制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤
【課題】生体に対する影響が少なく、安全性が高い制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍増強剤の提供。
【解決手段】次の一般式〔Ｉ〕：
で示される４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤及び制癌剤耐性克服剤となる。この抗腫瘍効果増強剤び制癌剤耐性克服剤は、生体に対する影響が少なくして、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、抗腫瘍効果増強作用及び制癌剤耐性克服作用を有する。
【解決手段】次の一般式〔Ｉ〕：
で示される４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤及び制癌剤耐性克服剤となる。この抗腫瘍効果増強剤び制癌剤耐性克服剤は、生体に対する影響が少なくして、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、抗腫瘍効果増強作用及び制癌剤耐性克服作用を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤に関し、特に、制癌剤と併用することによって、１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体を含有するヒトを含む哺乳動物の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌には、制癌剤感受性の比較的高い癌と低い癌があり、前者には小細胞癌、卵巣癌、乳癌などがあり、後者には非小細胞癌、胃癌、大腸癌などがある。また、一つの癌であっても制癌剤に対して、高感受性及び低感受性の細胞が混在しており、制癌剤で癌を治療すると、感受性の高い細胞は消失し、感受性の低い細胞が残存する。さらに制癌剤の投与により、癌細胞が耐性を獲得すると、癌細胞の増殖を阻害できず、制癌剤が効かない制癌剤耐性癌細胞が出現する。
癌細胞が制癌剤耐性癌になると、化学療法を用いても癌細胞の増殖を阻害できず、化学療法を極めて困難なものにする。
【０００３】
すでにこれまでに、制癌剤耐性克服剤および制癌剤耐性効果増強剤について、多くの候補物質が挙げられてきた。耐性克服剤として、例えば、ＭＳ−２０９やカルシウム拮抗薬のベラパミル、ニフェジピン等が挙げられる。また、Ｋ２０１又はＪＴＶ−５１９と呼ばれている４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４―ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容される塩(以下、Ｋ２０１という。）が、制癌剤耐性克服剤及び制癌剤耐性効果増強剤であることが開示されている（特許文献１）。また、カルシウム拮抗薬ベラパミルやニフェジピンが、in vitroで、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して耐性克服作用を有することが知られている（非特許文献１）。さらに、カルシウム拮抗作用の弱い多剤耐性克服剤として、ＭＳ−２０９が知られている（非特許文献２）。ＭＳ−２０９はＰ糖蛋白質と直接結合して、Ｐ糖蛋白質への制癌剤の結合を阻害することにより耐性を克服していると考えられている。ベラパミルやシクロスポリンＡはＰ糖蛋白質の制癌剤結合部位に競合的に阻害して耐性を克服すると推察されている。
制癌剤耐性を獲得した癌細胞に対して、耐性克服剤を投与し、制癌作用が増強されれば、癌治療にとってきわめて有効である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０４１６４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】〔CancerRes.,41, 1967-1972, (1981)〕
【非特許文献２】〔Cancer Chemother. Pharmacol., 35,271-277 (1995)、Cancer Chemother. Pharmacol., 36,361-367 (1995)〕
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、実際には、耐性克服剤の投与についても限界がある。例えば、制癌剤耐性克服作用が知られているカルシウム拮抗薬のベラパミルやニフェジピンについては、そのin vitroで有効とされる量は、動物やヒトにおいて、通常投与される量に比べ多量であり、血圧低下などの重篤な作用により、投与することは困難である。このように、制癌剤耐性克服剤として候補に挙げられる薬剤や癌細胞増殖阻害剤は、生体に対して影響が少ない安全性の高い薬剤であることも極めて重要な要素となる。
制癌剤耐性を有する癌細胞では、細胞膜変化による薬剤の取り込みの低下、Ｐ糖蛋白質や多剤耐性関連蛋白（ＭＲＰ）などによる薬剤排出の亢進、Ｐ−４５０などの薬物活性化酵素の活性低下、解毒酵素の活性上昇、制癌剤の解毒に関与する還元型グルタチオン（ＧＳＨ）濃度の上昇などが認められている。
また、制癌剤に対して耐性を獲得した癌細胞の中には、他の薬剤に対しても耐性を示すことがある。これを多剤耐性（multidrug
resistance；ＭＤＲ）という。多剤耐性を獲得した癌細胞では、分子量１７０ｋＤのＰ糖蛋白質を高発現していることが知られている。
従来の耐性克服剤は、Ｐ糖蛋白質や多剤耐性関連蛋白（ＭＲＰ）が関与する、いわゆるＭＤＲに対する耐性克服剤であった。カルシウム拮抗剤については、ベラパミルでの制癌剤耐性克服作用もＭＤＲに関連しているといわれ、シスプラチン耐性には動物実験で無効であったと報告されている。また、ベラパミルについては、ＭＤＲに対する小児での臨床試験が組まれたが、血圧低下（徐脈）のため治験は中止となったとの報告もある。
【０００７】
Ｐ糖蛋白質は多くの正常細胞にも存在し、排泄機構に関与している。制癌剤に対しては、Ｐ糖蛋白質はＡＴＰのエネルギーを利用して種々の制癌剤を細胞外に排出するポンプ機能を持ち、制癌剤の細胞内濃度を低下させて細胞を制癌剤に対し耐性化させる。癌種によっては、Ｐ糖蛋白質の発現の亢進している大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌や再発とともにＰ糖蛋白質の発現が亢進してくる急性白血病、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫等があり、またＰ糖蛋白質の発現の少ない乳癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、黒色腫等が知られている。
【０００８】
１９８１年にカルシウム拮抗剤であるベラパミルが多剤耐性を克服することが見出された（非特許文献１）。その後、いくつかのカルシウム拮抗薬やカルモジュリン拮抗薬などにも制癌剤耐性克服作用があることが明らかになった。また、免疫抑制剤であるシクロスポリンＡにも制癌剤耐性克服作用があることが明らかになった。また、カルシウム拮抗作用の弱い多剤耐性克服剤として、ＭＳ−２０９が知られている（非特許文献２）。ＭＳ−２０９はＰ糖蛋白質と直接結合して、Ｐ糖蛋白質への制癌剤の結合を阻害することにより耐性を克服していると考えられている。ベラパミルやシクロスポリンＡは、Ｐ糖蛋白質の制癌剤結合部位に対し競合的に阻害して制癌剤耐性を克服すると推察されている。これらのカルシウム拮抗剤や免疫抑制剤はその薬剤が本来的に有するカルシウム拮抗作用や免疫抑制作用が副作用として重篤で、臨床的に使用するには問題がある。
また、抗癌剤による治療法が確立するに従い、癌の種類によってはかなりの頻度で、患者の社会生活への復帰が可能となっている。しかし、癌細胞が、これら抗癌剤の投与により、あるいは、自然発生的に、制癌剤に対する耐性を有し、結果として、癌患者の生命予後に重大な影響を与えることも少なくない。
以上のように、制癌剤耐性を克服することは、癌治療の上で重要な課題であるが、制癌剤耐性克服作用を有する薬剤の多くは比較的強い毒性を有しており問題とされている。癌治療において、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して耐性克服作用を有して、生体に使用して毒性が少ない耐性克服剤の出現が渇望されている。
【０００９】
プラチナのアナログであるシスプラチンやカルボプラチン、ネダプラチンなどの白金製剤は固形がんにおいて重要な薬剤である。プラチナ製剤に対する制癌剤耐性の克服は癌治療の重要な要件である。制癌剤耐性を有する癌ではシスプラチン排出がおこなわれていることが推定され、ＰＣ１４におけるシスプラチン耐性では、細胞内シスプラチン量が減少している。これに対し４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容しうる塩（以下、Ｋ２０１という）を、有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤が、シスプラチン耐性癌細胞において、細胞内のシスプラチン濃度を高める作用があることは、既に開示されている(特許文献１)。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、毒性が少ない、制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤を提供することを目的としている。
本発明者は、次の一般式〔Ｉ〕：
【化１】
で示される４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩が、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与して、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制し、生体に対する影響が弱く、安全性の高いことを発見して、本発明に至った。
【００１１】
即ち、本発明は、４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤にあり、また、本発明は、４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩、及び制癌剤を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤にあり、さらに、本発明は、２種類の薬剤を含む制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤キットであって、第一の薬剤が４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩であり、第二の薬剤が制癌剤であることを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤キットにある。
【００１２】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩（以下、Ｍ２０１という）は、２０１０年９月２日に国際公開番号：ＷＯ２０１０／０９８０８０Ａ１号公報において、国際公開された化合物であり、該化合物の赤外線吸収、核磁気共鳴吸収及び質量分析の測定結果は以下のとおりである。
ＩＲ（ｃｍ−１）３４５２，２９１２，１６４３，１０２２、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨＺ）δ １．１−２．９５（１７Ｈ，ｍ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．８６−４．１６（２Ｈ，ｍ），４．６５（２Ｈ，ｓ），６．８−７．６５（８Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＦＤ−ＭＳ）：４４．１（Ｍ＋）
【００１３】
Ｍ２０１は、心筋の弛緩作用を有し、拡張障害治療、高血圧治療薬など心疾患についての治療薬としての用途を有する。しかしながら、国際公開番号：ＷＯ２０１０／０９８０８０Ａ１号公報には、Ｍ２０１が制癌剤耐性を有する抗腫瘍効果増強剤であることについては全く開示していない。
本発明は、Ｍ２０１が、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与されたとき、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制すること、生体に対する影響が弱く、安全性が高いことについての発見に基づくものである。
【００１４】
また、Ｍ２０１は、次の一般式〔ＩＩ〕：
【化２】
で示される４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容される塩(以下、Ｋ２０１という)の代謝物の一であるが、Ｋ２０１を酸化反応により酸化することによっても製造することができる。
Ｍ２０１は、制癌剤と併用して初めて強い、制癌剤耐性癌細胞の増殖抑制作用を発揮する。これに対してＫ２０１は、単独で使用した場合、制癌剤耐性を有する癌細胞の生育を抑制するが、制癌剤と併用した際の制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖抑制作用はＭ２０１に比し弱い。
このことは、制癌剤による副作用が強く出る場合は、Ｋ２０１と制癌剤を併用するよりも、安全性の高いＭ２０１と制癌剤とを併用する方が、より効果的にかつ安全に制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制できることを意味する。
【００１５】
また、Ｍ２０１はＫ２０１の生体内代謝物であるが、Ｋ２０１を酸化してＭ２０１を化学反応で製造する方が、Ｋ２０１の生体内での代謝により、Ｍ２０１を製造するよりも、Ｍ２０１を大量に製造できるので、Ｋ２０１を投与して体内でＭ２０１を生成させるよりも、Ｍ２０１を化学反応で製造する方がＭ２０１の投与量を大きくすることができ、制癌剤による治療効率を向上させることができる。
【００１６】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体又はその薬学的に許容しうる塩（Ｍ２０１）を、有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤を制癌剤と併用する場合、４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容しうる塩（Ｋ２０１）を、有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤を制癌剤と併用する場合より治療効果が高く、さらに生体への影響が少なく、安全性が高いことが分かった。
