低減したアレルギー誘発性および保持されたＴ細胞反応性を有するＰｈｌｐ５ａ誘導体
【課題】草花粉アレルギーを有する患者の特異的免疫療法（減感作）または草花粉アレルギーの予防免疫療法のために用いることができる、イチゴツナギ亜科(Pooideae)のグループ５アレルゲンの変異型の提供。
【解決手段】既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、および同時にＴリンパ球による実質的に保持された反応性により特徴付けられる、イチゴツナギ亜科(Pooideae)のグループ５アレルゲンの変異型。
【解決手段】既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、および同時にＴリンパ球による実質的に保持された反応性により特徴付けられる、イチゴツナギ亜科(Pooideae)のグループ５アレルゲンの変異型。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、および同時にＴリンパ球による実質的に保持された反応性により特徴付けられる、イチゴツナギ亜科(Pooideae)のグループ５アレルゲンの変異型の調製および使用に関する。
これらの低刺激性アレルゲン変異型を、草花粉アレルギーを有する患者の特異的免疫療法（減感作）または草花粉アレルギーの予防免疫療法のために用いることができる。
本発明の好ましい態様は、オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉からの主要アレルゲンPhl p 5aの変異型に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
１型アレルギーは、世界的にも重要である。先進国の人口の２０％までもが、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病状を患っている。これらのアレルギーは、植物の花粉、ダニ、ネコまたはイヌなどの様々な発生源から放出された空気中に存在するアレルゲン（空気アレルゲン）が原因である。同様に、これらの１型アレルギー患者の４０％までもが、草花粉アレルゲンに対し、特異的ＩｇＥ反応性を示す（Freidhoff et al., 1986, J. Allelgy Clin. Immunol. 78, 1190-2002）。
【０００３】
１型アレルギーを誘発する物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。粘膜を介した摂取の後、これらのアレルゲンは、感作された体内において肥満細胞の表面に結合しているＩｇＥ分子と反応する。２つのＩｇＥ分子が互いにアレルゲンにより架橋した場合、エフェクター細胞によるメディエーター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカインの放出が起こり、それに対応した臨床的な症状が生じる。
【０００４】
個々のアレルゲン分子がアレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する相対的頻度に依存して、主要および非主要アレルゲン間で区別される。
【０００５】
オオアワガエリ(Phleum pratense)の場合、Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796)、Phl p 5 (Matthiesen and Loewenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109)、Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198)およびPhl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)が、これまでに主要アレルゲンとして同定されている。
【０００６】
オオアワガエリ(Phleum pratense)の優勢な主要アレルゲンは、Phl p 1およびPhl p 5であり、Phl p 5は、それらの分子量について異なり、独立した遺伝子によりコードされる5aおよび5bの２種の形状で生じる。Phl p 5aのおよびPhl p 5bの両方の推定アミノ酸配列を、組み換えＤＮＡ技術を用いて決定してきた。Phl p 5aは、約３２ｋＤａのタンパク質であり、草花粉アレルギー患者の８５〜９０％のＩｇＥ抗体と反応する。Phl p 5aは、点突然変異を通じてお互いに異なり、おそらく異なるアレルギー形態に対応する一連の相同変異型中に存在する。例えば、Lolium perenne、Poa pratensisなどの近縁の草種の花粉は、とりわけ、Phl p 5aと相同であるアレルゲンを含有し、共にグループ５アレルゲンとして知られる。草種のこれらのグループ５アレルゲンの高い構造的相同性は相応して、草花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体を有する分子の高い交差反応性をもたらす。
【０００７】
効果的なアレルギーの治療上の処置への古典的アプローチは、特異的免疫療法または減感作方法である（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562）。この方法において、患者に天然のアレルゲン抽出物を漸増用量で皮下注射する。しかしながら、この方法では、アレルギー反応またはさらにアナフィラキシーショックの危険性を伴う。これらの危険性を最小限に抑えるために、アレルゴイドの形状の画期的な製剤が用いられる。これらは、化学的に修飾されたアレルゲン抽出物であり、非処理の抽出物と比較して、著しく低減されたＩｇＥ反応性を有するが、同一のＴ細胞反応性を有する（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382）。
【０００８】
さらにより実質的な治療の最適化が、組み換え方法により調製したアレルゲンを用いて可能であろう。任意で患者の個々の感作パターンに適合した、組み換え方法により調製した高純度アレルゲンの定義済み混合物(defined cocktail)は、様々なアレルゲンに加えて、比較的多数の免疫原性であるがアレルゲン性ではない二次タンパク質を含有することから、天然のアレルゲン源からの抽出物を置き換えることができる。
組み換え発現生成物による信頼性のある減感作をもたらすであろう現実的な展望は、治療に必須であるＴ細胞エピトープを損なわずに、ＩｇＥエピトープを特異的に欠失させる、特異的に突然変異した組み換えアレルゲンにより提供される（Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414）。
アレルギー患者における乱されたＴヘルパー細胞バランスの治療的処置についてのさらなる可能性は、関連アレルゲンをコードする発現可能なＤＮＡによる処置である（免疫療法的ＤＮＡワクチン接種）。
【０００９】
この型のＤＮＡワクチンによる免疫反応のアレルゲンに特異的な影響の初期の実験的証拠は、アレルゲンをコードするＤＮＡの注射により齧歯動物において提供されている(Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544)。
【発明の概要】
【００１０】
本発明が基礎とする目的は、低減したＩｇＥ活性と同時に実質的に保持されたＴ細胞反応性により区別され、したがって、特異的免疫療法および免疫療法的ＤＮＡワクチン接種に好適な、タンパク質およびＤＮＡレベルでのイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの新規の変異型の提供にある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同ｃＤＮＡ配列の関連領域のアライメントを示す図である。
【図２ａ】イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図２ｂ】イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図３】ヒスチジン融合タンパク質の形態の精製した欠失突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図４】精製した非融合タンパク質Phl p 5a DM-D94〜113、175〜198およびrPhl p 5a wtのSDS-PAGE（上）ならびにαPhl p 5抗体による同一性試験（下）を示す図である。
【図５】欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a(精製した非融合タンパク質)の分析(analytical)ＳＥＣを示す図である。
【図６】欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a（精製した非融合タンパク質）の非変性等電点電気泳動を示す図である。
【図７】Phl p 5a欠失突然変異体（非変性）のＩｇＥ結合能力を確認するためのストリップテストを示す図である。
【図８】２つの代表する単一の血清（ａおよびｂ）および血清プール（ｃ）によるＥＡＳＴ阻害試験を用いたPhl p 5a欠失突然変異体の低減したＩｇＥ反応性の決定を示す図である。
【図９】６人の異なる草花粉アレルギー患者（Ｐ）の好塩基球による好塩基球の活性化試験を用いた、Phl p 5a欠失突然変異体であるPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の低アレルギー誘発性の決定を示す図である。
【００１２】
図
図１：イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同ｃＤＮＡ配列の関連領域のアライメントである：Lolium perenne (Lol p)、Poa pratensis (Poa p)、Triticum aestivum (Tri a)およびHordeum vulgare (Hor v)
番号：ＤＮＡ挿入のヌクレオチド位置
Phl p 5a、Poa p 5およびLol p 5配列：National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USAの"Gen-Bank" データベースからのｃＤＮＡ配列
Hor vおよびTri a配列：Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, USAのESTデータベースからのEST配列
実線の境界線：Phl p 5aと同一の配列(GenBank AJ555152に基づく)
点線の境界線：アミノ酸94〜113に対応する欠失(deletion)(GenBank AJ555152に基づく)
破線の境界線：アミノ酸175〜198に対応する欠失(GenBank AJ555152に基づく)
【００１３】
図２：イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同アミノ酸配列のアライメントである（関連配列領域、ＤＮＡ配列から推定）：Lolium perenne (Lol p)、Poa pratensis (Poa p)、Triticum aestivum (Tri a)およびHordeum vulgare (Hor v)
番号：ＤＮＡ挿入のヌクレオチド位置
Phl p 5a、Poa p 5およびLol p 5配列：National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USAの"Gen-Bank" データベースからのｃＤＮＡ配列
Hor vおよびTri a配列：Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, USAのESTデータベースからのＥＳＴ配列
実線の境界線：Phl p 5aと同一の配列(GenBank AJ555152に基づく)
点線の境界線：アミノ酸94〜113に対応する欠失(GenBank AJ555152に基づく)
破線の境界線：アミノ酸175〜198に対応する欠失(GenBank AJ555152に基づく)
【００１４】
図３：ヒスチジン融合タンパク質の形態の精製した欠失突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
1) マーカー
2) rPhl p 5a wt (His)
3) Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)
4) Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)
5) Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)
