安定化タンパク質
組換えヒトアデノシンデアミナーゼ（ｒｈＡＤＡ）などのように少なくとも１つの酸化可能なアミノ酸を有するタンパク質を安定化する方法について開示している。該方法は、酸化可能なアミノ酸を有するタンパク質にグルタチオンなどのキャップ化剤の十分量を反応させることを含むが、このときの反応条件は、実質的にタンパク質を不活化せずに酸化可能なアミノ酸をキャップ化するのに十分な条件である。安定化キャップ化タンパク質、キャップ化タンパク質ポリマー複合体およびそれを用いた治療法についても開示している。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本願は、２００７年４月２０日に受理された米国特許出願No.１１／７３８，０１２号の優先権の利益を主張するものであり、また、該特許は、２００６年６月２１日に受理された米国特許出願Ｎｏ．６０／８０５，４１７号の優先権の利益を主張するものである。ここに参照することにより、それぞれの内容の全てを本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、タンパク質の溶液環境にさらされた、１個もしくはそれ以上の酸化可能なシステイン残基を保護またはキャップ化することによって安定化された、アデノシンデアミナーゼ酵素などのタンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００３】
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）または、時には「バブルボーイ」疾患と呼ばれることもある、酵素不全性疾患の治療に使用されている。エンゾンファーマシューティカル社（Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、１５年以上も前から、ウシ起源の酵素を使用し、患者に使用可能なＰＥＧ化ＡＤＡを製造している。
【０００４】
近年、ウシ起源の酵素を組換え起源の酵素（以後、「ｒＡＤＡ」と記す）に置き換えようとする試みがなされている。精製天然ウシＡＤＡの代替品としては、組換えヒトＡＤＡ（「ｒｈＡＤＡ」）および組換えウシＡＤＡ（「ｒｂＡＤＡ」）が考えられている。ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡは、現在使用されている天然の精製ウシ酵素よりも若干安定性に欠ける。ｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡは、システイン分解と同様の方法、すなわち、酸素付加；ジチオール類の生成；ｐＨ上昇に伴う分解増加；特に、ｐＨ上昇およびサンプルの濃縮に伴う沈澱、によって分解すると考えられている。還元状態においては、システインは、分解を担う形態である、反応性ＳＨ基（スルフヒドリル基）を含む。
【０００５】
発明者らは、単一の曝露されたシステインがｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方で観察される分解に関与していることを示唆する事実を見出した。ウシから精製したＡＤＡは、ｒｈＡＤＡと非常に類似した構造を有している。ウシＡＤＡおよびｒｈＡＤＡは、一次配列の同一位置に同一数のシステインを有する。現在入手可能な組換えウシＡＤＡは、システインの反応性と一致する分解物／不純物（ジチオール類）を含んでいる。天然ウシＡＤＡは、組換えウシＡＤＡと構造的に異なっており、後者は１モルのＡＤＡに対して１モルのシステインが結合しており、前者は高ｐＨ条件下で安定であることから、ＡＤＡに結合しているシステインが保護基の役割を果たしていることが示唆される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の事実にもかかわらず、所望する活性化ＰＥＧを用いる場合に、酵素の至適ＰＥＧ化に有用なｐＨレベルにおいて安定、すなわち著しい分解を起こさないｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡを提供することには利益がある。例えば、ある種のインターフェロン類など、不安定化に関与する遊離システイン基を有するその他のタンパク質および酵素の安定化にも、同様に利益がある。本発明は、この必要性に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むキャップ化タンパク質を提供し、該残基は、タンパク質が水性媒体中にある場合に、アミノ酸の酸化が阻害されるように選択されたキャップ化剤でキャップされており、それにより、キャップ化タンパク質は、水性媒体中において、キャップされていないものよりも実質的に安定である。アミノ酸は酸化可能なアミノ酸であり、例えば、システイン、トリプトファンまたはメチオニンなどである。キャップ化タンパク質としては、目的の任意のタンパク質を用いることができ、例えば、アデノシンデアミナーゼタンパク質（天然型または組換え発現型のもの）、インターフェロン（βインターフェロン、αインターフェロンおよびγインターフェロンなど）などが挙げられる。好ましくは、アデノシンデアミナーゼは組換えヒトアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２など）または組換えウシアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４など）である。さらに、組換えアデノシンデアミナーゼは、対応するＤＮＡオープンリーディングフレームの理論的翻訳によって示唆された６個のＣ末端残基が欠如している。さらに別の態様においては、対応するＤＮＡオープンリーディングフレームの理論的翻訳によって示唆されたＮ末端Ｍｅｔは、キャップ化タンパク質中に存在する。
【０００８】
本発明に従うキャップ化タンパク質は、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物などのキャップ化剤でキャップされている。
【０００９】
本発明に従うキャップ化タンパク質は、さらに、実質的に非抗原性であるポリマーに共役し、ポリマー複合組換えキャップ化タンパク質を形成するが、そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキシドが挙げられ、ここで、該ポリアルキレンオキシドの分子量は約２，０００〜約１００，０００である。ポリアルキレンオキシドは、リンカー化学物質を介してタンパク質と共役することが好ましく、例えば、スクシンイミジルカルボネート、チアゾリジンチオン、ウレタンおよびアミド系のリンカーなどが挙げられる。ポリアルキレンオキシドが共有結合する部位は、当該分野において共有結合部位として既知であるその他の部位よりも、該システイン安定化組換えヒトアデノシンデアミナーゼ上のＬｙｓのε−アミノ基であることが好ましい。好ましくは、本発明に従うキャップ化タンパク質は、該タンパク質上のＬｙｓのε−アミノ基に少なくとも５本のポリエチレングリコール鎖が結合しており、あるいはまた、該タンパク質上のＬｙｓのε−アミノ酸に約１１〜１８本のＰＥＧ鎖を有する。
【００１０】
さらに、本発明は、組換え発現タンパク質を実質的に不活化させることなく、反応性アミノ酸をキャップ化するのに十分な反応条件下で、水溶液中において、十分量のキャップ化剤で、酸化可能なアミノ酸を含むタンパク質を処理する工程を有してなる、酸化可能なアミノ酸を有するタンパク質の安定化方法を提供する。反応性アミノ酸としては、システインもしくはメチオニン、および／または、当該分野において既知のその他の任意の反応性タンパク質などが挙げられる。タンパク質は、上述したような任意の目的タンパク質を用いることができる。キャップ化剤は、例えば、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物などが挙げられるが、酸化グルタチオンが好ましい。好ましくは、酸化グルタチオンは、約２０〜約１００ｍＭの濃度でタンパク質と反応し、あるいは、酸化グルタチオンは、約２２〜約３０ｍＭの濃度でタンパク質と反応する。
【００１１】
好ましくは、本発明に従う方法は、ｐＨが約６．５〜約８．４である水溶液を含む反応条件で提供される。より具体的には、反応条件には、ｐＨが約７．２〜約７．８である水溶液が含まれる。
【００１２】
好ましい態様においては、水溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓからなる群より選択される緩衝液を含み、それらの濃度は２０〜１５０ｍＭの範囲である。
【００１３】
さらに、本発明の方法は、キャップ化タンパク質−ポリマー複合体を形成するのに十分な条件下、水溶液中でキャップ化タンパク質を活性化ポリマーと反応させる工程を含む。このとき用いる活性化ポリマーとしては、例えば、スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール、チアゾリジンチオン活性化ポリエチレングリコール、および／または、ウレタン結合もしくはアミド結合形成性活性化ポリエチレングリコールなどの活性化ポリエチレングリコールが挙げられ、ここでポリエチレングリコールは、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有することが好ましく、約４，０００〜約４５，０００の分子量を有することがさらに好ましい。
【００１４】
さらに、本発明の方法は、
適切な原核細胞性発現系中でタンパク質を組換え発現させ、
十分量のキャップ化剤を含む細胞抽出溶媒から組換え発現タンパク質を回収し、
それによって組換え発現タンパク質上の酸化可能なアミノ酸が、適切な原核細胞性発現系中の原核細胞から分泌された際に安定化される、
各工程を有してなる、酸化可能なシステインを有する組換え発現タンパク質を安定化する方法を含む。好ましくは、原核細胞性発現系は、組換えアデノシンデアミナーゼを産生できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系であり、さらに、組換え発現タンパク質は、アデノシンデアミナーゼおよび／またはインターフェロンである。
【００１５】
さらに、本発明に従う方法は、目的の酸化可能なタンパク質の安定化誘導体を産生する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）目的の酸化可能なタンパク質を識別する工程であって、前記タンパク質が、水溶液中に存在する場合に、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基において酸化可能であり、
（ｂ）前記目的のタンパク質中の酸化可能なアミノ酸を少なくとも１つを識別し、
（ｃ）前記目的の酸化可能なタンパク質を、酸化可能なアミノ酸の酸化を防ぐように選択したキャップ化剤と反応させる、
各工程を有してなる。
【００１６】
タンパク質は、例えば、アデノシンデアミナーゼまたはインターフェロンであり、酸化可能なアミノ酸は、システインまたはメチオニンであり、キャップ化剤は、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物から選択される。
【００１７】
本発明の更なる態様は、システイン安定化組換えタンパク質、酵素など、ならびに、それらの調製方法を含む。これに関連して好ましい形態は、システイン安定化ｒｂＡＤＡおよび／もしくはｒｈＡＤＡである。それらのポリマー複合体も本発明の実施の形態に含まれる。ポリマーは、ポリアルキレンオキシドが好ましく、例えば、ポリエチレングリコールなどがさらに好ましい。複合体は、キャップ化タンパク質を活性化ポリマーと反応させることによって調製し、そのような活性化ポリマーとしては、例えば、スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール（ＳＣ−ＰＥＧ）、チアゾリジンチオン活性化ポリエチレングリコール（Ｔ−ＰＥＧ）、および／または、ウレタン結合もしくはアミド結合形成性活性化ポリエチレングリコールなどが挙げられる。ＳＣ−ＰＥＧが好ましい。
【００１８】
本発明の更なる態様は、ポリマー複合型または非複合型の安定化酵素を用いた治療方法を包含する。特に、本発明の方法は、ＳＣＩＤまたはその他の酵素不全に関連する状態の治療を目的として、システイン安定化ｒＡＤＡを有効量でそれを必要とする患者に投与する工程を含む。
【００１９】
本発明の目的を遂行するためには、「有効量」とは、当然ながら、所望する臨床効果、すなわち、患者（すなわち、ほ乳類またはヒト）の酵素不全またはＳＣＩＤ状態を軽減、遅延、寛解、あるいは回復するような効果を達成する量を意味するものと理解されたい。
【００２０】
さらに、明細書中で便宜上単数で表している事項については、これに限定しているわけではない。従って、例えば、細胞を含む組成物には、そのような細胞を１つもしくはそれ以上含む組成物が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ａ．概要
広義には、本発明は、安定性が高められたキャップまたは保護タンパク質を提供する。特に、タンパク質が、例えば保管中に溶液中で不安定な性質を表すように、タンパク質の溶液環境下に晒された、１つまたはそれ以上の酸化可能なまたは反応性のシステイン残基を発現したタンパク質を提供する。好ましくは、該タンパク質は組換え産生ＡＤＡ酵素である。
【００２２】
本発明に従ってキャップされうる酸化可能なアミノ酸残基の数は、目的のタンパク質中に存在するそのようなアミノ酸残基の数、および該タンパク質の三次構造中のそれらの位置に応じて決まる。いずれの理論または仮説にも縛られることは意味しないが、タンパク質が水性媒体中に溶解または懸濁されている場合に、溶液に晒された酸化可能なアミノ酸は、酸化を介したタンパク質の分解を最も生じやすいと考えられる。従って、そのようなアミノ酸を識別し、キャップ化することによって、そのようなアミノ酸残基の酸化を阻害し、それにより、キャップされていないタンパク質と比較して、安定性が高められたキャップ化タンパク質を提供する。故に、例えば、キャップされるべき残基は、水性媒体中で不安定な目的のタンパク質の分解生成物を同定し、酸化可能なアミノ酸の存在に対するフラグメント切断の位置を決定することによって決定できる。キャップすべき残基の数は、少なくとも１個から目的のタンパク質の安定化に必要な数まで（例えば、５０個まで、またはそれ以上など）である。さらに詳細には、キャップすべき残基の数は、さらに典型的には１〜約２０個の範囲であり、さらに具体的には、１〜約１０個の範囲である。
【００２３】
本発明は、酸化可能なシステインを有する組換え発現タンパク質を安定化させる方法も提供する。本発明は、組換え発現タンパク質を実質的に不活化することなく、酸化可能なシステインをキャップするのに十分な反応条件下で、酸化可能なシステインを有する組換え発現タンパク質を十分量のキャップ化剤で処理する工程を含む。
【００２４】
当業者においては自明であるように、この態様において「処理する」とは、反応性システインの選択的酸化を進行させながら、該タンパク質の生物学的活性を保護するであろう、適切な緩衝液中で２種類の主要反応物を接触させることにより、組換え発現タンパク質をキャップ化剤と反応させることである。「処理」は、発現後、組換え体産生の様々な段階で行うことができるが、本発明のこの態様では、発現後の精製工程のうちの１つもしくはそれ以上の工程が好ましい。例えば、細胞抽出物由来のＡＤＡタンパク質の初期精製は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤の存在下、陰イオン交換クロマトグラフィーを通すことによって行える。続いて、ＤＴＴを除去する際に、半精製ＡＤＡを十分量のキャップ化剤で処理し、反応性システインを遮断できる。同様の操作は、精製の任意の段階において、あるいは、精製の最後であってＰＥＧ化の前に精製タンパク質を用いて、実施することができる。一旦キャップ化されると、修飾ＡＤＡの安定性を維持するための還元剤は必要ない。
【００２５】
Ｂ．ＡＤＡタンパク質
本発明の特定の好ましい態様では、組換え発現タンパク質は、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡである。より好ましくは、翻訳ｒｈＡＤＡは、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２のアミノ酸配列を有しており、また、翻訳ｒｂＡＤＡは、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４のアミノ酸配列を有している。ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２および４は、予想される成熟翻訳配列であり、Ｎ末端Ｍｅｔ残基の翻訳後切断を反映していることは注目に値する。故に、翻訳された各成熟ＡＤＡタンパク質中では、システイン残基は７４番の位置に存在している。さらに、ウシの腸から単離した天然ウシＡＤＡは、Ｃ末端から翻訳後除去された６残基を有することも注目に値する。本発明の追加的特徴として、ｒｂＡＤＡは、Ｃ末端の６残基を有しない状態で（ムテインとして）発現されるか、または、翻訳後修飾を受け、精製天然ウシＡＤＡには欠けているのと同一の該Ｃ末端残基が除去される。
【００２６】
ウシの腸から単離された天然ウシＡＤＡは多型であることも注目すべきである。故に、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を参照すると、ウシＡＤＡ多型には、例えば、１９８番のリジンの位置にグルタミンが、２４５番のスレオニンの位置にアラニンが、３５１番のグリシンの位置にアルギニンが存在するものなどが含まれる。従って、本発明に従う組換え位置７４番ムテインのウシＡＤＡも、次に示す位置またはそれらと類似の位置の１つもしくはそれ以上の位置でさらなる置換を有する場合がある：１９８番のリジンの代わりにグリシン；２４５番のスレオニンの代わりにアラニン；３５１番のグリシンの代わりにアルギニン。
【００２７】
さらに、ｒｈＡＤＡは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に従い、大腸菌での発現に最適化されたコドンを有するＤＮＡによって発現され、ｒｂＡＤＡは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３に従い、大腸菌での発現に最適化されたコドンを有するＤＮＡによって発現される。適切な発現ベクターは、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡをそれぞれコードしているゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから調製でき、さらに、随意的に、適切に機能発揮できるように接続した誘導性プロモーターの制御下におくことができる。
【００２８】
以下に例示するように、基本ｒｈＡＤＡヌクレオチド配列を含むベクター（ｐＥＴ９ｄ）は、米国ノースカロライナ州デューク・メディカルセンター（Ｄｕｋｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）のマイク・ハーシュフィールド（Ｍｉｋｅ Ｈｅｒｓｕｆｉｅｌｄ）氏から入手した（ＨＡＤＡ１０９２クローン）。次に、ＨＡＤＡ１０９２クローンを細菌発現用に最適化し、誘導性プロモーターの制御下にある適切な発現ベクターに挿入し、ＢＬＲ（λＤＥ３）株に形質転換した。この組換えクローンをＥＮ７６０と名付けた。
【００２９】
同様に、組換えｒｂＡＤＡ発現クローンは、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓプラスミド（ｐ２ＴｒｃＧｒｏ−ＲｏＡＤＡ２−２３）を新鮮な大腸菌ＢＬ２１化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社、カタログ番号６９４４９−４、ロット番号Ｎ６０８３０、遺伝子型Ｆ- ｏｍｐＴ ｈｓｄＳｂ（ｒＢ-ｍＢ-）ｇａｌ ｄｃｍ）に形質転換することによって構築した。このクローンは、Ｒｏｃｈｅ社から提供されたウシＡＤＡ遺伝子および大腸菌ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳシャペロンオペロン（米国特許第６，３６６，８６０号明細書参照）を有するプラスミドｐ２ＴｒｃＧｒｏ−ＲｏＡＤＡ２−２３を含む。この新規形質転換クローンは、ＣＦＢ培地（１０ｇ／Ｌの大豆ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）、２％（ｗ／ｖ）寒天および２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むプレート上、３０℃で培養した。ｒｂＡＤＡの発現はＩＰＴＧで誘導した。
【００３０】
Ｃ．キャップ化剤および反応条件
本発明に従う方法において使用するキャップ化剤としては、酸化グルタチオン（これが好ましい）、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システインおよび当業者において既知のその他のジチオール類、ならびにそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本明細書に記載している方法の反応相中に含まれるキャップ化剤の量および濃度は、使用するキャップ化剤および熟練者の必要性によって異なるが、それらの決定にあたっては、不要な実験を要しない。基本型として酸化グルタチオンを使用する場合には、ｒｈＡＤＡなどの組換えタンパク質と反応させる時の濃度範囲は、約２５μＭ〜約１００ｍＭである。好ましくは、酸化グルタチオンは、約５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度範囲で組換えタンパク質と反応させる。
【００３１】
