微生物反応及び酵素反応によってアザイド糖を製造する方法
【課題】クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する細菌の提供。
【解決手段】ヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物。さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有する上記のクレブジエラ属微生物。及び、同微生物が産生する、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素。６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドース異性化酵素。
【解決手段】ヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物。さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有する上記のクレブジエラ属微生物。及び、同微生物が産生する、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素。６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドース異性化酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、６-アザイド・ヘキシトールから６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物、該微生物由来の６-アザイド・ポリオール脱水素酵素または６-アザイド・アルドース異性化酵素、該酵素を用いる、６-アザイドケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースの製造法、ならびに、それらを原料とする各種アザイド糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「クリックケミストリー」は、シートベルトのように「カチッ」と音のした瞬間にベルトが結合するたとえ、すなわち簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることのできるシンプルな化学という意味である。
クリックケミストリーの特徴として、あらかじめ結合させたい場所に、例えばアジドおよびアセチレンをそれぞれ有する反応基を合成しておけば、副反応なしにその場所選択的に結合することができる（ここではトリアゾールが生成する）。そのため一度に多種類の化合物を得ることのできる組み合わせ合成への応用も可能であり、多様な化合物への簡便な変換反応と言い換えることができる。またクリックケミストリーは副生成物を出さないため、環境面も考慮した実用的な網羅的化学合成の概念を築くものである。したがって反応全体を通して信頼性が高く、容易な反応であるがゆえに幅広い汎用性が認められるのである。
最近開発されたクリックケミストリーを介したポリマー材料について、銅触媒による１，３−双極性付加環化によって多価アジドおよびアルキンが架橋ポリマー網目構造中に組み込まれる場合に、接着性ポリマーが形成される。金属表面から浸出するか、モノマー混合物に加えられるかのいずれかであるＣｕイオンによって、この縮合重合が効率的に促進され、複数のトリアゾール結合要素が生成されることによって金属表面との強い相互作用が得られること、この接着性ポリマーは、接着性ポリマーコーティングとして、または接着性ポリマー接合剤として形成することができることが示されている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５０７４０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
アザイド化合物（アジト化合物ともいう）は各種有用な有機化学物質を合成するのに非常に重要な物質であり、クリックケミストリーとして比較的単純な部分構造同士を、高い反応性・選択性を持った炭素−ヘテロ原子結合反応によって結びつけることで、新たな機能性分子を創出することに利用価値の高い物質である。
【０００５】
６-アザイト糖は窒素Nを含む化合物の合成に有用であり、一般に化１のような構造で示される。
【化１】
【０００６】
本発明においては、Ｒは単糖であり、ガラクチトール、ガラクトース、タガトースの６位にアザイドが結合したものである。これらの物質は有機合成によっては相互の転換が困難なものが多く、本発明における生産物である６-アザイド Ｌ-ガラクトースおよび６-アザイド Ｌ-タガトースは有機化学的反応によっては生産することが困難な物質である。
【０００７】
本発明は、微生物反応によって、６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・ケトース、さらにはそれらを原料とする各種アザイド糖を提供することを目的とする。
また、本発明は、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌の新規な機能を見いだし、その発見に基づき６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を、さらに６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を利用することを目的とする。
すなわち、本発明は、アザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有するクレブジエラ属微生物を提供することを目的とする。