6) マーカー
【００１５】
図４：精製した非融合タンパク質Phl p 5a DM-D94〜113、175〜198およびrPhl p 5a wtのSDS-PAGE（上）ならびにαPhl p 5抗体による同一性試験（下）を示す。
αPhl p 5 mAb Apha-1D11は、領域175〜198に結合する。
(rPhl p 5a wtのみが陽性である)
αPhl p 5a mAb Apha-3B2は、２つのPhl p 5a分子の結合エピトープ(joint epitope)を結合させる(両方のタンパク質は、陽性である)
(mAb:モノクローナル抗体)
【００１６】
図５：欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a(精製した非融合タンパク質)の分析(analytical)ＳＥＣを示す図である。
カラム：Superdex 75 HR10/ 30 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)
溶離剤：ＰＢＳ
矢印：排除量
【００１７】
図６：欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a（精製した非融合タンパク質）の非変性等電点電気泳動
1) IEFマーカー
2) rPhl p 5a wt
3) Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198
pI rPhl p 5a wt = 8.7
pI rPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 = 6.4
【００１８】
図７：Phl p 5a欠失突然変異体（非変性）のＩｇＥ結合能力を確認するためのストリップテスト(strip test)
Ｐ：臨床的に明確な草花粉アレルギー患者の血清
【００１９】
図８：２つの代表する単一の血清（ａおよびｂ）および血清プール（ｃ）によるＥＡＳＴ阻害試験を用いたPhl p 5a欠失突然変異体の低減したＩｇＥ反応性の決定
【表１】
Ｐ：臨床的に定義済の草花粉アレルギー患者の血清
【００２０】
図９：６人の異なる草花粉アレルギー患者（Ｐ）の好塩基球による好塩基球の活性化試験を用いた、Phl p 5a欠失突然変異体であるPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の低アレルギー誘発性の決定
【００２１】
発明の詳細な説明
ｃＤＮＡ配列の突然変異誘発およびクローニング
本発明の特に好ましい低刺激性Phl p 5a変異型の出発点は、オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉の全ｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、特異的プライマーを用いて単離された野生型Phl p 5aのイソ型のｃＤＮＡである(NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) GenBank番号AJ555152)(配列番号1)。配列番号２のように、アミノ酸配列はｃＤＮＡ配列から推定された。２８４のアミノ酸からなるPhl p 5aは、E. coli中で可溶性タンパク質として細胞質的に(cytosolically)発現され、続いて精製された。この組み換え野生型形状のPhl p 5a(rPhl p 5a wt)は、モノクローナル抗Phl p 5抗体と、および天然の精製したPhl p 5a(nPhl p 5a)と反応性を有する草花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する。
【００２２】
rPhl p 5a wtの上記ｃＤＮＡから始まり、一連の異なる欠失変異型(欠失突然変異体)を、制限／連結反応方法およびＰＣＲにより調製し、発現ベクターpProExHTaに連結反応(ligate)させた(Invitrogen, Carlsbad, USA)。ｃＤＮＡ分子の配列全体にわたって分布する長さ６〜７２ｂｐの部分(section)を欠失させ、E. coli中に発現したタンパク質のポリペプチド鎖における対応する欠失の誘導をもたらした。
【００２３】
Phl p 5aの欠失変異型を、草花粉アレルギー患者の代表する血清プールのＩｇＥ抗体へのそれらの結合能力について、免疫ブロット法により調査した。
この方法において、驚くべきことに、ＩｇＥ抗体（代表する血清プール）の結合を低減させた、Phl p 5aの２つの欠失変異型（アミノ酸94〜113の欠失であるPhl p 5a DM-Δ94〜113、およびrPhl p 5a wtのアミノ酸175〜198の欠失であるPhl p 5a DM-Δ175〜198）が、見出された。
これらの２つのPhl p 5a欠失は、両方の効果的な欠失（Phl p 5a DM -Δ94〜113、175〜198）を含有する二重欠失突然変異体の構築のための出発点としての機能を果たした。
【００２４】
遺伝子工学方法によるPhl p 5a DM-Δ94〜113、Phl p 5a DM-Δ175〜198およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の構築ならびにそれらの生化学的および免疫的特性を、以下に説明する。
【００２５】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113（配列番号３、ｃＤＮＡ配列（７９５ｂｐ）、および配列番号４、アミノ酸配列（２６４ａａ））の構築のために、第一に、rPhl p 5a wtのｃＤＮＡから始め、２つのフラグメントを調製した。rPhl p 5a wtのアミノ酸１〜９３をコードしたフラグメント「Ｆ１−９３」を、ＰＣＲによって、プライマー１および５を用いて調製し、フラグメント「Ｆ１１４−２８４」を、プライマー４および６を用いて調製した（プライマー配列、表１参照）。フラグメント「Ｆ１−９３」および「Ｆ１１４−２８４」を、プライマー１および４を使ってさらなるＰＣＲにおいて鋳型として用い、欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113をコードした完全ｃＤＮＡの増幅をもたらした。ＰＣＲによるフラグメント「Ｆ１−９３」および「Ｆ１１４−２８４」の連結の基礎は、両方のフラグメントに共通の配列領域であった。この配列領域は、５’領域でアミノ酸８８〜９３をコードした追加ＤＮＡ配列を含有した特別なセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによるフラグメント「Ｆ１１４−２８４」の増幅によって形成された（表１）。
【００２６】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ175〜198（配列番号５、ｃＤＮＡ配列（７８３ｂｐ）、および配列番号６、アミノ酸配列（２６０ａａ））をコードしたｃＤＮＡ配列は、制限およびそれに続く２つの別々に調製したｃＤＮＡフラグメントの連結反応により発生した。５’末端フラグメント「Ｆ１−１７４」をプライマー１および２を用いて、そして３’末端フラグメント「Ｆ１９９−２８４」をプライマー３および４を用いて、ＰＣＲによって調製した。ｃＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＳｐｅＩにより消化され、続いて連結反応した（表１参照）。連結反応生成物を、プライマー１および４を用いてＰＣＲにより増幅させた。
【００２７】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198（配列番号７、ｃＤＮＡ配列（７２３ｂｐ）、および配列番号８、アミノ酸配列（２４０ａａ））のｃＤＮＡも同様に、２つのｃＤＮＡフラグメントから調製した。５’末端フラグメントを、プライマー１および５を使用して、rPhl p 5a wt-cDNAを鋳型として発生させ、３’末端フラグメントを、プライマー４および６を使用して、Phl p 5a DM-Δ175〜198-cDNAを鋳型として発生させた。rPhl p 5a wtタンパク質のアミノ酸８８〜９３に対応する共通の配列領域を使って、フラグメントを、プライマー１および４を使用して３番目のＰＣＲによって連結し、生成物を増幅させた。
修飾されたアレルゲンをコードするｃＤＮＡを、EheIおよびHindIII制限部位を経て発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)に連結反応させ、続いて完全に配列決定した。
【００２８】
例えば、Poa pratensisおよびLolium perenneなどのイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの免疫交差反応性は、非常に類似したアミノ酸配列に基づいている。対応する遺伝子が共通の先祖遺伝子にさかのぼることは明白であると捉えられ得る。イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンにおける相同配列領域は、Phl p 5a wtタンパク質配列の欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の配列（参照：GenBank AJ555152）、またそれらのフランキング配列領域の両方について存在する。問題となっている配列領域の高い相同性を、ＤＮＡレベルで、またアミノ酸配列レベルでの両方で実証することができる（図１および図２）。
【００２９】
表１：欠失変異型の調製のために用いられるＰＣＲプライマーのリスト
【表２】
ＳｐｅＩ制限部位は、下線で示してある。
【００３０】
組み換えPhl p 5a分子の発現および精製
組み換えタンパク質を、Escherichia coli（菌種JM109）におけるヒスチジン融合成分(His)の任意的除去のために、統合(integrated)プロテアーゼ開裂部位（発現ベクターpProExHT; Invitrogen, Carlsbad, USA）によりヒスチジン融合タンパク質として発現させた。rPhl p5a wtおよび欠失突然変異体を、最初にＮ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリクス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ）への特異的結合により、続いて予備的(preparative)ゲルろ過（サイズ除去クロマトグラフィー、ＳＥＣ）により精製した。
【００３１】
溶出タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣにより監視した。結果により、rPhl p 5a wt (His)、Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His); Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)を、高純度で単量体型に調製することができることを示した（図３）。タンパク質の同一性を、Phl p 5a特異的モノクローナル抗体により実証した。
【００３２】
ＩｇＥ結合技術（免疫ブロット法、ストリップテスト、ＥＡＳＴ阻害試験および好塩基球の活性化試験）を用いたＩｇＥ反応性の点検およびＴ細胞反応性の調査を、ヒスチジン融合成分なしの試験物質を用いてさらに行った。
このために、欠失変異型を、最初に融合タンパク質として、比較タンパク質rPhl p 5a-wtと平行して調製した。しかしながら、ヒスチジン融合成分は続いて酵素的に開裂され（ＴＥＶプロテアーゼ、Invitrogen, Carlsbad, USA）、標的タンパク質のＮ末端にプロテアーゼ開裂配列の残基としてグリシンのみが残った。開裂したヒスチジン成分および開裂に使用したプロテアーゼの両方をＩＭＡＣにより完全に分離した。予備的ＳＥＣ後、溶出タンパク質の純度および立体構造を、rPhl p 5a wtおよび突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198それぞれについて、図４および５に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣにより点検した。すべてのタンパク質を、純粋および単量体型に調製した。非融合タンパク質の非変性等電点電気泳動法（ＩＥＦ）による調査は常に、表面電荷に対して高い均一性を示した（Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198についての例証は、図６参照）。
【００３３】