また、Ｋ２０１を投与して生体内でＭ２０１を生成させる場合は、Ｋ２０１の副作用により、Ｋ２０１の投与量は制限されるから、その治療効果は自ずと限度があり、Ｋ２０１の投与量を越えて治療効果の拡大を望むことはできない。
しかし、Ｍ２０１をＫ２０１から化学反応により製造する場合は、Ｋ２０１から生体内での代謝によりＭ２０１を製造するよりも、Ｋ２０１の副作用を受けずにＭ２０１を大量に製造することができる。さらに、Ｍ２０１は、Ｋ２０１より副作用が少なく、生体への安全性が高いから、その分投与量を増加できることとなり、生体内のＭ２０１濃度を高めて治療効果を増すことができる。
【００１７】
本発明において、Ｍ２０１と併用される制癌剤としては、白金錯体、植物由来抗腫瘍性物質又は抗腫瘍性抗生物質がある。また、Ｍ２０１と併用される制癌剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、アドリアマイシン又はタキソールがある。
本発明は、Ｍ２０１を有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤にある。
本発明において、２種類の薬剤を含んでなる癌治療用医薬キットであって、第一の薬剤がＭ２０１であり、第二の薬剤が制癌剤である癌治療用医薬キットにある。
【００１８】
本発明を説明するために本明細書において使用する用語の定義は次の通りである。
制癌剤耐性克服剤」とは、制癌剤に対する癌細胞の耐性を低下させる作用を有する薬剤を意味し、これは、即ち、制癌剤耐性を獲得した癌細胞の制癌剤に対する感受性を増加させる作用を有する薬剤をも意味する。この場合、「感受性の増加」とは、制癌剤耐性細胞に対する制癌剤の効果レベルを、制癌剤感受性細胞に対する効果レベル以上に上昇させるのみならず、制癌剤耐性細胞に対する制癌剤の効果レベルを制癌剤感受性細胞に対する効果レベルとほぼ同等まで上昇させることも含む。また、「耐性克服」と同義語として「耐性抑制」、「耐性解除」、「抵抗性解除」、「感受性増強」等を挙げることができる。
また、本発明において、「制癌剤効果増強剤」とは、制癌剤と併用することによって制癌剤の活性、言い換えれば制癌剤それ自体が有する制癌効果を増強する薬剤である。この場合、増強とは制癌剤耐性細胞に対する制癌剤の効果レベルを制癌剤感受性細胞に対する効果レベル以上に上昇させるのみならず、未だ耐性化していない癌細胞の制癌剤に対する感受性を高めることも意味する。
したがって、本発明において、制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤の用語は、当該薬剤を用いることにより、制癌剤耐性を獲得した癌細胞について、制癌剤に対する感受性を増加させることができるばかりでなく、制癌剤の投与量を低減したり、あるいは、制癌剤の投与間隔を延長したりすることを可能にする薬剤を意味する。
【００１９】
本発明において、Ｍ２０１における「薬学的に許容される塩」とは、医薬的に許容されうる塩であり、好適には医薬的に許容されうる酸付加塩であって、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は硝酸塩等の無機酸付加塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩又はアスコルビン酸塩等の有機酸付加塩；アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩等のアミノ酸付加塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。又、場合によっては含水物あるいは水和物であってもよい。
【００２０】
本発明において、「制癌剤」とは、ブスルファン、カルボコン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、チオテパ、ウラシルマスタード、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）、リン酸エストラムスチン等のアルキル化剤；アザチオプリン、アンシタビン、カルモフール、ドキシフルリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、チオイノシン、テガフール、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ヒドロキシカルバミド、シタラビンオクホスファート、ペントスタチン等の代謝拮抗剤；ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ブレオマイシン（ＢＬＭ）、ダウノルビシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ネオカルチノスタチン（ＮＣＳ）、塩酸イダルビシン等の抗腫瘍性抗生物質；エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール（パクリタキセル）、塩酸イリノテカン等の植物由来抗腫瘍性物質；シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）、ネダプラチン（ＮＤＰ）等の白金錯体；プレドニゾン、プレドニゾロン、テストステロン、エストラムスチン、ノルエチステロン、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、塩酸ファドロゾール、タモキシフェン等のホルモン剤、ミトキサントロン（ＭＸＴ）等のアントラサイクリン系化合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい制癌剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等の白金錯体；ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン、塩酸イダルビシン等の抗腫瘍性抗生物質；エトポシド、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、塩酸イリノテカン等の植物由来抗腫瘍性物質等である。より好ましくはシスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、アドリアマイシン、タキソール等であり、特に好ましくはシスプラチンである。制癌剤のカテゴリーとしては白金錯体が最も好ましく、次いで植物由来抗腫瘍性物質が好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、上記一般式〔１〕で示される４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容され得る塩、即ち、「Ｍ２０１」を有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤をその要旨とするものであり、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与した場合、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制することができ、しかも、生体に対する影響が少なく、安全性が高く、癌治療に有効である。さらにＫ２０１に比べて制癌剤を併用した際の細胞増殖阻害作用が強く、Ｋ２０１に比べ生体に対する影響が少なく、Ｋ２０１の投与に比べ、Ｍ２０１の投与量を増加することができ、癌に対し制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤としての働きを大きくして、高い治療効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、シスプラチン１０μＭを非耐性株、耐性株に加えた際の生存率を示す図である。
【図２】図２は、Ｍ２０１及びＫ２０１のシスプラチン耐性株に対する抗腫瘍効果増強作用の比較図である。
【図３】図３は、Ｍ２０１及びＫ２０１に対する繊維芽細胞の生存率を示す図である。
【図４】図４は、Ｍ２０１、Ｋ２０１及びベラパミルの正常ラットの循環動態、特にダブルプロダクトに及ぼす影響を示す図である。
【図５】図５は、Ｋ２０１を酸化してＭ２０１を製造する反応経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、次の一般式〔Ｉ〕：
【化３】
で表される４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５−テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン-１-オキシド若しくはその薬学的に許容される塩、即ちＭ２０１を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤及び制癌剤耐性克服剤にある。
本発明の化合物は、塩基性の窒素原子を有しているので、この位置において、酸付加塩を形成させることができる。この酸付加塩を形成させるための酸として は、薬学的に許容されるものであれば特に制限はない。本発明の好ましい酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は硝酸塩等の
無機酸付加塩;シュウ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩又はアスコルビン酸塩等の有機酸付加塩;アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩等のアミノ酸付加塩などが挙げられる。また、本発明の化合物又はその酸付加塩は、水和物のような溶媒和物であってもよい。
【００２４】
本発明の化合物において、へテロ環の硫黄（Ｓ）と酸素（Ｏ）の結合（ＳＯ）は、強い電気陰性を示す極性原子団を形成し、配位結合であるから、硫黄と酸素の
結合については、配位結合であることを示すために、へテロ環Ｓ→Ｏの矢印で示すことができ、また、この配位結合は、へテロ環Ｓ＋−Ｏ−で示すことができる。
【００２５】
本発明において、Ｍ２０１は、母体化合物のＫ２０１で表される化合物を適当な酸化剤で酸化することにより製造することができる。
Ｋ２０１を酸化してＭ２０１を製造する方法。
Ｋ２０１を酸化する酸化剤としては、過 酸、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸(mCPBA)などを使用することができる。溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロ
ゲン化炭化水素などを適宜使用することができる。反応温度はスルホンまでの酸化を防止するために低温、例えば、０℃から５℃程度が好ましい。反応混合物か ら、抽出操作やクロマトグラフィーや蒸留などの公知の分離精製手段により、目的物を分離精製することができる。本発明の化合物において、へテロ環の硫黄（Ｓ）と酸素（Ｏ）の結合（ＳＯ）は、強い電気陰性を示す極性原子団を形成し、配位結合であるから、硫黄と酸素の
結合については、配位結合であることを示すために、へテロ環Ｓ→Ｏの矢印で示すことができ、また、この配位接合は、へテロ環Ｓ＋−Ｏ−で示すことができる。
本発明のＭ２０１で表される化合物は、Ｋ２０１で表される化合物を適当な酸化剤で酸化することにより製造することができる。
【００２６】
本発明において、例えば、Ｍ２０１の４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４―ベンゾチアゼピン-1-オキシドは、次の反応経路で、Ｋ２０１を 酸化することにより製造することができる。
[化４]
上記の反応経路により、例えば、Ｋ２０１の４−［３−（４−ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピンのヘテロ環の硫黄を、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）溶媒中で、酸化剤のメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）により、酸化することにより製造することができる。
この場合、Ｋ２０１の４−［３−（４−ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン塩酸塩を、クロロホルム溶媒中で、酸化剤のメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）により酸化することにより、４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベ
ンゾチアゼピン-1-オキシド、即ちＭ２０１が製造される。ここで製造されたＭ２０１は、移動相としてクロロホルム-メタノール混合液を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーにより分離し、次いで、分離されたクロロホルム-メタノール共沸溶媒から溶媒を留出し、さらにアルゴン中で残留溶媒を駆出して最終製品とする。このようにして得られたＭ２０１は、９０％以上の純度を有しており、４４０．６１の分子量を有し、アモルファスであり、室温で酸素及び湿度並びに酸及びアルカリに安定であり、エタノール及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に易溶であり、皮膚刺激性を有している。また、本発明のＭ２０１のシュウ酸塩
は、５３０．６５の分子量を有し、純度９０％以上で、１６７〜１６８℃の融点を有する結晶であり、水、エタノール及びジメチルスルホキシドに可溶である。１Ｈ−ＮＭＲの室温における測定で、アミド部分における立体異性体が約２：３の割合で存在することが確認されている。
Ｍ２０１をＫ２０１から代謝反応により製造する場合は、例えば、ラット又はイヌに、その母体化合物であるＫ２０１の１，４-ベンゾチアゼピン誘導体を投与し、得られた尿及び糞に、水を加 えてホモジネートし、その上清を、オクタデシル基を化学結合させたシリカゲル（ＯＤＳ）を用いる逆相カラムを使用して、移動相は、Ａ液として、０．１％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有の水を用い、Ｂ液として、０．１派ＴＦＡ含有のアセトニトリルを用いて、グラジエント溶離を用いる高速液体クロマトグラ フィーにより、保持時間１９〜２２分で成分分離した。分離された成分は、マススペクトロメトリーにより、質量荷電比（ｍ/Ｚ）は４５７であった。なお、Ｍ２０１も、本発明のＫ２０１と同様の手法で、グラジエント溶離を用いる高速液体クロマトグラフィーにより、保持時間２７〜３０分で
