保湿剤、抗老化剤、美白剤および皮膚外用剤
【課題】 保湿剤、抗老化剤、美白剤および皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】 プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する保湿剤、抗老化剤、美白剤および皮膚外用剤。
【解決手段】 プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する保湿剤、抗老化剤、美白剤および皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチド（以下、「プレプロオレキシン由来ペプチド」と略すことがある）を含有する保湿剤、抗老化剤、美白剤および皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索および配合検討がなされてきた。
【０００３】
例えば、肌に対して機能的に働くタンパク質およびペプチドとして、真皮の主要な構成成分であるコラーゲンが挙げられる。コラーゲンは、保湿作用に優れた安全性の高い保湿剤として、また皮膚の老化防止、改善作用を有する抗老化剤として、皮膚外用剤や機能性経口組成物などに応用され、上市されている。かかるコラーゲンとしては、魚類に由来する海洋性コラーゲン（特許文献１参照）や、植物由来のコラーゲン類似タンパク質（特許文献２参照）などが知られている。また、その他の機能性タンパク質としては、蚕の繭から得られるセリシン（特許文献３参照）が挙げられる。セリシンは抗酸化作用、美白作用、および保湿作用をもつ界面活性剤（特許文献４参照）などとして知られている。
【０００４】
プレプロオレキシンは、ヒトでは１３１個のアミノ酸残基から、ラットやマウスでは１３０個のアミノ酸残基からなるタンパク質であり、睡眠と覚醒などを制御する神経ペプチドであるオレキシンの前駆体として知られている。本発明におけるプレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドとしては、例えば、３３アミノ酸残基からなるオレキシンＡと、２８アミノ酸残基からなるオレキシンＢの、これら２種のアイソペプチドが挙げられる。オレキシンＡは分子内に２対のジスルフィド結合を有しており、その構造はヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌといった哺乳類の多くで完全に保存されている。一方、オレキシンＢは直鎖状のペプチドであり、ヒトとマウスでは２残基の違いがある。（非特許文献１参照）
【０００５】
オレキシンは、脳の外側視床下部領域、及びその周辺に特異的に局在する神経細胞に含まれる神経ペプチドである。オレキシンの作用としては、摂食量の増加、覚醒時間の延長、自発運動量の亢進、交感神経系の活性化などが挙げられる。オレキシンには２つの受容体が存在し、オレキシン１受容体はオレキシンＡに対する親和性がオレキシンＢよりも高く、オレキシン２受容体はオレキシンＡ、及びＢのそれぞれに対してほぼ同一の結合親和性を示す。各オレキシン受容体は視床下部の他、腸筋層間神経叢や腸の内分泌細胞、副腎などの種々の末梢組織に分布している。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−９２９９７号公報
【特許文献２】特開平６−１０７５１７号公報
【特許文献３】特開平４−２０２４３５号公報
【特許文献４】特開平１１−２７６８７６号公報
【非特許文献１】桜井 武「視床下部オレキシン神経の機能：エネルギーバランスに応じた適応行動の制御」肥満の科学（第１２４回 日本医学会シンポジウム記録集）ｐ５３−６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、これまでに様々なタンパク質由来の有効成分が応用されている。しかし、生体内でタンパク質から切り出される機能性ペプチドの中には、肌へと与える効果が未だ知られていないものも数多く存在し、その効能の解明が待たれていた。特に、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用を有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々の機能性ペプチドが肌に与える効果について検討を行った結果、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＥＦ）、正常ヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）にオレキシン１受容体が発現していることを発見した。そして、従来は皮膚に対する効果が知られていなかったプレプロオレキシン由来ペプチドに、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明者は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＥＦ）、正常ヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）の各細胞でのオレキシン受容体の発現を検討した。ＰＣＲ条件としては、９８℃で５分間反応させた後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、４０サイクル反応させ、７２℃で５分反応させた後、４℃まで冷却した。得られた反応液を、電気泳動にて解析したところ、図１に示すとおり、各細胞にオレキシン１受容体が発現していることが認められた。
【００１０】
すなわち、本発明は、プレプロオレキシン由来ペプチドを含有する保湿剤、抗老化剤、美白剤、皮膚外用剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、プレプロオレキシン由来ペプチドを配合することにより、優れた効果を有する保湿剤、抗老化剤、美白剤、皮膚外用剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲ後、得られた反応液を電気泳動解析したもので、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＥＦ）、正常ヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）において、オレキシン１受容体が発現していることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
プレプロオレキシン由来ペプチドは、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用を有し、保湿剤、抗老化剤、美白剤、皮膚外用剤および機能性経口組成物として利用することができる。
【００１４】
プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分とする保湿剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用を有し、優れた保湿効果を発揮する。
【００１５】
プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用、およびヒト表皮角化細胞賦活作用を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１６】
プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分とする美白剤は、優れたＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用を有し、優れた美白効果を発揮する。
【００１７】
プレプロオレキシン由来ペプチドを含有する皮膚外用剤は、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用を発揮する。
【００１８】
これらの各剤は、プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分として含む限り、その形態およびその他成分の配合の有無等については、なんら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル（賦形剤）、溶剤、その他の一般的な添加剤（酸化防止剤、着色剤、分散剤等）を任意に含むことができる。
【００１９】
ここで、皮膚外用剤とは、化粧料、医薬部外品、外用医薬品等の、皮膚または毛髪に外用される全ての外用組成物を意味している。機能性経口組成物についても、医薬品、食品、飲料等の種類を問わず、経口により摂取される全ての組成物を意味する。
【００２０】
皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系やカラミンローション等の分散系、クリームや乳液などの乳化系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤、パップ剤などの種々の剤型で提供することもできる。
【００２１】
具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料、メイクアップ化粧料等の各種化粧料；液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼付剤、パップ剤等の様々な形態の化粧料、医薬部外品や外用医薬品などが例示できる。
【００２２】
機能性経口組成物の形態も任意であり、特に限定されることはない。具体的には、飲料を含む一般食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の健康食品（サプリメント）または機能性食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エキス等の経口医薬品などが例示できる。
【００２３】
皮膚外用剤には、プレプロオレキシン由来ペプチドの他に、その用途と必要に応じて、医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料および洗浄料等に通常配合される任意の成分、例えば水、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、ゲル化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、薬剤（薬効成分）、香料、樹脂、防菌防かび剤、抗酸化剤、アルコール類等を適宜配合することができる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤および痩身剤あるいは各種植物／菌類またはその抽出物との併用も可能である。
【００２４】
プレプロオレキシン由来ペプチドの皮膚外用剤への配合量は、種類や目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、固形分換算で、０．０００１〜１０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．０１〜５質量％であり、一層好ましくは０．１〜５質量％である。
【実施例】
【００２５】
以下にプレプロオレキシン由来ペプチドの保湿効果・抗老化効果・美白効果を評価するための試験方法、皮膚外用剤としての処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２６】
［オレキシンＡ］
オレキシンＡとして、商品名Ｏｒｅｘｉｎ Ａ（ｈｕｍａｎ，ｂｏｖｉｎｅ，ｒａｔ，ｍｏｕｓｅ）（Ａｌｅｘｉｓ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）社製）を用いた。溶媒には、以下に特記しない場合には蒸留水を用いた。
【００２７】
[オレキシンＢ]
オレキシンＢとして、商品名Ｏｒｅｘｉｎ−Ｂ（Ｈｕｍａｎ）（Ｐｈｏｅｎｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ社製）を用いた。溶媒には蒸留水を用いた。
【００２８】
上記各試料を用いて、オレキシンについて保湿効果・抗老化効果・美白効果の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊で表したものである。
【００２９】
＜保湿効果（ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡおよびオレキシンＢを用いた。
【００３０】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表１および表２に示す各濃度となるように各試料を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、ヒアルロン酸結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、最後はアビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し反応させた。１０〜１５分後１Ｎの塩酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表１および表２に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】
表１および表２より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
【００３４】
＜保湿効果（ヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用）＞
オレキシンのヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡを用いた。
【００３５】
正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫを１ウェル当り２．０×１０４個となるようにコラーゲンコートされた９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地(クラボウ社製のＮＨＥＫ増殖培地)を用いた。２４時間培養後、表３に示す各濃度となるようにオレキシンＡを添加した、１．２ｍＭのＣａＣｌ２を含むＫＧ２培地（分化誘導培地）に交換し、さらに９日間培養した。培地交換は３日に１回のペースで行った。培養上清中に分泌された尿素の定量には、尿素窒素 Ｂ−テストワコー（和光純薬）を用いた。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチン、尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールに由来する５７０ｎｍの吸光度を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を１００とした時の相対値にて表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
表３より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用が認められた。
【００３８】
表１〜３に示したとおり、オレキシンは、ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用を示すことから、優れた保湿効果を発揮する。
【００３９】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞賦活作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡを用いた。
【００４０】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表４に示す各濃度となるようオレキシンＡを添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。次に４００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて表４に示す。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表４より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
【００４３】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡおよびオレキシンＢを用いた。
【００４４】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表５および表６に示す各濃度となるように各試料を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表５および表６に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
表５および表６より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用が認められた。
【００４８】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＢを用いた。
