併用療法におけるＣＤ８３の使用
本発明は、ＣＤ８３の使用を含む、望ましくない免疫応答を抑制および／または予防する改善された方法に関する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３を、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とともに、被験体に同時投与する。寛容誘導性樹状細胞および制御性Ｔ細胞を産生するための方法も提供される。これらの細胞は、治療目的のためのさらなる細胞を産生するために、インビトロにおいて使用可能であり、または望ましくない免疫応答を抑制および／または予防するために、インビボにおいて使用可能である。本発明の方法は、自己免疫疾患を予防するため、またはその重症度を減少させるために使用可能であり、治療用タンパク質または移植組織のような、少なくとも１つの治療用組成物に対する寛容誘導性を誘導するためにも使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年５月３日に出願された米国特許仮出願第６０／９２７，３７７号、および２００６年８月１８日に出願された米国特許仮出願第６０／８３８，８１２号（両方の内容は参照によって明確に本明細書に組み込まれている）の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、望ましくない免疫応答を抑制または予防するために、被験体を治療する改善された方法に関する。本方法にはＣＤ８３の使用が含まれ、被験体を治療用組成物に対して寛容化する。たとえば、本方法は、移植組織の拒絶を予防するために使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳動物の免疫系は、非常に多数の外来抗原に対する防御反応を開始することが可能である。不運なことに、この応答性が、たとえば移植組織、遺伝子治療ベクター、および特定の疾患および疾病の治療のために使用される化合物（とりわけタンパク質）を含む、治療上の使用を意図した化合物へ向けられた場合、まさにこの応答性が困難を引き起こす可能性がある。たとえば、Ｂ型血友病に苦しんでいる患者は、治療用第ＩＸ因子に対して、ならびにこれらの患者において、第ＩＸ因子を発現するために使用される遺伝子移入ベクターに対して免疫応答を生ずる可能性がある（たとえば、Ｄｏｂｒｙｚｙｎｓｋｉら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４５９２−４５９７を参照のこと）。同様に、治療用抗体（たとえばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標））で治療した患者は、これらの治療用抗体に対する免疫応答を生ずる可能性があり、これらの治療用抗体の効果をなくし、さらなるリスクを患者に対して引き起こす。
【０００３】
不運なことに、望ましくない免疫応答を予防する、または除去するための現在の治療は、典型的に、免疫応答の全体的な抑制を引き起こす化合物の使用を伴う（たとえば、Ｊａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の第１４章を参照のこと）。これらの治療は、患者に将来の感染に対するリスクを与え（たとえばＧｏｔｔｓｃｈａｌｋら（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５６：２９−４４を参照のこと）、一般に望ましくない、重度の副作用を持つ。異なる治療を組み合わせたいくつかの研究によって、いくつかの組合せが実際に毒性を悪化させることが示された（たとえば、Ａｎｄｏｈら，（１９９６）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６２：３１１−３１６を参照のこと）。現在使用可能な治療は、長時間、場合によっては（たとえば組織移植の場合）患者の人生の残り時間にわたる治療もまた必要とする可能性がある。
【０００４】
また、たとえば、接触皮膚炎、慢性喘息、薬物アレルギー、および全身性アナフィラキシーのような、アレルギー性反応および過敏反応を治療することにおいて、集中的で、時間制限を設けた免疫系の抑制が望ましい多くの他の例が存在する（たとえばＪａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）の第１２章を参照のこと）。一般に、これらの応答を抑制するための臨床治療はまた、広範囲に効果を持つ（Ｊａｎｅｗａｙら，上記を参照のこと）。別の例が、Ｂ細胞媒介性応答に関して見られる。Ｂ細胞は、抗体が媒介する移植片拒絶の主要なメディエーターであり、また抗原提示細胞としても機能する。しかしながら、望ましくないＢ細胞媒介性応答の副作用を予防するための現在の療法は、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いる枯渇に限定されており、Ｂ細胞活性化および／または分化を予防するための効果的な療法は存在しない。望まれない免疫応答のために現在使用されている他の治療は、特定の阻害剤を使用して、マスト細胞によって産生される炎症性メディエーターの合成および効果を遮断する。脱感作を誘導するために設計されたいくつかの治療は、特定の抗原（単数または複数）の注入を伴い、これらの治療は、ＴＨ２型応答からＴＨ１型応答へアレルゲンに対する免疫応答を変更し、それによってＩｇＧがＩｇＥのかわりに産生されると考えられる。これらの治療は多くの症例で成功してきたが、すべての症例で成功したわけではない。
【０００５】
細胞リンパ球溶解、遅延型過敏症（ＤＴＨ）、移植拒絶および同種移植片拒絶を含む、多くの型の免疫が、Ｔ細胞によって媒介される（たとえば、Ｐａｕｌ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（３ｒｄ ｅｄ．）を参照のこと）。Ｔ細胞の挙動は、樹状細胞（「ＤＣ」）によって影響を受けるが、これらは免疫系の専門的抗原提示細胞であり、Ｔ細胞応答を劇的に刺激可能である（本明細書で場合により「免疫刺激性樹状細胞（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）」とも呼ぶ；たとえばＢａｎｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔ編（１９９５）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｓｃｈｕｌｅｒら（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７；米国特許出願第１０／２８７，８１３号を参照のこと）。
【０００６】
状況によっては、樹状細胞はまた、免疫寛容において重要な役割を果たす。これに関連して、これらはしばしば「寛容誘導性樹状細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」と呼ばれる（たとえば、Ｓｔｅｉｎｍａｎら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１；Ｋｕｂａｃｈら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：１９７−２０３を参照のこと）。不運なことに、樹状細胞は末梢血で非常に稀であり、したがって、特定の適用は、治療量の寛容誘導性樹状細胞を産生するためにエクスビボの方法を必要としうる。免疫刺激性ＤＣを作製するための方法が記述されている（たとえば米国特許第６，２７４，３７８号を参照のこと）が、これらのＤＣは寛容誘導性ではない。「制御性Ｔ細胞」を含む別の型の細胞もまた、寛容誘導性において役割を果たすことが示された（たとえばＢｏｅｈｍｅｒ（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３３８−３４４を参照のこと）。齧歯類での研究によって、自己応答性Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能の両方を積極的かつ優位に防止する、専門的な制御性（または「サプレッサー」）Ｔ細胞の固有のＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団が示された（Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−１１６４；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９６９−１９８０；Ｉｔｏｈら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６）。これらの制御性Ｔ細胞の除去または不活性化が、結果として、重度の自己免疫疾患となり、またアロ抗原および腫瘍に対する免疫応答を増強することが示された（たとえばＳｈｉｍｉｚｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５２１１−５２１８も参照のこと）。最近の研究によって、ヒトにおいて制御性Ｔ細胞が同定された（米国特許出願第１０／６６１，８０４号）。制御特性を持つが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞ではないヒトＴ細胞の調製も報告された（米国特許出願第１０／６１８，１３４号を参照のこと）。
【０００７】
ＣＤ８３は、免疫グロブリン（「Ｉｇ」）スーパーファミリーのタンパク質からの分子である（たとえば、Ｚｈｏｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２を参照のこと；また米国特許第７，１６９，８９８号を参照のこと；概説のために、ＦｕｊｉｍｏｔｏおよびＴｅｄｄｅｒ（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｄｅｎｔ．Ｓｃｉ．５３：８６−９１を参照のこと）。ＣＤ８３の正確な機能はまだ決定されていないが、ＣＤ８３の可溶型が、未熟および成熟樹状細胞の両方に結合することが報告された（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）。筆者らはまた、このタンパク質が、インビトロにおいて成熟させた樹状細胞によって、ＣＤ８０およびＣＤ８３の発現を減少させたこと、およびＴ細胞をインビトロにおいて刺激する樹状細胞の能力を阻害したことを報告した（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：２７３−２７５も参照のこと）。別の者が、インビボでのＣＤ８３の可溶型の存在を報告した（たとえば、Ｈｏｃｋら（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：９５９−９６７を参照のこと）。ＨＳＶ−１感染ＤＣでの研究によって、ウイルス感染が、ＣＤ８３の分解とＣＤ８３ ｍＲＮＡ輸送の阻害とを導くことが示された；ＨＳＶ−１による回避についてのこの可能性のある機構は、ＣＤ８３のＤＣ生物学に対する重要性をさらに支持する（たとえばＫｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７１２７−７１３６を参照のこと）。Ｋｒｕｓｅら（２０００）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１５８１−１５８９）は、ＧＣ７（Ｎ（１）−グアニル−１，７−ジアミノヘプタン）が、ＣＤ８３ ｍＲＮＡの核細胞質間移行を干渉し、ＣＤ８３の表面発現を阻止し、これらのＤＣによるＴリンパ球の活性化を有意に阻害したことを報告した。
【０００８】
ＣＤ８３は、約４５ｋＤａの一本鎖糖タンパク質であり、ＣＤ８３の未熟型には、膜の中へのタンパク質の挿入に際して除去される、シグナルペプチドが含まれる。成熟ＣＤ８３には、３つの構造ドメイン、すなわち細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが含まれる（たとえば、細胞外ドメインを正しく同定した、ＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）。ＣＤ８３細胞外ドメインには、少なくとも２つのエキソンによってコードされており（たとえばＺｈｏｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２；ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＃Ｚ１１６９７）、ネイティブの成熟樹状細胞（「ｍＤＣ」）の細胞表面上に非常に強く発現している、単一Ｉｇ様（Ｖ型）ドメインが含まれる。
【０００９】
米国特許第５，３１６，９２０号および対応するＷＯ９３／２１３１８は、ＣＤ８３タンパク質（「ＨＢ１５」と呼ばれる）および「任意の特定のドメイン、リガンド結合断片または免疫特異的断片を含む、ＨＢ１５タンパク質またはその部分をコードするｃＤＮＡ配列」を記述している（第２欄、２３〜２５行目）。この特許はまた、「免疫学的障害、疾患または症候群を治療するための、ＨＢ１５に応答する抗体および抗ＨＢ１５抗体、または他のＨＢ１５機能に対するアンタゴニストの使用方法」の使用も議論している（要約を参照のこと）。この特許はさらに、「ＨＢ１５抗体、その免疫特異的結合断片若しくはリガンド結合断片若しくは特異的なドメイン、またはＨＢ１５機能に干渉するＨＢ１５に対する他のアンタゴニストを、免疫応答若しくは細胞相互作用の発現若しくは進行を調節若しくは阻害するため、またはＨＢ１５を発現している細胞に対して薬物、毒素若しくは造影剤を送達するために、治療上使用可能である」ことを推測している（第３欄、６〜１２行目）。
【００１０】
米国特許第５，７１０，２６２号（米国特許第５，３１６，９２０号として特許付与された出願の一部継続出願）および対応するＷＯ９５／２９２３６は、ＣＤ８３タンパク質を対象とし、ヒトタンパク質とマウスタンパク質との比較を議論している（第２欄、４６〜４８行目）。これらの特許および出願はさらに、「ヒトＨＢ１５またはＨＢ１５の哺乳動物ホモログを産生する方法」（第３欄、５〜６行目）、抗体の産生（第４欄、３５〜３７行目）、および「ＨＢ１５を発現する細胞に薬物、毒素または造影剤を送達する」ためのＨＢ１５抗体の使用（第４欄、３８〜３９行目）を対象としている。
【００１１】
ＷＯ９７／２９７８１は、「薬学的に許容可能な担体中のＣＤ８３試薬および抗原を投与し、それによってＣＤ８３が抗原特異的抗体の産生を刺激することを含む、体液性免疫応答を刺激する方法」を対象としている（１ページ）。該出願は、「好ましい実施形態において、ＣＤ８３試薬は、ＣＤ８３の細胞外ドメインを含むＣＤ８３ペプチド、およびＣＤ８３の細胞外ドメインをコードするＤＮＡである」と言及している（２ページ）。該出願はまた、哺乳動物における望ましくない抗原特異的応答を阻害するためのＣＤ８３抗体の使用を議論しており、「そのような方法は・・・自己免疫疾患、および組織または器官の移植拒絶を防止または治療するする際に、ならびにアレルギーまたは喘息の治療または予防の際に有用である」と言及している（３ページ）。
【００１２】
ＷＯ２００４／０４６１８２および対応する米国特許第７，１６９，８９８号（両方とも、そのすべてが参照によって本明細書に組み込まれている）は、ＣＤ８３の細胞外ドメインを正しく同定し、「樹状細胞、Ｔ細胞および／またはＢ細胞に関する細胞性免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または病状の治療および予防のための・・・ＣＤ８３ファミリーのタンパク質の可溶性型のメンバーの使用」を示している（ＷＯ２００４／０４６１８２、７ページ）。このＰＣＴ出願（１２ページ）は、ＣＤ８３の一形態が、未熟および成熟樹状細胞の両方において、変化した表面マーカー発現パターンを誘導したことを言及している。さらに、「本発明のＣＤ８３ファミリーのタンパク質の可溶性型のメンバーが、樹状細胞のＴ細胞および／またはＢ細胞との相互作用を崩壊させ、および／または樹状細胞−Ｔ細胞クラスターの形成を阻害することが可能である・・・」（１４ページ；またＳｅｎｅｃｈａｌら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３：４２０７−４２１５を参照のこと）。該出願はさらに、ｈＣＤ８３ｅｘｔで治療したマウスは、実験的自己免疫脳炎（「ＥＡＥ」）に関連した典型的な麻痺症を発症しなかったことを開示している（１２ページ；またＺｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１を参照のこと）。
【００１３】
以上を概観すると、本出願人らは、免疫応答の全体的な抑制を生ずることなしに、そして患者に対する他の損害を引き起こすことなしに、特定の組成物に対する免疫応答を抑制可能である安全で効果的な治療に対する必要性を認識した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／９２７，３７７号
【特許文献２】米国特許仮出願第６０／８３８，８１２号
【特許文献３】米国特許出願第１０／２８７，８１３号
【特許文献４】米国特許第６，２７４，３７８号
【特許文献５】米国特許出願第１０／６６１，８０４号
【特許文献６】米国特許出願第１０／６１８，１３４号
【特許文献７】米国特許第７，１６９，８９８号
【特許文献８】ＷＯ２００４／０４６１８２
【特許文献９】米国特許第５，３１６，９２０号
【特許文献１０】ＷＯ９３／２１３１８
【特許文献１１】米国特許第５，７１０，２６２号
【特許文献１２】ＷＯ９５／２９２３６
【特許文献１３】ＷＯ９７／２９７８１
【特許文献１４】米国特許出願第１０／３８２，３９７号
【特許文献１５】米国特許出願第１０／５３５，５２２号
【特許文献１６】米国特許第７，０１５，２０４号
【特許文献１７】米国特許第７，１６０，９８７号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄｏｂｒｙｚｙｎｓｋｉら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４５９２−４５９７
【非特許文献２】Ｊａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の第１４章
【非特許文献３】Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５６：２９−４４
【非特許文献４】Ａｎｄｏｈら，（１９９６）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６２：３１１−３１６
【非特許文献５】Ｊａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）の第１２章
【非特許文献６】Ｐａｕｌ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（３ｒｄ ｅｄ．）
【非特許文献７】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔ編（１９９５）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
【非特許文献８】Ｓｃｈｕｌｅｒら（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７
【非特許文献９】Ｓｔｅｉｎｍａｎら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１
【非特許文献１０】Ｋｕｂａｃｈら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：１９７−２０３
【非特許文献１１】Ｂｏｅｈｍｅｒ（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３３８−３４４
【非特許文献１２】Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−１１６４
【非特許文献１３】Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９６９−１９８０
【非特許文献１４】Ｉｔｏｈら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６
【非特許文献１５】Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５２１１−５２１８
【非特許文献１６】ＦｕｊｉｍｏｔｏおよびＴｅｄｄｅｒ（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｄｅｎｔ．Ｓｃｉ．５３：８６−９１
【非特許文献１７】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１
【非特許文献１８】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：２７３−２７５
【非特許文献１９】Ｈｏｃｋら（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：９５９−９６７
【非特許文献２０】Ｋｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７１２７−７１３６
【非特許文献２１】Ｋｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１５８１−１５８９
【非特許文献２２】Ｓｅｎｅｃｈａｌら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３：４２０７−４２１５
【非特許文献２３】Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１
【非特許文献２４】Ｚｈｏｕら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２
【非特許文献２５】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．）
【非特許文献２６】Ｄａｉら（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９−１７５
【非特許文献２７】ＰｒａｔおよびＡｎｔｅｌ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２２５−２３０
【非特許文献２８】Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｊｕｎｅ ２１，２０００：１−２３
【非特許文献２９】Ｈｏｃｋら（２００６）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６７：５７−６０
【非特許文献３０】Ｍａｈａｎｏｎｄａら（２００２）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．３７：１７７−１８３
【非特許文献３１】Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４
【非特許文献３２】Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．）
【非特許文献３３】Ａｎｔｏｎｙら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１０７７５−１０７８４
【非特許文献３４】Ｅｓｃｒｉｏｕら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６８：２７６−２８８
【非特許文献３５】Ｇｕｙ−Ｃａｆｆｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３１３９１−３１３９６
【非特許文献３６】Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７
【非特許文献３７】Ｂｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（２３）：５３１０−５３１７
【非特許文献３８】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｉｃｏら編（Ｗｉｌｅｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）
【非特許文献３９】Ｗａｎｇら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３８２３−３８３６
【非特許文献４０】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２４：４４５−４５２
【非特許文献４１】Ｌｕｔｚら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２３：７７
【非特許文献４２】Ｃａｒｕｓｏら（１９９７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２７：７１
【非特許文献４３】Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：１８１
【非特許文献４４】ＴａｎｑｕａｙおよびＫｉｌｌｉｏｎ（１９９４）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１３：２５９
【非特許文献４５】Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
本発明は、ＣＤ８３の使用を含む、望ましくない免疫応答を抑制および／または予防する改善された方法に関する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３を、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とともに、被験体に同時投与する。寛容誘導性樹状細胞および制御性Ｔ細胞を産生するための方法も提供される。これらの細胞は、治療目的のためのさらなる細胞を産生するために、インビトロにおいて使用可能であり、または望ましくない免疫応答を抑制および／または予防するために、インビボにおいて使用可能である。本発明の方法は、自己免疫疾患を予防するため、またはその重症度を減少させるために使用可能であり、治療用タンパク質または移植組織のような、少なくとも１つの治療用組成物に対する寛容誘導性を誘導するためにも使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１（実施例２を参照のこと）は、Ｔ細胞増殖アッセイにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｔ細胞が由来したマウスに投与したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の濃度の関数として示す。簡単に記すと、動物をｓＣＤ８３で処理し、ついでＫＬＨを注射し、２８日後、脾臓細胞を採取して、様々な用量のＫＬＨで再刺激した。ｓＣＤ８３で処理した動物から得た細胞（菱形）、ならびにＢＳＡで処理していない（四角）またはＢＳＡで処理した（三角）対照動物に関して、３Ｈ−チミジンの組み込みをＫＬＨ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す。
【図２】図２は、Ｔ細胞増殖アッセイにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｔ細胞が由来したマウスに投与したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の濃度の関数として示す（実施例３を参照のこと）。簡単に記すと、動物をｓＣＤ８３で処理し、ついでＫＬＨを注射し、１０日後、脾臓細胞を採取して、様々な用量のＫＬＨで再刺激した。ｓＣＤ８３で処理した動物から得た細胞（菱形）、ならびに偽接種した対照動物（三角）に関して、３Ｈ−チミジンの組み込みをＫＬＨ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す。
【図３】図３は、Ｔ細胞増殖アッセイにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｔ細胞が由来したマウスに投与したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の濃度の関数として示す（実施例３を参照のこと）。簡単に記すと、動物をｓＣＤ８３で処理し、ついでＫＬＨを注射し、２２日後、脾臓細胞を採取して、様々な用量のＫＬＨで再刺激した。ｓＣＤ８３で処理した動物から得た細胞（菱形）、ならびに偽接種した対照動物（三角）に関して、３Ｈ−チミジンの組み込みをＫＬＨ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す。
【図４】図４は、実施例５で記述した実験の結果を示し、可溶性ＣＤ８３（「ｓＣＤ８３」）が、エクスビボでＢ細胞増殖を抑制することを明らかにする。
【図５】図５は、実施例５で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、移植レシピエントのＢ細胞によるエクスビボでの抗体産生を抑制することを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０１をす。
【図６】図６は、実施例７で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、外来抗原に対するＢ細胞によるアロ−抗体応答の誘導を防止可能であることを明らかにする。
【図７】図７は、実施例８で記述した実験の結果を示し、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植心臓組織の長期間の生存をもたらしたことを明らかにする。
【図８】図８は、実施例８で記述した実験の結果を示し、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植レシピエントにおけるＤＣ成熟化を阻害したことを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図９】図９は、実施例８で記述した実験の結果を示しており、図８と同様に、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植レシピエントにおけるＤＣ成熟化を阻害したことを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０１を示す。
【図１０】図１０は、実施例８で記述した実験の結果を示し、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植レシピエントにおいて制御性Ｔ細胞を産生したことを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０１をす。
【図１１】図１１は、実施例９で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、インビトロで、ＴＮＦ−α産生とカニクイザル由来のｍＤＣによるｍＤＣ活性化マーカーの表面発現とを抑制したことを明らかにする。
【図１２】図１２は、実施例９で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、インビトロで、ＴＮＦ−α産生と単球活性化マーカーの表面発現とを中程度に抑制したことを明らかにする。
【図１３】図１３は、実施例９で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、制御性Ｔ細胞の産生を促進したことを示す。縦軸は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｉＦｏｘｐ３＋細胞の割合を示す。
【図１４】図１４は、実施例９で記述した実験の結果を示し、増加した数の制御性Ｔ細胞が、可溶性ＣＤ８３で処理した樹状細胞によって産生されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、被験体を治療するためにＣＤ８３を用いる方法を提供する。本発明の方法には、ＣＤ８３単独の使用、または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物との組合せでの使用が含まれる。ＣＤ８３を単独で、または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物と組み合わせて使用する方法が提供され、またＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とを含む組成物も提供される。本発明の方法には、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つまたはそれ以上の免疫抑制性化合物と一緒にＣＤ８３を用いる方法が含まれる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法にはまた、別の化合物の使用が含まれる。たとえば、いくつかの実施形態において、治療用組成物（単数または複数）に対して被験体を寛容化するために、少なくとも１つの治療用組成物をＣＤ８３とともに被験体に同時投与する。いくつかの実施形態において、本発明の方法には、ＣＤ８３と、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物を、少なくとも１つの治療用組成物と一緒に、被験体に同時投与することによって、被験体を寛容化することが含まれる。本発明の方法は、たとえば、少なくとも１つの治療用組成物に対する寛容性を誘導するため、または自己免疫疾患を予防またはその重症度を減少させるために使用可能である。治療用組成物は、移植組織であってよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法を、移植組織の拒絶を予防するために使用する。
【００２０】
本発明はまた、インビボまたはインビトロ（たとえばエクスビボ）のいずれかにおけるＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物の存在下での成熟化を介して、寛容誘導性樹状細胞を産生することを含む、被験体を寛容化する方法を提供する。いくつかの実施形態において、寛容誘導性樹状細胞を、制御性Ｔ細胞を産生するために使用する。本発明の寛容誘導性樹状細胞および制御性Ｔ細胞は、インビボまたはエクスビボで産生可能であり、エクスビボで産生された細胞はついで被験体に投与可能である。本発明の寛容誘導性樹状細胞および制御性Ｔ細胞は、自己由来であってよく、または幹細胞に由来してよい。本発明の組成物および方法を、抗原に対する寛容化のため、ならびに免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または病状（たとえば障害）の治療または予防のために使用してよく、ここで、有効量のＣＤ８３と少なくとも１つの別の免疫抑制性化合物を被験体に投与する。
【００２１】
本発明の目的は、実施形態によって異なってよい。いくつかの実施形態において、本発明の目的には、治療用組成物に対する被験体の完全寛容化が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の目的には、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状の予防、治癒、軽減および／または緩和が含まれる。被験体は、これらの目的の少なくとも１つが達成された場合に、寛容化される、および／または免疫抑制されたと考えられる（すなわち免疫寛容が、誘導または獲得されたと考えられる）。したがって、本明細書で使用するところの、被験体を「寛容化すること」、または「免疫抑制」を誘導することは、樹状細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞に関する免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状が、未治療対照またはその他の適切な対照と比較して（たとえば、治療が免疫応答の発生を予防するか、または重症度を軽減することを意図する場合、治療の前の症状、または治療なしでの症状の予想される重症度と比較して）、予防、治癒、軽減または緩和されることを意味する。当業者は、症状の測定および評価の方法の選択および適用、ならびに適切な対照の選択に詳しい。
【００２２】
したがって、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状が、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％軽減または緩和される場合に、被験体は寛容化されたと考えられ、および／または免疫抑制が発生したと考えられる。治療が、自己免疫疾病を発症することに対する被験体のリスクを軽減することを意図する実施形態において、このリスクは、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％軽減または緩和され、この評価を、被験体の集団において、統計学的に実施することができる。治療が、治療用組成物に対して被験体を寛容化することを意図する実施形態において、免疫応答の望ましくない機能は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％減少する。他の実施形態において、本発明の目的には、寛容誘導性樹状細胞の産生が含まれ、これらの実施形態において、「症状」は、インビボまたはインビトロのいずれかでの、細胞の挙動のパラメータを意味する。
【００２３】
本発明の方法は、治療目的のために有用であり、したがって、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状を予防、治癒または緩和することを意図する。治療が予防的であることが意図される場合、たとえば治療の前の症状との比較、または予想される症状の重症度との比較のような、適切な対照との比較で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上、必要に応じて、症状が軽減、増加、または改善される場合に、疾患または障害の症状は、軽減または緩和されたと考えられる。当業者は、症状における変化を評価するための技術および基準に詳しい。免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の症状が当業者に既知であり、これには以下の、移植組織の異常な組織構造；移植組織の異常機能；診断または移植のような事象後の短期間の生存期間；望ましくない抗体または望ましくない細胞（たとえば抗原特異的樹状細胞またはＴ細胞）のような、血中の指標タンパク質（単数または複数）または他の化合物（単数または複数）の異常に、または望ましくないほどに高い、または低い濃度または数；血中または体内の別の場所での、指標細胞の異常に、または望ましくないほどに低い濃度または数、たとえば制御性Ｔ細胞の望ましくないほどに低い濃度または数が含まれ、望ましくない免疫応答が開始または維持される。
【００２４】
必要に応じて、インビボ寛容化または寛容性および／または免疫抑制を、たとえば被験体より単離された細胞を用いる混合リンパ球反応のような、インビトロアッセイを用いて測定することができる。同様に、エクスビボにて細胞内で達成される寛容化または寛容性および／または免疫抑制を、たとえば樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞のような、種々の型の細胞を用いるエクスビボアッセイにおいて測定することができる。寛容化または寛容性、および／または免疫抑制を、エクスビボ法を用いて測定する場合、寛容化または寛容性は、適切な対照との比較において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上、免疫刺激に対する細胞の応答が減少した場合に、発生したと考えられる。好適なアッセイが、直接的、または間接的に免疫応答を測定し、当該技術分野で既知であり、それらには限定はされないが、混合リンパ球反応アッセイ、細胞傷害性アッセイ、抗体力価アッセイ、ＩＬ−１０の産生についてのアッセイ、ＴＧＦ−βの産生についてのアッセイ、細胞表面マーカーの評価、およびＦｏｘｐ３の発現についてのアッセイが含まれる。
【００２５】
本明細書で使用するところの用語「可溶性ＣＤ８３」または「ｓＣＤ８３」は、ＣＤ８３ファミリーのメンバーのタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、タンパク質性分子を意味する。いくつかの実施形態において、可溶性ＣＤ８３タンパク質は、それが発現している細胞の膜へ前記分子をつなぐことが可能なアミノ酸配列を持たない。たとえば、可溶性ＣＤ８３タンパク質には、細胞外ドメインの外にある、全長のネイティブＣＤ８３タンパク質のさらなる残基が含まれうる。ＣＤ８３タンパク質、核酸配列および構造が当該技術分野で既知である。（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ１１６９７に記載のような）ヒトＣＤ８３の核酸配列は配列番号：１と記載される。本配列には、（終止コドンを含む）位置１１〜６２８のコード配列、および位置１１〜６７のシグナルペプチドが含まれる。成熟ＣＤ８３ペプチドをコードする配列は、位置６８〜６２５に広がっている。制限酵素認識部位は、配列の先頭および末端に存在する（位置１〜６および１７５５〜１７６０）。（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｑ０１１５１に記載され、配列番号：１と記載された核酸配列によってコードされた）ヒトＣＤ８３のアミノ酸配列を、配列番号：２として記載する。
【００２６】
ＣＤ８３の細胞外ドメインは、ネイティブ全長タンパク質のアミノ酸２０〜１４４を含むことが記述されている。ＣＤ８３の全長アミノ酸配列を、配列番号：２と記載し、全長ＣＤ８３のアミノ酸２０〜１４４をまた配列番号：４と記載する。細胞外ドメインをコードするＣＤ８３核酸配列の部分を、配列番号：３と記載する。たとえばそのすべてが参照によって本明細書に組み込まれている、Ｚｈｏｕら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ１１６９７、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１１５１、ＷＯ２００４／０４６１８２も参照のこと。
【００２７】
他の実施形態において、ＣＤ８３タンパク質は、「膜結合型」であり、すなわち、ＣＤ８３ファミリーのメンバーのタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含み、また細胞の膜のような膜へつなぐことが可能であるアミノ酸配列を持つタンパク質またはペプチドを含む。本明細書で使用するところの用語「ＣＤ８３」は、可溶性ＣＤ８３と膜結合型ＣＤ８３を包含する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質は、配列番号：２において記載された、および／またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１１５１において記載されたヒトＣＤ８３タンパク質の配列の対応する部分に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を持ちうる。したがって用語「ＣＤ８３」は、マウスＣＤ８３タンパク質（「ＨＢ１５」とも呼ばれる、たとえばＢｅｒｃｈｔｏｌｄら（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４６１：２１１−２１６を参照のこと）を包含する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質は、ネイティブの全長ＣＤ８３タンパク質に由来する少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、１００またはそれ以上の連続するアミノ酸の断片を含むか、そのような断片に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一般に、本明細書で使用するところの「配列同一性」は、配列の型（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）に対して適切なデフォルトパラメータで、周知のＢＬＡＳＴアライメントプログラムを用いて決定される、２つの配列間の配列同一性を意味する。これ以外のプログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、これらのプログラムの詳細は当該技術分野で既知であり、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトで見ることができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用するところの「可溶性ＣＤ８３」または「ｓＣＤ８３」は、ＣＤ８３ファミリーのメンバーのタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むエピトープを意味し、前記エピソープは、たとえば被験体に投与した時に、それ自体に対する免疫応答を刺激する。そのような実施形態において、ｓＣＤ８３であるエピトープに対する免疫応答は、ｓＣＤ８３に関して本明細書に記述した活性および効果を摸倣しうる。すなわち、ｓＣＤ８３であるエピトープに対する免疫応答は、ネイティブＣＤ８３の細胞外ドメインを含むｓＣＤ８３の活性を持ってよく、もしくはｓＣＤ８３であるエピトープに対する免疫応答は、ネイティブＣＤ８３の細胞外ドメインを含むｓＣＤ８３の投与によって生じる効果と同様である、それが投与された被験体における効果を持ってよい。そのような実施形態において、アッセイ中の、または被験体に対するＣＤ８３の活性または効果は、エピトープに対する免疫応答の結果である可能性があり、またはＣＤ８３それ自体の結果である可能性があり、またはそれら両方の結果である可能性がある。
【００３０】
本発明で使用されるＣＤ８３は、ＣＤ８３タンパク質のダイマーまたはマルチマーであってよい。ダイマー化またはマルチマー化は、（たとえば、ネイティブタンパク質の位置１２、２７、３５、１００、１０７、１２９および１６３に存在する）ＣＤ８３タンパク質の単量体型内に存在するシステイン残基間の１つまたはそれ以上のジスルフィド結合の形成によって、またはＣＤ８３タンパク質の単量体型内の、同一または異なる官能基（たとえばカルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオ基など）を連結する、二官能性リンカー分子（たとえばジアミン、ジカルボン酸化合物など）によって達成されてよい。後者には、組換え技術によって直接産生可能な二量体構造を産生するための、ポリペプチドリンカー（たとえば［（Ｇｌｙ）ｘＳｅｒ］ｙ−（式中ｘはたとえば３または４で、ｙはたとえば１〜５である）のような小さな極性アミノ酸残基からなる）の使用が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ８３は、ホモダイマーまたはホモマルチマー（たとえば可溶性ＣＤ８３の第五システイン残基（すなわちネイティブタンパク質中のアミノ酸１２９に対応するシステイン残基）との間でジスルフィド結合を介して連結した、ネイティブＣＤ８３タンパク質のアミノ酸残基２０〜１４４（すなわち配列番号：２）を含むｓＣＤ８３）である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８３は、モノマーであってよく、そのような実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＤ８３のネイティブシステイン残基が、別のアミノ酸残基、たとえば小さいアミノ酸残基および／または極性アミノ酸残基によって置換されてよい。いくつかの実施形態において、好ましくは、小さいアミノ酸残基、および／または極性アミノ酸残基は、セリン、アラニン、グリシン、バリン、スレオニンなどから選択される。ＣＤ８３がモノマーの場合、いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質の少なくとも１つのシステイン残基が置換され、たとえば全長ネイティブタンパク質の位置１２９に対応するシステイン残基がアラニンで置換されてよい。
【００３２】
いくつかの実施形態において、用語「可溶性ＣＤ８３」または「ｓＣＤ８３」はまた、ＣＤ８３の細胞外ドメインの少なくとも一部分ならびに機能的断片および誘導体の融合タンパク質を包含する（たとえば、ＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）。融合タンパク質が本明細書で定義したようなＣＤ８３活性を維持している限り、好適な融合タンパク質には、ＣＤ８３の細胞外ドメインの少なくとも一部分と、少なくとも１つの他のペプチドまたはタンパク質が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ８３の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むであろう。そのようなタンパク質またはペプチドが当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン外のＣＤ８３のさらなる残基を含むタンパク質が、用語「可溶性ＣＤ８３」によって包含される。したがって、好適な誘導体には、限定はされないが、Ｃ末端またはＮ末端に結合したさらなる配列を持つタンパク質、たとえば、それらのＣ末端に膜貫通ドメインの部分、または短いペプチドをＮ末端に持つ（たとえば遺伝子工学的に改変した融合タンパク質の産物のような、トロンビンによるトロンビン部位の開裂によって生じ得る、たとえばＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、または融合タンパク質の開裂後のＧＳＴの断片から生じる短いペプチド）ものが含まれる。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ８３は、ネイティブな全長タンパク質（配列番号：２）のアミノ酸２０〜１４５からなるか、または該アミノ酸を含み、細胞外ドメインと、Ｃ末端でのさらなるアミノ酸を含む。他の実施形態において、ｓＣＤ８３は、配列番号：２のアミノ酸２０〜１４３からなる。