キャップ化剤と組換えタンパク質との反応中の反応条件としては、さらに、ｐＨ約６．５〜８．４、好ましくは約７．２〜７．８の範囲の水溶液を使用することを含む。加えて、好ましくは、該水溶液は、適切な緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓおよびそれらの混合物を１０〜１５０ｍＭの濃度範囲で含む（コメント：キャップ化は、この濃度範囲外、すなわち、１０ｍＭ未満または１５０ｍＭより高い緩衝液中でも進行する）。さらに、反応条件としては、タンパク質が分解を起こさない温度、すなわち 約４〜３７℃で反応を進行させることを含む。場合によっては、キャップ化はこの温度範囲外、例えば、０〜４℃未満または３７℃より高くても進行する。反応は、反応性システインの安定化が所望する状態に達するまで十分時間行う。単なる例ではあるが、反応は、約５秒〜約８時間（例えば、一晩など）行う。
【００３２】
本発明は、好ましい組換えタンパク質、すなわち、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡについて記載しているが、本明細書中に記載している過程は、不安定性に関与している遊離システイン基を有する任意の組換え調製タンパク質、酵素など（例えば、ある種のインターフェロン類など）を用いて実施できることは明かである。例えば、α、βまたはγインターフェロンは、本明細書記載の方法に従って安定化できる。その他の適切なタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：ヘモグロビン、血清タンパク質（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を含む血液因子など）、免疫グロブリン類、サイトカイン類（インターロイキン類、すなわち、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３など）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、血小板由来増殖因子など）など。生物学的または治療上の関心が高いその他のタンパク質としては、インスリン、植物タンパク質（レシチン類およびリシン類など）、腫瘍壊死因子および関連タンパク質、トランスフォーミング増殖因子などの増殖因子（ＴＧＦαまたはβ、ならびに上皮増殖因子など）、ホルモン類、ソマトメジン類、エリスロポエチン、色素性ホルモン類、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン類、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子などが挙げられる。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤならびにそれらのフラグメントおよびそれらを構築する１本鎖が挙げられる。
【００３３】
酵素としては、炭水化物特異的酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、脱炭酸酵素、異性化酵素およびリガーゼなどが挙げられる。 特定の酵素に限定されるわけではないが、目的の酵素の例としては次のようなものが挙げられる：Ｌ−アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ類、カタラーゼ類、キモトリプシン、リパーゼ類、ウリカーゼ類、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ類およびビリルビンオキシダーゼなど。炭水化物特異的酵素としては、グルコースオキシダーゼ類、グルコシダーゼ類、ガラクトシダーゼ類、グルコセロブロシダーゼ類、グルコウロニダーゼ類などが挙げられる。
【００３４】
上記のリストは、本発明に従う方法を用いて安定化させることが企図されるタンパク質の例示に過ぎない。本明細書で定義されるタンパク質、酵素などは、特別に取り上げたものではなくても、反応性システインを有するものであれば、本発明の方法に含まれることが意図されているものと理解されたい。
【００３５】
本発明の方法を用いた結果として、安定化タンパク質は、反応性システインの位置に、結合したキャップ化基を有する。例えば、グルタチオンまたはその他のキャップ化基は、次に示すように、ジスルフィド結合を介してｒｈＡＤＡに結合する：
ＡＤＡ−Ｓ−Ｓ−グルタチオン
ここで、ＡＤＡの一次配列中の１つのシステインは、１分子のグルタチオンと結合し、以下に示すように、ＡＤＡ Ｃｙｓの−ＳＨがグルタチオンの−ＳＨと反応する：
【化１】
【００３６】
このようなジスルフィド結合は、酸化分解経路に対して安定であり、従って、特にｐＨ７．４の範囲においては、ｒｈＡＤＡをより安定化させる。さらに、ｒｈＡＤＡなどの安定化タンパク質のグルタチオン付加物の分子量は、非安定化型と比較して、使用したキャップ化剤の分子量とほぼ同量分だけ増加する。このことにより、望ましい場合には、所望する付加物の分離が可能である。安定化付加物は、さまざまな物理的および化学的特性を有しており、このことを利用してクロマトグラフィーによる分離および単離もできるであろう。
【００３７】
Ｄ．ポリマー複合体
本発明の別の態様では、システインがキャップ化または安定化された組換えタンパク質を、ポリマー複合体の作出を目的として、適切なポリマーと共役させる。ポリマーの共役は、当業者に既知の反応であるＰＥＧ化反応によって行なわれることが好ましい。概説すると、例えば、システインがキャップ化または安定化されたポリマー複合体が生成するのに十分な条件下、水溶液中でｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡを活性化ポリマーと反応させる。これに関しては、広範な活性化ポリエチレングリコール類を使用でき、それらとしては例えば、米国特許第５，１２２，６１４号、同第５，３２４，８４４号、同第５，６１２，４６０号および同第５，８０８，０９６号（スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール（ＳＣ−ＰＥＧ）および関連する活性化ＰＥＧ類）、同第５，３４９，００１号（環状イミドチオン活性化ＰＥＧ類）、同第５，６５０，２３４号の各明細書に記載されているもの、ならびに当業者において既知のその他のものなどが挙げられる。上述の特許のそれぞれの開示を本明細書中に参照として援用する。ネクター／シェアウォーター／ポリマーズ（Ｎｅｋｔａｒ／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）社から入手可能な活性化ポリマーも参照のこと。活性化ＰＥＧ類は、直線、分岐鎖またはＵ−ＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第５，６０５，９７６号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号および同第６，１１３，９０６号の各明細書に記載されているものなど。これらを本明細書中に参照として援用する）、または分岐鎖誘導体である。さらに、ＰＥＧに基づくポリマーに加え、その他多数のポリアルキレンオキシド類も使用できることが理解されよう。例えば、本発明の複合体は、参照することにより本明細書に援用される、日油株式会社のＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍカタログ第８版（２００６年４月）に記載されている、マルチアームＰＥＧ−ＯＨまたは「スター−ＰＥＧ」生成物を、適切な活性化ポリマーに転換することを含む方法によっても調製でき、その際、前述の米国特許第５，１２２，６１４号または同第第５，８０８，０９６号の各明細書に記載の活性化法を用いる。特に、ＰＥＧは次のような化学式で表される：
【化２】
【００３８】
または
【化３】
【００３９】
ここで、ｕ’は、約４〜約４５５までの整数であり、好ましくは、与えられるポリマーの分子量が約５，０００〜約４０，０００の範囲になるような整数であり；さらに、残基のうち、最大３つまでの末端部位がメチルもしくはその他の低級アルキルでキャップされる。
【００４０】
いくつかの好ましい実施形態では、ＰＥＧのアームの４本全てが適切な離脱基、すなわち、ＳＣなどに転換され、組換えタンパク質に容易に結合できるようになっている。転換前のそのような化合物としては次のようなものが挙げられる：
【化４−１】
【化４−２】
【００４１】
および
【化５】
【００４２】
本発明に従う最も好ましい実施態様では、活性化ポリエチレングリコールはタンパク質とウレタン結合またはアミド結合するものである。
【００４３】
さらに別の態様では、活性化ポリマーとして、立体的に妨害された(hindered)エステル系リンカーを用いることができる。例えば、発明の名称を「立体的に妨害されたエステルに基づく生体分解性リンカーを有するポリアルキレンオキシド類（Ｐｏｌｙａｌｋｙｌｅｎｅ Ｏｘｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｈｉｎｄｅｒｅｄ Ｅｓｔｅｒ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ）」とする米国特許仮出願第６０／８４４，９４２号明細書を参照のこと。参照することにより、その内容を本明細書に援用する。例えば、次のような化合物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：
【化６】
【００４４】
および
【化７】
【００４５】
ここで、「ｕ」は、１０〜約４５５までの整数である。
【００４６】
適切なポリマーは、分子量によって実質的に異なる。通常、平均分子量が約２，０００〜約１００，０００の範囲のポリマーを本発明の目的遂行のために選択する。分子量約４，０００〜約４５，０００のものが好ましく、５，０００〜約１２，０００のものが特に好ましい。
【００４７】
末端にカルボン酸を有するポリマーを高純度で調製する方法については、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書に記載されており、参照することによりその内容を本明細書に援用する。該方法には、最初にポリアルキレンオキシドの四級アルキルエステルを調製し、次に、それらをカルボン酸誘導体に転換する工程を含む。ＰＡＯカルボン酸調製の第一段階には、ポリアルキレンオキシドカルボン酸のｔ−ブチルエステルのような中間体を形成する工程を含む。この中間体は、カリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下、ＰＡＯをｔ−ブチルハロアセテートと反応させることによって生成する。一旦ｔ−ブチルエステル中間体が生成すると、ポリアルキレンオキシドのカルボン酸誘導体は、９２％を超える純度、好ましくは、９７％超える純度、より好ましくは９９％超える純度、最も好ましくは９９．５％超える純度で得られる。 さらに別の態様においては、末端アミノ基を有するポリマーを用いてＡＤＡ複合体を生成できる。末端アミンを有するポリマーの高純度調製法については、米国特許出願第１１／５０８，５０７号および同第１１／５３７，１７２号の各明細書に記載されており、参照することによりそれらの内容を本明細書に援用する。例えば、アジドを有するポリマーをトリフェニルホスフィンなどのホスフィン系還元剤、またはＮａＢＨ4などのアルカリ金属ボロヒドリド還元剤と反応させる。別の方法としては、遊離基を有するポリマーは、保護アミン塩（例えば、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボネートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ2）など）と反応させ、続いて、保護アミノ基を脱保護する。これらの工程に従って生成された末端アミンを有するポリマーは、約９５％を超える純度、好ましくは９９％を超える純度である。
【００４８】
上掲の米国特許第５，６４３，５７５号明細書のポリマー類によって分岐がもたらされることにより、ひとつの付着点から派生する生物学的活性分子上へのポリマー結合数を増やす方法として、二次的または三次的分岐が可能になる。必要であれば、不要な実験を行うことなく、二官能性結合基に結合できるように、水溶液ポリマーを機能性化できるものと理解されたい。
【００４９】
好ましくは、本明細書において使用するポリマー性基質は、室温で水溶性である。そのようなポリマーとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール類などのホモポリマー類、ポリオキシエチレン化ポリオール類、それらのコポリマー類ならびにそれらのブロックコポリマー類など。このとき、該ブロックコポリマー類の水溶性は維持されている。ｍＰＥＧに加えて、Ｃ1-4アルキル末端ポリマー類も有用である。
【００５０】
ＰＡＯに基づくポリマー類とは別に、有用な非抗原性材料であるデキストラン、ポリビニルピロリドン類、ＨＰＭＡ類（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド類）などのポリアクリルアミド類、ポリビニルアルコール類、炭水化物に基づくポリマー類、それらのコポリマー類なども用いられる。当業者には、上掲の化合物群は単なる例示であり、本明細書に記載している性質を有する全てのポリマー材料が含まれることは明らかであろう。本発明の目的遂行のためには、「実質的に、または実際上は非抗原性である」とは、ほ乳類において非毒性であり、かつ明白な免疫原性応答を誘起しないことが当該分野において確認されている全ての材料を指す。
【００５１】
Ｅ．キャップ化剤を含む細胞抽出培地
本発明の別の態様においては、反応性システインを有する組換え発現タンパク質を安定化させる別の方法を提供する。この方法には、適切な原核細胞性発現系内で組換えによって発現されたタンパク質、および、十分量のキャップ化剤を含む細胞抽出培地から該組換え発現タンパク質を回収する工程が含まれ、それによって、該組換え発現タンパク質上の反応性システインは、適切な原核細胞性発現系内の原核細胞から分泌される際に実質的に安定化される。本発明の第一の態様に従えば、発現される好ましいタンパク質はｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡである。適切な原核細胞性発現系は、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡを産生できる大腸菌発現系である。
【００５２】
発現ベクター（ｐＥＴ９ｄ）を含むｒｈＡＤＡ ｃＤＮＡは、大腸菌発現株ＢＬ２１（λＤＥ３）に導入し、あるいは、同等の発現ベクターおよび細菌性株の組み合わせにより、ＩＰＴＧ誘導によって細菌内で組換えタンパク質を合成させる。次に、ＥＤＴＡおよび所望する濃度（本明細書においては５〜５０ｍＭ）のキャップ化剤を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中で細胞を溶解させ、発現されたｒｈＡＤＡを含む抽出物を調製する。
【００５３】
以下の実施例は、本発明の更なる理解のために供するものであるが、如何なる意味においても、本発明の有効範囲を制限するためのものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１
合成ｒｈＡＤＡ ｃＤＮＡを有する組換え細菌性クローンの作成
基本的なヒトアデノシンデアミナーゼヌクレオチド（ｒｈＡＤＡ）配列を有するベクター（ｐＥＴ９ｄ−ＨＣＡＤＡ １０９２）は、米国ノースカロライナ州デューク・メディカルセンター（Ｄｕｋｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）のマイク・ハーシュフィールド（Ｍｉｋｅ Ｈｅｒｓｕｆｉｅｌｄ）氏から入手した（ＨＡＤＡ１０９２クローン）。該ｃＤＮＡは、大腸菌Ｋ１２用の標準的な細菌コドン使用法に従う細菌性発現用に最適化されたコドンであり、コドンデータとしては、グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ），Ｒ.ら（1981;「遺伝子発現性のために調整されたゲノム計画におけるコドンカタログの使用法（Ｃｏｄｏｎ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ）」、Nucleic Acid Res.,9:r43-r47）、およびラテ（Ｌａｔｈｅ），Ｒ．（1985；「アミノ酸配列データから推定された合成オリゴヌクレオチドプローブ類：理論的および実践的考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）、J.Mol.Biol.,183:1-12」）によって記載されたものを使用し、ここに参照することによりこれらの文献の全体を本明細書に援用する。次に、対応するＲＮＡ配列に関し、ヘアピン構造もしくはループ形成についての分析を行い、最低遊離エネルギー計算を行い、続いて、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ隣接部位を合成的に挿入し、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社から購入可能）にクローニングできるようにした。ヒトＡＤＡ ｃＤＮＡを有する得られた組換えプラスミドをｐＨＡＤＡｐＥＴ２８ａと名付け、大腸菌のＢＬＲ（λＤＥ３）株（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社）に形質転換し、ｒｈＡＤＡを活発に発現するクローンを作出した。この組換えクローンは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導性プロモーターの制御下にあるｒｈＡＤＡ遺伝子を有しており、ＥＮ７６０と名付けた。ｒｈＡＤＡタンパク質をコードしているコドン最適化ＤＮＡ分子は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に示している。
【００５５】
実施例２
ｒｈＡＤＡを発現するＥＮ７６０クローンの発酵
ＢＬＲ（λＤＥ３）プレート由来のひとつのコロニーは、１０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた５ｍｌの培地（５０ｍｌ管）中に接種した。管は、３７℃／２５０ｒｐｍのシェーカー内で７時間インキュベートし、次に、２５０μｌの培養物を取り出し、新鮮な完全ＬＢ培地２５０ｍｌが入った１Ｌフラスコに接種した。このフラスコは、３７℃／２５０ｒｐｍのシェーカー内で一晩インキュベートした。一晩培養したもの（ＯＤ600＝４．４０１）を取り出し、４．５Ｌの完全ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ（完全：１０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５ｍｌ／Ｌのグリセロール、および１．６８ｍｌ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）を含むＢｉｏＦｌｏ ３０００発酵機（容量５Ｌ；ノース・ブランウスウィック・サイエンティフィック社（Ｎｏｒｔｈ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国ニュージャージー州エジソン）に接種したところ、初期のＯＤ600＝０．２４４５であった。培養物はＯＤ600＝２２．５に達するまで増殖させ（ＥＦＴ ６時間）、５ｍＭのＩＰＴＧで誘導することにより、産生相を開始させた。培養物は、誘導から２時間後（ＯＤ600＝４４）に、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社のＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（７０００ｒｐｍ／４℃／２０分）を用いて回収し、湿細胞重量として２８２ｇを得た。
【００５６】
培地組成
ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈの組成（ＢＤ バイオサイエンシーズ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）社から購入したＤｉｆｃｏ（商標）ＳｅｌｅｃｔＡＰＳ（商標）ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ）
オートクレーブ組成物：
大豆加水分解物 １２．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２４．０ｇ／Ｌ
リン酸二カリウム １１．４ｇ／Ｌ
リン酸一カリウム １．７ｇ／Ｌ
ろ過組成物（添加物）
カナマイシン １０μｇ／ｍｌ
テトラサイクリン １２．５μｇ／ｍｌ
発酵パラメーター：
回転数：１０００ｒｐｍ、温度：３７℃、ｐＨ：７．０、通気：１．５／２．０（誘導）ｖｖｍ、カナマイシン：１０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン：１２．５μｇ／ｍｌ
、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：１．６８ｍｌ／Ｌ
【００５７】
実施例３
合成ｒｂＡＤＡ ｃＤＮＡを有する組換え細菌性クローンの作成
ウシ腸調製物由来の精製成熟ＡＤＡタンパク質は、ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ ７７６３１２：本明細書に参照として援用する）から予測されるＮ末端メチオニンおよび最後の６つのＣ末端残基を欠いた、３５６個のアミノ酸からなるタンパク質である。概説すると、確認済みのポリペプチド配列をバイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）社に提供し、重複オリゴヌクレオチドセグメントの化学合成を含む該社の方法に従い、大腸菌内での発現用に最適化されたコドンを有する新規遺伝子の全合成を行った。バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）法については、米国特許第６，３６６，８６０号明細書に詳細に記載されており、その内容の全てを本明細書に参照として援用する。