【００４９】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り４．０×１０４個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表７に示す各濃度となるようにオレキシンＢを添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素の溶出を防ぐため、ＡＴＰ分解酵素阻害剤（Ｃｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。ＡＴＰの定量にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製 ＡＴＰ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。評価結果を試料無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生能を１００とした相対値にて表７に示す。
【００５０】
【表７】
【００５１】
表７より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用が認められた。
【００５２】
＜抗老化効果（ヒト表皮角化細胞賦活作用）＞
オレキシンのヒト表皮角化細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡおよびオレキシンＢを用いた。
【００５３】
正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地(クラボウ社製のＮＨＥＫ増殖培地)を用いた。２４時間培養後、表８および表９に示す各濃度となるように各試料を添加したＫＧ２培地に交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表８および表９に示す。
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
表８および表９より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト表皮角化細胞賦活作用が認められた。
【００５７】
表４〜９に示したとおり、オレキシンは、ヒト真皮線維芽細胞賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用、およびヒト表皮角化細胞賦活作用を示すことから、優れた抗老化効果を発揮する。
【００５８】
＜美白効果（メラニン産生抑制作用）＞
オレキシンのＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡを用いた。オレキシンＡの溶媒にはＤＭＳＯを用いた。
【００５９】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表１０に示す各濃度となるようにオレキシンＡを添加した５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。これらの目視判定結果は判定５、および判定１とし、サンプル判定の指標とした。目視判定は表１１に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。評価結果を表１０に示す。
【００６０】
【表１０】
【００６１】
【表１１】
【００６２】
表１０より明らかなように、オレキシンＡを添加した培地では、有意なＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用が認められたことから、優れた美白効果を発揮する。
【００６３】
続いて、オレキシンＡおよび／またはオレキシンＢ（以下、総称してオレキシンとする）を配合した皮膚外用剤の処方例を示す。
【００６４】
［実施例１］乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（１２）オレキシン ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。冷却後４０℃にて、（１１）と（１２）を順次加え、均一に混合する。
【００６５】
［実施例２］化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 １００とする残部
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）オレキシン １．０
製法：（１）に（２）および（３）を溶解する。さらに（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００６６】
［実施例３］クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（１２）オレキシン ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。（１１）を添加して攪拌後、冷却し４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００６７】
［実施例４］美容液
（１）精製水 １００とする残部（質量％）
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム（１質量％水溶液） １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（１０）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（１１）ベヘニルアルコール ０．７５
（１２）ミツロウ １．０
（１３）ホホバ油 １．０
（１４）１，３−ブチレングリコール １０．０
（１５）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（１６）オレキシン ３．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。冷却後５０℃にて（１５）を、４０℃にて（１６）を加え、均一に混合する。
【００６８】
［実施例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 １００とする残部
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）オレキシン ０．５
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 １．０
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００６９】
［実施例６］クレンジング料
（１）スクワラン ８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（３）オレキシン ４．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）を加え、均一に混合する。
【００７０】
［実施例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２５．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 １００とする残部
（８）オレキシン ０．１
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合攪拌する。冷却後４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００７１】
［実施例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．２（質量％）
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 １００とする残部
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（１０）黄酸化鉄 ０．４
（１１）香料 ０．１
（１２）オレキシン ３．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（１０）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【００７２】
［実施例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０（質量％）
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１，３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）酸化チタン ９．０
（１２）タルク ７．４
（１３）ベンガラ ０．５
（１４）黄酸化鉄 １．１
（１５）黒酸化鉄 ０．１