【００３３】
本発明で使用されるＣＤ８３の活性は、当該技術分野で既知の方法によって評価可能である。ＣＤ８３タンパク質は、任意の好適なアッセイによって測定されるような、ネイティブな全長ＣＤ８３タンパク質の少なくとも１つの活性を示す場合に、「ＣＤ８３活性」を持つと言われる。ＣＤ８３タンパク質は、そのようなアッセイにおいて、同様のアッセイにて測定されたネイティブな全長ＣＤ８３タンパク質の活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の活性を持つ場合に、「ＣＤ８３活性」を持つと言われる。好ましくは、本発明で使用されるＣＤ８３タンパク質は、成熟免疫刺激性樹状細胞に結合し、Ｔ細胞増殖を刺激するこれらの樹状細胞の能力を減少させることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３は、成熟ＤＣまたは単球において、たとえば、実施例９で記述したアッセイにおいて、ＴＮＦ−αを抑制または減少させる。この活性は、直接的または間接的に評価可能であり、インビボまたはインビトロにて測定可能であり、好適なアッセイが当該技術分野で既知であって、たとえば混合リンパ球反応アッセイすなわち「ＭＬＲ」（たとえばＫｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７１２７−７１３６；Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）が含まれる。したがって、本発明で使用されるＣＤ８３タンパク質は、たとえばｓＣＤ８３のない状態での、成熟免疫刺激性樹状細胞とＴ細胞との間の相互作用のような、適切な対照との比較において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％またはそれ以上、Ｔ細胞増殖を刺激する、成熟免疫刺激性樹状細胞の能力を減少させることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３は、エピトープであり、免疫応答を刺激する活性を持つ。本活性は、インビトロアッセイにおいて、または被験体への投与に続いて、ＣＤ８３に対する応答において産生される、抗ＣＤ８３抗体を同定することによってアッセイしてよい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ８３タンパク質は、適切な対照との比較において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％またはそれ以上、少なくとも１つの成熟化過程の工程の間、可溶性ＣＤ８３の存在下のインビトロにおいて成熟した免疫刺激性樹状細胞による、ＴＮＦ−α、ＣＤ８０および／またはＣＤ８３の発現を減少させることができる（たとえばＬｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１、ＷＯ２００４／０４６１８２、実施例９を参照のこと）。このように、ＣＤ８３は、細胞表面マーカーの発現を変化させたと言うことができ、すなわち、処理した細胞の免疫表現型を変更したということができる。細胞表面マーカーの発現の解析のために一般に使用されている技術（たとえばＦＡＣＳ解析）がしばしば、細胞の混合集団を表すデータを生成しうること、およびどの集団が特定のデータセットにおいて表されうるかを同定するために注意が払われるべきであることが当業者によって理解されている。
【００３５】
タンパク質のＣＤ８３ファミリーの他のメンバーは、たとえば、哺乳動物のような他の動物からの、または同一の生物の他の組織からの、核酸の種々の供給源（たとえばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）に対して、細胞外部分をコードしているヒトＣＤ８３コード領域の全体または一部を含む核酸をハイブリッド形成させることによって得ることが可能である。本発明の方法および組成物において使用されるＣＤ８３および他のタンパク質を任意の好適な方法によって生産および精製してよい。種々のタンパク質およびその誘導体、ならびにこれらをコードする核酸を生産、精製および操作するための方法が、当該技術分野でまたよく知られている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと、また米国特許第７，１６９，８９８号、米国特許出願第１０／３８２，３９７号、および米国特許出願第１０／５３５，５２２号を参照のこと。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質をコードする核酸を被験体に提供することによって、ＣＤ８３を被験体に投与する。たとえば、ＣＤ８３は、米国特許第７，１６９，８９８号の配列番号：１のヌクレオチド５８〜４３２を含むＤＮＡ断片として、または対応するｍＲＮＡとして、被験体に投与可能である（たとえば米国特許第７，０１５，２０４号を参照のこと）。同様に、いくつかの実施形態において、宿主細胞（すなわち細胞）へＣＤ８３タンパク質をコードする核酸を形質転換することによって、ＣＤ８３をインビトロまたはインビボにおいて細胞に提供し、形質転換宿主細胞がついでＣＤ８３タンパク質を発現し、それによって、他の細胞ならびにそれ自身（すなわち形質転換宿主細胞）に対してＣＤ８３タンパク質を提供する。そのような実施形態において、好適な宿主細胞には樹状細胞が含まれる。ＣＤ８３が、ＣＤ８３タンパク質をコードする核酸として提供される実施形態において、用語「ＣＤ８３」はまた、ＣＤ８３タンパク質をコードする核酸も意味する。ＣＤ８３タンパク質をコードする限り、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸を含む、任意の好適な核酸を使用することができる。核酸は、コードされたタンパク質またはタンパク質断片の発現のために好適なベクター内で提供されうる。これらを産生するための好適なベクターおよび方法が当該技術分野で既知である。
【００３７】
本明細書で使用するところの「治療用組成物」は、治療目的のために使用され、それに対する免疫応答が望ましくない、外来性組成物を意味する。したがって、用語「治療用組成物」は、純粋な調製物（すなわち単一の、本質的に純粋な物質または化合物からなる調製物）ならびに物質または化合物の混合物を包含する。本明細書で使用するところの用語「治療目的」には、疾患または障害の少なくとも１つの症状を予防、治癒または軽減若しくは緩和するための努力が含まれる。このように、「治療目的」には、本発明の組成物および／または方法の治療上の使用および予防上の使用の両方が含まれ、したがって、治療用組成物には、Ｔ細胞に関する免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の発症を予防するために使用されるものが含まれる。
【００３８】
本発明で使用される好適な治療用組成物には、限定はされないが、抗体、タンパク質、「小分子」、遺伝子治療ベクターおよび遺伝子治療ベクターによって発現される任意のタンパク質、抗原、アレルゲン、（幹細胞を含む）細胞、ならびに組織移植片が含まれる。これらのカテゴリーは、必ずしも相互に排他的ではなく、したがって、たとえば多くのタンパク質が抗原であり、多くの抗原がタンパク質であることが理解される。治療用組成物をＣＤ８３と同時投与するが、被験体が、少なくとも１つの他の治療用組成物または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物で治療されてはいない実施形態において、治療用組成物は移植組織ではない。治療用組成物をＣＤ８３と同時投与するが、被験体が、少なくとも１つの他の治療用組成物または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物で治療されてはいない実施形態において、治療用組成物は、移植組織に関連する抗原ではない。
【００３９】
抗原である好適な治療用組成物は、それに対して免疫応答が発生しうる任意の組成物（すなわち、被験体が免疫応答を持つか、または持ちうる任意の組成物）である。好適な抗原には、自己免疫疾患の発症に関与する若しくは関連する抗原、またはそれに対する抗体が自己免疫疾患を持つ被験体において発見される抗原などの、たとえば寛容性が望まれる自己免疫疾患に関連した抗原などの、タンパク質およびタンパク質断片が含まれる。
【００４０】
したがって、例示的な抗原には、（多発性硬化症の発症に関与する）ミエリン塩基性タンパク質、（尋常性天疱瘡の発症に関与すると考えられている）デスモグレイン−３タンパク質、（グレーブス病の発症に関与する）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター、（橋本甲状腺炎の発症に関与する）甲状腺ペルオキシダーゼ、（重症筋無力症の発症に関与する）アセチルコリンレセプター、および（Ｉ型糖尿病の発症に関与する）インスリンが含まれる。抗体である好適な治療用組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、または抗体の一部または断片を含む、任意の型の抗体またはその誘導体であってよい。
【００４１】
本発明の方法は、本発明の方法において使用される治療用組成物が、望ましくない免疫応答の近くまで寛容誘導性細胞を導く限り、免疫応答が指向される抗原または指向される可能性のある抗原が未知である場合でさえも、寛容誘導性を誘導可能である。したがって、望ましくない免疫応答が指向されるまたは指向される可能性のある組織中、またはその近くにおける抗原の正体にもかかわらず、好適な治療用組成物には、寛容化が望まれる特定の組織に関連する抗原が含まれる。このように、いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、「決定基拡散（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）」が発生したか、発生しうる、疾患または障害を治療、および／または予防することにおいてとりわけ有用であり得る（たとえばＤａｉら（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９−１７５；ＰｒａｔおよびＡｎｔｅｌ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２２５−２３０を参照のこと）。
【００４２】
抗原は、その組織を構成する細胞によって発現される場合、またはその組織を構成する細胞上またはその近く（たとえばその組織の細胞外マトリックス）にある場合、特定の組織に「関連する」。特定の組織に「関連した」抗原の使用には、組織それ自体から分離した精製形態での抗原の使用が含まれ、またはインサイチュ（すなわち組織内）での抗原の使用が含まれる可能性がある。本明細書で使用するところの用語「組織」は、個々の器官（たとえば肝臓、腎臓、心臓、肺など）、ならびに「液体」組織（たとえば血液、血清のような血液成分、Ｔ細胞のような細胞など）、およびいずれかまたは両方の部分またはサブパートを包含する。
【００４３】
必要に応じて、治療用組成物は、本発明の方法において使用される時に、被験体を寛容化するそれらの能力以外の生物学的活性を欠くように選択してよい。したがってたとえば、治療用組成物は、ネイティブインスリンの正常な生理学的活性を欠くネイティブインスリンタンパク質の一部または断片のみからなってよい。抗体である好適な治療用組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体または抗体の一部または断片を含む、任意の型の抗体またはその誘導体であってよい。当業者は、本発明の方法での使用のために、好適な治療用組成物を同定および提供可能である。
【００４４】
好適な治療用組成物には、本発明の目的（たとえば移植組織に対する寛容化）が達成される限り、寛容化が望まれる特定の組織と関連するか否かを問わず、寛容化を刺激するために役に立つ抗原または他の薬剤が含まれうる。いくつかの実施形態において、好適な治療用組成物には、対象とする組織から単離された総ＲＮＡ、またはＲＮＡの一部が含まれ、これは被験体に直接投与可能であり（たとえば米国特許第７，０１５，２０４号を参照のこと）、または樹状細胞を形質導入するために使用可能であり、その結果たとえば被験体を治療するため、または制御性Ｔ細胞のインビトロ産生のために使用可能である。タンパク質またはポリペプチドである治療用組成物を、タンパク質またはポリペプチドとして投与してよく、またはそれをコードする核酸を細胞または被験体に提供することによって投与してよい。したがって、いくつかの実施形態において、治療用組成物には、ＲＮＡが含まれる（たとえば、米国特許第７，０１５，２０４号を参照のこと）。いくつかの実施形態において、２つ以上の治療用組成物を被験体に投与する。
【００４５】
用語「免疫抑制性化合物（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、リンパ球のＴおよび／またはＢクローンの集団のサイズを枯渇させることが可能であるか、またはそれらの反応性、増殖または分化を抑制することが可能である、化合物を意味する。本発明の方法において使用される免疫抑制性化合物には、限定はされないが、シクロスポリン（「ＣｓＡ」としても知られ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）およびタクロリムス（「ＦＫ５０６」としても知られ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）として市販されている）を含むカルシニューリン阻害剤；ミコフェノール酸モフェチル（「ＭＭＦ」としても知られ、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）として市販されている）およびアザチオプリン（Ａｚａｓａｎ（登録商標）またはＩｍｕｒａｎ（登録商標）として市販されている）のようなプリン代謝阻害剤；エベロリムス（Ｃｅｒｔｉｃａｎ（登録商標）として市販されている）およびシロリムス（「ラパマイシン」または「Ｒａｐａ」としても知られ、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）のような増殖阻害剤；抗ＣＤ４５および抗ＣＤ４５ＲＢのようなモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）（たとえば米国特許第７，１６０，９８７号を参照のこと）；ＯＫＴ３のような、Ｔ細胞に対して指向されるモノクローナル抗体；バシリキシマブおよびダクリズマブのような、ヒト化抗ＴａＴ抗体を含む、ＩＬ−２レセプターに対して指向されるモノクローナル抗体；ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ１融合タンパク質のような、Ｔ細胞共刺激経路を遮断する物質；キメラ現象（すなわち、移植片組織が自己として認識される、ドナーおよびレシピエント免疫細胞の共存）を誘導可能な物質；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）として市販されている）のような、骨髄非破壊的移植前治療（ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏｂｌａｔｉｖｅ ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）が含まれる。免疫抑制薬およびそれらの標的の議論のために、たとえばＳｔｅｐｋｏｗｓｋｉ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｊｕｎｅ ２１，２０００：１−２３を参照のこと）。
【００４６】
シロリムス（「ラパマイシン」または「Ｒａｐａ」としても知られ、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）は、１３歳以上の腎臓移植患者における、器官拒絶の予防のために現在必要とされている。製造業者は、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を、最初にシクロスポリンおよびコルチコステロイドとの処方において使用するべきであると推奨している。実験モデル（すなわちマウス、ブタおよび／または霊長類）における研究によって、シロリムスが、たとえば腎臓、心臓、皮膚、膵島、小腸、膵−十二指腸組織、および骨髄の同種移植片生存を延長したことが示された。シロリムスは、ラットにおける心臓および腎臓の同種移植片の急性拒絶を無効にし、前感作ラットにおける移植片生存を延長した。いくつかの研究において、シロリムスの免疫抑制効果は、治療の中止後６ヶ月まで続いた。シロリムスの寛容性効果は、同種移植片特異的である。自己免疫疾患の齧歯類モデルにおいて、シロリムスが、全身性紅斑性狼瘡、コラーゲン誘導関節炎、自己免疫性（Ｉ型）糖尿病、自己免疫性心筋炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、移植片対宿主疾患および自己免疫性ぶどう膜網膜炎に関連した、免疫が媒介する事象を抑制した。
【００４７】
ミコフェノール酸モフェチル（「ＭＭＦ」としても知られ、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）として市販されている）は、同種異系心移植（心臓）または肝移植（肝臓）を受ける患者における器官拒絶の予防のために現在必要とされている。製造業者は、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）をシクロスポリンおよびコルチコステロイドと一緒に使用することを推奨している。ミコフェノール酸モフェチルが、実験動物モデルにおいて、腎臓、心臓、肝臓、腸、四肢、小腸、膵島、および骨髄を含む同種移植片の生存を延長したことが示された。ミコフェノール酸モフェチルはまた、イヌ腎臓モデルおよびラット心臓同種移植片モデルにおいて、発生している急性拒絶を覆すことも示され、ラットにおける大動脈および心臓の同種移植片ならびに霊長類異種移植片の実験モデルにおいて、増殖性の動脈疾患を阻害した。ミコフェノール酸モフェチルはまた、マウス腫瘍移植モデルにおいて、腫瘍発生を阻害し、生存を延長したことが明らかにされた。ミコフェノール酸モフェチルは、単独、または別の免疫抑制薬剤との組合せで使用してよい。
【００４８】
タクロリムス（「ＦＫ５０６」としても知られ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）として市販されている）は、同種異系の肝移植、腎移植または心移植を受けている患者における器官拒絶の予防のために現在必要とされている。タクロリムスは、副腎コルチコステロイドと一緒に使用されるべきである。心臓移植レシピエントにおいて、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）は、アザチオプリンまたはＭＭＦと一緒に使用されることが推奨されている。タクロリムスは、肝臓、腎臓、心臓、骨髄、小腸および膵臓、肺および気管、皮膚、角膜および四肢の動物移植モデルにおいて、宿主および移植片の生存を延長することが示された。動物において、タクロリムスは、いくつかの体液性免疫を抑制し、そして、より大きな程度まで、同種移植拒絶、遅延型過敏症、コラーゲン誘導動脈炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎および移植片対宿主疾患のような細胞媒介性反応を抑制することが明らかにされた。本発明は、任意の化合物またはそれらの組合せの作用機序にとらわれるわけではなく、またタクロリムスの正確な作用機序は未知であるけれども、タクロリムスは、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害し、Ｔリンパ球活性化を阻害すると考えられている。
【００４９】
シクロスポリン（「ＣｓＡ」としても知られ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）は、腎臓、肝臓および心臓の同種移植に対する器官拒絶の予防のために現在必要とされている。シクロスポリンは、アザチオプリンおよびコルチコステロイドとの組合せで使用されており、リウマチ性関節炎患者において、メトトレキサートとの組合せで使用可能である。シクロスポリンは、疾患が十分にメトトレキサートに反応しなかった重度の活性リウマチ性関節炎の患者の治療のために必要とされている。シクロスポリンはまた、重度の難治性尋常性乾癬の、成人で免疫システムが損なわれていない患者の治療のために必要とされている。シクロスポリンは、動物モデルにおいて、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、骨髄、小腸および肺を含む同種移植片の生存を延長する、強力な免疫抑制薬剤である。シクロスポリンは、いくつかの体液性免疫を抑制し、そして、より大きな程度まで、種々の器官に対して多くの動物種における、同種移植拒絶、遅延型過敏症、実験的アレルギー性脳脊髄炎、フロイントアジュバント関節炎（Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および移植片対宿主疾患のような細胞媒介性免疫応答を抑制することが示されている。本発明は、任意の化合物またはそれらの組合せの作用機序にとらわれるわけではないが、シクロスポリンは、細胞周期のＧ０およびＧ１期において、免疫応答性リンパ球を阻害し、そしてＴリンパ球を選択的に阻害することが示されてきた。
【００５０】
「有効量」の物質によって、本発明の方法にしたがって、被験体に投与した場合に、少なくとも、本発明の少なくとも１つの目的を達成するのに十分な量が意図される。したがって、たとえば、「有効量」の治療用組成物は、ＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物と一緒に被験体に同時投与した時に、治療用組成物に対して被験体を寛容化するのに少なくとも十分である。同様に、「有効量」のＣＤ８３は、治療用組成物および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物と同時投与したときに、治療用組成物に対して患者を寛容化するのに、少なくとも十分である。「有効量」の免疫抑制性化合物は、ＣＤ８３と、任意に治療用組成物とを同時投与した時に、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状に対して、測定可能な効果を生ずるのに少なくとも十分である。いくつかの実施形態において、有効量の免疫抑制性化合物は、本明細書の別の場所で定義したように、寛容性および／または免疫抑制を誘導するのに、少なくとも十分である。免疫抑制性化合物の有効量は、個々の被験体が示した症状に関して決定されてよく、または臨床研究から決定するか、若しくはモデル系における適切な研究から外挿してよい。したがって、たとえば、免疫抑制性化合物の有効量には、本発明の方法を用いる臨床研究において決定された用量範囲に基づいて、疾患または障害の少なくとも１つの症状において、測定可能な効果を生ずることが予想されうる量が含まれる。
【００５１】
有効量は、１つまたはそれ以上の投与、適用または用量で投与可能である。好適な投与、適用および用量は、限定はされないが、組成物の特異的活性；組成物の処方；治療される被験体の体重、年齢、健康、疾患および状態；ならびに組成物の被験体内への投与の経路を含む、多数の因子によって変化しうる。場合によっては、有効量であることが要求されるＣＤ８３の最小量は、患者内にすでに存在しているＣＤ８３、とりわけ可溶性ＣＤ８３の存在によって、減少させてよく（たとえばＨｏｃｋら（２００６）（Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６７：５７−６０を参照のこと）、当業者は、用量および投与などを、最適な結果を達成するために簡単に適合可能である。たとえば、ＣＤ８３は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００若しくは７００ｍｇ／ｋｇまたは１、２、５、７、１０、２０、５０若しくは１００ｇ／ｋｇの下限、および０．０５、０．１、０．５、１、２、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００若しくは７００ｍｇ／ｋｇまたは１、２、５、７、１０、２０、５０、１００、若しくは２００ｇ／ｋｇの上限を持つ範囲内で、患者に投与してよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、それに対して免疫応答が指向されるかまたは指向される可能性のある抗原が未知である場合でさえも、寛容性を誘導可能である。したがって、好適な治療用組成物には、それに対する望ましくない免疫応答が指向されるかまたは指向され留可能性がある組織中またはその組織の近くにおける抗原の正体にもかかわらず、寛容化が望まれる特定の組織に関連する抗原が含まれる。このように、いくつかの実施形態で、本発明の方法および組成物が、「決定基拡散」が発生するか、または発生しうる疾患または障害を治療すること、および／または予防することにおいてとりわけ有用であり得る（たとえば、Ｄａｉら（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９−１７５、ＰｒａｔおよびＡｎｔｅｌ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２２５−２３０を参照のこと）。抗原は、組織を構成する細胞によって発現される場合、または組織を構成する細胞上またはその近くで（たとえば組織の細胞外マトリックス中で）見られる場合に、特定の組織に「関連する」。
【００５３】
本発明の方法は、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とＣＤ８３との同時投与によって生じる相乗効果の利益を提供し、それによって、併用治療の効果は、２つの個々の治療の組合せから期待されるものよりも格段に高い。さらに、ＣＤ８３を、２つまたはそれ以上の他の免疫抑制性化合物とともに被験体に同時投与する場合、さらにより大きな利益が提供されうる。このように、本発明は、個々の治療のみによって提供されるものよりも大きな効果を持つ、併用治療（または「同時投与」治療）を提供する。いくつかの実施形態において、併用治療または同時投与治療は、各個々の治療によって提供される利益の合計よりも大きな利益を提供する。いくつかの実施形態において、併用治療または同時投与治療は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％若しくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍若しくはそれ以上、個々の治療によって提供される利益よりも大きな利益を提供する。いくつかの実施形態において、併用治療または同時投与治療は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％若しくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍若しくはそれ以上、個々の治療によって提供される利益の合計より大きな利益を提供する。
【００５４】
併用（または「同時投与」）治療のこの改善された効果が、化合物を単独で使用する場合に必要であるものよりも低い用量の個々の化合物を、被験体を治療するために使用可能である、本発明の治療の方法を提供する。このように、本発明は、現在使用されているよりも少ない個々の化合物を用いて、効果的な治療を可能にする。言い換えれば、本発明は、被験体を治療するための化合物の量を減少させて使用する方法を提供し、被験体を治療するために使用する化合物の量を減少させる方法を提供する。したがって、本発明は、減少した用量を使用することによって、副作用の可能性の低下した、および／または副作用の重症度を減少させる治療を提供する。そのような副作用には、カルシニューリン阻害剤について一般的に見られるもの（たとえば腎臓毒性）が含まれる。個々のカルシニューリン阻害剤はまた、特定の副作用を生ずる傾向にあり、たとえば、シクロスポリン治療で見られる傾向にある副作用には、糖尿病、高血圧、高脂血症、麻痺、歯肉過形成、多毛症、および皮膚変化が含まれ、一方で、タクロリムス治療において見られる傾向にある副作用には、糖尿病の発症の増加が含まれるが、高脂血症、高血圧、および歯肉過形成はシクロスポリン治療で見られるよりもその傾向が少ない。ミコフェノール酸モフェチル治療で一般に見られる副作用には、白血球減少症のリスクの増加、下痢、貧血、高血圧、食道炎、胃炎および胃腸管出血が含まれる。
【００５５】
「減少した用量」は、個々の化合物を、別の場合に被験体を治療するために使用しうるものよりも、低い投与量レベルで、被験体に投与することを意図する。いくつかの実施形態において、「減少した用量」によって、個々の化合物が、製造業者によって推奨されるもの、すなわち化合物に関する取扱説明書で推奨される投与量レベルよりも低い投与量レベルで、被験体に投与されることが意図される。参照として、本発明のいくつかの化合物に関して、取扱説明書において現在推奨されている投与量レベルは以下のとおりである。推奨投与量レベルが、治療の段階または治療間隔によって変化する場合（たとえば、新規移植患者のための投与量レベルに対する維持投与量レベル）、本発明の方法には、被験体をただ１つの治療段階または治療間隔の間、または少なくとも１つの治療段階または治療間隔の間、減少した用量の化合物で被験体を治療する治療方法が含まれる。治療の段階および／または治療間隔は、当業者によって理解され、たとえば、慢性自己免疫障害または疾患の長期維持または管理；移植前準備；移植後回復；および移植後維持が含まれる。あるいは、治療間隔は、１日、１週間、１ヶ月若しくは２、３、４、５若しくは６ヶ月、若しくは１年、または特定の治療目標（単数または複数）が達成されたことを被験体が示す間、またはその後の間隔のような、治療が実施される期間および／または評価される期間であってよい。
【００５６】
タクロリムス（「ＦＫ５０６」としても知られ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）として市販されている）に関して、製造業者の推奨は、連続静脈注入として、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日（心臓移植について）、または０．０３〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日（肝臓または腎臓移植について）の開始用量で、移植から６時間後に投与することである。連続注入は、患者が経口投与を受容できる間までのみ続けられるべきである。
【００５７】
シロリムス（「ラパマイシン」としても知られる、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）に関して、推奨用量は、患者に対する免疫学的リスク、および移植後治療の段階によって変化する。免疫リスクが低〜中レベルである患者に対して、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）経口溶液および錠剤を、シクロスポリンとコルチコステロイドと組み合わせて使用することが推奨され、シクロスポリンは、移植から２〜４ヶ月後に中止すべきである。デノボ移植レシピエントに対して、維持用量の３倍に相当する負荷量のＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）が与えられるべきである。たとえば、腎臓移植患者に対して、２ｍｇの維持用量が、６ｍｇの負荷量とともに推奨される。シクロスポリンの中止が検討された患者には、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）とシクロスポリンとの併用療法を与えるべきである。移植後２〜４ヶ月の時点で、シクロスポリンを、４〜８週間にわたって、漸次停止し、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を、移植後１年目に、１６〜２４ｎｇ／ｍＬの範囲内の全血トラフ濃度を得るように調節すべきであり、その後標的は１０〜２０ｎｇ／ｍＬであるべきである。
【００５８】
免疫学的リスクの高い患者に対して、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）経口溶液および錠剤を、１年目は、シクロスポリンとコルチコステロイドとの組合せで使用することが推奨されている。シクロスポリンと一緒にＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を受けている患者に対して、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）治療を、移植後第１日目に、１５ｍｇまでの負荷量で開始すべきである。移植後第２日に開始して、５ｍｇ／日の初期維持用量が与えられるべきである。シクロスポリンの開始用量は、分割用量で、７ｍｇ／ｋｇ／日までであり、用量はつづいて、標的の全血トラフ濃度（すなわち血中の最小濃度）を達成するように調節されるべきである。プレドニゾンを、最小量５ｍｇ／日で投与すべきである。
【００５９】
腎臓同種移植レシピエントに対して使用するために、開始用量のＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を、移植後可能な限り早く投与すべきである。非定常状態のＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）濃度に基づく頻繁なＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）用量調節によって、過剰投与または過小投与が起こりうるため、そのような用量調節は、注意深く実施され、モニタされるべきである。一旦維持用量が調節されたならば、患者を、少なくとも７〜１４日間、新規維持用量に維持すべきである。
【００６０】
ミコフェノール酸モフェチル（「ＭＭＦ」としても知られ、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）として市販されている）に関して、腎臓移植患者に対する製造業者の推奨は、総１日用量２グラムで、１日２回、（２時間以上にわたり）経口または静脈内に投与される、１グラム用量である。生後３ヶ月〜１８歳の小児患者に対して、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）経口懸濁液の推奨１日用量は、６００ｍｇ／ｍ２の１日２回（最大２グラム／１０ｍｌ経口懸濁液まで）である。体表面積は、たとえば、体重の関数としての体表面積の標準表を用いて決定してよい（たとえば、Ｓｈａｒｋｅｙら（２００１）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：２３−２８を参照のこと）。心臓移植患者に対して、成人には、２時間以上にわたり、静脈内に１日２回（「ｂ．ｉ．ｄ．」）１グラムの用量か、または３グラムの１日用量について、経口で１日２回投与される１．５グラムの用量で治療すべきである。肝臓移植患者に関して、成人は、２時間以上にわたり、静脈にｂ．ｉ．ｄ．で投与される１グラムの用量か、または総１日用量３グラムについて、経口でｂ．ｉ．ｄ．で投与される１．５グラムで治療すべきである。
【００６１】
シクロスポリン（「ＣｓＡ」としても知られ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）に関して、製造業者の推奨は、開始経口用量のＮｅｏｒａｌ（登録商標）を、移植前４〜１２時間、または手術後与えることが可能である、というものである。新規移植患者において、平均開始用量（±ＳＤ）は、腎臓移植患者について、９（±３）ｍｇ／ｋｇ／日、肝臓移植患者について８（±４）ｍｇ／ｋｇ／日、心臓移植患者について７（±３）ｍｇ／ｋｇ／日である。総１日用量は２つの等用量にわけ、用量を続いて先に定義されたシクロスポリン血中濃度を達成するために調節する；個人の体重に基づいた代表的な投与スケジュールは、最初の１４日間、２ｍｇ／ｋｇ／日で開始し、その後、用量を１週間で１ｍｇ／ｋｇ／日まで漸減し、さらに２週間で０．６ｍｇ／ｋｇ／日まで、１ヶ月で０．３ｍｇ／ｋｇ／日まで、そして２ヶ月で０．１５ｍｇ／ｋｇ／日まで漸減させ、その後維持治療とする。病初では、副腎コルチコステロイドでの補助治療が推奨される。
【００６２】
リウマチ性関節炎の治療のために、シクロスポリンの初期用量は、分割経口用量として、１日２回服用する、２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。サリチル酸、非ステロイド性抗炎症剤、および経口コルチコステロイドの他の治療を継続してよい。任意の時点での有害事象を制御するために、用量は２５〜５０％まで減少すべきである。乾癬の治療のために、シクロスポリンの初期用量は、分割経口投与として、１日２回服用する、２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。有害事象がなければ、患者には少なくとも４週間、この用量を維持すべきである。有意な臨床改善が４週間後に見られない場合、用量を、最大４ｍｇ／ｋｇ／日まで０．５ｍｇ／ｋｇ／日ずつ、２週間間隔で増加させることができる。任意の時点での有害事象を制御するために、用量を２５〜５０％減少させるべきである。
【００６３】
本明細書で使用するところの用語「化合物」、「組成物」および「物質」はそれぞれ、本発明の方法で使用することが意図された任意の物質を意味する（すなわち、ＣＤ８３、治療用組成物または免疫抑制性化合物を含む）。物質を被験体に同時に投与する場合、または別の物質を被験体に投与する前、または後、２、４、６、８、１０、１２、若しくは１４時間以内、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０若しくは２００日以内に、物質を被験体に投与した場合、物質は、他の物質と「同時投与」され、「同時投与」が発生する。物質を同時に投与する場合、投与の前に物質を組み合わせてよく、または同時に別々に投与可能である。
【００６４】
本発明の方法には、一用量若しくは一投与、または各化合物または組成物の複数回用量若しくは複数回投与が含まれうる。複数回投与が好ましい実施形態において、化合物または組成物の少なくとも１回の投与は、投与される別の化合物または組成物の「有効性の時間枠（ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）」内で発生する。いくつかの実施形態において、第二の物質の投与は、併用治療の（すなわち両方の物質の投与の）効果が、別々に投与された場合、すなわち適切な対照実験において、個々の治療の１つまたは両方を超えるか、または個々の治療とは異なる場合、またはそれらのことが予想される場合に、第一の物質の「有効性の時間枠」内で発生したとみなされる。いくつかの実施形態において、第二の物質の投与は、併用治療の（すなわち両方の物質の投与の）効果が、別々に投与された場合、すなわち適切な対照実験において、個々の治療を組み合わせた効果を超えるか、または当該効果とは異なる場合、またはそれらのことが予想される場合に、第一の物質の「有効性の時間枠」内で発生したとみなされる。たとえば、被験体を、ＣＤ８３の投与と、ＣＤ８３の有効性の時間枠内での治療用組成物の投与とを含む方法によって、治療用組成物に対して寛容化してよく、この結果は、治療用組成物の投与が、ＣＤ８３の有効性の時間枠内で発生する被験体をＣＤ８３と治療用組成物とで別々に治療した場合に予想されないものである。
【００６５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化合物または組成物を、その物質の「有効性の時間枠」と少なくとも１つの他の物質の「有効性の時間枠」とが少なくともいくらか重なるように投与する。そのような重なりは、併用治療の効果が、別々に投与された場合、すなわち適切な対照実験において、個々の治療と組み合わせた効果を超えるか、または当該効果とは異なるか、またはそれらのことが予想される場合に発生すると考えられる。いくつかの実施形態において、特定の治療の経過の間、さらなる投与が、１つまたはそれ以上の物質の有効性の時間枠の前、間または後に発生してよく、一方他の実施形態において、１つまたはそれ以上の物質の有効性の時間枠外でのさらなる投与は存在しない。いくつかの実施形態において、各物質のすべての投与は、被験体へ投与される物質の互いの有効性の時間枠内で発生する。３つ以上の物質を被験体に投与する実施形態において、物質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の他の物質の有効性の時間枠内で投与可能である。
【００６６】
本発明の方法にはまた、２つ以上の治療用組成物の投与が含まれうる。したがって、本発明の方法には、複数の治療用組成物の投与が含まれうる。治療用組成物は、類似しているか、または異なってよい。たとえば、本発明の方法で被験体に投与した治療用組成物には、関連抗原が含まれうる。したがって、たとえば、いくつかの実施形態において、被験体に投与した治療用組成物は、特定の組織から調製したＲＮＡ（「総組織ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ＲＮＡ）」）を含みうる。
【００６７】
治療目的のために、被験体を、ＣＤ８３によって外来化合物に対して寛容化可能であるので、被験体が、少なくとも治療の間に、または少なくともＣＤ８３の効果のウインドウの間に、寛容化が望ましくない化合物に暴露されないことが重要である。したがって、たとえば、被験体は、腫瘍特異的抗原、およびウイルス、細菌、かびなどを含む病原微生物に暴露されるべきではない。一般に、本明細書で使用する場合、「被験体」は、治療を必要とする任意の動物を意図する。したがって、たとえば、「被験体」はヒト患者、若しくは非ヒト哺乳動物患者であってもよく、または動物である別の患者であってよい。
【００６８】
疾患または病状の予防が望まれる場合、被験体を、一定間隔（たとえば、約２年ごと、毎年、６ヶ月ごと、２〜４ヶ月ごとまたは毎月）で治療してよい。しかしながら、本発明のすべての実施形態において、本発明の方法および組成物を、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる特定の疾患または障害をもつとして同定された被験体に、または特定の疾患または障害を発症する可能性があるとして同定された被験体に、投与する。たとえば、被験体を、被験体の家族歴の検査の結果、遺伝的試験若しくは被験体の酵素若しくは代謝物濃度を測定するための試験のような医学的試験の結果、または別の疾患若しくは障害と診断される結果として、そのような特定の疾患または障害を発症する可能性として同定してよい。このように、たとえば、本発明の方法は、自己免疫疾患を治療するため、自己免疫疾患の発症を予防するため、または自己免疫疾患の発症に関する被験体のリスクを減少させるために使用してよい。一般に、一連の治療は、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる特定の疾患または病状を緩和する、または予防するために被験体をそれ以上治療しないときに終わる。
【００６９】
したがって、本発明は、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または病状の治療または予防の方法を提供し、そこで、有効量のＣＤ８３が、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とともに、免疫抑制が達成されるように被験体に同時投与される。任意に、治療用組成物をまた、投与してよい。治療用組成物を投与する場合、治療用組成物は、被験体が治療用組成物に対して寛容化するように、ＣＤ８３の有効性の時間枠の間に被験体に投与される。任意の形態の投与が、目的が達成される限り、ＣＤ８３および治療用組成物の送達のために選択される。したがって、たとえば、ＣＤ８３および治療用組成物は、一緒に、および同一の投与形態によって投与してよく、または別々に、および／または異なる投与形態によって投与してよい。したがって、たとえば、ＣＤ８３を、タンパク質として被験体に投与してよく、または（たとえば、ｍＲＮＡとして、または発現ベクター内で）ＣＤ８３をコードする核酸として被験体に投与してよい。
【００７０】
本発明の方法を、たとえば、アレルギー；喘息；組織移植の拒絶；慢性的に投与した物質に対する免疫応答；重症筋無力症、多発性硬化症、脈管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎のような慢性炎症性腸疾患、強直性脊椎炎、全身性紅斑性狼蒼、乾癬のような皮膚疾患、リウマチ性関節炎、およびインスリン依存性糖尿病のような自己免疫疾患；ならびにＡＩＤＳのような、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害を患う、または患うことになりうる被験体を治療するために使用可能である。本発明の方法は、たとえば（多発性骨髄腫および急性リンパ芽球性白血病を含む）白血病のようなＢ細胞過形成、ＡＩＤＳに関連したＢ細胞過敏、毒素性ショック症候群、血清病、および歯周病（たとえば、Ｍａｈａｎｏｎｄａら（２００２）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．３７：１７７−１８３を参照のこと）のような、Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害に悩む被験体を治療するために使用可能である。血清病は、特定の医薬品または抗血清に対する望ましくない免疫応答によって引き起こされる一群の症状である。すなわち、血清病は、別の動物または別のヒトからの抗血清が、受動免疫付与を誘導する目的のために、被験体に与えられる時に発生しうる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害に対する治療を提供し、そこで、治療がＢ細胞枯渇、すなわち、被験体におけるＢ細胞の数および／またはサブタイプの減少を引き起こさない。
【００７１】
本発明の組成物および方法は、単独で使用可能であり（すなわち他の治療を受けていない被験体を治療するために使用可能であり）、または他の治療を受けているか、または受けた被験体に投与可能である。たとえば、特定の疾患または障害に悩んでいる被験体を、本発明の方法および組成物のみで治療可能であり、または本発明の方法および組成物、ならびにたとえば従来の化学療法または薬品治療のような、特定の疾患または障害に罹患しているか、または罹患しうる被験体に一般に投与される、別の治療または療法で治療可能である。したがって、たとえば、本発明の方法には、非免疫抑制性化合物を含む他の化合物の使用または同時投与がさらに含まれうる。したがって、本発明の方法にはさらに、たとえばコルチコステロイド、たとえばアザチオプリンのような抗炎症薬剤、およびたとえばメトトレキサートのような抗代謝薬物を含む、他の化合物の使用または同時投与が含まれうる。
【００７２】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法を、組織レシピエントにおける組織移植の拒絶の少なくとも１つの症状を予防、治癒または緩和するために使用する。そのような実施形態において、移植レシピエント（「レシピエント」または被験体）を、ＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、または少なくとも１つの治療用組成物で治療してよい。治療用組成物は、たとえば移植組織の試料の溶解またはホモジナイゼーションによって、移植組織から調製した、または抽出した抗原のような、移植組織に関連した抗原であってよい。一般に、本発明の方法にしたがった移植レシピエントの治療には、組織の移植前、移植と一緒に（すなわち同時に）、および／または移植後の治療が含まれうる。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、移植組織それ自身であり、したがって、治療用組成物のさらなる投与は、移植組織の導入以外、レシピエントには実施されない；そのような実施形態においては、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物または少なくとも１つの治療用組成物も投与される。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、組織移植の拒絶のすべての有害症状を予防、治癒または緩和し、拒絶を予防するための移植被験体の連続治療が必要なくなり、そのような実施形態では、移植片寛容性が被験体において誘導されたと言われる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、移植されるべき組織のドナー（「移植ドナー」）を、意図するレシピエント内での移植のために組織を採取する前に、（たとえば本発明の方法にしたがって、ＣＤ８３と、少なくとも１つの他の免疫抑制剤、および任意に少なくとも１つの治療用組成物で）治療してよい。いくつかの実施形態において、物質を、本明細書で記述したように、移植ドナーに投与するが、本治療の目的は、移植レシピエントにおいて寛容性および／または免疫抑制を誘導することである。ここでまた、治療用組成物は、移植組織（たとえば器官）に関連した抗原であってよい。いくつかの実施形態において、移植ドナーおよび移植レシピエント両方を、本発明の方法にしたがって治療してよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、移植されるべき組織を、ドナーから採取し、ついでＣＤ８３を含む溶液に暴露してよい。すなわち、たとえば組織を、移植の前に、ＣＤ８３を含む溶液中で保存および／またはかん流させてよい。いくつかの実施形態において、移植されるべき組織をドナーから採取し、ついでＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とを含む溶液に暴露してよい。すなわち、たとえば、組織をＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とを含む溶液中で保存および／またはかん流させてよい。治療用組成物をまた、ドナーに投与してもよい。結果として、本組織が移植レシピエント内に導入されたときに、組織内の、そして組織の表面上のＣＤ８３と他の免疫抑制性化合物（単数または複数）とが、組織に関連した抗原と一緒に被験体に同時投与されることになる。本明細書で使用するところの「組織」は、別個の器官および／または特定の組織（たとえば肝臓、腎臓、心臓、肺、皮膚、膵島など）、ならびに「液体」組織（たとえば、血液、血漿のような血液成分、樹状細胞のような細胞など）を包含し、用語「組織」はまた、別個の器官および「液体」組織の部分およびサブパートを包含する。
