免疫蛋白質の産生促進剤
【課題】免疫グロブリンおよび／またはサイトカインなどの免疫蛋白質の産生を促進可能な新規な免疫蛋白質産生促進剤を提供する。
【解決手段】本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンを含有する。
【解決手段】本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンを含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫蛋白質の産生促進剤に関し、詳細には、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ抗体、およびＩｇＥ抗体の免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，ＮＦαなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）の免疫蛋白質の産生を促進することが可能な免疫蛋白質の産生促進剤に関するものである。以下では説明の便宜上、免疫グロブリンを中心に説明するが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、略称Ｉｇ）は、通常抗体と呼ばれる複合蛋白質であり、ヒトにおいてはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ，ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類がある。免疫グロブリンは、体内に入った細菌などを破壊する作用、好中球の食細胞を補助する作用、細菌が産生した毒素を中和する作用を有する他、抗生物質の治療効果を高めて人体を感染から守る役割を果たすなど、免疫のなかで大きな役割を担っており、体内診断薬、治療薬等の医薬分野への応用が強く期待されている。
【０００３】
免疫グロブリンは、通常、ヒトリンパ球や、ヒト型親細胞と癌患者のリンパ球とを融合させて得られるヒト型ハイブリドーマ細胞などのヒトリンパ球類から産生されるが、その産生効率は極めて低いという問題がある。そこで、免疫グロブリンの産生能を高めるための研究が行なわれている。
【０００４】
本発明者らは、免疫賦活活性を有する生体機能調節因子の研究を長年の間、行なっており、例えば、クラゲのコラーゲン抽出物質が免疫賦活作用を有することを知見して、コラーゲンの存在下でヒトリンパ球類を培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献１）や、放射線処理したコラーゲンなどの存在下で白血球やリンパ球ハイブリドーマを培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献２）を開示している。また、特許文献３には、複数種の乳製品と酵母を共生培養して得られる発酵乳が、ＩｇＭ産生促進作用やＩＦＮ−γ産生促進作用を有する生理活性ペプチドを含有することを開示している。更に、特許文献４には、魚類の卵の破砕液を抽出して得られた化合物が免疫調整作用を有することを開示している。
【０００５】
一方、特許文献５には、搾汁した温州ミカン果汁を遠心分離して得た上澄み液に所定の処理を施した抽出物が、ヒト型ハイブリドーマ細胞の抗体産生を有することが開示されている。この方法によって得られる抽出物は、分子量が少なくとも１万以上のタンパク質であると推察され、産生効率が低いという問題がある。
【０００６】
ところで、柑橘類の果皮などは、古くから漢方の原料として使用されている。例えば、温州みかんなどに多く含まれるβ−カロテノイド類のβ−クリプトキサンチンや、夏みかんなどに含まれるクマリン系化合物のオーラプテンは、悪性腫瘍抑制作用を有することが報告され、注目されている。
【０００７】
このうち、オーラプテンについて、上記のほか、抗菌作用も知られている。また、例えば、特許文献６にエプスタインバーウイルス早期抗原誘導抑制作用を有することが開示され、特許文献７にメタボリックシンドローム改善作用を有することが開示されているが、オーラプテンが、免疫グロブリンやサイトカインなどの免疫蛋白質の産生促進能を有することは、全く開示されていない。
【０００８】
また、β−クリプトキサンチンは、α−カロテン、β−カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、ルテインと共にヒト血液中に存在する６種類のカロテノイド類の一つであり、糖尿病、リウマチに関する疾病リスク低減作用、発がん予防作用、骨粗鬆症予防作用などが見出されている。また、特許文献８には、その特許請求の範囲にクリプトキサンチンなど多くの成分を含む免疫賦活剤が記載されている。しかし、特許文献８の実施例の欄には、クリプトキサンチンを用いた例は全く開示されておらず、そもそも特許文献８は、紫外線による皮膚の免疫機能低下を外用により防止するための皮膚免疫賦活剤およびこれを含有するクリームや乳液などの皮膚外用剤に関するものであり、免疫グロブリンやサイトカインなどの免疫蛋白質の産生能向上は全く意図していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２０４２４８号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２０２６号公報
【特許文献３】特開２００６−７６９６１号公報
【特許文献４】特開２００７−９１６５４号公報
【特許文献５】特開平６−９８７６３号公報
【特許文献６】特開平９−１５７１６６号公報
【特許文献７】国際公開第２００６／０７７９７２号パンフレット
【特許文献８】特開平１１−２４６３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、免疫グロブリンやサイトカインなどに代表される免疫蛋白質の産生を促進させる新規な免疫蛋白質産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンを含有するところに要旨を有するものである。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫グロブリンおよび／またはサイトカインの産生を促進するものであり、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭの免疫グロブリン；インターフェロン−γ、インターロイキン４、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生促進に極めて有効である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンや；インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子などのサイトカインの産生能が著しく向上するため、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫蛋白質を用いた種々の医療用途に好適に用いられる。具体的には、例えば、免疫グロブリンやサイトカインを原料とする免疫グロブリン製剤、免疫疾患治療薬、免疫機能薬、免疫促進効果を有する健康食品(機能性食品)・サプリメント、健康維持を目的とした飲料、魚類用機能性飼料、家畜・家禽用機能性飼料などの用途に好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、オーラプテンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】図２は、オーラプテンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、ＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を示している。
【図３】図３は、オーラプテンがマウス脾臓細胞の抗体産生に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡの産生に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＧの産生に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図４】図４は、オーラプテンがマウス脾臓細胞の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図５Ａ】図５Ａは、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＧの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＭの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球の免疫蛋白質の遺伝子転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図７】図７は、β−クリプトキサンチンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】図８は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の産生に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡの産生に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＧの産生に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図９】図９は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＧの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＭの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、血中の抗体産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、脾臓細胞の抗体産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【図１３】図１３は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、脾臓細胞のサイトカイン産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【図１４】図１４は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、腸間膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは、新規な免疫蛋白質の産生促進剤を提供するため、検討を重ねてきた。その結果、オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンが、免疫蛋白質の産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。詳細には、これらの成分が、ＨＢ４Ｃ５細胞［ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたものであり、ＩｇＭ産生能を有する］の抗体産生に及ぼす影響を検討した結果、いずれの成分も、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生を促進することが判明した。更に、これらの成分は、マウス脾臓リンパ球のＩｇＧ及びＩｇＡの産生を促進すると共に、マウス腸間膜リンパ球のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭの産生を促進した。更に、抗体の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した結果、これらの成分は転写段階で上方制御していることが明らかとなった。従って、これら成分による免疫蛋白質産生促進作用は、転写促進によるタンパク質性合成系の活性化によるものであることが強く示唆された。更に、これら成分による上記の免疫蛋白質産生促進作用は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においても見られることが確認された。
【００１６】
