含油性酵母および真菌におけるカロテノイドの産生
本発明は、カロテノイドを発現する操作された含油性酵母又は真菌を生成するためのシステムを提供する。本発明はまた、そのような酵母及び真菌を構築する方法、カロテノイドを生産するためにそのような酵母及び真菌を使用する方法、及びそのような含油性酵母又は真菌において生産されるカロテノイドを使用して、食品又は飼料添加物又は栄養補助食品などのカロテノイド含有組成物を製造する方法を提供する。特に、本発明は、改変を含まない、さもなければ同じ生物と比較して、含油性を高める及び／又はカロテノイド生産能力を変化させる１又はそれ以上の含油性及び／又はカロテノイド形成性改変を含む酵母及び真菌を作製するためのシステム及び方法を提供する。含油性生物の脂質体内に蓄積されたカロテノイドは脂質体の単離をとおして容易に単離できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年３月１８日に出願された米国仮出願第60/663,621号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
カロテノイドは、光合成生物（例えば植物、藻類、藍細菌）及び一部の真菌を含む、ある種の生物によって天然に生産される黄色から赤色までの範囲にわたる有機色素である。カロテノイドは、ニンジンの橙色、並びにフラミンゴ及びサケの桃色、及びロブスターならびにエビの赤色の原因である。しかしながら、動物は、カロテノイドを生産することができず、食餌を通して摂取しなければならない。
【０００３】
カロテノイド色素（例えばβ−カロテン及びアスタキサンチン）は、産業上、食料及び供給原料の原料として使用されており、どちらも栄養機能に役立ち、消費者の受容性を高める。例えばアスタキサンチンは、サケの水産養殖においてその野生物の特徴である橙色の着色を与えるために広く使用されている。一部のカロテノイドはビタミンＡの前駆体でもある。また、カロテノイドは抗酸化特性を有しており、様々な健康上の恩恵を有し得る（例えば非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５参照）。β−カロテン、リコペン及びルテインなどの一部のカロテノイドは現在、栄養補助食品として市販されている。
【０００４】
一般に、カロテノイドを生産する生物系は、産業的に加工しにくく及び／又は商業規模での単離が実施不能である程の低レベルでしか化合物を生産しない。それ故、産業上使用される大部分のカロテノイドは化学合成によって生産される。カロテノイドを生産する改善された生物系への需要が存在する。より高レベルのカロテノイドを生産するようにある種の細菌又は真菌を遺伝子工作する努力がこれまでにも為されてきた（例えば非特許文献６；非特許文献７参照）。しかし、より高いレベルの生産とより容易な単離を可能にする改善されたシステムが必要とされている。
【非特許文献１】Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒ，Ｃａｎｃｅｒ １６：９３，１９９１
【非特許文献２】Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７：１７６７，１９９５
【非特許文献３】Ｍｉｋｉ，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ ６３：１４１，１９９１
【非特許文献４】Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：１８４９，１９９９
【非特許文献５】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：２４５２，２０００
【非特許文献６】Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１６９，１９９８
【非特許文献７】Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４：２２１，２００３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、カロテノイドの生物学的生産のための改善されたシステムを提供する。１つの態様では、本発明は、含油性生物においてカロテノイドを生産することが望ましいという発見を含む。特定理論に縛られるのは望むところではないが、本願発明人は、化合物を脂質体内に隔離すれば生物系はより高いレベルのカロテノイドを蓄積し得ると提案する。絶対レベルがより高いか否かに関わらず、しかしながら、含油性生物の脂質体内に蓄積されたカロテノイドは脂質体の単離をとおして容易に単離できる。
【０００６】
本発明は、それ故、１又はそれ以上のカロテノイドを生産する含油性真菌（例えば酵母又は他の単細胞真菌を含む）を提供する。本発明はまた、そのような酵母及び真菌を構築する方法、カロテノイドを生産するためにそのような酵母及び真菌を使用する方法、及びそのような含油性酵母又は真菌において生産されるカロテノイドを使用して、食品又は飼料添加物又は栄養補助食品などのカロテノイド含有組成物を製造する方法を提供する。特に、本発明は、改変を含まない、さもなければ同じ生物と比較して、含油性（ｏｌｅａｇｉｎｉｃｉｔｙ）を高める及び／又はカロテノイド生産能力を変化させる１又はそれ以上の含油性（ｏｌｅａｇｉｎｉｃ）及び／又はカロテノイド形成性改変を含む酵母及び真菌を作製するためのシステム及び方法を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、脂質蓄積システムが親油性物質（イソプレノイド又はイソプレノイド由来化合物など、しかしこれらに限定されない）の生産及び／又は単離のために有用であるという一般的認識を含む。それ故、本発明によれば、そのような親油性物質を生産する及び／又は脂質を蓄積するように生物を遺伝子工作することが望ましい。
【０００８】
本発明の様々な他の態様は、付属の特許請求の範囲を含む本発明の説明から当業者に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（定義）
カロテノイド形成性改変：ここで使用する、「カロテノイド形成性改変」という用語は、ここで述べるような、１又はそれ以上のカロテノイドの生産を調節する宿主生物の改変を指す。例えばカロテノイド形成性改変は、１又はそれ以上のカロテノイドの生産レベルを上昇させ得る、及び／又は種々のカロテノイドの相対的生産レベルを変化させ得る。原則として、本発明のカロテノイド形成性改変は、同じ改変に供していない、さもなければ同じ生物において生産されるレベルと比較して、その生物によって生産される、宿主生物における１又はそれ以上のカロテノイドの生産を適切に変化させる何らかの化学的、生理的、遺伝的又は他の改変であり得る。大部分の実施形態では、しかしながら、カロテノイド形成性改変は、典型的には１又はそれ以上の選択カロテノイドの生産上昇を生じさせる、遺伝的改変を含む。一部の実施形態では、選択カロテノイドは、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ルテイン、リコペン、フィトエン、ゼアキサンチン、及び／又はゼアキサンチン又はアスタキサンチンの改変体（例えば配糖体、エステル化ゼアキサンチン又はアスタキサンチン）の１又はそれ以上である。一部の実施形態では、選択カロテノイドは、１又はそれ以上のキサントフィル、及び／又はその改変体（例えば配糖体、エステル化キサントフィル）である。ある実施形態では、選択キサントフィルは、アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、リコペン、及びそれらの改変体から成る群より選択される。一部の実施形態では、選択カロテノイドは、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ルテイン、リコペン及びゼアキサンチン及び／又はゼアキサンチン又はアスタキサンチンの改変体の１又はそれ以上である。一部の実施形態では、カロテノイドはβ−カロテンである。一部の実施形態では、選択カロテノイドはアスタキサンチンである。一部の実施形態では、選択カロテノイドはβ−カロテン以外である。
【００１０】
カロテノイド形成性ポリペプチド：ここで使用する、「カロテノイド形成性ポリペプチド」という用語は、細胞においてカロテノイドを生産する過程に関与するポリペプチドを指し、カロテノイド生産以外の過程に関与するが、その活性が、例えばカロテノイド生産に直接関与するカロテノイドポリペプチドによって利用される基質又は反応物を捕捉することによって、１又はそれ以上のカロテノイドの生産の程度又はレベルに影響を及ぼすポリペプチドを含み得る。カロテノイド形成性ポリペプチドは、それらの用語がここで定義される、イソプレノイド生合成ポリペプチド、カロテノイド生合成ポリペプチド、及びイソプレノイド生合成競合ポリペプチドを含む。この用語はまた、カロテノイドが脂質体内に蓄積される程度に影響を及ぼし得るポリペプチドを包含する。
【００１１】
カロテノイド：「カロテノイド」という用語は、当技術分野では、イソプレノイド経路の中間体から誘導される構造的に多様なクラスの色素を指すと理解される。カロテノイド生合成における拘束段階は、ゲラニルゲラニルピロリン酸からのフィトエンの形成である。カロテノイドは非環式又は環式であり得、酸素を含んでもよく又は含まなくてもよいので、この用語はカロテンとキサントフィルの両方を包含する。一般に、カロテノイドは、形式的にはトリテルペン（Ｃ３０ジアポカロテノイド）及びテトラテルペン（Ｃ４０カロテノイド）並びにそれらの酸素化誘導体及び、例えばＣ３５、Ｃ５０、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ８０の長さ又は他の長さの他の化合物を含む、５炭素化合物ＩＰＰから誘導される共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素化合物である。多くのカロテノイドは強力な吸光特性を有し、その長さはＣ２００以上に及ぶ。Ｃ３０ジアポカロテノイドは、典型的には、イソプレノイド単位の配置が、２個の中点メチル基が１，６−位置関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５位置関係にあるように分子の中央で逆転する方式で連結された６個のイソプレノイド単位から成る。そのようなＣ３０カロテノイドは、形式的には、共役二重結合の長い中心鎖を有する非環式Ｃ３０Ｈ４２構造から、（ｉ）水素添加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、又はこれらの工程の何らかの組合せによって誘導され得る。Ｃ４０カルテノイドは、典型的には、イソプレノイド単位の配置が、２個の中点メチル基が１，６−位置関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５位置関係にあるように分子の中央で逆転する方式で連結された８個のイソプレノイド単位から成る。そのようなＣ４０カロテノイドは、形式的には、共役二重結合の長い中心鎖を有する非環式Ｃ４０Ｈ５６構造から、（ｉ）水素添加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、又はこれらの工程の何らかの組合せによって誘導され得る。Ｃ４０カロテノイドのクラスはまた、炭素骨格の再構成から、又はこの構造の部分の（形式的な）除去によって生じるある種の化合物を含む。６００個以上の異なるカロテノイドが自然界で特定された；一部の一般的なカロテノイドが図１に示されている。カロテノイドは、以下を含むがこれらに限定されない：アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、β、Ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、Ψ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピン配糖体、４−ケト−ルビキサンチン、シフォナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−二配糖体、ゼアキサンチン及びＣ３０カロテノイド。付加的に、カロテノイド化合物は、ヒドロキシ、メトキシ、オキソ、エポキシ、カルボキシ又はアルデヒド官能基を含み得る、これらの分子の誘導体を含む。さらに、含まれるカロテノイド化合物は、エステル（例えば配糖体エステル、脂肪酸エステル）及び硫酸誘導体（例えばエステル化キサントフィル）を含む。
【００１２】
カロテノイド生合成ポリペプチド：「カロテノイド生合成ポリペプチド」という用語は、１又はそれ以上のカロテノイドの合成に関与するポリペプチドを指す。いくつか挙げると、これらのカロテノイド生合成ポリペプチドは、例えばフィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ（又はデサチュラーゼ）、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、アスタキサンチンシンターゼ、カロテノイドεヒドロキシラーゼ、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼ、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含む。カロテノイド生合成ポリペプチド配列の代表的な例を表１７−２５に示す。
【００１３】
遺伝子：ここで使用する、「遺伝子」という用語は、一般に、場合により１又はそれ以上の遺伝子産物（すなわちＲＮＡ又はタンパク質）の発現に影響を及ぼし得るある種の調節エレメントを含む、ポリペプチドをコードする核酸を指す。
【００１４】
異種：遺伝子又はポリペプチドを指すためにここで使用する、「異種」という用語は、それが発現されている生物において天然では生じない遺伝子又はポリペプチドを指す。一般に、宿主細胞への導入及び／又は宿主細胞による発現のために異種遺伝子又はポリペプチドを選択するとき、そこから異種遺伝子又はポリペプチドを選択し得る特定の供給源生物が本発明の実施にとって必須でないことは了解される。関連する考慮事項は、例えば潜在的ソースと宿主生物が進化においてどれほど密接に関連するか、又は供給源生物が、他の関連ポリペプチドの配列が選択された他の供給源生物とどのように関連するかを含み得る。
【００１５】
宿主細胞：ここで使用する、「宿主細胞」は、ここで述べるように脂質を蓄積するため及び／又は１又はそれ以上のカロテノイドを発現するために本発明に従って操作される酵母又は真菌細胞である。「改変宿主細胞」は、ここで使用するとき、本発明に従った少なくとも１つの含油性改変及び／又は少なくとも１つのカロテノイド形成性改変を含む宿主細胞である。
【００１６】
「単離」：ここで使用する、「単離」という用語は、単離された実体が、それがこれまで結合していた少なくとも１つの成分から分離されたことを意味する。大部分の他の成分が除去されているとき、単離された実体は「精製」されている。単離及び／又は精製は、例えば分画、抽出、沈殿又は他の分離法を含む、当技術分野で公知の何らかの手法を用いて実施し得る。
【００１７】
イソプレノイド生合成競合ポリペプチド：ここで使用する、「イソプレノイド生合成競合ポリペプチド」という用語は、細胞におけるその発現が、カロテノイド生合成経路に入るために使用可能なゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のレベルを低下させるポリペプチドを指す。例えばイソプレノイド生合成競合ポリペプチドは、より少ないＧＧＰＰが生成されるように、ＧＧＰＰに先立つイソプレノイド中間体に作用する酵素を含む（例えば図５参照）。スクアレンシンターゼは、本発明に従ったイソプレノイド生合成競合ポリペプチドの１つである；代表的なスクアレンシンターゼ配列を表１６に示す。プレニル二リン酸シンターゼ酵素及びパラ−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）ポリプレニルトランスフェラーゼは、本発明に従ったさらなるイソプレノイド生合成競合ポリペプチドである；代表的なプレニル二リン酸シンターゼ酵素及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼポリペプチドをそれぞれ表２９及び３０に示す。
【００１８】
イソプレノイド生合成ポリペプチド：「イソプレノイド生合成ポリペプチド」という用語は、イソプレノイドの合成に関与するポリペプチドを指す。例えばここで論じるように、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼは、全てイソプレノイド生合成のためのメバロン酸経路に関与する。これらのタンパク質の各々はまた、本発明のためのイソプレノイド生合成ポリペプチドであり、これらの酵素の代表的な例の配列を表７−１５に示す。
【００１９】
イソプレノイド経路：「イソプレノイド経路」は、当技術分野では、５炭素代謝産物イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）を生産するか又は利用する代謝経路を指すと理解される。ここで論じるように、２つの異なる経路−「メバロン酸経路」と「非メバロン酸経路」−が共通のイソプレノイド前駆体ＩＰＰを生産することができる。「イソプレノイド経路」は、これらの種類の経路の両方を包含するのに十分なだけ一般的である。ＩＰＰからのイソプレノイドの生合成は、いくつかの５炭素イソプレンサブユニットの重合によって起こる。ＩＰＰから誘導されるイソプレノイド代謝産物は、環式及び非環式分子の両方を含む、様々な大きさと化学構造である。イソプレノイド代謝産物は、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、ステロール及びカロテノイドなどのポリプレノールを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
含油性改変：ここで使用する、「含油性改変」という用語は、ここで述べるように、宿主生物の望ましい含油性を調節する宿主生物の改変を指す。一部の場合、宿主生物は、その乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積する能力を有するという意味で既に含油性である。それにもかかわらず、例えばその総脂質蓄積を上昇させるため（又は一部の場合、場合により低下させるため）、又はそれが蓄積する１又はそれ以上の特定脂質の種類又は量を調節するため（例えばトリアシルグリセロールの相対的蓄積を上昇させるため）に、本発明に従って、そのような生物に含油性改変を適用することが望ましいと考えられる。また別の場合には、宿主生物は非含油性であり得（脂質を蓄積するために他の生物において使用されるいくつかの酵素及び調節成分を含み得るが）、本発明に従って含油性になるために含油性改変を必要とし得る。本発明はまた、改変後も、ここで定義する含油性になり得ない場合でも、それらの含油性を上昇させるような非油性宿主株への含油性改変の適用を考慮する。原則として、含油性改変は、含油性改変に供していない、さもなければ同じ生物と比較して、宿主生物の含油性を適切に変化させる何らかの化学的、生理的、遺伝的又は他の改変であり得る。大部分の実施形態では、しかしながら、含油性改変は、典型的には１又はそれ以上の含油性ポリペプチドの生産及び／又は活性上昇を生じさせる、遺伝的改変を含む。一部の実施形態では、含油性改変は、少なくとも１つの化学的、生理的、遺伝的又は他の改変を含む；別の実施形態では、含油性改変は２以上の化学的、生理的、遺伝的又は他の改変を含む。２以上の改変を使用するある態様では、そのような改変は、化学的、生理的、遺伝的又は他の改変の何らかの組合せ（例えば１又はそれ以上の遺伝的改変と化学的又は生理的改変）を含み得る。
【００２１】
含油性ポリペプチド：ここで使用する、「含油性ポリペプチド」という用語は、細胞における脂質蓄積の過程に関与するポリペプチドを指し、脂質生合成以外の過程に関与するが、その活性が、例えば脂質蓄積に直接関与する含油性ポリペプチドによって利用される基質又は反応物を捕捉することによって、１又はそれ以上の脂質の蓄積の程度又はレベルに影響を及ぼすポリペプチドを含み得る。例えばここで論じるように、数あるタンパク質の中でも特に、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、及びＡＭＰデアミナーゼは全て細胞における脂質蓄積に関与する。一般に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させること、及び／又はアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素及び／又はＡＭＰデアミナーゼの活性を上昇させることは含油性を促進すると予想される。これらのタンパク質の各々は本発明のための含油性ポリペプチドであり、これらの酵素の代表的な例の配列を表１−６に示す。
【００２２】
含油性：「含油性」という用語は、その乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積する生物の能力を指す。本発明のある実施形態では、含油性酵母又は真菌は、それらの乾燥細胞重量の少なくとも約２５％まで脂質を蓄積する。他の実施形態では、本発明の含油性酵母又は真菌は、それらの乾燥細胞重量の約２０−４５％の範囲内の脂質を蓄積する。一部の実施形態では、含油性生物は、それらの乾燥細胞重量の約７０％まで脂質を蓄積し得る。本発明の一部の実施形態では、含油性生物は、全脂質蓄積の大きな画分をトリアシルグリセロールの形態で蓄積し得る。ある実施形態では、蓄積脂質の大部分がトリアシルグリセロールの形態である。代替的に、又は付加的に、脂質は細胞内脂質体又は油体（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｏｉｌ ｂｏｄｙ）の形態で蓄積し得る。ある実施形態では、本発明は、天然に含油性である酵母又は真菌を利用する。一部の態様では、天然含油性生物を、生物における蓄積脂質のレベルをさらに上昇させるように操作する（例えば遺伝学的に、化学的に又は別の方法で）。他の実施形態では、天然では含油性でない酵母又は真菌を、ここで述べるように脂質を蓄積するように操作する（例えば遺伝学的に、化学的に又は別の方法で）。本発明に関して、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）及びＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓは天然含油性真菌ではない。
【００２３】
ポリペプチド：ここで使用する、「ポリペプチド」という用語は、一般に少なくとも３個のアミノ酸のポリマーの当技術分野で認識される意味を有する。しかし、この用語はまた、例えば含油性ポリペプチド、カロテノイド形成性ポリペプチド、イソプレノイド生合成ポリペプチド、カロテノイド生合成ポリペプチド、及びイソプレノイド生合成競合ポリペプチドなどの、特定機能クラスのポリペプチドを指すためにも使用される。各々のそのようなクラスに関して、本明細書は、そのようなポリペプチドの公知の配列のいくつかの例を提供する。当業者は、しかしながら、「ポリペプチド」という用語が、ここで（又はここで特定して言及する参考文献又はデータベースにおいて）列挙する完全な配列を有するポリペプチドだけでなく、そのような完全ポリペプチドの機能性フラグメント（すなわち少なくとも１つの活性を保持するフラグメント）であるポリペプチドも包含するのに十分なほど一般的であることが意図されている。さらに、当業者は、タンパク質配列が一般に活性を破壊することなく多少の置換を許容することを理解する。それ故、活性を保持し、同じクラスのもう１つ別のポリペプチドと、少なくとも約３０−４０％の全体的配列同一性、しばしば約５０％、６０％、７０％又は８０％以上の全体的配列同一性を共有し、さらに通常は、１又はそれ以上の高度に保存された領域内にはるかに高い同一性、しばしば９０％以上又はさらには９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性の少なくとも１つの領域を含み（例えばイソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドはしばしば保存されたＡＭＰ結合モチーフを共有する；ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドは、典型的には高度に保存された触媒ドメインを含む（例えば図７参照）；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、典型的にはカルボキシルトランスフェラーゼドメインを有する；例えば各々その全体が参照によりここに組み込まれる、Ｄｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．９３：４８４，１９８０；Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：２４９，１９８５；Ｊｉｔｒａｐａｋｄｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．４：２１７，２００３；米国特許第５，３４９，１２６号参照）、通常は少なくとも３−４個、しばしば２０個又はそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドは、ここで使用する「ポリペプチド」の関連用語内に包含される。
【００２４】
供給源生物：ここで使用する、「供給源生物」という用語は、特定ポリペプチド配列が天然で見出され得る生物を指す。それ故、例えば１又はそれ以上の異種ポリペプチドが宿主生物において発現される／発現されている場合、そのポリペプチドが天然で発現される（及び／又はそれらの遺伝子が最初にクローン化された）生物を「供給源生物」と称する。２以上の異種ポリペプチドが宿主生物において発現されている場合、１又はそれ以上の供給源生物を異種ポリペプチドの各々の独立した選択のために使用し得る。関連ペプチド配列を天然に含むありとあらゆる生物が、本発明に従った供給源生物として使用し得る。代表的な供給源生物は、例えば動物、哺乳動物、昆虫、植物、真菌、酵母、藻類、細菌、藍細菌、古細菌及び原生動物供給源生物を含む。
【００２５】
（本発明の一部の好ましい実施形態の詳細な説明）
上述したように、本発明は、カロテノイドが含油性酵母及び真菌において望ましく生産できるという発見を含む。本発明によれば、（ｉ）しばしば細胞質油体の形態で、及び典型的にはそれの乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで、脂質を蓄積し；及び（ｉｉ）それらの乾燥細胞重量の少なくとも約１％、一部の実施形態では少なくとも約３−２０％のレベルでカロテノイドを生産する菌株が、宿主細胞の操作を通して生成される（すなわち、例えば天然に生じる菌株、これまでに改変された菌株等を含む菌株）。その後、脂質体に分配されるカロテノイドが容易に単離できるように、これらの操作された宿主細胞を使用してカロテノイドを生産する。
【００２６】
一般に、最小限の望ましいレベルの含油性が達成されるやいなや、利用することができ、生成物の生合成に転用できる実質的に全てのさらなる炭素がカロテノイド生産経路に転用されるように、本発明の細胞における含油性とカロテノイド生産のバランスをとることが望ましい。本発明の一部の実施形態では、この戦略は、細胞を含油性に遺伝子工作することを含む；他の実施形態では、細胞を、遺伝子工作された細胞がここで定義する「含油性」になり得ない場合でも、そのような遺伝子工作を受けない場合にそれらの細胞が蓄積するよりも高いレベルの脂質、特に細胞質脂質を蓄積するように遺伝子工作することを含む。他の実施形態では、含油性宿主細胞が脂質を蓄積する程度を、残りの炭素がカロテノイド生産において利用できるように実質的に低下させる。
【００２７】
（宿主細胞）
当業者は、天然に含油性である又は天然にカロテノイドを生産する様々な酵母及び真菌が存在することを容易に認識する。そのような菌株のいずれもが本発明に従った宿主菌株として使用でき、本発明の含油性・カロテノイド生産菌株を生成するように遺伝子工作又はさもなければ操作し得る。代替的に、天然では含油性でなく、カロテノイド生産性でもない菌株を使用し得る。さらに、特定菌株が含油性又はカロテノイド生産の天然能力を有するときでも、脂質及び／又はカロテノイドの生産レベルを変化させるために、その天然の能力をここで述べるように調節し得る。ある実施形態では、菌株の遺伝子工作又は操作は、脂質及び／又は生産されるカロテノイドの改変を生じさせる。例えば菌株は天然に含油性及び／又はカロテノイド形成性であり得るが、蓄積される脂質の種類を変化させるため又は生産されるカロテノイドの種類を変化させるために菌株の遺伝子工作又は操作を利用し得る。
【００２８】
本発明に従った使用のために特定酵母又は真菌を選択するとき、一般に、その培養特徴が商業規模生産に適合させやすいものを選択することが望ましい。例えば一般に（必ずしも常にではないが）、糸状生物、又は増殖条件に関して特に変わった又は厳密な要求事項を有する生物は避けることが望ましい。しかし、糸状生物の使用を許容する商業規模生産のための条件が適用できる場合は、これらを宿主細胞として選択し得る。本発明の一部の実施形態では、食用生物は、所望に応じて、場合により食品又は飼料添加物又は栄養補助食品に直接製剤し得るので、食用生物を宿主細胞として使用することが望ましい。生産を容易にするため、本発明の一部の実施形態は、遺伝学的に扱いやすく、分子遺伝学に供しやすく（例えば、特に確立された又は使用可能なベクターで、効率的に形質転換できる；場合により、例えば連続的に、多数の遺伝子を組み込む及び／又は組み入れることができる；及び／又は公知の遺伝子配列を有する等）、複雑な増殖必要条件（例えば光の必要性）を有さず、中温性であり（例えば約２５−３２℃の範囲内の増殖温度を好む）、様々な炭素及び窒素源を同化することができる及び／又は高い細胞密度に増殖することができる宿主細胞を使用する。代替的に又は付加的に、本発明の様々な実施形態は、多細胞生物ではなく単細胞として（例えば菌糸体として）増殖する宿主細胞を使用する。
【００２９】
一般に、本発明に従って天然含油性生物を使用することが望ましいとき、改変可能で培養可能ないかなる含油性生成物も使用し得る。本発明のある実施形態では、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ及びＹａｒｒｏｗｉａを含むが、これらに限定されない属の酵母又は真菌を使用する。ある特定の実施形態では、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ、Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ、Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない種の生物を使用する。
【００３０】
これらの天然含油生菌株のうちで、一部はカロテノイドも天然に生産し、また別の一部はカロテノイドを生産しない。ほとんどの場合、低いレベル（約０．０５％乾燥細胞重量未満）のカロテノイドだけが、天然に生じるカロテノイド形成性の含油性酵母又は真菌によって生産される。β−カロテンのより高いレベルが時として生産されるが、他のカロテノイドの高レベルは一般に認められない。
【００３１】
一般に、天然に含油性であり、非カロテノイド生産性（例えば約０．０５％乾燥細胞重量未満を生産する、対象カロテノイドを生産しない）である生物は、本発明に従った宿主細胞として使用し得る。一部の実施形態では、生物は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ及びＹａｒｒｏｗｉａなどの、しかしこれらに限定されない属からの酵母又は真菌である；一部の実施形態では、生物は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない種である。
【００３２】
同等に、本発明は、天然に含油性であり、カロテノイド生産性生物を宿主細胞として使用し得る。一般に、本発明は、天然にカロテノイド生産性の生物においてイソプレノイド経路への炭素の流入を上昇させるため（特にＢｌａｋｅｓｌｅａ及びＰｈｙｃｏｍｙｃｅｓ以外の生物に関して）、及び／又は生産をあるカロテノイド（例えばβ−カロテン）から別のカロテノイド（例えばアスタキサンチン）に転換させるために利用し得る。本発明に従った、１又はそれ以上のカロテノイド形成性改変（例えば１又はそれ以上の内在性又は異種カロテノイド形成性ポリペプチドの発現上昇）の導入はこれらの目標を達成することが出来る。
【００３３】
本発明のある実施形態では、使用される含油性・カロテノイド生産性生物は、例えばＢｌａｋｅｓｌｅａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａなどの、しかしこれらに限定されない属の、酵母又は真菌である；一部の実施形態では、生物は、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓなどの種である。
【００３４】
天然では非含油性である菌株を本発明に従った宿主細胞として使用することが望ましいとき、非含油性酵母又は真菌の属は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）を含むが、これらに限定されない；一部の実施形態では、生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）を含むが、これらに限定されない種である。
【００３５】
ここで使用する、「非含油性」という用語は、脂質を、特に細胞質内に、蓄積するある程度の能力を天然に有するが、ここで定義する「含油性」として適格であるほど十分なレベルには有さない菌株、並びに余分な脂質、例えば膜外脂質を蓄積するいかなる能力も天然では有さない菌株の両方を包含することが認識される。さらに、本発明の一部の実施形態では、改変細胞がここで定義する含油性としては適格でない場合でも、特定宿主細胞の含油性の天然レベルを上昇させるには十分であることが認識される。
【００３６】
天然含油性生物に関して、天然非含油性真菌の一部は天然にカロテノイドを生産し、また別の一部はカロテノイドを生産しない。天然ではカロテノイドを生産しない（例えば約０．０５％乾燥細胞重量未満を生産する、対象カロテノイドを生産しない）天然非含油性真菌の属は、本発明に従った宿主細胞として望ましく使用でき、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＰｉｃｈｉａを含むが、これらに限定されない；種は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むが、これらに限定されない。天然ではカロテノイドを生産せず、本発明に従った宿主細胞として望ましく使用し得る天然非含油性真菌の属は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）を含むが、これらに限定されない；種は、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
上記で論じたように、様々な生物のいずれもが本発明に従った宿主細胞として使用し得る。本発明のある実施形態では、宿主細胞はＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞である。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの利点は、例えば遺伝学及び分子生物学での取り扱いやすさ、ゲノム配列が入手可能であること（例えばＳｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３１５−８，２００４参照）、様々な費用効果的増殖条件への適合性、及び高い細胞密度で増殖する能力を含む。加えて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは天然に含油性であり、そのため含油性でカロテノイド生産性のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株を生成するには、他の生物のために必要であり得るよりも少ない操作しか必要としないと考えられる。さらに、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに関しては既に広汎な商業経験がある。
【００３８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅも、特にその実験上の取り扱いやすさと研究者達がこの生物に関して蓄積してきた広汎な経験の故に、本発明に従った有用な宿主細胞である。高炭素条件下でのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの培養は高いエタノール生産を生じさせ得るが、これは一般に工程及び／又は遺伝的変化によって管理できる。
【００３９】
さらなる有用な宿主は、実験的に取り扱いやすく、天然にカロテノイド形成性である、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）を含む。Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）菌株は、アスタキサンチンを含むいくつかのカロテノイドを生産することができる。
【００４０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａは、それぞれ多量のクエン酸及び脂肪酸を蓄積する；Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａは同時に含油性である。
【００４１】
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ又はＧｉｂｂｅｒｅｌｌａも有用である。それらは天然に含油性ではなく、非常に低レベルのカロテノイドを生産する傾向があり、それ故、本発明に従って広範な改変が必要と考えられる。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＧｉｂｂｅｒｅｌｌａは、実験的見地から比較的取り扱いやすいと考えられる。どちらも糸状真菌であるので、商業規模での生産は、そのような菌株の使用において克服する必要のある課題であり得る。
【００４２】
Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓはもう１つの使用可能な有用種である、その分子遺伝学は概して一部の他の生物よりもアクセスしにくいが、天然にβ−カロテンを生産し、それ故、使用可能な他の種よりも少ない改変しか必要としないと考えられる。
【００４３】
Ｂｌａｋｅｓｌｅａでは分子遺伝学を実施することができるが、かなりの努力を必要とし得る。さらに、例えば２つの交配型を混合する必要があると考えられるので、費用効果的な発酵条件が課題であり得る。Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ属の真菌も可能なソースであるが、発酵工程の課題を課す潜在的可能性があり、これらの真菌はまた、いくつかの他の潜在的宿主生物よりも操作しにくいと考えられる。
【００４４】