【００７５】
当業者は、レシピエントとドナー両方に対して可能である最適な結果を達成するための、移植レシピエントとドナーの評価と治療の方法に詳しい。したがって、当業者は簡単に、ＣＤ８３、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、および任意に特定の被験体に対して適切であるような治療用組成物の用量および投与を評価および調節可能である。以上の議論から簡単に理解されるであろうように、本発明の方法は多数の工程を含み、これらの工程は、少なくとも１つの本発明の目的を達成する限り、任意の順番で実施可能である。本方法は、複数の化合物の複数回投与を含んでよいため、工程の任意のかさなりが発生しうる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物が、たとえばアデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）およびＡＡＶに由来するベクターのような遺伝子治療ベクターに対して、および／または遺伝子治療ベクターによってコードされた遺伝子産物に対して、寛容性を提供する。したがって、たとえば、遺伝子治療を、特定の遺伝子産物を欠く被験体に施す時（たとえば、被験体が特定のタンパク質の欠如をもたらす遺伝的欠損を持つ場合）、被験体内へ導入した時の遺伝子産物に対する望ましくない免疫応答を予防するために、本発明の方法を用いて被験体を治療可能である。好ましくは、本発明の組成物および方法において使用される遺伝子治療ベクターは、病因には関連しないであろう。いくつかの実施形態において、本方法および本方法の組成物が、たとえば多発性硬化症に悩んでいる被験体にしばしば投与される、ベータインターフェロンのような、被験体に繰り返し（すなわち「慢性的に」）投与され、免疫応答が望ましくない物質に対して、寛容性を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、「寛容誘導性」である樹状細胞（「ＤＣ」）を提供し、すなわちこれらは、先に記述したように、免疫耐性を誘導可能である（すなわち「被験体を寛容化」可能である）。樹状細胞の寛容誘導性活性は、直接的または間接的に評価可能であり、インビボまたはインビトロにおいて測定可能である。好適なアッセイが当該技術分野で公知であり、たとえばインビトロでのＣＤ４＋Ｔ細胞集団とのインキュベーション後の制御性Ｔ細胞の産生能力、および／またはＣＤ１４またはＣＤ８０のような細胞表面マーカーの発現における検出可能な変化が含まれる（たとえば、Ｓｔｅｉｎｍａｎら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１；Ｋｕｂａｃｈら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：１９７−２０３を参照のこと）。
【００７８】
本発明の寛容誘導性樹状細胞によって誘導される寛容性は、インビボまたはエクスビボにおいて誘導されてよく、ＤＣによって提示された抗原に対して特異的であってよい。用語「免疫刺激性」ＤＣは、本発明の寛容誘導性ＤＣを「正常」ＤＣまたはネイティブＤＣと区別するために本明細書で使用している。寛容誘導性ＤＣを産生するための本発明の方法は、インビボまたはエクスビボで実施してよく、ＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物に対して、細胞を暴露する工程が含まれる。細胞は、成熟化過程の間、または成熟化過程が完了した後、インビボまたはエクスビボ（インビトロ）いずれかで、ＣＤ８３と他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露してよい。成熟化過程がインビトロで実施される実施形態において、「暴露」は、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）の存在下で細胞をインキュベートしてよいこと、またはＣＤ８３と他の免疫抑制性化合物（単数または複数）の存在下で培養してよいこと（すなわち細胞が増殖および分裂しうること）を意図している。細胞を、任意の好適な様式で、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露してよく、たとえば、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）を、増殖培地に加えてよく、または可能である場合、１つまたはそれ以上のＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）は、それらをコードするＲＮＡでのトランスフェクション後、培養液中の細胞によって発現されてよい。
【００７９】
いくつかの実施形態において、寛容誘導性ＤＣを産生するための方法には、産生過程の間（たとえば最終成熟化過程の間）、未熟ＤＣをＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とに暴露することが含まれる。一般に、これらの方法において、未熟樹状細胞を、培地１ｍｌあたり、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０または１００マイクログラムの下限、および培地１ｍｌあたり、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、１００または２００マイクログラムの上限を持つ範囲内で、ＣＤ８３に暴露してよい。もっとも好ましくは、ＤＣを、１〜１０μｇ／ｍｌのＣＤ８３の存在下で成熟させる。他の免疫抑制性化合物（単数または複数）の用量は、当業者によって簡単に選択されうる。本明細書で使用するところの「未熟ＤＣ」は、細胞が、（インビトロの場合）適切に培養された場合、または（インビボの場合）成熟させられた場合、成熟樹状細胞になることが可能であることを意図する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法には、成熟化過程の少なくとも１工程の間、細胞をＣＤ８３に暴露すること、および成熟化過程の少なくとも１工程の間、細胞を他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露することが含まれ、これらの工程は、同一の工程（単数または複数）であってよく、または異なるおよび／または重なり合わない工程（単数または複数）であってよい。いくつかの実施形態において、成熟化過程の少なくとも１工程を通して、成熟化工程の２工程以上の間、または全成熟化過程の間、細胞を、ＣＤ８３および／または他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露する。
【００８０】
本発明の寛容誘導性樹状細胞をまた、抗原で細胞を「パルスする」ことによって、またはＲＮＡを細胞に形質導入することによって、提示のために抗原を取り込ませてもよい（たとえば、米国特許第６，３８７，７０１号、米国特許第６，６７０，１８６号、米国特許出願第１０／３６２，７１５号を参照のこと）。さらなる利点を提供するために、本発明の方法を、当該技術分野で既知の他の方法と組み合わせてもよい（たとえば米国特許第５，８３１，０６８号、米国特許出願第１１／２４６，３８７号を参照のこと）。本発明の方法の工程が、望まれる結果を生ずる任意の順番で実施してよいことが理解される。したがって、たとえば、ＣＤ８３への、および／または他の免疫抑制性化合物（単数または複数）への暴露の前、または後に、細胞に抗原を取り込ませてもよい。このように、本発明の方法には、成熟化過程の間の、ＣＤ８３、少なくとも１つの免疫抑制性化合物、および任意に治療用組成物（たとえば対象とする抗原）の細胞への同時投与を含む方法による、寛容誘導性樹状細胞の産生が含まれる。
【００８１】
成熟免疫刺激性樹状細胞は一般に、細胞表面マーカーの特徴的なアレイを示す。したがって、一般に、成熟免疫刺激性ＤＣは、ＣＤ１４の発現を全く、またはほとんど示さない。また一般に、成熟免疫刺激性ＤＣ（インビボで産生されるネイティブＤＣまたはインビトロで産生されるＤＣのいずれか）は、たとえば、細胞表面マーカーＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現、およびＩＬ−１２の分泌のような特徴を示しうる。反対に、いくつかの実施形態において、本発明の方法によって産生された寛容誘導性ＤＣでは、これらの特徴的細胞表面マーカーの少なくとも１つの発現のレベルが減少する。いくつかの実施形態において、本発明の方法によって産生された寛容誘導性ＤＣ上の特定の細胞表面マーカーの発現のレベルは、適切な対照細胞（たとえば、ネイティブ成熟免疫刺激性ＤＣ、またはインビトロ成熟化を介して得た成熟免疫刺激性ＤＣ）上の同一の細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少するか、検出不能である。いくつかの実施形態において、本発明の寛容誘導性ＤＣは、ＣＤ８３の検出不能な発現と、大幅に減少したＣＤ８０の発現を示す。いくつかの実施形態において、本発明の寛容誘導性ＤＣは、適切な対照細胞と比較して、各マーカーに対して、少なくとも９５％減少するＣＤ８３発現と、少なくとも５０％減少するＣＤ８０発現を示す。また、いくつかの実施形態において、本発明の寛容誘導性ＤＣは、成熟免疫刺激性ＤＣよりも高いＣＤ１４の発現を示す。寛容誘導性樹状細胞は、当該技術分野で既知の（たとえばＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）、または実験の項目において記述するような、または以下のような技術を用いて、産生されおよび／または機能に関してアッセイされてよい。
【００８２】
たとえば、細胞を、１％ヒト血清を含む標準培地（たとえばグルタミン（２００μｇ／ｍｌ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および（５６℃で３０分間インキュベートすることによって先に熱不活性化した）単一ドナーからの１％ヒト血清を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））を用いて培養可能である。ヒトＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中での沈降によってバフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）から単離可能であり、ＩｇＧ（コーン画分からの１０μｇ／ｍｌ γ−グロブリン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコートした１００ｍｍ培養ディッシュ上に播種し、５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベート可能である。１時間および７時間のインキュベーション後、非接着細胞画分を取り除き、接着細胞をさらに、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を添加した１％ ヒト血漿培地中で培養した。インキュベーション期間の第３日に、新鮮な培地（４００Ｕ／ｍｌでＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍｌでＩＬ−４を含む）を加える。第４日または第５日に、非接着細胞を回収し、計数し、０．３〜０．５×１０５細胞／ｍｌの密度で、新しいディッシュに移す。最終成熟化工程のために、１％ヒト血漿培地に、ＴＮＦ−α（１．２５ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（４０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）、プロスタグランジンＥ２（０．５ｐｇ／ｍｌ、たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）を加える。あるいは、最終成熟化工程のために、成熟化カクテルには、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）が含まれる。第８日に、細胞をＦＡＣＳによって解析可能である。本方法によって成熟した細胞は、正常に成熟したＤＣと比較した時に、ＣＤ８０の細胞表面発現における明確な減少（たとえば９６％から６６％）、およびＣＤ８３の細胞表面発現における明確な減少（たとえば、９６％から３０％）、およびＣＤ１４陽性細胞の増加を示している（たとえば、ＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）。他の細胞表面マーカー（たとえばＭＨＣクラスＩおよびＩＩ）の発現は有意に影響を受けえない。他の実施形態において、細胞を、以上で記述したようなプロトコルにしたがって成熟化可能であるが、可溶性ＣＤ８３を、１、２、３またはそれ以上の日数後に成熟化カクテルに加えることができる。
【００８３】
ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露した樹状細胞を、それらの寛容誘導性または免疫刺激性特性を評価するための種々の方法において、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物に暴露しなかった樹状細胞と比較可能である。適切なアッセイが当該技術分野で既知であり（たとえばＭＬＲアッセイ）、いくつかを、実験の項目でも記述している。ＭＬＲアッセイの典型的な特徴は、免疫刺激性ＤＣおよび増殖Ｔ細胞のクラスターの形成である。アッセイの１日目での可溶性ＣＤ８３の添加が、典型的な細胞クラスター形成を強力に阻害する（たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）。さらに、可溶性ＣＤ８３は、成熟樹状細胞のＴ細胞増殖を刺激する能力を、濃度依存的に阻害する（たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１），上記を参照のこと）。
【００８４】
いくつかの実施形態において、寛容誘導性樹状細胞を、制御性Ｔ細胞を産生するために使用する（たとえば、米国特許出願第１０／６６１，８０４号を参照のこと）。簡単に記すと、制御性Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む集団から産生してよい。これらのＴ細胞集団は、被験体から単離してよく、または培養してよい。たとえば、特定の細胞（たとえばＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞）の濃縮集団を含むように、細胞表面マーカーによって分類した集団のような、Ｔ細胞の亜集団も使用してよい。ついでＴ細胞を、本発明の寛容誘導性樹状細胞とともに、すなわちたとえば成熟化過程の間にｓＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物に暴露した樹状細胞とともに、培養またはインキュベートする。制御性Ｔ細胞をインビトロにおいて産生している場合、寛容誘導性樹状細胞はＴ細胞と同種異系であるか、または同系であってよい。いくつかの実施形態において、寛容誘導性ＤＣに、抗原を取り込ませる（たとえば抗原でパルスするか、または抗原コードＲＮＡでトランスフェクトする）。そのような実施形態において、寛容誘導性ＤＣは、Ｔ細胞に対して抗原を提示してよい。
【００８５】
寛容誘導性Ｔ細胞の産生の間、Ｔ細胞を、１回または２回以上、寛容誘導性ＤＣに暴露してよく、および／または寛容誘導性ＤＣとともに培養してよい。たとえば、Ｔ細胞を、数日間または数週間、ＤＣとともに培養してよく、必要であれば混合培養液中のＤＣを補充してよい。いくつかの実施形態において、培養を、治療量の制御性Ｔ細胞が得られるまで続ける。他の培養技術および／または添加物を使用して、得られる結果を改善してよく、たとえば培養培地には、ＩＬ−２のようなサイトカインが含まれてもよい。
【００８６】
一般に、制御性Ｔ細胞は、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βを分泌し（たとえばＷａｌｓｈら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１３９８−１４０３を参照のこと）、これらのサイトカインの分泌を確かめるためのアッセイが、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、制御性Ｔ細胞は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％または１００％、混合リンパ球反応を阻害する。混合リンパ球反応アッセイは、当該技術分野でよく知られている。本発明の制御性Ｔ細胞は、抗原特異的である。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は一般に、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を含む特徴的な細胞表面マーカーを発現し、細胞表面マーカーに対するアッセイが、当該技術分野でよく知られている。
【００８７】
用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、またはポリヌクレオチドの挿入または組み込みによって操作可能な、当該技術分野で既知の他の担体を意味する。そのようなベクターは、遺伝子操作のために使用可能であり（すなわち「クローニングベクター」）、または挿入されたポリヌクレオチドを複写および／または翻訳するために使用可能である（「発現ベクター」）。ベクターは一般に、細胞内での増殖のための複製起点とプロモーターとを少なくとも含む。本明細書に記載するような発現制御因子を含む、発現ベクター内に存在する制御因子が、適切な転写および翻訳を促進するために含まれる（たとえば、イントロンのためのスプライシングシグナル、インフレームでのｍＲＮＡの翻訳を許可するための、遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、終止コドンなど）。本明細書で使用するところの用語「制御因子」には、最低限、１つまたはそれ以上の、その存在が発現に影響を与えうる成分が含まれ、本明細書で使用するところの用語「発現制御因子」は、操作可能に連結する核酸配列の発現を調節する１つまたはそれ以上の核酸配列を意味する。核酸配列に操作可能に連結した発現制御因子は、転写を制御し、必要に応じて、核酸配列の翻訳を制御する。したがって、発現制御因子には、必要に応じて、タンパク質コード遺伝子の前に、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子、および／または開始コドン（たとえばＡＴＧ）が含まれうる。ベクターはまた、たとえばリーダー配列および融合タンパク質配列のようなさらなる成分を含みうる。「操作可能に連結」は、成分が、それらの意図するように機能することを可能にする関係にある、並列位置を意味する。
【００８８】
「プロモーター」は、転写を指向するのに十分な、少なくとも最小配列を意味する。本発明において使用されるプロモーター、または本発明とともに使用されるプロモーターは、必要に応じて、構成的であるか、誘導可能である（たとえばＢｉｔｔｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４を参照のこと）。誘導性プロモーターは、外部シグナルまたは薬剤によって活性化される。他のプロモーター要素には、特定の細胞型、組織または生理学的状態に対する、プロモーター依存性遺伝子発現の制御を提供するのに十分であるものが含まれてよく、そのような要素は、遺伝子の５’、３’またはイントロン領域内に局在しうる。有用なプロモーターにはまた、特定の条件下でのみ活性である「条件付けプロモーター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」も含まれる。たとえば、条件付けプロモーターは、特定の薬剤（たとえば化合物）が存在する時、不活性であるか、または抑制されてよく、薬剤がもはや存在しないときに活性であるか、活性化される可能性がある。
【００８９】
本明細書で使用するところの、「トランスフェクトすること」または「トランスフェクション」は、真核細胞内への１つ以上の外来性核酸またはポリヌクレオチドの導入を意味する。トランスフェクションには、核酸またはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現可能である様式での導入が含まれる。トランスフェクション法は当該技術分野で既知であり、エレクトロポレーション、タンパク質に基づく核酸送達複合体、脂質に基づく核酸送達複合体、およびカチオン性イオンに基づく核酸送達複合体を使用する方法、ウイルスベクター、「遺伝子ガン」送達、および種々の他の技術のような、種々の技術が含まれる。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞（たとえばＤＣ）内に導入したポリヌクレオチドは、細胞を遺伝子操作はせず、安定に維持されない。用語「遺伝子操作された」または「形質転換された」は、外来遺伝子、または言い換えれば次々に細胞またはその子孫の遺伝子型を改変する核酸配列を含むこと、および／または発現することを意味し、いくつかの実施形態において、細胞の表現型がまた変化する。「遺伝子操作」または「形質転換」はまた、細胞の内因性ヌクレオチドへの任意の付加、欠失または破壊をも意味する。導入したポリヌクレオチドの安定的な維持は典型的に、ポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合可能な複製起点を持つか、または染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）または核染色体またはミトコンドリア染色体のような細胞のレプリコンへ統合されるかのいずれかであることを必要とする。
【００９１】
用語「一過性にトランスフェクトした」は、トランスフェクトされたが、遺伝子操作されていない細胞のことであって、したがってその細胞の子孫が、形質導入された遺伝物質（たとえば核酸またはポリヌクレオチド）を遺伝しない細胞を意味する。遺伝物質は、ＲＮＡであってよく、またはＲＮＡに転写されてよく、遺伝物質によってコードされるタンパク質が発現されてよい。そのような発現を、本明細書で「一過性発現」と呼ぶ。通常、一過性発現は、トランスフェクトされた遺伝物質を染色体内に取り込まないことによって達成される。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態において、樹状細胞を、ＲＮＡエレクトロポレーションを用いて、一過性にトランスフェクトする。ＲＮＡエレクトロポレーションの方法は、当該技術分野でよく知られている。一般に、ｍＲＮＡは、染色体または染色体外のいずれにおいても、細胞のゲノムの恒久的一部分とはならない。所望のタンパク質を一過性に発現するために使用可能な任意の他の方法もまた、本発明の範囲内で企図される。この方法には、ゲノムの恒久的な変化が含まれず（すなわち、細胞に対して遺伝可能な遺伝的変化をもたらさない）、したがって、たとえばレトロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルスの使用と関連した不利益を回避する。
【００９３】
所望であれば、ＤＮＡでの細胞の形質転換を、当業者に既知の従来の技術によって実施してよい。たとえば、細胞が真核生物の場合、ＤＮＡ形質転換の方法には、たとえば、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム中に含まれるプラスミドの挿入、およびウイルスベクターのような従来の機械的手段が含まれる。真核細胞をまた、対象とする核酸をコードするＤＮＡ配列、および／または本明細書に記載したもののような選択可能表現型をコードする第二の外来ＤＮＡと同時形質転換可能でもある。別の方法は、真核細胞を一過性に感染させるか、形質転換して、タンパク質を発現させるための、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスのような、真核ウイルスベクターを使用することである。形質転換に続いて、ＣＤ８３を従来の方法にしたがって、単離し、精製してよい。たとえば、発現宿主（たとえば細菌）から調製した溶解物を、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィまたは他の精製技術を用いて精製可能である。実質的に純粋なタンパク質をまた、ペプチド合成機（たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）など）を用いる、化学合成によって得ることもできる。ＣＤ８３はまた、本明細書以下の実験の項目にて記述したように産生してもよい。
【００９４】
ＣＤ８３と、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、または少なくとも１つの本発明にしたがった治療用組成物を含む、医薬品または薬学的組成物の生産、およびそのような医薬品または薬学的組成物の使用は、一般的な薬学的技術方法によって慣習的な様式で発生し、したがって当業者によって簡単に提供される。当業者は、異なる形態の投与が、異なる化合物および／または適応症に対して好適であることを理解し、もっとも適切な投与方法を選択可能である。たとえば、乾癬は、皮膚への投与のために好適な製剤で、局所で治療してよく、一方で全身性エリテマトーデスは、腹腔内注射のための好適な製剤の、被験体への投与によって治療してよい。当業者は、生化学的および免疫学的アッセイを含む、たとえば従来の臨床および実験室試験からの結果の評価のような、化合物の用量および投与の調節のための基準ならびに方法に詳しい。必要に応じて、医薬品の成分を別々に投与可能である。
【００９５】
一般に、本発明の化合物は、種々の適応症および種々の型の投与経路に対して好適な医療用形態を提供するために、好適な、薬学的に許容可能なアジュバントおよび／または担体と一緒に処理される。好適な薬学的組成物にはまた、安定化剤および保存剤が含まれうる。担体、安定化剤およびアジュバントの例に関して、たとえばＧｅｎｎａｒｏ（１９９５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．）を参照のこと。したがって、医薬品は、たとえば、迅速な投与効果または徐放性効果のような、それぞれの望まれる放出速度を得るように生産可能である。
【００９６】
本発明によって提供された治療の方法には、インビボで被験体における寛容性および／または免疫抑制を誘導するための、ＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、および任意に治療用組成物（たとえば抗原）の使用が含まれる。これらの物質を被験体に投与する方法には、限定はされないが、たとえば、経口、経肺、非経口（たとえば筋肉内、関節内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）、吸引（微細な粉末処方または微細なミスト（エアロゾル）による）、経皮、皮内、経鼻、経膣、経直腸、舌下投与経路のような、従来の生理学的に許容可能な経路が含まれる。これらの物質（すなわちＣＤ８３、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、および任意に治療用組成物）は、担体と一緒に投与してよく、これらは、同一の製剤内で、同一の投与経路を介して投与してよく、または異なる製剤で、および／若しくは異なる投与経路を介して投与してよい。好ましくは、各物質を、その最適用量にて、同時投与の最適な治療効果が得られるように、投与する。たとえば、抗体の投与は、静脈内注射経由であってよく、一方でＣＤ８３の投与は、腹腔内注射であってよく、免疫抑制性化合物の投与はピルでの経口投与によるものであってよい。
【００９７】
担体には、任意の好適な生理学的溶液または分散剤などが含まれる。生理学的溶液には、生理食塩水または緩衝生理食塩水のような、任意の許容可能な溶液または分散培地が含まれる。担体にはまた、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸着遅延薬剤なども含まれてよい。任意の従来の培地、担体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いて、その使用が企図されている。担体にはさらに、限定はされないが、たとえばインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびＴＧＦ−βのようなサイトカインを含む、１つまたはそれ以上のさらなる化合物が含まれる。
【００９８】
薬学的組成物が、特定の動物種への投与のための核酸を含む場合、本発明において使用される核酸は、その種に由来してよい。たとえば、ＣＤ８３をコードする核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む薬学的組成物をヒトに投与する場合、核酸には、ヒト型のＣＤ８３タンパク質の配列が含まれてよい。本発明において使用される核酸は、核酸の細胞膜透過性および／または細胞取り込みを増加させる薬剤との組合せで投与可能である。これらの薬剤の例は、たとえばＡｎｔｏｎｙら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１０７７５−１０７８４に記載されたようなポリアミン；たとえばＥｓｃｒｉｏｕら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６８：２７６−２８８によって記載されたような分岐ポリアミン；たとえばＧｕｙ−Ｃａｆｆｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３１３９１−３１３９６によって記載されたポリアミノ脂質；Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７によって記載されたようなＤＯＴＭＡ；およびＢｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（２３）：５３１０−５３１７によって記載されたようなカチオン性ポルフィリンがあげられる。
【００９９】
本発明によって提供された組成物、医薬品および治療方法にはまた、本発明の方法にしたがって産生された寛容誘導性ＤＣおよび／または制御性Ｔ細胞と、インビボで被験体の寛容性を誘導するためのそれらの使用も含まれる。本発明の寛容誘導性ＤＣおよび制御性Ｔ細胞の被験体への投与の方法には、限定はされないが、たとえば、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射のような、従来の生理学的に許容可能な経路が含まれる。本発明の細胞（すなわち、本発明の方法によって産生された寛容誘導性ＤＣおよび／または制御性Ｔ細胞）は、担体と一緒に投与してよい。そのような担体には、たとえば生理食塩水または緩衝生理食塩水のような、任意の好適な生理学的溶液または分散剤などが含まれる。担体にはまた、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸着遅延剤などが含まれてよい。任意の従来の培地、担体または薬剤が、活性成分（すなわち寛容誘導性ＤＣおよび／または制御性Ｔ細胞）と不適合である場合を除いて、組成物中でのその使用が企図される。
【０１００】
当業者によく知られているように、インビボで投与されるべき、本発明の細胞の用量は、宿主の種、年齢、体重および疾患状態を含む、種々のパラメータを参照して決定される。用量はまた、宿主内の標的とされる部位、たとえばドナーからの組織の移植の部位にもよる。たとえば、挿入組織の部位の直接標的化には、哺乳動物宿主の血流内への投与とは異なる用量が必要とされうる。用量は好ましくは、投与が効果的な結果を導くように選択され、これは、分子アッセイによって、または被験体における好適な症状をモニタすることによって、測定可能である。用量は、１回の投与あたり、少なくとも約１×１０４細胞〜少なくとも約１×１０９細胞の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、用量は、約５×１０５細胞〜約５×１０７細胞の範囲である。最大の治療効果を達成するために、いくつかの用量が必要とされうる。
【０１０１】
必要に応じて、本発明の細胞の予備投与もまた使用してよい。したがって、たとえば、細胞を移植組織の生存を延長するために使用すべき場合、移植レシピエント内への細胞の投与を、たとえば移植の１週間前など、移植の前に実施してよい。投与はまた、移植組織の受容または拒絶反応がないことを確かにするために、移植の時点、またはその後（たとえば移植の１〜２週間後、または臨床評価に基づいて必要である間）実施してもよい。必要に応じて、治療にはまた、本明細書にて記述した２つ以上の個々の治療が含まれてよく、したがって、たとえば、患者に対する一連の治療には、ｓＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物との投与が含まれてよく、そして寛容誘導性ＤＣの投与も含まれてよい。
【０１０２】
本明細書で引用された各特許、特許出願、科学論文、書籍または書籍の見出しおよび他の参考文献は、そのすべてが、各個々の引用が特別にかつ個々に、参照によって組み込まれるべきことを示す場合と同程度まで、参照によって本明細書に組み込まれている。
【０１０３】
以下にて、本発明の種々の側面が、実施例によってより詳細に記述されている。しかしながら、本発明は、これらの実施例によって例示された実施形態のみに限定はされず、全体として、本出願においてより十分に記述されたような利点を提供する。
【実施例】
【０１０４】
実験
一般方法：
一般的な技術に関して、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｉｃｏら編（Ｗｉｌｅｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）を参照のこと。
【０１０５】
ウエスタンブロッティング／クマシーブルー染色：ｓＣＤ８３を評価するための典型的な手順は以下のとおりであった。ｓＣＤ８３の各試料に関して、１マイクログラムのｓＣＤ８３を、ランニング緩衝液および２マイクロリットルのβ−メルカプトエタノールとともに調製した。試料を１０分間、９６度で加熱し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルをクマシーブルーで直接染色するか、もしくは所望であれば、膜に移した。膜を、１／１０００ ＣＤ８３ ４Ｂ５モノクローナル一次抗体で、ついで１／２０，０００ヤギ抗−ラット二次抗体でプローブし、シグナルをＡｍｅｒｓｈａｍ化学発光試薬で展開した。
【０１０６】
霊長類混合リンパ球反応（「ＭＬＲ」）：ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配分離を用いて、２匹の異なるカニクイザルの血液試料から単離した。刺激細胞を、マイトマイシンＣまたは放射線処理で、非増殖性にした。刺激細胞および応答細胞を、３×１０５細胞／ウェルで播種し、滴定量のｓＣＤ８３で処理した。９６時間の時点で、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を培養液に加えた。細胞を１８〜２０時間後に回収し、Ｔ細胞増殖の量を測定するために解析した。
【０１０７】
ＴＮＦ−α、ＣＤ８６およびＣＣＲ５に対する染色：ＴＮＦ−α（細胞内）ならびにＣＤ８６およびＣＣＲ５（表面）に対する染色を以下のように実施した。全血試料を、カニクイザルより得て、ｓＣＤ８３とともに１２時間インキュベートした。試料を１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳと１００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−γで６時間刺激した。ＴＮＦ−αに対する細胞内染色を、市販のＦｉｘ／Ｐｅｒｍキットを用いて実施した。あるいは、ＣＤ８６およびＣＣＲ５に対する表面染色を、標準的な技術を用いて実施した。染色後、赤血球細胞を溶解させ、結果を、ＢＤ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析した。
【０１０８】
Ｂ細胞増殖プロトコル：マウス脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製し、赤血球細胞をＡＣＫ溶解緩衝液を用いて溶解させた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｉｃｏら編（Ｗｉｌｅｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）を参照のこと）。Ｂ細胞をＣＤ１９ ＭＡＣＳビーズを用いて精製し、１０５細胞／ウェルの純粋なＢ細胞を、滴定量のｓＣＤ８３とともに、３時間予備インキュベートした。ついでＢ細胞を２μｇ／ｍＬ ＬＰＳで刺激した。４８時間の時点で、１μＣｉの３Ｈ−チミジン／ウェルを培養液に加えた。細胞を１８〜２０時間後に回収して、Ｂ細胞増殖の量を測定した。
【０１０９】
インビトロ研究のための抗体産生プロトコル：ＩｇＭおよびＩｇＧ産生は以下のとおりであった。（Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの）２×１０６Ｂ細胞／ウェルの純粋な集団を、滴定濃度のｓＣＤ８３（１５〜９０μｇ／ｍＬ）の存在下、（抗体産生を誘導するために）２０μｇ／ｍＬのＬＰＳとともに培養した。上清を培養の７２時間後に回収し、上清中のＩｇＭとＩｇＧの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１１０】
アイソタイプ変換：（Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの）２×１０６Ｂ細胞／ウェルの純粋な集団を、以下の処理の１つで培養した：２０μｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＩｇＧ２ｂを誘導するため）、；２０μｇ／ｍＬ ＬＰＳ、８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４および１５０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−５（ＩｇＧ１を誘導するため）；または２０μｇ／ｍＬ ＬＰＳおよび１０００ Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−γ（ＩｇＧ２ａを誘導するため）。各処理のために、いくつかの細胞を、６０μｇ／ｍＬ ｓＣＤ８３とともに培養し、いくつかを未処理対照として設計した。細胞を７２時間後に回収し、簡単に酸洗浄をして、Ｆｃレセプター結合免疫グロブリンを除去した。ついで細胞を、表面ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをそれぞれ検出するために、以下のうちの１つを使用して染色した：抗−ＩｇＭ−ＦＩＴＣおよび抗−ＩｇＧ２ｂ−ＲＰＥ、抗−ＩｇＭ−ＦＩＴＣおよび抗−ＩｇＧ１−ＲＰＥ、または抗−ＩｇＭ−ＦＩＴＣおよび抗−ＩｇＧ２ａ−ＲＰＥ。
【０１１１】
エクスビボ研究のための抗体産生プロトコル：Ｂ細胞増殖：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、Ｃ３Ｈマウスからの異所性心臓同種移植片を与えた。マウスを未処理のままにするか、または腹腔内注射によって、１００μｇのｓＣＤ８３の１日用量で処理した。次いでマウスを、未処理マウスのおおよその平均生存期間であった８日目に屠殺した。Ｂ細胞をついでマウス脾臓より回収し、１０５Ｂ細胞／ウェルの純粋な集団を、細胞を刺激するために、２μｇ／ｍＬのＬＰＳとともに培養した（ｓＣＤ８３は加えない）。培養の４８時間後、３Ｈ−チミジンを加え、さらに１８〜２０時間の培養後、細胞を回収して、３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。
【０１１２】
ＩｇＭおよびＩｇＧの産生：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、Ｃ３Ｈマウスからの異所性心臓同種移植片を与えた。マウスを未処理のままにするか、または腹腔内注射による、１００μｇのｓＣＤ８３の１日用量で処理した。ついでマウスを、未処理マウスのおおよその平均生存期間であった８日目に屠殺した。Ｂ細胞をレシピエントマウスの脾臓から回収し、（抗体産生を誘導するため、ｓＣＤ８３を加えない）２×１０６Ｂ細胞／ウェルで、２０ｕｇ／ｍＬ ＬＰＳとともに培養した。培養の７２時間後、上清を回収し、ＩｇＭおよびＩｇＧ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１１３】
移植：マウス株の選択の手順および基準が当該技術分野で既知である。たとえば、Ｗａｎｇら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３８２３−３８３６を参照のこと。
実施例１
組換え可溶性ＣＤ８３の産生
細菌株およびプラスミド：ＧＳＴに融合した、ＣＤ８３の細胞外ドメイン（ｓＣＤ８３）をコードするｃＤＮＡを含むｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔのプラスミドを、ＩＰＴＧ誘導ｔａｃプロモーターの制御下にある、組換えＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔの産生のための発現ベクターとして使用した（たとえばＬｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２４：４４５−４５２を参照のこと）。ＧＳＴとｈＣＤ８３ｅｘｔとの間の連結におけるトロンビン開裂部位の設計のために、最終ｓＣＤ８３産物は、アミノ末端に、４つの余剰アミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）を持つ。
【０１１４】
ＧＳＴ−ｓＣＤ８３の培養：Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ博士によって提供された大腸菌産生株を、−８０℃にて凍結保存し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｍｐ）を含む、ＬＢ寒天プレート（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトンおよび１５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ寒天）上にストリーキングすることによって再活性化した。プレートを、約１５時間、３７℃にてインキュベートした。２、３の単離した単一コロニーを使用して、５０μｇ／ｍＬ Ａｍｐを含む６００ｍＬ ＬＢ培地に植菌した。培養液をついで、回転式振盪培養器上で、２００ｒｐｍで約１６時間、３７℃にてインキュベートした。（６００ｍＬまでの）種培養液を使用して、１〜１５リットルの実質容量の培養培地（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトン、および５ｇ／Ｌ グルコース）を含むバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ＡＧ，Ｗｅｔｚｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に植菌した。細胞が、２．０±０．２ＯＤ６００の指定された細胞密度まで増殖したときに、培養液に、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ産生の誘導のために、０．５ｍＭ イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。５０μＬ／ＬでのＡｎｔｉｆｏａｍ ２８９（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）も、培養の間の過剰な発泡を避けるために培養液に加えた。エアレーションのために、バイオリアクターを、１．５ｖｖｍで、濾過滅菌した空気でパージした。培養液ｐＨを、ｐＨ電極（Ｉｎｇｏｌｄ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ｐＨコントローラー（Ｍｏｄｅｌ ｐＨ−４０，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）、および２つの蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＵＫ）の組合せを用いて、３Ｎ ＮＨ４ＯＨまたは３Ｎ Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、７．００±０．１５に維持した。誘導の後、バイオリアクターを、６時間、２８℃および６００〜６５０ｒｐｍで運転した。
【０１１５】
ｓＣＤ８３の後処理：培養後、細胞を、６０００×ｇおよび２℃での遠心によって回収し、重量を量り、後で使用するために−８０℃で保存した。典型的には、約２０ｇ湿潤細胞重量（ｗｃｗ）の細胞ペーストを、８〜１０ＯＤ６００の細胞密度を持つ培養液１リットルから得ることができたが、これは、１ｇ ｗｃｗが、４００〜５００ＯＤ６００ユニットとほぼ等価であることを意味する。ｈＣＤ８３ｅｘｔの精製のために溶解物を調製するために、０．０５ｇｗｃｗ／ｍＬでの細胞懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）中に、適切な量の凍結細胞ペーストを懸濁させることによって調製した。約２０〜２５ＯＤ６００での１００ｍＬの細胞懸濁液のバッチを、標準的なチップでの超音波処理装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、４分間、断続的に（０．５秒オン／０．５秒オフ）、超音波処理した。処理した細胞溶解物をついで、１５，０００×ｇおよび２℃で１５分間遠心し、細胞残骸を除去した。総可溶性タンパク質を含む上清を、タンパク質精製のための引き続くクロマトグラフィ処理の前に、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０１１６】
ＧＳＴアフィニティクロマトグラフィによってＧＳＴ−ＣＤ８３融合タンパク質を捕獲するために、上記で調製した溶解物１００ｍＬを、４ｍＬ／分の流速で、２０ｍＬ ＧＳＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）内にロードした。カラムに結合させる一方で、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合物を、インサイチュにおいて、１０Ｕ／ｍＬトロンビンで開裂させた（すなわち「カラム上開裂」。これを実施するために、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合物と結合したＧＳＴｒａｐカラム内のＰＢＳ結合緩衝液を、カラム内への手動注入によって、同容量の１０Ｕ／ｍＬトロンビンを含む結合緩衝液で置換した。開裂は、約２．５時間、室温で実施し、主にトロンビンと夾雑したｈＣＤ８３ｅｘｔを含む、ＧＳＴｒａｐカラム中の大部分の液体を、１カラム容量の結合緩衝液を用いて押し出した。ＧＳＴ部位を残りの未消化ＧＳＴ−ｈＣＤ８３と一緒に、溶出緩衝液を用いて溶出した。カラム上開裂の良好な性能を維持するために、ＧＳＴｒａｐカラムを、１Ｍ ＮａＯＨおよび６Ｍ グアニジンＨＣｌで洗浄して、カラム内にトラップされた種々のタンパク質夾雑物を除去した。
【０１１７】
ＣＤ８３からトロンビンおよび他の夾雑タンパク質を除去するために、ポリッシング工程を実施した。ＨＰＬＣシステムも、本精製工程の実施のために使用することが可能であるが、強力なアニオン交換カラム（ＸＫ１６／２０中の３０ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えるＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ ＵＰＣ１０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を処理のために使用した。使用したローディング緩衝液および溶出緩衝液は、それぞれ、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）および１Ｍ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液であった。最初に、ＦＰＬＣシステムのアニオン交換カラムをローディング緩衝液で平衡化した。ついで、先に記載したＧＳＴｒａｐカラムから溶出したタンパク質溶液を、カラム内にロードした。ｈＣＤ８３ｅｘｔを含む画分を溶出し、プールし、高圧攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ、ＹＭ１０ディスク付きＭｏｄｅｌ ８０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｎａｄａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ Ｃａｎａｄａ）、または同様の限外濾過ユニットを用いる限外濾過で濃縮し、ついで−２０℃で保存した。本産物の蓄積を、蓄積量が、さらなるエンドトキシン除去のための処理に十分な量になるまで、毎日実施した。
【０１１８】
さらなるエンドトキシン除去のために、約１ｇの蓄積ｓＣＤ８３を、ポリッシング工程と同一の実験装置およびプロトコルを用いて、アニオン交換クロマトグラフィによって処理した。本処理工程のためのすべての緩衝液を、注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いて調製した。ｈＣＤ８３ｅｘｔを含む画分をプールし、高圧攪拌セルを用いる限外濾過で濃縮した。最後に、ＣＤ８３産物画分を、エンドトキシン除去のために、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）または同様の濾過ユニットを用いる濾過に供することができ、ついで濾過滅菌可能である。各産物の画分のエンドトキシンをアッセイした。
【０１１９】