（１６）香料 ０．１
（１７）オレキシン ０．５
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（１１）〜（１５）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。冷却後４０℃にて（１６）と（１７）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００７３】
［実施例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３４．０（質量％）
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１，３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）オレキシン ３．０
（１１）精製水 １００とする残部
（１２）香料 ０．１
製法：（５）と（６）を（１１）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に攪拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（１０）を（１１）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを攪拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００７４】
［実施例１１］パック
（１）精製水 １００とする残部（質量％）
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ９．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）オレキシン １．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却する。４０℃にて（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００７５】
［実施例１２］入浴剤
（１）香料 ０．３（質量％）
（２）オレキシン ３．０
（３）炭酸水素ナトリウム ５０．０
（４）硫酸ナトリウム ４６．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００７６】
［実施例１３］ヘアーワックス
（１）ステアリン酸 ３．０（質量％）
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）セチルアルコール ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン ２．０
（５）メチルポリシロキサン ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体 １．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（８）１，３−ブチレングリコール ７．５
（９）アルギニン ０．７
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）オレキシン ２．０
（１２）香料 ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【００７７】
［実施例１４］ヘアートニック
（１）エタノール ５０．０（質量％）
（２）精製水 １００とする残部
（３）オレキシン ３．０
（４）香料 ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【００７８】
実施例１〜実施例１４に示した皮膚外用剤は、保湿作用、抗老化作用、美白作用を有する組成物であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチド（以下、「プレプロオレキシン由来ペプチド」と略すことがある）を含有する保湿剤、抗老化剤、美白剤および皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索および配合検討がなされてきた。
【０００３】
例えば、肌に対して機能的に働くタンパク質およびペプチドとして、真皮の主要な構成成分であるコラーゲンが挙げられる。コラーゲンは、保湿作用に優れた安全性の高い保湿剤として、また皮膚の老化防止、改善作用を有する抗老化剤として、皮膚外用剤や機能性経口組成物などに応用され、上市されている。かかるコラーゲンとしては、魚類に由来する海洋性コラーゲン（特許文献１参照）や、植物由来のコラーゲン類似タンパク質（特許文献２参照）などが知られている。また、その他の機能性タンパク質としては、蚕の繭から得られるセリシン（特許文献３参照）が挙げられる。セリシンは抗酸化作用、美白作用、および保湿作用をもつ界面活性剤（特許文献４参照）などとして知られている。
【０００４】
プレプロオレキシンは、ヒトでは１３１個のアミノ酸残基から、ラットやマウスでは１３０個のアミノ酸残基からなるタンパク質であり、睡眠と覚醒などを制御する神経ペプチドであるオレキシンの前駆体として知られている。本発明におけるプレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドとしては、例えば、３３アミノ酸残基からなるオレキシンＡと、２８アミノ酸残基からなるオレキシンＢの、これら２種のアイソペプチドが挙げられる。オレキシンＡは分子内に２対のジスルフィド結合を有しており、その構造はヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌといった哺乳類の多くで完全に保存されている。一方、オレキシンＢは直鎖状のペプチドであり、ヒトとマウスでは２残基の違いがある。（非特許文献１参照）
【０００５】
オレキシンは、脳の外側視床下部領域、及びその周辺に特異的に局在する神経細胞に含まれる神経ペプチドである。オレキシンの作用としては、摂食量の増加、覚醒時間の延長、自発運動量の亢進、交感神経系の活性化などが挙げられる。オレキシンには２つの受容体が存在し、オレキシン１受容体はオレキシンＡに対する親和性がオレキシンＢよりも高く、オレキシン２受容体はオレキシンＡ、及びＢのそれぞれに対してほぼ同一の結合親和性を示す。各オレキシン受容体は視床下部の他、腸筋層間神経叢や腸の内分泌細胞、副腎などの種々の末梢組織に分布している。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−９２９９７号公報
【特許文献２】特開平６−１０７５１７号公報
【特許文献３】特開平４−２０２４３５号公報
【特許文献４】特開平１１−２７６８７６号公報
【非特許文献１】桜井 武「視床下部オレキシン神経の機能：エネルギーバランスに応じた適応行動の制御」肥満の科学（第１２４回 日本医学会シンポジウム記録集）ｐ５３−６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、これまでに様々なタンパク質由来の有効成分が応用されている。しかし、生体内でタンパク質から切り出される機能性ペプチドの中には、肌へと与える効果が未だ知られていないものも数多く存在し、その効能の解明が待たれていた。特に、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用を有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々の機能性ペプチドが肌に与える効果について検討を行った結果、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＥＦ）、正常ヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）にオレキシン１受容体が発現していることを発見した。そして、従来は皮膚に対する効果が知られていなかったプレプロオレキシン由来ペプチドに、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明者は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＥＦ）、正常ヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）の各細胞でのオレキシン受容体の発現を検討した。ＰＣＲ条件としては、９８℃で５分間反応させた後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、４０サイクル反応させ、７２℃で５分反応させた後、４℃まで冷却した。得られた反応液を、電気泳動にて解析したところ、図１に示すとおり、各細胞にオレキシン１受容体が発現していることが認められた。
