前駆脂肪細胞分化誘導促進剤及び飲食物
【課題】
安全性に優れかつ優れた前駆脂肪細胞分化誘導促進活性作用を有し、糖尿病及びインスリン抵抗性症候群に有用な薬剤や飲食物を提供すること。
【解決手段】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する糖尿病の予防及び改善剤。カタルパラクトン（catalpalactone）を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。キササゲの抽出物を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。キササゲの抽出物を含有する糖尿病の予防及び改善剤。キササゲの抽出物を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する飲食物。キササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有する飲食物。キササゲが木部である上記の各薬剤又は飲食物。
安全性に優れかつ優れた前駆脂肪細胞分化誘導促進活性作用を有し、糖尿病及びインスリン抵抗性症候群に有用な薬剤や飲食物を提供すること。
【解決手段】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する糖尿病の予防及び改善剤。カタルパラクトン（catalpalactone）を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。キササゲの抽出物を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。キササゲの抽出物を含有する糖尿病の予防及び改善剤。キササゲの抽出物を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する飲食物。キササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有する飲食物。キササゲが木部である上記の各薬剤又は飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前駆脂肪細胞分化誘導促進剤及び飲食物に関し、詳細には、カタルパラクトン又はキササゲの抽出物を含有する前駆脂肪分化誘導促進剤及び飲食物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病は、日本人の死亡原因の３分の２を占めるとも言われ、現在、生活習慣病への対応は国にとっても重要な課題となっている。糖尿病は、生活習慣病の一であり、患者の数は増加傾向にある。糖尿病を大別すると、１型糖尿病と２型糖尿病に分類され、糖尿病患者の９０％以上が２型糖尿病であると言われている。１型糖尿病は、膵β細胞からインシュリンが全く分泌されないか、ほとんど分泌されない糖尿病である。２型糖尿病は、１型糖尿病ほどではないがインスリンの分泌が低下しているか、インスリン抵抗性のある（インスリン感受性が悪い）糖尿病である。血中グルコースは、インスリンの作用により細胞内に取り込まれるが、インスリンの効き具合が悪く、血中グルコースを下げるのに必要なインスリン量が多くなっている状態をインスリン抵抗性という。インスリン抵抗性は、遺伝的素因による場合、高脂肪食・運動不足・肥満など生活習慣に伴う場合、高血糖自体の糖毒性による場合の３つに分けて考えることができる。現在、糖尿病が急増している最大の原因は、生活習慣の欧米化に伴うインスリン抵抗性にある。インスリン抵抗性に起因し、高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患が集積した病態は特にインスリン抵抗性症候群と呼ばれることがある（DeFronzo 1991)。
【０００３】
肥満を伴うインスリン抵抗性の治療は、一般に食事療法・運動療法を厳格に行い、肥満を解消すれば可能である。しかし、食事療法・運動療法は根気と苦痛を伴うものであるため、患者が継続して行うことは必ずしも容易ではない。糖尿病の治療は、薬物療法も行われている。経口糖尿病薬のスルホニル尿素誘導体（SU剤）は、主として１型糖尿病に使用され、インスリン抵抗性を改善するものではない。他方、インスリン抵抗性を細胞レベルで見ると、インスリン刺激に伴い血中グルコースを細胞に取り込む機能が低下していることであるが、インスリン刺激に伴い前駆脂肪細胞は脂肪細胞へと分化し、血中グルコースの脂肪細胞への取り込みを促進するので、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を促進できれば、インスリン抵抗性の改善を期待できる。このような作用を有し、インスリン抵抗性を改善する薬剤として、現在、臨床においてチアゾリジン系の薬剤が用いられている
（特許文献１参照）。また、マティコ（Matico）から抽出される成分を有効成分とする、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への脂肪細胞分化促進剤の提案がある（特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】特許第３１７６６９４号明細書
【特許文献２】特開２００６−２８０４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、チアゾリジン系のインスリン抵抗性を改善する薬剤は、慎重な薬剤血中濃度コントロールが必要とされており、更なる安全性の高い有効なインスリン抵抗性を改善する薬剤の開発が求められている。また、マティコ（Matico）から抽出される成分を有効成分とする脂肪細胞分化促進剤は脂肪細胞への分化誘導作用が認められるものの、分化誘導作用の強さについては明らかではない。
【０００６】
本発明の目的は、安全性に優れかつ優れた前駆脂肪細胞分化誘導促進活性作用を有し、糖尿病及びインスリン抵抗性症候群に有用な薬剤や飲食物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、新規な前駆脂肪細胞分化誘導促進剤について、鋭意研究を重ねた結果、ノウゼンカズラ科キササゲ属に属する植物であるキササゲに含まれるカタルパラクトン
（catalpalactone）が、マウス前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を極めて強力に促進することを見出し本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防及び改善剤ならびにインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤に関する。