当業者は、本発明に従った使用のための特定宿主細胞の選択がまた、例えば細胞に導入する異種ポリペプチドに関して使用する発現配列の選択にも影響を及ぼし、また培養条件等の様々な態様にも影響することを認識する。本発明に従って使用する種々の宿主細胞の、様々な遺伝子調節必要条件、タンパク質ターゲティング配列の必要条件及び培養条件については多くが知られている（例えばＹａｒｒｏｗｉａに関しては、Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９：２１９，１９９７；Ｍａｄｚａｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０９：６３，２００４参照；例えばＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓに関しては、Ｖｅｒｄｏｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６９：３７２８−３８，２００３；Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ４：２２１−３１，２００３；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．７３（２）：１４７−５３，１９９８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（５）：１９４７−９，１９９８；Ｗｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．１８４（ｌ）：８９−９７，１９９７参照；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに関しては、例えばＧｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４：１−９３３，１９９１参照）。ある態様では、例えば宿主細胞（又は密接に関連する類似体）のターゲティング配列は、異種タンパク質を細胞内局在へと指令するために含むことが有用であり得る。それ故、そのような有用なターゲティング配列を、活性の適切な細胞内局在のために異種配列に付加することができる。他の態様（例えばミトコンドリアターゲティング配列の付加）では、異種ターゲティング配列を選択した異種配列において排除し得る又は変化させ得る（例えば供給源生物の植物葉緑体ターゲティング配列の変化又は除去）。
【００４５】
（含油性の遺伝子工作）
全ての生体生物は、それらの膜及び様々な他の構造における使用のために脂質を合成する。しかし、ほとんどの生物は、総脂質としてそれらの乾燥細胞重量の約１０％以上は蓄積せず、この脂質の大部分は一般に細胞膜内に存在する。
【００４６】
微生物に含油性を付与するために必要な代謝酵素を定義するために多大の生化学的研究がなされてきた（主としてアラキドン酸及びドコサヘキサエン酸の商業的ソースとして単細胞油を工作するため；例えばその内容全体が参照によりここに組み込まれる、Ｒａｔｌｅｄｇｅ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８６：８０７，２００４参照）。この生化学的研究は必要不可欠であるが、本発明以前には、鍵となる代謝酵素をコードする遺伝子による遺伝子工作を通して新規に含油性を確立するという報告はなかった。
【００４７】
含油性生物は、典型的には炭素過剰及び窒素又は他の栄養素制限の条件下で増殖するときにのみ脂質を蓄積することに留意すべきである。これらの条件下では、生物は直ちに制限栄養素を使い果たし、炭素源を同化し続ける。「過剰の」炭素は、脂質（通常はトリアシルグリセロール）が、典型的には脂質体の形態で、サイトゾル内に蓄積するように脂質生合成へと転用される。
【００４８】
一般に、含油性であるためには、生物は、その後脂質を生成するために脂肪酸シンターゼ機構によって利用され得る、アセチル−ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨの両方をサイトゾル内で生産しなければならないと思われる。少なくとも一部の含油性生物では、アセチル−ＣｏＡは、以下の反応：
（１）クエン酸＋ＣｏＡ＋ＡＴＰ→アセチル−ＣｏＡ＋オキサロ酢酸＋ＡＤＰ＋Ｐｉ
を触媒する、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼの作用を通してサイトゾル内で生成される。
【００４９】
言うまでもなく、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼがサイトゾルにおいて適切なレベルのアセチル−ＣｏＡを生成するためには、最初にその基質クエン酸の使用可能なプールを有していなければならない。クエン酸は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルを通して全ての真核細胞のミトコンドリアにおいて生成され、クエン酸／リンゴ酸トランスロカーゼによってサイトゾルへと移動することができる（リンゴ酸と交換に）。
【００５０】
大部分の含油性生物及び一部の非含油性生物では、ミトコンドリアにおけるＴＣＡサイクルの一部として機能する、酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼは強くＡＭＰ依存性である。それ故、ＡＭＰがミトコンドリアから枯渇したとき、この酵素は不活性化する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼが不活性であるとき、イソクエン酸はミトコンドリア内に蓄積する。この蓄積されたイソクエン酸はその後、おそらくアコニターゼの作用を通して、クエン酸と平衡する。それ故低ＡＭＰ条件下では、クエン酸がミトコンドリア内に蓄積する。上述したように、ミトコンドリアのクエン酸は直ちにサイトゾルへと輸送される。
【００５１】
含油性生物では、細胞質におけるクエン酸（及びそれ故アセチル−ＣｏＡ）の蓄積を導くカスケードを開始させると考えられる、ＡＭＰ枯渇は、上記の栄養素枯渇の結果として起こる。含油性細胞が、過剰炭素源の存在下であるが窒素又は一部の他の栄養素に関して制限された条件下で増殖するとき、以下の反応：
（２）ＡＭＰ→イノシン５’−一リン酸＋ＮＨ３
を触媒する、ＡＭＰデアミナーゼの活性が強力に誘導される。この酵素の活性上昇は、サイトゾルとミトコンドリアの両方において細胞ＡＭＰを枯渇させる。ミトコンドリアからのＡＭＰの枯渇は、ＡＭＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼを不活性化すると思われ、ミトコンドリアにおける、及びそれ故サイトゾルにおけるクエン酸の蓄積を生じさせる。この一連の事象を図２に図式的に示す。
【００５２】
上述したように、含油性はサイトゾルのアセチル−ＣｏＡとサイトゾルＮＡＤＰＨの両方を必要とする。多くの含油性生物では、リンゴ酸酵素の作用を通して適切なレベルのサイトゾルＮＡＤＰＨが提供されると考えられる（図２における酵素３）。一部の含油性生物（例えばＬｉｐｏｍｙｃｅｓ及び一部のＣａｎｄｉｄａ）は、しかしながら、リンゴ酸酵素を持たないと思われ、そのため見かけ上は他の酵素が匹敵し得る活性を提供し得るが、おそらくＮＡＤＰＨの専用ソースが脂肪酸合成のために必要であると予想される（例えば、各々その全体が参照によりここに組み込まれる、Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １４５：１９１１，１９９９；Ｒａｔｌｅｄｇｅ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：１，２００２参照）。
【００５３】
それ故、本発明によれば、宿主生物の含油性は、サイトゾルのアセチル−ＣｏＡ及び／又はＮＡＤＰＨの生成に関与する１又はそれ以上のポリペプチドの発現又は活性を改変することによって強化し得る。例えばアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、及びＡＭＰデアミナーゼの１又はそれ以上の発現又は活性の改変は、本発明に従った含油性を高めることができる。本発明に従った含油性を高めるために使用できる又は得られる例示的なポリペプチドは、それぞれ表１、表２、表３、表４、表５及び表６に示す
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、及びＡＭＰデアミナーゼポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
含油性宿主細胞を用いる本発明の一部の実施形態では、含油性に関連する酵素及び調節成分は既に備えられているが、所望する場合は、例えば１又はそれ以上の含油性ポリペプチドの発現又は活性を変化させることによって及び／又は１又はそれ以上の異種含油性ポリペプチドを導入することによって、改変できる。非含油性宿主細胞を用いる本発明の実施形態では、少なくとも１又はそれ以上の異種含油性ポリペプチドが導入されると予想される。
【００５５】
本発明は、異種含油性ポリペプチドの導入だけでなく、例えば構成的又は誘導的発現パターンの変化を含む、異種又は内在性含油性ポリペプチドの発現又は活性レベルの調節も考慮する。本発明の一部の実施形態では、含油性を誘導するために栄養素制限条件での増殖を必要としないように発現パターンを調節する。例えば調節配列（例えばプロモーターエレメント、ターミネーターエレメント）の変化及び／又は付加を含む遺伝子改変は、発現パターンの特定調節を与えるために利用し得る。そのような遺伝子改変は内在性遺伝子と共に使用し得る（例えば内在性含油性ポリペプチドの調節のため）；代替的には、そのような遺伝子改変は、少なくとも１つの異種ポリペプチド（例えば含油性ポリペプチド）の発現の調節を与えるために含まれ得る。例えばＴｅｆ１、Ｇｐｄ１プロモーターを含むが、これらに限定されないプロモーターは、内在性含油性ポリペプチド及び／又は異種含油性ポリペプチドの発現パターンの改変のために内在性遺伝子及び／又は異種遺伝子と共に使用できる。同様に、例示的なターミネーター配列は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＸＰＲ２ターミネーター配列の使用を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの含油性ポリペプチドを宿主細胞に導入する。本発明の一部の実施形態では、複数の（例えば２又はそれ以上の）異なる含油性ポリペプチドを同じ宿主細胞に導入する。一部の実施形態では、複数の含油性ポリペプチドは同じ供給源生物からのポリペプチドを含む；他の実施形態では、複数の含油性ポリペプチドは、異なる供給源生物から独立して選択されたポリペプチドを含む。
【００５７】
本発明に従って宿主細胞に導入し得る又は宿主細胞において改変し得る様々な含油性ポリペプチドの代表的な例は、表１−６に示すものを含むが、これらに限定されない。上述したように、これらのポリペプチドの少なくとも一部（例えばリンゴ酸酵素及びＡＴＰ−クエン酸リアーゼ）は、望ましくは協調して、おそらく脂肪酸シンターゼの１又はそれ以上の成分と共に作用するはずであるので、本発明の一部の実施形態では、同じ供給源生物から２又はそれ以上の含油性ポリペプチドを使用することが望ましい。
【００５８】
一般に、本発明に従って使用する含油性ポリペプチドのための供給源生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素及び／又はＡＭＰデアミナーゼポリペプチドのためのソース種は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない；一部の実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドのためのソース種は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
（カロテノイド生産の遺伝子工作）
カロテノイドはイソプレノイド前駆体から合成され、その一部はステロイド及びステロールの生産にも関与する。時として「メバロン酸経路」と称される、最も一般的なイソプレノイド生合成経路を図３に一般的に示す。図に示すように、アセチル−ＣｏＡは、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）によってメバロン酸に変換される。メバロン酸は次にリン酸化されて、５炭素化合物、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換される。ＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への異性化後、ＩＰＰのさらなる分子との３つの連続的縮合反応が１０炭素分子、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生成し、次に１５炭素分子、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、そして最後に２０炭素化合物、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を生成する。
【００６０】
一部の生物（特に細菌）によって利用される選択的イソプレノイド生合成経路は、時として「メバロン酸非依存性経路」と呼ばれ、図４に示されている。この経路は、ピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸からの１−デオキシ−Ｄ−キシログルコース−５−リン酸（ＤＯＸＰ）の合成によって開始される。ＤＯＸＰは次に、図４に示す一連の反応を経てＩＰＰに変換され、ＤＭＡＰＰに異性化されて、その後ＧＰＰ及びＦＰＰにより、図３に示すように、以下で論じるＧＧＰＰへと変換される。
【００６１】
イソプレノイド生合成に関与する様々なタンパク質が多くの生物において特定され、特性決定されている。さらに、イソプレノイド生合成経路の様々な態様が、真菌、細菌、植物及び動物界全体にわたって保存されている。例えば図３に示すアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼに対応するポリペプチドが、多種多様な生物及び細胞から特定され、単離された。多種多様なそのようなポリペプチドの代表的な例を表７−１５に示す。表７−１５のいずれかに提示されるものから選択されるポリペプチドの１又はそれ以上は、本発明に従った方法及び組成物における使用のために利用し得る又は誘導し得る。
【００６２】
本発明によれば、宿主生物におけるカロテノイド生産は、イソプレノイド生合成に関与する１又はそれ以上のタンパク質の発現又は活性を改変することによって調節し得る。一部の実施形態では、そのような改変は、１又はそれ以上の異種イソプレノイド生合成ポリペプチドの宿主細胞への導入を含む；代替的に又は付加的に、改変は、１又はそれ以上の内在性又は異種イソプレノイド生合成ポリペプチドの発現又は活性に対して施し得る。イソプレノイド生合成ポリペプチドの成分のかなりの保存を考慮すると、異種イソプレノイド生合成ポリペプチドは、しばしば有意に異なる生物においても機能すると予想される。さらに、２以上の異種イソプレノイド生合成ポリペプチドを導入することが望ましければ、多くの場合異なる供給源生物からのポリペプチドが共に機能する。本発明の一部の実施形態では、複数の異なる異種イソプレノイド生合成ポリペプチドを同じ宿主細胞に導入する。一部の実施形態では、この複数のポリペプチドは、同じ供給源生物からのポリペプチド（例えば同じ供給源生物からの、又は同じ供給源生物に由来する配列の、２又はそれ以上の配列）だけを含む；他の実施形態では、複数のポリペプチドは、異なる供給源生物から独立して選択されるポリペプチド（例えば少なくとも２つの無関係な供給源生物の、又は少なくとも２つの無関係な供給源生物に由来する配列の、２又はそれ以上の配列）を含む。
【００６３】
異種イソプレノイド生合成ポリペプチドを使用する本発明の一部の実施形態では、供給源生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）属の真菌を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、供給源生物は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｉｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない種である。
【００６４】
上述したように、イソプレノイド生合成経路はまた、ステロール、ステロイド及び、ビタミンＥ又はビタミンＫなどのビタミンのような、非カロテノイド化合物の生産に関与する。イソプレノイド生合成経路中間体に作用し、それらを非カロテノイド化合物の生合成へと転換させるタンパク質は、それ故、カロテノイド生合成の間接的阻害剤である（例えばイソプレノイド中間体を他の生合成経路に導く時点を例示する、図５参照）。そのようなタンパク質は、それ故、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドとみなされる。そのようなイソプレノイド生合成競合ポリペプチドのレベル又は活性の低下は、本発明に従った宿主細胞におけるカロテノイド生産を上昇させると期待される。
【００６５】
本発明の一部の実施形態では、内在性イソプレノイド生合成競合ポリペプチドの生産又は活性を宿主細胞において低下又は排除し得る。一部の実施形態では、このイソプレノイド生合成競合ポリペプチドの活性の低下又は排除は、エルゴステロール生合成経路の酵素の低分子阻害剤での宿主生物の処理によって達成され得る。エルゴステロール生合成経路の酵素は、例えばスクアレンシンターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、２，３−オキシドスクアレン−ラノステロールシクラーゼ、シトクロムＰ４５０ラノステロール１４α−デメチラーゼ、Ｃ−１４ステロールレダクターゼ、Ｃ−４ステロールメチルオキシダーゼ、ＳＡＭ：Ｃ−２４ステロールメチルトランスフェラーゼ、Ｃ−８ステロールイソメラーゼ、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ、及びＣ−２４ステロールレダクターゼを含む。これらの酵素の各々は、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドとみなされる。これらの酵素の調節剤も、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドとみなし得る（例えば、他の生物における相同体を有し得る又は有さないと考えられる、酵母タンパク質Ｓｕｔ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＣ４３７４ ＧＩ：２１３３１５９）及びＭｏｔ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１３７８６ ＧＩ：６３２３７１５））。
【００６６】
他の実施形態では、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドの活性の低下又は排除は、ユビキノン生合成経路の活性を低下させることによって達成できる。ユビキノン生合成における拘束段階は、哺乳動物におけるチロシン又はフェニルアラニン又は細菌におけるコリスミ酸からのパラ−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）の形成、及びそれに続く、プレニル基の付加を生じさせる、ＰＨＢとイソプレン前駆体の縮合である。この反応はＰＨＢ−ポリプレニルトランスフェラーゼによって触媒される。ユビキノンのイソプレノイド側鎖は、プレニル二リン酸シンターゼ酵素によって決定される。ＰＨＢとデカプレニル二リン酸の縮合反応から生じる３−デカプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸は、ユビキノン（ＣｏＱ１０）を形成するために、ヒドロキシル化、メチル化及び脱カルボキシル化を含むさらなる改変を受ける。それ故、ファルネシル二リン酸から伸長したイソプレノイドを導くプレニル二リン酸シンターゼの阻害、又はＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼの阻害は、カロテノイド生合成のために使用可能なイソプレノイドの量を上昇させる上で有用であり得る。（プレニル二リン酸シンターゼ及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼ酵素の例をそれぞれ表２９及び３０に示す）。
【００６７】
イソプレノイド生合成競合酵素の公知の低分子阻害剤は、ザラゴジン酸（ＴＡＮ１６０７Ａ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９６ Ｆｅｂ １５；２１９（２）：５１５−５２０）などのその類似体を含む）、ＲＰＲ １０７３９３（３−ヒドロキシ−３−［４−（キノリン−６−イル）フェニル］−１−アザビシクロ［２−２−２］オクタン二塩酸塩；Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．１９９７ Ｍａｙ；２８１（２）：７４６−５２）、ＥＲ−２８４４８（５−｛Ｎ−［２−ブテニル−３−（２−メトキシフェニル）］−Ｎ−メチルアミノ｝−１，１−ペンチリデンビス（ホスホン酸）三ナトリウム塩；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４１，１１３６−１１４４，Ｊｕｌｙ ２０００）、ＢＭＳ−１８８４９４（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９８；３８：１１１６−１１２１）、ＴＡＫ−４７５（１−［２−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（３−アセトキシ−２，２−ジメチルプロピル）−７−クロロ−１，２，３，５−テトラヒドロ−２−オキソ−５−（２，３−ジメトキシフェニル）−４，１−ベンゾオキサゼピン−３−イル］アセチル］ピペリジン−４−酢酸；Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３ Ａｐｒ １１；４６６（１−２）：１５５−６１）、ＹＭ−５３６０１（（Ｅ）−２−［２−フルオロ−２−（キヌクリジン−３−イリデン）エトキシ］−９Ｈ−カルバゾール一塩酸塩；Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００ Ｓｅｐ；１３１（ｌ）：６３−７０）、又はスクアレンシンターゼを阻害するスクアレスタチンＩ；スクアレンエポキシダーゼを阻害するテルビナフィン；シトクロムＰ４５０ラノステロール１４α−デメチラーゼを阻害する様々なアゾール；及びＣ−１４ステロールレダクターゼ及びＣ−８ステロールイソメラーゼを阻害するフェンプロピモルフを含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、異種イソプレノイド生合成競合ポリペプチド（機能性又は非機能性のいずれも；一部の実施形態では、ドミナントネガティブ突然変異体を用いる）を使用し得る。
【００６８】
本発明に従って有用な１つの特定イソプレノイド生合成競合ポリペプチドは、様々な生物から特定され、特性決定されたスクアレンシンターゼである；スクアレンシンターゼポリペプチド配列の代表的な例は表１６に含まれる。スクアレンシンターゼ（又はスクアレンシンターゼの改変型）を使用する本発明の一部の実施形態では、供給源生物は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
カロテノイド生合成経路は、ＧＧＰＰが形成された時点でイソプレノイド生合成経路から枝分れする。カロテノイド生合成における拘束段階は、フィトエンシンターゼ（しばしばｃｒｔＢと呼ばれる；図６参照）によって触媒される、ＧＧＰＰの２個の分子の頭−頭縮合によるフィトエンの形成である。各々が共役二重結合の数を２倍に増加させる、一連の脱水素反応が、ニューロスポレンを経てフィトエンをリコペンに変換する。経路は、広範囲のカロテノイドが生成され得るように、リコペン生産の前後両方の、様々な時点で分岐する。例えばリコペンへのシクラーゼ酵素の作用はγ−カロテンを生成する；デサチュラーゼの作用は、その代わりに３，４−ジデヒドロリコペンを生じる。γ−カロテンは、シクラーゼの作用を通してβ−カロテンに変換される。β−カロテンは、アスタキサンチンを含む多くの生成物（例えば図６Ｃ参照）のいずれかへと処理され得る（エキネノン、ヒドロキシエキネノン及びフェニコキサンチンを経て）。
【００７０】
本発明によれば、宿主生物におけるカロテノイド生産は、カロテノイド生合成に関与する１又はそれ以上のタンパク質の発現又は活性を改変することによって調節し得る。指摘したように、一部の実施形態では、１又はそれ以上のカロテノイドを天然に生産する生物を宿主細胞として使用することが望ましい。一部のそのような場合には、焦点は、例えばそのカロテノイドの合成に関与する１又はそれ以上のタンパク質のレベル及び／又は活性を上昇させることによって及び／又は競合生合成経路に関与する１又はそれ以上のタンパク質のレベル又は活性を低下させることによって、天然に生産されるカロテノイドの生産量を増加させることにある。代替的に又は付加的に、一部の実施形態では、宿主細胞によって天然では生産されない１又はそれ以上のカロテノイドの生産を生じさせることが望ましい。
【００７１】
本発明の一部の実施形態によれば、１又はそれ以上の異種カロテノイド形成性ポリペプチドを宿主細胞に導入することが望ましい。当業者には明白であるように、様々な異種ポリペプチドのいずれも使用し得る；選択は、例えばその生産を高めるべき特定カロテノイドを考慮する。本発明は、異種カロテノイド形成性ポリペプチドの導入だけでなく、例えば構成的又は誘導的発現パターンの変化を含む、異種又は内在性カロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性レベルの調節も考慮する。本発明の一部の実施形態では、含油性を誘導するために栄養素制限条件での増殖を必要としないように発現パターンを調節する。例えば調節配列（例えばプロモーターエレメント、ターミネーターエレメント）の変化及び／又は付加を含む遺伝子改変は、発現パターンの特定調節を与えるために利用し得る。そのような遺伝子改変は内在性遺伝子と共に使用し得る（例えば内在性カロテノイド形成性の調節のため）；代替的には、そのような遺伝子改変は、少なくとも１つの異種ポリペプチド（例えばカロテノイド形成性ポリペプチド）の発現の調節を与えるために含まれ得る。例えばＴｅｆ１、Ｇｐｄ１プロモーターを含むが、これらに限定されないプロモーターは、内在性カロテノイド形成性ポリペプチド及び／又は異種カロテノイド形成性ポリペプチドの発現パターンの改変のために内在性遺伝子及び／又は異種遺伝子と共に使用できる。同様に、例示的なターミネーター配列は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＸＰＲ２ターミネーター配列の使用を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
図６及び文献において指摘されるように、カロテノイド生合成に関与するタンパク質は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、アスタキサンチンシンターゼ（典型的にはケトラーゼとヒドロキシラーゼ活性の両方を有する、一部の供給源生物で認められる単一多機能酵素）、カロテノイドεヒドロキシラーゼ、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼ、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのカロテノイド生合成ポリペプチドについての代表例配列を表１７−２５に示す。
【００７３】
キサントフィルは、それらの環状末端基上の酸素含有官能基の存在によって他のカロテノイドと区別することができる。例えばルテイン及びゼアキサンチンはそれらの末端環構造の各々に１個のヒドロキシル基を含み、一方アスタキサンチンは各々の末端環にケト基とヒドロキシル基の両方を含む。この性質は、キサントフィルをβ−カロテン及びリコペンなどのカロテンよりも極性にし、それ故脂肪及び脂質におけるそれらの溶解度を劇的に低下させる。天然に生じるキサントフィルは、しばしば末端ヒドロキシル基のエステルとして、脂肪酸のモノ及びジエステルの両方として認められる。それらはまた、細菌の一部の種では配糖体として生じる。キサントフィルの溶解度及び分散性はエステル部分の付加によって大きく改変され、エステル化はまた、所与のカロテノイドの吸収性及び／又はバイオアベイラビリティーにも影響を及ぼし得ることが知られている。含油性酵母の細胞内トリアシルグリセリド画分内に蓄積する特定キサントフィルの量を最大化することが本発明の１つの目的であり、この目標を達成するための１つの機序は、蓄積するキサントフィル生成物の疎水性を高めることである。これを達成する１つの方法は、標的キサントフィル化合物の脂肪アシルモノ及び／又はジエステルの生産を遺伝子工作することである。
【００７４】
様々な酵素がカロテノイドをエステル化するために機能し得る。例えばカロテノイドグルコシルトランスフェラーゼがいくつかの細菌種において特定された（例えば表２４参照）。加えて、トリアシルグリセロール生合成の最終段階で働く、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）及びアシルＣｏＡ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）は、キサントフィルのエステル化において付加的な役割を果たすと考えられる。代表的なＤＧＡＴポリペプチドを表２５に示す。さらに、他の酵素は、カロテノイド及び同様の構造の分子（例えばステロール）を特異的に改変すると考えられ、改変及びエステル生産のために使用可能であり得る。
【００７５】
本発明の一部の実施形態では、カロテノイド生合成ポリペプチドのための潜在的供給源生物は、天然にカロテノイドを生産する、天然に含油性又は非含油性の属を含むが、これらに限定されない。これらは、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｕｃｃｉｎａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓを含むが、これらに限定されない。例示的な種は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｌａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓを含むが、これらに限定されない。言うまでもなく、カロテノイドは、植物、藻類、酵母、真菌、細菌、藍細菌等のような広い範囲の多様な生物によって生産される。いかなるそのような生物も、本発明に従ったカロテノイド生合成ポリペプチドのための供給源生物であり得る。
【００７６】
本発明に従って宿主細胞に適用する特定カロテノイド形成性改変が、いずれのカロテノイドの生産を所望するかによって影響されることは認識される。例えばイソプレノイド生合成ポリペプチドは大部分のカロテノイドの生産に関連する。カロテノイド生合成ポリペプチドも広く関連する。ケトラーゼは、カンタキサンチンの生産のために特に適切であり、同様にヒドロキシラーゼは、中でも特に、ルテイン及びゼアキサンチンの生産に関連する。ヒドロキシラーゼ及びケトラーゼ（又はアスタキサンチンシンターゼ）の両方がアスタキサンチンの生産のために特に有用である。
【００７７】
（カロテノイドの生産と単離）
上記で論じたように、含油性生物における脂質体の蓄積は、一般に過剰の炭素源と制限窒素の存在下で関連生物を増殖させることによって誘導される。そのような蓄積を誘導するための詳細な条件は、これまでに多くの異なる含油性生物に関して確立されている（例えば、おのおのその全体が参照によりここに組み込まれる、Ｗｏｌｆ（ｅｄ．）Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｙｅａｓｔｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐｐ．３１３−３３８；Ｌｉｐｉｄｓ １８（９）：６２３，１９８３；Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３５（３）：３１３，１９９７；Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（ｌ）：７５，２００３；Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ．９５（３）：２８７，２００４参照）。
【００７８】
一般に、本発明の改変宿主細胞を、それらの乾燥細胞重量の少なくとも約２０％を脂質として蓄積することを許容する条件下で培養することが望ましい。他の実施形態では、本発明の改変宿主細胞を、それらの乾燥細胞重量の少なくとも約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又はさらには８０％を脂質として蓄積することを許容する条件下で増殖させる。ある実施形態では、使用する宿主細胞は、天然に含油性であり、所望レベルまで脂質を生産するように誘導された細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、天然に脂質を生産するが、所望レベルの脂質生産及び蓄積を達成するように、脂質の生産を高めるように遺伝子工作された細胞である。
【００７９】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、天然では含油性でないが、所望レベルの脂質生産が得られるように、脂質を生産するように遺伝子工作されている。当業者は、一般に、供給源生物における脂質蓄積を誘導するために有効な増殖条件はまた、供給源生物の含油性ポリペプチドが導入された宿主細胞における脂質蓄積を誘導するためにも誘導であり得ることを認識する。いうまでもなく、改変は宿主細胞の性質から鑑みて必要であると考えられ、そのような改変は当業者の技術範囲内である。
【００８０】
また、一般に本発明の改変宿主細胞による所望カロテノイドの生産が、カロテノイドが脂質体内に蓄積するように含油性の誘導に関して適切な時点で起こることを確実にすることが望ましいことも当業者によって認識される。一部の実施形態では、検出可能なレベルのカロテノイドが生産されるように、天然ではカロテノイドを生産しない宿主細胞においてカロテノイドの生産を誘導することが望ましい。ある態様では、天然ではある種のカロテノイドを生産しない宿主細胞が他のカロテノイドを生産することができる（例えばある宿主細胞は、例えばβ−カロテンを天然に生産し得るが、天然ではアスタキサンチンを生産できない）；他の態様では、宿主細胞は、天然ではいかなるカロテノイドも生産しない。他の実施形態では、高い検出可能レベルのカロテノイドが生産されるように、天然で低レベルのカロテノイドを生産する宿主細胞においてカロテノイドの生産レベルを上昇させることが望ましい。ある態様では、天然でカロテノイド（例えばβ−カロテン）を生産する宿主細胞が付加的なカロテノイド（例えばアスタキサンチン等）も生産する；さらなる他の態様では、天然でカロテノイド（例えばβ−カロテン）を生産する細胞は付加的なカロテノイドを生産しない。
【００８１】
本発明のある実施形態では、カロテノイドを、細胞の乾燥重量の少なくとも約１％以上のレベル（すなわち生産される全てのカロテノイドの総量を合わせて考慮して）まで蓄積することが望ましい。一部の実施形態では、脂質体における総カロテノイド蓄積は、細胞の総乾燥重量の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％又はそれ以上のレベルまでである。本発明のある実施形態では、細胞の乾燥重量の少なくとも約１％以上の脂質体内のカロテノイド蓄積の総レベル（すなわち生産される全てのカロテノイドの総量を合わせて考慮して）を達成することが望ましい。一部の実施形態では、脂質体内の総カロテノイド蓄積は、細胞の総乾燥重量の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％又はそれ以上のレベルまでである。
【００８２】
細菌のカロテノイド形成性遺伝子は、他の生物に転移し得ることが既に明らかにされており、それ故本発明に従って特に有用である（例えばＭｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１２２６，１９９８参照）。他の実施形態では、植物、藻類又は微細藻類などの他の供給源生物からの遺伝子を使用することが望ましいと考えられる；これらの生物は、ケトラーゼ及びヒドロキシラーゼポリペプチドのための多様な潜在的ソースを提供する。さらなる他の有用な供給源生物は、ポリペプチドの真菌、酵母、昆虫、原生動物及び哺乳動物ソースを含む。
【００８３】
ある実施形態では、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ多機能性フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａフィトエンデヒドロゲナーゼ遺伝子がＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現され得る。その後の、Ｎ．ｃｒａｓｓａヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼからの触媒ドメインの過剰発現及び／又はスクアレンシンターゼ阻害剤、ザラゴジン酸による改変Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株の処理は、カロテノイド生産をさらに上昇させる。最後に、カロテノイドヒドロキシラーゼ及びカロテノイドケトラーゼ酵素をコードするＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ遺伝子は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ β−カロテン生産菌株において発現され、この改変はアスタキサンチンの蓄積を生じさせる。カロテノイド生産を高めるための同様のアプローチは、他の含油性又は非含油性宿主生物において使用でき、同じ、相同な又は機能的に類似するカロテノイド形成性ポリペプチドを使用して実施できる。
【００８４】
２以上のカロテノイドを生産する本発明の生物に関して、増殖条件を調節することによって生産される個々のカロテノイドの相対量を調節することが時として可能であることに留意すべきである。例えば、培養の間に培養物中の溶解酸素の濃度を制御することは、β−カロテン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンなどの一部のカロテノイドの相対生産レベルを調節できることが報告された（例えば、その内容全体が参照によりここに組み込まれる、Ｔｓｕｂｏｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，８２５，００２号参照）。
【００８５】
特にアスタキサンチンの生産を対象とする本発明の実施形態に関して、天然アスタキサンチン生産生物からの１又はそれ以上の遺伝子を使用することがしばしば望ましい。多数の異種ポリペプチドを発現させる場合、全てに同じ供給源生物を使用すること、又は密接に関連する供給源生物を使用することが望ましいと考えられる。
【００８６】
本発明によって提供される１つの利点は、高レベルのカロテノイドの生産を可能にすることに加えて、生産された化合物が含油性生成物の脂質体内に蓄積されるので、本発明は、それらを容易に単離することを可能にする。脂質体を単離するための方法及びシステムは多種多様な含油性生物に関して確立されている（例えば、各々その全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，１６４，３０８号；同第５，３７４，６５７号；同第５，４２２，２４７号；同第５，５５０，１５６号；同第５，５８３，０１９号；同第６，１６６，２３１号；同第６，５４１，０４９号；同第６，７２７，３７３号；同第６，７５０，０４８号；及び同第６，８１２，００１号参照）。簡単に述べると、細胞を、しばしば噴霧乾燥、ろ過又は遠心分離によって、典型的には培養から回収する。一部の場合には、細胞を均質化し、その後超臨界液体抽出又は溶媒抽出（例えばクロロホルム、ヘキサン、塩化メチレン、メタノール、イソプロパノール、酢酸エチル等のような溶媒による）に供して、粗油懸濁液を生成する。この油懸濁液を、場合により当技術分野で公知のように精製する。精製した油は飼料又は食品添加物として直接使用し得る。代替的に又は付加的に、従来の手法を用いてカロテノイドを油から単離することができる。
【００８７】
一般的に酸化に対するカロテノイドの感受性を考慮して、本発明の多くの実施形態は、カロテノイド単離の間及び／又は単離後に酸化安定剤（例えばトコフェロール、ビタミンＣ；エトキシキン；ビタミンＥ、ＢＨＴ、ＢＨＡ、ＴＢＨＱ等、又はそれらの組合せ）を使用する。代替的に又は付加的に、例えばタンパク質による、マイクロカプセル化は、酸化に対する物理的障壁を追加するため及び／又は取り扱いを改善するために使用し得る（例えば米国特許出願第２００４／０１９１３６５号参照）。
【００８８】
（使用）