成分分離して得ることができる。
使用試薬
Ｋ２０１：ＬｏｔＮｏ．３１Ｔ−５−７０９０２
ｍＣＰＢＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）：ＬｏｔＮｏ．０６６２０ＬＤ，ＭＫＡＡ２８２９
Ｎａ２ＳＯ３（和光純薬）：特級ＬｏｔＮｏ．ＣＤＫ３０４５
ＮａＯＨ（関東化学）：ＬｏｔＮｏ．０１１Ｘ６０１７
ＣＨＣ１３（和光純薬）：特急ＬｏｔＮｏ．ＣＤＪ５０７８
Ｎａ２ＳＯ．（和光純薬）：特急ＬｏｔＮｏ．ＣＤＱ５１３９
シリカゲル（関東化学）：ＬｏｔＮｏ．０１０１０１２０１
総括
Ｋ２０１（ＬｏｔＮｏ．３１ＴＬ５−７０９０２）１０７．７０ｇを用いて，反応及び絡む生成を行った結果，終了５５．５５ｇ，収率５３．９％，ＨＰＬＣ純度９９．５６ａｒｅａ％（スルホン体：０．４０面積％）でＭ２０１を得ることができた（Ｌｏｔ Ｎｏ．０９１０１９Ａ）
【００２７】
本発明の制癌剤耐性克服剤及び制癌剤効果増強剤及び医薬組成物における有効成分としては、一般式〔１〕で示される４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４―ベンゾチアゼピン-1-オキシド化合物又はその塩（Ｍ２０１）が用いられる。
【００２８】
本発明において、Ｍ２０１は優れた制癌剤耐性克服作用及び制癌剤効果増強作用を有する。すなわち、本発明の制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤は、制癌剤と併用投与することにより、耐性化した癌細胞に対しても制癌剤の制癌作用が発揮される。本発明化合物を制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤として用いる場合、通常全身的、あるいは局所的に、経口又は非経口で投与される。非経口投与としては、静脈内投与（点滴静注を含む）、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与、膀胱内投与、髄腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、直腸内投与、腫瘍内投与などが挙げられる。本発明の制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤は、制癌剤と同時に投与してもよく、又は制癌剤の投与前若しくは投与後に投与してもよいし、あるいは制癌剤の休薬期間中に投与してもよい。制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤と制癌剤との投与経路は同じであっても、異なっていてもよい。
【００２９】
本発明の制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤は、制癌剤と併用投与することにより、ヒトを含む哺乳動物における肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、大腸癌（直腸癌、結腸癌）、小腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、悪性黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌）、卵巣癌、乳癌、骨肉腫、悪性リンパ腫、前立腺癌、白血病（急性白血病、慢性白血病）、骨髄腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、皮膚癌、睾丸腫瘍等の癌（悪性腫瘍）の治療に使用することできる。
【００３０】
本発明において、「併用投与」とは、２種類の薬剤を同時に、連続して、又は時間間隔をおいて投与することを意味する。２種類の薬剤は、混合物として投与してもよく、または別々の製剤として投与してもよい。別々の製剤として投与する場合、それぞれの投与経路は同じであっても異なっていてもよい。
【００３１】
本発明において、Ｍ２０１の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人当たり０．０１ｍｇ乃至１ｇの範囲で、一日一回から数回経口あるいは非経口投与される。
併用投与する制癌剤の投与量は、通常の癌の治療に使用される投与量、又はそれより少ない投与量でよい。また併用投与する制癌剤の投与経路は、通常の癌の治療で用いられる投与経路と同じであってよい。
【００３２】
また、本発明において、Ｍ２０１と、制癌剤とを含有する医薬組成物として投与することもできる。この場合、組成物中におけるＭ２０１と、制癌剤との重量比は、１：１００〜１００：１の範囲であってよいが、この範囲に限定されるものではない。
【００３３】
本発明によれば、２種類の薬剤を含んでなる癌治療用医薬キットが提供される。本発明の癌治療用医薬キットにおいて、第一の薬剤は、Ｍ２０１を含有する制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤であり、第二の薬剤は制癌剤である。これら２種類の薬剤を併用投与することによって、癌の治療、特に制癌剤に対して耐性化した癌の治療に使用することができる。制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤は、制癌剤と同時に投与してもよく、又は制癌剤の投与前若しくは投与後に投与してもよいし、場合によっては、制癌剤の休薬期間中に投与してもよい。これら制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤の投与経路は、制癌剤の投与経路と同じであっても、異なっていてもよい。
【００３４】
Ｍ２０１を経口投与のための固体組成物にする場合、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤等の剤形が可能である。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、分散剤又は吸着剤等、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微晶性セルロース、澱粉、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム又は無水ケイ酸末等と混合される。又、組成物は常法に従って、希釈剤以外の添加剤を混合させてもよい。
錠剤又は丸剤に調製する場合は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで皮膜してもよいし、二以上の層で皮膜してもよい。さらに、ゼラチン又はエチルセルロースのような物質のカプセルにしてもよい。
【００３５】
経口投与のための液体組成物にする場合は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶解剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等の剤形が可能である。用いる希釈剤としては、例えば精製水、エタノール、植物油又は乳化剤等がある。又、この組成物は希釈剤以外に浸潤剤、懸濁剤、甘味剤、風味剤、芳香剤又は防腐剤等のような補助剤を混合させてもよい。
【００３６】
非経口のための注射剤に調製する場合は、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤または乳化剤を用いる。水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水、シクロデキストリン及びその誘導体、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリエチルアミン等の有機アミン類あるいは無機アルカリ溶液等がある。
水溶性の溶液剤にする場合、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールあるいはオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類等を用いてもよい。又、可溶化剤として、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、蔗糖脂肪酸エステル等の界面活性剤（混合ミセル形成）、又はレシチンあるいは水添レシチン（リポソーム形成）等も用いられる。又、植物油等の非水溶性の溶解剤と、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等からなるエマルジョン製剤にすることもできる。
【００３７】
非経口投与のためのその他の組成物としては、一つ又はそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方される外用液剤、軟膏のような塗布剤、座剤又はペッサリー等にしてもよい。
【００３８】
本発明の医薬組成物を経口投与のための固体組成物にする場合には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤等の剤形が可能である。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、分散剤又は吸着剤等、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、
微晶性セルロース、澱粉、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム又は無水ケイ酸末等と混合され、常法にしたがって製造することができ る。
錠剤又は丸剤に調製する場合は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸
溶性物質のフィルムで皮膜してもよいし、二以上の層で皮膜してもよい。さらに、ゼラチン又はエチルセルロースのような物質のカプセルにしてもよい。
【００３９】
経口投与のための液体組成物にする場合は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶解剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等の剤形が可能である。用いる希釈剤と
しては、例えば精製水、エタノール、植物油又は乳化剤等がある。又、この組成物は希釈剤以外に浸潤剤、懸濁剤、甘味剤、風味剤、芳香剤又は防腐剤等のよう な補助剤を混合させてもよい。
【００４０】
非経口のための注射剤に調製する場合は、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤または乳化剤を用いる。水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤とし
ては、例えば注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水、シクロデキストリン及びその誘導体、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミ ン、トリエチルアミン等の有機アミン類あるいは無機アルカリ溶液等がある。
水溶性の溶液剤にする場合、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールあるいはオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類等を用いてもよい。又、可溶化剤として、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、蔗糖脂肪酸エステル等の界面活性剤(混合ミセル形成)、又はレシチンあるいは 水添レシチン(リポソーム形成)等も用いられる。又、植物油等の非水溶性の溶解剤と、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油又はポリオキシエチレンポ
リオキシプロピレングリコール等からなるエマルジョン製剤にすることもできる。
【００４１】
本発明において、Ｍ２０１は、遊離の化合物として、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人当たり０．１ｍｇ乃至１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ
乃至０．５ｇの範囲で、一日一回から数回に分けて経口あるいは非経口投与することができる。
【００４２】
以下に、本発明の一実施例をあげて、本発明について更に具体的に説明するが、ここでの例示及び説明により、何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
シスプラチン非耐性株およびシスプラチン耐性株に対するシスプラチンの制癌作用
シスプラチン非耐性株およびシスプラチン耐性株に対するシスプラチンの非小細胞肺癌細胞株における制癌剤感受性増強作用を調べるために、ヒト非小細胞肺癌株であるＰＣ−１４及びそのシスプラチン耐性細胞株ＰＣ−１４／ＣＤＤＰを用いてシスプラチンに対する制癌作用を検討した。シスプラチン耐性株は、シスプラチン投与下での段階的濃度上昇により、作成した。
ＲＰＭＩ １６４０培地中でＰＣ−１４及びＰＣ−１４／ＣＤＤＰをトリプシン処理により又はセルスクレイパーを用いてシングル細胞とし、１５μｌ当たり１００個の細胞浮遊液を調製した。これを９６穴プレートに１ウェル当たり１５０μｌづつ入れた。また、制癌剤（シスプラチン）を最終濃度０、１，５，１０μＭになるように、滅菌蒸留水に溶解させて１５０μｌ加えた。陰性対照として細胞を加えない群を調製した。３７℃、５％二酸化炭素濃度、飽和水蒸気の条件下で７２時間培養した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフぇニルテトラゾリウムブロマイド〕試薬を２０μｌ加えて、３７℃で更に４時間培養した。培養終了後、プレートごと遠心し、上清を捨てた。２００μｌのジメチルスルホキシドを加えて、細胞内のミトコンドリアの酵素活性により生成したホルマザン結晶を溶解させ、５６２〜６３０ｎｍの吸光度をマルチプレートリーダーを用いて測定した。シスプラチン濃度が０μＭを対照とした平均発育率を１００％として、非耐性株および耐性株に対する１０μＭシスプラチン投与後の生存率を算出した。非耐性株の生存率は３１％であり、耐性株の生存率は６５％であった。この結果のシスプラチン１０μＭを非耐性株、耐性株に加えた際の生存率を図１に示す。
【実施例２】
【００４４】
Ｍ２０１およびＫ２０１のシスプラチン耐性株に対する抗腫瘍効果増強作用の比較