また、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素、およびアザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドース異性化酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物を要旨としている。
上記のクレブジエラ属微生物は、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有することを特徴としている。
【０００９】
上記のクレブジエラ属微生物は、クレブジエラ・ニューモニエに属する微生物であり、好ましくはクレブジエラ・ニューモニエ40BR（寄託番号ＩＦＯ３３１７）である。
【００１０】
また、本発明は、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素を要旨としている。
【００１１】
さらにまた、本発明は、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する、６-アザイド・アルドース異性化酵素を要旨としている。
【００１２】
また，本発明は、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いることを特徴とする６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造する方法を要旨としている。
【００１３】
さらにまた、本発明は、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いて６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造し、それらを原料とすることを特徴とする各種アザイド糖の製造方法を要旨としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、微生物反応によって、６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・ケトース、さらにはそれらを原料とする各種アザイド糖を提供することができる。
【００１５】
また、本発明は、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌の新規な機能である６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を、さらに６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を利用することができる。
すなわち、本発明により、ザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有するクレブジエラ属微生物を提供することができる。
【００１６】
また、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素、およびアザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドース異性化酵素を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者は、６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造する酵素の検索を鋭意続けてきた。その結果、従来知られている、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌（特許第特許３１９４１６０号）が、ガラクチトールのみならず、ヘキソースの６位がアザイド化されている６-アザイド・ヘキシトールにも作用し、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを得ることができることを発見し、該酵素（６-アザイド・ポリオール脱水素酵素）を利用した６-アザイド・ケトヘキソースの製造方法を確立した。
公知の該細菌が、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有することを見いだし、該酵素（６-アザイド・アルドース異性化酵素）を利用した６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドヘキソースの製造方法を確立した。
【００１８】
クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌について特許第特許３１９４１６０号明細書に基づき説明する。
ガラクチトールからＬ-タガトースを製造するのに使用される細菌は、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する細菌である。その一例としては、クレブジエラ ニューモニエ （ＫＬｅｂｓｉｅＬＬａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ ３３１７または、これの変異株などが有利に利用できる。
クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する細菌は、ガラクチトールを含有する水溶液に接触し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生しうる微生物であればよく、例えば、クレブジエラ ニューモニエ ＩＦＯ ３３１７、または、この変異株などの細菌が好適であり、通常、これら細菌をキシリトール、Ｄ-タリトール、Ｌ-アラビノール、グリセロール等炭素源を含有する栄養培地で培養し、望ましくは、振盪、通気撹拌などの好気的条件下で培養し、培養中に、または得られる細菌（生菌体）を用いることができる。
【００１９】