組み換えタンパク質の同一性を、モノクローナル抗Phl p 5抗体（Allergopharma, Reinbek, Germany）Apha-1D11またはApha-3B2（Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198についての例証は、図４参照）およびＮ末端配列により実証した。
【００３４】
Phl p 5a欠失変異型の低減したＩｇＥ結合の決定
アレルゲン性分子のＩｇＥ反応性の決定についての単純な試験方法は、ストリップテストによるアレルギー患者からの血清からの特異的ＩｇＥの、膜結合性試験タンパク質への結合の調査である。
【００３５】
この目的のために、試験物質を、同じ濃度および量で、一緒に非変性条件下で一片のニトロセルロース膜に結合させる。一連のかかる膜片を、アレルギー患者からの様々な血清と同時にインキュベートすることができる。洗浄段階後、特異的に結合したＩｇＥ抗体を、抗ｈＩｇＥ／アルカリホスファターゼ接合(conjugate)により促進された呈色反応により、膜上で可視化する。
【００３６】
組み換えタンパク質Phl p 5a wt (His)、Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)、Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)のＩｇＥ反応性を、草花粉アレルギー患者からの４３の個別の血清を使用して、ストリップテストにおいて比較調査した（図７）。
アレルギー患者からのすべての43の血清は、天然のPhl p 5a(nPhl p 5a、本明細書中に記載せず)および組み換え同等物のrPhl p 5a wt (His)と強力に反応するPhl p 5aに特異的なＩｇＥ抗体を含有した。
驚くべきことに、すべての４３の患者の血清のPhl p 5a特異的ＩｇＥ抗体は、欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)に全く結合しなかったか、または非常に狭い範囲で結合したかのどちらかであることが明らかになった。低減したＩｇＥ結合は、欠失Δ94〜113および欠失Δ175〜198の両方に起因する。欠失変異型Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)は、この試験において、アレルギー患者からの４３の血清のうち３５で、明らかにすぐ分かる低減したＩｇＥ結合能力を示す。いくつかの試験において、アミノ酸１７５〜１９８の欠失の影響は非常に大きく、ＩｇＥ結合を、事実上完全に防止した（例：Ｐ３、Ｐ２０、Ｐ２８）。
【００３７】
ＩｇＥ結合反応性への欠失Δ94〜113の影響は、さほど述べられていないが、同様に明らかに目に見える。欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)を、参照rPhl p 5a wt (His)よりも、アレルギー患者からの４３の個別の血清のうち１９のＩｇＥによって著しく弱く結合させた（例：Ｐ３１、Ｐ３７、Ｐ４２）。しかしながら、ＩｇＥ結合の低減は、多くの個々の試験において、Δ175〜198が原因の低減よりも大幅に少なく示された。
【００３８】
したがって、両方の欠失が、欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)の全体のＩｇＥ結合反応性における減少に寄与することは明らかである。
【００３９】
ストリップテストと対照的に、ＥＡＳＴ阻害試験（酵素アレルゲン吸着試験）は、溶液中のアレルゲン／ＩｇＥ相互作用の調査を可能にし、膜上で固定化することによる試験物質のエピトープのマスキングの妨害を、根本的に排除できるようにする。ＥＡＳＴ阻害試験を、以下のように行う。マイクロタイタープレートを、アレルゲンで、本発明の場合、天然のPhl p 5（Phl p 5aおよびPhl p 5bの混合物であるnPhl p 5a/b）で被覆する。洗浄による非結合のアレルゲン分子の除去後、以降の非特異的な結合を防止するために、プレートをウシ血清アルブミンで固定する。アレルギー患者のＩｇＥ抗体は、個々の血清のプール（血清プール）の代表としてまたは単一の血清として、アレルゲン被覆マイクロタイタープレートと共に好適な希釈率でインキュベートする。アレルゲン結合性ＩｇＥ抗体の量を、基質の着色した最終生成物への変換を通じて、第二の抗体（抗ｈＩｇＥ／アルカリホスファターゼ接合）に共役した酵素経由で光度的に定量化する。
ＩｇＥ抗体の結合を、可溶性アレルゲンまたは試験される物質（組み換え修飾されたアレルゲン）により、濃度に依存して、物質特異的に阻害する。免疫化学的に同一の物質は、同一の阻害曲線を示す。
【００４０】
本発明において使用された参照分子は、nPhl p 5、rPhl p 5a wt、およびヒスチジン融合タンパク質rPhl p 5a wt (His)である。他の分子に加えて、ヒスチジン融合タンパク質Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)、Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)の、および非融合タンパク質Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198のIgE結合を、これらの参照と比較して調査した。
【００４１】
図８ａ〜ｃは、２つの個々の血清および草花粉アレルギー患者の血清プールにより生じた試験物質の特異的阻害曲線を典型的に示す。nPhl p 5a/bは、すべての試験における最大の阻害効果を示した（１０μｇ／ｍｌの濃度で約８０〜９５％の阻害効果）。rPhl p 5aの阻害効果は、最大阻害の７０〜８０％へと著しく低下した。この効果は、イソ型Phl p 5aに加えてイソ型Phl p 5bも含有する、nPhl p 5a/bの組成によるものである。Phl p 5bに対する特異的ＩｇＥ抗体を、rPhl p 5a wtにより阻害することはできない。
ヒスチジン融合成分は、ＩｇＥ結合への効果を示さなかった。これは、rPhl p 5a wt (His)およびrPhl p 5a wtの同一の阻害曲線を通じてすべての試験において明らかである。これは、ヒスチジン融合タンパク質を用いる試験の妥当性を実証している。
【００４２】
一般的に、２グループの患者血清を、定性的ＩｇＥ結合に関して区別した。
第一のグループは、個々の血清Ｐ１５により表される（図８ａ）。アレルギー患者からのこれらの血清は、Phl p 5への結合が欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の両方により低減したＩｇＥ抗体を含んだ。欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)は、本発明においてほんの約５０％の最大阻害効果を示し、および欠失突然変異体Phl p 5a DM-175〜198 (His)は、たった２０〜３０％の阻害効果を示した。
二重欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)は、用いた最高濃度でＩｇＥ抗体の結合を０〜１０％しか阻害することができなかった。非融合タンパク質Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の使用は、この結果を確認した（０〜１０％の最大ＩｇＥ阻害）。
【００４３】
個々の血清Ｐ４４により表される（図８ｂ）アレルギー患者からの血清の第二のグループは、血清に存在するＩｇＥ抗体が、Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)と反応するのと同等に、参照rPhl p 5a wt (His)とも反応した（７０〜８０％の最大阻害）一方、ＩｇＥ抗体がPhl p 5a DM-Δ175〜198 (His)と反応しなかったかあるいは検出不可能な量だけ反応した（０〜１０％の最大阻害）事実から、第一のグループとは異なる。
二重欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198も同様に、このグループのアレルギー患者からの血清により大きく低減した阻害効果を示し（０〜１０％）、融合タンパク質についておよび融合成分が含まれていないタンパク質についての両方で示された。
これらのアレルギー患者の血清は明らかに、主に分子のＣ末端部のエピトープに対するＩｇＥ抗体を含んだ。
【００４４】
２０人のアレルギー患者の血清プールのＩｇＥ抗体のＩｇＥ結合反応性の測定データは、Phl p 5aのIgE結合の減少のための欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の重要性を明確に示す(図8 c)。個々の欠失突然変異体であるPhl p 5a DM-Δ94〜113 (His)およびPhl p 5a DM-Δ175〜198 (His)の両方は、rPhl p 5a wt（約７０％）より低いそれぞれ４０〜５０％および約３０％の最大阻害効果を示す。二重欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198は、血清プールのＩｇＥ抗体により非常に弱く結合し（１０〜１５％の最大阻害）、ストリップテストにおける４３人のアレルギー患者の試験に一致して、すべてではなくとも、非常に多くの草花粉アレルギー患者におけるこのPhl p 5a変異型の大きく低減したＩｇＥ結合反応性を示す。
【００４５】
好塩基球の活性化試験による欠失突然変異体の低アレルギー誘発性の決定
好塩基球の活性化試験を用いて、エフェクター細胞の膜結合性ＩｇＥの架橋における機能的効果に関する欠失突然変異体の低減したＩｇＥ結合能力の効果およびそれらの活性化を調査した。したがって、アレルギー誘発性における機能的減少を、感受性in-vitro試験において測定した。
【００４６】
好塩基球の活性化試験のために、草花粉アレルギー患者からのヘパリン添加全血を、様々な濃度の試験物質と共にインキュベートする。アレルゲン性物質は、好塩基性顆粒球の高親和性ＩｇＥ受容体に結合した特異的ＩｇＥ抗体と結合することができる。
アレルゲン分子により開始されるＩｇＥ／受容体複合体の架橋は、エフェクター細胞の脱顆粒、したがってin vivoでアレルギー反応の開始をもたらす、シグナル変換をもたらす。
【００４７】
In vitroで、好塩基性免疫細胞のアレルゲン誘導活性化を、ＩｇＥ受容体架橋のシグナル変換に共役した表面タンパク質（ＣＤ２０３ｃ）の発現の定量化により決定することができる（Kahlert et al., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744）。細胞上で発現した表面タンパク質の数および細胞プールの活性化細胞のパーセンテージを、蛍光標識モノクローナル抗体の表面タンパク質への結合および続いて蛍光活性化フローサイトメトリーによる分析を介して高感度で測定する。
【００４８】
本発明において用いられる参照物質は、試験物質と平行して、精製した天然のPhl p 5a (nPhl p 5a)およびrPhl p5aの両方であった。６人の被験者からの好塩基球による二重欠失突然変異体Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198の試験結果を、図９に曲線で示す。合計１０人の臨床的に明確なアレルギー患者からの好塩基球による試験結果を、表２に示す。
参照分子のＡ５０値（Ａ５０：最大に活性化された好塩基球数の５０％でのアレルゲン濃度）は、個々に様々であり、rPhl p 5a wtについて約１．３〜１５ｐＭおよびnPhl p 5aについて約０．３〜１０ｐＭであった（表２）。これに対し、欠失変異型Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198のＡ５０値は、約１８〜８４００ｐＭであった。
用いられた３つの物質について決定したＡ５０値を、各被験者について変わらない参照分子nPhl p 5aおよびrPhl p5a wtに関して欠失変異型Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198のアレルゲン性の有効性を決定するために使用した（表２）。
【００４９】
欠失変異型Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198の相対的アレルゲン性の有効性（Ｐｒ、相対力）は、参照rPhl p 5a wtと比較して約１２〜５０００倍、または参照nPhl p 5aと比較して約１６〜３２０００倍低減した（表２）。
【００５０】
表２：好塩基球の活性化試験を用いた欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の低刺激性の決定
【表３】