【００５８】
ウシＡＤＡの発現については、いくつかの発現系で調べた。例えば、隣接する制限酵素部位であるＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは遺伝子の末端に位置している。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで合成ＤＮＡを切断した後、やはり同じ２種の酵素で切断したプラスミドベクターｐＥＴ−９ｄ（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社）内に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを介して１．１ｋｂの遺伝子を結合させた。組換えプラスミドは、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００をメーカーの指示に従って使用し、電気穿孔法によって大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。形質転換混合物は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。これにより、プラスミドｐＥＴ−９ｄ／ｂＡＤＡ（ｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）と名付けた）を含むコロニーを選択した。ＡＤＡ変異体遺伝子ヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを用い、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒによるＤＮＡ配列分析を行って確認した。さらに、単離したコロニーを培養することによって精製し、ＬＢ培地中でのＩＰＴＧ誘導性遺伝子発現について分析を行った。この分析は、ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）ｐＥＴ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ 第９版に記載されているような標準的な方法に従って行った。時間、温度および誘導物質濃度を含むいくつかの誘導パラメーターについて調べた。好ましい条件は、０．３％のラクトースを用いた、３７℃、１２時間の誘導であり、これによって宿主細菌の細胞質中のＡＤＡ産生が高レベルに達し、細胞総タンパク質の約２０％を占めるまでになった。ＡＤＡ生成物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を行って発現を確認した。
【００５９】
実施例４
実施例３においてｒｂＡＤＡ発現クローンから産生された組換えＡＤＡタンパク質の精製
ｒｂＡＤＡの精製は、エンゾン（Ｅｎｚｏｎ）社によって開発された３クロマトグラフィープロトコールに従って行った。概説すると、−８０℃で保存していた２００ｇの溶解細胞ペースト（バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）社から入手）を２０ｍMのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１８００ｍｌの緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）マイクロプロセッサー、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて１２００ＲＰＭで１０秒間均質化した。この懸濁物をステンレスのメッシュ（網目サイズ２５０μｍ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ．タイラー（Ｔｙｌｅｒ）社）に通し、大きな固まりを除去した。均質な細胞懸濁物は、１５，０００ｐｓｉで３サイクルの微細流動化を行った（装置を氷槽中に入れた）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒを使用、マイクロフルーディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、モデル＃１１０Ｙ、米国マサチューセッツ州ボストン）。微細流動化の最後に、上記の緩衝液２００ｍｌを用いて装置をすすぎ、この溶液を懸濁液とあわせた。細胞溶解物由来の可溶性タンパク質は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって抽出した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は２１００ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は１３．２ｍｇ／ｍｌであった。
【００６０】
この細胞抽出物からヌクレオチド類を除去することを目的として、３１ｍｌの１０％ＰＥＩ溶液を上記の上清に加（ＰＥＩの最終濃度は０．１５％）え、１０分間撹拌することによってよく混合した。細胞抽出物は４℃で一晩保存した。一晩保存したサンプルに生じた沈殿物は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって除去した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。同様に、上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は１９４０ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は３．５３ｍｇ／ｍｌであった。システインの酸化からｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡを保護する操作は、ｐＨ２〜１０において、５〜５０ｍＭの酸化グルタチオンを加えることによって行った。第一カラムへのＡＤＡの結合を補助することを目的として、この細胞抽出物にＰＥＧ４６００をゆっくり加え、さらに、１ＮのＮａＯＨおよび１ＮのＨＣｌを用いてこの細胞抽出物のｐＨを６．５にゆっくりと調整した。この上清については、再度、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離した後（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）、次のカラムにかけた。
【００６１】
細胞抽出物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｂｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｑカラム（カタログ＃１７−５３１６−０１、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ：ＸＫ−５０カラムにベッド容量３５０ｍｌが予め充填されている）にかけた。ＡＤＡの溶出は、始めに６０ｍＭおよび７０ｍＭのＮａＣｌをカラムに流して不純物を除去した後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む平衡緩衝液を用いて行った。溶出プロファイルは、ＡＤＡ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロットおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００６２】
Ｃａｐｔｏ Ｑカラムによる溶出後、２つの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製を続けて行い、タンパク質の純度をさらに上げた。最初に用いたＨＩＣはＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（カタログ＃１７−０９４６−０２、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）である。Ｃａｐｔｏ Ｑカラム由来のＡＤＡフラクションをプールしたものに硫酸アンモニウム粉末を直接加えて（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１．５Ｍに調整し、ｐＨを６．５に調整した。ろ過したサンプル（ナルジーン・ヌンク（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ）社、カタログ＃５４０８８７、ＭＥＭＢ ０．２ＰＥＳを使用、米国ニューヨーク州ロチェスター）を第一のＨＩＣカラムにかけたが、このとき該カラムは、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。ＡＤＡタンパク質は硫酸アンモニウム濃度勾配によって流出させ、この溶出物の純度プロファイルはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。第一のＨＩＣカラムのフラクション中のＡＤＡタンパク質を集め、（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１Ｍに調整し、直接第二のＨＩＣカラム（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌのＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、カタログ＃１７−１０８２−０１、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）にかけたが、該カラムは、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた。ＡＤＡは、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で硫酸アンモニウム濃度を１Ｍ〜３００ｍＭまで変化させた溶液を用いて溶出させた。これらのフラクションのＡＤＡ純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。さらに、精製したｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡは、脱塩し、ＬａｂＳｃａｌｅ（商標）ＴＦＦシステム（メンブレン・バイオマックス５（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＢｉｏＭａｘ ５）、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）内で濃縮した。
【００６３】
実施例５
酸化グルタチオンで処理したｒｈＡＤＡ細胞抽出物の調製
実施例２に従って調製した冷凍細胞を溶解し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む再懸濁用緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。溶解、再懸濁した細胞を均質化し、２５０μのステンレスメッシュに通してろ過し、さらに、１５０００ｐｓｉで３サイクル処理して微細流動化し、完全溶解物を得た。得られた細胞抽出物は、遠心分離して清澄化し、上清の半分を２５ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）（最終濃度）に加えた（ＧＳＳＧは、２００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で２５０ｍＭとなるように調製した貯蔵溶液から調製した）。抽出物の残り半分は、さらに２５ｍＭのＧＳＳＧを加えて処理した後（故に、ＧＳＳＧの総濃度は５０ｍＭ）、更なる処理に供した。次に、両サンプルについて、０．１％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ｐＨ７．４）を用い、４℃で一晩処理した後、遠心分離して核酸およびタンパク質沈殿物を除去し、続いてろ過を行った。次に、清澄サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてさらに処理を行った。細胞抽出物調製の詳細については、以下の表１にまとめた。
【表１】
【００６４】
ＰＥＩ処理による細胞抽出物の清澄化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。ＧＳＳＧによるＡＤＡタンパク質の保護については、逆相ＨＰＬＣカラムで確認した。
【００６５】
実施例６
酸化グルタチオン存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことによるｒｈＡＤＡの精製
上の実施例によって得られた細胞抽出物（１００ｍｌ）を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにかけた（カラムとしては、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗなどを使用できる。ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。２種類の異なるクロマトグラフィーを行い、２５ｍＭのＧＳＳＧ処理細胞抽出物および５０ｍＭのＧＳＳＧ処理細胞抽出物からｒｈＡＤＡを精製した。概説すると、細胞抽出物のｐＨおよび伝導性を１ＮのＮａＯＨを用いてそれぞれ６．５および１．５ｍＳ／ｃｍに調整し、続いて、蒸留水で希釈した。調整済み細胞抽出物の約１００ｍｌ（２５ｍＭのＧＳＳＧで処理したもの）は、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む平衡緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化した２７ｍｌのＤＥＡＥカラムに通した。２ｃｖ（カラム容量）の平衡緩衝液を用いて非特異的結合タンパク質を除去し、ヒトＡＤＡは、上記緩衝液中で調製したＫＣｌの直線濃度勾配（２０ｃｖで２０ｍMまで）を用いて溶出させた。ピークに相当するフラクションを回収し、４〜２０％の還元ゲルで分析し、ヒトＡＤＡを含むフラクションをプールした。タンパク質溶出に続き、ＮａＯＨおよび酢酸を用いてカラムを浄化し、平衡緩衝液で平衡化した後、同様のプロトコールに従い、５０ｍＭのＧＳＳＧ処理細胞抽出物からヒトＡＤＡを精製した。グルタチオン修飾分子種の集積性を保護することを目的として、精製段階では還元剤を使用しなかった。
【００６６】
このクロマトグラフィー法によってその他の不純物から分取したグルタチオンキャップｒｈＡＤＡ（ＧＳ−ｒｈＡＤＡ）は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での流動ピークフラクションによって確認した。ＧＳ−ｒｈＡＤＡのＡＤＡ活性は標準的な酵素アッセイによって確認した。
【００６７】
実施例７
酸化グルタチオンの存在下、クロマトグラフィー法を用いたｒｂＡＤＡの精製
ｒｂＡＤＡの精製は、３クロマトグラフィープロトコールに従って行った。概説すると、−８０℃で保存していた２００ｇの細胞ペースト（実施例４で得られたもの、同上）を溶解し、これを２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ７．４）１８００ｍｌに再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）マイクロプロセッサー、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて１２００ｒｐｍ、１０秒間均質化した。この懸濁液をステンレスメッシュ（網目の大きさ２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ．タイラー（Ｔｙｌｅｒ）社）に通し、大きな固まりを除去した。 均質な細胞懸濁物は、１５，０００ｐｓｉで３サイクルの微細流動化を行った（装置を氷槽中に入れた）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒを使用、マイクロフルーディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、モデル＃１１０Ｙ、米国マサチューセッツ州ボストン）。微細流動化の最後に、上記の緩衝液２００ｍｌを用いて装置をすすぎ、この溶液を懸濁液とあわせた。細胞溶解物由来の可溶性タンパク質は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって抽出した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は２１００ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は１３．２ｍｇ／ｍｌであった。
【００６８】
この細胞抽出物からヌクレオチド類を除去することを目的として、３１ｍｌの１０％ＰＥＩ溶液を上記の上清に加え（ＰＥＩの最終濃度は０．１５％）、１０分間撹拌することによってよく混合した。細胞抽出物は４℃で一晩保存した。一晩保存したサンプルに生じた沈殿物は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって除去した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。同様に、上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は１９４０ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は３．５３ｍｇ／ｍｌであった。
【００６９】
７４番のシステイン（すなわち、Ｎ末端Ｍｅｔが存在する場合には、７５番のシステイン）の保護は、ｐＨ６．５において２５ｍＭの酸化グルタチオンを用いてこのアミノ酸をキャップすることによって行った。ＡＤＡの第一カラムへの結合を補助することを目的として、この細胞抽出物に１０％のＰＥＧ４６００をゆっくり加え、１ＮのＮａＯＨを用いてこの細胞抽出物のｐＨを６．５にゆっくり調整した。この上清について再度４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）後に次のカラムにかけた。
【００７０】
細胞抽出物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｂｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｑカラム（カタログ＃１７−５３１６−０１、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ：ＸＫ−５０カラムにベッド容量３５０ｍｌが予め充填されている）にかけた。ＡＤＡの溶出は、始めに６０ｍＭおよび７０ｍＭのＮａＣｌをカラムに流して不純物を除去した後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む平衡緩衝液を用いて行った。溶出プロファイルは、ＡＤＡ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロットおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００７１】
Ｃａｐｔｏ Ｑカラムによる溶出後、２つの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製を続けて行い、タンパク質の純度をさらに上げた。最初に用いたＨＩＣはＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（カタログ＃１７−０９４６−０２、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）である。Ｃａｐｔｏ Ｑカラム由来のＡＤＡフラクションをプールしたものに硫酸アンモニウム粉末を直接加えて（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１．５Ｍに調整し、ｐＨを６．５に調整した。ろ過したサンプル（ナルジーン・ヌンク（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ）社、カタログ＃５４０８８７、ＭＥＭＢ ０．２ＰＥＳを使用、米国ニューヨーク州ロチェスター）を第一のＨＩＣカラムにかけたが、このとき該カラムは、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。ＡＤＡタンパク質は硫酸アンモニウム濃度勾配によって流出させ、この溶出物の純度プロファイルはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。第一のＨＩＣカラムのフラクション中のＡＤＡタンパク質を集め、（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１Ｍに調整し、直接第二のＨＩＣカラム（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌのＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、カタログ＃１７−１０８２−０１、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）にかけたが、該カラムは、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた。ＡＤＡは、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で硫酸アンモニウム濃度を１Ｍ〜３００ｍＭまで変化させた溶液を用いて溶出させた。これらのフラクションのＡＤＡ純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。さらに、精製したｒｂＡＤＡは、脱塩し、ＬａｂＳｃａｌｅ（商標）ＴＦＦシステム（メンブレン・バイオマックス５（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＢｉｏＭａｘ ５）、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）内で濃縮した。