【０００９】
本発明は、キササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有する飲食物に関する。
【００１０】
上記のキササゲの抽出物において、キササゲの木部を用いることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤は、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物を含有し、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導の促進作用により、血中グルコースの脂肪細胞への取り込み活性を促進できる。本発明の糖尿病の予防及び改善剤は、前駆脂肪細胞分化誘導促進作用により、血中グルコースの細胞への取り込み活性が促進し、インスリン抵抗性の糖尿病を予防、改善できる。本発明のインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、前駆脂肪細胞分化誘導促進作用により、インスリン抵抗性を予防、改善し、ひいてはインスリン抵抗性症候群を予防、改善できる。
【００１２】
本発明の飲食物は、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有し、摂取することにより前駆脂肪細胞の分化誘導を促進し、糖尿病やインスリン抵抗性症候群を予防、改善できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防及び改善剤ならびにインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、カタルパラクトン（catalpalactone）を有効成分として含有する。カタルパラクトン（catalpalactone）は、下記の化１に示す構造式を有し、また、IUPAC命名法による化合物名は３−（５，６−ジヒドロ−６，６−ジメチル−２−オキソ−２Ｈ−ピラン−３−イル）−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン（3-(5,6-dihydro-6,6-dimetyl-2-oxo-2H-pyran-3-yl)-1(3H)-isobenzofuranone）である。カタルパラクトン（catalpalactone）は、キササゲの抽出物から分離、精製することにより得ることができる。分離、精製は、クロマトグラフィーなど、樹脂、膜、晶析等の一般的な分離技術を用いて行うことができる。キササゲは、ノウゼンカズラ科キササゲ属の学名をCatalpa ovataという植物で、中国原産とされるが日本各地でも生育し、入手が容易である。また、キササゲは他の同属植物を用いることもできる。キササゲ及び同属植物のトウキキササゲ（Catalpa bungei）の果実は利尿作用があり、日本薬局方に生薬「キササゲ」として収載されており、また、民間薬として使用されているので、キササゲに含有されるカタルパラクトン（catalpalactone）は安全性に優れる。
【００１４】
【化１】
【００１５】
また、カタルパラクトンは、合成により製造したものでもよい。以下にカタルパラクトンの合成法について記載される文献を例示する。
（１）John N. Max and Paul J. Dobrowolski, " Total Synthesis of Catalpalactone", Tetrahedron Letters, 23(43), 4457-4460(1982)
（２）Kimberley J.Lane and A.R. Pinder, " Synthesis of Catalpalactone" Journal
Organic Chemistry, 47, 3171-3173(1982)
（３）Mahendra D. Chordia and Nurani S. Narasimhan, " New Synthesis of Catalpalactone", Journal Chemical Society, Perkin Trans. 1, 371-376(1991)
【００１６】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防及び改善剤ならびにインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、キササゲの抽出物を含有する。キササゲの抽出物は、キササゲを未乾燥又は乾燥させ、抽出溶媒で抽出することで得ることができる。キササゲの抽出に用いられる抽出溶媒は、カタルパラクトン（catalpalactone）を抽出成分として含ませることができる限り、特に限定はないが、例えば、アセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール等の有機溶媒、有機溶媒の２種以上の混合溶媒、水と有機溶媒の混合溶媒などを用いることができる。抽出は、通常、室温で行うことができる。抽出に用いるキササゲは、カタルパラクトン（catalpalactone）が抽出成分として含まれる限り、木部、葉、花、果実、果皮、茎、根、根皮などいずれの部位をも用い得るが、木部を用いることが好ましい。また、カタルパラクトン（catalpalactone）を含む限り、同属植物を用いることもできる。
【００１７】
キササゲの抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、必要に応じて濾過等の処理をしたり、濃縮化や粉末化したものを用いることもできる。
【００１８】
カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を促進するので、血中グルコースの脂肪細胞への取り込み活性を促進し、インスリンに依存しない糖尿病に有用である。また、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物は、インスリン抵抗性を予防、改善するので、インスリン抵抗性症候群に有用である。インスリン抵抗性症候群とは、既述の高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患が集積した病態のことを言うが、ここで言うインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、これらの諸症状が集積した場合を予防、改善する場合を含む他、更に、個々の症状、すなわち、インスリン抵抗性に起因する高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、脳梗塞）を個々に予防、改善する場合をも含む。
【００１９】
カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物は、医薬として薬剤に用いることができるが、サプリメント、あるいは飲食物として用いることもできる。飲食物として用いる場合、糖尿病やインスリン抵抗性症候群を予防、改善する機能性食品として供することも可能である。使用する際の形態は特に限定されず、カプセル状、粉末、粒状、タブレット状、液状などの形態とでき、また、外用剤としてクリーム、ペースト状、ジェルなどの形態で用いることもできる。製剤に当たって、薬学的に許容される賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤のような担体を添加でき、また、着色料、香料、防腐剤などを添加できる。
【００２０】
飲用物は、例えば飴、クッキー、チューインガム、ビスケットのような固形物として用いても、あるいは清涼飲料水、牛乳、ヨーグルト、シロップのような液状でもよい。飲食物とする場合、クエン酸、乳酸、カゼインなど、通常飲食物に使用される添加剤を配合することができる。
【００２１】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する薬剤、サプリメントあるいは飲食物の場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重などを考慮して適宜増減できるが、20〜400mg/日が好ましい。
また、キササゲの抽出物を含有する薬剤、サプリメントあるいは飲食物の場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重などを考慮して適宜増減できるが、1〜20g/日が好ましい。
【実施例】
【００２２】
[実施例１〕（カタルパラクトン(catalpalactone) の抽出・分離・精製）
カタルパラクトン(catalpalactone)の抽出には、キササゲの木部を用いた。該木部を乾燥後（乾燥重量3 Kg）、粉砕し、アセトンで室温下抽出することにより、アセトン抽出エキス（76 g）を調製した。得られたエキスについて、シリカゲル60 (70-230 mesh, Merck社) を用いたシリカゲルカラムクロマト法を行い、n-ヘキサン：アセトン混合溶媒で化合物１の分離を行った（表１参照）。全ての溶出画分についてTLC (シリカゲル60F254, Merck社) 分析を行い、予備分離における分離フラクションで後記の前駆脂肪細胞を脂肪細胞へ分化誘導する活性が認められた19番目から27番目までの溶出液を混合し、再度同様なシリカゲルカラムクロマト法により、精製を行った。次いで、ほぼ１種の成分が認められた65番目から73番目の画分を減圧下濃縮後、n-ヘキサン・アセトン混合溶媒中で結晶化させることにより、無色板状晶として化合物１を360 mgの収量で単離した。更に、表１に示すように、ろ液をシリカゲルカラムクロマト法及び分取TLC法で精製を繰り返し、新たに30 mgの化合物１を得た。本精製工程により、化合物１をアセトン抽出エキスに対し0.51質量/質量%の収量で、また原料であるキササゲ木部に対し0.013質量/質量%の収量で単離した。
【００２３】
以下に化合物１の機器スペクトルデータを示した。
融点: 106-107 ℃.
EIMS m/z (rel. int.): 258 (M+, 3), 240 ([M-H2O]+, 100), 225 (8), 212 (16), 197 (34), 156 (10), 133 (52), 115 (8), 105 (22), 77 (18).
HREIMS m/z: 240.0790 (C15H12O3 as [M-H2O]+, calcd. 240.0786).
1H- 及び13C-NMR スペクトルのデータは表２に示した。なお、表１の位置番号は化２に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【化２】
【００２７】
化合物１は、融点106 - 107 ℃の無色板状晶として得られ、EIMSスペクトルにおいてm/z 258に分子イオンピークが観察されたことから、その分子式はC15H14O4であると予想された。1H-NMRスペクトルから、2個のメチル基 (d 1.36, 1.50)、1対のメチレンプロトン (d 2.43, 2.55)、1個の酸素原子に隣接するプロトン (d 6.42)、４個の連続する芳香族プロトン (d 6.42, 7.55, 7.65, 7.69)及び1個のオレフィンプロトン (d 6.79)の存在が示唆された。更に、13C-NMRスペクトルにおいて、d 162.9及び169.8にエステルカルボニル基に由来するシグナルが観察された。これらの推定部分構造を基に、1H-1H COSY、13C-1H COSYおよびCOLOCスペクトルなどの二次元NMRスペクトルを測定することにより、化合物１の構造をキササゲの心材より単離、報告（Inouye, H.; Okuda, T.; Hirata, Y.; Nagakura, N.; Yoshizaki, M. Tetrahedron Lett.1965, 1261.)されているカタルパラクトン（catalpalactone）であると同定した。尚、化合物１は分子内に不斉を有するが、前記文献に報告されているように光学不活性なラセミ体であった。
【００２８】
〔実施例２〕（カタルパラクトン(catalpalactone)の前駆脂肪細胞分化誘導促進活性評価）
マウス前駆脂肪細胞（3T3-L1、以下、3T3-L1細胞という）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）は、通常培養条件下においては繊維芽細胞様の形態を示す。3T3-L1細胞は、一定濃度のインスリン刺激を与えることにより、細胞内に脂肪粒を形成し脂肪細胞へと分化するので、低濃度でのインスリン刺激に伴う細胞内への脂肪粒蓄積減少をインスリン抵抗性と仮定し、添加する化合物による脂肪粒蓄積増加活性を評価することで、脂肪細胞への分化誘導促進活性の評価が可能である。3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化誘導は、以下の方法で行った。
【００２９】
培養細胞をトリプシン処理により回収し、4℃、1000rpm、3分間遠心分離を行った後、培地（10%CS(子牛血清)を含むダルベッコ変法イーグルMEM培地）を用いて4.2 x 104 細胞/mlとなるよう調整し、これを24ウエル マルチウェルプレートに1ml/wellにて分注し検定プレートとした。検定プレートは、72時間、37℃、5％CO2存在下で培養後、各ウェルにカタルパラクトン(catalpalactone)を添加し、30分間、37℃、5％CO2存在下で静置後、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリンからなる分化誘導剤をそれぞれの最終濃度が20μM、10μM、0.085μMとなるように添加した。48時間後、培地を交換し、カタルパラクトン(catalpalactone)を再度同濃度添加した。更に、インスリンを最終濃度