解析プロトコル：培養液試料を、分光光度計（ＤＵ（登録商標）５２０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、ＯＤ６００における細胞密度を測定するために、生理食塩水で適切に希釈した。解析のための細胞抽出物の調製のために、４０ＯＤ６００ユニットの量の細胞（「ＯＤ６００×ｍＬ」と定義する）を、６０００×ｇ、２℃で１０分間遠心した。細胞ペレットを、３ｍＬ ＰＢＳ中で再懸濁させ、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）によって破壊し、ついで１５，０００×ｇ、２℃で１５分間遠心して、細胞残骸を除去した。細胞破壊はまた、他の物理的方法（たとえば超音波処理）または化学的方法を用いて引き起こしてよい。可溶性タンパク質を含む上清を、ＧＳＴアッセイおよびＳＤＳゲルのために使用した。不溶性タンパク質と細胞残骸を含むペレットを、リン酸緩衝液で洗浄し、ＴＥ／ＳＤＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で再懸濁させ、１００℃まで５分間加熱して溶解させた。ペレットのタンパク質分を、不溶性画分として解析した。
【０１２０】
ＧＳＴ機能を、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）およびグルタチオンを用いて、室温でアッセイした。ＧＳＴ（およびその融合物）は、２つの基質間の反応を触媒して、３４０ｎｍにおいて検出可能な共役産物を形成する。１ユニット（ＵＧＳＴ）は、１ ＯＤ３４０／分での吸収の増加を引き起こす酵素の量として定義される。（ＵＧＳＴ／ｍＬでの）容積活性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、（ＵＧＳＴ／ＯＤ６００ユニットでの）特定の活性と（ＯＤ６００での）細胞密度との積である。エンドトキシンは、市販のアッセイキット（ＬＡＬ ＱＣＬ−１０００，Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いてアッセイし、容積エンドトキシン濃度（ＥＵ／ｍＬ）は、（ＥＵ／ｍｇでの）特定のエンドトキシン濃度と（ｍｇ／ｍＬでの）タンパク質濃度との積である。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、４％ポリアクリルアミド濃縮ゲルによって濃縮し、１２．５％ポリアクリルアミド分離ゲルを用いて、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＩＩ電気泳動セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で実施した。細胞抽出物のタンパク質試料（０．１２ＯＤ６００ユニットの可溶性および不溶性画分の両方）と、適切な量の精製した産物をロードした。電気泳動を、約４５分間、２００Ｖの一定の電圧で実施した。ゲルをクマシーブルーまたは硝酸銀で染色し、乾燥させ、スキャンして、処理試料からのエンドトキシンの除去を確認した。精製したタンパク質を、−２０℃または−８０℃のいずれかで、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．５）中で凍結し、保存した。
実施例２
可溶性ＣＤ８３は、自己免疫疾患のマウスモデルにおいて、広範囲の免疫抑制を誘導しない
実験的自己免疫疾患脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）が、罹患した組織の高密度自己攻撃性ＣＤ４＋リンパ球浸潤を含む、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）と、病理学的特徴を共有する疾患である、多発性硬化症の動物モデルとしての役割を果たす。可溶性ＣＤ８３は、ＥＡＥの誘導の結果生じる麻痺を軽減可能であることが報告された（たとえば、Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１を参照のこと）。本発明者らは、このマウス疾患モデルに関して、ＣＤ８３によって誘導される免疫抑制が、特異的であるかどうか、または広範囲の免疫抑制であるかどうかを決定することを希望した。
【０１２１】
ＥＡＥを誘導するために、マウスを、中枢神経系のミエリン鞘周辺ニューロンの構成物である、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）に由来するペプチド、および百日咳毒素で免疫した（たとえば、Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１を参照のこと）。１０日後に開始して、マウスに、１０日間毎日、可溶性ＣＤ８３（１００μｇ）を接種した。可溶性ＣＤ８３の最後の注射から２８日後に、マウスに、キーホールリンペットヘモシアニン（「ＫＬＨ」、１０μｇ／マウス）を皮下注射した。１０日後、脾臓細胞をマウスより採取し、異なる用量のＫＬＨで再刺激した。本刺激に応答したリンパ球増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。（図１に示した）結果は、これらのマウスからのリンパ球が、ＫＬＨに応答して増殖することを明らかにしており、動物が免疫コンピテントであること、および可溶性ＣＤ８３が、長期間続く広範囲の免疫抑制を誘導しなかったことを示す。
実施例３
ＣＤ８３の有効性の時間枠の終点の特性化
被験体が投与した別の抗原に対して寛容化しうる、ＣＤ８３の投与後の時間間隔を決定するために、マウスを評価した。可溶性ＣＤ８３（１００μｇ）を、２日ごとに１０回、注射によってＣＢＡマウスに投与した。１１日後、処理した動物を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、１０μｇ）で免疫した。１０日後、脾臓細胞を採取し、再刺激アッセイを、その内容が参照によって組み込まれている、ＷＯ２００４／０４６１８２に記載のように実施した。（図２に示した）結果によって、この免疫付与間隔で、被験体は抗原に対して寛容化されないことが明らかにされた。
【０１２２】
別の同様の実験を、脾臓細胞を処置した動物から２２日後に採取し、再刺激アッセイによって評価して実施した。これらの結果は、先に記載したものと同様であり、図３に示す。
実施例４
マウス骨髄前駆細胞からの、寛容誘導性ＤＣの産生
Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびＢＡＬＢ／Ｃマウス（オスまたはメス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｇａ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１〜４月齢で使用した。骨髄由来樹状細胞（「ＢＭ−ＤＣ」）の産生を、Ｌｕｔｚら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２３：７７に記載のとおりに実施した。ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ ＭＥ（Ｓｉｇｍａ）、および１０％熱不活性化濾過ＦＣＳ（ＰＡＡ，Ｃｏｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。ＧＭ−ＣＳＦを、２００Ｕ／ｍｌ（ＰｒｅｐｏＴｅｃｈ／Ｔｅｂｕ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）で、インキュベーション期間の第０、３、６および８日に使用した。
【０１２３】
同種異系ＭＬＲアッセイを以下のように実施した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの鼠径部リンパ節および間葉性リンパ節から単離し、ＢＭ−ＤＣのための調製プロトコルの第９日まで処理した（異なる割合の）ＢＭ−ＤＣと一緒に３日間、同時培養した（２×１０５細胞／ウェル）。培養液は９６−ウェル培養ディッシュ中であり、培地は、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌ ＭＥ、および１０％熱不活性化濾過ＦＣＳを添加した、２００マイクロリットル ＲＰＭＩ １６４０であった。細胞を［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で１６時間パルスした。培養液上清を、Ｉｎｏｔｅｃｈ １Ｈ−１１０回収器（Ｉｎｏｔｅｃｈ，Ｄｏｔｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてガラスファイバーフィルター上に回収し、フィルターを、Ｗａｌｌａｃ １４５０マイクロプレート計数機（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ）中で計数した。
【０１２４】
同種異系ＭＬＲアッセイの結果によって、マウス免疫刺激性樹状細胞およびマウスＴ細胞間のクラスターの形成が、可溶性ＣＤ８３（ここでは、ｈＣＤ８３ｅｘｔ）によって阻害されたことが示された。さらに、可溶性ＣＤ８３は、濃度依存的に、マウスの免疫刺激性樹状細胞の、Ｔ細胞を刺激する能力を阻害し、Ｔ細胞は、ＤＣへの暴露に応答して増殖しなかった。
実施例５
ｓＣＤ８３は、Ｂ細胞増殖と機能をエクスビボで抑制する
ｓＣＤ８３のＢ細胞に対する効果を、以下のように、一連の実験において測定した。
【０１２５】
移植レシピエントＢ細胞の増殖に対する、エクスビボでのｓＣＤ８３の効果：Ｃ３Ｈマウスの心臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内へ移植した。移植の８日後（未処理マウスにおいて、移植片が典型的に拒絶されうる時）に、マウスを屠殺した。Ｂ細胞をレシピエントマウスから精製し、培養し、ＬＰＳで刺激した。３Ｈ−チミジン取り込みを、計数／分（ｃｐｍ）として測定した。結果を図４に示しており、ｓＣＤ８３が、エクスビボＢ細胞増殖を抑制することが明らかにされている。
【０１２６】
Ｂ細胞によるエクスビボ抗体産生に対するｓＣＤ８３の効果：Ｃ３Ｈマウスの心臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に移植した。移植の８日後（未処理マウスにおいて、移植片が典型的に拒絶されうる時）に、マウスを屠殺した。Ｂ細胞をレシピエントマウスから精製し、培養し、ＬＰＳで刺激した。培養の７２時間後、上清を回収し、ＩｇＭおよびＩｇＧの産生を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を図５に示しており、ｓＣＤ８３が、エクスビボ抗体産生を抑制することが明らかにされている。
実施例６
シクロスポリン、タクロリムス、またはＭＭＦと同時投与したｓＣＤ８３は、同種移植片移植レシピエントにおける心臓移植片の生着を増加させる
心臓を、示したようにドナーマウスから採取し、レシピエントマウスの腹腔内に移植した（すなわち、腹腔内、異所性心臓移植）。いくつかの処理を移植の前に開始して、レシピエントマウスを示したように処理した。移植組織の平均生着期間を、各処理に関して測定した。
【０１２７】
Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスおよびＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスを使用した。各処理群に対する、移植組織の処理および生着は、表１に示したとおりである。この一連の実験において、ｓＣＤ８３での処理を、「−１日目」（すなわち移植の日の前日）〜７日目まで、１００μｇのｓＣＤ８３の毎日の腹腔内注射で開始し、ついで２８日目まで、２日ごと注射を続けた。本出願において、「−１日目」は、「０日目」と呼ばれる移植の前日を一般に意味する。シクロスポリンでの処理は、治療量未満の用量（５ｍｇ／ｋｇ／日）、または高用量（１５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで、毎日の皮下注射によってであった。タクロリムスでの処理は、８ｍｇ／ｋｇ／日の治療量未満の用量の、毎日の経口投与によってであり、ＭＭＦでの処理は、８０ｍｇ／ｋｇ／日の低用量の毎日の経口投与によってであった。その結果によって、シクロスポリン、タクロリムス、またはＭＭＦと同時投与したｓＣＤ８３が、同種移植片移植レシピエントにおける心臓移植片の生着を増加させたことが明らかにされる。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
さらなる実験において、移植レシピエントを、より短い投与コース、および異なる投与経路で処理した。マウスを、一般に上述したように処理し、心臓をＣ５７ＢＬ／６ドナーマウスから採取し、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの腹腔内に移植した。１００μｇ／マウス／日の用量での可溶性ＣＤ８３と、１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのシクロスポリンを、−１日目〜７日目に、レシピエントマウスに静脈内に投与した。移植組織の平均生着期間は、１００日を超えた。
実施例７
ｓＣＤ８３は、移植レシピエントにおいて、アロ抗体誘導を阻害する
組織非適合個体間の組織の移植は、移植拒絶を刺激する。拒絶過程には、免疫応答の細胞性の応答および体液性の応答の両方が含まれうる。移植された器官の急性拒絶は、ドナー特異的アロ抗原（すなわち外来組織適合抗原）に対して指向される抗体応答によって媒介されうる。あるいは、アロ抗体応答は、細胞媒介性応答によって促進されたドナー組織破壊の結果として誘導されうる。いずれの場合でも、レシピエントにおけるアロ抗体応答の存在は、典型的にはドナー由来脾臓細胞を染色することによって、ドナー由来細胞に結合可能なレシピエント血清中の抗体の力価を測定することによって検出可能である。ｓＣＤ８３が、移植実験において、移植片の生着期間を増加させたので、本発明者らは、ｓＣＤ８３が、移植レシピエントにおけるアロ抗体の誘導に影響を与えたかどうかを決定することを希望した。
【０１３０】
これらの実験において、血清を（対照処理個体、ｓＣＤ８３処理個体および無処理個体からの）移植レシピエントから回収した。脾臓細胞を、移植ドナー（単数または複数）から採取し、移植レシピエント血清とともにインキュベートした。アロ抗血清からの抗体の、移植ドナー脾臓細胞の表面への結合を、マウスＩｇＭおよびＩｇＧのＦｃ断片に対して特異的な抗体を用いて選択的にモニタした。本手順の利点は、Ｉｇが細胞外供給源（すなわちレシピエント血清）に由来する場合にのみＦｃ断片とアクセス可能であるので、ドナー細胞（たとえば、ドナー脾臓細胞集団内のＢ細胞）から受動的に発現したマウス抗体を測定しないことであり、ドナーＢ細胞の表面上のドナー由来ＩｇのＦｃ断片などが、Ｆｃレセプター内に組み込まれ、または細胞内に維持され、したがって、染色のために使用不可能である。染色細胞は、ＦＡＣＳを用いて解析可能である。
【０１３１】
移植手順において、心臓をＣ３Ｈマウスから採取し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス内に移植し、ついでこれをｓＣＤ８３で処理するか、または未処理のままにした。血清をＣ５７ＢＬ／６移植レシピエントから、移植の８日後（未処理マウスが移植を典型的に拒絶しうる（すなわち完全組織拒絶を示す）おおよその時間）に回収した。このレシピエント血清をついで、Ｃ３Ｈドナーからの脾臓細胞を染色するために使用し、アロ抗体結合を、抗ＩｇＧ Ｆｃ断片または抗ＩｇＭ Ｆｃ断片のいずれかに特異的なＦＩＴＣ共役抗体で検出した。その結果によって、ｓＣＤ８３で処置した移植レシピエントが、ナイーブマウス（すなわち移植を受けていないマウス）からの血清中のレベルと等価であった、低アロ抗体活性（すなわちＩｇＭまたはＩｇＧの低いドナー特異的結合）を持ったことが示された（図６を参照のこと）。Ｃ３Ｈ心臓移植を受け、そしてｓＣＤ８３で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスは、低いアロ抗体活性を持ち、これは、非移植ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに由来した血清と等価である。反対に、未処理であり、移植組織を拒絶した移植レシピエントは、対照におけるよりも有意に高いレベルで存在する検出可能なアロ抗体を有していた。未処理移植レシピエントからの血清はまた、対照のレベルを上回るＣ３Ｈ−ドナー由来脾臓細胞を染色可能であった。これらの実験によって、ｓＣＤ８３が、外来抗原（たとえば移植組織）に対するＢ細胞によるドナー特異的抗体産生を抑制し、器官拒絶を予防可能であることが明らかにされる。
実施例８
シロリムスおよびＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂと同時投与したｓＣＤ８３は、同種移植片移植レシピエントにおける、長期の心臓移植片の生着率を達成する
心臓を、示したようにドナーマウスから採取し、レシピエントマウスの腹腔内に移植した（すなわち異所性移植）。レシピエントマウスを示したように処理し、いくつかの処理を移植の前に開始した。同種移植片の生着をモニタし、以下のようにスコア化した。「Ａ」強く鼓動。「Ｂ」脈動の強度の穏やかな減少、「Ｃ」脈動の強度の顕著な減少、「Ｄ」心拍動の完全な停止。移植組織の平均生着期間を、各処理に関して測定した。
【０１３２】
最初の一連の実験において、Ｃ３ＨドナーマウスとＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスを使用した。各処理群に対する移植組織の処理および生着は、表２に示したとおりである。この一連の実験において、ｓＣＤ８３処理を−１日目（すなわち、移植の前日）に開始し、２８日目まで続け、各日、１００μｇのｓＣＤ８３を各マウスに、腹腔内注射によって投与した。シロリムス処理は０日目（すなわち移植の日）に開始し、１４日目まで続け、各日に、２ｍｇ／ｋｇのシロリムスを経口で各マウスに投与した。抗ＣＤ４５ＲＢ処理は０日目に開始し、１４日目まで続け、各日に、１００μｇの抗ＣＤ４５ＲＢ（ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を各マウスに静脈内投与した。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
さらなる一連の実験において、Ｃ３Ｈマウス心臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に移植した（結果を表３および図７に示している）。処理なしで、心臓移植片が、脈管炎、出血、血栓症およびＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞の浸潤によって特徴づけられる、急性細胞性および体液性拒絶によって、８．５±０．６日以内に拒絶された。高レベルのＩｇＧおよびＩｇＭも、移植組織内、ならびにレシピエントの血中で検出された。ｓＣＤ８３のみでの処理（すなわち、１日目〜７日目に毎日、ついで８日目〜１６日目に２日ごと（ｑ．ｏ．ｄ．）、マウスあたり１００μｇのｓＣＤ８３の腹腔内注射）が、急性拒絶の症状を減少させ、１０．７±１．５日まで、心臓移植片の生着を増加させ、４００μｇのｓＣＤ８３での同じ処理は、１５±１．０日まで、心臓移植片の生着を２倍にした。他の処理には、治療量未満の、抗ＣＤ４５ＲＢモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）（すなわち、１００μｇ／マウスの０日目〜１４日目の毎日の静脈内注射）、またはシロリムス（すなわち、２ｍｇ／ｋｇの０日目〜１４日目の毎日の経口投与（「ｐ．ｏ．」）」）が含まれた。これらの実験における治療量未満の用量は、相当するヒト用量に基づいた。
【０１３５】
思いがけなく、注射あたり１００μｇのより少ない用量でのｓＣＤ８３が、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂまたはシロリムスいずれかのこれらの治療量未満の用量と相乗的な効果を示し、ｓＣＤ８３との併用処理はさらに、それぞれ、３２±３．６日、および３９．３±４．７日まで、移植片生着を改善した。抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとシロリムスとの併用処理は、５０．３±３．１日まで生着を増加させた。注目すべきことに、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂおよびシロリムスの両方との併用でのｓＣＤ８３が、急性拒絶を効果的に予防し、１００日を超える無期限の生着によって、移植片耐性を誘導した（ｐ＜０．０１ 対抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂおよびシロリムスの併用処理）。ｓＣＤ８３、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂ、およびシロリムスの併用で処理した（すなわち「三重処理」）マウスからの移植心臓を、手術後１００日目（「ＰＯＤ１００」）に試験し、血管障害なしで、正常の組織構造を示した。この実験によって、シロリムスと抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡＢとのｓＣＤ８３の同時投与を含む処理が、移植心臓組織の長期間の許容を誘導したことが明らかにされた。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
本発明は、操作の任意の特定の機構によって縛られない一方で、一般に、Ｃ３Ｈ組織のＢＡＬＢ／ｃマウスへの移植が、抗体媒介性拒絶のためのモデル系として考えられ、一方Ｃ３Ｈ組織のＣ５７ＢＬ／６マウスへの移植が、Ｔ細胞媒介性拒絶のためのモデル系として考えられる。ｓＣＤ８３のみでの処理、および他の物質と同時投与したｓＣＤ８３は、両方の系で移植片生着を改善し、これは、ｓＣＤ８３が、Ｂ細胞によって媒介される望ましくない免疫応答、ならびに、Ｔ細胞によって媒介されるものを抑制可能であることを明らかにする。言い換えれば、ｓＣＤ８３は、Ｃ３Ｈ対ＢＡＬＢ／ｃマウス心臓移植モデルにおける体液性移植片拒絶を抑制可能であり、そして、Ｃ３Ｈ対Ｃ５７ＢＬ／６マウス心臓移植モデルにおける急性細胞性移植片拒絶を抑制可能である。
【０１３８】
ｓＣＤ８３、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂ、およびシロリムスの三重処理を受けたレシピエントマウスをまた、寛容誘導性ＤＣ（すなわちＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｌｏｗＣＤ４０ｌｏｗＣＤ８６ｌｏｗＩＬ１２−細胞）、および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）の産生における、処理の効果を測定するために試験した。寛容誘導性ＤＣと制御性Ｔ細胞両方の量の増加が、手術後１００日目において試験したときに、これらのマウスで見られた（図８、図９および図１０に示したフローサイトメトリーの結果を参照のこと）。ＣＸＣＲ６マーカーが、未熟ＤＣの特徴であり、一方で、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ７マーカーが成熟ＤＣの特徴である。図９および図１０におけるアスタリスクは、ｐ＜０．０１で異なった結果を示している。したがって、これらの結果によって、ｓＣＤ８３に基づく治療が、寛容誘導性ＤＣおよび制御性Ｔ細胞の両方の産生を誘導したことが明らかになる。
実施例９
ｓＣＤ８３は、インビトロでのＴＮＦ−α産生と、ｍＤＣ活性化マーカーの表面発現を抑制する
本発明者らは、末梢血ＤＣ、単球およびＴ細胞に対するヒトｓＣＤ８３のインビトロでの機能的特性を試験することを希望した。カニクイザルからの成熟ＤＣ（「ｍＤＣ」）を、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、系列陰性（すなわちＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ１４およびＣＤ１６陰性）、およびＣＤ１１ｃ陽性であった細胞として、４色で染色するＦＡＣＳを用いて同定した。細胞内ＴＮＦ−α、ＩＬ−６および表面マーカーＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＣＲ５（活性化成熟ＤＣにおいて増加する）もモニタした。
【０１３９】
ｓＣＤ８３のｍＤＣに対する効果を評価するために、カニクイザルからの単離ＰＢＭＣ（１×１０６細胞）をｓＣＤ８３とともに一晩インキュベートした。細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で６時間刺激した。細胞内ＴＮＦ−αレベルおよび表面マーカーを、ＦＡＣＳを用いてｍＤＣ中で検出した。３つの実験のうちの１つの代表的な結果を、図１１に示しており、結果を、％陽性細胞と平均蛍光ユニット（ＭＦＵ）として表した。この結果によって、ｓＣＤ８３が、ｍＤＣによる、ＴＮＦ−αのインビトロ産生を抑制し、またｍＤＣ活性化マーカーＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＣＲ５およびＣＤ８０の表面発現を抑制したことが示される。
【０１４０】
単球におけるｓＣＤ８３の効果を評価するために、カニクイザルからの単離ＰＢＭＣ（１×１０６細胞）を一晩、ｓＣＤ８３（１×１０６細胞）とともにインキュベートした。細胞内ＴＮＦ−αレベルおよび表面マーカーを、ＦＡＣＳを用いて単球中で検出した。３つの実験のうちの１つの代表的な結果を、図１２に示しており、結果を、％陽性細胞と平均蛍光ユニット（ＭＦＵ）として表した。この結果によって、ｓＣＤ８３が、単球によるＴＮＦ−αのインビトロ産生を穏やかに抑制し、また単球活性化マーカーの表面発現を抑制したことが示される。
【０１４１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＤ８３の効果を評価するために、これらの細胞を、カニクイザルから精製し、ついで、ｓＣＤ８３または抗ＣＤ２８ ｍＡｂの存在下または非存在下で、６日間刺激した。ついで細胞を染色して、制御性Ｔ細胞（すなわちＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）を同定し、ＦＡＣＳによって解析した。（図１３に示した）結果によって、ｓＣＤ８３が制御性Ｔ細胞の産生を促進することが示唆される。
【０１４２】
制御性Ｔ細胞をまた、以下のようにカニクイザルから調製した樹状細胞を用いて調製した。カニクイザル骨髄樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下、７日間、ＣＤ１４＋単球細胞から産生し、５０ｕｇ／ｍｌでの可溶性ＣＤ８３を、３日目〜７日目に、いくつかの培養液に加え、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ−２の成熟化カクテルを５日目〜７日目に加えた。Ｔ細胞（１×１０６／ｍｌ）を、ネガティブ選択によって単離し、異なる比で、ｓＣＤ８３（５０μｇ／ｍｌ）で処理した、または処理していない同種成熟樹状細胞で刺激した。ついで細胞を染色して、制御性Ｔ細胞（すなわちＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）を同定し、ＦＡＣＳによって解析した。（図１４に示した）結果によって、増加した制御性Ｔ細胞が、特に試験した高いＤＣ：Ｔ比で、可溶性ＣＤ８３で処理した樹状細胞によって産生されたことが示される。
実施例１０
インビトロでのＢ細胞増殖および機能のｓＣＤ８３抑制
インビトロでのＢ細胞増殖におけるｓＣＤ８３の効果の評価：Ｃ５７ＢＬ／６Ｂ細胞を、ｓＣＤ８３の存在下または非存在下で、ＬＰＳで刺激する。培養の４８時間後、３Ｈ−チミジン取り込みを、カウント／分（ｃｐｍ）として測定する。結果を、ｓＣＤ８３が、インビトロでのＢ細胞増殖を抑制するかどうかを決定するために評価する。
【０１４３】
Ｂ細胞によるＩｇＭおよびＩｇＧ産生におけるｓＣＤ８３の効果の評価：Ｃ５７ＢＬ／６Ｂ細胞を、ｓＣＤ８３の存在下または非存在下で、ＬＰＳで刺激する。培養の７２時間後、上清を回収し、ＩｇＭまたはＩｇＧ産生を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を、ｓＣＤ８３が、インビトロでのＢ細胞抗体産生を抑制するかどうかを決定するために評価する。
実施例１１
寛容誘導性樹状細胞の産生と、樹状細胞機能の評価
寛容誘導性樹状細胞は、以下のように産生可能である。グルタミン（２００μｇ／ｍｌ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および（５６℃にて３０分間インキュベートすることによって予め熱不活性化した）単一ドナーからの１％ ヒト血漿を添加した１％ ヒト血漿を含む標準培地（たとえばＲＰＭＩ１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて細胞を培養可能である。ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の沈殿によって軟膜から単離し、ＩｇＧ（コーン画分からの１０μｇ／ｍｌ γ−グロブリン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコートした１００ｍｍ培養ディッシュ上に播種し、５％ＣＯ２中３７℃においてインキュベート可能である。１時間および７時間のインキュベーション後、非接着細胞画分を除去し、接着細胞をさらに、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を含む１％ヒト血漿培地中でさらに培養する。インキュベーション期間の３日目に、（４００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む）新鮮な培地を加える。第４日または第５日に、非接着細胞を回収し、計数し、０．３〜０．５×１０５細胞／ｍｌの密度で、新しいディッシュ内に移した。最終成熟化工程のために、１％ヒト血漿培地に、ＴＮＦ−α（１．２５ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（４０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）、プロスタグランジンＥ２（０．５ｐｇ／ｍｌ、たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）を加える。あるいは、最終成熟化工程のために、成熟化カクテルには、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）が含まれる。８日目に、細胞をＦＡＣＳによって解析可能である。本方法によって成熟させた細胞によって、正常に成熟させたＤＣ（たとえばＷＯ２００４／０４６１８２）と比較した場合に、ＣＤ８０の細胞表面発現の明らかな減少（たとえば９６％から６６％）、およびＣＤ８３の細胞表面発現の明らかな減少（たとえば９６％から３０％）ならびに、ＣＤ１４陽性細胞の増加が明らかになる。他の細胞表面マーカー（たとえば、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ）の発現は、有意に影響を受け得ない。他の実施形態において、細胞を、先に記載したようなプロトコルにしたがって成熟化するが、可溶性ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）を、１、２、３またはそれ以上の日数後（別々に、または一緒に、先に記載したように）、成熟化カクテルに加えることができる。
【０１４４】
樹状細胞を、以下のように、同種異系混合リンパ球反応（「ＭＬＲ」）アッセイを用いて評価してよい。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、軟膜から単離する。簡単に記すと、回収した非接着細胞画分を、ニューロアミダーゼ処理したヒツジ赤血球とともにインキュベートし、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心によって回収し、単一のＡＢドナーからの５％ヒト血清を含むＲＰＭＩ中で培養する。ついで細胞を、様々な比の成熟同種異系免疫刺激性ＤＣで刺激する。細胞を、様々な濃度の可溶性ＣＤ８３（ＷＯ２００４／０４６１８２に記載されたような「ｈＣＤ８３ｅｘｔ」）と、または対照としてＢＳＡ（ＢｉｏＲａｄ）とともにインキュベートするか、または処理しない。Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル）およびＤＣを、９６−ウェル細胞培養ディッシュ中、単一のＡＢドナーからの５％ヒト血清を添加したＲＰＭＩ中で、４日間同時培養する。細胞に、［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で１６時間パルスする。培養上清を、ＩＨ−１１０ハーベスター（Ｉｎｏｔｅｃｈ．Ｄｏｔｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてガラス繊維フィルター上に回収し、フィルターを、Ｗａｌｌａｃ １４５０マイクロプレートカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ）中で計数する。
実施例１２
種々の刺激に対する応答での、ＣＤ８３有効性の時間枠の終点の決定
マウスを、ＣＤ８３とＫＬＨの投与間の種々の間隔（すなわち１０日間、８日間、６日間、４日間、２日間、１日間）後のそれらの免疫応答に関して、本質的に実施例３に記載したように評価する。間隔は、ＫＬＨを用いる再刺激が、免疫応答を誘発しない間と定義し、この間隔は、本実験での感応性の時間枠の末端を記録する。
【０１４５】
被験体を、本質的に先に記載したように評価したが、他の免疫刺激を試験する。これらのプロトコルは、ＫＬＨ抗原に対する第三者の皮膚移植片を代用する。他のプロトコルは、ＣＤ８３での処理の間、および後（ＣＤ８３処理の前日、ＣＤ８３処理の次の日、ＣＤ８３処理の３日後）のリーシュマニア感染を代わりに用いる。他のプロトコルは、ＣＤ８３の投与の間、および後のＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）での感染を代わりに用いる。
実施例１３
ＣＤ８３に応答したメモリーＴ細胞再活性化の評価
マウスにＬＣＭＶを感染させ、２８日後にＣＤ８３を注射する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＦＮγおよびＩＬ−２を産生するが、標的細胞を殺さない、ＬＣＭＶ−特異的メモリーＴ細胞の存在に関して評価する。
実施例１４
制御性Ｔ細胞に対するＣＤ８３の効果の評価
抗原特異的Ｔ細胞を、インビトロで産生し、可溶性ＣＤ８３の存在下または非存在下で、樹状細胞に暴露する。ついで、Ｔ細胞について増殖（ＣＦＳＥ）、アポトーシス（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）、サイトカイン産生（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）、およびＦｏｘｐ３の存在をアッセイすることによって、ＣＤ８３の効果を評価する。適切なアッセイが当該技術分野で既知である。
【０１４６】
哺乳動物より、インビトロで培養および／またはアッセイ可能であるように、Ｔ細胞を単離する。ＰＢＭＣを、確立された手順にしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心を用いて、赤血球細胞および好中球から分離する。細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、改変ＡＩＭ−Ｖ（２ｍＭグルタミン、１０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＡＩＭ−Ｖ（ＧＩＢＣＯ）からなる）で洗浄する。Ｔ細胞を、標準的な手順にしたがって、カラムまたは磁気ビーズに結合した適切なモノクローナル抗体での、ネガティブまたはポジティブ選択によって濃縮する。細胞の分液を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ１４の発現を含む細胞表面発現系に関して解析する。
【０１４７】
場合によっては、細胞を洗浄し、上記のように改変した５％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌ組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）を含むＡＩＭ−Ｖ（添加ＡＩＭ−Ｖ）へ濃度あたり約５×１０５細胞で再懸濁する。Ｔ細胞をついで、ｓＣＤ８３の存在下または非存在下で、免疫刺激性および寛容誘導性樹状細胞に暴露可能である。
【０１４８】
増殖を刺激するために、ＯＫＴ３モノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで加えることができる。細胞を、２４ウェルプレート（０．５ｍｌの細胞懸濁液／ウェル）中にプレートし、５％ＣＯ２の湿潤インキュベーター中、約３７℃の温度で培養する。ＯＫＴ３抗体のような反応性組成物に応答したＴ細胞の増殖を、たとえば３Ｈ−チミジン取り込みを測定することによって定量的にモニタ可能である（たとえば、Ｃａｒｕｓｏら（１９９７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２７：７１を参照のこと）。
【０１４９】
樹状細胞に対する暴露の間および後の、Ｔ細胞によって分泌されたサイトカインの型および量の解析は、機能的活性の指標でありうる。サイトカインを、サイトカイン産生の速度と総量を測定するために、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定可能である。たとえば、Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：１８１、ＴａｎｑｕａｙおよびＫｉｌｌｉｏｎ（１９９４）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１３：２５９、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９を参照のこと。
実施例１５
ＣＤ８３で産生された制御性Ｔ細胞を用いる、免疫の養子伝達の評価
マウスを、１０μｇのＫＬＨで免疫する。ＣＤ８３（１００μｇ）を、ＫＬＨ免疫付与の前日、翌日、そして３日後に投与する。ＫＬＨ免疫付与の１０日後、脾臓細胞をこれらの動物から調製し、ナイーブマウスに移してその後ＫＬＨで免疫し、抗原に対する免疫応答に関してアッセイする。
実施例１６
寛容誘導性ＤＣを用いる、耐性の養子伝達
可溶性ＣＤ８３を含む成熟化工程で調製した寛容誘導性ＤＣを、実施例４に記載したように調製する。未熟ＤＣに、対象とする抗原、または対象とする抗原をコードする核酸を取り込ませる。これらのＤＣを被験体内に移し、抗原に対する被験体の免疫応答を評価する。
実施例１７
可溶性ＣＤ８３と移植器官の同時投与
腎臓移植を、非近交系、若年性カニクイザルにおいて実施し、各サルに、別のサルから採取した腎臓を与える。移植手順の間、レシピエントのサルに、３〜６ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、可溶性ＣＤ８３を、静脈内または腹腔内に注射する。投与は、毎日１回〜毎日４回の、２８日間である。対照のサルには、移植器官を与えるが、可溶性ＣＤ８３は与えない。移植手順の後、サルを、移植器官の生着と血液供給に関してモニタする。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年５月３日に出願された米国特許仮出願第６０／９２７，３７７号、および２００６年８月１８日に出願された米国特許仮出願第６０／８３８，８１２号（両方の内容は参照によって明確に本明細書に組み込まれている）の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、望ましくない免疫応答を抑制または予防するために、被験体を治療する改善された方法に関する。本方法にはＣＤ８３の使用が含まれ、被験体を治療用組成物に対して寛容化する。たとえば、本方法は、移植組織の拒絶を予防するために使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳動物の免疫系は、非常に多数の外来抗原に対する防御反応を開始することが可能である。不運なことに、この応答性が、たとえば移植組織、遺伝子治療ベクター、および特定の疾患および疾病の治療のために使用される化合物（とりわけタンパク質）を含む、治療上の使用を意図した化合物へ向けられた場合、まさにこの応答性が困難を引き起こす可能性がある。たとえば、Ｂ型血友病に苦しんでいる患者は、治療用第ＩＸ因子に対して、ならびにこれらの患者において、第ＩＸ因子を発現するために使用される遺伝子移入ベクターに対して免疫応答を生ずる可能性がある（たとえば、Ｄｏｂｒｙｚｙｎｓｋｉら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４５９２−４５９７を参照のこと）。同様に、治療用抗体（たとえばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標））で治療した患者は、これらの治療用抗体に対する免疫応答を生ずる可能性があり、これらの治療用抗体の効果をなくし、さらなるリスクを患者に対して引き起こす。
【０００３】
不運なことに、望ましくない免疫応答を予防する、または除去するための現在の治療は、典型的に、免疫応答の全体的な抑制を引き起こす化合物の使用を伴う（たとえば、Ｊａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の第１４章を参照のこと）。これらの治療は、患者に将来の感染に対するリスクを与え（たとえばＧｏｔｔｓｃｈａｌｋら（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５６：２９−４４を参照のこと）、一般に望ましくない、重度の副作用を持つ。異なる治療を組み合わせたいくつかの研究によって、いくつかの組合せが実際に毒性を悪化させることが示された（たとえば、Ａｎｄｏｈら，（１９９６）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６２：３１１−３１６を参照のこと）。現在使用可能な治療は、長時間、場合によっては（たとえば組織移植の場合）患者の人生の残り時間にわたる治療もまた必要とする可能性がある。
【０００４】
また、たとえば、接触皮膚炎、慢性喘息、薬物アレルギー、および全身性アナフィラキシーのような、アレルギー性反応および過敏反応を治療することにおいて、集中的で、時間制限を設けた免疫系の抑制が望ましい多くの他の例が存在する（たとえばＪａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）の第１２章を参照のこと）。一般に、これらの応答を抑制するための臨床治療はまた、広範囲に効果を持つ（Ｊａｎｅｗａｙら，上記を参照のこと）。別の例が、Ｂ細胞媒介性応答に関して見られる。Ｂ細胞は、抗体が媒介する移植片拒絶の主要なメディエーターであり、また抗原提示細胞としても機能する。しかしながら、望ましくないＢ細胞媒介性応答の副作用を予防するための現在の療法は、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いる枯渇に限定されており、Ｂ細胞活性化および／または分化を予防するための効果的な療法は存在しない。望まれない免疫応答のために現在使用されている他の治療は、特定の阻害剤を使用して、マスト細胞によって産生される炎症性メディエーターの合成および効果を遮断する。脱感作を誘導するために設計されたいくつかの治療は、特定の抗原（単数または複数）の注入を伴い、これらの治療は、ＴＨ２型応答からＴＨ１型応答へアレルゲンに対する免疫応答を変更し、それによってＩｇＧがＩｇＥのかわりに産生されると考えられる。これらの治療は多くの症例で成功してきたが、すべての症例で成功したわけではない。
【０００５】
細胞リンパ球溶解、遅延型過敏症（ＤＴＨ）、移植拒絶および同種移植片拒絶を含む、多くの型の免疫が、Ｔ細胞によって媒介される（たとえば、Ｐａｕｌ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（３ｒｄ ｅｄ．）を参照のこと）。Ｔ細胞の挙動は、樹状細胞（「ＤＣ」）によって影響を受けるが、これらは免疫系の専門的抗原提示細胞であり、Ｔ細胞応答を劇的に刺激可能である（本明細書で場合により「免疫刺激性樹状細胞（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）」とも呼ぶ；たとえばＢａｎｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔ編（１９９５）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｓｃｈｕｌｅｒら（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７；米国特許出願第１０／２８７，８１３号を参照のこと）。
【０００６】
状況によっては、樹状細胞はまた、免疫寛容において重要な役割を果たす。これに関連して、これらはしばしば「寛容誘導性樹状細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」と呼ばれる（たとえば、Ｓｔｅｉｎｍａｎら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１；Ｋｕｂａｃｈら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：１９７−２０３を参照のこと）。不運なことに、樹状細胞は末梢血で非常に稀であり、したがって、特定の適用は、治療量の寛容誘導性樹状細胞を産生するためにエクスビボの方法を必要としうる。免疫刺激性ＤＣを作製するための方法が記述されている（たとえば米国特許第６，２７４，３７８号を参照のこと）が、これらのＤＣは寛容誘導性ではない。「制御性Ｔ細胞」を含む別の型の細胞もまた、寛容誘導性において役割を果たすことが示された（たとえばＢｏｅｈｍｅｒ（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３３８−３４４を参照のこと）。齧歯類での研究によって、自己応答性Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能の両方を積極的かつ優位に防止する、専門的な制御性（または「サプレッサー」）Ｔ細胞の固有のＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団が示された（Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−１１６４；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９６９−１９８０；Ｉｔｏｈら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６）。これらの制御性Ｔ細胞の除去または不活性化が、結果として、重度の自己免疫疾患となり、またアロ抗原および腫瘍に対する免疫応答を増強することが示された（たとえばＳｈｉｍｉｚｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５２１１−５２１８も参照のこと）。最近の研究によって、ヒトにおいて制御性Ｔ細胞が同定された（米国特許出願第１０／６６１，８０４号）。制御特性を持つが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞ではないヒトＴ細胞の調製も報告された（米国特許出願第１０／６１８，１３４号を参照のこと）。
【０００７】
ＣＤ８３は、免疫グロブリン（「Ｉｇ」）スーパーファミリーのタンパク質からの分子である（たとえば、Ｚｈｏｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２を参照のこと；また米国特許第７，１６９，８９８号を参照のこと；概説のために、ＦｕｊｉｍｏｔｏおよびＴｅｄｄｅｒ（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｄｅｎｔ．Ｓｃｉ．５３：８６−９１を参照のこと）。ＣＤ８３の正確な機能はまだ決定されていないが、ＣＤ８３の可溶型が、未熟および成熟樹状細胞の両方に結合することが報告された（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）。筆者らはまた、このタンパク質が、インビトロにおいて成熟させた樹状細胞によって、ＣＤ８０およびＣＤ８３の発現を減少させたこと、およびＴ細胞をインビトロにおいて刺激する樹状細胞の能力を阻害したことを報告した（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：２７３−２７５も参照のこと）。別の者が、インビボでのＣＤ８３の可溶型の存在を報告した（たとえば、Ｈｏｃｋら（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：９５９−９６７を参照のこと）。ＨＳＶ−１感染ＤＣでの研究によって、ウイルス感染が、ＣＤ８３の分解とＣＤ８３ ｍＲＮＡ輸送の阻害とを導くことが示された；ＨＳＶ−１による回避についてのこの可能性のある機構は、ＣＤ８３のＤＣ生物学に対する重要性をさらに支持する（たとえばＫｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７１２７−７１３６を参照のこと）。Ｋｒｕｓｅら（２０００）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１５８１−１５８９）は、ＧＣ７（Ｎ（１）−グアニル−１，７−ジアミノヘプタン）が、ＣＤ８３ ｍＲＮＡの核細胞質間移行を干渉し、ＣＤ８３の表面発現を阻止し、これらのＤＣによるＴリンパ球の活性化を有意に阻害したことを報告した。
【０００８】