本発明に従って生産されるカロテノイドは、例えばそれらの生物学的又は栄養特性（例えば抗酸化、抗増殖等）及び／又はそれらの色素特性を利用して、多様な適用のいずれかにおいて使用できる。例えば本発明によれば、カロテノイドは、医薬品（例えばＢｅｒｔｒａｍ，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．５７：１８２，１９９９；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２：１６４３，１９９８；Ｒｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７５：１８５，１９９７；Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ４１：１８９，１９９７；米国特許出願第２００４／０１１６５１４号；米国特許出願第２００４／０２５９９５９号参照）、栄養補助食品（例えばＫｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ９：２６５，１９９１；Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ，Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ａｓ ｃｏｌｏｒａｎｔｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８１；米国特許出願第２００４／０１１５３０９号；米国特許出願第２００４／０２３４５７９号参照）、電気光学適用、動物飼料添加物（例えばＫｒｉｎｓｋｉ，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１００３，１９９４；Ｐｏｌａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１３：４０３，１９９２参照）、化粧品（抗酸化剤として及び／又は香料を含む、化粧品として；例えば米国特許出願第２００４／０１２７５５４号参照）等において使用し得る。本発明に従って生産されるカロテノイドはまた、他の化合物（例えばステロイド等）の生産における中間体としても使用し得る。
【００８９】
例えばアスタキサンチン及び／又はそのエステルは、炎症性疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、多発性骨髄腫、動脈硬化症、心臓血管疾患、肝臓病、脳血管疾患、血栓症、癌、リウマチ、糖尿病性網膜症を含む血管新生関連疾患；黄斑変性及び脳障害、高脂血症、腎虚血、糖尿病、高血圧症、腫瘍増殖及び転移；及び代謝性疾患の治療を含む、様々な医薬適用及び健康食品において有用であり得る。付加的に、カロテノイド及びアスタキサンチンは、疲労の予防及び治療、炎症性疾患からの腎症において腎機能を改善するため、並びに他の生活習慣関連疾患の予防及び治療において有用であり得る。さらに、アスタキサンチンは、インターロイキン阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ホスホリパーゼＡ２阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、毛細血管内皮細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤を含む、様々な生物学的過程の阻害剤として役割を果たすことが認められた。例えば２００６年１月２６日公開の日本特許公開第２００６０２２１２１号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５６号）；２００６年１月１９日公開の日本特許公開第２００６０１６４０８号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５５号）；２００６年１月１９日公開の日本特許公開第２００６０１６４０９号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５７号）；２００６年１月１９日公開の日本特許公開第２００６０１６４０７号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５３号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１７号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５１号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１６号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５０号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７２０号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５− ３０１１５８号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１９号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５４号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１８号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５２号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１３号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４７号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１５号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４９号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１４号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４８号）；及び２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１２号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４６号）参照。
【００９０】
本発明の一部の実施形態では、ここで述べるように遺伝子操作された宿主細胞によって生産されるカロテノイドが、宿主細胞に関する最終製品（例えば栄養補助食品又は飼料、医薬品、化粧品、染料含有製品等）に組み込まれることは認識される。例えば宿主細胞は、凍結乾燥、凍結又はさもなければ不活性化することができ、その後全細胞を最終製品に組み込み得るか又は最終製品として使用し得る。宿主細胞はまた、生成物への組込みの前に、生物学的利用率を高めるために処理し得る（例えば溶解によって）。代替的に又は付加的に、最終製品は、全体から分離された、宿主細胞の一部だけ（例えば大きさ、溶解度によって分画された）を組み込み得る。例えば本発明の一部の実施形態では、脂質滴を宿主細胞から単離し、最終製品に組み込むか又は最終製品として使用する。他の実施形態では、カロテノイド自体又は個々のカロテノイド化合物を単離し、最終製品に再製剤する。
【００９１】
上述したように、脂肪酸と配糖体のエステルは自然界で認められる主要なカロテノイドエステルであるが、有用な製品形態を生成するために付加的なエステルを（例えば有機酸又は無機リン酸と）合成することができる。送達のために、カロテノイドエステルはまた、エステル形態の塩として製剤することもできる（例えば米国特許公開第２００５００９６４７７号参照）。
【００９２】
所与の生成物に組み込まれるカロテノイドの量は、製品及び関与する特定カロテノイドに依存して劇的に異なり得る。量は、例えば生成物の０．０１重量％未満から１％以上、１０％、２０％、３０％又はそれ以上の範囲にわたり得る；一部の場合には、カロテノイドは生成物の１００％を構成し得る。
【００９３】
本発明の一部の実施形態では、生産された１又はそれ以上のカロテノイドを食品又は飼料（例えば栄養補助食品）の成分に組み込む。本発明に従ってカロテノイドを組み込むことができる食品の種類は特に限定されず、茶、ジュース及び酒などの飲料；ゼリーやビスケットなどの菓子；乳製品などの脂肪含有食品及び飲料；米及び軟質米（又は粥）などの加工食品；特殊調製粉乳等を含む。本発明のこの態様の一部の実施形態では、食用脂質体内にカロテノイドを組み込むことは、ある種の脂肪含有食品への組込みを容易にし得るので、有用であると考えられる。
【００９４】
本発明に従って生産されるカロテノイドを組み込み得る飼料の例は、例えばキャットフード、ドッグフード等のようなペットフード、観賞魚、養殖魚又は甲殻類等のための飼料、農場で飼育される動物（家畜を含み、さらに水産養殖で育てられる魚又は甲殻類を含む）のための飼料を含む。本発明に従って生産されるカロテノイドを組み込む食品又は飼料材料は、好ましくは意図される受容者である生物にとって口当たりがよい。この食品又は飼料材料は、食品材料に関して現在公知の何らかの物理的性質（例えば固体、液体、軟質）を有し得る。
【００９５】
本発明の一部の実施形態では、生産された１又はそれ以上のカロテノイドを化粧品に組み込む。そのような化粧品の例は、例えば皮膚用化粧品（例えばローション、乳液、クリーム等）、口紅、日焼け防止化粧品、メーキャップ化粧品、香料、日用品（例えば歯磨き粉、うがい薬、口臭予防剤、固形石けん、液体石けん、シャンプー、コンディショナー）等を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、生産された１又はそれ以上のカロテノイドを医薬品に組み込む。そのような医薬品の例は、例えば様々な種類の錠剤、カプセル、ドリンク剤、トローチ、うがい薬等を含む。一部の実施形態では、医薬品は局所適用に適する。投与形態は特に限定されず、カプセル、油、顆粒、微細顆粒、粉末、錠剤、丸剤、トローチ等を含む。油及び油充填カプセルは、製造の間の成分分解がないこと及び本発明のカロテノイド含有脂質滴が油性製剤に容易に組み込まれ得ることの両方の理由で、付加的な利点を提供し得る。
【００９７】
本発明に従った医薬品は、例えば米国薬局方に述べられている一般手順を含む、当技術分野において確立された手法に従って製造し得る。
【００９８】
本発明に従って生産されるカロテノイドは、例えば織物、塗料等を含む色素含有製品に組み込み得る。それらはまた、環境指標である製品又は検出試薬としての使用のためのバイオセンサーなどの装置にも組み込み得る。
【実施例】
【００９９】
下の表２６は、以下の実施例において使用したあるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株を説明する：
【０１００】
【表１】
（ＬＹＣｌ、ＬＹＳｌ、ＸＰＲ２及びＰＥＸ１７における遺伝子型は交配において決定されず、ＡＴＣＣ菌株に関しても確認されなかった。）
ここで述べる全ての基本的分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ（ｅｄｓ）．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ ＪＡ，Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ（ｅｄｓ）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に従って実施される。
【０１０１】
（実施例１）
カロテノイド菌株構築のためのプラスミドの生産
カロテノイド生産菌株の構築のためにプラスミドを作製した。以下の項は、カロテノイド形成性ポリペプチドをコードするプラスミドの生産を説明する。これらの試験において使用したプラスミド及びそれらの構築の詳細を表２７に示す。さらなるプラスミド構築の詳細及びそれらの使用の説明は、関連する章の本文に述べられている。全てのＰＣＲ増幅は、異なる記載がない限りＮＲＲＬ Ｙ−１０９５ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。以下で述べるＵＲＡ５遺伝子は、上記ｕｒａ２−２１栄養要求性株と対立遺伝子である。ＧＰＤ１及びＴＥＦ１プロモーターは、ＸＰＲ２ターミネーターと同様にＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからである。
【０１０２】
ＧＧＳ１は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子をコードする遺伝子である。核酸コード配列、及びｐＭＢ４５９１及びｐＭＢ４６８３のコードされるＧｇｓ１タンパク質は以下の通りである：
【０１０３】
【化１】
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
【表３】
表２７において言及する一部のオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０１０６】
【化２】
１Ａ：フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼをコードするｐＭＢ４６２８（ｔｅｆｌｐ−ｃａｒＲＰ ＬＥＵ２）の生産：イントロンを含むｃａｒＲＰを、ＭＯ４５２５及びＭＯ４５４１：
【０１０７】
【化３】
を使用してＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ９０６８０）ゲノムＤＮＡから増幅し、生じた１．９ｋｂフラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。生じたフラグメントを、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ−に平滑末端連結し、ｐＭＢ４５９９を生成した。ｐＭＢ４５９９からの１．９ｋｂ ＸｂａＩ−ＭｌｕＩフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＭｌｕＩで切断したｐＭＢ４６０３に挿入し、ｐＭＢ４６２８を生成した。イントロンを含む核酸コード配列、及びｐＭＢ４６２８のコードされるＣａｒＲＰタンパク質は以下の通りである：
【０１０８】
【化４−１】
【０１０９】
【化４−２】
代替的には、ｐＭＢ４５９９も、ＭＯ４３１８、ＭＯ４６４３、ＭＯ４６４４及びＭＯ４６３９：
【０１１０】
【化５】
を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用し、生じた０．５及び０．９５ｋｂのフラグメントを、その後、それぞれＡｃｃ６５ＩとＢｓａＩ、及びＢｓａＩとＰｐｕＭＩで切断した。これらのフラグメントを、Ａｃｃ６５Ｉ及びＰｐｕＭＩで消化しておいたｐＭＢ４５９９に連結し、イントロンのないｃａｒＲＰを担持するｐＭＢ４６１３を生成した。ｐＭＢ４６１３からの１．８５ｋｂ ＸｂａＩ−ＭｌｕＩフラグメントをＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ切断したｐＭＢ４６０３に挿入して、ｐＣａｒＲＰｄｅｌＩを生成することができる。
【０１１１】
１Ｂ：フィトエンデヒドロゲナーゼをコードする、ｐＭＢ４６３８（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ ＡＤＥ１）の生産：イントロンを含むｃａｒＢを、ＭＯ４５３０及びＭＯ４５４２：
【０１１２】
【化６】
を使用してＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ９０６８０）ゲノムＤＮＡから増幅し、生じた１．９ｋｂフラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳ−ＳＫＩ−に平滑末端連結し、ｐＭＢ４６０６を生成した。ｐＭＢ４６０６を、次に、ＭＯ４３１８とＭＯ４６４８、及びＭＯ４６４６とＭＯ４６４７、及びＭＯ４３４３とＭＯ４６４５：
【０１１３】
【化７】
を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用し、生じた０．４及び０．８５及び０．７ｋｂのフラグメントを、その後、Ａｃｃ６５ＩとＢｓａＩ、及びＢｓａＩ、及びＢｓａＩとＢａｍＨＩでそれぞれ切断した。これらのフラグメントを、Ａｃｃ６５ＩとＢａｍＨＩで切断しておいたｐＢＳ−ＳＫＩＩ−に連結し、イントロンのないｃａｒＢを担持するｐＭＢ４６１９を生成した。ｐＭＢ４６１９からの１．７５ｋｂ ＸｂａＩ−ＭｌｕＩフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ切断したｐＭＢ４６２９に挿入し、ｐＭＢ４６３８を生成した。生じた核酸コード配列及びｐＭＢ４６３８のコードされるＣａｒＢタンパク質は以下の通りである：
【０１１４】
【化８】
１Ｃ．フィトエンデヒドロゲナーゼをコードするｐＭＢ４６６０（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ ＵＲＡ３）の生産：ｐＭＢ４６３８からの４．３ｋｂ ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメント及び１．８ｋｂ ＮｏｔＩ−ＳｐｅＩフラグメントを、ＭＯ４６８４及びＭＯ４６８５：
【０１１５】
【化９】
を用いたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成した１．９ｋｂ ＢｓａＩ及びＳｐｅＩ切断ＵＲＡ３遺伝子に連結し、ｐＭＢ４６６０を作製した。生じた核酸コード配列及びｐＭＢ４６６０のコードされるＣａｒＢ（ｉ）タンパク質は以下の通りである：
【０１１６】
【化１０】
１Ｄ．切断型ＨＭＧ１をコードするｐＭＢ４６３７及びｐＴｅｆ−ＨＭＧの生産：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する７７アミノ酸リーダー配列を同時にコードする、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体の生産のために、以下のオリゴヌクレオチドを合成する：
【０１１７】
【化１１】
プライマーＯ及びＰは、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｍｅｔ−Ａｌａ及びそれに続くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨｍｇ１タンパク質の残基５３０−６０４をコードする０．２３ｋｂフラグメントを増幅するために使用する。プライマーＱ及びＭＯ４６５８は、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＨｍｇ１タンパク質のＣ末端４４８残基をコードする１．４ｋｂフラグメントを増幅するために使用する。これらのフラグメントを適切なクローニングベクターに連結し、ｐＯＰ及びｐＱＭＯ４６５８と称する、生じたプラスミドを、配列決定によって確認する。ＯＰフラグメントをＸｂａＩとＡｓｅＩで遊離させ、ＱＭＯ４６５８フラグメントをＭａｅＩとＭｌｕＩで遊離させる。これらのフラグメントを、次に、ＸｂａＩとＭｌｕＩで切断したＡＤＥ１ ＴＥＦ１ｐ発現ベクターｐＭＢ４６２９に連結して、ｐＴｅｆＨＭＧを生産する。
【０１１８】
代替的には、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからの天然ＨＭＧ１遺伝子を、プライマーＭＯ４６５８（上述した）及びＭＯ４６５７：
【０１１９】
【化１２】
を用いて上記表に示したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列なしで改変して、ｐＭＢ４６３７を作製し得る。生じた核酸コード配列及びｐＭＢ４６３７のコードされるＨｍｇ１ｔｒｕｎｃタンパク質は以下の通りである：
【０１２０】
【化１３−１】
【化１３−２】
１Ｅ．カロテンヒドロキシラーゼをコードするｐＭＢ４６９２（ＵＲＡ３ ｔｅｆ１ｐ−ｃｒｔＺ）の生産：Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのコドン使用の偏りを利用して、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓのタンパク質配列に基づき、以下のカロテンヒドロキシラーゼ（ＣｒｔＺ）ＯＲＦ配列を合成した：
【０１２１】
【化１４】
この配列を、ＸｂａＩとＭｌｕＩを用いて切断し、ｐＭＢ４６２９からのＡｃｃ６５Ｉ−ＮｈｅＩ ＴＥＦ１プロモーターフラグメントと共に、Ａｃｃ６５ＩとＭｌｕＩで切断したｐＭＢ４６６２に連結して、ｐＭＢ４６９２を作製した。核酸コード配列を上記に太字下線で示す。生じたｐＭＢ４６９２のコードされるｃｒｔＺタンパク質は以下の通りである：
【０１２２】
【化１５】
１Ｆ．カロテンケトラーゼをコードするｐＭＢ４６９８（ＡＤＥ１ ｔｅｆ１ｐ−ｃｒｔＷ）の生産：Ｓａｒｇａｓｓｏ Ｓｅａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣＹ０１０３４１９３．１）から単離した環境配列のタンパク質配列に基づき、以下のカロテンケトラーゼ（ＣｒｔＷ）ＯＲＦ配列を合成した：
【０１２３】
【化１６】
この配列を、ＸｂａＩとＭｌｕＩを用いて切断し、ＮｈｅＩとＭｌｕＩで切断したｐＭＢ４６２９に連結して、ｐＭＢ４６９８を作製した。核酸コード配列を上記に太字下線で示す。生じたｐＭＢ４６９８のコードされるｃｒｔＷタンパク質は以下の通りである：
【０１２４】
【化１７】
（実施例２）
カロテノイド生産上昇のためのＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの遺伝子工作
２Ａ．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ及びフィトエンデヒドロゲナーゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ３５０（ＭＡＴＢ ｕｒａ２−２１ ｌｅｕ２−３５ ａｄｅ１）を、ＳｓｐＩによってＵＲＡ５の上流で切断しておいたｐＭＢ４５９１（ｔｅｆ１ｐ−ＧＧＳ１）で形質転換した；ｕｒａ２遺伝子座にプラスミドを担持するＵｒａ＋形質転換体を特定し、ＭＦ３６４と命名した。それをその後、ＳｓｐＩによってＡＤＥ１で切断しておいたｐＭＢ４６３８（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ）で形質転換し、ａｄｅ１遺伝子座にプラスミドを担持する原栄養株形質転換体を選択した。この菌株をＭＦ５０２と命名した。
【０１２５】
２Ｂ．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ及びフィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ５０２を、ＳｓｐＩで処理しておいたｐＭＢ４６２８（ｔｅｆ１ｐ−ＣａｒＲＰ）で形質転換した。２−３日間の増殖後に形質転換プレート（１％グルコース及び０．１％グルタミン酸を添加したＹＮＢ寒天［ＹＮＢｇｌｕｔ］）で着色なし、橙色又は強い橙色であった９個の原栄養性コロニーを選択した。ＭＦ５９７とＭＦ６００（強い橙色）の２個は、ＹＰＤにおける３０℃で４日間の増殖後、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）ｇ当り４ｍｇ以上のカロテンを生産した。サザン分析は、ＭＦ５９７及びＭＦ６００からのゲノムＤＮＡにおいて異なる単一ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩバンドを明らかにし、いずれもｌｅｕ２−２７０において相同的組込みが起こらないことを示唆した。
【０１２６】
２Ｃ．フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ及びフィトエンデヒドロゲナーゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＡＴＣＣ２０１２４９（ＭＡＴＡ ｕｒａ３−３０２ ｌｅｕ２−２７０ ｌｙｓ８−ｌｌ）を、ＳｓｐＩ切断したｐＭＢ４６２８で形質転換した。数百個のＬｅｕ＋コロニーをプールし、再増殖させて、ＳａｌＩによってＵＲＡ３の上流で切断しておいたｐＭＢ４６６０（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ）で形質転換した。ＹＮＢｇｌｕｔプラス０．６ｍＭリシン上で３０℃にて５日後、著明に黄色であった１個のコロニーを選択し、ＭＦ４４７と命名して、ＹＰＤにおける４日間の増殖後に乾燥細胞重量のグラム当り０．２ｍｇのカロテンを生産することを認めた。
【０１２７】
ＭＦ４４７を１ｇ／Ｌの５−フルオロオロチン酸で攻撃誘発し、Ｕｒａ−分離株（ｓｅｇｒｅｇａｎｔｓ）を選択した。驚くべきことに、それらは全て親と同じ黄色の外観を保持することが認められ、機能的ＵＲＡ３遺伝子の喪失が機能的ＣａｒＢ酵素の喪失と一致しないことを示唆した。サザン分析は、ＭＦ４４７ ＤＮＡのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物からの２個のフラグメントがＵＲＡ３ｐにハイブリダイズする配列を含み、そのうちの１個だけがｃａｒＢにもハイブリダイズすることを明らかにする。他方はＭＦ５７８には存在せず、Ｕｒａ３−分離株をさらなる操作のために選択した。菌株ＭＦ４４７、ＭＦ５９７（実施例２ｃ）及びＭＦ６００（実施例２ｃ）におけるプラスミド救済及びｃａｒＢＰイントロンを含むＤＮＡ配列の分析は、エクソン１及び２が隣接し、もとの内部ＳｓｐＩ部位（ｐＭＢ４６２８に存在する）を持たないイントロン配列によって各々分離されていることを明らかにした。
【０１２８】
２Ｄ．フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ及びゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ５７８を、ＳａｌＩ（ＵＲＡ３の上流）又はＳｔｕＩ（ＧＧＳ１ ＯＲＦ内）で切断しておいたｐＭＢ４６８３（ｔｅｆ１ｐ−ＧＧＳ１）で形質転換した。Ｕｒａ＋Ｌｅｕ＋コロニーは、両方の場合に、ＹＮＢｇｌｕｔ＋Ｌｙｓ及びＹＰＤで明るい橙色に見え、いくつかは、上記のように増殖させたとき乾燥細胞重量のグラム当り４ｍｇ以上のカロテンを生産した。一方のＭＦ６３３は、サザン分析から推測されたように、ＧＧＳ１遺伝子座に１コピーのプラスミドを含んだ。他方は非相同的又はより複雑な組込みによって生じた。
【０１２９】
２Ｅ．フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ及びゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ３６４をＭＦ５７８と交配し、生じた二倍体からの胞子を３０℃で２−３日間ＹＰＤにプレートする。橙色のＬｅｕ＋Ａｄｅ−Ｕｒａ−コロニーをｔｅｆｐ−ｃａｒＢ、ｔｅｆｐ−ｃａｒＲＰ及びｔｅｆｐ−ＧＧＳ１の存在に関してＰＣＲによってスクリーニングし、ＹＰＤ液体培地での増殖後、高カロテノイド（＞４ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量）生産に関してスクリーニングする。これらの判定基準に合致し、並びにｕｒａ３−３０２対立遺伝子を担持することの指標である、５−フルオロオロチン酸に対する耐性を示すコロニーをさらなる検討のために選択し、以下ＧＢＲＰｕａ菌株と称する。そのような菌株をさらなる分析及び改変のために選択する。
【０１３０】
（実施例３）
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞からのカロテノイドの抽出
生成した菌株の振とうフラスコ試験を、ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）を用いて実施した。１２５ｍｌフラスコ中の培養物２０ｍｌを３０℃で増殖させた。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞を７２−９６時間培養物から採集し、カロテノイドの形態及び量を測定するために抽出を行った。培養物１．８ｍｌをエッペンドルフチューブに入れた。細胞をペレット化し、Ｈ２Ｏ １ｍｌで２回洗った。２回目の洗浄後、再懸濁した細胞を、上部に開けた穴がある、あらかじめ計量したスナップ式キャップのチューブに移し、細胞を一晩凍結乾燥した。完全に乾燥した後、乾燥細胞重量を算定するためにチューブを計量した。同じ振とうフラスコ培養から０．２５ｍｌを、カロテノイド抽出のために２ｍｌスクリューキャップチューブに入れた。細胞をペレット化し、上清を吸引した。ペレット化した細胞は、−８０℃で凍結し、保存し得る。等容積のキュービックジルコニアビーズを、氷冷抽出溶媒（０．０１％ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むヘキサンと酢酸エチルの５０／５０ ｖ／ｖ混合物）１ｍｌと共に、細胞ペレットに添加した。次に混合物を４℃で５分間、最大速度にて攪拌した（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ−８，ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）。その後混合物を最大速度で１分間遠心し、上清を収集して、低温１６ｍｌガラスバイアルにおいて沈殿させた。残りの細胞デブリを、キュービックジルコニアビーズを添加せずに少なくとも３回再抽出した；全ての上清を１６ｍｌガラスバイアルにプールした。抽出後、ガラスバイアルをＳｏｒｖａｌｌ卓上遠心分離機において４℃にて２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい低温１６ｍｌガラスバイアルに移した。上清を濃縮するためにＳｐｅｅｄ Ｖａｃを使用し（暗所にて室温で）、試料をＨＰＬＣ分析の直前まで−２０℃又は−８０℃で保存した。ＨＰＬＣ分析の前に、試料を氷冷溶媒１ｍｌに再懸濁し、その後低温アンバーバイアルに移した。プロトコール全体を通して、酸素、光、熱及び酸との接触を避けるように注意を払った。
【０１３１】
（実施例４）
ＨＰＬＣによるカロテノイド生産の定量化
カロテノイド分析のため、試料を氷冷抽出溶媒（０．０１％ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むヘキサンと酢酸エチルの５０／５０ ｖ／ｖ混合物）に再懸濁した。 Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）及びＴｈｅｒｍｏ Ｂａｓｉｃ ８ガードカラム（２．１×１０ｍｍ）を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２７９５ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を、２５℃でカロテノイドを分解するために使用した；基準カロテノイド試料を標準品として使用した。移動相及び流速を以下に示す（溶媒Ａ＝酢酸エチル；溶媒Ｂ＝水；溶媒Ｃ＝メタノール；溶媒Ｄ＝アセトニトリル）。注入量は１０μＬであった。検出器は、Ｗａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器であった。親油性分子についての保持時間は、アスタキサンチン（１．１５９分）、ゼアキサンチン（１．３３５分）、β−アポ−８’−カロテナール（２．８６分）、エルゴステロール（３．１１分）、リコペン（３．６９分）、β−カロテン（４．０２分）及びフィトエン（４．１３分）を含む。アスタキサンチン、ゼアキサンチン、β−アポ−８’−カロテナール、リコペン及びβ−カロテンは４７５ｎｍで検出し、エルゴステロールとフィトエンは２８６ｎｍで検出した。
【０１３２】
【表４】
（実施例５）
切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現はカロテノイド生産の上昇を生じさせる
カロテノイド生産を高めるため、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体を導入することによってイソプレノイド経路を通る炭素の流れを強化する。
【０１３３】
１つのアプローチでは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈｍｇ１に由来する７７アミノ酸リーダー配列を同時にコードするＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体をＧＲＰＢｕａ菌株（上記実施例２Ｅで述べた）に導入する。プラスミドｐＴｅｆＨＭＧを、ＧＲＰＢｕａ菌株において、ａｄｅ１遺伝子座での組込みを指令するためにＳｎａＢＩ、ＢｂｖＣＩ又はＢｓｕ３６Ｉで、又はＨＭＧ１遺伝子座での組込みを指令するためにＢａｍＨＩで、又はランダムな組込みを促進するためにＥｃｏＲＶで切断し、それらをアデニン原栄養性に回復させることができる。生じるＡｄｅ＋形質転換体をカロテノイド生産上昇に関してスクリーニングする。
【０１３４】
代替的には、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからの天然ＨＭＧ１遺伝子を、ｐＭＢ４６３７を生成するように、上記実施例１Ｄで述べたようにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列なしで改変し得る。このプラスミドを、ｐＴｅｆＨＭＧに関して述べたように消化し、ＧＲＰＢｕａ菌株に形質転換して、生じた形質転換体を上述したようにカロテノイド生産上昇に関してスクリーニングすることができる。
【０１３５】
さらにもう１つのアプローチでは、Ｎ．ｃｒａｓｓａ ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体を使用して、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株に導入し得る。異種ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現に適したプラスミドを作製するため、ｐ６４１Ｐ（Ｙｅａｓｔ ２００１；１８（２００１）：９７−１１３）を、ＩＣＬ１プロモーターをＧＰＤプロモーターで置換し、フレオマイシンに対する耐性を与える配列を付加することによって改変する。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１３６】
【化１８】
で増幅し、生じたフラグメント（０．７ｋｂ）をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化して、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ切断ｐ６４１Ｐに連結して、プラスミド「ｐ６４１Ｐｇｐｄ」を作製する。Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ＧＰＤプロモーターの制御下のｂｌｅ遺伝子を、次に、ｐＢＣｐｈｌｅｏ（Ｓｉｌａｒ，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ ４２：７３）から３．２ｋｂのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、ＧＰＤプロモーターに近接するＢａｍＨＩ部位を保存する方向で、「ｐ６４１Ｐｇｐｄ」のユニークＢａｍＨＩ部位に挿入して、「ｐ６４１Ｐｇｐｄｂｌｅ」を作製する。
【０１３７】
Ｎ．ｃｒａｓｓａゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１３８】
【化１９】
で増幅し、生じたフラグメントをＢａｍＨＩで切断して、ＢａｍＨＩ消化した「ｐ６４１Ｐｇｐｄｂｌｅ」に正しい方向で挿入する。生じるプラスミド、「ｐＺｇ」は、構成的ＧＰＤプロモーターの制御下でＮ．ｃｒａｓｓａからのヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの切断型サイトゾル触媒ドメインをコードする配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿３２４８９２）を含む。このプラスミドを、上記実施例２Ｅで作製したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株に導入することができ、形質転換体をフレオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）に対するそれらの耐性によって選択する。生じた形質転換体を、上述したように、β−カロテン生産に関して試験する。
【０１３９】
（実施例６）
アスタキサンチンの生産のための、カロテノイドを生産するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株への異種カロテンヒドロキシラーゼ及びカロテンケトラーゼ遺伝子の導入
カロテノイド産生Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへのカロテンヒドロキシラーゼ及びカロテンケトラーゼの導入のために、上記実施例１Ｅ及び１Ｆで述べたｐＭＢ４６９２及びｐＭＢ４６９８をＧＲＰＢｕａ菌株（実施例２Ｅで述べた）に連続的に導入することができる。ｐＭＢ４６９２の導入のためには、ｕｒａ３遺伝子座での組込みを指令するためにＳａｌＩ又はＢｓｒＧＩで、又はランダムな組込みを促進するためにＸｂａＩで切断し、ウラシル原栄養性を選択する。ｐＭＢ４６９２を内包するＧＲＰＢｕａ Ｕｒａ＋形質転換体をＹＰＤにおけるゼアキサンチン生産に関してスクリーニングする。ゼアキサンチン産生細胞をｐＭＢ４６９８（ａｄｅ１遺伝子座での組込みを指令するためにＰｐｕＭＩ、ＳｓｐＩ又はＢｂｖＣＩで、又はランダムな組込みを促進するためにＥｃｏＲＶで切断し得る）で形質転換し、原栄養性コロニーをアスタキサンチン生産に関してスクリーニングする。
【０１４０】
代替的には、プラスミド形質転換の順序を逆にしてもよく、ｐＭＢ４６９８を最初に形質転換し、形質転換体をアデニン原栄養性に関してスクリーニングする。ｐＭＢ４６９８を内包するＧＲＰＢｕａ Ａｄｅ＋形質転換体をカンタキサンチン生産に関してスクリーニングする。カンタキサンチン産生ＧＲＰＢｕａ［ｐＭＢ４６９８］細胞をｐＭＢ４６９２で形質転換し、原栄養性コロニーをアスタキサンチン生産に関してスクリーニングする。
【０１４１】
もう１つのアプローチでは、β−カロテンをアスタキサンチンに変換するために、Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉからのカロテノイドケトラーゼ及びカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子を上記実施例２で述べた菌株に導入することができる。Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１４２】
【化２０】
で増幅し、生じたフラグメントをＢｓｍＢＩで切断して、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで改変し、ＢｇｌＩＩで切断する。このフラグメントを、ｈｐ４ｄプロモーター、ＸＰＲ２ターミネーター、選択可能なＬＥＵ２遺伝子、及び大腸菌における選択と増殖のために必要な配列を含む、ＰｍｌＩ及びＢａｍＨＩ切断したｐＩＮＡ１２６９（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（２０００）：２０７−２１６）に挿入する。生じるプラスミド「ｐＡ」は、ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でＰ．ｍａｒｃｕｓｉｉからのカロテンヒドロキシラーゼをコードする配列（ｃｒｔＺ遺伝子）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＣＡＢ５６０６０．１）を含む。
【０１４３】