培養方法としては、クレブジエラ属に属する細菌が必要とする栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩などを含有する培地、望ましくは、微酸性乃至微アルカリ性の液体培地に、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する細菌を植菌し、温度約２０乃至３５℃で、１乃至１０日間好気的条件下で培養すればよい。とりわけ、炭素源として、例えば、キシリトール、Ｄ-タリトール、Ｌ-アラビトール、およびグリセロールなどの一種または二種以上の炭素源とともに他の各種栄養源を含有する液体培地で好気的に培養するのが望ましい。
この細菌は、培養液から分離された生菌体そのままの状態に限る必要はなく、例えば、生菌体を半透膜製のホローファイバーに封入した細菌、寒天、ゼラチン、アルギン酸塩などで包括し、ビーズ状、シート状などの各種形状に固定化した細菌などとして、繰り返し利用することも好都合である。
【００２０】
実施例においては、アザイド・ポリオールのアザイド・ケトースへの酸化と、アザイド・ケトースのアザイド・アルドースへの異性化を同一の微生物を用いて連続的に行った。しかし、両反応を個別に行うことも可能である。微生物反応を用いてまず、アザイド・ケトースを生産し、それを基質として新たにイソメラーゼを用いてさらにアザイド・アルドースへと異性化することも可能である。他のアザイド・ポリオールなど場合には同一の微生物が両酵素系を持っていない場合も考えられるからである。本発明の実施例の方法は、同一の微生物によって、一気に生産できるという非常に優位なものとなっている。
【００２１】
［原料の調製］
原料となるヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールは、図１に示される一般的な製造法を採用することができるが、それに限定されることはない。
実施例においては６-アザイド・D-ガラクチトールを用いた。しかしIzumoringの戦略（例えば特開２００８−１０９９３３号公報参照）からすると、各種の６-アザイド・ポリオールを酸化し、さらに還元することによって多くの他の６-アザイド・ケトースや６-アザイド・アルドースを生産できることを示している。ケトースは必ずしもヘキソースには限る必要はなく、炭素数５のペントースにおいてもこの反応戦略は有効であることも当然である。本発明は、Izumoringの戦略がアザイド糖へも適用できることの証明であり、今後この手法を用いることで多くのアザイド糖の生産に利用できることが可能となる。
【００２２】
以下、実施例により本発明の詳細を述べるが、これらの実施例により、本発明が限定されることはない。
【実施例１】
【００２３】
基質である１-アザイド Ｄ-ガラクチトールの一般的な製造法は、図１の反応式で示される方法を用いた。８ステップの反応であり収率は２７％であった。Ｄ-ガラクトースの１位および４位を保護し、２および３位、５及び６位をメチル化した後、１位の保護をはずしてアザイド化することで生産した。精製はクロマトグラフィーによって行った。
【００２４】
生産された１-アザイド Ｄ-ガラクチトールは、化２で示されるように、１８０度回転することで、６-アザイド Ｌ-ガラクチトールと同一と物質であることが分かる。
【化２】
【００２５】
化３で示されるように、この６-アザイドＬ-ガラクチトールの２位を微生物酸化すると、生産物は６-アザイド Ｌ-タガトースであると予想される。この反応をガラクチトールをＬ-タガトースへ酸化する微生物クレブジエラ ニューモニエを用いて行った。
【化３】
【００２６】
微生物はガラクチトールからＬ-タガトースを生産する能力を有する、クレブジエラ・ニューモニエ40BR（ＩＦＯ ３３１７）を用いた。
【００２７】
培養条件は１％キシリトール、０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）前培養は５０ｍＬ/３００ｍＬバッフル付三角フラスコ、３０℃、１８時間おこなった。本培養は４Ｌ/５Ｌジャーファーメンター、３０℃、４００ｒｐｍ、通気量３Ｌ/ｍiｎ、２４時間とした。菌体を洗浄後、洗浄菌体反応を行った。
【００２８】
反応条件は以下のとおりである。
［反応液組成］
８％基質 １４０ｍＬ 終濃度０．５％
１M Tris-HCＬ ｐH７．５ １１２ｍＬ 終濃度５０ｍM
４０ｂR (A６００=８９) ５００ｍＬ 終濃度A６００=２０
水 １４８８ｍＬ
全量 ２２４０ｍＬ
［反応条件］
反応温度は３０℃、４００ｒｐｍの速度で、ジャーファーメンター中で撹拌しながら、通気量（３Ｌ/ｍiｎ）での酸化条件において反応を行った。
【００２９】
反応中の組成変化を図２に示した。横軸が反応時間、縦軸がそれぞれの物質の濃度を示している。■が基質である１-アザイドＤ-ガラクチトール（６-アザイドＬ-ガラクチトール）、▲がHPＬC分析で４４．６分に溶出される６-アザイドＬ-タガトース、◆がHPＬC分析で２０．４分に溶出される６-アザイドＬ-ガラクトースである。
【００３０】
［生産物の精製］
１００時間反応後菌体を回収除去し、上清を反応生産物として回収した。その後、活性炭処理、脱塩(SK1B+IRA411)をした。減圧濃縮後の処理液からの生産物の分離は、ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ-Ｘ２ (Ｃａ型)カラム（Φ３０×４７０ｍｍ）を用いて行った。カラム温度は５０℃、サンプル３０％溶液７．５ｍＬ、流速３ｍＬ/ｍｉｎ、フラクション７．５ｍＬ/ｔuｂe 分画した。
図３はその溶出パターンを示している。最初のピークが６-アザイド Ｌ-ガラクトースであり、二番目のピークが６-アザイド Ｌ-タガトースである。
【００３１】
［構造の確認］
化４に本反応で予想される反応を示した。
【化４】
【００３２】