ａ 最大に活性化された好塩基球数の５０％でのアレルゲン濃度
ｂ 相対力
ｃ 臨床的に明確な草花粉アレルギー患者
ｄ A50 rPhl p 5a wt/ A50 Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198からの計算
ｅ A50 nPhl p 5a/ A50 Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198からの計算
ｆ 太字：最小値および最大値
【００５１】
Ｔ細胞反応性
Ｔヘルパーリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）における酵素分解により形成されたアレルゲンのペプチドフラグメント（およそ１２〜２５のアミノ酸）と反応し、ＡＰＣｓの表面で個々のＭＨＣクラスＩＩ分子における好適なペプチドの封入(inclusion)後、Ｔ細胞に現れる。Ｔヘルパーリンパ球のこのアレルゲン特異的活性化は、続く反応（増殖、アネルギー、アポトーシス）におよび機能的分化（ＴＨ１およびＴＨ２）に必須の条件である。減感作におけるアレルゲンまたはアレルゲン変異型を用いた処置によるアレルゲン特異的Ｔ−リンパ球の影響は、治療上の有効性のためのカギであるとされている。
【００５２】
Ｔ細胞反応性を調査するために、イネ科の花粉アレルギー患者のオリゴクローナルＴ細胞系（ＴＣＬｓ）を、nPhl p5またはrPhl p 5分子による刺激を用いる従来の方法により、確立する。増殖試験において、様々なＴ細胞系を、参照アレルゲンnPhl p5aおよびrPhl p5a wtおよび二重欠失突然変異体Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198により刺激した。増殖率を、従来の方法により、［３Ｈ］チジミンの取り込みによって決定した。
【００５３】
表３：Phl p 5特異的Ｔ細胞系（ＴＣＬｓ）による増殖試験を用いた欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198のＴ細胞反応性の決定
【表４】
ａ ［３Ｈ］測定値から計算。アレルゲン刺激細胞培養物のｃｐｍ測定値／無刺激細胞培養物のｃｐｍ測定値
ｂ 提供者：臨床的に明確な草花粉アレルギー患者
【００５４】
６人のアレルギー患者からの１０のＴＣＬｓによる結果は、これらのＴＣＬが、変化のない天然のまたは組み換え野生型アレルゲンによるものと同程度の強度で、Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198により増殖への刺激を受けたことを示す（表３）。
【００５５】
したがって、本発明は、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、およびＴリンパ球との保持された反応性により特徴付けられるイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの変異型に関する。これらのグループ５アレルゲンは、好ましくはPhl p 5a、Poa p 5およびLol p 5であり、非常に特に好ましくはPhl p 5aである。
【００５６】
グループ５アレルゲンにおいて欠如するまたは除去されるPhl p 5aのアミノ酸配列領域94〜113および175〜198に対応するアミノ酸配列領域について、本発明の目的に特に好ましいと証明されたように、本発明は特に、かかるアレルゲン変異型に関する。最初に述べたまたは二番目に述べた領域は、個々に欠如していてもよいが、両方の前記領域はまた同時に欠如していてもよく、後者の態様が、非常に特に好ましい。
イチゴツナギ亜科からのグループ５アレルゲン内の高い配列の相同性のおかげで、これらの領域を、他のグループ５アレルゲンからの配列を有するPhl p 5a配列の配列アライメントにおいて疑いなく同定することができる。上記アレルゲン変異型は、好ましくはPhl p 5a由来であるか、または配列番号４、６または８に記載の配列に対応する。
【００５７】
本発明のアレルゲン変異型を、遺伝子工学方法を用いて、クローン化ＤＮＡ配列から出発して調製することができる。しかしながら、原理上は、天然のアレルゲン抽出物の化学修飾もまた、可能である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382)。
【００５８】
もちろん、他の位置におけるさらなる修飾もまた、例えば低アレルギー誘発性を増加させるために、本願明細書中に記載されたグループ５アレルゲンの変化(variations)を介して可能である。これらの修飾は、例えば、アミノ酸挿入、欠失および交換、タンパク質のフラグメントへの開裂ならびにタンパク質またはそのフラグメントの他のタンパク質またはペプチドとの融合であり得る。
【００５９】
本明細書中により詳細に記載したアレルゲン変異型の調製中、Hisタグを、過剰に発現したタンパク質の精製を改善する目的のために、遺伝子工学方法により導入した。
【００６０】
本発明はさらに、特に配列番号３、５または７に記載の配列に対応した、上記のアレルゲン変異型をコードするＤＮＡ分子に、このＤＮＡ分子を含有する組み換え発現ベクターに、ならびに前記ＤＮＡ分子または前記発現ベクターにより形質転換した宿主生物に関する。好適な宿主生物は、バクテリアまたは酵母などの原核生物または真核生物、単細胞生物または多細胞生物であってもよい。本発明にしたがって好ましい宿主生物は、E. coliである。
【００６１】
本発明はさらに、前記宿主生物の培養および対応するアレルゲン変異型の培養物からの単離による、本発明のアレルゲン変異型の調製方法に関する。
本発明は加えて、薬剤としてのそれらの特性における上記のアレルゲン変異型、ＤＮＡ分子および発現ベクターに関する。
【００６２】
本発明はさらに、イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、またはイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ワクチン接種のための、および／またはかかるアレルギーの防止のための、これらのアレルゲン変異型の少なくとも１つまたは対応するＤＮＡ分子または対応する発現ベクターおよび任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む医薬組成物に関する。
これらが、第二の型（少なくとも１つのＤＮＡ分子または１つの発現ベクターを含む）の医薬組成物である場合、これらの組成物は、好ましくはさらに、水酸化アルミニウム、免疫刺激性ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはこれら２種の組み合わせを、補助剤として含む。
【００６３】
本発明の目的のために、医薬組成物を、ヒト医学または獣医学において治療剤として使用することができる。好適な賦形剤は、非経口投与に好適であり、本発明のグループ５アレルゲン変異型と反応しない、有機または無機物質である。非経口投与に好適なのは、特に、溶液、好ましくは油性溶液または水溶液、さらに懸濁液、乳液または移植片である。本発明のアレルゲン変異型はまた、凍結乾燥してもよく、得られる凍結乾燥物は、例えば、注射製剤の調製に使われる。示した組成物を滅菌してもよく、ならびに／あるいは潤滑剤、保存剤、安定化剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変更する塩、緩衝物質および／または複数のさらなる活性成分などの補助剤を含んでもよい。
さらに、本発明のアレルゲン変異型の適当な処方は、例えば水酸化アルミニウムへの吸着により、デポー製剤を得るのを可能にする。
【００６４】
最後に、本発明は、イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、またはイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ワクチン接種のための、および／またはかかるアレルギーの防止のための薬剤の調製のための、本発明の少なくとも１つのアレルゲン変異型または本発明のＤＮＡ分子または本発明の発現ベクターの使用に関する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、および同時にＴリンパ球による実質的に保持された反応性により特徴付けられる、イチゴツナギ亜科(Pooideae)のグループ５アレルゲンの変異型の調製および使用に関する。
これらの低刺激性アレルゲン変異型を、草花粉アレルギーを有する患者の特異的免疫療法（減感作）または草花粉アレルギーの予防免疫療法のために用いることができる。
本発明の好ましい態様は、オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉からの主要アレルゲンPhl p 5aの変異型に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
１型アレルギーは、世界的にも重要である。先進国の人口の２０％までもが、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病状を患っている。これらのアレルギーは、植物の花粉、ダニ、ネコまたはイヌなどの様々な発生源から放出された空気中に存在するアレルゲン（空気アレルゲン）が原因である。同様に、これらの１型アレルギー患者の４０％までもが、草花粉アレルゲンに対し、特異的ＩｇＥ反応性を示す（Freidhoff et al., 1986, J. Allelgy Clin. Immunol. 78, 1190-2002）。
【０００３】
１型アレルギーを誘発する物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。粘膜を介した摂取の後、これらのアレルゲンは、感作された体内において肥満細胞の表面に結合しているＩｇＥ分子と反応する。２つのＩｇＥ分子が互いにアレルゲンにより架橋した場合、エフェクター細胞によるメディエーター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカインの放出が起こり、それに対応した臨床的な症状が生じる。
【０００４】
個々のアレルゲン分子がアレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する相対的頻度に依存して、主要および非主要アレルゲン間で区別される。
【０００５】
オオアワガエリ(Phleum pratense)の場合、Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796)、Phl p 5 (Matthiesen and Loewenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109)、Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198)およびPhl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)が、これまでに主要アレルゲンとして同定されている。
【０００６】
オオアワガエリ(Phleum pratense)の優勢な主要アレルゲンは、Phl p 1およびPhl p 5であり、Phl p 5は、それらの分子量について異なり、独立した遺伝子によりコードされる5aおよび5bの２種の形状で生じる。Phl p 5aのおよびPhl p 5bの両方の推定アミノ酸配列を、組み換えＤＮＡ技術を用いて決定してきた。Phl p 5aは、約３２ｋＤａのタンパク質であり、草花粉アレルギー患者の８５〜９０％のＩｇＥ抗体と反応する。Phl p 5aは、点突然変異を通じてお互いに異なり、おそらく異なるアレルギー形態に対応する一連の相同変異型中に存在する。例えば、Lolium perenne、Poa pratensisなどの近縁の草種の花粉は、とりわけ、Phl p 5aと相同であるアレルゲンを含有し、共にグループ５アレルゲンとして知られる。草種のこれらのグループ５アレルゲンの高い構造的相同性は相応して、草花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体を有する分子の高い交差反応性をもたらす。
【０００７】
効果的なアレルギーの治療上の処置への古典的アプローチは、特異的免疫療法または減感作方法である（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562）。この方法において、患者に天然のアレルゲン抽出物を漸増用量で皮下注射する。しかしながら、この方法では、アレルギー反応またはさらにアナフィラキシーショックの危険性を伴う。これらの危険性を最小限に抑えるために、アレルゴイドの形状の画期的な製剤が用いられる。これらは、化学的に修飾されたアレルゲン抽出物であり、非処理の抽出物と比較して、著しく低減されたＩｇＥ反応性を有するが、同一のＴ細胞反応性を有する（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382）。