シスプラチン耐性非小細胞肺癌細胞株における被験化合物の制癌剤感受性増強作用を調べるために、ヒト非小細胞肺癌株であるＰＣ−１４のシスプラチン耐性細胞株ＰＣ−１４／ＣＤＤＰを用いてシスプラチンに対する抗腫瘍効果増強作用を検討した。ＲＰＭＩ １６４０培地中でＰＣ−１４及びＰＣ−１４／ＣＤＤＰをトリプシン処理により又はセルスクレイパーを用いてシングル細胞とし、１５μｌ当たり１００個の細胞浮遊液を調製した。これに化合物Ｋ２０１又はＭ２０１をジメチルスルホキシドに溶解させて、最終濃度１０μＭとなるように加え、これを９６穴プレートに１ウェル当たり１５０μｌづつ入れた。また、制癌剤（シスプラチン）を最終濃度０．１、５、１０μＭになるように、滅菌蒸留水に溶解させて１５０μｌ加えた。陰性対照として細胞を加えない群を、又陽性対照として制癌剤及びいずれの化合物（Ｍ２０１又はK２０１）も加えない群を調製した。３７℃、５％二酸化炭素濃度、飽和水蒸気の条件下で７２時間培養した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＭＴＴ試薬を２０μｌ加えて、３７℃で更に４時間培養した。培養終了後、プレートごと遠心し、上清を捨てた。２００μｌのジメチルスルホキシドを加えて、細胞内のミトコンドリアの酵素活性により生成したホルマザン結晶を溶解させ、５６２〜６３０ｎｍの吸光度をマルチプレートリーダーを用いて測定した。陰性対照の平均発育率を０％、陽性対照の平均発育率を１００％として生存率を算出した。その結果を図２に示す。
図２に示すように、シスプラチン耐性株に対し、Ｋ２０１（１０μＭ）は、単独で、耐性株の生存率を低下させたが、Ｍ２０１（１０μＭ）には単独での耐性株の生存率低下作用はなかった。しかし、Ｍ２０１は、シスプラチンと併用すると急激に抗腫瘍効果増強作用を示し、Ｋ２０１に比べ、制癌剤を併用することにより、抗腫瘍効果増強作用を示すことが明らかとなった。
【実施例３】
【００４５】
非癌細胞に対する影響を調べるため、Ｋ２０１及びＭ２０１に対する線維芽細胞の生存率を検討した。ＲＰＭＩ １６４０培地中でＰＣ−１４及びＰＣ−１４／ＣＤＤＰをトリプシン処理により又はセルスクレイパーを用いてシングル細胞とし、１５μｌ当たり１００個の細胞浮遊液を調製した。これに化合物Ｋ２０１又はＭ２０１をジメチルスルホキシドに溶解させて、最終濃度０、１、５、１０、３０、５０、１００μＭとなるように加え、これを９６穴プレートに１ウェル当たり３００μｌづつ入れた。陰性対照として細胞を加えない群を、又陽性対照としていずれの化合物も加えない群を調製した。３７℃、５％二酸化炭素濃度、飽和水蒸気の条件下で７２時間培養した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＭＴＴ試薬を２０μｌ加えて、３７℃で更に４時間培養した。培養終了後、プレートごと遠心し、上清を捨てた。２００μｌのジメチルスルホキシドを加えて、細胞内のミトコンドリアの酵素活性により生成したホルマザン結晶を溶解させ、５６２〜６３０ｎｍの吸光度をマルチプレートリーダーを用いて測定した。陰性対照の平均発育率を０％、陽性対照の平均発育率を１００％として求めた。５０％細胞発育抑制濃度（ＩＣ50）を算出した。この結果を図３に示す。
線維芽細胞に対してＫ２０１に比べ、Ｍ２０１の生存率は高く、５０％細胞発育抑制濃度（ＩＣ５０）は、Ｍ２０１は９２μＭ、Ｋ２０１は１９μＭであった。このことから、Ｍ２０１はＫ２０１に比べ非腫瘍細胞に対する影響が極めて弱いことがわかった。臍帯静脈内皮細胞およびヒト平滑筋細胞においても同様の結果であった。
【実施例４】
【００４６】
Ｋ２０１、Ｍ２０１及びベラパミルの正常ラットの循環動態、特にダブルプロダクトに及
ぼす影響について
生体への影響を調べるために、循環動態の指標として、血圧と心拍数の積 ダブルプロダクトを測定した。ダブルプロダクトは心筋の酸素消費量を反映することが知られ、その低下は循環動態への抑制を意味する。
ウィスター(Ｗｉｓｔａｒ)系雄性ラットを1週間飼育後、３％イソフルランで吸入麻酔し、気管内挿管後、人工呼吸器を装着した。１．７％イソフルラ ンの吸入麻酔下で、呼吸管理を行った。右総頚動脈から圧測定チップ付カテーテル(2Fミラー社)を左室内に挿入し、また、右大腿静脈から本発明の化合物又 は生理食塩水注入用ポリエチレンチューブ(SP10)を挿入した。10分間の血行動態の安定化を図った後に、連続的に1分毎に、左室拡張期最小圧、左室拡 張末期圧を測定し、Ｍ２０１、Ｋ２０１、ベラパミルを０．３ｍｇ/ｋｇ/分で１０分間投与した。対照例では生理食塩水を投与し、各溶液の注入速度は1分間あたり、１６．６μｌとした。各例３例で調べた。
Ｋ２０１、Ｍ２０１又はベラパミルの投与前及び投与後における左室圧、心拍数その積すなわちダブルプロダクトを２０心拍測定し算出した。測定されたダブルプロダクトは投与前値を１００％とし、投与後の値を当与前値に対する値（％表示）で表した。測定値は平均値と標準偏差値で求めた。結果を図４に示す。
Ｍ２０１はダブルプロダクトを低下させず、生体への影響が最も少ないことが判った。Ｋ２０１はわずかに低下させたが、耐性克服作用があるとされるカルシウム拮抗薬ベラパミルはダブルプロダクトを著しく低下させ、循環動態への強い影響があることがわかった。
【実施例５】
【００４７】
Ｍ２０１およびＫ２０１の経済効率について
Ｍ２０１はＫ２０１の代謝物であることが分かっている。また、Ｍ２０１はＫ２０１を酸化させることによっても製造することができる。Ｍ２０１の経済効率を調べる目的で、Ｋ２０１からＭ２０１を作成した場合の収率を調べ、また、Ｋ２０１に放射性同位元素を結合させ、イヌにＫ２０１を投与した際のＭ２０１の血漿中濃度を投与５部後、および２時間後に測定した。なお、Ｋ２０１の半減期は約２ないし３時間であることが知られている。
【実施例６】
【００４８】
Ｋ２０１（ＬｏｔＮｏ．３１Ｔ−５−７０９０２）１０７．７０ｇを用いて、図５の製造方法チャートに従いＭ２０１を製造した。
Ｋ２０１の４−［３−（４−ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン塩酸塩１０７．７０ｇを、室温下でクロロホルム溶媒に溶解し、０〜５℃の温度に冷却し、クロロホルム溶媒中で、反応温度が上昇しないように留意しながら攪拌して、酸化剤のメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）により酸化することにより、４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベ
ンゾチアゼピン-1-オキシド、即ちＭ２０１を製造した。ここで製造されたＭ２０１に、０〜５℃の温度で、硫酸ナトリウム溶液を加えて、さらに攪拌を続け、０〜５℃の温度で、水酸化ナトリウム溶液を加え、攪拌を続けて、有機層を分液後、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を水で洗浄し、次いで食塩水で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、減圧濃縮した。
濃縮残渣についを、移動相としてクロロホルム-メタノール混合液を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーにより分離し、次いで、分離されたクロロホルム-メタノール共沸溶媒から溶媒を留出し、さらにアルゴン中で残留溶媒を駆出して最終製品とした。このようにして得られたＭ２０１は、９０％以上の純度を有しており、４４０．６１の分子量を有し、アモルファスであり、室温で酸素及び湿度並びに酸及びアルカリに安定であり、エタノール及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に易溶であり、皮膚刺激性を有している。また、本発明のＭ２０１のシュウ酸塩
は、５３０．６５の分子量を有し、純度９０％以上で、１６７〜１６８℃の融点を有する結晶であり、水、エタノール及びジメチルスルホキシドに可溶である。１Ｈ−ＮＭＲの室温における測定で、アミド部分における立体異性体が約２：３の割合で存在することが確認されている。
その結果、収量５５．５ｇ，収率５３．９％，ＨＰＬＣ純度９９．５６ａｒｅａ％でＭ２０１を得ることができた。この製造方法のフロー図を図５に示す。
【実施例７】
【００４９】
（２）Ｋ２０１を静脈内に投与した際のイヌにおける血中のＭ２０１組成
放射性物質で標識したＫ２０１（ＪＴＶ−５１９）を、０．２％クエン酸および５％マンニトール溶液に加え撹拌し投与液とした。イヌは６および８ヶ月齢の雄性ビーグル犬を使用した。イヌへの投与量は０．３ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。各動物への投与は、３例ずつとした。投与から５分後、２時間後に採血を行い、その血液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を分取し、放射能測定用試料とした。血漿はシンチレーター１０ｍｌを加えて放射能測定サンプルとした。放射能の測定は液体シンチレーションカウンターを用い５分間測定した。未変化体および化合物は３例のプールして測定した。
測定結果は総放射能、未変化体および代謝物濃度を、総放射能を１００％として平均値を算出して表１に示した。
表１
(上記表１において、その他の代謝物のＭ-Ｉは、式〔ＩＩＩ〕
で示される４−［３−４（４−ヒドロキシベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピンを示す。
上記表１において、その他の代謝物のＭ-ＩＩＩは、式〔ＩＶ〕
で示される４−［３−４（４−ヒドロキシベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン-１-オキシドを示す。
上記表１において、その他の代謝物のＭ-ＩＶは、式〔Ｖ〕
で示される４−［３−4（２,４−ジヒドロキシベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピンを示す。)
その結果、イヌにおいて、投与されたＫ２０１の１３〜１４％が、Ｍ２０１に生成されることが分かった。
以上の実施例５−１および５−２の結果より、Ｍ２０１をＫ２０１から化学合成で得た場合は、Ｍ２０１の収率は５３．９％であり、Ｋ２０１を生体に投与した場合のＭ２０１の生成率は、１３〜１４％であった。このことからＫ２０１を投与するよりも、Ｍ２０１をＫ２０１から製造した方が経済効率が高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、Ｍ２０１を有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤にあるので、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与した場合、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制することができ、しかも、生体に対する影響が弱く、安全性が高く、癌治療に有効である。
【符号の説明】
【００５１】
図２において、＊: ｐ
＜ ０．０５ ｖｓ Ｋ２０１ＣＤＤＰ ５μＭ 、
＊＊: ｐ
＜ ０．０１ ｖｓ Ｋ２０１ ＣＤＤＰ １μＭ
＊＊＊: ｐ
＜ ０．０００１ ｖｓ Ｋ２０１ ＣＤＤＰ ０μＭ〕
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤に関し、特に、制癌剤と併用することによって、１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体を含有するヒトを含む哺乳動物の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌には、制癌剤感受性の比較的高い癌と低い癌があり、前者には小細胞癌、卵巣癌、乳癌などがあり、後者には非小細胞癌、胃癌、大腸癌などがある。また、一つの癌であっても制癌剤に対して、高感受性及び低感受性の細胞が混在しており、制癌剤で癌を治療すると、感受性の高い細胞は消失し、感受性の低い細胞が残存する。さらに制癌剤の投与により、癌細胞が耐性を獲得すると、癌細胞の増殖を阻害できず、制癌剤が効かない制癌剤耐性癌細胞が出現する。
癌細胞が制癌剤耐性癌になると、化学療法を用いても癌細胞の増殖を阻害できず、化学療法を極めて困難なものにする。
【０００３】
すでにこれまでに、制癌剤耐性克服剤および制癌剤耐性効果増強剤について、多くの候補物質が挙げられてきた。耐性克服剤として、例えば、ＭＳ−２０９やカルシウム拮抗薬のベラパミル、ニフェジピン等が挙げられる。また、Ｋ２０１又はＪＴＶ−５１９と呼ばれている４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４―ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容される塩(以下、Ｋ２０１という。）が、制癌剤耐性克服剤及び制癌剤耐性効果増強剤であることが開示されている（特許文献１）。また、カルシウム拮抗薬ベラパミルやニフェジピンが、in vitroで、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して耐性克服作用を有することが知られている（非特許文献１）。さらに、カルシウム拮抗作用の弱い多剤耐性克服剤として、ＭＳ−２０９が知られている（非特許文献２）。ＭＳ−２０９はＰ糖蛋白質と直接結合して、Ｐ糖蛋白質への制癌剤の結合を阻害することにより耐性を克服していると考えられている。ベラパミルやシクロスポリンＡはＰ糖蛋白質の制癌剤結合部位に競合的に阻害して耐性を克服すると推察されている。
制癌剤耐性を獲得した癌細胞に対して、耐性克服剤を投与し、制癌作用が増強されれば、癌治療にとってきわめて有効である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０４１６４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】〔CancerRes.,41, 1967-1972, (1981)〕
【非特許文献２】〔Cancer Chemother. Pharmacol., 35,271-277 (1995)、Cancer Chemother. Pharmacol., 36,361-367 (1995)〕
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、実際には、耐性克服剤の投与についても限界がある。例えば、制癌剤耐性克服作用が知られているカルシウム拮抗薬のベラパミルやニフェジピンについては、そのin vitroで有効とされる量は、動物やヒトにおいて、通常投与される量に比べ多量であり、血圧低下などの重篤な作用により、投与することは困難である。このように、制癌剤耐性克服剤として候補に挙げられる薬剤や癌細胞増殖阻害剤は、生体に対して影響が少ない安全性の高い薬剤であることも極めて重要な要素となる。