ＣＤ８３は、約４５ｋＤａの一本鎖糖タンパク質であり、ＣＤ８３の未熟型には、膜の中へのタンパク質の挿入に際して除去される、シグナルペプチドが含まれる。成熟ＣＤ８３には、３つの構造ドメイン、すなわち細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが含まれる（たとえば、細胞外ドメインを正しく同定した、ＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）。ＣＤ８３細胞外ドメインには、少なくとも２つのエキソンによってコードされており（たとえばＺｈｏｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２；ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＃Ｚ１１６９７）、ネイティブの成熟樹状細胞（「ｍＤＣ」）の細胞表面上に非常に強く発現している、単一Ｉｇ様（Ｖ型）ドメインが含まれる。
【０００９】
米国特許第５，３１６，９２０号および対応するＷＯ９３／２１３１８は、ＣＤ８３タンパク質（「ＨＢ１５」と呼ばれる）および「任意の特定のドメイン、リガンド結合断片または免疫特異的断片を含む、ＨＢ１５タンパク質またはその部分をコードするｃＤＮＡ配列」を記述している（第２欄、２３〜２５行目）。この特許はまた、「免疫学的障害、疾患または症候群を治療するための、ＨＢ１５に応答する抗体および抗ＨＢ１５抗体、または他のＨＢ１５機能に対するアンタゴニストの使用方法」の使用も議論している（要約を参照のこと）。この特許はさらに、「ＨＢ１５抗体、その免疫特異的結合断片若しくはリガンド結合断片若しくは特異的なドメイン、またはＨＢ１５機能に干渉するＨＢ１５に対する他のアンタゴニストを、免疫応答若しくは細胞相互作用の発現若しくは進行を調節若しくは阻害するため、またはＨＢ１５を発現している細胞に対して薬物、毒素若しくは造影剤を送達するために、治療上使用可能である」ことを推測している（第３欄、６〜１２行目）。
【００１０】
米国特許第５，７１０，２６２号（米国特許第５，３１６，９２０号として特許付与された出願の一部継続出願）および対応するＷＯ９５／２９２３６は、ＣＤ８３タンパク質を対象とし、ヒトタンパク質とマウスタンパク質との比較を議論している（第２欄、４６〜４８行目）。これらの特許および出願はさらに、「ヒトＨＢ１５またはＨＢ１５の哺乳動物ホモログを産生する方法」（第３欄、５〜６行目）、抗体の産生（第４欄、３５〜３７行目）、および「ＨＢ１５を発現する細胞に薬物、毒素または造影剤を送達する」ためのＨＢ１５抗体の使用（第４欄、３８〜３９行目）を対象としている。
【００１１】
ＷＯ９７／２９７８１は、「薬学的に許容可能な担体中のＣＤ８３試薬および抗原を投与し、それによってＣＤ８３が抗原特異的抗体の産生を刺激することを含む、体液性免疫応答を刺激する方法」を対象としている（１ページ）。該出願は、「好ましい実施形態において、ＣＤ８３試薬は、ＣＤ８３の細胞外ドメインを含むＣＤ８３ペプチド、およびＣＤ８３の細胞外ドメインをコードするＤＮＡである」と言及している（２ページ）。該出願はまた、哺乳動物における望ましくない抗原特異的応答を阻害するためのＣＤ８３抗体の使用を議論しており、「そのような方法は・・・自己免疫疾患、および組織または器官の移植拒絶を防止または治療するする際に、ならびにアレルギーまたは喘息の治療または予防の際に有用である」と言及している（３ページ）。
【００１２】
ＷＯ２００４／０４６１８２および対応する米国特許第７，１６９，８９８号（両方とも、そのすべてが参照によって本明細書に組み込まれている）は、ＣＤ８３の細胞外ドメインを正しく同定し、「樹状細胞、Ｔ細胞および／またはＢ細胞に関する細胞性免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または病状の治療および予防のための・・・ＣＤ８３ファミリーのタンパク質の可溶性型のメンバーの使用」を示している（ＷＯ２００４／０４６１８２、７ページ）。このＰＣＴ出願（１２ページ）は、ＣＤ８３の一形態が、未熟および成熟樹状細胞の両方において、変化した表面マーカー発現パターンを誘導したことを言及している。さらに、「本発明のＣＤ８３ファミリーのタンパク質の可溶性型のメンバーが、樹状細胞のＴ細胞および／またはＢ細胞との相互作用を崩壊させ、および／または樹状細胞−Ｔ細胞クラスターの形成を阻害することが可能である・・・」（１４ページ；またＳｅｎｅｃｈａｌら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３：４２０７−４２１５を参照のこと）。該出願はさらに、ｈＣＤ８３ｅｘｔで治療したマウスは、実験的自己免疫脳炎（「ＥＡＥ」）に関連した典型的な麻痺症を発症しなかったことを開示している（１２ページ；またＺｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１を参照のこと）。
【００１３】
以上を概観すると、本出願人らは、免疫応答の全体的な抑制を生ずることなしに、そして患者に対する他の損害を引き起こすことなしに、特定の組成物に対する免疫応答を抑制可能である安全で効果的な治療に対する必要性を認識した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／９２７，３７７号
【特許文献２】米国特許仮出願第６０／８３８，８１２号
【特許文献３】米国特許出願第１０／２８７，８１３号
【特許文献４】米国特許第６，２７４，３７８号
【特許文献５】米国特許出願第１０／６６１，８０４号
【特許文献６】米国特許出願第１０／６１８，１３４号
【特許文献７】米国特許第７，１６９，８９８号
【特許文献８】ＷＯ２００４／０４６１８２
【特許文献９】米国特許第５，３１６，９２０号
【特許文献１０】ＷＯ９３／２１３１８
【特許文献１１】米国特許第５，７１０，２６２号
【特許文献１２】ＷＯ９５／２９２３６
【特許文献１３】ＷＯ９７／２９７８１
【特許文献１４】米国特許出願第１０／３８２，３９７号
【特許文献１５】米国特許出願第１０／５３５，５２２号
【特許文献１６】米国特許第７，０１５，２０４号
【特許文献１７】米国特許第７，１６０，９８７号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄｏｂｒｙｚｙｎｓｋｉら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４５９２−４５９７
【非特許文献２】Ｊａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の第１４章
【非特許文献３】Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５６：２９−４４
【非特許文献４】Ａｎｄｏｈら，（１９９６）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６２：３１１−３１６
【非特許文献５】Ｊａｎｅｗａｙら編（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）の第１２章
【非特許文献６】Ｐａｕｌ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（３ｒｄ ｅｄ．）
【非特許文献７】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔ編（１９９５）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
【非特許文献８】Ｓｃｈｕｌｅｒら（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７
【非特許文献９】Ｓｔｅｉｎｍａｎら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１
【非特許文献１０】Ｋｕｂａｃｈら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：１９７−２０３
【非特許文献１１】Ｂｏｅｈｍｅｒ（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３３８−３４４
【非特許文献１２】Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−１１６４
【非特許文献１３】Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９６９−１９８０
【非特許文献１４】Ｉｔｏｈら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６
【非特許文献１５】Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５２１１−５２１８
【非特許文献１６】ＦｕｊｉｍｏｔｏおよびＴｅｄｄｅｒ（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｄｅｎｔ．Ｓｃｉ．５３：８６−９１
【非特許文献１７】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１
【非特許文献１８】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：２７３−２７５
【非特許文献１９】Ｈｏｃｋら（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：９５９−９６７
【非特許文献２０】Ｋｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７１２７−７１３６
【非特許文献２１】Ｋｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１５８１−１５８９
【非特許文献２２】Ｓｅｎｅｃｈａｌら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３：４２０７−４２１５
【非特許文献２３】Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１
【非特許文献２４】Ｚｈｏｕら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２
【非特許文献２５】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．）
【非特許文献２６】Ｄａｉら（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９−１７５
【非特許文献２７】ＰｒａｔおよびＡｎｔｅｌ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２２５−２３０
【非特許文献２８】Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｊｕｎｅ ２１，２０００：１−２３
【非特許文献２９】Ｈｏｃｋら（２００６）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６７：５７−６０
【非特許文献３０】Ｍａｈａｎｏｎｄａら（２００２）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．３７：１７７−１８３
【非特許文献３１】Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４
【非特許文献３２】Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．）
【非特許文献３３】Ａｎｔｏｎｙら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１０７７５−１０７８４
【非特許文献３４】Ｅｓｃｒｉｏｕら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６８：２７６−２８８
【非特許文献３５】Ｇｕｙ−Ｃａｆｆｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３１３９１−３１３９６
【非特許文献３６】Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７
【非特許文献３７】Ｂｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（２３）：５３１０−５３１７
【非特許文献３８】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｉｃｏら編（Ｗｉｌｅｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）
【非特許文献３９】Ｗａｎｇら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３８２３−３８３６
【非特許文献４０】Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２４：４４５−４５２
【非特許文献４１】Ｌｕｔｚら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２３：７７
【非特許文献４２】Ｃａｒｕｓｏら（１９９７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２７：７１
【非特許文献４３】Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：１８１
【非特許文献４４】ＴａｎｑｕａｙおよびＫｉｌｌｉｏｎ（１９９４）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１３：２５９
【非特許文献４５】Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
本発明は、ＣＤ８３の使用を含む、望ましくない免疫応答を抑制および／または予防する改善された方法に関する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３を、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とともに、被験体に同時投与する。寛容誘導性樹状細胞および制御性Ｔ細胞を産生するための方法も提供される。これらの細胞は、治療目的のためのさらなる細胞を産生するために、インビトロにおいて使用可能であり、または望ましくない免疫応答を抑制および／または予防するために、インビボにおいて使用可能である。本発明の方法は、自己免疫疾患を予防するため、またはその重症度を減少させるために使用可能であり、治療用タンパク質または移植組織のような、少なくとも１つの治療用組成物に対する寛容誘導性を誘導するためにも使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１（実施例２を参照のこと）は、Ｔ細胞増殖アッセイにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｔ細胞が由来したマウスに投与したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の濃度の関数として示す。簡単に記すと、動物をｓＣＤ８３で処理し、ついでＫＬＨを注射し、２８日後、脾臓細胞を採取して、様々な用量のＫＬＨで再刺激した。ｓＣＤ８３で処理した動物から得た細胞（菱形）、ならびにＢＳＡで処理していない（四角）またはＢＳＡで処理した（三角）対照動物に関して、３Ｈ−チミジンの組み込みをＫＬＨ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す。
【図２】図２は、Ｔ細胞増殖アッセイにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｔ細胞が由来したマウスに投与したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の濃度の関数として示す（実施例３を参照のこと）。簡単に記すと、動物をｓＣＤ８３で処理し、ついでＫＬＨを注射し、１０日後、脾臓細胞を採取して、様々な用量のＫＬＨで再刺激した。ｓＣＤ８３で処理した動物から得た細胞（菱形）、ならびに偽接種した対照動物（三角）に関して、３Ｈ−チミジンの組み込みをＫＬＨ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す。
【図３】図３は、Ｔ細胞増殖アッセイにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｔ細胞が由来したマウスに投与したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の濃度の関数として示す（実施例３を参照のこと）。簡単に記すと、動物をｓＣＤ８３で処理し、ついでＫＬＨを注射し、２２日後、脾臓細胞を採取して、様々な用量のＫＬＨで再刺激した。ｓＣＤ８３で処理した動物から得た細胞（菱形）、ならびに偽接種した対照動物（三角）に関して、３Ｈ−チミジンの組み込みをＫＬＨ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す。
【図４】図４は、実施例５で記述した実験の結果を示し、可溶性ＣＤ８３（「ｓＣＤ８３」）が、エクスビボでＢ細胞増殖を抑制することを明らかにする。
【図５】図５は、実施例５で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、移植レシピエントのＢ細胞によるエクスビボでの抗体産生を抑制することを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０１をす。
【図６】図６は、実施例７で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、外来抗原に対するＢ細胞によるアロ−抗体応答の誘導を防止可能であることを明らかにする。
【図７】図７は、実施例８で記述した実験の結果を示し、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植心臓組織の長期間の生存をもたらしたことを明らかにする。
【図８】図８は、実施例８で記述した実験の結果を示し、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植レシピエントにおけるＤＣ成熟化を阻害したことを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図９】図９は、実施例８で記述した実験の結果を示しており、図８と同様に、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植レシピエントにおけるＤＣ成熟化を阻害したことを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０１を示す。
【図１０】図１０は、実施例８で記述した実験の結果を示し、シロリムス（「Ｒａｐａ」）および抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとのｓＣＤ８３の同時投与が、移植レシピエントにおいて制御性Ｔ細胞を産生したことを明らかにする。アスタリスクは、ｐ＜０．０１をす。
【図１１】図１１は、実施例９で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、インビトロで、ＴＮＦ−α産生とカニクイザル由来のｍＤＣによるｍＤＣ活性化マーカーの表面発現とを抑制したことを明らかにする。
【図１２】図１２は、実施例９で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、インビトロで、ＴＮＦ−α産生と単球活性化マーカーの表面発現とを中程度に抑制したことを明らかにする。
【図１３】図１３は、実施例９で記述した実験の結果を示し、ｓＣＤ８３が、制御性Ｔ細胞の産生を促進したことを示す。縦軸は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｉＦｏｘｐ３＋細胞の割合を示す。
【図１４】図１４は、実施例９で記述した実験の結果を示し、増加した数の制御性Ｔ細胞が、可溶性ＣＤ８３で処理した樹状細胞によって産生されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、被験体を治療するためにＣＤ８３を用いる方法を提供する。本発明の方法には、ＣＤ８３単独の使用、または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物との組合せでの使用が含まれる。ＣＤ８３を単独で、または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物と組み合わせて使用する方法が提供され、またＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とを含む組成物も提供される。本発明の方法には、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つまたはそれ以上の免疫抑制性化合物と一緒にＣＤ８３を用いる方法が含まれる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法にはまた、別の化合物の使用が含まれる。たとえば、いくつかの実施形態において、治療用組成物（単数または複数）に対して被験体を寛容化するために、少なくとも１つの治療用組成物をＣＤ８３とともに被験体に同時投与する。いくつかの実施形態において、本発明の方法には、ＣＤ８３と、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物を、少なくとも１つの治療用組成物と一緒に、被験体に同時投与することによって、被験体を寛容化することが含まれる。本発明の方法は、たとえば、少なくとも１つの治療用組成物に対する寛容性を誘導するため、または自己免疫疾患を予防またはその重症度を減少させるために使用可能である。治療用組成物は、移植組織であってよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法を、移植組織の拒絶を予防するために使用する。
【００２０】
本発明はまた、インビボまたはインビトロ（たとえばエクスビボ）のいずれかにおけるＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物の存在下での成熟化を介して、寛容誘導性樹状細胞を産生することを含む、被験体を寛容化する方法を提供する。いくつかの実施形態において、寛容誘導性樹状細胞を、制御性Ｔ細胞を産生するために使用する。本発明の寛容誘導性樹状細胞および制御性Ｔ細胞は、インビボまたはエクスビボで産生可能であり、エクスビボで産生された細胞はついで被験体に投与可能である。本発明の寛容誘導性樹状細胞および制御性Ｔ細胞は、自己由来であってよく、または幹細胞に由来してよい。本発明の組成物および方法を、抗原に対する寛容化のため、ならびに免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または病状（たとえば障害）の治療または予防のために使用してよく、ここで、有効量のＣＤ８３と少なくとも１つの別の免疫抑制性化合物を被験体に投与する。
【００２１】
本発明の目的は、実施形態によって異なってよい。いくつかの実施形態において、本発明の目的には、治療用組成物に対する被験体の完全寛容化が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の目的には、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状の予防、治癒、軽減および／または緩和が含まれる。被験体は、これらの目的の少なくとも１つが達成された場合に、寛容化される、および／または免疫抑制されたと考えられる（すなわち免疫寛容が、誘導または獲得されたと考えられる）。したがって、本明細書で使用するところの、被験体を「寛容化すること」、または「免疫抑制」を誘導することは、樹状細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞に関する免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状が、未治療対照またはその他の適切な対照と比較して（たとえば、治療が免疫応答の発生を予防するか、または重症度を軽減することを意図する場合、治療の前の症状、または治療なしでの症状の予想される重症度と比較して）、予防、治癒、軽減または緩和されることを意味する。当業者は、症状の測定および評価の方法の選択および適用、ならびに適切な対照の選択に詳しい。
【００２２】
したがって、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状が、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％軽減または緩和される場合に、被験体は寛容化されたと考えられ、および／または免疫抑制が発生したと考えられる。治療が、自己免疫疾病を発症することに対する被験体のリスクを軽減することを意図する実施形態において、このリスクは、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％軽減または緩和され、この評価を、被験体の集団において、統計学的に実施することができる。治療が、治療用組成物に対して被験体を寛容化することを意図する実施形態において、免疫応答の望ましくない機能は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％減少する。他の実施形態において、本発明の目的には、寛容誘導性樹状細胞の産生が含まれ、これらの実施形態において、「症状」は、インビボまたはインビトロのいずれかでの、細胞の挙動のパラメータを意味する。
【００２３】
本発明の方法は、治療目的のために有用であり、したがって、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状を予防、治癒または緩和することを意図する。治療が予防的であることが意図される場合、たとえば治療の前の症状との比較、または予想される症状の重症度との比較のような、適切な対照との比較で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上、必要に応じて、症状が軽減、増加、または改善される場合に、疾患または障害の症状は、軽減または緩和されたと考えられる。当業者は、症状における変化を評価するための技術および基準に詳しい。免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の症状が当業者に既知であり、これには以下の、移植組織の異常な組織構造；移植組織の異常機能；診断または移植のような事象後の短期間の生存期間；望ましくない抗体または望ましくない細胞（たとえば抗原特異的樹状細胞またはＴ細胞）のような、血中の指標タンパク質（単数または複数）または他の化合物（単数または複数）の異常に、または望ましくないほどに高い、または低い濃度または数；血中または体内の別の場所での、指標細胞の異常に、または望ましくないほどに低い濃度または数、たとえば制御性Ｔ細胞の望ましくないほどに低い濃度または数が含まれ、望ましくない免疫応答が開始または維持される。
【００２４】
必要に応じて、インビボ寛容化または寛容性および／または免疫抑制を、たとえば被験体より単離された細胞を用いる混合リンパ球反応のような、インビトロアッセイを用いて測定することができる。同様に、エクスビボにて細胞内で達成される寛容化または寛容性および／または免疫抑制を、たとえば樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞のような、種々の型の細胞を用いるエクスビボアッセイにおいて測定することができる。寛容化または寛容性、および／または免疫抑制を、エクスビボ法を用いて測定する場合、寛容化または寛容性は、適切な対照との比較において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％またはそれ以上、免疫刺激に対する細胞の応答が減少した場合に、発生したと考えられる。好適なアッセイが、直接的、または間接的に免疫応答を測定し、当該技術分野で既知であり、それらには限定はされないが、混合リンパ球反応アッセイ、細胞傷害性アッセイ、抗体力価アッセイ、ＩＬ−１０の産生についてのアッセイ、ＴＧＦ−βの産生についてのアッセイ、細胞表面マーカーの評価、およびＦｏｘｐ３の発現についてのアッセイが含まれる。
【００２５】
本明細書で使用するところの用語「可溶性ＣＤ８３」または「ｓＣＤ８３」は、ＣＤ８３ファミリーのメンバーのタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、タンパク質性分子を意味する。いくつかの実施形態において、可溶性ＣＤ８３タンパク質は、それが発現している細胞の膜へ前記分子をつなぐことが可能なアミノ酸配列を持たない。たとえば、可溶性ＣＤ８３タンパク質には、細胞外ドメインの外にある、全長のネイティブＣＤ８３タンパク質のさらなる残基が含まれうる。ＣＤ８３タンパク質、核酸配列および構造が当該技術分野で既知である。（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ１１６９７に記載のような）ヒトＣＤ８３の核酸配列は配列番号：１と記載される。本配列には、（終止コドンを含む）位置１１〜６２８のコード配列、および位置１１〜６７のシグナルペプチドが含まれる。成熟ＣＤ８３ペプチドをコードする配列は、位置６８〜６２５に広がっている。制限酵素認識部位は、配列の先頭および末端に存在する（位置１〜６および１７５５〜１７６０）。（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｑ０１１５１に記載され、配列番号：１と記載された核酸配列によってコードされた）ヒトＣＤ８３のアミノ酸配列を、配列番号：２として記載する。
【００２６】
ＣＤ８３の細胞外ドメインは、ネイティブ全長タンパク質のアミノ酸２０〜１４４を含むことが記述されている。ＣＤ８３の全長アミノ酸配列を、配列番号：２と記載し、全長ＣＤ８３のアミノ酸２０〜１４４をまた配列番号：４と記載する。細胞外ドメインをコードするＣＤ８３核酸配列の部分を、配列番号：３と記載する。たとえばそのすべてが参照によって本明細書に組み込まれている、Ｚｈｏｕら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３５−７４２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ１１６９７、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１１５１、ＷＯ２００４／０４６１８２も参照のこと。
【００２７】
他の実施形態において、ＣＤ８３タンパク質は、「膜結合型」であり、すなわち、ＣＤ８３ファミリーのメンバーのタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含み、また細胞の膜のような膜へつなぐことが可能であるアミノ酸配列を持つタンパク質またはペプチドを含む。本明細書で使用するところの用語「ＣＤ８３」は、可溶性ＣＤ８３と膜結合型ＣＤ８３を包含する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質は、配列番号：２において記載された、および／またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０１１５１において記載されたヒトＣＤ８３タンパク質の配列の対応する部分に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を持ちうる。したがって用語「ＣＤ８３」は、マウスＣＤ８３タンパク質（「ＨＢ１５」とも呼ばれる、たとえばＢｅｒｃｈｔｏｌｄら（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４６１：２１１−２１６を参照のこと）を包含する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質は、ネイティブの全長ＣＤ８３タンパク質に由来する少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、１００またはそれ以上の連続するアミノ酸の断片を含むか、そのような断片に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一般に、本明細書で使用するところの「配列同一性」は、配列の型（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）に対して適切なデフォルトパラメータで、周知のＢＬＡＳＴアライメントプログラムを用いて決定される、２つの配列間の配列同一性を意味する。これ以外のプログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、これらのプログラムの詳細は当該技術分野で既知であり、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトで見ることができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用するところの「可溶性ＣＤ８３」または「ｓＣＤ８３」は、ＣＤ８３ファミリーのメンバーのタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むエピトープを意味し、前記エピソープは、たとえば被験体に投与した時に、それ自体に対する免疫応答を刺激する。そのような実施形態において、ｓＣＤ８３であるエピトープに対する免疫応答は、ｓＣＤ８３に関して本明細書に記述した活性および効果を摸倣しうる。すなわち、ｓＣＤ８３であるエピトープに対する免疫応答は、ネイティブＣＤ８３の細胞外ドメインを含むｓＣＤ８３の活性を持ってよく、もしくはｓＣＤ８３であるエピトープに対する免疫応答は、ネイティブＣＤ８３の細胞外ドメインを含むｓＣＤ８３の投与によって生じる効果と同様である、それが投与された被験体における効果を持ってよい。そのような実施形態において、アッセイ中の、または被験体に対するＣＤ８３の活性または効果は、エピトープに対する免疫応答の結果である可能性があり、またはＣＤ８３それ自体の結果である可能性があり、またはそれら両方の結果である可能性がある。
【００３０】
本発明で使用されるＣＤ８３は、ＣＤ８３タンパク質のダイマーまたはマルチマーであってよい。ダイマー化またはマルチマー化は、（たとえば、ネイティブタンパク質の位置１２、２７、３５、１００、１０７、１２９および１６３に存在する）ＣＤ８３タンパク質の単量体型内に存在するシステイン残基間の１つまたはそれ以上のジスルフィド結合の形成によって、またはＣＤ８３タンパク質の単量体型内の、同一または異なる官能基（たとえばカルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオ基など）を連結する、二官能性リンカー分子（たとえばジアミン、ジカルボン酸化合物など）によって達成されてよい。後者には、組換え技術によって直接産生可能な二量体構造を産生するための、ポリペプチドリンカー（たとえば［（Ｇｌｙ）ｘＳｅｒ］ｙ−（式中ｘはたとえば３または４で、ｙはたとえば１〜５である）のような小さな極性アミノ酸残基からなる）の使用が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ８３は、ホモダイマーまたはホモマルチマー（たとえば可溶性ＣＤ８３の第五システイン残基（すなわちネイティブタンパク質中のアミノ酸１２９に対応するシステイン残基）との間でジスルフィド結合を介して連結した、ネイティブＣＤ８３タンパク質のアミノ酸残基２０〜１４４（すなわち配列番号：２）を含むｓＣＤ８３）である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８３は、モノマーであってよく、そのような実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＤ８３のネイティブシステイン残基が、別のアミノ酸残基、たとえば小さいアミノ酸残基および／または極性アミノ酸残基によって置換されてよい。いくつかの実施形態において、好ましくは、小さいアミノ酸残基、および／または極性アミノ酸残基は、セリン、アラニン、グリシン、バリン、スレオニンなどから選択される。ＣＤ８３がモノマーの場合、いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質の少なくとも１つのシステイン残基が置換され、たとえば全長ネイティブタンパク質の位置１２９に対応するシステイン残基がアラニンで置換されてよい。
【００３２】
いくつかの実施形態において、用語「可溶性ＣＤ８３」または「ｓＣＤ８３」はまた、ＣＤ８３の細胞外ドメインの少なくとも一部分ならびに機能的断片および誘導体の融合タンパク質を包含する（たとえば、ＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）。融合タンパク質が本明細書で定義したようなＣＤ８３活性を維持している限り、好適な融合タンパク質には、ＣＤ８３の細胞外ドメインの少なくとも一部分と、少なくとも１つの他のペプチドまたはタンパク質が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ８３の細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むであろう。そのようなタンパク質またはペプチドが当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン外のＣＤ８３のさらなる残基を含むタンパク質が、用語「可溶性ＣＤ８３」によって包含される。したがって、好適な誘導体には、限定はされないが、Ｃ末端またはＮ末端に結合したさらなる配列を持つタンパク質、たとえば、それらのＣ末端に膜貫通ドメインの部分、または短いペプチドをＮ末端に持つ（たとえば遺伝子工学的に改変した融合タンパク質の産物のような、トロンビンによるトロンビン部位の開裂によって生じ得る、たとえばＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、または融合タンパク質の開裂後のＧＳＴの断片から生じる短いペプチド）ものが含まれる。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ８３は、ネイティブな全長タンパク質（配列番号：２）のアミノ酸２０〜１４５からなるか、または該アミノ酸を含み、細胞外ドメインと、Ｃ末端でのさらなるアミノ酸を含む。他の実施形態において、ｓＣＤ８３は、配列番号：２のアミノ酸２０〜１４３からなる。
【００３３】
本発明で使用されるＣＤ８３の活性は、当該技術分野で既知の方法によって評価可能である。ＣＤ８３タンパク質は、任意の好適なアッセイによって測定されるような、ネイティブな全長ＣＤ８３タンパク質の少なくとも１つの活性を示す場合に、「ＣＤ８３活性」を持つと言われる。ＣＤ８３タンパク質は、そのようなアッセイにおいて、同様のアッセイにて測定されたネイティブな全長ＣＤ８３タンパク質の活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の活性を持つ場合に、「ＣＤ８３活性」を持つと言われる。好ましくは、本発明で使用されるＣＤ８３タンパク質は、成熟免疫刺激性樹状細胞に結合し、Ｔ細胞増殖を刺激するこれらの樹状細胞の能力を減少させることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３は、成熟ＤＣまたは単球において、たとえば、実施例９で記述したアッセイにおいて、ＴＮＦ−αを抑制または減少させる。この活性は、直接的または間接的に評価可能であり、インビボまたはインビトロにて測定可能であり、好適なアッセイが当該技術分野で既知であって、たとえば混合リンパ球反応アッセイすなわち「ＭＬＲ」（たとえばＫｒｕｓｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７１２７−７１３６；Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）が含まれる。したがって、本発明で使用されるＣＤ８３タンパク質は、たとえばｓＣＤ８３のない状態での、成熟免疫刺激性樹状細胞とＴ細胞との間の相互作用のような、適切な対照との比較において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％またはそれ以上、Ｔ細胞増殖を刺激する、成熟免疫刺激性樹状細胞の能力を減少させることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８３は、エピトープであり、免疫応答を刺激する活性を持つ。本活性は、インビトロアッセイにおいて、または被験体への投与に続いて、ＣＤ８３に対する応答において産生される、抗ＣＤ８３抗体を同定することによってアッセイしてよい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ８３タンパク質は、適切な対照との比較において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％またはそれ以上、少なくとも１つの成熟化過程の工程の間、可溶性ＣＤ８３の存在下のインビトロにおいて成熟した免疫刺激性樹状細胞による、ＴＮＦ−α、ＣＤ８０および／またはＣＤ８３の発現を減少させることができる（たとえばＬｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１、ＷＯ２００４／０４６１８２、実施例９を参照のこと）。このように、ＣＤ８３は、細胞表面マーカーの発現を変化させたと言うことができ、すなわち、処理した細胞の免疫表現型を変更したということができる。細胞表面マーカーの発現の解析のために一般に使用されている技術（たとえばＦＡＣＳ解析）がしばしば、細胞の混合集団を表すデータを生成しうること、およびどの集団が特定のデータセットにおいて表されうるかを同定するために注意が払われるべきであることが当業者によって理解されている。
【００３５】
タンパク質のＣＤ８３ファミリーの他のメンバーは、たとえば、哺乳動物のような他の動物からの、または同一の生物の他の組織からの、核酸の種々の供給源（たとえばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）に対して、細胞外部分をコードしているヒトＣＤ８３コード領域の全体または一部を含む核酸をハイブリッド形成させることによって得ることが可能である。本発明の方法および組成物において使用されるＣＤ８３および他のタンパク質を任意の好適な方法によって生産および精製してよい。種々のタンパク質およびその誘導体、ならびにこれらをコードする核酸を生産、精製および操作するための方法が、当該技術分野でまたよく知られている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと、また米国特許第７，１６９，８９８号、米国特許出願第１０／３８２，３９７号、および米国特許出願第１０／５３５，５２２号を参照のこと。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８３タンパク質をコードする核酸を被験体に提供することによって、ＣＤ８３を被験体に投与する。たとえば、ＣＤ８３は、米国特許第７，１６９，８９８号の配列番号：１のヌクレオチド５８〜４３２を含むＤＮＡ断片として、または対応するｍＲＮＡとして、被験体に投与可能である（たとえば米国特許第７，０１５，２０４号を参照のこと）。同様に、いくつかの実施形態において、宿主細胞（すなわち細胞）へＣＤ８３タンパク質をコードする核酸を形質転換することによって、ＣＤ８３をインビトロまたはインビボにおいて細胞に提供し、形質転換宿主細胞がついでＣＤ８３タンパク質を発現し、それによって、他の細胞ならびにそれ自身（すなわち形質転換宿主細胞）に対してＣＤ８３タンパク質を提供する。そのような実施形態において、好適な宿主細胞には樹状細胞が含まれる。ＣＤ８３が、ＣＤ８３タンパク質をコードする核酸として提供される実施形態において、用語「ＣＤ８３」はまた、ＣＤ８３タンパク質をコードする核酸も意味する。ＣＤ８３タンパク質をコードする限り、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸を含む、任意の好適な核酸を使用することができる。核酸は、コードされたタンパク質またはタンパク質断片の発現のために好適なベクター内で提供されうる。これらを産生するための好適なベクターおよび方法が当該技術分野で既知である。
【００３７】
本明細書で使用するところの「治療用組成物」は、治療目的のために使用され、それに対する免疫応答が望ましくない、外来性組成物を意味する。したがって、用語「治療用組成物」は、純粋な調製物（すなわち単一の、本質的に純粋な物質または化合物からなる調製物）ならびに物質または化合物の混合物を包含する。本明細書で使用するところの用語「治療目的」には、疾患または障害の少なくとも１つの症状を予防、治癒または軽減若しくは緩和するための努力が含まれる。このように、「治療目的」には、本発明の組成物および／または方法の治療上の使用および予防上の使用の両方が含まれ、したがって、治療用組成物には、Ｔ細胞に関する免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の発症を予防するために使用されるものが含まれる。
【００３８】
本発明で使用される好適な治療用組成物には、限定はされないが、抗体、タンパク質、「小分子」、遺伝子治療ベクターおよび遺伝子治療ベクターによって発現される任意のタンパク質、抗原、アレルゲン、（幹細胞を含む）細胞、ならびに組織移植片が含まれる。これらのカテゴリーは、必ずしも相互に排他的ではなく、したがって、たとえば多くのタンパク質が抗原であり、多くの抗原がタンパク質であることが理解される。治療用組成物をＣＤ８３と同時投与するが、被験体が、少なくとも１つの他の治療用組成物または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物で治療されてはいない実施形態において、治療用組成物は移植組織ではない。治療用組成物をＣＤ８３と同時投与するが、被験体が、少なくとも１つの他の治療用組成物または少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物で治療されてはいない実施形態において、治療用組成物は、移植組織に関連する抗原ではない。
【００３９】
抗原である好適な治療用組成物は、それに対して免疫応答が発生しうる任意の組成物（すなわち、被験体が免疫応答を持つか、または持ちうる任意の組成物）である。好適な抗原には、自己免疫疾患の発症に関与する若しくは関連する抗原、またはそれに対する抗体が自己免疫疾患を持つ被験体において発見される抗原などの、たとえば寛容性が望まれる自己免疫疾患に関連した抗原などの、タンパク質およびタンパク質断片が含まれる。
【００４０】
したがって、例示的な抗原には、（多発性硬化症の発症に関与する）ミエリン塩基性タンパク質、（尋常性天疱瘡の発症に関与すると考えられている）デスモグレイン−３タンパク質、（グレーブス病の発症に関与する）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター、（橋本甲状腺炎の発症に関与する）甲状腺ペルオキシダーゼ、（重症筋無力症の発症に関与する）アセチルコリンレセプター、および（Ｉ型糖尿病の発症に関与する）インスリンが含まれる。抗体である好適な治療用組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、または抗体の一部または断片を含む、任意の型の抗体またはその誘導体であってよい。
【００４１】
本発明の方法は、本発明の方法において使用される治療用組成物が、望ましくない免疫応答の近くまで寛容誘導性細胞を導く限り、免疫応答が指向される抗原または指向される可能性のある抗原が未知である場合でさえも、寛容誘導性を誘導可能である。したがって、望ましくない免疫応答が指向されるまたは指向される可能性のある組織中、またはその近くにおける抗原の正体にもかかわらず、好適な治療用組成物には、寛容化が望まれる特定の組織に関連する抗原が含まれる。このように、いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、「決定基拡散（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）」が発生したか、発生しうる、疾患または障害を治療、および／または予防することにおいてとりわけ有用であり得る（たとえばＤａｉら（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９−１７５；ＰｒａｔおよびＡｎｔｅｌ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２２５−２３０を参照のこと）。
【００４２】
抗原は、その組織を構成する細胞によって発現される場合、またはその組織を構成する細胞上またはその近く（たとえばその組織の細胞外マトリックス）にある場合、特定の組織に「関連する」。特定の組織に「関連した」抗原の使用には、組織それ自体から分離した精製形態での抗原の使用が含まれ、またはインサイチュ（すなわち組織内）での抗原の使用が含まれる可能性がある。本明細書で使用するところの用語「組織」は、個々の器官（たとえば肝臓、腎臓、心臓、肺など）、ならびに「液体」組織（たとえば血液、血清のような血液成分、Ｔ細胞のような細胞など）、およびいずれかまたは両方の部分またはサブパートを包含する。
【００４３】
必要に応じて、治療用組成物は、本発明の方法において使用される時に、被験体を寛容化するそれらの能力以外の生物学的活性を欠くように選択してよい。したがってたとえば、治療用組成物は、ネイティブインスリンの正常な生理学的活性を欠くネイティブインスリンタンパク質の一部または断片のみからなってよい。抗体である好適な治療用組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体または抗体の一部または断片を含む、任意の型の抗体またはその誘導体であってよい。当業者は、本発明の方法での使用のために、好適な治療用組成物を同定および提供可能である。
【００４４】