本明細書において、免疫蛋白質とは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体などの免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，ＴＮＦαなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）を意味する。
【００１７】
本明細書において、「免疫蛋白質産生促進作用を有する」とは、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。詳細は後述する。）数の増加、または免疫蛋白質産生細胞における免疫グロブリンやサイトカインなどの産生量の増加を意味する。
【００１８】
以下、各成分について詳しく説明する。
【００１９】
（オーラプテン）
オーラプテン（ａｕｒａｐｔｅｎｅ）は、下記の構造式で表わされるクマリン類の一種である。前述したように、オーラプテンは、抗ガン活性などの生理活性を有することは報告されているが、免疫蛋白質の産生促進作用については報告されていない。
【００２０】
【化１】
【００２１】
オーラプテンは、柑橘類の果皮に多く含まれており、果肉には殆ど含まれていない。柑橘類としては、例えば、夏みかん、甘夏、イヨカン、温州ミカン、はっさく、夏ダイダイ、ネーブル、柚子、かぼす、グレープフルーツ、すだち、レモン、ポンカン、キンカン、シークワーサーなどのミカン科植物が挙げられる。オーラプテンは、特にイヨカン、甘夏、ネーブルなどの晩柑類に豊富に含まれる。オーラプテンによる高い免疫蛋白質産生促進作用を得るためには、このうち特に、温州ミカン、夏みかん、甘夏を使用することが好ましく、より好ましくは甘夏である。
【００２２】
本発明に用いられるオーラプテンは、柑橘類の果皮を原料とし、公知の方法で抽出することができる。柑橘類の果皮は、予め凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、抽出を行なうことが好ましい。具体的には、エタノール、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を用いて抽出すれば良い。オーラプテンを効率よく抽出するためには、特に、抽出時間に留意することが好ましく、おおむね、室温で６時間以上に制御することが好ましい。
【００２３】
あるいは、オーラプテンは、本発明者の一人によって発明された独自のパウダー製造方法（特開２００９−１７８２２号公報）から得ることもできる。
【００２４】
あるいは、オーラプテンは市販品を用いることもできる（例えば、和光純薬工業株式会社製）。
【００２５】
（β−クリプトキサンチン）
β−クリプトキサンチンは、下記の構造式で表わされるカロテノイド類の一種である。前述したように、β−クリプトキサンチンは、発ガン抑制作用などの生理活性を有することは報告されているが、免疫蛋白質の産生促進作用については報告されていない。
【００２６】
【化２】
【００２７】
β−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉に多く含まれているが、温州ミカンでは、果肉よりも果皮に多く含まれているといわれている。柑橘類としては、前述したオーラプテンの欄で説明した上記柑橘類と同じものを例示することができる。β−クリプトキサンチンによる高い免疫蛋白質産生促進作用を得るためには、このうち特に、温州ミカン、夏みかん、イヨカン、ポンカン、キンカン、シークワーサーを使用することが好ましく、より好ましくは温州ミカンである。
【００２８】
本発明に用いられるβ−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉を原料とし、公知の方法で抽出することができる。柑橘類の果肉は、予め凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、抽出を行なうことが好ましい。具体的には、エタノール、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル等を用いて抽出すれば良い。β−クリプトキサンチンを効率よく抽出するためには、特に、抽出時間に留意することが好ましく、例えば、室温で６時間以上に制御することが好ましい。
【００２９】
あるいは、β−クリプトキサンチンは、本発明者の一人によって発明された独自のパウダー製造方法（特開２００９−１７８２２号公報）から得ることもできる。
【００３０】
あるいは、温州ミカンを用いる場合は、上述したように果肉のほか果皮中にも多く含まれていることから、以下のようにして抽出することが好ましい。果皮等を凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕し、有機溶媒を用いて抽出することが好ましく、用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノールなどのアルコール系有機溶媒、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式脂肪族炭化水素類を挙げることができる。これらの中でも、エタノール、メタノール、ｎ−ヘキサン、酢酸エチルから選ばれることが好ましく、より好ましくはエタノールを用いる。
【００３１】
あるいは、β−クリプトキサンチンは市販品を用いることもできる（例えば、和光純薬工業株式会社）。
【００３２】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、上記のオーラプテンおよび／またはβ−クリプトキサンチンを含んでおり、これらは単独で含有しても良いし、両方を併用しても良い。
【００３３】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、これらの成分のみから構成されていても良いし、医薬などに通常用いられる公知の担体を組み合わせて用いることもできる。具体的には、製剤学的に許容される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、希釈剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの担体が挙げられる。また、食品分野で慣用されている各種の栄養源、例えば糖質、脂質、蛋白質素材などを添加しても良い。更に、必要に応じて、他の医薬品と併用しても良い。
【００３４】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の形態は特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤(懸濁剤、乳剤、注射剤など)、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、軟膏剤などが挙げられる。これら各形態への調製は、上述した慣用の担体を用い、常法に従って行なうことができる。
【００３５】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与形態は、その製剤形態に応じて適切に選択すれば良い。例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの場合は経口投与の形態で用いられ、注射剤などの場合は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与などの形態で用いられ、坐剤の場合は直腸内投与の形態で用いられる。
【００３６】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与量は、一律に限定されず、被験者の年齢、性別、疾患の程度などに応じ、所望の効果が発揮されるように適宜調整すれば良い。
【００３７】
また、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、家畜・家禽、魚類などの非ヒト動物用の飼料の形態で用いても良く、これにより、非ヒト動物の免疫蛋白質産生能が促進される。具体的には、例えば、非ヒト動物用の飼料中に本発明の免疫蛋白質産生促進剤を、非ヒト動物の症状などに応じ、適切な量だけ配合すれば良い。用いられる非ヒト動物用の飼料の組成は限定されず、例えば、市販品を用いることもできる。また、対象となる非ヒト動物も限定されず、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、ウサギ、羊などの家畜類；鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウなどの家禽類；タイ、ハマチ、マグロ、コイ、エビ、アユ、ヒラメなどの魚類などが代表的に例示される。
【００３８】
次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤を用い、免疫グロブリンやサイトカインに代表される免疫蛋白質の産生を促進する方法について説明する。本発明では、免疫蛋白質産生促進剤であるオーラプテンおよび／またはβ−クリプトキサンチンの存在下で、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。）を培養すれば、免疫蛋白質の産生促進剤を添加せずに培養した場合に比べ、上記免疫蛋白質産生細胞中の免疫グロブリンやサイトカインなどの産生が著しく向上する（後記する実施例を参照）。
【００３９】
本明細書において、「免疫蛋白質産生細胞」とは、好ましくは免疫グロブリンやサイトカインの免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）やマクロファージなどの白血球；上記リンパ球（特にＢ細胞）と自立増殖能を有する多発性骨髄腫やリンパ腫などのミエローマ細胞との融合細胞（リンパ球ハイブリドーマ）などが代表的に例示される。後者のリンパ球ハイブリドーマは、例えばセンダイウイルスを用いた細胞融合法、ポリエチレングリコール法、または電気パルスによる電気融合など、慣用方法に従って調製することができる。好ましいリンパ球ハイブリドーマとしては、後記する実施例で用いた、ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞が挙げられる。ＨＢ４Ｃ５細胞を使用すると、当該細胞から分泌されるＩｇＭを指標として、免疫蛋白質産生能を容易に測定することができる。
【００４０】
これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマは、単一種類のものに限定されず、２種以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの白血球およびリンパ球ハイブリドーマの由来は特に制限されないが、本発明ではヒト由来の免疫蛋白質の産生を促進するという観点から、好ましくはヒト由来である。
【００４１】
本発明では、これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマに代表される免疫蛋白質産生細胞を、オーラプテンやβ−クリプトキサンチンを含有する培地中で培養する。
【００４２】
ここで、上記の培地は、上記の免疫蛋白質産生細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地または７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０培地またはＦ１２培地、１９９培地、ＥＤＲＦ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などや、これらの改良型培地などが挙げられる。これらの培地は、市販品を用いることができる。
【００４３】
本発明では、本発明による作用を損なわない限り、上記の培地中に、ウシ血清等の血清を添加しても良い。ただし、血清成分による免疫蛋白質の産生を促進するという観点からは、血清を添加しない無血清培地の使用が好ましい。
【００４４】
本発明で使用する上記培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することもできる。例えば、ＥＤＲＦ培地に、上記のインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウム（以下、ＩＴＥＳと呼ぶ場合がある。）を添加すると、血清の影響を受けずに活性を測定できるという利点があることから、後記するハイブリドーマを用いた培養実験では、上記のＩＴＥＳを所定の濃度で添加したＥＤＲＦ培地（ＩＴＥＳ−ＥＤＲＦ培地）を使用している。
【００４５】