用いたクレブジエラ・ニューモニエ４０BRは、ガラクトースを酸化してＬ-タガトースを生産する能力を持つことから、第一の反応である６-アザイド Ｌ-ガラクチトールの２位を酸化して６-アザイド Ｌ-タガトースを生産したと考えられる。さらにこの菌は、Ｌ-ガラクトースに作用してＬ-タガトースを生産するＤ-アラビノースイソメラーゼを持っていることから、第二の反応である６-アザイド Ｌ-ガラクトースを生産したと予想される。
生産物の確認として最も直接的である糖の結晶のエックス線解析によって行った。それは精製した６-アザイド Ｌ-ガラクトースと思われるが結晶状に得ることができたので実施した。
【００３３】
Nonius KappaCCD diffractometer を用いた６-アザイド Ｌ-ガラクトースのエックス線構造解析の結果の図４を下に示す。この構造は６-アザイド-アルファー Ｌ-ガラクトースであることを明確にしめしている。
【００３４】
この構造確定の結果から、上記のような、６-アザイド Ｌ-ガラクチトールから生産された二種類の糖は、６-アザイド Ｌ-タガトースおよび６-アザイド Ｌ-ガラクトースであることが明らかになった。
【００３５】
本発明においては、アザイド・ポリオールのアザイド・ケトースへの酸化と、アザイド・ケトースのアザイド・アルドースへの異性化を同一の微生物を用いて連続的に行った。しかし、両反応を個別に行うことも可能である。微生物反応を用いてまず、アザイド・ケトースを生産し、それを基質として新たにイソメラーゼを用いてさらにアザイド・アルドースへと異性化することも可能である。他のアザイド・ポリオールなど場合には同一の微生物が両酵素系を持っていない場合も考えられるからである。本発明は同一の微生物によって、一気に生産できるという非常に優位なものとなっている。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明においては、６-アザイド Ｌ-タガトースおよび６-アザイド Ｌ-ガラクトースを、Ｄ-ガラクトースから合成される１-アザイド Ｄ-ガラクチトールを出発原料として生産できることを明らかにした。これらのアザイド糖は具体的にはノジリマイシン関連物質の合成へ使用できることが容易に期待できるものであり、今後の研究が期待される。
また、これらのアザイド化合物は有機化学的手法では容易には相互変換できないため、これまで生産が困難である物質である。それをこのような微生物反応と酵素反応によって進むことを明らかにできたことは、今回生産法を明らかにした６-アザイド Ｌ-タガトースおよび６-アザイト
Ｌ-ガラクトースばかりでなく、各種の６-アザイド糖の生産が可能であることを示したこととなる。これは基本的には Izumoring の生産戦略を用いたものであり、各種のアザイド糖の体系的な生産が可能であることも示している。
【００３７】
すなわち本発明においては６-アザイド・D-ガラクチトールを用いた。しかしIzumoringの戦略からすると、各種の６-アザイド・ポリオールを酸化し、さらに還元することによって多くの他の６-アザイド・ケトースや６-アザイド・アルドースを生産できることを示している。ケトースは必ずしもヘキソースには限る必要はなく、炭素数５のペントースにおいてもこの反応戦略は有効であることも当然である。この発明は、Izumoringの戦略がアザイド糖へも適用できることの証明であり、今後この手法を用いることで多くのアザイド糖の生産に利用できることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】原料となるヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールの一般的な製造の反応を示す化学式である。
【図２】実施例１の微生物反応における反応中の組成変化を示す図面(横軸：反応時間、縦軸：物質の濃度)である。■：基質である１-アザイドＤ-ガラクチトール（６-アザイドＬ-ガラクチトール）、▲：HPＬC分析で４４．６分に溶出される６-アザイドＬ-タガトース、◆：HPＬC分析で２０．４分に溶出される６-アザイドＬ-ガラクトース
【図３】実施例１の微生物反応における生産物のクロマトグラフィーによる溶出パターンを示す図面である。最初のピーク：６-アザイド Ｌ-ガラクトース、二番目のピーク：６-アザイド Ｌ-タガトース
【図４】NoniusKappaCCD diffractometer を用いた６-アザイド Ｌ-ガラクトースのエックス線構造解析の結果を示す図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、６-アザイド・ヘキシトールから６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物、該微生物由来の６-アザイド・ポリオール脱水素酵素または６-アザイド・アルドース異性化酵素、該酵素を用いる、６-アザイドケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースの製造法、ならびに、それらを原料とする各種アザイド糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「クリックケミストリー」は、シートベルトのように「カチッ」と音のした瞬間にベルトが結合するたとえ、すなわち簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることのできるシンプルな化学という意味である。
クリックケミストリーの特徴として、あらかじめ結合させたい場所に、例えばアジドおよびアセチレンをそれぞれ有する反応基を合成しておけば、副反応なしにその場所選択的に結合することができる（ここではトリアゾールが生成する）。そのため一度に多種類の化合物を得ることのできる組み合わせ合成への応用も可能であり、多様な化合物への簡便な変換反応と言い換えることができる。またクリックケミストリーは副生成物を出さないため、環境面も考慮した実用的な網羅的化学合成の概念を築くものである。したがって反応全体を通して信頼性が高く、容易な反応であるがゆえに幅広い汎用性が認められるのである。