0.085μMとなるように加えた。その後、3日間間隔で、培地交換、試料添加及びインスリンの添加を行い、9日間培養を行った。培地を除去した後、細胞をPBS(-)0.5mlを用いて2回洗浄し、10％中性緩衝ホルマリン液0.5mlを用い細胞を固定した。30分静置後、PBS(-)
0.5mlを用いて1回洗浄し、オイルレッドO染色液（オイルレッドO 60%イソプロパノール溶液）0.5mlを加え、90分間静置した。さらにPBS(-)0.5mlを用いて1回洗浄し、光学顕微鏡下、脂肪粒蓄積の変化について観察を行った。すなわち、顕微鏡下において各試料にて処理した細胞のオイルレッドOによる染色を観察し、インスリン濃度を1.7μMにて処理した細胞における細胞内への脂肪粒蓄積状態から、どの程度脂肪粒蓄積が促進されたかを目視にて判断し、非常に強く脂肪粒蓄積を促進している場合を＋＋とし、中程度に促進している場合を＋とした（表３参照）。なお、カタルパラクトン（catalpalactone）の調製及び添加は以下のように行った。実施例１で得られたカタルパラクトン（catalpalactone）をジメチルスルフォキシドに溶解し、それぞれにつき最終濃度0.8 および0.16μg/mlに調製した。調製した溶液を、培地1mlに対して1ml添加し、培地中における濃度が、0.8及び0.16μg/mlとなるよう添加した。
【００３０】
【表３】
【００３１】
表３の結果より、カタルパラクトン（catalpalactone）は、優れた脂肪細胞分化誘導促進活性を有することが分かった。
【００３２】
なお、実施例１における活性成分の探索に先立ち、予備分離で得られた各分離フラクションについて、上記のカタルパラクトン(catalpalactone)の前駆脂肪細胞分化誘導促進活性評価と同様の評価を行い、活性の認められたフラクションについて、実施例１のクロマトグラフィー及び再結晶を行った。
【００３３】
〔実施例３〕（グリセロール３リン酸脱水素酵素（GPDH）活性）
次いで、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化に伴い上昇が認められるグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性について検討を行った。
6ウエル マルチウェルプレートに3T3-L1細胞を21x104細胞/wellの密度でまき、実施例２と同様にカタルパラクトン（catalpalactone）の存在下で脂肪細胞への分化誘導を行った後、全て氷冷下にて以下の行程を行った。まず、培地を除き、氷冷PBS(-) 2mlを用いて2回洗浄した後、トリス緩衝液（50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM EDTA, 1mM β-メルカプトエタノール）600μlを加え、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離し、1.5mlプラスチックチューブに回収し、細胞懸濁液を得た。超音波処理（5秒間、40W）により細胞膜を破壊した後、4℃、15,000rpm、15分間遠心分離を行うことにより、この上清を得、細胞抽出液とした。Bradford色素結合法により細胞抽出液に含まれるタンパク質濃度について定量を行った後、緩衝液の添加によりタンパク質濃度を一定にした。GPDH活性測定は、次のように行った。細胞抽出液に、氷冷した反応液（100mM トリエタノールアミン-HCl pH 7.5, 2.5mM EDTA, 0.12mM NADH, 0.1mM β-メルカプトエタノール)を加え、全量を950μlとした。 25℃、5分間静置した後、これに反応開始液（4mM ヒドロキシアセトンフォスフェート)を50μl添加し、全量を1mlとした。25℃、1分間、340nmにおける吸光度（100秒測定し、反応開始後20秒から80秒までの1分間の吸光度）の変化を測定した。なお、GPDH活性は、1分間に1nmolのNADHを酸化する酵素量を1ユニットとして次式により算出した。
GPDH活性（U/mg protein）=ΔOD340 x 1/6220 x 1/C x 106
ΔOD340: 1分間当たりの340nmにおける吸光度の変化
キュベットの光路長：1cm
C: 用いたタンパク質質量（mg）
【００３４】
GPDH活性は、カタルパラクトン（catalpalactone）のそれぞれ200nM、40nM、8nMについて測定した。また、比較例として、トログリタゾンを上記のカタルパラクトン（catalpalactone）の場合と同様の方法でそれぞれ1000nM、10nM、0.1nMについてGPDH活性を測定した。なお、トログリタゾンは、ノスカール（登録商標、三共（株））をすり潰し、有機溶媒にて抽出したものを用いた。GPDH活性の測定結果は表４に示した。
【００３５】
【表４】
【００３６】
表４より、カタルパラクトン（catalpalacotne）は、強い前駆脂肪細胞分化誘導促進活性を示すトログリタゾンとほぼ同等の優れた促進活性を示すことが分かった。また、カタルパラクトン（catalpalacotne）は、既存のインスリン抵抗性を改善するチアゾリジン系の薬剤とは全く異なる構造を有していることから、これらチアゾリジン系の薬剤に認められる副作用を発現する可能性が低いと思われる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前駆脂肪細胞分化誘導促進剤及び飲食物に関し、詳細には、カタルパラクトン又はキササゲの抽出物を含有する前駆脂肪分化誘導促進剤及び飲食物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病は、日本人の死亡原因の３分の２を占めるとも言われ、現在、生活習慣病への対応は国にとっても重要な課題となっている。糖尿病は、生活習慣病の一であり、患者の数は増加傾向にある。糖尿病を大別すると、１型糖尿病と２型糖尿病に分類され、糖尿病患者の９０％以上が２型糖尿病であると言われている。１型糖尿病は、膵β細胞からインシュリンが全く分泌されないか、ほとんど分泌されない糖尿病である。２型糖尿病は、１型糖尿病ほどではないがインスリンの分泌が低下しているか、インスリン抵抗性のある（インスリン感受性が悪い）糖尿病である。血中グルコースは、インスリンの作用により細胞内に取り込まれるが、インスリンの効き具合が悪く、血中グルコースを下げるのに必要なインスリン量が多くなっている状態をインスリン抵抗性という。インスリン抵抗性は、遺伝的素因による場合、高脂肪食・運動不足・肥満など生活習慣に伴う場合、高血糖自体の糖毒性による場合の３つに分けて考えることができる。現在、糖尿病が急増している最大の原因は、生活習慣の欧米化に伴うインスリン抵抗性にある。インスリン抵抗性に起因し、高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患が集積した病態は特にインスリン抵抗性症候群と呼ばれることがある（DeFronzo 1991)。