培地中に添加する免疫蛋白質の産生促進剤（オーラプテンおよび／またはβ−クリプトキサンチン）の量は、前述したように、所望の効果を発揮することができる程度に適宜調整すれば良いが、例えば、培養する白血球またはリンパ球ハイブリドーマの量が培地１ｍＬあたり１×１０４〜５×１０５ｃｅｌｌｓである場合、オーラプテンを、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。同様に、β−クリプトキサンは、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。
【００４６】
培養時の温度は、免疫蛋白質を産生できる温度であれば特に制限されず、おおむね、３０〜４５℃の範囲である。好ましくは３５〜４２℃であり、より好ましくは３６〜３８℃である。また、湿度も特に制限されず、相対湿度は、おおむね、８０〜１００％の範囲であり、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％である。
【００４７】
また、培養に当たり、炭酸ガスを１〜１０体積％程度の割合で含む空気の雰囲気下で培養することが好ましい。炭酸ガスの好ましい濃度は、おおむね、３〜８体積％の範囲である。
【００４８】
培養時間は、上記免疫蛋白質の産生促進剤の免疫グロブリン産生効率によっても相違するが、おおむね、５時間〜２週間の範囲である。
【００４９】
このようにして培地中に免疫蛋白質を効率よく産生した後は、定法に従い、培地から固液分離して免疫蛋白質を単離し、必要に応じてアフィニティクロマトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等を用いて精製することにより、所望の免疫蛋白質を取得することができる。
【００５０】
このようにして得られる免疫蛋白質、好ましくは前述する免疫グロブリンやサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）、より好ましくは免疫グロブリンは、例えば、免疫疾患治療薬、免疫機能検査薬の有効成分として広く用いることができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５２】
実施例１
本実施例では、オーラプテンが、ＩｇＭを産生するヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を検討した。
【００５３】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用意し、これに、オーラプテン（和光純薬工業株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して図１に示すように３９．１〜２５００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整したものを添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、抗ヒトＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５４】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した。
【００５５】
これらの結果を図１に示す。
【００５６】
図１より、オーラプテンの添加によってＩｇＭは、ほぼ濃度依存的に増加し、オーラプテンを６２５〜２５００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加すると、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べ、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生量が１．９倍以上に促進された。
【００５７】
実施例２
本実施例では、オーラプテンで刺激したＨＢ４Ｃ５細胞内において、ＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００５８】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した５００ｎｇ／ｍＬ及び２０００ｎｇ／ｍＬのオーラプテンで刺激したＨＢ４Ｃ５細胞からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：CTCCCAAAGTGAGCGTCTTC、リバース：CAGCCAGGACACCTGAATCTである。本実施例では、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラス リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバ
イオサイエンス社製）を用いた。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５９】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現
量を解析した。
【００６０】
これらの結果を図２に示す。
【００６１】
図２より、オーラプテンの刺激によりＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は促進されることが分かった。この実験結果より、オーラプテンによるＩｇＭ産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００６２】
実施例３
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、オーラプテンがマウス脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００６３】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、オーラプテン（和光純薬工業株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して図３に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した脾臓から脾臓リンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、並びに抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００６４】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡおよびＩｇＧの産生量を測定した。
【００６５】
ＩｇＡの結果を図３（ａ）に、ＩｇＧの結果を図３（ｂ）に示す。
【００６６】
図３より、オーラプテンの添加により、マウス脾臓リンパ球のＩｇＡおよびＩｇＧの産生は、ほぼ濃度依存的に促進された。詳細には、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約２．３倍に増加し、ＩｇＧは約１６０ｎｇ／ｍＬの添加で約３．２倍にまで増加した。
【００６７】
実施例４
本実施例では、オーラプテンで刺激したマウス脾臓リンパ球内において、ＩｇＡおよびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００６８】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した５００ｎｇ／ｍＬのオーラプテンで刺激した６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：GGGGCACTGGTCACATACTT、リバース：CAGCTCGTGAGCAACTGAACである。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラスリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００６９】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００７０】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００７１】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図４（ａ）に、ＩｇＭ−ｍＲＮＡの結果を図４（ｂ）に示す。
【００７２】
図４（ａ）および図４（ｂ）より、オーラプテンの刺激により、脾臓リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は、約１．５倍程度促進されることが分かった。この実験結果より、オーラプテンによるＩｇＡおよびＩｇＭの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００７３】
実施例５
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、オーラプテンがマウス腸管膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００７４】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、オーラプテン（和光純薬社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して図５Ａ〜図５Ｃに示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した腸間膜リンパ節からリンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ、並びに抗マウスＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００７５】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生量を測定した。
【００７６】
ＩｇＡの結果を図５Ａに、ＩｇＧの結果を図５Ｂに、ＩｇＭの結果を図５Ｃに、それぞれ示す。
【００７７】
図５Ａ〜図５Ｃより、オーラプテンの添加により、マウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生は促進されることが分かった。詳細には、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約１．８倍に増加し、ＩｇＧは３９．０ｎｇ／ｍＬの添加で２．７倍に増加し、ＩｇＭは３９．０ｎｇ／ｍＬ以上の添加で２．１倍に増加した。
【００７８】
実施例６
本実施例では、オーラプテンで刺激したマウス腸間膜リンパ節リンパ球内において、ＩｇＡおよびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００７９】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した１５６ｎｇ／ｍＬまたは６２５ｎｇ／ｍＬのオーラプテンで刺激した６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス腸間膜リンパ節リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩＦＮ−γに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA、リバース：GTTGCTGATGGCCTGATTGTCである。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラス リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００８０】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００８１】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００８２】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図６（ａ）に、ＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡの結果を図６（ｂ）に、それぞれ示す。
【００８３】
図６（ａ）および図６（ｂ）より、オーラプテンの刺激により、腸管リンパ節リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡの転写活性は、濃度依存的に増加していることが分かる。これらの実験結果より、オーラプテンによるＩｇＡおよびＩＦＮ−γの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００８４】