制癌剤耐性を有する癌細胞では、細胞膜変化による薬剤の取り込みの低下、Ｐ糖蛋白質や多剤耐性関連蛋白（ＭＲＰ）などによる薬剤排出の亢進、Ｐ−４５０などの薬物活性化酵素の活性低下、解毒酵素の活性上昇、制癌剤の解毒に関与する還元型グルタチオン（ＧＳＨ）濃度の上昇などが認められている。
また、制癌剤に対して耐性を獲得した癌細胞の中には、他の薬剤に対しても耐性を示すことがある。これを多剤耐性（multidrug
resistance；ＭＤＲ）という。多剤耐性を獲得した癌細胞では、分子量１７０ｋＤのＰ糖蛋白質を高発現していることが知られている。
従来の耐性克服剤は、Ｐ糖蛋白質や多剤耐性関連蛋白（ＭＲＰ）が関与する、いわゆるＭＤＲに対する耐性克服剤であった。カルシウム拮抗剤については、ベラパミルでの制癌剤耐性克服作用もＭＤＲに関連しているといわれ、シスプラチン耐性には動物実験で無効であったと報告されている。また、ベラパミルについては、ＭＤＲに対する小児での臨床試験が組まれたが、血圧低下（徐脈）のため治験は中止となったとの報告もある。
【０００７】
Ｐ糖蛋白質は多くの正常細胞にも存在し、排泄機構に関与している。制癌剤に対しては、Ｐ糖蛋白質はＡＴＰのエネルギーを利用して種々の制癌剤を細胞外に排出するポンプ機能を持ち、制癌剤の細胞内濃度を低下させて細胞を制癌剤に対し耐性化させる。癌種によっては、Ｐ糖蛋白質の発現の亢進している大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌や再発とともにＰ糖蛋白質の発現が亢進してくる急性白血病、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫等があり、またＰ糖蛋白質の発現の少ない乳癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、黒色腫等が知られている。
【０００８】
１９８１年にカルシウム拮抗剤であるベラパミルが多剤耐性を克服することが見出された（非特許文献１）。その後、いくつかのカルシウム拮抗薬やカルモジュリン拮抗薬などにも制癌剤耐性克服作用があることが明らかになった。また、免疫抑制剤であるシクロスポリンＡにも制癌剤耐性克服作用があることが明らかになった。また、カルシウム拮抗作用の弱い多剤耐性克服剤として、ＭＳ−２０９が知られている（非特許文献２）。ＭＳ−２０９はＰ糖蛋白質と直接結合して、Ｐ糖蛋白質への制癌剤の結合を阻害することにより耐性を克服していると考えられている。ベラパミルやシクロスポリンＡは、Ｐ糖蛋白質の制癌剤結合部位に対し競合的に阻害して制癌剤耐性を克服すると推察されている。これらのカルシウム拮抗剤や免疫抑制剤はその薬剤が本来的に有するカルシウム拮抗作用や免疫抑制作用が副作用として重篤で、臨床的に使用するには問題がある。
また、抗癌剤による治療法が確立するに従い、癌の種類によってはかなりの頻度で、患者の社会生活への復帰が可能となっている。しかし、癌細胞が、これら抗癌剤の投与により、あるいは、自然発生的に、制癌剤に対する耐性を有し、結果として、癌患者の生命予後に重大な影響を与えることも少なくない。
以上のように、制癌剤耐性を克服することは、癌治療の上で重要な課題であるが、制癌剤耐性克服作用を有する薬剤の多くは比較的強い毒性を有しており問題とされている。癌治療において、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して耐性克服作用を有して、生体に使用して毒性が少ない耐性克服剤の出現が渇望されている。
【０００９】
プラチナのアナログであるシスプラチンやカルボプラチン、ネダプラチンなどの白金製剤は固形がんにおいて重要な薬剤である。プラチナ製剤に対する制癌剤耐性の克服は癌治療の重要な要件である。制癌剤耐性を有する癌ではシスプラチン排出がおこなわれていることが推定され、ＰＣ１４におけるシスプラチン耐性では、細胞内シスプラチン量が減少している。これに対し４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容しうる塩（以下、Ｋ２０１という）を、有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤が、シスプラチン耐性癌細胞において、細胞内のシスプラチン濃度を高める作用があることは、既に開示されている(特許文献１)。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、毒性が少ない、制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤を提供することを目的としている。
本発明者は、次の一般式〔Ｉ〕：
【化１】
で示される４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩が、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与して、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制し、生体に対する影響が弱く、安全性の高いことを発見して、本発明に至った。
【００１１】
即ち、本発明は、４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤にあり、また、本発明は、４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩、及び制癌剤を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤にあり、さらに、本発明は、２種類の薬剤を含む制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤キットであって、第一の薬剤が４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩であり、第二の薬剤が制癌剤であることを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤キットにある。
【００１２】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容される塩（以下、Ｍ２０１という）は、２０１０年９月２日に国際公開番号：ＷＯ２０１０／０９８０８０Ａ１号公報において、国際公開された化合物であり、該化合物の赤外線吸収、核磁気共鳴吸収及び質量分析の測定結果は以下のとおりである。
ＩＲ（ｃｍ−１）３４５２，２９１２，１６４３，１０２２、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨＺ）δ １．１−２．９５（１７Ｈ，ｍ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．８６−４．１６（２Ｈ，ｍ），４．６５（２Ｈ，ｓ），６．８−７．６５（８Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＦＤ−ＭＳ）：４４．１（Ｍ＋）
【００１３】
Ｍ２０１は、心筋の弛緩作用を有し、拡張障害治療、高血圧治療薬など心疾患についての治療薬としての用途を有する。しかしながら、国際公開番号：ＷＯ２０１０／０９８０８０Ａ１号公報には、Ｍ２０１が制癌剤耐性を有する抗腫瘍効果増強剤であることについては全く開示していない。
本発明は、Ｍ２０１が、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与されたとき、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制すること、生体に対する影響が弱く、安全性が高いことについての発見に基づくものである。
【００１４】
また、Ｍ２０１は、次の一般式〔ＩＩ〕：
【化２】
で示される４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容される塩(以下、Ｋ２０１という)の代謝物の一であるが、Ｋ２０１を酸化反応により酸化することによっても製造することができる。
Ｍ２０１は、制癌剤と併用して初めて強い、制癌剤耐性癌細胞の増殖抑制作用を発揮する。これに対してＫ２０１は、単独で使用した場合、制癌剤耐性を有する癌細胞の生育を抑制するが、制癌剤と併用した際の制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖抑制作用はＭ２０１に比し弱い。
このことは、制癌剤による副作用が強く出る場合は、Ｋ２０１と制癌剤を併用するよりも、安全性の高いＭ２０１と制癌剤とを併用する方が、より効果的にかつ安全に制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制できることを意味する。
【００１５】
また、Ｍ２０１はＫ２０１の生体内代謝物であるが、Ｋ２０１を酸化してＭ２０１を化学反応で製造する方が、Ｋ２０１の生体内での代謝により、Ｍ２０１を製造するよりも、Ｍ２０１を大量に製造できるので、Ｋ２０１を投与して体内でＭ２０１を生成させるよりも、Ｍ２０１を化学反応で製造する方がＭ２０１の投与量を大きくすることができ、制癌剤による治療効率を向上させることができる。
【００１６】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体又はその薬学的に許容しうる塩（Ｍ２０１）を、有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤を制癌剤と併用する場合、４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容しうる塩（Ｋ２０１）を、有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤を制癌剤と併用する場合より治療効果が高く、さらに生体への影響が少なく、安全性が高いことが分かった。
また、Ｋ２０１を投与して生体内でＭ２０１を生成させる場合は、Ｋ２０１の副作用により、Ｋ２０１の投与量は制限されるから、その治療効果は自ずと限度があり、Ｋ２０１の投与量を越えて治療効果の拡大を望むことはできない。
しかし、Ｍ２０１をＫ２０１から化学反応により製造する場合は、Ｋ２０１から生体内での代謝によりＭ２０１を製造するよりも、Ｋ２０１の副作用を受けずにＭ２０１を大量に製造することができる。さらに、Ｍ２０１は、Ｋ２０１より副作用が少なく、生体への安全性が高いから、その分投与量を増加できることとなり、生体内のＭ２０１濃度を高めて治療効果を増すことができる。
【００１７】
本発明において、Ｍ２０１と併用される制癌剤としては、白金錯体、植物由来抗腫瘍性物質又は抗腫瘍性抗生物質がある。また、Ｍ２０１と併用される制癌剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、アドリアマイシン又はタキソールがある。
本発明は、Ｍ２０１を有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤にある。
本発明において、２種類の薬剤を含んでなる癌治療用医薬キットであって、第一の薬剤がＭ２０１であり、第二の薬剤が制癌剤である癌治療用医薬キットにある。
【００１８】
本発明を説明するために本明細書において使用する用語の定義は次の通りである。
制癌剤耐性克服剤」とは、制癌剤に対する癌細胞の耐性を低下させる作用を有する薬剤を意味し、これは、即ち、制癌剤耐性を獲得した癌細胞の制癌剤に対する感受性を増加させる作用を有する薬剤をも意味する。この場合、「感受性の増加」とは、制癌剤耐性細胞に対する制癌剤の効果レベルを、制癌剤感受性細胞に対する効果レベル以上に上昇させるのみならず、制癌剤耐性細胞に対する制癌剤の効果レベルを制癌剤感受性細胞に対する効果レベルとほぼ同等まで上昇させることも含む。また、「耐性克服」と同義語として「耐性抑制」、「耐性解除」、「抵抗性解除」、「感受性増強」等を挙げることができる。
また、本発明において、「制癌剤効果増強剤」とは、制癌剤と併用することによって制癌剤の活性、言い換えれば制癌剤それ自体が有する制癌効果を増強する薬剤である。この場合、増強とは制癌剤耐性細胞に対する制癌剤の効果レベルを制癌剤感受性細胞に対する効果レベル以上に上昇させるのみならず、未だ耐性化していない癌細胞の制癌剤に対する感受性を高めることも意味する。
したがって、本発明において、制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤の用語は、当該薬剤を用いることにより、制癌剤耐性を獲得した癌細胞について、制癌剤に対する感受性を増加させることができるばかりでなく、制癌剤の投与量を低減したり、あるいは、制癌剤の投与間隔を延長したりすることを可能にする薬剤を意味する。
【００１９】
本発明において、Ｍ２０１における「薬学的に許容される塩」とは、医薬的に許容されうる塩であり、好適には医薬的に許容されうる酸付加塩であって、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は硝酸塩等の無機酸付加塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩又はアスコルビン酸塩等の有機酸付加塩；アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩等のアミノ酸付加塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。又、場合によっては含水物あるいは水和物であってもよい。
【００２０】