好適な治療用組成物には、本発明の目的（たとえば移植組織に対する寛容化）が達成される限り、寛容化が望まれる特定の組織と関連するか否かを問わず、寛容化を刺激するために役に立つ抗原または他の薬剤が含まれうる。いくつかの実施形態において、好適な治療用組成物には、対象とする組織から単離された総ＲＮＡ、またはＲＮＡの一部が含まれ、これは被験体に直接投与可能であり（たとえば米国特許第７，０１５，２０４号を参照のこと）、または樹状細胞を形質導入するために使用可能であり、その結果たとえば被験体を治療するため、または制御性Ｔ細胞のインビトロ産生のために使用可能である。タンパク質またはポリペプチドである治療用組成物を、タンパク質またはポリペプチドとして投与してよく、またはそれをコードする核酸を細胞または被験体に提供することによって投与してよい。したがって、いくつかの実施形態において、治療用組成物には、ＲＮＡが含まれる（たとえば、米国特許第７，０１５，２０４号を参照のこと）。いくつかの実施形態において、２つ以上の治療用組成物を被験体に投与する。
【００４５】
用語「免疫抑制性化合物（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、リンパ球のＴおよび／またはＢクローンの集団のサイズを枯渇させることが可能であるか、またはそれらの反応性、増殖または分化を抑制することが可能である、化合物を意味する。本発明の方法において使用される免疫抑制性化合物には、限定はされないが、シクロスポリン（「ＣｓＡ」としても知られ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）およびタクロリムス（「ＦＫ５０６」としても知られ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）として市販されている）を含むカルシニューリン阻害剤；ミコフェノール酸モフェチル（「ＭＭＦ」としても知られ、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）として市販されている）およびアザチオプリン（Ａｚａｓａｎ（登録商標）またはＩｍｕｒａｎ（登録商標）として市販されている）のようなプリン代謝阻害剤；エベロリムス（Ｃｅｒｔｉｃａｎ（登録商標）として市販されている）およびシロリムス（「ラパマイシン」または「Ｒａｐａ」としても知られ、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）のような増殖阻害剤；抗ＣＤ４５および抗ＣＤ４５ＲＢのようなモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）（たとえば米国特許第７，１６０，９８７号を参照のこと）；ＯＫＴ３のような、Ｔ細胞に対して指向されるモノクローナル抗体；バシリキシマブおよびダクリズマブのような、ヒト化抗ＴａＴ抗体を含む、ＩＬ−２レセプターに対して指向されるモノクローナル抗体；ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ１融合タンパク質のような、Ｔ細胞共刺激経路を遮断する物質；キメラ現象（すなわち、移植片組織が自己として認識される、ドナーおよびレシピエント免疫細胞の共存）を誘導可能な物質；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）として市販されている）のような、骨髄非破壊的移植前治療（ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏｂｌａｔｉｖｅ ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）が含まれる。免疫抑制薬およびそれらの標的の議論のために、たとえばＳｔｅｐｋｏｗｓｋｉ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｊｕｎｅ ２１，２０００：１−２３を参照のこと）。
【００４６】
シロリムス（「ラパマイシン」または「Ｒａｐａ」としても知られ、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）は、１３歳以上の腎臓移植患者における、器官拒絶の予防のために現在必要とされている。製造業者は、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を、最初にシクロスポリンおよびコルチコステロイドとの処方において使用するべきであると推奨している。実験モデル（すなわちマウス、ブタおよび／または霊長類）における研究によって、シロリムスが、たとえば腎臓、心臓、皮膚、膵島、小腸、膵−十二指腸組織、および骨髄の同種移植片生存を延長したことが示された。シロリムスは、ラットにおける心臓および腎臓の同種移植片の急性拒絶を無効にし、前感作ラットにおける移植片生存を延長した。いくつかの研究において、シロリムスの免疫抑制効果は、治療の中止後６ヶ月まで続いた。シロリムスの寛容性効果は、同種移植片特異的である。自己免疫疾患の齧歯類モデルにおいて、シロリムスが、全身性紅斑性狼瘡、コラーゲン誘導関節炎、自己免疫性（Ｉ型）糖尿病、自己免疫性心筋炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、移植片対宿主疾患および自己免疫性ぶどう膜網膜炎に関連した、免疫が媒介する事象を抑制した。
【００４７】
ミコフェノール酸モフェチル（「ＭＭＦ」としても知られ、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）として市販されている）は、同種異系心移植（心臓）または肝移植（肝臓）を受ける患者における器官拒絶の予防のために現在必要とされている。製造業者は、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）をシクロスポリンおよびコルチコステロイドと一緒に使用することを推奨している。ミコフェノール酸モフェチルが、実験動物モデルにおいて、腎臓、心臓、肝臓、腸、四肢、小腸、膵島、および骨髄を含む同種移植片の生存を延長したことが示された。ミコフェノール酸モフェチルはまた、イヌ腎臓モデルおよびラット心臓同種移植片モデルにおいて、発生している急性拒絶を覆すことも示され、ラットにおける大動脈および心臓の同種移植片ならびに霊長類異種移植片の実験モデルにおいて、増殖性の動脈疾患を阻害した。ミコフェノール酸モフェチルはまた、マウス腫瘍移植モデルにおいて、腫瘍発生を阻害し、生存を延長したことが明らかにされた。ミコフェノール酸モフェチルは、単独、または別の免疫抑制薬剤との組合せで使用してよい。
【００４８】
タクロリムス（「ＦＫ５０６」としても知られ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）として市販されている）は、同種異系の肝移植、腎移植または心移植を受けている患者における器官拒絶の予防のために現在必要とされている。タクロリムスは、副腎コルチコステロイドと一緒に使用されるべきである。心臓移植レシピエントにおいて、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）は、アザチオプリンまたはＭＭＦと一緒に使用されることが推奨されている。タクロリムスは、肝臓、腎臓、心臓、骨髄、小腸および膵臓、肺および気管、皮膚、角膜および四肢の動物移植モデルにおいて、宿主および移植片の生存を延長することが示された。動物において、タクロリムスは、いくつかの体液性免疫を抑制し、そして、より大きな程度まで、同種移植拒絶、遅延型過敏症、コラーゲン誘導動脈炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎および移植片対宿主疾患のような細胞媒介性反応を抑制することが明らかにされた。本発明は、任意の化合物またはそれらの組合せの作用機序にとらわれるわけではなく、またタクロリムスの正確な作用機序は未知であるけれども、タクロリムスは、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害し、Ｔリンパ球活性化を阻害すると考えられている。
【００４９】
シクロスポリン（「ＣｓＡ」としても知られ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）は、腎臓、肝臓および心臓の同種移植に対する器官拒絶の予防のために現在必要とされている。シクロスポリンは、アザチオプリンおよびコルチコステロイドとの組合せで使用されており、リウマチ性関節炎患者において、メトトレキサートとの組合せで使用可能である。シクロスポリンは、疾患が十分にメトトレキサートに反応しなかった重度の活性リウマチ性関節炎の患者の治療のために必要とされている。シクロスポリンはまた、重度の難治性尋常性乾癬の、成人で免疫システムが損なわれていない患者の治療のために必要とされている。シクロスポリンは、動物モデルにおいて、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、骨髄、小腸および肺を含む同種移植片の生存を延長する、強力な免疫抑制薬剤である。シクロスポリンは、いくつかの体液性免疫を抑制し、そして、より大きな程度まで、種々の器官に対して多くの動物種における、同種移植拒絶、遅延型過敏症、実験的アレルギー性脳脊髄炎、フロイントアジュバント関節炎（Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および移植片対宿主疾患のような細胞媒介性免疫応答を抑制することが示されている。本発明は、任意の化合物またはそれらの組合せの作用機序にとらわれるわけではないが、シクロスポリンは、細胞周期のＧ０およびＧ１期において、免疫応答性リンパ球を阻害し、そしてＴリンパ球を選択的に阻害することが示されてきた。
【００５０】
「有効量」の物質によって、本発明の方法にしたがって、被験体に投与した場合に、少なくとも、本発明の少なくとも１つの目的を達成するのに十分な量が意図される。したがって、たとえば、「有効量」の治療用組成物は、ＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物と一緒に被験体に同時投与した時に、治療用組成物に対して被験体を寛容化するのに少なくとも十分である。同様に、「有効量」のＣＤ８３は、治療用組成物および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物と同時投与したときに、治療用組成物に対して患者を寛容化するのに、少なくとも十分である。「有効量」の免疫抑制性化合物は、ＣＤ８３と、任意に治療用組成物とを同時投与した時に、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状に対して、測定可能な効果を生ずるのに少なくとも十分である。いくつかの実施形態において、有効量の免疫抑制性化合物は、本明細書の別の場所で定義したように、寛容性および／または免疫抑制を誘導するのに、少なくとも十分である。免疫抑制性化合物の有効量は、個々の被験体が示した症状に関して決定されてよく、または臨床研究から決定するか、若しくはモデル系における適切な研究から外挿してよい。したがって、たとえば、免疫抑制性化合物の有効量には、本発明の方法を用いる臨床研究において決定された用量範囲に基づいて、疾患または障害の少なくとも１つの症状において、測定可能な効果を生ずることが予想されうる量が含まれる。
【００５１】
有効量は、１つまたはそれ以上の投与、適用または用量で投与可能である。好適な投与、適用および用量は、限定はされないが、組成物の特異的活性；組成物の処方；治療される被験体の体重、年齢、健康、疾患および状態；ならびに組成物の被験体内への投与の経路を含む、多数の因子によって変化しうる。場合によっては、有効量であることが要求されるＣＤ８３の最小量は、患者内にすでに存在しているＣＤ８３、とりわけ可溶性ＣＤ８３の存在によって、減少させてよく（たとえばＨｏｃｋら（２００６）（Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６７：５７−６０を参照のこと）、当業者は、用量および投与などを、最適な結果を達成するために簡単に適合可能である。たとえば、ＣＤ８３は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００若しくは７００ｍｇ／ｋｇまたは１、２、５、７、１０、２０、５０若しくは１００ｇ／ｋｇの下限、および０．０５、０．１、０．５、１、２、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００若しくは７００ｍｇ／ｋｇまたは１、２、５、７、１０、２０、５０、１００、若しくは２００ｇ／ｋｇの上限を持つ範囲内で、患者に投与してよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、それに対して免疫応答が指向されるかまたは指向される可能性のある抗原が未知である場合でさえも、寛容性を誘導可能である。したがって、好適な治療用組成物には、それに対する望ましくない免疫応答が指向されるかまたは指向され留可能性がある組織中またはその組織の近くにおける抗原の正体にもかかわらず、寛容化が望まれる特定の組織に関連する抗原が含まれる。このように、いくつかの実施形態で、本発明の方法および組成物が、「決定基拡散」が発生するか、または発生しうる疾患または障害を治療すること、および／または予防することにおいてとりわけ有用であり得る（たとえば、Ｄａｉら（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９−１７５、ＰｒａｔおよびＡｎｔｅｌ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２２５−２３０を参照のこと）。抗原は、組織を構成する細胞によって発現される場合、または組織を構成する細胞上またはその近くで（たとえば組織の細胞外マトリックス中で）見られる場合に、特定の組織に「関連する」。
【００５３】
本発明の方法は、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とＣＤ８３との同時投与によって生じる相乗効果の利益を提供し、それによって、併用治療の効果は、２つの個々の治療の組合せから期待されるものよりも格段に高い。さらに、ＣＤ８３を、２つまたはそれ以上の他の免疫抑制性化合物とともに被験体に同時投与する場合、さらにより大きな利益が提供されうる。このように、本発明は、個々の治療のみによって提供されるものよりも大きな効果を持つ、併用治療（または「同時投与」治療）を提供する。いくつかの実施形態において、併用治療または同時投与治療は、各個々の治療によって提供される利益の合計よりも大きな利益を提供する。いくつかの実施形態において、併用治療または同時投与治療は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％若しくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍若しくはそれ以上、個々の治療によって提供される利益よりも大きな利益を提供する。いくつかの実施形態において、併用治療または同時投与治療は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％若しくはそれ以上、または１．５倍、２倍、３倍、４倍若しくはそれ以上、個々の治療によって提供される利益の合計より大きな利益を提供する。
【００５４】
併用（または「同時投与」）治療のこの改善された効果が、化合物を単独で使用する場合に必要であるものよりも低い用量の個々の化合物を、被験体を治療するために使用可能である、本発明の治療の方法を提供する。このように、本発明は、現在使用されているよりも少ない個々の化合物を用いて、効果的な治療を可能にする。言い換えれば、本発明は、被験体を治療するための化合物の量を減少させて使用する方法を提供し、被験体を治療するために使用する化合物の量を減少させる方法を提供する。したがって、本発明は、減少した用量を使用することによって、副作用の可能性の低下した、および／または副作用の重症度を減少させる治療を提供する。そのような副作用には、カルシニューリン阻害剤について一般的に見られるもの（たとえば腎臓毒性）が含まれる。個々のカルシニューリン阻害剤はまた、特定の副作用を生ずる傾向にあり、たとえば、シクロスポリン治療で見られる傾向にある副作用には、糖尿病、高血圧、高脂血症、麻痺、歯肉過形成、多毛症、および皮膚変化が含まれ、一方で、タクロリムス治療において見られる傾向にある副作用には、糖尿病の発症の増加が含まれるが、高脂血症、高血圧、および歯肉過形成はシクロスポリン治療で見られるよりもその傾向が少ない。ミコフェノール酸モフェチル治療で一般に見られる副作用には、白血球減少症のリスクの増加、下痢、貧血、高血圧、食道炎、胃炎および胃腸管出血が含まれる。
【００５５】
「減少した用量」は、個々の化合物を、別の場合に被験体を治療するために使用しうるものよりも、低い投与量レベルで、被験体に投与することを意図する。いくつかの実施形態において、「減少した用量」によって、個々の化合物が、製造業者によって推奨されるもの、すなわち化合物に関する取扱説明書で推奨される投与量レベルよりも低い投与量レベルで、被験体に投与されることが意図される。参照として、本発明のいくつかの化合物に関して、取扱説明書において現在推奨されている投与量レベルは以下のとおりである。推奨投与量レベルが、治療の段階または治療間隔によって変化する場合（たとえば、新規移植患者のための投与量レベルに対する維持投与量レベル）、本発明の方法には、被験体をただ１つの治療段階または治療間隔の間、または少なくとも１つの治療段階または治療間隔の間、減少した用量の化合物で被験体を治療する治療方法が含まれる。治療の段階および／または治療間隔は、当業者によって理解され、たとえば、慢性自己免疫障害または疾患の長期維持または管理；移植前準備；移植後回復；および移植後維持が含まれる。あるいは、治療間隔は、１日、１週間、１ヶ月若しくは２、３、４、５若しくは６ヶ月、若しくは１年、または特定の治療目標（単数または複数）が達成されたことを被験体が示す間、またはその後の間隔のような、治療が実施される期間および／または評価される期間であってよい。
【００５６】
タクロリムス（「ＦＫ５０６」としても知られ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）として市販されている）に関して、製造業者の推奨は、連続静脈注入として、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日（心臓移植について）、または０．０３〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日（肝臓または腎臓移植について）の開始用量で、移植から６時間後に投与することである。連続注入は、患者が経口投与を受容できる間までのみ続けられるべきである。
【００５７】
シロリムス（「ラパマイシン」としても知られる、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）に関して、推奨用量は、患者に対する免疫学的リスク、および移植後治療の段階によって変化する。免疫リスクが低〜中レベルである患者に対して、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）経口溶液および錠剤を、シクロスポリンとコルチコステロイドと組み合わせて使用することが推奨され、シクロスポリンは、移植から２〜４ヶ月後に中止すべきである。デノボ移植レシピエントに対して、維持用量の３倍に相当する負荷量のＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）が与えられるべきである。たとえば、腎臓移植患者に対して、２ｍｇの維持用量が、６ｍｇの負荷量とともに推奨される。シクロスポリンの中止が検討された患者には、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）とシクロスポリンとの併用療法を与えるべきである。移植後２〜４ヶ月の時点で、シクロスポリンを、４〜８週間にわたって、漸次停止し、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を、移植後１年目に、１６〜２４ｎｇ／ｍＬの範囲内の全血トラフ濃度を得るように調節すべきであり、その後標的は１０〜２０ｎｇ／ｍＬであるべきである。
【００５８】
免疫学的リスクの高い患者に対して、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）経口溶液および錠剤を、１年目は、シクロスポリンとコルチコステロイドとの組合せで使用することが推奨されている。シクロスポリンと一緒にＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を受けている患者に対して、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）治療を、移植後第１日目に、１５ｍｇまでの負荷量で開始すべきである。移植後第２日に開始して、５ｍｇ／日の初期維持用量が与えられるべきである。シクロスポリンの開始用量は、分割用量で、７ｍｇ／ｋｇ／日までであり、用量はつづいて、標的の全血トラフ濃度（すなわち血中の最小濃度）を達成するように調節されるべきである。プレドニゾンを、最小量５ｍｇ／日で投与すべきである。
【００５９】
腎臓同種移植レシピエントに対して使用するために、開始用量のＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）を、移植後可能な限り早く投与すべきである。非定常状態のＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）濃度に基づく頻繁なＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）用量調節によって、過剰投与または過小投与が起こりうるため、そのような用量調節は、注意深く実施され、モニタされるべきである。一旦維持用量が調節されたならば、患者を、少なくとも７〜１４日間、新規維持用量に維持すべきである。
【００６０】
ミコフェノール酸モフェチル（「ＭＭＦ」としても知られ、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）として市販されている）に関して、腎臓移植患者に対する製造業者の推奨は、総１日用量２グラムで、１日２回、（２時間以上にわたり）経口または静脈内に投与される、１グラム用量である。生後３ヶ月〜１８歳の小児患者に対して、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）経口懸濁液の推奨１日用量は、６００ｍｇ／ｍ２の１日２回（最大２グラム／１０ｍｌ経口懸濁液まで）である。体表面積は、たとえば、体重の関数としての体表面積の標準表を用いて決定してよい（たとえば、Ｓｈａｒｋｅｙら（２００１）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：２３−２８を参照のこと）。心臓移植患者に対して、成人には、２時間以上にわたり、静脈内に１日２回（「ｂ．ｉ．ｄ．」）１グラムの用量か、または３グラムの１日用量について、経口で１日２回投与される１．５グラムの用量で治療すべきである。肝臓移植患者に関して、成人は、２時間以上にわたり、静脈にｂ．ｉ．ｄ．で投与される１グラムの用量か、または総１日用量３グラムについて、経口でｂ．ｉ．ｄ．で投与される１．５グラムで治療すべきである。
【００６１】
シクロスポリン（「ＣｓＡ」としても知られ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）として市販されている）に関して、製造業者の推奨は、開始経口用量のＮｅｏｒａｌ（登録商標）を、移植前４〜１２時間、または手術後与えることが可能である、というものである。新規移植患者において、平均開始用量（±ＳＤ）は、腎臓移植患者について、９（±３）ｍｇ／ｋｇ／日、肝臓移植患者について８（±４）ｍｇ／ｋｇ／日、心臓移植患者について７（±３）ｍｇ／ｋｇ／日である。総１日用量は２つの等用量にわけ、用量を続いて先に定義されたシクロスポリン血中濃度を達成するために調節する；個人の体重に基づいた代表的な投与スケジュールは、最初の１４日間、２ｍｇ／ｋｇ／日で開始し、その後、用量を１週間で１ｍｇ／ｋｇ／日まで漸減し、さらに２週間で０．６ｍｇ／ｋｇ／日まで、１ヶ月で０．３ｍｇ／ｋｇ／日まで、そして２ヶ月で０．１５ｍｇ／ｋｇ／日まで漸減させ、その後維持治療とする。病初では、副腎コルチコステロイドでの補助治療が推奨される。
【００６２】
リウマチ性関節炎の治療のために、シクロスポリンの初期用量は、分割経口用量として、１日２回服用する、２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。サリチル酸、非ステロイド性抗炎症剤、および経口コルチコステロイドの他の治療を継続してよい。任意の時点での有害事象を制御するために、用量は２５〜５０％まで減少すべきである。乾癬の治療のために、シクロスポリンの初期用量は、分割経口投与として、１日２回服用する、２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。有害事象がなければ、患者には少なくとも４週間、この用量を維持すべきである。有意な臨床改善が４週間後に見られない場合、用量を、最大４ｍｇ／ｋｇ／日まで０．５ｍｇ／ｋｇ／日ずつ、２週間間隔で増加させることができる。任意の時点での有害事象を制御するために、用量を２５〜５０％減少させるべきである。
【００６３】
本明細書で使用するところの用語「化合物」、「組成物」および「物質」はそれぞれ、本発明の方法で使用することが意図された任意の物質を意味する（すなわち、ＣＤ８３、治療用組成物または免疫抑制性化合物を含む）。物質を被験体に同時に投与する場合、または別の物質を被験体に投与する前、または後、２、４、６、８、１０、１２、若しくは１４時間以内、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０若しくは２００日以内に、物質を被験体に投与した場合、物質は、他の物質と「同時投与」され、「同時投与」が発生する。物質を同時に投与する場合、投与の前に物質を組み合わせてよく、または同時に別々に投与可能である。
【００６４】
本発明の方法には、一用量若しくは一投与、または各化合物または組成物の複数回用量若しくは複数回投与が含まれうる。複数回投与が好ましい実施形態において、化合物または組成物の少なくとも１回の投与は、投与される別の化合物または組成物の「有効性の時間枠（ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）」内で発生する。いくつかの実施形態において、第二の物質の投与は、併用治療の（すなわち両方の物質の投与の）効果が、別々に投与された場合、すなわち適切な対照実験において、個々の治療の１つまたは両方を超えるか、または個々の治療とは異なる場合、またはそれらのことが予想される場合に、第一の物質の「有効性の時間枠」内で発生したとみなされる。いくつかの実施形態において、第二の物質の投与は、併用治療の（すなわち両方の物質の投与の）効果が、別々に投与された場合、すなわち適切な対照実験において、個々の治療を組み合わせた効果を超えるか、または当該効果とは異なる場合、またはそれらのことが予想される場合に、第一の物質の「有効性の時間枠」内で発生したとみなされる。たとえば、被験体を、ＣＤ８３の投与と、ＣＤ８３の有効性の時間枠内での治療用組成物の投与とを含む方法によって、治療用組成物に対して寛容化してよく、この結果は、治療用組成物の投与が、ＣＤ８３の有効性の時間枠内で発生する被験体をＣＤ８３と治療用組成物とで別々に治療した場合に予想されないものである。
【００６５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化合物または組成物を、その物質の「有効性の時間枠」と少なくとも１つの他の物質の「有効性の時間枠」とが少なくともいくらか重なるように投与する。そのような重なりは、併用治療の効果が、別々に投与された場合、すなわち適切な対照実験において、個々の治療と組み合わせた効果を超えるか、または当該効果とは異なるか、またはそれらのことが予想される場合に発生すると考えられる。いくつかの実施形態において、特定の治療の経過の間、さらなる投与が、１つまたはそれ以上の物質の有効性の時間枠の前、間または後に発生してよく、一方他の実施形態において、１つまたはそれ以上の物質の有効性の時間枠外でのさらなる投与は存在しない。いくつかの実施形態において、各物質のすべての投与は、被験体へ投与される物質の互いの有効性の時間枠内で発生する。３つ以上の物質を被験体に投与する実施形態において、物質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の他の物質の有効性の時間枠内で投与可能である。
【００６６】
本発明の方法にはまた、２つ以上の治療用組成物の投与が含まれうる。したがって、本発明の方法には、複数の治療用組成物の投与が含まれうる。治療用組成物は、類似しているか、または異なってよい。たとえば、本発明の方法で被験体に投与した治療用組成物には、関連抗原が含まれうる。したがって、たとえば、いくつかの実施形態において、被験体に投与した治療用組成物は、特定の組織から調製したＲＮＡ（「総組織ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ＲＮＡ）」）を含みうる。
【００６７】
治療目的のために、被験体を、ＣＤ８３によって外来化合物に対して寛容化可能であるので、被験体が、少なくとも治療の間に、または少なくともＣＤ８３の効果のウインドウの間に、寛容化が望ましくない化合物に暴露されないことが重要である。したがって、たとえば、被験体は、腫瘍特異的抗原、およびウイルス、細菌、かびなどを含む病原微生物に暴露されるべきではない。一般に、本明細書で使用する場合、「被験体」は、治療を必要とする任意の動物を意図する。したがって、たとえば、「被験体」はヒト患者、若しくは非ヒト哺乳動物患者であってもよく、または動物である別の患者であってよい。
【００６８】
疾患または病状の予防が望まれる場合、被験体を、一定間隔（たとえば、約２年ごと、毎年、６ヶ月ごと、２〜４ヶ月ごとまたは毎月）で治療してよい。しかしながら、本発明のすべての実施形態において、本発明の方法および組成物を、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる特定の疾患または障害をもつとして同定された被験体に、または特定の疾患または障害を発症する可能性があるとして同定された被験体に、投与する。たとえば、被験体を、被験体の家族歴の検査の結果、遺伝的試験若しくは被験体の酵素若しくは代謝物濃度を測定するための試験のような医学的試験の結果、または別の疾患若しくは障害と診断される結果として、そのような特定の疾患または障害を発症する可能性として同定してよい。このように、たとえば、本発明の方法は、自己免疫疾患を治療するため、自己免疫疾患の発症を予防するため、または自己免疫疾患の発症に関する被験体のリスクを減少させるために使用してよい。一般に、一連の治療は、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる特定の疾患または病状を緩和する、または予防するために被験体をそれ以上治療しないときに終わる。
【００６９】
したがって、本発明は、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または病状の治療または予防の方法を提供し、そこで、有効量のＣＤ８３が、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とともに、免疫抑制が達成されるように被験体に同時投与される。任意に、治療用組成物をまた、投与してよい。治療用組成物を投与する場合、治療用組成物は、被験体が治療用組成物に対して寛容化するように、ＣＤ８３の有効性の時間枠の間に被験体に投与される。任意の形態の投与が、目的が達成される限り、ＣＤ８３および治療用組成物の送達のために選択される。したがって、たとえば、ＣＤ８３および治療用組成物は、一緒に、および同一の投与形態によって投与してよく、または別々に、および／または異なる投与形態によって投与してよい。したがって、たとえば、ＣＤ８３を、タンパク質として被験体に投与してよく、または（たとえば、ｍＲＮＡとして、または発現ベクター内で）ＣＤ８３をコードする核酸として被験体に投与してよい。
【００７０】
本発明の方法を、たとえば、アレルギー；喘息；組織移植の拒絶；慢性的に投与した物質に対する免疫応答；重症筋無力症、多発性硬化症、脈管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎のような慢性炎症性腸疾患、強直性脊椎炎、全身性紅斑性狼蒼、乾癬のような皮膚疾患、リウマチ性関節炎、およびインスリン依存性糖尿病のような自己免疫疾患；ならびにＡＩＤＳのような、免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害を患う、または患うことになりうる被験体を治療するために使用可能である。本発明の方法は、たとえば（多発性骨髄腫および急性リンパ芽球性白血病を含む）白血病のようなＢ細胞過形成、ＡＩＤＳに関連したＢ細胞過敏、毒素性ショック症候群、血清病、および歯周病（たとえば、Ｍａｈａｎｏｎｄａら（２００２）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．３７：１７７−１８３を参照のこと）のような、Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害に悩む被験体を治療するために使用可能である。血清病は、特定の医薬品または抗血清に対する望ましくない免疫応答によって引き起こされる一群の症状である。すなわち、血清病は、別の動物または別のヒトからの抗血清が、受動免疫付与を誘導する目的のために、被験体に与えられる時に発生しうる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害に対する治療を提供し、そこで、治療がＢ細胞枯渇、すなわち、被験体におけるＢ細胞の数および／またはサブタイプの減少を引き起こさない。
【００７１】
本発明の組成物および方法は、単独で使用可能であり（すなわち他の治療を受けていない被験体を治療するために使用可能であり）、または他の治療を受けているか、または受けた被験体に投与可能である。たとえば、特定の疾患または障害に悩んでいる被験体を、本発明の方法および組成物のみで治療可能であり、または本発明の方法および組成物、ならびにたとえば従来の化学療法または薬品治療のような、特定の疾患または障害に罹患しているか、または罹患しうる被験体に一般に投与される、別の治療または療法で治療可能である。したがって、たとえば、本発明の方法には、非免疫抑制性化合物を含む他の化合物の使用または同時投与がさらに含まれうる。したがって、本発明の方法にはさらに、たとえばコルチコステロイド、たとえばアザチオプリンのような抗炎症薬剤、およびたとえばメトトレキサートのような抗代謝薬物を含む、他の化合物の使用または同時投与が含まれうる。
【００７２】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法を、組織レシピエントにおける組織移植の拒絶の少なくとも１つの症状を予防、治癒または緩和するために使用する。そのような実施形態において、移植レシピエント（「レシピエント」または被験体）を、ＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、または少なくとも１つの治療用組成物で治療してよい。治療用組成物は、たとえば移植組織の試料の溶解またはホモジナイゼーションによって、移植組織から調製した、または抽出した抗原のような、移植組織に関連した抗原であってよい。一般に、本発明の方法にしたがった移植レシピエントの治療には、組織の移植前、移植と一緒に（すなわち同時に）、および／または移植後の治療が含まれうる。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、移植組織それ自身であり、したがって、治療用組成物のさらなる投与は、移植組織の導入以外、レシピエントには実施されない；そのような実施形態においては、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物または少なくとも１つの治療用組成物も投与される。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、組織移植の拒絶のすべての有害症状を予防、治癒または緩和し、拒絶を予防するための移植被験体の連続治療が必要なくなり、そのような実施形態では、移植片寛容性が被験体において誘導されたと言われる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、移植されるべき組織のドナー（「移植ドナー」）を、意図するレシピエント内での移植のために組織を採取する前に、（たとえば本発明の方法にしたがって、ＣＤ８３と、少なくとも１つの他の免疫抑制剤、および任意に少なくとも１つの治療用組成物で）治療してよい。いくつかの実施形態において、物質を、本明細書で記述したように、移植ドナーに投与するが、本治療の目的は、移植レシピエントにおいて寛容性および／または免疫抑制を誘導することである。ここでまた、治療用組成物は、移植組織（たとえば器官）に関連した抗原であってよい。いくつかの実施形態において、移植ドナーおよび移植レシピエント両方を、本発明の方法にしたがって治療してよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、移植されるべき組織を、ドナーから採取し、ついでＣＤ８３を含む溶液に暴露してよい。すなわち、たとえば組織を、移植の前に、ＣＤ８３を含む溶液中で保存および／またはかん流させてよい。いくつかの実施形態において、移植されるべき組織をドナーから採取し、ついでＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とを含む溶液に暴露してよい。すなわち、たとえば、組織をＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とを含む溶液中で保存および／またはかん流させてよい。治療用組成物をまた、ドナーに投与してもよい。結果として、本組織が移植レシピエント内に導入されたときに、組織内の、そして組織の表面上のＣＤ８３と他の免疫抑制性化合物（単数または複数）とが、組織に関連した抗原と一緒に被験体に同時投与されることになる。本明細書で使用するところの「組織」は、別個の器官および／または特定の組織（たとえば肝臓、腎臓、心臓、肺、皮膚、膵島など）、ならびに「液体」組織（たとえば、血液、血漿のような血液成分、樹状細胞のような細胞など）を包含し、用語「組織」はまた、別個の器官および「液体」組織の部分およびサブパートを包含する。
【００７５】
当業者は、レシピエントとドナー両方に対して可能である最適な結果を達成するための、移植レシピエントとドナーの評価と治療の方法に詳しい。したがって、当業者は簡単に、ＣＤ８３、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、および任意に特定の被験体に対して適切であるような治療用組成物の用量および投与を評価および調節可能である。以上の議論から簡単に理解されるであろうように、本発明の方法は多数の工程を含み、これらの工程は、少なくとも１つの本発明の目的を達成する限り、任意の順番で実施可能である。本方法は、複数の化合物の複数回投与を含んでよいため、工程の任意のかさなりが発生しうる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物が、たとえばアデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）およびＡＡＶに由来するベクターのような遺伝子治療ベクターに対して、および／または遺伝子治療ベクターによってコードされた遺伝子産物に対して、寛容性を提供する。したがって、たとえば、遺伝子治療を、特定の遺伝子産物を欠く被験体に施す時（たとえば、被験体が特定のタンパク質の欠如をもたらす遺伝的欠損を持つ場合）、被験体内へ導入した時の遺伝子産物に対する望ましくない免疫応答を予防するために、本発明の方法を用いて被験体を治療可能である。好ましくは、本発明の組成物および方法において使用される遺伝子治療ベクターは、病因には関連しないであろう。いくつかの実施形態において、本方法および本方法の組成物が、たとえば多発性硬化症に悩んでいる被験体にしばしば投与される、ベータインターフェロンのような、被験体に繰り返し（すなわち「慢性的に」）投与され、免疫応答が望ましくない物質に対して、寛容性を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、「寛容誘導性」である樹状細胞（「ＤＣ」）を提供し、すなわちこれらは、先に記述したように、免疫耐性を誘導可能である（すなわち「被験体を寛容化」可能である）。樹状細胞の寛容誘導性活性は、直接的または間接的に評価可能であり、インビボまたはインビトロにおいて測定可能である。好適なアッセイが当該技術分野で公知であり、たとえばインビトロでのＣＤ４＋Ｔ細胞集団とのインキュベーション後の制御性Ｔ細胞の産生能力、および／またはＣＤ１４またはＣＤ８０のような細胞表面マーカーの発現における検出可能な変化が含まれる（たとえば、Ｓｔｅｉｎｍａｎら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１；Ｋｕｂａｃｈら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：１９７−２０３を参照のこと）。
【００７８】
本発明の寛容誘導性樹状細胞によって誘導される寛容性は、インビボまたはエクスビボにおいて誘導されてよく、ＤＣによって提示された抗原に対して特異的であってよい。用語「免疫刺激性」ＤＣは、本発明の寛容誘導性ＤＣを「正常」ＤＣまたはネイティブＤＣと区別するために本明細書で使用している。寛容誘導性ＤＣを産生するための本発明の方法は、インビボまたはエクスビボで実施してよく、ＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物に対して、細胞を暴露する工程が含まれる。細胞は、成熟化過程の間、または成熟化過程が完了した後、インビボまたはエクスビボ（インビトロ）いずれかで、ＣＤ８３と他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露してよい。成熟化過程がインビトロで実施される実施形態において、「暴露」は、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）の存在下で細胞をインキュベートしてよいこと、またはＣＤ８３と他の免疫抑制性化合物（単数または複数）の存在下で培養してよいこと（すなわち細胞が増殖および分裂しうること）を意図している。細胞を、任意の好適な様式で、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露してよく、たとえば、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）を、増殖培地に加えてよく、または可能である場合、１つまたはそれ以上のＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）は、それらをコードするＲＮＡでのトランスフェクション後、培養液中の細胞によって発現されてよい。
【００７９】
いくつかの実施形態において、寛容誘導性ＤＣを産生するための方法には、産生過程の間（たとえば最終成熟化過程の間）、未熟ＤＣをＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物とに暴露することが含まれる。一般に、これらの方法において、未熟樹状細胞を、培地１ｍｌあたり、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０または１００マイクログラムの下限、および培地１ｍｌあたり、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、１００または２００マイクログラムの上限を持つ範囲内で、ＣＤ８３に暴露してよい。もっとも好ましくは、ＤＣを、１〜１０μｇ／ｍｌのＣＤ８３の存在下で成熟させる。他の免疫抑制性化合物（単数または複数）の用量は、当業者によって簡単に選択されうる。本明細書で使用するところの「未熟ＤＣ」は、細胞が、（インビトロの場合）適切に培養された場合、または（インビボの場合）成熟させられた場合、成熟樹状細胞になることが可能であることを意図する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法には、成熟化過程の少なくとも１工程の間、細胞をＣＤ８３に暴露すること、および成熟化過程の少なくとも１工程の間、細胞を他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露することが含まれ、これらの工程は、同一の工程（単数または複数）であってよく、または異なるおよび／または重なり合わない工程（単数または複数）であってよい。いくつかの実施形態において、成熟化過程の少なくとも１工程を通して、成熟化工程の２工程以上の間、または全成熟化過程の間、細胞を、ＣＤ８３および／または他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露する。
【００８０】
本発明の寛容誘導性樹状細胞をまた、抗原で細胞を「パルスする」ことによって、またはＲＮＡを細胞に形質導入することによって、提示のために抗原を取り込ませてもよい（たとえば、米国特許第６，３８７，７０１号、米国特許第６，６７０，１８６号、米国特許出願第１０／３６２，７１５号を参照のこと）。さらなる利点を提供するために、本発明の方法を、当該技術分野で既知の他の方法と組み合わせてもよい（たとえば米国特許第５，８３１，０６８号、米国特許出願第１１／２４６，３８７号を参照のこと）。本発明の方法の工程が、望まれる結果を生ずる任意の順番で実施してよいことが理解される。したがって、たとえば、ＣＤ８３への、および／または他の免疫抑制性化合物（単数または複数）への暴露の前、または後に、細胞に抗原を取り込ませてもよい。このように、本発明の方法には、成熟化過程の間の、ＣＤ８３、少なくとも１つの免疫抑制性化合物、および任意に治療用組成物（たとえば対象とする抗原）の細胞への同時投与を含む方法による、寛容誘導性樹状細胞の産生が含まれる。
【００８１】
成熟免疫刺激性樹状細胞は一般に、細胞表面マーカーの特徴的なアレイを示す。したがって、一般に、成熟免疫刺激性ＤＣは、ＣＤ１４の発現を全く、またはほとんど示さない。また一般に、成熟免疫刺激性ＤＣ（インビボで産生されるネイティブＤＣまたはインビトロで産生されるＤＣのいずれか）は、たとえば、細胞表面マーカーＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現、およびＩＬ−１２の分泌のような特徴を示しうる。反対に、いくつかの実施形態において、本発明の方法によって産生された寛容誘導性ＤＣでは、これらの特徴的細胞表面マーカーの少なくとも１つの発現のレベルが減少する。いくつかの実施形態において、本発明の方法によって産生された寛容誘導性ＤＣ上の特定の細胞表面マーカーの発現のレベルは、適切な対照細胞（たとえば、ネイティブ成熟免疫刺激性ＤＣ、またはインビトロ成熟化を介して得た成熟免疫刺激性ＤＣ）上の同一の細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少するか、検出不能である。いくつかの実施形態において、本発明の寛容誘導性ＤＣは、ＣＤ８３の検出不能な発現と、大幅に減少したＣＤ８０の発現を示す。いくつかの実施形態において、本発明の寛容誘導性ＤＣは、適切な対照細胞と比較して、各マーカーに対して、少なくとも９５％減少するＣＤ８３発現と、少なくとも５０％減少するＣＤ８０発現を示す。また、いくつかの実施形態において、本発明の寛容誘導性ＤＣは、成熟免疫刺激性ＤＣよりも高いＣＤ１４の発現を示す。寛容誘導性樹状細胞は、当該技術分野で既知の（たとえばＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）、または実験の項目において記述するような、または以下のような技術を用いて、産生されおよび／または機能に関してアッセイされてよい。
【００８２】
たとえば、細胞を、１％ヒト血清を含む標準培地（たとえばグルタミン（２００μｇ／ｍｌ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および（５６℃で３０分間インキュベートすることによって先に熱不活性化した）単一ドナーからの１％ヒト血清を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））を用いて培養可能である。ヒトＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中での沈降によってバフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）から単離可能であり、ＩｇＧ（コーン画分からの１０μｇ／ｍｌ γ−グロブリン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコートした１００ｍｍ培養ディッシュ上に播種し、５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベート可能である。１時間および７時間のインキュベーション後、非接着細胞画分を取り除き、接着細胞をさらに、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を添加した１％ ヒト血漿培地中で培養した。インキュベーション期間の第３日に、新鮮な培地（４００Ｕ／ｍｌでＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍｌでＩＬ−４を含む）を加える。第４日または第５日に、非接着細胞を回収し、計数し、０．３〜０．５×１０５細胞／ｍｌの密度で、新しいディッシュに移す。最終成熟化工程のために、１％ヒト血漿培地に、ＴＮＦ−α（１．２５ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（４０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）、プロスタグランジンＥ２（０．５ｐｇ／ｍｌ、たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）を加える。あるいは、最終成熟化工程のために、成熟化カクテルには、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）が含まれる。第８日に、細胞をＦＡＣＳによって解析可能である。本方法によって成熟した細胞は、正常に成熟したＤＣと比較した時に、ＣＤ８０の細胞表面発現における明確な減少（たとえば９６％から６６％）、およびＣＤ８３の細胞表面発現における明確な減少（たとえば、９６％から３０％）、およびＣＤ１４陽性細胞の増加を示している（たとえば、ＷＯ２００４／０４６１８２を参照のこと）。他の細胞表面マーカー（たとえばＭＨＣクラスＩおよびＩＩ）の発現は有意に影響を受けえない。他の実施形態において、細胞を、以上で記述したようなプロトコルにしたがって成熟化可能であるが、可溶性ＣＤ８３を、１、２、３またはそれ以上の日数後に成熟化カクテルに加えることができる。