「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ」を、以下のようにＸＰＲ２ターミネーターをＬＩＰ２ターミネーターで置換することによって改変する。ｐＩＮＡ１２９１をＡｖｒＩＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで改変して、ＥｃｏＲＩで切断し、その小さなＬＩＰ２ｔ含有フラグメントを、ＳａｃＩＩで消化し、ｄＮＴＰの存在下にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで改変して、ＥｃｏＲＩで切断しておいた「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ」に連結する。生じるプラスミドを「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ−ＬＩＰ２ｔ」と命名する。
【０１４４】
カロテノイドケトラーゼ遺伝子を増幅するため、Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１４５】
【化２１】
で増幅し、生じたフラグメントをＡｖｒＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＡｖｒＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ切断した「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ−ＬＩＰ２ｔ」に挿入する。生じるプラスミド「ｐＢｔ」は、構成的ＴＥＦ１プロモーターの制御下でカロテンケトラーゼをコードする配列（ｃｒｔＷ遺伝子）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＣＡＢ５６０５９．１）を含む。
【０１４６】
２個の発現カセットを１個のプラスミド内で組み合わせるため、「ｐＢｔ」をＣｌａＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで改変して、ＥｃｏＲＩで切断し、ｃｒｔＷ含有フラグメントを単離して、リン酸化オリゴヌクレオチドアダプター対：
【０１４７】
【化２２】
と混合して、ＮｏｔＩで切断し、ＮｏｔＩ消化した「ｐＡ」に連結する。生じるプラスミド「ｐＡＢｔ」は、ＴＥＦ１ｐ／ｃｒｔＷ／ＬＩＰ２ｔカセット及びｈｐ４ｄ／ｃｒｔＺ／ＸＰＲ２ｔカセット並びに選択可能なＬＥＵ２遺伝子を含む。
【０１４８】
「ｐＡＢｔ」は、実施例４で上述したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株（ＴＥＦ１ｐ／ａｌ−１／ＸＰＲ２ｔ；ｈｐ４ｄ／ｃａｒＲＰ／ＬＩＰ２ｔ；ＧＰＤｐ／ＨＭＧＲｔｒｕｎｃ）に導入することができ、形質転換体をロイシン原栄養性に関して選択する。
【０１４９】
（実施例７）
スクアレンシンターゼをコードするＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＥＲＧ９遺伝子の部分的不活性化はカロテノイド生産の上昇を生じさせる
７Ａ．スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９遺伝子を部分的に不活性化するため、隣接するＦＯＬ３遺伝子を機能破壊し、フォリン酸要求性を生じさせる。次にこの菌株を、部分的に２個の遺伝子にわたる突然変異誘発したフラグメントで形質転換し、Ｆｏｌ＋形質転換体をスクアレンシンターゼ活性の低下に関してスクリーニングする。
【０１５０】
以下のオリゴヌクレオチド：
【０１５１】
【化２３】
を合成し、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して、ＦＯＬ３遺伝子の大部分にわたるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡからの２．３ｋｂフラグメントを増幅するために使用する。生じるフラグメントをＸｂａＩで切断し、リン酸化して、その後、ＫｐｎＩで切断し、ｄＮＴＰの存在下にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４ｐｏｌ）で処理して、その後ＸｂａＩで切断しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に連結する。ｐＢＳ−ｆｏｌ３と称する、生じたプラスミドを、Ａｃｃ６５ＩとＥｃｏＲＩで切断し、上記のようにＴ４ｐｏｌで処理して、ｐＭＢ４５２９からの３．４ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩ ＡＤＥ１フラグメント（Ｔ４ｐｏｌで処理した）に連結する。
【０１５２】
生じるプラスミド、ｐＢＳｆｏｌ３ΔａｄｅをＢｓｉＷＩとＸｂａＩで切断して、５．５ｋｂフラグメントを遊離させ、それを、上述したＧＲＢＰｕａ菌株をアデニン原栄養性に形質転換するために使用する。生じたＡｄｅ＋形質転換体をフォリン酸要求性に関して、及びＰＣＲ分析によって相同的組込みに関してスクリーニングする。
【０１５３】
生じるｆｏｌ３ΔＡＤＥ１対立遺伝子を内包する菌株を、プライマー：
【０１５４】
【化２４】
及び鋳型としてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡを用いて突然変異誘発性ＰＣＲ増幅によって作製した３．５ｋｂ ＤＮＡフラグメントで形質転換することができる。ＦＯＬ３ ＯＲＦのＮ末端側の４分の３及びＥＲＧ９ ＯＲＦのＣ末端側の１０分の９を含む、生じたフラグメントを、菌株を形質転換するために使用する。生じるＦｏｌ＋Ａｄｅ―形質転換体を、ザラゴジン酸、イトラコナゾール又はフルコナゾールなどの薬剤に対する感受性によってスクアレンシンターゼ活性の低下に関してスクリーニングする。付加的に、生じる形質転換体をカロテノイド生産の上昇に関してスクリーニングする。
【０１５５】
７Ｂ．代替的には、７Ａで作製したＰＣＲフラグメントをクローニングし、ＥＲＧ９遺伝子の３’非翻訳領域を除去するように変化させ得る。このフラグメントによるｆｏｌ３ΔＡＤＥ１機能破壊体の置換は、７Ａにおけるように確認できる、スクアレンシンターゼの発現低下を生じさせる［Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｃｅｌｌ １２３：５０７−５１９］［Ｍｕｈｌｒａｄ ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ（１９９９），ＲＮＡ ５：１２９９−１３０７］。このアプローチはまた、ＥＲＧ９ ３’−ＵＴＲを機能破壊するためのＡＤＥ１マーカーを用いて、Ｆｏｌ＋Ａｄｅ−菌株においても使用し得る。
【０１５６】
７Ｃ．さらにもう１つのアプローチでは、部分的欠損性ＥＲＧ９対立遺伝子を、プラスミドシャッフリング手法［Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：１６４−１７５］を用いて、及び薬剤感受性を表現型として使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて特定することができる。欠損遺伝子を、標準分子遺伝学手法を用いてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに移入することができる。
【０１５７】
（実施例８）
イソプレノイド生合成競合ポリペプチドの阻害剤によるカロテノイド産生Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株の処理はカロテノイド生産の上昇を生じさせる
実施例２で生成した培養物を、スクアレンシンターゼ阻害剤、ザラゴジン酸（０．５μＭのザラゴジン酸）で処理し、上述したようにβ−カロテン生産に関して観測する。
【０１５８】
（実施例９）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの含油性菌株の構築
Ｎ．ｃｒａｓｓａからのＡＴＰ−クエン酸リアーゼの２個のサブユニット、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＡＭＰデアミナーゼ及びＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓからのサイトゾルリンゴ酸酵素をコードする遺伝子を、総脂質含量を高めるためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ菌株において過剰発現させる。脂質生産を強化するための同様にアプローチを、同じ、相同又は機能的に類似の含油性ポリペプチドを使用して、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）などの他の宿主生物において使用できる。
【０１５９】
Ｑｉａｇｅｎ ＲΝＡＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ．）を、Ｎ．ｃｒａｓｓａの培養物から調製した凍結乾燥バイオマスからメッセンジャーＲＮＡを作製するために使用する。その後、ＲＴ−ＰＣＲを、ｍＲＮＡ鋳型及び以下のプライマー対：
【０１６０】
【化２５】
のいずれかを含む２つの反応において実施する。
【０１６１】
ａｃｌ１反応から生じたフラグメントをＳｐｅＩとＢａｍＨＩで切断し、ａｃｌ２反応からのフラグメントをＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断して、両方を、ＮｈｅＩとＳｐｈＩで消化しておいたＹＥｐ２４に連結して、プラスミド「ｐ１２」を作製する。二方向性ＧＡＬ１−１０プロモーターを、プライマー：
【０１６２】
【化２６】
を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡから増幅し、生じた０．６７ｋｂフラグメントをＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩ消化した「ｐ１２」にいずれかの方向で連結して、それぞれＧＡＬ１−ａｃｌ１／ＧＡＬ１０−ａｃｌ２及びＧＡＬ１０−ａｃｌ１ ／ＧＡＬ１−ａｃｌ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ａｃｌ１：ＣＡＢ９１７４０．２；ａｃｌ２：ＣＡＢ９１７４１．２）を含む、「ｐ１ｇａｌ２」及び「ｐ２ｇａｌ１」を作製する。
【０１６３】
ＡＭＰデアミナーゼをコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ遺伝子及びこの遺伝子を発現するのに適したプロモーターを増幅するため、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅゲノムＤＮＡを別々の反応において２個のプライマー対：
【０１６４】
【化２７】
を用いて増幅し、ＡＭＤ１反応から生じたフラグメント（２．４ｋｂ）をＳａｃＩとＡｖｒＩＩで切断し、ＧＡＬ７反応からのフラグメント（０．７ｋｂ）をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断して、両方を、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化しておいたＹＥｐ１３に連結して、プラスミド「ｐＡＭＰＤ」を作製する。このプラスミドは、ガラクトース誘導的ＧＡＬ７プロモーターの制御下に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子、ＡＭＰデアミナーゼをコードするＡＭＤ１を担持する。
【０１６５】
メッセンジャーＲＮＡを上述したようにＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓの凍結乾燥バイオマスから調製し、そのｍＲＮＡ鋳型を２個のプライマー：
【０１６６】
【化２８】
と共にＲＴ−ＰＣＲ反応において使用して、生じたフラグメントをＮｈｅＩとＳａｌＩで切断し、ＸｂａＩとＸｈｏＩで消化したｐＲＳ４１３ＴＥＦ（Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ，１５６：１１９−１２２）に連結して、構成的ＴＥＦ１プロモーターの制御下にＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓからのサイトゾルＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素をコードする配列（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４０；ｍｃｅ遺伝子；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＹ２０９１９１）を含む、プラスミド「ｐＴＥＦＭＡＥ」を作製する。
【０１６７】
プラスミド「ｐ１ｇａｌ２」、「ｐＡＭＰＤ」及び「ｐＴＥＦＭＡＥ」を、ウラシル（「ｐ１ｇａｌ２」）、ロイシン（「ｐＡＭＰＤ」）及びヒスチジン（「ｐＴＥＦＭＡＥ」）に対する原栄養性を回復するためＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅの菌株に連続的に形質転換する（Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４：１−９３３，１９９１）。生じた形質転換体を、実施例３で述べたように、ウラシル、ロイシン及びヒスチジンを含まない合成完全（ＳＣ）培地、又は２段階発酵工程のいずれかにおける振とうフラスコ試験後に総脂質含量に関して試験する。２段階工程では、ウラシル、ロイシン及びヒスチジンを欠くＳＣ培地を含む一晩の回転管培養物２ｍｌからの細胞１．５ｍｌを遠心分離し、蒸留水で洗って、脂質蓄積に適する窒素制限培地２０ｍｌ（３０ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ酵母抽出物、０．５ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、７ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０８ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ Ｃｏ（ＮＯ３）２−６Ｈ２Ｏ；ｐＨ５．５（Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７０：８９１−８９４（１９９３））に再懸濁する。
【０１６８】
改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株と対照菌株の細胞内脂質含量を、蛍光プローブ、ナイルレッドを用いて分析する（Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ（２００４）５６：３３１−３３８）。簡単に述べると、緩衝液に希釈した細胞をナイルレッドで染色し、４８８ｎｍで励起して、４００−７００ｎｍの波長領域内の蛍光発光スペクトルを獲得し、ナイルレッドで染色していない細胞からの対応するスペクトルと比較する。迅速推定法からの結果を確認するため、記述されているように（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；６０（３）：２７５−８０）、乾燥細胞から直接トランスメチルエステル化した総脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析によって総脂質含量を測定する。非形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株は、ＹＰＤ及び脂質蓄積培地における増殖後、それぞれ６％及び１０％総脂質（乾燥細胞重量ベース）を生産する。多数の含油性ポリペプチドを発現する酵母菌株は、ＹＰＤ及び脂質蓄積培地における増殖後、それぞれ１７％及び２５％総脂質を生産する。
【０１６９】
（実施例１０）
ゼアキサンチンの生産のための、カロテノイド産生Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株への異種カロテンヒドロキシラーゼの導入
ＭＦ５７８（ｔｅｆ−ｃａｒＲＰ ｔｅｆ−ｃａｒＢ）を、ＳａｌＩで切断しておいたｐＭＢ４６９２で形質転換した。ＰＣＲ分析により、ｔｅｆ−ｃｒｔＺを含むと推定されるいくつかのＵｒａ＋コロニーは、ＹＰＤ振とうフラスコにおいてゼアキサンチンを生産することができ、ある場合には、全てのカロテンが使い尽くされた。
【０１７０】
以下の表は、本書全体を通して参照される：
【０１７１】
【表５】
【０１７２】
【表６】
【０１７３】
【表７】
【０１７４】
【表８】
【０１７５】
【表９】
【０１７６】
【表１０】
【０１７７】
【表１１】
【０１７８】
【表１２】
【０１７９】
【表１３】
【０１８０】
【表１４】
【０１８１】
【表１５】
【０１８２】
【表１６】
【０１８３】
【表１７】
【０１８４】
【表１８】
【０１８５】
【表１９】
【０１８６】
【表２０】
【０１８７】
【表２１】
【０１８８】
【表２２】
【０１８９】
【表２３】
【０１９０】
【表２４】
【０１９１】
【表２５】
【０１９２】
【表２６】
【０１９３】
【表２７】
【０１９４】
【表２８】
【０１９５】
【表２９】
【０１９６】
【表３０】
【０１９７】
【表３１】
【０１９８】
【表３２】
【０１９９】
【表３３】
【０２００】
【表３４】
【０２０１】
【表３５】
【０２０２】
【表３６】
【０２０３】
【表３７】
【０２０４】
【表３８】
【０２０５】
【表３９】
【０２０６】
【表４０】
【０２０７】
【表４１】
【０２０８】
【表４２】
【０２０９】
【表４３】
【０２１０】
【表４４】
【０２１１】
【表４５】
【０２１２】
【表４６】
【０２１３】
【表４７】
【０２１４】
【表４８】
【０２１５】
【表４９】
【０２１６】
【表５０】
【０２１７】
【表５１】
【０２１８】
【表５２】
【０２１９】
【表５３】
【０２２０】
【表５４】
当業者は、ここで述べる本発明の特定実施形態の多くの等価物を認識する、又は単に常套的な実験を用いて確認することができる。本発明の範囲は上記説明に限定されることを意図されず、付属の特許請求の範囲に述べられている通りである。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図２】図２は、重要なレベルのサイトゾル脂質の生産を可能にする十分なレベルのアセチル−ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨがどのようにして含油性生物のサイトゾル内に蓄積され得るかを示す。酵素：１、ピルビン酸デカルボキシラーゼ；２、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；３、リンゴ酸酵素；４、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ；５、クエン酸シンターゼ；６、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ；７、クエン酸／リンゴ酸トランスロカーゼ。
【図３Ａ】図３Ａは、典型的には真菌を含む真核生物において作動する、メバロン酸イソプレノイド生合成経路を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、典型的には真菌を含む真核生物において作動する、メバロン酸イソプレノイド生合成経路を示す。
【図４】図４は、典型的には細菌及び植物の色素体において作動する、ＤＸＰ経路としても知られるメバロン酸非依存性イソプレノイド生合成経路を示す。
【図５】図５は、イソプレノイド生合成経路における中間体、及びそれらがどのようにしてカロテノイド並びにステロール、ステロイド及びビタミンＥ又はビタミンＫなどのビタミンのような非カロテノイド化合物を含む他の生体分子の生合成経路に供給されるかを示す。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ａは、様々な環式及び非環式キサントフィルを導く分枝を強調する。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ｂは、アスタキサンチンを含む、二環式及び単環式カロテノイドを生成するある種のＸ．ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ経路を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ｃは、β−カロテンを、アスタキサンチンを含む様々な他のカロテノイドのいずれかに変換するための相互連結経路を示すす。
【図６Ｄ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ｄは、ニューロスポレンからの環式カロテノイド及び一般的な植物及び藻類キサントフィルの可能な合成経路を示す。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｅ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｆ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｇ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｈ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｉ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図８Ａ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【図８Ｂ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【図８Ｃ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【図８Ｄ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年３月１８日に出願された米国仮出願第60/663,621号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
カロテノイドは、光合成生物（例えば植物、藻類、藍細菌）及び一部の真菌を含む、ある種の生物によって天然に生産される黄色から赤色までの範囲にわたる有機色素である。カロテノイドは、ニンジンの橙色、並びにフラミンゴ及びサケの桃色、及びロブスターならびにエビの赤色の原因である。しかしながら、動物は、カロテノイドを生産することができず、食餌を通して摂取しなければならない。
【０００３】
カロテノイド色素（例えばβ−カロテン及びアスタキサンチン）は、産業上、食料及び供給原料の原料として使用されており、どちらも栄養機能に役立ち、消費者の受容性を高める。例えばアスタキサンチンは、サケの水産養殖においてその野生物の特徴である橙色の着色を与えるために広く使用されている。一部のカロテノイドはビタミンＡの前駆体でもある。また、カロテノイドは抗酸化特性を有しており、様々な健康上の恩恵を有し得る（例えば非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５参照）。β−カロテン、リコペン及びルテインなどの一部のカロテノイドは現在、栄養補助食品として市販されている。
【０００４】
一般に、カロテノイドを生産する生物系は、産業的に加工しにくく及び／又は商業規模での単離が実施不能である程の低レベルでしか化合物を生産しない。それ故、産業上使用される大部分のカロテノイドは化学合成によって生産される。カロテノイドを生産する改善された生物系への需要が存在する。より高レベルのカロテノイドを生産するようにある種の細菌又は真菌を遺伝子工作する努力がこれまでにも為されてきた（例えば非特許文献６；非特許文献７参照）。しかし、より高いレベルの生産とより容易な単離を可能にする改善されたシステムが必要とされている。
【非特許文献１】Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒ，Ｃａｎｃｅｒ １６：９３，１９９１
【非特許文献２】Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７：１７６７，１９９５
【非特許文献３】Ｍｉｋｉ，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ ６３：１４１，１９９１
【非特許文献４】Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：１８４９，１９９９
【非特許文献５】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：２４５２，２０００
【非特許文献６】Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１６９，１９９８
【非特許文献７】Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４：２２１，２００３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、カロテノイドの生物学的生産のための改善されたシステムを提供する。１つの態様では、本発明は、含油性生物においてカロテノイドを生産することが望ましいという発見を含む。特定理論に縛られるのは望むところではないが、本願発明人は、化合物を脂質体内に隔離すれば生物系はより高いレベルのカロテノイドを蓄積し得ると提案する。絶対レベルがより高いか否かに関わらず、しかしながら、含油性生物の脂質体内に蓄積されたカロテノイドは脂質体の単離をとおして容易に単離できる。
【０００６】
本発明は、それ故、１又はそれ以上のカロテノイドを生産する含油性真菌（例えば酵母又は他の単細胞真菌を含む）を提供する。本発明はまた、そのような酵母及び真菌を構築する方法、カロテノイドを生産するためにそのような酵母及び真菌を使用する方法、及びそのような含油性酵母又は真菌において生産されるカロテノイドを使用して、食品又は飼料添加物又は栄養補助食品などのカロテノイド含有組成物を製造する方法を提供する。特に、本発明は、改変を含まない、さもなければ同じ生物と比較して、含油性（ｏｌｅａｇｉｎｉｃｉｔｙ）を高める及び／又はカロテノイド生産能力を変化させる１又はそれ以上の含油性（ｏｌｅａｇｉｎｉｃ）及び／又はカロテノイド形成性改変を含む酵母及び真菌を作製するためのシステム及び方法を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、脂質蓄積システムが親油性物質（イソプレノイド又はイソプレノイド由来化合物など、しかしこれらに限定されない）の生産及び／又は単離のために有用であるという一般的認識を含む。それ故、本発明によれば、そのような親油性物質を生産する及び／又は脂質を蓄積するように生物を遺伝子工作することが望ましい。
【０００８】
本発明の様々な他の態様は、付属の特許請求の範囲を含む本発明の説明から当業者に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（定義）
カロテノイド形成性改変：ここで使用する、「カロテノイド形成性改変」という用語は、ここで述べるような、１又はそれ以上のカロテノイドの生産を調節する宿主生物の改変を指す。例えばカロテノイド形成性改変は、１又はそれ以上のカロテノイドの生産レベルを上昇させ得る、及び／又は種々のカロテノイドの相対的生産レベルを変化させ得る。原則として、本発明のカロテノイド形成性改変は、同じ改変に供していない、さもなければ同じ生物において生産されるレベルと比較して、その生物によって生産される、宿主生物における１又はそれ以上のカロテノイドの生産を適切に変化させる何らかの化学的、生理的、遺伝的又は他の改変であり得る。大部分の実施形態では、しかしながら、カロテノイド形成性改変は、典型的には１又はそれ以上の選択カロテノイドの生産上昇を生じさせる、遺伝的改変を含む。一部の実施形態では、選択カロテノイドは、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ルテイン、リコペン、フィトエン、ゼアキサンチン、及び／又はゼアキサンチン又はアスタキサンチンの改変体（例えば配糖体、エステル化ゼアキサンチン又はアスタキサンチン）の１又はそれ以上である。一部の実施形態では、選択カロテノイドは、１又はそれ以上のキサントフィル、及び／又はその改変体（例えば配糖体、エステル化キサントフィル）である。ある実施形態では、選択キサントフィルは、アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、リコペン、及びそれらの改変体から成る群より選択される。一部の実施形態では、選択カロテノイドは、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ルテイン、リコペン及びゼアキサンチン及び／又はゼアキサンチン又はアスタキサンチンの改変体の１又はそれ以上である。一部の実施形態では、カロテノイドはβ−カロテンである。一部の実施形態では、選択カロテノイドはアスタキサンチンである。一部の実施形態では、選択カロテノイドはβ−カロテン以外である。
【００１０】
カロテノイド形成性ポリペプチド：ここで使用する、「カロテノイド形成性ポリペプチド」という用語は、細胞においてカロテノイドを生産する過程に関与するポリペプチドを指し、カロテノイド生産以外の過程に関与するが、その活性が、例えばカロテノイド生産に直接関与するカロテノイドポリペプチドによって利用される基質又は反応物を捕捉することによって、１又はそれ以上のカロテノイドの生産の程度又はレベルに影響を及ぼすポリペプチドを含み得る。カロテノイド形成性ポリペプチドは、それらの用語がここで定義される、イソプレノイド生合成ポリペプチド、カロテノイド生合成ポリペプチド、及びイソプレノイド生合成競合ポリペプチドを含む。この用語はまた、カロテノイドが脂質体内に蓄積される程度に影響を及ぼし得るポリペプチドを包含する。
【００１１】
カロテノイド：「カロテノイド」という用語は、当技術分野では、イソプレノイド経路の中間体から誘導される構造的に多様なクラスの色素を指すと理解される。カロテノイド生合成における拘束段階は、ゲラニルゲラニルピロリン酸からのフィトエンの形成である。カロテノイドは非環式又は環式であり得、酸素を含んでもよく又は含まなくてもよいので、この用語はカロテンとキサントフィルの両方を包含する。一般に、カロテノイドは、形式的にはトリテルペン（Ｃ３０ジアポカロテノイド）及びテトラテルペン（Ｃ４０カロテノイド）並びにそれらの酸素化誘導体及び、例えばＣ３５、Ｃ５０、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ８０の長さ又は他の長さの他の化合物を含む、５炭素化合物ＩＰＰから誘導される共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素化合物である。多くのカロテノイドは強力な吸光特性を有し、その長さはＣ２００以上に及ぶ。Ｃ３０ジアポカロテノイドは、典型的には、イソプレノイド単位の配置が、２個の中点メチル基が１，６−位置関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５位置関係にあるように分子の中央で逆転する方式で連結された６個のイソプレノイド単位から成る。そのようなＣ３０カロテノイドは、形式的には、共役二重結合の長い中心鎖を有する非環式Ｃ３０Ｈ４２構造から、（ｉ）水素添加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、又はこれらの工程の何らかの組合せによって誘導され得る。Ｃ４０カルテノイドは、典型的には、イソプレノイド単位の配置が、２個の中点メチル基が１，６−位置関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５位置関係にあるように分子の中央で逆転する方式で連結された８個のイソプレノイド単位から成る。そのようなＣ４０カロテノイドは、形式的には、共役二重結合の長い中心鎖を有する非環式Ｃ４０Ｈ５６構造から、（ｉ）水素添加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、又はこれらの工程の何らかの組合せによって誘導され得る。Ｃ４０カロテノイドのクラスはまた、炭素骨格の再構成から、又はこの構造の部分の（形式的な）除去によって生じるある種の化合物を含む。６００個以上の異なるカロテノイドが自然界で特定された；一部の一般的なカロテノイドが図１に示されている。カロテノイドは、以下を含むがこれらに限定されない：アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、β、Ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、Ψ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピン配糖体、４−ケト−ルビキサンチン、シフォナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−二配糖体、ゼアキサンチン及びＣ３０カロテノイド。付加的に、カロテノイド化合物は、ヒドロキシ、メトキシ、オキソ、エポキシ、カルボキシ又はアルデヒド官能基を含み得る、これらの分子の誘導体を含む。さらに、含まれるカロテノイド化合物は、エステル（例えば配糖体エステル、脂肪酸エステル）及び硫酸誘導体（例えばエステル化キサントフィル）を含む。
【００１２】
カロテノイド生合成ポリペプチド：「カロテノイド生合成ポリペプチド」という用語は、１又はそれ以上のカロテノイドの合成に関与するポリペプチドを指す。いくつか挙げると、これらのカロテノイド生合成ポリペプチドは、例えばフィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ（又はデサチュラーゼ）、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、アスタキサンチンシンターゼ、カロテノイドεヒドロキシラーゼ、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼ、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含む。カロテノイド生合成ポリペプチド配列の代表的な例を表１７−２５に示す。
【００１３】
遺伝子：ここで使用する、「遺伝子」という用語は、一般に、場合により１又はそれ以上の遺伝子産物（すなわちＲＮＡ又はタンパク質）の発現に影響を及ぼし得るある種の調節エレメントを含む、ポリペプチドをコードする核酸を指す。
【００１４】
異種：遺伝子又はポリペプチドを指すためにここで使用する、「異種」という用語は、それが発現されている生物において天然では生じない遺伝子又はポリペプチドを指す。一般に、宿主細胞への導入及び／又は宿主細胞による発現のために異種遺伝子又はポリペプチドを選択するとき、そこから異種遺伝子又はポリペプチドを選択し得る特定の供給源生物が本発明の実施にとって必須でないことは了解される。関連する考慮事項は、例えば潜在的ソースと宿主生物が進化においてどれほど密接に関連するか、又は供給源生物が、他の関連ポリペプチドの配列が選択された他の供給源生物とどのように関連するかを含み得る。
【００１５】
宿主細胞：ここで使用する、「宿主細胞」は、ここで述べるように脂質を蓄積するため及び／又は１又はそれ以上のカロテノイドを発現するために本発明に従って操作される酵母又は真菌細胞である。「改変宿主細胞」は、ここで使用するとき、本発明に従った少なくとも１つの含油性改変及び／又は少なくとも１つのカロテノイド形成性改変を含む宿主細胞である。
【００１６】
「単離」：ここで使用する、「単離」という用語は、単離された実体が、それがこれまで結合していた少なくとも１つの成分から分離されたことを意味する。大部分の他の成分が除去されているとき、単離された実体は「精製」されている。単離及び／又は精製は、例えば分画、抽出、沈殿又は他の分離法を含む、当技術分野で公知の何らかの手法を用いて実施し得る。
【００１７】
イソプレノイド生合成競合ポリペプチド：ここで使用する、「イソプレノイド生合成競合ポリペプチド」という用語は、細胞におけるその発現が、カロテノイド生合成経路に入るために使用可能なゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のレベルを低下させるポリペプチドを指す。例えばイソプレノイド生合成競合ポリペプチドは、より少ないＧＧＰＰが生成されるように、ＧＧＰＰに先立つイソプレノイド中間体に作用する酵素を含む（例えば図５参照）。スクアレンシンターゼは、本発明に従ったイソプレノイド生合成競合ポリペプチドの１つである；代表的なスクアレンシンターゼ配列を表１６に示す。プレニル二リン酸シンターゼ酵素及びパラ−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）ポリプレニルトランスフェラーゼは、本発明に従ったさらなるイソプレノイド生合成競合ポリペプチドである；代表的なプレニル二リン酸シンターゼ酵素及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼポリペプチドをそれぞれ表２９及び３０に示す。
【００１８】
イソプレノイド生合成ポリペプチド：「イソプレノイド生合成ポリペプチド」という用語は、イソプレノイドの合成に関与するポリペプチドを指す。例えばここで論じるように、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼは、全てイソプレノイド生合成のためのメバロン酸経路に関与する。これらのタンパク質の各々はまた、本発明のためのイソプレノイド生合成ポリペプチドであり、これらの酵素の代表的な例の配列を表７−１５に示す。
【００１９】
イソプレノイド経路：「イソプレノイド経路」は、当技術分野では、５炭素代謝産物イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）を生産するか又は利用する代謝経路を指すと理解される。ここで論じるように、２つの異なる経路−「メバロン酸経路」と「非メバロン酸経路」−が共通のイソプレノイド前駆体ＩＰＰを生産することができる。「イソプレノイド経路」は、これらの種類の経路の両方を包含するのに十分なだけ一般的である。ＩＰＰからのイソプレノイドの生合成は、いくつかの５炭素イソプレンサブユニットの重合によって起こる。ＩＰＰから誘導されるイソプレノイド代謝産物は、環式及び非環式分子の両方を含む、様々な大きさと化学構造である。イソプレノイド代謝産物は、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、ステロール及びカロテノイドなどのポリプレノールを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
含油性改変：ここで使用する、「含油性改変」という用語は、ここで述べるように、宿主生物の望ましい含油性を調節する宿主生物の改変を指す。一部の場合、宿主生物は、その乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積する能力を有するという意味で既に含油性である。それにもかかわらず、例えばその総脂質蓄積を上昇させるため（又は一部の場合、場合により低下させるため）、又はそれが蓄積する１又はそれ以上の特定脂質の種類又は量を調節するため（例えばトリアシルグリセロールの相対的蓄積を上昇させるため）に、本発明に従って、そのような生物に含油性改変を適用することが望ましいと考えられる。また別の場合には、宿主生物は非含油性であり得（脂質を蓄積するために他の生物において使用されるいくつかの酵素及び調節成分を含み得るが）、本発明に従って含油性になるために含油性改変を必要とし得る。本発明はまた、改変後も、ここで定義する含油性になり得ない場合でも、それらの含油性を上昇させるような非油性宿主株への含油性改変の適用を考慮する。原則として、含油性改変は、含油性改変に供していない、さもなければ同じ生物と比較して、宿主生物の含油性を適切に変化させる何らかの化学的、生理的、遺伝的又は他の改変であり得る。大部分の実施形態では、しかしながら、含油性改変は、典型的には１又はそれ以上の含油性ポリペプチドの生産及び／又は活性上昇を生じさせる、遺伝的改変を含む。一部の実施形態では、含油性改変は、少なくとも１つの化学的、生理的、遺伝的又は他の改変を含む；別の実施形態では、含油性改変は２以上の化学的、生理的、遺伝的又は他の改変を含む。２以上の改変を使用するある態様では、そのような改変は、化学的、生理的、遺伝的又は他の改変の何らかの組合せ（例えば１又はそれ以上の遺伝的改変と化学的又は生理的改変）を含み得る。