本発明において、「制癌剤」とは、ブスルファン、カルボコン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、チオテパ、ウラシルマスタード、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）、リン酸エストラムスチン等のアルキル化剤；アザチオプリン、アンシタビン、カルモフール、ドキシフルリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、チオイノシン、テガフール、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ヒドロキシカルバミド、シタラビンオクホスファート、ペントスタチン等の代謝拮抗剤；ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ブレオマイシン（ＢＬＭ）、ダウノルビシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ネオカルチノスタチン（ＮＣＳ）、塩酸イダルビシン等の抗腫瘍性抗生物質；エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール（パクリタキセル）、塩酸イリノテカン等の植物由来抗腫瘍性物質；シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）、ネダプラチン（ＮＤＰ）等の白金錯体；プレドニゾン、プレドニゾロン、テストステロン、エストラムスチン、ノルエチステロン、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、塩酸ファドロゾール、タモキシフェン等のホルモン剤、ミトキサントロン（ＭＸＴ）等のアントラサイクリン系化合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい制癌剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等の白金錯体；ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン、塩酸イダルビシン等の抗腫瘍性抗生物質；エトポシド、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、塩酸イリノテカン等の植物由来抗腫瘍性物質等である。より好ましくはシスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、アドリアマイシン、タキソール等であり、特に好ましくはシスプラチンである。制癌剤のカテゴリーとしては白金錯体が最も好ましく、次いで植物由来抗腫瘍性物質が好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、上記一般式〔１〕で示される４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド又はその薬学的に許容され得る塩、即ち、「Ｍ２０１」を有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤をその要旨とするものであり、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与した場合、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制することができ、しかも、生体に対する影響が少なく、安全性が高く、癌治療に有効である。さらにＫ２０１に比べて制癌剤を併用した際の細胞増殖阻害作用が強く、Ｋ２０１に比べ生体に対する影響が少なく、Ｋ２０１の投与に比べ、Ｍ２０１の投与量を増加することができ、癌に対し制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤としての働きを大きくして、高い治療効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、シスプラチン１０μＭを非耐性株、耐性株に加えた際の生存率を示す図である。
【図２】図２は、Ｍ２０１及びＫ２０１のシスプラチン耐性株に対する抗腫瘍効果増強作用の比較図である。
【図３】図３は、Ｍ２０１及びＫ２０１に対する繊維芽細胞の生存率を示す図である。
【図４】図４は、Ｍ２０１、Ｋ２０１及びベラパミルの正常ラットの循環動態、特にダブルプロダクトに及ぼす影響を示す図である。
【図５】図５は、Ｋ２０１を酸化してＭ２０１を製造する反応経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、次の一般式〔Ｉ〕：
【化３】
で表される４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５−テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン-１-オキシド若しくはその薬学的に許容される塩、即ちＭ２０１を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤及び制癌剤耐性克服剤にある。
本発明の化合物は、塩基性の窒素原子を有しているので、この位置において、酸付加塩を形成させることができる。この酸付加塩を形成させるための酸として は、薬学的に許容されるものであれば特に制限はない。本発明の好ましい酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は硝酸塩等の
無機酸付加塩;シュウ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩又はアスコルビン酸塩等の有機酸付加塩;アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩等のアミノ酸付加塩などが挙げられる。また、本発明の化合物又はその酸付加塩は、水和物のような溶媒和物であってもよい。
【００２４】
本発明の化合物において、へテロ環の硫黄（Ｓ）と酸素（Ｏ）の結合（ＳＯ）は、強い電気陰性を示す極性原子団を形成し、配位結合であるから、硫黄と酸素の
結合については、配位結合であることを示すために、へテロ環Ｓ→Ｏの矢印で示すことができ、また、この配位結合は、へテロ環Ｓ＋−Ｏ−で示すことができる。
【００２５】
本発明において、Ｍ２０１は、母体化合物のＫ２０１で表される化合物を適当な酸化剤で酸化することにより製造することができる。
Ｋ２０１を酸化してＭ２０１を製造する方法。
Ｋ２０１を酸化する酸化剤としては、過 酸、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸(mCPBA)などを使用することができる。溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロ
ゲン化炭化水素などを適宜使用することができる。反応温度はスルホンまでの酸化を防止するために低温、例えば、０℃から５℃程度が好ましい。反応混合物か ら、抽出操作やクロマトグラフィーや蒸留などの公知の分離精製手段により、目的物を分離精製することができる。本発明の化合物において、へテロ環の硫黄（Ｓ）と酸素（Ｏ）の結合（ＳＯ）は、強い電気陰性を示す極性原子団を形成し、配位結合であるから、硫黄と酸素の
結合については、配位結合であることを示すために、へテロ環Ｓ→Ｏの矢印で示すことができ、また、この配位接合は、へテロ環Ｓ＋−Ｏ−で示すことができる。
本発明のＭ２０１で表される化合物は、Ｋ２０１で表される化合物を適当な酸化剤で酸化することにより製造することができる。
【００２６】
本発明において、例えば、Ｍ２０１の４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４―ベンゾチアゼピン-1-オキシドは、次の反応経路で、Ｋ２０１を 酸化することにより製造することができる。
[化４]
上記の反応経路により、例えば、Ｋ２０１の４−［３−（４−ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピンのヘテロ環の硫黄を、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）溶媒中で、酸化剤のメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）により、酸化することにより製造することができる。
この場合、Ｋ２０１の４−［３−（４−ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン塩酸塩を、クロロホルム溶媒中で、酸化剤のメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）により酸化することにより、４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベ
ンゾチアゼピン-1-オキシド、即ちＭ２０１が製造される。ここで製造されたＭ２０１は、移動相としてクロロホルム-メタノール混合液を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーにより分離し、次いで、分離されたクロロホルム-メタノール共沸溶媒から溶媒を留出し、さらにアルゴン中で残留溶媒を駆出して最終製品とする。このようにして得られたＭ２０１は、９０％以上の純度を有しており、４４０．６１の分子量を有し、アモルファスであり、室温で酸素及び湿度並びに酸及びアルカリに安定であり、エタノール及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に易溶であり、皮膚刺激性を有している。また、本発明のＭ２０１のシュウ酸塩
は、５３０．６５の分子量を有し、純度９０％以上で、１６７〜１６８℃の融点を有する結晶であり、水、エタノール及びジメチルスルホキシドに可溶である。１Ｈ−ＮＭＲの室温における測定で、アミド部分における立体異性体が約２：３の割合で存在することが確認されている。
Ｍ２０１をＫ２０１から代謝反応により製造する場合は、例えば、ラット又はイヌに、その母体化合物であるＫ２０１の１，４-ベンゾチアゼピン誘導体を投与し、得られた尿及び糞に、水を加 えてホモジネートし、その上清を、オクタデシル基を化学結合させたシリカゲル（ＯＤＳ）を用いる逆相カラムを使用して、移動相は、Ａ液として、０．１％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有の水を用い、Ｂ液として、０．１派ＴＦＡ含有のアセトニトリルを用いて、グラジエント溶離を用いる高速液体クロマトグラ フィーにより、保持時間１９〜２２分で成分分離した。分離された成分は、マススペクトロメトリーにより、質量荷電比（ｍ/Ｚ）は４５７であった。なお、Ｍ２０１も、本発明のＫ２０１と同様の手法で、グラジエント溶離を用いる高速液体クロマトグラフィーにより、保持時間２７〜３０分で
成分分離して得ることができる。
使用試薬
Ｋ２０１：ＬｏｔＮｏ．３１Ｔ−５−７０９０２
ｍＣＰＢＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）：ＬｏｔＮｏ．０６６２０ＬＤ，ＭＫＡＡ２８２９
Ｎａ２ＳＯ３（和光純薬）：特級ＬｏｔＮｏ．ＣＤＫ３０４５
ＮａＯＨ（関東化学）：ＬｏｔＮｏ．０１１Ｘ６０１７
ＣＨＣ１３（和光純薬）：特急ＬｏｔＮｏ．ＣＤＪ５０７８
Ｎａ２ＳＯ．（和光純薬）：特急ＬｏｔＮｏ．ＣＤＱ５１３９
シリカゲル（関東化学）：ＬｏｔＮｏ．０１０１０１２０１
総括
Ｋ２０１（ＬｏｔＮｏ．３１ＴＬ５−７０９０２）１０７．７０ｇを用いて，反応及び絡む生成を行った結果，終了５５．５５ｇ，収率５３．９％，ＨＰＬＣ純度９９．５６ａｒｅａ％（スルホン体：０．４０面積％）でＭ２０１を得ることができた（Ｌｏｔ Ｎｏ．０９１０１９Ａ）
【００２７】
本発明の制癌剤耐性克服剤及び制癌剤効果増強剤及び医薬組成物における有効成分としては、一般式〔１〕で示される４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４―ベンゾチアゼピン-1-オキシド化合物又はその塩（Ｍ２０１）が用いられる。
【００２８】
本発明において、Ｍ２０１は優れた制癌剤耐性克服作用及び制癌剤効果増強作用を有する。すなわち、本発明の制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤は、制癌剤と併用投与することにより、耐性化した癌細胞に対しても制癌剤の制癌作用が発揮される。本発明化合物を制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤として用いる場合、通常全身的、あるいは局所的に、経口又は非経口で投与される。非経口投与としては、静脈内投与（点滴静注を含む）、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与、膀胱内投与、髄腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、直腸内投与、腫瘍内投与などが挙げられる。本発明の制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤は、制癌剤と同時に投与してもよく、又は制癌剤の投与前若しくは投与後に投与してもよいし、あるいは制癌剤の休薬期間中に投与してもよい。制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤と制癌剤との投与経路は同じであっても、異なっていてもよい。
【００２９】
本発明の制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤は、制癌剤と併用投与することにより、ヒトを含む哺乳動物における肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、大腸癌（直腸癌、結腸癌）、小腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、悪性黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌）、卵巣癌、乳癌、骨肉腫、悪性リンパ腫、前立腺癌、白血病（急性白血病、慢性白血病）、骨髄腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、皮膚癌、睾丸腫瘍等の癌（悪性腫瘍）の治療に使用することできる。
【００３０】
本発明において、「併用投与」とは、２種類の薬剤を同時に、連続して、又は時間間隔をおいて投与することを意味する。２種類の薬剤は、混合物として投与してもよく、または別々の製剤として投与してもよい。別々の製剤として投与する場合、それぞれの投与経路は同じであっても異なっていてもよい。
【００３１】
本発明において、Ｍ２０１の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人当たり０．０１ｍｇ乃至１ｇの範囲で、一日一回から数回経口あるいは非経口投与される。
併用投与する制癌剤の投与量は、通常の癌の治療に使用される投与量、又はそれより少ない投与量でよい。また併用投与する制癌剤の投与経路は、通常の癌の治療で用いられる投与経路と同じであってよい。
【００３２】