【０００３】
肥満を伴うインスリン抵抗性の治療は、一般に食事療法・運動療法を厳格に行い、肥満を解消すれば可能である。しかし、食事療法・運動療法は根気と苦痛を伴うものであるため、患者が継続して行うことは必ずしも容易ではない。糖尿病の治療は、薬物療法も行われている。経口糖尿病薬のスルホニル尿素誘導体（SU剤）は、主として１型糖尿病に使用され、インスリン抵抗性を改善するものではない。他方、インスリン抵抗性を細胞レベルで見ると、インスリン刺激に伴い血中グルコースを細胞に取り込む機能が低下していることであるが、インスリン刺激に伴い前駆脂肪細胞は脂肪細胞へと分化し、血中グルコースの脂肪細胞への取り込みを促進するので、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を促進できれば、インスリン抵抗性の改善を期待できる。このような作用を有し、インスリン抵抗性を改善する薬剤として、現在、臨床においてチアゾリジン系の薬剤が用いられている
（特許文献１参照）。また、マティコ（Matico）から抽出される成分を有効成分とする、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への脂肪細胞分化促進剤の提案がある（特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】特許第３１７６６９４号明細書
【特許文献２】特開２００６−２８０４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、チアゾリジン系のインスリン抵抗性を改善する薬剤は、慎重な薬剤血中濃度コントロールが必要とされており、更なる安全性の高い有効なインスリン抵抗性を改善する薬剤の開発が求められている。また、マティコ（Matico）から抽出される成分を有効成分とする脂肪細胞分化促進剤は脂肪細胞への分化誘導作用が認められるものの、分化誘導作用の強さについては明らかではない。
【０００６】
本発明の目的は、安全性に優れかつ優れた前駆脂肪細胞分化誘導促進活性作用を有し、糖尿病及びインスリン抵抗性症候群に有用な薬剤や飲食物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、新規な前駆脂肪細胞分化誘導促進剤について、鋭意研究を重ねた結果、ノウゼンカズラ科キササゲ属に属する植物であるキササゲに含まれるカタルパラクトン
（catalpalactone）が、マウス前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を極めて強力に促進することを見出し本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防及び改善剤ならびにインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤に関する。
【０００９】
本発明は、キササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有する飲食物に関する。
【００１０】
上記のキササゲの抽出物において、キササゲの木部を用いることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤は、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物を含有し、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導の促進作用により、血中グルコースの脂肪細胞への取り込み活性を促進できる。本発明の糖尿病の予防及び改善剤は、前駆脂肪細胞分化誘導促進作用により、血中グルコースの細胞への取り込み活性が促進し、インスリン抵抗性の糖尿病を予防、改善できる。本発明のインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、前駆脂肪細胞分化誘導促進作用により、インスリン抵抗性を予防、改善し、ひいてはインスリン抵抗性症候群を予防、改善できる。
【００１２】
本発明の飲食物は、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有し、摂取することにより前駆脂肪細胞の分化誘導を促進し、糖尿病やインスリン抵抗性症候群を予防、改善できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防及び改善剤ならびにインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、カタルパラクトン（catalpalactone）を有効成分として含有する。カタルパラクトン（catalpalactone）は、下記の化１に示す構造式を有し、また、IUPAC命名法による化合物名は３−（５，６−ジヒドロ−６，６−ジメチル−２−オキソ−２Ｈ−ピラン−３−イル）−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン（3-(5,6-dihydro-6,6-dimetyl-2-oxo-2H-pyran-3-yl)-1(3H)-isobenzofuranone）である。カタルパラクトン（catalpalactone）は、キササゲの抽出物から分離、精製することにより得ることができる。分離、精製は、クロマトグラフィーなど、樹脂、膜、晶析等の一般的な分離技術を用いて行うことができる。キササゲは、ノウゼンカズラ科キササゲ属の学名をCatalpa ovataという植物で、中国原産とされるが日本各地でも生育し、入手が容易である。また、キササゲは他の同属植物を用いることもできる。キササゲ及び同属植物のトウキキササゲ（Catalpa bungei）の果実は利尿作用があり、日本薬局方に生薬「キササゲ」として収載されており、また、民間薬として使用されているので、キササゲに含有されるカタルパラクトン（catalpalactone）は安全性に優れる。
【００１４】
【化１】
【００１５】
また、カタルパラクトンは、合成により製造したものでもよい。以下にカタルパラクトンの合成法について記載される文献を例示する。