実施例７
本実施例では、β−クリプトキサンチンが、ＩｇＭを産生するヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を検討した。
【００８５】
詳細には、前述した実施例１に用いたＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地を用意し、これに、β−クリプトキサンチン（和光純薬工業株式会社製）をＤＭＳＯに溶解して図７に示すように３２〜４０００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整したものを添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、実施例１と同様にして測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００８６】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＭの
産生量を測定した。
【００８７】
これらの結果を図７に示す。
【００８８】
図７より、β−クリプトキサンチンの添加によってＩｇＭは、ほぼ濃度依存的に増加し、最大濃度（４０００ｎｇ／ｍＬ）では、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生量が１．６倍に促進された。
【００８９】
実施例８
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００９０】
詳細には、前述した実施例３で用いたＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図８（ａ）または図８（ｂ）に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した脾臓から脾臓リンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の量を、実施例３と同様にして測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００９１】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡおよびＩｇＧの産生量を測定した。
【００９２】
ＩｇＡの結果を図８（ａ）に、ＩｇＧの結果を図８（ｂ）に示す。
【００９３】
図８より、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス脾臓リンパ球のＩｇＡおよびＩｇＧの産生は、ほぼ濃度依存的に促進された。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で２．５倍に増加し、ＩｇＧは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で約３．７倍にまで増加した。
【００９４】
実施例９
本実施例では、β−クリプトキサンチンで刺激したマウス脾臓リンパ球内において、ＩｇＡおよびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００９５】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した５００ｎｇ／ｍＬのβ−クリプトキサンチンで刺激したＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＡおよびＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列、並びに内部標準物質は、実施例４と同じである。
【００９６】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００９７】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００９８】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図９（ａ）に、ＩｇＭ−ｍＲＮＡの結果を図９（ｂ）に、それぞれ示す。
【００９９】
図９（ａ）および図９（ｂ）より、β−クリプトキサンチンの刺激により、脾臓リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は、いずれも約２倍程度促進されることが分かった。この実験結果より、β−クリプトキサンチンによるＩｇＡおよびＩｇＭの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【０１００】
実施例１０
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス腸管膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【０１０１】
詳細には、前述した実施例５に用いたＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図１０Ａ〜図１０Ｃに示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した腸間膜リンパ節からリンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の量を、実施例５と同様にして測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【０１０２】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生量を測定した。
【０１０３】
ＩｇＡの結果を図１０Ａに、ＩｇＧの結果を図１０Ｂに、ＩｇＭの結果を図１０Ｃに、それぞれ示す。
【０１０４】
図１０Ａ〜図１０Ｃより、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生は促進されることが分かった。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約２．１倍に増加し、ＩｇＧは１５６ｎｇ／ｍＬの添加で約１．７倍に増加し、ＩｇＭは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約１．４倍に増加した。
【０１０５】
実施例１１
本実施例では、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における、オーラプテンによる免疫蛋白質の産生促進効果を調べた。
【０１０６】
詳細には、オーラプテン（和光純薬工業株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して２００ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したものを用意した。次に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を５匹／群に分け、各マウスに対し、下記要領でオーラプテンを１４日間経口投与した。
（Ａ）高容量投与群（上記濃度のオーラプテンを１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち２００ｍｇ／ｋｇ／日投与）
（Ｂ）低容量投与群（上記濃度のオーラプテン溶液をＤＭＳＯで５倍希釈し、濃度を４０ｍｇ／ｍＬに調整した溶液を１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち４０ｍｇ／ｋｇ／日）
（Ｃ）コントロール群（ＤＭＳＯのみ１ｍＬ／ｋｇ／日投与）
【０１０７】
１４日間の経口投与終了後、マウスを屠殺し、血清、脾臓細胞、および腸間膜リンパ節を採取した。そして血清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を、前述した実施例５と同様にして測定した。また、脾臓細胞から脾臓リンパ球を採取し、前述した実施例３に記載の培地に添加し、実施例３と同様にして培養後の上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を測定した。また、腸間膜リンパ節については、腸間膜リンパ節からリンパ球を採取し、前述した実施例５に記載の培地に添加し、実施例５と同様にして培養後の上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を測定した。これらの結果を図１１〜１２、１４に示す。
【０１０８】
更に、上記の脾臓細胞から脾臓リンパ球を採取し、酵素抗体法により、サイトカイン［詳細にはインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α］の各量を測定した。これらの結果を図１３に示す。
【０１０９】
図１１より、オーラプテンの添加により、血清中の各抗体量は増加する傾向が見られた。特に低容量投与群のＩｇＡ産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。なお、いずれの抗体についても、高容量投与群に比べて低容量投与群の方が、概して、抗体産生量が高くなる傾向が見られたが、これは、生体内における至適濃度が存在するためと考察される。
【０１１０】
また、図１２〜１４より、オーラプテンの添加により、血清中の各抗体量の上昇に加え、脾臓や腸間膜リンパ節リンパ球に存在する免疫蛋白質の産生も上昇することが分かった。
【０１１１】
詳細には脾臓細胞中の各抗体産生量の結果は図１２に示すとおりであり、低容量投与群のＩｇＡ産生量、低容量投与群および高容量投与群のＩｇＧ産生量、並びに高容量投与群のＩｇＭ産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。
【０１１２】
また、脾臓細胞中の各サイトカインの産生量の結果は図１３に示すとおりであり、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αのいずれのサイトカインについても、高容量投与群の産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。
【０１１３】
また、腸間膜リンパ節リンパ球中の各抗体産生量の結果は図１４に示すとおりであり、低容量投与群のＩｇＡ産生量、低容量投与群および高容量投与群のＩｇＧ産生量、並びに低容量投与群のＩｇＭ産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。
【０１１４】
以上の実験結果より、オーラプテンは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でも免疫蛋白質の産生促進効果を有することが確認された。なお、本実施例では、β−クリプトキサンチンによる生体内での作用を示していないが、オーラプテンとβ−クリプトキサンチンは、生体外での作用がほぼ同様であり、また、本実施例によりオーラプテンによる生体内での作用が実証されたため、β−クリプトキサンチンについても、同様の生体内作用を奏することは十分に推察される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫蛋白質の産生促進剤に関し、詳細には、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ抗体、およびＩｇＥ抗体の免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，ＮＦαなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）の免疫蛋白質の産生を促進することが可能な免疫蛋白質の産生促進剤に関するものである。以下では説明の便宜上、免疫グロブリンを中心に説明するが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、略称Ｉｇ）は、通常抗体と呼ばれる複合蛋白質であり、ヒトにおいてはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ，ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類がある。免疫グロブリンは、体内に入った細菌などを破壊する作用、好中球の食細胞を補助する作用、細菌が産生した毒素を中和する作用を有する他、抗生物質の治療効果を高めて人体を感染から守る役割を果たすなど、免疫のなかで大きな役割を担っており、体内診断薬、治療薬等の医薬分野への応用が強く期待されている。