【００２１】
含油性ポリペプチド：ここで使用する、「含油性ポリペプチド」という用語は、細胞における脂質蓄積の過程に関与するポリペプチドを指し、脂質生合成以外の過程に関与するが、その活性が、例えば脂質蓄積に直接関与する含油性ポリペプチドによって利用される基質又は反応物を捕捉することによって、１又はそれ以上の脂質の蓄積の程度又はレベルに影響を及ぼすポリペプチドを含み得る。例えばここで論じるように、数あるタンパク質の中でも特に、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、及びＡＭＰデアミナーゼは全て細胞における脂質蓄積に関与する。一般に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させること、及び／又はアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素及び／又はＡＭＰデアミナーゼの活性を上昇させることは含油性を促進すると予想される。これらのタンパク質の各々は本発明のための含油性ポリペプチドであり、これらの酵素の代表的な例の配列を表１−６に示す。
【００２２】
含油性：「含油性」という用語は、その乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積する生物の能力を指す。本発明のある実施形態では、含油性酵母又は真菌は、それらの乾燥細胞重量の少なくとも約２５％まで脂質を蓄積する。他の実施形態では、本発明の含油性酵母又は真菌は、それらの乾燥細胞重量の約２０−４５％の範囲内の脂質を蓄積する。一部の実施形態では、含油性生物は、それらの乾燥細胞重量の約７０％まで脂質を蓄積し得る。本発明の一部の実施形態では、含油性生物は、全脂質蓄積の大きな画分をトリアシルグリセロールの形態で蓄積し得る。ある実施形態では、蓄積脂質の大部分がトリアシルグリセロールの形態である。代替的に、又は付加的に、脂質は細胞内脂質体又は油体（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｏｉｌ ｂｏｄｙ）の形態で蓄積し得る。ある実施形態では、本発明は、天然に含油性である酵母又は真菌を利用する。一部の態様では、天然含油性生物を、生物における蓄積脂質のレベルをさらに上昇させるように操作する（例えば遺伝学的に、化学的に又は別の方法で）。他の実施形態では、天然では含油性でない酵母又は真菌を、ここで述べるように脂質を蓄積するように操作する（例えば遺伝学的に、化学的に又は別の方法で）。本発明に関して、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）及びＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓは天然含油性真菌ではない。
【００２３】
ポリペプチド：ここで使用する、「ポリペプチド」という用語は、一般に少なくとも３個のアミノ酸のポリマーの当技術分野で認識される意味を有する。しかし、この用語はまた、例えば含油性ポリペプチド、カロテノイド形成性ポリペプチド、イソプレノイド生合成ポリペプチド、カロテノイド生合成ポリペプチド、及びイソプレノイド生合成競合ポリペプチドなどの、特定機能クラスのポリペプチドを指すためにも使用される。各々のそのようなクラスに関して、本明細書は、そのようなポリペプチドの公知の配列のいくつかの例を提供する。当業者は、しかしながら、「ポリペプチド」という用語が、ここで（又はここで特定して言及する参考文献又はデータベースにおいて）列挙する完全な配列を有するポリペプチドだけでなく、そのような完全ポリペプチドの機能性フラグメント（すなわち少なくとも１つの活性を保持するフラグメント）であるポリペプチドも包含するのに十分なほど一般的であることが意図されている。さらに、当業者は、タンパク質配列が一般に活性を破壊することなく多少の置換を許容することを理解する。それ故、活性を保持し、同じクラスのもう１つ別のポリペプチドと、少なくとも約３０−４０％の全体的配列同一性、しばしば約５０％、６０％、７０％又は８０％以上の全体的配列同一性を共有し、さらに通常は、１又はそれ以上の高度に保存された領域内にはるかに高い同一性、しばしば９０％以上又はさらには９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性の少なくとも１つの領域を含み（例えばイソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドはしばしば保存されたＡＭＰ結合モチーフを共有する；ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドは、典型的には高度に保存された触媒ドメインを含む（例えば図７参照）；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、典型的にはカルボキシルトランスフェラーゼドメインを有する；例えば各々その全体が参照によりここに組み込まれる、Ｄｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．９３：４８４，１９８０；Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：２４９，１９８５；Ｊｉｔｒａｐａｋｄｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．４：２１７，２００３；米国特許第５，３４９，１２６号参照）、通常は少なくとも３−４個、しばしば２０個又はそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドは、ここで使用する「ポリペプチド」の関連用語内に包含される。
【００２４】
供給源生物：ここで使用する、「供給源生物」という用語は、特定ポリペプチド配列が天然で見出され得る生物を指す。それ故、例えば１又はそれ以上の異種ポリペプチドが宿主生物において発現される／発現されている場合、そのポリペプチドが天然で発現される（及び／又はそれらの遺伝子が最初にクローン化された）生物を「供給源生物」と称する。２以上の異種ポリペプチドが宿主生物において発現されている場合、１又はそれ以上の供給源生物を異種ポリペプチドの各々の独立した選択のために使用し得る。関連ペプチド配列を天然に含むありとあらゆる生物が、本発明に従った供給源生物として使用し得る。代表的な供給源生物は、例えば動物、哺乳動物、昆虫、植物、真菌、酵母、藻類、細菌、藍細菌、古細菌及び原生動物供給源生物を含む。
【００２５】
（本発明の一部の好ましい実施形態の詳細な説明）
上述したように、本発明は、カロテノイドが含油性酵母及び真菌において望ましく生産できるという発見を含む。本発明によれば、（ｉ）しばしば細胞質油体の形態で、及び典型的にはそれの乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで、脂質を蓄積し；及び（ｉｉ）それらの乾燥細胞重量の少なくとも約１％、一部の実施形態では少なくとも約３−２０％のレベルでカロテノイドを生産する菌株が、宿主細胞の操作を通して生成される（すなわち、例えば天然に生じる菌株、これまでに改変された菌株等を含む菌株）。その後、脂質体に分配されるカロテノイドが容易に単離できるように、これらの操作された宿主細胞を使用してカロテノイドを生産する。
【００２６】
一般に、最小限の望ましいレベルの含油性が達成されるやいなや、利用することができ、生成物の生合成に転用できる実質的に全てのさらなる炭素がカロテノイド生産経路に転用されるように、本発明の細胞における含油性とカロテノイド生産のバランスをとることが望ましい。本発明の一部の実施形態では、この戦略は、細胞を含油性に遺伝子工作することを含む；他の実施形態では、細胞を、遺伝子工作された細胞がここで定義する「含油性」になり得ない場合でも、そのような遺伝子工作を受けない場合にそれらの細胞が蓄積するよりも高いレベルの脂質、特に細胞質脂質を蓄積するように遺伝子工作することを含む。他の実施形態では、含油性宿主細胞が脂質を蓄積する程度を、残りの炭素がカロテノイド生産において利用できるように実質的に低下させる。
【００２７】
（宿主細胞）
当業者は、天然に含油性である又は天然にカロテノイドを生産する様々な酵母及び真菌が存在することを容易に認識する。そのような菌株のいずれもが本発明に従った宿主菌株として使用でき、本発明の含油性・カロテノイド生産菌株を生成するように遺伝子工作又はさもなければ操作し得る。代替的に、天然では含油性でなく、カロテノイド生産性でもない菌株を使用し得る。さらに、特定菌株が含油性又はカロテノイド生産の天然能力を有するときでも、脂質及び／又はカロテノイドの生産レベルを変化させるために、その天然の能力をここで述べるように調節し得る。ある実施形態では、菌株の遺伝子工作又は操作は、脂質及び／又は生産されるカロテノイドの改変を生じさせる。例えば菌株は天然に含油性及び／又はカロテノイド形成性であり得るが、蓄積される脂質の種類を変化させるため又は生産されるカロテノイドの種類を変化させるために菌株の遺伝子工作又は操作を利用し得る。
【００２８】
本発明に従った使用のために特定酵母又は真菌を選択するとき、一般に、その培養特徴が商業規模生産に適合させやすいものを選択することが望ましい。例えば一般に（必ずしも常にではないが）、糸状生物、又は増殖条件に関して特に変わった又は厳密な要求事項を有する生物は避けることが望ましい。しかし、糸状生物の使用を許容する商業規模生産のための条件が適用できる場合は、これらを宿主細胞として選択し得る。本発明の一部の実施形態では、食用生物は、所望に応じて、場合により食品又は飼料添加物又は栄養補助食品に直接製剤し得るので、食用生物を宿主細胞として使用することが望ましい。生産を容易にするため、本発明の一部の実施形態は、遺伝学的に扱いやすく、分子遺伝学に供しやすく（例えば、特に確立された又は使用可能なベクターで、効率的に形質転換できる；場合により、例えば連続的に、多数の遺伝子を組み込む及び／又は組み入れることができる；及び／又は公知の遺伝子配列を有する等）、複雑な増殖必要条件（例えば光の必要性）を有さず、中温性であり（例えば約２５−３２℃の範囲内の増殖温度を好む）、様々な炭素及び窒素源を同化することができる及び／又は高い細胞密度に増殖することができる宿主細胞を使用する。代替的に又は付加的に、本発明の様々な実施形態は、多細胞生物ではなく単細胞として（例えば菌糸体として）増殖する宿主細胞を使用する。
【００２９】
一般に、本発明に従って天然含油性生物を使用することが望ましいとき、改変可能で培養可能ないかなる含油性生成物も使用し得る。本発明のある実施形態では、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ及びＹａｒｒｏｗｉａを含むが、これらに限定されない属の酵母又は真菌を使用する。ある特定の実施形態では、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ、Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ、Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない種の生物を使用する。
【００３０】
これらの天然含油生菌株のうちで、一部はカロテノイドも天然に生産し、また別の一部はカロテノイドを生産しない。ほとんどの場合、低いレベル（約０．０５％乾燥細胞重量未満）のカロテノイドだけが、天然に生じるカロテノイド形成性の含油性酵母又は真菌によって生産される。β−カロテンのより高いレベルが時として生産されるが、他のカロテノイドの高レベルは一般に認められない。
【００３１】
一般に、天然に含油性であり、非カロテノイド生産性（例えば約０．０５％乾燥細胞重量未満を生産する、対象カロテノイドを生産しない）である生物は、本発明に従った宿主細胞として使用し得る。一部の実施形態では、生物は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ及びＹａｒｒｏｗｉａなどの、しかしこれらに限定されない属からの酵母又は真菌である；一部の実施形態では、生物は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない種である。
【００３２】
同等に、本発明は、天然に含油性であり、カロテノイド生産性生物を宿主細胞として使用し得る。一般に、本発明は、天然にカロテノイド生産性の生物においてイソプレノイド経路への炭素の流入を上昇させるため（特にＢｌａｋｅｓｌｅａ及びＰｈｙｃｏｍｙｃｅｓ以外の生物に関して）、及び／又は生産をあるカロテノイド（例えばβ−カロテン）から別のカロテノイド（例えばアスタキサンチン）に転換させるために利用し得る。本発明に従った、１又はそれ以上のカロテノイド形成性改変（例えば１又はそれ以上の内在性又は異種カロテノイド形成性ポリペプチドの発現上昇）の導入はこれらの目標を達成することが出来る。
【００３３】
本発明のある実施形態では、使用される含油性・カロテノイド生産性生物は、例えばＢｌａｋｅｓｌｅａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａなどの、しかしこれらに限定されない属の、酵母又は真菌である；一部の実施形態では、生物は、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓなどの種である。
【００３４】
天然では非含油性である菌株を本発明に従った宿主細胞として使用することが望ましいとき、非含油性酵母又は真菌の属は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）を含むが、これらに限定されない；一部の実施形態では、生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）を含むが、これらに限定されない種である。
【００３５】
ここで使用する、「非含油性」という用語は、脂質を、特に細胞質内に、蓄積するある程度の能力を天然に有するが、ここで定義する「含油性」として適格であるほど十分なレベルには有さない菌株、並びに余分な脂質、例えば膜外脂質を蓄積するいかなる能力も天然では有さない菌株の両方を包含することが認識される。さらに、本発明の一部の実施形態では、改変細胞がここで定義する含油性としては適格でない場合でも、特定宿主細胞の含油性の天然レベルを上昇させるには十分であることが認識される。
【００３６】
天然含油性生物に関して、天然非含油性真菌の一部は天然にカロテノイドを生産し、また別の一部はカロテノイドを生産しない。天然ではカロテノイドを生産しない（例えば約０．０５％乾燥細胞重量未満を生産する、対象カロテノイドを生産しない）天然非含油性真菌の属は、本発明に従った宿主細胞として望ましく使用でき、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＰｉｃｈｉａを含むが、これらに限定されない；種は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むが、これらに限定されない。天然ではカロテノイドを生産せず、本発明に従った宿主細胞として望ましく使用し得る天然非含油性真菌の属は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）を含むが、これらに限定されない；種は、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
上記で論じたように、様々な生物のいずれもが本発明に従った宿主細胞として使用し得る。本発明のある実施形態では、宿主細胞はＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞である。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの利点は、例えば遺伝学及び分子生物学での取り扱いやすさ、ゲノム配列が入手可能であること（例えばＳｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３１５−８，２００４参照）、様々な費用効果的増殖条件への適合性、及び高い細胞密度で増殖する能力を含む。加えて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは天然に含油性であり、そのため含油性でカロテノイド生産性のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株を生成するには、他の生物のために必要であり得るよりも少ない操作しか必要としないと考えられる。さらに、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに関しては既に広汎な商業経験がある。
【００３８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅも、特にその実験上の取り扱いやすさと研究者達がこの生物に関して蓄積してきた広汎な経験の故に、本発明に従った有用な宿主細胞である。高炭素条件下でのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの培養は高いエタノール生産を生じさせ得るが、これは一般に工程及び／又は遺伝的変化によって管理できる。
【００３９】
さらなる有用な宿主は、実験的に取り扱いやすく、天然にカロテノイド形成性である、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）を含む。Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）菌株は、アスタキサンチンを含むいくつかのカロテノイドを生産することができる。
【００４０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａは、それぞれ多量のクエン酸及び脂肪酸を蓄積する；Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａは同時に含油性である。
【００４１】
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ又はＧｉｂｂｅｒｅｌｌａも有用である。それらは天然に含油性ではなく、非常に低レベルのカロテノイドを生産する傾向があり、それ故、本発明に従って広範な改変が必要と考えられる。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＧｉｂｂｅｒｅｌｌａは、実験的見地から比較的取り扱いやすいと考えられる。どちらも糸状真菌であるので、商業規模での生産は、そのような菌株の使用において克服する必要のある課題であり得る。
【００４２】
Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓはもう１つの使用可能な有用種である、その分子遺伝学は概して一部の他の生物よりもアクセスしにくいが、天然にβ−カロテンを生産し、それ故、使用可能な他の種よりも少ない改変しか必要としないと考えられる。
【００４３】
Ｂｌａｋｅｓｌｅａでは分子遺伝学を実施することができるが、かなりの努力を必要とし得る。さらに、例えば２つの交配型を混合する必要があると考えられるので、費用効果的な発酵条件が課題であり得る。Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ属の真菌も可能なソースであるが、発酵工程の課題を課す潜在的可能性があり、これらの真菌はまた、いくつかの他の潜在的宿主生物よりも操作しにくいと考えられる。
【００４４】
当業者は、本発明に従った使用のための特定宿主細胞の選択がまた、例えば細胞に導入する異種ポリペプチドに関して使用する発現配列の選択にも影響を及ぼし、また培養条件等の様々な態様にも影響することを認識する。本発明に従って使用する種々の宿主細胞の、様々な遺伝子調節必要条件、タンパク質ターゲティング配列の必要条件及び培養条件については多くが知られている（例えばＹａｒｒｏｗｉａに関しては、Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９：２１９，１９９７；Ｍａｄｚａｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０９：６３，２００４参照；例えばＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓに関しては、Ｖｅｒｄｏｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６９：３７２８−３８，２００３；Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ４：２２１−３１，２００３；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．７３（２）：１４７−５３，１９９８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（５）：１９４７−９，１９９８；Ｗｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．１８４（ｌ）：８９−９７，１９９７参照；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに関しては、例えばＧｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４：１−９３３，１９９１参照）。ある態様では、例えば宿主細胞（又は密接に関連する類似体）のターゲティング配列は、異種タンパク質を細胞内局在へと指令するために含むことが有用であり得る。それ故、そのような有用なターゲティング配列を、活性の適切な細胞内局在のために異種配列に付加することができる。他の態様（例えばミトコンドリアターゲティング配列の付加）では、異種ターゲティング配列を選択した異種配列において排除し得る又は変化させ得る（例えば供給源生物の植物葉緑体ターゲティング配列の変化又は除去）。
【００４５】
（含油性の遺伝子工作）
全ての生体生物は、それらの膜及び様々な他の構造における使用のために脂質を合成する。しかし、ほとんどの生物は、総脂質としてそれらの乾燥細胞重量の約１０％以上は蓄積せず、この脂質の大部分は一般に細胞膜内に存在する。
【００４６】
微生物に含油性を付与するために必要な代謝酵素を定義するために多大の生化学的研究がなされてきた（主としてアラキドン酸及びドコサヘキサエン酸の商業的ソースとして単細胞油を工作するため；例えばその内容全体が参照によりここに組み込まれる、Ｒａｔｌｅｄｇｅ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８６：８０７，２００４参照）。この生化学的研究は必要不可欠であるが、本発明以前には、鍵となる代謝酵素をコードする遺伝子による遺伝子工作を通して新規に含油性を確立するという報告はなかった。
【００４７】
含油性生物は、典型的には炭素過剰及び窒素又は他の栄養素制限の条件下で増殖するときにのみ脂質を蓄積することに留意すべきである。これらの条件下では、生物は直ちに制限栄養素を使い果たし、炭素源を同化し続ける。「過剰の」炭素は、脂質（通常はトリアシルグリセロール）が、典型的には脂質体の形態で、サイトゾル内に蓄積するように脂質生合成へと転用される。
【００４８】
一般に、含油性であるためには、生物は、その後脂質を生成するために脂肪酸シンターゼ機構によって利用され得る、アセチル−ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨの両方をサイトゾル内で生産しなければならないと思われる。少なくとも一部の含油性生物では、アセチル−ＣｏＡは、以下の反応：
（１）クエン酸＋ＣｏＡ＋ＡＴＰ→アセチル−ＣｏＡ＋オキサロ酢酸＋ＡＤＰ＋Ｐｉ
を触媒する、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼの作用を通してサイトゾル内で生成される。
【００４９】
言うまでもなく、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼがサイトゾルにおいて適切なレベルのアセチル−ＣｏＡを生成するためには、最初にその基質クエン酸の使用可能なプールを有していなければならない。クエン酸は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルを通して全ての真核細胞のミトコンドリアにおいて生成され、クエン酸／リンゴ酸トランスロカーゼによってサイトゾルへと移動することができる（リンゴ酸と交換に）。
【００５０】
大部分の含油性生物及び一部の非含油性生物では、ミトコンドリアにおけるＴＣＡサイクルの一部として機能する、酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼは強くＡＭＰ依存性である。それ故、ＡＭＰがミトコンドリアから枯渇したとき、この酵素は不活性化する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼが不活性であるとき、イソクエン酸はミトコンドリア内に蓄積する。この蓄積されたイソクエン酸はその後、おそらくアコニターゼの作用を通して、クエン酸と平衡する。それ故低ＡＭＰ条件下では、クエン酸がミトコンドリア内に蓄積する。上述したように、ミトコンドリアのクエン酸は直ちにサイトゾルへと輸送される。
【００５１】
含油性生物では、細胞質におけるクエン酸（及びそれ故アセチル−ＣｏＡ）の蓄積を導くカスケードを開始させると考えられる、ＡＭＰ枯渇は、上記の栄養素枯渇の結果として起こる。含油性細胞が、過剰炭素源の存在下であるが窒素又は一部の他の栄養素に関して制限された条件下で増殖するとき、以下の反応：
（２）ＡＭＰ→イノシン５’−一リン酸＋ＮＨ３
を触媒する、ＡＭＰデアミナーゼの活性が強力に誘導される。この酵素の活性上昇は、サイトゾルとミトコンドリアの両方において細胞ＡＭＰを枯渇させる。ミトコンドリアからのＡＭＰの枯渇は、ＡＭＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼを不活性化すると思われ、ミトコンドリアにおける、及びそれ故サイトゾルにおけるクエン酸の蓄積を生じさせる。この一連の事象を図２に図式的に示す。
【００５２】
上述したように、含油性はサイトゾルのアセチル−ＣｏＡとサイトゾルＮＡＤＰＨの両方を必要とする。多くの含油性生物では、リンゴ酸酵素の作用を通して適切なレベルのサイトゾルＮＡＤＰＨが提供されると考えられる（図２における酵素３）。一部の含油性生物（例えばＬｉｐｏｍｙｃｅｓ及び一部のＣａｎｄｉｄａ）は、しかしながら、リンゴ酸酵素を持たないと思われ、そのため見かけ上は他の酵素が匹敵し得る活性を提供し得るが、おそらくＮＡＤＰＨの専用ソースが脂肪酸合成のために必要であると予想される（例えば、各々その全体が参照によりここに組み込まれる、Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １４５：１９１１，１９９９；Ｒａｔｌｅｄｇｅ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：１，２００２参照）。
【００５３】
それ故、本発明によれば、宿主生物の含油性は、サイトゾルのアセチル−ＣｏＡ及び／又はＮＡＤＰＨの生成に関与する１又はそれ以上のポリペプチドの発現又は活性を改変することによって強化し得る。例えばアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、及びＡＭＰデアミナーゼの１又はそれ以上の発現又は活性の改変は、本発明に従った含油性を高めることができる。本発明に従った含油性を高めるために使用できる又は得られる例示的なポリペプチドは、それぞれ表１、表２、表３、表４、表５及び表６に示す
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、及びＡＭＰデアミナーゼポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
含油性宿主細胞を用いる本発明の一部の実施形態では、含油性に関連する酵素及び調節成分は既に備えられているが、所望する場合は、例えば１又はそれ以上の含油性ポリペプチドの発現又は活性を変化させることによって及び／又は１又はそれ以上の異種含油性ポリペプチドを導入することによって、改変できる。非含油性宿主細胞を用いる本発明の実施形態では、少なくとも１又はそれ以上の異種含油性ポリペプチドが導入されると予想される。
【００５５】
本発明は、異種含油性ポリペプチドの導入だけでなく、例えば構成的又は誘導的発現パターンの変化を含む、異種又は内在性含油性ポリペプチドの発現又は活性レベルの調節も考慮する。本発明の一部の実施形態では、含油性を誘導するために栄養素制限条件での増殖を必要としないように発現パターンを調節する。例えば調節配列（例えばプロモーターエレメント、ターミネーターエレメント）の変化及び／又は付加を含む遺伝子改変は、発現パターンの特定調節を与えるために利用し得る。そのような遺伝子改変は内在性遺伝子と共に使用し得る（例えば内在性含油性ポリペプチドの調節のため）；代替的には、そのような遺伝子改変は、少なくとも１つの異種ポリペプチド（例えば含油性ポリペプチド）の発現の調節を与えるために含まれ得る。例えばＴｅｆ１、Ｇｐｄ１プロモーターを含むが、これらに限定されないプロモーターは、内在性含油性ポリペプチド及び／又は異種含油性ポリペプチドの発現パターンの改変のために内在性遺伝子及び／又は異種遺伝子と共に使用できる。同様に、例示的なターミネーター配列は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＸＰＲ２ターミネーター配列の使用を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの含油性ポリペプチドを宿主細胞に導入する。本発明の一部の実施形態では、複数の（例えば２又はそれ以上の）異なる含油性ポリペプチドを同じ宿主細胞に導入する。一部の実施形態では、複数の含油性ポリペプチドは同じ供給源生物からのポリペプチドを含む；他の実施形態では、複数の含油性ポリペプチドは、異なる供給源生物から独立して選択されたポリペプチドを含む。
【００５７】
本発明に従って宿主細胞に導入し得る又は宿主細胞において改変し得る様々な含油性ポリペプチドの代表的な例は、表１−６に示すものを含むが、これらに限定されない。上述したように、これらのポリペプチドの少なくとも一部（例えばリンゴ酸酵素及びＡＴＰ−クエン酸リアーゼ）は、望ましくは協調して、おそらく脂肪酸シンターゼの１又はそれ以上の成分と共に作用するはずであるので、本発明の一部の実施形態では、同じ供給源生物から２又はそれ以上の含油性ポリペプチドを使用することが望ましい。
【００５８】
一般に、本発明に従って使用する含油性ポリペプチドのための供給源生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素及び／又はＡＭＰデアミナーゼポリペプチドのためのソース種は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない；一部の実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドのためのソース種は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
（カロテノイド生産の遺伝子工作）
カロテノイドはイソプレノイド前駆体から合成され、その一部はステロイド及びステロールの生産にも関与する。時として「メバロン酸経路」と称される、最も一般的なイソプレノイド生合成経路を図３に一般的に示す。図に示すように、アセチル−ＣｏＡは、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）によってメバロン酸に変換される。メバロン酸は次にリン酸化されて、５炭素化合物、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換される。ＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への異性化後、ＩＰＰのさらなる分子との３つの連続的縮合反応が１０炭素分子、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生成し、次に１５炭素分子、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、そして最後に２０炭素化合物、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を生成する。
【００６０】
一部の生物（特に細菌）によって利用される選択的イソプレノイド生合成経路は、時として「メバロン酸非依存性経路」と呼ばれ、図４に示されている。この経路は、ピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸からの１−デオキシ−Ｄ−キシログルコース−５−リン酸（ＤＯＸＰ）の合成によって開始される。ＤＯＸＰは次に、図４に示す一連の反応を経てＩＰＰに変換され、ＤＭＡＰＰに異性化されて、その後ＧＰＰ及びＦＰＰにより、図３に示すように、以下で論じるＧＧＰＰへと変換される。
【００６１】
イソプレノイド生合成に関与する様々なタンパク質が多くの生物において特定され、特性決定されている。さらに、イソプレノイド生合成経路の様々な態様が、真菌、細菌、植物及び動物界全体にわたって保存されている。例えば図３に示すアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼに対応するポリペプチドが、多種多様な生物及び細胞から特定され、単離された。多種多様なそのようなポリペプチドの代表的な例を表７−１５に示す。表７−１５のいずれかに提示されるものから選択されるポリペプチドの１又はそれ以上は、本発明に従った方法及び組成物における使用のために利用し得る又は誘導し得る。
【００６２】
本発明によれば、宿主生物におけるカロテノイド生産は、イソプレノイド生合成に関与する１又はそれ以上のタンパク質の発現又は活性を改変することによって調節し得る。一部の実施形態では、そのような改変は、１又はそれ以上の異種イソプレノイド生合成ポリペプチドの宿主細胞への導入を含む；代替的に又は付加的に、改変は、１又はそれ以上の内在性又は異種イソプレノイド生合成ポリペプチドの発現又は活性に対して施し得る。イソプレノイド生合成ポリペプチドの成分のかなりの保存を考慮すると、異種イソプレノイド生合成ポリペプチドは、しばしば有意に異なる生物においても機能すると予想される。さらに、２以上の異種イソプレノイド生合成ポリペプチドを導入することが望ましければ、多くの場合異なる供給源生物からのポリペプチドが共に機能する。本発明の一部の実施形態では、複数の異なる異種イソプレノイド生合成ポリペプチドを同じ宿主細胞に導入する。一部の実施形態では、この複数のポリペプチドは、同じ供給源生物からのポリペプチド（例えば同じ供給源生物からの、又は同じ供給源生物に由来する配列の、２又はそれ以上の配列）だけを含む；他の実施形態では、複数のポリペプチドは、異なる供給源生物から独立して選択されるポリペプチド（例えば少なくとも２つの無関係な供給源生物の、又は少なくとも２つの無関係な供給源生物に由来する配列の、２又はそれ以上の配列）を含む。
【００６３】
異種イソプレノイド生合成ポリペプチドを使用する本発明の一部の実施形態では、供給源生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）属の真菌を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、供給源生物は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｉｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない種である。
【００６４】
上述したように、イソプレノイド生合成経路はまた、ステロール、ステロイド及び、ビタミンＥ又はビタミンＫなどのビタミンのような、非カロテノイド化合物の生産に関与する。イソプレノイド生合成経路中間体に作用し、それらを非カロテノイド化合物の生合成へと転換させるタンパク質は、それ故、カロテノイド生合成の間接的阻害剤である（例えばイソプレノイド中間体を他の生合成経路に導く時点を例示する、図５参照）。そのようなタンパク質は、それ故、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドとみなされる。そのようなイソプレノイド生合成競合ポリペプチドのレベル又は活性の低下は、本発明に従った宿主細胞におけるカロテノイド生産を上昇させると期待される。
【００６５】
本発明の一部の実施形態では、内在性イソプレノイド生合成競合ポリペプチドの生産又は活性を宿主細胞において低下又は排除し得る。一部の実施形態では、このイソプレノイド生合成競合ポリペプチドの活性の低下又は排除は、エルゴステロール生合成経路の酵素の低分子阻害剤での宿主生物の処理によって達成され得る。エルゴステロール生合成経路の酵素は、例えばスクアレンシンターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、２，３−オキシドスクアレン−ラノステロールシクラーゼ、シトクロムＰ４５０ラノステロール１４α−デメチラーゼ、Ｃ−１４ステロールレダクターゼ、Ｃ−４ステロールメチルオキシダーゼ、ＳＡＭ：Ｃ−２４ステロールメチルトランスフェラーゼ、Ｃ−８ステロールイソメラーゼ、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ、及びＣ−２４ステロールレダクターゼを含む。これらの酵素の各々は、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドとみなされる。これらの酵素の調節剤も、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドとみなし得る（例えば、他の生物における相同体を有し得る又は有さないと考えられる、酵母タンパク質Ｓｕｔ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＣ４３７４ ＧＩ：２１３３１５９）及びＭｏｔ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１３７８６ ＧＩ：６３２３７１５））。
【００６６】
他の実施形態では、イソプレノイド生合成競合ポリペプチドの活性の低下又は排除は、ユビキノン生合成経路の活性を低下させることによって達成できる。ユビキノン生合成における拘束段階は、哺乳動物におけるチロシン又はフェニルアラニン又は細菌におけるコリスミ酸からのパラ−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）の形成、及びそれに続く、プレニル基の付加を生じさせる、ＰＨＢとイソプレン前駆体の縮合である。この反応はＰＨＢ−ポリプレニルトランスフェラーゼによって触媒される。ユビキノンのイソプレノイド側鎖は、プレニル二リン酸シンターゼ酵素によって決定される。ＰＨＢとデカプレニル二リン酸の縮合反応から生じる３−デカプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸は、ユビキノン（ＣｏＱ１０）を形成するために、ヒドロキシル化、メチル化及び脱カルボキシル化を含むさらなる改変を受ける。それ故、ファルネシル二リン酸から伸長したイソプレノイドを導くプレニル二リン酸シンターゼの阻害、又はＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼの阻害は、カロテノイド生合成のために使用可能なイソプレノイドの量を上昇させる上で有用であり得る。（プレニル二リン酸シンターゼ及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼ酵素の例をそれぞれ表２９及び３０に示す）。
【００６７】