【００８３】
ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）に暴露した樹状細胞を、それらの寛容誘導性または免疫刺激性特性を評価するための種々の方法において、ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物に暴露しなかった樹状細胞と比較可能である。適切なアッセイが当該技術分野で既知であり（たとえばＭＬＲアッセイ）、いくつかを、実験の項目でも記述している。ＭＬＲアッセイの典型的な特徴は、免疫刺激性ＤＣおよび増殖Ｔ細胞のクラスターの形成である。アッセイの１日目での可溶性ＣＤ８３の添加が、典型的な細胞クラスター形成を強力に阻害する（たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）。さらに、可溶性ＣＤ８３は、成熟樹状細胞のＴ細胞増殖を刺激する能力を、濃度依存的に阻害する（たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１），上記を参照のこと）。
【００８４】
いくつかの実施形態において、寛容誘導性樹状細胞を、制御性Ｔ細胞を産生するために使用する（たとえば、米国特許出願第１０／６６１，８０４号を参照のこと）。簡単に記すと、制御性Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む集団から産生してよい。これらのＴ細胞集団は、被験体から単離してよく、または培養してよい。たとえば、特定の細胞（たとえばＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞）の濃縮集団を含むように、細胞表面マーカーによって分類した集団のような、Ｔ細胞の亜集団も使用してよい。ついでＴ細胞を、本発明の寛容誘導性樹状細胞とともに、すなわちたとえば成熟化過程の間にｓＣＤ８３および少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物に暴露した樹状細胞とともに、培養またはインキュベートする。制御性Ｔ細胞をインビトロにおいて産生している場合、寛容誘導性樹状細胞はＴ細胞と同種異系であるか、または同系であってよい。いくつかの実施形態において、寛容誘導性ＤＣに、抗原を取り込ませる（たとえば抗原でパルスするか、または抗原コードＲＮＡでトランスフェクトする）。そのような実施形態において、寛容誘導性ＤＣは、Ｔ細胞に対して抗原を提示してよい。
【００８５】
寛容誘導性Ｔ細胞の産生の間、Ｔ細胞を、１回または２回以上、寛容誘導性ＤＣに暴露してよく、および／または寛容誘導性ＤＣとともに培養してよい。たとえば、Ｔ細胞を、数日間または数週間、ＤＣとともに培養してよく、必要であれば混合培養液中のＤＣを補充してよい。いくつかの実施形態において、培養を、治療量の制御性Ｔ細胞が得られるまで続ける。他の培養技術および／または添加物を使用して、得られる結果を改善してよく、たとえば培養培地には、ＩＬ−２のようなサイトカインが含まれてもよい。
【００８６】
一般に、制御性Ｔ細胞は、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βを分泌し（たとえばＷａｌｓｈら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１３９８−１４０３を参照のこと）、これらのサイトカインの分泌を確かめるためのアッセイが、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、制御性Ｔ細胞は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％または１００％、混合リンパ球反応を阻害する。混合リンパ球反応アッセイは、当該技術分野でよく知られている。本発明の制御性Ｔ細胞は、抗原特異的である。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は一般に、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を含む特徴的な細胞表面マーカーを発現し、細胞表面マーカーに対するアッセイが、当該技術分野でよく知られている。
【００８７】
用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、またはポリヌクレオチドの挿入または組み込みによって操作可能な、当該技術分野で既知の他の担体を意味する。そのようなベクターは、遺伝子操作のために使用可能であり（すなわち「クローニングベクター」）、または挿入されたポリヌクレオチドを複写および／または翻訳するために使用可能である（「発現ベクター」）。ベクターは一般に、細胞内での増殖のための複製起点とプロモーターとを少なくとも含む。本明細書に記載するような発現制御因子を含む、発現ベクター内に存在する制御因子が、適切な転写および翻訳を促進するために含まれる（たとえば、イントロンのためのスプライシングシグナル、インフレームでのｍＲＮＡの翻訳を許可するための、遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、終止コドンなど）。本明細書で使用するところの用語「制御因子」には、最低限、１つまたはそれ以上の、その存在が発現に影響を与えうる成分が含まれ、本明細書で使用するところの用語「発現制御因子」は、操作可能に連結する核酸配列の発現を調節する１つまたはそれ以上の核酸配列を意味する。核酸配列に操作可能に連結した発現制御因子は、転写を制御し、必要に応じて、核酸配列の翻訳を制御する。したがって、発現制御因子には、必要に応じて、タンパク質コード遺伝子の前に、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子、および／または開始コドン（たとえばＡＴＧ）が含まれうる。ベクターはまた、たとえばリーダー配列および融合タンパク質配列のようなさらなる成分を含みうる。「操作可能に連結」は、成分が、それらの意図するように機能することを可能にする関係にある、並列位置を意味する。
【００８８】
「プロモーター」は、転写を指向するのに十分な、少なくとも最小配列を意味する。本発明において使用されるプロモーター、または本発明とともに使用されるプロモーターは、必要に応じて、構成的であるか、誘導可能である（たとえばＢｉｔｔｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４を参照のこと）。誘導性プロモーターは、外部シグナルまたは薬剤によって活性化される。他のプロモーター要素には、特定の細胞型、組織または生理学的状態に対する、プロモーター依存性遺伝子発現の制御を提供するのに十分であるものが含まれてよく、そのような要素は、遺伝子の５’、３’またはイントロン領域内に局在しうる。有用なプロモーターにはまた、特定の条件下でのみ活性である「条件付けプロモーター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」も含まれる。たとえば、条件付けプロモーターは、特定の薬剤（たとえば化合物）が存在する時、不活性であるか、または抑制されてよく、薬剤がもはや存在しないときに活性であるか、活性化される可能性がある。
【００８９】
本明細書で使用するところの、「トランスフェクトすること」または「トランスフェクション」は、真核細胞内への１つ以上の外来性核酸またはポリヌクレオチドの導入を意味する。トランスフェクションには、核酸またはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現可能である様式での導入が含まれる。トランスフェクション法は当該技術分野で既知であり、エレクトロポレーション、タンパク質に基づく核酸送達複合体、脂質に基づく核酸送達複合体、およびカチオン性イオンに基づく核酸送達複合体を使用する方法、ウイルスベクター、「遺伝子ガン」送達、および種々の他の技術のような、種々の技術が含まれる。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞（たとえばＤＣ）内に導入したポリヌクレオチドは、細胞を遺伝子操作はせず、安定に維持されない。用語「遺伝子操作された」または「形質転換された」は、外来遺伝子、または言い換えれば次々に細胞またはその子孫の遺伝子型を改変する核酸配列を含むこと、および／または発現することを意味し、いくつかの実施形態において、細胞の表現型がまた変化する。「遺伝子操作」または「形質転換」はまた、細胞の内因性ヌクレオチドへの任意の付加、欠失または破壊をも意味する。導入したポリヌクレオチドの安定的な維持は典型的に、ポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合可能な複製起点を持つか、または染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）または核染色体またはミトコンドリア染色体のような細胞のレプリコンへ統合されるかのいずれかであることを必要とする。
【００９１】
用語「一過性にトランスフェクトした」は、トランスフェクトされたが、遺伝子操作されていない細胞のことであって、したがってその細胞の子孫が、形質導入された遺伝物質（たとえば核酸またはポリヌクレオチド）を遺伝しない細胞を意味する。遺伝物質は、ＲＮＡであってよく、またはＲＮＡに転写されてよく、遺伝物質によってコードされるタンパク質が発現されてよい。そのような発現を、本明細書で「一過性発現」と呼ぶ。通常、一過性発現は、トランスフェクトされた遺伝物質を染色体内に取り込まないことによって達成される。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態において、樹状細胞を、ＲＮＡエレクトロポレーションを用いて、一過性にトランスフェクトする。ＲＮＡエレクトロポレーションの方法は、当該技術分野でよく知られている。一般に、ｍＲＮＡは、染色体または染色体外のいずれにおいても、細胞のゲノムの恒久的一部分とはならない。所望のタンパク質を一過性に発現するために使用可能な任意の他の方法もまた、本発明の範囲内で企図される。この方法には、ゲノムの恒久的な変化が含まれず（すなわち、細胞に対して遺伝可能な遺伝的変化をもたらさない）、したがって、たとえばレトロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルスの使用と関連した不利益を回避する。
【００９３】
所望であれば、ＤＮＡでの細胞の形質転換を、当業者に既知の従来の技術によって実施してよい。たとえば、細胞が真核生物の場合、ＤＮＡ形質転換の方法には、たとえば、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム中に含まれるプラスミドの挿入、およびウイルスベクターのような従来の機械的手段が含まれる。真核細胞をまた、対象とする核酸をコードするＤＮＡ配列、および／または本明細書に記載したもののような選択可能表現型をコードする第二の外来ＤＮＡと同時形質転換可能でもある。別の方法は、真核細胞を一過性に感染させるか、形質転換して、タンパク質を発現させるための、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスのような、真核ウイルスベクターを使用することである。形質転換に続いて、ＣＤ８３を従来の方法にしたがって、単離し、精製してよい。たとえば、発現宿主（たとえば細菌）から調製した溶解物を、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィまたは他の精製技術を用いて精製可能である。実質的に純粋なタンパク質をまた、ペプチド合成機（たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）など）を用いる、化学合成によって得ることもできる。ＣＤ８３はまた、本明細書以下の実験の項目にて記述したように産生してもよい。
【００９４】
ＣＤ８３と、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、または少なくとも１つの本発明にしたがった治療用組成物を含む、医薬品または薬学的組成物の生産、およびそのような医薬品または薬学的組成物の使用は、一般的な薬学的技術方法によって慣習的な様式で発生し、したがって当業者によって簡単に提供される。当業者は、異なる形態の投与が、異なる化合物および／または適応症に対して好適であることを理解し、もっとも適切な投与方法を選択可能である。たとえば、乾癬は、皮膚への投与のために好適な製剤で、局所で治療してよく、一方で全身性エリテマトーデスは、腹腔内注射のための好適な製剤の、被験体への投与によって治療してよい。当業者は、生化学的および免疫学的アッセイを含む、たとえば従来の臨床および実験室試験からの結果の評価のような、化合物の用量および投与の調節のための基準ならびに方法に詳しい。必要に応じて、医薬品の成分を別々に投与可能である。
【００９５】
一般に、本発明の化合物は、種々の適応症および種々の型の投与経路に対して好適な医療用形態を提供するために、好適な、薬学的に許容可能なアジュバントおよび／または担体と一緒に処理される。好適な薬学的組成物にはまた、安定化剤および保存剤が含まれうる。担体、安定化剤およびアジュバントの例に関して、たとえばＧｅｎｎａｒｏ（１９９５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．）を参照のこと。したがって、医薬品は、たとえば、迅速な投与効果または徐放性効果のような、それぞれの望まれる放出速度を得るように生産可能である。
【００９６】
本発明によって提供された治療の方法には、インビボで被験体における寛容性および／または免疫抑制を誘導するための、ＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、および任意に治療用組成物（たとえば抗原）の使用が含まれる。これらの物質を被験体に投与する方法には、限定はされないが、たとえば、経口、経肺、非経口（たとえば筋肉内、関節内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）、吸引（微細な粉末処方または微細なミスト（エアロゾル）による）、経皮、皮内、経鼻、経膣、経直腸、舌下投与経路のような、従来の生理学的に許容可能な経路が含まれる。これらの物質（すなわちＣＤ８３、少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物、および任意に治療用組成物）は、担体と一緒に投与してよく、これらは、同一の製剤内で、同一の投与経路を介して投与してよく、または異なる製剤で、および／若しくは異なる投与経路を介して投与してよい。好ましくは、各物質を、その最適用量にて、同時投与の最適な治療効果が得られるように、投与する。たとえば、抗体の投与は、静脈内注射経由であってよく、一方でＣＤ８３の投与は、腹腔内注射であってよく、免疫抑制性化合物の投与はピルでの経口投与によるものであってよい。
【００９７】
担体には、任意の好適な生理学的溶液または分散剤などが含まれる。生理学的溶液には、生理食塩水または緩衝生理食塩水のような、任意の許容可能な溶液または分散培地が含まれる。担体にはまた、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸着遅延薬剤なども含まれてよい。任意の従来の培地、担体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いて、その使用が企図されている。担体にはさらに、限定はされないが、たとえばインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびＴＧＦ−βのようなサイトカインを含む、１つまたはそれ以上のさらなる化合物が含まれる。
【００９８】
薬学的組成物が、特定の動物種への投与のための核酸を含む場合、本発明において使用される核酸は、その種に由来してよい。たとえば、ＣＤ８３をコードする核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む薬学的組成物をヒトに投与する場合、核酸には、ヒト型のＣＤ８３タンパク質の配列が含まれてよい。本発明において使用される核酸は、核酸の細胞膜透過性および／または細胞取り込みを増加させる薬剤との組合せで投与可能である。これらの薬剤の例は、たとえばＡｎｔｏｎｙら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１０７７５−１０７８４に記載されたようなポリアミン；たとえばＥｓｃｒｉｏｕら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６８：２７６−２８８によって記載されたような分岐ポリアミン；たとえばＧｕｙ−Ｃａｆｆｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３１３９１−３１３９６によって記載されたポリアミノ脂質；Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７によって記載されたようなＤＯＴＭＡ；およびＢｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（２３）：５３１０−５３１７によって記載されたようなカチオン性ポルフィリンがあげられる。
【００９９】
本発明によって提供された組成物、医薬品および治療方法にはまた、本発明の方法にしたがって産生された寛容誘導性ＤＣおよび／または制御性Ｔ細胞と、インビボで被験体の寛容性を誘導するためのそれらの使用も含まれる。本発明の寛容誘導性ＤＣおよび制御性Ｔ細胞の被験体への投与の方法には、限定はされないが、たとえば、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射のような、従来の生理学的に許容可能な経路が含まれる。本発明の細胞（すなわち、本発明の方法によって産生された寛容誘導性ＤＣおよび／または制御性Ｔ細胞）は、担体と一緒に投与してよい。そのような担体には、たとえば生理食塩水または緩衝生理食塩水のような、任意の好適な生理学的溶液または分散剤などが含まれる。担体にはまた、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸着遅延剤などが含まれてよい。任意の従来の培地、担体または薬剤が、活性成分（すなわち寛容誘導性ＤＣおよび／または制御性Ｔ細胞）と不適合である場合を除いて、組成物中でのその使用が企図される。
【０１００】
当業者によく知られているように、インビボで投与されるべき、本発明の細胞の用量は、宿主の種、年齢、体重および疾患状態を含む、種々のパラメータを参照して決定される。用量はまた、宿主内の標的とされる部位、たとえばドナーからの組織の移植の部位にもよる。たとえば、挿入組織の部位の直接標的化には、哺乳動物宿主の血流内への投与とは異なる用量が必要とされうる。用量は好ましくは、投与が効果的な結果を導くように選択され、これは、分子アッセイによって、または被験体における好適な症状をモニタすることによって、測定可能である。用量は、１回の投与あたり、少なくとも約１×１０４細胞〜少なくとも約１×１０９細胞の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、用量は、約５×１０５細胞〜約５×１０７細胞の範囲である。最大の治療効果を達成するために、いくつかの用量が必要とされうる。
【０１０１】
必要に応じて、本発明の細胞の予備投与もまた使用してよい。したがって、たとえば、細胞を移植組織の生存を延長するために使用すべき場合、移植レシピエント内への細胞の投与を、たとえば移植の１週間前など、移植の前に実施してよい。投与はまた、移植組織の受容または拒絶反応がないことを確かにするために、移植の時点、またはその後（たとえば移植の１〜２週間後、または臨床評価に基づいて必要である間）実施してもよい。必要に応じて、治療にはまた、本明細書にて記述した２つ以上の個々の治療が含まれてよく、したがって、たとえば、患者に対する一連の治療には、ｓＣＤ８３と少なくとも１つの他の免疫抑制性化合物との投与が含まれてよく、そして寛容誘導性ＤＣの投与も含まれてよい。
【０１０２】
本明細書で引用された各特許、特許出願、科学論文、書籍または書籍の見出しおよび他の参考文献は、そのすべてが、各個々の引用が特別にかつ個々に、参照によって組み込まれるべきことを示す場合と同程度まで、参照によって本明細書に組み込まれている。
【０１０３】
以下にて、本発明の種々の側面が、実施例によってより詳細に記述されている。しかしながら、本発明は、これらの実施例によって例示された実施形態のみに限定はされず、全体として、本出願においてより十分に記述されたような利点を提供する。
【実施例】
【０１０４】
実験
一般方法：
一般的な技術に関して、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｉｃｏら編（Ｗｉｌｅｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）を参照のこと。
【０１０５】
ウエスタンブロッティング／クマシーブルー染色：ｓＣＤ８３を評価するための典型的な手順は以下のとおりであった。ｓＣＤ８３の各試料に関して、１マイクログラムのｓＣＤ８３を、ランニング緩衝液および２マイクロリットルのβ−メルカプトエタノールとともに調製した。試料を１０分間、９６度で加熱し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルをクマシーブルーで直接染色するか、もしくは所望であれば、膜に移した。膜を、１／１０００ ＣＤ８３ ４Ｂ５モノクローナル一次抗体で、ついで１／２０，０００ヤギ抗−ラット二次抗体でプローブし、シグナルをＡｍｅｒｓｈａｍ化学発光試薬で展開した。
【０１０６】
霊長類混合リンパ球反応（「ＭＬＲ」）：ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配分離を用いて、２匹の異なるカニクイザルの血液試料から単離した。刺激細胞を、マイトマイシンＣまたは放射線処理で、非増殖性にした。刺激細胞および応答細胞を、３×１０５細胞／ウェルで播種し、滴定量のｓＣＤ８３で処理した。９６時間の時点で、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を培養液に加えた。細胞を１８〜２０時間後に回収し、Ｔ細胞増殖の量を測定するために解析した。
【０１０７】
ＴＮＦ−α、ＣＤ８６およびＣＣＲ５に対する染色：ＴＮＦ−α（細胞内）ならびにＣＤ８６およびＣＣＲ５（表面）に対する染色を以下のように実施した。全血試料を、カニクイザルより得て、ｓＣＤ８３とともに１２時間インキュベートした。試料を１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳと１００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−γで６時間刺激した。ＴＮＦ−αに対する細胞内染色を、市販のＦｉｘ／Ｐｅｒｍキットを用いて実施した。あるいは、ＣＤ８６およびＣＣＲ５に対する表面染色を、標準的な技術を用いて実施した。染色後、赤血球細胞を溶解させ、結果を、ＢＤ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析した。
【０１０８】
Ｂ細胞増殖プロトコル：マウス脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製し、赤血球細胞をＡＣＫ溶解緩衝液を用いて溶解させた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｉｃｏら編（Ｗｉｌｅｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）を参照のこと）。Ｂ細胞をＣＤ１９ ＭＡＣＳビーズを用いて精製し、１０５細胞／ウェルの純粋なＢ細胞を、滴定量のｓＣＤ８３とともに、３時間予備インキュベートした。ついでＢ細胞を２μｇ／ｍＬ ＬＰＳで刺激した。４８時間の時点で、１μＣｉの３Ｈ−チミジン／ウェルを培養液に加えた。細胞を１８〜２０時間後に回収して、Ｂ細胞増殖の量を測定した。
【０１０９】
インビトロ研究のための抗体産生プロトコル：ＩｇＭおよびＩｇＧ産生は以下のとおりであった。（Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの）２×１０６Ｂ細胞／ウェルの純粋な集団を、滴定濃度のｓＣＤ８３（１５〜９０μｇ／ｍＬ）の存在下、（抗体産生を誘導するために）２０μｇ／ｍＬのＬＰＳとともに培養した。上清を培養の７２時間後に回収し、上清中のＩｇＭとＩｇＧの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１１０】
アイソタイプ変換：（Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの）２×１０６Ｂ細胞／ウェルの純粋な集団を、以下の処理の１つで培養した：２０μｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＩｇＧ２ｂを誘導するため）、；２０μｇ／ｍＬ ＬＰＳ、８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４および１５０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−５（ＩｇＧ１を誘導するため）；または２０μｇ／ｍＬ ＬＰＳおよび１０００ Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−γ（ＩｇＧ２ａを誘導するため）。各処理のために、いくつかの細胞を、６０μｇ／ｍＬ ｓＣＤ８３とともに培養し、いくつかを未処理対照として設計した。細胞を７２時間後に回収し、簡単に酸洗浄をして、Ｆｃレセプター結合免疫グロブリンを除去した。ついで細胞を、表面ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをそれぞれ検出するために、以下のうちの１つを使用して染色した：抗−ＩｇＭ−ＦＩＴＣおよび抗−ＩｇＧ２ｂ−ＲＰＥ、抗−ＩｇＭ−ＦＩＴＣおよび抗−ＩｇＧ１−ＲＰＥ、または抗−ＩｇＭ−ＦＩＴＣおよび抗−ＩｇＧ２ａ−ＲＰＥ。
【０１１１】
エクスビボ研究のための抗体産生プロトコル：Ｂ細胞増殖：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、Ｃ３Ｈマウスからの異所性心臓同種移植片を与えた。マウスを未処理のままにするか、または腹腔内注射によって、１００μｇのｓＣＤ８３の１日用量で処理した。次いでマウスを、未処理マウスのおおよその平均生存期間であった８日目に屠殺した。Ｂ細胞をついでマウス脾臓より回収し、１０５Ｂ細胞／ウェルの純粋な集団を、細胞を刺激するために、２μｇ／ｍＬのＬＰＳとともに培養した（ｓＣＤ８３は加えない）。培養の４８時間後、３Ｈ−チミジンを加え、さらに１８〜２０時間の培養後、細胞を回収して、３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。
【０１１２】
ＩｇＭおよびＩｇＧの産生：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、Ｃ３Ｈマウスからの異所性心臓同種移植片を与えた。マウスを未処理のままにするか、または腹腔内注射による、１００μｇのｓＣＤ８３の１日用量で処理した。ついでマウスを、未処理マウスのおおよその平均生存期間であった８日目に屠殺した。Ｂ細胞をレシピエントマウスの脾臓から回収し、（抗体産生を誘導するため、ｓＣＤ８３を加えない）２×１０６Ｂ細胞／ウェルで、２０ｕｇ／ｍＬ ＬＰＳとともに培養した。培養の７２時間後、上清を回収し、ＩｇＭおよびＩｇＧ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１１３】
移植：マウス株の選択の手順および基準が当該技術分野で既知である。たとえば、Ｗａｎｇら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３８２３−３８３６を参照のこと。
実施例１
組換え可溶性ＣＤ８３の産生
細菌株およびプラスミド：ＧＳＴに融合した、ＣＤ８３の細胞外ドメイン（ｓＣＤ８３）をコードするｃＤＮＡを含むｐＧＥＸ２ＴｈＣＤ８３ｅｘｔのプラスミドを、ＩＰＴＧ誘導ｔａｃプロモーターの制御下にある、組換えＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔの産生のための発現ベクターとして使用した（たとえばＬｅｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２４：４４５−４５２を参照のこと）。ＧＳＴとｈＣＤ８３ｅｘｔとの間の連結におけるトロンビン開裂部位の設計のために、最終ｓＣＤ８３産物は、アミノ末端に、４つの余剰アミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）を持つ。
【０１１４】
ＧＳＴ−ｓＣＤ８３の培養：Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ博士によって提供された大腸菌産生株を、−８０℃にて凍結保存し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｍｐ）を含む、ＬＢ寒天プレート（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトンおよび１５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ寒天）上にストリーキングすることによって再活性化した。プレートを、約１５時間、３７℃にてインキュベートした。２、３の単離した単一コロニーを使用して、５０μｇ／ｍＬ Ａｍｐを含む６００ｍＬ ＬＢ培地に植菌した。培養液をついで、回転式振盪培養器上で、２００ｒｐｍで約１６時間、３７℃にてインキュベートした。（６００ｍＬまでの）種培養液を使用して、１〜１５リットルの実質容量の培養培地（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトン、および５ｇ／Ｌ グルコース）を含むバイオリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ＡＧ，Ｗｅｔｚｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に植菌した。細胞が、２．０±０．２ＯＤ６００の指定された細胞密度まで増殖したときに、培養液に、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ産生の誘導のために、０．５ｍＭ イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。５０μＬ／ＬでのＡｎｔｉｆｏａｍ ２８９（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）も、培養の間の過剰な発泡を避けるために培養液に加えた。エアレーションのために、バイオリアクターを、１．５ｖｖｍで、濾過滅菌した空気でパージした。培養液ｐＨを、ｐＨ電極（Ｉｎｇｏｌｄ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ｐＨコントローラー（Ｍｏｄｅｌ ｐＨ−４０，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）、および２つの蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＵＫ）の組合せを用いて、３Ｎ ＮＨ４ＯＨまたは３Ｎ Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、７．００±０．１５に維持した。誘導の後、バイオリアクターを、６時間、２８℃および６００〜６５０ｒｐｍで運転した。
【０１１５】
ｓＣＤ８３の後処理：培養後、細胞を、６０００×ｇおよび２℃での遠心によって回収し、重量を量り、後で使用するために−８０℃で保存した。典型的には、約２０ｇ湿潤細胞重量（ｗｃｗ）の細胞ペーストを、８〜１０ＯＤ６００の細胞密度を持つ培養液１リットルから得ることができたが、これは、１ｇ ｗｃｗが、４００〜５００ＯＤ６００ユニットとほぼ等価であることを意味する。ｈＣＤ８３ｅｘｔの精製のために溶解物を調製するために、０．０５ｇｗｃｗ／ｍＬでの細胞懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）中に、適切な量の凍結細胞ペーストを懸濁させることによって調製した。約２０〜２５ＯＤ６００での１００ｍＬの細胞懸濁液のバッチを、標準的なチップでの超音波処理装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、４分間、断続的に（０．５秒オン／０．５秒オフ）、超音波処理した。処理した細胞溶解物をついで、１５，０００×ｇおよび２℃で１５分間遠心し、細胞残骸を除去した。総可溶性タンパク質を含む上清を、タンパク質精製のための引き続くクロマトグラフィ処理の前に、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０１１６】
ＧＳＴアフィニティクロマトグラフィによってＧＳＴ−ＣＤ８３融合タンパク質を捕獲するために、上記で調製した溶解物１００ｍＬを、４ｍＬ／分の流速で、２０ｍＬ ＧＳＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）内にロードした。カラムに結合させる一方で、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合物を、インサイチュにおいて、１０Ｕ／ｍＬトロンビンで開裂させた（すなわち「カラム上開裂」。これを実施するために、ＧＳＴ−ｈＣＤ８３ｅｘｔ融合物と結合したＧＳＴｒａｐカラム内のＰＢＳ結合緩衝液を、カラム内への手動注入によって、同容量の１０Ｕ／ｍＬトロンビンを含む結合緩衝液で置換した。開裂は、約２．５時間、室温で実施し、主にトロンビンと夾雑したｈＣＤ８３ｅｘｔを含む、ＧＳＴｒａｐカラム中の大部分の液体を、１カラム容量の結合緩衝液を用いて押し出した。ＧＳＴ部位を残りの未消化ＧＳＴ−ｈＣＤ８３と一緒に、溶出緩衝液を用いて溶出した。カラム上開裂の良好な性能を維持するために、ＧＳＴｒａｐカラムを、１Ｍ ＮａＯＨおよび６Ｍ グアニジンＨＣｌで洗浄して、カラム内にトラップされた種々のタンパク質夾雑物を除去した。
【０１１７】
ＣＤ８３からトロンビンおよび他の夾雑タンパク質を除去するために、ポリッシング工程を実施した。ＨＰＬＣシステムも、本精製工程の実施のために使用することが可能であるが、強力なアニオン交換カラム（ＸＫ１６／２０中の３０ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えるＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ ＵＰＣ１０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を処理のために使用した。使用したローディング緩衝液および溶出緩衝液は、それぞれ、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）および１Ｍ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液であった。最初に、ＦＰＬＣシステムのアニオン交換カラムをローディング緩衝液で平衡化した。ついで、先に記載したＧＳＴｒａｐカラムから溶出したタンパク質溶液を、カラム内にロードした。ｈＣＤ８３ｅｘｔを含む画分を溶出し、プールし、高圧攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ、ＹＭ１０ディスク付きＭｏｄｅｌ ８０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｎａｄａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ Ｃａｎａｄａ）、または同様の限外濾過ユニットを用いる限外濾過で濃縮し、ついで−２０℃で保存した。本産物の蓄積を、蓄積量が、さらなるエンドトキシン除去のための処理に十分な量になるまで、毎日実施した。
【０１１８】
さらなるエンドトキシン除去のために、約１ｇの蓄積ｓＣＤ８３を、ポリッシング工程と同一の実験装置およびプロトコルを用いて、アニオン交換クロマトグラフィによって処理した。本処理工程のためのすべての緩衝液を、注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いて調製した。ｈＣＤ８３ｅｘｔを含む画分をプールし、高圧攪拌セルを用いる限外濾過で濃縮した。最後に、ＣＤ８３産物画分を、エンドトキシン除去のために、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）または同様の濾過ユニットを用いる濾過に供することができ、ついで濾過滅菌可能である。各産物の画分のエンドトキシンをアッセイした。
【０１１９】
解析プロトコル：培養液試料を、分光光度計（ＤＵ（登録商標）５２０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、ＯＤ６００における細胞密度を測定するために、生理食塩水で適切に希釈した。解析のための細胞抽出物の調製のために、４０ＯＤ６００ユニットの量の細胞（「ＯＤ６００×ｍＬ」と定義する）を、６０００×ｇ、２℃で１０分間遠心した。細胞ペレットを、３ｍＬ ＰＢＳ中で再懸濁させ、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）によって破壊し、ついで１５，０００×ｇ、２℃で１５分間遠心して、細胞残骸を除去した。細胞破壊はまた、他の物理的方法（たとえば超音波処理）または化学的方法を用いて引き起こしてよい。可溶性タンパク質を含む上清を、ＧＳＴアッセイおよびＳＤＳゲルのために使用した。不溶性タンパク質と細胞残骸を含むペレットを、リン酸緩衝液で洗浄し、ＴＥ／ＳＤＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で再懸濁させ、１００℃まで５分間加熱して溶解させた。ペレットのタンパク質分を、不溶性画分として解析した。
【０１２０】
ＧＳＴ機能を、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）およびグルタチオンを用いて、室温でアッセイした。ＧＳＴ（およびその融合物）は、２つの基質間の反応を触媒して、３４０ｎｍにおいて検出可能な共役産物を形成する。１ユニット（ＵＧＳＴ）は、１ ＯＤ３４０／分での吸収の増加を引き起こす酵素の量として定義される。（ＵＧＳＴ／ｍＬでの）容積活性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、（ＵＧＳＴ／ＯＤ６００ユニットでの）特定の活性と（ＯＤ６００での）細胞密度との積である。エンドトキシンは、市販のアッセイキット（ＬＡＬ ＱＣＬ−１０００，Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いてアッセイし、容積エンドトキシン濃度（ＥＵ／ｍＬ）は、（ＥＵ／ｍｇでの）特定のエンドトキシン濃度と（ｍｇ／ｍＬでの）タンパク質濃度との積である。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、４％ポリアクリルアミド濃縮ゲルによって濃縮し、１２．５％ポリアクリルアミド分離ゲルを用いて、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＩＩ電気泳動セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で実施した。細胞抽出物のタンパク質試料（０．１２ＯＤ６００ユニットの可溶性および不溶性画分の両方）と、適切な量の精製した産物をロードした。電気泳動を、約４５分間、２００Ｖの一定の電圧で実施した。ゲルをクマシーブルーまたは硝酸銀で染色し、乾燥させ、スキャンして、処理試料からのエンドトキシンの除去を確認した。精製したタンパク質を、−２０℃または−８０℃のいずれかで、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．５）中で凍結し、保存した。
実施例２
可溶性ＣＤ８３は、自己免疫疾患のマウスモデルにおいて、広範囲の免疫抑制を誘導しない
実験的自己免疫疾患脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）が、罹患した組織の高密度自己攻撃性ＣＤ４＋リンパ球浸潤を含む、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）と、病理学的特徴を共有する疾患である、多発性硬化症の動物モデルとしての役割を果たす。可溶性ＣＤ８３は、ＥＡＥの誘導の結果生じる麻痺を軽減可能であることが報告された（たとえば、Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１を参照のこと）。本発明者らは、このマウス疾患モデルに関して、ＣＤ８３によって誘導される免疫抑制が、特異的であるかどうか、または広範囲の免疫抑制であるかどうかを決定することを希望した。
【０１２１】
ＥＡＥを誘導するために、マウスを、中枢神経系のミエリン鞘周辺ニューロンの構成物である、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）に由来するペプチド、および百日咳毒素で免疫した（たとえば、Ｚｉｎｓｅｒら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：３４５−３５１を参照のこと）。１０日後に開始して、マウスに、１０日間毎日、可溶性ＣＤ８３（１００μｇ）を接種した。可溶性ＣＤ８３の最後の注射から２８日後に、マウスに、キーホールリンペットヘモシアニン（「ＫＬＨ」、１０μｇ／マウス）を皮下注射した。１０日後、脾臓細胞をマウスより採取し、異なる用量のＫＬＨで再刺激した。本刺激に応答したリンパ球増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。（図１に示した）結果は、これらのマウスからのリンパ球が、ＫＬＨに応答して増殖することを明らかにしており、動物が免疫コンピテントであること、および可溶性ＣＤ８３が、長期間続く広範囲の免疫抑制を誘導しなかったことを示す。
実施例３
ＣＤ８３の有効性の時間枠の終点の特性化
被験体が投与した別の抗原に対して寛容化しうる、ＣＤ８３の投与後の時間間隔を決定するために、マウスを評価した。可溶性ＣＤ８３（１００μｇ）を、２日ごとに１０回、注射によってＣＢＡマウスに投与した。１１日後、処理した動物を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、１０μｇ）で免疫した。１０日後、脾臓細胞を採取し、再刺激アッセイを、その内容が参照によって組み込まれている、ＷＯ２００４／０４６１８２に記載のように実施した。（図２に示した）結果によって、この免疫付与間隔で、被験体は抗原に対して寛容化されないことが明らかにされた。
【０１２２】
別の同様の実験を、脾臓細胞を処置した動物から２２日後に採取し、再刺激アッセイによって評価して実施した。これらの結果は、先に記載したものと同様であり、図３に示す。
実施例４
マウス骨髄前駆細胞からの、寛容誘導性ＤＣの産生
Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびＢＡＬＢ／Ｃマウス（オスまたはメス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｇａ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１〜４月齢で使用した。骨髄由来樹状細胞（「ＢＭ−ＤＣ」）の産生を、Ｌｕｔｚら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２３：７７に記載のとおりに実施した。ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ ＭＥ（Ｓｉｇｍａ）、および１０％熱不活性化濾過ＦＣＳ（ＰＡＡ，Ｃｏｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。ＧＭ−ＣＳＦを、２００Ｕ／ｍｌ（ＰｒｅｐｏＴｅｃｈ／Ｔｅｂｕ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）で、インキュベーション期間の第０、３、６および８日に使用した。
【０１２３】
同種異系ＭＬＲアッセイを以下のように実施した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの鼠径部リンパ節および間葉性リンパ節から単離し、ＢＭ−ＤＣのための調製プロトコルの第９日まで処理した（異なる割合の）ＢＭ−ＤＣと一緒に３日間、同時培養した（２×１０５細胞／ウェル）。培養液は９６−ウェル培養ディッシュ中であり、培地は、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌ ＭＥ、および１０％熱不活性化濾過ＦＣＳを添加した、２００マイクロリットル ＲＰＭＩ １６４０であった。細胞を［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で１６時間パルスした。培養液上清を、Ｉｎｏｔｅｃｈ １Ｈ−１１０回収器（Ｉｎｏｔｅｃｈ，Ｄｏｔｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてガラスファイバーフィルター上に回収し、フィルターを、Ｗａｌｌａｃ １４５０マイクロプレート計数機（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ）中で計数した。
【０１２４】
同種異系ＭＬＲアッセイの結果によって、マウス免疫刺激性樹状細胞およびマウスＴ細胞間のクラスターの形成が、可溶性ＣＤ８３（ここでは、ｈＣＤ８３ｅｘｔ）によって阻害されたことが示された。さらに、可溶性ＣＤ８３は、濃度依存的に、マウスの免疫刺激性樹状細胞の、Ｔ細胞を刺激する能力を阻害し、Ｔ細胞は、ＤＣへの暴露に応答して増殖しなかった。
実施例５
ｓＣＤ８３は、Ｂ細胞増殖と機能をエクスビボで抑制する
ｓＣＤ８３のＢ細胞に対する効果を、以下のように、一連の実験において測定した。
【０１２５】
移植レシピエントＢ細胞の増殖に対する、エクスビボでのｓＣＤ８３の効果：Ｃ３Ｈマウスの心臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内へ移植した。移植の８日後（未処理マウスにおいて、移植片が典型的に拒絶されうる時）に、マウスを屠殺した。Ｂ細胞をレシピエントマウスから精製し、培養し、ＬＰＳで刺激した。３Ｈ−チミジン取り込みを、計数／分（ｃｐｍ）として測定した。結果を図４に示しており、ｓＣＤ８３が、エクスビボＢ細胞増殖を抑制することが明らかにされている。
【０１２６】
Ｂ細胞によるエクスビボ抗体産生に対するｓＣＤ８３の効果：Ｃ３Ｈマウスの心臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に移植した。移植の８日後（未処理マウスにおいて、移植片が典型的に拒絶されうる時）に、マウスを屠殺した。Ｂ細胞をレシピエントマウスから精製し、培養し、ＬＰＳで刺激した。培養の７２時間後、上清を回収し、ＩｇＭおよびＩｇＧの産生を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を図５に示しており、ｓＣＤ８３が、エクスビボ抗体産生を抑制することが明らかにされている。
実施例６
シクロスポリン、タクロリムス、またはＭＭＦと同時投与したｓＣＤ８３は、同種移植片移植レシピエントにおける心臓移植片の生着を増加させる
心臓を、示したようにドナーマウスから採取し、レシピエントマウスの腹腔内に移植した（すなわち、腹腔内、異所性心臓移植）。いくつかの処理を移植の前に開始して、レシピエントマウスを示したように処理した。移植組織の平均生着期間を、各処理に関して測定した。
【０１２７】
Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスおよびＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスを使用した。各処理群に対する、移植組織の処理および生着は、表１に示したとおりである。この一連の実験において、ｓＣＤ８３での処理を、「−１日目」（すなわち移植の日の前日）〜７日目まで、１００μｇのｓＣＤ８３の毎日の腹腔内注射で開始し、ついで２８日目まで、２日ごと注射を続けた。本出願において、「−１日目」は、「０日目」と呼ばれる移植の前日を一般に意味する。シクロスポリンでの処理は、治療量未満の用量（５ｍｇ／ｋｇ／日）、または高用量（１５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで、毎日の皮下注射によってであった。タクロリムスでの処理は、８ｍｇ／ｋｇ／日の治療量未満の用量の、毎日の経口投与によってであり、ＭＭＦでの処理は、８０ｍｇ／ｋｇ／日の低用量の毎日の経口投与によってであった。その結果によって、シクロスポリン、タクロリムス、またはＭＭＦと同時投与したｓＣＤ８３が、同種移植片移植レシピエントにおける心臓移植片の生着を増加させたことが明らかにされる。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