【００１０】
すなわち、本発明は、プレプロオレキシン由来ペプチドを含有する保湿剤、抗老化剤、美白剤、皮膚外用剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、プレプロオレキシン由来ペプチドを配合することにより、優れた効果を有する保湿剤、抗老化剤、美白剤、皮膚外用剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲ後、得られた反応液を電気泳動解析したもので、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＥＦ）、正常ヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）において、オレキシン１受容体が発現していることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
プレプロオレキシン由来ペプチドは、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用を有し、保湿剤、抗老化剤、美白剤、皮膚外用剤および機能性経口組成物として利用することができる。
【００１４】
プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分とする保湿剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用を有し、優れた保湿効果を発揮する。
【００１５】
プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用、およびヒト表皮角化細胞賦活作用を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１６】
プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分とする美白剤は、優れたＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用を有し、優れた美白効果を発揮する。
【００１７】
プレプロオレキシン由来ペプチドを含有する皮膚外用剤は、優れた保湿作用、抗老化作用、美白作用を発揮する。
【００１８】
これらの各剤は、プレプロオレキシン由来ペプチドを有効成分として含む限り、その形態およびその他成分の配合の有無等については、なんら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル（賦形剤）、溶剤、その他の一般的な添加剤（酸化防止剤、着色剤、分散剤等）を任意に含むことができる。
【００１９】
ここで、皮膚外用剤とは、化粧料、医薬部外品、外用医薬品等の、皮膚または毛髪に外用される全ての外用組成物を意味している。機能性経口組成物についても、医薬品、食品、飲料等の種類を問わず、経口により摂取される全ての組成物を意味する。
【００２０】
皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系やカラミンローション等の分散系、クリームや乳液などの乳化系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤、パップ剤などの種々の剤型で提供することもできる。
【００２１】
具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料、メイクアップ化粧料等の各種化粧料；液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼付剤、パップ剤等の様々な形態の化粧料、医薬部外品や外用医薬品などが例示できる。
【００２２】
機能性経口組成物の形態も任意であり、特に限定されることはない。具体的には、飲料を含む一般食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の健康食品（サプリメント）または機能性食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エキス等の経口医薬品などが例示できる。
【００２３】
皮膚外用剤には、プレプロオレキシン由来ペプチドの他に、その用途と必要に応じて、医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料および洗浄料等に通常配合される任意の成分、例えば水、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、ゲル化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、薬剤（薬効成分）、香料、樹脂、防菌防かび剤、抗酸化剤、アルコール類等を適宜配合することができる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤および痩身剤あるいは各種植物／菌類またはその抽出物との併用も可能である。
【００２４】
プレプロオレキシン由来ペプチドの皮膚外用剤への配合量は、種類や目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、固形分換算で、０．０００１〜１０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．０１〜５質量％であり、一層好ましくは０．１〜５質量％である。
【実施例】
【００２５】
以下にプレプロオレキシン由来ペプチドの保湿効果・抗老化効果・美白効果を評価するための試験方法、皮膚外用剤としての処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２６】
［オレキシンＡ］
オレキシンＡとして、商品名Ｏｒｅｘｉｎ Ａ（ｈｕｍａｎ，ｂｏｖｉｎｅ，ｒａｔ，ｍｏｕｓｅ）（Ａｌｅｘｉｓ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）社製）を用いた。溶媒には、以下に特記しない場合には蒸留水を用いた。
【００２７】
[オレキシンＢ]
オレキシンＢとして、商品名Ｏｒｅｘｉｎ−Ｂ（Ｈｕｍａｎ）（Ｐｈｏｅｎｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ社製）を用いた。溶媒には蒸留水を用いた。
【００２８】
上記各試料を用いて、オレキシンについて保湿効果・抗老化効果・美白効果の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊で表したものである。
【００２９】
＜保湿効果（ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡおよびオレキシンＢを用いた。
【００３０】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表１および表２に示す各濃度となるように各試料を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、ヒアルロン酸結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、最後はアビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し反応させた。１０〜１５分後１Ｎの塩酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表１および表２に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】
表１および表２より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
【００３４】
＜保湿効果（ヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用）＞
オレキシンのヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡを用いた。
【００３５】