イソプレノイド生合成競合酵素の公知の低分子阻害剤は、ザラゴジン酸（ＴＡＮ１６０７Ａ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９６ Ｆｅｂ １５；２１９（２）：５１５−５２０）などのその類似体を含む）、ＲＰＲ １０７３９３（３−ヒドロキシ−３−［４−（キノリン−６−イル）フェニル］−１−アザビシクロ［２−２−２］オクタン二塩酸塩；Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．１９９７ Ｍａｙ；２８１（２）：７４６−５２）、ＥＲ−２８４４８（５−｛Ｎ−［２−ブテニル−３−（２−メトキシフェニル）］−Ｎ−メチルアミノ｝−１，１−ペンチリデンビス（ホスホン酸）三ナトリウム塩；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４１，１１３６−１１４４，Ｊｕｌｙ ２０００）、ＢＭＳ−１８８４９４（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９８；３８：１１１６−１１２１）、ＴＡＫ−４７５（１−［２−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（３−アセトキシ−２，２−ジメチルプロピル）−７−クロロ−１，２，３，５−テトラヒドロ−２−オキソ−５−（２，３−ジメトキシフェニル）−４，１−ベンゾオキサゼピン−３−イル］アセチル］ピペリジン−４−酢酸；Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３ Ａｐｒ １１；４６６（１−２）：１５５−６１）、ＹＭ−５３６０１（（Ｅ）−２−［２−フルオロ−２−（キヌクリジン−３−イリデン）エトキシ］−９Ｈ−カルバゾール一塩酸塩；Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００ Ｓｅｐ；１３１（ｌ）：６３−７０）、又はスクアレンシンターゼを阻害するスクアレスタチンＩ；スクアレンエポキシダーゼを阻害するテルビナフィン；シトクロムＰ４５０ラノステロール１４α−デメチラーゼを阻害する様々なアゾール；及びＣ−１４ステロールレダクターゼ及びＣ−８ステロールイソメラーゼを阻害するフェンプロピモルフを含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、異種イソプレノイド生合成競合ポリペプチド（機能性又は非機能性のいずれも；一部の実施形態では、ドミナントネガティブ突然変異体を用いる）を使用し得る。
【００６８】
本発明に従って有用な１つの特定イソプレノイド生合成競合ポリペプチドは、様々な生物から特定され、特性決定されたスクアレンシンターゼである；スクアレンシンターゼポリペプチド配列の代表的な例は表１６に含まれる。スクアレンシンターゼ（又はスクアレンシンターゼの改変型）を使用する本発明の一部の実施形態では、供給源生物は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
カロテノイド生合成経路は、ＧＧＰＰが形成された時点でイソプレノイド生合成経路から枝分れする。カロテノイド生合成における拘束段階は、フィトエンシンターゼ（しばしばｃｒｔＢと呼ばれる；図６参照）によって触媒される、ＧＧＰＰの２個の分子の頭−頭縮合によるフィトエンの形成である。各々が共役二重結合の数を２倍に増加させる、一連の脱水素反応が、ニューロスポレンを経てフィトエンをリコペンに変換する。経路は、広範囲のカロテノイドが生成され得るように、リコペン生産の前後両方の、様々な時点で分岐する。例えばリコペンへのシクラーゼ酵素の作用はγ−カロテンを生成する；デサチュラーゼの作用は、その代わりに３，４−ジデヒドロリコペンを生じる。γ−カロテンは、シクラーゼの作用を通してβ−カロテンに変換される。β−カロテンは、アスタキサンチンを含む多くの生成物（例えば図６Ｃ参照）のいずれかへと処理され得る（エキネノン、ヒドロキシエキネノン及びフェニコキサンチンを経て）。
【００７０】
本発明によれば、宿主生物におけるカロテノイド生産は、カロテノイド生合成に関与する１又はそれ以上のタンパク質の発現又は活性を改変することによって調節し得る。指摘したように、一部の実施形態では、１又はそれ以上のカロテノイドを天然に生産する生物を宿主細胞として使用することが望ましい。一部のそのような場合には、焦点は、例えばそのカロテノイドの合成に関与する１又はそれ以上のタンパク質のレベル及び／又は活性を上昇させることによって及び／又は競合生合成経路に関与する１又はそれ以上のタンパク質のレベル又は活性を低下させることによって、天然に生産されるカロテノイドの生産量を増加させることにある。代替的に又は付加的に、一部の実施形態では、宿主細胞によって天然では生産されない１又はそれ以上のカロテノイドの生産を生じさせることが望ましい。
【００７１】
本発明の一部の実施形態によれば、１又はそれ以上の異種カロテノイド形成性ポリペプチドを宿主細胞に導入することが望ましい。当業者には明白であるように、様々な異種ポリペプチドのいずれも使用し得る；選択は、例えばその生産を高めるべき特定カロテノイドを考慮する。本発明は、異種カロテノイド形成性ポリペプチドの導入だけでなく、例えば構成的又は誘導的発現パターンの変化を含む、異種又は内在性カロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性レベルの調節も考慮する。本発明の一部の実施形態では、含油性を誘導するために栄養素制限条件での増殖を必要としないように発現パターンを調節する。例えば調節配列（例えばプロモーターエレメント、ターミネーターエレメント）の変化及び／又は付加を含む遺伝子改変は、発現パターンの特定調節を与えるために利用し得る。そのような遺伝子改変は内在性遺伝子と共に使用し得る（例えば内在性カロテノイド形成性の調節のため）；代替的には、そのような遺伝子改変は、少なくとも１つの異種ポリペプチド（例えばカロテノイド形成性ポリペプチド）の発現の調節を与えるために含まれ得る。例えばＴｅｆ１、Ｇｐｄ１プロモーターを含むが、これらに限定されないプロモーターは、内在性カロテノイド形成性ポリペプチド及び／又は異種カロテノイド形成性ポリペプチドの発現パターンの改変のために内在性遺伝子及び／又は異種遺伝子と共に使用できる。同様に、例示的なターミネーター配列は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＸＰＲ２ターミネーター配列の使用を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
図６及び文献において指摘されるように、カロテノイド生合成に関与するタンパク質は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、アスタキサンチンシンターゼ（典型的にはケトラーゼとヒドロキシラーゼ活性の両方を有する、一部の供給源生物で認められる単一多機能酵素）、カロテノイドεヒドロキシラーゼ、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼ、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのカロテノイド生合成ポリペプチドについての代表例配列を表１７−２５に示す。
【００７３】
キサントフィルは、それらの環状末端基上の酸素含有官能基の存在によって他のカロテノイドと区別することができる。例えばルテイン及びゼアキサンチンはそれらの末端環構造の各々に１個のヒドロキシル基を含み、一方アスタキサンチンは各々の末端環にケト基とヒドロキシル基の両方を含む。この性質は、キサントフィルをβ−カロテン及びリコペンなどのカロテンよりも極性にし、それ故脂肪及び脂質におけるそれらの溶解度を劇的に低下させる。天然に生じるキサントフィルは、しばしば末端ヒドロキシル基のエステルとして、脂肪酸のモノ及びジエステルの両方として認められる。それらはまた、細菌の一部の種では配糖体として生じる。キサントフィルの溶解度及び分散性はエステル部分の付加によって大きく改変され、エステル化はまた、所与のカロテノイドの吸収性及び／又はバイオアベイラビリティーにも影響を及ぼし得ることが知られている。含油性酵母の細胞内トリアシルグリセリド画分内に蓄積する特定キサントフィルの量を最大化することが本発明の１つの目的であり、この目標を達成するための１つの機序は、蓄積するキサントフィル生成物の疎水性を高めることである。これを達成する１つの方法は、標的キサントフィル化合物の脂肪アシルモノ及び／又はジエステルの生産を遺伝子工作することである。
【００７４】
様々な酵素がカロテノイドをエステル化するために機能し得る。例えばカロテノイドグルコシルトランスフェラーゼがいくつかの細菌種において特定された（例えば表２４参照）。加えて、トリアシルグリセロール生合成の最終段階で働く、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）及びアシルＣｏＡ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）は、キサントフィルのエステル化において付加的な役割を果たすと考えられる。代表的なＤＧＡＴポリペプチドを表２５に示す。さらに、他の酵素は、カロテノイド及び同様の構造の分子（例えばステロール）を特異的に改変すると考えられ、改変及びエステル生産のために使用可能であり得る。
【００７５】
本発明の一部の実施形態では、カロテノイド生合成ポリペプチドのための潜在的供給源生物は、天然にカロテノイドを生産する、天然に含油性又は非含油性の属を含むが、これらに限定されない。これらは、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｕｃｃｉｎａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓを含むが、これらに限定されない。例示的な種は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｌａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓを含むが、これらに限定されない。言うまでもなく、カロテノイドは、植物、藻類、酵母、真菌、細菌、藍細菌等のような広い範囲の多様な生物によって生産される。いかなるそのような生物も、本発明に従ったカロテノイド生合成ポリペプチドのための供給源生物であり得る。
【００７６】
本発明に従って宿主細胞に適用する特定カロテノイド形成性改変が、いずれのカロテノイドの生産を所望するかによって影響されることは認識される。例えばイソプレノイド生合成ポリペプチドは大部分のカロテノイドの生産に関連する。カロテノイド生合成ポリペプチドも広く関連する。ケトラーゼは、カンタキサンチンの生産のために特に適切であり、同様にヒドロキシラーゼは、中でも特に、ルテイン及びゼアキサンチンの生産に関連する。ヒドロキシラーゼ及びケトラーゼ（又はアスタキサンチンシンターゼ）の両方がアスタキサンチンの生産のために特に有用である。
【００７７】
（カロテノイドの生産と単離）
上記で論じたように、含油性生物における脂質体の蓄積は、一般に過剰の炭素源と制限窒素の存在下で関連生物を増殖させることによって誘導される。そのような蓄積を誘導するための詳細な条件は、これまでに多くの異なる含油性生物に関して確立されている（例えば、おのおのその全体が参照によりここに組み込まれる、Ｗｏｌｆ（ｅｄ．）Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｙｅａｓｔｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐｐ．３１３−３３８；Ｌｉｐｉｄｓ １８（９）：６２３，１９８３；Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３５（３）：３１３，１９９７；Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（ｌ）：７５，２００３；Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ．９５（３）：２８７，２００４参照）。
【００７８】
一般に、本発明の改変宿主細胞を、それらの乾燥細胞重量の少なくとも約２０％を脂質として蓄積することを許容する条件下で培養することが望ましい。他の実施形態では、本発明の改変宿主細胞を、それらの乾燥細胞重量の少なくとも約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又はさらには８０％を脂質として蓄積することを許容する条件下で増殖させる。ある実施形態では、使用する宿主細胞は、天然に含油性であり、所望レベルまで脂質を生産するように誘導された細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、天然に脂質を生産するが、所望レベルの脂質生産及び蓄積を達成するように、脂質の生産を高めるように遺伝子工作された細胞である。
【００７９】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、天然では含油性でないが、所望レベルの脂質生産が得られるように、脂質を生産するように遺伝子工作されている。当業者は、一般に、供給源生物における脂質蓄積を誘導するために有効な増殖条件はまた、供給源生物の含油性ポリペプチドが導入された宿主細胞における脂質蓄積を誘導するためにも誘導であり得ることを認識する。いうまでもなく、改変は宿主細胞の性質から鑑みて必要であると考えられ、そのような改変は当業者の技術範囲内である。
【００８０】
また、一般に本発明の改変宿主細胞による所望カロテノイドの生産が、カロテノイドが脂質体内に蓄積するように含油性の誘導に関して適切な時点で起こることを確実にすることが望ましいことも当業者によって認識される。一部の実施形態では、検出可能なレベルのカロテノイドが生産されるように、天然ではカロテノイドを生産しない宿主細胞においてカロテノイドの生産を誘導することが望ましい。ある態様では、天然ではある種のカロテノイドを生産しない宿主細胞が他のカロテノイドを生産することができる（例えばある宿主細胞は、例えばβ−カロテンを天然に生産し得るが、天然ではアスタキサンチンを生産できない）；他の態様では、宿主細胞は、天然ではいかなるカロテノイドも生産しない。他の実施形態では、高い検出可能レベルのカロテノイドが生産されるように、天然で低レベルのカロテノイドを生産する宿主細胞においてカロテノイドの生産レベルを上昇させることが望ましい。ある態様では、天然でカロテノイド（例えばβ−カロテン）を生産する宿主細胞が付加的なカロテノイド（例えばアスタキサンチン等）も生産する；さらなる他の態様では、天然でカロテノイド（例えばβ−カロテン）を生産する細胞は付加的なカロテノイドを生産しない。
【００８１】
本発明のある実施形態では、カロテノイドを、細胞の乾燥重量の少なくとも約１％以上のレベル（すなわち生産される全てのカロテノイドの総量を合わせて考慮して）まで蓄積することが望ましい。一部の実施形態では、脂質体における総カロテノイド蓄積は、細胞の総乾燥重量の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％又はそれ以上のレベルまでである。本発明のある実施形態では、細胞の乾燥重量の少なくとも約１％以上の脂質体内のカロテノイド蓄積の総レベル（すなわち生産される全てのカロテノイドの総量を合わせて考慮して）を達成することが望ましい。一部の実施形態では、脂質体内の総カロテノイド蓄積は、細胞の総乾燥重量の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％又はそれ以上のレベルまでである。
【００８２】
細菌のカロテノイド形成性遺伝子は、他の生物に転移し得ることが既に明らかにされており、それ故本発明に従って特に有用である（例えばＭｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１２２６，１９９８参照）。他の実施形態では、植物、藻類又は微細藻類などの他の供給源生物からの遺伝子を使用することが望ましいと考えられる；これらの生物は、ケトラーゼ及びヒドロキシラーゼポリペプチドのための多様な潜在的ソースを提供する。さらなる他の有用な供給源生物は、ポリペプチドの真菌、酵母、昆虫、原生動物及び哺乳動物ソースを含む。
【００８３】
ある実施形態では、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ多機能性フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａフィトエンデヒドロゲナーゼ遺伝子がＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現され得る。その後の、Ｎ．ｃｒａｓｓａヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼからの触媒ドメインの過剰発現及び／又はスクアレンシンターゼ阻害剤、ザラゴジン酸による改変Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株の処理は、カロテノイド生産をさらに上昇させる。最後に、カロテノイドヒドロキシラーゼ及びカロテノイドケトラーゼ酵素をコードするＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｃｕｓｉｉ遺伝子は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ β−カロテン生産菌株において発現され、この改変はアスタキサンチンの蓄積を生じさせる。カロテノイド生産を高めるための同様のアプローチは、他の含油性又は非含油性宿主生物において使用でき、同じ、相同な又は機能的に類似するカロテノイド形成性ポリペプチドを使用して実施できる。
【００８４】
２以上のカロテノイドを生産する本発明の生物に関して、増殖条件を調節することによって生産される個々のカロテノイドの相対量を調節することが時として可能であることに留意すべきである。例えば、培養の間に培養物中の溶解酸素の濃度を制御することは、β−カロテン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンなどの一部のカロテノイドの相対生産レベルを調節できることが報告された（例えば、その内容全体が参照によりここに組み込まれる、Ｔｓｕｂｏｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，８２５，００２号参照）。
【００８５】
特にアスタキサンチンの生産を対象とする本発明の実施形態に関して、天然アスタキサンチン生産生物からの１又はそれ以上の遺伝子を使用することがしばしば望ましい。多数の異種ポリペプチドを発現させる場合、全てに同じ供給源生物を使用すること、又は密接に関連する供給源生物を使用することが望ましいと考えられる。
【００８６】
本発明によって提供される１つの利点は、高レベルのカロテノイドの生産を可能にすることに加えて、生産された化合物が含油性生成物の脂質体内に蓄積されるので、本発明は、それらを容易に単離することを可能にする。脂質体を単離するための方法及びシステムは多種多様な含油性生物に関して確立されている（例えば、各々その全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，１６４，３０８号；同第５，３７４，６５７号；同第５，４２２，２４７号；同第５，５５０，１５６号；同第５，５８３，０１９号；同第６，１６６，２３１号；同第６，５４１，０４９号；同第６，７２７，３７３号；同第６，７５０，０４８号；及び同第６，８１２，００１号参照）。簡単に述べると、細胞を、しばしば噴霧乾燥、ろ過又は遠心分離によって、典型的には培養から回収する。一部の場合には、細胞を均質化し、その後超臨界液体抽出又は溶媒抽出（例えばクロロホルム、ヘキサン、塩化メチレン、メタノール、イソプロパノール、酢酸エチル等のような溶媒による）に供して、粗油懸濁液を生成する。この油懸濁液を、場合により当技術分野で公知のように精製する。精製した油は飼料又は食品添加物として直接使用し得る。代替的に又は付加的に、従来の手法を用いてカロテノイドを油から単離することができる。
【００８７】
一般的に酸化に対するカロテノイドの感受性を考慮して、本発明の多くの実施形態は、カロテノイド単離の間及び／又は単離後に酸化安定剤（例えばトコフェロール、ビタミンＣ；エトキシキン；ビタミンＥ、ＢＨＴ、ＢＨＡ、ＴＢＨＱ等、又はそれらの組合せ）を使用する。代替的に又は付加的に、例えばタンパク質による、マイクロカプセル化は、酸化に対する物理的障壁を追加するため及び／又は取り扱いを改善するために使用し得る（例えば米国特許出願第２００４／０１９１３６５号参照）。
【００８８】
（使用）
本発明に従って生産されるカロテノイドは、例えばそれらの生物学的又は栄養特性（例えば抗酸化、抗増殖等）及び／又はそれらの色素特性を利用して、多様な適用のいずれかにおいて使用できる。例えば本発明によれば、カロテノイドは、医薬品（例えばＢｅｒｔｒａｍ，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．５７：１８２，１９９９；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２：１６４３，１９９８；Ｒｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７５：１８５，１９９７；Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ４１：１８９，１９９７；米国特許出願第２００４／０１１６５１４号；米国特許出願第２００４／０２５９９５９号参照）、栄養補助食品（例えばＫｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ９：２６５，１９９１；Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ，Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ａｓ ｃｏｌｏｒａｎｔｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８１；米国特許出願第２００４／０１１５３０９号；米国特許出願第２００４／０２３４５７９号参照）、電気光学適用、動物飼料添加物（例えばＫｒｉｎｓｋｉ，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１００３，１９９４；Ｐｏｌａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１３：４０３，１９９２参照）、化粧品（抗酸化剤として及び／又は香料を含む、化粧品として；例えば米国特許出願第２００４／０１２７５５４号参照）等において使用し得る。本発明に従って生産されるカロテノイドはまた、他の化合物（例えばステロイド等）の生産における中間体としても使用し得る。
【００８９】
例えばアスタキサンチン及び／又はそのエステルは、炎症性疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、多発性骨髄腫、動脈硬化症、心臓血管疾患、肝臓病、脳血管疾患、血栓症、癌、リウマチ、糖尿病性網膜症を含む血管新生関連疾患；黄斑変性及び脳障害、高脂血症、腎虚血、糖尿病、高血圧症、腫瘍増殖及び転移；及び代謝性疾患の治療を含む、様々な医薬適用及び健康食品において有用であり得る。付加的に、カロテノイド及びアスタキサンチンは、疲労の予防及び治療、炎症性疾患からの腎症において腎機能を改善するため、並びに他の生活習慣関連疾患の予防及び治療において有用であり得る。さらに、アスタキサンチンは、インターロイキン阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ホスホリパーゼＡ２阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、毛細血管内皮細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤を含む、様々な生物学的過程の阻害剤として役割を果たすことが認められた。例えば２００６年１月２６日公開の日本特許公開第２００６０２２１２１号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５６号）；２００６年１月１９日公開の日本特許公開第２００６０１６４０８号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５５号）；２００６年１月１９日公開の日本特許公開第２００６０１６４０９号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５７号）；２００６年１月１９日公開の日本特許公開第２００６０１６４０７号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５３号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１７号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５１号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１６号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５０号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７２０号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５− ３０１１５８号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１９号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５４号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１８号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１５２号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１３号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４７号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１５号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４９号）；２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１４号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４８号）；及び２００６年１月１２日公開の日本特許公開第２００６００８７１２号（２００５年１０月１７日出願の日本特許出願第２００５−３０１１４６号）参照。
【００９０】
本発明の一部の実施形態では、ここで述べるように遺伝子操作された宿主細胞によって生産されるカロテノイドが、宿主細胞に関する最終製品（例えば栄養補助食品又は飼料、医薬品、化粧品、染料含有製品等）に組み込まれることは認識される。例えば宿主細胞は、凍結乾燥、凍結又はさもなければ不活性化することができ、その後全細胞を最終製品に組み込み得るか又は最終製品として使用し得る。宿主細胞はまた、生成物への組込みの前に、生物学的利用率を高めるために処理し得る（例えば溶解によって）。代替的に又は付加的に、最終製品は、全体から分離された、宿主細胞の一部だけ（例えば大きさ、溶解度によって分画された）を組み込み得る。例えば本発明の一部の実施形態では、脂質滴を宿主細胞から単離し、最終製品に組み込むか又は最終製品として使用する。他の実施形態では、カロテノイド自体又は個々のカロテノイド化合物を単離し、最終製品に再製剤する。
【００９１】
上述したように、脂肪酸と配糖体のエステルは自然界で認められる主要なカロテノイドエステルであるが、有用な製品形態を生成するために付加的なエステルを（例えば有機酸又は無機リン酸と）合成することができる。送達のために、カロテノイドエステルはまた、エステル形態の塩として製剤することもできる（例えば米国特許公開第２００５００９６４７７号参照）。
【００９２】
所与の生成物に組み込まれるカロテノイドの量は、製品及び関与する特定カロテノイドに依存して劇的に異なり得る。量は、例えば生成物の０．０１重量％未満から１％以上、１０％、２０％、３０％又はそれ以上の範囲にわたり得る；一部の場合には、カロテノイドは生成物の１００％を構成し得る。
【００９３】
本発明の一部の実施形態では、生産された１又はそれ以上のカロテノイドを食品又は飼料（例えば栄養補助食品）の成分に組み込む。本発明に従ってカロテノイドを組み込むことができる食品の種類は特に限定されず、茶、ジュース及び酒などの飲料；ゼリーやビスケットなどの菓子；乳製品などの脂肪含有食品及び飲料；米及び軟質米（又は粥）などの加工食品；特殊調製粉乳等を含む。本発明のこの態様の一部の実施形態では、食用脂質体内にカロテノイドを組み込むことは、ある種の脂肪含有食品への組込みを容易にし得るので、有用であると考えられる。
【００９４】
本発明に従って生産されるカロテノイドを組み込み得る飼料の例は、例えばキャットフード、ドッグフード等のようなペットフード、観賞魚、養殖魚又は甲殻類等のための飼料、農場で飼育される動物（家畜を含み、さらに水産養殖で育てられる魚又は甲殻類を含む）のための飼料を含む。本発明に従って生産されるカロテノイドを組み込む食品又は飼料材料は、好ましくは意図される受容者である生物にとって口当たりがよい。この食品又は飼料材料は、食品材料に関して現在公知の何らかの物理的性質（例えば固体、液体、軟質）を有し得る。
【００９５】
本発明の一部の実施形態では、生産された１又はそれ以上のカロテノイドを化粧品に組み込む。そのような化粧品の例は、例えば皮膚用化粧品（例えばローション、乳液、クリーム等）、口紅、日焼け防止化粧品、メーキャップ化粧品、香料、日用品（例えば歯磨き粉、うがい薬、口臭予防剤、固形石けん、液体石けん、シャンプー、コンディショナー）等を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、生産された１又はそれ以上のカロテノイドを医薬品に組み込む。そのような医薬品の例は、例えば様々な種類の錠剤、カプセル、ドリンク剤、トローチ、うがい薬等を含む。一部の実施形態では、医薬品は局所適用に適する。投与形態は特に限定されず、カプセル、油、顆粒、微細顆粒、粉末、錠剤、丸剤、トローチ等を含む。油及び油充填カプセルは、製造の間の成分分解がないこと及び本発明のカロテノイド含有脂質滴が油性製剤に容易に組み込まれ得ることの両方の理由で、付加的な利点を提供し得る。
【００９７】
本発明に従った医薬品は、例えば米国薬局方に述べられている一般手順を含む、当技術分野において確立された手法に従って製造し得る。
【００９８】
本発明に従って生産されるカロテノイドは、例えば織物、塗料等を含む色素含有製品に組み込み得る。それらはまた、環境指標である製品又は検出試薬としての使用のためのバイオセンサーなどの装置にも組み込み得る。
【実施例】
【００９９】
下の表２６は、以下の実施例において使用したあるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株を説明する：
【０１００】
【表１】
（ＬＹＣｌ、ＬＹＳｌ、ＸＰＲ２及びＰＥＸ１７における遺伝子型は交配において決定されず、ＡＴＣＣ菌株に関しても確認されなかった。）
ここで述べる全ての基本的分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ（ｅｄｓ）．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ ＪＡ，Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ（ｅｄｓ）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に従って実施される。
【０１０１】
（実施例１）
カロテノイド菌株構築のためのプラスミドの生産
カロテノイド生産菌株の構築のためにプラスミドを作製した。以下の項は、カロテノイド形成性ポリペプチドをコードするプラスミドの生産を説明する。これらの試験において使用したプラスミド及びそれらの構築の詳細を表２７に示す。さらなるプラスミド構築の詳細及びそれらの使用の説明は、関連する章の本文に述べられている。全てのＰＣＲ増幅は、異なる記載がない限りＮＲＲＬ Ｙ−１０９５ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。以下で述べるＵＲＡ５遺伝子は、上記ｕｒａ２−２１栄養要求性株と対立遺伝子である。ＧＰＤ１及びＴＥＦ１プロモーターは、ＸＰＲ２ターミネーターと同様にＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからである。
【０１０２】
ＧＧＳ１は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子をコードする遺伝子である。核酸コード配列、及びｐＭＢ４５９１及びｐＭＢ４６８３のコードされるＧｇｓ１タンパク質は以下の通りである：
【０１０３】
【化１】
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
【表３】
表２７において言及する一部のオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０１０６】
【化２】
１Ａ：フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼをコードするｐＭＢ４６２８（ｔｅｆｌｐ−ｃａｒＲＰ ＬＥＵ２）の生産：イントロンを含むｃａｒＲＰを、ＭＯ４５２５及びＭＯ４５４１：
【０１０７】
【化３】
を使用してＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ９０６８０）ゲノムＤＮＡから増幅し、生じた１．９ｋｂフラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。生じたフラグメントを、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ−に平滑末端連結し、ｐＭＢ４５９９を生成した。ｐＭＢ４５９９からの１．９ｋｂ ＸｂａＩ−ＭｌｕＩフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＭｌｕＩで切断したｐＭＢ４６０３に挿入し、ｐＭＢ４６２８を生成した。イントロンを含む核酸コード配列、及びｐＭＢ４６２８のコードされるＣａｒＲＰタンパク質は以下の通りである：
【０１０８】
【化４−１】
【０１０９】
【化４−２】
代替的には、ｐＭＢ４５９９も、ＭＯ４３１８、ＭＯ４６４３、ＭＯ４６４４及びＭＯ４６３９：
【０１１０】
【化５】
を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用し、生じた０．５及び０．９５ｋｂのフラグメントを、その後、それぞれＡｃｃ６５ＩとＢｓａＩ、及びＢｓａＩとＰｐｕＭＩで切断した。これらのフラグメントを、Ａｃｃ６５Ｉ及びＰｐｕＭＩで消化しておいたｐＭＢ４５９９に連結し、イントロンのないｃａｒＲＰを担持するｐＭＢ４６１３を生成した。ｐＭＢ４６１３からの１．８５ｋｂ ＸｂａＩ−ＭｌｕＩフラグメントをＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ切断したｐＭＢ４６０３に挿入して、ｐＣａｒＲＰｄｅｌＩを生成することができる。
【０１１１】
１Ｂ：フィトエンデヒドロゲナーゼをコードする、ｐＭＢ４６３８（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ ＡＤＥ１）の生産：イントロンを含むｃａｒＢを、ＭＯ４５３０及びＭＯ４５４２：
【０１１２】
【化６】
を使用してＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ９０６８０）ゲノムＤＮＡから増幅し、生じた１．９ｋｂフラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳ−ＳＫＩ−に平滑末端連結し、ｐＭＢ４６０６を生成した。ｐＭＢ４６０６を、次に、ＭＯ４３１８とＭＯ４６４８、及びＭＯ４６４６とＭＯ４６４７、及びＭＯ４３４３とＭＯ４６４５：
【０１１３】
【化７】
を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用し、生じた０．４及び０．８５及び０．７ｋｂのフラグメントを、その後、Ａｃｃ６５ＩとＢｓａＩ、及びＢｓａＩ、及びＢｓａＩとＢａｍＨＩでそれぞれ切断した。これらのフラグメントを、Ａｃｃ６５ＩとＢａｍＨＩで切断しておいたｐＢＳ−ＳＫＩＩ−に連結し、イントロンのないｃａｒＢを担持するｐＭＢ４６１９を生成した。ｐＭＢ４６１９からの１．７５ｋｂ ＸｂａＩ−ＭｌｕＩフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ切断したｐＭＢ４６２９に挿入し、ｐＭＢ４６３８を生成した。生じた核酸コード配列及びｐＭＢ４６３８のコードされるＣａｒＢタンパク質は以下の通りである：
【０１１４】
【化８】
１Ｃ．フィトエンデヒドロゲナーゼをコードするｐＭＢ４６６０（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ ＵＲＡ３）の生産：ｐＭＢ４６３８からの４．３ｋｂ ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメント及び１．８ｋｂ ＮｏｔＩ−ＳｐｅＩフラグメントを、ＭＯ４６８４及びＭＯ４６８５：
【０１１５】
【化９】
を用いたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成した１．９ｋｂ ＢｓａＩ及びＳｐｅＩ切断ＵＲＡ３遺伝子に連結し、ｐＭＢ４６６０を作製した。生じた核酸コード配列及びｐＭＢ４６６０のコードされるＣａｒＢ（ｉ）タンパク質は以下の通りである：
【０１１６】
【化１０】
１Ｄ．切断型ＨＭＧ１をコードするｐＭＢ４６３７及びｐＴｅｆ−ＨＭＧの生産：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する７７アミノ酸リーダー配列を同時にコードする、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体の生産のために、以下のオリゴヌクレオチドを合成する：
【０１１７】
【化１１】
プライマーＯ及びＰは、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｍｅｔ−Ａｌａ及びそれに続くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨｍｇ１タンパク質の残基５３０−６０４をコードする０．２３ｋｂフラグメントを増幅するために使用する。プライマーＱ及びＭＯ４６５８は、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＨｍｇ１タンパク質のＣ末端４４８残基をコードする１．４ｋｂフラグメントを増幅するために使用する。これらのフラグメントを適切なクローニングベクターに連結し、ｐＯＰ及びｐＱＭＯ４６５８と称する、生じたプラスミドを、配列決定によって確認する。ＯＰフラグメントをＸｂａＩとＡｓｅＩで遊離させ、ＱＭＯ４６５８フラグメントをＭａｅＩとＭｌｕＩで遊離させる。これらのフラグメントを、次に、ＸｂａＩとＭｌｕＩで切断したＡＤＥ１ ＴＥＦ１ｐ発現ベクターｐＭＢ４６２９に連結して、ｐＴｅｆＨＭＧを生産する。
【０１１８】
代替的には、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからの天然ＨＭＧ１遺伝子を、プライマーＭＯ４６５８（上述した）及びＭＯ４６５７：
【０１１９】
【化１２】