【０００３】
免疫グロブリンは、通常、ヒトリンパ球や、ヒト型親細胞と癌患者のリンパ球とを融合させて得られるヒト型ハイブリドーマ細胞などのヒトリンパ球類から産生されるが、その産生効率は極めて低いという問題がある。そこで、免疫グロブリンの産生能を高めるための研究が行なわれている。
【０００４】
本発明者らは、免疫賦活活性を有する生体機能調節因子の研究を長年の間、行なっており、例えば、クラゲのコラーゲン抽出物質が免疫賦活作用を有することを知見して、コラーゲンの存在下でヒトリンパ球類を培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献１）や、放射線処理したコラーゲンなどの存在下で白血球やリンパ球ハイブリドーマを培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献２）を開示している。また、特許文献３には、複数種の乳製品と酵母を共生培養して得られる発酵乳が、ＩｇＭ産生促進作用やＩＦＮ−γ産生促進作用を有する生理活性ペプチドを含有することを開示している。更に、特許文献４には、魚類の卵の破砕液を抽出して得られた化合物が免疫調整作用を有することを開示している。
【０００５】
一方、特許文献５には、搾汁した温州ミカン果汁を遠心分離して得た上澄み液に所定の処理を施した抽出物が、ヒト型ハイブリドーマ細胞の抗体産生を有することが開示されている。この方法によって得られる抽出物は、分子量が少なくとも１万以上のタンパク質であると推察され、産生効率が低いという問題がある。
【０００６】
ところで、柑橘類の果皮などは、古くから漢方の原料として使用されている。例えば、温州みかんなどに多く含まれるβ−カロテノイド類のβ−クリプトキサンチンや、夏みかんなどに含まれるクマリン系化合物のオーラプテンは、悪性腫瘍抑制作用を有することが報告され、注目されている。
【０００７】
このうち、オーラプテンについて、上記のほか、抗菌作用も知られている。また、例えば、特許文献６にエプスタインバーウイルス早期抗原誘導抑制作用を有することが開示され、特許文献７にメタボリックシンドローム改善作用を有することが開示されているが、オーラプテンが、免疫グロブリンやサイトカインなどの免疫蛋白質の産生促進能を有することは、全く開示されていない。
【０００８】
また、β−クリプトキサンチンは、α−カロテン、β−カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、ルテインと共にヒト血液中に存在する６種類のカロテノイド類の一つであり、糖尿病、リウマチに関する疾病リスク低減作用、発がん予防作用、骨粗鬆症予防作用などが見出されている。また、特許文献８には、その特許請求の範囲にクリプトキサンチンなど多くの成分を含む免疫賦活剤が記載されている。しかし、特許文献８の実施例の欄には、クリプトキサンチンを用いた例は全く開示されておらず、そもそも特許文献８は、紫外線による皮膚の免疫機能低下を外用により防止するための皮膚免疫賦活剤およびこれを含有するクリームや乳液などの皮膚外用剤に関するものであり、免疫グロブリンやサイトカインなどの免疫蛋白質の産生能向上は全く意図していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２０４２４８号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２０２６号公報
【特許文献３】特開２００６−７６９６１号公報
【特許文献４】特開２００７−９１６５４号公報
【特許文献５】特開平６−９８７６３号公報
【特許文献６】特開平９−１５７１６６号公報
【特許文献７】国際公開第２００６／０７７９７２号パンフレット
【特許文献８】特開平１１−２４６３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、免疫グロブリンやサイトカインなどに代表される免疫蛋白質の産生を促進させる新規な免疫蛋白質産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンを含有するところに要旨を有するものである。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫グロブリンおよび／またはサイトカインの産生を促進するものであり、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭの免疫グロブリン；インターフェロン−γ、インターロイキン４、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生促進に極めて有効である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンや；インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子などのサイトカインの産生能が著しく向上するため、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫蛋白質を用いた種々の医療用途に好適に用いられる。具体的には、例えば、免疫グロブリンやサイトカインを原料とする免疫グロブリン製剤、免疫疾患治療薬、免疫機能薬、免疫促進効果を有する健康食品(機能性食品)・サプリメント、健康維持を目的とした飲料、魚類用機能性飼料、家畜・家禽用機能性飼料などの用途に好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、オーラプテンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】図２は、オーラプテンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、ＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を示している。
【図３】図３は、オーラプテンがマウス脾臓細胞の抗体産生に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡの産生に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＧの産生に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図４】図４は、オーラプテンがマウス脾臓細胞の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図５Ａ】図５Ａは、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＧの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＭの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、オーラプテンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球の免疫蛋白質の遺伝子転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図７】図７は、β−クリプトキサンチンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】図８は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の産生に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡの産生に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＧの産生に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図９】図９は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＧの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＭの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、血中の抗体産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、脾臓細胞の抗体産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【図１３】図１３は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、脾臓細胞のサイトカイン産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【図１４】図１４は、マウスにオーラプテンを経口投与したとき、腸間膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼすオーラプテンの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは、新規な免疫蛋白質の産生促進剤を提供するため、検討を重ねてきた。その結果、オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンが、免疫蛋白質の産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。詳細には、これらの成分が、ＨＢ４Ｃ５細胞［ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたものであり、ＩｇＭ産生能を有する］の抗体産生に及ぼす影響を検討した結果、いずれの成分も、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生を促進することが判明した。更に、これらの成分は、マウス脾臓リンパ球のＩｇＧ及びＩｇＡの産生を促進すると共に、マウス腸間膜リンパ球のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭの産生を促進した。更に、抗体の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した結果、これらの成分は転写段階で上方制御していることが明らかとなった。従って、これら成分による免疫蛋白質産生促進作用は、転写促進によるタンパク質性合成系の活性化によるものであることが強く示唆された。更に、これら成分による上記の免疫蛋白質産生促進作用は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においても見られることが確認された。
【００１６】
本明細書において、免疫蛋白質とは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体などの免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，ＴＮＦαなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）を意味する。
【００１７】
本明細書において、「免疫蛋白質産生促進作用を有する」とは、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。詳細は後述する。）数の増加、または免疫蛋白質産生細胞における免疫グロブリンやサイトカインなどの産生量の増加を意味する。
【００１８】
以下、各成分について詳しく説明する。
【００１９】
（オーラプテン）
オーラプテン（ａｕｒａｐｔｅｎｅ）は、下記の構造式で表わされるクマリン類の一種である。前述したように、オーラプテンは、抗ガン活性などの生理活性を有することは報告されているが、免疫蛋白質の産生促進作用については報告されていない。
【００２０】
【化１】
【００２１】
オーラプテンは、柑橘類の果皮に多く含まれており、果肉には殆ど含まれていない。柑橘類としては、例えば、夏みかん、甘夏、イヨカン、温州ミカン、はっさく、夏ダイダイ、ネーブル、柚子、かぼす、グレープフルーツ、すだち、レモン、ポンカン、キンカン、シークワーサーなどのミカン科植物が挙げられる。オーラプテンは、特にイヨカン、甘夏、ネーブルなどの晩柑類に豊富に含まれる。オーラプテンによる高い免疫蛋白質産生促進作用を得るためには、このうち特に、温州ミカン、夏みかん、甘夏を使用することが好ましく、より好ましくは甘夏である。