正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫを１ウェル当り２．０×１０４個となるようにコラーゲンコートされた９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地(クラボウ社製のＮＨＥＫ増殖培地)を用いた。２４時間培養後、表３に示す各濃度となるようにオレキシンＡを添加した、１．２ｍＭのＣａＣｌ２を含むＫＧ２培地（分化誘導培地）に交換し、さらに９日間培養した。培地交換は３日に１回のペースで行った。培養上清中に分泌された尿素の定量には、尿素窒素 Ｂ−テストワコー（和光純薬）を用いた。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチン、尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールに由来する５７０ｎｍの吸光度を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を１００とした時の相対値にて表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
表３より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用が認められた。
【００３８】
表１〜３に示したとおり、オレキシンは、ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用を示すことから、優れた保湿効果を発揮する。
【００３９】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞賦活作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡを用いた。
【００４０】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表４に示す各濃度となるようオレキシンＡを添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。次に４００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて表４に示す。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表４より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
【００４３】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡおよびオレキシンＢを用いた。
【００４４】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表５および表６に示す各濃度となるように各試料を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて表５および表６に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
表５および表６より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用が認められた。
【００４８】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用）＞
オレキシンのヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＢを用いた。
【００４９】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り４．０×１０４個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表７に示す各濃度となるようにオレキシンＢを添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素の溶出を防ぐため、ＡＴＰ分解酵素阻害剤（Ｃｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。ＡＴＰの定量にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製 ＡＴＰ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。評価結果を試料無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生能を１００とした相対値にて表７に示す。
【００５０】
【表７】
【００５１】
表７より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用が認められた。
【００５２】
＜抗老化効果（ヒト表皮角化細胞賦活作用）＞
オレキシンのヒト表皮角化細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡおよびオレキシンＢを用いた。
【００５３】
正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地(クラボウ社製のＮＨＥＫ増殖培地)を用いた。２４時間培養後、表８および表９に示す各濃度となるように各試料を添加したＫＧ２培地に交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表８および表９に示す。
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
表８および表９より明らかなように、オレキシンには、有意なヒト表皮角化細胞賦活作用が認められた。
【００５７】
表４〜９に示したとおり、オレキシンは、ヒト真皮線維芽細胞賦活作用、ヒト真皮線維芽細胞タイプＩコラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用、およびヒト表皮角化細胞賦活作用を示すことから、優れた抗老化効果を発揮する。
【００５８】
＜美白効果（メラニン産生抑制作用）＞
オレキシンのＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、オレキシンＡを用いた。オレキシンＡの溶媒にはＤＭＳＯを用いた。
【００５９】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表１０に示す各濃度となるようにオレキシンＡを添加した５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。これらの目視判定結果は判定５、および判定１とし、サンプル判定の指標とした。目視判定は表１１に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。評価結果を表１０に示す。
【００６０】
【表１０】
【００６１】
【表１１】
【００６２】
表１０より明らかなように、オレキシンＡを添加した培地では、有意なＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用が認められたことから、優れた美白効果を発揮する。
【００６３】
続いて、オレキシンＡおよび／またはオレキシンＢ（以下、総称してオレキシンとする）を配合した皮膚外用剤の処方例を示す。
【００６４】
［実施例１］乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（１２）オレキシン ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。冷却後４０℃にて、（１１）と（１２）を順次加え、均一に混合する。
【００６５】
［実施例２］化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 １００とする残部
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）オレキシン １．０
製法：（１）に（２）および（３）を溶解する。さらに（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００６６】
［実施例３］クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（１２）オレキシン ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。（１１）を添加して攪拌後、冷却し４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００６７】
［実施例４］美容液
（１）精製水 １００とする残部（質量％）
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム（１質量％水溶液） １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（１０）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（１１）ベヘニルアルコール ０．７５
（１２）ミツロウ １．０
（１３）ホホバ油 １．０