を用いて上記表に示したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列なしで改変して、ｐＭＢ４６３７を作製し得る。生じた核酸コード配列及びｐＭＢ４６３７のコードされるＨｍｇ１ｔｒｕｎｃタンパク質は以下の通りである：
【０１２０】
【化１３−１】
【化１３−２】
１Ｅ．カロテンヒドロキシラーゼをコードするｐＭＢ４６９２（ＵＲＡ３ ｔｅｆ１ｐ−ｃｒｔＺ）の生産：Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのコドン使用の偏りを利用して、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓのタンパク質配列に基づき、以下のカロテンヒドロキシラーゼ（ＣｒｔＺ）ＯＲＦ配列を合成した：
【０１２１】
【化１４】
この配列を、ＸｂａＩとＭｌｕＩを用いて切断し、ｐＭＢ４６２９からのＡｃｃ６５Ｉ−ＮｈｅＩ ＴＥＦ１プロモーターフラグメントと共に、Ａｃｃ６５ＩとＭｌｕＩで切断したｐＭＢ４６６２に連結して、ｐＭＢ４６９２を作製した。核酸コード配列を上記に太字下線で示す。生じたｐＭＢ４６９２のコードされるｃｒｔＺタンパク質は以下の通りである：
【０１２２】
【化１５】
１Ｆ．カロテンケトラーゼをコードするｐＭＢ４６９８（ＡＤＥ１ ｔｅｆ１ｐ−ｃｒｔＷ）の生産：Ｓａｒｇａｓｓｏ Ｓｅａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣＹ０１０３４１９３．１）から単離した環境配列のタンパク質配列に基づき、以下のカロテンケトラーゼ（ＣｒｔＷ）ＯＲＦ配列を合成した：
【０１２３】
【化１６】
この配列を、ＸｂａＩとＭｌｕＩを用いて切断し、ＮｈｅＩとＭｌｕＩで切断したｐＭＢ４６２９に連結して、ｐＭＢ４６９８を作製した。核酸コード配列を上記に太字下線で示す。生じたｐＭＢ４６９８のコードされるｃｒｔＷタンパク質は以下の通りである：
【０１２４】
【化１７】
（実施例２）
カロテノイド生産上昇のためのＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの遺伝子工作
２Ａ．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ及びフィトエンデヒドロゲナーゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ３５０（ＭＡＴＢ ｕｒａ２−２１ ｌｅｕ２−３５ ａｄｅ１）を、ＳｓｐＩによってＵＲＡ５の上流で切断しておいたｐＭＢ４５９１（ｔｅｆ１ｐ−ＧＧＳ１）で形質転換した；ｕｒａ２遺伝子座にプラスミドを担持するＵｒａ＋形質転換体を特定し、ＭＦ３６４と命名した。それをその後、ＳｓｐＩによってＡＤＥ１で切断しておいたｐＭＢ４６３８（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ）で形質転換し、ａｄｅ１遺伝子座にプラスミドを担持する原栄養株形質転換体を選択した。この菌株をＭＦ５０２と命名した。
【０１２５】
２Ｂ．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ及びフィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ５０２を、ＳｓｐＩで処理しておいたｐＭＢ４６２８（ｔｅｆ１ｐ−ＣａｒＲＰ）で形質転換した。２−３日間の増殖後に形質転換プレート（１％グルコース及び０．１％グルタミン酸を添加したＹＮＢ寒天［ＹＮＢｇｌｕｔ］）で着色なし、橙色又は強い橙色であった９個の原栄養性コロニーを選択した。ＭＦ５９７とＭＦ６００（強い橙色）の２個は、ＹＰＤにおける３０℃で４日間の増殖後、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）ｇ当り４ｍｇ以上のカロテンを生産した。サザン分析は、ＭＦ５９７及びＭＦ６００からのゲノムＤＮＡにおいて異なる単一ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩバンドを明らかにし、いずれもｌｅｕ２−２７０において相同的組込みが起こらないことを示唆した。
【０１２６】
２Ｃ．フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ及びフィトエンデヒドロゲナーゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＡＴＣＣ２０１２４９（ＭＡＴＡ ｕｒａ３−３０２ ｌｅｕ２−２７０ ｌｙｓ８−ｌｌ）を、ＳｓｐＩ切断したｐＭＢ４６２８で形質転換した。数百個のＬｅｕ＋コロニーをプールし、再増殖させて、ＳａｌＩによってＵＲＡ３の上流で切断しておいたｐＭＢ４６６０（ｔｅｆ１ｐ−ｃａｒＢ）で形質転換した。ＹＮＢｇｌｕｔプラス０．６ｍＭリシン上で３０℃にて５日後、著明に黄色であった１個のコロニーを選択し、ＭＦ４４７と命名して、ＹＰＤにおける４日間の増殖後に乾燥細胞重量のグラム当り０．２ｍｇのカロテンを生産することを認めた。
【０１２７】
ＭＦ４４７を１ｇ／Ｌの５−フルオロオロチン酸で攻撃誘発し、Ｕｒａ−分離株（ｓｅｇｒｅｇａｎｔｓ）を選択した。驚くべきことに、それらは全て親と同じ黄色の外観を保持することが認められ、機能的ＵＲＡ３遺伝子の喪失が機能的ＣａｒＢ酵素の喪失と一致しないことを示唆した。サザン分析は、ＭＦ４４７ ＤＮＡのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物からの２個のフラグメントがＵＲＡ３ｐにハイブリダイズする配列を含み、そのうちの１個だけがｃａｒＢにもハイブリダイズすることを明らかにする。他方はＭＦ５７８には存在せず、Ｕｒａ３−分離株をさらなる操作のために選択した。菌株ＭＦ４４７、ＭＦ５９７（実施例２ｃ）及びＭＦ６００（実施例２ｃ）におけるプラスミド救済及びｃａｒＢＰイントロンを含むＤＮＡ配列の分析は、エクソン１及び２が隣接し、もとの内部ＳｓｐＩ部位（ｐＭＢ４６２８に存在する）を持たないイントロン配列によって各々分離されていることを明らかにした。
【０１２８】
２Ｄ．フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ及びゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ５７８を、ＳａｌＩ（ＵＲＡ３の上流）又はＳｔｕＩ（ＧＧＳ１ ＯＲＦ内）で切断しておいたｐＭＢ４６８３（ｔｅｆ１ｐ−ＧＧＳ１）で形質転換した。Ｕｒａ＋Ｌｅｕ＋コロニーは、両方の場合に、ＹＮＢｇｌｕｔ＋Ｌｙｓ及びＹＰＤで明るい橙色に見え、いくつかは、上記のように増殖させたとき乾燥細胞重量のグラム当り４ｍｇ以上のカロテンを生産した。一方のＭＦ６３３は、サザン分析から推測されたように、ＧＧＳ１遺伝子座に１コピーのプラスミドを含んだ。他方は非相同的又はより複雑な組込みによって生じた。
【０１２９】
２Ｅ．フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ及びゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを発現するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生産：ＭＦ３６４をＭＦ５７８と交配し、生じた二倍体からの胞子を３０℃で２−３日間ＹＰＤにプレートする。橙色のＬｅｕ＋Ａｄｅ−Ｕｒａ−コロニーをｔｅｆｐ−ｃａｒＢ、ｔｅｆｐ−ｃａｒＲＰ及びｔｅｆｐ−ＧＧＳ１の存在に関してＰＣＲによってスクリーニングし、ＹＰＤ液体培地での増殖後、高カロテノイド（＞４ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量）生産に関してスクリーニングする。これらの判定基準に合致し、並びにｕｒａ３−３０２対立遺伝子を担持することの指標である、５−フルオロオロチン酸に対する耐性を示すコロニーをさらなる検討のために選択し、以下ＧＢＲＰｕａ菌株と称する。そのような菌株をさらなる分析及び改変のために選択する。
【０１３０】
（実施例３）
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞からのカロテノイドの抽出
生成した菌株の振とうフラスコ試験を、ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）を用いて実施した。１２５ｍｌフラスコ中の培養物２０ｍｌを３０℃で増殖させた。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞を７２−９６時間培養物から採集し、カロテノイドの形態及び量を測定するために抽出を行った。培養物１．８ｍｌをエッペンドルフチューブに入れた。細胞をペレット化し、Ｈ２Ｏ １ｍｌで２回洗った。２回目の洗浄後、再懸濁した細胞を、上部に開けた穴がある、あらかじめ計量したスナップ式キャップのチューブに移し、細胞を一晩凍結乾燥した。完全に乾燥した後、乾燥細胞重量を算定するためにチューブを計量した。同じ振とうフラスコ培養から０．２５ｍｌを、カロテノイド抽出のために２ｍｌスクリューキャップチューブに入れた。細胞をペレット化し、上清を吸引した。ペレット化した細胞は、−８０℃で凍結し、保存し得る。等容積のキュービックジルコニアビーズを、氷冷抽出溶媒（０．０１％ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むヘキサンと酢酸エチルの５０／５０ ｖ／ｖ混合物）１ｍｌと共に、細胞ペレットに添加した。次に混合物を４℃で５分間、最大速度にて攪拌した（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ−８，ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）。その後混合物を最大速度で１分間遠心し、上清を収集して、低温１６ｍｌガラスバイアルにおいて沈殿させた。残りの細胞デブリを、キュービックジルコニアビーズを添加せずに少なくとも３回再抽出した；全ての上清を１６ｍｌガラスバイアルにプールした。抽出後、ガラスバイアルをＳｏｒｖａｌｌ卓上遠心分離機において４℃にて２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい低温１６ｍｌガラスバイアルに移した。上清を濃縮するためにＳｐｅｅｄ Ｖａｃを使用し（暗所にて室温で）、試料をＨＰＬＣ分析の直前まで−２０℃又は−８０℃で保存した。ＨＰＬＣ分析の前に、試料を氷冷溶媒１ｍｌに再懸濁し、その後低温アンバーバイアルに移した。プロトコール全体を通して、酸素、光、熱及び酸との接触を避けるように注意を払った。
【０１３１】
（実施例４）
ＨＰＬＣによるカロテノイド生産の定量化
カロテノイド分析のため、試料を氷冷抽出溶媒（０．０１％ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むヘキサンと酢酸エチルの５０／５０ ｖ／ｖ混合物）に再懸濁した。 Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）及びＴｈｅｒｍｏ Ｂａｓｉｃ ８ガードカラム（２．１×１０ｍｍ）を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２７９５ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を、２５℃でカロテノイドを分解するために使用した；基準カロテノイド試料を標準品として使用した。移動相及び流速を以下に示す（溶媒Ａ＝酢酸エチル；溶媒Ｂ＝水；溶媒Ｃ＝メタノール；溶媒Ｄ＝アセトニトリル）。注入量は１０μＬであった。検出器は、Ｗａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器であった。親油性分子についての保持時間は、アスタキサンチン（１．１５９分）、ゼアキサンチン（１．３３５分）、β−アポ−８’−カロテナール（２．８６分）、エルゴステロール（３．１１分）、リコペン（３．６９分）、β−カロテン（４．０２分）及びフィトエン（４．１３分）を含む。アスタキサンチン、ゼアキサンチン、β−アポ−８’−カロテナール、リコペン及びβ−カロテンは４７５ｎｍで検出し、エルゴステロールとフィトエンは２８６ｎｍで検出した。
【０１３２】
【表４】
（実施例５）
切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現はカロテノイド生産の上昇を生じさせる
カロテノイド生産を高めるため、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体を導入することによってイソプレノイド経路を通る炭素の流れを強化する。
【０１３３】
１つのアプローチでは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈｍｇ１に由来する７７アミノ酸リーダー配列を同時にコードするＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体をＧＲＰＢｕａ菌株（上記実施例２Ｅで述べた）に導入する。プラスミドｐＴｅｆＨＭＧを、ＧＲＰＢｕａ菌株において、ａｄｅ１遺伝子座での組込みを指令するためにＳｎａＢＩ、ＢｂｖＣＩ又はＢｓｕ３６Ｉで、又はＨＭＧ１遺伝子座での組込みを指令するためにＢａｍＨＩで、又はランダムな組込みを促進するためにＥｃｏＲＶで切断し、それらをアデニン原栄養性に回復させることができる。生じるＡｄｅ＋形質転換体をカロテノイド生産上昇に関してスクリーニングする。
【０１３４】
代替的には、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからの天然ＨＭＧ１遺伝子を、ｐＭＢ４６３７を生成するように、上記実施例１Ｄで述べたようにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列なしで改変し得る。このプラスミドを、ｐＴｅｆＨＭＧに関して述べたように消化し、ＧＲＰＢｕａ菌株に形質転換して、生じた形質転換体を上述したようにカロテノイド生産上昇に関してスクリーニングすることができる。
【０１３５】
さらにもう１つのアプローチでは、Ｎ．ｃｒａｓｓａ ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の切断型変異体を使用して、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株に導入し得る。異種ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現に適したプラスミドを作製するため、ｐ６４１Ｐ（Ｙｅａｓｔ ２００１；１８（２００１）：９７−１１３）を、ＩＣＬ１プロモーターをＧＰＤプロモーターで置換し、フレオマイシンに対する耐性を与える配列を付加することによって改変する。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１３６】
【化１８】
で増幅し、生じたフラグメント（０．７ｋｂ）をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化して、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ切断ｐ６４１Ｐに連結して、プラスミド「ｐ６４１Ｐｇｐｄ」を作製する。Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ＧＰＤプロモーターの制御下のｂｌｅ遺伝子を、次に、ｐＢＣｐｈｌｅｏ（Ｓｉｌａｒ，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ ４２：７３）から３．２ｋｂのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、ＧＰＤプロモーターに近接するＢａｍＨＩ部位を保存する方向で、「ｐ６４１Ｐｇｐｄ」のユニークＢａｍＨＩ部位に挿入して、「ｐ６４１Ｐｇｐｄｂｌｅ」を作製する。
【０１３７】
Ｎ．ｃｒａｓｓａゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１３８】
【化１９】
で増幅し、生じたフラグメントをＢａｍＨＩで切断して、ＢａｍＨＩ消化した「ｐ６４１Ｐｇｐｄｂｌｅ」に正しい方向で挿入する。生じるプラスミド、「ｐＺｇ」は、構成的ＧＰＤプロモーターの制御下でＮ．ｃｒａｓｓａからのヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの切断型サイトゾル触媒ドメインをコードする配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿３２４８９２）を含む。このプラスミドを、上記実施例２Ｅで作製したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株に導入することができ、形質転換体をフレオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）に対するそれらの耐性によって選択する。生じた形質転換体を、上述したように、β−カロテン生産に関して試験する。
【０１３９】
（実施例６）
アスタキサンチンの生産のための、カロテノイドを生産するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株への異種カロテンヒドロキシラーゼ及びカロテンケトラーゼ遺伝子の導入
カロテノイド産生Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへのカロテンヒドロキシラーゼ及びカロテンケトラーゼの導入のために、上記実施例１Ｅ及び１Ｆで述べたｐＭＢ４６９２及びｐＭＢ４６９８をＧＲＰＢｕａ菌株（実施例２Ｅで述べた）に連続的に導入することができる。ｐＭＢ４６９２の導入のためには、ｕｒａ３遺伝子座での組込みを指令するためにＳａｌＩ又はＢｓｒＧＩで、又はランダムな組込みを促進するためにＸｂａＩで切断し、ウラシル原栄養性を選択する。ｐＭＢ４６９２を内包するＧＲＰＢｕａ Ｕｒａ＋形質転換体をＹＰＤにおけるゼアキサンチン生産に関してスクリーニングする。ゼアキサンチン産生細胞をｐＭＢ４６９８（ａｄｅ１遺伝子座での組込みを指令するためにＰｐｕＭＩ、ＳｓｐＩ又はＢｂｖＣＩで、又はランダムな組込みを促進するためにＥｃｏＲＶで切断し得る）で形質転換し、原栄養性コロニーをアスタキサンチン生産に関してスクリーニングする。
【０１４０】
代替的には、プラスミド形質転換の順序を逆にしてもよく、ｐＭＢ４６９８を最初に形質転換し、形質転換体をアデニン原栄養性に関してスクリーニングする。ｐＭＢ４６９８を内包するＧＲＰＢｕａ Ａｄｅ＋形質転換体をカンタキサンチン生産に関してスクリーニングする。カンタキサンチン産生ＧＲＰＢｕａ［ｐＭＢ４６９８］細胞をｐＭＢ４６９２で形質転換し、原栄養性コロニーをアスタキサンチン生産に関してスクリーニングする。
【０１４１】
もう１つのアプローチでは、β−カロテンをアスタキサンチンに変換するために、Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉからのカロテノイドケトラーゼ及びカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子を上記実施例２で述べた菌株に導入することができる。Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１４２】
【化２０】
で増幅し、生じたフラグメントをＢｓｍＢＩで切断して、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで改変し、ＢｇｌＩＩで切断する。このフラグメントを、ｈｐ４ｄプロモーター、ＸＰＲ２ターミネーター、選択可能なＬＥＵ２遺伝子、及び大腸菌における選択と増殖のために必要な配列を含む、ＰｍｌＩ及びＢａｍＨＩ切断したｐＩＮＡ１２６９（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（２０００）：２０７−２１６）に挿入する。生じるプラスミド「ｐＡ」は、ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でＰ．ｍａｒｃｕｓｉｉからのカロテンヒドロキシラーゼをコードする配列（ｃｒｔＺ遺伝子）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＣＡＢ５６０６０．１）を含む。
【０１４３】
「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ」を、以下のようにＸＰＲ２ターミネーターをＬＩＰ２ターミネーターで置換することによって改変する。ｐＩＮＡ１２９１をＡｖｒＩＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで改変して、ＥｃｏＲＩで切断し、その小さなＬＩＰ２ｔ含有フラグメントを、ＳａｃＩＩで消化し、ｄＮＴＰの存在下にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで改変して、ＥｃｏＲＩで切断しておいた「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ」に連結する。生じるプラスミドを「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ−ＬＩＰ２ｔ」と命名する。
【０１４４】
カロテノイドケトラーゼ遺伝子を増幅するため、Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉゲノムＤＮＡを２個のプライマー：
【０１４５】
【化２１】
で増幅し、生じたフラグメントをＡｖｒＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＡｖｒＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ切断した「ｐＹＥＧ１ＴＥＦ−ＬＩＰ２ｔ」に挿入する。生じるプラスミド「ｐＢｔ」は、構成的ＴＥＦ１プロモーターの制御下でカロテンケトラーゼをコードする配列（ｃｒｔＷ遺伝子）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＣＡＢ５６０５９．１）を含む。
【０１４６】
２個の発現カセットを１個のプラスミド内で組み合わせるため、「ｐＢｔ」をＣｌａＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで改変して、ＥｃｏＲＩで切断し、ｃｒｔＷ含有フラグメントを単離して、リン酸化オリゴヌクレオチドアダプター対：
【０１４７】
【化２２】
と混合して、ＮｏｔＩで切断し、ＮｏｔＩ消化した「ｐＡ」に連結する。生じるプラスミド「ｐＡＢｔ」は、ＴＥＦ１ｐ／ｃｒｔＷ／ＬＩＰ２ｔカセット及びｈｐ４ｄ／ｃｒｔＺ／ＸＰＲ２ｔカセット並びに選択可能なＬＥＵ２遺伝子を含む。
【０１４８】
「ｐＡＢｔ」は、実施例４で上述したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株（ＴＥＦ１ｐ／ａｌ−１／ＸＰＲ２ｔ；ｈｐ４ｄ／ｃａｒＲＰ／ＬＩＰ２ｔ；ＧＰＤｐ／ＨＭＧＲｔｒｕｎｃ）に導入することができ、形質転換体をロイシン原栄養性に関して選択する。
【０１４９】
（実施例７）
スクアレンシンターゼをコードするＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＥＲＧ９遺伝子の部分的不活性化はカロテノイド生産の上昇を生じさせる
７Ａ．スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９遺伝子を部分的に不活性化するため、隣接するＦＯＬ３遺伝子を機能破壊し、フォリン酸要求性を生じさせる。次にこの菌株を、部分的に２個の遺伝子にわたる突然変異誘発したフラグメントで形質転換し、Ｆｏｌ＋形質転換体をスクアレンシンターゼ活性の低下に関してスクリーニングする。
【０１５０】
以下のオリゴヌクレオチド：
【０１５１】
【化２３】
を合成し、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して、ＦＯＬ３遺伝子の大部分にわたるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡからの２．３ｋｂフラグメントを増幅するために使用する。生じるフラグメントをＸｂａＩで切断し、リン酸化して、その後、ＫｐｎＩで切断し、ｄＮＴＰの存在下にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４ｐｏｌ）で処理して、その後ＸｂａＩで切断しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に連結する。ｐＢＳ−ｆｏｌ３と称する、生じたプラスミドを、Ａｃｃ６５ＩとＥｃｏＲＩで切断し、上記のようにＴ４ｐｏｌで処理して、ｐＭＢ４５２９からの３．４ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩ ＡＤＥ１フラグメント（Ｔ４ｐｏｌで処理した）に連結する。
【０１５２】
生じるプラスミド、ｐＢＳｆｏｌ３ΔａｄｅをＢｓｉＷＩとＸｂａＩで切断して、５．５ｋｂフラグメントを遊離させ、それを、上述したＧＲＢＰｕａ菌株をアデニン原栄養性に形質転換するために使用する。生じたＡｄｅ＋形質転換体をフォリン酸要求性に関して、及びＰＣＲ分析によって相同的組込みに関してスクリーニングする。
【０１５３】
生じるｆｏｌ３ΔＡＤＥ１対立遺伝子を内包する菌株を、プライマー：
【０１５４】
【化２４】
及び鋳型としてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムＤＮＡを用いて突然変異誘発性ＰＣＲ増幅によって作製した３．５ｋｂ ＤＮＡフラグメントで形質転換することができる。ＦＯＬ３ ＯＲＦのＮ末端側の４分の３及びＥＲＧ９ ＯＲＦのＣ末端側の１０分の９を含む、生じたフラグメントを、菌株を形質転換するために使用する。生じるＦｏｌ＋Ａｄｅ―形質転換体を、ザラゴジン酸、イトラコナゾール又はフルコナゾールなどの薬剤に対する感受性によってスクアレンシンターゼ活性の低下に関してスクリーニングする。付加的に、生じる形質転換体をカロテノイド生産の上昇に関してスクリーニングする。
【０１５５】
７Ｂ．代替的には、７Ａで作製したＰＣＲフラグメントをクローニングし、ＥＲＧ９遺伝子の３’非翻訳領域を除去するように変化させ得る。このフラグメントによるｆｏｌ３ΔＡＤＥ１機能破壊体の置換は、７Ａにおけるように確認できる、スクアレンシンターゼの発現低下を生じさせる［Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｃｅｌｌ １２３：５０７−５１９］［Ｍｕｈｌｒａｄ ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ（１９９９），ＲＮＡ ５：１２９９−１３０７］。このアプローチはまた、ＥＲＧ９ ３’−ＵＴＲを機能破壊するためのＡＤＥ１マーカーを用いて、Ｆｏｌ＋Ａｄｅ−菌株においても使用し得る。
【０１５６】
７Ｃ．さらにもう１つのアプローチでは、部分的欠損性ＥＲＧ９対立遺伝子を、プラスミドシャッフリング手法［Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：１６４−１７５］を用いて、及び薬剤感受性を表現型として使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて特定することができる。欠損遺伝子を、標準分子遺伝学手法を用いてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに移入することができる。
【０１５７】
（実施例８）
イソプレノイド生合成競合ポリペプチドの阻害剤によるカロテノイド産生Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株の処理はカロテノイド生産の上昇を生じさせる
実施例２で生成した培養物を、スクアレンシンターゼ阻害剤、ザラゴジン酸（０．５μＭのザラゴジン酸）で処理し、上述したようにβ−カロテン生産に関して観測する。
【０１５８】
（実施例９）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの含油性菌株の構築
Ｎ．ｃｒａｓｓａからのＡＴＰ−クエン酸リアーゼの２個のサブユニット、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＡＭＰデアミナーゼ及びＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓからのサイトゾルリンゴ酸酵素をコードする遺伝子を、総脂質含量を高めるためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ菌株において過剰発現させる。脂質生産を強化するための同様にアプローチを、同じ、相同又は機能的に類似の含油性ポリペプチドを使用して、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）などの他の宿主生物において使用できる。
【０１５９】
Ｑｉａｇｅｎ ＲΝＡＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ．）を、Ｎ．ｃｒａｓｓａの培養物から調製した凍結乾燥バイオマスからメッセンジャーＲＮＡを作製するために使用する。その後、ＲＴ−ＰＣＲを、ｍＲＮＡ鋳型及び以下のプライマー対：
【０１６０】
【化２５】
のいずれかを含む２つの反応において実施する。
【０１６１】
ａｃｌ１反応から生じたフラグメントをＳｐｅＩとＢａｍＨＩで切断し、ａｃｌ２反応からのフラグメントをＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断して、両方を、ＮｈｅＩとＳｐｈＩで消化しておいたＹＥｐ２４に連結して、プラスミド「ｐ１２」を作製する。二方向性ＧＡＬ１−１０プロモーターを、プライマー：
【０１６２】
【化２６】
を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡから増幅し、生じた０．６７ｋｂフラグメントをＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩ消化した「ｐ１２」にいずれかの方向で連結して、それぞれＧＡＬ１−ａｃｌ１／ＧＡＬ１０−ａｃｌ２及びＧＡＬ１０−ａｃｌ１ ／ＧＡＬ１−ａｃｌ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ａｃｌ１：ＣＡＢ９１７４０．２；ａｃｌ２：ＣＡＢ９１７４１．２）を含む、「ｐ１ｇａｌ２」及び「ｐ２ｇａｌ１」を作製する。
【０１６３】
ＡＭＰデアミナーゼをコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ遺伝子及びこの遺伝子を発現するのに適したプロモーターを増幅するため、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅゲノムＤＮＡを別々の反応において２個のプライマー対：
【０１６４】
【化２７】
を用いて増幅し、ＡＭＤ１反応から生じたフラグメント（２．４ｋｂ）をＳａｃＩとＡｖｒＩＩで切断し、ＧＡＬ７反応からのフラグメント（０．７ｋｂ）をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断して、両方を、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化しておいたＹＥｐ１３に連結して、プラスミド「ｐＡＭＰＤ」を作製する。このプラスミドは、ガラクトース誘導的ＧＡＬ７プロモーターの制御下に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子、ＡＭＰデアミナーゼをコードするＡＭＤ１を担持する。
【０１６５】
メッセンジャーＲＮＡを上述したようにＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓの凍結乾燥バイオマスから調製し、そのｍＲＮＡ鋳型を２個のプライマー：
【０１６６】
【化２８】
と共にＲＴ−ＰＣＲ反応において使用して、生じたフラグメントをＮｈｅＩとＳａｌＩで切断し、ＸｂａＩとＸｈｏＩで消化したｐＲＳ４１３ＴＥＦ（Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ，１５６：１１９−１２２）に連結して、構成的ＴＥＦ１プロモーターの制御下にＭ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓからのサイトゾルＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素をコードする配列（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４０；ｍｃｅ遺伝子；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＹ２０９１９１）を含む、プラスミド「ｐＴＥＦＭＡＥ」を作製する。
【０１６７】
プラスミド「ｐ１ｇａｌ２」、「ｐＡＭＰＤ」及び「ｐＴＥＦＭＡＥ」を、ウラシル（「ｐ１ｇａｌ２」）、ロイシン（「ｐＡＭＰＤ」）及びヒスチジン（「ｐＴＥＦＭＡＥ」）に対する原栄養性を回復するためＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅの菌株に連続的に形質転換する（Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４：１−９３３，１９９１）。生じた形質転換体を、実施例３で述べたように、ウラシル、ロイシン及びヒスチジンを含まない合成完全（ＳＣ）培地、又は２段階発酵工程のいずれかにおける振とうフラスコ試験後に総脂質含量に関して試験する。２段階工程では、ウラシル、ロイシン及びヒスチジンを欠くＳＣ培地を含む一晩の回転管培養物２ｍｌからの細胞１．５ｍｌを遠心分離し、蒸留水で洗って、脂質蓄積に適する窒素制限培地２０ｍｌ（３０ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ酵母抽出物、０．５ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、７ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０８ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ Ｃｏ（ＮＯ３）２−６Ｈ２Ｏ；ｐＨ５．５（Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７０：８９１−８９４（１９９３））に再懸濁する。
【０１６８】
改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株と対照菌株の細胞内脂質含量を、蛍光プローブ、ナイルレッドを用いて分析する（Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ（２００４）５６：３３１−３３８）。簡単に述べると、緩衝液に希釈した細胞をナイルレッドで染色し、４８８ｎｍで励起して、４００−７００ｎｍの波長領域内の蛍光発光スペクトルを獲得し、ナイルレッドで染色していない細胞からの対応するスペクトルと比較する。迅速推定法からの結果を確認するため、記述されているように（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；６０（３）：２７５−８０）、乾燥細胞から直接トランスメチルエステル化した総脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析によって総脂質含量を測定する。非形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株は、ＹＰＤ及び脂質蓄積培地における増殖後、それぞれ６％及び１０％総脂質（乾燥細胞重量ベース）を生産する。多数の含油性ポリペプチドを発現する酵母菌株は、ＹＰＤ及び脂質蓄積培地における増殖後、それぞれ１７％及び２５％総脂質を生産する。
【０１６９】
（実施例１０）
ゼアキサンチンの生産のための、カロテノイド産生Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株への異種カロテンヒドロキシラーゼの導入
ＭＦ５７８（ｔｅｆ−ｃａｒＲＰ ｔｅｆ−ｃａｒＢ）を、ＳａｌＩで切断しておいたｐＭＢ４６９２で形質転換した。ＰＣＲ分析により、ｔｅｆ−ｃｒｔＺを含むと推定されるいくつかのＵｒａ＋コロニーは、ＹＰＤ振とうフラスコにおいてゼアキサンチンを生産することができ、ある場合には、全てのカロテンが使い尽くされた。
【０１７０】
以下の表は、本書全体を通して参照される：
【０１７１】
【表５】
【０１７２】
【表６】
【０１７３】
【表７】
【０１７４】
【表８】
【０１７５】
【表９】
【０１７６】
【表１０】
【０１７７】
【表１１】
【０１７８】
【表１２】
【０１７９】
【表１３】
【０１８０】
【表１４】
【０１８１】
【表１５】
【０１８２】
【表１６】
【０１８３】
【表１７】
【０１８４】
【表１８】
【０１８５】
【表１９】
【０１８６】
【表２０】
【０１８７】
【表２１】
【０１８８】
【表２２】
【０１８９】
【表２３】
【０１９０】
【表２４】
【０１９１】
【表２５】
【０１９２】
【表２６】
【０１９３】
【表２７】
【０１９４】
【表２８】
【０１９５】
【表２９】
【０１９６】
【表３０】
【０１９７】
【表３１】
【０１９８】
【表３２】
【０１９９】
【表３３】
【０２００】
【表３４】
【０２０１】
【表３５】
【０２０２】
【表３６】
【０２０３】
【表３７】
【０２０４】
【表３８】
【０２０５】
【表３９】
【０２０６】
【表４０】
【０２０７】
【表４１】
【０２０８】
【表４２】
【０２０９】
【表４３】
【０２１０】
【表４４】
【０２１１】
【表４５】
【０２１２】
【表４６】
【０２１３】
【表４７】
【０２１４】
【表４８】
【０２１５】
【表４９】
【０２１６】
【表５０】
【０２１７】
【表５１】
【０２１８】
【表５２】
【０２１９】
【表５３】
【０２２０】
【表５４】
当業者は、ここで述べる本発明の特定実施形態の多くの等価物を認識する、又は単に常套的な実験を用いて確認することができる。本発明の範囲は上記説明に限定されることを意図されず、付属の特許請求の範囲に述べられている通りである。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、ある種の一般的なカロテノイドを示す。
【図２】図２は、重要なレベルのサイトゾル脂質の生産を可能にする十分なレベルのアセチル−ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨがどのようにして含油性生物のサイトゾル内に蓄積され得るかを示す。酵素：１、ピルビン酸デカルボキシラーゼ；２、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；３、リンゴ酸酵素；４、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ；５、クエン酸シンターゼ；６、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ；７、クエン酸／リンゴ酸トランスロカーゼ。
【図３Ａ】図３Ａは、典型的には真菌を含む真核生物において作動する、メバロン酸イソプレノイド生合成経路を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、典型的には真菌を含む真核生物において作動する、メバロン酸イソプレノイド生合成経路を示す。
【図４】図４は、典型的には細菌及び植物の色素体において作動する、ＤＸＰ経路としても知られるメバロン酸非依存性イソプレノイド生合成経路を示す。