【００２２】
本発明に用いられるオーラプテンは、柑橘類の果皮を原料とし、公知の方法で抽出することができる。柑橘類の果皮は、予め凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、抽出を行なうことが好ましい。具体的には、エタノール、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を用いて抽出すれば良い。オーラプテンを効率よく抽出するためには、特に、抽出時間に留意することが好ましく、おおむね、室温で６時間以上に制御することが好ましい。
【００２３】
あるいは、オーラプテンは、本発明者の一人によって発明された独自のパウダー製造方法（特開２００９−１７８２２号公報）から得ることもできる。
【００２４】
あるいは、オーラプテンは市販品を用いることもできる（例えば、和光純薬工業株式会社製）。
【００２５】
（β−クリプトキサンチン）
β−クリプトキサンチンは、下記の構造式で表わされるカロテノイド類の一種である。前述したように、β−クリプトキサンチンは、発ガン抑制作用などの生理活性を有することは報告されているが、免疫蛋白質の産生促進作用については報告されていない。
【００２６】
【化２】
【００２７】
β−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉に多く含まれているが、温州ミカンでは、果肉よりも果皮に多く含まれているといわれている。柑橘類としては、前述したオーラプテンの欄で説明した上記柑橘類と同じものを例示することができる。β−クリプトキサンチンによる高い免疫蛋白質産生促進作用を得るためには、このうち特に、温州ミカン、夏みかん、イヨカン、ポンカン、キンカン、シークワーサーを使用することが好ましく、より好ましくは温州ミカンである。
【００２８】
本発明に用いられるβ−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉を原料とし、公知の方法で抽出することができる。柑橘類の果肉は、予め凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、抽出を行なうことが好ましい。具体的には、エタノール、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル等を用いて抽出すれば良い。β−クリプトキサンチンを効率よく抽出するためには、特に、抽出時間に留意することが好ましく、例えば、室温で６時間以上に制御することが好ましい。
【００２９】
あるいは、β−クリプトキサンチンは、本発明者の一人によって発明された独自のパウダー製造方法（特開２００９−１７８２２号公報）から得ることもできる。
【００３０】
あるいは、温州ミカンを用いる場合は、上述したように果肉のほか果皮中にも多く含まれていることから、以下のようにして抽出することが好ましい。果皮等を凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕し、有機溶媒を用いて抽出することが好ましく、用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノールなどのアルコール系有機溶媒、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式脂肪族炭化水素類を挙げることができる。これらの中でも、エタノール、メタノール、ｎ−ヘキサン、酢酸エチルから選ばれることが好ましく、より好ましくはエタノールを用いる。
【００３１】
あるいは、β−クリプトキサンチンは市販品を用いることもできる（例えば、和光純薬工業株式会社）。
【００３２】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、上記のオーラプテンおよび／またはβ−クリプトキサンチンを含んでおり、これらは単独で含有しても良いし、両方を併用しても良い。
【００３３】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、これらの成分のみから構成されていても良いし、医薬などに通常用いられる公知の担体を組み合わせて用いることもできる。具体的には、製剤学的に許容される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、希釈剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの担体が挙げられる。また、食品分野で慣用されている各種の栄養源、例えば糖質、脂質、蛋白質素材などを添加しても良い。更に、必要に応じて、他の医薬品と併用しても良い。
【００３４】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の形態は特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤(懸濁剤、乳剤、注射剤など)、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、軟膏剤などが挙げられる。これら各形態への調製は、上述した慣用の担体を用い、常法に従って行なうことができる。
【００３５】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与形態は、その製剤形態に応じて適切に選択すれば良い。例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの場合は経口投与の形態で用いられ、注射剤などの場合は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与などの形態で用いられ、坐剤の場合は直腸内投与の形態で用いられる。
【００３６】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与量は、一律に限定されず、被験者の年齢、性別、疾患の程度などに応じ、所望の効果が発揮されるように適宜調整すれば良い。
【００３７】
また、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、家畜・家禽、魚類などの非ヒト動物用の飼料の形態で用いても良く、これにより、非ヒト動物の免疫蛋白質産生能が促進される。具体的には、例えば、非ヒト動物用の飼料中に本発明の免疫蛋白質産生促進剤を、非ヒト動物の症状などに応じ、適切な量だけ配合すれば良い。用いられる非ヒト動物用の飼料の組成は限定されず、例えば、市販品を用いることもできる。また、対象となる非ヒト動物も限定されず、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、ウサギ、羊などの家畜類；鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウなどの家禽類；タイ、ハマチ、マグロ、コイ、エビ、アユ、ヒラメなどの魚類などが代表的に例示される。
【００３８】
次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤を用い、免疫グロブリンやサイトカインに代表される免疫蛋白質の産生を促進する方法について説明する。本発明では、免疫蛋白質産生促進剤であるオーラプテンおよび／またはβ−クリプトキサンチンの存在下で、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。）を培養すれば、免疫蛋白質の産生促進剤を添加せずに培養した場合に比べ、上記免疫蛋白質産生細胞中の免疫グロブリンやサイトカインなどの産生が著しく向上する（後記する実施例を参照）。
【００３９】
本明細書において、「免疫蛋白質産生細胞」とは、好ましくは免疫グロブリンやサイトカインの免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）やマクロファージなどの白血球；上記リンパ球（特にＢ細胞）と自立増殖能を有する多発性骨髄腫やリンパ腫などのミエローマ細胞との融合細胞（リンパ球ハイブリドーマ）などが代表的に例示される。後者のリンパ球ハイブリドーマは、例えばセンダイウイルスを用いた細胞融合法、ポリエチレングリコール法、または電気パルスによる電気融合など、慣用方法に従って調製することができる。好ましいリンパ球ハイブリドーマとしては、後記する実施例で用いた、ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞が挙げられる。ＨＢ４Ｃ５細胞を使用すると、当該細胞から分泌されるＩｇＭを指標として、免疫蛋白質産生能を容易に測定することができる。
【００４０】
これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマは、単一種類のものに限定されず、２種以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの白血球およびリンパ球ハイブリドーマの由来は特に制限されないが、本発明ではヒト由来の免疫蛋白質の産生を促進するという観点から、好ましくはヒト由来である。
【００４１】
本発明では、これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマに代表される免疫蛋白質産生細胞を、オーラプテンやβ−クリプトキサンチンを含有する培地中で培養する。
【００４２】
ここで、上記の培地は、上記の免疫蛋白質産生細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地または７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０培地またはＦ１２培地、１９９培地、ＥＤＲＦ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などや、これらの改良型培地などが挙げられる。これらの培地は、市販品を用いることができる。
【００４３】
本発明では、本発明による作用を損なわない限り、上記の培地中に、ウシ血清等の血清を添加しても良い。ただし、血清成分による免疫蛋白質の産生を促進するという観点からは、血清を添加しない無血清培地の使用が好ましい。
【００４４】
本発明で使用する上記培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することもできる。例えば、ＥＤＲＦ培地に、上記のインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウム（以下、ＩＴＥＳと呼ぶ場合がある。）を添加すると、血清の影響を受けずに活性を測定できるという利点があることから、後記するハイブリドーマを用いた培養実験では、上記のＩＴＥＳを所定の濃度で添加したＥＤＲＦ培地（ＩＴＥＳ−ＥＤＲＦ培地）を使用している。
【００４５】
培地中に添加する免疫蛋白質の産生促進剤（オーラプテンおよび／またはβ−クリプトキサンチン）の量は、前述したように、所望の効果を発揮することができる程度に適宜調整すれば良いが、例えば、培養する白血球またはリンパ球ハイブリドーマの量が培地１ｍＬあたり１×１０４〜５×１０５ｃｅｌｌｓである場合、オーラプテンを、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。同様に、β−クリプトキサンは、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。
【００４６】
培養時の温度は、免疫蛋白質を産生できる温度であれば特に制限されず、おおむね、３０〜４５℃の範囲である。好ましくは３５〜４２℃であり、より好ましくは３６〜３８℃である。また、湿度も特に制限されず、相対湿度は、おおむね、８０〜１００％の範囲であり、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％である。
【００４７】
また、培養に当たり、炭酸ガスを１〜１０体積％程度の割合で含む空気の雰囲気下で培養することが好ましい。炭酸ガスの好ましい濃度は、おおむね、３〜８体積％の範囲である。
【００４８】
培養時間は、上記免疫蛋白質の産生促進剤の免疫グロブリン産生効率によっても相違するが、おおむね、５時間〜２週間の範囲である。
【００４９】
このようにして培地中に免疫蛋白質を効率よく産生した後は、定法に従い、培地から固液分離して免疫蛋白質を単離し、必要に応じてアフィニティクロマトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等を用いて精製することにより、所望の免疫蛋白質を取得することができる。