【０００８】
さらにより実質的な治療の最適化が、組み換え方法により調製したアレルゲンを用いて可能であろう。任意で患者の個々の感作パターンに適合した、組み換え方法により調製した高純度アレルゲンの定義済み混合物(defined cocktail)は、様々なアレルゲンに加えて、比較的多数の免疫原性であるがアレルゲン性ではない二次タンパク質を含有することから、天然のアレルゲン源からの抽出物を置き換えることができる。
組み換え発現生成物による信頼性のある減感作をもたらすであろう現実的な展望は、治療に必須であるＴ細胞エピトープを損なわずに、ＩｇＥエピトープを特異的に欠失させる、特異的に突然変異した組み換えアレルゲンにより提供される（Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414）。
アレルギー患者における乱されたＴヘルパー細胞バランスの治療的処置についてのさらなる可能性は、関連アレルゲンをコードする発現可能なＤＮＡによる処置である（免疫療法的ＤＮＡワクチン接種）。
【０００９】
この型のＤＮＡワクチンによる免疫反応のアレルゲンに特異的な影響の初期の実験的証拠は、アレルゲンをコードするＤＮＡの注射により齧歯動物において提供されている(Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544)。
【発明の概要】
【００１０】
本発明が基礎とする目的は、低減したＩｇＥ活性と同時に実質的に保持されたＴ細胞反応性により区別され、したがって、特異的免疫療法および免疫療法的ＤＮＡワクチン接種に好適な、タンパク質およびＤＮＡレベルでのイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの新規の変異型の提供にある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同ｃＤＮＡ配列の関連領域のアライメントを示す図である。
【図２ａ】イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図２ｂ】イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図３】ヒスチジン融合タンパク質の形態の精製した欠失突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図４】精製した非融合タンパク質Phl p 5a DM-D94〜113、175〜198およびrPhl p 5a wtのSDS-PAGE（上）ならびにαPhl p 5抗体による同一性試験（下）を示す図である。
【図５】欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a(精製した非融合タンパク質)の分析(analytical)ＳＥＣを示す図である。
【図６】欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a（精製した非融合タンパク質）の非変性等電点電気泳動を示す図である。
【図７】Phl p 5a欠失突然変異体（非変性）のＩｇＥ結合能力を確認するためのストリップテストを示す図である。
【図８】２つの代表する単一の血清（ａおよびｂ）および血清プール（ｃ）によるＥＡＳＴ阻害試験を用いたPhl p 5a欠失突然変異体の低減したＩｇＥ反応性の決定を示す図である。
【図９】６人の異なる草花粉アレルギー患者（Ｐ）の好塩基球による好塩基球の活性化試験を用いた、Phl p 5a欠失突然変異体であるPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の低アレルギー誘発性の決定を示す図である。
【００１２】
図
図１：イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同ｃＤＮＡ配列の関連領域のアライメントである：Lolium perenne (Lol p)、Poa pratensis (Poa p)、Triticum aestivum (Tri a)およびHordeum vulgare (Hor v)
番号：ＤＮＡ挿入のヌクレオチド位置
Phl p 5a、Poa p 5およびLol p 5配列：National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USAの"Gen-Bank" データベースからのｃＤＮＡ配列
Hor vおよびTri a配列：Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, USAのESTデータベースからのEST配列
実線の境界線：Phl p 5aと同一の配列(GenBank AJ555152に基づく)
点線の境界線：アミノ酸94〜113に対応する欠失(deletion)(GenBank AJ555152に基づく)
破線の境界線：アミノ酸175〜198に対応する欠失(GenBank AJ555152に基づく)
【００１３】
図２：イチゴツナギ亜科種のPhl p 5a相同アミノ酸配列のアライメントである（関連配列領域、ＤＮＡ配列から推定）：Lolium perenne (Lol p)、Poa pratensis (Poa p)、Triticum aestivum (Tri a)およびHordeum vulgare (Hor v)
番号：ＤＮＡ挿入のヌクレオチド位置
Phl p 5a、Poa p 5およびLol p 5配列：National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USAの"Gen-Bank" データベースからのｃＤＮＡ配列
Hor vおよびTri a配列：Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, USAのESTデータベースからのＥＳＴ配列
実線の境界線：Phl p 5aと同一の配列(GenBank AJ555152に基づく)
点線の境界線：アミノ酸94〜113に対応する欠失(GenBank AJ555152に基づく)
破線の境界線：アミノ酸175〜198に対応する欠失(GenBank AJ555152に基づく)
【００１４】
図３：ヒスチジン融合タンパク質の形態の精製した欠失突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
1) マーカー
2) rPhl p 5a wt (His)
3) Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)
4) Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)
5) Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)
6) マーカー
【００１５】
図４：精製した非融合タンパク質Phl p 5a DM-D94〜113、175〜198およびrPhl p 5a wtのSDS-PAGE（上）ならびにαPhl p 5抗体による同一性試験（下）を示す。
αPhl p 5 mAb Apha-1D11は、領域175〜198に結合する。
(rPhl p 5a wtのみが陽性である)
αPhl p 5a mAb Apha-3B2は、２つのPhl p 5a分子の結合エピトープ(joint epitope)を結合させる(両方のタンパク質は、陽性である)
(mAb:モノクローナル抗体)
【００１６】
図５：欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a(精製した非融合タンパク質)の分析(analytical)ＳＥＣを示す図である。
カラム：Superdex 75 HR10/ 30 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)
溶離剤：ＰＢＳ
矢印：排除量
【００１７】
図６：欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198および組み換え野生型Phl p 5a（精製した非融合タンパク質）の非変性等電点電気泳動
1) IEFマーカー
2) rPhl p 5a wt
3) Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198
pI rPhl p 5a wt = 8.7
pI rPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 = 6.4
【００１８】
図７：Phl p 5a欠失突然変異体（非変性）のＩｇＥ結合能力を確認するためのストリップテスト(strip test)
Ｐ：臨床的に明確な草花粉アレルギー患者の血清
【００１９】
図８：２つの代表する単一の血清（ａおよびｂ）および血清プール（ｃ）によるＥＡＳＴ阻害試験を用いたPhl p 5a欠失突然変異体の低減したＩｇＥ反応性の決定
【表１】
Ｐ：臨床的に定義済の草花粉アレルギー患者の血清
【００２０】
図９：６人の異なる草花粉アレルギー患者（Ｐ）の好塩基球による好塩基球の活性化試験を用いた、Phl p 5a欠失突然変異体であるPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の低アレルギー誘発性の決定
【００２１】
発明の詳細な説明
ｃＤＮＡ配列の突然変異誘発およびクローニング
本発明の特に好ましい低刺激性Phl p 5a変異型の出発点は、オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉の全ｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、特異的プライマーを用いて単離された野生型Phl p 5aのイソ型のｃＤＮＡである(NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) GenBank番号AJ555152)(配列番号1)。配列番号２のように、アミノ酸配列はｃＤＮＡ配列から推定された。２８４のアミノ酸からなるPhl p 5aは、E. coli中で可溶性タンパク質として細胞質的に(cytosolically)発現され、続いて精製された。この組み換え野生型形状のPhl p 5a(rPhl p 5a wt)は、モノクローナル抗Phl p 5抗体と、および天然の精製したPhl p 5a(nPhl p 5a)と反応性を有する草花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する。
【００２２】
rPhl p 5a wtの上記ｃＤＮＡから始まり、一連の異なる欠失変異型(欠失突然変異体)を、制限／連結反応方法およびＰＣＲにより調製し、発現ベクターpProExHTaに連結反応(ligate)させた(Invitrogen, Carlsbad, USA)。ｃＤＮＡ分子の配列全体にわたって分布する長さ６〜７２ｂｐの部分(section)を欠失させ、E. coli中に発現したタンパク質のポリペプチド鎖における対応する欠失の誘導をもたらした。
【００２３】
Phl p 5aの欠失変異型を、草花粉アレルギー患者の代表する血清プールのＩｇＥ抗体へのそれらの結合能力について、免疫ブロット法により調査した。
この方法において、驚くべきことに、ＩｇＥ抗体（代表する血清プール）の結合を低減させた、Phl p 5aの２つの欠失変異型（アミノ酸94〜113の欠失であるPhl p 5a DM-Δ94〜113、およびrPhl p 5a wtのアミノ酸175〜198の欠失であるPhl p 5a DM-Δ175〜198）が、見出された。
これらの２つのPhl p 5a欠失は、両方の効果的な欠失（Phl p 5a DM -Δ94〜113、175〜198）を含有する二重欠失突然変異体の構築のための出発点としての機能を果たした。
【００２４】
遺伝子工学方法によるPhl p 5a DM-Δ94〜113、Phl p 5a DM-Δ175〜198およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の構築ならびにそれらの生化学的および免疫的特性を、以下に説明する。