（１）John N. Max and Paul J. Dobrowolski, " Total Synthesis of Catalpalactone", Tetrahedron Letters, 23(43), 4457-4460(1982)
（２）Kimberley J.Lane and A.R. Pinder, " Synthesis of Catalpalactone" Journal
Organic Chemistry, 47, 3171-3173(1982)
（３）Mahendra D. Chordia and Nurani S. Narasimhan, " New Synthesis of Catalpalactone", Journal Chemical Society, Perkin Trans. 1, 371-376(1991)
【００１６】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防及び改善剤ならびにインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、キササゲの抽出物を含有する。キササゲの抽出物は、キササゲを未乾燥又は乾燥させ、抽出溶媒で抽出することで得ることができる。キササゲの抽出に用いられる抽出溶媒は、カタルパラクトン（catalpalactone）を抽出成分として含ませることができる限り、特に限定はないが、例えば、アセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール等の有機溶媒、有機溶媒の２種以上の混合溶媒、水と有機溶媒の混合溶媒などを用いることができる。抽出は、通常、室温で行うことができる。抽出に用いるキササゲは、カタルパラクトン（catalpalactone）が抽出成分として含まれる限り、木部、葉、花、果実、果皮、茎、根、根皮などいずれの部位をも用い得るが、木部を用いることが好ましい。また、カタルパラクトン（catalpalactone）を含む限り、同属植物を用いることもできる。
【００１７】
キササゲの抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、必要に応じて濾過等の処理をしたり、濃縮化や粉末化したものを用いることもできる。
【００１８】
カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を促進するので、血中グルコースの脂肪細胞への取り込み活性を促進し、インスリンに依存しない糖尿病に有用である。また、カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物は、インスリン抵抗性を予防、改善するので、インスリン抵抗性症候群に有用である。インスリン抵抗性症候群とは、既述の高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患が集積した病態のことを言うが、ここで言うインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤は、これらの諸症状が集積した場合を予防、改善する場合を含む他、更に、個々の症状、すなわち、インスリン抵抗性に起因する高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、脳梗塞）を個々に予防、改善する場合をも含む。
【００１９】
カタルパラクトン（catalpalactone）又はキササゲの抽出物は、医薬として薬剤に用いることができるが、サプリメント、あるいは飲食物として用いることもできる。飲食物として用いる場合、糖尿病やインスリン抵抗性症候群を予防、改善する機能性食品として供することも可能である。使用する際の形態は特に限定されず、カプセル状、粉末、粒状、タブレット状、液状などの形態とでき、また、外用剤としてクリーム、ペースト状、ジェルなどの形態で用いることもできる。製剤に当たって、薬学的に許容される賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤のような担体を添加でき、また、着色料、香料、防腐剤などを添加できる。
【００２０】
飲用物は、例えば飴、クッキー、チューインガム、ビスケットのような固形物として用いても、あるいは清涼飲料水、牛乳、ヨーグルト、シロップのような液状でもよい。飲食物とする場合、クエン酸、乳酸、カゼインなど、通常飲食物に使用される添加剤を配合することができる。
【００２１】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する薬剤、サプリメントあるいは飲食物の場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重などを考慮して適宜増減できるが、20〜400mg/日が好ましい。
また、キササゲの抽出物を含有する薬剤、サプリメントあるいは飲食物の場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重などを考慮して適宜増減できるが、1〜20g/日が好ましい。
【実施例】
【００２２】
[実施例１〕（カタルパラクトン(catalpalactone) の抽出・分離・精製）
カタルパラクトン(catalpalactone)の抽出には、キササゲの木部を用いた。該木部を乾燥後（乾燥重量3 Kg）、粉砕し、アセトンで室温下抽出することにより、アセトン抽出エキス（76 g）を調製した。得られたエキスについて、シリカゲル60 (70-230 mesh, Merck社) を用いたシリカゲルカラムクロマト法を行い、n-ヘキサン：アセトン混合溶媒で化合物１の分離を行った（表１参照）。全ての溶出画分についてTLC (シリカゲル60F254, Merck社) 分析を行い、予備分離における分離フラクションで後記の前駆脂肪細胞を脂肪細胞へ分化誘導する活性が認められた19番目から27番目までの溶出液を混合し、再度同様なシリカゲルカラムクロマト法により、精製を行った。次いで、ほぼ１種の成分が認められた65番目から73番目の画分を減圧下濃縮後、n-ヘキサン・アセトン混合溶媒中で結晶化させることにより、無色板状晶として化合物１を360 mgの収量で単離した。更に、表１に示すように、ろ液をシリカゲルカラムクロマト法及び分取TLC法で精製を繰り返し、新たに30 mgの化合物１を得た。本精製工程により、化合物１をアセトン抽出エキスに対し0.51質量/質量%の収量で、また原料であるキササゲ木部に対し0.013質量/質量%の収量で単離した。
【００２３】
以下に化合物１の機器スペクトルデータを示した。
融点: 106-107 ℃.