さらなる実験において、移植レシピエントを、より短い投与コース、および異なる投与経路で処理した。マウスを、一般に上述したように処理し、心臓をＣ５７ＢＬ／６ドナーマウスから採取し、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの腹腔内に移植した。１００μｇ／マウス／日の用量での可溶性ＣＤ８３と、１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのシクロスポリンを、−１日目〜７日目に、レシピエントマウスに静脈内に投与した。移植組織の平均生着期間は、１００日を超えた。
実施例７
ｓＣＤ８３は、移植レシピエントにおいて、アロ抗体誘導を阻害する
組織非適合個体間の組織の移植は、移植拒絶を刺激する。拒絶過程には、免疫応答の細胞性の応答および体液性の応答の両方が含まれうる。移植された器官の急性拒絶は、ドナー特異的アロ抗原（すなわち外来組織適合抗原）に対して指向される抗体応答によって媒介されうる。あるいは、アロ抗体応答は、細胞媒介性応答によって促進されたドナー組織破壊の結果として誘導されうる。いずれの場合でも、レシピエントにおけるアロ抗体応答の存在は、典型的にはドナー由来脾臓細胞を染色することによって、ドナー由来細胞に結合可能なレシピエント血清中の抗体の力価を測定することによって検出可能である。ｓＣＤ８３が、移植実験において、移植片の生着期間を増加させたので、本発明者らは、ｓＣＤ８３が、移植レシピエントにおけるアロ抗体の誘導に影響を与えたかどうかを決定することを希望した。
【０１３０】
これらの実験において、血清を（対照処理個体、ｓＣＤ８３処理個体および無処理個体からの）移植レシピエントから回収した。脾臓細胞を、移植ドナー（単数または複数）から採取し、移植レシピエント血清とともにインキュベートした。アロ抗血清からの抗体の、移植ドナー脾臓細胞の表面への結合を、マウスＩｇＭおよびＩｇＧのＦｃ断片に対して特異的な抗体を用いて選択的にモニタした。本手順の利点は、Ｉｇが細胞外供給源（すなわちレシピエント血清）に由来する場合にのみＦｃ断片とアクセス可能であるので、ドナー細胞（たとえば、ドナー脾臓細胞集団内のＢ細胞）から受動的に発現したマウス抗体を測定しないことであり、ドナーＢ細胞の表面上のドナー由来ＩｇのＦｃ断片などが、Ｆｃレセプター内に組み込まれ、または細胞内に維持され、したがって、染色のために使用不可能である。染色細胞は、ＦＡＣＳを用いて解析可能である。
【０１３１】
移植手順において、心臓をＣ３Ｈマウスから採取し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス内に移植し、ついでこれをｓＣＤ８３で処理するか、または未処理のままにした。血清をＣ５７ＢＬ／６移植レシピエントから、移植の８日後（未処理マウスが移植を典型的に拒絶しうる（すなわち完全組織拒絶を示す）おおよその時間）に回収した。このレシピエント血清をついで、Ｃ３Ｈドナーからの脾臓細胞を染色するために使用し、アロ抗体結合を、抗ＩｇＧ Ｆｃ断片または抗ＩｇＭ Ｆｃ断片のいずれかに特異的なＦＩＴＣ共役抗体で検出した。その結果によって、ｓＣＤ８３で処置した移植レシピエントが、ナイーブマウス（すなわち移植を受けていないマウス）からの血清中のレベルと等価であった、低アロ抗体活性（すなわちＩｇＭまたはＩｇＧの低いドナー特異的結合）を持ったことが示された（図６を参照のこと）。Ｃ３Ｈ心臓移植を受け、そしてｓＣＤ８３で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスは、低いアロ抗体活性を持ち、これは、非移植ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに由来した血清と等価である。反対に、未処理であり、移植組織を拒絶した移植レシピエントは、対照におけるよりも有意に高いレベルで存在する検出可能なアロ抗体を有していた。未処理移植レシピエントからの血清はまた、対照のレベルを上回るＣ３Ｈ−ドナー由来脾臓細胞を染色可能であった。これらの実験によって、ｓＣＤ８３が、外来抗原（たとえば移植組織）に対するＢ細胞によるドナー特異的抗体産生を抑制し、器官拒絶を予防可能であることが明らかにされる。
実施例８
シロリムスおよびＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂと同時投与したｓＣＤ８３は、同種移植片移植レシピエントにおける、長期の心臓移植片の生着率を達成する
心臓を、示したようにドナーマウスから採取し、レシピエントマウスの腹腔内に移植した（すなわち異所性移植）。レシピエントマウスを示したように処理し、いくつかの処理を移植の前に開始した。同種移植片の生着をモニタし、以下のようにスコア化した。「Ａ」強く鼓動。「Ｂ」脈動の強度の穏やかな減少、「Ｃ」脈動の強度の顕著な減少、「Ｄ」心拍動の完全な停止。移植組織の平均生着期間を、各処理に関して測定した。
【０１３２】
最初の一連の実験において、Ｃ３ＨドナーマウスとＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスを使用した。各処理群に対する移植組織の処理および生着は、表２に示したとおりである。この一連の実験において、ｓＣＤ８３処理を−１日目（すなわち、移植の前日）に開始し、２８日目まで続け、各日、１００μｇのｓＣＤ８３を各マウスに、腹腔内注射によって投与した。シロリムス処理は０日目（すなわち移植の日）に開始し、１４日目まで続け、各日に、２ｍｇ／ｋｇのシロリムスを経口で各マウスに投与した。抗ＣＤ４５ＲＢ処理は０日目に開始し、１４日目まで続け、各日に、１００μｇの抗ＣＤ４５ＲＢ（ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を各マウスに静脈内投与した。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
さらなる一連の実験において、Ｃ３Ｈマウス心臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に移植した（結果を表３および図７に示している）。処理なしで、心臓移植片が、脈管炎、出血、血栓症およびＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞の浸潤によって特徴づけられる、急性細胞性および体液性拒絶によって、８．５±０．６日以内に拒絶された。高レベルのＩｇＧおよびＩｇＭも、移植組織内、ならびにレシピエントの血中で検出された。ｓＣＤ８３のみでの処理（すなわち、１日目〜７日目に毎日、ついで８日目〜１６日目に２日ごと（ｑ．ｏ．ｄ．）、マウスあたり１００μｇのｓＣＤ８３の腹腔内注射）が、急性拒絶の症状を減少させ、１０．７±１．５日まで、心臓移植片の生着を増加させ、４００μｇのｓＣＤ８３での同じ処理は、１５±１．０日まで、心臓移植片の生着を２倍にした。他の処理には、治療量未満の、抗ＣＤ４５ＲＢモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）（すなわち、１００μｇ／マウスの０日目〜１４日目の毎日の静脈内注射）、またはシロリムス（すなわち、２ｍｇ／ｋｇの０日目〜１４日目の毎日の経口投与（「ｐ．ｏ．」）」）が含まれた。これらの実験における治療量未満の用量は、相当するヒト用量に基づいた。
【０１３５】
思いがけなく、注射あたり１００μｇのより少ない用量でのｓＣＤ８３が、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂまたはシロリムスいずれかのこれらの治療量未満の用量と相乗的な効果を示し、ｓＣＤ８３との併用処理はさらに、それぞれ、３２±３．６日、および３９．３±４．７日まで、移植片生着を改善した。抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂとシロリムスとの併用処理は、５０．３±３．１日まで生着を増加させた。注目すべきことに、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂおよびシロリムスの両方との併用でのｓＣＤ８３が、急性拒絶を効果的に予防し、１００日を超える無期限の生着によって、移植片耐性を誘導した（ｐ＜０．０１ 対抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂおよびシロリムスの併用処理）。ｓＣＤ８３、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂ、およびシロリムスの併用で処理した（すなわち「三重処理」）マウスからの移植心臓を、手術後１００日目（「ＰＯＤ１００」）に試験し、血管障害なしで、正常の組織構造を示した。この実験によって、シロリムスと抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡＢとのｓＣＤ８３の同時投与を含む処理が、移植心臓組織の長期間の許容を誘導したことが明らかにされた。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
本発明は、操作の任意の特定の機構によって縛られない一方で、一般に、Ｃ３Ｈ組織のＢＡＬＢ／ｃマウスへの移植が、抗体媒介性拒絶のためのモデル系として考えられ、一方Ｃ３Ｈ組織のＣ５７ＢＬ／６マウスへの移植が、Ｔ細胞媒介性拒絶のためのモデル系として考えられる。ｓＣＤ８３のみでの処理、および他の物質と同時投与したｓＣＤ８３は、両方の系で移植片生着を改善し、これは、ｓＣＤ８３が、Ｂ細胞によって媒介される望ましくない免疫応答、ならびに、Ｔ細胞によって媒介されるものを抑制可能であることを明らかにする。言い換えれば、ｓＣＤ８３は、Ｃ３Ｈ対ＢＡＬＢ／ｃマウス心臓移植モデルにおける体液性移植片拒絶を抑制可能であり、そして、Ｃ３Ｈ対Ｃ５７ＢＬ／６マウス心臓移植モデルにおける急性細胞性移植片拒絶を抑制可能である。
【０１３８】
ｓＣＤ８３、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂ、およびシロリムスの三重処理を受けたレシピエントマウスをまた、寛容誘導性ＤＣ（すなわちＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｌｏｗＣＤ４０ｌｏｗＣＤ８６ｌｏｗＩＬ１２−細胞）、および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）の産生における、処理の効果を測定するために試験した。寛容誘導性ＤＣと制御性Ｔ細胞両方の量の増加が、手術後１００日目において試験したときに、これらのマウスで見られた（図８、図９および図１０に示したフローサイトメトリーの結果を参照のこと）。ＣＸＣＲ６マーカーが、未熟ＤＣの特徴であり、一方で、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ７マーカーが成熟ＤＣの特徴である。図９および図１０におけるアスタリスクは、ｐ＜０．０１で異なった結果を示している。したがって、これらの結果によって、ｓＣＤ８３に基づく治療が、寛容誘導性ＤＣおよび制御性Ｔ細胞の両方の産生を誘導したことが明らかになる。
実施例９
ｓＣＤ８３は、インビトロでのＴＮＦ−α産生と、ｍＤＣ活性化マーカーの表面発現を抑制する
本発明者らは、末梢血ＤＣ、単球およびＴ細胞に対するヒトｓＣＤ８３のインビトロでの機能的特性を試験することを希望した。カニクイザルからの成熟ＤＣ（「ｍＤＣ」）を、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、系列陰性（すなわちＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ１４およびＣＤ１６陰性）、およびＣＤ１１ｃ陽性であった細胞として、４色で染色するＦＡＣＳを用いて同定した。細胞内ＴＮＦ−α、ＩＬ−６および表面マーカーＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＣＲ５（活性化成熟ＤＣにおいて増加する）もモニタした。
【０１３９】
ｓＣＤ８３のｍＤＣに対する効果を評価するために、カニクイザルからの単離ＰＢＭＣ（１×１０６細胞）をｓＣＤ８３とともに一晩インキュベートした。細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で６時間刺激した。細胞内ＴＮＦ−αレベルおよび表面マーカーを、ＦＡＣＳを用いてｍＤＣ中で検出した。３つの実験のうちの１つの代表的な結果を、図１１に示しており、結果を、％陽性細胞と平均蛍光ユニット（ＭＦＵ）として表した。この結果によって、ｓＣＤ８３が、ｍＤＣによる、ＴＮＦ−αのインビトロ産生を抑制し、またｍＤＣ活性化マーカーＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＣＲ５およびＣＤ８０の表面発現を抑制したことが示される。
【０１４０】
単球におけるｓＣＤ８３の効果を評価するために、カニクイザルからの単離ＰＢＭＣ（１×１０６細胞）を一晩、ｓＣＤ８３（１×１０６細胞）とともにインキュベートした。細胞内ＴＮＦ−αレベルおよび表面マーカーを、ＦＡＣＳを用いて単球中で検出した。３つの実験のうちの１つの代表的な結果を、図１２に示しており、結果を、％陽性細胞と平均蛍光ユニット（ＭＦＵ）として表した。この結果によって、ｓＣＤ８３が、単球によるＴＮＦ−αのインビトロ産生を穏やかに抑制し、また単球活性化マーカーの表面発現を抑制したことが示される。
【０１４１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＤ８３の効果を評価するために、これらの細胞を、カニクイザルから精製し、ついで、ｓＣＤ８３または抗ＣＤ２８ ｍＡｂの存在下または非存在下で、６日間刺激した。ついで細胞を染色して、制御性Ｔ細胞（すなわちＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）を同定し、ＦＡＣＳによって解析した。（図１３に示した）結果によって、ｓＣＤ８３が制御性Ｔ細胞の産生を促進することが示唆される。
【０１４２】
制御性Ｔ細胞をまた、以下のようにカニクイザルから調製した樹状細胞を用いて調製した。カニクイザル骨髄樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下、７日間、ＣＤ１４＋単球細胞から産生し、５０ｕｇ／ｍｌでの可溶性ＣＤ８３を、３日目〜７日目に、いくつかの培養液に加え、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ−２の成熟化カクテルを５日目〜７日目に加えた。Ｔ細胞（１×１０６／ｍｌ）を、ネガティブ選択によって単離し、異なる比で、ｓＣＤ８３（５０μｇ／ｍｌ）で処理した、または処理していない同種成熟樹状細胞で刺激した。ついで細胞を染色して、制御性Ｔ細胞（すなわちＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞）を同定し、ＦＡＣＳによって解析した。（図１４に示した）結果によって、増加した制御性Ｔ細胞が、特に試験した高いＤＣ：Ｔ比で、可溶性ＣＤ８３で処理した樹状細胞によって産生されたことが示される。
実施例１０
インビトロでのＢ細胞増殖および機能のｓＣＤ８３抑制
インビトロでのＢ細胞増殖におけるｓＣＤ８３の効果の評価：Ｃ５７ＢＬ／６Ｂ細胞を、ｓＣＤ８３の存在下または非存在下で、ＬＰＳで刺激する。培養の４８時間後、３Ｈ−チミジン取り込みを、カウント／分（ｃｐｍ）として測定する。結果を、ｓＣＤ８３が、インビトロでのＢ細胞増殖を抑制するかどうかを決定するために評価する。
【０１４３】
Ｂ細胞によるＩｇＭおよびＩｇＧ産生におけるｓＣＤ８３の効果の評価：Ｃ５７ＢＬ／６Ｂ細胞を、ｓＣＤ８３の存在下または非存在下で、ＬＰＳで刺激する。培養の７２時間後、上清を回収し、ＩｇＭまたはＩｇＧ産生を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を、ｓＣＤ８３が、インビトロでのＢ細胞抗体産生を抑制するかどうかを決定するために評価する。
実施例１１
寛容誘導性樹状細胞の産生と、樹状細胞機能の評価
寛容誘導性樹状細胞は、以下のように産生可能である。グルタミン（２００μｇ／ｍｌ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および（５６℃にて３０分間インキュベートすることによって予め熱不活性化した）単一ドナーからの１％ ヒト血漿を添加した１％ ヒト血漿を含む標準培地（たとえばＲＰＭＩ１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて細胞を培養可能である。ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の沈殿によって軟膜から単離し、ＩｇＧ（コーン画分からの１０μｇ／ｍｌ γ−グロブリン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコートした１００ｍｍ培養ディッシュ上に播種し、５％ＣＯ２中３７℃においてインキュベート可能である。１時間および７時間のインキュベーション後、非接着細胞画分を除去し、接着細胞をさらに、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を含む１％ヒト血漿培地中でさらに培養する。インキュベーション期間の３日目に、（４００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む）新鮮な培地を加える。第４日または第５日に、非接着細胞を回収し、計数し、０．３〜０．５×１０５細胞／ｍｌの密度で、新しいディッシュ内に移した。最終成熟化工程のために、１％ヒト血漿培地に、ＴＮＦ−α（１．２５ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（４０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）、プロスタグランジンＥ２（０．５ｐｇ／ｍｌ、たとえば、Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１８１３−１８２１を参照のこと）、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）を加える。あるいは、最終成熟化工程のために、成熟化カクテルには、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、および可溶性ＣＤ８３（４μｇ／ｍｌ）が含まれる。８日目に、細胞をＦＡＣＳによって解析可能である。本方法によって成熟させた細胞によって、正常に成熟させたＤＣ（たとえばＷＯ２００４／０４６１８２）と比較した場合に、ＣＤ８０の細胞表面発現の明らかな減少（たとえば９６％から６６％）、およびＣＤ８３の細胞表面発現の明らかな減少（たとえば９６％から３０％）ならびに、ＣＤ１４陽性細胞の増加が明らかになる。他の細胞表面マーカー（たとえば、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ）の発現は、有意に影響を受け得ない。他の実施形態において、細胞を、先に記載したようなプロトコルにしたがって成熟化するが、可溶性ＣＤ８３および他の免疫抑制性化合物（単数または複数）を、１、２、３またはそれ以上の日数後（別々に、または一緒に、先に記載したように）、成熟化カクテルに加えることができる。
【０１４４】
樹状細胞を、以下のように、同種異系混合リンパ球反応（「ＭＬＲ」）アッセイを用いて評価してよい。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、軟膜から単離する。簡単に記すと、回収した非接着細胞画分を、ニューロアミダーゼ処理したヒツジ赤血球とともにインキュベートし、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心によって回収し、単一のＡＢドナーからの５％ヒト血清を含むＲＰＭＩ中で培養する。ついで細胞を、様々な比の成熟同種異系免疫刺激性ＤＣで刺激する。細胞を、様々な濃度の可溶性ＣＤ８３（ＷＯ２００４／０４６１８２に記載されたような「ｈＣＤ８３ｅｘｔ」）と、または対照としてＢＳＡ（ＢｉｏＲａｄ）とともにインキュベートするか、または処理しない。Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル）およびＤＣを、９６−ウェル細胞培養ディッシュ中、単一のＡＢドナーからの５％ヒト血清を添加したＲＰＭＩ中で、４日間同時培養する。細胞に、［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で１６時間パルスする。培養上清を、ＩＨ−１１０ハーベスター（Ｉｎｏｔｅｃｈ．Ｄｏｔｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてガラス繊維フィルター上に回収し、フィルターを、Ｗａｌｌａｃ １４５０マイクロプレートカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ）中で計数する。
実施例１２
種々の刺激に対する応答での、ＣＤ８３有効性の時間枠の終点の決定
マウスを、ＣＤ８３とＫＬＨの投与間の種々の間隔（すなわち１０日間、８日間、６日間、４日間、２日間、１日間）後のそれらの免疫応答に関して、本質的に実施例３に記載したように評価する。間隔は、ＫＬＨを用いる再刺激が、免疫応答を誘発しない間と定義し、この間隔は、本実験での感応性の時間枠の末端を記録する。
【０１４５】
被験体を、本質的に先に記載したように評価したが、他の免疫刺激を試験する。これらのプロトコルは、ＫＬＨ抗原に対する第三者の皮膚移植片を代用する。他のプロトコルは、ＣＤ８３での処理の間、および後（ＣＤ８３処理の前日、ＣＤ８３処理の次の日、ＣＤ８３処理の３日後）のリーシュマニア感染を代わりに用いる。他のプロトコルは、ＣＤ８３の投与の間、および後のＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）での感染を代わりに用いる。
実施例１３
ＣＤ８３に応答したメモリーＴ細胞再活性化の評価
マウスにＬＣＭＶを感染させ、２８日後にＣＤ８３を注射する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＦＮγおよびＩＬ−２を産生するが、標的細胞を殺さない、ＬＣＭＶ−特異的メモリーＴ細胞の存在に関して評価する。
実施例１４
制御性Ｔ細胞に対するＣＤ８３の効果の評価
抗原特異的Ｔ細胞を、インビトロで産生し、可溶性ＣＤ８３の存在下または非存在下で、樹状細胞に暴露する。ついで、Ｔ細胞について増殖（ＣＦＳＥ）、アポトーシス（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）、サイトカイン産生（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）、およびＦｏｘｐ３の存在をアッセイすることによって、ＣＤ８３の効果を評価する。適切なアッセイが当該技術分野で既知である。
【０１４６】
哺乳動物より、インビトロで培養および／またはアッセイ可能であるように、Ｔ細胞を単離する。ＰＢＭＣを、確立された手順にしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心を用いて、赤血球細胞および好中球から分離する。細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、改変ＡＩＭ−Ｖ（２ｍＭグルタミン、１０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＡＩＭ−Ｖ（ＧＩＢＣＯ）からなる）で洗浄する。Ｔ細胞を、標準的な手順にしたがって、カラムまたは磁気ビーズに結合した適切なモノクローナル抗体での、ネガティブまたはポジティブ選択によって濃縮する。細胞の分液を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ１４の発現を含む細胞表面発現系に関して解析する。
【０１４７】
場合によっては、細胞を洗浄し、上記のように改変した５％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌ組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）を含むＡＩＭ−Ｖ（添加ＡＩＭ−Ｖ）へ濃度あたり約５×１０５細胞で再懸濁する。Ｔ細胞をついで、ｓＣＤ８３の存在下または非存在下で、免疫刺激性および寛容誘導性樹状細胞に暴露可能である。
【０１４８】
増殖を刺激するために、ＯＫＴ３モノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで加えることができる。細胞を、２４ウェルプレート（０．５ｍｌの細胞懸濁液／ウェル）中にプレートし、５％ＣＯ２の湿潤インキュベーター中、約３７℃の温度で培養する。ＯＫＴ３抗体のような反応性組成物に応答したＴ細胞の増殖を、たとえば３Ｈ−チミジン取り込みを測定することによって定量的にモニタ可能である（たとえば、Ｃａｒｕｓｏら（１９９７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２７：７１を参照のこと）。
【０１４９】
樹状細胞に対する暴露の間および後の、Ｔ細胞によって分泌されたサイトカインの型および量の解析は、機能的活性の指標でありうる。サイトカインを、サイトカイン産生の速度と総量を測定するために、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定可能である。たとえば、Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：１８１、ＴａｎｑｕａｙおよびＫｉｌｌｉｏｎ（１９９４）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１３：２５９、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９を参照のこと。
実施例１５
ＣＤ８３で産生された制御性Ｔ細胞を用いる、免疫の養子伝達の評価
マウスを、１０μｇのＫＬＨで免疫する。ＣＤ８３（１００μｇ）を、ＫＬＨ免疫付与の前日、翌日、そして３日後に投与する。ＫＬＨ免疫付与の１０日後、脾臓細胞をこれらの動物から調製し、ナイーブマウスに移してその後ＫＬＨで免疫し、抗原に対する免疫応答に関してアッセイする。
実施例１６
寛容誘導性ＤＣを用いる、耐性の養子伝達
可溶性ＣＤ８３を含む成熟化工程で調製した寛容誘導性ＤＣを、実施例４に記載したように調製する。未熟ＤＣに、対象とする抗原、または対象とする抗原をコードする核酸を取り込ませる。これらのＤＣを被験体内に移し、抗原に対する被験体の免疫応答を評価する。
実施例１７
可溶性ＣＤ８３と移植器官の同時投与
腎臓移植を、非近交系、若年性カニクイザルにおいて実施し、各サルに、別のサルから採取した腎臓を与える。移植手順の間、レシピエントのサルに、３〜６ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、可溶性ＣＤ８３を、静脈内または腹腔内に注射する。投与は、毎日１回〜毎日４回の、２８日間である。対照のサルには、移植器官を与えるが、可溶性ＣＤ８３は与えない。移植手順の後、サルを、移植器官の生着と血液供給に関してモニタする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植組織ではない少なくとも１つの治療用組成物に対して被験体を寛容化する方法であって、該少なくとも１つの治療用組成物を、被験体にＣＤ８３とともに同時投与する工程を含む、治療用組成物前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの治療用組成物の少なくとも１用量および前記ＣＤ８３の少なくとも１用量を、互いに３日以内に被験体に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が自己免疫疾患を持ち、そして前記治療用組成物が該自己免疫疾患に関連した抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療用組成物が、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ８３をコードする核酸を被験体に導入することによって、前記ＣＤ８３を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用組成物が、対象とするポリペプチドであり、そして該ポリペプチドをコードする核酸を被験体に導入し、それによって該核酸が該ポリペプチドに翻訳されることによって該ポリペプチドを投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの治療用組成物に対して被験体を寛容化する方法であって、
（ａ）ＣＤ８３および前記少なくとも１つの治療用組成物にインビトロにおいて暴露した寛容誘導性樹状細胞を提供する工程、
（ｂ）Ｔ細胞の集団を、前記寛容誘導性樹状細胞に暴露する工程、および
（ｃ）前記被験体に、前記Ｔ細胞の集団を提供する工程治療用組成物
を含み、それによって前記被験体が、前記少なくとも１つの治療用組成物に対して寛容化される、前記方法。
【請求項８】
移植ドナーからの組織に対して、移植被験体を寛容化する方法であって、
（ａ）組織の採取の前に、移植ドナーにＣＤ８３を投与する工程、
（ｂ）移植被験体へ組織を挿入する工程、および
（ｃ）移植被験体へＣＤ８３を同時投与する工程
を含み、それによって移植被験体が組織に対して寛容化される、前記方法。
【請求項９】
第一の免疫抑制性化合物を、組織を採取する前に移植ドナーに投与する工程をさらに含み、ここで前記ＣＤ８３および該第一の免疫抑制性化合物が移植ドナーに同時投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シロリムスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二の免疫抑制性化合物を、組織を採取する前に移植ドナーに投与する工程をさらに含み、ここで前記ＣＤ８３および該第二の免疫抑制性化合物が移植ドナーに同時投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一の免疫抑制性化合物がシロリムスであり、前記第二の免疫抑制性化合物が抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
移植組織に対して被験体を寛容化する方法であって、
（ａ）移植ドナーから組織を採取する工程、
（ｂ）ｓＣＤ８３を含む溶液に、移植組織を暴露する工程、および
（ｃ）被験体に前記組織を移植し、それによってＣＤ８３を移植組織とともに被験体に同時投与する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
第一の免疫抑制性化合物を被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シロリムスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二の免疫抑制性化合物を被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の免疫抑制性化合物が、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
自己免疫疾患を発症するリスクを減少させる方法であって、
（ａ）自己免疫疾患を発症するリスクが増加した被験体を同定する工程、
（ｂ）ｓＣＤ８３と、自己免疫疾患の発症と関連した抗原とを前記患者に同時投与する工程
を含む、前記方法。
【請求項１９】
免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状を予防、治癒、または緩和するために、被験体を治療する方法であって、ＣＤ８３と第一の免疫抑制性化合物とを被験体に同時投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記第一の免疫抑制性化合物が、カルシニューリン阻害剤、プリン代謝阻害剤、および増殖阻害剤からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シクロスポリンおよびタクロリムスからなる群より選択される、カルシニューリン阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される増殖阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一の免疫抑制性化合物が、抗ＣＤ４５ＲＢであるモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一の免疫抑制性化合物が、ミコフェノール酸モフェチルであるプリン代謝阻害剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
第二の免疫抑制性化合物を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一の免疫抑制性化合物がシロリムスであり、前記第二の免疫抑制性化合物が抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ８３および前記第一の免疫抑制性化合物を、互いに３日以内に投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
治療用組成物を被験体へ投与する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療用組成物が移植組織である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が自己免疫疾患を患っている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ８３をコードする核酸を被験体に導入することによって、前記ＣＤ８３を投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体が移植レシピエントであり、そして前記治療用組成物が移植組織に関連した抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
移植される組織へＣＤ８３を移植前に投与する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
移植される組織へのＣＤ８３の前記投与が、移植レシピエントへの移植のために組織を採取する前に、移植ドナーへＣＤ８３を投与することによって実施される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの治療間隔の間、被験体を治療するために使用するシロリムスの量を減少させる方法であって、シロリムスとＣＤ８３とを被験体に同時投与し、それによって前記被験体に投与されたシロリムスの量を、前記少なくとも１つの治療間隔の間、添付文書において推奨された量よりも少なくする工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害について、Ｂ細胞枯渇を伴うことなく被験体を治療するための方法であって、Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害を患っているか、または発症する可能性のある被験体を同定する工程、および前記被験体にｓＣＤ８３を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３７】
治療用ポリペプチドに対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３と治療用ポリペプチドとを含む医薬品。
【請求項３８】
治療用ポリペプチドに対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３をコードする核酸と治療用ポリペプチドをコードする核酸とを含む医薬品。
【請求項３９】
治療用ポリペプチドに対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３と治療用ポリペプチドをコードする核酸とを含む医薬品。
【請求項４０】
治療用組成物に対する望まれない免疫応答を治療するための、移植組織ではない治療用組成物とＣＤ８３をコードする核酸とを含む治療用組成物医薬品。
【請求項４１】
移植組織に対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３と別の治療用組成物または別の免疫抑制性化合物とを含む、医薬品。
【請求項４２】
前記免疫抑制性化合物が、カルシニューリン阻害剤、プリン代謝阻害剤および増殖阻害剤からなる群より選択される、請求項４１に記載の医薬品。
【請求項４３】
前記免疫抑制性化合物が、シクロスポリンおよびタクロリムスからなる群より選択されるカルシニューリン阻害剤である、請求項４２に記載の医薬品。
【請求項４４】
前記免疫抑制性化合物が、シロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される増殖阻害剤である、請求項４２に記載の医薬品。
【請求項４５】
前記免疫抑制性化合物が、抗ＣＤ４５ＲＢであるモノクローナル抗体である、請求項４１に記載の医薬品。
【請求項４６】
前記免疫抑制性化合物が、ミコフェノール酸モフェチルであるプリン代謝阻害剤である、請求項４２に記載の医薬品。
【請求項４７】
第二の免疫抑制性化合物をさらに含む、請求項４１に記載の医薬品。
【請求項４８】
免疫抑制性化合物シロリムスと抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである第二の免疫抑制性化合物とを含む、請求項４７に記載の医薬品。
【請求項４９】
Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害を治療するための、ＣＤ８３を含む医薬品。
【請求項１】
移植組織ではない少なくとも１つの治療用組成物に対して被験体を寛容化する方法であって、該少なくとも１つの治療用組成物を、被験体にＣＤ８３とともに同時投与する工程を含む、治療用組成物前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの治療用組成物の少なくとも１用量および前記ＣＤ８３の少なくとも１用量を、互いに３日以内に被験体に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が自己免疫疾患を持ち、そして前記治療用組成物が該自己免疫疾患に関連した抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療用組成物が、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ８３をコードする核酸を被験体に導入することによって、前記ＣＤ８３を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用組成物が、対象とするポリペプチドであり、そして該ポリペプチドをコードする核酸を被験体に導入し、それによって該核酸が該ポリペプチドに翻訳されることによって該ポリペプチドを投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの治療用組成物に対して被験体を寛容化する方法であって、
（ａ）ＣＤ８３および前記少なくとも１つの治療用組成物にインビトロにおいて暴露した寛容誘導性樹状細胞を提供する工程、
（ｂ）Ｔ細胞の集団を、前記寛容誘導性樹状細胞に暴露する工程、および
（ｃ）前記被験体に、前記Ｔ細胞の集団を提供する工程治療用組成物
を含み、それによって前記被験体が、前記少なくとも１つの治療用組成物に対して寛容化される、前記方法。
【請求項８】
移植ドナーからの組織に対して、移植被験体を寛容化する方法であって、
（ａ）組織の採取の前に、移植ドナーにＣＤ８３を投与する工程、
（ｂ）移植被験体へ組織を挿入する工程、および
（ｃ）移植被験体へＣＤ８３を同時投与する工程
を含み、それによって移植被験体が組織に対して寛容化される、前記方法。
【請求項９】
第一の免疫抑制性化合物を、組織を採取する前に移植ドナーに投与する工程をさらに含み、ここで前記ＣＤ８３および該第一の免疫抑制性化合物が移植ドナーに同時投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シロリムスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二の免疫抑制性化合物を、組織を採取する前に移植ドナーに投与する工程をさらに含み、ここで前記ＣＤ８３および該第二の免疫抑制性化合物が移植ドナーに同時投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一の免疫抑制性化合物がシロリムスであり、前記第二の免疫抑制性化合物が抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
移植組織に対して被験体を寛容化する方法であって、
（ａ）移植ドナーから組織を採取する工程、
（ｂ）ｓＣＤ８３を含む溶液に、移植組織を暴露する工程、および
（ｃ）被験体に前記組織を移植し、それによってＣＤ８３を移植組織とともに被験体に同時投与する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
第一の免疫抑制性化合物を被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シロリムスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二の免疫抑制性化合物を被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の免疫抑制性化合物が、抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
自己免疫疾患を発症するリスクを減少させる方法であって、
（ａ）自己免疫疾患を発症するリスクが増加した被験体を同定する工程、
（ｂ）ｓＣＤ８３と、自己免疫疾患の発症と関連した抗原とを前記患者に同時投与する工程
を含む、前記方法。
【請求項１９】
免疫応答の不全または望ましくない機能によって引き起こされる疾患または障害の少なくとも１つの症状を予防、治癒、または緩和するために、被験体を治療する方法であって、ＣＤ８３と第一の免疫抑制性化合物とを被験体に同時投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記第一の免疫抑制性化合物が、カルシニューリン阻害剤、プリン代謝阻害剤、および増殖阻害剤からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シクロスポリンおよびタクロリムスからなる群より選択される、カルシニューリン阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の免疫抑制性化合物が、シロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される増殖阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一の免疫抑制性化合物が、抗ＣＤ４５ＲＢであるモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一の免疫抑制性化合物が、ミコフェノール酸モフェチルであるプリン代謝阻害剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
第二の免疫抑制性化合物を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一の免疫抑制性化合物がシロリムスであり、前記第二の免疫抑制性化合物が抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ８３および前記第一の免疫抑制性化合物を、互いに３日以内に投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
治療用組成物を被験体へ投与する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療用組成物が移植組織である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が自己免疫疾患を患っている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ８３をコードする核酸を被験体に導入することによって、前記ＣＤ８３を投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体が移植レシピエントであり、そして前記治療用組成物が移植組織に関連した抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
移植される組織へＣＤ８３を移植前に投与する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
移植される組織へのＣＤ８３の前記投与が、移植レシピエントへの移植のために組織を採取する前に、移植ドナーへＣＤ８３を投与することによって実施される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの治療間隔の間、被験体を治療するために使用するシロリムスの量を減少させる方法であって、シロリムスとＣＤ８３とを被験体に同時投与し、それによって前記被験体に投与されたシロリムスの量を、前記少なくとも１つの治療間隔の間、添付文書において推奨された量よりも少なくする工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害について、Ｂ細胞枯渇を伴うことなく被験体を治療するための方法であって、Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害を患っているか、または発症する可能性のある被験体を同定する工程、および前記被験体にｓＣＤ８３を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３７】
治療用ポリペプチドに対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３と治療用ポリペプチドとを含む医薬品。
【請求項３８】
治療用ポリペプチドに対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３をコードする核酸と治療用ポリペプチドをコードする核酸とを含む医薬品。
【請求項３９】
治療用ポリペプチドに対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３と治療用ポリペプチドをコードする核酸とを含む医薬品。
【請求項４０】
治療用組成物に対する望まれない免疫応答を治療するための、移植組織ではない治療用組成物とＣＤ８３をコードする核酸とを含む治療用組成物医薬品。
【請求項４１】
移植組織に対する望まれない免疫応答を治療するための、ＣＤ８３と別の治療用組成物または別の免疫抑制性化合物とを含む、医薬品。
【請求項４２】
前記免疫抑制性化合物が、カルシニューリン阻害剤、プリン代謝阻害剤および増殖阻害剤からなる群より選択される、請求項４１に記載の医薬品。
【請求項４３】
前記免疫抑制性化合物が、シクロスポリンおよびタクロリムスからなる群より選択されるカルシニューリン阻害剤である、請求項４２に記載の医薬品。
【請求項４４】
前記免疫抑制性化合物が、シロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される増殖阻害剤である、請求項４２に記載の医薬品。
【請求項４５】
前記免疫抑制性化合物が、抗ＣＤ４５ＲＢであるモノクローナル抗体である、請求項４１に記載の医薬品。
【請求項４６】
前記免疫抑制性化合物が、ミコフェノール酸モフェチルであるプリン代謝阻害剤である、請求項４２に記載の医薬品。
【請求項４７】
第二の免疫抑制性化合物をさらに含む、請求項４１に記載の医薬品。
【請求項４８】
免疫抑制性化合物シロリムスと抗ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂである第二の免疫抑制性化合物とを含む、請求項４７に記載の医薬品。
【請求項４９】
Ｂ細胞またはＢ細胞機能が関与する疾患または障害を治療するための、ＣＤ８３を含む医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５０１５５６（Ｐ２０１０−５０１５５６Ａ）
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２５５６３（Ｐ２００９−５２５５６３）
【出願日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１８０４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２４２４２
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５０６１７５７８１）アルゴス・セラピューティクス・インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１８０４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２４２４２
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５０６１７５７８１）アルゴス・セラピューティクス・インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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