【００２５】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113（配列番号３、ｃＤＮＡ配列（７９５ｂｐ）、および配列番号４、アミノ酸配列（２６４ａａ））の構築のために、第一に、rPhl p 5a wtのｃＤＮＡから始め、２つのフラグメントを調製した。rPhl p 5a wtのアミノ酸１〜９３をコードしたフラグメント「Ｆ１−９３」を、ＰＣＲによって、プライマー１および５を用いて調製し、フラグメント「Ｆ１１４−２８４」を、プライマー４および６を用いて調製した（プライマー配列、表１参照）。フラグメント「Ｆ１−９３」および「Ｆ１１４−２８４」を、プライマー１および４を使ってさらなるＰＣＲにおいて鋳型として用い、欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113をコードした完全ｃＤＮＡの増幅をもたらした。ＰＣＲによるフラグメント「Ｆ１−９３」および「Ｆ１１４−２８４」の連結の基礎は、両方のフラグメントに共通の配列領域であった。この配列領域は、５’領域でアミノ酸８８〜９３をコードした追加ＤＮＡ配列を含有した特別なセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによるフラグメント「Ｆ１１４−２８４」の増幅によって形成された（表１）。
【００２６】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ175〜198（配列番号５、ｃＤＮＡ配列（７８３ｂｐ）、および配列番号６、アミノ酸配列（２６０ａａ））をコードしたｃＤＮＡ配列は、制限およびそれに続く２つの別々に調製したｃＤＮＡフラグメントの連結反応により発生した。５’末端フラグメント「Ｆ１−１７４」をプライマー１および２を用いて、そして３’末端フラグメント「Ｆ１９９−２８４」をプライマー３および４を用いて、ＰＣＲによって調製した。ｃＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＳｐｅＩにより消化され、続いて連結反応した（表１参照）。連結反応生成物を、プライマー１および４を用いてＰＣＲにより増幅させた。
【００２７】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198（配列番号７、ｃＤＮＡ配列（７２３ｂｐ）、および配列番号８、アミノ酸配列（２４０ａａ））のｃＤＮＡも同様に、２つのｃＤＮＡフラグメントから調製した。５’末端フラグメントを、プライマー１および５を使用して、rPhl p 5a wt-cDNAを鋳型として発生させ、３’末端フラグメントを、プライマー４および６を使用して、Phl p 5a DM-Δ175〜198-cDNAを鋳型として発生させた。rPhl p 5a wtタンパク質のアミノ酸８８〜９３に対応する共通の配列領域を使って、フラグメントを、プライマー１および４を使用して３番目のＰＣＲによって連結し、生成物を増幅させた。
修飾されたアレルゲンをコードするｃＤＮＡを、EheIおよびHindIII制限部位を経て発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)に連結反応させ、続いて完全に配列決定した。
【００２８】
例えば、Poa pratensisおよびLolium perenneなどのイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの免疫交差反応性は、非常に類似したアミノ酸配列に基づいている。対応する遺伝子が共通の先祖遺伝子にさかのぼることは明白であると捉えられ得る。イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンにおける相同配列領域は、Phl p 5a wtタンパク質配列の欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の配列（参照：GenBank AJ555152）、またそれらのフランキング配列領域の両方について存在する。問題となっている配列領域の高い相同性を、ＤＮＡレベルで、またアミノ酸配列レベルでの両方で実証することができる（図１および図２）。
【００２９】
表１：欠失変異型の調製のために用いられるＰＣＲプライマーのリスト
【表２】
ＳｐｅＩ制限部位は、下線で示してある。
【００３０】
組み換えPhl p 5a分子の発現および精製
組み換えタンパク質を、Escherichia coli（菌種JM109）におけるヒスチジン融合成分(His)の任意的除去のために、統合(integrated)プロテアーゼ開裂部位（発現ベクターpProExHT; Invitrogen, Carlsbad, USA）によりヒスチジン融合タンパク質として発現させた。rPhl p5a wtおよび欠失突然変異体を、最初にＮ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレートマトリクス（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ）への特異的結合により、続いて予備的(preparative)ゲルろ過（サイズ除去クロマトグラフィー、ＳＥＣ）により精製した。
【００３１】
溶出タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣにより監視した。結果により、rPhl p 5a wt (His)、Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His); Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)を、高純度で単量体型に調製することができることを示した（図３）。タンパク質の同一性を、Phl p 5a特異的モノクローナル抗体により実証した。
【００３２】
ＩｇＥ結合技術（免疫ブロット法、ストリップテスト、ＥＡＳＴ阻害試験および好塩基球の活性化試験）を用いたＩｇＥ反応性の点検およびＴ細胞反応性の調査を、ヒスチジン融合成分なしの試験物質を用いてさらに行った。
このために、欠失変異型を、最初に融合タンパク質として、比較タンパク質rPhl p 5a-wtと平行して調製した。しかしながら、ヒスチジン融合成分は続いて酵素的に開裂され（ＴＥＶプロテアーゼ、Invitrogen, Carlsbad, USA）、標的タンパク質のＮ末端にプロテアーゼ開裂配列の残基としてグリシンのみが残った。開裂したヒスチジン成分および開裂に使用したプロテアーゼの両方をＩＭＡＣにより完全に分離した。予備的ＳＥＣ後、溶出タンパク質の純度および立体構造を、rPhl p 5a wtおよび突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198それぞれについて、図４および５に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣにより点検した。すべてのタンパク質を、純粋および単量体型に調製した。非融合タンパク質の非変性等電点電気泳動法（ＩＥＦ）による調査は常に、表面電荷に対して高い均一性を示した（Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198についての例証は、図６参照）。
【００３３】
組み換えタンパク質の同一性を、モノクローナル抗Phl p 5抗体（Allergopharma, Reinbek, Germany）Apha-1D11またはApha-3B2（Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198についての例証は、図４参照）およびＮ末端配列により実証した。
【００３４】
Phl p 5a欠失変異型の低減したＩｇＥ結合の決定
アレルゲン性分子のＩｇＥ反応性の決定についての単純な試験方法は、ストリップテストによるアレルギー患者からの血清からの特異的ＩｇＥの、膜結合性試験タンパク質への結合の調査である。
【００３５】
この目的のために、試験物質を、同じ濃度および量で、一緒に非変性条件下で一片のニトロセルロース膜に結合させる。一連のかかる膜片を、アレルギー患者からの様々な血清と同時にインキュベートすることができる。洗浄段階後、特異的に結合したＩｇＥ抗体を、抗ｈＩｇＥ／アルカリホスファターゼ接合(conjugate)により促進された呈色反応により、膜上で可視化する。
【００３６】
組み換えタンパク質Phl p 5a wt (His)、Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)、Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)のＩｇＥ反応性を、草花粉アレルギー患者からの４３の個別の血清を使用して、ストリップテストにおいて比較調査した（図７）。
アレルギー患者からのすべての43の血清は、天然のPhl p 5a(nPhl p 5a、本明細書中に記載せず)および組み換え同等物のrPhl p 5a wt (His)と強力に反応するPhl p 5aに特異的なＩｇＥ抗体を含有した。
驚くべきことに、すべての４３の患者の血清のPhl p 5a特異的ＩｇＥ抗体は、欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)に全く結合しなかったか、または非常に狭い範囲で結合したかのどちらかであることが明らかになった。低減したＩｇＥ結合は、欠失Δ94〜113および欠失Δ175〜198の両方に起因する。欠失変異型Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)は、この試験において、アレルギー患者からの４３の血清のうち３５で、明らかにすぐ分かる低減したＩｇＥ結合能力を示す。いくつかの試験において、アミノ酸１７５〜１９８の欠失の影響は非常に大きく、ＩｇＥ結合を、事実上完全に防止した（例：Ｐ３、Ｐ２０、Ｐ２８）。
【００３７】
ＩｇＥ結合反応性への欠失Δ94〜113の影響は、さほど述べられていないが、同様に明らかに目に見える。欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)を、参照rPhl p 5a wt (His)よりも、アレルギー患者からの４３の個別の血清のうち１９のＩｇＥによって著しく弱く結合させた（例：Ｐ３１、Ｐ３７、Ｐ４２）。しかしながら、ＩｇＥ結合の低減は、多くの個々の試験において、Δ175〜198が原因の低減よりも大幅に少なく示された。
【００３８】
したがって、両方の欠失が、欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)の全体のＩｇＥ結合反応性における減少に寄与することは明らかである。
【００３９】
ストリップテストと対照的に、ＥＡＳＴ阻害試験（酵素アレルゲン吸着試験）は、溶液中のアレルゲン／ＩｇＥ相互作用の調査を可能にし、膜上で固定化することによる試験物質のエピトープのマスキングの妨害を、根本的に排除できるようにする。ＥＡＳＴ阻害試験を、以下のように行う。マイクロタイタープレートを、アレルゲンで、本発明の場合、天然のPhl p 5（Phl p 5aおよびPhl p 5bの混合物であるnPhl p 5a/b）で被覆する。洗浄による非結合のアレルゲン分子の除去後、以降の非特異的な結合を防止するために、プレートをウシ血清アルブミンで固定する。アレルギー患者のＩｇＥ抗体は、個々の血清のプール（血清プール）の代表としてまたは単一の血清として、アレルゲン被覆マイクロタイタープレートと共に好適な希釈率でインキュベートする。アレルゲン結合性ＩｇＥ抗体の量を、基質の着色した最終生成物への変換を通じて、第二の抗体（抗ｈＩｇＥ／アルカリホスファターゼ接合）に共役した酵素経由で光度的に定量化する。
ＩｇＥ抗体の結合を、可溶性アレルゲンまたは試験される物質（組み換え修飾されたアレルゲン）により、濃度に依存して、物質特異的に阻害する。免疫化学的に同一の物質は、同一の阻害曲線を示す。
【００４０】
本発明において使用された参照分子は、nPhl p 5、rPhl p 5a wt、およびヒスチジン融合タンパク質rPhl p 5a wt (His)である。他の分子に加えて、ヒスチジン融合タンパク質Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)、Phl p 5a DM-Δ175〜198 (His)およびPhl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)の、および非融合タンパク質Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198のIgE結合を、これらの参照と比較して調査した。
【００４１】