EIMS m/z (rel. int.): 258 (M+, 3), 240 ([M-H2O]+, 100), 225 (8), 212 (16), 197 (34), 156 (10), 133 (52), 115 (8), 105 (22), 77 (18).
HREIMS m/z: 240.0790 (C15H12O3 as [M-H2O]+, calcd. 240.0786).
1H- 及び13C-NMR スペクトルのデータは表２に示した。なお、表１の位置番号は化２に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【化２】
【００２７】
化合物１は、融点106 - 107 ℃の無色板状晶として得られ、EIMSスペクトルにおいてm/z 258に分子イオンピークが観察されたことから、その分子式はC15H14O4であると予想された。1H-NMRスペクトルから、2個のメチル基 (d 1.36, 1.50)、1対のメチレンプロトン (d 2.43, 2.55)、1個の酸素原子に隣接するプロトン (d 6.42)、４個の連続する芳香族プロトン (d 6.42, 7.55, 7.65, 7.69)及び1個のオレフィンプロトン (d 6.79)の存在が示唆された。更に、13C-NMRスペクトルにおいて、d 162.9及び169.8にエステルカルボニル基に由来するシグナルが観察された。これらの推定部分構造を基に、1H-1H COSY、13C-1H COSYおよびCOLOCスペクトルなどの二次元NMRスペクトルを測定することにより、化合物１の構造をキササゲの心材より単離、報告（Inouye, H.; Okuda, T.; Hirata, Y.; Nagakura, N.; Yoshizaki, M. Tetrahedron Lett.1965, 1261.)されているカタルパラクトン（catalpalactone）であると同定した。尚、化合物１は分子内に不斉を有するが、前記文献に報告されているように光学不活性なラセミ体であった。
【００２８】
〔実施例２〕（カタルパラクトン(catalpalactone)の前駆脂肪細胞分化誘導促進活性評価）
マウス前駆脂肪細胞（3T3-L1、以下、3T3-L1細胞という）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）は、通常培養条件下においては繊維芽細胞様の形態を示す。3T3-L1細胞は、一定濃度のインスリン刺激を与えることにより、細胞内に脂肪粒を形成し脂肪細胞へと分化するので、低濃度でのインスリン刺激に伴う細胞内への脂肪粒蓄積減少をインスリン抵抗性と仮定し、添加する化合物による脂肪粒蓄積増加活性を評価することで、脂肪細胞への分化誘導促進活性の評価が可能である。3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化誘導は、以下の方法で行った。
【００２９】
培養細胞をトリプシン処理により回収し、4℃、1000rpm、3分間遠心分離を行った後、培地（10%CS(子牛血清)を含むダルベッコ変法イーグルMEM培地）を用いて4.2 x 104 細胞/mlとなるよう調整し、これを24ウエル マルチウェルプレートに1ml/wellにて分注し検定プレートとした。検定プレートは、72時間、37℃、5％CO2存在下で培養後、各ウェルにカタルパラクトン(catalpalactone)を添加し、30分間、37℃、5％CO2存在下で静置後、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリンからなる分化誘導剤をそれぞれの最終濃度が20μM、10μM、0.085μMとなるように添加した。48時間後、培地を交換し、カタルパラクトン(catalpalactone)を再度同濃度添加した。更に、インスリンを最終濃度
0.085μMとなるように加えた。その後、3日間間隔で、培地交換、試料添加及びインスリンの添加を行い、9日間培養を行った。培地を除去した後、細胞をPBS(-)0.5mlを用いて2回洗浄し、10％中性緩衝ホルマリン液0.5mlを用い細胞を固定した。30分静置後、PBS(-)
0.5mlを用いて1回洗浄し、オイルレッドO染色液（オイルレッドO 60%イソプロパノール溶液）0.5mlを加え、90分間静置した。さらにPBS(-)0.5mlを用いて1回洗浄し、光学顕微鏡下、脂肪粒蓄積の変化について観察を行った。すなわち、顕微鏡下において各試料にて処理した細胞のオイルレッドOによる染色を観察し、インスリン濃度を1.7μMにて処理した細胞における細胞内への脂肪粒蓄積状態から、どの程度脂肪粒蓄積が促進されたかを目視にて判断し、非常に強く脂肪粒蓄積を促進している場合を＋＋とし、中程度に促進している場合を＋とした（表３参照）。なお、カタルパラクトン（catalpalactone）の調製及び添加は以下のように行った。実施例１で得られたカタルパラクトン（catalpalactone）をジメチルスルフォキシドに溶解し、それぞれにつき最終濃度0.8 および0.16μg/mlに調製した。調製した溶液を、培地1mlに対して1ml添加し、培地中における濃度が、0.8及び0.16μg/mlとなるよう添加した。
【００３０】
【表３】
【００３１】
表３の結果より、カタルパラクトン（catalpalactone）は、優れた脂肪細胞分化誘導促進活性を有することが分かった。
【００３２】
なお、実施例１における活性成分の探索に先立ち、予備分離で得られた各分離フラクションについて、上記のカタルパラクトン(catalpalactone)の前駆脂肪細胞分化誘導促進活性評価と同様の評価を行い、活性の認められたフラクションについて、実施例１のクロマトグラフィー及び再結晶を行った。
【００３３】
〔実施例３〕（グリセロール３リン酸脱水素酵素（GPDH）活性）
次いで、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化に伴い上昇が認められるグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性について検討を行った。