【図５】図５は、イソプレノイド生合成経路における中間体、及びそれらがどのようにしてカロテノイド並びにステロール、ステロイド及びビタミンＥ又はビタミンＫなどのビタミンのような非カロテノイド化合物を含む他の生体分子の生合成経路に供給されるかを示す。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ａは、様々な環式及び非環式キサントフィルを導く分枝を強調する。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ｂは、アスタキサンチンを含む、二環式及び単環式カロテノイドを生成するある種のＸ．ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ経路を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ｃは、β−カロテンを、アスタキサンチンを含む様々な他のカロテノイドのいずれかに変換するための相互連結経路を示すす。
【図６Ｄ】図６Ａ−６Ｄは、様々なカロテノイド生合成経路を例示する。図６Ｄは、ニューロスポレンからの環式カロテノイド及び一般的な植物及び藻類キサントフィルの可能な合成経路を示す。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｅ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｆ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｇ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｈ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図７Ｉ】図７Ａ−７Ｃは、ある種の代表的な真菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドのアラインメントを示す。図からわかるように、これらのポリペプチドは触媒領域全体にわたって非常に高い同一性を示し、同時に複雑な膜貫通ドメインを有する。本発明の一部の実施形態では、例えば高活性型のポリペプチドを生産し得るように、膜貫通ドメインを切断するか又は除去する。
【図８Ａ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【図８Ｂ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【図８Ｃ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【図８Ｄ】図８Ａ−８Ｄは、実施例において作製し、詳細に説明するプラスミドの図式的表示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．真菌が、その乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積できるという意味で含油性であり；及び
ｂ．該真菌が少なくとも１つのカロテノイドを生産し、該生産されたカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％まで蓄積することができ、
ここで、該真菌は、カロテノイド形成性改変、含油性改変及びそれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの改変を含み、そして、その少なくとも１つの改変は、該真菌の含油性を変化させるか、該真菌に含油性を付与するか、該真菌に該少なくとも１つのカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％のレベルまで生産する能力を付与するか、又は該真菌に該真菌が天然では生産しない少なくとも１つのカロテノイドを生産する能力を付与する、
ことを特徴とする組換え真菌。
【請求項２】
天然に含油性である、請求項１に記載の真菌。
【請求項３】
天然に含油性ではない、請求項１に記載の真菌。
【請求項４】
前記の少なくとも１つのカロテノイドを天然では生産しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項５】
前記の少なくとも１つのカロテノイドを天然に生産する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項６】
前記真菌が少なくとも１つのカロテノイドも天然では生産しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項７】
前記真菌が少なくとも１つのカロテノイドを天然に生産する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項８】
前記真菌が単細胞として増殖する、請求項１に記載の真菌。
【請求項９】
前記真菌が酵母である、請求項１に記載の真菌。
【請求項１０】
前記真菌が少なくとも１つの含油性改変を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの含油性改変が前記真菌に含油性を付与する、請求項１０に記載の真菌。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの含油性改変が前記真菌の含油性を変化させる、請求項１０に記載の真菌。
【請求項１３】
前記真菌が少なくとも１つのカロテノイド形成性改変をさらに含み、該カロテノイド形成性改変が、該真菌に少なくとも１つのカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％のレベルまで生産する能力を付与するか、又は該真菌に該真菌が天然では生産しない少なくとも１つのカロテノイドを生産する能力を付与する、請求項１０に記載の真菌。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの含油性改変が、少なくとも１つの含油性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの含油性改変が、少なくとも１つの含油性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの含油性改変が、少なくとも１つの含油性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させ、かつ少なくとも１つの他の含油性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１７】
前記真菌が、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）種である、請求項１１に記載の真菌。
【請求項１８】
前記真菌が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ種である、請求項１１に記載の真菌。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの含油性ポリペプチドが、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド、ピルビン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼポリペプチド、リンゴ酸酵素ポリペプチド、ＡＭＰデアミナーゼポリペプチド、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１４又は１５に記載の真菌。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの含油性ポリペプチドが、表１から６のいずれかの中のポリペプチドから成る群より選択される少なくとも１つのポリペプチドである、請求項１４又は１５に記載の真菌。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの含油性改変が、前記真菌における少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドの発現を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの含油性改変が、前記少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現を含む、請求項２１に記載の真菌。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドが、動物ポリペプチド、哺乳動物ポリペプチド、昆虫ポリペプチド、植物ポリペプチド、真菌ポリペプチド、酵母ポリペプチド、藻類ポリペプチド、細菌ポリペプチド、藍細菌ポリペプチド、古細菌ポリペプチド、又は原生動物ポリペプチドを含む、請求項２１に記載の真菌。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドが、少なくとも２つの異種含油性ポリペプチドを含む、請求項２１に記載の真菌。
【請求項２５】
前記少なくとも２つの異種含油性ポリペプチドが単一の供給源生物に由来する、請求項２４に記載の真菌。
【請求項２６】
前記少なくとも２つの異種含油性ポリペプチドが、少なくとも２つの異なる供給源生物に由来する、請求項２４に記載の真菌。
【請求項２７】
前記真菌が、少なくとも１つのカロテノイド形成性改変を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記真菌に、前記少なくとも１つのカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％のレベルまで生産する能力を付与する、請求項２７に記載の真菌。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記真菌に、該真菌が天然では生産しない少なくとも１つのカロテノイドを生産する能力を付与する、請求項２７に記載の真菌。
【請求項３０】
前記真菌が、少なくとも１つの含油性改変をさらに含み、該含油性改変が、該真菌の含油性を変化させるか、又は該真菌に含油性を付与する、請求項２７に記載の真菌。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記少なくとも１つのカロテノイドを、前記真菌の乾燥細胞重量の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、及び少なくとも約１０％から成る群より選択されるレベルまで生産する能力を該真菌に付与する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのカロテノイドが、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、リコペン、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのカロテノイドが主としてアスタキサンチンである、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、カロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させる、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、カロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項２７〜３１のいずれかに記載の真菌。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、少なくとも１つのカロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させ、かつ少なくとも１つの他のカロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドの発現を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現を含む、請求項３７に記載の真菌。
【請求項３９】
前記カロテノイド形成性ポリペプチドが、イソプレノイド生合成ポリペプチド、カロテノイド生合成ポリペプチド、イソプレノイド生合成競合ポリペプチド、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項３４又は３５に記載の真菌。
【請求項４０】
前記イソプレノイド生合成ポリペプチドが、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼポリペプチド、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼポリペプチド、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、メバロン酸キナーゼポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼポリペプチド、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、ＩＰＰイソメラーゼポリペプチド、ＦＰＰシンターゼポリペプチド及びＧＧＰＰシンターゼポリペプチドから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチドが、フィトエンシンターゼポリペプチド、フィトエンデヒドロゲナーゼポリペプチド、リコペンシクラーゼポリペプチド、カロテノイドケトラーゼポリペプチド、カロテノイドヒドロキシラーゼポリペプチド、アスタキサンチンシンターゼポリペプチド、カロテノイドεヒドロキシラーゼポリペプチド、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼポリペプチド、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）ポリペプチド、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼポリペプチドから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４２】
前記イソプレノイド生合成競合ポリペプチドが、スクアレンシンターゼポリペプチド、プレニル二リン酸シンターゼ及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４３】
前記カロテノイド形成性ポリペプチドが、表７〜２５、表２９及び表３０のいずれか１つのうちの任意のポリペプチド、及びその組合せから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが、動物ポリペプチド、哺乳動物ポリペプチド、昆虫ポリペプチド、植物ポリペプチド、真菌ポリペプチド、酵母ポリペプチド、藻類ポリペプチド、細菌ポリペプチド、藍細菌ポリペプチド、古細菌ポリペプチド、又は原生動物ポリペプチドを含む、請求項３７に記載の真菌。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが、少なくとも２つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドを含む、請求項３７に記載の真菌。
【請求項４６】
前記少なくとも２つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが単一の供給源生物に由来する、請求項４５に記載の真菌。
【請求項４７】
前記少なくとも２つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが、少なくとも２つの異なる供給源生物に由来する、請求項４５に記載の真菌。
【請求項４８】
前記真菌が、前記生産された少なくとも１つのカロテノイドを該真菌の乾燥細胞重量の約１％以上、約２％以上、約３％以上、約５％以上、及び約１０％以上から成る群より選択されるレベルまで蓄積する、請求項１〜４７のいずれかに記載の真菌。
【請求項４９】
前記真菌が脂質を細胞質内封入体の形態で蓄積することを特徴とする、請求項１〜４８のいずれかに記載の真菌。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのカロテノイドが細胞質内油体として蓄積する、請求項４９に記載の真菌。
【請求項５１】
菌株がその乾燥細胞重量の１％−１０％を少なくとも１つのカロテノイドとして蓄積するように、含油性改変、カロテノイド形成性改変、及びそれらの組合せから成る群より選択される１又はそれ以上の改変を含むＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの菌株。
【請求項５２】
菌株がその乾燥細胞重量の２０％−５０％を脂質として蓄積することをさらなる特徴とする、請求項５１に記載の菌株。
【請求項５３】
前記菌株が、その乾燥細胞重量の２０％−５０％を細胞質内油体の形態の脂質として蓄積する、請求項５２に記載の菌株。
【請求項５４】
前記菌株が、
ａ．Ｎ末端膜貫通ドメインを持たない切断型内在性ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼから成る群より選択されるポリペプチドの発現；
ｂ．フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、及びそれらの組合せから成る群より選択される異種ポリペプチドの発現；
ｃ．スクアレンシンターゼポリペプチド、プレニル二リン酸シンターゼポリペプチド及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼポリペプチドから成る群より選択される内在性ポリペプチドの発現又は活性低下；
及びそれらの組合せから成る群より選択されるカロテノイド形成性改変を含む、請求項５１に記載の菌株。
【請求項５５】
前記菌株がその乾燥細胞重量の１−１０％をβ−カロテンとして蓄積する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項５６】
前記菌株が、
ａ．Ｎ末端膜貫通ドメインを持たない切断型内在性ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼから成る群より選択されるポリペプチドの発現；
ｂ．フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、アスタキサンチンシンターゼ、カロテノイドεヒドロキシラーゼ、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼ、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ及びそれらの組合せから成る群より選択される異種ポリペプチドの発現；
ｃ．内在性スクアレンシンターゼポリペプチドの発現又は活性低下；
及びそれらの組合せから成る群より選択されるカロテノイド形成性改変を含む、請求項５１に記載の菌株。
【請求項５７】
前記菌株がその乾燥細胞重量の１−１０％をアスタキサンチン又はルテインとして蓄積する、請求項５１〜５３又は５６のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項５８】
ａ．請求項１〜５７のいずれかに記載の真菌を、カロテノイドの生産を可能にする条件下で培養する工程；
ｂ．該生産されたカロテノイドを単離する工程
を含む、カロテノイドを生産する方法。
【請求項５９】
前記単離の工程が、少なくとも１つのカロテノイド富化画分を得るために培養培地を分画することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記培養の工程が、細胞質内油体における前記カロテノイドの蓄積を可能にする条件下で前記真菌を培養することを含み、かつ前記単離の工程が、該細胞質内油体に由来する油を単離することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記カロテノイドが、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、リコペン、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記カロテノイドがアスタキサンチンを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
ａ．請求項１〜５７のいずれかに記載の真菌を、カロテノイドの生産を可能にする条件下で培養する工程；
ｂ．該カロテノイドを単離する工程；及び
ｃ．該単離したカロテノイドを１又はそれ以上の他の食品又は飼料添加物成分と組み合わせる工程
を含む、カロテノイドを含有する食品又は飼料添加物を製造する方法。
【請求項１】
ａ．真菌が、その乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積できるという意味で含油性であり；及び
ｂ．該真菌が少なくとも１つのカロテノイドを生産し、該生産されたカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％まで蓄積することができ、
ここで、該真菌は、カロテノイド形成性改変、含油性改変及びそれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの改変を含み、そして、その少なくとも１つの改変は、該真菌の含油性を変化させるか、該真菌に含油性を付与するか、該真菌に該少なくとも１つのカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％のレベルまで生産する能力を付与するか、又は該真菌に該真菌が天然では生産しない少なくとも１つのカロテノイドを生産する能力を付与する、
ことを特徴とする組換え真菌。
【請求項２】
天然に含油性である、請求項１に記載の真菌。
【請求項３】
天然に含油性ではない、請求項１に記載の真菌。
【請求項４】
前記の少なくとも１つのカロテノイドを天然では生産しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項５】
前記の少なくとも１つのカロテノイドを天然に生産する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項６】
前記真菌が少なくとも１つのカロテノイドも天然では生産しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項７】
前記真菌が少なくとも１つのカロテノイドを天然に生産する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項８】
前記真菌が単細胞として増殖する、請求項１に記載の真菌。
【請求項９】
前記真菌が酵母である、請求項１に記載の真菌。
【請求項１０】
前記真菌が少なくとも１つの含油性改変を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの含油性改変が前記真菌に含油性を付与する、請求項１０に記載の真菌。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの含油性改変が前記真菌の含油性を変化させる、請求項１０に記載の真菌。
【請求項１３】
前記真菌が少なくとも１つのカロテノイド形成性改変をさらに含み、該カロテノイド形成性改変が、該真菌に少なくとも１つのカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％のレベルまで生産する能力を付与するか、又は該真菌に該真菌が天然では生産しない少なくとも１つのカロテノイドを生産する能力を付与する、請求項１０に記載の真菌。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの含油性改変が、少なくとも１つの含油性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの含油性改変が、少なくとも１つの含油性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの含油性改変が、少なくとも１つの含油性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させ、かつ少なくとも１つの他の含油性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項１７】
前記真菌が、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）種である、請求項１１に記載の真菌。
【請求項１８】
前記真菌が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ種である、請求項１１に記載の真菌。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの含油性ポリペプチドが、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼポリペプチド、ピルビン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼポリペプチド、リンゴ酸酵素ポリペプチド、ＡＭＰデアミナーゼポリペプチド、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１４又は１５に記載の真菌。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの含油性ポリペプチドが、表１から６のいずれかの中のポリペプチドから成る群より選択される少なくとも１つのポリペプチドである、請求項１４又は１５に記載の真菌。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの含油性改変が、前記真菌における少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドの発現を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの含油性改変が、前記少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現を含む、請求項２１に記載の真菌。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドが、動物ポリペプチド、哺乳動物ポリペプチド、昆虫ポリペプチド、植物ポリペプチド、真菌ポリペプチド、酵母ポリペプチド、藻類ポリペプチド、細菌ポリペプチド、藍細菌ポリペプチド、古細菌ポリペプチド、又は原生動物ポリペプチドを含む、請求項２１に記載の真菌。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの異種含油性ポリペプチドが、少なくとも２つの異種含油性ポリペプチドを含む、請求項２１に記載の真菌。
【請求項２５】
前記少なくとも２つの異種含油性ポリペプチドが単一の供給源生物に由来する、請求項２４に記載の真菌。
【請求項２６】
前記少なくとも２つの異種含油性ポリペプチドが、少なくとも２つの異なる供給源生物に由来する、請求項２４に記載の真菌。
【請求項２７】
前記真菌が、少なくとも１つのカロテノイド形成性改変を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記真菌に、前記少なくとも１つのカロテノイドをその乾燥細胞重量の少なくとも約１％のレベルまで生産する能力を付与する、請求項２７に記載の真菌。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記真菌に、該真菌が天然では生産しない少なくとも１つのカロテノイドを生産する能力を付与する、請求項２７に記載の真菌。
【請求項３０】
前記真菌が、少なくとも１つの含油性改変をさらに含み、該含油性改変が、該真菌の含油性を変化させるか、又は該真菌に含油性を付与する、請求項２７に記載の真菌。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記少なくとも１つのカロテノイドを、前記真菌の乾燥細胞重量の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、及び少なくとも約１０％から成る群より選択されるレベルまで生産する能力を該真菌に付与する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのカロテノイドが、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、リコペン、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのカロテノイドが主としてアスタキサンチンである、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、カロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させる、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、カロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項２７〜３１のいずれかに記載の真菌。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、少なくとも１つのカロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を上昇させ、かつ少なくとも１つの他のカロテノイド形成性ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドの発現を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の真菌。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのカロテノイド形成性改変が、前記少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現を含む、請求項３７に記載の真菌。
【請求項３９】
前記カロテノイド形成性ポリペプチドが、イソプレノイド生合成ポリペプチド、カロテノイド生合成ポリペプチド、イソプレノイド生合成競合ポリペプチド、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項３４又は３５に記載の真菌。
【請求項４０】
前記イソプレノイド生合成ポリペプチドが、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼポリペプチド、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼポリペプチド、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、メバロン酸キナーゼポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼポリペプチド、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、ＩＰＰイソメラーゼポリペプチド、ＦＰＰシンターゼポリペプチド及びＧＧＰＰシンターゼポリペプチドから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチドが、フィトエンシンターゼポリペプチド、フィトエンデヒドロゲナーゼポリペプチド、リコペンシクラーゼポリペプチド、カロテノイドケトラーゼポリペプチド、カロテノイドヒドロキシラーゼポリペプチド、アスタキサンチンシンターゼポリペプチド、カロテノイドεヒドロキシラーゼポリペプチド、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼポリペプチド、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）ポリペプチド、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼポリペプチドから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４２】
前記イソプレノイド生合成競合ポリペプチドが、スクアレンシンターゼポリペプチド、プレニル二リン酸シンターゼ及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４３】
前記カロテノイド形成性ポリペプチドが、表７〜２５、表２９及び表３０のいずれか１つのうちの任意のポリペプチド、及びその組合せから成る群より選択される、請求項３９に記載の真菌。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが、動物ポリペプチド、哺乳動物ポリペプチド、昆虫ポリペプチド、植物ポリペプチド、真菌ポリペプチド、酵母ポリペプチド、藻類ポリペプチド、細菌ポリペプチド、藍細菌ポリペプチド、古細菌ポリペプチド、又は原生動物ポリペプチドを含む、請求項３７に記載の真菌。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが、少なくとも２つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドを含む、請求項３７に記載の真菌。
【請求項４６】
前記少なくとも２つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが単一の供給源生物に由来する、請求項４５に記載の真菌。
【請求項４７】
前記少なくとも２つの異種カロテノイド形成性ポリペプチドが、少なくとも２つの異なる供給源生物に由来する、請求項４５に記載の真菌。
【請求項４８】
前記真菌が、前記生産された少なくとも１つのカロテノイドを該真菌の乾燥細胞重量の約１％以上、約２％以上、約３％以上、約５％以上、及び約１０％以上から成る群より選択されるレベルまで蓄積する、請求項１〜４７のいずれかに記載の真菌。
【請求項４９】
前記真菌が脂質を細胞質内封入体の形態で蓄積することを特徴とする、請求項１〜４８のいずれかに記載の真菌。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのカロテノイドが細胞質内油体として蓄積する、請求項４９に記載の真菌。
【請求項５１】
菌株がその乾燥細胞重量の１％−１０％を少なくとも１つのカロテノイドとして蓄積するように、含油性改変、カロテノイド形成性改変、及びそれらの組合せから成る群より選択される１又はそれ以上の改変を含むＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの菌株。
【請求項５２】
菌株がその乾燥細胞重量の２０％−５０％を脂質として蓄積することをさらなる特徴とする、請求項５１に記載の菌株。
【請求項５３】
前記菌株が、その乾燥細胞重量の２０％−５０％を細胞質内油体の形態の脂質として蓄積する、請求項５２に記載の菌株。
【請求項５４】
前記菌株が、
ａ．Ｎ末端膜貫通ドメインを持たない切断型内在性ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼから成る群より選択されるポリペプチドの発現；
ｂ．フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、及びそれらの組合せから成る群より選択される異種ポリペプチドの発現；
ｃ．スクアレンシンターゼポリペプチド、プレニル二リン酸シンターゼポリペプチド及びＰＨＢポリプレニルトランスフェラーゼポリペプチドから成る群より選択される内在性ポリペプチドの発現又は活性低下；
及びそれらの組合せから成る群より選択されるカロテノイド形成性改変を含む、請求項５１に記載の菌株。
【請求項５５】
前記菌株がその乾燥細胞重量の１−１０％をβ−カロテンとして蓄積する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項５６】
前記菌株が、
ａ．Ｎ末端膜貫通ドメインを持たない切断型内在性ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ及びＧＧＰＰシンターゼから成る群より選択されるポリペプチドの発現；
ｂ．フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコペンシクラーゼ、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、アスタキサンチンシンターゼ、カロテノイドεヒドロキシラーゼ、リコペンシクラーゼ（β及びεサブユニット）、カロテノイドグルコシルトランスフェラーゼ、及びアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ及びそれらの組合せから成る群より選択される異種ポリペプチドの発現；
ｃ．内在性スクアレンシンターゼポリペプチドの発現又は活性低下；
及びそれらの組合せから成る群より選択されるカロテノイド形成性改変を含む、請求項５１に記載の菌株。
【請求項５７】
前記菌株がその乾燥細胞重量の１−１０％をアスタキサンチン又はルテインとして蓄積する、請求項５１〜５３又は５６のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項５８】
ａ．請求項１〜５７のいずれかに記載の真菌を、カロテノイドの生産を可能にする条件下で培養する工程；
ｂ．該生産されたカロテノイドを単離する工程
を含む、カロテノイドを生産する方法。
【請求項５９】
前記単離の工程が、少なくとも１つのカロテノイド富化画分を得るために培養培地を分画することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記培養の工程が、細胞質内油体における前記カロテノイドの蓄積を可能にする条件下で前記真菌を培養することを含み、かつ前記単離の工程が、該細胞質内油体に由来する油を単離することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記カロテノイドが、アスタキサンチン、β−カロテン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、リコペン、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記カロテノイドがアスタキサンチンを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
ａ．請求項１〜５７のいずれかに記載の真菌を、カロテノイドの生産を可能にする条件下で培養する工程；
ｂ．該カロテノイドを単離する工程；及び
ｃ．該単離したカロテノイドを１又はそれ以上の他の食品又は飼料添加物成分と組み合わせる工程
を含む、カロテノイドを含有する食品又は飼料添加物を製造する方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【公表番号】特表２００８−５３７８７８（Ｐ２００８−５３７８７８Ａ）
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０２１５５（Ｐ２００８−５０２１５５）
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１０２７１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０２３４２
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０７３１０３２９）マイクロビア， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１０２７１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０２３４２
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０７３１０３２９）マイクロビア， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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