図８ａ〜ｃは、２つの個々の血清および草花粉アレルギー患者の血清プールにより生じた試験物質の特異的阻害曲線を典型的に示す。nPhl p 5a/bは、すべての試験における最大の阻害効果を示した（１０μｇ／ｍｌの濃度で約８０〜９５％の阻害効果）。rPhl p 5aの阻害効果は、最大阻害の７０〜８０％へと著しく低下した。この効果は、イソ型Phl p 5aに加えてイソ型Phl p 5bも含有する、nPhl p 5a/bの組成によるものである。Phl p 5bに対する特異的ＩｇＥ抗体を、rPhl p 5a wtにより阻害することはできない。
ヒスチジン融合成分は、ＩｇＥ結合への効果を示さなかった。これは、rPhl p 5a wt (His)およびrPhl p 5a wtの同一の阻害曲線を通じてすべての試験において明らかである。これは、ヒスチジン融合タンパク質を用いる試験の妥当性を実証している。
【００４２】
一般的に、２グループの患者血清を、定性的ＩｇＥ結合に関して区別した。
第一のグループは、個々の血清Ｐ１５により表される（図８ａ）。アレルギー患者からのこれらの血清は、Phl p 5への結合が欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の両方により低減したＩｇＥ抗体を含んだ。欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)は、本発明においてほんの約５０％の最大阻害効果を示し、および欠失突然変異体Phl p 5a DM-175〜198 (His)は、たった２０〜３０％の阻害効果を示した。
二重欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)は、用いた最高濃度でＩｇＥ抗体の結合を０〜１０％しか阻害することができなかった。非融合タンパク質Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の使用は、この結果を確認した（０〜１０％の最大ＩｇＥ阻害）。
【００４３】
個々の血清Ｐ４４により表される（図８ｂ）アレルギー患者からの血清の第二のグループは、血清に存在するＩｇＥ抗体が、Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)と反応するのと同等に、参照rPhl p 5a wt (His)とも反応した（７０〜８０％の最大阻害）一方、ＩｇＥ抗体がPhl p 5a DM-Δ175〜198 (His)と反応しなかったかあるいは検出不可能な量だけ反応した（０〜１０％の最大阻害）事実から、第一のグループとは異なる。
二重欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198も同様に、このグループのアレルギー患者からの血清により大きく低減した阻害効果を示し（０〜１０％）、融合タンパク質についておよび融合成分が含まれていないタンパク質についての両方で示された。
これらのアレルギー患者の血清は明らかに、主に分子のＣ末端部のエピトープに対するＩｇＥ抗体を含んだ。
【００４４】
２０人のアレルギー患者の血清プールのＩｇＥ抗体のＩｇＥ結合反応性の測定データは、Phl p 5aのIgE結合の減少のための欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の重要性を明確に示す(図8 c)。個々の欠失突然変異体であるPhl p 5a DM-Δ94〜113 (His)およびPhl p 5a DM-Δ175〜198 (His)の両方は、rPhl p 5a wt（約７０％）より低いそれぞれ４０〜５０％および約３０％の最大阻害効果を示す。二重欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198は、血清プールのＩｇＥ抗体により非常に弱く結合し（１０〜１５％の最大阻害）、ストリップテストにおける４３人のアレルギー患者の試験に一致して、すべてではなくとも、非常に多くの草花粉アレルギー患者におけるこのPhl p 5a変異型の大きく低減したＩｇＥ結合反応性を示す。
【００４５】
好塩基球の活性化試験による欠失突然変異体の低アレルギー誘発性の決定
好塩基球の活性化試験を用いて、エフェクター細胞の膜結合性ＩｇＥの架橋における機能的効果に関する欠失突然変異体の低減したＩｇＥ結合能力の効果およびそれらの活性化を調査した。したがって、アレルギー誘発性における機能的減少を、感受性in-vitro試験において測定した。
【００４６】
好塩基球の活性化試験のために、草花粉アレルギー患者からのヘパリン添加全血を、様々な濃度の試験物質と共にインキュベートする。アレルゲン性物質は、好塩基性顆粒球の高親和性ＩｇＥ受容体に結合した特異的ＩｇＥ抗体と結合することができる。
アレルゲン分子により開始されるＩｇＥ／受容体複合体の架橋は、エフェクター細胞の脱顆粒、したがってin vivoでアレルギー反応の開始をもたらす、シグナル変換をもたらす。
【００４７】
In vitroで、好塩基性免疫細胞のアレルゲン誘導活性化を、ＩｇＥ受容体架橋のシグナル変換に共役した表面タンパク質（ＣＤ２０３ｃ）の発現の定量化により決定することができる（Kahlert et al., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744）。細胞上で発現した表面タンパク質の数および細胞プールの活性化細胞のパーセンテージを、蛍光標識モノクローナル抗体の表面タンパク質への結合および続いて蛍光活性化フローサイトメトリーによる分析を介して高感度で測定する。
【００４８】
本発明において用いられる参照物質は、試験物質と平行して、精製した天然のPhl p 5a (nPhl p 5a)およびrPhl p5aの両方であった。６人の被験者からの好塩基球による二重欠失突然変異体Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198の試験結果を、図９に曲線で示す。合計１０人の臨床的に明確なアレルギー患者からの好塩基球による試験結果を、表２に示す。
参照分子のＡ５０値（Ａ５０：最大に活性化された好塩基球数の５０％でのアレルゲン濃度）は、個々に様々であり、rPhl p 5a wtについて約１．３〜１５ｐＭおよびnPhl p 5aについて約０．３〜１０ｐＭであった（表２）。これに対し、欠失変異型Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198のＡ５０値は、約１８〜８４００ｐＭであった。
用いられた３つの物質について決定したＡ５０値を、各被験者について変わらない参照分子nPhl p 5aおよびrPhl p5a wtに関して欠失変異型Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198のアレルゲン性の有効性を決定するために使用した（表２）。
【００４９】
欠失変異型Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198の相対的アレルゲン性の有効性（Ｐｒ、相対力）は、参照rPhl p 5a wtと比較して約１２〜５０００倍、または参照nPhl p 5aと比較して約１６〜３２０００倍低減した（表２）。
【００５０】
表２：好塩基球の活性化試験を用いた欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の低刺激性の決定
【表３】
ａ 最大に活性化された好塩基球数の５０％でのアレルゲン濃度
ｂ 相対力
ｃ 臨床的に明確な草花粉アレルギー患者
ｄ A50 rPhl p 5a wt/ A50 Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198からの計算
ｅ A50 nPhl p 5a/ A50 Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198からの計算
ｆ 太字：最小値および最大値
【００５１】
Ｔ細胞反応性
Ｔヘルパーリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）における酵素分解により形成されたアレルゲンのペプチドフラグメント（およそ１２〜２５のアミノ酸）と反応し、ＡＰＣｓの表面で個々のＭＨＣクラスＩＩ分子における好適なペプチドの封入(inclusion)後、Ｔ細胞に現れる。Ｔヘルパーリンパ球のこのアレルゲン特異的活性化は、続く反応（増殖、アネルギー、アポトーシス）におよび機能的分化（ＴＨ１およびＴＨ２）に必須の条件である。減感作におけるアレルゲンまたはアレルゲン変異型を用いた処置によるアレルゲン特異的Ｔ−リンパ球の影響は、治療上の有効性のためのカギであるとされている。
【００５２】
Ｔ細胞反応性を調査するために、イネ科の花粉アレルギー患者のオリゴクローナルＴ細胞系（ＴＣＬｓ）を、nPhl p5またはrPhl p 5分子による刺激を用いる従来の方法により、確立する。増殖試験において、様々なＴ細胞系を、参照アレルゲンnPhl p5aおよびrPhl p5a wtおよび二重欠失突然変異体Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198により刺激した。増殖率を、従来の方法により、［３Ｈ］チジミンの取り込みによって決定した。
【００５３】
表３：Phl p 5特異的Ｔ細胞系（ＴＣＬｓ）による増殖試験を用いた欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198のＴ細胞反応性の決定
【表４】
ａ ［３Ｈ］測定値から計算。アレルゲン刺激細胞培養物のｃｐｍ測定値／無刺激細胞培養物のｃｐｍ測定値
ｂ 提供者：臨床的に明確な草花粉アレルギー患者
【００５４】
６人のアレルギー患者からの１０のＴＣＬｓによる結果は、これらのＴＣＬが、変化のない天然のまたは組み換え野生型アレルゲンによるものと同程度の強度で、Phl p 5a DM Δ94〜113、175〜198により増殖への刺激を受けたことを示す（表３）。
【００５５】
したがって、本発明は、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、およびＴリンパ球との保持された反応性により特徴付けられるイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの変異型に関する。これらのグループ５アレルゲンは、好ましくはPhl p 5a、Poa p 5およびLol p 5であり、非常に特に好ましくはPhl p 5aである。
【００５６】
グループ５アレルゲンにおいて欠如するまたは除去されるPhl p 5aのアミノ酸配列領域94〜113および175〜198に対応するアミノ酸配列領域について、本発明の目的に特に好ましいと証明されたように、本発明は特に、かかるアレルゲン変異型に関する。最初に述べたまたは二番目に述べた領域は、個々に欠如していてもよいが、両方の前記領域はまた同時に欠如していてもよく、後者の態様が、非常に特に好ましい。
イチゴツナギ亜科からのグループ５アレルゲン内の高い配列の相同性のおかげで、これらの領域を、他のグループ５アレルゲンからの配列を有するPhl p 5a配列の配列アライメントにおいて疑いなく同定することができる。上記アレルゲン変異型は、好ましくはPhl p 5a由来であるか、または配列番号４、６または８に記載の配列に対応する。
【００５７】
本発明のアレルゲン変異型を、遺伝子工学方法を用いて、クローン化ＤＮＡ配列から出発して調製することができる。しかしながら、原理上は、天然のアレルゲン抽出物の化学修飾もまた、可能である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382)。
【００５８】
もちろん、他の位置におけるさらなる修飾もまた、例えば低アレルギー誘発性を増加させるために、本願明細書中に記載されたグループ５アレルゲンの変化(variations)を介して可能である。これらの修飾は、例えば、アミノ酸挿入、欠失および交換、タンパク質のフラグメントへの開裂ならびにタンパク質またはそのフラグメントの他のタンパク質またはペプチドとの融合であり得る。
【００５９】
本明細書中により詳細に記載したアレルゲン変異型の調製中、Hisタグを、過剰に発現したタンパク質の精製を改善する目的のために、遺伝子工学方法により導入した。
【００６０】
本発明はさらに、特に配列番号３、５または７に記載の配列に対応した、上記のアレルゲン変異型をコードするＤＮＡ分子に、このＤＮＡ分子を含有する組み換え発現ベクターに、ならびに前記ＤＮＡ分子または前記発現ベクターにより形質転換した宿主生物に関する。好適な宿主生物は、バクテリアまたは酵母などの原核生物または真核生物、単細胞生物または多細胞生物であってもよい。本発明にしたがって好ましい宿主生物は、E. coliである。
【００６１】