最近開発されたクリックケミストリーを介したポリマー材料について、銅触媒による１，３−双極性付加環化によって多価アジドおよびアルキンが架橋ポリマー網目構造中に組み込まれる場合に、接着性ポリマーが形成される。金属表面から浸出するか、モノマー混合物に加えられるかのいずれかであるＣｕイオンによって、この縮合重合が効率的に促進され、複数のトリアゾール結合要素が生成されることによって金属表面との強い相互作用が得られること、この接着性ポリマーは、接着性ポリマーコーティングとして、または接着性ポリマー接合剤として形成することができることが示されている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５０７４０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
アザイド化合物（アジト化合物ともいう）は各種有用な有機化学物質を合成するのに非常に重要な物質であり、クリックケミストリーとして比較的単純な部分構造同士を、高い反応性・選択性を持った炭素−ヘテロ原子結合反応によって結びつけることで、新たな機能性分子を創出することに利用価値の高い物質である。
【０００５】
６-アザイト糖は窒素Nを含む化合物の合成に有用であり、一般に化１のような構造で示される。
【化１】
【０００６】
本発明においては、Ｒは単糖であり、ガラクチトール、ガラクトース、タガトースの６位にアザイドが結合したものである。これらの物質は有機合成によっては相互の転換が困難なものが多く、本発明における生産物である６-アザイド Ｌ-ガラクトースおよび６-アザイド Ｌ-タガトースは有機化学的反応によっては生産することが困難な物質である。
【０００７】
本発明は、微生物反応によって、６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・ケトース、さらにはそれらを原料とする各種アザイド糖を提供することを目的とする。
また、本発明は、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌の新規な機能を見いだし、その発見に基づき６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を、さらに６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を利用することを目的とする。
すなわち、本発明は、アザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有するクレブジエラ属微生物を提供することを目的とする。
また、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素、およびアザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドース異性化酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物を要旨としている。
上記のクレブジエラ属微生物は、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有することを特徴としている。
【０００９】
上記のクレブジエラ属微生物は、クレブジエラ・ニューモニエに属する微生物であり、好ましくはクレブジエラ・ニューモニエ40BR（寄託番号ＩＦＯ３３１７）である。
【００１０】
また、本発明は、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素を要旨としている。
【００１１】
さらにまた、本発明は、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する、６-アザイド・アルドース異性化酵素を要旨としている。
【００１２】
また，本発明は、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いることを特徴とする６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造する方法を要旨としている。
【００１３】
さらにまた、本発明は、上記のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いて６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造し、それらを原料とすることを特徴とする各種アザイド糖の製造方法を要旨としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、微生物反応によって、６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・ケトース、さらにはそれらを原料とする各種アザイド糖を提供することができる。
【００１５】
また、本発明は、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌の新規な機能である６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を、さらに６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を利用することができる。
すなわち、本発明により、ザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有するクレブジエラ属微生物を提供することができる。
【００１６】