【００７２】
実施例８
質量分析および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて行った部分精製ｒｈＡＤＡの特性付け
グルタチオン修飾組換えヒトＡＤＡ細胞抽出物は、溶出液として２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡに８０ｍＭのＮａＣｌを加えたもの（ｐＨ６．５）を用い、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ Ｑカラム、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）にかけることによって部分精製を行った。主生成物含有フラクションを液体クロマトグラフィー／質量分析機（ＬＣ／ＭＳ）にかけ、ＡＤＡのグルタチオン付加物の存在について分析した。分析から、クロマトグラフィーグラムの総面積の８５％を占める主ピークの分子量は４０，９４０Ｄａであり、これは、グルタチオン修飾ｒｈＡＤＡの理論的質量に相当することが示された。非修飾ｒｈＡＤＡの微量構成成分を含む数種のその他の不純物が存在しており、それらはクロマトグラムの残り１５％に相当していた。
【００７３】
さらに、実験を行ってグルタチオン濃度がｒｈＡＤＡの修飾度合いに与える影響を調べた。粗細胞抽出物を２つに分け、それぞれ、２５ｍＭおよび５０ｍＭのグルタチオンで処理した。次に、各調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーで部分精製し、ＬＣ／ＭＳで分析した。ＬＣ／ＭＳの結果から、各調製物の主ピークはグルタチオン修飾ｒｈＡＤＡの理論的質量に相当する質量を有していることが示され、そのピーク面積は、クロマトグラムの総面積の８３〜８５％を占めていた。非修飾ｒｈＡＤＡの微量構成成分を含む数種のその他の不純物が存在しており、それらはクロマトグラムの残り１５〜１７％に相当していた。これらの結果から、グルタチオン処理は２５ｍＭおよび５０ｍＭのいずれであっても、効果的にｒｈＡＤＡをグルタチオン修飾ｒｈＡＤＡに転換させることが示唆された。
【００７４】
実施例９
ＩＡＡでキャップしたシステインがｒｈＡＤＡにもたらす保護効果の確認
以下の実験は、ＩＡＡでキャップしたＡＤＡの保護効果を確認することを目的として行った。約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｈＡＤＡは、ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中、３７℃で１６時間、１２５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と反応させた。反応開始後数分間では、ＵＶを用いたＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析計によるサンプル分析から、ｒｈＡＤＡの約７０．９％がＩＡＡでモノ誘導体化され、１７．２％が二カ所において誘導体化されたことが示された。３７℃で２および１６時間インキュベートした後では、クロマトグラフィープロファイルは顕著な変化が見られず、酸化物の生成は示唆されなかったことから、ＩＡＡ誘導体は、ｒｈＡＤＡにおいて一般的である酸化分解路に対して安定であることが示唆された。
【００７５】
ＩＡＡで誘導体化していないｒｈＡＤＡサンプルを用い、同一条件下（３７℃、１６時間、ｐＨ７．４）でインキュベートし、同様に分析を行ったところ、ｒｈＡＤＡタンパク質は、３０％程度が分解して酸化物になった。
【００７６】
故に、ＩＡＡを用いたキャップ化前により、３７℃、ｐＨ７．４において生じる酸化的分解からｒｈＡＤＡは保護された。
【００７７】
実施例１０
グルタチオンを用いてキャップしたシステインがｒｈＡＤＡにもたらす保護効果の確認
ＩＡＡに代わり、通常の生体構成成分である酸化グルタチオンを用いて反応性システインの誘導体化を試みることにした。０．６ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｈＡＤＡは、ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中で２５ｍＭの酸化グルタチオンと反応させた。４、８および１２時間インキュベートした後、ＵＶを用いたＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析計によってサンプルを分析した。ＧＳ−ｒｈＡＤＡで表されるモノ誘導体型が独占的に形成されており、該誘導体は、２５℃で１２時間インキュベート後も安定であった。さらに、モノグルタチオン化ｒｈＡＤＡ化合物の活性は、非誘導体化ｒｈＡＤＡのそれとの差異がほとんど確認できなかった。故に、酸化グルタチオンでｒｈＡＤＡの反応性システインをキャップ化することにより、優先的にモノ誘導体が得られ、これは、非誘導体化ｒｈＡＤＡが酸化的分解を受ける条件下において安定であり、かつ、該誘導体は、ｒｈＡＤＡの非誘導体型の活性と同等のそれを有する。
【００７８】
実施例１１
ＧＳ−ｒｂＡＤＡに関する保護効果の確認
７４番のシステインをグルタチオンでキャップした成熟ｒｂＡＤＡ（ＧＳ−ｒｂＡＤＡ）のサンプルは、リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、安定性試験に使用した。安定性は、２２０ｎｍにおけるＵＶ検出および質量分析計による検出（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦエレクトロスプレー質量分析計）を併用した逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）でモニターした。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ−Ｃ８（Ａｇｉｌｅｎｔ、２５０×４．６ｍｍ、ポアサイズ３００Å、粒子径５ミクロン）
移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水
移動相Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水（８０／２０；ｖ／ｖ）
濃度勾配：時間 移動相Ｂの％
０ ２０
５ ２０
４５ ８０
４６ ２０
６０ ２０
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／分
注入量：５０μＬ
化合物の純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって測定し、安定性試験開始時、および試験開始後４、８および１７日目を含む多数の時間点において測定した。ｒｂＡＤＡおよびＧＳ−ｒｂＡＤＡのサンプルは、本試験開始時において、調製から約２ヶ月が経過しており、既にある程度の分解を受けていたことを特記しておく。しかしながら、本試験の目的遂行に対しては、調査すべき有意味なパラメーターは、試験開始時および２５℃で１７日間インキュベートした後における純度の差である。表１に示すように、試験開始時におけるｒｂＡＤＡの純度は８３．７％であり、１７日後には６６．１％に低下していたことから、この期間中に１７．６％のｒｂＡＤＡが分解したことが示されている。クロマトグラフィーによって分離を示したピークを質量分析したところ、３１．８５１分に溶出し、クロマトグラムの面積の３０．５％を占めている主要分解物は、質量がｒｂＡＤＡのそれより３２Ｄａ大きかった。この質量変化は、ｒｂＡＤＡに２つの酸素が付加し、ｒｂＡＤＡの７４番の遊離システインがスルフィン酸分解物を形成したものと一致している。３２．５３８分に溶出した、分子量のより小さい分解物ピークは、ｒｂＡＤＡに１つの酸素が付加し、ｒｂＡＤＡの７４番の遊離システインがスルフェン酸分解物を形成したものと一致している。ｒｂＡＤＡでは大量の分解が観察されたのとは対照的に、ＧＳ−ｒｂＡＤＡでは、同一条件下で保存した場合に、顕著な分解を示さなかった。その開始時の純度は８１．９％であり、２５℃、１７日後の純度は８７．４％であった。純度の明らかな上昇は、クロマトグラフィーに変化が生じたためと考えられ、このことは、連続する４つの時間点における純度（％）を調べた場合により明かである。ｒｂＡＤＡにおいては、明らかな酸化分解の事実が観察されなかったことから、ｒｂＡＤＡの反応性システインをキャップ化することにより、この分解経路から該酵素が保護されることが示された。これにより、７４番のシステインが、ＡＤＡにおいて生じる酸化的分解の真の要因であることが示された。
【表２】
【関連出願の説明】
【０００１】
本願は、２００７年４月２０日に受理された米国特許出願No.１１／７３８，０１２号の優先権の利益を主張するものであり、また、該特許は、２００６年６月２１日に受理された米国特許出願Ｎｏ．６０／８０５，４１７号の優先権の利益を主張するものである。ここに参照することにより、それぞれの内容の全てを本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、タンパク質の溶液環境にさらされた、１個もしくはそれ以上の酸化可能なシステイン残基を保護またはキャップ化することによって安定化された、アデノシンデアミナーゼ酵素などのタンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００３】
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）または、時には「バブルボーイ」疾患と呼ばれることもある、酵素不全性疾患の治療に使用されている。エンゾンファーマシューティカル社（Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、１５年以上も前から、ウシ起源の酵素を使用し、患者に使用可能なＰＥＧ化ＡＤＡを製造している。
【０００４】
近年、ウシ起源の酵素を組換え起源の酵素（以後、「ｒＡＤＡ」と記す）に置き換えようとする試みがなされている。精製天然ウシＡＤＡの代替品としては、組換えヒトＡＤＡ（「ｒｈＡＤＡ」）および組換えウシＡＤＡ（「ｒｂＡＤＡ」）が考えられている。ｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡは、現在使用されている天然の精製ウシ酵素よりも若干安定性に欠ける。ｒｈＡＤＡおよびｒｂＡＤＡは、システイン分解と同様の方法、すなわち、酸素付加；ジチオール類の生成；ｐＨ上昇に伴う分解増加；特に、ｐＨ上昇およびサンプルの濃縮に伴う沈澱、によって分解すると考えられている。還元状態においては、システインは、分解を担う形態である、反応性ＳＨ基（スルフヒドリル基）を含む。
【０００５】
発明者らは、単一の曝露されたシステインがｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡの両方で観察される分解に関与していることを示唆する事実を見出した。ウシから精製したＡＤＡは、ｒｈＡＤＡと非常に類似した構造を有している。ウシＡＤＡおよびｒｈＡＤＡは、一次配列の同一位置に同一数のシステインを有する。現在入手可能な組換えウシＡＤＡは、システインの反応性と一致する分解物／不純物（ジチオール類）を含んでいる。天然ウシＡＤＡは、組換えウシＡＤＡと構造的に異なっており、後者は１モルのＡＤＡに対して１モルのシステインが結合しており、前者は高ｐＨ条件下で安定であることから、ＡＤＡに結合しているシステインが保護基の役割を果たしていることが示唆される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の事実にもかかわらず、所望する活性化ＰＥＧを用いる場合に、酵素の至適ＰＥＧ化に有用なｐＨレベルにおいて安定、すなわち著しい分解を起こさないｒｂＡＤＡおよびｒｈＡＤＡを提供することには利益がある。例えば、ある種のインターフェロン類など、不安定化に関与する遊離システイン基を有するその他のタンパク質および酵素の安定化にも、同様に利益がある。本発明は、この必要性に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むキャップ化タンパク質を提供し、該残基は、タンパク質が水性媒体中にある場合に、アミノ酸の酸化が阻害されるように選択されたキャップ化剤でキャップされており、それにより、キャップ化タンパク質は、水性媒体中において、キャップされていないものよりも実質的に安定である。アミノ酸は酸化可能なアミノ酸であり、例えば、システイン、トリプトファンまたはメチオニンなどである。キャップ化タンパク質としては、目的の任意のタンパク質を用いることができ、例えば、アデノシンデアミナーゼタンパク質（天然型または組換え発現型のもの）、インターフェロン（βインターフェロン、αインターフェロンおよびγインターフェロンなど）などが挙げられる。好ましくは、アデノシンデアミナーゼは組換えヒトアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２など）または組換えウシアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４など）である。さらに、組換えアデノシンデアミナーゼは、対応するＤＮＡオープンリーディングフレームの理論的翻訳によって示唆された６個のＣ末端残基が欠如している。さらに別の態様においては、対応するＤＮＡオープンリーディングフレームの理論的翻訳によって示唆されたＮ末端Ｍｅｔは、キャップ化タンパク質中に存在する。
【０００８】
本発明に従うキャップ化タンパク質は、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物などのキャップ化剤でキャップされている。
【０００９】
本発明に従うキャップ化タンパク質は、さらに、実質的に非抗原性であるポリマーに共役し、ポリマー複合組換えキャップ化タンパク質を形成するが、そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキシドが挙げられ、ここで、該ポリアルキレンオキシドの分子量は約２，０００〜約１００，０００である。ポリアルキレンオキシドは、リンカー化学物質を介してタンパク質と共役することが好ましく、例えば、スクシンイミジルカルボネート、チアゾリジンチオン、ウレタンおよびアミド系のリンカーなどが挙げられる。ポリアルキレンオキシドが共有結合する部位は、当該分野において共有結合部位として既知であるその他の部位よりも、該システイン安定化組換えヒトアデノシンデアミナーゼ上のＬｙｓのε−アミノ基であることが好ましい。好ましくは、本発明に従うキャップ化タンパク質は、該タンパク質上のＬｙｓのε−アミノ基に少なくとも５本のポリエチレングリコール鎖が結合しており、あるいはまた、該タンパク質上のＬｙｓのε−アミノ酸に約１１〜１８本のＰＥＧ鎖を有する。
【００１０】
さらに、本発明は、組換え発現タンパク質を実質的に不活化させることなく、反応性アミノ酸をキャップ化するのに十分な反応条件下で、水溶液中において、十分量のキャップ化剤で、酸化可能なアミノ酸を含むタンパク質を処理する工程を有してなる、酸化可能なアミノ酸を有するタンパク質の安定化方法を提供する。反応性アミノ酸としては、システインもしくはメチオニン、および／または、当該分野において既知のその他の任意の反応性タンパク質などが挙げられる。タンパク質は、上述したような任意の目的タンパク質を用いることができる。キャップ化剤は、例えば、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物などが挙げられるが、酸化グルタチオンが好ましい。好ましくは、酸化グルタチオンは、約２０〜約１００ｍＭの濃度でタンパク質と反応し、あるいは、酸化グルタチオンは、約２２〜約３０ｍＭの濃度でタンパク質と反応する。
【００１１】
好ましくは、本発明に従う方法は、ｐＨが約６．５〜約８．４である水溶液を含む反応条件で提供される。より具体的には、反応条件には、ｐＨが約７．２〜約７．８である水溶液が含まれる。
【００１２】
好ましい態様においては、水溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓからなる群より選択される緩衝液を含み、それらの濃度は２０〜１５０ｍＭの範囲である。
【００１３】
さらに、本発明の方法は、キャップ化タンパク質−ポリマー複合体を形成するのに十分な条件下、水溶液中でキャップ化タンパク質を活性化ポリマーと反応させる工程を含む。このとき用いる活性化ポリマーとしては、例えば、スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール、チアゾリジンチオン活性化ポリエチレングリコール、および／または、ウレタン結合もしくはアミド結合形成性活性化ポリエチレングリコールなどの活性化ポリエチレングリコールが挙げられ、ここでポリエチレングリコールは、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有することが好ましく、約４，０００〜約４５，０００の分子量を有することがさらに好ましい。
【００１４】
さらに、本発明の方法は、
適切な原核細胞性発現系中でタンパク質を組換え発現させ、
十分量のキャップ化剤を含む細胞抽出溶媒から組換え発現タンパク質を回収し、
それによって組換え発現タンパク質上の酸化可能なアミノ酸が、適切な原核細胞性発現系中の原核細胞から分泌された際に安定化される、
各工程を有してなる、酸化可能なシステインを有する組換え発現タンパク質を安定化する方法を含む。好ましくは、原核細胞性発現系は、組換えアデノシンデアミナーゼを産生できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系であり、さらに、組換え発現タンパク質は、アデノシンデアミナーゼおよび／またはインターフェロンである。
【００１５】
さらに、本発明に従う方法は、目的の酸化可能なタンパク質の安定化誘導体を産生する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）目的の酸化可能なタンパク質を識別する工程であって、前記タンパク質が、水溶液中に存在する場合に、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基において酸化可能であり、
（ｂ）前記目的のタンパク質中の酸化可能なアミノ酸を少なくとも１つを識別し、
（ｃ）前記目的の酸化可能なタンパク質を、酸化可能なアミノ酸の酸化を防ぐように選択したキャップ化剤と反応させる、
各工程を有してなる。
【００１６】
タンパク質は、例えば、アデノシンデアミナーゼまたはインターフェロンであり、酸化可能なアミノ酸は、システインまたはメチオニンであり、キャップ化剤は、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物から選択される。
【００１７】
本発明の更なる態様は、システイン安定化組換えタンパク質、酵素など、ならびに、それらの調製方法を含む。これに関連して好ましい形態は、システイン安定化ｒｂＡＤＡおよび／もしくはｒｈＡＤＡである。それらのポリマー複合体も本発明の実施の形態に含まれる。ポリマーは、ポリアルキレンオキシドが好ましく、例えば、ポリエチレングリコールなどがさらに好ましい。複合体は、キャップ化タンパク質を活性化ポリマーと反応させることによって調製し、そのような活性化ポリマーとしては、例えば、スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール（ＳＣ−ＰＥＧ）、チアゾリジンチオン活性化ポリエチレングリコール（Ｔ−ＰＥＧ）、および／または、ウレタン結合もしくはアミド結合形成性活性化ポリエチレングリコールなどが挙げられる。ＳＣ−ＰＥＧが好ましい。
【００１８】
本発明の更なる態様は、ポリマー複合型または非複合型の安定化酵素を用いた治療方法を包含する。特に、本発明の方法は、ＳＣＩＤまたはその他の酵素不全に関連する状態の治療を目的として、システイン安定化ｒＡＤＡを有効量でそれを必要とする患者に投与する工程を含む。
【００１９】
本発明の目的を遂行するためには、「有効量」とは、当然ながら、所望する臨床効果、すなわち、患者（すなわち、ほ乳類またはヒト）の酵素不全またはＳＣＩＤ状態を軽減、遅延、寛解、あるいは回復するような効果を達成する量を意味するものと理解されたい。
【００２０】
さらに、明細書中で便宜上単数で表している事項については、これに限定しているわけではない。従って、例えば、細胞を含む組成物には、そのような細胞を１つもしくはそれ以上含む組成物が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ａ．概要
広義には、本発明は、安定性が高められたキャップまたは保護タンパク質を提供する。特に、タンパク質が、例えば保管中に溶液中で不安定な性質を表すように、タンパク質の溶液環境下に晒された、１つまたはそれ以上の酸化可能なまたは反応性のシステイン残基を発現したタンパク質を提供する。好ましくは、該タンパク質は組換え産生ＡＤＡ酵素である。
【００２２】