6ウエル マルチウェルプレートに3T3-L1細胞を21x104細胞/wellの密度でまき、実施例２と同様にカタルパラクトン（catalpalactone）の存在下で脂肪細胞への分化誘導を行った後、全て氷冷下にて以下の行程を行った。まず、培地を除き、氷冷PBS(-) 2mlを用いて2回洗浄した後、トリス緩衝液（50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM EDTA, 1mM β-メルカプトエタノール）600μlを加え、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離し、1.5mlプラスチックチューブに回収し、細胞懸濁液を得た。超音波処理（5秒間、40W）により細胞膜を破壊した後、4℃、15,000rpm、15分間遠心分離を行うことにより、この上清を得、細胞抽出液とした。Bradford色素結合法により細胞抽出液に含まれるタンパク質濃度について定量を行った後、緩衝液の添加によりタンパク質濃度を一定にした。GPDH活性測定は、次のように行った。細胞抽出液に、氷冷した反応液（100mM トリエタノールアミン-HCl pH 7.5, 2.5mM EDTA, 0.12mM NADH, 0.1mM β-メルカプトエタノール)を加え、全量を950μlとした。 25℃、5分間静置した後、これに反応開始液（4mM ヒドロキシアセトンフォスフェート)を50μl添加し、全量を1mlとした。25℃、1分間、340nmにおける吸光度（100秒測定し、反応開始後20秒から80秒までの1分間の吸光度）の変化を測定した。なお、GPDH活性は、1分間に1nmolのNADHを酸化する酵素量を1ユニットとして次式により算出した。
GPDH活性（U/mg protein）=ΔOD340 x 1/6220 x 1/C x 106
ΔOD340: 1分間当たりの340nmにおける吸光度の変化
キュベットの光路長：1cm
C: 用いたタンパク質質量（mg）
【００３４】
GPDH活性は、カタルパラクトン（catalpalactone）のそれぞれ200nM、40nM、8nMについて測定した。また、比較例として、トログリタゾンを上記のカタルパラクトン（catalpalactone）の場合と同様の方法でそれぞれ1000nM、10nM、0.1nMについてGPDH活性を測定した。なお、トログリタゾンは、ノスカール（登録商標、三共（株））をすり潰し、有機溶媒にて抽出したものを用いた。GPDH活性の測定結果は表４に示した。
【００３５】
【表４】
【００３６】
表４より、カタルパラクトン（catalpalacotne）は、強い前駆脂肪細胞分化誘導促進活性を示すトログリタゾンとほぼ同等の優れた促進活性を示すことが分かった。また、カタルパラクトン（catalpalacotne）は、既存のインスリン抵抗性を改善するチアゾリジン系の薬剤とは全く異なる構造を有していることから、これらチアゾリジン系の薬剤に認められる副作用を発現する可能性が低いと思われる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項２】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する糖尿病の予防及び改善剤。
【請求項３】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。
【請求項４】
キササゲの抽出物を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項５】
キササゲが木部である請求項４に記載の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項６】
キササゲの抽出物を含有する糖尿病の予防及び改善剤。
【請求項７】
キササゲが木部である請求項６に記載の糖尿病の予防及び改善剤。
【請求項８】
キササゲの抽出物を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。
【請求項９】
キササゲが木部である請求項８に記載のインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。
【請求項１０】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する飲食物。
【請求項１１】
キササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有する飲食物。
【請求項１２】
キササゲが木部である請求項１１に記載の飲食物。
【請求項１】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項２】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する糖尿病の予防及び改善剤。
【請求項３】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。
【請求項４】
キササゲの抽出物を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項５】
キササゲが木部である請求項４に記載の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項６】
キササゲの抽出物を含有する糖尿病の予防及び改善剤。
【請求項７】
キササゲが木部である請求項６に記載の糖尿病の予防及び改善剤。
【請求項８】
キササゲの抽出物を含有するインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。
【請求項９】
キササゲが木部である請求項８に記載のインスリン抵抗性症候群の予防及び改善剤。
【請求項１０】
カタルパラクトン（catalpalactone）を含有する飲食物。
【請求項１１】
キササゲのカタルパラクトン（catalpalactone）を含む抽出物を含有する飲食物。
【請求項１２】
キササゲが木部である請求項１１に記載の飲食物。
【公開番号】特開２００８−７４４０（Ｐ２００８−７４４０Ａ）
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７７４４９（Ｐ２００６−１７７４４９）
【出願日】平成１８年６月２８日（２００６．６．２８）
【出願人】（８０５００００１８）財団法人名古屋産業科学研究所 (55)
【出願人】（５０２１６９４７８）財団法人岡山県産業振興財団 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２８日（２００６．６．２８）
【出願人】（８０５００００１８）財団法人名古屋産業科学研究所 (55)
【出願人】（５０２１６９４７８）財団法人岡山県産業振興財団 (8)
【Ｆターム（参考）】
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