また、６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素、およびアザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドース異性化酵素を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者は、６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造する酵素の検索を鋭意続けてきた。その結果、従来知られている、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌（特許第特許３１９４１６０号）が、ガラクチトールのみならず、ヘキソースの６位がアザイド化されている６-アザイド・ヘキシトールにも作用し、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを得ることができることを発見し、該酵素（６-アザイド・ポリオール脱水素酵素）を利用した６-アザイド・ケトヘキソースの製造方法を確立した。
公知の該細菌が、さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有することを見いだし、該酵素（６-アザイド・アルドース異性化酵素）を利用した６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する６-アザイド・アルドヘキソースの製造方法を確立した。
【００１８】
クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する公知の細菌について特許第特許３１９４１６０号明細書に基づき説明する。
ガラクチトールからＬ-タガトースを製造するのに使用される細菌は、クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する細菌である。その一例としては、クレブジエラ ニューモニエ （ＫＬｅｂｓｉｅＬＬａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ ３３１７または、これの変異株などが有利に利用できる。
クレブジエラ属に属し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する細菌は、ガラクチトールを含有する水溶液に接触し、ガラクチトールからＬ-タガトース産生しうる微生物であればよく、例えば、クレブジエラ ニューモニエ ＩＦＯ ３３１７、または、この変異株などの細菌が好適であり、通常、これら細菌をキシリトール、Ｄ-タリトール、Ｌ-アラビノール、グリセロール等炭素源を含有する栄養培地で培養し、望ましくは、振盪、通気撹拌などの好気的条件下で培養し、培養中に、または得られる細菌（生菌体）を用いることができる。
【００１９】
培養方法としては、クレブジエラ属に属する細菌が必要とする栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩などを含有する培地、望ましくは、微酸性乃至微アルカリ性の液体培地に、ガラクチトールからＬ-タガトース産生能を有する細菌を植菌し、温度約２０乃至３５℃で、１乃至１０日間好気的条件下で培養すればよい。とりわけ、炭素源として、例えば、キシリトール、Ｄ-タリトール、Ｌ-アラビトール、およびグリセロールなどの一種または二種以上の炭素源とともに他の各種栄養源を含有する液体培地で好気的に培養するのが望ましい。
この細菌は、培養液から分離された生菌体そのままの状態に限る必要はなく、例えば、生菌体を半透膜製のホローファイバーに封入した細菌、寒天、ゼラチン、アルギン酸塩などで包括し、ビーズ状、シート状などの各種形状に固定化した細菌などとして、繰り返し利用することも好都合である。
【００２０】
実施例においては、アザイド・ポリオールのアザイド・ケトースへの酸化と、アザイド・ケトースのアザイド・アルドースへの異性化を同一の微生物を用いて連続的に行った。しかし、両反応を個別に行うことも可能である。微生物反応を用いてまず、アザイド・ケトースを生産し、それを基質として新たにイソメラーゼを用いてさらにアザイド・アルドースへと異性化することも可能である。他のアザイド・ポリオールなど場合には同一の微生物が両酵素系を持っていない場合も考えられるからである。本発明の実施例の方法は、同一の微生物によって、一気に生産できるという非常に優位なものとなっている。
【００２１】
［原料の調製］
原料となるヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールは、図１に示される一般的な製造法を採用することができるが、それに限定されることはない。
実施例においては６-アザイド・D-ガラクチトールを用いた。しかしIzumoringの戦略（例えば特開２００８−１０９９３３号公報参照）からすると、各種の６-アザイド・ポリオールを酸化し、さらに還元することによって多くの他の６-アザイド・ケトースや６-アザイド・アルドースを生産できることを示している。ケトースは必ずしもヘキソースには限る必要はなく、炭素数５のペントースにおいてもこの反応戦略は有効であることも当然である。本発明は、Izumoringの戦略がアザイド糖へも適用できることの証明であり、今後この手法を用いることで多くのアザイド糖の生産に利用できることが可能となる。
【００２２】
以下、実施例により本発明の詳細を述べるが、これらの実施例により、本発明が限定されることはない。
【実施例１】
【００２３】
基質である１-アザイド Ｄ-ガラクチトールの一般的な製造法は、図１の反応式で示される方法を用いた。８ステップの反応であり収率は２７％であった。Ｄ-ガラクトースの１位および４位を保護し、２および３位、５及び６位をメチル化した後、１位の保護をはずしてアザイド化することで生産した。精製はクロマトグラフィーによって行った。
【００２４】
生産された１-アザイド Ｄ-ガラクチトールは、化２で示されるように、１８０度回転することで、６-アザイド Ｌ-ガラクチトールと同一と物質であることが分かる。