また、本発明において、Ｍ２０１と、制癌剤とを含有する医薬組成物として投与することもできる。この場合、組成物中におけるＭ２０１と、制癌剤との重量比は、１：１００〜１００：１の範囲であってよいが、この範囲に限定されるものではない。
【００３３】
本発明によれば、２種類の薬剤を含んでなる癌治療用医薬キットが提供される。本発明の癌治療用医薬キットにおいて、第一の薬剤は、Ｍ２０１を含有する制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤であり、第二の薬剤は制癌剤である。これら２種類の薬剤を併用投与することによって、癌の治療、特に制癌剤に対して耐性化した癌の治療に使用することができる。制癌剤耐性克服剤あるいは制癌剤効果増強剤は、制癌剤と同時に投与してもよく、又は制癌剤の投与前若しくは投与後に投与してもよいし、場合によっては、制癌剤の休薬期間中に投与してもよい。これら制癌剤耐性克服剤又は制癌剤効果増強剤の投与経路は、制癌剤の投与経路と同じであっても、異なっていてもよい。
【００３４】
Ｍ２０１を経口投与のための固体組成物にする場合、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤等の剤形が可能である。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、分散剤又は吸着剤等、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微晶性セルロース、澱粉、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム又は無水ケイ酸末等と混合される。又、組成物は常法に従って、希釈剤以外の添加剤を混合させてもよい。
錠剤又は丸剤に調製する場合は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで皮膜してもよいし、二以上の層で皮膜してもよい。さらに、ゼラチン又はエチルセルロースのような物質のカプセルにしてもよい。
【００３５】
経口投与のための液体組成物にする場合は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶解剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等の剤形が可能である。用いる希釈剤としては、例えば精製水、エタノール、植物油又は乳化剤等がある。又、この組成物は希釈剤以外に浸潤剤、懸濁剤、甘味剤、風味剤、芳香剤又は防腐剤等のような補助剤を混合させてもよい。
【００３６】
非経口のための注射剤に調製する場合は、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤または乳化剤を用いる。水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水、シクロデキストリン及びその誘導体、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリエチルアミン等の有機アミン類あるいは無機アルカリ溶液等がある。
水溶性の溶液剤にする場合、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールあるいはオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類等を用いてもよい。又、可溶化剤として、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、蔗糖脂肪酸エステル等の界面活性剤（混合ミセル形成）、又はレシチンあるいは水添レシチン（リポソーム形成）等も用いられる。又、植物油等の非水溶性の溶解剤と、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等からなるエマルジョン製剤にすることもできる。
【００３７】
非経口投与のためのその他の組成物としては、一つ又はそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方される外用液剤、軟膏のような塗布剤、座剤又はペッサリー等にしてもよい。
【００３８】
本発明の医薬組成物を経口投与のための固体組成物にする場合には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤等の剤形が可能である。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、分散剤又は吸着剤等、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、
微晶性セルロース、澱粉、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム又は無水ケイ酸末等と混合され、常法にしたがって製造することができ る。
錠剤又は丸剤に調製する場合は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸
溶性物質のフィルムで皮膜してもよいし、二以上の層で皮膜してもよい。さらに、ゼラチン又はエチルセルロースのような物質のカプセルにしてもよい。
【００３９】
経口投与のための液体組成物にする場合は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶解剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等の剤形が可能である。用いる希釈剤と
しては、例えば精製水、エタノール、植物油又は乳化剤等がある。又、この組成物は希釈剤以外に浸潤剤、懸濁剤、甘味剤、風味剤、芳香剤又は防腐剤等のよう な補助剤を混合させてもよい。
【００４０】
非経口のための注射剤に調製する場合は、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤または乳化剤を用いる。水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤とし
ては、例えば注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水、シクロデキストリン及びその誘導体、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミ ン、トリエチルアミン等の有機アミン類あるいは無機アルカリ溶液等がある。
水溶性の溶液剤にする場合、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールあるいはオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類等を用いてもよい。又、可溶化剤として、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、蔗糖脂肪酸エステル等の界面活性剤(混合ミセル形成)、又はレシチンあるいは 水添レシチン(リポソーム形成)等も用いられる。又、植物油等の非水溶性の溶解剤と、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油又はポリオキシエチレンポ
リオキシプロピレングリコール等からなるエマルジョン製剤にすることもできる。
【００４１】
本発明において、Ｍ２０１は、遊離の化合物として、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人当たり０．１ｍｇ乃至１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ
乃至０．５ｇの範囲で、一日一回から数回に分けて経口あるいは非経口投与することができる。
【００４２】
以下に、本発明の一実施例をあげて、本発明について更に具体的に説明するが、ここでの例示及び説明により、何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
シスプラチン非耐性株およびシスプラチン耐性株に対するシスプラチンの制癌作用
シスプラチン非耐性株およびシスプラチン耐性株に対するシスプラチンの非小細胞肺癌細胞株における制癌剤感受性増強作用を調べるために、ヒト非小細胞肺癌株であるＰＣ−１４及びそのシスプラチン耐性細胞株ＰＣ−１４／ＣＤＤＰを用いてシスプラチンに対する制癌作用を検討した。シスプラチン耐性株は、シスプラチン投与下での段階的濃度上昇により、作成した。
ＲＰＭＩ １６４０培地中でＰＣ−１４及びＰＣ−１４／ＣＤＤＰをトリプシン処理により又はセルスクレイパーを用いてシングル細胞とし、１５μｌ当たり１００個の細胞浮遊液を調製した。これを９６穴プレートに１ウェル当たり１５０μｌづつ入れた。また、制癌剤（シスプラチン）を最終濃度０、１，５，１０μＭになるように、滅菌蒸留水に溶解させて１５０μｌ加えた。陰性対照として細胞を加えない群を調製した。３７℃、５％二酸化炭素濃度、飽和水蒸気の条件下で７２時間培養した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフぇニルテトラゾリウムブロマイド〕試薬を２０μｌ加えて、３７℃で更に４時間培養した。培養終了後、プレートごと遠心し、上清を捨てた。２００μｌのジメチルスルホキシドを加えて、細胞内のミトコンドリアの酵素活性により生成したホルマザン結晶を溶解させ、５６２〜６３０ｎｍの吸光度をマルチプレートリーダーを用いて測定した。シスプラチン濃度が０μＭを対照とした平均発育率を１００％として、非耐性株および耐性株に対する１０μＭシスプラチン投与後の生存率を算出した。非耐性株の生存率は３１％であり、耐性株の生存率は６５％であった。この結果のシスプラチン１０μＭを非耐性株、耐性株に加えた際の生存率を図１に示す。
【実施例２】
【００４４】
Ｍ２０１およびＫ２０１のシスプラチン耐性株に対する抗腫瘍効果増強作用の比較
シスプラチン耐性非小細胞肺癌細胞株における被験化合物の制癌剤感受性増強作用を調べるために、ヒト非小細胞肺癌株であるＰＣ−１４のシスプラチン耐性細胞株ＰＣ−１４／ＣＤＤＰを用いてシスプラチンに対する抗腫瘍効果増強作用を検討した。ＲＰＭＩ １６４０培地中でＰＣ−１４及びＰＣ−１４／ＣＤＤＰをトリプシン処理により又はセルスクレイパーを用いてシングル細胞とし、１５μｌ当たり１００個の細胞浮遊液を調製した。これに化合物Ｋ２０１又はＭ２０１をジメチルスルホキシドに溶解させて、最終濃度１０μＭとなるように加え、これを９６穴プレートに１ウェル当たり１５０μｌづつ入れた。また、制癌剤（シスプラチン）を最終濃度０．１、５、１０μＭになるように、滅菌蒸留水に溶解させて１５０μｌ加えた。陰性対照として細胞を加えない群を、又陽性対照として制癌剤及びいずれの化合物（Ｍ２０１又はK２０１）も加えない群を調製した。３７℃、５％二酸化炭素濃度、飽和水蒸気の条件下で７２時間培養した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＭＴＴ試薬を２０μｌ加えて、３７℃で更に４時間培養した。培養終了後、プレートごと遠心し、上清を捨てた。２００μｌのジメチルスルホキシドを加えて、細胞内のミトコンドリアの酵素活性により生成したホルマザン結晶を溶解させ、５６２〜６３０ｎｍの吸光度をマルチプレートリーダーを用いて測定した。陰性対照の平均発育率を０％、陽性対照の平均発育率を１００％として生存率を算出した。その結果を図２に示す。
図２に示すように、シスプラチン耐性株に対し、Ｋ２０１（１０μＭ）は、単独で、耐性株の生存率を低下させたが、Ｍ２０１（１０μＭ）には単独での耐性株の生存率低下作用はなかった。しかし、Ｍ２０１は、シスプラチンと併用すると急激に抗腫瘍効果増強作用を示し、Ｋ２０１に比べ、制癌剤を併用することにより、抗腫瘍効果増強作用を示すことが明らかとなった。
【実施例３】
【００４５】
非癌細胞に対する影響を調べるため、Ｋ２０１及びＭ２０１に対する線維芽細胞の生存率を検討した。ＲＰＭＩ １６４０培地中でＰＣ−１４及びＰＣ−１４／ＣＤＤＰをトリプシン処理により又はセルスクレイパーを用いてシングル細胞とし、１５μｌ当たり１００個の細胞浮遊液を調製した。これに化合物Ｋ２０１又はＭ２０１をジメチルスルホキシドに溶解させて、最終濃度０、１、５、１０、３０、５０、１００μＭとなるように加え、これを９６穴プレートに１ウェル当たり３００μｌづつ入れた。陰性対照として細胞を加えない群を、又陽性対照としていずれの化合物も加えない群を調製した。３７℃、５％二酸化炭素濃度、飽和水蒸気の条件下で７２時間培養した後、Ｄ−ＰＢＳ（−）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＭＴＴ試薬を２０μｌ加えて、３７℃で更に４時間培養した。培養終了後、プレートごと遠心し、上清を捨てた。２００μｌのジメチルスルホキシドを加えて、細胞内のミトコンドリアの酵素活性により生成したホルマザン結晶を溶解させ、５６２〜６３０ｎｍの吸光度をマルチプレートリーダーを用いて測定した。陰性対照の平均発育率を０％、陽性対照の平均発育率を１００％として求めた。５０％細胞発育抑制濃度（ＩＣ50）を算出した。この結果を図３に示す。
線維芽細胞に対してＫ２０１に比べ、Ｍ２０１の生存率は高く、５０％細胞発育抑制濃度（ＩＣ５０）は、Ｍ２０１は９２μＭ、Ｋ２０１は１９μＭであった。このことから、Ｍ２０１はＫ２０１に比べ非腫瘍細胞に対する影響が極めて弱いことがわかった。臍帯静脈内皮細胞およびヒト平滑筋細胞においても同様の結果であった。
【実施例４】
【００４６】
Ｋ２０１、Ｍ２０１及びベラパミルの正常ラットの循環動態、特にダブルプロダクトに及
ぼす影響について
生体への影響を調べるために、循環動態の指標として、血圧と心拍数の積 ダブルプロダクトを測定した。ダブルプロダクトは心筋の酸素消費量を反映することが知られ、その低下は循環動態への抑制を意味する。
ウィスター(Ｗｉｓｔａｒ)系雄性ラットを1週間飼育後、３％イソフルランで吸入麻酔し、気管内挿管後、人工呼吸器を装着した。１．７％イソフルラ ンの吸入麻酔下で、呼吸管理を行った。右総頚動脈から圧測定チップ付カテーテル(2Fミラー社)を左室内に挿入し、また、右大腿静脈から本発明の化合物又 は生理食塩水注入用ポリエチレンチューブ(SP10)を挿入した。10分間の血行動態の安定化を図った後に、連続的に1分毎に、左室拡張期最小圧、左室拡 張末期圧を測定し、Ｍ２０１、Ｋ２０１、ベラパミルを０．３ｍｇ/ｋｇ/分で１０分間投与した。対照例では生理食塩水を投与し、各溶液の注入速度は1分間あたり、１６．６μｌとした。各例３例で調べた。