【００５０】
このようにして得られる免疫蛋白質、好ましくは前述する免疫グロブリンやサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）、より好ましくは免疫グロブリンは、例えば、免疫疾患治療薬、免疫機能検査薬の有効成分として広く用いることができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５２】
実施例１
本実施例では、オーラプテンが、ＩｇＭを産生するヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を検討した。
【００５３】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用意し、これに、オーラプテン（和光純薬工業株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して図１に示すように３９．１〜２５００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整したものを添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、抗ヒトＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５４】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した。
【００５５】
これらの結果を図１に示す。
【００５６】
図１より、オーラプテンの添加によってＩｇＭは、ほぼ濃度依存的に増加し、オーラプテンを６２５〜２５００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加すると、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べ、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生量が１．９倍以上に促進された。
【００５７】
実施例２
本実施例では、オーラプテンで刺激したＨＢ４Ｃ５細胞内において、ＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００５８】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した５００ｎｇ／ｍＬ及び２０００ｎｇ／ｍＬのオーラプテンで刺激したＨＢ４Ｃ５細胞からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：CTCCCAAAGTGAGCGTCTTC、リバース：CAGCCAGGACACCTGAATCTである。本実施例では、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラス リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバ
イオサイエンス社製）を用いた。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５９】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現
量を解析した。
【００６０】
これらの結果を図２に示す。
【００６１】
図２より、オーラプテンの刺激によりＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は促進されることが分かった。この実験結果より、オーラプテンによるＩｇＭ産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００６２】
実施例３
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、オーラプテンがマウス脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００６３】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、オーラプテン（和光純薬工業株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して図３に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した脾臓から脾臓リンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、並びに抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００６４】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡおよびＩｇＧの産生量を測定した。
【００６５】
ＩｇＡの結果を図３（ａ）に、ＩｇＧの結果を図３（ｂ）に示す。
【００６６】
図３より、オーラプテンの添加により、マウス脾臓リンパ球のＩｇＡおよびＩｇＧの産生は、ほぼ濃度依存的に促進された。詳細には、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約２．３倍に増加し、ＩｇＧは約１６０ｎｇ／ｍＬの添加で約３．２倍にまで増加した。
【００６７】
実施例４
本実施例では、オーラプテンで刺激したマウス脾臓リンパ球内において、ＩｇＡおよびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００６８】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した５００ｎｇ／ｍＬのオーラプテンで刺激した６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：GGGGCACTGGTCACATACTT、リバース：CAGCTCGTGAGCAACTGAACである。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラスリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００６９】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００７０】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００７１】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図４（ａ）に、ＩｇＭ−ｍＲＮＡの結果を図４（ｂ）に示す。
【００７２】
図４（ａ）および図４（ｂ）より、オーラプテンの刺激により、脾臓リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は、約１．５倍程度促進されることが分かった。この実験結果より、オーラプテンによるＩｇＡおよびＩｇＭの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００７３】
実施例５
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、オーラプテンがマウス腸管膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００７４】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、オーラプテン（和光純薬社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して図５Ａ〜図５Ｃに示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した腸間膜リンパ節からリンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ、並びに抗マウスＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００７５】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生量を測定した。
【００７６】
ＩｇＡの結果を図５Ａに、ＩｇＧの結果を図５Ｂに、ＩｇＭの結果を図５Ｃに、それぞれ示す。
【００７７】
図５Ａ〜図５Ｃより、オーラプテンの添加により、マウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生は促進されることが分かった。詳細には、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約１．８倍に増加し、ＩｇＧは３９．０ｎｇ／ｍＬの添加で２．７倍に増加し、ＩｇＭは３９．０ｎｇ／ｍＬ以上の添加で２．１倍に増加した。
【００７８】
実施例６
本実施例では、オーラプテンで刺激したマウス腸間膜リンパ節リンパ球内において、ＩｇＡおよびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００７９】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した１５６ｎｇ／ｍＬまたは６２５ｎｇ／ｍＬのオーラプテンで刺激した６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス腸間膜リンパ節リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩＦＮ−γに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA、リバース：GTTGCTGATGGCCTGATTGTCである。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラス リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００８０】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００８１】
比較のため、オーラプテンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００８２】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図６（ａ）に、ＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡの結果を図６（ｂ）に、それぞれ示す。
【００８３】
図６（ａ）および図６（ｂ）より、オーラプテンの刺激により、腸管リンパ節リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡの転写活性は、濃度依存的に増加していることが分かる。これらの実験結果より、オーラプテンによるＩｇＡおよびＩＦＮ−γの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００８４】
実施例７
本実施例では、β−クリプトキサンチンが、ＩｇＭを産生するヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を検討した。
【００８５】
詳細には、前述した実施例１に用いたＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地を用意し、これに、β−クリプトキサンチン（和光純薬工業株式会社製）をＤＭＳＯに溶解して図７に示すように３２〜４０００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整したものを添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、実施例１と同様にして測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００８６】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＭの
産生量を測定した。
【００８７】
これらの結果を図７に示す。
【００８８】
図７より、β−クリプトキサンチンの添加によってＩｇＭは、ほぼ濃度依存的に増加し、最大濃度（４０００ｎｇ／ｍＬ）では、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生量が１．６倍に促進された。
【００８９】
実施例８
