Ｈである、請求項５１に記載のキット。
【請求項８５】
前記リンカー核酸結合鋳型核酸の配列のうち、前記所望の配列以外の配列と相補的な除去用プライマーをさらに包含する、請求項５１に記載のキット。
【請求項８６】
前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
前記除去用プライマーは、前記所望の配列からなるＲＮＡに直接連結されている配列に対して相補的な配列を少なくとも１つ含み、該相補的な配列は、前記ＲＮＡ産物とのハイブリダイズ形成に充分な長さを含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８８】
さらに、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生じたオーバーハングを除去する手段を備える、請求項５１に記載のキット。
【請求項８９】
機能を有するＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、
Ａ）対象ＲＮＡを提供する工程；
Ｂ）Ｂ−１）該所望の配列を有する鋳型核酸にリンカー核酸を結合させてリンカー核酸結合鋳型核酸を生産するライゲーション工程；
Ｂ−２）該リンカー核酸結合鋳型核酸に基づいて核酸増幅鋳型を生産する核酸増幅鋳型生産工程；
Ｂ−３）該核酸増幅鋳型に対して核酸増幅反応を行って増幅産物を生産する増幅工程；
Ｂ−４）該増幅産物をベクターに配置し、該ベクターで宿主を形質転換する工程；
Ｂ−５）該宿主を増幅させる増幅された宿主からベクターを入手する工程；
Ｂ−６）該ベクターを鋳型として用いてＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ産物を生産するＲＮＡ増幅工程；および
Ｂ−７）該ＲＮＡ産物から所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する調整工程、
を行って、対象ＲＮＡを増幅生産する工程、
Ｃ）該対象ＲＮＡを試験細胞に感染させる工程；
Ｄ）該試験細胞が所望の機能を発現した場合、該発現が見出される試験細胞に含まれる対象ＲＮＡに対応する宿主をさらに培養して増幅させる工程；
Ｅ）必要に応じて、Ｂ−５〜Ｂ−７、ＣおよびＤを繰り返し、単一コロニーを探索する工程、
Ｆ）該単一コロニーに含まれるＲＮＡの配列を決定する工程；
ここで、該決定された配列と該機能と関連付けて、機能を有するRNAが同定される、方法。
【請求項９０】
Ｇ）該ＲＮＡの発現パターン解析を行う工程、をさらに包含する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
請求項１〜４に記載のRNAまたは請求項５〜８８に記載の方法によって生産されたRNAの、該RNAの機能を利用する分析または診断のための使用。
【請求項９２】
所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産する方法であって、
ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマーと該所望の配列を含むＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程；および
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する工程、
を包含する、方法。
【請求項９３】
前記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
所望の配列を含むＲＮＡから所望でないＲＮＡ配列を除去し、それにより成熟型ＲＮＡを生産するためのキットであって、
ａ）所望の配列を含むＲＮＡ以外の配列に相補的な少なくとも１つのＤＮＡプライマー；および
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のみを認識して分解する手段、
を備える、キット。
【請求項９５】
前記ＤＮＡプライマーは、５’末端に少なくとも１つおよび３’末端に少なくとも１つ含む、請求項９４に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−２０２５２１（Ｐ２００７−２０２５２１Ａ）
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７７７７（Ｐ２００６−２７７７７）
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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