本発明に従ってキャップされうる酸化可能なアミノ酸残基の数は、目的のタンパク質中に存在するそのようなアミノ酸残基の数、および該タンパク質の三次構造中のそれらの位置に応じて決まる。いずれの理論または仮説にも縛られることは意味しないが、タンパク質が水性媒体中に溶解または懸濁されている場合に、溶液に晒された酸化可能なアミノ酸は、酸化を介したタンパク質の分解を最も生じやすいと考えられる。従って、そのようなアミノ酸を識別し、キャップ化することによって、そのようなアミノ酸残基の酸化を阻害し、それにより、キャップされていないタンパク質と比較して、安定性が高められたキャップ化タンパク質を提供する。故に、例えば、キャップされるべき残基は、水性媒体中で不安定な目的のタンパク質の分解生成物を同定し、酸化可能なアミノ酸の存在に対するフラグメント切断の位置を決定することによって決定できる。キャップすべき残基の数は、少なくとも１個から目的のタンパク質の安定化に必要な数まで（例えば、５０個まで、またはそれ以上など）である。さらに詳細には、キャップすべき残基の数は、さらに典型的には１〜約２０個の範囲であり、さらに具体的には、１〜約１０個の範囲である。
【００２３】
本発明は、酸化可能なシステインを有する組換え発現タンパク質を安定化させる方法も提供する。本発明は、組換え発現タンパク質を実質的に不活化することなく、酸化可能なシステインをキャップするのに十分な反応条件下で、酸化可能なシステインを有する組換え発現タンパク質を十分量のキャップ化剤で処理する工程を含む。
【００２４】
当業者においては自明であるように、この態様において「処理する」とは、反応性システインの選択的酸化を進行させながら、該タンパク質の生物学的活性を保護するであろう、適切な緩衝液中で２種類の主要反応物を接触させることにより、組換え発現タンパク質をキャップ化剤と反応させることである。「処理」は、発現後、組換え体産生の様々な段階で行うことができるが、本発明のこの態様では、発現後の精製工程のうちの１つもしくはそれ以上の工程が好ましい。例えば、細胞抽出物由来のＡＤＡタンパク質の初期精製は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤の存在下、陰イオン交換クロマトグラフィーを通すことによって行える。続いて、ＤＴＴを除去する際に、半精製ＡＤＡを十分量のキャップ化剤で処理し、反応性システインを遮断できる。同様の操作は、精製の任意の段階において、あるいは、精製の最後であってＰＥＧ化の前に精製タンパク質を用いて、実施することができる。一旦キャップ化されると、修飾ＡＤＡの安定性を維持するための還元剤は必要ない。
【００２５】
Ｂ．ＡＤＡタンパク質
本発明の特定の好ましい態様では、組換え発現タンパク質は、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡである。より好ましくは、翻訳ｒｈＡＤＡは、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２のアミノ酸配列を有しており、また、翻訳ｒｂＡＤＡは、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４のアミノ酸配列を有している。ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２および４は、予想される成熟翻訳配列であり、Ｎ末端Ｍｅｔ残基の翻訳後切断を反映していることは注目に値する。故に、翻訳された各成熟ＡＤＡタンパク質中では、システイン残基は７４番の位置に存在している。さらに、ウシの腸から単離した天然ウシＡＤＡは、Ｃ末端から翻訳後除去された６残基を有することも注目に値する。本発明の追加的特徴として、ｒｂＡＤＡは、Ｃ末端の６残基を有しない状態で（ムテインとして）発現されるか、または、翻訳後修飾を受け、精製天然ウシＡＤＡには欠けているのと同一の該Ｃ末端残基が除去される。
【００２６】
ウシの腸から単離された天然ウシＡＤＡは多型であることも注目すべきである。故に、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を参照すると、ウシＡＤＡ多型には、例えば、１９８番のリジンの位置にグルタミンが、２４５番のスレオニンの位置にアラニンが、３５１番のグリシンの位置にアルギニンが存在するものなどが含まれる。従って、本発明に従う組換え位置７４番ムテインのウシＡＤＡも、次に示す位置またはそれらと類似の位置の１つもしくはそれ以上の位置でさらなる置換を有する場合がある：１９８番のリジンの代わりにグリシン；２４５番のスレオニンの代わりにアラニン；３５１番のグリシンの代わりにアルギニン。
【００２７】
さらに、ｒｈＡＤＡは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に従い、大腸菌での発現に最適化されたコドンを有するＤＮＡによって発現され、ｒｂＡＤＡは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３に従い、大腸菌での発現に最適化されたコドンを有するＤＮＡによって発現される。適切な発現ベクターは、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡをそれぞれコードしているゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから調製でき、さらに、随意的に、適切に機能発揮できるように接続した誘導性プロモーターの制御下におくことができる。
【００２８】
以下に例示するように、基本ｒｈＡＤＡヌクレオチド配列を含むベクター（ｐＥＴ９ｄ）は、米国ノースカロライナ州デューク・メディカルセンター（Ｄｕｋｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）のマイク・ハーシュフィールド（Ｍｉｋｅ Ｈｅｒｓｕｆｉｅｌｄ）氏から入手した（ＨＡＤＡ１０９２クローン）。次に、ＨＡＤＡ１０９２クローンを細菌発現用に最適化し、誘導性プロモーターの制御下にある適切な発現ベクターに挿入し、ＢＬＲ（λＤＥ３）株に形質転換した。この組換えクローンをＥＮ７６０と名付けた。
【００２９】
同様に、組換えｒｂＡＤＡ発現クローンは、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓプラスミド（ｐ２ＴｒｃＧｒｏ−ＲｏＡＤＡ２−２３）を新鮮な大腸菌ＢＬ２１化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社、カタログ番号６９４４９−４、ロット番号Ｎ６０８３０、遺伝子型Ｆ- ｏｍｐＴ ｈｓｄＳｂ（ｒＢ-ｍＢ-）ｇａｌ ｄｃｍ）に形質転換することによって構築した。このクローンは、Ｒｏｃｈｅ社から提供されたウシＡＤＡ遺伝子および大腸菌ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳシャペロンオペロン（米国特許第６，３６６，８６０号明細書参照）を有するプラスミドｐ２ＴｒｃＧｒｏ−ＲｏＡＤＡ２−２３を含む。この新規形質転換クローンは、ＣＦＢ培地（１０ｇ／Ｌの大豆ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）、２％（ｗ／ｖ）寒天および２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むプレート上、３０℃で培養した。ｒｂＡＤＡの発現はＩＰＴＧで誘導した。
【００３０】
Ｃ．キャップ化剤および反応条件
本発明に従う方法において使用するキャップ化剤としては、酸化グルタチオン（これが好ましい）、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システインおよび当業者において既知のその他のジチオール類、ならびにそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本明細書に記載している方法の反応相中に含まれるキャップ化剤の量および濃度は、使用するキャップ化剤および熟練者の必要性によって異なるが、それらの決定にあたっては、不要な実験を要しない。基本型として酸化グルタチオンを使用する場合には、ｒｈＡＤＡなどの組換えタンパク質と反応させる時の濃度範囲は、約２５μＭ〜約１００ｍＭである。好ましくは、酸化グルタチオンは、約５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度範囲で組換えタンパク質と反応させる。
【００３１】
キャップ化剤と組換えタンパク質との反応中の反応条件としては、さらに、ｐＨ約６．５〜８．４、好ましくは約７．２〜７．８の範囲の水溶液を使用することを含む。加えて、好ましくは、該水溶液は、適切な緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓおよびそれらの混合物を１０〜１５０ｍＭの濃度範囲で含む（コメント：キャップ化は、この濃度範囲外、すなわち、１０ｍＭ未満または１５０ｍＭより高い緩衝液中でも進行する）。さらに、反応条件としては、タンパク質が分解を起こさない温度、すなわち 約４〜３７℃で反応を進行させることを含む。場合によっては、キャップ化はこの温度範囲外、例えば、０〜４℃未満または３７℃より高くても進行する。反応は、反応性システインの安定化が所望する状態に達するまで十分時間行う。単なる例ではあるが、反応は、約５秒〜約８時間（例えば、一晩など）行う。
【００３２】
本発明は、好ましい組換えタンパク質、すなわち、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡについて記載しているが、本明細書中に記載している過程は、不安定性に関与している遊離システイン基を有する任意の組換え調製タンパク質、酵素など（例えば、ある種のインターフェロン類など）を用いて実施できることは明かである。例えば、α、βまたはγインターフェロンは、本明細書記載の方法に従って安定化できる。その他の適切なタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：ヘモグロビン、血清タンパク質（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を含む血液因子など）、免疫グロブリン類、サイトカイン類（インターロイキン類、すなわち、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３など）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、血小板由来増殖因子など）など。生物学的または治療上の関心が高いその他のタンパク質としては、インスリン、植物タンパク質（レシチン類およびリシン類など）、腫瘍壊死因子および関連タンパク質、トランスフォーミング増殖因子などの増殖因子（ＴＧＦαまたはβ、ならびに上皮増殖因子など）、ホルモン類、ソマトメジン類、エリスロポエチン、色素性ホルモン類、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン類、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子などが挙げられる。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤならびにそれらのフラグメントおよびそれらを構築する１本鎖が挙げられる。
【００３３】
酵素としては、炭水化物特異的酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、脱炭酸酵素、異性化酵素およびリガーゼなどが挙げられる。 特定の酵素に限定されるわけではないが、目的の酵素の例としては次のようなものが挙げられる：Ｌ−アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ類、カタラーゼ類、キモトリプシン、リパーゼ類、ウリカーゼ類、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ類およびビリルビンオキシダーゼなど。炭水化物特異的酵素としては、グルコースオキシダーゼ類、グルコシダーゼ類、ガラクトシダーゼ類、グルコセロブロシダーゼ類、グルコウロニダーゼ類などが挙げられる。
【００３４】
上記のリストは、本発明に従う方法を用いて安定化させることが企図されるタンパク質の例示に過ぎない。本明細書で定義されるタンパク質、酵素などは、特別に取り上げたものではなくても、反応性システインを有するものであれば、本発明の方法に含まれることが意図されているものと理解されたい。
【００３５】
本発明の方法を用いた結果として、安定化タンパク質は、反応性システインの位置に、結合したキャップ化基を有する。例えば、グルタチオンまたはその他のキャップ化基は、次に示すように、ジスルフィド結合を介してｒｈＡＤＡに結合する：
ＡＤＡ−Ｓ−Ｓ−グルタチオン
ここで、ＡＤＡの一次配列中の１つのシステインは、１分子のグルタチオンと結合し、以下に示すように、ＡＤＡ Ｃｙｓの−ＳＨがグルタチオンの−ＳＨと反応する：
【化１】
【００３６】
このようなジスルフィド結合は、酸化分解経路に対して安定であり、従って、特にｐＨ７．４の範囲においては、ｒｈＡＤＡをより安定化させる。さらに、ｒｈＡＤＡなどの安定化タンパク質のグルタチオン付加物の分子量は、非安定化型と比較して、使用したキャップ化剤の分子量とほぼ同量分だけ増加する。このことにより、望ましい場合には、所望する付加物の分離が可能である。安定化付加物は、さまざまな物理的および化学的特性を有しており、このことを利用してクロマトグラフィーによる分離および単離もできるであろう。
【００３７】
Ｄ．ポリマー複合体
本発明の別の態様では、システインがキャップ化または安定化された組換えタンパク質を、ポリマー複合体の作出を目的として、適切なポリマーと共役させる。ポリマーの共役は、当業者に既知の反応であるＰＥＧ化反応によって行なわれることが好ましい。概説すると、例えば、システインがキャップ化または安定化されたポリマー複合体が生成するのに十分な条件下、水溶液中でｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡを活性化ポリマーと反応させる。これに関しては、広範な活性化ポリエチレングリコール類を使用でき、それらとしては例えば、米国特許第５，１２２，６１４号、同第５，３２４，８４４号、同第５，６１２，４６０号および同第５，８０８，０９６号（スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール（ＳＣ−ＰＥＧ）および関連する活性化ＰＥＧ類）、同第５，３４９，００１号（環状イミドチオン活性化ＰＥＧ類）、同第５，６５０，２３４号の各明細書に記載されているもの、ならびに当業者において既知のその他のものなどが挙げられる。上述の特許のそれぞれの開示を本明細書中に参照として援用する。ネクター／シェアウォーター／ポリマーズ（Ｎｅｋｔａｒ／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）社から入手可能な活性化ポリマーも参照のこと。活性化ＰＥＧ類は、直線、分岐鎖またはＵ−ＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第５，６０５，９７６号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号および同第６，１１３，９０６号の各明細書に記載されているものなど。これらを本明細書中に参照として援用する）、または分岐鎖誘導体である。さらに、ＰＥＧに基づくポリマーに加え、その他多数のポリアルキレンオキシド類も使用できることが理解されよう。例えば、本発明の複合体は、参照することにより本明細書に援用される、日油株式会社のＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍカタログ第８版（２００６年４月）に記載されている、マルチアームＰＥＧ−ＯＨまたは「スター−ＰＥＧ」生成物を、適切な活性化ポリマーに転換することを含む方法によっても調製でき、その際、前述の米国特許第５，１２２，６１４号または同第第５，８０８，０９６号の各明細書に記載の活性化法を用いる。特に、ＰＥＧは次のような化学式で表される：
【化２】
【００３８】
または
【化３】
【００３９】
ここで、ｕ’は、約４〜約４５５までの整数であり、好ましくは、与えられるポリマーの分子量が約５，０００〜約４０，０００の範囲になるような整数であり；さらに、残基のうち、最大３つまでの末端部位がメチルもしくはその他の低級アルキルでキャップされる。
【００４０】
いくつかの好ましい実施形態では、ＰＥＧのアームの４本全てが適切な離脱基、すなわち、ＳＣなどに転換され、組換えタンパク質に容易に結合できるようになっている。転換前のそのような化合物としては次のようなものが挙げられる：
【化４−１】
【化４−２】
【００４１】
および
【化５】
【００４２】
本発明に従う最も好ましい実施態様では、活性化ポリエチレングリコールはタンパク質とウレタン結合またはアミド結合するものである。
【００４３】
さらに別の態様では、活性化ポリマーとして、立体的に妨害された(hindered)エステル系リンカーを用いることができる。例えば、発明の名称を「立体的に妨害されたエステルに基づく生体分解性リンカーを有するポリアルキレンオキシド類（Ｐｏｌｙａｌｋｙｌｅｎｅ Ｏｘｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｈｉｎｄｅｒｅｄ Ｅｓｔｅｒ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ）」とする米国特許仮出願第６０／８４４，９４２号明細書を参照のこと。参照することにより、その内容を本明細書に援用する。例えば、次のような化合物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：
【化６】
【００４４】
および
【化７】
【００４５】
ここで、「ｕ」は、１０〜約４５５までの整数である。
【００４６】
適切なポリマーは、分子量によって実質的に異なる。通常、平均分子量が約２，０００〜約１００，０００の範囲のポリマーを本発明の目的遂行のために選択する。分子量約４，０００〜約４５，０００のものが好ましく、５，０００〜約１２，０００のものが特に好ましい。
【００４７】
末端にカルボン酸を有するポリマーを高純度で調製する方法については、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書に記載されており、参照することによりその内容を本明細書に援用する。該方法には、最初にポリアルキレンオキシドの四級アルキルエステルを調製し、次に、それらをカルボン酸誘導体に転換する工程を含む。ＰＡＯカルボン酸調製の第一段階には、ポリアルキレンオキシドカルボン酸のｔ−ブチルエステルのような中間体を形成する工程を含む。この中間体は、カリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下、ＰＡＯをｔ−ブチルハロアセテートと反応させることによって生成する。一旦ｔ−ブチルエステル中間体が生成すると、ポリアルキレンオキシドのカルボン酸誘導体は、９２％を超える純度、好ましくは、９７％超える純度、より好ましくは９９％超える純度、最も好ましくは９９．５％超える純度で得られる。 さらに別の態様においては、末端アミノ基を有するポリマーを用いてＡＤＡ複合体を生成できる。末端アミンを有するポリマーの高純度調製法については、米国特許出願第１１／５０８，５０７号および同第１１／５３７，１７２号の各明細書に記載されており、参照することによりそれらの内容を本明細書に援用する。例えば、アジドを有するポリマーをトリフェニルホスフィンなどのホスフィン系還元剤、またはＮａＢＨ4などのアルカリ金属ボロヒドリド還元剤と反応させる。別の方法としては、遊離基を有するポリマーは、保護アミン塩（例えば、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボネートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボネートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ2）など）と反応させ、続いて、保護アミノ基を脱保護する。これらの工程に従って生成された末端アミンを有するポリマーは、約９５％を超える純度、好ましくは９９％を超える純度である。
【００４８】
上掲の米国特許第５，６４３，５７５号明細書のポリマー類によって分岐がもたらされることにより、ひとつの付着点から派生する生物学的活性分子上へのポリマー結合数を増やす方法として、二次的または三次的分岐が可能になる。必要であれば、不要な実験を行うことなく、二官能性結合基に結合できるように、水溶液ポリマーを機能性化できるものと理解されたい。
【００４９】
好ましくは、本明細書において使用するポリマー性基質は、室温で水溶性である。そのようなポリマーとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール類などのホモポリマー類、ポリオキシエチレン化ポリオール類、それらのコポリマー類ならびにそれらのブロックコポリマー類など。このとき、該ブロックコポリマー類の水溶性は維持されている。ｍＰＥＧに加えて、Ｃ1-4アルキル末端ポリマー類も有用である。
【００５０】
ＰＡＯに基づくポリマー類とは別に、有用な非抗原性材料であるデキストラン、ポリビニルピロリドン類、ＨＰＭＡ類（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド類）などのポリアクリルアミド類、ポリビニルアルコール類、炭水化物に基づくポリマー類、それらのコポリマー類なども用いられる。当業者には、上掲の化合物群は単なる例示であり、本明細書に記載している性質を有する全てのポリマー材料が含まれることは明らかであろう。本発明の目的遂行のためには、「実質的に、または実際上は非抗原性である」とは、ほ乳類において非毒性であり、かつ明白な免疫原性応答を誘起しないことが当該分野において確認されている全ての材料を指す。