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００９０】
詳細には、前述した実施例３で用いたＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図８（ａ）または図８（ｂ）に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した脾臓から脾臓リンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の量を、実施例３と同様にして測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００９１】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡおよびＩｇＧの産生量を測定した。
【００９２】
ＩｇＡの結果を図８（ａ）に、ＩｇＧの結果を図８（ｂ）に示す。
【００９３】
図８より、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス脾臓リンパ球のＩｇＡおよびＩｇＧの産生は、ほぼ濃度依存的に促進された。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で２．５倍に増加し、ＩｇＧは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で約３．７倍にまで増加した。
【００９４】
実施例９
本実施例では、β−クリプトキサンチンで刺激したマウス脾臓リンパ球内において、ＩｇＡおよびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００９５】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解した５００ｎｇ／ｍＬのβ−クリプトキサンチンで刺激したＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製し、ＩｇＡおよびＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列、並びに内部標準物質は、実施例４と同じである。
【００９６】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００９７】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００９８】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図９（ａ）に、ＩｇＭ−ｍＲＮＡの結果を図９（ｂ）に、それぞれ示す。
【００９９】
図９（ａ）および図９（ｂ）より、β−クリプトキサンチンの刺激により、脾臓リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は、いずれも約２倍程度促進されることが分かった。この実験結果より、β−クリプトキサンチンによるＩｇＡおよびＩｇＭの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【０１００】
実施例１０
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス腸管膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【０１０１】
詳細には、前述した実施例５に用いたＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図１０Ａ〜図１０Ｃに示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した腸間膜リンパ節からリンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の量を、実施例５と同様にして測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【０１０２】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生量を測定した。
【０１０３】
ＩｇＡの結果を図１０Ａに、ＩｇＧの結果を図１０Ｂに、ＩｇＭの結果を図１０Ｃに、それぞれ示す。
【０１０４】
図１０Ａ〜図１０Ｃより、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生は促進されることが分かった。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約２．１倍に増加し、ＩｇＧは１５６ｎｇ／ｍＬの添加で約１．７倍に増加し、ＩｇＭは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約１．４倍に増加した。
【０１０５】
実施例１１
本実施例では、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における、オーラプテンによる免疫蛋白質の産生促進効果を調べた。
【０１０６】
詳細には、オーラプテン（和光純薬工業株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して２００ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したものを用意した。次に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を５匹／群に分け、各マウスに対し、下記要領でオーラプテンを１４日間経口投与した。
（Ａ）高容量投与群（上記濃度のオーラプテンを１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち２００ｍｇ／ｋｇ／日投与）
（Ｂ）低容量投与群（上記濃度のオーラプテン溶液をＤＭＳＯで５倍希釈し、濃度を４０ｍｇ／ｍＬに調整した溶液を１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち４０ｍｇ／ｋｇ／日）
（Ｃ）コントロール群（ＤＭＳＯのみ１ｍＬ／ｋｇ／日投与）
【０１０７】
１４日間の経口投与終了後、マウスを屠殺し、血清、脾臓細胞、および腸間膜リンパ節を採取した。そして血清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を、前述した実施例５と同様にして測定した。また、脾臓細胞から脾臓リンパ球を採取し、前述した実施例３に記載の培地に添加し、実施例３と同様にして培養後の上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を測定した。また、腸間膜リンパ節については、腸間膜リンパ節からリンパ球を採取し、前述した実施例５に記載の培地に添加し、実施例５と同様にして培養後の上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を測定した。これらの結果を図１１〜１２、１４に示す。
【０１０８】
更に、上記の脾臓細胞から脾臓リンパ球を採取し、酵素抗体法により、サイトカイン［詳細にはインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α］の各量を測定した。これらの結果を図１３に示す。
【０１０９】
図１１より、オーラプテンの添加により、血清中の各抗体量は増加する傾向が見られた。特に低容量投与群のＩｇＡ産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。なお、いずれの抗体についても、高容量投与群に比べて低容量投与群の方が、概して、抗体産生量が高くなる傾向が見られたが、これは、生体内における至適濃度が存在するためと考察される。
【０１１０】
また、図１２〜１４より、オーラプテンの添加により、血清中の各抗体量の上昇に加え、脾臓や腸間膜リンパ節リンパ球に存在する免疫蛋白質の産生も上昇することが分かった。
【０１１１】
詳細には脾臓細胞中の各抗体産生量の結果は図１２に示すとおりであり、低容量投与群のＩｇＡ産生量、低容量投与群および高容量投与群のＩｇＧ産生量、並びに高容量投与群のＩｇＭ産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。
【０１１２】
また、脾臓細胞中の各サイトカインの産生量の結果は図１３に示すとおりであり、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αのいずれのサイトカインについても、高容量投与群の産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。
【０１１３】
また、腸間膜リンパ節リンパ球中の各抗体産生量の結果は図１４に示すとおりであり、低容量投与群のＩｇＡ産生量、低容量投与群および高容量投与群のＩｇＧ産生量、並びに低容量投与群のＩｇＭ産生量は、オーラプテンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。
【０１１４】
以上の実験結果より、オーラプテンは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でも免疫蛋白質の産生促進効果を有することが確認された。なお、本実施例では、β−クリプトキサンチンによる生体内での作用を示していないが、オーラプテンとβ−クリプトキサンチンは、生体外での作用がほぼ同様であり、また、本実施例によりオーラプテンによる生体内での作用が実証されたため、β−クリプトキサンチンについても、同様の生体内作用を奏することは十分に推察される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンを含有することを特徴とする免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項２】
前記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである請求項１に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項３】
前記免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、前記サイトカインはインターフェロン−γ、インターロイキン４、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αである請求項２に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項１】
オーラプテン及び／又はβ−クリプトキサンチンを含有することを特徴とする免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項２】
前記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである請求項１に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項３】
前記免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、前記サイトカインはインターフェロン−γ、インターロイキン４、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αである請求項２に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１１６７３５（Ｐ２０１１−１１６７３５Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６０１０４（Ｐ２０１０−１６０１０４）
【出願日】平成２２年７月１４日（２０１０．７．１４）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５０７１９２３７８）伊方サービス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１４日（２０１０．７．１４）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５０７１９２３７８）伊方サービス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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