【化２】
【００２５】
化３で示されるように、この６-アザイドＬ-ガラクチトールの２位を微生物酸化すると、生産物は６-アザイド Ｌ-タガトースであると予想される。この反応をガラクチトールをＬ-タガトースへ酸化する微生物クレブジエラ ニューモニエを用いて行った。
【化３】
【００２６】
微生物はガラクチトールからＬ-タガトースを生産する能力を有する、クレブジエラ・ニューモニエ40BR（ＩＦＯ ３３１７）を用いた。
【００２７】
培養条件は１％キシリトール、０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）前培養は５０ｍＬ/３００ｍＬバッフル付三角フラスコ、３０℃、１８時間おこなった。本培養は４Ｌ/５Ｌジャーファーメンター、３０℃、４００ｒｐｍ、通気量３Ｌ/ｍiｎ、２４時間とした。菌体を洗浄後、洗浄菌体反応を行った。
【００２８】
反応条件は以下のとおりである。
［反応液組成］
８％基質 １４０ｍＬ 終濃度０．５％
１M Tris-HCＬ ｐH７．５ １１２ｍＬ 終濃度５０ｍM
４０ｂR (A６００=８９) ５００ｍＬ 終濃度A６００=２０
水 １４８８ｍＬ
全量 ２２４０ｍＬ
［反応条件］
反応温度は３０℃、４００ｒｐｍの速度で、ジャーファーメンター中で撹拌しながら、通気量（３Ｌ/ｍiｎ）での酸化条件において反応を行った。
【００２９】
反応中の組成変化を図２に示した。横軸が反応時間、縦軸がそれぞれの物質の濃度を示している。■が基質である１-アザイドＤ-ガラクチトール（６-アザイドＬ-ガラクチトール）、▲がHPＬC分析で４４．６分に溶出される６-アザイドＬ-タガトース、◆がHPＬC分析で２０．４分に溶出される６-アザイドＬ-ガラクトースである。
【００３０】
［生産物の精製］
１００時間反応後菌体を回収除去し、上清を反応生産物として回収した。その後、活性炭処理、脱塩(SK1B+IRA411)をした。減圧濃縮後の処理液からの生産物の分離は、ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ-Ｘ２ (Ｃａ型)カラム（Φ３０×４７０ｍｍ）を用いて行った。カラム温度は５０℃、サンプル３０％溶液７．５ｍＬ、流速３ｍＬ/ｍｉｎ、フラクション７．５ｍＬ/ｔuｂe 分画した。
図３はその溶出パターンを示している。最初のピークが６-アザイド Ｌ-ガラクトースであり、二番目のピークが６-アザイド Ｌ-タガトースである。
【００３１】
［構造の確認］
化４に本反応で予想される反応を示した。
【化４】
【００３２】
用いたクレブジエラ・ニューモニエ４０BRは、ガラクトースを酸化してＬ-タガトースを生産する能力を持つことから、第一の反応である６-アザイド Ｌ-ガラクチトールの２位を酸化して６-アザイド Ｌ-タガトースを生産したと考えられる。さらにこの菌は、Ｌ-ガラクトースに作用してＬ-タガトースを生産するＤ-アラビノースイソメラーゼを持っていることから、第二の反応である６-アザイド Ｌ-ガラクトースを生産したと予想される。
生産物の確認として最も直接的である糖の結晶のエックス線解析によって行った。それは精製した６-アザイド Ｌ-ガラクトースと思われるが結晶状に得ることができたので実施した。
【００３３】
Nonius KappaCCD diffractometer を用いた６-アザイド Ｌ-ガラクトースのエックス線構造解析の結果の図４を下に示す。この構造は６-アザイド-アルファー Ｌ-ガラクトースであることを明確にしめしている。
【００３４】
この構造確定の結果から、上記のような、６-アザイド Ｌ-ガラクチトールから生産された二種類の糖は、６-アザイド Ｌ-タガトースおよび６-アザイド Ｌ-ガラクトースであることが明らかになった。
【００３５】
本発明においては、アザイド・ポリオールのアザイド・ケトースへの酸化と、アザイド・ケトースのアザイド・アルドースへの異性化を同一の微生物を用いて連続的に行った。しかし、両反応を個別に行うことも可能である。微生物反応を用いてまず、アザイド・ケトースを生産し、それを基質として新たにイソメラーゼを用いてさらにアザイド・アルドースへと異性化することも可能である。他のアザイド・ポリオールなど場合には同一の微生物が両酵素系を持っていない場合も考えられるからである。本発明は同一の微生物によって、一気に生産できるという非常に優位なものとなっている。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明においては、６-アザイド Ｌ-タガトースおよび６-アザイド Ｌ-ガラクトースを、Ｄ-ガラクトースから合成される１-アザイド Ｄ-ガラクチトールを出発原料として生産できることを明らかにした。これらのアザイド糖は具体的にはノジリマイシン関連物質の合成へ使用できることが容易に期待できるものであり、今後の研究が期待される。
また、これらのアザイド化合物は有機化学的手法では容易には相互変換できないため、これまで生産が困難である物質である。それをこのような微生物反応と酵素反応によって進むことを明らかにできたことは、今回生産法を明らかにした６-アザイド Ｌ-タガトースおよび６-アザイト
Ｌ-ガラクトースばかりでなく、各種の６-アザイド糖の生産が可能であることを示したこととなる。これは基本的には Izumoring の生産戦略を用いたものであり、各種のアザイド糖の体系的な生産が可能であることも示している。
【００３７】