本発明はさらに、前記宿主生物の培養および対応するアレルゲン変異型の培養物からの単離による、本発明のアレルゲン変異型の調製方法に関する。
本発明は加えて、薬剤としてのそれらの特性における上記のアレルゲン変異型、ＤＮＡ分子および発現ベクターに関する。
【００６２】
本発明はさらに、イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、またはイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ワクチン接種のための、および／またはかかるアレルギーの防止のための、これらのアレルゲン変異型の少なくとも１つまたは対応するＤＮＡ分子または対応する発現ベクターおよび任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む医薬組成物に関する。
これらが、第二の型（少なくとも１つのＤＮＡ分子または１つの発現ベクターを含む）の医薬組成物である場合、これらの組成物は、好ましくはさらに、水酸化アルミニウム、免疫刺激性ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはこれら２種の組み合わせを、補助剤として含む。
【００６３】
本発明の目的のために、医薬組成物を、ヒト医学または獣医学において治療剤として使用することができる。好適な賦形剤は、非経口投与に好適であり、本発明のグループ５アレルゲン変異型と反応しない、有機または無機物質である。非経口投与に好適なのは、特に、溶液、好ましくは油性溶液または水溶液、さらに懸濁液、乳液または移植片である。本発明のアレルゲン変異型はまた、凍結乾燥してもよく、得られる凍結乾燥物は、例えば、注射製剤の調製に使われる。示した組成物を滅菌してもよく、ならびに／あるいは潤滑剤、保存剤、安定化剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変更する塩、緩衝物質および／または複数のさらなる活性成分などの補助剤を含んでもよい。
さらに、本発明のアレルゲン変異型の適当な処方は、例えば水酸化アルミニウムへの吸着により、デポー製剤を得るのを可能にする。
【００６４】
最後に、本発明は、イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、またはイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ワクチン接種のための、および／またはかかるアレルギーの防止のための薬剤の調製のための、本発明の少なくとも１つのアレルゲン変異型または本発明のＤＮＡ分子または本発明の発現ベクターの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、およびＴリンパ球との実質的に保持された反応性により特徴付けられるイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの変異型。
【請求項２】
Phl p 5a、Poa p 5およびLol p 5からなる群から選択された、請求項１に記載のアレルゲン変異型。
【請求項３】
Phl p 5a由来の、請求項１または２に記載のアレルゲン変異型。
【請求項４】
Phl p 5aのアミノ酸配列領域94〜113および175〜198に対応する少なくとも１つの領域または領域の組み合わせが、既知の野生型アレルゲンと比較して欠如していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のアレルゲン変異型。
【請求項５】
アミノ酸配列領94〜113および175〜198から選択された少なくとも１つの領域または領域の組み合わせが欠如していることを特徴とする、アレルゲンPhl p 5aの変異型。
【請求項６】
配列番号４、６および８に記載の配列の１つから選択されたアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のアレルゲンPhl p 5aの変異型。
【請求項７】
組み換え遺伝子工学方法により得られることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のアレルゲン変異型。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型をコードするＤＮＡ分子。
【請求項９】
配列番号３、５および７に記載の配列の１つから選択されたＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子。
【請求項１０】
発現制御配列に機能的に結合している、請求項８または９に記載のＤＮＡ分子を含有する、組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８または９に記載のＤＮＡ分子または請求項１０に記載の発現ベクターにより形質転換した、宿主生物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主生物の培養および培養物からの対応するアレルゲン変異型の単離による、請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型の調製方法。
【請求項１３】
薬剤としての請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型。
【請求項１４】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、請求項１〜７のいずれかに対応する少なくとも１つのアレルゲン変異型、および任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための薬剤の製造のための、少なくとも１つの請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型の使用。
【請求項１６】
薬剤としての請求項８または９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１７】
薬剤としての請求項１０に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１８】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはかかるアレルギーの予防のための、少なくとも１つの請求項１６に記載のＤＮＡ分子または少なくとも１つの請求項１７に記載の発現ベクターならびに、任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
水酸化アルミニウム、免疫刺激性ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはこれら２つの組み合わせを補助剤として含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはかかるアレルギーの予防のための薬剤の製造のための、少なくとも１つの請求項１６に記載のＤＮＡ分子または少なくとも１つの請求項１７に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１】
既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、およびＴリンパ球との実質的に保持された反応性により特徴付けられるイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの変異型。
【請求項２】
Phl p 5a、Poa p 5およびLol p 5からなる群から選択された、請求項１に記載のアレルゲン変異型。
【請求項３】
Phl p 5a由来の、請求項１または２に記載のアレルゲン変異型。
【請求項４】
Phl p 5aのアミノ酸配列領域94〜113および175〜198に対応する少なくとも１つの領域または領域の組み合わせが、既知の野生型アレルゲンと比較して欠如していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のアレルゲン変異型。
【請求項５】
アミノ酸配列領94〜113および175〜198から選択された少なくとも１つの領域または領域の組み合わせが欠如していることを特徴とする、アレルゲンPhl p 5aの変異型。
【請求項６】
配列番号４、６および８に記載の配列の１つから選択されたアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のアレルゲンPhl p 5aの変異型。
【請求項７】
組み換え遺伝子工学方法により得られることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のアレルゲン変異型。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型をコードするＤＮＡ分子。
【請求項９】
配列番号３、５および７に記載の配列の１つから選択されたＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子。
【請求項１０】
発現制御配列に機能的に結合している、請求項８または９に記載のＤＮＡ分子を含有する、組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８または９に記載のＤＮＡ分子または請求項１０に記載の発現ベクターにより形質転換した、宿主生物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主生物の培養および培養物からの対応するアレルゲン変異型の単離による、請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型の調製方法。
【請求項１３】
薬剤としての請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型。
【請求項１４】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、請求項１〜７のいずれかに対応する少なくとも１つのアレルゲン変異型、および任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための薬剤の製造のための、少なくとも１つの請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型の使用。
【請求項１６】
薬剤としての請求項８または９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１７】
薬剤としての請求項１０に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１８】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはかかるアレルギーの予防のための、少なくとも１つの請求項１６に記載のＤＮＡ分子または少なくとも１つの請求項１７に記載の発現ベクターならびに、任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
水酸化アルミニウム、免疫刺激性ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはこれら２つの組み合わせを補助剤として含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはかかるアレルギーの予防のための薬剤の製造のための、少なくとも１つの請求項１６に記載のＤＮＡ分子または少なくとも１つの請求項１７に記載の発現ベクターの使用。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−４１５６６（Ｐ２０１１−４１５６６Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０７４３８（Ｐ２０１０−２０７４３８）
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【分割の表示】特願２００６−５０８１６４（Ｐ２００６−５０８１６４）の分割
【原出願日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【分割の表示】特願２００６−５０８１６４（Ｐ２００６−５０８１６４）の分割
【原出願日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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