（１４）１，３−ブチレングリコール １０．０
（１５）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（１６）オレキシン ３．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。冷却後５０℃にて（１５）を、４０℃にて（１６）を加え、均一に混合する。
【００６８】
［実施例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 １００とする残部
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）オレキシン ０．５
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 １．０
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００６９】
［実施例６］クレンジング料
（１）スクワラン ８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（３）オレキシン ４．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）を加え、均一に混合する。
【００７０】
［実施例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２５．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 １００とする残部
（８）オレキシン ０．１
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合攪拌する。冷却後４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００７１】
［実施例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．２（質量％）
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 １００とする残部
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（１０）黄酸化鉄 ０．４
（１１）香料 ０．１
（１２）オレキシン ３．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（１０）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【００７２】
［実施例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０（質量％）
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１，３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）酸化チタン ９．０
（１２）タルク ７．４
（１３）ベンガラ ０．５
（１４）黄酸化鉄 １．１
（１５）黒酸化鉄 ０．１
（１６）香料 ０．１
（１７）オレキシン ０．５
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（１１）〜（１５）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。冷却後４０℃にて（１６）と（１７）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００７３】
［実施例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３４．０（質量％）
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１，３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（１０）オレキシン ３．０
（１１）精製水 １００とする残部
（１２）香料 ０．１
製法：（５）と（６）を（１１）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に攪拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（１０）を（１１）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを攪拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００７４】
［実施例１１］パック
（１）精製水 １００とする残部（質量％）
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ９．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）オレキシン １．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却する。４０℃にて（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００７５】
［実施例１２］入浴剤
（１）香料 ０．３（質量％）
（２）オレキシン ３．０
（３）炭酸水素ナトリウム ５０．０
（４）硫酸ナトリウム ４６．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００７６】
［実施例１３］ヘアーワックス
（１）ステアリン酸 ３．０（質量％）
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）セチルアルコール ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン ２．０
（５）メチルポリシロキサン ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体 １．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（８）１，３−ブチレングリコール ７．５
（９）アルギニン ０．７
（１０）精製水 １００とする残部
（１１）オレキシン ２．０
（１２）香料 ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【００７７】
［実施例１４］ヘアートニック
（１）エタノール ５０．０（質量％）
（２）精製水 １００とする残部
（３）オレキシン ３．０
（４）香料 ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【００７８】
実施例１〜実施例１４に示した皮膚外用剤は、保湿作用、抗老化作用、美白作用を有する組成物であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する保湿剤。
【請求項２】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する抗老化剤。
【請求項３】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する美白剤。
【請求項４】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する皮膚外用剤。
【請求項１】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する保湿剤。
【請求項２】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する抗老化剤。
【請求項３】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する美白剤。
【請求項４】
プレプロオレキシンから切り出されるアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含有する皮膚外用剤。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２４１１５１（Ｐ２０１１−２４１１５１Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１１９３５（Ｐ２０１０−１１１９３５）
【出願日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
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