すなわち本発明においては６-アザイド・D-ガラクチトールを用いた。しかしIzumoringの戦略からすると、各種の６-アザイド・ポリオールを酸化し、さらに還元することによって多くの他の６-アザイド・ケトースや６-アザイド・アルドースを生産できることを示している。ケトースは必ずしもヘキソースには限る必要はなく、炭素数５のペントースにおいてもこの反応戦略は有効であることも当然である。この発明は、Izumoringの戦略がアザイド糖へも適用できることの証明であり、今後この手法を用いることで多くのアザイド糖の生産に利用できることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】原料となるヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールの一般的な製造の反応を示す化学式である。
【図２】実施例１の微生物反応における反応中の組成変化を示す図面(横軸：反応時間、縦軸：物質の濃度)である。■：基質である１-アザイドＤ-ガラクチトール（６-アザイドＬ-ガラクチトール）、▲：HPＬC分析で４４．６分に溶出される６-アザイドＬ-タガトース、◆：HPＬC分析で２０．４分に溶出される６-アザイドＬ-ガラクトース
【図３】実施例１の微生物反応における生産物のクロマトグラフィーによる溶出パターンを示す図面である。最初のピーク：６-アザイド Ｌ-ガラクトース、二番目のピーク：６-アザイド Ｌ-タガトース
【図４】NoniusKappaCCD diffractometer を用いた６-アザイド Ｌ-ガラクトースのエックス線構造解析の結果を示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物。
【請求項２】
さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有する請求項１に記載のクレブジエラ属微生物。
【請求項３】
クレブジエラ・ニューモニエに属する微生物である請求項１または２に記載のクレブジエラ属微生物。
【請求項４】
クレブジエラ・ニューモニエ40BR（寄託番号ＩＦＯ ３３１７）である請求項３に記載のクレブジエラ属微生物。
【請求項５】
６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する、請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素。
【請求項６】
６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する、請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する、６-アザイド・アルドース異性化酵素。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いることを特徴とする６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造する方法。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いて６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造し、それらを原料とすることを特徴とする各種アザイド糖の製造方法。
【請求項１】
ヘキソースの６位がアザイド化されている、６-アザイド・ヘキシトールを原料とし、２位を酸化し、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する能力を有するクレブジエラ属微生物。
【請求項２】
さらに、６-アザイド・ケトヘキソースを異性化して、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する能力を有する請求項１に記載のクレブジエラ属微生物。
【請求項３】
クレブジエラ・ニューモニエに属する微生物である請求項１または２に記載のクレブジエラ属微生物。
【請求項４】
クレブジエラ・ニューモニエ40BR（寄託番号ＩＦＯ ３３１７）である請求項３に記載のクレブジエラ属微生物。
【請求項５】
６-アザイド・ポリオールに作用し、２位をケトースへ酸化することで、６-アザイド・ケトヘキソースを生成する、請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素。
【請求項６】
６-アザイド・ケトヘキソースを異性化することによって、６-アザイド・アルドヘキソースを生産する、請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する、６-アザイド・アルドース異性化酵素。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いることを特徴とする６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造する方法。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれかに記載のクレブジエラ属微生物に由来する６-アザイド・ポリオール脱水素酵素および／または６-アザイド・アルドース異性化酵素を用いて６-アザイド・ケトヘキソースおよび／または６-アザイド・アルドヘキソースを製造し、それらを原料とすることを特徴とする各種アザイド糖の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１７１４６（Ｐ２０１０−１７１４６Ａ）
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１８１４６９（Ｐ２００８−１８１４６９）
【出願日】平成２０年７月１１日（２００８．７．１１）
【出願人】（５０６３８８０６０）合同会社希少糖生産技術研究所 (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１１日（２００８．７．１１）
【出願人】（５０６３８８０６０）合同会社希少糖生産技術研究所 (18)
【Ｆターム（参考）】
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