【００５１】
Ｅ．キャップ化剤を含む細胞抽出培地
本発明の別の態様においては、反応性システインを有する組換え発現タンパク質を安定化させる別の方法を提供する。この方法には、適切な原核細胞性発現系内で組換えによって発現されたタンパク質、および、十分量のキャップ化剤を含む細胞抽出培地から該組換え発現タンパク質を回収する工程が含まれ、それによって、該組換え発現タンパク質上の反応性システインは、適切な原核細胞性発現系内の原核細胞から分泌される際に実質的に安定化される。本発明の第一の態様に従えば、発現される好ましいタンパク質はｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡである。適切な原核細胞性発現系は、ｒｈＡＤＡまたはｒｂＡＤＡを産生できる大腸菌発現系である。
【００５２】
発現ベクター（ｐＥＴ９ｄ）を含むｒｈＡＤＡ ｃＤＮＡは、大腸菌発現株ＢＬ２１（λＤＥ３）に導入し、あるいは、同等の発現ベクターおよび細菌性株の組み合わせにより、ＩＰＴＧ誘導によって細菌内で組換えタンパク質を合成させる。次に、ＥＤＴＡおよび所望する濃度（本明細書においては５〜５０ｍＭ）のキャップ化剤を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中で細胞を溶解させ、発現されたｒｈＡＤＡを含む抽出物を調製する。
【００５３】
以下の実施例は、本発明の更なる理解のために供するものであるが、如何なる意味においても、本発明の有効範囲を制限するためのものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１
合成ｒｈＡＤＡ ｃＤＮＡを有する組換え細菌性クローンの作成
基本的なヒトアデノシンデアミナーゼヌクレオチド（ｒｈＡＤＡ）配列を有するベクター（ｐＥＴ９ｄ−ＨＣＡＤＡ １０９２）は、米国ノースカロライナ州デューク・メディカルセンター（Ｄｕｋｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）のマイク・ハーシュフィールド（Ｍｉｋｅ Ｈｅｒｓｕｆｉｅｌｄ）氏から入手した（ＨＡＤＡ１０９２クローン）。該ｃＤＮＡは、大腸菌Ｋ１２用の標準的な細菌コドン使用法に従う細菌性発現用に最適化されたコドンであり、コドンデータとしては、グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ），Ｒ.ら（1981;「遺伝子発現性のために調整されたゲノム計画におけるコドンカタログの使用法（Ｃｏｄｏｎ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｉｔｙ）」、Nucleic Acid Res.,9:r43-r47）、およびラテ（Ｌａｔｈｅ），Ｒ．（1985；「アミノ酸配列データから推定された合成オリゴヌクレオチドプローブ類：理論的および実践的考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）、J.Mol.Biol.,183:1-12」）によって記載されたものを使用し、ここに参照することによりこれらの文献の全体を本明細書に援用する。次に、対応するＲＮＡ配列に関し、ヘアピン構造もしくはループ形成についての分析を行い、最低遊離エネルギー計算を行い、続いて、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ隣接部位を合成的に挿入し、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社から購入可能）にクローニングできるようにした。ヒトＡＤＡ ｃＤＮＡを有する得られた組換えプラスミドをｐＨＡＤＡｐＥＴ２８ａと名付け、大腸菌のＢＬＲ（λＤＥ３）株（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社）に形質転換し、ｒｈＡＤＡを活発に発現するクローンを作出した。この組換えクローンは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導性プロモーターの制御下にあるｒｈＡＤＡ遺伝子を有しており、ＥＮ７６０と名付けた。ｒｈＡＤＡタンパク質をコードしているコドン最適化ＤＮＡ分子は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に示している。
【００５５】
実施例２
ｒｈＡＤＡを発現するＥＮ７６０クローンの発酵
ＢＬＲ（λＤＥ３）プレート由来のひとつのコロニーは、１０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた５ｍｌの培地（５０ｍｌ管）中に接種した。管は、３７℃／２５０ｒｐｍのシェーカー内で７時間インキュベートし、次に、２５０μｌの培養物を取り出し、新鮮な完全ＬＢ培地２５０ｍｌが入った１Ｌフラスコに接種した。このフラスコは、３７℃／２５０ｒｐｍのシェーカー内で一晩インキュベートした。一晩培養したもの（ＯＤ600＝４．４０１）を取り出し、４．５Ｌの完全ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ（完全：１０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５ｍｌ／Ｌのグリセロール、および１．６８ｍｌ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）を含むＢｉｏＦｌｏ ３０００発酵機（容量５Ｌ；ノース・ブランウスウィック・サイエンティフィック社（Ｎｏｒｔｈ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国ニュージャージー州エジソン）に接種したところ、初期のＯＤ600＝０．２４４５であった。培養物はＯＤ600＝２２．５に達するまで増殖させ（ＥＦＴ ６時間）、５ｍＭのＩＰＴＧで誘導することにより、産生相を開始させた。培養物は、誘導から２時間後（ＯＤ600＝４４）に、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社のＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（７０００ｒｐｍ／４℃／２０分）を用いて回収し、湿細胞重量として２８２ｇを得た。
【００５６】
培地組成
ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈの組成（ＢＤ バイオサイエンシーズ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）社から購入したＤｉｆｃｏ（商標）ＳｅｌｅｃｔＡＰＳ（商標）ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ）
オートクレーブ組成物：
大豆加水分解物 １２．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２４．０ｇ／Ｌ
リン酸二カリウム １１．４ｇ／Ｌ
リン酸一カリウム １．７ｇ／Ｌ
ろ過組成物（添加物）
カナマイシン １０μｇ／ｍｌ
テトラサイクリン １２．５μｇ／ｍｌ
発酵パラメーター：
回転数：１０００ｒｐｍ、温度：３７℃、ｐＨ：７．０、通気：１．５／２．０（誘導）ｖｖｍ、カナマイシン：１０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン：１２．５μｇ／ｍｌ
、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：１．６８ｍｌ／Ｌ
【００５７】
実施例３
合成ｒｂＡＤＡ ｃＤＮＡを有する組換え細菌性クローンの作成
ウシ腸調製物由来の精製成熟ＡＤＡタンパク質は、ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ ７７６３１２：本明細書に参照として援用する）から予測されるＮ末端メチオニンおよび最後の６つのＣ末端残基を欠いた、３５６個のアミノ酸からなるタンパク質である。概説すると、確認済みのポリペプチド配列をバイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）社に提供し、重複オリゴヌクレオチドセグメントの化学合成を含む該社の方法に従い、大腸菌内での発現用に最適化されたコドンを有する新規遺伝子の全合成を行った。バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）法については、米国特許第６，３６６，８６０号明細書に詳細に記載されており、その内容の全てを本明細書に参照として援用する。
【００５８】
ウシＡＤＡの発現については、いくつかの発現系で調べた。例えば、隣接する制限酵素部位であるＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは遺伝子の末端に位置している。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで合成ＤＮＡを切断した後、やはり同じ２種の酵素で切断したプラスミドベクターｐＥＴ−９ｄ（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社）内に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを介して１．１ｋｂの遺伝子を結合させた。組換えプラスミドは、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００をメーカーの指示に従って使用し、電気穿孔法によって大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。形質転換混合物は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。これにより、プラスミドｐＥＴ−９ｄ／ｂＡＤＡ（ｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）と名付けた）を含むコロニーを選択した。ＡＤＡ変異体遺伝子ヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを用い、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒによるＤＮＡ配列分析を行って確認した。さらに、単離したコロニーを培養することによって精製し、ＬＢ培地中でのＩＰＴＧ誘導性遺伝子発現について分析を行った。この分析は、ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）ｐＥＴ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ 第９版に記載されているような標準的な方法に従って行った。時間、温度および誘導物質濃度を含むいくつかの誘導パラメーターについて調べた。好ましい条件は、０．３％のラクトースを用いた、３７℃、１２時間の誘導であり、これによって宿主細菌の細胞質中のＡＤＡ産生が高レベルに達し、細胞総タンパク質の約２０％を占めるまでになった。ＡＤＡ生成物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を行って発現を確認した。
【００５９】
実施例４
実施例３においてｒｂＡＤＡ発現クローンから産生された組換えＡＤＡタンパク質の精製
ｒｂＡＤＡの精製は、エンゾン（Ｅｎｚｏｎ）社によって開発された３クロマトグラフィープロトコールに従って行った。概説すると、−８０℃で保存していた２００ｇの溶解細胞ペースト（バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）社から入手）を２０ｍMのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１８００ｍｌの緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）マイクロプロセッサー、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて１２００ＲＰＭで１０秒間均質化した。この懸濁物をステンレスのメッシュ（網目サイズ２５０μｍ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ．タイラー（Ｔｙｌｅｒ）社）に通し、大きな固まりを除去した。均質な細胞懸濁物は、１５，０００ｐｓｉで３サイクルの微細流動化を行った（装置を氷槽中に入れた）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒを使用、マイクロフルーディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、モデル＃１１０Ｙ、米国マサチューセッツ州ボストン）。微細流動化の最後に、上記の緩衝液２００ｍｌを用いて装置をすすぎ、この溶液を懸濁液とあわせた。細胞溶解物由来の可溶性タンパク質は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって抽出した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は２１００ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は１３．２ｍｇ／ｍｌであった。
【００６０】
この細胞抽出物からヌクレオチド類を除去することを目的として、３１ｍｌの１０％ＰＥＩ溶液を上記の上清に加（ＰＥＩの最終濃度は０．１５％）え、１０分間撹拌することによってよく混合した。細胞抽出物は４℃で一晩保存した。一晩保存したサンプルに生じた沈殿物は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって除去した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。同様に、上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は１９４０ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は３．５３ｍｇ／ｍｌであった。システインの酸化からｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡを保護する操作は、ｐＨ２〜１０において、５〜５０ｍＭの酸化グルタチオンを加えることによって行った。第一カラムへのＡＤＡの結合を補助することを目的として、この細胞抽出物にＰＥＧ４６００をゆっくり加え、さらに、１ＮのＮａＯＨおよび１ＮのＨＣｌを用いてこの細胞抽出物のｐＨを６．５にゆっくりと調整した。この上清については、再度、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離した後（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）、次のカラムにかけた。
【００６１】
細胞抽出物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｂｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｑカラム（カタログ＃１７−５３１６−０１、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ：ＸＫ−５０カラムにベッド容量３５０ｍｌが予め充填されている）にかけた。ＡＤＡの溶出は、始めに６０ｍＭおよび７０ｍＭのＮａＣｌをカラムに流して不純物を除去した後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む平衡緩衝液を用いて行った。溶出プロファイルは、ＡＤＡ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロットおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００６２】
Ｃａｐｔｏ Ｑカラムによる溶出後、２つの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製を続けて行い、タンパク質の純度をさらに上げた。最初に用いたＨＩＣはＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（カタログ＃１７−０９４６−０２、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）である。Ｃａｐｔｏ Ｑカラム由来のＡＤＡフラクションをプールしたものに硫酸アンモニウム粉末を直接加えて（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１．５Ｍに調整し、ｐＨを６．５に調整した。ろ過したサンプル（ナルジーン・ヌンク（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ）社、カタログ＃５４０８８７、ＭＥＭＢ ０．２ＰＥＳを使用、米国ニューヨーク州ロチェスター）を第一のＨＩＣカラムにかけたが、このとき該カラムは、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。ＡＤＡタンパク質は硫酸アンモニウム濃度勾配によって流出させ、この溶出物の純度プロファイルはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。第一のＨＩＣカラムのフラクション中のＡＤＡタンパク質を集め、（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１Ｍに調整し、直接第二のＨＩＣカラム（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌのＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、カタログ＃１７−１０８２−０１、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）にかけたが、該カラムは、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた。ＡＤＡは、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で硫酸アンモニウム濃度を１Ｍ〜３００ｍＭまで変化させた溶液を用いて溶出させた。これらのフラクションのＡＤＡ純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。さらに、精製したｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡは、脱塩し、ＬａｂＳｃａｌｅ（商標）ＴＦＦシステム（メンブレン・バイオマックス５（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＢｉｏＭａｘ ５）、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）内で濃縮した。
【００６３】
実施例５
酸化グルタチオンで処理したｒｈＡＤＡ細胞抽出物の調製
実施例２に従って調製した冷凍細胞を溶解し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む再懸濁用緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。溶解、再懸濁した細胞を均質化し、２５０μのステンレスメッシュに通してろ過し、さらに、１５０００ｐｓｉで３サイクル処理して微細流動化し、完全溶解物を得た。得られた細胞抽出物は、遠心分離して清澄化し、上清の半分を２５ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）（最終濃度）に加えた（ＧＳＳＧは、２００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で２５０ｍＭとなるように調製した貯蔵溶液から調製した）。抽出物の残り半分は、さらに２５ｍＭのＧＳＳＧを加えて処理した後（故に、ＧＳＳＧの総濃度は５０ｍＭ）、更なる処理に供した。次に、両サンプルについて、０．１％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ｐＨ７．４）を用い、４℃で一晩処理した後、遠心分離して核酸およびタンパク質沈殿物を除去し、続いてろ過を行った。次に、清澄サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてさらに処理を行った。細胞抽出物調製の詳細については、以下の表１にまとめた。
【表１】
【００６４】
ＰＥＩ処理による細胞抽出物の清澄化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。ＧＳＳＧによるＡＤＡタンパク質の保護については、逆相ＨＰＬＣカラムで確認した。
【００６５】
実施例６
酸化グルタチオン存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことによるｒｈＡＤＡの精製
上の実施例によって得られた細胞抽出物（１００ｍｌ）を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにかけた（カラムとしては、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗなどを使用できる。ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。２種類の異なるクロマトグラフィーを行い、２５ｍＭのＧＳＳＧ処理細胞抽出物および５０ｍＭのＧＳＳＧ処理細胞抽出物からｒｈＡＤＡを精製した。概説すると、細胞抽出物のｐＨおよび伝導性を１ＮのＮａＯＨを用いてそれぞれ６．５および１．５ｍＳ／ｃｍに調整し、続いて、蒸留水で希釈した。調整済み細胞抽出物の約１００ｍｌ（２５ｍＭのＧＳＳＧで処理したもの）は、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む平衡緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化した２７ｍｌのＤＥＡＥカラムに通した。２ｃｖ（カラム容量）の平衡緩衝液を用いて非特異的結合タンパク質を除去し、ヒトＡＤＡは、上記緩衝液中で調製したＫＣｌの直線濃度勾配（２０ｃｖで２０ｍMまで）を用いて溶出させた。ピークに相当するフラクションを回収し、４〜２０％の還元ゲルで分析し、ヒトＡＤＡを含むフラクションをプールした。タンパク質溶出に続き、ＮａＯＨおよび酢酸を用いてカラムを浄化し、平衡緩衝液で平衡化した後、同様のプロトコールに従い、５０ｍＭのＧＳＳＧ処理細胞抽出物からヒトＡＤＡを精製した。グルタチオン修飾分子種の集積性を保護することを目的として、精製段階では還元剤を使用しなかった。
【００６６】
このクロマトグラフィー法によってその他の不純物から分取したグルタチオンキャップｒｈＡＤＡ（ＧＳ−ｒｈＡＤＡ）は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での流動ピークフラクションによって確認した。ＧＳ−ｒｈＡＤＡのＡＤＡ活性は標準的な酵素アッセイによって確認した。
【００６７】
実施例７
酸化グルタチオンの存在下、クロマトグラフィー法を用いたｒｂＡＤＡの精製
ｒｂＡＤＡの精製は、３クロマトグラフィープロトコールに従って行った。概説すると、−８０℃で保存していた２００ｇの細胞ペースト（実施例４で得られたもの、同上）を溶解し、これを２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ７．４）１８００ｍｌに再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）マイクロプロセッサー、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて１２００ｒｐｍ、１０秒間均質化した。この懸濁液をステンレスメッシュ（網目の大きさ２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ．タイラー（Ｔｙｌｅｒ）社）に通し、大きな固まりを除去した。 均質な細胞懸濁物は、１５，０００ｐｓｉで３サイクルの微細流動化を行った（装置を氷槽中に入れた）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒを使用、マイクロフルーディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、モデル＃１１０Ｙ、米国マサチューセッツ州ボストン）。微細流動化の最後に、上記の緩衝液２００ｍｌを用いて装置をすすぎ、この溶液を懸濁液とあわせた。細胞溶解物由来の可溶性タンパク質は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって抽出した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は２１００ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は１３．２ｍｇ／ｍｌであった。
【００６８】
この細胞抽出物からヌクレオチド類を除去することを目的として、３１ｍｌの１０％ＰＥＩ溶液を上記の上清に加え（ＰＥＩの最終濃度は０．１５％）、１０分間撹拌することによってよく混合した。細胞抽出物は４℃で一晩保存した。一晩保存したサンプルに生じた沈殿物は、４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離することによって除去した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）。同様に、上清を注意深く回収し、不要な混入が生じないようにした。得られた上清の量は１９４０ｍｌであり、ＢＣＡ法で求めた総タンパク質濃度は３．５３ｍｇ／ｍｌであった。
【００６９】
７４番のシステイン（すなわち、Ｎ末端Ｍｅｔが存在する場合には、７５番のシステイン）の保護は、ｐＨ６．５において２５ｍＭの酸化グルタチオンを用いてこのアミノ酸をキャップすることによって行った。ＡＤＡの第一カラムへの結合を補助することを目的として、この細胞抽出物に１０％のＰＥＧ４６００をゆっくり加え、１ＮのＮａＯＨを用いてこの細胞抽出物のｐＨを６．５にゆっくり調整した。この上清について再度４℃、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で６０分間遠心分離した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１を使用、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、ローター＃ＪＬＡ８．１０００）後に次のカラムにかけた。
【００７０】
細胞抽出物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｂｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｑカラム（カタログ＃１７−５３１６−０１、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ：ＸＫ−５０カラムにベッド容量３５０ｍｌが予め充填されている）にかけた。ＡＤＡの溶出は、始めに６０ｍＭおよび７０ｍＭのＮａＣｌをカラムに流して不純物を除去した後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む平衡緩衝液を用いて行った。溶出プロファイルは、ＡＤＡ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロットおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００７１】
Ｃａｐｔｏ Ｑカラムによる溶出後、２つの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製を続けて行い、タンパク質の純度をさらに上げた。最初に用いたＨＩＣはＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（カタログ＃１７−０９４６−０２、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）である。Ｃａｐｔｏ Ｑカラム由来のＡＤＡフラクションをプールしたものに硫酸アンモニウム粉末を直接加えて（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１．５Ｍに調整し、ｐＨを６．５に調整した。ろ過したサンプル（ナルジーン・ヌンク（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ）社、カタログ＃５４０８８７、ＭＥＭＢ ０．２ＰＥＳを使用、米国ニューヨーク州ロチェスター）を第一のＨＩＣカラムにかけたが、このとき該カラムは、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。ＡＤＡタンパク質は硫酸アンモニウム濃度勾配によって流出させ、この溶出物の純度プロファイルはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。第一のＨＩＣカラムのフラクション中のＡＤＡタンパク質を集め、（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を１Ｍに調整し、直接第二のＨＩＣカラム（ＸＫ−５０カラムにベッド容量１５０ｍｌのＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰが予め充填されている：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、カタログ＃１７−１０８２−０１、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）にかけたが、該カラムは、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で予め平衡化しておいた。ＡＤＡは、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で硫酸アンモニウム濃度を１Ｍ〜３００ｍＭまで変化させた溶液を用いて溶出させた。これらのフラクションのＡＤＡ純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。さらに、精製したｒｂＡＤＡは、脱塩し、ＬａｂＳｃａｌｅ（商標）ＴＦＦシステム（メンブレン・バイオマックス５（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＢｉｏＭａｘ ５）、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）内で濃縮した。
【００７２】
実施例８
質量分析および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて行った部分精製ｒｈＡＤＡの特性付け
グルタチオン修飾組換えヒトＡＤＡ細胞抽出物は、溶出液として２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡに８０ｍＭのＮａＣｌを加えたもの（ｐＨ６．５）を用い、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ Ｑカラム、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）にかけることによって部分精製を行った。主生成物含有フラクションを液体クロマトグラフィー／質量分析機（ＬＣ／ＭＳ）にかけ、ＡＤＡのグルタチオン付加物の存在について分析した。分析から、クロマトグラフィーグラムの総面積の８５％を占める主ピークの分子量は４０，９４０Ｄａであり、これは、グルタチオン修飾ｒｈＡＤＡの理論的質量に相当することが示された。非修飾ｒｈＡＤＡの微量構成成分を含む数種のその他の不純物が存在しており、それらはクロマトグラムの残り１５％に相当していた。
【００７３】
さらに、実験を行ってグルタチオン濃度がｒｈＡＤＡの修飾度合いに与える影響を調べた。粗細胞抽出物を２つに分け、それぞれ、２５ｍＭおよび５０ｍＭのグルタチオンで処理した。次に、各調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーで部分精製し、ＬＣ／ＭＳで分析した。ＬＣ／ＭＳの結果から、各調製物の主ピークはグルタチオン修飾ｒｈＡＤＡの理論的質量に相当する質量を有していることが示され、そのピーク面積は、クロマトグラムの総面積の８３〜８５％を占めていた。非修飾ｒｈＡＤＡの微量構成成分を含む数種のその他の不純物が存在しており、それらはクロマトグラムの残り１５〜１７％に相当していた。これらの結果から、グルタチオン処理は２５ｍＭおよび５０ｍＭのいずれであっても、効果的にｒｈＡＤＡをグルタチオン修飾ｒｈＡＤＡに転換させることが示唆された。
【００７４】
実施例９
ＩＡＡでキャップしたシステインがｒｈＡＤＡにもたらす保護効果の確認
以下の実験は、ＩＡＡでキャップしたＡＤＡの保護効果を確認することを目的として行った。約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｈＡＤＡは、ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中、３７℃で１６時間、１２５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と反応させた。反応開始後数分間では、ＵＶを用いたＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析計によるサンプル分析から、ｒｈＡＤＡの約７０．９％がＩＡＡでモノ誘導体化され、１７．２％が二カ所において誘導体化されたことが示された。３７℃で２および１６時間インキュベートした後では、クロマトグラフィープロファイルは顕著な変化が見られず、酸化物の生成は示唆されなかったことから、ＩＡＡ誘導体は、ｒｈＡＤＡにおいて一般的である酸化分解路に対して安定であることが示唆された。
【００７５】
ＩＡＡで誘導体化していないｒｈＡＤＡサンプルを用い、同一条件下（３７℃、１６時間、ｐＨ７．４）でインキュベートし、同様に分析を行ったところ、ｒｈＡＤＡタンパク質は、３０％程度が分解して酸化物になった。
【００７６】
故に、ＩＡＡを用いたキャップ化前により、３７℃、ｐＨ７．４において生じる酸化的分解からｒｈＡＤＡは保護された。
【００７７】
実施例１０
グルタチオンを用いてキャップしたシステインがｒｈＡＤＡにもたらす保護効果の確認
ＩＡＡに代わり、通常の生体構成成分である酸化グルタチオンを用いて反応性システインの誘導体化を試みることにした。０．６ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｈＡＤＡは、ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液中で２５ｍＭの酸化グルタチオンと反応させた。４、８および１２時間インキュベートした後、ＵＶを用いたＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析計によってサンプルを分析した。ＧＳ−ｒｈＡＤＡで表されるモノ誘導体型が独占的に形成されており、該誘導体は、２５℃で１２時間インキュベート後も安定であった。さらに、モノグルタチオン化ｒｈＡＤＡ化合物の活性は、非誘導体化ｒｈＡＤＡのそれとの差異がほとんど確認できなかった。故に、酸化グルタチオンでｒｈＡＤＡの反応性システインをキャップ化することにより、優先的にモノ誘導体が得られ、これは、非誘導体化ｒｈＡＤＡが酸化的分解を受ける条件下において安定であり、かつ、該誘導体は、ｒｈＡＤＡの非誘導体型の活性と同等のそれを有する。
【００７８】
実施例１１
ＧＳ−ｒｂＡＤＡに関する保護効果の確認
７４番のシステインをグルタチオンでキャップした成熟ｒｂＡＤＡ（ＧＳ−ｒｂＡＤＡ）のサンプルは、リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、安定性試験に使用した。安定性は、２２０ｎｍにおけるＵＶ検出および質量分析計による検出（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦエレクトロスプレー質量分析計）を併用した逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）でモニターした。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ−Ｃ８（Ａｇｉｌｅｎｔ、２５０×４．６ｍｍ、ポアサイズ３００Å、粒子径５ミクロン）
移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水
移動相Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水（８０／２０；ｖ／ｖ）
濃度勾配：時間 移動相Ｂの％
０ ２０
５ ２０
４５ ８０
４６ ２０
６０ ２０
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／分
注入量：５０μＬ
化合物の純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって測定し、安定性試験開始時、および試験開始後４、８および１７日目を含む多数の時間点において測定した。ｒｂＡＤＡおよびＧＳ−ｒｂＡＤＡのサンプルは、本試験開始時において、調製から約２ヶ月が経過しており、既にある程度の分解を受けていたことを特記しておく。しかしながら、本試験の目的遂行に対しては、調査すべき有意味なパラメーターは、試験開始時および２５℃で１７日間インキュベートした後における純度の差である。表１に示すように、試験開始時におけるｒｂＡＤＡの純度は８３．７％であり、１７日後には６６．１％に低下していたことから、この期間中に１７．６％のｒｂＡＤＡが分解したことが示されている。クロマトグラフィーによって分離を示したピークを質量分析したところ、３１．８５１分に溶出し、クロマトグラムの面積の３０．５％を占めている主要分解物は、質量がｒｂＡＤＡのそれより３２Ｄａ大きかった。この質量変化は、ｒｂＡＤＡに２つの酸素が付加し、ｒｂＡＤＡの７４番の遊離システインがスルフィン酸分解物を形成したものと一致している。３２．５３８分に溶出した、分子量のより小さい分解物ピークは、ｒｂＡＤＡに１つの酸素が付加し、ｒｂＡＤＡの７４番の遊離システインがスルフェン酸分解物を形成したものと一致している。ｒｂＡＤＡでは大量の分解が観察されたのとは対照的に、ＧＳ−ｒｂＡＤＡでは、同一条件下で保存した場合に、顕著な分解を示さなかった。その開始時の純度は８１．９％であり、２５℃、１７日後の純度は８７．４％であった。純度の明らかな上昇は、クロマトグラフィーに変化が生じたためと考えられ、このことは、連続する４つの時間点における純度（％）を調べた場合により明かである。ｒｂＡＤＡにおいては、明らかな酸化分解の事実が観察されなかったことから、ｒｂＡＤＡの反応性システインをキャップ化することにより、この分解経路から該酵素が保護されることが示された。これにより、７４番のシステインが、ＡＤＡにおいて生じる酸化的分解の真の要因であることが示された。
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャップ化剤に結合している少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、キャップ化タンパク質であって、
前記キャップ化タンパク質が、水性溶媒中において、同等の非キャップ化タンパク質よりも実質的に安定であり、
結合しているアミノ酸残基は酸化可能なアミノ酸であり、キャップ化剤は、前記アミノ酸の酸化を阻害するように選択されることを特徴とする、
キャップ化タンパク質。
【請求項２】
前記酸化可能なアミノ酸が、システイン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基およびそれらの組合わせからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載のキャップ化タンパク質。
【請求項３】
前記キャップ化タンパク質が、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはインターフェロンであることを特徴とする請求項１記載のキャップ化タンパク質。
【請求項４】
前記アデノシンデアミナーゼが、組換えヒトアデノシンデアミナーゼおよび組換えウシアデノシンデアミナーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項３記載のキャップ化タンパク質。
【請求項５】
前記組換えヒトアデノシンデアミナーゼが、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２を含んでおり、
前記組換えウシアデノシンデアミナーゼが、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を含んでいる、
ことを特徴とする請求項４記載のキャップ化タンパク質。
【請求項６】
ウシアデノシンデアミナーゼのＣ末端の６残基が欠如していることを特徴とする請求項５記載のキャップ化タンパク質。
【請求項７】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載のキャップ化タンパク質。
【請求項８】
実質的に非抗原性のポリマーと共役し、ポリマー複合キャップ化タンパク質を形成することを特徴とする請求項４記載のキャップ化タンパク質。
【請求項９】
前記ポリマーが、ポリアルキレンオキシドであることを特徴とする請求項８記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１０】
前記ポリアルキレンオキシドが、分子量約２，０００〜約１００，０００の大きさの範囲であることを特徴とする請求項９記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１１】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項９記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコールが、スクシンイミジルカルボネート、チアゾリジンチオン、ウレタンおよびアミド系リンカーからなる群より選択されるリンカー化学物質を介して前記タンパク質に共役していることを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールが、前記キャップ化タンパク質のＬｙｓのε−アミノ基に共有結合していることを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が、前記キャップ化タンパク質のＬｙｓのε−アミノ基に結合している、少なくとも５本のポリエチレングリコール鎖を有することを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化組換え発現タンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質が、前記キャップ化タンパク質のＬｙｓのεアミノ基に結合している、約１１〜１８本のＰＥＧ鎖を有することを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化組換え発現タンパク質。