Ｋ２０１、Ｍ２０１又はベラパミルの投与前及び投与後における左室圧、心拍数その積すなわちダブルプロダクトを２０心拍測定し算出した。測定されたダブルプロダクトは投与前値を１００％とし、投与後の値を当与前値に対する値（％表示）で表した。測定値は平均値と標準偏差値で求めた。結果を図４に示す。
Ｍ２０１はダブルプロダクトを低下させず、生体への影響が最も少ないことが判った。Ｋ２０１はわずかに低下させたが、耐性克服作用があるとされるカルシウム拮抗薬ベラパミルはダブルプロダクトを著しく低下させ、循環動態への強い影響があることがわかった。
【実施例５】
【００４７】
Ｍ２０１およびＫ２０１の経済効率について
Ｍ２０１はＫ２０１の代謝物であることが分かっている。また、Ｍ２０１はＫ２０１を酸化させることによっても製造することができる。Ｍ２０１の経済効率を調べる目的で、Ｋ２０１からＭ２０１を作成した場合の収率を調べ、また、Ｋ２０１に放射性同位元素を結合させ、イヌにＫ２０１を投与した際のＭ２０１の血漿中濃度を投与５部後、および２時間後に測定した。なお、Ｋ２０１の半減期は約２ないし３時間であることが知られている。
【実施例６】
【００４８】
Ｋ２０１（ＬｏｔＮｏ．３１Ｔ−５−７０９０２）１０７．７０ｇを用いて、図５の製造方法チャートに従いＭ２０１を製造した。
Ｋ２０１の４−［３−（４−ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン塩酸塩１０７．７０ｇを、室温下でクロロホルム溶媒に溶解し、０〜５℃の温度に冷却し、クロロホルム溶媒中で、反応温度が上昇しないように留意しながら攪拌して、酸化剤のメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）により酸化することにより、４−［３−（４-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７-メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベ
ンゾチアゼピン-1-オキシド、即ちＭ２０１を製造した。ここで製造されたＭ２０１に、０〜５℃の温度で、硫酸ナトリウム溶液を加えて、さらに攪拌を続け、０〜５℃の温度で、水酸化ナトリウム溶液を加え、攪拌を続けて、有機層を分液後、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を水で洗浄し、次いで食塩水で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、減圧濃縮した。
濃縮残渣についを、移動相としてクロロホルム-メタノール混合液を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーにより分離し、次いで、分離されたクロロホルム-メタノール共沸溶媒から溶媒を留出し、さらにアルゴン中で残留溶媒を駆出して最終製品とした。このようにして得られたＭ２０１は、９０％以上の純度を有しており、４４０．６１の分子量を有し、アモルファスであり、室温で酸素及び湿度並びに酸及びアルカリに安定であり、エタノール及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に易溶であり、皮膚刺激性を有している。また、本発明のＭ２０１のシュウ酸塩
は、５３０．６５の分子量を有し、純度９０％以上で、１６７〜１６８℃の融点を有する結晶であり、水、エタノール及びジメチルスルホキシドに可溶である。１Ｈ−ＮＭＲの室温における測定で、アミド部分における立体異性体が約２：３の割合で存在することが確認されている。
その結果、収量５５．５ｇ，収率５３．９％，ＨＰＬＣ純度９９．５６ａｒｅａ％でＭ２０１を得ることができた。この製造方法のフロー図を図５に示す。
【実施例７】
【００４９】
（２）Ｋ２０１を静脈内に投与した際のイヌにおける血中のＭ２０１組成
放射性物質で標識したＫ２０１（ＪＴＶ−５１９）を、０．２％クエン酸および５％マンニトール溶液に加え撹拌し投与液とした。イヌは６および８ヶ月齢の雄性ビーグル犬を使用した。イヌへの投与量は０．３ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。各動物への投与は、３例ずつとした。投与から５分後、２時間後に採血を行い、その血液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を分取し、放射能測定用試料とした。血漿はシンチレーター１０ｍｌを加えて放射能測定サンプルとした。放射能の測定は液体シンチレーションカウンターを用い５分間測定した。未変化体および化合物は３例のプールして測定した。
測定結果は総放射能、未変化体および代謝物濃度を、総放射能を１００％として平均値を算出して表１に示した。
表１
(上記表１において、その他の代謝物のＭ-Ｉは、式〔ＩＩＩ〕
で示される４−［３−４（４−ヒドロキシベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピンを示す。
上記表１において、その他の代謝物のＭ-ＩＩＩは、式〔ＩＶ〕
で示される４−［３−４（４−ヒドロキシベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピン-１-オキシドを示す。
上記表１において、その他の代謝物のＭ-ＩＶは、式〔Ｖ〕
で示される４−［３−4（２,４−ジヒドロキシベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-７−メトキシ-２，３，４，５-テトラヒドロ-１，４-ベンゾチアゼピンを示す。)
その結果、イヌにおいて、投与されたＫ２０１の１３〜１４％が、Ｍ２０１に生成されることが分かった。
以上の実施例５−１および５−２の結果より、Ｍ２０１をＫ２０１から化学合成で得た場合は、Ｍ２０１の収率は５３．９％であり、Ｋ２０１を生体に投与した場合のＭ２０１の生成率は、１３〜１４％であった。このことからＫ２０１を投与するよりも、Ｍ２０１をＫ２０１から製造した方が経済効率が高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、Ｍ２０１を有効成分として含有してなる制癌剤耐性克服剤及び抗腫瘍効果増強剤にあるので、制癌剤耐性を有する癌細胞に対して、制癌剤と併用して投与した場合、制癌剤耐性を有する癌細胞の増殖を抑制することができ、しかも、生体に対する影響が弱く、安全性が高く、癌治療に有効である。
【符号の説明】
【００５１】
図２において、＊: ｐ
＜ ０．０５ ｖｓ Ｋ２０１ＣＤＤＰ ５μＭ 、
＊＊: ｐ
＜ ０．０１ ｖｓ Ｋ２０１ ＣＤＤＰ １μＭ
＊＊＊: ｐ
＜ ０．０００１ ｖｓ Ｋ２０１ ＣＤＤＰ ０μＭ〕
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項２】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体又はその薬学的に許容される塩、及び制癌剤を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項３】
２種類の薬剤を含んでなる癌治療用医薬キットであって、第一の薬剤が上記一般式（１）に記載の４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシドであり、第二の薬剤が制癌剤であることを特徴とする癌治療用医薬キット。
【請求項４】
制癌剤が、白金錯体、植物由来抗腫瘍性物質又は抗腫瘍性抗生物質であるであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤
【請求項５】
制癌剤が、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、アドリアマイシン、ネダラプラチン、ビンクリスチン、エトポシド、アクチノマイシンＤ、イマチニブ又はタキソールであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項６】
制癌剤が、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン、塩酸イダルビシン、エトポシド、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、塩酸イリノテカンであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項７】
制癌剤が、ブスルファン、カルボコン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、チオテパ、ウラシルマスタード、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）、リン酸エストラムスチン、アザチオプリン、アンシタビン、カルモフール、ドキシフルリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、チオイノシン、テガフール、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ヒドロキシカルバミド、シタラビンオクホスファート、ペントスタチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ブレオマイシン（ＢＬＭ）、ダウノルビシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ネオカルチノスタチン（ＮＣＳ）、塩酸イダルビシン、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール（パクリタキセル）、塩酸イリノテカン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）、ネダプラチン（ＮＤＰ）、プレドニゾン、プレドニゾロン、テストステロン、エストラムスチン、ノルエチステロン、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、塩酸ファドロゾール、タモキシフェン、ミトキサントロン（ＭＸＴ）等のアントラサイクリンであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体又はその薬学的に許容される塩を、有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項２】
４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシド誘導体又はその薬学的に許容される塩、及び制癌剤を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項３】
２種類の薬剤を含んでなる癌治療用医薬キットであって、第一の薬剤が上記一般式（１）に記載の４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン−1-オキシドであり、第二の薬剤が制癌剤であることを特徴とする癌治療用医薬キット。
【請求項４】
制癌剤が、白金錯体、植物由来抗腫瘍性物質又は抗腫瘍性抗生物質であるであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤
【請求項５】
制癌剤が、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、アドリアマイシン、ネダラプラチン、ビンクリスチン、エトポシド、アクチノマイシンＤ、イマチニブ又はタキソールであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項６】
制癌剤が、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン、塩酸イダルビシン、エトポシド、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、塩酸イリノテカンであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【請求項７】
制癌剤が、ブスルファン、カルボコン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、チオテパ、ウラシルマスタード、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）、リン酸エストラムスチン、アザチオプリン、アンシタビン、カルモフール、ドキシフルリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、チオイノシン、テガフール、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ヒドロキシカルバミド、シタラビンオクホスファート、ペントスタチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ブレオマイシン（ＢＬＭ）、ダウノルビシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ネオカルチノスタチン（ＮＣＳ）、塩酸イダルビシン、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール（パクリタキセル）、塩酸イリノテカン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）、ネダプラチン（ＮＤＰ）、プレドニゾン、プレドニゾロン、テストステロン、エストラムスチン、ノルエチステロン、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、塩酸ファドロゾール、タモキシフェン、ミトキサントロン（ＭＸＴ）等のアントラサイクリンであることを特徴とする請求項１，２又は３に記載の制癌剤耐性を有する癌細胞に対する抗腫瘍効果増強剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１３１７１０（Ｐ２０１２−１３１７１０Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８２４５２（Ｐ２０１０−２８２４５２）
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【出願人】（５０４４６４６６７）株式会社アエタスファルマ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【出願人】（５０４４６４６６７）株式会社アエタスファルマ (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]