【請求項１６】
少なくとも１つの酸化可能なアミノ酸を有するタンパク質をキャップ化する方法であって、
タンパク質を実質的に不活化せずに、酸化可能なアミノ酸をキャップするのに十分な反応条件下で、前記酸化可能なアミノ酸を含むタンパク質を、十分量のキャップ化剤で処理し、安定化タンパク質を得る、
工程を有してなる方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が、組換えヒトアデノシンデアミナーゼおよび組換えウシアデノシンデアミナーゼからなる群より選択される、組換えアデノシンデアミナーゼであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記組換えヒトアデノシンデアミナーゼが、キャップ前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２を含、み、
前記組換えウシアデノシンデアミナーゼが、キャップ前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を含む、
ことを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオンであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記酸化グルタチオンを、約２０〜約１００ｍＭの濃度でタンパク質と反応させることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記酸化グルタチオンを、約２２〜約３０ｍＭの濃度でタンパク質と反応させることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記反応条件が、ｐＨが約６．５〜約８．４の水溶液を含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
前記反応条件が、ｐＨが約７．２〜約７．８の水溶液含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記水溶液が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓからなる群より選択される緩衝液を、２０〜１５０ｍＭの濃度範囲で含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記水溶液中における前記キャップ化タンパク質を、キャップ化タンパク質−ポリマー複合体を形成するのに十分な条件下で、活性化ポリマーと反応させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２７】
前記活性化ポリマーが、活性化ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記活性化ポリエチレングリコールが、スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール、チアゾリジンチオン活性化ポリエチレングリコール、ならびに、ウレタン結合もしくはアミド結合形成活性化ポリエチレングリコールからなる群より選択されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリエチレングリコールが、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリエチレングリコールが、約４，０００〜約４５，０００の分子量を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質がインターフェロンであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項３２】
前記インターフェロンが、βインターフェロン、αインターフェロンおよびγインターフェロンからなる群より選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
反応性システインを有する組換え発現タンパク質を安定化する方法であって、
適切な原核細胞性発現系内でタンパク質を組換え発現させ、
十分量のキャップ化剤を含む細胞抽出培地から前記組換え発現タンパク質を回収する、
各工程を有してなり、
それによって、前記組換え発現タンパク質上の前記反応性システインが、前記適切な原核細胞性発現系内で前記原核細胞から分泌される際に安定化されることを特徴とする、
方法。
【請求項３４】
前記原核細胞性発現系が、組換えアデノシンデアミナーゼを産生可能な大腸菌発現系であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記組換え発現タンパク質が、アデノシンデアミナーゼおよびインターフェロンからなる群より選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記組換え発現アデノシンデアミナーゼが、キャップ化前に、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２またはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４のアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記キャップ化剤が酸化グルタチオンであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞抽出培地中の前記グルタチオンが、約２０〜約１００ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞抽出培地中の前記グルタチオンが、約２０〜約５０ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞抽出培地が、ｐＨが７．４において、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１．０ｍＭのＥＤＴＡを含むことを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
ほ乳類におけるアデノシンデアミナーゼが介在する病状を治療する方法であって、
請求項１５に記載のポリマー複合キャップ化組換え発現アデノシンデアミナーゼを、有効量で投与する工程を有してなる方法。
【請求項４３】
前記アデノシンデアミナーゼが介在する病状が、重症複合型免疫不全症であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
目的の酸化可能なタンパク質の安定誘導体の生成方法であって、
（ａ）前記目的とする酸化可能なタンパク質を識別する工程であって、前記タンパク質が水溶液中に存在する場合に、前記タンパク質が、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基位置において酸化可能である工程と、
（ｂ）前記目的とするタンパク質中の少なくとも１つの酸化可能なアミノ酸を識別する工程と、
（ｃ）前記目的とする酸化可能なタンパク質を、前記酸化可能なアミノ酸の酸化を防ぐように選択されたキャップ化剤と反応させる工程と、
を有してなる方法。
【請求項４５】
前記タンパク質が、アデノシンデアミナーゼまたはインターフェロンであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記酸化可能なアミノ酸はシステインであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記反応条件が、ｐＨ約６．５の水溶液を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項１】
キャップ化剤に結合している少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、キャップ化タンパク質であって、
前記キャップ化タンパク質が、水性溶媒中において、同等の非キャップ化タンパク質よりも実質的に安定であり、
結合しているアミノ酸残基は酸化可能なアミノ酸であり、キャップ化剤は、前記アミノ酸の酸化を阻害するように選択されることを特徴とする、
キャップ化タンパク質。
【請求項２】
前記酸化可能なアミノ酸が、システイン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基およびそれらの組合わせからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載のキャップ化タンパク質。
【請求項３】
前記キャップ化タンパク質が、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはインターフェロンであることを特徴とする請求項１記載のキャップ化タンパク質。
【請求項４】
前記アデノシンデアミナーゼが、組換えヒトアデノシンデアミナーゼおよび組換えウシアデノシンデアミナーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項３記載のキャップ化タンパク質。
【請求項５】
前記組換えヒトアデノシンデアミナーゼが、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２を含んでおり、
前記組換えウシアデノシンデアミナーゼが、キャップ化前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を含んでいる、
ことを特徴とする請求項４記載のキャップ化タンパク質。
【請求項６】
ウシアデノシンデアミナーゼのＣ末端の６残基が欠如していることを特徴とする請求項５記載のキャップ化タンパク質。
【請求項７】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載のキャップ化タンパク質。
【請求項８】
実質的に非抗原性のポリマーと共役し、ポリマー複合キャップ化タンパク質を形成することを特徴とする請求項４記載のキャップ化タンパク質。
【請求項９】
前記ポリマーが、ポリアルキレンオキシドであることを特徴とする請求項８記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１０】
前記ポリアルキレンオキシドが、分子量約２，０００〜約１００，０００の大きさの範囲であることを特徴とする請求項９記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１１】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項９記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコールが、スクシンイミジルカルボネート、チアゾリジンチオン、ウレタンおよびアミド系リンカーからなる群より選択されるリンカー化学物質を介して前記タンパク質に共役していることを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールが、前記キャップ化タンパク質のＬｙｓのε−アミノ基に共有結合していることを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化タンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が、前記キャップ化タンパク質のＬｙｓのε−アミノ基に結合している、少なくとも５本のポリエチレングリコール鎖を有することを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化組換え発現タンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質が、前記キャップ化タンパク質のＬｙｓのεアミノ基に結合している、約１１〜１８本のＰＥＧ鎖を有することを特徴とする請求項１１記載のポリマー複合キャップ化組換え発現タンパク質。
【請求項１６】
少なくとも１つの酸化可能なアミノ酸を有するタンパク質をキャップ化する方法であって、
タンパク質を実質的に不活化せずに、酸化可能なアミノ酸をキャップするのに十分な反応条件下で、前記酸化可能なアミノ酸を含むタンパク質を、十分量のキャップ化剤で処理し、安定化タンパク質を得る、
工程を有してなる方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が、組換えヒトアデノシンデアミナーゼおよび組換えウシアデノシンデアミナーゼからなる群より選択される、組換えアデノシンデアミナーゼであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記組換えヒトアデノシンデアミナーゼが、キャップ前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２を含、み、
前記組換えウシアデノシンデアミナーゼが、キャップ前にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を含む、
ことを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオンであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記酸化グルタチオンを、約２０〜約１００ｍＭの濃度でタンパク質と反応させることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記酸化グルタチオンを、約２２〜約３０ｍＭの濃度でタンパク質と反応させることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記反応条件が、ｐＨが約６．５〜約８．４の水溶液を含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
前記反応条件が、ｐＨが約７．２〜約７．８の水溶液含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記水溶液が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓからなる群より選択される緩衝液を、２０〜１５０ｍＭの濃度範囲で含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記水溶液中における前記キャップ化タンパク質を、キャップ化タンパク質−ポリマー複合体を形成するのに十分な条件下で、活性化ポリマーと反応させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２７】
前記活性化ポリマーが、活性化ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記活性化ポリエチレングリコールが、スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール、チアゾリジンチオン活性化ポリエチレングリコール、ならびに、ウレタン結合もしくはアミド結合形成活性化ポリエチレングリコールからなる群より選択されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリエチレングリコールが、約２，０００〜約１００，０００の分子量を有することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリエチレングリコールが、約４，０００〜約４５，０００の分子量を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質がインターフェロンであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項３２】
前記インターフェロンが、βインターフェロン、αインターフェロンおよびγインターフェロンからなる群より選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
反応性システインを有する組換え発現タンパク質を安定化する方法であって、
適切な原核細胞性発現系内でタンパク質を組換え発現させ、
十分量のキャップ化剤を含む細胞抽出培地から前記組換え発現タンパク質を回収する、
各工程を有してなり、
それによって、前記組換え発現タンパク質上の前記反応性システインが、前記適切な原核細胞性発現系内で前記原核細胞から分泌される際に安定化されることを特徴とする、
方法。
【請求項３４】
前記原核細胞性発現系が、組換えアデノシンデアミナーゼを産生可能な大腸菌発現系であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記組換え発現タンパク質が、アデノシンデアミナーゼおよびインターフェロンからなる群より選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記組換え発現アデノシンデアミナーゼが、キャップ化前に、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２またはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４のアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記キャップ化剤が酸化グルタチオンであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞抽出培地中の前記グルタチオンが、約２０〜約１００ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞抽出培地中の前記グルタチオンが、約２０〜約５０ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞抽出培地が、ｐＨが７．４において、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓおよび１．０ｍＭのＥＤＴＡを含むことを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
ほ乳類におけるアデノシンデアミナーゼが介在する病状を治療する方法であって、
請求項１５に記載のポリマー複合キャップ化組換え発現アデノシンデアミナーゼを、有効量で投与する工程を有してなる方法。
【請求項４３】
前記アデノシンデアミナーゼが介在する病状が、重症複合型免疫不全症であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
目的の酸化可能なタンパク質の安定誘導体の生成方法であって、
（ａ）前記目的とする酸化可能なタンパク質を識別する工程であって、前記タンパク質が水溶液中に存在する場合に、前記タンパク質が、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基位置において酸化可能である工程と、
（ｂ）前記目的とするタンパク質中の少なくとも１つの酸化可能なアミノ酸を識別する工程と、
（ｃ）前記目的とする酸化可能なタンパク質を、前記酸化可能なアミノ酸の酸化を防ぐように選択されたキャップ化剤と反応させる工程と、
を有してなる方法。
【請求項４５】
前記タンパク質が、アデノシンデアミナーゼまたはインターフェロンであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記酸化可能なアミノ酸はシステインであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記キャップ化剤が、酸化グルタチオン、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、システイン、その他のジチオール類およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記反応条件が、ｐＨ約６．５の水溶液を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【公表番号】特表２０１０−５００９６３（Ｐ２０１０−５００９６３Ａ）
【公表日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１６６２３（Ｐ２００９−５１６６２３）
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４９６８６
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５０５３５４８９９）エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド (28)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４９６８６
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５０５３５４８９９）エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド (28)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]